CN103159848B - 人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药生物技术领域,涉及了一种人胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的二串体蛋白及其构建方法,将人胰高血糖素样肽-2的氨基酸片段的第二位突变并应用连接肽将其两个片段串联起来,模拟GLP-2二聚体结构,应用人工合成的方法获得了其二串体蛋白的编码基因,将编码基因克隆入pET22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,在大肠杆菌中高效表达,经过硫酸铵分段盐析,阴离子交换柱层析获得了纯化的重组目的蛋白。该重组目的蛋白可以刺激Caco-2细胞,显著的促进Caco-2细胞的增殖,表明人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白具有天然生物学活性,为人GLP-2的进一步研究和广泛应用奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,具体涉及一种人胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的二串体蛋白及其构建方法、制备方法,以及该二串体蛋白的表达、纯化及鉴定、在体外的生物学活性检测等方面。
背景技术
胰高血糖素样肽-2(glucagon-likepeptide-2,GLP-2)是胰高血糖素原基因(proglucagon,PG)衍生肽类(PGDP)之一,为PG转录、翻译后处理加工的含33个氨基酸的多肽,其氨基酸残基序列为:HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。PG在胰腺A细胞和肠道L细胞都有表达,但其表达产物却因为组织特异性的加工修饰而不同。在胰腺主要产生胰高血糖素,而在肠道内主要产生PGDP(1-160个氨基酸),PGDP主要包括GLP-1、GLP-2、肠高血糖素、胃泌酸调节素等,而GLP-2定位于第126-158位氨基酸。
GLP-2和GLP-1一样由小肠和大肠的内皮细胞分泌,GLP-2的生物学活性包括:促进小肠和大肠粘膜生长、抑制肠和隐窝细胞凋亡、促进肠内葡萄糖运输和GLUT-2表达、增加营养吸收、抑制胃排空和胃酸分泌、降低肠通透性、增高肠血流量等。除此之外,GLP-2还可促进大鼠星形胶质细胞增殖和抑制骨吸收。鉴于GLP-2的上述生物学活性,其被开发用于短肠综合征、肠型放射病等疾病的治疗。值得注意的是,GLP-2只有以完整形式(1-33)存在时才有生物学活性,其在体内的半衰期只有7min,可被二肽激酶4(DPP4,又称为T细胞表面抗原CD26、DPPIV等)通过识别并水解N末端的Ala而成为无活性的GLP-2(3-33),并经由肾脏排出。GLP-2通过其特异性受体GLP-2R来发挥作用,GLP-2R下游的分子机制涉及多条信号通路,目前还没有完全明确。
1GLP-2的生成和降解
GLP-2是胰高血糖素原(PG)基因的表达产物,是胰高血糖素原衍生肽类(PGDP)之一。PG基因在胰腺A细胞和肠道L细胞都有表达,但其表达产物却因为组织特异性的加工修饰而不同。在胰腺主要产生胰高血糖素,而在肠道内主要产生PGDP(1-160个氨基酸),PGDP主要包括GLP-1、GLP-2、肠高血糖素、胃泌酸调节素等,而GLP-2定位于第126-158位氨基酸。
GLP-2在各种哺乳动物中比较保守,仅个别氨基酸有差异。GLP-2主要由肠道L内分泌细胞合成和分泌,而且受摄食、疾病引起的肠粘膜病例损伤影响。GLP-2只有以完整形式(1-33)存在时才有生物学活性,其在体内的半衰期只有7min,可被DPP4(CD26)通过识别并水解N末端的Ala而成为无活性的GLP-2(3-33),并经由肾脏排出。
2GLP-2在肠道内的生物学功能
1971年Dowling等报导一位患有胰高血糖素瘤的妇女同时表现出小肠肿大,而肿瘤切除后小肠的异常肿大随之消失。十年之后,第二例胰高血糖素瘤伴有绒毛异常增生的病例才报导出来。据报道肠绒毛异常增生和胰高血糖素瘤的关系可以被CT检测到。这些病例使得人们对于PGDP分泌的增高及其对肠道疾病相关肠损伤的反应产生了浓厚的兴趣。尽管一系列实验证明PG基因和PGDP的分泌升高有关,但PGDP种类较多,具体是哪个特异因子发挥作用一直没有确定。直到有人报道在PGDP中,GLP-2具有促进肠粘膜细胞增殖的作用,对于GLP-2的研究才拉开了序幕。
研究表明外源性GLP-2能促进小肠的生长。在体研究发现,GLP-2可通过增加肠上皮层的细胞数量来显著增加模型动物的肠重量,其机制是GLP-2可刺激肠隐窝上皮细胞增殖并抑制隐窝和绒毛细胞凋亡从而导致隐窝-绒毛高度增高引起的。最终,外源性GLP-2可以增加粘膜的功能表面区域。GLP-2对肠的显著作用在临床试验中也得到了证实。短肠综合症(SBS)的受试者服用六个星期的GLP-2或者三个星期的GLP-2类似物(Teduglutide)(0.03-0.15mg/kg/day)可增加隐窝-绒毛高度和有丝分裂指数并且提高肠内营养的吸收。相似的,给SBS患者服用20-24周的Teduglutide(0.05mg/kg/day)可以减少20-63%的肠道外营养。另一项研究表示通过评估血液中瓜氨酸的浓度,证明Teduglutide(0.05-0.2mg/kg/day)同样可以增加Crohn’s综合症患者的肠粘膜重量和高度。
有趣的是,相比外源性GLP-2对肠的生长有很强的作用,内源性GLP-2的作用比较温和。通过应用GLP-2R的竞争性抑制剂(例如GLP-2的代谢物GLP-23-33)或GLP-2R敲除小鼠,内源性GLP-2的重要性已被证实。GLP-23-33在低浓度时是GLP-2的竞争剂,高浓度时是部分抑制剂。服用GLP-23-3324小时或者4周均可降低小肠重量和隐窝-绒毛高度。
最近GLP-2促进肠功能的信号通路备受关注。研究表明GLP-2其可以CD36依赖性的方式升高小鼠和仓鼠血液中甘油三酯和胆固醇水平,促进肠apoB48分泌。在CD36缺陷小鼠中,GLP-2对肠脂类吸收的功能有所降低。这说明GLP-2具有CD36依赖性的促进肠内脂类吸收的功能。另有研究表明,GLP-2可增加猪和人肠系膜血流量,这是又一个有利于消化和营养吸收的机制。由于GLP-2对胃肠道的诸多有利效用,Teduglutide已进入临床试验用于治疗克罗恩病(II期)和短肠综合症(III期)(http://www.npsp.com)。与其它生长因子不同的是,GLP-2的促生长作用具有器官特异性(仅限于胃肠道),因此受到广泛关注。然而,在推广应用前,对于GLP-2的作用机制还有待于更深入的研究。
3GLP-2作用机制
GLP-2通过结合GLP-2R来发挥生物学作用。GLP-2R属于G蛋白偶联受体超家族,其编码基因位于人染色体17p13.3。它主要分布在胃肠道,在肺和下丘脑也有少量分布。虽然GLP-2对肠道的功能已经确证,但由于肠上皮细胞不表达GLP-2R,故其作用机制仍不甚明了。GLP-2R在肠上皮下的成纤维细胞(ISEMF)表达,由此可以推测GLP-2通过GLP-2R+细胞ISEMF分泌的下游因子间接的发挥其对肠道的作用。虽然目前用于机制研究的细胞模型还不多,但GLP-2通过旁分泌因子发挥间接作用已经初步明确。研究表明角质化生长因子和内皮NOS分别是GLP-2诱导结肠生长和提高肠血流量的介导因子。
最近更多的研究则集中在胰岛素样生长因子(IGFs)、ErbB网络和血管活性肠肽方面。IGFs(包括IGF-1和IGF-2)是能促进细胞增殖、分化的致有丝分裂多肽因子。IGFs有许多和GLP-2相似的功能。IGF-1基因敲除小鼠给于GLP-2处理,并没有表现出促隐窝细胞增殖、隐窝-绒毛长度和重量增加的反应,说明IGF-1在GLP-2促进小肠和大肠生长中起着关键作用。而IGF-2的作用相对较弱,只对粘膜表面有影响。进一步研究表明,GLP-2可提高小鼠肠内IGF-1的转录和翻译水平。Nelson等证明粘膜生长不仅依赖于IGF-1mRNA水平,而且还会受到GLP-23-33的抑制。然而,IGF-1在许多组织中都会产生,除了肠道外,在血液循环中也有。因此,需要更深入地探讨与GLP-2协同作用的IGF-1是否来源于肠道,如果是,源于哪种细胞?
除了IGFs,ErbB配体作为GLP-2促肠作用的下游因子最近逐渐引起人们的关注。ErbB网络是一种能维持肠粘膜生长和功能的强效的增殖系统。用GLP-2处理小鼠1小时和4小时之后,小肠中ErbB配体的外调蛋白和神经调节蛋白有所上调。相似的,给予GLP-2或者EGF可以提高ErbB配体、双调蛋白、外调蛋白等mRNA的水平,也可以激活c-fos、egr-1这些立早基因。此外,通过利用ErbB的抑制剂,证明ErbB受体在GLP-2促进肠增殖和生长中是必须的。最近,又有实验表明给予EGF可以使GLP-2R敲除小鼠肠得到重新生长。与此相反,也有人利用ErbB受体抑制剂gefitinib证明GLP-2增加肠重量和隐窝-绒毛高度的功能与ErbB信号无关。
目前还不知道如何协调关于ErbB相关的发现和IGF-1-IEC-IGF-1R这条通路。有研究表明,培养肠上皮下的成纤维细胞(ISEMF)时给予GLP-2可以升高IGF-1的转录水平,而不能提高ErbB配体转录,这提示ErbB位于IGF-1下游。与此相反,外源性EGF可以使GLP-2R基因敲除小鼠肠得到重新生长,而IGF-1却不行,这又暗示IGF-1系统是EGF/ErbB的下游信号。尽管如此,IGF-1R与ErbB受体有互动关系已经得到验证,说明这两个信号通路可以相互调节。通过研究其它的细胞模型也证明了这两个通路是相互依赖的。为了说明IGF-1R和ErbB在GLP-2肠促作用中的关系,还需要更多特异性的细胞模型实验。
最后,联系到粘膜下层肠神经细胞表达GLP-2R,最近有研究发现GLP-2可以通过刺激产生VIP的神经来降低肠炎和损伤。在许多有肠炎的大鼠和小鼠模型中,给予GLP-2可降低炎症因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β)的水平,并且可以促进抗炎因子IL-10的产生,与此同时增加小肠粘膜层表达VIP的神经细胞数量。与正常肠道中GLP-2可以促进有丝分裂的作用形成对比,Sigalet等观察到,在炎症模型中,GLP-2介导降低肠上皮的增殖速率,使炎症向正常转化。GLP-2或VIP处理都能提高肠重量的损失并且减少肠道损伤。另外,VIP竞争剂可以阻止GLP-2的抗炎作用。通过对IL-10无效的小鼠模型的研究证明GLP-2通过一种依赖IL-10的机制发挥降低粘膜炎症和隐窝细胞增殖的功能。虽然VIP在GLP-2降低肠道炎症疾病中发挥重要作用,但具体机制仍不清楚。
总之,GLP-2对肠的作用机制非常复杂,涉及多种下游因子(例如eNOS、ErbB配体、IGF-1、KGF和VIP),这些因子都具有细胞特异性并且依赖生物的生理或病理状态。
虽然利用动物模型实验来了解GLP-2的下游因子已经取得了许多进展,但是这些研究并不能为GLP-2R的细胞内信号机制提供信息。所以又有许多不同的细胞模型实验用来检测GLP-2R信号。与其它的B族G蛋白偶联受体一样,配体结合异种细胞表达的转染的GLP-2R可以导致cAMP剂量依赖性的升高并且激活PKA、cAMP反应元件蛋白和AP-1。此外,GLP-2对转染了GLP-2R的细胞有一种PKA依赖的促增殖作用,并且可以通过抑制糖原合酶kinase-3β和Bcl-2相关的死亡启动子来抑制凋亡。不过,利用异种和同种细胞模型得到的结果并不完全一致。虽然原代培养的小鼠粘膜细胞,肠肌肉细胞和新生小鼠内皮细胞经过GLP-2处理后cAMP水平均增高;但原代ISEMF细胞中,GLP-2对cAMP-PKA-CREB途径并没有影响;与此相似的,HeLa细胞经GLP-2处理后cAMP水平也无变化。此外,令人意外的是,在ISEMF细胞中GLP-2调节IGF-1的转录依赖于(PI3K)Akt,而此前并没有发现该途径和GLP-2R的激活相关。事实上,虽然GLP-2同样激活IEC中的PI3K/Akt信号,但被推测并不是因为GLP-2R的直接信号,IGF-1R和ErbB受体都能刺激IEC细胞PI3K/Akt信号证实了这个假设。与此相似,虽然经典的cWnt/β-catenin信号通路最近被证实与GLP-2对体内隐窝细胞的影响有关,但有可能通过IEC-IGF-1R间接作用,而不是直接和GLP-2R相关。这个想法同样被PI3K/Akt信号通过Ser的磷酸化激活肠干细胞的β-catenin和祖细胞得到了证实。因此,虽然GLP-2可以激活IEC细胞中的多条信号通路,但目前在肠内仅发现ISEMF细胞表达GLP-2R。肠神经细胞或内分泌细胞中关于GLP-2激活的信号通路仍未见报道。
4GLP-2研究中存在的问题
虽然GLP-2的肠道特异性使得其比IGF-1等其它生长因子具有更大优势,但是和其它生长因子一样,GLP-2促进肿瘤形成的影响也不容忽视。Thulesen等用GLP-2喂养用1,2-DMH诱发肿瘤的小鼠,发现GLP-2组与对照组的生存率无显著差异,但GLP-2组肿瘤体积更大。Iakoubov等利用azoxymethane在小鼠中诱导肿瘤模型并研究GLP-2的促癌变作用,发现GLP-2类似物可以增加异常隐窝的聚集并导致小鼠恶性肿瘤的形成,而GLP-2R拮抗剂,GLP-2(3-33)可以减少异常隐窝的聚集。上述实验预示着GLP-2可以促进肿瘤的形成和发展。虽然机制还不明确,但可能与cWnt和PI3K/Akt途径有关。与此相反,也有体内与体外试验表明GLP-2不能促进肿瘤的形成和发展。Koehler等用人GLP-2R转染人结肠癌细胞系并研究GLP-2的促增殖和抑凋亡作用,不管是体外细胞实验还是裸鼠移植瘤模型中,都没有发现GLP-2的作用。Bengine等利用免疫共沉淀实验研究30种结肠癌相关的肿瘤中GLP-2R的表达情况,发现只有在正常的粘膜细胞中有表达。因此,虽然GLP-2和其类似物在治疗肠道疾病时功效显著,但其致癌性还存在争议,仍然需要更深入的调查研究才能确认其安全性。
GLP-2是一种肠上皮特异性因子,在治疗肠道疾病时作用明显,目前GLP-2类似物Teduglutide治疗短肠综合症已经进入了III期临床试验。但是关于GLP-2发挥作用的分子机制还不清楚,这也是目前研究的重点和难点。此外,关于GLP-2促癌作用的争议也会影响GLP-2及其类似物进入临床应用。因此,只有明晰GLP-2作用的分子机制,才能避免GLP-2治疗肠道疾病时潜在的安全隐患。
发明内容
本发明的目的是将无法在大肠杆菌中直接表达的人胰高血糖素样肽-2以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达,并且提供一种人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白的制备方法,此方法制备的人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白具有生物学活性,促进Caco-2细胞(人结肠癌上皮细胞)的增殖,活性优于化学合成的单体,为其广泛应用奠定基础。
本发明的目的之一是提供一种重组的、分离的或合成的二串体蛋白,该二串体蛋白由两个人胰高血糖素样肽-2(GLP-2)通过连接肽连接获得。本发明对GLP-2的氨基酸序列进行了优化,用Gly代替第二位氨基酸(Ala)后,再用连接肽将突变序列进行串联设计,获得的GLP-2二串体蛋白既能保持生物学活性,又可延长体内或体外的半衰期。所述的二串体蛋白,其特征在于,所述连接肽为Gly-Ser。
所述的二串体蛋白,其中所述人胰高血糖素样肽-2的基因序列为1)~6)中任一种:
1)SEQIDNO:1所示的序列;
2)DNA分子,其编码与SEQIDNO:1所示序列所编码的多肽相比,具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽;
3)与SEQIDNO:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其酶活性片段的序列;
4)与SEQIDNO:1所示序列互补的序列;
5)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQIDNO:1所示序列的序列之一。
6)编码SEQIDNO:2所示氨基酸序列的基因序列。
所述的二串体蛋白,其中所述二串体蛋白为以下任一种:
1)其编码基因序列为SEQIDNO:2所示的序列;2)SEQIDNO:2所示序列编码的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加而衍生的多肽。
所述的二串体蛋白,其中所述二串体蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:3所示。
所述的二串体蛋白,其中所述二串体蛋白的基因序列为以下a)~f)中任一种:
a)SEQIDNO:3所示的序列;
b)DNA分子,其编码与SEQIDNO:3所示序列所编码的多肽相比,具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽;
c)与SEQIDNO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其酶活性片段的序列;
d)与SEQIDNO:3所示序列互补的序列;
e)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQIDNO:3所示序列的序列之一;
f)编码SEQIDNO:4所示氨基酸序列的基因序列。
所述二串体蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。
本发明的目的之一是提供含有上述任一二串体蛋白的表达载体或表达盒;或提供含有上述任一二串体蛋白的转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
本发明的目的之一是提供一种二串体蛋白的制备方法,该方法的步骤包括:
1)将上述任一所述二串体蛋白、或上述表达载体或表达盒、或上述转基因细胞系、重组菌或重组病毒进行重组表达,获得重组表达产物;2)纯化重组表达产物,获得所述二串体蛋白。
本发明的目的之一是提供上述任一二串体蛋白在制备预防或治疗肠道疾病的药物中的应用;其中所述肠道疾病为短肠综合征、肠型放射病、结肠癌、Crohn′s综合症、肠道炎、或克罗恩病。
本发明的目的之一是提供上述任一二串体蛋白在制备促进肠粘膜细胞增殖的药物中的应用。
本发明的目的之一是提供一种供有肠道吸收障碍的病人口服食用的组合物,其包含上述任一所述二串体蛋白,该组合物可以是食品、食品添加剂或保健品等。本发明还提供了上述任一二串体蛋白在制备促进消化或营养吸收的食品或保健品中的应用。
本发明之所以采用连接肽Gly-Ser(编码基因GCATCC),一方面,GAATTC为BamHI内切酶识别位点,有利于后期的基因克隆等的操作;另一方面,GAATTC翻译后为两个小的氨基酸残基:Gly-Ser,可以作为柔性臂,不影响两个单体肽的各自折叠成为正确的空间构象;此外,体内的生物活性分子大多采用的是二聚化以后与相应的受体结合激活信号转导通路来发挥生物学效用,因此将两个多肽连接为二串体,可以使其模拟二聚体效果而发挥更高的生物学活性;二串体蛋白分子量相对较大,容易在大肠杆菌中实现其原核表达,大大方便了其制备;二串体蛋白分子量较大,在生物体内的半衰期延长,可以有效的延长其作用时间,相对于单体而言具有更好的成药性。
本发明制备的GLP-2二串体蛋白的编码基因在大肠杆菌中获得了高水平表达,经过硫酸铵盐析和离子交换柱层析即可获得纯化的重组蛋白样品,纯化的GLP-2二串体对Caco-2细胞具有明显的促进增殖效果,其生物学活性优于化学合成单体。该发明克服了单体GLP-2无法原核表达的缺陷,经过简单的技术即可制备大量的高活性GLP-2串联体,为下一步短肠综合征和肠型放射病等动物模型治疗研究奠定一定的基础。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:利用大肠杆菌偏爱密码子,合成人胰高血糖素样肽-2二串体基因,构建人胰高血糖素样肽-2二串体基因表达载体pET-22b(+)-GLP-2②,重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达后,经盐析和离子交换作用层析纯化重组蛋白,最终获得了高纯度的人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白,并采用Westernblot和HPLC对其进行鉴定。通过Caco-2细胞增殖实验测定其活性,结果表明,人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白可促进Caco-2细胞的增殖,其促进Caco-2细胞增殖的能力高于化学合成的单体。
具体内容如下:
1.合成[Gly-2]GLP-2②基因序列
由文献可知,人体内的GLP-2容易被二酰肽酶IV(DPPIV)水解氨基末端的前两个氨基酸而失去活性,DPPIV的作用位点是GLP-2氨基末端第二位的丙氨酸残基,如果用甘氨酸残基取代后形成[Gly2]GLP-2,则能抵抗DPPIV的水解,从而延长GLP-2的半衰期。优化后的[Gly2]GLP-2的氨基酸序列为HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQIDNO:2)。依据大肠杆菌偏爱密码子,将优化后的[Gly-2]GLP-2的氨基酸序列转化为基因序列,两个重复基因之间用GGATCC(BamHI酶切位点,翻译后为GS)作为柔性臂串联,5’端引入保护碱基AG和NdeI酶切位点CATATG,3’端引入终止密码子TAA和SalI酶切位点GTCGAC,合成目的基因为[Gly-2]GLP-2②。
2.构建人胰高血糖素样肽-2二串体基因表达载体pET-22b(+)-GLP-2②
以NdeI和SalI两个限制性内切酶消化pET22b载体,1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切大片段,以NdeI和SalI两个限制性内切酶消化合成的含[Gly-2]GLP-2②基因的载体,1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切小片段,回收的pET-22b大片段和回收的[Gly-2]GLP-2②小片段用T4连接酶在16℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂板、培养,挑取单克隆,进行酶切鉴定。候选克隆进行质粒序列测定,得到含有目的基因片段的阳性克隆,称为pET22b-[Gly-2]GLP-2②。
3.人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白的表达、纯化
构建好的pET22b-[Gly-2]GLP-2②转化BL21感受态细胞,挑取单克隆培养并进行酶切鉴定,阳性克隆命名为pET22b-[Gly-2]GLP-2②/BL21。阳性克隆培养至对数生长期经1mMIPTG诱导4h后收集菌体。超声裂菌后的上清经(NH4)2SO4盐析和离子交换作用层析进行纯化。
4.人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白的鉴定
用免疫印迹的分析纯化产物的免疫反应性,用HPLC鉴定纯化产物的纯度。
5.人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白体外生物学活性检测
用MTT法检测人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白在体外对于Caco-2细胞增殖的促进作用。
附图说明
图1是重组质粒pET-22b(+)-GLP-2②的酶切鉴定图,图中M:DNAmarker;1,2:pET-22b(+)-GLP-2②/NdeI和SalI双酶切。
图2是pET-22b(+)-GLP-2②的质粒DNA测序结果图。
图3是目的蛋白质经过阴离子柱层析分离的色谱图,0:穿过峰;1,2:杂蛋白洗脱峰;3:目的蛋白洗脱峰。
图4是人GLP-2二串体蛋白的诱导表达和纯化结果,图中M:蛋白质分子量marker;1:未诱导pET-22b(+)-GLP-2②/BL21菌体总蛋白;2:1mMIPTG诱导pET-22b(+)-GLP-2②/BL214h后菌体总蛋白;3:超声裂菌上清;4:25%硫酸铵盐析上清;5:30%硫酸铵盐析沉淀;6:阴离子交换层析洗脱峰1;7:阴离子交换层析洗脱峰2;8:阴离子交换层析洗脱峰3(目的蛋白)
图5是人GLP-2二串体蛋白的免疫印迹鉴定,1:未诱导菌体总蛋白;2:1mMEDTA诱导4h后菌体总蛋白。
图6是人GLP-2二串体蛋白的HPLC鉴定结果;
图7是用MTT法测定人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白对Caco-2细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明作详细的描述。
按照本发明采用的技术方案是:利用大肠杆菌偏爱密码子,合成人胰高血糖素样肽-2二串体基因,构建人胰高血糖素样肽-2二串体基因表达载体pET-22b(+)-GLP-2②,重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达后,经盐析和离子交换作用层析纯化重组蛋白,最终获得了高纯度的人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白,并采用Westernblot和HPLC对其进行鉴定。通过Caco-2细胞增殖实验测定其生物学活性。结果表明,人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白可促进Caco-2细胞的增殖,其促进Caco-2细胞增殖的能力高于化学合成的单体。
实现上述人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白的制备方法,按照以下步骤进行:
1.合成[Gly-2]GLP-2②基因序列
由文献可知,人体内的GLP-2容易被二酰肽酶IV(DPPIV)水解氨基末端的前两个氨基酸而失去活性,DPPIV的作用位点是GLP-2氨基末端第二位的丙氨酸残基,如果用甘氨酸残基取代后形成[Gly2]GLP-2,则能抵抗DPPIV的水解,从而延长GLP-2的半衰期并增高其活性。优化后的[Gly2]GLP-2的氨基酸序列为HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQIDNO:2)。依据大肠杆菌偏爱密码子,将优化后的[Gly-2]GLP-2的氨基酸序列转化为基因序列,两段重复的基因序列用GGATCC(对应GS)串联,5’端引入保护碱基AG和NdeI酶切位点CATATG,3’端引入终止密码子TAA和SalI酶切位点GTCGAC,合成目的基因[Gly-2]GLP-2②。合成的基因序列如下:
5’-AGCATATGCATGGCGATGGCAGCTTTAGCGATGAAATGAACACCATTCTGNdeI起始码
GATAACCTGGCGGCGCGCGATTTTATTAACTGGCTGATTCAGACCAAAATTACCGATGGATCCCATGGCGATGGCAGCTTTAGCGATGAAATGAACACCATT
linker
CTGGATAACCTGGCGGCGCGCGATTTTATTAACTGGCTGATTCAGACCAAAATTACCGATTAAGTCGAC(SEQIDNO:5)
终止码SalI
2.构建人胰高血糖素样肽-2二串体基因表达载体pET-22b(+)-GLP-2②
用NdeI和SalI两个限制性内切酶酶切pET22b载体,1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切大片段,再用NdeI和SalI两个限制性内切酶酶切合成的含有[Gly-2]GLP-2②基因的pGH-GLP-2②质粒,1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切小片段,将回收的大、小片段用T4连接酶在16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒,经酶切鉴定获得预期的大、小片段(图1)。DNA测序结果显示合成的[Gly-2]GLP-2②基因成功的连接到了pET-22b载体上面(图2)。将此质粒命名为pET-22b(+)-GLP-2②。
3.人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白的表达、纯化
重组质粒pET-22b(+)-GLP-2②转化大肠杆菌BL21感受态细胞,12h后挑取边缘整齐,生长状态良好的菌落,接种于LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中,摇床37℃培养过夜,次日以1∶100的比例接种于新鲜LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中,37℃继续培养至细菌密度达到OD600=0.4~0.6,加入终浓度1mMIPTG,诱导4h后收集菌体。
按1g菌体加10ml裂菌缓冲液STE(20mMTris-HClpH7.5,100mMNaCl,1mMEDTA)的比例将菌体重悬,在冰浴中300W超声裂解菌体30min,工作5秒,间隙10秒。离心(12000rpm×20min,4℃),收集超声上清,冰浴中边搅拌边加研磨细的固体(NH4)2SO4至25%饱和度,加完后继续搅拌30min,之后4℃静置1h,离心(12000rpm×20min,4℃),收集上清。上清再边搅拌边加研磨细的固体(NH4)2SO4至30%饱和度,加完后继续搅拌30mim,之后4℃静置1h,离心(12000rpm×20min,4℃),收集沉淀。用同上清体积相同的A液:20mMTris-HClpH7.5,1mMEDTA重新溶解沉淀,然后对30倍体积A液透析,中间换液三到四次,透析后液体过0.22μm的滤膜,然后用经A液充分平衡的QSepharoseFastFlow(Pharmacia公司)层析纯化,用B液:20mMTris-HClpH7.5,1MNaCl,1mMEDTA连续梯度洗脱6个柱床体积,收集目的蛋白所在洗脱峰进行分析(图3)。将其对30倍体积PBS透析,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装后-20℃保存备用。
4.人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白鉴定
1)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
取20μl待鉴定样品加入20μL2×载样缓冲液混匀,沸水中煮10min,离心(12000rpm×10min),取10μl上清进行15%SDS-PAGE,上样后电压为30V约1h,样品进入分离胶后电压升至60V约4h,用0.5%考马斯亮兰R-250振荡染色2h,脱色直至背景清洗后进行胶的保存(图4)。
2)Western-Blot检测产物
在SDS-PAGE结束后,拆下凝胶,按照Bio-Rad产品说明,将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧,在预冷的转移缓冲液(25mMTris、192mMGlycine、20%甲醇)中100V恒压电泳1h,将蛋白转移至PVDF膜上。电转移结束后,取出PVDF膜,洗涤液TBST(20mMTris-HCl,pH7.5、150mMNaCl、0.05%Tween-20)清洗后浸入封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)中4℃封闭过夜。次日,TBST室温洗膜3次,每次5min;加入兔抗人胰高血糖素样肽-2单克隆抗体(1∶1600稀释),室温孵育1h;TBST室温洗3次,每次5min;再加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶5000),室温孵育1h;TBST室温洗3次,每次5min;最后用TBST和TBS(20mMTris-HCl,pH7.5、150mMNaCl)各洗3次,每次5min;PVDF膜按照ECL产品说明书进行显色。(图5).
3)HPLC纯度鉴定
用流动相(50mMTris-HCl1mMEDTApH7.5)平衡TSK-GelG3000SW色谱柱至基线平稳,流速为0.8ml/min,取20μl蛋白样品上样,用流动相洗脱,检测波长为280nm,记录并分析结果(图6)。
4)GLP-2②生物学活性测定
运用MTT法测定GLP-2②对于Caco-2细胞的促进增值作用。首先,将Caco-2细胞重悬于DMEM培养基(含有10%FBS和非必需氨基酸等),调节至5×104个/mL,将细胞以100uL/孔加入96孔板中。然后37℃、5%CO2孵箱中培养2小时后,加入用DMEM培养基稀释的GLP-2②100uL,设定化学合成的单体GLP-2作为阳性对照,DMEM培养基为阴性对照组。继续培养18/36/72小时,然后每孔加入20uL的MTT(5mg/mL),孵育4小时。弃去上清,每孔加入150uL的DMSO并室温孵育30分钟,用酶标仪测定490nm处光吸收值并计算活细胞的比例。
本发明的效果如下:
a)利用基因人工合成技术成功构建了人胰高血糖素样肽-2二串体基因表达载体pET-22b(+)-GLP-2②,其酶切鉴定结果与预期一致。
b)工程菌pET-22b(+)-GLP-2②/BL21经1mMIPTG诱导后便可高效表达目的蛋白,诱导后菌体的超声裂解上清经盐析和离子交换作用层析,可得到纯度大于95%的目的蛋白。
c)采用免疫印迹证明人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白可与兔抗人胰高血糖素样肽-2单克隆抗体特异性结合,HPLC分析结果表明制备的人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白纯度可达95%以上。
d)纯化的人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白与标准品人胰高血糖素样肽-2均可促进Caco-2细胞增殖,二串体的活性高于化学合成的标准品。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白及其制备方法
<130>2012
<160>5
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
catggcgatggcagctttagcgatgaaatgaacaccattctggataacctggcggcgcgc60
gattttattaactggctgattcagaccaaaattaccgat99
<210>2
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
HisGlyAspGlySerPheSerAspGluMetAsnThrIleLeuAspAsn
151015
LeuAlaAlaArgAspPheIleAsnTrpLeuIleGlnThrLysIleThr
202530
Asp
<210>3
<211>207
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgcatggcgatggcagctttagcgatgaaatgaacaccattctggataacctggcggcg60
cgcgattttattaactggctgattcagaccaaaattaccgatggatcccatggcgatggc120
agctttagcgatgaaatgaacaccattctggataacctggcggcgcgcgattttattaac180
tggctgattcagaccaaaattaccgat207
<210>4
<211>69
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
MetHisGlyAspGlySerPheSerAspGluMetAsnThrIleLeuAsp
151015
AsnLeuAlaAlaArgAspPheIleAsnTrpLeuIleGlnThrLysIle
202530
ThrAspGlySerHisGlyAspGlySerPheSerAspGluMetAsnThr
354045
IleLeuAspAsnLeuAlaAlaArgAspPheIleAsnTrpLeuIleGln
505560
ThrLysIleThrAsp
65
<210>5
<211>221
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
agcatatgcatggcgatggcagctttagcgatgaaatgaacaccattctggataacctgg60
cggcgcgcgattttattaactggctgattcagaccaaaattaccgatggatcccatggcg120
atggcagctttagcgatgaaatgaacaccattctggataacctggcggcgcgcgatttta180
ttaactggctgattcagaccaaaattaccgattaagtcgac221
Claims (9)
1.重组的、分离的或合成的二串体蛋白,其由两个人胰高血糖素样肽-2(GLP-2)通过连接肽连接获得;所述人胰高血糖素样肽-2的基因序列为1)~2)中任一种:
1)SEQIDNO:1所示的序列;
2)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQIDNO:1所示序列的序列之一;所述连接肽为Gly-Ser。
2.权利要求1所述的二串体蛋白,其中所述二串体蛋白的基因序列为a)~c)中任一种:
a)SEQIDNO:3所示的序列;
b)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQIDNO:3所示序列的序列之一
c)编码SEQIDNO:4所示氨基酸序列的基因序列。
3.权利要求1所述的二串体蛋白,其中所述二串体蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。
4.含有编码权利要求1-3任一所述二串体蛋白的基因序列的表达载体或表达盒。
5.含有编码权利要求1-3任一所述二串体蛋白的基因序列的转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
6.一种二串体蛋白的制备方法,该方法的步骤包括:
1)将权利要求1-3任一所述二串体蛋白、或权利要求4所述表达载体或表达盒、或权利要求5所述的转基因细胞系、重组菌或重组病毒进行重组表达,获得重组表达产物;
2)纯化重组表达产物,获得所述二串体蛋白。
7.权利要求1-3任一所述二串体蛋白在制备治疗肠道疾病的药物中的应用;所述肠道疾病为短肠综合征、肠型放射病或肠道炎。
8.权利要求7所述的应用,其中所述肠道炎为克罗恩病。
9.一种供有肠道吸收障碍的病人口服食用的组合物,其包含权利要求1-3任一所述二串体蛋白。
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