CN102827257B - 一组gp96蛋白的多肽片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组gp96蛋白的多肽片段及其应用。本发明提供的多肽片段，为序列表的序列1至序列18中任一所述的多肽片段。所述多肽片段具有如下应用：(1)预防和/或治疗肝炎；(2)预防和/或治疗肝炎引发的肝损伤；(3)抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长和/或侵袭；(4)促进肿瘤细胞的凋亡；(5)抑制肿瘤生长；(6)促进肿瘤细胞中HER2蛋白与gp96蛋白的结合；(7)降低肿瘤细胞中HER2蛋白的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一组gp96蛋白的多肽片段及其应用。
背景技术
热休克蛋白gp96存在于人和动物几乎所有细胞的内质网膜中，也存在于某些细胞的质膜上，它是热休克蛋白90家族(HSP90)中的成员。人的gp96蛋白由803个氨基酸组成，N端21个氨基酸为信号肽序列，因此成熟的蛋白由782个氨基酸组成。Gp96是糖蛋白，该分子拥有6个潜在的糖基化位点。犬类的gp96(与人的gp96高度同源，有98.5的同源性)与ATP结合的晶体结构已经解析，单个分子分为N端结构域、中间(M)结构域和C端结构域，gp96以同源二聚体的形式存在，其N端结合ATP，C端形成二聚化，整个二聚体从C端到N端围绕分子中轴左旋扭曲形成扭曲的V字形。该分子与ATP的结合及发挥水解ATP的功能与其构象变化相关，其构象变化涉及N端结构域和M段结构域的90°的旋转，gp96构象变化引发与其它蛋白的结合或释放。
HER2又称为erbB-2，它是原癌基因属于EGFR家族成员，编码一种酪氨酸激酶受体。该家族共有四个成员即HER1，HER2，HER3和HER4。HER2与该家族的其它三个成员之间可以形成异源二聚体，该异源二聚体与配体结合后，能活化下游信号通路。HER2在正常细胞和肿瘤细胞的生长、分化、恶性转化和抵抗化疗药物的过程中起着重要的作用。HER2的过表达可以向肿瘤细胞提供促有丝分裂的信号，导致肿瘤细胞生长速度加快，并抵抗细胞凋亡。HER2过表达的肿瘤恶性程度高、迁移性和浸润性强，对化疗药物更加不敏感，且治疗后复发的可能性更大。HER2在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达，与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切。大约四分之一的乳腺癌病人有HER2的基因扩增或蛋白过表达，HER2的过表达与淋巴结转移的数目和病人预后不良有关。因此HER2是极具发展前途的治疗靶位，抑制HER2基因表达对治疗HER2阳性的乳腺癌将有着很重要的意义。Trastuzumab(即赫塞汀)是一种人源化的HER2单克隆抗体，对HER2基因扩增和过表达的乳腺癌病人，trastuzumab单独应用或与其它药物联合应用有效率可分别达到25％或50％，赫塞汀目前已成为乳腺癌等治疗的一线药物，销售额位居肿瘤生物治疗药物前列。
发明内容
本发明的目的是提供一组gp96蛋白的多肽片段及其应用。
本发明提供的多肽片段，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的多肽片段；
(b)将序列18的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的添加且与具有相同功能的由序列18衍生的多肽片段。
所述(b)中的多肽片段具体可为序列表的序列1至17中任一所示的多肽片段。
本发明还保护所述的多肽片段的如下(1)至(4)中任一所述的应用：(1)在与gp96蛋白结合中的应用；(2)在抑制胰酶消化gp96蛋白中的应用；(3)在制备与gp96蛋白结合的产品中的应用；(4)在制备抑制胰酶消化gp96蛋白的产品中的应用。
本发明还保护一种产品，它的活性成分为所述多肽片段；所述产品的用途为如下(1)至(7)中的至少一种：(1)预防和/或治疗肝炎；(2)预防和/或治疗肝炎引发的肝损伤；(3)抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长和/或侵袭；(4)促进肿瘤细胞的凋亡；(5)抑制肿瘤生长；(6)促进肿瘤细胞中HER2蛋白与gp96蛋白的结合；(7)降低肿瘤细胞中HER2蛋白的含量。
所述产品中，所述(1)和/或所述(2)中，所述肝炎为自体免疫性肝炎或重型肝炎。所述自体免疫性肝炎具体可为刀豆蛋白引发的自体免疫性肝炎。所述重型肝炎具体可为甘露糖引发的重型肝炎。
所述产品中，所述(3)和/或所述(4)和/或所述(6)和/或所述(7)中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞，优选为乳腺癌细胞SKBR3。
所述产品中，所述(5)中，所述肿瘤是由乳腺癌细胞引发的，所述乳腺癌细胞优选为乳腺癌细胞SKBR3。
所述多肽片段的如下(1)至(7)中任一所述的应用也属于本发明的保护范围：(1)制备预防和/或治疗肝炎的药物；(2)制备预防和/或治疗肝炎引发的肝损伤的药物；(3)制备抑制肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭的药物；(4)制备促进肿瘤细胞凋亡的药物；(5)制备抑制肿瘤生长的药物；(6)制备促进肿瘤细胞中HER2蛋白与gp96蛋白结合的药物；(7)制备降低肿瘤细胞中HER2蛋白含量的药物。
所述应用中，所述(1)和/或所述(2)中，所述肝炎为自体免疫性肝炎或重型肝炎。所述自体免疫性肝炎具体可为刀豆蛋白引发的自体免疫性肝炎。所述重型肝炎具体可为甘露糖引发的重型肝炎。
所述应用中，所述(3)和/或所述(4)和/或所述(6)和/或所述(7)中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞，优选为乳腺癌细胞SKBR3。
所述应用中，所述(5)中，所述肿瘤是由乳腺癌细胞引发的，所述乳腺癌细胞优选为乳腺癌细胞SKBR3。
以上任一所述gp96蛋白具体可为如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列19衍生的蛋白质。
本发明提供的18种多肽片段可竞争性地抑制该α-螺旋的功能，从而阻碍gp96的构象变化。
免疫系统调控失调和过度活化是导致急性乙肝和慢加急性肝炎等肝衰竭疾病的重要原因，Gp96蛋白作为炎症因子，在急性乙肝和慢加急性肝炎等肝衰竭中发挥重要调控作用。Gp96与TLR2和TLR4相互作用，刺激IL-6、IL-12、TNF-α等细胞因子的产生，引发天然免疫；同时通过抗原呈递激活特异性CTL，引发细胞免疫，加重肝损伤。本发明提供的多肽片段可有效抑制gp96的免疫学功能，阻止由gp96引发的天然免疫和细胞免疫，减轻肝损伤症状，对急性乙肝和慢加急性肝炎等肝衰竭疾病有治疗作用。
本发明提供的多肽片段抑制gp96后能明显下调HER2，而且gp96与HER2分子相互作用。通过所述多肽片段下调gp96来抑制HER2，对乳腺癌细胞SKBR3、ZR751细胞增殖有抑制作用，促进细胞凋亡，降低细胞的侵袭性，在小鼠体内对乳腺癌生长有明显抑制作用，因此本发明提供的多肽片段可用于治疗HER2过表达的肿瘤。
附图说明
图1为gp96蛋白的的N端结构域、中间(M)结构域和C端结构域；两个同源聚体分别用绿色和蓝色表示，左为侧面图，右为俯视图。
图2为rgp96蛋白的鉴定图谱；1：分子量标准；2：步骤(二)的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：rgp96蛋白的western blot。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。BALB/c小鼠：购自北京维通利华公司，体重为18-20g。PBS缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、3.625g Na2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4，加水至1L，调pH7.3。
实施例1、制备各种多肽片段
根据三维晶体结构(图1)分析发现gp96蛋白第448-475位氨基酸残基形成一个α-螺旋，该α-螺旋可与分子内的其它序列相互作用，对于gp96蛋白同源二聚体的扭曲张开结构和闭合结构之间的构象变化至关重要。
分别人工合成如下十八条多肽片段：多肽片段P440-480、多肽片段P441-480、多肽片段P442-480、多肽片段P443-480、多肽片段P444-480、多肽片段P445-480、多肽片段P446-480、多肽片段P447-480、多肽片段P448-480、多肽片段P444-475、多肽片段P444-476、多肽片段P444-477、多肽片段P444-478、多肽片段P444-479、多肽片段P440-475、多肽片段P442-475、多肽片段P446-475和多肽片段P448-475。
十八条多肽片段的氨基酸序列如下(由氮末端至碳末端方向)：
多肽片段P440-480：DDLPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P441-480：DLPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P442-480：LPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P443-480：PLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P444-480：LNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P445-480：NVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P446-480：VSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P447-480：SRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P448-480：RETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKY；
多肽片段P444-475：LNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKI；
多肽片段P444-476：LNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIA；
多肽片段P444-477：LNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIAD；
多肽片段P444-478：LNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADD；
多肽片段P444-479：LNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDK；
多肽片段P440-475：DDLPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKI；
多肽片段P442-475：LPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKI；
多肽片段P446-475：VSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKI；
多肽片段P448-475：RETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKI；
以上十八条序列按由上至下的顺序依次为序列表的序列1至序列18。
实施例2、各个多肽片段对gp96蛋白的作用
gp96蛋白(人热休克蛋白；GENBANK ACCESSION NO.AY040226)的氨基酸序列如序列表的序列19所示，其编码序列如序列表的序列20所示。
一、制备重组gp96蛋白(rgp96蛋白)
(一)重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建
1、提取人肝癌细胞HepG2(购自ATCC，产品号HB-8065)的mRNA，反转录合成cDNA。
2、以步骤1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
上游引物：5’-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3’；
下游引物：5’-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3’。
3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号V20520)，回收载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96。
测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码序列)。
6、在重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的BglII酶切位点插入LEU2片段(序列表的序列21所示的DNA)，BamHI酶切位点插入α-淀粉酶报告系统(序列表的序列22所示的DNA)，得到重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96。
(二)rgp96蛋白的表达
1、采用电转化法将重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号MYA-335)细胞，得到重组菌。
2、将重组菌接种于5mL SD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号GMS12117.7)，37℃培养48h，然后转接到100mL SYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号GMS12116.1)，30℃培养48h，得到种子培养液。
3、将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养；使用氨水控制pH维持在5.5；每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上；根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组rgp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵。
(三)rgp96蛋白的分离纯化
将步骤(二)的发酵液离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞；破碎后的细胞12000转/min离心20min，收集上清液；上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液，将滤液进行浓缩，得到浓缩液。
将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTA Purification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h；然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h；将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后上样；用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值＜0.01；用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液(即为rgp96蛋白)；所有操作在4℃下进行，流速为0.5mL/min。
每升步骤(二)的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90％以上的rgp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液进行离子交换层析(Q柱)，主要步骤：200mM NaCl的PBS液平衡；上样；300mM NaCl的PBS液洗杂质；800mM NaCl的PBS液洗目的蛋白。
将步骤(二)的发酵液、亲和层析后的洗脱液(rgp96蛋白)和离子交换层析后的洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后进行考染，见图2。rgp96蛋白的纯度达90％以上。将rgp96蛋白进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号sc-56399)，见图2。
gp96蛋白还可以从人肝癌细胞系HepG2培养细胞，或临床手术切除的肿瘤组织(如乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌或胃癌等各种肿瘤组织)，或人胎盘等组织中提取得到，具体提取方法见论文：Meng S，Song J，Rao Z，Tien P，Gao G.2002.Three-step purification of gp96 from human liver tumor tissues suitable forisolation of gp96-bound peptides.Journal of Immunological Methods，264(1-2)：29-35.。gp96蛋白还可利用汉逊酵母表达得到，具体方法见论文：Li Y，Song H，LiJ，Wang Y，Yan X，Zhao B，Zhang X，Wang S，Chen L，Qiu B，Meng S.2011.Hansenulapolymorpha expressed heat shock protein gp96 exerts potent T cell activationactivity as an adjuvant.J Biotechnol.[Epub ahead of print]PMID：21167226。
二、gp96蛋白与各个多肽片段的相互作用
通过Biacore方法分别检测实施例1制备的各种多肽片段与步骤一制备的gp96蛋白之间的相互作用。检测所用仪器为Biacore3000系统，使用CM5传感芯片，按说明书将gp96蛋白通过氨基偶联固化在CM5传感芯片上，具体方法如下：采用过滤并除气的HBS缓冲盐溶液(10mmol/L HEPES，0.15mol/L NaCl，3.4mol/L EDTA，0.05％P-20；pH7.4)作为流动相溶液，将CM5传感器芯片模块嵌入BIAcore系统；设定流过流动池的流速为5μL/min；用0.2mol/L的N-乙基-N-二甲基-氨丙基碳二亚胺和0.05mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺等体积混合溶液活化CM5传感芯片表面7min；注射35μL 1mg/mL的gp96蛋白到活化表面，使之与CM5传感芯片表面结合；注射35μL乙醇胺使过量的反应基团失活；快速注射10μL 20mmol/L的HCl，然后用Extraclean除去非共价结合型材料；通过在开始注射gp96蛋白前放置第1个基线报道点，并在注射20mmol/L HCl结束后2min放置第2个报道点，来测定结合gp96蛋白的水平；设定结合gp96的流通池为检测通道，未结合gp96蛋白的流通池为参比通道，HBS缓冲溶液为流动相，流通池的流速为10μL/min；同时将待测物注入gp96蛋白流通池和参比流通池，使结合反应在22-24℃，pH7.4的条件下进行；注射10μL多肽片段(使用含1mg/mL羧甲基葡聚糖的HBS缓冲液稀释)检测；快速注射10μL 20mmol/L的HCl，用Extraclean再生gp96蛋白表面；再次注射10μL多肽片段，重复此循环，以测定其结合到gp96蛋白表面的重现性。按上述步骤，分别检测不同浓度级别(156，312，625，1250，2500nmol/L)的多肽片段，每一浓度级别重复测定1次。
各多肽片段与gp96蛋白的结合系数KD(mM/L)见表1。
表1 各多肽片段与gp96结合反应的系数
结果表明，每个多肽片段与gp96蛋白都有亲和力。
三、采用胰酶消化实验检测各个多肽片段对gp96蛋白构象变化的抑制作用
所用胰酶为Modified Trypsin(TPCK-treated)(购自New England BioLabs公司，产品号：P8101S)。
分别检测实施例1制备的各个多肽片段是否能抑制胰酶消化步骤一制备的gp96蛋白，每个多肽片段设置如下四组实验处理：
第一组：将BSA溶于PBS缓冲液，使其终浓度为10μM；
第二组：将BSA和多肽片段溶于PBS缓冲液，BSA终浓度为10μM，多肽片段终浓度为100μM；
第三组：将gp96蛋白溶于PBS缓冲液，使其终浓度为10μM；
第四组：将gp96蛋白和多肽片段溶于PBS缓冲液，gp96蛋白终浓度为10μM，多肽片段终浓度为100μM；
将各实验组于37℃孵育15分钟，然后滴定0.1M柠檬酸至相应的pH值(分别为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0)，然后37℃孵育5分钟，然后加入0.5M Tris至pH7.3；随后在各测试管中加入质量为蛋白质量1/20的胰酶(约2μg)，20℃消化1h；最后，各管加入5×SDS-PAGE蛋白loading Buffer(1mol/L Tirs-HCl(pH6.8)0.6ml，10％SDS2ml，50％甘油5ml，β-巯基乙醇0.5ml，1％溴酚兰1ml，加0.9ml H2O至10ml)，沸水煮样10min，进行SDS-PAGE电泳检测酶切及酶切保护情况。
每种多肽片段都设置不同的pH处理，结果一致，均为：第一、二、三组随pH值降低，BSA蛋白或gp96蛋白被胰酶消化降解；第四组中，gp96蛋白没有随pH值的降低被胰酶消化降解。实验结果证明，每个多肽片段都能抑制胰酶消化gp96蛋白。
实施例3、各个多肽片段对肝损伤的预防作用
一、各个多肽片段抑制刀豆蛋白引发的自体免疫性肝炎的肝损伤
分别将实施例1制备的各个多肽片段进行如下实验：
(1)将多肽片段溶于PBS缓冲液，得到多肽片段溶液；
(2)5只BALB/c小鼠每只腹腔注射200uL多肽片段溶液(含100ug多肽片段)，作为实验组；5只BALB/c小鼠每只腹腔注射200uL PBS缓冲液，作为阳性对照组；
(3)5分钟后，每只小鼠通过尾静脉注射200uL 20mg/kg刀豆蛋白(Con A)，8小时后取血清，通过ALT检测试剂盒(上海荣盛生物有限公司，货号360100)按试剂盒说明检测小鼠血清ALT水平，具体操作步骤如下：
①绘制标准曲线
按表2将各个组分加入不同的反应管，然后每管加入2.4-二硝基苯肼0.50ml混匀，37℃水浴20分钟后，再分别加入0.40M氢氧化钠溶液5.0ml，置室温10分钟；以“0”号管校正“零”点，读取各管在波长505nm处吸光度(A)值；以吸光度(A)值为纵坐标，酶活力单位为横坐标绘制标准曲线。
表2 各个反应管中加入的组分及其用量
| 管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 生理盐水(ml) | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
| 2.0mmol/L丙酮酸钠校准液(ml) | 0.00 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 |
| 丙氨酸氨基转移酶基质液(ml) | 0.50 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 |
| 相当于酶活力单位 | 0 | 28 | 57 | 97 | 150 |
标准曲线为：血清ALT＝619.97*A2+298.8*A-1.8355。
②检测小鼠血清的ALT
在测定前将丙氨酸氨基转移酶基质液在37℃水浴5分钟后，按表3的量和条件加入各个组分；混匀后37℃水浴20分钟后，再分别加入0.40M氢氧化钠溶液5.0ml，置室温10分钟；以对照管校正“零”点，读取在波长505nm处吸光度(A)值；从标准曲线表查得丙氨酸氨基转移酶活力单位。
表3 反应组分的添加量
③检测结果
肝损伤降低比例＝(阳性对照组小鼠的ALT-实验组小鼠的ALT)*100％/阳性对照组小鼠的ALT。ALT的检测结果(5只小鼠的平均值)和肝损伤降低比例(5只小鼠的平均值)见表4。
表4 多肽片段可以降低Con A引发的小鼠ALT水平并抑制肝损伤比例
| 多肽片段 | ALT水平 | 肝损伤降低比例％ | 多肽片段 | ALT水平 | 肝损伤降低比例％ |
| P440-480 | 410.55 | 66.98 | P444-476 | 312.25 | 74.89 |
| P441-480 | 401.75 | 67.69 | P444-477 | 322.05 | 74.10 |
| P442-480 | 793.15 | 36.21 | P444-478 | 263.25 | 78.83 |
| P443-480 | 346.7 | 72.12 | P444-479 | 252.25 | 79.71 |
| P444-480 | 438.25 | 64.75 | P440-475 | 277.8 | 77.66 |
| P445-480 | 461.15 | 62.91 | P442-475 | 234.25 | 81.16 |
| P446-480 | 1084.9 | 12.74 | P446-475 | 237.65 | 80.89 |
| P447-480 | 377.25 | 69.66 | P448-475 | 320.60 | 74.21 |
| P448-480 | 226.15 | 81.81 | 阳性对照组 | 1243.34 | ---- |
| P444-475 | 615.6 | 50.49 |
结果表明，各个多肽片段均可抑制刀豆蛋白(Con A)引发的自体免疫性肝炎引发的肝损伤。
二、各个多肽片段抑制甘露糖引发的重型肝炎的肝损伤
分别将实施例1制备的各个多肽片段进行如下实验：
(1)将多肽片段溶于PBS缓冲液，得到多肽片段溶液；
(2)5只BALB/c小鼠每只腹腔注射200uL多肽片段溶液(含100ug多肽片段)，作为实验组；5只BALB/c小鼠每只腹腔注射200uLPBS缓冲液，作为阳性对照组；
(3)5分钟后，每只小鼠通过尾静脉注射200uL 20mg/kg甘露糖，8小时后取血清，通过ALT检测试剂盒(上海荣盛生物有限公司，货号360100)按试剂盒说明检测小鼠血清ALT水平，具体操作步骤同步骤一的(3)。
ALT的检测结果(5只小鼠的平均值)和肝损伤降低比例(5只小鼠的平均值)见表5。
表5 多肽片段可以降低甘露糖引发的小鼠ALT水平并抑制肝损伤比例
| 多肽片段 | ALT水平 | 肝损伤降低比例％ | 多肽片段 | ALT水平 | 肝损伤降低比例％ |
| P440-480 | 450.26 | 61.86 | P444-476 | 360.78 | 69.44 |
| P441-480 | 416.12 | 64.75 | P444-477 | 410.26 | 65.25 |
| P442-480 | 765.32 | 35.17 | P444-478 | 305.18 | 74.15 |
| P443-480 | 359.68 | 69.53 | P444-479 | 289.26 | 75.50 |
| P444-480 | 450.35 | 61.85 | P440-475 | 312.36 | 73.54 |
| P445-480 | 455.16 | 61.44 | P442-475 | 275.24 | 76.68 |
| P446-480 | 950.52 | 19.48 | P446-475 | 268.58 | 77.25 |
| P447-480 | 360.24 | 69.48 | P448-475 | 348.65 | 70.47 |
| P448-480 | 256.45 | 78.28 | 阳性对照组 | 1180.48 | ---- |
| P444-475 | 652.3 | 44.74 |
结果表明，各个多肽片段均可抑制甘露糖引发的重型肝炎引发的肝损伤。
实施例4、各个多肽片段对gp96与TLR2和TLR4的结合的抑制作用
分别将实施例1制备的各个多肽片段进行如下实验：
一、分组处理
(1)将多肽片段溶于PBS缓冲液，得到多肽片段溶液；
(2)5只BALB/c小鼠每只腹腔注射200uL多肽片段溶液(含100ug多肽片段)，作为实验组；5只BALB/c小鼠每只腹腔注射200uLPBS缓冲液，作为阳性对照组；
(3)5分钟后，每只小鼠通过尾静脉注射200uL 20mg/kg刀豆蛋白(Con A)，24小时后处死小鼠；分别取血清，并剥取小鼠脾脏。
二、各个多肽片段对gp96与TLR2和TLR4的结合的抑制作用
提取步骤一的小鼠脾脏的组织蛋白(蛋白抽提试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，产品号P1250，按产品说明书进行操作)，测定蛋白含量，并用TLR2和TLR4进行免疫共沉淀，通过免疫印迹检测热休克蛋白gp96水平。TLR2抗体和TLR4抗体购自santa cruz公司，产品号分别是sc-10739和sc-16240。Protein G sepharose 4 Fastflow购自GE公司，货号17-0618-01。免疫印迹所用的抗体为gp96大鼠单抗，购自SANTA CRUZ，货号SC-56399。
免疫共沉淀(IP)实验的步骤如下：
1、小鼠脾脏组织蛋白中加入TLR2抗体或者TLR4抗体(每500ug蛋白加2ug抗体)，4℃摇晃过夜。
2、用PBS缓冲液将Protein G sepharose 4 Fast flow洗3遍(12000rpm，2min)。
3、将步骤1处理后的蛋白中加入20ul步骤2处理后的Protein G sepharose 4 Fastflow，4℃震荡1小时。
4、12000rpm离心10min，收集沉淀，尽量将上清吸净。
5、用PBS缓冲液清洗并离心收集沉淀(12000rpm，2min)，连续清洗3次。
6、在沉淀中加入等体积的2×loading buffer，水浴煮沸10min，12000rpm离心30s。
7、将离心后的上清进行10％SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测共沉淀蛋白gp96水平。
实验结果表明，各个多肽片段可抑制gp96与TLR2和TLR4的结合，与TLR2和TLR4相互作用的gp96蛋白均降低50％(5只小鼠的平均值)。
三、各个多肽片段对IL-6、IL-12、TNF-α等细胞因子的作用效果
利用ELISA技术测定步骤一的小鼠血清中IL-6、IL-12、TNF-α含量。IL-6、IL-12、TNF-α检测试剂盒均购自R&D公司，产品号分别为M6000B、M1270和MTA00，实验步骤均按照产品说明书操作。
阳性对照组中，IL-6的检测结果为185.28pg/ml(5只小鼠的平均值)，IL-12的检测结果为30.5pg/ml(5只小鼠的平均值)，TNF-α的检测结果为106.8pg/ml(5只小鼠的平均值)。各个多肽片段实验组相对阳性对照组各个细胞因子含量降低的百分比见表6(5只小鼠的平均值)。
表6 各个多肽片段处理组相对阳性对照组各个细胞因子含量降低的百分比
| 多肽 | IL-6 | IL-12 | TNF-α | 多肽 | IL-6 | IL-12 | TNF-α |
| P440-480 | 41.2％ | 38.3％ | 40.6％ | P444-475 | 47.6％ | 37.9％ | 38.6％ |
| P441-480 | 46.5％ | 35.6％ | 42.3％ | P444-476 | 43.8％ | 39.4％ | 42.6％ |
| P442-480 | 40.0％ | 37.5％ | 39.5％ | P444-477 | 40.2％ | 40.4％ | 40.3％ |
| P443-480 | 44.6％ | 40.2％ | 46.2％ | P444-478 | 41.7％ | 43.0％ | 46.2％ |
| P444-480 | 43.5％ | 38.4％ | 43.6％ | P444-479 | 44.5％ | 38.6％ | 44.4％ |
| P445-480 | 45.8％ | 42.3％ | 40.8％ | P440-475 | 43.4％ | 39.7％ | 39.4％ |
| P446-480 | 39.4％ | 39.6％ | 38.9％ | P442-475 | 39.8％ | 37.1％ | 41.5％ |
| P447-480 | 43.4％ | 41.6％ | 45.2％ | P446-475 | 47.8％ | 41.7％ | 43.8％ |
| P448-480 | 46.8％ | 42.0％ | 43.1％ | P448-475 | 46.5％ | 40.5％ | 45.5％ |
结果表明，各个多肽片段能够不同程度地降低IL-6、IL-12、TNF-α等细胞因子的产生。
四、各个多肽片段对T细胞活化因子CD69的作用效果
分离小鼠脾脏的T细胞，流式细胞术(FACS)检测T细胞活化因子CD69的表达水平；小鼠T细胞活化因子CD69检测试剂盒购自eBioscience公司，货号12-0691-81，实验按照产商说明书操作。
阳性对照组中，T细胞活化因子CD69的检测结果为9.68％(5只小鼠的平均值)。各多肽片段实验组相对阳性对照组各个细胞因子含量降低的百分比(抑制率)见表7(5只小鼠的平均值)。
表7 各个多肽片段处理组相对阳性对照组T细胞活化因子CD69含量降低的百分比
| 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 |
| P440-480 | 47.6％ | P446-480 | 50.8％ | P444-478 | 49.7％ |
| P441-480 | 50.3％ | P447-480 | 48.6％ | P444-479 | 50.6％ |
| P442-480 | 49.4％ | P448-480 | 49.8％ | P440-475 | 48.8％ |
| P443-480 | 51.2％ | P444-475 | 52.1％ | P442-475 | 52.4％ |
| P444-480 | 55.6％ | P444-476 | 53.7％ | P446-475 | 52.2％ |
| P445-480 | 56.4％ | P444-477 | 50.6％ | P448-475 | 53.5％ |
结果表明，各个多肽片段能够降低小鼠脾T细胞活化因子CD69表达水平，抑制小鼠T细胞活化。
实施例5、各个多肽片段对乳腺癌细胞SKBr3的作用效果
乳腺癌细胞SKBr3：购自ATCC(American type culture collection)，产品号为HTB-30。
分别将实施例1制备的各个多肽片段进行如下实验：
一、各个多肽片段抑制乳腺癌细胞SKBr3增殖
通过CCK-8试剂盒(购自日本同仁化学研究所，货号CK04-05)分别检测各个多肽片段对乳腺癌细胞SKBr3增殖的抑制作用。具体操作步骤如下：
1、将SKBr3细胞铺到96孔板中，汇合度为50％左右。每组细胞设三个复孔。
2、待细胞贴壁后，加入多肽片段(终浓度25ug/ml)做为实验组，设三个不加多肽的孔为对照组。
3、在不同的时间检测点(0，3，6，12小时)，每孔中加入CCK-8检测试剂10ul，37℃孵育2小时。
4、测定490nm的OD值。
对照组中OD490平均值为1.36。
细胞生长抑制率计算公式为：(对照组OD490平均值-实验组OD490平均值)/对照组OD490*100％。各个多肽片段处理组的细胞生长抑制率(平均值)见表8。
表8 各个多肽片段处理组的细胞生长抑制率
| 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 |
| P440-480 | 51％ | P446-480 | 52％ | P444-478 | 51％ |
| P441-480 | 50％ | P447-480 | 44％ | P444-479 | 49％ |
| P442-480 | 46％ | P448-480 | 46％ | P440-475 | 46％ |
| P443-480 | 48％ | P444-475 | 45％ | P442-475 | 50％ |
| P444-480 | 50％ | P444-476 | 42％ | P446-475 | 51％ |
| P445-480 | 50％ | P444-477 | 50％ | P448-475 | 47％ |
结果表明，各个多肽片段均能显著抑制乳腺癌细胞SKBr3增殖(生长)。
二、各个多肽片段抑制乳腺癌细胞SKBr3的侵袭力
利用Tanswell plate(购自Corning公司，产品号#3422)和Matrigel(购自BD公司，产品号354234)分别检测各个多肽对乳腺癌细胞SKBr3侵袭能力的影响。细胞侵袭实验根据Transwell和Matrigel说明书进行操作。主要操作步骤如下：
1、实验前一天在冰上过夜冻融Matrigel，在Transwell上层小室中加入60ul的Matrigel，37℃包被1小时，PBS缓冲液洗涤2次。
2、将已消化计数好的乳腺癌细胞SKBr3用含多肽片段的无血清培养液(多肽片段的浓度为25ug/ml)稀释到40万/ml，取100ul加入Transwell上层小室，Transwell下层小室加入600ul完全细胞培养液，作为实验组；用无血清培养液代替含多肽片段的无血清培养液，作为阴性对照组。
3、在CO2孵箱中37℃5％CO2续培养24小时，用棉签刮去上层Transwell小室中的细胞，50％甲醇/50％丙酮固定15分钟后，再用PBS缓冲液洗3次，DAPI封片，荧光显微镜下计数侵袭的细胞数。
阴性对照组中侵袭的细胞数为86。
侵袭抑制率的计算公式为：(阴性对照组中侵袭的细胞数-实验组中侵袭的细胞数)/阴性对照组中侵袭的细胞数*100％。
各个多肽片段处理组相对阴性对照组对SKBr3的侵袭抑制率(平均值)见表9。
表9 各个多肽片段处理组相对阴性对照组对SKBr3侵袭的抑制率
| 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 |
| P440-480 | 46.2％ | P446-480 | 50.3％ | P444-478 | 52.6％ |
| P441-480 | 51.5％ | P447-480 | 44.6％ | P444-479 | 48.4％ |
| P442-480 | 40.3％ | P448-480 | 48.7％ | P440-475 | 44.8％ |
| P443-480 | 47.8％ | P444-475 | 49.5％ | P442-475 | 50.2％ |
| P444-480 | 50.4％ | P444-476 | 41.5％ | P446-475 | 47.5％ |
| P445-480 | 43.6％ | P444-477 | 51.2％ | P448-475 | 49.2％ |
结果表明，各个多肽片段均能有效抑制SKBr3细胞的侵袭功能。
三、各个多肽片段促进乳腺癌细胞SKBr3的凋亡
分别检测各个多肽对乳腺癌细胞SKBr3凋亡的促进作用。具体步骤如下：
1、乳腺癌细胞SKBr3接种于6孔细胞培养板，20万细胞/孔；
2、待细胞贴壁后，加入多肽片段(终浓度25ug/ml)继续培养24小时，作为实验组；用PBS溶液代替多肽片段，作为阴性对照组。
3、运用Invitrogen公司生产的试剂盒
Apoptosis Assay kit对细胞染色后通过流式细胞仪分析结果，具体的操作步骤如下：
(1)用胰酶常规消化细胞，PBS缓冲液洗两遍(细胞数量一般为6孔板的四分之一或一个24孔板的数量为宜)。
(2)用20ul 1x Annexin V Buffer将细胞轻轻悬起来，加入1ul的FITC annexinV后轻轻混匀，室温避光染色15分钟。
(3)向反应管中加入1x Annexin V Buffer使终体积为200ul。
(4)加入浓度为100ug/ml的PI，使其终浓度为1ug/ml，室温避光染色3分钟左右即可上机检测。
阴性对照组中的细胞凋亡率为6.8％。
各个多肽片段处理组相比阴性对照组增加的细胞凋亡率(平均值)见表10。
表10 各个多肽片段处理组比阴性对照组增加的细胞凋亡率
| 多肽 | 凋亡率 | 多肽 | 凋亡率 | 多肽 | 凋亡率 |
| P440-480 | 48.5％ | P446-480 | 52.8％ | P444-478 | 45.8％ |
| P441-480 | 55.5％ | P447-480 | 45.6％ | P444-479 | 51.4％ |
| P442-480 | 43.4％ | P448-480 | 51.3％ | P440-475 | 49.8％ |
| P443-480 | 50.4％ | P444-475 | 49.4％ | P442-475 | 46.7％ |
| P444-480 | 51.6％ | P444-476 | 44.5％ | P446-475 | 48.9％ |
| P445-480 | 47.8％ | P444-477 | 48.8％ | P448-475 | 50.2％ |
结果表明，各个多肽片段均能明显促进SKBr3细胞凋亡。
四、各个多肽片段抑制乳腺癌细胞SKBr3的移植瘤生长
分别检测各个多肽对乳腺癌细胞SKBr3的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
1、将培养至对数生长期的乳腺癌细胞SKBr3皮下接种BALB/c裸鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只接种200万细胞；
2、7天后，可见小鼠形成肿瘤，将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进行如下治疗处理：
多肽治疗组(5只小鼠)：用多肽溶液(多肽溶于PBS缓冲液的溶液)进行腹腔注射治疗，每次每只注射多肽剂量为100ug，每周治疗3次(分别于该周的第一天、第三天和第六天)；
阴性对照组(5只小鼠)：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，注射体积同多肽治疗组，每周治疗3次(分别于该周的第一天、第三天和第六天)；
3、治疗1个月后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率。
阴性对照组小鼠的肿瘤重量(平均值)为1.12g。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(对照组小鼠的肿瘤重量-多肽治疗组小鼠肿瘤的重量)/对照组小鼠的肿瘤重量×100％。
各个多肽处理组的肿瘤抑制率(平均值)结果见表11。
表11 各个多肽处理组的肿瘤抑制率结果
| 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 | 多肽 | 抑制率 |
| P440-480 | 72.3％ | P446-480 | 62.8％ | P444-478 | 65.4％ |
| P441-480 | 62.5％ | P447-480 | 80.5％ | P444-479 | 82.4％ |
| P442-480 | 82.6％ | P448-480 | 69.6％ | P440-475 | 76.4％ |
| P443-480 | 76.4％ | P444-475 | 76.4％ | P442-475 | 81.2％ |
| P444-480 | 70.3％ | P444-476 | 68.7％ | P446-475 | 65.2％ |
| P445-480 | 67.6％ | P444-477 | 73.8％ | P448-475 | 80.0％ |
结果表明，各个多肽片段均能有效抑制乳腺癌细胞SKBr3引起的乳腺癌肿瘤生长。
五、各个多肽片段促进乳腺癌细胞SKBr3中HER2蛋白与gp96蛋白的结合并降低HER2的表达
分别检将各个多肽进行实验。具体步骤如下：
1、乳腺癌细胞SKBr3接种于6孔细胞培养板，20万细胞/孔；
2、待细胞贴壁后，加入多肽片段(终浓度25ug/ml)继续培养24小时，作为实验组；用PBS溶液代替多肽片段，作为阴性对照组。
3、收集细胞，免疫共沉淀和免疫印迹检测HER2蛋白与gp96蛋白的结合以及gp96蛋白的表达水平，FACS检测细胞表面HER2蛋白表达情况。
(1)免疫共沉淀(IP)和免疫印迹检测
试剂：Protein G sepharose 4 Fast flow(GE公司，货号17-0618-01)
细胞裂解液(pH7.5)：20mM Hepes、150mM NaCl、0.5％Triton X-100、1mM EDTA、10％Glycerol、蛋白酶抑制剂抑制剂1片/50mL(抑制剂为多组分药片，属罗氏公司产品，货号04 693 132 001)。
IP抗体：注射用曲妥珠单抗赫赛汀(罗氏公司，货号S20060026；曲妥珠单抗赫赛汀即HER2蛋白的抗体)。
①将细胞上的培养基吸干净，并用冷的PBS缓冲液清洗两遍，在培养皿中加入细胞裂解液(0.8ml/10cm皿)，4℃裂解30分钟，收集裂解液，12000rpm低温离心15分钟，收集上清于1.5ml离心管中，测定蛋白浓度。
②在步骤①的上清中加入IP抗体(曲妥珠单抗赫赛汀1-2ug/500ug蛋白)，4℃摇晃过夜。
③用无蛋白酶抑制剂的细胞裂解液将Protein G sepharose 4 Fast flow洗3遍(12000rpm，2min)，等体积重悬于裂解液中。
④向步骤②的细胞裂解物中加入50ul步骤③的Protein G sepharose 4 Fastflow，4℃摇晃1小时。
⑤12000rpm离心10min，收集沉淀，尽量将上清吸净，用无蛋白酶抑制剂的细胞裂解液洗3遍(12000rpm，2min)，收集沉淀，加入等体积的2×loading buffer，水浴煮沸10min，12000rpm离心30s。
⑥将离心后的液体全部加入到一个上样孔中，吸到无任何液体为止(加入少量的Protein G颗粒对电泳无影响)。
⑦将步骤⑥的液体进行免疫印迹试验，所用的一抗为热休克蛋白gp96单克隆抗体(购自santa cruz，产品号sc-56399)，二抗为HRP标记的IgG抗体(购自SEROTEC公司，产品号为STAR117P)。
结果表明，与阴性对照组相比，实验组的gp96蛋白水平均增加1倍以上。
(2)流式检测膜表面HER2
流式抗体：注射用曲妥珠单抗赫赛汀(罗氏，S20060026).
①消化收集细胞，细胞数控制在106以下，PBS洗2遍(1800rpm，2min)，将细胞收集到1.5ml的EP管中，用200ul 5％BSA将细胞重悬，4℃封闭30min。
②加入1ug注射用曲妥珠单抗赫赛汀，4℃孵育30min.用PBS洗3遍(1800rpm，2min)，以200ul的PBS将细胞重悬起来。
③加入FITC标记山羊抗小鼠二抗2ul，4℃避光孵育30min。PBS洗2次，用300PBS重悬，直接上流式细胞仪检测。
抑制率的计算公式如下：(阴性对照组小鼠的Her表达量-实验组小鼠的Her表达量)/阴性对照组小鼠的Her表达量×100％。
结果见表12。
表12 各种多肽明显抑制乳腺癌细胞Her2的表达
| 多肽 | Her2抑制率 | 多肽 | Her2抑制率 | 多肽 | Her2抑制率 |
| P440-480 | 58.82％ | P446-480 | 62.01％ | P444-478 | 60.15％ |
| P441-480 | 60.03％ | P447-480 | 58.88％ | P444-479 | 59.87％ |
| P442-480 | 62.25％ | P448-480 | 51.38％ | P440-475 | 55.64％ |
| P443-480 | 57.02％ | P444-475 | 50.02％ | P442-475 | 52.35％ |
| P444-480 | 61.54％ | P444-476 | 53.69％ | P446-475 | 50.46％ |
| P445-480 | 58.54％ | P444-477 | 58.38％ | P448-475 | 57.05％ |
结果表明，各种多肽片段能明显抑制Her2的表达水平。
Claims (9)
1.一种多肽片段，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的多肽片段；
（b）序列表的序列1至序列17中任一所示的多肽片段。
2.权利要求1所述的多肽片段的如下（1）至（3）中任一所述的应用：
（1）在抑制胰酶消化gp96蛋白中的应用；
（2）在制备与gp96蛋白结合的产品中的应用；
（3）在制备抑制胰酶消化gp96蛋白的产品中的应用。
3.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述gp96蛋白为由序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.一种产品，它的活性成分为权利要求1所述的多肽片段；所述产品的用途为如下（1）至（7）中的至少一种：
（1）预防和/或治疗肝炎；
（2）预防和/或治疗肝炎引发的肝损伤；
（3）抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长和/或侵袭；
（4）促进肿瘤细胞的凋亡；
（5）抑制肿瘤生长；
（6）促进肿瘤细胞中HER2蛋白与gp96蛋白的结合；
（7）降低肿瘤细胞中HER2蛋白的含量；
所述（1）和所述（2）中，所述肝炎为自体免疫性肝炎或重型肝炎；
所述（3）、所述（4）、所述（6）和所述（7）中，所述肿瘤细胞为乳腺肿瘤细胞；所述（5）中，所述肿瘤是由乳腺肿瘤细胞引发的。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于：所述（3）和/或所述（4）和/或所述（6）和/或所述（7）中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞SKBR3；所述（5）中，所述肿瘤是由乳腺癌细胞SKBR3引发的。
6.如权利要求4-6中任一所述的产品，其特征在于：所述gp96蛋白为由序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
7.权利要求1所述的多肽片段的如下（（1）至（7）中任一所述的应用：
（1）制备预防和/或治疗肝炎的药物；
（2）制备预防和/或治疗肝炎引发的肝损伤的药物；
（3）制备抑制肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭的药物；
（4）制备促进肿瘤细胞凋亡的药物；
（5）制备抑制肿瘤生长的药物；
（6）制备促进肿瘤细胞中HER2蛋白与gp96蛋白结合的药物；
（7）制备降低肿瘤细胞中HER2蛋白含量的药物；
所述（1）和所述（2）中，所述肝炎为自体免疫性肝炎或重型肝炎；
所述（3）、所述（4）、所述（6）和所述（7）中，所述肿瘤细胞为乳腺肿瘤细胞；所述（5）中，所述肿瘤是由乳腺肿瘤细胞引发的。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述（3）和/或所述（4）和/或所述（6）和/或所述（7）中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞SKBR3；所述（5）中，所述肿瘤是由乳腺癌细胞SKBR3引发的。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述gp96蛋白为由序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
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