CN1207046A - Ix型胶原蛋白和嵌合体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型人胶原蛋白、编码这些新型胶原蛋白的多聚核苷酸序列以及这些新型蛋白和多聚核苷酸在诊断和治疗疾病方面的用途。本发明还涉及特定胶原蛋白和衍生物,具体地说涉及Ⅸ型胶原蛋白与Ⅱ型和/或XⅠ型胶原蛋白的融合蛋白,以及将它们做为治疗剂的用途。

Description

IX型胶原蛋白和嵌合体

I.技术领域

本发明涉及新型人胶原蛋白、编码这些新型胶原蛋白的多聚核苷酸序列以及这些新型蛋白在疾病的诊断和治疗方面的用途。更准确地说，本发明涉及编码人α3(IX)胶原蛋白及其衍生物多聚核苷酸、IX型胶原蛋白与II和/或XI型胶原蛋白亚基的融合蛋白及其衍生物、以及这些蛋白和多聚核苷酸作为诊断和治疗剂的用途。

II.背景技术

胶原原纤维、蛋白聚糖聚集体和糖蛋白是软骨胞外基质的重要组分，它们集体地抵抗关节动作时产生的压力、拉力和剪切力。Heinegird和Oldberg，FASEB J.3：2042-2051(1989)；Mayne和Brewton，软骨退化：基础和临床方面(Cartilage Degradation：Basic and ClinicalAspects)(Woessner，J.F.和Howell，D.S.eds.)Marcel Dekker，Inc.，NewYork，第81-108页(1993)。影响这些各种基质组分的生物合成、装配或它们之间相互作用的软骨基质基因突变可能为软骨基质退化和丧失正常软骨功能的原因之一。人胶原蛋白突变已经表现出引起一系列软骨发育异常，严重程度从致命的II型软骨成长不全到Stickler关节眼病和早发性家族性骨关节炎(由Spranger等综述，Eur.J Pediatr.153：56-65(1994)；Vikkula等，Ann.Medicine 26：107-114(1994)；Prockop和Kivirikko，Annu.Rev.Biochem.64：403-434(1995))。

对IX型胶原蛋白的分析证明该分子位于透明软骨和包括玻璃体液在内的其他组织的含有II型胶原原纤维的表面(由Brewton和Mayne综述，胞外基质的装配和结构(Extracellular Matrix Assembly andStructure)(Yurchenco，P.D.，Birk，D.E.，Mecham.R.P.，eds)AcademicPress，Inc.，San Diego，第129-170页(1994))。IX型胶原蛋白是一异三聚体，由三个多肽亚基组成：α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)，这些多肽亚基是独特基因的产物，含有交替的非三股螺旋或非胶原域(NC1-4)和三股螺旋或胶原域(COL1-3)。这三个多肽亚基以a(IX)α2(IX)α3(IX)的结构装配为成熟的胶原蛋白分子(van der Rest和Mayne，胶原蛋白类型的结构和功能(Structure and Function of Collagen Types)(Mayne，R.和Burgeson，R.，eds.)学术出版社，Orlando，FL，第195-221页(1987)。除II型和IX型胶原蛋白外，多种来源的透明软骨也含有显著量的至少三种其它胶原蛋白分子，即VI、X和XI型。Thomas等，Ann.Rheumat.Diseases 53：488-496(1994)；Mayne和Brewton，软骨退化：基础和临床方面(Cartilage Degradation：Basic and Clinical Aspects)(Woessner，J.F.和Howell，D.S.eds.)Marcel Dekker，Inc.，New York，第81-108页(1993)。XI型胶原蛋白与IX型胶原蛋白类似，是一异三聚体，由三个不同的多肽亚基组成，即α1(XI)、α2(XI)和α3(XI)。从牛关节软骨中也分离出XII型和XIV型胶原蛋白。

天然IX型胶原蛋白分子高度特异性地与II型胶原蛋白分子相互作用，使得NC1、COL1、NC2、COL2和NC3域沿着胶原原纤维的表面分布。IX型胶原蛋白和II型胶原蛋白间的相互作用被由特定赖氨酸残基形成的多个共价交联所稳定。参见van der Rest和Mayne，J.Biol.Chem.263：1615-1618(1988)；Shimokomaki等，Ann.N.Y. Acad.Sci.580：1-7(1990)；Wu等，J.Biol.Chem.267：23007-23014(1992)。通过旋转投影法可以容易地见到IX型胶原蛋白沿II型胶原原纤维表面的周期性定位，因为胶原域COL3和大球形域NC4从该原纤维的表面突出。Vaughan等，J.Cell Biol.106：991-997(1988)；Shimokomaki等，Ann.N.Y.Acad.Sci.580：1-7(1990)。与之对照，XI型胶原蛋白异三聚体据认为位于该原纤维的中心部位。Mendler等，J.Cell Biol.108：191-97(1989)。

人II型胶原蛋白基因和三种人XI型胶原蛋白基因的克隆和测序已有报道。完整的人II型胶原蛋白基因序列由Baldwin等报道，Biochem.J.262：521-28(1989)，和由Su等报道，Nucleic Acids Res.17：9473(1989)。在这三种XI型胶原蛋白亚基中，据信α3(XI)链是II型胶原蛋白基因产物。Bernard等，J.Biol.Chem.263：17159-66(1988)公开了号称编码前α1(XI)胶原蛋白的cDNA序列。编码α2(XI)基因的序列由Kimura等报道，J.Biol.Chem.264：13910-16(1989)。

编码IX型胶原蛋白的三条链的基因是影响关节和/或玻璃体液的软骨发育异常和退化性失调的优秀候选物，因为IX型胶原蛋白在这二种组织中都是重要的结构分子。因此，大量研究工作的目标是克隆编码这三种IX型胶原蛋白亚基的基因。Muragaki等，Eur.J.Biochem.192：703-8(1990)提出人α1(IX)基因两个交替转录物的完整cDNA序列。大多数人α2(IX)胶原蛋白cDNA由Perala等报道，FEBS Lett.319：177-80(1993)，由Warman完成，Genomics 23：158-62(1994)。直到最近才得到完整的人α3(IX)亚基序列。正如同时提交的申请(待转让的美国专利申请)所描述的，R.W.Brewton和R.Mayne博士已经鉴定和记述了对应于人α3(IX)全长度序列的特征。Brewton和Mayne的临时申请内包含的资料通过引用结合到本文中。

使用转基因鼠的实验提示IX型胶原蛋白在保持透明软骨的完整性方面起重要的作用。表达携带α1(IX)链中一个缺失的小基因(Nakata等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：2870-2874(1993))或携带分裂的α1(IX)基因(Fessler等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：5070-5074(1994))的动物发生类似于人类骨关节炎的退化性关节疾病。IX型胶原蛋白在人类疾病中的重要性已被鉴别出的一个COL9A2内的突变所证实(Muragaki等，已提交申请，(1995))，该突变导致跳过外显子3从而导致多发性骨骺发育异常(EDM2)。

III.本发明摘要

本发明涉及新型胶原蛋白衍生蛋白和编码它们的多聚核苷酸序列。本发明也描述了由胶原蛋白合成或结构异常导致的疾病的诊断方法。

本发明的一个方面是发现可以制备人IX型胶原蛋白的融合蛋白，其中人IX型胶原蛋白亚基与人II型胶原蛋白和/或人XI型胶原蛋白亚基共价连接。在本发明的一个实施方案中，通过将人IX型胶原蛋白亚基的多聚核苷酸编码序列与人II型胶原蛋白和/或人XI型胶原蛋白的多聚核苷酸编码序列在框架中连接起来，以嵌合体形式重组产生该融合蛋白。将此嵌合编码序列插入一表达载体并用于转化合适的宿主细胞。然后诱导该宿主细胞表达该嵌合编码序列，因而产生该嵌合胶原融合蛋白。这些融合蛋白可用于治疗胶原相关疾病和状态。

本发明也部分涉及编码本发明嵌合胶原蛋白的核苷酸序列和表达载体。

本发明也公开了与胶原蛋白产生或对胶原蛋白自身免疫性的异常有关的疾病或状态的治疗方法。这些异常可以导致例如类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、自身免疫性听觉疾病、由细菌或病毒感染引起的软骨炎症(例如莱姆病)、寄生虫病、滑囊炎、角膜病和关节强硬性脊椎炎(脊柱融合)。本发明的新蛋白质用于与胶原蛋白相关疾病的治疗方法中。

IV.附图简述

图1.在非还原性8％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中重组人IX型胶原蛋白α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)异三聚体的盐分级分离

图2.在还原性10％SDS-PAGE中重组人IX型胶原蛋白α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)异三聚体的盐分级分离

V.本发明详细说明

本发明涉及编码IX型胶原蛋白衍生物与II型胶原蛋白和/或XI型胶原蛋白的重组融合蛋白的多聚核苷酸和核酸序列以及这些融合蛋白。本发明也包括使用这些胶原融合蛋白治疗与胶原蛋白有关的疾病和状态的方法。

A.定义

名词“胶原蛋白亚基”指由单个基因编码的胶原蛋白的一个亚基的氨基酸序列以及衍生物，包括缺失衍生物、保守置换等。

“融合蛋白”是一由不同蛋白的肽序列共价连接起来的蛋白。

名词“嵌合体”或“嵌合的”指通过将二个或更多的胶原蛋白亚基的多聚核苷酸编码序列可操作地在框架中连接并将连接的编码序列作为单个肽链重组表达产生的融合蛋白。

“活性人IX型胶原蛋白”指天然的三聚体蛋白复合物，可以重组产生。

本文使用的短语“严格条件”指那些杂交条件，即(1)采用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，温度50℃；(2)在杂交过程中采用诸如甲酰胺之类的变性剂，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％(体积/体积)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5含750mMNaCl、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液，温度42℃；或(3)采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl，0.075M焦磷酸钠，5×Denhardt′s溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，温度42℃，于42℃在0.2×SSC和0.1％SDS中清洗。

按照本发明，任何编码要求保护的融合蛋白氨基酸序列的核酸序列均可以用于产生指导该融合蛋白表达的重组分子。

本文使用与胶原蛋白有关的“纯化”一词表示所指分子的环境中实际上不存在其它生物大分子，例如多聚核苷酸、蛋白质等等。本文使用的“纯化”优选表示存在至少95％、更优选至少99.8％的所指生物大分子(但是水、缓冲液和其它小分子，特别是分子量小于1000道尔顿的分子可以存在)。本文中所用的“分离”一词指一蛋白分子不仅与存在于该蛋白天然来源的其它蛋白质分离，而且也与其它蛋白质分离，最好指仅仅在溶剂、缓冲液、离子、或其它在同一溶液中正常存在的其它组分存在下发现的蛋白质。名词“分离”和“纯化”不包括存在于其天然来源之中的蛋白质。

B.本发明的胶原融合蛋白的表达

1.编码序列

按照本发明，可以用编码IX型、II型和XI型胶原蛋白、或其功能等价物的多聚核苷酸顺序，产生指导IX型胶原蛋白亚基与II型胶原蛋白和/或XI型胶原蛋白亚基的融合蛋白，或其功能等价物在适当宿主细胞中表达的重组DNA分子。这类胶原蛋白多聚核苷酸序列以及其它选择性地与这类胶原蛋白多聚核苷酸或其互补物的至少一部分杂交的多聚核苷酸，也可以用于核酸杂交测定、Southern和Northern印迹分析等。

由于遗传密码的固有简并性，编码实际上相同或功能相同的氨基酸序列的其它DNA序列亦可用于本发明克隆和表达这些胶原蛋白的实践之中。这类DNA序列包括在严格条件下可以与适当的人胶原蛋白序列杂交的那些序列。

可以按照本发明使用的改变的DNA序列包括不同核苷酸残基的缺失、添加或置换，它们产生的序列编码相同或功能相同的基因产物。该基因产物本身在一胶原蛋白序列中可以包括氨基酸残基的缺失、添加或置换，导致沉默变化从而产生同等功能的胶原蛋白。这类氨基酸置换可以在相关残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质相似的基础上进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具相似亲水性值、带有无电荷极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的DNA序列可以进行遗传工程以改变该胶原蛋白编码序列使其具有各种末端，包括但不局限于修饰该基因产物加工和表达的改变。例如，交替分泌信号可代替天然的人分泌信号，并且/或者采用本领域已知的技术如定点诱变引入突变，以插入新的限制位点，改变糖基化方式、磷酸化等。另外，当在非人体细胞中表达时，可以在任何氨基酸三联密码子的沉默位置修饰编码本发明胶原蛋白的多聚核苷酸，以更好地符合特定宿主生物对密码子的选择性。

在本发明的另一个实施方案中，可以将胶原蛋白序列连接到异源序列上以编码融合蛋白。例如，可以对一融合蛋白做工程改造，使其在α3(IX)胶原蛋白序列和异源蛋白序列之间有一切割位点，以使该α3(IX)胶原蛋白可以与该异源部分切开。

在一特别优选的实施方案中，通过将编码IX型胶原蛋白亚基或其衍生物的序列与编码II型胶原蛋白和/或XI型胶原蛋白亚基的序列连接，构建嵌合融合蛋白。本领域技术人员知道有几种现成技术可以用于将IX型胶原蛋白亚基编码序列的全部或任何部分与II型和XI型胶原蛋白的编码序列的全部或任何部分相连接。例如，可以在适当选择的限制性核酸内切酶位点将编码序列连接起来。然而，为确保选定胶原蛋白的编码顺序连接在正确的翻译框架中，有必要用位点特异性诱变对限制性位点进行工程改造。连接二个或多个多聚核苷酸序列的更优越的方法是按照Ausubel等，分子生物学现行方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.，(1990)第3.17.1节所述，利用聚合酶链式反应和适当设计的引物。采用该方法，本领域技术人员可以以任何构型连接二个或更多的多聚核苷酸序列。

在本发明的另一实施方案中，可以用本领域的已知化学方法全合成或部分合成本发明胶原蛋白的编码序列。参见例如Caruthers等，Nuc.Acids Res.Symp.Ser.7：215-233(1980)；Crea和Horn，Nuc.Acids Res.9(10)：2331(1980)；Matteucci和Caruthers，Tetrahedron Letters 21：719(1980)；和Chow和Kempe，Nuc.Acids Res.9(12)：2807-2817(1981)。或者，可以采用化学方法至少部分合成所需的胶原蛋白氨基酸序列来制备蛋白本身。例如，用固相技术合成肽，将肽从树脂切下，用制备型高效液相色谱纯化肽。(例如参见Creighton，蛋白、结构和分子原理(Proteins，Structures And Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，第50-60页(1983)。可以通过氨基酸分析或测序确认合成肽的组成(例如埃德曼降解法；参见Creighton，蛋白，结构和分子原理(Proteins，Structures And Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，第34-49页(1983)。

为表达本发明的胶原蛋白，将编码该胶原蛋白或功能等价物的核苷酸序列插入适当的表达载体，即包含该插入编码序列转录和翻译所必需元件的载体。

2.表达系统

可以用本领域技术人员熟知的方法构建包含本发明胶原蛋白的胶原蛋白编码序列和适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如，Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，N.Y.(1989)和Ausubel等，分子生物学现行方法(Current Protocols in MolecularBiology)，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)描述的技术。

可以使用多种宿主-表达载体系统表达胶原蛋白编码序列。它们包括但不限于微生物，如用重组噬菌体DNA转化的细菌、包含一胶原蛋白编码序列的质粒DNA或粘粒DNA表达载体；用包含一胶原蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌；用包含本发明胶原蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含一胶原蛋白序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用包含一胶原蛋白序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。另外，本发明的胶原蛋白可以在非人类转基因动物中表达，其中可以从该转基因动物的乳汁中回收所需的胶原蛋白产物。这些系统的表达元件在其强度和专一性方面变化。根据所用的宿主/载体系统，任何适用的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子，都可以用于表达载体中。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诸如噬菌体1的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂种启动子)之类的诱导型启动子；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用诸如杆状病毒多面体启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可以使用得自植物细胞基因组的启动子(例如，热休克启动子；RUBISCO小亚基启动子；叶绿素a/b结合蛋白启动子)或得自植物病毒的启动子(例如CaMV的35S RNA启动子；TMV外壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用得自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)；当制备包含多拷贝胶原蛋白DNA的细胞系时，可以使用带有适当选择性标记的以SV40、BPV和EBV为基础的载体。

在细菌系统中，可以根据所表达胶原蛋白的用途，优选一些表达载体。例如，当欲生产大量本发明胶原蛋白以制备抗体时，则可能所需的是指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这类载体包括但不局限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2：1791(1983))，其中可以将胶原蛋白编码序列连接到该载体具有lac Z编码区的框架中以产生杂种AS-lac Z蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.264：5503-5509(1989))等等。亦可以用pGEX载体以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白表达外源多肽。总之，这类融合蛋白可以是可溶性并可易于通过吸附于谷胱甘肽-琼脂糖颗粒而后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱的方法从溶胞中纯化。将pGEX载体设计为含有凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶酶切位点，以使所需的克隆多肽能从GST部解释放出来。

优选的表达系统是酵母表达系统。在酵母中，可以使用一些包含组成型或诱导型启动子的载体。参见综述，分子生物学现行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第二卷，Ed.Ausubel等，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，第13章(1988)；Grant等，酵母表达和分泌载体(Expression and Secretion Vector fod Yeast)，酶学方法(Methods in Enzymology)，Ed.Wu & Grossman，学术出版社，N.Y.153：516-544(1987)；Glover，DNA克隆(DNA Cloning)，第II卷，IRL出版社，Wash.，D.C.，第3章(1986)；和Bitter，酵母属酵母中的异源基因表达(Heterologous Gene Expression in Yeast)，酶学方法(Methods inEnzymology)，Eds.Berger和Kimmer，学术出版社，N.Y.152：673-684(1987)；和酵母属酵母的分子生物学(The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces)，Eds.Strathern等，冷泉港出版社，第I卷和第II卷(1982)。

用于克隆和表达本发明胶原蛋白的特别优选的系统是毕赤酵母属酵母的宿主细胞。非酵母属酵母诸如巴斯德毕赤酵母在放大规模生产高产量的重组蛋白方面似乎有特别的优点。另外，InvitrogenCorporation(San Diego，CA)有市售的毕赤酵母表达药盒。

在诸如巴斯德毕赤酵母的嗜甲醇(methylotropic)酵母中有一些甲醇反应性基因，每个这种基因的表达都由甲醇反应调控区(也称为启动子)控制。任何这种甲醇反应性启动子都适用于本发明的实施中。特定的调控区的实例包括得自巴斯德毕赤酵母AOX1的伯醇氧化酶基因启动子、得自巴斯德毕赤酵母AXO2的仲醇氧化酶基因启动子、得自巴斯德毕赤酵母(DAS)的二羟丙酮合酶基因启动子、得自巴斯德毕赤酵母的P40基因启动子、得自巴斯德毕赤酵母的过氧化氢酶基因启动子等等之类。

通过严格调控的AOX1基因启动子可以得到在巴斯德毕赤酵母中的典型表达。参见Ellis等，Mol.Cell.Biol.5：1111(1985)和编号为4,855,231的美国专利。在向培养物中加入甲醇后可以诱导该启动子产生高水平的重组蛋白。通过对这些细胞的后续调控，本文所述的本发明胶原蛋白基因在下述条件下得到了表达，即该重组蛋白被脯氨酰4-羟化酶充分羟基化，因此，该重组蛋白可以折叠成对该蛋白形成原纤维的正常生物学功能所必需的稳定螺旋。

另一个特别优选的酵母表达系统利用嗜甲醇酵母多形汉逊酵母。在甲醇中的生长导致诱导产生甲醇代谢的关键酶，即MOX(甲醇氧化酶)、DAS(二羟丙酮合酶)和FMHD(甲酸脱氢酶)。这些酶占细胞总蛋白的比例可达30-40％。编码MOX、DAS和FMDH生产的基因由很强的启动子控制，这些启动子在甲醇里生长时被诱导、在葡萄糖里生长时被抑制。这三个启动子的任何一个或全部都可以用于得到异源基因在多形汉逊酵母中高水平表达。将编码本发明胶原蛋白的基因克隆入一个在诱导型多形汉逊酵母启动子控制下的表达载体中。如果需要该产物分泌，将一编码酵母分泌信号(例如酿酒酵母前原接合因子α1)序列的多聚核苷酸在框架中与本发明胶原蛋白的编码序列融合。该表达载体最好包含一营养缺陷型标记基因，诸如URA3或LEU2，该基因可以用于互补营养缺陷型宿主的缺陷。

然后采用本领域技术人员已知的技术用该表达载体转化多形汉逊酵母宿主细胞。多形汉逊酵母转化的有趣和有用的特征是多达100个拷贝的表达载体自发地整合进入基因组中。在大多数情况下，整合的DNA形成了展示头-尾布局的多体。整合的外源DNA在几个重组菌株里甚至在非选择条件下表现出有丝分裂稳定。这种高拷贝整合现象进一步增加了该系统的高产率潜能。

在使用植物表达载体的情况下，编码本发明胶原蛋白的序列的表达可以由许多启动子的任何一个所驱动。例如，可以使用病毒启动子如CaMV 35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等，Nature 310：511-514(1984)，或TMV外壳蛋白启动子(Takamatsu等，EMBO J.6：307-311(1987))；或者，可以使用植物启动子如RUBISCO小亚基启动子(Coruzzi等，EMBO J.3：1671-1680(1984)；Broglie等，Science 224：838-843(1984)；或可以使用热休克启动子如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，Mol.Cell.Biol.6：559-565(1986)。可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等将这些构建物导入植物细胞。这类技术的综述参见例如Weissbach & Weissbach，植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology)，学术出版社，NY.第VIII节，第421-463页(1988)；和Grierson & Corey，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，第二版，Blackie，London，第7-9章(1988)。

可以用来表达本发明胶原蛋白的另一个表达系统是昆虫系统。在一个这种系统中，使用苜蓿银纹衣蛾核型多角体病毒(nuclearpolyhidrosis rvirus)(AcNPV)作为载体表达外源基因。该病毒在草地粘虫细胞中生长。可以把本发明胶原蛋白的编码序列克隆到该病毒的非必需区(例如多面体基因)并置于AcNPV启动子(例如多面体启动子)的控制之下。胶原蛋白编码基因的成功插入将导致多面体基因的失活并产生非内涵重组病毒(例如缺失由多面体基因编码的蛋白性外壳的病毒)。然后使用这些重组病毒感染草地粘虫细胞，其中插入的基因被表达。(例如参见Smith等，J.Virol.46：584(1983)；Smith，美国专利编号4,215,051)。

在哺乳动物宿主细胞中，可以使用一些基于病毒的表达系统。在使用腺病毒做为表达载体的情况下，可以将本发明胶原蛋白的编码序列与一腺病毒转录/翻译控制复合体连接，例如晚期启动子和三分前导序列。然后，可以将此嵌合基因通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)会产生一活的并能在受感染宿主中表达胶原蛋白的重组病毒。(例如参见Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：3655-3659(1984))。或者，可以使用痘苗7.5K启动子。(参见例如Mackett等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：7415-7419(1982)；Mackett等，J.Virol.49：857-864(1984)；Panicali等，Proc.Natl.Acad Sci.79：4927-4931(1982)。

插入的胶原蛋白编码序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在整个胶原蛋白基因包括其起始密码子和相邻序列都插入适当的表达载体的情况下，可以不需要额外的翻译控制信号。然而，在仅插入部分胶原蛋白编码序列的情况下，则必须提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。另外，该起始密码子必须与胶原蛋白编码序列的阅读框架一致，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，包括天然和合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等增强表达的效率。(参见Bittner等，酶学方法(Methods inEnzymol.) 153：516-544(1987))。

本发明胶原蛋白重组生产的一个优选表达系统是转基因非人类动物，其中可以从该转基因动物的乳汁中回收所需的胶原蛋白。通过将编码本发明胶原蛋白的DNA序列可操作地与一启动子和其它所需或可选的能实现在乳腺内表达的调控序列连接起来可以构建这种系统。同样，采用可在产生靶乳蛋白的乳腺细胞中运作的合适表达系统，尤其是美国专利申请08/037,728公开的表达载体，可以在靶细胞中同时产生所需的或可选的翻译后酶。

为在乳汁中表达，选择的启动子最好来自丰富乳汁特异性蛋白之一，例如αS1-酪蛋白、或b-乳球蛋白。例如，已成功地将αS1-酪蛋白的5′和3′调控序列用于表达人乳铁传递蛋白cDNA，同样地，b-乳球蛋白启动子已实现了在羊产乳汁细胞中表达人抗胰蛋白酶基因片段。Wright等，Biotechnology 9：830-833(1991)。在转基因山羊中，已使用乳清酸启动子表达人组织纤溶酶原激活因子，导致在该转基因动物的乳汁中分泌人组织纤溶酶原激活因子。Ebert等，Biotechnology 9：835-838(1991)。采用这类表达系统，得到了将本发明胶原蛋白分泌到乳汁中的动物。采用本领域一般技术人员熟知的方法，可以简单地将编码所需胶原蛋白链的基因连接到在所选动物物种乳腺细胞中起作用的适当的控制序列上。类似地构建所需翻译后酶编码基因的表达系统。

本发明胶原蛋白最好作为分泌蛋白表达。当用于表达这些蛋白的工程细胞是非人类宿主细胞时，将人胶原蛋白分泌信号肽用一更有效地被宿主细胞分泌导向机制识别的替代分泌信号肽取代一般更为优越。适当的分泌信号序列对得到哺乳动物基因的最佳真菌表达特别重要。例如，在嗜甲醇酵母中，可以将编码阅读框架内酿酒酵母a-接合因子前原序列DNA序列插到该编码序列的氨基酸末端。该aMF前原序列是包含在aMF前体分子内的前导序列，它包对蛋白水解处理和分泌必需的赖氨酸-精氨酸编码序列(参见例如Brake等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，81：4642(1984))。

另外，可以选择调控插入序列表达或以特定方式修饰和加工该基因产物的宿主细胞株。这类对蛋白产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可能对该蛋白的功能很重要。不同宿主细胞对蛋白质的翻译后加工和修饰有特征性和特异性的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保对表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为达到这个目的，可以使用拥有对初级转录产物进行正确加工和对该基因产物进行糖基化和磷酸化的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等。

另外，可以对宿主细胞进行工程改造，使其表达确保胶原蛋白分子正确加工的各种酶。例如，可以将脯氨酰4-羟化酶基因与胶原蛋白基因在宿主细胞中共表达。

为长期高产率生产重组蛋白，最好是稳定表达。例如，可以对稳定表达本发明胶原蛋白的细胞系进行工程化改造。不采用包含病毒复制起点的表达载体，而用受适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等等)控制的胶原蛋白编码DNA和一个选择性标记转化宿主细胞。导入外源DNA后，让工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转到选择培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性并使细胞稳定地将质粒整合进其染色体中并生长形成细胞集落(foci)，该细胞集落随后可以被克隆并扩增成细胞系。最好可以使用该方法对表达所需胶原蛋白的细胞系进行工程化改造。

可以使用一些选择系统，包括但不限于单纯疱病毒疹胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026(1962))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell 22：817(1980))基因等都可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。而且，可以使用抗代谢物抗性作为以下的选择基础，dhfr，它赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，它赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，它赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150：1(1981))；和hygro，它赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30：147(1984))。最近，已描述了其它的可选择基因，即trpB，它使细胞利用吲哚而不是色氨酸；hisD，它使细胞利用组氨醇而不是组氨酸(Hartman和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047(1988))；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，它赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，即DFMO(McConlogueL.，现代分子生物学通讯(Current Communications in MolecularBiology)，冷泉港实验室编辑)(1987)的抗性。

C.表达本发明胶原蛋白的转染子或转化子的鉴定和表达蛋白

的纯化

可以通过至少四种常见方法鉴别包含该编码序列并表达该生物活性基因产物的宿主细胞：(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(b)“标记”基因功能出现与否；(c)以胶原蛋白mRNA转录物在宿主细胞中的表达评价转录水平；和(d)通过免疫测定或其生物学活性检测该基因产物。

在第一种方法中，使用含有分别与胶原蛋白编码序列或其部分或其衍生物同源的核苷酸序列的探针进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交，可以探测插入该表达载体的胶原蛋白编码序列的存在。

在第二种方法中，可以根据一定“标记”基因功能(例如胸苷激酶活性、对抗生素抗性、氨甲蝶呤抗性、转化表型、在杆状病毒内形成内涵体等)的出现与否鉴定和选择重组表达载体/宿主系统。例如，如果该胶原蛋白编码序列插入载体的某标记基因序列内，则可以通过缺少该标记基因功能鉴定包含胶原蛋白编码序列的重组细胞。或者，可以将某标记基因与该胶原蛋白序列串联置于用于控制该胶原蛋白编码序列表达的同一或不同启动子的控制之下。响应诱导或选择的该标记表达表明了该胶原蛋白编码序列的表达。

在第三种方法中，可以通过杂交分析评价该胶原蛋白编码区的转录活性。例如，可以分离RNA并使用与胶原蛋白编码序列或其特定部分同源的探针用Northern印迹法分析。或者，可以提取宿主细胞总核酸并检测与这类探针的杂交。

在第四种方法中，可以用免疫学评价胶原蛋白产物的表达，例如Western印迹、诸如放射免疫沉淀、酶联免疫测定之类的免疫测定。

例如用层析法，将优选分泌到培养基中的表达的本发明胶原蛋白纯化至同质性。在一个实施方案中，用大小排阻层析纯化该重组胶原蛋白。然而，也可以使用本领域已知的其它纯化技术，包括离子交换层析和反相层析。

D.本发明胶原蛋白和工程化细胞系的应用

1.抗体生产和筛选

可以使用本领域已知的各种方法生产该重组产生的胶原蛋白的表位的抗体。这类抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和用Fab片段表达文库制备的片段。

为生产抗体，可以用胶原蛋白注射免疫各种的宿主动物，包括但不限于兔子、小鼠、大鼠等。根据宿主种可以使用各种佐剂增强免疫应答，佐剂包括但不限于弗洛因德佐剂(完全和不完全)、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳化剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能可用的人类佐剂，诸如如BCG(卡介苗)和粉刺棒状杆菌制剂。

可以使用通过连续细胞系培养提供生产抗体分子的任何技术制备胶原蛋白的单克隆抗体。这些技术包括但不限于首先由Koehler和Milstein描述的杂交瘤技术(Nature，256：495-497(1975))、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today，4：72(1983))；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.，80：2026-2030(1983)和EBV杂交瘤技术(Cole等，单克隆抗体和癌治疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，AlanR.Liss，Inc.，第77-96页(1985)。另外，可以使用通过将适当抗原特异性的小鼠抗体分子基因与适当生物学活性的人抗体分子基因一起剪接开发的生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Neuberger等，Nature，312：604-608(1984)；Takeda等，Nature 314：452-454(1985))。或者，可以使用生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)生产胶原蛋白特异性单链抗体。

可以使用已知技术制备包含缺失特定结合位点的抗体片段。例如，这种片段包括但不限：可以由胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段和可以通过还原F(ab′)2片段的二硫桥产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，Science 246：1275-1281(1989))以快速容易地鉴定对所关注的胶原蛋白有所需特异性的单克隆Fab片段。

2.本发明胶原蛋白的治疗用途

本发明的另一方面是提供使用本发明胶原蛋白治疗免疫系统介导疾病的方法。此处与某一疾病有关的名词“治疗(treatment)”或“医治(treating)”既涉及预防也涉及减轻个体中业已存在的症状。本领域一般技术人员明白一种治疗不需要完全有效地防止疾病的发生或减轻与该疾病有关的症状。对病人而言，希望减轻任何症状的严重程度、延迟症状的发生或延迟症状严重性的发展。根据任何各种暗示可能发生免疫系统介导疾病的因素，例如家族史、遗传标记、早期症状之类，可以对有发生给定免疫系统介导疾病风险的人进行预防治疗。

可以用题述方法治疗的免疫系统介导疾病包括但不限于，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、自身免疫性听觉疾病、由细菌或病毒感染引起的软骨炎症(例如莱姆病)、寄生虫病、滑囊炎、角膜病和关节强硬性脊椎炎(脊柱融合)。本发明方法的主题包括给予有效剂量的本发明组合物(例如胶原蛋白、胶原蛋白衍生物)的步骤。用于治疗特定免疫系统介导疾病的优选组合物是IX型胶原蛋白的融合蛋白，最好是IX型胶原蛋白亚基与II型胶原蛋白和/或XI型胶原蛋白的嵌合体及其衍生物和亚基，以及在前述章节中描述的融合蛋白。在题述方法的一个优选实施例中，给予受治疗者的组合物包含不同程度糖基化的胶原蛋白。给予题述方法中给予的组合物使得活性组分(即胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物)接触肠道的淋巴组织，例如淋巴集结或其它类似位点，以诱导免疫耐受。在许多可能的方法中，通过使用包含设计用于口服的题述组合物制剂，可以实现这种用药，即在活性组分接触适当的肠道淋巴组织之前，该活性组分不会在口腔、胃或消化系统的其它部分中被破坏或灭活。本发明的治疗方法也可以包括给予治疗免疫系统介导疾病的其它药物化合物(例如抗炎症剂之类)的步骤。

题述组合物的给药剂量可以在一宽范围内变化，并且将取决于各种因素，例如炎症的严重性、病人年龄等，可能必需根据个体调整。每天可以给药的胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物量的可能范围可以从0.001mg至200mg。最好胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物的给药量低，因此有利于通过抑制而不是克隆无反应诱导免疫耐受。可以适当地配制含有胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物的药物组合物，使得它们以单剂量单位或多剂量单位提供这些范围内的剂量。

本发明方法使用的诱导耐受的组合物的最适剂量将根据一些因素变化。此处使用的名词“剂量(dosage)”和“剂量(dose)”，除非另行说明，可以不仅指组合物的单次给药，而且可以用于指在选定时间内给予的给定药物组合物的总量并涉及多个单次给药。影响最适剂量的因素包括选择给予病人的一种或多种胶原蛋白分子(和/或胶原蛋白衍生物)、选定的特定粘膜结合分子、病人年龄、疾病严重性、该病人所患的其它疾病、配方中的惰性组分、佐剂等等。在有效治疗给定免疫失调的剂量范围可以有相当程度的变化。同一药物组合物的不同剂量可以通过不同机制产生所需的耐受效应。尽管本发明的作用不依赖于特定的作用原理，本领域的一般技术人员通过了解据信有两种介导口服耐受的主要机制，会更好地理解本发明并提供额外的实施方案。通过活性细胞抑制可以介导口服耐受，其中调节T细胞抑制被耐受抗原特异性淋巴细胞的激活和增殖。另一个口服耐受诱导机制是克隆无反应性，其中使具合适受体的T淋巴细胞变为不反应。一般“低”剂量耐受抗原有利于活性抑制耐受，同一耐受抗原的相对“高”剂量有利于克隆无反应性。有关口服耐受诱导的原理和技术的综述参见Weiner等，免疫学年述(Annual ReviewImmunilogy)，第809-835页，Annual Reviews(1994)。

可以将题述组合物作为药物组合物配制，以适应向粘膜表面给药的一定类型，例如口服、局部给药和吸入给药。口服药物制剂的优选形式是这样一种形式，其中该组合物中的胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物与肠淋巴组织(如淋巴集结)接触。本发明组合物可以以药物组合物的形式通过注射或吸入局部给药、口服、鼻内给药，该药物组合物包含原始化合物形式或可选地以药学上可接受的盐形式的胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物，与可以是固体、半固体或液体稀释剂或可摄取胶囊的药学上可接受的的载体相结合，这类制剂组成了本发明的另一个方面。也可以与载体材料一起使用胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物和粘膜结合胶原蛋白结合物。药物制剂的例子是已提过的片剂、滴剂(例如滴鼻剂)、局部用药的制剂(如软膏剂、凝胶剂、乳膏和悬液剂、吸入用的气溶胶、鼻腔喷雾剂、脂质体等。通常胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物将构成制剂的0.05-99％(重量)，或0.1-99％(重量)，例如注射用制剂构成0.5-20％(重量)，而口服制剂构成的0.1-50％(重量)。

为了制备含有本发明化合物的这种口服剂量单位形式的药物制剂，可以将该活性组分与固体粉末状载体混合，这些载体例如为乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉(诸如土豆淀粉、玉米淀粉、支链淀粉、昆布属粉或柑橘属果肉粉)、纤维素衍生物或明胶，药物制剂也可以包括润滑剂，诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙或Carbowax”或其它聚乙二醇蜡，并压缩形成片剂或糖衣丸的核心。如果需要糖衣丸，可以把核心包衣，例如用可以含有阿拉伯胶、滑石粉和/或二氧化钛的浓缩糖溶液包衣，或者用溶于挥发性有机溶剂或有机溶剂混合物中的成膜剂包衣。可以在这些包衣中加入染料，例如以区分活性物质的不同含量。为制备由明胶和例如作为增塑剂的甘油组成的软明胶胶囊、或类似的封闭胶囊，可以将该活性物质与Carbowax”或合适的油(例如芝麻油、橄榄油或花生油)混合。硬明胶胶囊可以包含该活性物质与固体粉末载体的颗粒，这些载体例如为乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉(例如土豆淀粉、玉米淀粉或支链淀粉)、纤维素衍生物或明胶，也可以包含硬脂酸镁或硬脂酸作为润滑剂。

也可以配制本发明组合物，以便提供持久释放。通过使用被缓慢溶解的包衣分隔的多层活性药物，可以得到持久释放片剂。制备持久释放片剂的另一方法是将该活性药物剂量分成有不同厚度包被的颗粒，并将这些颗粒与载体物质一同压制成片剂。也可以将胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物和粘膜结合胶原蛋白结合物混入由例如脂肪和蜡物质制成的缓慢溶解的片剂，或均匀地分布在由不溶物质(如生理惰性的槊料物质)制成的片剂里。

为获得设计来防止活性物质在胃液里释放或可能分解的片剂、胶囊等口服制剂的剂量单位，可以将片剂、糖衣丸等包肠溶衣，即提供一层具有在酸性pH下不溶于胃液这类特性的抗胃液肠膜或包衣。因此，在该制剂到达肠道之后，才释放该活性物质。这种已知肠溶包衣的例子可以提到例如商品名为HP55和HP50、Edragit^L和Eudragit^S销售的乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素。

口服的液体制剂可以是酏剂、糖浆剂或悬液剂形式，例如含有约0.1-20％(重量)活性物质的溶液、糖和作为分散剂的混合物或乙醇、水甘油、丙二醇和可选的芳香剂、糖精和/或羧甲基纤维素。

VI.实施例

通过参考以下实施例会进一步理解本发明，这些实施例子仅作为本发明的例证。

A.实施例1：在巴斯德毕赤酵母中表达重组α3(IX)胶原蛋白亚基

制备扩增得自p545质粒和cDNA文库克隆RB410的α3(IX)胶原蛋白cDNA编码序列所用的PCR引物。设计引物使其在α3(IX)胶原蛋白编码序列的5′和3′末端引入一Eco RI位点，利用一独特的限制性位点将在这两个克隆中找到的这两半编码序列连接起来。

采用Ausubel等，分子生物学现行方法(Current Protocols inMolecular Biology)，Grene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.(1990)描述的标准PCR条件，用引物1和引物2扩增得自p545质粒的α3(IX)胶原蛋白编码序列的成熟氨基末端。用引物3和引物4扩增得自上述cDNA克隆RB410的其余cDNA编码序列，包括终止密码子。所得的PCR产物用选定的独特限制性核酸内切酶和EcoRI消化。

指导在巴斯德毕赤酵母中分泌表达的市售表达载体pPIC9(Invitrogen，San Diego，CA)用限制性核酸内切酶EcoR I 消化，后用牛小肠磷酸酶(Pharmacia)消化，然后在70℃热变性5分钟。按照实施例3描述的方法凝胶纯化消化的PCR产物和pPIC9载体，进行三种方式连接。在转化到感受态大肠杆菌后，用限制分析鉴别并用市售毕赤酵母测序引物(Invitrogen，San Diego，CA)测序确认正确连接的质粒。

将α3(IX)毕赤酵母表达载体线性化并用于转化亦表达脯氨酰4-羟化酶的his4巴斯德毕赤酵母菌株的球芽。在组氨酸缺陷培养基上鉴别转化体，并通过在甲醇培养基上的缓慢生长检测AOX1基因的缺失确认转化体。通过将细胞在做为唯一碳源的甲醇里生长诱导α3(IX)基因的表达。α3(IX)胶原蛋白亚基蛋白分泌到生长培养基中，接着用标准离心、过滤和层析技术纯化。

B.实施例2：在巴斯德毕赤酵母中表达三聚体人IX型胶原蛋

  白

用类似的方法，将产生α3(IX)胶原蛋白亚基的巴斯德毕赤酵母菌株进行工程化改造，使其在同一细胞中共表达α1(IX)和α2(IX)胶原蛋白亚基。

C.实施例3：在草地粘虫Sf9昆虫细胞中表达三聚体人IX型

  胶原蛋白

通过采用Baculogold转染药盒(Pharmingen)，将重组α1(IX)、α2(IX)、和α3(IX)构建物和一修饰的苜蓿银纹衣蛾核型多角体病毒DNA共转染入草地粘虫Sf9昆虫细胞。用于构建这三条α(IX)链的序列由van der Rest和Mayne公开，胶原蛋白类型的结构和功能(Structureand Function of Collagen Types)(Mayne，R.and Burgeson，R.eds.)学术出版社，Orlando，FL，第185-221页(1987)。按照Gruenwald，S.和Heitz，J.，杆状病毒表达系统：步骤和方法手册(Baculovirus ExpressionSystems：Procedures & Methods Manual)，Pharmingen，San Diego，CA(1993)描述的方法，将所得的病毒库进行收集、扩增、和噬斑纯化。

在添加10％胎牛血清(BioClear)的TNH-FH培养基上于27℃单层培养草地粘虫Sf9昆虫细胞。约5×10⁶昆虫细胞用重组人α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)构建物和人脯氨酰4-羟化酶的αβ病毒(正在准备手稿)感染。使用的IX型胶原蛋白α链病毒比脯氨酰4-羟化酶病毒多出2-3倍。每天向培养基中加入80μg/ml抗坏血酸盐。感染72小时后除去培养基，用pH7.4的含0.15 NaCl和0.02M磷酸盐的溶液清洗细胞层一次。将细胞刮入1.4ml含0.5乙酸、0.75M NaCl、10mM EDTA和1mM PMSF pH2.5的冰冷溶液中进行收获。然后将细胞匀浆并在15000×g离心20分钟。上清液用最终浓度为1.2M的NaCl于4℃混合样品12小时进行沉淀。沉淀物于4℃在15000×g离心20分钟。将得到的沉淀于4℃在500μl冷的50mM乙酸中溶解3小时。用非还原性或还原性SDS-PAGE和随后的考马斯亮蓝染色分析15μl样品。亦用胃蛋白酶于22℃消化该材料4小时，按照Buckner等，Anal.Biochem 110：360-368(1981)描述的方法用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物，快速消化测定抗胃蛋白酶重组IX型胶原蛋白的热稳定性。在还原性SDS-PAGE上并接着用三股螺旋胶原蛋白抗体采用Western印迹法分析所得的材料。

结果表明，人IX型胶原蛋白表达为一约300kDA的异三聚体(图1)，由图2所示的等量的α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)链组成。用蛋白酶短暂消化后，分析重组人IX型胶原蛋白的热稳定性。重组人IX型胶原蛋白的热稳定性超过40℃。

D.实施例4：嵌合型II/IX/XI胶原蛋白分子的克隆和表达

修饰上述α3(IX)毕赤酵母表达载体，以便指导嵌合II型/IX型/XI型分子的表达。具体地说，将该载体从α3(IX)胶原蛋白编码序列的5′或3′切割，并将II型胶原蛋白编码序列插入框架。另外，可以在5′或3′或在II型和IX型胶原蛋白编码序列之间再次切割该载体，并将XI型胶原蛋白编码序列也插入正确的读框中，以便表达嵌合型II/IX/XI胶原蛋白分子。用上述方法通过限制消化筛选具有所需定位的质粒的感受态大肠杆菌转化体，并通过测序确认。

上述表明和描述之外的本发明的各种修改，从前面的描述而言对本领域技术人员是明显的。这类修改应在附加的权利要求书范围之内。也应理解，所有给定的核苷酸碱基对的大小是大约的，供描述之用。

本文引用的参考文献通过全文引用结合到本文中。

Claims (7)

1.包含与异源肽序列连接的人IX型胶原的融合蛋白。

2.权利要求1的融合蛋白，其中该异源肽序列包含II型胶原蛋白。

3.权利要求1的融合蛋白，其中该异源肽序列包含XI型胶原蛋白。

4.权利要求1的融合蛋白，其中该异源肽序列包含II型和XI型胶原蛋白。

5.产生重组人融合蛋白的方法，包括：

(a)培养用表达所述融合蛋白的重组DNA表达载体转化的宿主细胞；和

(b)从该细胞培养物中回收该融合蛋白。

6.包含人重组IX型胶原蛋白的蛋白。

7.产生重组人IX型胶原蛋白的方法，包括：

(a)培养用表达所述IX型胶原蛋白的重组DNA表达载体转化的宿主细胞；以及

(b)从该细胞培养物中回收该IX型胶原蛋白。

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