CN104987367A - 人工抗菌肽pr39-r1t的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法及其应用。本发明人工设计出人工抗菌肽PR39-R1T的氨基酸序列，并采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列；采用重叠区扩增基因拼接法合成目的基因，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21或Rosetta中诱导表达；表达产物经肠激酶酶切处理和镍离子亲和层析纯化后，即可获得本发明人工抗菌肽PR39-R1T。该抗菌肽具备较强的广谱抗菌活性，可抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，同时不具有溶血活性。因此，其可作为一类新型抗菌药物，在食品防腐、疾病治疗等方面具有良好的应用前景，极具开发潜力。本发明制备方法表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，稳定性好，可应用于规模化生产。

Description

人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法及其应用。

背景技术

抗生素长期在临床治疗上广泛地不恰当应用，使得许多病原菌产生了明显耐药性，现已成为威胁人类和动物健康的重大问题。更为严重的是临床上出现了多重耐药菌株，2010年发现的超级病菌NDM-1更是对绝大多数抗生素均不敏感。目前，开发一种新的抗生素一般需要10年左右，而产生一代耐药菌只需2年。抗感染形势非常严峻，开发设计新型抗菌药物已迫在眉睫。

抗菌肽是一类由宿主产生的能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分，由特定基因编码产生。其生物功能具有多样性，除了具备广谱抗菌活性外，还具备抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫等生物活性。抗菌肽广泛存在于各种生物体内，在微生物、植物和动物中均有发现并成功分离获得。在适当的浓度下，抗菌肽能够与生物膜/壁组成成分或胞内细胞器等多种微生物靶位相互作用，前者破坏细胞质膜的完整性，后者干扰细胞的正常代谢活动，最终导致细菌死亡。更重要的是抗菌肽能作为免疫效应分子，启动和调节宿主免疫防御体系，保护宿主免受病原微生物侵害。抗菌肽独特的作用机理，使得其具有抗菌谱广泛、不易产生耐药性等特点，且对目前已产生耐药性的菌株同样可发挥作用。因此，抗菌肽或能替代传统抗生素药品，扭转抗生素应用的恶性循环，是一类具备广阔的市场前景和发展潜力的新型抗菌药物。

各类动物基于适应生存环境的需要，在长期的自然选择中，逐渐形成了防御机制，即分泌多种结构特殊、功能多样的抗菌肽类物质，用以抵抗病原微生物的侵袭。在猪肠道内发现的抗菌肽PR-39，具有39个氨基酸残基，分子量约为4.2kD；在林蛙皮肤上发现的抗菌肽Ranatuerin-1T，具有33个氨基酸残基，分子量约为3.6kD。以上两种抗菌肽的天然分离物可对多种细菌、真菌和原生生物表现出杀伤作用。

生物体内抗菌肽含量较低，直接提取的工艺要求高，难度大，无法应用于规模化生产。人工化学合成虽可获得与天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正确的空间结构，且因存在昂贵的成本，使其目前仅停留在实验室试验阶段。通过基因工程途径合成人工抗菌肽是规模化生产制备的理想选择。除此之外，天然抗菌肽的生物活性不强、存在细胞毒性和溶血活性使其推广应用受到一定的限制。研究表明，杂合不同抗菌肽分子可以有效改善其生物活性，消除或降低其细胞毒性和溶血活性。迄今尚无将抗菌肽PR-39和Ranatuerin-1T杂合并进行高效表达的报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有天然抗菌肽生物活性低，且存在溶血活性的问题，提供一种具有高生物活性、无溶血活性的人工抗菌肽PR39-R1T，以及适用于规模化生产的基于大肠杆菌表达系统的高效制备方法，同时提供人工抗菌肽PR39-R1T针对多种细菌的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

根据GenBank中的抗菌肽PR-39（No. AAB20869.1）和Ranatuerin-1T（No. P82740.1）成熟肽氨基酸序列，人工设计出本发明人工抗菌肽PR39-R1T的氨基酸序列SEQ ID No.1，采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶识别位点，形成目的基因序列SEQ ID No.2。

采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因。设计两两互补的6条PCR引物，所述引物P1、P2、P3、P4、P5和P6分别具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，通过多步PCR获得目的基因。

将获得的目的基因与原核表达质粒pET-32a(+)连接，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21或Rosetta中，筛选基因工程阳性菌。添加IPTG诱导基因工程菌表达，超声波裂解菌体后进行SDS-PAGE，检测蛋白表达量。

使用肠激酶酶切处理表达产物后，通过镍离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌肽PR39-R1T。

通过微量稀释法测定人工抗菌肽PR39-R1T对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、猪链球菌2型和炭疽杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。

通过测定抗菌肽PR39-R1T针对小鼠红细胞的溶血率，判断其溶血性。

本发明具有积极有益的效果。

本发明依据GenBank中的抗菌肽PR-39和Ranatuerin-1T成熟肽氨基酸序列，人工设计出本发明人工抗菌肽PR39-R1T，并采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列，通过原核表达系统大量获取人工抗菌肽PR39-R1T。经实验证明本发明人工抗菌肽PR39-R1T具备较强的广谱抗菌活性，可抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，同时不具有溶血活性。因此，其可作为一类新型抗菌药物，在食品防腐、疾病治疗等方面具有良好的应用前景，极具开发潜力。

本发明制备方法表达效率高，分离纯化过程简单，生产成本低，稳定性好，可应用于规模化生产。

附图说明

图1  人工抗菌肽PR39-R1T溶血活性检测。

具体实施方式

实施例1：构建原核表达载体和基因工程菌。

根据GenBank中的抗菌肽PR-39（No. AAB20869.1）和Ranatuerin-1T（No. P82740.1）成熟肽氨基酸序列，将抗菌肽Ranatuerin-1T第22位的甲硫氨酸（Met）替换成色氨酸（Trp），人工设计出本发明人工抗菌肽PR39-R1T的氨基酸序列SEQ ID No.1，其中DDDDK为肠激酶酶切位点。之后采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶Xho 和BamH 识别位点，形成目的基因，序列如SEQ ID No.2所示。

设计的目的基因序列为5′-cacctcgaggatgatgatgataaacatcatcgtcgtcgtccgcgtccgccgtatctgccgcgtccgcgtccgccgccgttttttccgccgcgtctgccgccgcgtattccgccgggttttccgccgcgttttccgccgcgttttccgcatcatggtctgctgagcggtctgaaaaaagttggtaaacatgttgcaaaaaatgttgcagttagcctgtgggatagcctgaaatgtaaaattagcggtgattgtcatcatgatgatgatgataaaggatccaat-3′，总序列共有282bp，下划线分别为核酸限制性内切酶Xho 和BamH 识别位点。

采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因。设计两两互补的6条PCR引物，其中P1、P2之间，P2、P3之间，P3、P4之间，P4、P5之间和P5、P6之间均含有10个重叠碱基。所述引物P1、P2、P3、P4、P5和P6分别具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，由广州英骏生物有限公司合成。

使用上述引物进行多步PCR获得目的基因。先以P1和P2为引物扩增目的基因前面1/3部分序列，然后以P3和P4为引物扩增目的基因中间1/3部分序列，再以P5和P6为引物扩增目的基因后面1/3部分序列，最后以前三次PCR产物为模板，P1和P6为引物扩增获得目的基因的完整序列。反应体系（50μL）如下：2×Taq PCR Mastermix 25μL，上游引物和下游引物各1.0μL，ddH₂O 23μL。PCR程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃终延伸10min。反应结束后使用1.0% 琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析。产物经深圳华大基因科技服务有限公司测序，确认与设计完全一致，置于-20℃保存。

使用Xho 和BamH 核酸限制性内切酶对获得的目的基因和原核表达质粒pET-32a(+)同时进行双酶切操作。纯化酶切产物后，将目的基因片段与pET-32a(+)质粒连接，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或Rosetta中，利用氨苄西林鉴定筛选基因工程阳性菌。在200mL的LB液态培养基中添加IPTG大规模诱导基因工程菌表达目的蛋白，于4℃下5000r/min离心10min收集菌体，使用PBS清洗三次后超声波裂解菌体，12000r/min 离心15min后收集上清液进行SDS-PAGE，检测目的蛋白表达量。

实施例2：获取和纯化人工抗菌肽PR39-R1T。

使用肠激酶按下述酶切体系对表达产物进行酶切处理：10×Buffer 10.0μL，ddH₂O 38.0μL，目的蛋白50.0μL，肠激酶2.0μL，置于23℃下20h。

利用Thermo Scientific公司的HisPur Ni-NTA Spin Purification Kit，通过镍离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌肽PR39-R1T。按说明书预处理树脂柱后，加入与High-capacity nickel-IMAC resin等量的酶切处理过的上清液，置于4℃环境中结合1h后，洗脱蛋白，收集洗脱液进行SDS-PAGE检测，结果可见4.6-10.0kD之间有明显的蛋白条带，符合实验设计大小，即为人工抗菌肽PR39-R1T。通过Bradford法测定其浓度为362.50μg/mL。

实施例3：人工抗菌肽PR39-R1T生物活性检测。

通过微量稀释法测定人工抗菌肽PR39-R1T对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、猪链球菌2型和炭疽杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。具体实验步骤如下：将实验菌株制备成10⁶cfu/mL的菌液，分别加入96孔细胞培养板内，每孔90μL。使用PBS将人工抗菌肽PR39-R1T溶液分别稀释成40.0、20.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5μg/mL，并加入96孔细胞培养板内，每孔10μL。设置空白对照组仅含LB液态培养基，条件对照组仅含有实验菌株的菌液，酶切对照组添加有未经肠激酶处理的目的蛋白溶液和实验菌株的菌液。置于37℃培养箱中过夜，翌日测定每孔的OD _600 nm 值。可完全抑制细菌生长的最低溶液浓度即为人工抗菌肽PR39-R1T针对该实验菌株的MIC。将MIC以上的组按1:100比例接种LB液态培养基，并取其中100μL均匀涂布在LB固态培养基上，置于37℃培养箱中12h后，进行菌落计数。固态培养基上少于5个菌落的最高溶液浓度即为人工抗菌肽PR39-R1T针对该实验菌株的MBC。人工抗菌肽PR39-R1T对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌、以猪链球菌2型为代表的革兰氏阳性菌和目前耐药性最严重的金黄色葡萄球菌均具有生物活性，说明其具有广谱抗菌活性。

各实验菌株的MIC和MBC                                              单位：μg/mL

	大肠杆菌	金黄色葡萄球菌	枯草芽孢杆菌	绿脓杆菌	猪链球菌2型	炭疽杆菌
							MIC	1.0	4.0	2.0	1.0	2.0	8.0
MBC	2.0	6.0	4.0	2.0	4.0	10.0

未经肠激酶处理的目的蛋白针对所有实验菌株不能表现出生物活性。

实施例4：人工抗菌肽PR39-R1T溶血活性检测。

对健康小鼠进行眼球采血，将获得的小鼠血液与阿氏液等比例混合，2000r/min离心5min后弃去上清液。使用10倍体积的生理盐水洗涤小鼠红细胞3次后，使用生理盐水将其稀释成2％浓度的红细胞悬液。将人工抗菌肽PR39-R1T制备成不同浓度的稀释液，与红细胞悬液混合，37℃孵育30min后，2000r/min离心5min，测定上清液于540nm的吸收值。使用生理盐水作为阴性对照组，使用1％Triton X-100作为阳性对照组，按照540nm吸收值计算人工抗菌肽溶血率。人工抗菌肽PR39-R1T浓度为300μg/mL时，溶血率仅为10.31%，推测其针对小鼠红细胞的HC₅₀值应远远超出300μg/mL，而人工抗菌肽PR39-R1T发挥生物活性的浓度仅需1.0~10.0μg/mL，由此可以认为其不表现溶血活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方法，但本发明的实施方法并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明精神实质与原理的改变、修饰、替代、组合、简化均为等效的置换方法，包含在本发明的保护范围内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>  刘诚

 

<120>  人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法及其应用

 

<160>  8

 

<210>  1

<211>  88

<212>  PRT

<213>  人工抗菌肽PR39-R1T氨基酸序列

 

<400>  1

Asp Asp Asp Asp Lys His His Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu

1                         5                            10                          15

Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg

                  20                          25                           30

Ile Pro Pro Gly Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro His His

          35                          40                            45

Gly Leu Leu Ser Gly Leu Lys Lys Val Gly Lys His Val Ala Lys Asn

      50                           55                          60

Val Ala Val Ser Leu Trp Asp Ser Leu Lys Cys Lys Ile Ser Gly Asp

65                          70                           75                         80

Cys His His Asp Asp Asp Asp Lys

                         85

 

<210>  2

<211>  282

<212>  DNA

<213>  人工抗菌肽PR39-R1T核苷酸序列

 

<400>  2

cacctcgagg atgatgatga taaacatcat cgtcgtcgtc cgcgtccgcc gtatctgccg                               60

cgtccgcgtc cgccgccgtt ttttccgccg cgtctgccgc cgcgtattcc gccgggtttt                               120

ccgccgcgtt ttccgccgcg ttttccgcat catggtctgc tgagcggtct gaaaaaagtt                               180

ggtaaacatg ttgcaaaaaa tgttgcagtt agcctgtggg atagcctgaa atgtaaaatt                               240

agcggtgatt gtcatcatga tgatgatgat aaaggatcca at                                                            282

 

<210>  3

<211>  50

<212>  DNA

<213>  引物P1

 

<400>  3

cacctcgagg atgatgatga taaacatcat cgtcgtcgtc cgcgtccgcc                                               50

 

<210>  4

<211>  58

<212>  DNA

<213>  引物P2

 

<400>  4

ggcagacgcg gcggaaaaaa cggcggcgga cgcggacgcg gcagatacgg cggacgcg                       58

 

<210>  5

<211>  58

<212>  DNA

<213>  引物P3

 

<400>  5

cgcgtctgcc gccgcgtatt ccgccgggtt ttccgccgcg ttttccgccg cgttttcc                                    58

 

<210>  6

<211>  58

<212>  DNA

<213>  引物P4

 

<400>  6

gcaacatgtt taccaacttt tttcagaccg ctcagcagac cacgatgcgg aaaacgcg                                 58

 

<210>  7

<211>  58

<212>  DNA

<213>  引物P5

 

<400>  7

aacatgttgc aaaaaatgtt gcagttagcc tgtgggatag cctgaaatgt aaaattag                                   58

 

<210>  8

<211>  50

<212>  DNA

<213>  引物P6

 

<400>  8

attggatcct ttatcatcat catcatgatg acaatcaccg ctaattttac                                                    50

Claims (9)

1.一种人工抗菌肽PR39-R1T，其特征在于，其是如序列表中SEQ ID No.1 所示氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID No.1 所示氨基酸序列经过环化、N末端和/或C末端修饰、L-型氨基酸和D-型氨基酸互相转变、序列末端缺失中的至少一种处理而得到的功能等同的多肽。

2.一种多核苷酸，其特征在于，其是如序列表中SEQ ID No.2所示核苷酸序列或与之互补的多核苷酸，可编码SEQ ID No.1 所示氨基酸序列。

3.一种载体，其特征在于，具备权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，具备权利要求3所述的载体。

5.权利要求1所述的人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法，包括如下步骤：

（1）根据GenBank中的抗菌肽PR-39和Ranatuerin-1T成熟肽氨基酸序列，人工设计出本发明人工抗菌肽PR39-R1T的氨基酸序列SEQ ID No.1，之后采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶识别位点，形成目的基因序列SEQ ID No.2；

（2）采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因，设计两两互补的6条PCR引物，通过多步PCR获得的目的基因；

（3）将获得的目的基因与原核表达质粒pET-32a(+)连接，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21或Rosetta中，筛选基因工程阳性菌；

（4）添加IPTG诱导基因工程菌表达，超声波裂解菌体后进行SDS-PAGE，检测蛋白表达量；

（5）使用肠激酶酶切处理表达产物后，通过镍离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌肽PR39-R1T。

6.根据权利要求5所述的人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法，其特征在于，所述目的基因序列如SEQ ID No.2所示。

7.根据权利要求5所述的人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法，其特征在于，所述6条PCR引物序列如SEQ ID No.3~8所示。

8.权利要求1所述的人工抗菌肽PR39-R1T的应用，其特征在于，应用于制备抗菌剂。

9.权利要求8所述的人工抗菌肽PR39-R1T应用于制备抗菌剂，其特征在于，针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、猪链球菌2型和炭疽杆菌。