JP2005511026A

JP2005511026A - 心臓または消化器系の疾病および病態、ならびに癌の診断ならびに治療の方法

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Publication number: JP2005511026A
Application number: JP2003531882A
Authority: JP
Inventors: マークシー．フィッシュマン; ウォルフガンロットバウアー
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2001-10-01
Filing date: 2002-10-01
Publication date: 2005-04-28
Also published as: WO2003028537A2; AU2002330177B2; US20050053935A1; WO2003028537A3; EP1438389A4; CA2460261A1; EP1438389A2

Abstract

本発明は、心臓または消化器系の疾病および病態ならびに癌を診断および治療する方法、該疾病および病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法、ならびに該疾病および病態を治療または予防するためのこれら化合物の使用方法を提供する。また、スクリーニング法において使用可能な動物モデル系も本発明において提供される。

Description

発明の分野
本発明は、心臓または消化器系の疾病および病態、ならびに癌を診断する方法ならびに治療する方法に関する。

発明の背景
心疾患とは、数多くの様々な心臓病を表すのに用いられる一般的な用語である。例えば、冠動脈疾患は最も一般的な心疾患であり、酸素の豊富な血液を心臓に供給する動脈の狭窄または狭小化を特徴とし、心筋の一部の壊死である心筋梗塞を引き起こす可能性がある。心不全とは、心臓が十分な量の血液を全身に送り出すことができなくなったために生じる病態である。心不全は心臓の活動が突然急に停止するのではなく、むしろ、心臓が血液を効率的に送り出す能力を次第に失うにつれて、何年も経てゆっくりと発症することが多い。心不全の危険因子には、冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、心筋症、心筋疾患、肥満症、糖尿病、および心不全の家族歴が含まれる。

ゼブラフィッシュ、Danio rerioは、発生の遺伝解析および生化学的解析に用いるのに便利な生物である。扱いやすく透明な胚を有することから、発生の最も早い段階から器官機能を直接観察することができ、世代時間が短く、さらに繁殖力が旺盛である。

発明の概要
本発明は、fvo39-Kと命名したゼブラフィッシュのレプチン遺伝子の変異が、異常な消化器系および心臓の発生および機能によって特徴づけられる表現型をゼブラフィッシュにもたらすという知見に基づいた診断、薬物スクリーニング、および治療の方法を提供する。

第一の局面において、本発明は、被験者（例えば、ヒト等の哺乳動物）がレプチンに関連する疾病または病態（例えば、消化器系または心臓の疾病もしくは病態(例えば心不全)、または癌）を有するか否かまたは発症する危険性があるか否かを決定する方法を提供する。この方法は、被験者由来の試料の核酸分子を解析し、被験者がレプチンをコードする遺伝子に変異（例えばfvo39-K変異；以下を参照のこと）を有するか否かを決定する段階を含む。そのような変異の存在により、被験者がレプチンに関連する疾患を有するまたは発症する危険性があることが示される。この方法はまた、ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の核酸分子増幅のために、レプチンをコードする遺伝子に特異的な核酸分子プライマーを用いる段階を含んでもよい。この方法は、被験者由来のレプチンをコードする核酸分子のシークエンシングをさらに含んでもよい。

第二の局面において、本発明は、消化器系もしくは心臓の疾病もしくは病態または癌などのレプチンに関連する疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法を提供する。この方法は、レプチン遺伝子に変異（例えばfvo39-K変異）を有しかつそのような疾病または病態に特有の表現型を有する生物（例えばゼブラフィッシュ）に化合物を接触させる段階、およびその化合物の表現型への効果を決定する段階を含む。その表現型において改善が認められれば、その疾病または病態を治療するのに使用可能な化合物が同定されたことが示される。

第三の局面において、本発明は、上述の方法により同定された化合物を患者に投与する段階を含む、患者（例えば、レプチン遺伝子に変異（例えばfvo39-K変異）を有する患者）のレプチンに関連する疾病または病態（消化器系もしくは心臓の疾病もしくは病態または癌）を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、そのような疾病または病態の治療または予防におけるそのような化合物の使用、およびそのような治療または予防のための医薬品の調製におけるこれらの化合物の使用も含む。

第四の局面において、本発明は、患者のレプチンに関連する疾病または病態、例えば消化器系もしくは心臓の疾病もしくは病態または癌を治療または予防するさらなる方法を提供する。この方法は、機能的なレプチンタンパク質またはそのタンパク質をコードする（例えば発現ベクター内の）核酸分子を患者に投与する段階を含む。本発明はまた、そのような疾病または病態の治療または予防におけるそのようなタンパク質または核酸分子の使用、およびそのような治療または予防のための医薬品の調製におけるこれらのタンパク質または核酸分子の使用も含む。

第五の局面において、本発明は、実質的に純粋なゼブラフィッシュのレプチンポリペプチドを含む。このポリペプチドは、例えば配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれらの配列からなっていてよい。本発明はまた、これらのポリペプチドの配列と少なくとも75%、85%、90％、または95%（例えば、少なくとも96%、97%、98%、または99%）同一である配列を含み、かつ（発生に対する影響、または例えばATPアーゼおよび/もしくはヘリカーゼ活性の解析により決定される；後述参照）レプチン活性を有するかまたはさもなくば本明細書の他所に記載する疾患および病態に特有である、これらのポリペプチドの変種を含む。これらのポリペプチドの断片もまた、本発明に含まれる。例えば、レプチンの任意の異なるドメインを様々な組み合わせで含む断片が含まれる。好ましくは、本発明に係るレプチンポリペプチドは、Walker保存モチーフAおよびB（それぞれGQPGTGKTおよびDEVH；配列番号:2、4、および6参照）を含む。さらに、これらのポリペプチドは、一本鎖DNA依存型ATPアーゼおよび/またはATP依存型DNAヘリカーゼ活性を有しうる。

第六の局面において、本発明は、ゼブラフィッシュレプチンポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸分子（例えばDNA分子）を提供する。この核酸分子は、配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれらの配列からなっているポリペプチドをコードし得る。本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:1の相補鎖とハイブリダイズし、かつレプチン活性を有するかまたはさもなくば本明細書の他所で記載する疾患および病態に特有であるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

第七の局面において、本発明は上述の核酸分子を含むベクターを提供する。

第八の局面において、本発明は上述のベクターを含む細胞を含む。

第九の局面において、本発明は、上述の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物（例えばゼブラフィッシュまたはマウス）を提供する。

第十の局面において、本発明は、レプチンポリペプチドをコードする対立遺伝子の一方または両方にノックアウト変異を有する非ヒト動物を提供する。

第十一の局面において、本発明は、上述の非ヒトノックアウト動物由来の細胞を含む。

第十二の局面において、本発明は、例えばfvo39-K変異を有するポリペプチド等の変異型レプチンポリペプチドをコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物（例えばゼブラフィッシュ）を含む（配列番号:5および6ならびに後述を参照のこと）。

第十三の局面において、本発明はレプチンポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。

第十四の局面において、本発明は、レプチンポリペプチドの活性を促進または阻害するRNAを患者に投与することにより、患者においてこの活性を調節する方法を提供する。

「ポリペプチド」または「ポリペプチド断片」とは、いかなる翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、二つ以上(例えば10、15、20、30、50、100、もしくは200、またはそれ以上)のアミノ酸の鎖を意味し、これは自然界に存在するまたは自然界に存在しないポリペプチドのすべてまたは一部を構成する。「翻訳後修飾」とは、合成中または合成後のポリペプチドまたはポリペプチド断片に対する何らかの変化を意味する。翻訳後修飾は、（細胞内での合成中等に）自然に起こり得るか、または（組換えまたは化学的手段等によって）人工的に引き起こし得る。「タンパク質」は、一つ以上のポリペプチドで構成され得る。

「レプチンタンパク質」または「レプチンポリペプチド」とは、ヒト（配列番号:4）またはゼブラフィッシュ（配列番号:2）のレプチンポリペプチドの配列と少なくとも45％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％、および最も好ましくは少なくとも90％(例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％)のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。本明細書において定義するように、レプチンポリペプチドは、心臓の発生、モデリング、および機能に関与している。これは、消化器系の疾病または病態、心臓疾患（例えば心不全）、または癌などのレプチンに関連する心疾患等の疾患および状態のマーカーとして用いることができる（後述参照のこと）。

レプチン遺伝子配列のスプライスバリアントおよび変異を含むレプチン遺伝子からのポリペプチド産物も、本発明に含まれる。例えば、スプライスバリアントでは、例えばfvo39-k変異の場合にはスプライス部位に（以下を参照のこと）、短いアミノ酸（1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸）のひと配列の挿入が生じ得る。さらなる変異の種類には、例えば、切断型タンパク質の形成を生じる、タンパク質に終止コドンが挿入される変異が含まれる。

「レプチン核酸分子」または「レプチン核酸分子」とは、先に定義したように、レプチンタンパク質（例えば、ヒト（配列番号:3によりコードされる）またはゼブラフィッシュ（配列番号:1によりコードされる）のレプチンタンパク質）、レプチンポリペプチド、またはその一部をコードするゲノムDNA、cDNA、またはRNA（例えばmRNA）分子等の核酸分子を意味する。レプチン核酸分子の変異は、例えばレプチン遺伝子内の任意の箇所での未熟な終止コドンの挿入、またはスプライス供与部位またはイントロン配列における変異によって特徴づけることができ、これにより異常な転写産物（例えば、未熟な終止コドンを有する転写産物）が産生される。本発明は、fvo39-Kおよび同様の変異に加えて、異常なレプチンタンパク質の産生または機能をもたらすいかなる変異も含み、単なる例としてではあるがヌル突然変異および切断を引き起こすさらなる変異も含む。

「同一性」という用語は、本明細書において、特定の核酸分子またはポリペプチドの配列とそれと同じタイプの参照分子の配列との関係を示すために用いられる。例えば、整列させた参照分子と比較して、ポリペプチドまたは核酸分子がある位置で同じアミノ酸またはヌクレオチド残基を有する場合、その位置で「同一」であると言う。参照分子に対する核酸分子またはポリペプチドの配列同一性のレベルは、通常、最適な配列比較を行うためのギャップの導入等のそこに規定されたデフォルトパラメーターを使い、配列解析ソフトウェアを用いて測定する（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ジェネティクスコンピューターグループの配列解析ソフトウェアパッケージ、1710 University Avenue, Madison, WI 53705、BLAST、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）。これらのソフトウェアプログラムは、様々な置換、欠失、または他の修飾に同一性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を整合させる。保存的置換には、一般的に以下の群内での置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。

核酸分子またはポリペプチドは、それが参照分子の配列に対して、その全長にわたって少なくとも51％、好ましくは少なくとも55％、60％、または65％、および最も好ましくは75％、85％、90%、または95％の同一性を示す場合に、参照分子に対して「実質的に同一」であると言う。ポリペプチドに関しては、比較配列の長さは少なくとも16個のアミノ酸、好ましくは少なくとも20個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも25個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも35個のアミノ酸である。核酸分子に関しては、比較配列の長さは少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも110ヌクレオチドである。当然のことながら、比較の長さは、全長までのおよび全長を含む任意の長さでありうる。

レプチン核酸分子またはレプチンポリペプチドは、その生物活性の決定、またはそれが野生型であるかもしくは変異型であるかの決定をする試験方法が実施された場合に、「解析される」または「解析」に供される。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて動物のゲノムDNAを増幅し、次に、例えばヌクレオチド配列または制限酵素断片解析によって増幅されたDNAが例えばfvo39-K変異等の変異を含むか否かを決定することにより、動物（例えば、ヒトまたはゼブラフィッシュ）のレプチン遺伝子を解析することができる。

「プローブ」または「プライマー」は、相補的配列（「標的」）を含む第二のDNAまたはRNA分子と塩基対を形成することができる規定の配列の一本鎖DNAまたはRNA分子を意味する。形成されたハイブリッドの安定性は、塩基対形成の起こる程度に依存する。この安定性は、プローブと標的分子間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度等のパラメータによって影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、温度、塩濃度、およびホルムアミド等の有機分子の濃度のようなパラメータによって影響を受け、当業者に周知の方法によって決定される。レプチン核酸分子に特異的なプローブまたはプライマーは、ヒト(配列番号:3)またはゼブラフィッシュ（配列番号:1）のレプチン遺伝子の配列と好ましくは45％を超える配列同一性、より好ましくは少なくとも55〜75％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも75〜85％の配列同一性、さらにこれより好ましくは少なくとも85〜99％の配列同一性、および最も好ましくは100％の配列同一性を有する。

プローブは、当業者に周知の方法により、検出可能な程度に放射性標識または非放射性標識することができる。プローブは、核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）解析、制限断片長多型（RFLP）解析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、および当業者に周知の他の方法等の、核酸ハイブリダイゼーションに関する方法に用いることができる。

分子、例えば、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー、遺伝子もしくはその断片、cDNA分子、ポリペプチド、または抗体は、その存在が試料中で直接同定され得るように標識される場合に、「検出可能な程度に標識される」と言うことができる。検出可能な程度に分子を標識する方法は当技術分野で周知であり、放射性標識（例えば、³²Pまたは³⁵Sのような同位元素）および非放射性標識（例えば、フルオレセインのような蛍光標識）が含まれるが、これらに限定されない。

「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然に付随するタンパク質および有機分子から分離されているポリペプチド（またはその断片）を意味する。一般に、ポリペプチドは、それが天然に会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を重量で少なくとも60％含まない場合に、実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％純粋であるレプチンスポリペプチドである。実質的に純粋なレプチンポリペプチドは、例えば天然源からの抽出、レプチンポリペプチドをコードする組換え核酸分子の発現、または化学合成によって得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析等の何らかの適当な方法によって測定することができる。

ポリペプチドは、天然状態でこれに付随するタンパク質および有機分子から分離されている場合に、天然に会合する成分を実質的に含まない。このように、化学合成された、またはそれが天然に産生される細胞とは異なる細胞系において産生されたタンパク質は、天然に会合する成分を実質的に含まない。したがって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するポリペプチドが含まれるのみならず、大腸菌、他の原核生物において、または他のそのような系において合成されたポリペプチドも含まれる。

「単離された核酸分子」とは、それが天然に存在する環境から取り出された核酸分子を意味する。例えば、細胞のゲノム中または遺伝子バンクの一部として存在する天然型の核酸分子は単離されていないが、例えばクローニング事象（増幅）の結果としてゲノムの残りの部分から分離された同じ分子は「単離されている」。典型的に、単離された核酸分子は、天然型ゲノムにおいて5'または3'末端で直接隣接している核酸領域（例えばコード領域）を含まない。そのような単離された核酸分子はベクターまたは組成物の一部であってよく、そのようなベクターおよび組成物はその天然環境の一部ではないためやはり単離されていると言える。

抗体は、例えば天然にポリペプチドを含む生体試料等の試料において、このポリペプチド（例えばレプチンポリペプチド）を認識して結合するが、他の分子（例えば非レプチン関連ポリペプチド）を実質的に認識せず結合しない場合に、ポリペプチドに「特異的に結合する」と言う。

「高ストリンジェンシー条件」とは、0.5 M NaHPO₄、pH 7.2、7％SDS、1 mM EDTA、および1％BSA（フラクションV）を含む緩衝液において65℃で、または48％ホルムアミド、4.8 × SSC、0.2 Mトリス-Cl、pH 7.6、1 × デンハルツ溶液、10％硫酸デキストラン、および0.1％SDSを含む緩衝液において42℃で、少なくとも100、例えば200、350、または500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて起こるハイブリダイゼーションに匹敵するハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。（これらは、高ストリンジェンシーのノーザンまたはサザンハイブリダイゼーションの典型的な条件である。）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはまた、高ストリンジェンシーPCR、DNAシークエンシング、一本鎖DNA高次構造多型解析、およびインサイチューハイブリダイゼーション等の分子生物学者によって日常的に行われる多数の手法の確立に貢献している。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの手法は通常比較的短いプローブを用いて行われる（例えば、PCRまたはシークエンシングに関しては通常16ヌクレオチド以上、およびインサイチューハイブリダイゼーションに関しては40ヌクレオチド以上）。これらの手法において用いられる高ストリンジェンシー条件は分子生物学の当業者に周知であり、その例は例えば、参照として本明細書に組み入れられるAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1998に見ることができる。

「試料」とは、患者または被験者から得られた組織生検、羊水、細胞、血液、血清、尿、便、またはその他の検体を意味する。試料は、当技術分野において周知の方法によって、レプチン遺伝子における変異またはレプチン遺伝子の発現レベルを検出するために解析することができる。例えば、患者の試料に由来するPCR産物にシークエンシング、一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）解析、または制限断片長多型（RFLP）解析等の方法を用いてレプチン遺伝子における変異を検出することができ、ELISAおよび他のイムノアッセイ法を用いてレプチンポリペプチドのレベルを測定することができ、およびPCRを用いてレプチン核酸分子のレベルを測定することができる。

「レプチン-関連疾患」または「レプチン関連病態」とは、レプチン遺伝子の不適当に高いもしくは低い発現、またはレプチン核酸分子もしくはポリペプチドの生物活性を変化させるレプチン遺伝子における変異（プロモーターなどの調節配列を含む）が原因で起こる疾病または病態を意味する。レプチン関連疾患および病態は、レプチンが出生前または出生後に発現されるいかなる組織においても起こり得る。レプチン関連疾患および病態には、消化器系もしくは心臓の疾病もしくは病態（例えば心不全）、または癌が含まれ得る。

本発明はいくつかの利点を提供する。例えば、本発明の診断方法を用いて、患者における消化器系もしくは心臓の疾病、または癌などのレプチンに関連した疾病または病態が起こる可能性の増大を検出することが可能であり、よって何らかの症状が見られる以前に適切な処置を行うことが可能である。これは、例えばそのような疾病または病態の危険性の高い群の患者に有効となり得る。また、本発明の診断方法により、患者における既存のそのような疾病または病態の病因決定が容易になり、適切な治療法が選択され得る。さらに、本発明のスクリーニング方法は、こうした疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定するのに用いることが可能である。本発明はまた、本発明より以前は唯一の治療法が臓器移植のみであり、ドナーの臓器の入手可能性および臓器拒絶の可能性により制限されていた疾病または病態（例えば臓器不全）を治療するために用いることができる。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。

詳細な説明
本発明は、消化器系もしくは心臓の疾病もしくは病態、または癌等のレプチンに関連する疾患および病態を診断、予防、および治療する方法、およびそのような疾患および病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。具体的には、本発明者らは、消化器系および心臓の発生および機能を撹乱させる遺伝子変異、fvo39-K を同定した。本明細書で、fvo39-K遺伝子がレプチンをコードすることを示す。

したがって、本発明の診断方法は、レプチンタンパク質をコードする遺伝子における変異の検出に関連し、化合物の同定方法は、レプチンをコードする遺伝子に変異を有する生物または他の適切な疾患および病態モデルの表現型に影響を与える化合物のスクリーニングに関連する。このようにして同定された化合物、ならびにレプチン遺伝子、タンパク質、およびその抗体は、レプチンに関連する疾患および病態を治療または予防する方法において用いることができる（後述参照）。

本発明はまた、上述のスクリーニング方法に使用可能な動物モデル系（例えば、レプチンに変異（例えばfvo39-K変異）を有するゼブラフィッシュ、またはそのような変異を有するマウス（または他の動物））、ならびにレプチンタンパク質およびこのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。また、変異型ゼブラフィッシュレプチンタンパク質をコードする遺伝子（例えば、fvo39-K変異を有する遺伝子）およびこれらの遺伝子にコードされるタンパク質も本発明に含まれる。これらのタンパク質（野生型または変異型）に特異的に結合する抗体も、本発明に含まれる。

本発明に従って診断、予防、または治療され得るレプチンに関連する疾患および病態について簡単に説明した後に、本発明の診断、スクリーニング、および治療方法、ならびに本発明の動物モデル系、タンパク質、および遺伝子についてさらに以下で説明する。

レプチン関連疾患また病態
レプチン遺伝子またはタンパク質における異常は任意の多種多様な疾病または病態と関連している可能性があり、したがって、本発明の方法によりそれらすべてを診断、予防、または治療することができる。例えば、上記のように、ゼブラフィッシュのfvo39-K変異は異常な消化器系および心臓の発生および機能によって特徴づけられる。よって、MLC-2遺伝子またはそれらの発現における異常の検出を、消化器系もしくは心臓の疾病もしくは病態（後述参照）を診断する方法、またはそれらの治療または進行をモニターする方法に使用することができる。本発明者らはまた、レプチンが細胞増殖の調節にある役割を果たしていることを見出した。したがって、この遺伝子（またはそれがコードするタンパク質）における異常の検出が、癌の診断、ならびに癌の治療のモニタリングに使用できる。さらに、本明細書に記載するスクリーニング方法で同定される化合物、ならびにレプチン核酸分子、タンパク質、およびそれらの抗体を、そのような疾病または病態を予防または治療する方法に使用することができる。本発明はまた、眼疾患に関して適用することもできる。

本発明の方法を用いて診断、予防、または治療できる心臓の疾病または病態の例は心不全である。心不全の例としては、肺内部または体内の液体貯留を特徴とし、心臓のポンプとしての機能障害に起因するうっ血性心不全、右心室のポンプ作用の障害を特徴とし、体、特に足および腹部のむくみを起こす右心不全（右心室）、心臓の左側のポンプ作用の障害により、肺のうっ血を起こす左心不全（左心室）、安静時または運動時に、心臓が体の酸素要求を満たすに十分な速度で前方に血液を送り出すことができないことを特徴とする前方心不全、心充満圧が異常に高い場合に限り、心臓が体の要求を満たすことができることを特徴とする後方心不全、血液の拍出量を維持できないことを特徴とする低心拍出量、ならびに心拍出量が高いにもかかわらず心不全の症状があることを特徴とする高心拍出量が含まれる。

本明細書に記載した方法はまた、冠動脈疾患、心臓細動（例えば心房細動）、または弁形成の異常に関連する病態等の心不全以外の心循環器疾患の診断、予防、および治療に用いることができ、よってこれらの病態を診断およびモニターする方法にも、レプチン遺伝子またはその発現における異常の検出が利用できる。

本発明の方法を用いて診断（および予防または治療）され得る消化管の疾患または病態には、腸（大腸または小腸）、肝臓、胆管、膵臓、胃、胆嚢または食道等の消化器を冒す任意の疾患または病態が含まれる。例えば、本方法を用いて、消化器不全（肝不全）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、憩室疾患（例えば、憩室炎または憩室症）、吸収不良、脂肪便、虚血性腸疾患、過敏性腸症候群、セリアック病、大腸炎、肝炎（例えば、自己免疫性肝炎、またはA型、B型、C型、D型、E型、もしくはG型肝炎）、肝硬変、脂肪肝、胃炎（急性および慢性）、胃潰瘍、肥厚性胃病、消化性腫瘍、口咽頭嚥下障害、アカラシア、および逆流性食道炎を診断（または治療）することができる。

本発明の方法は、例えば消化管癌のような癌の診断（および予防または治療）に使用することもできる。例えば、本発明の方法を用いて、大腸癌、直腸癌、肝臓癌（例えば肝細胞癌）、膵癌（外分泌腺または膵島）、胆嚢癌、食道癌、胃癌、または胆管癌を診断または治療することができ、これらの癌は、例えば腺癌、腺腫、カルチノイド、または癌腫であってよい。

診断方法
レプチンタンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子によってコードされるポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに特異的な抗体は、このタンパク質をコードする遺伝子における変異またはその不適当な発現に関連する疾患および病態を診断またはモニターする方法において用いることができる。

本発明の診断方法は、例えば、レプチンに関連した疾病または病態を患う患者にその病因を決定するために用いることができ、そのため適切な治療過程の選択が容易になる。この診断方法はまた、そのような疾病または病態をまだ発症していないが今後発症する危険性がある患者、または該疾病または病態を発症する初期段階にある患者について用いることができる。同様に、本発明の診断方法は出生前遺伝子スクリーニングに用いることができ、例えば、レプチンタンパク質をコードする遺伝子において劣性変異を保因する可能性のある親が同定される。さらに、本方法を用いて、患者のレプチン遺伝子が変異を含むか否かを決定することにより、患者においてレプチン変異が疾病または病態（例えば心疾患）の原因となっている可能性があるか否かを調べることができる。本発明の方法を用いて、例えばヒト、ペット、または家畜等の任意の哺乳動物において、本明細書に記載する疾患を診断（または予防もしくは治療）することができる。

本発明の診断方法を用いて検出できるレプチンの異常には、例えば、（i）異常なレプチンタンパク質の産生を起こす変異を含むレプチンタンパク質をコードする遺伝子、（ii）異常なレプチンポリペプチド自身（例えば切断された型のタンパク質）、および（iii）異常な量のこのタンパク質の産生を引き起こすレプチン遺伝子の変異、を特徴とする異常が含まれる。該異常の検出は、消化器系または心臓に影響を及ぼすものなどレプチンに関連した、ヒトの疾病または病態の診断において利用できる。レプチン遺伝子の変異の典型的な例はfvo39-K変異であり、これについては以下で詳述する。

レプチン遺伝子の変異は、たとえこのタンパク質が発現されていなくても、被験者のいかなる組織において検出できる。これらのタンパク質が発現されている組織の数はおそらく限られており、限られた期間であるため、およびアッセイのための該組織（例えば心臓の組織、または消化器系器官）の試料採取はおそらく望ましくないため、血液または羊水試料等のより容易に得られる別のタイプの試料において、変異型遺伝子を検出することが好ましいと思われる。

レプチンタンパク質をコードする遺伝子における変異の検出は、標準的な診断手法のいずれかを用いて行うことができる。例えば、患者から得られた生体試料は、ミスマッチ検出法により、レプチンタンパク質をコードする核酸分子における一つ以上の変異（例えばfvo39-K変異）に関して解析することができる。一般に、この方法には患者の試料からの核酸分子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅が含まれ、それに続いて、ハイブリダイゼーションの変化、異常な電気泳動ゲル移動、結合、もしくはミスマッチ結合タンパク質によって媒介される切断の検出により、または直接核酸分子シークエンシングにより、変異（すなわちミスマッチ）の同定が行われる。レプチンタンパク質をコードする変異型遺伝子の検出を容易にするためには、これらの手法のいずれもが利用でき、それぞれ当技術分野で周知である。例えばこれらの手法の例は、Oritaら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2766-2770, 1989）およびSheffieldら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:232-236, 1989）によって記載されている。

上述したように、変異の検出アッセイ法は、既存の疾病または病態の診断を容易にする上、レプチン遺伝子の変異に関連する疾患の素因を、症状が発現する前に診断する機会も提供する。例えば、正常なレプチン生物活性または発現を抑制する異常なレプチンタンパク質（またはその異常な量）をコードする遺伝子に関してヘテロ接合である患者は、該タンパク質に関連した疾患の臨床症状を示さない可能性があるが、なおもこのような疾病を発症する確率は正常より高い。そのような診断が仮定されれば、患者は有害な環境因子に対する曝露を最小限にするように予防することができ、例えば頻繁に健康診断を受けることにより、その病状を注意深くモニターすることができる。上術のように、このタイプの診断法は、出生前スクリーニングにおいてレプチンをコードする遺伝子の変異を検出するためにも用いることができる。

上述したように容易に入手できる組織由来のゲノムDNAを使用して、レプチン遺伝子の変異を検出する診断方法を実施することが好ましいと思われるが、このタンパク質をコードするmRNAまたはタンパク質自身を、このタンパク質を発現する組織試料からアッセイすることもできる。患者の該組織試料におけるレプチンをコードする遺伝子の発現レベルは、当技術分野で周知の多くの標準的な手法のいずれかを用いて決定することができ、この手法にはノーザンブロット解析および定量的PCR（例えば、Ausubelら、前記；PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Ehrlich, Ed., Stockton Press, NY；Yapら、Nucl. Acids. Res. 19:4294, 1991を参照のこと）が含まれる。

本発明のもう一つの診断方法においては、イムノアッセイを用いて、生体試料中のレプチンタンパク質のレベルを検出またはモニターする。レプチンタンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を標準的なイムノアッセイフォーマット（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、またはRIA；例えばAusubelら、前記を参照のこと）のいずれかにおいて用いることにより、レプチンタンパク質のポリペプチドレベルを測定することができる。これらのレベルは、健常人由来の試料におけるレプチンタンパク質のレベルと比較することができる。この方法を用いてレプチンタンパク質の産生が減少していることが検出されれば、例えば、レプチンタンパク質の不十分な生物活性に関与する病態または病態に対する素因があることが示唆されるかもしれない。

患者の試料におけるレプチンタンパク質の検出には、免疫組織化学的手法も用いることができる。例えば、患者から組織試料を得て、切片にし、抗レプチンタンパク質抗体および何らかの標準的な検出系（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素に結合した二次抗体を含む系）を用いてレプチンタンパク質の存在に関して染色することができる。そのような手法に関する一般的な手引きは、例えば、Bancroftら、Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982、およびAusubelら、前記に見ることができる。

レプチンに関連した疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な分子の同定
消化器系および心臓の異常な発生および機能をもたらす表現型を引き起こすようなレプチンをコードする遺伝子における変異を同定することにより、心不全等の心疾患を治療または予防するのに使用可能な分子（例えば、小さな有機もしくは無機分子、抗体、ペプチド、または核酸分子）の同定が容易になる。候補化合物が、上述したレプチンに関連する疾病または病態にもたらす効果は、例えばゼブラフィッシュの系を用いて調べることができる。上述したように、ゼブラフィッシュ、Danio rerioは、血管発生の遺伝解析に用いるのに便利な生物である。その胚は扱いやすく透明であることから、発生の初期段階から臓器機能を直接観察することができ、世代期間も短く多産である。以下に詳述するように、fvo39-K変異のようなレプチン変異を有するゼブラフィシュおよび他の生物（例えば、マウス、ショウジョウバエ、および酵母）は、これらの方法において用いることができ、よって本発明に含まれる。

本発明のスクリーニング方法の一例として、レプチンタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するゼブラフィッシュ（例えば、fvo39-K変異を有するゼブラフィッシュ）を候補化合物と接触させ、異常な消化器系または心臓の発生に及ぼすその化合物の影響、またはそのような既存の異常な状態に及ぼすその化合物の影響を、未治療の全く同一の変異型対照と比較してモニターする。

ゼブラフィッシュ系において化合物が望ましい効果を有することが示された後、消化器系または心臓の疾患の他のモデル、例えばレプチンをコードする遺伝子に変異を有するマウスまたは他の動物において、この化合物を試験することができる。または、ゼブラフィッシュの試験をやらずに、そのような動物モデル系における試験を実施してもよい。

レプチンのレベルまたは生物活性を上昇または低下させる分子の同定には、細胞培養に基づくアッセイも利用できる。ある方法では、レプチンmRNAを発現する細胞の培養液に種々の濃度で候補分子を添加する。次に、標準的な手法によりレプチンの生物活性を測定する。例えば、本明細書に記載のように、ある化合物の発生に対する影響を測定することができる。または、標準的な方法を用いてヘリカーゼ活性を測定することができる。生物活性の測定には、レプチンタンパク質レベルおよびレプチン核酸分子レベルの測定が含まれ得る。

一般に、レプチンをコードする遺伝子における変異に関連する疾患の予防または治療に用いられる新規薬剤は、天然物、合成（または半合成）抽出物、および化学物質ライブラリーの大規模ライブラリーから、当技術分野で周知の方法により同定することができる。薬剤の探索および開発分野の技術者には、被験抽出物または被験化合物の詳細な供給源が本発明のスクリーニング法に重要ではないこと、および脱反復(dereplication)法、または心疾患に対する治療活性が既に明らかな物質の反復もしくは繰り返しの除去を必要に応じて行い得ることが理解されると思われる。

被験候補化合物には、精製した（または実質的に精製した）分子または化合物の混合物（例えば、細胞由来の抽出物または上清；Ausubelら、前記）の一つ以上の成分が含まれ、該化合物には、さらに天然型または人工的な化学物質と既存の化合物の修飾物質の両方が含まれる。例えば、候補化合物は、ポリペプチド、合成有機または分子、天然有機または無機分子、核酸分子、およびそれらの成分であってよい。

天然の候補化合物の供給源には、当業者にとって容易に入手できるものが多数ある。例えば、天然化合物は、細胞（植物、真菌、原核生物、および動物を含む）抽出物、哺乳動物の血清、哺乳動物細胞を培養した増殖培地、タンパク質発現ライブラリー、または発酵培養液に見出され得る。さらに、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の状態である天然化合物のライブラリーは多くの業者から市販されており、これには、バイオティックス（Biotics）（英国、サセックス）、ゼノバ（Xenova）（英国、スラウ）、ハーバーブランチ海洋研究所（Harbor Branch Oceanographic Institute）（フロリダ州、フォートピアス）、およびファルママー（PharmaMar）、U.S.A.（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）が含まれる。さらに、例えば標準的な抽出および分画法のような当技術分野で周知の方法により、必要に応じて天然化合物のライブラリーを作製することができる。

人工的な候補化合物も、当業者にとって容易に入手できる。非常に多くの化合物をランダム合成または標的合成（例えば、半合成または全合成）する方法が多数あり、この化合物には糖類、脂質、ペプチド、および核酸分子に由来する化合物が含まれる。また、合成化合物ライブラリーは、ブランドンアソシエイツ（Brandon Associates）（ニューハンプシャー州、メリマク）およびアルドリッチケミカルズ（Aldrich Chemicals）（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から市販されている。例えば標準的な抽出および分画法のような当技術分野で周知の方法により、必要に応じて合成化合物のライブラリーも作製することができる。さらに、必要に応じて、標準的な化学的、物理的、または生化学的方法により、いかなるライブラリーまたは化合物も容易に修飾することができる。コンビナトリアル・ケミストリーを含む現代の合成化学の技術も使用することができる（Schreiber, Bioorganic and Medicinal Chemistry 6: 1172-1152, 1998; Schreiber, Science 287: 1964-1969, 2000に概説されている）。

粗抽出物がレプチン関連疾患の発症および持続に影響を与えることが判明したら、陽性を示すリード抽出物の分画をさらに行い、観察された効果をもたらす化学成分を単離することができる。つまり、抽出、分画、および精製過程の目的は、所望の活性を有する粗抽出物に含まれる化学物質の特性を慎重に決定して同定することにある。本明細書に記載の、化合物混合物中における活性を検出するアッセイ法と同様のアッセイ法を用いて、活性成分を精製し、それらの化合物の誘導体を試験することができる。このような不均一な抽出物の分画法および精製法は、当技術分野で周知である。治療に有用な薬剤であることが判明した化合物は、必要に応じて、当技術分野で周知の方法に従って化学的に修飾することができる。

一般に、レプチンの発現または活性を活性化させることが知られている化合物は、上記に列挙したもののような、消化器系または心臓の疾病または病態を予防または治療するのに用いることができる。

動物モデル系
本発明はまた、上述のスクリーニング方法を行うのに用いられる動物モデル系を提供する。これらのモデル系の例には、レプチン遺伝子に変異（例えばfvo39-K変異）を有するゼブラフィッシュ、およびマウスをはじめとする他の動物が含まれる。例えば、本発明に用いることができるゼブラフィッシュモデルには、レプチンタンパク質を産生しない変異、または切断型（例えば、終止コドンまたはスプライス部位変異の導入による）もしくは他の変化したレプチン遺伝子産物を産生する変異が含まれ得る。具体的な例として、fvo39-K変異を有するゼブラフィッシュを用いることができる（以下を参照のこと）。

レプチン関連疾病または病態の治療または予防
上記のスクリーニング方法により同定された化合物を用いて、消化器系もしくは心臓の疾病もしくは病態、または癌がある患者またはそのような心疾患を発症する危険性がある患者を治療することができる。レプチンタンパク質をコードする核酸分子およびこれらのタンパク質自身も、そのような方法において使用できる。治療は短期間必要であるに過ぎないか、または患者の生涯にわたって何らかの形で必要である可能性がある。しかし、治療が継続的に必要であるか否かは、例えば上述の診断方法により決定され得る。様々な治療を考えるに当たって、そのような治療は、好ましくは罹患器官または罹患している可能性のある器官（例えば消化器系器官または心臓）を対象に行うことを理解すべきである。そのような標的化は標準的な方法を用いて達成できる。

レプチン変異遺伝子に起因する疾患の治療または予防は、例えば変異型レプチンタンパク質の機能を調節することにより行うことができる。正常なレプチンタンパク質を適当な細胞に送達することにより、正常もしくは変異型レプチンタンパク質のレベルを変化させることにより、レプチンタンパク質をコードする変異型遺伝子をレプチンタンパク質をコードする正常遺伝子に置換することにより、またはレプチンタンパク質をコードする正常遺伝子を投与することにより、治療することもできる。同様に、レプチンタンパク質が関与する生理的経路（例えばシグナル伝達経路）を修飾することにより、レプチンタンパク質をコードする遺伝子における欠陥の影響を修正することが可能である。

変異型レプチンタンパク質をコードする遺伝子に関してヘテロ接合であると診断された患者、または該変異もしくは異常なレプチン発現を起こす可能性がある（たとえ、それらの変異または発現パターンがレプチンの発現または生物活性に未だ変化を生じていなくても）と診断された患者において、本明細書に記載のいずれかの治療をその疾患の表現型が生じる前に行うことができる。特に、変異型の表現型に対して効果を有することが示されている化合物、またはレプチンの発現を調節することが示されている化合物は、いずれかの標準的用量およびいずれかの投与経路によって、潜在的な疾患または実際の疾患であると診断された患者に投与することができる。

本発明に従って、上述したようにレプチン遺伝子、タンパク質、または抗体が同定された化合物を投与するには、適切な投与経路のいずれかを用いることができる。例えば、投与は、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、脳室内投与、関節内投与、髄腔内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾルによる投与、坐剤による投与、または経口投与が可能である。

本発明の治療用化合物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤に含めて単位剤形として投与することができる。投与は、患者の症状が出現する前または後に行うことができる。当技術分野で周知の製剤化法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18^th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton PA. に記載されている。治療用の剤形は、溶液状または懸濁液状とすることができる。非経口投与用の剤形には、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水のほか、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、植物性油、または水素化ナフタレンが含まれ得る。化合物の放出を制御するには、生体適合性があり生物分解性のある、ラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレン共重合体を用いることができる。有用と考えられる非経口送達系には、他に、エチレン‐ビニルアセテート共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが含まれる。経口投与する場合は、錠剤またはカプセル剤とすることができる。吸入用の剤形には、例えばラクトースなどの賦形剤を含むことができ、または例えばポリオキシエチレン‐9‐ラウリルエーテル、グリココール酸、およびデオキシコール酸を含む水溶液とすることができ、または点鼻薬またはゲル剤として投与する油性溶液とすることができる。または、鼻腔内投与用の剤形は、粉末剤またはエアゾル剤とすることができる。

変異型タンパク質を正常タンパク質に置換するため、または十分量のレプチンもしくは正常なレプチンタンパク質を発現しない細胞にタンパク質を加えるためには、レプチンタンパク質が発現される培養系から大量の純粋な該タンパク質を得る必要があり得る（例えば以下を参照のこと）。次に、適当なパッケージングまたは投与系を用いて、罹患組織への該タンパク質の送達を行うことができる。

遺伝子治療は、レプチン遺伝子の欠陥によって引き起こされる疾患を予防または回復させるためのもう一つの治療アプローチである。野生型レプチンタンパク質をコードする核酸分子を、十分な正常レプチンタンパク質生物活性を欠損する細胞（例えば、レプチン遺伝子に変異（例えばfvo39-K変異）を有する細胞）に送達することができる。該核酸分子は、細胞に取り込まれる形でそれらの細胞に送達されなければならず、それにより、有効なレプチンタンパク質機能を提供するのに十分なレベルのタンパク質が産生される。または、いくつかのレプチン変異に関して、該遺伝子において第二の変異を有する相同的な遺伝子の別のコピーを導入することにより、結果として生じた疾患の進行を遅らせることもしくはレプチンタンパク質活性を調節すること、変異を変化させること、または負の影響のいずれかを遮断するために別の遺伝子を使用することができるかもしれない。

形質導入するウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のベクターは、特にそれらの感染、安定な組込み、および発現の効率が高いことから、体細胞遺伝子治療に用いることができる（例えば、Cayouetteら、Human Gene Therapy 8:423-430, 1997； Kidoら、Current Eye Research 15:833-844, 1996； Bloomerら、Journal of Virology 71:6641-6649, 1997； Naldiniら、Science 272:263-267, 1996；およびMiyoshiら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照のこと）。例えば、完全長のレプチン遺伝子またはその一部をレトロウイルスベクターにクローニングし、その内在性プロモーター、レトロウイルス末端反復配列、または目的の標的細胞のタイプに特異的なプロモーターから発現を開始させることができる。使用可能なウイルスベクターには、他に、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはエプスタイン・バーウイルス等のヘルペスウイルスが含まれる（同様に、例えば、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990； Friedman, Science 244:1275-1281, 1989； Eglitisら、BioTechniques 6:608-614, 1988；Tolstoshevら、Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991； Cornettaら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987； Anderson, Science 226:401-409, 1984； Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991； Millerら、Biotechnology 7:980-990, 1989； Le Gal La Salleら、Science 259:988-990, 1993；およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995のベクターも参照のこと）。レトロウイルスベクターは、特に十分に開発され、臨床状況において用いられてきている（Rosenbergら、N. Engl. J. Med. 323:370, 1990； Andersonら、米国特許第5,399,346号）。

非ウイルスアプローチも同様に、レプチンタンパク質に関連する疾患になりやすいと予測される細胞に治療的DNAを導入するために用いることができる。例えば、レプチン核酸分子またはアンチセンス核酸分子は、リポフェクション（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987；Onoら、Neuroscience Letters 17:259, 1990； Brighamら、Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989； Staubingerら、Methods in Enzymology 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド‐ポリリジン結合（Wuら、Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988； Wuら、Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）、または外科的状況下でのマイクロインジェクション（Wolffら、Science 247:1465, 1990）によって細胞に導入することができる。

遺伝子導入は、インビトロでのトランスフェクションを含む非ウイルス手段を用いても行うことができる。そのような方法には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラスト融合の使用が含まれる。リポソームもまた、細胞にDNAを送達するためにおそらく有用となり得る。エクスビボで培養可能なタイプの細胞（例えば自系または異種の初代培養細胞またはその後代）に正常なレプチンタンパク質を導入し、その後、該細胞（またはその子孫）を標的組織に注入することにより、正常な遺伝子を患者の罹患組織に移植することもできる。

遺伝子治療法において用いられるレプチンcDNA発現は、任意の適当なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、またはメタロチオネインプロモーター）から促すことができ、任意の適当な哺乳類調節エレメントによって調節することができる。例えば、必要に応じて、特定のタイプの細胞において選択的に遺伝子発現を促進することが知られているエンハンサーを用いて、レプチン発現を促進することができる。用いるエンハンサーには、組織または細胞特異的エンハンサーとしての特徴を有するエンハンサーが含まれ得るが、これらに限定されない。または、レプチンゲノムクローンを治療構築物として用いる場合（本明細書に記載するように、そのようなクローンはレプチンcDNAとのハイブリダイゼーションによって同定可能である）、同族の調節配列、または必要ならば上述のプロモーターもしくは調節エレメントのいずれかを含む異種起源に由来する調節配列によって、調節することができる。

レプチン関連疾病の治療と同様に、レプチンタンパク質の遺伝子機能を調べるため、治療薬デザインの基礎として、アンチセンスに影響を及ぼす分子に基づく戦略を用いることができる。これらの戦略は、遺伝子発現の（転写または翻訳による）配列特異的抑制が、ゲノムDNAまたはmRNAと相補的アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションによって行われ得るという原理に基づいている。ハイブリッドRNA二本鎖の形成により、標的レプチンタンパク質コードゲノムDNA分子の転写、または標的レプチンmRNA分子のプロセシング、輸送、翻訳、もしくは安定性が妨げられる。

様々な方法により、アンチセンス戦略を実現させることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスRNAは、（例えば、静脈内注射により）細胞に取り込まれる形で被験者に直接投与することができる。または、アンチセンスRNA（またはアンチセンスRNA断片）をコードするウイルスまたはプラスミドベクターを、インビボまたはエクスビボで細胞に導入することができる。アンチセンス効果は対照（センス）配列によって誘導することができるが、表現型の変化の程度は非常に多様である。アンチセンス分子によって誘導される表現型への効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性の測定、および標的mRNAレベル等の基準の変化に基づく。

レプチン遺伝子治療は、野生型または変異型レプチンタンパク質の発現によって負の影響を受けると予測される細胞に、アンチセンスレプチンmRNAを直接投与することによっても行うことができる。アンチセンスレプチンmRNAは、標準的な技術のいずれかにより産生および単離することが可能であるが、効率の高いプロモーター（例えばT7プロモーター）の制御下にあるアンチセンスレプチンcDNAを用いてインビトロ転写することにより、最も容易に産生される。核酸分子を直接投与する上記方法のいずれかにより、アンチセンスレプチンmRNAを細胞に投与することができる。

遺伝子治療を用いてレプチンタンパク質機能を阻害する方法には、他に、抗レプチンタンパク質抗体または抗レプチンタンパク質抗体の一部を細胞内で発現させることが含まれる。例えば、レプチンタンパク質に特異的に結合し、その生物活性を阻害するモノクローナル抗体をコードする遺伝子（または遺伝子断片）を、組織特異的遺伝子制御配列の転写制御下に置くことができる。

本発明に包含される別の治療法には、罹患している可能性のある組織もしくは実際の罹患組織の部位に直接（例えば、注射によって）、または全身に（例えば、従来の組換えタンパク質投与手法によって）、組換えレプチンポリペプチドを投与することが含まれる。レプチンタンパク質の用量は、個々の患者の体格および健康状態を含む多数の要因に依存するが、一般に、薬学的に許容される剤形のいずれかで、一日当たり0.001 mgから100 mgを成人に投与する。

レプチン調節化合物、レプチンタンパク、またはレプチン核酸を患者に投与する段階を含む本明細書に記載する治療法に加えて、本発明はそのような分子の存在下で器官を培養する方法を提供する。具体的には、上記のように、レプチン変異は消化器系および心臓の異常な発生および機能に関連している。したがって、これらの分子の存在下で消化器系器官または心臓の組織を培養することにより、それらの適切な発生または機能を促進することができる。この組織は、例えば同種または異種ドナーおよび合成組織または器官から移植片として調製される組織であってよい。

レプチンタンパク質、ポリペプチド、およびポリペプチド断片の合成
分子生物学の当業者は、多種多様な発現系を用いて、組換えレプチンタンパク質を生産し得ることを理解されよう。以下に詳述するように、使用する宿主細胞の詳細は本発明に重要ではない。レプチンタンパク質は、原核生物宿主（例えば大腸菌）、または真核生物宿主（例えば、酵母（S. cerevisiae）、Sf9細胞等の昆虫細胞、またはCOS-1、NIH 3T3、もしくはHeLa細胞等の哺乳類細胞）において産生させることができる。これらの細胞は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州、ロックビルから市販されている（Ausubelら、前記も参照のこと）。形質転換法および発現媒体（例えば発現ベクター）の選択は、選択した宿主系によって変わるであろう。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えばAusubelら、前記に記載されており、発現媒体は、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A laboratory Manual, 1985, Supp. 1987において提供される発現媒体から選択することができる。本発明に使用可能な発現系の具体例については、以下に詳述する。

タンパク質を発現させるために、プラスミドをはじめとするベクターにレプチン遺伝子配列を導入し、次にこれを用いて生細胞を形質転換するという、真核生物または原核生物の発現系を構築することができる。発現プラスミドに正しい方向に挿入された全読み枠を含む完全長のレプチンcDNAを有する構築物を用いて、タンパク質を発現させることができる。あるいは、野生型または変異型のレプチン配列を含む、レプチン遺伝子の一部を挿入してもよい。原核生物または真核生物の発現系では、レプチンタンパク質の種々の重要な機能ドメインを必要であれば融合タンパク質として回収してから、結合試験、構造試験、および機能試験に使用することが可能であり、さらに抗体作製にも使用できる。

典型的な発現ベクターは、ベクターに挿入された核酸分子に対応する、大量のmRNAの合成を促すプロモーターを含む。ベクターはまた、宿主細胞内における自律的な複製を可能とする真核生物または原核生物に由来する複製起点、ベクターを含む細胞を薬剤存在下で選択可能とする、通常は毒性作用をもたらす薬剤に対する耐性を付与する配列、および合成されたmRNAの翻訳効率を高める配列も含む。長期安定型ベクターは、例えばウイルスの制御エレメント（例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のOriP配列）を用いることで、遊離の複製分子として維持される。ベクターが細胞のゲノムDNAに組み込まれた形で存在する細胞株を作製することも可能であり、この方法では、遺伝子産物を細胞内で連続的に生産することができる。

大腸菌等の細菌内において外来分子を発現させるためには、外来核酸分子、例えばレプチン核酸分子を細菌の発現ベクターに挿入する必要がある。そのようなプラスミドベクターには、細菌内におけるプラスミドの増殖、およびプラスミド内に含まれる外来DNAの発現に必要ないくつかのエレメントが含まれる。プラスミドを保持する細菌のみを増殖させるためには、毒性薬剤の存在下でプラスミドを保持する細菌の増殖を可能とする、選択マーカーコード遺伝子をプラスミド内に導入する。該プラスミドは、外来DNAから大量のmRNAの合成を促し得る転写プロモーターも含む。このようなプロモーターは、適切な条件下（例えば、プロモーターを活性化する薬剤の存在下）での培養による誘導に応じて転写を開始する誘導性プロモーターとすることができるが、それ以外のプロモーターでもよい。プラスミドはまた、遺伝子をベクター内で正しい方向に挿入しやすくするポリリンカーを含むことが好ましい。

レプチン遺伝子、もしくはその断片、融合体、またはその変異体を含む適切な発現ベクターを構築したら、例えばカルシウムリン酸トランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、またはリポソームを用いたトランスフェクション等の形質転換手法により、そのベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。本発明のベクターを導入可能な宿主細胞には、大腸菌をはじめとする細菌、酵母、真菌、昆虫細胞（例えば、発現用バキュロウイルスベクターを使用して）、マウス、ヒトをはじめとする動物由来の細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。哺乳類細胞を使用して、例えばAusubelら、前記に記載されるウイルス発現系（例えばワクシニアウイルス発現系）によりレプチンタンパク質を発現させることもできる。

クローン化されたDNAにコードされるレプチンタンパク質、融合体、ポリペプチド断片、または変異型は、T7後期プロモーター発現系を用いて、インビトロで発現させることもできる。この系は、バクテリオファージT7のDNAにコードされる酵素である、T7 RNAポリメラーゼの制御型の発現に基づく。T7 RNAポリメラーゼは、T7後期プロモーターと呼ばれる特定の23塩基対のプロモーター配列から転写を開始する。T7後期プロモーターのコピーはT7ゲノム上の複数の部位に位置するが、大腸菌の染色体DNA上には存在しない。その結果として、T7を感染させた大腸菌では、T7 RNAポリメラーゼはウイルス遺伝子の転写を触媒するが、大腸菌遺伝子の転写は触媒しない。この発現系では、最初に、lacプロモーターの隣にT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子をもつように、組換え大腸菌細胞を操作しておく。これらの細胞はIPTG存在下でT7ポリメラーゼ遺伝子を高率で転写し、大量のT7 RNAポリメラーゼを合成する。次に、これらの細胞をT7後期プロモータータンパク質のコピーを有するプラスミドベクターで形質転換する。これらの形質転換された大腸菌細胞を含む培養液にIPTGを添加すると、大量のT7 RNAポリメラーゼが産生される。このポリメラーゼは次に、プラスミド発現ベクター上のT7後期プロモーターに結合し、挿入されたcDNAの転写を高率で触媒する。個々の大腸菌細胞は多コピーの発現ベクターを含むので、クローン化されたcDNAに対応する大量のmRNAをこの系で産生させることが可能であり、結果として得られるタンパク質は放射性標識することができる。

後期プロモーターを含むプラスミドベクターならびにT3、T5、およびSP6等の類縁バクテリオファージ由来の対応するRNAポリメラーゼを使用して、クローン化したDNAからインビトロでタンパク質を生産することができる。大腸菌はまた、mGPI-2等のM13ファージを用いた発現にも使用することができる。さらに、ラムダファージの制御配列を含むベクター、または融合タンパク質の発現を促すベクター、例えばマルトース結合タンパク質の融合タンパク質もしくはグルタチオンSトランスフェラーゼの融合タンパク質も大腸菌における発現に使用できる。

真核生物の発現系は、発現タンパク質を適切に翻訳後修飾するために有用である。レプチンタンパク質を含む真核生物の発現プラスミドを真核生物の宿主細胞に一過性トランスフェクションすることにより、トランスフェクションされた宿主細胞でレプチンタンパク質を一過性に産生させることができる。レプチンタンパク質は、安定性トランスフェクションした真核生物（例えば哺乳類）の細胞株で産生させることもできる。哺乳類細胞の安定性トランスフェクションに適した多くのベクターが一般に利用でき（例えば、Pouwelsら、前記を参照のこと）、このような細胞を含む細胞株の構築法についても同様である（Ausubelら、前記を参照のこと）。

一例として、レプチンタンパク質、融合体、変異型、またはポリペプチド断片をコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターにクローン化する。プラスミドの宿主細胞染色体への組み込み、つまりfvo39-Kタンパク質コード遺伝子の宿主細胞染色体への組み込みは、細胞培養液中に0.01〜300 μMのメトトレキセートを添加することで選択する（Ausubelら、前記）。この優性選択法は、たいていの細胞種で行うことができる。DHFRを用いてトランスフェクションされた遺伝子を増幅することにより、組換えタンパク質の発現を増加させることができる。遺伝子増幅した細胞株の選択法は、Ausubelら、前記に記載されている。このような方法は、一般に、メトトレキセート濃度を徐々に増加させた培養液中で長時間培養することに関連する。最も広く使用されているDHFR含有発現ベクターは、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)である（例えばAusuelら、前記に記載されている）。上述の宿主細胞、または好ましくはDHFR欠損CHO細胞株（例えばCHO DHFR細胞、ATCCアクセッション番号CRL 9096）は、安定にトランスフェクションされた細胞株のDHFR選択またはDHFRによる遺伝子増幅に極めて好ましい細胞株の例である。

真核生物の別の好ましい発現系には、例えばクロンテック（Clontech）（カリフォルニア州、パロアルト）から入手可能なpBacPAK9ベクター等のベクターを用いるバキュロウイルスの系がある。必要であれば、この系は、例えばEvanら（Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985）に記載のmycタグ法等の他のタンパク質発現手法と併せて使用することができる。

組換えタンパク質が発現したら、細胞溶解とそれに続くアフィニティクロマトグラフィー等のタンパク質精製手法により、発現細胞からこの組換えタンパク質を単離することができる。この例では、本明細書に記載の方法で作製可能な抗レプチンタンパク質抗体をカラムに結合させ、組換えレプチンの単離に使用することができる。アフィニティクロマトグラフィーに先行するレプチンタンパク質を有する細胞の溶解および分画は、標準的な方法で行うことができる（例えばAusubelら、前記を参照のこと）。単離後、必要に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC；例えばFisher、Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, Work and Burden, Eds., Elsevier, 1980を参照のこと）により組換えタンパク質をさらに精製することができる。

本発明のポリペプチド、特に短いレプチン断片、ならびにレプチンのN末端およびC末端のより長い断片も、化学合成により（例えばSolid Phase Peptide Synthesis, 2^nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford ILに記載の方法により）作製することができる。本明細書に記載したように、ポリペプチドを発現させて精製するこれらの一般的な手法を用いても、有用なレプチン断片または類似体を作製し単離することができる。

レプチンタンパク質断片
レプチンタンパク質の様々な部分を含むポリペプチド断片は、生物学的活性に重要な役割を果たすレプチンのドメインを同定する際に有用である。本明細書で提供するヌクレオチド配列を用いてこのような断片を作製する方法は、当技術分野で周知である（例えばAusubelら、前記を参照のこと）。例えば、レプチンタンパク質断片は、レプチン核酸配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、所望のレプチン核酸分子の断片をPCR増幅することにより作製できる。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後の断片を発現ベクター（例えば哺乳類の発現ベクター、上記を参照のこと）のクローニング部位へ容易に挿入するそれぞれ1か所しかない制限酵素切断部位を含むことが好ましい。このベクターは、次に、本明細書に記載された方法をはじめとする当技術分野で周知の様々な手法のいずれかを用いて、細胞（例えば哺乳類細胞、上記を参照のこと）に導入することができ、その結果、発現ベクターを含む細胞内でレプチンタンパク質断片が産生される。レプチンタンパク質断片（例えばキメラの融合タンパク質）は、例えば後述する方法により、レプチンタンパク質の様々な領域に特異的な抗体を産生させる際にも使用することができる。

レプチンタンパク質抗体
ポリクローナル抗体を調製するためには、レプチンタンパク質、レプチンタンパク質の断片、またはレプチンタンパク質の特定の部分を含む融合タンパク質を、例えば細菌中で適切なクローニング媒体に含まれる対応DNA配列を発現させることによって合成することができる。通常は、抗体産生に用いられる抗原の供給源として融合タンパク質が使用される。大腸菌で広く用いられている発現系には、pURシリーズのベクターを用いるlacZ融合とpATHベクターを用いるtrpE融合の二つがある。タンパク質は精製後に担体タンパク質と結合させ、被接種動物における抗原応答を促進するためにフロイントアジュバントと混合し、ウサギをはじめとする実験動物に注入することができる。または、タンパク質は、レプチンを発現する培養細胞から単離することができる。2週間毎に行うブースター注射に続いて、ウサギをはじめとする実験動物から採血して血清を分離する。この血清は直接使用できるほか、プロテインAセファロース、抗原セファロース、および抗マウスIgセファロース等の試薬を用いるアフィニティクロマトグラフィーを含む様々な方法で使用前に精製することができる。次にこの血清を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画したレプチン発現組織由来のタンパク質抽出物を精査し、レプチンタンパク質を同定することができる。または、タンパク質の抗原性部分に対応する合成ペプチドを作製して、動物への接種に用いることができる。

ペプチドまたは完全長のタンパク質を例えばレプチン特異的抗体産生用に作製するためには、レプチンをコードする配列をグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST；Smithら、Gene 67:31-40, 1988）とのC末端またはN末端融合体として発現させてもよい。融合タンパク質はグルタチオン‐セファロースビーズ上で精製し、グルタチオンで溶出し、さらにトロンビンまたはファクターXa等のプロテアーゼで（作出された切断部位において）切断し、さらにウサギを良好に免疫化するのに必要な程度まで精製する。初回免疫はフロイント完全アジュバントを用いて実施し、それに続く免疫はフロイント不完全アジュバントを用いて実施するとよい。抗体の力価は、GST−レプチンタンパク質をプロテアーゼで切断したレプチンタンパク質断片を用いてウェスタンブロットおよび免疫沈降解析することにより、評価できる。免疫血清は、CNBrセファロースに結合させたレプチンを用いてアフィニティ精製することができる。抗血清の特異性は、関連のないGST融合タンパク質のパネルを用いて決定することができる。

または、モノクローナルレプチン抗体は、レプチンを発現する培養細胞から単離されたレプチンタンパク質または組織から単離されたレプチンタンパク質を抗原として用いることにより、作製することができる。レプチンを含む細胞抽出物または組換えタンパク質抽出物は、例えば、フロイントアジュバントと共にマウスに注射することができる。注射から数日後にマウスの脾臓を切除し、組織をばらばらにし、脾臓細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）に懸濁する。脾臓細胞はリンパ球の供給源となり、リンパ球の一部は適当な特異性をもつ抗体を産生すると考えられる。次に、これらを永久に増殖するミエローマ細胞と融合し、融合した細胞を多数の組織培養用ウェルにヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT）等の選択薬剤の存在下でプレーティングする。次にこれらのウェルを対象にELISAによりスクリーニングを行い、レプチンタンパク質、ポリペプチド断片、またはその変異型に結合可能な抗体を産生する細胞を含むウェルを同定する。次にこれらの細胞を再プレーティングして成長させた後に、同細胞を含むウェルのスクリーニングを再び行って抗体産生細胞を同定する。続いてこれらの細胞を再度プレーティングし、増殖させた後、これらの細胞を含むウェルを再度スクリーニングして抗体産生細胞を同定する。90％を越えるウェルが特異的抗体産生について陽性を示す単一のクローンを含むようになるまで、複数のクローニング法を実施してもよい。この手順により、抗体を産生する安定なクローン株を樹立することができる。次に、プロテインAセファロースを用いるアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ならびにこれらの手法を改変または組み合わせることにより、モノクローナル抗体を精製することができる。モノクローナル抗体の産生が認められたら、ウェスタンブロットまたは免疫沈降解析により、レプチンタンパク質に対する認識の特異性についても検討を行う（例えば、Kohlerら、Nature 256:495, 1975；Kohlerら、European Journal of Immunology 6:511, 1976；Kohlerら、European Journal of Immunology 6:292, 1976；Hammerlingら、In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, New York, NY, 1981；Ausubelら、前記を参照のこと）。

GST融合タンパク質に対する代替または補助的な免疫源として、レプチンの比較的特有な親水性領域に対応するペプチドを作製し、C末端に導入したリシンを介してキーホールリンペットヘモシニアン（KLH）に結合させることができる。個々のこれらペプチドに対する抗血清は、BSAに結合させたペプチド上で同様にアフィニティ精製することが可能であり、その特異性は、ペプチド複合物を用いるELISAおよびウェスタンブロッティング、ならびに例えばGST融合タンパク質として発現させたレプチンを用いるウェスタンブロッティングおよび免疫沈降により調べることができる。

本発明の抗体は、Jamesoら、CABIOS 4:181, 1988のアルゴリズムを用いたペプチド構造プログラム（ジェネティクスコンピューターグループ配列解析パッケージ、Program Manual for the GCG Package, Version 7, 1991）により提供されるような基準に基づく解析から、高度に保存された領域内には存在せず抗原性が強いと考えられるレプチンアミノ酸配列を用いて作製することができる。これらの断片は、標準的な手法、例えばPCRやpGEX発現ベクターへのクローン化によって作製することができる。GST融合タンパク質は、大腸菌で発現させ、グルタチオン‐アガロースのアフィニティマトリックス（Ausubelら、前記）を用いて精製することができる。ウサギのポリクローナル抗体を作製するため、およびレプチンに対して非特異的な抗血清または親和性の低い結合を示す抗血清が得られる可能性を最小限にするためには、各タンパク質について2、3種の融合体を作製し、各融合体を少なくとも2匹のウサギに注射する。好ましくは少なくとも3回のブースター注射を含む連続的な注射を行うことで、抗血清が得られる。

本発明は、完全な形のモノクローナルおよびポリクローナルの抗レプチン抗体に加え、遺伝子操作した様々な抗体、ヒト化抗体、およびF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、およびsFvの各断片を含む抗体断片を扱う。例えば切断型のモノクローナル抗体は、組換え法を使って、所望のモノクローナル抗体断片（断片群）を適切な宿主で発現するプラスミドを作製することにより産生できる。抗体は当技術分野で周知の方法でヒト化することができ、例えば所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は外注でヒト化できる（スコットジーン（Scotgene）、スコットランド；オックスフォードモレキュラー（Oxford Molecular）、カリフォルニア州、パロアルト）。トランスジェニック動物で発現される抗体等の完全なヒト抗体も、本発明に含まれる（Greenら、Nature Genetics:13-21, 1994）。

Ladner（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）は、1本鎖ポリペプチド抗体の調製法を記載している。Wardら、Nature 341, 544-546, 1989は、彼らが「シングルドメイン抗体」と呼ぶ、高い抗原結合親和性を有する重鎖可変ドメインの調製法を記載している。McCaffertyら、Nature 348:552-554, 1990は、完全な抗体Vドメインがfdバクテリオファージの表面に呈示可能であること、該ファージが抗原に特異的に結合すること、および極めて少数のファージ（100万個に1つ）がアフィニティクロマトグラフィーで単離可能であることを示している。Boss（米国特許第4,816,397号）は、単一の宿主細胞内で、免疫グロブリンならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む免疫学的に機能するそれらの断片を作製するさまざまな方法を記載している。Cabillyら、米国特許第4,816,567号は、キメラ抗体の調製法を記載している。

レプチン抗体の使用
上述した通り、レプチンに対する抗体を用いてレプチンを検出することができるほか、レプチンの生物活性を抑制することができる。例えば、抗体または抗体の一部をコードする核酸分子を細胞内で発現させ、レプチンの機能を抑制することができる。また、診断または治療に用いるために、抗体を放射性核種およびリポソーム等の化合物に結合させることができる。本明細書に記載したレプチンポリペプチドの活性を抑制する抗体は、野生型または変異型のレプチン遺伝子の不適当な発現に起因する疾患の発症を防いだり緩やかにするためにも有用である。

レプチン遺伝子発現の検出
上述したように、上記抗体を用いてレプチン遺伝子の発現を観察することができる。RNAのインサイチューハイブリダイゼーションにより、レプチン遺伝子の発現を検出することができる。RNAインサイチューハイブリダイゼーション手法は、特異的に標識された核酸プローブと、個々の細胞または組織内における細胞RNAとのハイブリダイゼーションに基づく。したがって、RNAインサイチューハイブリダイゼーションは、組織特異的および時間特異的な遺伝子発現を調べる強力な方法である。この方法では、レプチン遺伝子の特有の部分に対応するオリゴヌクレオチド、クローン化されたDNA断片、またはクローン化されたDNA断片のアンチセンスRNA転写産物を用いて、例えばマウス等の動物組織内で様々な発生段階において、特定のmRNA種を検出する。当業者に周知の他の遺伝子発現検出手法を用いて、レプチン遺伝子の発現を検出することもできる。

さらなるレプチン遺伝子の同定
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーション等の標準的な手法を用いて、他の種におけるレプチン相同体、およびヒトにおけるレプチン関連遺伝子をクローン化することができる。レプチン関連遺伝子および相同体は、ヒトのレプチンプローブまたはプライマーを用いて、ストリンジェンシーの低いDNAハイブリダイゼーションまたはストリンジェンシーの低いPCRで容易に同定することができる。ヒトのレプチンアミノ酸配列またはヒトのレプチン関連アミノ酸配列をコードする縮重プライマーを用いてRT-PCRすることにより、さらなるレプチン関連遺伝子および相同体をクローン化することができる。

トランスジェニック動物およびノックアウト動物の作製
レプチン遺伝子の特性解析を行うことで、相同組換えによりレプチンノックアウト動物モデルを作製可能とするための情報が得られる。レプチンノックアウト動物は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはマウスである。同様に、レプチンを過剰に生産する動物モデルは、標準的なトランスジェニック手法により、一つ以上の複数のレプチン配列を動物のゲノムに組み込むことで作製することができる。さらに、レプチン変異の影響（例えば優性遺伝子突然変異）は、変異したレプチンの導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いることで、または標準的な相同組換え法でそのような変異を内在性のレプチン遺伝子に導入することで、検討可能である。

ノックアウトモデルの作製に使用可能な置換型の標的ベクターは、例えば129/Sv（ストラタジーン社（Stratagene Inc.）、カリフォルニア州、ラホーヤ）等のマウス系統に由来する同質遺伝子のゲノムクローンを用いて構築することができる。胚幹（ES）細胞の適切に派生された系統に標的ベクターをエレクトロポレーションにより導入することで、末端が大きく切断された型のレプチン遺伝子を有するES細胞株を作ることが可能である。キメラの創始マウスを作製するためには、標的細胞株をマウスの胞胚期の胚に注入する。ヘテロ接合の子孫を同系交配することにより、ホモ接合の個体を得ることができる。レプチンノックアウトマウスは、レプチンが胚発生および疾患に果たす役割を調べるためのツールとなる。またこのようなマウスは、レプチンに依存する経路またはレプチンが影響を及ぼす経路にかかわる疾病または病態を回復させる治療化合物をインビボにて試験する手段を提供する。

消化器系器官または心臓の幹細胞マーカーとしてのレプチンの使用
発生の過程において、消化器系器官または心臓を生じる細胞でレプチンが発現されることから、レプチンを心臓の幹細胞マーカーとして使用することができる。例えば、レプチンを用いて、そのような幹細胞を同定、選別、または標的することができる。例えば、候補細胞のプールをレプチン発現について解析し、心臓幹細胞の同定を容易にすることが可能であり、この同定に基づきこの細胞をプールから分離することができる。単離された幹細胞は、当技術分野で周知の多くの目的に使用され得る。例えば、幹細胞は、新しい器官の産生において、器官培養において、または損傷したまたは移植された器官を強化するために使用され得る。

実験結果
化学的に突然変異誘発したゼブラフィッシュの遺伝学的スクリーニングにおいて、受精後72時間に心臓収縮性の障害を引き起こす劣性変異（fvo39-K）が同定された。罹患した胚は、発生の最初の72時間の間に、見かけ上正常な心臓収縮性有する2心腔心臓を発達させる。しかし、この直後に、心房流入路にうっ血を伴う心室収縮性の減少が観察され得る。受精後約84時間には、心臓は拍動を停止する。さらに、受精後24時間には、fvo39-k変異胚は体軸異常（カーリーダウン（curly down）を示す。受精後72時間までに、眼、顎、および腸の伸長は起こらない。これらの欠陥は、発生が進行するにつれてより明白になる。

変異胚の組織学的解析から、最も激しく影響を受ける器官は眼および消化器であることが示される。眼の大きさの縮小は、網膜における細胞死の量が増加するためであり、これはトンネル（TUNNEL）アッセイ法により受精後24時間にはじめて検出可能となる。肝臓および膵外分泌細胞もまた、顕著に縮小する。変異型の腸管上皮細胞は、扁平であり、極性がなく、多形成であり、数が減少している。心臓形態は、受精後72時間では正常であるように見える。腸脂肪酸結合タンパク質およびトリプシン等の腸の終末分化マーカーが変異胚に存在しないことから、腸および膵外分泌細胞の終末分化の障害が示唆される。

バルク法（bulked-segregant analysis）により、fvo39-kをゼブラフィッシュ連鎖群5にマッピングした。微細な遺伝子マッピングにより、fvo39-k区間はマイクロサテライトマーカーZ9419とZ26415の間に位置づけられた（図1）。その区間はYACおよびBACでカバーされ、fvo39-kを含むBAC B191g20およびB65g72をショットガンシークエンスした。さらなる微細な遺伝子マッピングにより、fvo39-k区間を1遺伝子に限定した。この遺伝子のイントロン-エクソン構造を図2に図示する。BLAST検索から、RUVB様DNAヘリカーゼであるレプチンとの高い相同性が明らかになった（図3）。したがって、本出願者らは、fvo39-K変異の存在するこの遺伝子をゼブラフィッシュレプチン遺伝子と命名した。

ホモ接合体変異体fvo39-K胚のゼブラフィッシュレプチンcDNAのシークエンシングにより、エクソン7-エクソン8境界における9塩基対の挿入が明らかとなった。これらの9塩基対は、新たなアミノ酸であるフェニルアラニン(F)、システイン(C)、およびアルギニン(R)をコードする。変異胚のイントロン7DNAのシークエンシングにより、別のスプライス受容部位を生じる、-10位での点突然変異（t→g）が明らかになった。独立した36個のcDNAクローンのシークエンシングにより、変異胚における新たなスプライス受容部位の100%の使用が実証される。野生型cDNAは検出されなかった。

野生型および変異型のゼブラフィッシュレプチンRNAを、変異胚に注入した。受精後48時間目に、体軸異常について胚をスコアリングした。変異型RNAの注入では8%（2/25）の変異胚が救出されたのに対して、単細胞胚への野生型RNAの注入では30%の変異体（6/20）を救出することができた。

ゼブラフィッシュレプチンの翻訳開始部位に対して、モルフォリノ（morpholino）アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。レプチンモルフォリノの注入により、fV039-K表現型の表現型が模写された。高用量の注入により、体軸ならびに心臓の形態および機能へのさらに顕著な効果が明らかとなった。

ゼブラフィッシュレプチンは、ショウジョウバエレプチンについて記載されているのと同様に、発生期間中、普遍的に発現される。しかし、受精後48時間目に、内胚葉由来組織（鰓弓、肝臓、膵臓、および腸）で発現の増強が観察され得る。

fvo39-k変異型ゼブラフィッシュで示されるように、レプチンは、脳（網膜）
および内胚葉発生においてならびに心臓収縮性の維持において重要な役割を果たす。ショウジョウバエオーソログの不活性化は初期幼虫の死をもたらし、このことから初期発生中のreptinの必須であり非重複性の機能が示唆される。酵母での遺伝子研究から、レプチンは分裂増殖に必須であることが示された。最近の研究から、レプチンは、β-カテニン-TCF複合体のトランス活性化を抑制することが実証されている。β-カテニンを介するトランス活性化は、正準のウィングレス（Wingless）/Wnt経路を調節する機構を構成する。Wnt遺伝子は進化的に保存された分泌タンパク質をコードし、これは多くの発生過程に重要である細胞内伝達カスケードを開始する。興味深いことに、脊椎動物の体軸形成、脳および頭蓋顔面の発生、および腸発生において、完全なwnt/β-カテニン経路の必要性が実証されている。発生における適切な心臓収縮性の維持へのWntシグナル伝達の必要性は、これまで評価されていなかった。

Wntシグナル伝達経路は、胚のパターン形成ばかりでなく、上皮癌の発症にも結びつけられている。例えば、この経路を構成的に活性化する変異は結腸癌に関連する。したがって、レプチン遺伝子は、心臓収縮性の低下、消化器疾患、および/または腸癌を診断および治療する新規標的を意味する。β-カテニン/Tcf-4を介するWntシグナル伝達がマウス腸における上皮幹細胞区画の維持に必要とされることが知られているため、レプチン活性の調節を用いて、内在性の腸幹細胞を分化した器官組織を生じる発生経路に導くこと、またはレプチン活性の調節を培養での器官の増殖に用いることができる。

その他の態様
本明細書に記載したすべての刊行物および特許出願は、それぞれの独立した刊行物または特許出願が参照として組み入れられることが特におよび個々に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。

本発明をその特定の態様とともに説明してきたが、本発明はさらなる改変が可能であり、本出願は、本発明の原理に一般に準拠しつつ、および本発明に関する技術分野の範囲内にある周知または慣習的な実践の中で起こるような本開示からの逸脱を含みつつ、本発明のいかなる変更、使用、または適合にわたることが意図されており、本明細書に上述した基本的な特徴に適用可能であり、添付の特許請求の範囲に従うことが理解されるべきである。

ゼブラフィッシュfvo39-K領域の総合的な遺伝および物理地図である。 15エクソンを含む、ゼブラフィッシュレプチン遺伝子のゲノム構造の略図である。ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、ヒト、ショウジョウバエおよび酵母レプチンのアミノ酸配列アラインメントである。 fvo39-Kにおけるイントロンの点突然変異の影響を示す略図である。ゼブラフィッシュ（それぞれ配列番号:1および2）およびヒト（それぞれ配列番号:3および4）野生型レプチンのcDNAおよびアミノ酸配列の略図である。同様に図5に、ゼブラフィッシュfvo39-K変異型のcDNAおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号:5および6）を提供する。

【配列表】

Claims

被験者由来の試料の核酸分子を解析し、被験者がレプチンをコードする遺伝子に変異を有するか否かを決定する段階を含み、変異の存在により該被験者がレプチンに関連する疾病または病態を有するまたは発症する危険性があることが示される、被験者がレプチンに関連する疾病または病態を有するか否かまたは発症する危険性があるか否かを決定する方法。
被験者が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
疾病または病態が、心臓もしくは消化器系の疾患もしくは病態、または癌である、請求項1記載の方法。
疾病または病態が心不全である、請求項4記載の方法。
変異がfvo39-K変異である、請求項1記載の方法。
レプチンをコードする遺伝子に変異を含みかつレプチンに関連する疾病または病態に特有の表現型を有する生物に化合物を接触させる段階、および該化合物の該表現型への効果を決定する段階を含み、該表現型における改善の検出により該疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物が同定されたことが示される、レプチンに関連する疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法。
レプチンに関連する疾病または病態が、心臓もしくは消化器系の疾病もしくは病態、または癌である、請求項7記載の方法。
生物がゼブラフィッシュである、請求項7記載の方法。
請求項7記載の方法を用いて同定された化合物を患者に投与する段階を含む、患者のレプチンに関連する疾病または病態を治療または予防する方法。
疾病または病態が、心臓もしくは消化器系の疾病もしくは病態、または癌である、請求項10記載の方法。
患者がレプチンをコードする遺伝子に変異を有する、請求項10記載の方法。
機能的なレプチンタンパク質または該タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを患者に投与する段階を含む、患者のレプチンに関連する疾病または病態を治療または予防する方法。
患者におけるレプチンの活性または発現を阻害する化合物または分子を患者に投与することを含む、患者における癌を治療または予防する方法。
実質的に純粋なゼブラフィッシュのレプチンポリペプチド。
配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項15記載のポリペプチド。
配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項15記載のポリペプチド。
配列番号:2の配列、および配列番号:2の配列と少なくとも95%同一である配列を含みかつレプチン活性を有するその変種を含む、実質的に純粋なポリペプチド。
ゼブラフィッシュのレプチンポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項19記載の核酸分子。
配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項19記載の核酸分子。
高ストリンジェンシー条件下で配列番号:1に示す配列の相補鎖と特異的にハイブリダイズし、レプチン活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
請求項19記載の核酸分子を含むベクター。
請求項23記載のベクターを含む細胞。
請求項19記載の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
動物がゼブラフィッシュである、請求項25記載の非ヒトトランスジェニック動物。
レプチンポリペプチドをコードする対立遺伝子の一方または両方にノックアウト変異を有する非ヒト動物。
請求項27記載の非ヒトノックアウト動物由来の細胞。
変異型レプチンポリペプチドをコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
ゼブラフィッシュである、請求項29記載の非ヒトトランスジェニック動物。
fvo39-K変異を含む、請求項30記載の非ヒトトランスジェニック動物。
レプチンポリペプチドに特異的に結合する抗体。
レプチンの活性を促進または阻害するRNAを患者に投与する段階を含む、患者においてレプチンポリペプチドの活性を調節する方法。