CN102747060B - D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用。首次获得了一种突变型D-氨甲酰水解酶，所述的突变型D-氨甲酰水解酶在保持催化产物不变的情况下，单位菌体酶活性大幅度提高，可溶性表达能力也显著提高。

Description

D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体内容涉及D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素具有抗菌活力强，广谱低毒等优点，是临床控制细菌感染的首选药物之一。D-对羟基苯甘氨酸(DHPG)是合成该类药物的一种重要中间体，用于制备羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢菌素的侧链。D-对羟基苯甘氨酸的制备在工业上有化学合成法和酶法两种方法，其中化学合成法成本高，污染大；而酶法具有成本较低、无污染的特点，因此日益受到重视。酶法的技术原理是：D-乙内酰脲酶(也称为D-海因酶)将DL-对羟基苯海因不对称水解为N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶(也称为D-氨甲酰水解酶，简称DCase)的作用下，将N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸不可逆水解转变成DHPG。

工业生产中发现：在两步酶法生产D-对羟基苯甘氨酸的过程中，由于DCase催化效率低、稳定性差的缺点，导致中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸大量积累，终产物D-对羟基苯甘氨酸产率低。因此DCase成为两步酶法反应系统中的一个关键酶、限速酶。

随着基因工程技术的发展，大肠杆菌表达系统的日臻成熟，将DCase基因在大肠杆菌表达系统中进行过量表达，从而获得高表达、高活力的基因工程菌株成为可能。例如，许祯等从一株能将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的菌株中，成功克隆出DCase基因，Genbank索取号为：AF320814(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)：149-54)。本发明人的实验室在将DCase基因构建入pET表达系统，转化E.coli过量表达后，对目的蛋白的活性和表达情况进行分析，结果显示：E.coli可以大量表达出重组蛋白，但是70-80％左右的重组蛋白是以包涵体的形式存在，严重影响了该酶的功能发挥。如何使更多的目的蛋白表达后能够正确折叠成为有活力的蛋白成为研究和努力的方向。前期对DCase的研究表明，其18位和30位残基的疏水性对目的蛋白的可溶性有较大影响，分别将这两个位点突变为疏水性不同的氨基酸(A18Y、A18N、A18D、A18E；Y30E、Y30D)，可溶性有进一步提高。

虽然天然酶分子在自然条件下已经进化了千百万年，但是因为天然酶分子存在的环境与实际应用的环境不同，酶分子仍然蕴藏着巨大的进化潜力。运用定点突变技术等对微生物来源的酶进行分子改造和人工进化在近些年中取得了令人瞩目的进展(参见：王正祥等，生物工程学报，16(3)，2000)，已经成为酶的人工工程改造的常用手段。这种分子水平上的改造技术是通过体外定点突变来改造靶基因，从而创造具有新功能的改性的酶，大大加速了蛋白质的进化进程。

因此，本领域有必要进一步改进天然的酶分子，以期更大限度地提高酶的表达以及酶活力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种突变型D-氨甲酰水解酶，其对应于SEQ IDNO：2氨基酸序列的第18位由丙氨酸(A)突变为谷氨酸(E)，第30位酪氨酸(Y)突变为天冬氨酸(D)，第34位赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)。

在另一优选例中，所述的突变型D-氨甲酰水解酶是：

(a)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白；或

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO：3第18位上的氨基酸为谷氨酸，对应于SEQ ID NO：3第30位上的氨基酸为天冬氨酸，对应于SEQID NO：3第34位上的氨基酸为谷氨酸。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的突变型D-氨甲酰水解酶的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的突变型D-氨甲酰水解酶。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞；在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌。

在本发明的另一方面，提供一种生产突变型D-氨甲酰水解酶的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离突变型D-氨甲酰水解酶。

在本发明的另一方面，提供所述的突变型D-氨甲酰水解酶的用途，用于生产D-对羟基苯甘氨酸。

在本发明的另一方面，提供一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，所述的方法包括：利用所述的突变型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，获得D-对羟基苯甘氨酸。

在另一优选例中，所述的方法包括：培养所述的宿主细胞产生突变型D-氨甲酰水解酶，该突变型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，获得D-对羟基苯甘氨酸。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，获得了一种突变型D-氨甲酰水解酶，所述的突变型D-氨甲酰水解酶在保持催化产物不变的情况下，单位发酵菌体酶活性大幅度提高，可溶性表达能力也显著提高。

本发明的多肽(突变型D-氨甲酰水解酶)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括突变型D-氨甲酰水解酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变型D-氨甲酰水解酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“突变型D-氨甲酰水解酶”或“突变型D-氨甲酰水解酶蛋白”指具有突变型D-氨甲酰水解酶活性的SEQ ID NO：3序列的多肽。该术语还包括具有与突变型D-氨甲酰水解酶相同功能的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变型D-氨甲酰水解酶的活性片段和活性衍生物。但是，这些变异形式中，对应于SEQ ID NO：2氨基酸序列的第18位为谷氨酸(E)，第30位为天冬氨酸(D)，第34位为谷氨酸(E)。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与所述的突变型D-氨甲酰水解酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗突变型D-氨甲酰水解酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含突变型D-氨甲酰水解酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了突变型D-氨甲酰水解酶蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有突变型D-氨甲酰水解酶序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供突变型D-氨甲酰水解酶或多肽的类似物。这些类似物与所述的突变型D-氨甲酰水解酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。但是，这些多肽类似物中，对应于SEQ ID NO：2氨基酸序列的第18位为谷氨酸(E)，第30位为天冬氨酸(D)，第34位为谷氨酸(E)。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“突变型D-氨甲酰水解酶的保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。这些保守性变异多肽中，对应于SEQ ID NO：2氨基酸序列的第18位为谷氨酸(E)，第30位为天冬氨酸(D)，第34位为谷氨酸(E)。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala

Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明突变型D-氨甲酰水解酶或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(如85％，90％，95％，99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码突变型D-氨甲酰水解酶的多聚核苷酸。

本发明的编码突变型D-氨甲酰水解酶的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或突变型D-氨甲酰水解酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的突变型D-氨甲酰水解酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码突变型D-氨甲酰水解酶(或变异体)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，突变型D-氨甲酰水解酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含突变型D-氨甲酰水解酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母，植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的突变型D-氨甲酰水解酶(或其片段、变异形式或衍生物)的多核苷酸在转化入宿主细胞后，可直接用于水解N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，获得D-对羟基苯甘氨酸。

在获得了本发明所述的突变型D-氨甲酰水解酶的信息后，本领域人员清楚如何用于后续制备D-对羟基苯甘氨酸。各种本领域已知的方法均可引用于本发明。

野生型D-氨甲酰水解酶的Genbank登录号为AF320814，由304个氨基酸组成，其编码DNA序列包括915bp，其编码DNA序列及氨基酸序列如SEQ IDNO.1和2所示。在本发明的一个实施例中，所获得的突变体A18E/Y30D/K34E与DCase的区别为该突变酶的第18位的氨基酸由丙氨酸突变为谷氨酸，第30位的酪氨酸突变为天冬氨酸和第34位的赖氨酸突变为谷氨酸。相对应地，其编码DNA序列中52-54bp的GCG突变为GAA，88-90bp的TAC变为GAT，100-102bp的AAA突变为GAA。

相比于野生型DCase，本发明所获得的突变体可溶性是野生酶的9倍，比另一三叠加突变体(A18T/Y30N/K34E)提高5％，每毫升发酵菌体的酶活比野生酶提高427％，比A18T/Y30N/K34E提高12％。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按质量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、DCase基因的克隆

1、PCR扩增

设计一对引物：

5’-GGAATTCCATATGACACGTCAGATGATA-3’(SEQ ID NO：4)；和

5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGATCAG-3’(SEQ ID NO：5)；

以质粒pXZ-total(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)：149-54)DNA为模板进行PCR扩增。PCR条件为：94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。

2、含DCase基因的质粒构建

PCR扩增结束后，使用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，电压为100V，采用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，然后按宝生物公司(网址：www.takara.com.cn)2005-2006产品目录说明书描述的方法，将所获得的DNA片段和载体pET-28b(Novagen公司)用限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切。

酶切产物再次进行电压为100V核酸电泳，回收相应大小分别为900bp、5300bp左右的片段和载体，最后将载体和片段按1∶3比例混合后，加入1个单位的T4DNA连接酶，16℃连接10小时以上。

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选，重组子经过NdeI和HindIII双酶切和DNA测序验证，得到基因序列正确的克隆，将该克隆命名为DCase-WT。其中，DCase酶的基因序列如SEQID NO：1所示，与GenBank登录号为AF320814的DCase基因相同，为野生型酶；其编码如SEQ ID NO：2所示的蛋白。

3、表达DCase的基因工程菌株的构建

用常规方法将DCase-WT转化入E.coli BL21(Novagen公司)，即获得DCase基因的大肠杆菌表达菌株。

实施例2、三突变位点的叠加

1、PCR扩增

以DCase-WT的编码基因为模板，分别使用第一对引物对：

5’-GTCGTTCGTCTTCTCGATATGCTGACGGAAGCCGCGAGCCGGGGC-3’(SEQ IDNO：6)和

5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGATCAG-3’(SEQ ID NO：7)；

第二对引物对：

5’-GGAATTCCATATGACACGTCAGATGATA-3’(SEQ ID NO：8)；

5’-GCCCCGGCTCGCGGCTTCCGTCAGCATATCGAGAAGACGAACGAC-3’(SEQ IDNO：9)；

进行PCR扩增。

PCR条件为：94℃变性10min后，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。

2、回收PCR产物

PCR扩增结束后，使用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，电压为100V，采用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收100bp，800bp左右的DNA片段。

3、再次PCR扩增

以步骤2中所回收的两个片段为模板，使用引物对：

5’-GGAATTCCATATGACACGTCAGATGATA-3’(SEQ ID NO：10)；

5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGATCAG-3’；(SEQ ID NO：11)；

进行PCR扩增。

PCR条件为：94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。

4、PCR产物测序

PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，电压100V，割胶后回收900bp左右的DNA片段，测序。

经测序显示，所得D-氨甲酰水解酶突变体是Y30D和K34E的叠加突变体体，即野生型DCase序列中88-90bp的TAC变为GAT，100-102bp的AAA变为GAA。

5、再次PCR扩增

以步骤4中所得的Y30D/K34E突变体的DNA为模板，分别使用第一对引物对：

5’-GGAATTCCATATGACACGTCAGATGATA-3’(SEQ ID NO：12)；和

5’-CTGTTCGCGTGTCTCTTCGCGCGCGATCGGACC-3’；(SEQ ID NO：13)

第二对引物对：

5’-GGTCCGATCGCGCGCGAAGAGACACGCGAACAG-3’(SEQ ID NO：14)；

5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGATCAG-3’(SEQ ID NO：15)；

进行PCR扩增。

PCR条件为：94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。

6、回收PCR产物

PCR扩增结束后，使用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，电压为100V，采用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收50bp，850bp左右的DNA片段。

7、再次PCR扩增

以步骤6中所回收的两个片段为模板，使用引物对：

5’-GGAATTCCATATGACACGTCAGATGATA-3’(SEQ ID NO：16)；和

5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGATCAG-3’(SEQ ID NO：17)；

进行PCR扩增。

PCR条件为：94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。

8、PCR产物测序

PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，电压100V，割胶后回收900bp左右的DNA片段，测序。

经测序显示，所得D-氨甲酰水解酶突变体是A18E、Y30D和K34E的叠加突变体体，即野生型DCase序列中52-54bp的GCG突变为GAA，88-90bp的TAC变为GAT，100-102bp的AAA突变为GAA。

9、A18E/Y30D/K34E突变体的构建

按宝生物公司(网址：www.takara.com.cn)2005-2006产品目录说明书描述的方法，将8中所获得的DNA片段和载体pET-28b(Novagen公司)用限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切。酶切产物再次进行电压为100V核酸电泳，回收相应大小分别为900bp、5300bp左右的片段和载体，最后将载体和片段按1∶3比例混合后，加入1个单位的T4DNA连接酶，16℃连接10小时以上。

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选，重组子经过NdeI和HindIII双酶切和DNA测序验证，得到基因序列正确的克隆，最终获得3点突变的克隆，命名为A18E/Y30D/K34E。

采用与上述类似的步骤，本发明人还制备了另一3位点突变体，该突变体是A18T、Y30N和K34E的叠加突变体，即野生型DCase序列中52-54bp的GCG突变为ACG，88-90bp的TAC变为AAC，100-102bp的AAA变为GAA。上述突变也通过在引物序列上的设计实现。将该突变的基因同样插入载体pET-28b(Novagen公司)，获得的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到基因序列正确的克隆，最终获得3点突变的克隆，命名为A18T/Y30N/K34E。

实施例3、重组表达蛋白

将构建获得的大肠杆菌表达菌株先在LB(按照质量比：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％)试管中培养过夜，按1％体积比的接种量接于装有30mLLB液体培养基的250mL摇瓶中，生长至OD600≈0.6，然后加入0.3mM的IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)诱导表达，放于200转/分钟的摇床，培养过夜。

以4000转/分钟，离心10分钟，收集菌体并悬浮于PBS缓冲液中，经超声波破碎处理，离心，取上清、沉淀物进行SDS-PAGE分析。结果见表2。试验表明，突变体A18E/Y30D/K34E的可溶性表达蛋白比例为64％，比突变体A18T/Y30N/K34E高5％，同时其单位菌体发酵酶活比A18T/Y30N/K34E高12％，是野生酶的5.3倍。在D-对羟基苯甘氨酸的生产中，具有潜在的应用优势。

表2、可溶性蛋白表达情况比较

实施例4、野生型酶和突变型酶的单位菌体酶活比较

1、粗酶液制备

取实施例3中发酵培养的A18E/Y30D/K34E菌体、A18T/Y30N/K34E和野生型克隆1mL，加入1.5mL离心管中，离心，弃上清。在-20℃冰箱冻存2小时以上，备用。

2、酶促水解反应

将菌体悬浮于1mL的0.1M、pH7.5的磷酸缓冲液中，取400μl的悬浮液，加入400μl的100mM的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸底物，进行水解反应，在40℃的水浴摇床，以150转/分钟的速度振荡。反应30分钟后，加入800μl的10％(v/v)盐酸终止反应。

3、酶活测定

取适量反应液进行稀释后，13000转/分钟离心5分钟，取上清进行HPLC测定。

HPLC测定D-氨甲酰水解酶活力的方法是：以水、甲醇和1.29％(v/v)冰乙酸为流动相，其比例为85∶12∶3，流速为1.0mL/min，在230nm处检测不同物质的含量及相同物质的不同峰高和保留值。

1U酶活定义为在上述反应条件下每分钟产生1微摩尔D-对羟基苯甘氨酸所需要的酶量。

4、菌体酶活比较

酶活测定结果见表3。

表3、菌体发酵酶活

相比于野生酶，突变体A18E/Y30D/K34E的单位菌体酶活提高427％，优势显著。

上述实施例表明，突变酶在可溶性表达和单位菌体的酶活方面优于野生型，同时也进一步表明新的叠加突变体具有很大的应用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种突变型D-氨甲酰水解酶，其对应于SEQ ID NO:2氨基酸序列的第18位由丙氨酸突变为谷氨酸，第30位酪氨酸突变为天冬氨酸，第34位赖氨酸突变为谷氨酸。

2.如权利要求1所述的突变型D-氨甲酰水解酶，其特征在于，其是氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(i)编码权利要求1或2所述的突变型D-氨甲酰水解酶的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQID NO:3所示氨基酸序列的突变型D-氨甲酰水解酶。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求3或4所述的多核苷酸。

7.一种生产突变型D-氨甲酰水解酶的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)培养权利要求6所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离突变型D-氨甲酰水解酶。

8.权利要求1所述的突变型D-氨甲酰水解酶的用途，用于生产D-对羟基苯甘氨酸。

9.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括：利用权利要求1所述的突变型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，获得D-对羟基苯甘氨酸。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，培养权利要求6所述的宿主细胞产生突变型D-氨甲酰水解酶，该突变型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，获得D-对羟基苯甘氨酸。