CN102212126B - 具有抑制内皮细胞生长活性的重组EDI-8t蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抑制内皮细胞生长活性的重组EDI-8t蛋白。本发明首次分离到该EDI-8t蛋白，并且验证了其抑制内皮细胞生长的功能以及抑制肿瘤生长的功能。因此，所述的EDI-8t蛋白具有良好的临床应用前景。

Description

具有抑制内皮细胞生长活性的重组EDI-8t蛋白

技术领域

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及重组内皮细胞生长抑制剂，其基因工程表达及临床应用。

背景技术

胶原蛋白(Collagen)又叫胶原质，是组成各种细胞外间质的聚合物，是细胞外基质最重要的组成成份，同时也是动物结构组织最主要的构造性蛋白质，主要是以不溶性纤维蛋白的形式存在。在人体的组成中，胶原蛋白约占蛋白质总量的33％，能保证并连结各种组织支撑起人体的结构。

近年来，胶原蛋白来源的血管生长抑制研究正正逐渐成为热点。1997年哈佛医学院的Folkman教授和他的团队发现了第一个胶原蛋白来源的内皮细胞生长抑制剂angiostatin(O’Reilly MS，Holmgren L，Shing Y，Chen C，Rosenthal RA，Moses M，Lane WS et al..Cell，1994，79(2)：315-328)，随后另一个抑制分子endostatin也被从尿液中提取(O’Reilly MS，Boehm T，Shing Y，Fukai N，VasiosG，Lane WS，Flynn E，Birkhead JR，Olsen BR，Folkman J.Cell，1997，88(2)：277-285)。Angiostatin和endostatin这两个内皮抑制剂分子的发现和动物实验的成功掀开了这个领域的研究热潮。随后一系列胶原蛋白来源的内皮细胞抑制剂被发现，如来源于胶原蛋白XV的Restin(Ramchandran R，Dhanabal M，Volk R，Waterman MJ，Segal M，Lu H，Knebelmann B，Sukhatme VP.BiochemBiophys Res Commun，1999，255(3)：735-739)、来源于胶原蛋白IV的canstatin(Kamphaus GD，Colorado PC，Panka DJ，Hopfer H，Ramchandran R，Torre A，Maeshima Y，Mier JW，Sukhatme VP，Kalluri R.J Biol Chem，2000，275(2)：1209-1215)等。这些分子均能专一性地抑制内皮细胞的生长，但是对正常细胞如成纤维细胞和肿瘤细胞的生长没有抑制活性。这种通过抑制血管生成抑制实体瘤的生长的方法，为治疗肿瘤提供了一种新的思路，常被形象地称作“饿死癌细胞”的疗法[Folkman J.N Eng J Med，1971，285(21)，1182-1186]。这种新思路相比以前的各种肿瘤治疗方法具有许多优点。它具有广谱的治疗范围，对绝大多数肿瘤的生长都有效，且不容易产生抗药性。目前，世界首个也是唯一一个内皮细胞抑制剂类抗癌药-恩度(endostatin)已在我国上市，取得了不错的市场反应。

然而，恩度对于内皮细胞的抑制作用还比较有限，因此，本领域还需要进一步进行研究，以开发改进的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组的内皮细胞生长抑制剂，其基因工程表达及临床应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的人内皮生长抑制蛋白-8(EDI-8t)多肽，该多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制内皮细胞生长功能的由(a)衍生的多肽。

在一个优选例中，该多肽是如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体是pPIC9。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞。更佳地，所述的宿主细胞选自：GS115和/或SMD1168。

在本发明的另一方面，提供一种多肽的制备方法，该方法包含：

(a)培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人内皮生长抑制蛋白-8(rhEDI-8t)多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽在制备抑制内皮细胞生长和/或迁移、或抑制肿瘤生长和/或转移的药物组合物中的用途。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：肝癌、肺癌。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及药学上可接受的载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了用PCR方法得到的EDI-8t基因DNA电泳图。

图2显示了重组表达菌株GpEDI-8t的发酵上清电泳图。

图3显示了EDI-8t蛋白纯品SDS-PAGE电泳图。

图4显示了EDI-8t蛋白抑制内皮细胞生长的曲线图。

图5显示了EDI-8t蛋白对内皮细胞迁移的抑制。

图6显示了流式细胞术验证EDI-8t蛋白纯品促使内皮细胞发生凋亡。

图7显示了EDI-8t蛋白对裸鼠表皮接种的肝癌细胞生长速度的影响。

具体实施方式

在本发明中，术语“EDI-8T蛋白”、“EDI-8T多肽”或“内皮生长抑制蛋白EDI-8T”可互换使用，都指具有人内皮生长抑制蛋白EDI-8T氨基酸序列(SEQID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的内皮生长抑制蛋白EDI-8T。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的EDI-8T蛋白或多肽”是指EDI-8T多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EDI-8T蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。EDI-8T多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人EDI-8T蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人EDI-8T蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人EDI-8T多肽”指具有人EDI-8T蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与人EDI-8T蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人EDI-8T蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人EDI-8T DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人EDI-8T多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人EDI-8T多肽或其片段的融合蛋白(如SEQID NO：3所示的融合蛋白，其羧基端携带6×His标签)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人EDI-8T多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人EDI-8T多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人EDI-8T蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人EDI-8T多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人EDI-8T蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EDI-8T蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人EDI-8T核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EDI-8T蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的EDI-8T多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人EDI-8T多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人EDI-8T多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在原核细胞中表达的载体，在真核细胞中表达的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人EDI-8T编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母(如毕赤酵母)；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人EDI-8T蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接作为药物抑制内皮细胞的生长和迁移；直接作为药物抑制肿瘤的生长和迁移；直接作为药物治疗EDI-8T蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗EDI-8T蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人EDI-8T蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人EDI-8T蛋白功能的多肽分子。

本发明对所述的肿瘤没有特别的限制。例如，所述的肿瘤选自：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。较佳地，所述的肿瘤选自：肝癌、肺癌。

另一方面，本发明还包括对人EDI-8T DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人EDI-8T基因产物或片段。较佳地，指那些能与人EDI-8T基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人EDI-8T蛋白的分子，也包括那些并不影响人EDI-8T蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人EDI-8T基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人EDI-8T基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人EDI-8T蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人EDI-8T蛋白功能的抗体以及不影响人EDI-8T蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人EDI-8T基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人EDI-8T基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，在使用本发明EDI-8T蛋白时，还可同时使用其他治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明EDI-8T多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约100微克/千克体重-约15毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的EDI-8T蛋白施用于哺乳动物，其中，所述的“安全有效量”指的是：所述EDI-8t的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。所述EDI-8t的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况在1-100mg的范围内选择。本发明的组合物宜包含0.1wt％(重量百分比)至10wt％的EDI-8t蛋白，最佳为0.5％至5％。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各辅剂能与活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。本发明的药物组合物中辅剂的选择取决于给药方式。

人EDI-8T蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于EDI-8T蛋白的无表达或异常/无活性的EDI-8T蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的EDI-8T蛋白，以抑制内源性的EDI-8T蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将EDI-8T基因转移至细胞内。构建携带EDI-8T基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献。另外重组人EDI-8T基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

在本发明的实施例中，本发明人根据基因工程原理，构建了含有rhEDI-8t基因序列(SEQ ID NO：1)的真核表达载体pPIC9-EDI8t。纯化的rhEDI-8t蛋白能特异性地抑制bFGF诱导的内皮细胞的生长和迁移，并引起内皮细胞凋亡。动物实验结果说明，纯化的rhEDI-8t蛋白相比对照组能显著减缓裸鼠体内实体瘤和转移病灶的生长，具有非常好的临床应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、基因序列的获得

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2显示了EDI-8t蛋白的基因和蛋白序列。取新鲜人脐带，用Trizol试剂处理抽提总RNA，溶解在RNA酶失活的无菌双蒸水中，以此为模板，用天根公司反转录试剂盒进行RT-PCR，按试剂盒说明书操作。随后以得到的反转录产物为模板，以引物1(序列为ATCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGCAAGAATGGAGGGCCA(SEQ ID NO：4)，其中划线部分为引入的XhoI切点)和引物2(序列为ATCGAATTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGCATGGGATACAATAAATA(SEQ ID NO：5)，其中划线部分为引入的EcoRI切点)为上下游引物进行PCR，获得两端带有XhoI和EcoRI酶切位点的PCR产物，DNA电泳验证结果如图1所示。其中，泳道1，DNA分子量Marker DL2000；泳道2，PCR产物。

PCR反应条件为：94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟，共30个循环。

PCR产物用XhoI和EcoRI酶(Takara)切后，和同样酶切处理的pPIC9载体(购自Invitrogen)用T4DNA连接酶(Takara)连接，16℃过夜，连接产物转化大肠杆菌Top10F(购自天根公司)感受态细胞，涂板氨苄平板，37℃培养过夜。筛选阳性克隆后经测序正确，获得阳性质粒pPIC-EDI-8t。

实施例2、基因在毕赤酵母中的表达

将上述重组质粒pPIC-EDI-8t抽提后BglII(Takara)酶切后抽提，电转化毕赤酵母表达菌株GS115(购自Invitrogen公司)，将转化产物涂布MD平板，30℃培养3-5天。

用PCR方法鉴定重组表达菌株，获得阳性克隆后通过摇瓶筛选获得重组表达菌株Gp-EDI-8t。

表达菌株进行发酵培养后，上清电泳如图2所示。

实施例3、重组蛋白纯化

将发酵液离心，超滤、在碱性条件下进行镍柱亲和层析、阴离子交换、凝胶过滤，最终得到的羧基端带有6×His Tag标签的目的蛋白，电泳验证结果如图3所示。

根据电泳和Western结果推测目的蛋白含有部分二聚体形式。

实施例4、抑制内皮细胞生长和迁移活性

用牛主动脉内皮细胞(BAEC，获自上海中医药大学)来测定EDI-8t样品的生物活性。牛主动脉内皮细胞(BAEC)培养于DMEM、10％FBS中。按2000细胞/孔接种于96孔板中，待2～3小时细胞贴壁后，吸去培基。加入100μL含2％FBS的DMEM，37℃孵育24小时。吸去培基，加入含有不同浓度rhEDI-8t蛋白样品和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(5ng/mL)的DMEM，2％FBS 200μL，37℃培养3天。每孔加入10μL 10g/L的MTT(噻唑蓝)，37℃，孵育4小时，吸去180μL培养基，加入100μL二甲亚砜，振荡溶解后测定A570nm，用Sigma Plot软件分析数据。发现加药后可特异性抑制bFGF诱导的BAEC细胞的生长，抑制活性和endostatin标准品(购自PEPROTECH公司)相同，如图4a所示。但是，EDI-8t对成纤维细胞Balb/c 3T3(购自中科院上海生化细胞所细胞库)和肝癌细胞BEL7404(购自中科院上海生化细胞所细胞库)的生长没有影响，结果见图4b。说明和endostatin一样，EDI-8t只特异性地作用于内皮细胞，对其他正常细胞的生长没有影响。

本发明人用Transwell试验测定了EDI-8t对内皮细胞迁移的影响。将6孔Transwell上的膜用明胶包被1小时，把牛主动脉细胞(BAEC)按1.0×10⁵接种在上层培养皿，培养2小时等待细胞贴壁。然后在上层培养基中加入重组内皮生长抑制蛋白(分别为6.25，25ug/mL)(n＝2)，对照组加入等体积PBS，在下层培养基中加入bFGF(10ug/mL)。37℃培养18小时后将膜取出，PBS清洗2遍，加入甲醇固定15分钟，再用PBS清洗1遍，利用棉签刮去膜上表面的细胞，这样只剩下迁移到膜下层的的细胞，再利用Gimsa染料染色30分钟，大量水冲洗后在显微镜下拍照、观察计数。结果如图5所示，6.25、25ug/ml EDI-8t加药培养18小时后，相对空白对照组加药组迁移的细胞量大大减少，说明EDI-8t可显著抑制内皮细胞的迁移。

用流式细胞仪检测细胞凋亡率，发现相比空白对照组20ug/ml rhEDI-8加药后细胞大量发生凋亡，凋亡率由5.7％增加到41.38％，如图6所示。

实施例5、抑制肿瘤生长活性

rhEDI-8t样品以50、20、5mg/kg/d剂量，按照it×24qd方案(每日皮下注射共24天)给药，对移植于裸鼠皮下的人体肝癌BEL-7404(购自中科院上海生化细胞所细胞库)的生长有明显抑制作用，其相对肿瘤增殖率分别为24.67％、33.11％、41.98％。阳性对照组恩度以20mg/kg/d剂量，相对肿瘤增殖率为30.84％。整个周期中肿瘤的体积变化见图7。

rhEDI-8t样品以50、20、5mg/kg/d剂量，对动物肿瘤B16黑色素瘤(获自上海医药工业研究院)静脉接种肺转移的试验显示了一定的抗肿瘤疗效，其肺肿瘤集落的抑制率分别为35.08％、27.02％、12.42％，见表2。而阳性对照组恩度以20mg/kg/d剂量，肺肿瘤集落的抑制率仅为9.8％。

表2、EDI-8t蛋白纯品对裸鼠肺转移模型的肺集落生成的影响

其中，相对于阴性对照，^**P＜0.01。

其中，iv×27qd表示每日静脉内注射共27天。

上述数据显示，EDI-8t蛋白可有效抑制裸鼠体内肝癌肿瘤的生长，尤其是可明显抑制肺部转移肿瘤的生长，抑制率显著高于市售药物恩度(endostatin)，具有良好的临床应用价值和药用开发潜力。

实施例6、蛋白变异体的功能验证

采用EDI-8t蛋白的变体蛋白(EDI-8t-M)，该蛋白序列如SEQ ID NO：2，不同点在于第136位由Ile变为Leu。同前述实施例1-3的方法表达和纯化该变体蛋白。

采用实施例4的方法验证EDI-8t-M的抑癌作用。结果，其也具有抑制肿瘤细胞生长和迁移的功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海普洛康裕药物研究院有限公司

<120>具有抑制内皮细胞生长活性的重组EDI-8t蛋白

<130>101433

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>417

<212>DNA

<213>智人

<400>1

ggcaagaatg gagggccagc ctatgagatg cctgcattta ccgccgagct aaccgcacct   60

ttcccaccgg tgggggcccc agtgaagttt aacaaactgc tgtataacgg cagacagaac  120

tacaacccgc agacaggcat cttcacctgt gaggtccctg gtgtctacta ctttgcatac  180

cacgttcact gcaagggggg caacgtgtgg gttgctctat tcaagaacaa cgagcccgtg  240

atgtacacgt acgacgagta caaaaagggc ttcctggacc aggcatctgg gagtgcagtg  300

ctgctgctca ggcccggaga ccgggtgttc ctccagatgc cctcagaaca ggctgcagga  360

ctgtatgccg ggcagtatgt ccactcctcc ttttcaggat atttattgta tcccatg     417

<210>2

<211>139

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Gly Lys Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Glu Met Pro Ala Phe Thr Ala Glu

1               5                   10                  15

Leu Thr Ala Pro Phe Pro Pro Val Gly Ala Pro Val Lys Phe Asn Lys

            20                  25                  30

Leu Leu Tyr Asn Gly Arg Gln Asn Tyr Asn Pro Gln Thr Gly Ile Phe

        35                  40                  45

Thr Cys Glu Val Pro Gly Val Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Val His Cys

    50                  55                  60

Lys Gly Gly Asn Val Trp Val Ala Leu Phe Lys Asn Asn Glu Pro Val

65                  70                  75                  80

Met Tyr Thr Tyr Asp Glu Tyr Lys Lys Gly Phe Leu Asp Gln Ala Ser

                85                  90                  95

Gly Ser Ala Val Leu Leu Leu Arg Pro Gly Asp Arg Val Phe Leu Gln

            100                 105                 110

Met Pro Ser Glu Gln Ala Ala Gly Leu Tyr Ala Gly Gln Tyr Val His

        115                 120                 125

Ser Ser Phe Ser Gly Tyr Leu Leu Tyr Pro Met

    130                 135

<210>3

<211>145

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Gly Lys Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Glu Met Pro Ala Phe Thr Ala Glu

1               5                   10                  15

Leu Thr Ala Pro Phe Pro Pro Val Gly Ala Pro Val Lys Phe Asn Lys

            20                  25                  30

Leu Leu Tyr Asn Gly Arg Gln Asn Tyr Asn Pro Gln Thr Gly Ile Phe

        35                  40                  45

Thr Cys Glu Val Pro Gly Val Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Val His Cys

    50                  55                  60

Lys Gly Gly Asn Val Trp Val Ala Leu Phe Lys Asn Asn Glu Pro Val

65                  70                  75                  80

Met Tyr Thr Tyr Asp Glu Tyr Lys Lys Gly Phe Leu Asp Gln Ala Ser

                85                  90                  95

Gly Ser Ala Val Leu Leu Leu Arg Pro Gly Asp Arg Val Phe Leu Gln

            100                 105                 110

Met Pro Ser Glu Gln Ala Ala Gly Leu Tyr Ala Gly Gln Tyr Val His

        115                 120                 125

Ser Ser Phe Set Gly Tyr Leu Leu Tyr Pro Met His His His His His

    130                 135                 140

His

145

<210>4

<211>46

<212>DNA

<213>引物

<400>4

atcgctcgag aaaagagagg ctgaagctgg caagaatgga gggcca      46

<210>5

<211>49

<212>DNA

<213>引物

<400>5

atcgaattca ttagtgatgg tgatggtgat gcatgggata caataaata   49

Claims (8)

1.一种分离的人内皮生长抑制蛋白-8多肽，其特征在于，该多肽是如SEQID NO:2氨基酸序列的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列如SEQID NO:1所示。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体。

6.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)培养权利要求5所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人内皮生长抑制蛋白-8多肽。

7.权利要求1所述的多肽在制备抑制内皮细胞生长和/或迁移、或抑制肿瘤生长和/或转移的药物组合物中的用途；所述的肿瘤为肝癌或肺癌。

8.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

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