CN111995686A

CN111995686A - 一种具有抗血管生成活性的药物及其制备方法

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Publication number: CN111995686A
Application number: CN202010444595.5A
Authority: CN
Inventors: 李红玉; 李婷; 支德娟; 李洋; 王欣; 史彦斌; 马兴铭; 朱红梅; 王梅竹; 刘燕; 段建功; 张涵姿; 葛广飞; 赵陇和; 岳昭蓉; 何玉红; 刘怡瑶; 宋美娟; 谢飞; 王如玥
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2020-05-23
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-05-23
Also published as: WO2020238924A1; CN111995686B

Abstract

本发明公开了一种血管生成抑制剂及其制备方法，属于基因工程制药领域，具体涉及一种能够作为血管生成抑制剂的融合蛋白。该融合蛋白具有长效的抑制血管生成作用，本发明公开的技术方案一方面提高了血管生成内皮抑素的抗血管生成活性及对黑色素瘤的抑制效果，另一方面又延长其半衰期，进一步增强了稳定性。

Description

一种具有抗血管生成活性的药物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，更具体的说，涉及一种具有抑制血管生成活性的融合蛋白，可应用在抗肿瘤药物领域中。

背景技术

据2018年全国最新研究报告，我国恶性肿瘤新发病例数高达380.4万例，全国癌症死亡人数达229.6万例，因此恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，与心脑血管疾病和意外事故构成当今世界所有国家三大死亡原因。随着社会经济的不断发展，肿瘤的患病率逐年上升，因此，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。

目前治疗肿瘤的手段包括物理治疗(放射疗法，手术摘除)和化学治疗(抗肿瘤药物)，前者对患者机体的损伤较大，后者多数患者会出现严重的副作用，包括恶心，呕吐，掉发等，且患者容易出现抗药性。以上方法皆不能完全根治肿瘤，因为肿瘤细胞往往具有浸润性和转移性，为治疗带来困难。

原发肿瘤的生长与转移是依赖于新生血管完成的，肿瘤的血管既能够为肿瘤的生长提供营养，又能通过血管介导肿瘤细胞转移，在肿瘤的整个生长阶段占有很重要的地位，若能够抑制肿瘤新生血管的形成，既能够阻断肿瘤细胞的营养供给渠道，又能阻断肿瘤细胞的转移渠道，解决了因肿瘤具有转移性而难以治疗的缺点，因此针对肿瘤血管生成的疗法近几年来备受重视，展现出了良好的应用前景。

有研究发现，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢，而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速，说明肿瘤血管的数量与肿瘤的发展程度息息相关。新生血管的形成主要依赖于血管内皮细胞的增殖，迁移和管腔的形成，这是新生血管发生的主要过程，是机体内促血管形成因子和抑制血管形成因子互相协调的结果。肿瘤新生血管发生的具体过程如下：①肿瘤细胞释放促血管形成因子(例如VEGF，bFGF等)，激活血管内皮细胞上的促血管形成因子受体，活化内皮细胞，增加血管通透性；②活化的内皮细胞释放蛋白酶，降解基底膜；③内皮细胞发生增殖和迁移，形成周围基质及萌芽状机构；④芽状机构进一步扩大呈环形，最终形成血管腔；⑤血管腔成熟并稳定，形成新的血管分支。整个血管形成过程是高度有序的。根据肿瘤新生血管形成过程，1971年，Judah Folkman首次提出血管生成对于肿瘤生长和转移的重要性，至今为止，“肿瘤血管生成理论”不断被证实并丰富，研究发现，肿瘤的生长需要大量氧气和养料，为肿瘤细胞提供这些养分的渠道就是血管，并且肿瘤血管能够将肿瘤细胞的有害代谢物质运出，刺激肿瘤生长，当肿瘤生长到一定阶段，会通过与此相连的血管进行转移，根据此过程，“抗血管生成理论”被提出，即通过抑制血管生成从而抑制肿瘤的生长和转移。肿瘤的侵袭转移是肿瘤治疗的难点，而抑制肿瘤血管生成能够有效抑制肿瘤生长所需养分的运输以及转移渠道，所以将肿瘤新生血管作为治疗的靶点来达到抑制肿瘤的方式是目前研究的主要方向。目前抑制肿瘤血管生成的药物有很多，包括抑制基底膜降解的药物，抑制内皮细胞的药物(直接抑制内皮细胞的药物和抑制血管内皮细胞上的特异性整合素的药物)，针对血管生长因子的药物。抑制内皮细胞的药物包括2种，一是直接抑制内皮细胞的生长，如内皮抑素；二是抑制内皮细胞上的特异性整合素的药物，该药物能够作用于整合素的不同配基，阻碍整合素开启的后续通路，抑制内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管形成。目前开发最多的是以促血管生长因子为靶点的药物，该药物能够抑制血管生长因子受体信号，阻断后续信号通路的开启和血管生长因子的分泌，从而达到抑制肿瘤的目的，目前以VEGF及其受体为靶点的药物发展最快，如贝伐单抗，恩度等，但因为肿瘤血管的生成是多种因子协调的结果，其形成的步骤较复杂，涉及许多因子和信号通路，因此单一靶点的药物并不能完全抑制肿瘤的生长和转移，在临床中往往达不到预期的效果，所以多靶点，多途径抑制血管生成成为人们研究的方向之一。

抑制肿瘤新生血管生成的药物较传统抗癌药物相比有以下优点：①实体瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管，因此以血管生成为靶向的药物具有广谱性，能够针对多种实体瘤发挥作用；②部分抑制肿瘤新生血管生成的药物作用于内皮细胞，内皮细胞与癌细胞相比具有突变率低的优点，机体产生抗药性的概率低；③药物可通过血液运输，直接达到靶位点，起效时间快，毒副作用少。

在血管生成过程中，血管内皮细胞粘附分子是一种重要的物质，能够将多种细胞成分粘附在一起，加速新生血管的发生与稳定。其中整合素家族属于血管内皮细胞粘附分子的一种，是跨膜蛋白，能够介导细胞与细胞外基质的粘附，在肿瘤血管新生和肿瘤转移的过程中发挥着重要作用。整合素是由α和β两种亚基组成的，目前共报道了18种α亚基和8种β亚基，不同亚基能够组成24种不同的整合素。整合素调控细胞的双向信号通路，能够识别胞外的配基并与之结合，打开胞内信号通路，介导内皮细胞和肿瘤细胞的粘附和迁移，例如整合素能够参与MAPK信号通路，调控VEGF的表达，促进VEGF与其受体的结合。目前αvβ3和αvβ5是研究较多的两种整合素，关于这两种整合素参与肿瘤恶化的报道很多，一方面整合素能够调控肿瘤细胞表达基质金属蛋白酶，加速胞外基质的降解，促进新生血管发生，一方面能够促进肿瘤自身分泌粘附分子，肿瘤细胞可通过粘附分子进行扩散，实现肿瘤细胞的转移。因此整合素在肿瘤血管生成和肿瘤细胞的生长和转移中发挥着重要作用，整合素也成为治疗肿瘤的重要靶点之一。

αvβ3在多种细胞中得到表达，但只在新生血管内皮细胞和肿瘤细胞表面存在高表达，而在静止的内皮细胞和正常的细胞表面低表达，因此，整合素αvβ3可作为抗血管生成较重要的靶点。αvβ3能够识别配体中Arg-Gly-Asp(RGD)序列，因此RGD在体内可以作为靶向整合素的靶向肽。但RGD序列仅有3个氨基酸构成，若单独存在极易被体内的蛋白酶降解。ZL2005100403785介绍了一种融合肽HM-3，为整合素阻断剂，氨基酸序列为：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。HM-3由2部分组成，内皮抑素活性肽ED(Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)和整合素配体序列(Arg-Gly-Asp)，两者之间由linker(Gly-Gly-Gly-Gly)进行连接，结构式为ED-L-RGD和RGD-L-ED。内皮抑素活性肽ED是内皮抑素的第60-70个氨基酸片段，有研究发现该片段在体外具有抑制血管生成的活性，但体内活性较低，可能与小肽的半衰期较短相关；HM-3将两种序列结合，研究发现该融合小肽具有很好的抗血管新生的效果，既保留了ED的抗血管生成活性，又能发挥RGD的靶向作用。研究证明，HM-3的作用靶点为αvβ3和α5β1，主要以αvβ3为主，体内体外实验皆证明该小肽能够有效抑制血管内皮细胞的迁移和粘附，抑制肿瘤血管的生成，具有较好的抑瘤效果。目前，HM-3在我国已开始临床实验(登记号：CTR20150368)，拟用临床用药是每天进行静脉滴注。

每天注射给药不仅给病患带来巨大的痛苦，也增加了治疗成本，原因是HM-3属于短肽，半衰期较短，为了解决该问题，专利201110370529.9公开了一种HM-3的聚乙二醇修饰的方法，获得了半衰期较长的HM-3，但聚乙二醇化短肽属于化学合成产品，不可避免的存在产品不均一等缺点，不能严格控制产品的质量，给临床带来一定困难。

在化学修饰带来一系列问题的情况下，为了延长药物的半衰期，人们转而寻求一种更优的药物修饰方法，近年来，融合蛋白技术越发成熟，其中，Fc融合蛋白药物和HSA相关融合蛋白技术的发展较快，尤其HSA与Fc相比具有轻微的靶向性并且可以实现单体融合而受到研究者的极大关注。研究发现，HSA相关融合蛋白由于HSA本身是大分子长肽的原因，其分子量较大，与药物连接时极大程度上增大了原药物肽的分子量，机体肾脏对于大分子药物的清除效率低，从而降低机体对相关融合蛋白药物的清除效率，延长了药物的半衰期；再者来说，HSA本身是属于内源性分子，与药物结合时，会对小分子多肽药物结构起到一定的修饰作用，减弱机体对外源小分子多肽药物的免疫排斥反应，在延缓机体对药物的清除作用的同时，也会减弱机体由于外源性小分子多肽药物而引发的细胞毒性作用。

尽管研究者已经对其进行了大量工作，但是至今仅有2种HSA融合蛋白药物上市。无可否认，通过融合蛋白的方式可以在一定程度上延长小分子多肽药物的半衰期，然而不尽如人意的是，将小肽制备成融合蛋白后，针对特定肿瘤的药效并不如单独使用短肽好，因此当使用与目的短肽融合过程中，如何增加融合蛋白的表达效率、增强其药效是提高其成药性的关键所在。

发明内容

本发明发现了一种新的具有抑制血管生成活性的血管生成内皮抑素ME(氨基酸序列为：PIVRRADRAAVPGGGG)，并且构建了血管生成内皮抑素ME的融合蛋白，不仅解决了现有技术存在的采用HSA融合的策略导致药效降低、表达量不理想的问题，而且提高了现有的血管生成内皮抑素活性不高的问题。发明人还意外地发现，虽然小分子多肽HM-3在体外对黑色素瘤细胞B16F10无增殖抑制效果，但是血管生成内皮抑素ME的融合蛋白在体外能够显著抑制黑色素瘤细胞B16F10的增殖，抑制率高达70％。黑色素瘤细胞B16F10皮下移植瘤模型的药效实验结果也显示，相较于小分子多肽HM-3，血管生成内皮抑素ME的融合蛋白具有更长的半衰期，在更低的给药摩尔浓度下具有更高抑制肿瘤的活性。为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

所述融合蛋白采用酵母细胞表达制备。

所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母(Pichia pastoris)。

所述的融合蛋白的制备方法包含以下步骤：

①全基因合成融合蛋白的DNA序列；

②通过基因工程技术连接目的片段与载体，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组酵母表达载体；

③将步骤②所述的重组酵母表达载体转化到大肠杆菌感受态中，经测序成功后，将所述质粒转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白，其中，所述宿主表达系统为嗜甲醇毕赤酵母。

本发明的另一个目的是提供一种含有编码所述融合蛋白DNA序列的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述重组表达载体的宿主表达系统。

本发明的另一个目的是提供一种所述融合蛋白在制备抑制血管生成药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种所述融合蛋白在制备抗实体瘤药物中的应用。

优选地，本发明所述融合蛋白用于制备抗肿瘤药物，尤其可在制备抑制黑色素瘤细胞，结肠癌细胞，胃癌细胞，非小细胞肺癌细胞等实体瘤细胞的药物中应用。

所述抗肿瘤药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、药丸、鼻喷剂或气雾剂。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明发现了一种具有更显著抑制血管生成活性的血管生成内皮抑素；

(2)本发明采用酵母表达系统，酵母表达系统能够对蛋白进行加工，大部分蛋白可以形成正确的高级结构，且酵母表达蛋白收率高，纯度高，纯化简单，增高宿主表达效率；

(3)本发明的融合蛋白可以靶向到新生血管内皮细胞上，体外实验证明该融合蛋白能够抑制新生血管形成，对肿瘤细胞具有选择抑制作用。

(4)虽然小分子多肽HM-3在体外对黑色素瘤细胞B16F10的增殖抑制效果不明显，但是改良后的融合蛋白在体外能够显著抑制黑色素瘤细胞B16F10的增殖，抑制率高达70％。

(5)相较于小分子多肽HM-3，改良后的融合蛋白具有更长的半衰期。

(6)阳性对照药HM-3肿瘤抑制率为38.8％，本发明请求保护的融合蛋白在摩尔浓度仅为阳性对照25％的给药剂量下，肿瘤重量抑制率达到40.4％，即本发明请求保护的融合蛋白在保证药物药效的前提下，给药摩尔浓度更低。

附图说明

图1载体pPinkα-HC图谱

图2载体pPinkα-HC/Fusion protein gene图谱

图3SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况

图4纯化后融合蛋白的SDS-PAGE

图5融合蛋白对HUVEC的细胞增殖抑制作用，CK表示空白对照，Bv是64μg/mL贝伐单抗对照组

图6融合蛋白的划痕实验结果，CK表示空白对照，Bv是64μg/mL贝伐单抗对照组

图7融合蛋白的Tanswell结果，CK表示空白对照，Bv是64μg/mL贝伐单抗对照组

图8融合蛋白抑制HUVEC的体外成管结果，CK表示空白对照，Bv是64μg/mL贝伐单抗对照组

图9融合蛋白对不同癌细胞增殖抑制作用实验结果，a融合蛋白对B16F10的细胞增殖抑制作用；b融合蛋白对HCT-116的细胞增殖抑制作用；c融合蛋白对MDA-MB-231的细胞增殖抑制作用；d融合蛋白对SMMC-7721的细胞增殖抑制作用

图10融合蛋白对小鼠黑色素瘤皮下移植模型治疗作用

具体实施方式

实施例1

一、pPINKα-HC/融合蛋白载体的构建

①全基因合成融合蛋白基因片段，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

②Kpn I和Stu I双酶切pPINKα-HC(Invitrogen公司产品)质粒和融合蛋白基因片段，胶回收获得pPINKα-HC(Kpn I/Stu I)载体和蛋白基因片段，将上述胶回收的pPINKα-HC(Kpn I/Stu I)载体片段和融合蛋白基因片段进行重组反应，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组酵母表达载体。转化大肠杆菌感受态TOP10，涂于氨苄抗性LB板37℃培养过夜，筛选阳性克隆。所得克隆送公司测序；

③将测序正确的pPINKα-HC/融合蛋白质粒DNA用Afl II酶切回收后得到线性化重组质粒片段，转化嗜甲醇毕赤酵母，然后将转化菌液接种于PAD平板，30℃培养3-4天，挑取阳性克隆。将得到阳性克隆分别接种BMGY液体培养基，30℃培养48小时，然后转接至BMMY培养基中诱导表达，持续96小时后，1500rpm低温离心15分钟，取上清，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。

结果如图3所示，融合蛋白的分子量约为70kDa，表达量较高且纯度较好。

实施例2融合蛋白的纯化

根据融合蛋白的性质，首先选择DEAE Sepharose Fast Flow进行纯化，实验过程如下：①样品预处理：表达上清用20mM PB buffer进行透析；②柱平衡：将DEAE Sepharosefast flow纯化填料装入纯化柱中，用20mM PB buffer进行平衡；③上样：将适量样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；④用适量20mM PB buffer冲洗填料，收集流传液，命名为W；⑤洗脱：分别用0.1M NaCl，0.3M NaCl，0.5M NaCl，1M NaCl进行洗脱，收集洗脱液，命名为E1，E2，E3，E4；⑥用0.1M NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为N；⑦用大量蒸馏水冲洗填料，20％乙醇保存填料。SDS-PAGE进行蛋白样品的分析。

选择Phenyl Sepharose Fast Flow进行后续纯化，实验过程如下：

①样品预处理：样品为DEAE Sepharose Fast Flow纯化后收集的E1洗脱液，加入硫酸铵使样品中含有1.5M(NH₄)₂SO₄；

②柱平衡：将Phenyl Sepharose Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用:1.5M(NH₄)₂SO₄+0.1M NaCl buffer进行平衡；

③上样：将适量样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；

④用适量:1.5M(NH₄)₂SO₄+0.1M NaCl buffer冲洗填料，收集流穿液，命名为W；

⑤洗脱：分别用1.0M(NH₄)₂SO₄，0.8M(NH₄)₂SO₄，0.6M(NH₄)₂SO₄，0.5M(NH₄)₂SO₄，0.3M(NH₄)₂SO₄，0.1M(NH₄)₂SO₄，H₂O进行洗脱，收集洗脱液，命名为E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7；

⑥用0.1M NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为N；

⑦用大量蒸馏水冲洗填料，20％乙醇保存填料。SDS-PAGE进行蛋白样品的分析。

10kDa浓缩管进行蛋白样品的浓缩，Lowry法测蛋白浓度。

结果如图4所示，获得纯度>90％的融合蛋白。

实施例3融合蛋白对HUVEC细胞增殖抑制作用

文献报道，贝伐单抗(Avastin)在0-5mg/mL时的HUVEC增殖抑制率和迁移率呈逐渐上升趋势(参考文献：Han YS,Lee JE,Jun JW,Lee JS.Inhibitory effects ofbevacizumab on angiogenesis and corneal neovascularization.Graefes Arch ClinExp Ophthalmol,2009,247:541–548.)，因此在64μg/mL时的抑制率理论上应比16μg/mL大，故而实验中统一用了最大浓度64μg/mL作为对比，即Bv组；HM-3在8μg/mL时的抑制率最高，因此选择8μg/mL作为阳性对照。

实验所用贝伐单抗(Avastin)购自甘肃省肿瘤医院，生产厂家为RocheDiagnostics GmbH，规格是100mg(4ml)/瓶，每瓶含贝伐珠单抗100mg，浓度为25mg/ml，装量为4ml；HM-3由上海吉尔多肽有限公司合成(HM-3氨基酸序列：IVRRADRAAVPGGGGRGD)，95％纯度以上。

采用MTT法检测融合蛋白对HUVEC细胞(购买于苏州BNCC生物技术有限公司)的增殖抑制作用。将HUVEC细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。将融合蛋白用生理盐水稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100μL。以加入融合蛋白作为给药组，Avastin(64μg/mL)和小肽HM-3(8.0μg/mL)作为阳性对照组，以等体积的生理盐水作为空白对照组，在37℃，5％CO₂培养箱孵育48小时。向96孔板中每孔加入15μL 5mg/mL的MTT，继续培养4小时。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在490nm下检测，计算生长抑制率，实验重复3次。实验结果如图5所示。

本实验选用细胞为HUVEC内皮细胞，不同浓度给药，48h以后检测吸光值，64μg/mL的贝伐单抗(Bv)组和8.0μg/mL的小肽HM-3的阳性对照对HUVEC内皮细胞的增殖抑制效果不明显，MTT实验证明融合蛋白对HUVEC的增殖抑制效果在64μg/mL时达到最强，为49.3％。

实施例4划痕法检测融合蛋白抑制人脐静脉内皮细胞迁移的活性

采用细胞划痕法检测融合蛋白对HUVEC细胞的迁移抑制作用。将HUVEC细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为1.0×10⁵个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养。将融合蛋白用生理盐水稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁并增殖到>90％时，用无菌的白枪头进行划线，用PBS洗一遍，除去划线产生的破损细胞，再向空中加入90μL含10％胎牛血清的1640细胞培养液，再加入10μL不同药物。以加入融合蛋白作为给药组，64μg/mL贝伐单抗(Avastin)和小肽HM-3(8.0μg/mL)作为阳性对照组，以等体积的生理盐水作为空白对照组，在37℃，5％CO₂培养箱孵育48小时，显微拍照，计算细胞迁移率，实验重复3次。

通过划痕实验(图6)可以证明该融合蛋白能够显著抑制HUVEC的迁移。融合蛋白在浓度为16μg/ml时，细胞迁移抑制率到最大，抑制率为38.7％左右，HM-3小肽的抑制率为41.2％，而贝伐单抗的抑制率在49.2％，与阴性对照相比皆具有显著性差异。

实施例5Transwell法检测融合蛋白抑制人脐静脉内皮细胞侵袭的活性

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用含10％胎牛血清的1640培养液进行培养，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至80％以上的汇合度时，采用Transwell法检测融合蛋白抑制内皮细胞迁移的活性，内皮细胞HUVEC只用第2-8代，具体操作如下：

①用10mg/mL Matrigel用无血清的1640培养基以1:3稀释，吸取10-20μL均匀铺散在Transwell内室膜上，放置细胞培养箱中10min，加入无血清的1640培养基水合30min；将培养到对数生长期的HUVEC细胞用0.2％EDTA的胰蛋白酶进行消化，收集，经PBS洗涤后用无血清的1640培养基进行稀释，在显微镜下计数，将细胞浓度调整到1×10⁵个/mL；

②将细胞接种到Transwell小室中，100μL/孔，并且将各组试验用液加入小室中，以加入融合蛋白作为给药组，Avastin(64μg/mL)和小肽HM-3(8.0μg/mL)作为阳性对照组，以等体积的生理盐水作为空白对照组，24孔板中加入0.6mL含10％胎牛血清的1640细胞培养液刺激细胞迁移，于5％CO₂，37℃孵育48h；

③弃去孔中培养液，用4％多聚甲醛常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，PBS漂洗3次，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数，计算迁移抑制率，实验重复3次。

Transwell实验(图7)证明，融合蛋白浓度在32μg/ml时出现最佳侵袭抑制率，为61.8％，HM-3抑制率为36.1％，而贝伐单抗的抑制率在57.3％，可见32μg/ml融合蛋白抑制HUVEC侵袭的能力较贝伐单抗强，与阴性对照相比具有显著性差异。

实施例6融合蛋白抑制人脐静脉内皮细胞体外成管的活性

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用含10％胎牛血清的1640培养液进行培养，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至80％以上的汇合度时，采用Transwell法检测融合蛋白抑制内皮细胞迁移的活性，内皮细胞HUVEC只用第2-4代，具体操作如下：(1)用10mg/mL Matrigel用无血清的1640培养基以1:3稀释，吸取50μL均匀铺散在96孔内，放置细胞培养箱中10min，加入无血清的1640培养基水合30min；(2)将培养到对数生长期的HUVEC细胞用0.2％EDTA的胰蛋白酶进行消化，收集，经PBS洗涤后用含10％胎牛血清的1640培养基进行稀释，在显微镜下计数，将细胞浓度调整8×10⁴个/mL，将细胞铺到凝固完全的胶上，100μL/孔，并且将各组试验用液加入小室中，以加入融合蛋白作为给药组，Avastin(64μg/mL)和小肽HM-3(8.0μg/mL)作为阳性对照组，以等体积的生理盐水作为空白对照组，于5％CO₂，37℃孵育6h，显微镜下观察并拍照，计算体外成管数，实验重复3次。

如图8所示，融合蛋白在浓度为32μg/ml时，最佳血管生成抑制率为19.1％，阳性对照组HM-3和贝伐单抗的抑制率分别为16.5％和20.3％，与CK组相比具有显著性差异。

实施例7融合蛋白对不同癌细胞增殖抑制作用

采用MTT法检测融合蛋白对黑素瘤细胞B16F10，结肠癌细胞HCT-116，乳腺癌细胞MDA-MB-231，肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。将B16F10细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。将融合蛋白用生理盐水稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100μL。以加入融合蛋白作为给药组，HSA和小肽HM-3作为对照组，以等体积的PBS作为空白对照组，在37℃，5％CO₂培养箱孵育48小时。向96孔板中每孔加入15μL 5mg/mL的MTT，继续培养4小时。吸去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解。用酶标仪在490nm下检测，计算生长抑制率。实验结果如图9所示。

MTT实验表明融合蛋白对B16F10的增殖抑制效果在18μM时达到最强，为70％左右，但融合蛋白对HCT-116，MDA-MB-231，SMMC-7721的增殖抑制效果不明显，由此可知，融合蛋白对B16F10具有较强选择抑制作用。

MTT实验同时表明HM-3对HCT-116，MDA-MB-231，SMMC-7721的增殖抑制效果不明显，而HM-3对B16F10无增殖抑制效果。

与HM-3相比，融合蛋白表现出对B16F10更强的增殖抑制效果。

实施例8融合蛋白半衰期的测定

SPF级昆明小鼠，随机分8组，雌雄各半，每组6只，将30mg/kg的融合蛋白通过尾静脉注射到老鼠体内分别于给药后0.5h，1h，2h，3h，6h，12h，24h，48h摘除小鼠眼球取血1mL，静置2h分离血清，离心后吸取上层血清用血清稀释液进行稀释，HSA ELISA检测试剂盒(美国Cygnus technologies公司)检测各个时间点小鼠血清中融合蛋白的含量，绘制药物浓度-时间曲线，DAS2.0软件计算融合蛋白的半衰期。

实验结果如表1所示，文献(Zhou K,Zheng X,Xu HM,Zhang J,Chen Y,Xi T,etal.Studies of poly(ethylene glycol)modification of HM-3polypeptides.BioconjugChem 2009,20:932–936.)显示HM-3的半衰期为27min，本发明请求保护的融合蛋白较HM-3来说，半衰期有显著延长，达到17h。

表1融合蛋白单剂量给药后在小鼠体内的药代动力学参数

Name	t1/2(h)	CL(L/h/kg)	AUC(0-∞)(μg/L*h)	Vz(L/kg)
					融合蛋白	17.361	156.616	127.701	3923.597

t1/2(h):血清半衰期

CL(L/h/kg)：静脉注射下的药物表观清除率

AUC(0-∞)：药时曲线下面积

Vz(L/kg)：静脉注射下的表观分布容积

实施例9融合蛋白对小鼠黑色素瘤皮下移植模型的疗效

取SPF级C57BL/6雌性小鼠56只，将培养的B16F10细胞经胰酶消化后，1000rpm离心5min用PBS清洗2遍，将细胞注射到老鼠左腋皮下(1×10⁶cells/100μl/只小鼠),建立皮下移植模型，待肿瘤体积达到50-80mm³进行随机分组，共7组，每组8只，以等体积PBS为空白对照组，以HSA蛋白为阴性对照组，以紫杉醇Taxol和合成药物HM-3肽为阳性对照组，融合蛋白的高(15mg/kg)、中(7.5mg/kg)、低(3.75mg/kg)剂量为实验组，将不同药物通过皮下注射到老鼠体内(远离肿瘤部位)，具体注射方案如下：

每隔2天用游标卡尺测量肿瘤体积并给老鼠称重，注射后第12天颈脱臼处死老鼠，测量肿瘤体积和重量。体积计算公式：长×宽²×0.52，根据肿瘤的重量和体积计算抑制率(肿瘤抑制率＝(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积)。实验结果如图10所示。

实验结果表明，在治疗12天后，在7.5mg/kg(相当于HM-3给药摩尔浓度的12.5％)和15mg/kg(相当于HM-3给药摩尔浓度的25％)药物浓度治疗下，肿瘤体积和重量显著减少，其中，高浓度治疗下的肿瘤重量抑制率最高达到40.4％，而HSA没有明显治疗效果，HM-3肿瘤抑制率为38.8％，由此可知，融合蛋白在摩尔浓度仅为阳性对照25％的给药剂量下，与药物小肽HM-3的治疗效果相当，且半衰期延长。

综上，本发明请求保护的融合蛋白在抑制人脐静脉内皮细胞增殖活性、迁移活性、侵袭活性及其体外成管活性实验中，相较阳性对照组HM-3和贝伐单抗具有更好的治疗作用，能显著抑制血管生成活性；本发明请求保护的融合蛋白取得了意想不到的技术效果，虽然小分子多肽HM-3在体外对黑色素瘤细胞B16F10无增殖抑制效果，但是改良后的融合蛋白在体外能够显著抑制黑色素瘤细胞B16F10的增殖，抑制率高达70％。而且，体内肿瘤抑制实验表明，阳性对照药HM-3肿瘤抑制率为38.8％，本发明请求保护的融合蛋白在摩尔浓度仅为阳性对照25％的给药剂量下，肿瘤重量抑制率达到40.4％，即本发明请求保护的融合蛋白在保证药物表达效率和药效的前提下，给药摩尔浓度更低，且显著提高药物的生物半衰期，降低注射频率，增强患者顺应性，具有良好的治疗前景。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种具有抗血管生成活性的药物及其制备方法

<150> 2019104459866

<151> 2019-05-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 614

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Pro Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His

20 25 30

Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe

35 40 45

Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro

50 55 60

Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys

65 70 75 80

Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His

85 90 95

Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr

100 105 110

Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn

115 120 125

Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu

130 135 140

Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu

145 150 155 160

Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro

165 170 175

Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala

180 185 190

Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu

195 200 205

Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

210 215 220

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe

225 230 235 240

Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu

245 250 255

Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr

260 265 270

Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp

275 280 285

Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu

290 295 300

Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala

305 310 315 320

Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala

325 330 335

Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys

340 345 350

Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro

355 360 365

Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr

370 375 380

Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala

385 390 395 400

Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu

405 410 415

Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe

420 425 430

Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser

435 440 445

Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

450 455 460

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp

465 470 475 480

Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr

485 490 495

Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn

500 505 510

Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro

515 520 525

Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr

530 535 540

Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu

545 550 555 560

Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val

565 570 575

Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp

580 585 590

Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser

595 600 605

Gln Ala Ala Leu Gly Leu

610

<210> 2

<211> 1842

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

cctattgtta gaagagctga tagagctgct gttccaggtg gtggtggtag aggtgacggt 60

ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgat gctcataagt ctgaagttgc tcatagattt 120

aaggatttgg gtgaagaaaa ctttaaggct ttggttttga ttgcttttgc tcaatacttg 180

caacaatgtc catttgaaga tcatgttaag ttggttaacg aagttactga atttgctaag 240

acttgtgttg ctgatgaatc tgctgaaaac tgtgataagt ctttgcatac tttgtttggt 300

gataagttgt gtactgttgc tactttgaga gaaacttacg gtgaaatggc tgattgttgt 360

gctaagcaag aaccagaaag aaacgaatgt tttttgcaac ataaggatga taacccaaac 420

ttgccaagat tggttagacc agaagttgat gttatgtgta ctgcttttca tgataacgaa 480

gaaacttttt tgaagaagta cttgtacgaa attgctagaa gacatccata cttttacgct 540

ccagaattgt tgttttttgc taagagatac aaggctgctt ttactgaatg ttgtcaagct 600

gctgataagg ctgcttgttt gttgccaaag ttggatgaat tgagagatga aggtaaggct 660

tcttctgcta agcaaagatt gaagtgtgct tctttgcaaa agtttggtga aagagctttt 720

aaggcttggg ctgttgctag attgtctcaa agatttccaa aggctgaatt tgctgaagtt 780

tctaagttgg ttactgattt gactaaggtt catactgaat gttgtcatgg tgatttgttg 840

gaatgtgctg atgatagagc tgatttggct aagtacattt gtgaaaacca agattctatt 900

tcttctaagt tgaaggaatg ttgtgaaaag ccattgttgg aaaagtctca ttgtattgct 960

gaagttgaaa acgatgaaat gccagctgat ttgccatctt tggctgctga ttttgttgaa 1020

tctaaggatg tttgtaagaa ctacgctgaa gctaaggatg tttttttggg tatgtttttg 1080

tacgaatacg ctagaagaca tccagattac tctgttgttt tgttgttgag attggctaag 1140

acttacgaaa ctactttgga aaagtgttgt gctgctgctg atccacatga atgttacgct 1200

aaggtttttg atgaatttaa gccattggtt gaagaaccac aaaacttgat taagcaaaac 1260

tgtgaattgt ttgaacaatt gggtgaatac aagtttcaaa acgctttgtt ggttagatac 1320

actaagaagg ttccacaagt ttctactcca actttggttg aagtttctag aaacttgggt 1380

aaggttggtt ctaagtgttg taagcatcca gaagctaaga gaatgccatg tgctgaagat 1440

tacttgtctg ttgttttgaa ccaattgtgt gttttgcatg aaaagactcc agtttctgat 1500

agagttacta agtgttgtac tgaatctttg gttaacagaa gaccatgttt ttctgctttg 1560

gaagttgatg aaacttacgt tccaaaggaa tttaacgctg aaacttttac ttttcatgct 1620

gatatttgta ctttgtctga aaaggaaaga caaattaaga agcaaactgc tttggttgaa 1680

ttggttaagc ataagccaaa ggctactaag gaacaattga aggctgttat ggatgatttt 1740

gctgcttttg ttgaaaagtg ttgtaaggct gatgataagg aaacttgttt tgctgaagaa 1800

ggtaagaagt tggttgctgc ttctcaagct gctttgggtt tg 1842

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白采用酵母细胞表达制备。

3.根据权利要求2所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母(Pichia pastoris)。

4.一种如权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

①全基因合成融合蛋白的DNA序列；

5.一种含有编码如权利要求1所述融合蛋白DNA序列的重组表达载体。

6.一种含有权利要求5所述的重组表达载体的宿主表达系统。

7.如权利要求1所述的融合蛋白在制备抑制血管生成药物中的应用。

8.如权利要求1所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求8所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该融合蛋白在制备抗实体瘤药物中的应用。

10.如权利要求8-9所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于抗肿瘤药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、药丸、鼻喷剂或气雾剂。