CN103012591B - 抗Benzonase单克隆抗体、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗Benzonase单克隆抗体的制备方法，以Benzonase蛋白作为免疫原或将Benzonase的氨基酸肽段与载体蛋白的偶联物作为免疫原获得特异性的抗Benzonase单克隆抗体。本发明的方法获得的单克隆抗体特异性好、灵敏度高，可用于Benzonase及其类似物的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及抗Benzonase单克隆抗体、其制备方法和应用。
背景技术
Benzonase是源于粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）产生的核酸内切酶，能高效地降解所有形式的DNA和RNA（单链、双链、线性、环状）。结构上，该酶由两个相同的亚基通过两个二硫键连接而成，每个亚基有245个氨基酸，分子量～30kDa。Benzonase有效用于实验室重组蛋白表达纯化以及重组药物制备过程中核酸的消化、去除。目前，Benzonase的检测方法之一是利用Benzonase本身的水解活性进行间接进行，但如果Benzonase失去酶解能力就不能检测出Benzonase；另外，可以通过ELISA方法检测Benzonase的含量，但是这种方法使用的抗体是多抗，特异性较差，不能精确定量。
发明内容
本申请的发明人通过研究发现，以Benzonase蛋白作为免疫原或将Benzonase的氨基酸肽段与载体蛋白的偶联物作为免疫原，能够获得灵敏、高效、特异的抗Benzonase单克隆抗体。
本发明的第一个目的在于提供抗Benzonase单克隆抗体的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供根据所述方法制备得到的抗Benzonase单克隆抗体。
本发明的第三个目的在于提供所述抗Benzonase单克隆抗体的应用。
作为本发明的第一个方面，抗Benzonase单克隆抗体的制备方法，以Benzonase蛋白作为免疫原或将Benzonase的氨基酸肽段与载体蛋白的偶联物作为免疫原获得特异性的抗Benzonase单克隆抗体。进一步地，所述方法包括以下步骤：
A）将Benzonase蛋白或Benzonase的氨基酸肽段与载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫动物；
B）将被免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
C）筛选融合的杂交瘤细胞，获得特异性的抗Benzonase单克隆抗体。
其中，所述Benzonase蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述Benzonase的氨基酸肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7中任一项所示。
其中，所述载体蛋白选自：KLH、BSA、OVA，优选为KLH。
其中，所述动物选自：小鼠、大鼠、兔子，优选为小鼠。
作为本发明的第二个方面，根据上述方法制备得到的抗Benzonase单克隆抗体。
作为本发明的第三个方面，所述抗Benzonase单克隆抗体在检测Benzonase及其类似物中的应用。
本发明的单克隆抗体的有益效果：
1、以Benzonase蛋白或Benzonase的氨基酸肽段作为免疫原，所制备的抗体特异地识别核酸内切酶Benzonase及其类似物，能够通过Western Blotting对Benzonase精确定量，并从分子量上作进一步地确认是否为Benzonase；
2、利用此抗体通过Western Blotting可检测出每毫升体系中低于1ng或1unit的Benzonase；
3、能够检测具有酶活或失活的Benzonase。
因此，根据本发明的方法获得的抗Benzonase单克隆抗体特异性好、灵敏度高、适用范围广，可用于Benzonase及其类似物的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明筛选获得的14株单克隆抗体与Benzonase的Western Blotting反应。
图2为本发明制备的单克隆抗体与Benzonase的Western Blotting反应，其中，泳道1-8对应的Benzonase浓度依次为10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml、0.15625ng/ml、0.078125ng/ml。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1、抗Benzonase单克隆抗体的制备
1.1、免疫
根据SEQ ID NO：1所示的Benzonase的氨基酸序列设计特异性的多肽，序列如表1所示。
表1、设计的多肽序列
| 序号 | SEQ ID | 位置 | 氨基酸序列 |
| 1 | NO：2 | 21-41aa | ADTLESIDNCAVGCPTGGS SN |
| 2 | NO：3 | 51-66aa | LNNNSTTKFANWVAYH |
| 3 | NO：4 | 68-83aa | TKDTPASGKTRNWKTD |
| 4 | NO：5 | 132-161aa | ITPQKSDLNQGAWARLEDQERKLIDRADIS |
| 5 | NO：6 | 171-184aa | YERDMGKLPGTQKA |
| 6 | NO：7 | 213-236aa | QNTPKGADFCQFRVTVDEIEKRTG |
委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行多肽合成和载体偶联，将上述合成的多肽分别与匙孔血蓝载体蛋白（KLH，购自Sigma公司）偶联。其中，载体蛋白也可选用牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）等分子量大、结构比较复杂的蛋白，能够增加免疫原性，容易刺激机体产生免疫反应而产生抗体，这对于本领域的技术人员是显而易见的。
然后将所述多肽与载体的偶联物以及Benzonase（购自EMD公司）分别按照表2的免疫程序免疫Balb/c小鼠（来源于武汉大学），免疫部位可以选择皮下、腹腔等部位。免疫动物也可以选择大鼠、兔子等。
表2、免疫程序
| 次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 | 第四次 | 尾静脉 |
| 剂量 | 50μg/次 | 25μg/次 | 25μg/次 | 25μg/次 | 50μg/次 |
| 间隔 | 0 | 3周 | 2周 | 2周 | 4天 |
| 佐剂 | 完全氟氏佐剂 | 氟氏佐剂 | 氟氏佐剂 | 氟氏佐剂 | / |
1.2、细胞融合
1.2.1、融合前骨髓瘤细胞的制备
融合前3-5天，解冻骨髓瘤细胞Sp2/0（来源于武汉吉爱生物技术有限公司），或从6孔板扩大到75cm培养瓶，使细胞大量增殖，并达到对数生长期。融合前夜或融合当天上午，更换30ml新鲜完全培养基（购自GIBCO公司），使细胞达最佳生长状态。融合前，轻轻拍下骨髓瘤细胞，转入一无菌50ml塑料离心管备用。
1.2.2、融合前脾细胞的制备
融合前3-4天，小鼠尾静脉或眼球静脉注射无佐剂抗原50μg/100μlPBS。融合前，用眼科镊子夹离小鼠眼球，立即将眼动脉血滴入一离心管，待血块收缩后离心，收集血清，加NaN3（最终浓度0.05%）防腐。该血清在4℃保存，作为多克隆抗血清用。
拉颈处死老鼠，泡入75%酒精约10分钟。无菌操作使脾脏充分暴露，小心剥离脾脏。用10ml已预温到37℃的无血清培养液（下同，购自GIBCO公司）淋洗脾脏，然后转入100mm直径无菌培养皿（含10-20ml无血清培养液）。用眼科剪子和镊子剔除脾脏表面粘连的脂肪和结缔组织，将处理好的脾脏转入另一100mm培养皿，加入20ml无血清培养液。用无菌注射器吸取无血清培养液后刺入脾脏，小心冲出脾细胞，反复数次，直至脾内细胞全部冲出而变成灰白色为止。静置脾细胞悬液1分钟，待粗块脾细胞下沉，轻轻吸取上层脾细胞悬液，合并到已有30ml骨髓瘤细胞的50ml离心管中，待下一步融合用。
1.2.3、融合
将已加入骨髓瘤细胞与脾细胞的离心管（细胞数的比例为1：5）于1500rpm离心5-10min，去上清。轻轻弹匀细胞沉淀，加入30-40ml无血清培养液，混匀后1500rpm离心5-10min。去上清，轻轻弹匀沉淀。吸取0.5-1ml无菌已37℃预温的PEG（购自Sigma公司），沿管壁缓慢加入，边加边轻轻转动离心管，轻轻混匀。用软塑料滴管吸取1ml无血清培养液，沿管壁轻轻加入，边加边轻轻转动离心管，轻轻混匀。轻轻加入10ml无血清培养液，在3min内加完。然后补充无血清培养液到40ml。离心1500rpm 5-10min，倒掉上清，轻轻弹匀细胞沉淀，加入已预温的HAT培养液（购自Sigma公司），混匀，分种96孔板（在1-2天前已加好100ml来源于正常的Balb/c小鼠的饲养细胞，在HAT培养液中），每孔100ml。置于37度、5%CO2培养箱中培养。
1.3、筛选
将实施例1.2中细胞融合后获得的杂交瘤细胞置于含10%的小牛血清的1640培养基（购自GIBCO公司）中，在37度、5%的CO2恒温培养箱中培养，培养上清通过ELISA和Western Blotting挑选阳性克隆，将阳性克隆进行连续的有限稀释，再次筛选出稳定的阳性单克隆，进行抗体生产，最后筛选得到14株针对Benzonase的特异性单克隆抗体。
其中，ELISA筛选的操作方法如下：
Benzonase按照1μg/ml的浓度包被微孔板，包被液为pH7.6的PBS，4~8℃包被过夜；用含1%的BSA的PBS于37℃封闭2小时后，将微孔板进行室温干燥，干燥好的微孔板干燥保存于4～8℃冰箱。取包被好的96孔微孔板，室温平衡30分钟。将培养的细胞上清加入到微孔板中，100μl/孔，37℃温育30min。取出温育的微孔板，用PBST洗涤液洗涤6次，尽量去除孔中的残液。在微孔板中加入HRP标记的抗鼠二抗，37℃温育30min。取出温育的微孔板，用PBST洗涤液洗涤6次，尽量去除孔中的残液。加入TMB显色液，37℃温育8min左右。加入终止液，混匀后立即用ELISA读数仪读数。将免疫小鼠血清按照1：1000稀释作为阳性对照，将免疫前小鼠血清按照1：1000稀释作为阴性对照，未加样品作为空白对照。
选择培养上清ELISA检测高值的克隆，读数在1.9左右，结果如表3所示。
表3、ELISA检测结果
| 抗体编号 | 免疫原的SEQ ID | ELISA检测结果 |
| 1 | NO：2 | 2.045 |
| 2 | NO：2 | 1.987 |
| 3 | NO：3 | 1.950 |
| 4 | NO：3 | 2.211 |
| 5 | NO：4 | 2.132 |
| 6 | NO：4 | 2.361 |
| 7 | NO：5 | 2.031 |
| 8 | NO：5 | 2.211 |
| 9 | NO：6 | 2.093 |
| 10 | NO：6 | 1.989 |
| 11 | NO：7 | 2.104 |
| 12 | NO：7 | 1.975 |
| 13 | NO：1 | 1.998 |
| 14 | NO：1 | 2.087 |
| 阳性对照 | 2.346 | |
| 阴性对照 | 0.054 | |
| 空白对照 | 0.013 |
然后将上述14株细胞的培养上清进行Western blotting检测，结果如图1和表4所示。
表4、Western blotting检测结果
综上所述，通过Western blotting和ELISA的筛选，成功地获得14株能够分泌抗Benzonase单克隆抗体的杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体对Benzonase具有很好的特异性。
实施例2、抗Benzonase单克隆抗体的应用
根据常规的Western Blotting方法，将商品化的Benzonase进行倍比稀释，然后和本发明中制备的抗Benzonase单克隆抗体进行孵育，如图2所示，结果表明在浓度为0.625ng/ml时还可以看到明显的特异性条带，说明本发明制备抗Benzonase单克隆抗体的灵敏度很高，能够检测出每毫升体系中低于1ng或1unit的Benzonase。
因此，本发明制备的针对Benzonase的单克隆抗体能够根据WesternBlotting显色的结果以及加入的Benzonase内参判断样品中的Benzonase及类似物的含量，所述类似物是指在氨基酸的序列和酶的功能上与Benzonase类似的多肽或蛋白，具体地说，本发明制备的单克隆抗体能够用于包含免疫原全部或部分氨基酸序列的蛋白或多肽的检测，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
Claims (4)
1.抗Benzonase单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将Benzonase的氨基酸肽段与载体蛋白的偶联物作为免疫原获得特异性的抗Benzonase单克隆抗体，所述方法包括以下步骤：
A）将Benzonase的氨基酸肽段与载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫动物；
B）将被免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
C）筛选融合的杂交瘤细胞，获得特异性的抗Benzonase单克隆抗体，
其中，所述Benzonase的氨基酸肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7中任一项所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白选自：KLH、BSA、OVA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物选自：小鼠、大鼠、兔子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法制备的抗Benzonase单克隆抗体在检测Benzonase及如权利要求1的制备方法中所述的Benzonase的氨基酸肽段中的应用。
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