CN110498860A

CN110498860A - 一种具有抗肿瘤功能的融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110498860A
Application number: CN201910771336.0A
Authority: CN
Inventors: 徐寒梅; 王军志; 李萌
Original assignee: China Pharmaceutical University; National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: China Pharmaceutical University; National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2039-08-20
Also published as: CN110498860B

Abstract

本发明公开了一种新型整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白及其制备方法，以及其在抗肿瘤方面的应用。

Description

一种具有抗肿瘤功能的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，更具体地说，涉及一种具有抗肿瘤功能的融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

近年我国肿瘤的发病率和病死率不断增长。无限制生长、侵袭和转移是肿瘤的恶性标志和特征，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移是改善预后，提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出肿瘤生长依赖血管新生的理论，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，它不仅向肿瘤提供营养，也向宿主输出大量的肿瘤细胞导致肿瘤的生长和转移。目前抑制血管生成药物Avastin(VEGF抗体)已上市销售，获得了巨大的商业利润。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤血管形成是重要的抗癌措施。

血管抑制剂抗肿瘤药物中一个重要大类是整合素阻断剂。整合素是一种介导细胞和其外环境(如细胞外基质，ECM)之间连接的跨膜受体。整合素是细胞外间质和细胞骨架之间的生理“桥梁”，发挥细胞黏着作用，而且可将细胞外的信号传递到细胞内。整合素通过结合配体中的RGD序列介导细胞与ECM之间的相互作用(王文静，胡加亮，徐寒梅.整合素阻断剂类药物的研究与开发进展[J].中国当代医药，2013，20(17)∶29-32+35.)。整合素参与和调节肿瘤血管生成过程，在肿瘤侵袭浸润、转移等过程中起着重要作用(程涛，胡加亮，徐寒梅.整合素阻断剂抗肿瘤药物研究进展[J].中国医药科学，2012，2(21)：44-47.)，血管生成过程需要在众多细胞因子间以特定的时空方式相互调节下完成，其中恰当的整合素和ECM作用是血管生成十分重要的两个因素。许多整合素分子均能影响血管生成(如αvβ3、α5β1、α2β1、α1β1等)，其中以αvβ3尤为重要，它参与内皮细胞的激活和迁移，介导内皮细胞增殖，抑制内皮细胞凋亡，从而促进肿瘤血管生成。整合素还可通过传递特定的信号或诱导基因表达来参与肿瘤细胞的转化、生长、侵袭、转移和凋亡。徐寒梅等发现ES-2(内皮抑素的一段氨基酸)在体外具有良好的抗血管生成的活性，但体内活性并不高。为了增加ES-2的靶向性，徐寒梅课题组设计了RGD-4C和ES-2的融合多肽AP25，通过动物实验证明有显著的抗肿瘤作用(张晓娟，王文静，王晶晶，沈鸿，王佳艺，徐寒梅.多肽AP25抗肿瘤活性研究[J].中国药理学通报，2013，29(09)：1225-1229.)。

但是，作为一种小分子多肽，AP25的半衰期只有45分钟，大大限制了其临床应用(徐寒梅，李梦玮，罗艳平.蛋白多肽药物临床前药物代谢动力学研究[M].抗肿瘤药物药理学实验指南，2015(01)：111.)。

“戈那瑞林”(GnRH)为人工合成的促性腺激素释放激素，属肽类化合物，为十肽，和哺乳动物下丘脑分泌的促性腺激素释放激素提取物的结构完全相同(徐继艳.“戈那瑞林”的研制及临床应用[J].养殖技术顾问，2011(08)：231.)。GnRH已被证实是下丘脑-垂体-性腺轴的关键信号分子，对下丘脑-垂体-性腺轴起重要调节作用。有研究表明，一些肿瘤的发生和发展过程中都有GnRH参与，某些非性腺轴器官起源的肿瘤，如肺癌、胰腺癌、结肠癌、肾上腺癌和肝癌细胞上都存在GnRH受体，而且GnRH或其类似物对这些类型的肿瘤有着生长抑制或调节作用(袁彪，张金山，张远强.GnRH及其受体与肿瘤关系的研究进展[J].解剖科学进展，2002(04)：367-371.)。

发明内容

发明人经过多年的研究和长期的试验发现，将整合素阻断剂(例如aapf多肽及其功能性变体和片段)、GnRH激动剂(例如GnRH及其功能性变体和片段)与能够增加半衰期的融合伴侣(例如人免疫球蛋白的Fc区段)通过柔性的连接子连接形成一种融合蛋白，可以有效提高融合蛋白的体内稳定性和抗肿瘤效果，提高药物疗效，从而完成了本发明。

在第一个方面中，本发明提供了一种整合素阻断剂-GnRH激动剂融合蛋白，其包含第一功能区、第二功能区、Fc区、第一连接子区和第二连接子区；其中：第一功能区包含整合素阻断剂；第二功能区包含GnRH激动剂；Fc区包含人免疫球蛋白Fc区段或其截短或变体形式；第一连接子区连接第一功能区和Fc区，包含序列(GGGGS)_n1，其中n1是大于等于1的整数；第二连接子区连接第二功能区和Fc区，包含序列(GGGGS)_n2，其中n2是大于等于1的整数。

在一个实施方案中，其中所述整合素阻断剂是aapf多肽或其截短或变体形式。

在另一个实施方案中，其中所述整合素阻断剂包含如或所示的氨基酸序列或由其组成。

在另一个实施方案中，其中所述GnRH激动剂为GnRH或其截短或变体形式。

在另一个实施方案中，其中所述GnRH激动剂包含如PHWSYGLRPG(SEQ ID NO：4)所示的氨基酸序列或由其组成。

在另一个实施方案中，其中所述n1为1至10之间的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选地，第一连接子区包含如(GGGGS)₃(SEQ ID NO：3)所示的氨基酸序列或由其组成；所述n2为1至10之间的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选地，第二连接子区包含如(GGGGS)₃(SEQ ID NO：3)所示的氨基酸序列或由其组成。

在另一个实施方案中，其中所述人免疫球蛋白Fc区段包含人免疫球蛋白重链恒定区或基本上由其构成，例如包含选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的1、2、3或4个结构域或基本上由其构成；还优选地，所述人免疫球蛋白Fc区段来源于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM，更优选IgG；进一步优选地，所述Fc区段来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

在另一个实施方案中，其中所述融合蛋白具有选自以下的结构：第一功能区-第一连接子区-Fc区-第二连接子区-第二功能区，第二功能区-第二连接子区-Fc区-第一连接子区-第一功能区，aapf多肽-第二连接子区-Fc区-第一连接子区-GnRH，和GnRH-第一连接子区-Fc区-第二连接子区-aapf多肽。

在另一个实施方案中，其中所述融合蛋白包含如或所示的氨基酸序列或由其组成。

在第二个方面中，本发明提供了一种多核苷酸，其编码任一如第一个方面中所述的融合蛋白。

在一个实施方案中，其中所述多核苷酸包含如或所示的核苷酸序列。

在第三个方面中，本发明提供了一种细胞，其包含如第二个方面中所述的多核苷酸，并且能够表达整合素阻断剂-GnRH激动剂融合蛋白。

在第四个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的如第一个方面所述的融合蛋白、如第二个方面中所述的多核苷酸、或如第三个方面中所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，其中所述的药物组合物为溶液剂、混悬剂、冻干粉、鼻喷剂或气雾剂形式。

在另一个实施方案中，其中所述的药物组合物通过选自以下的途径施用：静脉推注、静脉滴注、皮下和肌肉注射。

在另一个实施方案中，其中所述药物组合物用于预防和/或治疗肿瘤；其中所述肿瘤选自：起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤以及肉瘤。

在另一个实施方案中，其中所述药物组合物用于预防和/或治疗乳腺癌、前列腺癌或肝癌，尤其是乳腺癌或前列腺癌。

在第五个方面中，本发明提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的对象施用第一个方面中的融合蛋白、第二个方面中的多核苷酸、第三个方面汇总的细胞或第四个方面中的药物组合物。

发明人惊奇地发现，相比于单独给与aapf多肽、戈那瑞林，或aapf多肽与戈那瑞林联合给药，本发明的整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白的抑瘤效果以及对于肿瘤增长速度抑制的效果更为显著，具有很大的临床应用价值。

附图说明

图1为LMRAP对前列腺癌22RV1细胞体外增殖活性的抑制作用效果图。

图2为LMRAP对胃癌细胞MGC-803体外增殖活性的抑制作用效果图。

图3为LMRAP对卵巢癌SKOV3细胞体外增殖活性的抑制作用效果图。

图4为LMRAP对肺癌细胞A549体外增殖活性的抑制作用效果图。

图5为LMRAP对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖活性的抑制作用效果图。

图6为LMRAP对肝癌细胞SMMC-7721体外增殖活性的抑制作用效果图。

图7为LMRAP对结肠癌细胞HCT-116体外增殖活性的抑制作用效果图。

图8为LMRAPA对胶质瘤细胞U87体外增殖活性的抑制作用效果图。

图9为LMRAP对黑色素瘤细胞B16F10体外增殖活性的抑制作用效果图。

图10为LMRAP对前列腺癌细胞株22RV1裸鼠异种移植肿瘤的抑制作用效果图(肿瘤体积)。

图11为LMRAP对前列腺癌细胞株22RV1裸鼠异种移植肿瘤的抑制作用效果图(相对增值率)。

图12为LMRAP对前列腺癌细胞株22RV1裸鼠异种移植肿瘤抑制作用效果图(瘤重)，与模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

图13为LMRAP对前列腺癌细胞株22RV1裸鼠异种移植瘤模型小鼠体重的作用效果图。

图14为LMRAP药代动力学研究血药浓度-时间图。

具体实施方式

定义

本文中使用的术语“氨基酸”包含天然氨基酸、非天然氨基酸、和氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。非天然氨基酸包括但不限于氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β基丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基已酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、2，2氨基二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链赖氨素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、2-哌啶酸和硫代脯氨酸。氨基酸类似物包含在其C-末端羧基、N末端氨基或其侧链基团可逆或不可逆地化学封闭的、或被化学修饰成另一官能团的天然氨基酸和非天然氨基酸，例如甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜和S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。

本文中使用的术语“多肽”或“蛋白质”(亦称“蛋白”)可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。此外，本发明所述的“多肽”或“蛋白”还包含其变体或类似物形式，即通过一个或更多个替换、缺失、插入、融合、截短或其任意组合在氨基酸序列上有所不同的多肽。变体多肽可以是完全功能性的或者可缺乏一种或更多种活性的功能。完全功能性变体可含有例如仅仅保守性改变或非关键残基或非关键区域的改变。功能性变体还可包含相似氨基酸的替换，其导致功能未改变或不显著的改变。可以通过本领域已知的方法鉴定对于功能来说重要的氨基酸，所述方法例如定点诱变或甘氨酸扫描诱变(Cunningham，B.和Wel ls，J.，Science，244：1081-1085，1989)。可以例如通过结构分析如结晶、核磁共振或光亲和标记来确定对于多肽活性来说关键的位点(Smith，L等，J.Mol.Biol.，224：899-904，1992；de Vos，A.等，Science，255：306-312，1992)。

本文中使用的术语“连接子”(linker)是指连接两段多肽的一个或更多个氨基酸。

本文中使用的术语“aapf多肽”是指包含RGD-4C和ES-2的多肽。例如所述aapf多肽可以为AP25，也可以为其它包含RGD-4C和ES-2的多肽。RGD-4C为一种可以结合整合素的多肽，其序列是ACDCRGDCFCG(SEQ ID NO：9)，或者与其相比有一个或更多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸替换、缺失和/或添加的氨基酸序列所形成的功能性变体、片段和类似物。ES-2为内皮抑素的一段氨基酸，其序列为IVRRADRAAVP(SEQ ID NO：10)，或者与其相比有一个或更多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸替换、缺失和/或添加的氨基酸序列所形成的功能性变体、片段和类似物。aapf多肽包含RGD-4C和ES-2，其中RGD-4C和ES-2直接连接，或通过连接子连接。

本文中使用的术语“整合素阻断剂”是指可以同整合素相结合、抑制配体与整合素的结合、从而阻断其生物应答的一类物质。其可以为天然存在的物质或者人工合成的物质，例如ES-2、AP25、aapf多肽，也包含与这些物质相比有一个或更多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸置换、缺失和/或添加的氨基酸序列所形成的功能性变体、片段和类似物。

本文中使用的术语“GnRH激动剂”是指能够激活GnRH的物质，例如天然存在的促性腺激素释放激素，其可以来源于人或动物等不同来源，或者是人工合成的GnRH，也包含与它们相比有一个或更多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸置换、缺失和/或添加的氨基酸序列所形成的功能性变体、片段和类似物。

本文中使用的术语“整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白”是指整合素阻断剂(例如aapf多肽及其功能性变体和片段)、GnRH激动剂(例如GnRH及其功能性变体和片段)与能够增加半衰期的融合伴侣(例如人免疫球蛋白的Fc区段)直接或间接连接形成的一种融合蛋白。

人免疫球蛋白IgG由4个通过二硫键共价连接的多肽(轻链和重链的两个相同拷贝)组成。通过木瓜蛋白酶来蛋白水解IgG分子产生两个Fab片段和一个Fc区段。所述Fc区段由通过二硫键连接在一起的两个多肽组成。每个多肽，从N至C末端，由铰链区、CH2结构域和CH3结构域组成。所述Fc区段结构在所有亚型的人免疫球蛋白中几乎相同。IgG是人血液中最丰富的蛋白之一，其在组成了人血清中总免疫球蛋白的70至75％。

IgG在循环中的半衰期在所有5种类型的免疫球蛋白中是最长的，并且可达到21天。已有报导将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白(参见，例如Capon等人，Nature，337∶525-531，1989；Chamow等人，Tre ndsBiotechnol.，14：52-60，1996；美国专利No.5,116,964和5,541,087)。典型的融合蛋白是一重二聚体蛋白质，系通过IgG Fc绞链区中的半胱氨酸残基与蛋白连接，而形成类似IgG、但缺少CH1区域和轻链的分子。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出的体外药物动力学特性与同种型的人IgG相当类似。因此制造含有与人IgG蛋白质的Fc区域相连的融合蛋白，将有助于延长该物质的循环半衰期和/或增加它的生物活性。

免疫球蛋白的Fc区用作药物载体是安全的，因为它是体内代谢的可生物降解多肽，此外，与整个免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc区具有相对低的分子量，因此在缀合物的制备、纯化和生产上是有利的。由于免疫球蛋白Fc区不包含Fab片段(其氨基酸序列根据抗体亚类而不同并且因此是高度不均一的)，因此可以预期免疫球蛋白Fc区可极大地增加物质的均一性并具有低抗原性。

本发明所使用的术语“免疫球蛋白的Fc区”是指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，而不含免疫球蛋白的重链和轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)的蛋白质。它还可包含重链恒定区处的铰链区。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可含有包含除了重链和轻链的可变区以外的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的Fc区的一部分或全部，只要它具有与天然蛋白质基本相似或更好的生理功能即可。此外，它可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的片段。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可包含1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)一种或更多种结构域与免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合以及6)重链恒定区和轻链恒定区的各个结构域的二聚体。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc区包含天然氨基酸序列及其序列衍生物(突变体)。由于一个或更多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守替换或其组合，氨基酸序列衍生物具有与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fc中，第214至238、297至299、318至322或327至331位处的已知对于结合重要的氨基酸残基可用作修饰的适合靶点。此外，其它多种衍生物也可以，包含其中缺失了能够形成二硫键的区域的、缺失了天然Fc形式N-端处数个氨基酸残基的或者向天然Fc形式的N-端添加了甲硫氨酸残基的衍生物。此外，为了去除效应子功能，缺失可发生于补体结合位点，如C1q结合位点和ADCC位点。制备这样的免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的技术公开于WO 97/34631、WO 96/32478中。

蛋白质和肽中一般不改变分子活性的氨基酸替换是本领域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常发生的替换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，双向皆可。

如果需要，Fc区可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等进行修饰。

上述Fc衍生物是与本发明的Fc区具有相同生物活性或者改善的结构稳定性(例如对热、pH等的结构稳定性)的衍生物。

此外，这些Fc区可以得自从人和包含牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的其他动物中分离的天然形式，或者可以是得自转化的动物细胞或微生物的其重组体或衍生物。在本文中，它们可通过从人或动物有机体分离完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶对它们进行处理而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab区和Fc区，而胃蛋白酶处理则导致产生pFc’和F(ab’)2片段。例如，可对这些片段进行尺寸排阻层析以分离Fc或pFc’。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链、与天然形式相比糖链增加或与天然形式相比糖链减少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可以通过本领域中常用方法完成，如化学法、酶促法和利用微生物的遗传工程方法。从Fc片段去除糖链导致与补体(C1q)的结合亲和力明显降低和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或丧失，从而不会诱导不必要的体内免疫应答。鉴于此，去糖基化或未糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可更适于本发明的目的以作为药物使用。

本发明所使用的术语“去糖基化”意指从Fc区酶促地去除糖部分，而术语“未糖基化”意指Fc区是以无糖基化形式(例如在真核细胞如哺乳动物细胞中或者在原核生物如大肠杆菌中)产生的。

此外，免疫球蛋白Fc区可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区，或者通过其组合或杂合制备而成。优选地，其衍生自IgG或IgM(它们是人类血液中最丰富的蛋白质之一)，最优选衍生自IgG(已知其延长配体结合蛋白质的半衰期)。

本发明所使用的术语“组合”意指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接从而形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由选自以下的两种或更多种片段形成：IgG Fc片段、IgA Fc区段、IgM Fc区段、IgD Fc区段和IgE Fc区段。

本文中使用的术语“制备融合蛋白的方法”包含化学合成法和生物合成法。其中化学合成法为本领域技术人员已知的多肽的化学合成法，例如包含液相合成法和固相合成法；生物合成法为本领域技术人员已知的多肽的生物合成法，包含例如在合适的原核或真核宿主细胞中进行表达，然后通过常规技术从中分离出本发明的整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白，例如，可以首先通过化学合成法合成编码所述肽的核苷酸序列，随后将所述序列克隆到合适的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达；或者，还可以采用诱变法如PCR诱变法从整合素阻断剂或GnRH激动剂融合蛋白获得编码整合素阻断剂或GnRH激动剂融合蛋白的核苷酸序列、并且随后将所述序列以及构建融合蛋白的其他元件的序列克隆到合适的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达。这些技术完全在本领域普通技术人员的能力范围之内，并且在现有技术中有众多的教导。

合适的真核宿主细胞有哺乳动物细胞，例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2。所述细胞优选地生长于适合表达本发明整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白的条件下。至于用于生产或分离本发明的整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白的试剂和条件，则没有任何特别的限制，本领域已知的或商业上可得到的任何体系均可应用。在一个优选的实施方案中，所述整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白通过本领域中已描述的方法获得。

有多种表达载体可用于制备整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白，其可选自真核和原核表达载体。原核表达载体可包含例如质粒如pRSET、pET、pEE和pBAD等，其中可采用的启动子有例如lac、trc、trp、recA或araBAD等。真核表达载体包含有：(i)用于在酵母中表达的载体如pAO，pPIC，pYES，pMET，其中可使用诸如AOX1，GAP，GAL1，AUG1等的启动子；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体如pMT，pAc[delta]，plB，pMIB，pBAC等，其中可使用诸如PH，p10，MT，Ac5，OplE2，gp64，polh等的启动子；和(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体如pSVL，pCMV，pRc/RSV，pcDNA3，pBPV等，以及源自病毒体系的载体如痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等，其中可使用诸如CMV，SV40，EF-1，UbC，RSV，ADV，BPV和β肌动蛋白等的启动子。在一个优选的实施方案中，所述整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白在原核或真核细胞体系中进行表达，并且使用经过密码子优化的编码序列。在一个优选的实施方案中，表达所述整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白的序列包含前导肽和/或信号肽，以利于所述整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白从细胞中分泌到细胞外，从而进行分离纯化。在另一个优选的实施方案中，表达所述整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白的序列不包含前导肽和/或信号肽，其不分泌到细胞外，通过裂解细胞对其进行分离纯化。

药物组合物

本发明的整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白可以有多种用途，包含例如用于抗肿瘤。因此，本发明还提供了一种用于抗肿瘤的药物组合物，其中包含治疗有效量的本发明的融合蛋白，以及任选地药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物可用于抗肿瘤，更优选地所述肿瘤选自：起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤以及肉瘤。

本发明的融合蛋白的治疗有效量取决于给药途径、受试者类型以及所考虑的具体哺乳动物的身体特征。这些因素及其与确定该量之间的关系是医药领域中技术人员熟知的。可调整该量和施用方法以达到最佳效力，从而将肽递送到受试者，但是将取决于医药领域技术人员熟知的因素例如体重、同时用药和其它因素。

本发明的药物组合物可在联合疗法中施用，即与一种或多种其它药剂联合应用，其中所述治疗剂一起施用，或者依次施用。在另一些实施方案中，所述其它药剂可在施用一种或多种本发明的融合蛋白或者其药物组合物之前、期间或之后施用。可用于本发明的所述其它药剂包含例如抗肿瘤药物，和/或其它用于治疗疾病的化合物或组合物。优选地，这样的联合用药可以实现组合的、甚至协同的效果。

本文中使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包含在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述药学上可接受的载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于经口、鼻、瘤内、灌注、皮内、皮下、肌内、病灶内或静脉施用。

根据本发明的组合物可包含润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、矫味物质和/或芳香物质等作为添加剂。

“施与”或者“施用”意指以在药理学上可用的方式向对象提供物质，例如药物组合物。

向对象提供的药物组合物的剂量，是指足以显示其对于所施用对象产生益处的剂量，在本文中也可以被称为“药物有效量”或“有效量”。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于被施用对象的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白1mg/ml-50mg/ml。一般地，本发明的整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白的剂量范围可从约10μg/kg的患者体重到约100,000μg/kg患者体重。在另一些实施方案中，所述剂量范围可以为1mg/ml，2.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，25mg/ml，50mg/ml，以及上述两点间任意的剂量。基于所述组合物，所述剂量可连续递送(例如通过连续泵)，或者以周期性间隔递送。特定组合物多次给药的理想时间间隔可由本领域技术人员确定，而不需过度实验。所提供组合物的其它给药方案是本领域技术人员已知的，其中剂量、施用时间表、给药部位、给药模式等可以与前述有所不同。

本文中使用的术语“对象”是指动物，包含哺乳动物，例如灵长类动物，优选为人；鸟类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔子、猴子和豚鼠；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物等。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包含其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。而且如果提到一个特定的数值，至少会包含该数值，除非文章清楚的表明了其另有所指。

本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，“或”、“或者”意指“和/或”。

本发明还提供一种治疗疾病的方法，所述方法包含向有此需要的对象施用治疗有效量的整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白。在一些实施方案中，所述疾病选自：起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤以及肉瘤。

本发明将通过以下实施例进行进一步说明，其不应以任何方式解释为进一步限制。本申请中所有引用的参考文献的全部内容(包含文章参考、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)均明确地通过引用并入本文。以下实施例中，若未具体指出，所用试剂和材料是能够商业获得的至少分析纯或与此相当级别的产品。

实施例1：

本实施例制备了一种整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白：LMRAP。

(1)载体的构建

通过同源重组的方式将LMRAP编码序列克隆入质粒载体pEE12.4(LonzaBiologics)的EcoRI位点，宿主菌为Trans1-T1细胞(北京全式金生物)。其中，TAA/TGA为终止密码子。

编码LMRAP蛋白的核苷酸序列为：

转化：

取2μl目的基因片段与载体的重组产物，与50μl Transl-T1感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min。

混合物于42℃水浴中热击30s，之后迅速转至冰上冷却2min。

向混合物中加入450μl LB液体培养基，37℃振荡培养1h，便于细菌恢复抗性。

取100μl菌液涂布于氨苄抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中倒置培养16h。

重组质粒的制备：

挑取转化成功的单菌落接种于2ml含有氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养6-7h后进行测序鉴定，序列正确的菌液以0.5％的接种量转接入300ml含有氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rpm摇瓶振荡培养16h后，采用NucleoBond Xtra Midi Plus EF(MN)试剂盒中量制备稳定转染用质粒。

(2)稳定转染筛选

采用Neon电转仪通过电转化的方式将重组质粒转入CHO-K1细胞，电转条件：1400V，20ms，2Pulse。转染后细胞接入5ml 37℃预热的含4mM Gln的Dynamis(Gibco)培养基中静止培养2天，随后以5000cells/well接种96孔板，种板培养基Dynamis，筛选压力50μMMSX(Sigma)，放于37℃，7％CO₂培养箱中静止培养3周。

96孔板中生长起来的高表达克隆从96孔板扩大传代至24孔静止板中，随后进入24深孔板中振荡培养，每孔培养体积2ml，培养基Dynamis+25μM MSX，培养条件37℃，5％CO₂，220rpm。24深孔板中细胞以0.3-0.5×10⁶/ml的密度稀释传代2-4次至克隆适应悬浮培养，选取表达量最高的克隆用于生产和制备蛋白样品。

(3)目的蛋白的生产

细胞按0.5×10⁶/mL的密度接种至1000ml Dynamis培养基中，在37℃，5％CO₂，130rpm摇床上进行14天的补料批培养。第3天降温至34℃，第3、5、7、10天分别补料2×CDEfficientFeedC+(Gibco)，补料量为培养体积的5、5、8、8％，第7、10天nova检测后补糖3g/l，培养14天收获。

(4)目的蛋白的分离纯化

细胞上清液的收集：

将上步得到的细胞液9000rpm，离心15min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤，收集滤出液。

亲和层析：

目的蛋白为Fc融合蛋白，可利用Fc片段与亲和填料Prosep Ultra Plus(Millipore)的特异性吸附来捕获蛋白。首先将柱子用3倍柱体积的平衡液进行平衡，平衡液为PBS，pH 7.0；平衡后上样，根据层析柱实际压力将上样保留时间控制在1-2min之间，上样后使用5倍柱体积平衡液洗涤层析柱；采用50mM NaAc-HAc，pH＝3.6缓冲液洗脱蛋白样品，保留时间控制在3min，观察UV值进行收集；洗脱后蛋白样品用3M Tris回调pH至6.0-7.0之间，进行蛋白定量。

层析柱再生，使用150mM磷酸溶液对填料再生清洗，不收集清洗峰，再使用WFI清洗层析柱，保留时间3min，最后在50mM NaAC-HAc，1％苯甲醇pH 5.2溶液中保存。

超滤浓缩：

选取孔径30KDa膜面积为0.14m²的超滤膜包。膜包先使用0.5M NaOH进行预处理，并用WFI冲洗干净。使用置换液50mM PB，pH 6.6进行膜包润洗，润洗至TANK内pH与置换液pH一致，关闭滤出端并将样品缓慢倒入TANK内，将样品进行循环。样品浓度稳定后，打开滤出端，控制体积浓缩至理论体积后关闭滤出端，进行内循环。待浓度稳定，打开进料口以及滤出端，调节进出口速度，直至稳定体积不变化，换液10倍体积后，关闭进料口，将样品过浓缩一定体积后关闭滤出端。进行内循环，时间为30min，内循环后打开回流端收集样品。倒入一定体积置换液，润洗超滤设备，并与样品收集在一起。最终样品体系为50mM PB，6％蔗糖，pH6.6.，并进行蛋白定量。

实施例2：

本实施例制备了一种整合素阻断剂/GnRH激动剂融合蛋白：LMRAP-A。本实施例中载体的构建、稳定转染筛选、目的蛋白的生产和目的蛋白的分离纯化等步骤和实施例1相同。

编码LMRAP-A蛋白的核苷酸序列为：

实施例3：

LMRAP对多种肿瘤细胞增殖抑制作用

采用CCK-8法检测实施例1中得到的LMRAP对多种肿瘤细胞的增殖的活性抑制作用，包含前列腺癌细胞22RV1、胃癌细胞MGC-803、卵巢癌细胞SKOV3、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肝癌细胞SMMC-7721、结肠癌细胞HCT-116、胶质瘤细胞U87、黑色素瘤细胞B16F10。

取对数生长期细胞进行实验。细胞经消化、计数、制成1×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中(100μl/孔)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；每孔加入含相应浓度的融合蛋白LMRAP，同时设立空白对照组，每组6复孔；将板置于培养箱中培养72h后，显微镜下观察各组细胞形态，每孔加入10μl CCK8溶液(使用Enogene公司的CCK-8商业化的试剂盒)，在细胞培养箱内继续孵育2h，450nm下测定吸光值，并计算增殖抑制率(proliferationinhibition，PI)，公式如下：

其中，N_test为测试组的OD值，N_control为空白对照组的OD值。

数据统计：

试验独立重复6次，数据以mean±SD表示，应用GraphPad Prism 5.0统计软件，两组组间比较采用t检验，多组间比较采用One-way Anova(Dunnett)，^*P＜0.05为有统计学意义。

试验结果见表1-表9：

表1 LMRAP对前列腺癌细胞22RV1的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP能有效抑制前列腺癌细胞22RV1，在6.25μM浓度下，抑制率达到66％左右。

表2 LMRAP对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP能有效抑制胃癌细胞MGC-803，抑制率随浓度增加而提高。在100μM浓度下，抑制率达到50％左右。

表3 LMRAP对卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP能有效抑制卵巢癌细胞SKOV3，在浓度50μM下，抑制率达到40％以上。

表4 LMRAP对肺癌细胞A549的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP能有效抑制肺癌细胞A549，抑制率随浓度增加而提高。

表5 LMRAP对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231，在浓度3.125μM下，抑制率达到50％以上。

表6 LMRAP对肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721，在浓度12.5μM下，抑制率达到50％以上。

表7 LMRAP对结肠癌细胞HCT-116的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP能有效抑制结肠癌细胞HCT-116，在浓度25μM下，抑制率达到50％以上。

表8 LMRAP对胶质瘤细胞U87的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP对胶质瘤细胞U87有一定的抑制作用，抑制率随浓度增加而提高。

表9 LMRAP对黑色素瘤细胞B16F10的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control.

结果显示，LMRAP对黑色素瘤细胞B16F10有一定的抑制作用，抑制率随浓度增加而提高。

实施例4：

LMRAP对前列腺癌裸鼠移植瘤模型的影响

人前列腺癌细胞株22RV1裸鼠移植瘤模型由将细胞22RV1接种于裸鼠腋窝皮下而建立。接种形成移植瘤后再在裸鼠体内传3代后使用。

取对数生长期的22RV1细胞，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×10⁶个/只。用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至80-100mm³左右时挑选生长状态良好且肿瘤大小均一性较好的荷瘤裸鼠96只，随机分成11组，每组8只，模型组加倍，即模型组、LMRAP组(75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg)，AP25对照组、戈那瑞林对照组、AP25+戈那瑞林对照组。各组按相应给药方式给予不同药物，模型组给予等体积生理盐水作为对照。使用测量瘤径的方法动态观察受试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为隔天一次，测量肿瘤直径的同时称量裸鼠体重。第15天时处死小鼠，手术剥取瘤块，瘤组织用10％中性福尔马林固定。

剂量设置：

肿瘤体积(tumor volume，TV))的计算公式为：

TV＝1/2×a×b²

其中a、b分别表示长、宽。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝V_t/V₀。其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

试验结果见表：

表10LMRAP人前列腺癌细胞株22RV1裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响(Mean±SD，模型组n＝16，其余各组n＝8，肿瘤体积：mm³)

注：与模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

结果显示，LMRAP对前列腺癌细胞22RV1裸鼠异种移植瘤生长速度具有显著(**)抑制作用。

表11 LMRAP对人前列腺癌细胞株22RV1裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用，(Mean±SD，模型组n＝16，其余各组n＝8)。

注：与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果显示，LMRAP对前列腺癌细胞22RV1裸鼠异种移植瘤具有显著(**)抑制作用。

实施例5：

LMRAP体内药代动力学研究

SD大鼠尾部静脉给药剂量为12.5mg/kg。实验取样时间点：SD大鼠按照取样时间点分别为-0.083h(给药前)、0h、0.083h、0.167h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h，6只SD大鼠。雌雄各半，并记录其体重。眼框取血，离心取上清，每只血清约100-200μl放入EP管内置于-80°8冰箱保存。

SD大鼠尾静脉注射给予12.5mg/kg LMRAP后浓度-时间曲线见附图14，药代动参数见表13。

表13大鼠单次尾静脉注射12.5mg/kg LMRAP药代动力学参数

实验结果表明，SD大鼠尾静脉注射给予12.5mg/kg剂量LMRAP后，Cmax为93.346±15.722μg/ml，给药后消除半衰期T_1/2β为33.332±11.189h，AUC_0-216为539.94±155.243mg/l×h，CL为0.038±0.0361/h/kg，V_d为1.787±1.5271/kg。此方法建立在AP25单克隆抗体的间接竞争ELISA方法上，特异性高，结果准确。LMRAP是多肽AP25与人源Fc片段融合而成，相比多肽AP25，LMRAP消除半衰期延长到33h，为后期临床前研究提供可靠的数据。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国药科大学

中国食品药品检定研究院

<120> 一种具有抗肿瘤功能的融合蛋白及其制备方法和应用

<130> MP1901068

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> aapf polypeptide_Example 1

<400> 1

Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Ala

1 5 10 15

Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys

20 25

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> aapf polypeptide_Example 2

<400> 2

Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ile Val

1 5 10 15

Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro

20 25

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Linker

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GnRH

<400> 4

Pro His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 291

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Fusion Protein-1

<400> 5

Pro His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

20 25 30

Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

35 40 45

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

50 55 60

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

65 70 75 80

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

85 90 95

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

100 105 110

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

115 120 125

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

145 150 155 160

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

165 170 175

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

180 185 190

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

195 200 205

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

210 215 220

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

225 230 235 240

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp

260 265 270

Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp

275 280 285

Cys Phe Cys

290

<210> 6

<211> 927

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The nucleic acid encoding SEQ ID NO: 5

<400> 6

atgggcgtga aggtgctgtt cgccctgatc tgtatcgccg tggccgaggc tccccactgg 60

tcttacggcc tgagacctgg cggcggcggc ggaagcggag gaggaggatc tggcggcggc 120

gggtctgagt ctaagtacgg accaccatgc ccttcttgcc cagcacccga gtttctgggc 180

ggtccgtctg tgttcctgtt cccgccgaaa ccgaaagaca ccctgatgat ctctcgtact 240

ccggaagtta cctgcgttgt ggtggacgtt tcccaggagg atccggaggt gcagtttaac 300

tggtatgttg acggtgttga agttcataac gcgaagacca aaccgcgcga ggaacagttc 360

aactccacct atcgtgttgt tagcgttctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 420

aaggaataca aatgcaaagt ttctaacaaa ggtctgccga gctctattga gaagactatc 480

tctaaagcga aaggtcagcc gcgtgaaccg caggtttaca ctctgccgcc gtctcaggaa 540

gagatgacca agaaccaggt tagcctgacc tgcctggtga aaggcttcta cccgagcgac 600

atcgcggttg aatgggaatc caacggccag ccggagaaca actacaagac cactccgccg 660

gtgctggact ctgacggtag cttctttctg tactctcgtc tgactgttga caagtctcgt 720

tggcaggaag gtaacgtgtt ctcttgctct gttatgcacg aagcgctgca caaccactac 780

actcagaaat ccctgtctct gagcggtggc ggcggctcgg gcggaggcgg gtctggtggt 840

ggcggatcta tcgtaagaag agcagataga gcagcagtac caggtggcgg cggcgcatgt 900

gattgtagag gtgattgttt ttgttga 927

<210> 7

<211> 291

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Fusion Protein-2

<400> 7

Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ile Val

1 5 10 15

Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

35 40 45

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

50 55 60

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

65 70 75 80

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

85 90 95

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

100 105 110

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

115 120 125

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

130 135 140

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

145 150 155 160

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

165 170 175

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

180 185 190

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

195 200 205

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

210 215 220

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

225 230 235 240

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

245 250 255

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro His Trp Ser Tyr Gly Leu

275 280 285

Arg Pro Gly

290

<210> 8

<211> 975

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The nucleic acid encoding SEQ ID NO: 7

<400> 8

atggccgctc tccagaagtc cgtgtctagc ttcctcatgg gaacactcgc tacatcttgc 60

ctgctcctcc tggctctcct ggtgcagggt ggcgccgccg cttgcgattg cagaggagac 120

tgcttctgcg gaggaggcgg cattgtgaga cgcgctgaca gagctgctgt gccgggtggc 180

ggcggctcgg gcggaggcgg gtctggtggt ggcggatctg agtctaagta cggaccacca 240

tgcccttctt gcccagcacc cgagtttctg ggcggtccgt ctgtgttcct gttcccgccg 300

aaaccgaaag acaccctgat gatctctcgt actccggaag ttacctgcgt tgtggtggac 360

gtttcccagg aggatccgga ggtgcagttt aactggtatg ttgacggtgt tgaagttcat 420

aacgcgaaga ccaaaccgcg cgaggaacag ttcaactcca cctatcgtgt tgttagcgtt 480

ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggaat acaaatgcaa agtttctaac 540

aaaggtctgc cgagctctat tgagaagact atctctaaag cgaaaggtca gccgcgtgaa 600

ccgcaggttt acactctgcc gccgtctcag gaagagatga ccaagaacca ggttagcctg 660

acctgcctgg tgaaaggctt ctacccgagc gacatcgcgg ttgaatggga atccaacggc 720

cagccggaga acaactacaa gaccactccg ccggtgctgg actctgacgg tagcttcttt 780

ctgtactctc gtctgactgt tgacaagtct cgttggcagg aaggtaacgt gttctcttgc 840

tctgttatgc acgaagcgct gcacaaccac tacactcaga aatccctgtc tctgagcggc 900

ggcggcggaa gcggaggagg aggatctggc ggcggcgggt ctccacactg gtcctacggc 960

ctgcggcccg gataa 975

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> RGD-4C

<400> 9

Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> ES-2

<400> 10

Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro

1 5 10

Claims

1.一种整合素阻断剂-GnRH激动剂融合蛋白，其包含第一功能区、第二功能区、Fc区、第一连接子区和第二连接子区；其中：

第一功能区包含整合素阻断剂；

第二功能区包含GnRH激动剂；

Fc区包含人免疫球蛋白Fc区段或其截短或变体形式；

第一连接子区连接第一功能区和Fc区，包含序列(GGGGS)_n1，其中n1是大于等于1的整数；和

第二连接子区连接第二功能区和Fc区，包含序列(GGGGS)_n2，其中n2是大于等于1的整数。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述整合素阻断剂是aapf多肽或其截短或变体形式。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述整合素阻断剂包含如SEQ ID N O:1或SEQID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成。

4.根据权利要求1至3任一项所述的融合蛋白，其中所述GnRH激动剂为GnRH或其截短或变体形式。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述GnRH激动剂包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由其组成。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中

所述n1为1至10之间的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选地，第一连接子区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或由其组成；和/或

所述n2为1至10之间的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选地，第二连接子区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或由其组成。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中所述人免疫球蛋白Fc区段包含人免疫球蛋白重链恒定区或基本上由其构成，例如包含选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的1、2、3或4个结构域或基本上由其构成；还优选地，所述人免疫球蛋白Fc区段来源于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM，更优选IgG；进一步优选地，所述Fc区段来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其具有选自以下的结构：

第一功能区-第一连接子区-Fc区-第二连接子区-第二功能区，

第二功能区-第二连接子区-Fc区-第一连接子区-第一功能区，

aapf多肽-第二连接子区-Fc区-第一连接子区-GnRH，和

GnRH-第一连接子区-Fc区-第二连接子区-aapf多肽。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO:5或7所示的氨基酸序列或由其组成。

10.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白。

11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:6或8所示的核苷酸序列。

12.一种细胞，其包含根据权利要求10或11所述的多核苷酸，并且能够表达整合素阻断剂-GnRH激动剂融合蛋白。

13.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求10或11所述的多核苷酸、或者根据权利要求12所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其为溶液剂、混悬剂、冻干粉、鼻喷剂或气雾剂形式。

15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，其通过选自以下的途径施用：静脉推注、静脉滴注、皮下和肌肉注射。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤，其中所述肿瘤选自：起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发性癌、黑色素瘤以及肉瘤。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗乳腺癌、前列腺癌或肝癌，尤其是乳腺癌或前列腺癌。

18.一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的对象施用根据权利要求1至9任一项所述的融合蛋白，根据权利要求10或11所述的多核苷酸，根据权利要求12所述的细胞，或根据权利要求13至17中任一项所述的药物组合物。