CN105504058A - 一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法 - Google Patents

一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法。本发明提供了一种制备IGFBP3单克隆抗体的方法，该方法采用基础免疫和加强免疫的方式获得免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合后，以体外培养的方式制备单克隆抗体。本发明通过调整免疫方式、融合条件、体外培养条件，制得的单克隆抗体能够更好的与抗原亲和。实验表明，本发明提供方法制备的单克隆抗体与抗原结合的EC50值不大于0.1，与现有技术中制备的抗体相比具有极显著(p<0.01)的差异。

Description

一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法。
背景技术
身材矮小(shortstature)是指在相似环境下,儿童身高低于同种族个体正常身高2个标准差以上，或者低于正常儿童生长曲线第三百分位。在众多因素中，内分泌的生长激素(GH)对身高的影响起着十分重要的作用。患儿因GH缺乏所导致的矮小，称为生长激素缺乏症，又称为垂体性侏儒症。
IGF-1是一种具有广泛作用的生长激素依赖性细胞因子，对成骨细胞有促进有丝分裂的作用，还可刺激成骨细胞的AKP活性促进骨钙素的合成，对成骨细胞其它分化功能亦有影响。IGF-1在一些患侏儒症、生长激素缺乏症、矮小症等的儿童中，比正常对照组儿童会明显减少。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)是血液中IGF-1的主要载体，它结合了血清中大部分游离的IGF-1，当IGFBP-3与IGF-1结合后,可以减少游离IGF-1的浓度，有利于增强和发挥IGF-1受体的活性，可以延长IGF-1的半衰期,提高血清中的水平。
科学研究发现GH缺乏或不足会影响循环中的IGF-1和IGFBP-3含量；反之，血液IGF-1和IGFBP-3水平也反映了内源性的生长激素的分泌情况，而且数值稳定，几乎没有昼夜变化，所以，检测GH、IGF-1和IGFBP-3能较好反映机体GH的分泌情况，对临床早期诊断矮小症和GH分泌减低患儿有较重要意义。
开发IGFBP-3检测试剂，特别是以ELISA法检测IGFBP-3含量，最重要的环节是IGFBP-3抗体的制备，因此，制备具有更加优秀性能的IGFBP-3抗体是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法，本发明提供方法制备的IGFBP-3的效价较高，与抗原结合的EC50值更高。
本发明提供的制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法，包括：
步骤1：以IGFBP-3蛋白对小鼠进行基础免疫和加强免疫，获得免疫小鼠；
步骤2：使骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾细胞融合后，培养获得杂交瘤细胞；
步骤3：杂交瘤细胞经体外培养获得胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体。
作为优选，小鼠为6～8周龄的Balb/c雌性小鼠。
作为优选，基础免疫的方式为皮下多点注射，剂量为50μg/只～100μg/只。
作为优选，基础免疫的免疫的次数为每隔3天免疫一次，共免疫3次。
优选的，基础免疫中第一次免疫为对每只小鼠注射50μg～100μgIGFBP-3蛋白和等量弗式完全佐剂的混合物。
基础免疫中第二次免疫为对每只小鼠注射50μg～100μgIGFBP-3蛋白和等量弗氏不完全佐剂的混合物。
基础免疫中第三次免疫为对每只小鼠注射50μg～100μgIGFBP-3蛋白和等量弗氏不完全佐剂的混合物。
作为优选，基础免疫第三次免疫后5～7天，进行加强免疫。
作为优选，加强免疫的方式为脾内注射，剂量为50μg/只～100μg/只。
本发明中，加强免疫为对每只小鼠注射50μg～100μg的IGFBP-3蛋白。优选的，注射剂量为100μg/只。
本发明采用的免疫方式能够更有效的引起小鼠的免疫反应，实验表明，以本发明的免疫方式，第二次免疫10～15天后，小鼠鼠尾血清效价可达10-4。并且，加强免疫能够促进脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，提高获得杂交瘤的几率。
作为优选，加强免疫后8～10天，处死小鼠获得免疫小鼠的脾细胞。
作为优选，骨髓瘤细胞采用SP2/0细胞。
作为优选，步骤2中所述融合的骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾细胞的数量比为(3～5)：1。
优选的，骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞的数量比为4：1。
作为优选，步骤2中所述融合的融合剂为PEG。
优选的，融合剂中PEG的质量分数为50％。
作为优选，步骤2中融合的温度为37℃时间为15～30min。
经过15～30min的融合，免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合度达99％。
作为优选，步骤2中培养采用的培养基为含有10％(体积分数)胎牛血清的HAT选择性培养基。
优选的，步骤2中培养的次数为2～3次。
作为优选，步骤3中体外培养的培养基为10％(体积分数)胎牛血清的DMEM/F12培养基；培养温度为37℃培养时间为24h。
经过体外培养，单克隆抗体存在于培养的上清液中。
作为优选，IGFBP-3蛋白的制备方法为：将包含IGFBP-3基因和TEV基因的表达载体转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，制得IGFBP-3蛋白。
本发明采用的IGFBP-3基因来自Genbank，登录号为3486，其制备采用人工合成的方式。TEV基因来自武汉淼灵生物科技有限公司的载体pUC57simple-KF001AG2aFc，采用PCR的方式扩增获得。
所述IGFBP-3蛋白的制备方法，包括：
步骤1：以重叠PCR的方式连接IGFBP-3基因和TEV基因，获得IGFBP3-TEV片段；
步骤2：分别以XbaI和BamHI酶切IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体后，将酶切后的IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体连接获得表达载体；
步骤3：将表达载体转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，获得胰岛素样生长因子结合蛋白3。
作为优选，培养的培养基为含有体积分数为10％的FBS的DMEM培养基。
作为优选，培养的条件为37℃，CO2体积分数为5％。
作为优选，培养过程中静置培养。
作为优选，培养的时间为24小时。
经过转染的293f细胞经培养后，融合蛋白存在于上清液中。融合蛋白经TEV蛋白酶处理具体为：利用GE公司的proteinA预装柱(HiTrapproteinAHP)纯化，样品经proteinA预装柱后，加入含有5％(质量分数)TEV蛋白酶的0.1M，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目的蛋白IGFBP3。
上述IGFBP3蛋白的制备方法所得蛋白的量较大，纯度较高。作为免疫抗原制备抗体，能够引起更高的抗体效价。实验表明，采用本发明提供的方法制备IGFBP3的单克隆抗体，所得单克隆抗体的效价较高，与抗原结合的EC50值较小，说明本发明提供方法制备的单克隆抗体与抗原的亲和性更强。实验重复3次，结果显示皆相似，说明本发明提供的方法具有较好的重现性。
本发明还要求保护本发明提供方法方法制备的单克隆抗体。
本发明提供了一种制备IGFBP3单克隆抗体的方法，该方法采用基础免疫和加强免疫的方式获得免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合后，以体外培养的方式制备单克隆抗体。本发明通过调整免疫方式、融合条件、体外培养条件，制得的单克隆抗体能够更好的与抗原亲和。实验表明，本发明提供方法制备的单克隆抗体与抗原结合的EC50值不大于0.1，与现有技术中制备的抗体相比具有极显著(p<0.01)的差异。
附图说明
图1示琼脂糖凝胶电泳鉴定pUC57-IGFBP3重组子克隆；其中，M1示5kbDNAmarker，条带由上至下依次为5kb，3kb，2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；M2示2kbDNAmarker条带由上至下依次为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1～4示pUC57-IGFBP3表达载体；
图2示细胞培养上清液的SDS-PAGE凝胶电泳；泳道M为蛋白标准品，泳道1为悬浮293f细胞转染前的培养上清，泳道2为悬浮293f细胞转染后的培养上清；
图3示经纯化的IGFBP3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳；M为蛋白标准品。
具体实施方式
本发明提供了一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的实验动物、细胞、试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1IGFBP3蛋白的制备
1、IGFBP3基因的获取及扩增
通过NCBI查找IGFBP3基因序列，登录号为3486。并交由上海生工生物合成IGFBP3基因，克隆到大肠杆菌质粒载体pUC57-simple中，以pUC57simple-IGFBP3载体为模板，PCR扩增IGFBP3基因，
上游引物为F1：TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGGAG，
下游引物为R1：GTGGGGCCTCGTGGTCCCTGGAAATAC。
PCR扩增IGFBP3基因的反应体系为：
PCR扩增IGFBP3基因的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于-20℃保存。
2、TEV基因的扩增
以pUC57simple-KF001AG2aFc(购自武汉淼灵生物科技有限公司)载体为模板，PCR扩增TEV基因：
上游引物为F2：GGACCACGAGGCCCCACAAT；
下游引物为R2：ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT。
PCR扩增TEV基因的反应体系为：
PCR扩增TEV基因的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于-20℃保存。
3、重叠PCR将两个片段连接成IGFBP3-TEV基因，并插入到pUC57-simple载体中。
分别以胶回收的IGFBP3和TEV-mIgG2aFc基因作为模板，PCR扩增IGFBP3-TEV基因，
上游引物为F1：TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGGAG，
下游引物为R2：ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT。
重叠PCR的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收IGFBP3-TEV片段，并置于-20℃保存。
利用XbaI和BamHI酶切制得的IGFBP3-TEV和pUC57-simple载体，产物经琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和pUC57-simple载体，反应体系在水浴锅中16℃过夜连接。
将连接后的载体转化到感受态大肠杆菌DH5α中，取菌液100ul均匀涂在含氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃生化培养箱培养过夜。挑取单克隆，放置于37℃恒温培养箱中，摇菌培养过夜，并利用Promega质粒提取试剂盒提取质粒，所得质粒经通过菌落PCR扩增后利用琼脂凝胶电泳鉴定是否连接成功，电泳结果如图1：图中的1～4在500bp左右具有目的基因条带，说明挑取的单克隆为阳性菌落，重组子克隆成功。
采用脂质体介导转染法将连接成功的质粒转染处于对数期的293f细胞系，转染后，采用DMEM+10％FBS培养基在37度、5％二氧化碳培养箱中静置培养。培养前进行细胞计数，每皿培养细胞数目约为100万个。
培养所获得融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。培养24h后收集上清培养液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察融合蛋白的表达情况。结果如图2。
由图2可知，在蛋白标准品60kDa左右有一条明显加深的蛋白条带，该条带大小符合预期。即为融合蛋白的目的条带。
利用GE公司的proteinA预装柱(HiTrapproteinAHP)纯化，实施例3制得的融合蛋白经proteinA预装柱后，加入含有5％TEV蛋白酶的0.1M，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目的蛋白IGFBP3，最终收集目的蛋白10～15mL；目的蛋白进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察蛋白的纯化情况。结果如图3，图3在60kDa左右有一条目的蛋白条带，而其他杂带已基本没有。重复取样三次进行检测，获得蛋白的浓度为2～3μg/ml；纯化率达到90％以上，获得较高纯度的IGFBP3蛋白。
实施例2～4单克隆抗体的制备
各实施例分别取3只6～8周龄的BALB/c雌性小鼠，依次进行基础免疫和加强免疫。实验设置阴性对照，阴性对照组不进行免疫，正常饲养。
基础免疫为：以实施例1制备的IGFBP3蛋白进行皮下多点注射免疫小鼠，免疫剂量为50～100μg/只，每隔3天免疫一次，共免疫3次；具体如表1。
基础免疫第三次免疫后5～7天，进行加强免疫。加强免疫为脾内注射，剂量为50μg/只～100μg/只。具体如表1。
表1实施例2～4免疫方式
注，表1中免疫剂量以IGFBP-3蛋白质量计
第二次免疫10～15天后小鼠鼠尾取血进行血清效价检测，结果如表2：
表2小鼠鼠尾血清效价
血清稀释度 实施例2 实施例3 实施例4 阴性对照
1:1000 2.438 2.132 2.238 0.066
1:3000 1.542 1.387 1.472 0.043
1:9000 1.189 0.893 1.098 0.041
1:27000 0.321 0.459 0.381 0.046
1:81000 0.193 0.129 0.145 0.50
1:243000 0.084 0.063 0.076 0.066
PBS 0.052 0.048 0.051 0.053
由表2可知，3组免疫鼠的血清效价都达到了10-4，说明免疫的效果较好。
加强免疫8～10天后，取各实施例小鼠脾细胞。
取各实施例免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞以(3～5):1的比例(实施例2的比例为3:1；实施例3的比例为4:1，实施例4的比例为5：1)采用50％(质量分数)PEG为融合剂，37℃进行细胞融合，30min后观察到融合率达到99％，
以含有10％(体积分数)胎牛血清的HAT选择性培养基对格式实例制得的融合细胞，37℃下，通过2～3次克隆化培养及有限稀释后获得稳定表达目的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
各实施例中，选择1株制得的杂交瘤细胞株进行抗体效价检测，检测以商品化IGFBP-3抗体(购自sigma)为对照。检测方法具体为：取实施例2～4细胞株培养上清，采用ELISA法检测单克隆抗体的效价。即以IGFBP3抗原包被酶标板，包被过夜后采用磷酸缓冲液清洗，用BSA封闭2h后采用磷酸缓冲液清洗；加入各待测上清37℃孵育1h后，加入抗鼠IgG酶标二抗，37度孵育1h；缓冲液清洗2-3次，TMB底物显色5～10min后，用2～5MH2SO4终止显色反应，用酶标仪读取450nm吸光度的数值。并采用SPSS软件对所有数据进行处理并采用拟合方式拟合后，当OD值为最高OD值一半时所对应的浓度记为EC50。结果如表3。
表3，各实施例制备杂交瘤细胞分泌单抗效价检测
注：**代表和商品化抗体P<0.01，*代表和商品化抗体P<0.01
所获得的3株杂交瘤细胞株分泌的抗体与抗原结合的EC50数值都比商品化的对照抗体小，说明筛选出的杂交瘤细胞分泌的抗体亲和力更强，适合规模化的抗体生产。
为了证明本申请提供方法的重现性，另取实施例3制得3株杂交瘤细胞，以上述方法检测抗体效价，结果如表4。
表4实施例3制备3株杂交瘤细胞分泌单抗效价检测
结果表明，以本发明提供方法制备的单克隆抗体皆能具有良好的效价，其效果较为稳定，具有良好的重现性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法，其特征在于，包括：
步骤1：以IGFBP-3蛋白对小鼠进行基础免疫和加强免疫，获得免疫小鼠；
步骤2：使骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾细胞融合后，培养获得杂交瘤细胞；
步骤3：所述杂交瘤细胞经体外培养获得胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠为6～8周龄的BALB/c雌性小鼠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基础免疫的方式为皮下多点注射，剂量为50μg/只～100μg/只。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基础免疫的免疫的次数为每隔3天免疫一次，共免疫3次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加强免疫的方式为脾内注射，剂量为50μg/只～100μg/只。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加强免疫后8～10天，处死小鼠获得免疫小鼠的脾细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述融合的骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾细胞的数量比为(3～5)：1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述融合的融合剂为PEG。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，IGFBP-3蛋白的制备方法为：将包含IGFBP-3基因和TEV基因的表达载体转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，制得IGFBP-3蛋白。
10.权利要求1～9任一项所述方法制备的单克隆抗体。
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