CN1830487A - 血管生成抑制剂hm－3及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程制药技术领域，具体涉及高效血管生成抑制剂及其生产方法与应用。本发明设计了具有整合素亲和性的高效血管生成抑制剂HM－3，该抑制剂含有血管生成抑制蛋白内皮抑素全部氨基酸序列，在其羧基端连接含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列的多肽。本发明HM－3是通过基因工程方法在大肠杆菌中表达，进行包涵体蛋白分离、溶解和复性、离子交换层析分离纯化得到HM－3，产物在体内外实验中都能够显著提高现有血管生成抑制剂内皮抑素抑制内皮细胞生长和抗肿瘤效果，能够作为实体瘤包括胃癌、肺癌、肝癌在内的治疗药物。
Description
一.技术领域：本发明属于生物工程制药技术领域。
二.背景技术
研究表明，实体瘤生长依赖于新生血管生成，新生血管不仅可以提供肿瘤所需要的营养和氧气，排泄代谢产物，而且是远处转移的途径。因此，阻断新生血管形成可能成为阻止肿瘤生长和转移的手段，从而激发了对促血管生成分子和抗血管生成分子的广泛研究。
根据肿瘤的发展，血管生成分为两个阶段：血管前期和血管期。在血管前期，肿瘤稳步生长，肿瘤细胞增长速度基本与细胞凋亡速度持平；在血管期，肿瘤细胞组织快速增长，组织浸润，血源性播散肿瘤细胞，肿瘤细胞的增生速度并未改变，而凋亡速度减缓(O’Reilly，et al.，1996)。因此，根据肿瘤血管生成的不同阶段的生理状态和生化改变为靶点，设计各种血管生成抑制剂，控制肿瘤的生长和转移，就可以达到治疗肿瘤的目的。在阻断肿瘤血管生成方面，现在已经研究、发现了多种血管生成抑制剂。最近，越来越多的研究显示，针对肿瘤血管期，即肿瘤已经建立的血管设计药物，可能有着更广阔的治疗前景。很早，人们就知道肿瘤内皮和周围的基质与正常组织不同，但直到现在才从分子水平认识到这种差别。与正常组织相比，肿瘤血管是高度无序、扭曲的(Konerding，M.A.，et al.，2001)，很难区别动脉和静脉，经常出现分流(血液从动脉直接流入静脉)。肿瘤毛细血管中的血流缓慢，有时出现静止甚至倒流(Tozer，G..M.，1990)。血液和血管内皮出现低氧性缺氧、营养缺乏和酸性物质，在此环境下，肿瘤血管内皮细胞受到刺激，与正常组织内皮细胞相比，增殖迅速，同时诱导内皮细胞特异性分子，如成纤细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，并激活血管新生(Toyokuni，S.，et al，1995)。
内皮抑素是能够抑制内皮细胞增殖的一类血管生成抑制剂，由O‘Reilly等首次发现。内皮抑素是胶原XVIII的C-端片段，分子量为20kDa，能够特异性抑制内皮细胞的增殖和迁移，减少胶质细胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各种原发肿瘤。内皮抑素能够与整合素α5β1相互作用，预示着α5β1可能是endostain的功能靶点。Endostatin具有Zn2+结合位点，这对其抗血管生成活性和分子的稳定性很重要。
国内外大量研究表明，内皮抑素具有体内抑制肿瘤血管生成以及抗肿瘤作用；同时研究表明，利用内皮抑素的抗血管生成治疗方法的最大潜力在于克服了肿瘤治疗中最棘手的问题：耐药性和组织毒性。这是因为：不管来源于任何组织的实体肿瘤，治疗是针对血管内皮细胞的，内皮细胞不会发生变异，也很少发生突变，因此不会导致耐药性；而且内皮细胞是唯一显露于药物的细胞，克服了药物可能到达肿瘤中心的难题。尽管内皮抑素呈现出非常诱人的前景，但其缺陷也非常明显：在动物体内使用时，用量很高，在小鼠动物模型实验时，内皮抑素达到数十毫克/公斤体重，当这些血管生成抑制剂在人体内使用时，使用剂量会更高。这样大的药物使用剂量势必增加日后该类药物毒副作用发生的可能性，造成该类药物质量控制难度加大、生产规模和生产成本增大、药物价格居高。因此，一个好的抗血管生成药物应该有便于生产、成本低、使用很低剂量的药物，就能达到高效的抑制血管生成的效果。
尽管很早就有人提出肿瘤血管靶向性治疗实体瘤的想法(Denekamp，J.，1990)，但是缺乏实验依据。直到1993年，两位学者利用内皮细胞表面表达的MHCII抗原，将其抗体与蓖麻蛋白融合，成功地运输到小鼠肿瘤内皮细胞，此抗体-蓖麻蛋白融合体进入并杀死肿瘤内皮细胞、瓦解血管，使肿瘤消退(Burrows，F.J.& Thorpe，P.E.，1993)。这个实验说明肿瘤血管可以作为治疗的靶点有效地清除肿瘤。要获得肿瘤血管靶向性治疗分子，首先需要筛选肿瘤血管特异性表达的分子标记，才能针对此种分子设计治疗方案。
其中对肿瘤血管生成相关的重要肿瘤血管内皮细胞标记之一是整合素家族的部分成员。
整合素是多种细胞外基质成分的受体，广泛存在于细胞表面，是一个相当大的受体家族。这类受体由一条α链和一条β链组成，在与配体的结合中都起作用，不同α链和β链的组合决定了配体的特异性。到目前为止，已发现15种α链和9种β链。在肿瘤细胞中，整合素的组成成分发生了复杂的变化，大体上讲，参与组织结构的整合素数量下降，而与细胞迁移有关的整合素数量会上升。整合素α5β1、αvβ5、αvβ3等都与血管新生和细胞迁移有关，其中αvβ3可影响癌变中的几个非常重要的过程。它能与多种细胞外基质的糖蛋白结合，细胞的迁移是由细胞外基质决定的，而在具有迁移能力的肿瘤细胞中，αvβ3表达量升高，由于它能与多种细胞外基质结合，这使肿瘤细胞可以在几乎所有细胞外基质上迁移和侵入；αvβ3还能够与金属蛋白酶结合，降解细胞外基质，从而更有利于侵入；另外两个受αvβ3影响的过程是细胞凋亡和血管新生，在参与血管新生的毛细血管内皮细胞上，αvβ3的表达量也升高。在肿瘤血管内皮细胞中，血管生长因子类与整合素的表达有着密切的关系，如VEGF、FGF都能够上调αvβ3的表达。抗αvβ3单克隆抗体能够抑制它的功能，因此能够促进凋亡和抑制血管新生。目前正在研究开发的αvβ3抗体有Vitaxin(LM609)，临床上用于抗血管生成治疗(Gutheil，J.C.et al.2000)，但有资料报道效果并不令人满意(Posey，J.A.et al.2001)。
整合素家族中一部分成员(α5β1、αvβ1、αIIbβ3、αvβ3、αvβ5、αvβ6)有一个共同特征，即能够识别含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列的配体-细胞外基质蛋白，这一重要发现是Pasqualini&Ruoslahti利用噬菌体展示技术证明的(1997)。Christopher(19999)等认为RGD能够诱导凋亡，其作用是通过进入细胞后诱导与凋亡相关的caspase-3自我加工并产生活性实现的。环肽RGD本身半衰期很短，在体内会被肾脏和肝脏快速清除，这一点在小鼠、兔和人体内都得到了证实。但RGD序列可以作为一种载体，与其它试剂偶联并将其靶向运输到肿瘤血管内皮。
三.发明内容
本发明是将抑制血管生成的内皮抑素的氨基酸序列的C端加上含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列，构建了一种对整合素具有结合作用和亲和性的血管生成抑制剂。
本发明的目的是提供一种与整合素有亲和性或结合能力的高效血管生成抑制剂，本发明的高效血管生成抑制剂可以进行不同的原核细胞或真核细胞表达。本发明应用PCR扩增得到目的基因，克隆于原核表达载体，用基因工程手段获得产物，所得产物与内皮抑素比较，具有高效、特异性抑制内皮细胞增殖和抗肿瘤效果，并且用量小，相应减少了药物治疗的副作用。
本发明的技术方案：
1.本发明所述血管生成抑制剂为：
Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-
Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-
Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-
Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-
Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Leu-Leu-
Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys-
Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-
Pro-Thr-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-
Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Lys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-
Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-
Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-
Ser-Phe-Met-Thr-Ala-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-
Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His
其中在血管生成抑制剂HM-3的第185个氨基酸X可以无或被任意天然或非天然存在的氨基酸取代。
2.本发明所述血管生成抑制剂的制备方法：
(1)从人的肝脏组织提取人总RNA，进行反转录，RT-PCR，克隆内皮抑素基因，以此序列为模板，设计上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上适合克隆的酶切位点，PCR扩增，获得HM-3基因。将基因克隆于载体中，筛选阳性克隆，核苷酸序列分析鉴定。
(2)HM-3基因与原核表达载体重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达HM-3，表达产物以包涵体形式存在。
(3)进行包涵体蛋白分离、溶解，并进行Ni+亲和层析分离纯化HM-3蛋白产物，收集穿过液，透析，冻干。
3.本发明所述血管生成抑制剂的活性测定方法：
进行内皮细胞增殖实验和小鼠体内抗肿瘤实验。
4.本发明与现有技术相比其有益效果为：
产物在体内外实验中都能够大幅度改善和提高现有血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长和抗肿瘤效果，副作用小，并且用量小，降低了成本，说明本发明设计的高效血管生成抑制剂科学、合理、可行有效，能作为制备治疗人类新生血管生成有关疾病的药物及实体肿瘤的治疗药物。
四.附图说明：
图1 15％ SDS-PAGE分析纯化的重组HM-3。1：分子量标记；2：15μg纯化的HM-3。
图2内皮细胞分析HM-3抑制增殖情况。
五.具体实施方式：
1. HM-3基因的克隆及其原核表达载体的构建
取内皮抑素基因为模板(本试验室提供)；合成上游引物和下游引物，其中上游引物加入了NdeI酶切位点；下游引物含有Arg-Gly-Asp序列和XhoI位点。进行PCR扩增，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，进行NdeI和XhoI酶切，克隆到原核表达载体pET29a(Novagen)，PCR筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实序列发生了设计的突变。
合成的引物1：5′GCCATATGCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGG 3′
合成的引物2：
5′GGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCAGTCGCATGCACCACCACCACC 3′
其中，引物1编码了NdeI位点和内皮抑素的部分序列，引物2编码XhoI位点和含有Arg-Gly-Asp序列的基因。
2.为了比较本发明所设计的血管生成抑制剂HM-3的实际效果，本实例中我们同时克隆表达了内皮抑素基因。
3.重组菌的诱导表达
准备细胞，接种，诱导表达。在细胞OD600＝0.5时，用1mM IPTG诱导3小时，收集细胞，加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer(20mM Tris-HClpH7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol，6M Guanidium HCl)和1mM PMSF。将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。15000转/分，4度离心15分钟。取上清，置于冰上备用或-20度保存。
4.重组蛋白HM-3分离纯化
将NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol，6M Guanidium HCl)洗。将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。用5倍NTA体积GuNTA-200(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol，6M Guanidium HCl，200mM Imidazole)洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，4℃透析，透析液为buffer A(10mM Tris-HCl，1mM氧化型谷胱甘肽和1mM还原型谷胱甘肽，pH7.4)，6-8h换液一次，最后透析一次，透析液为buffer B(10mM Tris-HCl，pH7.4)，SDS/PAGE分析。
层析结果如图1所示。
5.内皮细胞增殖分析
培养BCE细胞和NIH 3T3细胞，方法：培养液DMEM含10％灭活小牛血清(BCS)，1％抗生素及3ng/ml bFGF。细胞增殖分析方法如下：PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化，加入培养液悬浮细胞并离心收集细胞，调整细胞浓度至25,000cells/ml。将细胞移入6孔板(0.5ml/well)，培养24h.，更换培养基为1mlDMEM，5％BCS，1％抗生素，1ng/ml bFGF，每孔加入不同剂量的样品，进一步培养48h，胰蛋白酶消化细胞，重悬于PBS，用70％冰冷乙醇固定30min，7-AAD染色，用流式细胞仪进行分析。
结果显示：重组HM-3能够特异性抑制内皮细胞-BCE细胞的增殖，而对非内皮细胞-NIH 3T3则没有抑制作用。抑制BCE增殖的ED50大约为0.3μg/ml，而内皮抑素的ED50大约为0.5μg/ml。以上实验说明本发明所设计的高效血管生成抑制剂确实显著提高了现有的血管生成的生物活性。
结果如图2所示。
6.动物体内抗肺癌实验
将培养的鼠Lewis肺癌细胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种5×105细胞0.1ml。当肿瘤平均体积达到200mm3-300mm3，随机将小鼠分组，每组12只，其中一组接受HM-3治疗，一组用内皮抑素治疗，以上两组剂量均为5mg/kg/d，对照注射PBS。治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式：肿瘤体积＝长×宽2×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。
如表1所示，结果表明，在第10天时，HM-3的肿瘤抑制率为85％，而内皮抑素的肿瘤抑制率为37％(两两比较P＜0.05)。以上实验说明本发明所设计的高效血管生成抑制剂能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。
表1.HM-3体内抑制鼠Lewis肺癌的效果
| 治疗天数 | |||||
| 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | |
| rhE(5mg/kg)*HM-3(5mg/kg)*PBS | 0.117±0.0640.113±0.080.114±0.08 | 0.404±0.220.149±0.100.618±0.33 | 0.506±0.520.165±0.110.825±0.58 | 1.011±0.580.245±0.121.359±0.74 | 1.716±1.020.408±0.212.722±1.14 |
7.小鼠HAC肝癌模型抑瘤效应
将培养的鼠HAC肝癌细胞株用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在F1(6-8周)小鼠体侧皮下接种5×105细胞0.1ml。当肿瘤平均体积达到200mm3-300mm3，随机将小鼠分组，每组12只，治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式：肿瘤体积＝长×宽2×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。
分阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(内皮抑素)与HM-3治疗组进行研究，皮下注射给药，如表2所示，结果表明，在第10天时，治疗组抑瘤率为78％，阳性对照内皮抑素组30％(两两比较P＜0.05)。
表2.HM-3体内抑制鼠HAC肝癌的效果
| 治疗天数 | |||||
| 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | |
| rhE(5mg/kg)*HM-3(5mg/kg)*PBS | 0.105±0.070.120±0.050.108±0.09 | 0.568±0.110.165±0.120.712±0.25 | 0.598±0.380.171±0.140.905±0.43 | 1.170±0.500.488±0.111.625±0.65 | 2.051±1.000.645±0.212.932±1.14 |
8. HM-3对人胃腺癌裸小鼠移植瘤SGC-7901的实验治疗作用
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称鼠重。实验组皮下注射蛋白，每周5次，共2周，阴性对照组同时给等量生理盐水。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
TRTV：治疗组瘤体积；CRTV：阴性对照组瘤体积。
如表3所示，结果表明，在第10天时，治疗组抑瘤率为50％，阳性对照内皮抑素组39％(两两比较P＜0.05)。
表3.HM-3对人胃腺癌裸小鼠移植瘤SGC-7901的实验治疗作用
| 组别 | 剂量mg/kg | 给药方式 | 动物数 | 体重(克) | TV(x±SD) | RTV(x±SD) | T/C(％) | P值 | |||
| 开始 | 最后 | 开始 | 最后 | d0 | d7 | ||||||
| NSHM-3rhE | 0.20ml/只1010 | iviviv | 1066 | 1066 | 20.3±1.520.8±0.720.5±1.1 | 25.4±1.124.4±1.525.1±1.3 | 157±131144±103159±147 | 1092±635561±113741±204 | 7.64±2.113.89±1.044.63±1.17 | 50.060.6 | ＜0.05＜0.05 |
d0：分笼给药时间
血管生成抑制剂HM-3序列表
<110>申请人姓名：徐寒梅
<120>发明名称： 血管生成抑制剂HM-3及其制备方法和应用
<160>序列表中序列的个数：2
<210>序列相对应的序列标识符：1
<211>序列长度：207个氨基酸
<212>序列的类型：PRT
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：1
Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Aal-Leu-Asn-Ser-Pro-
3 6 9 12 15 18
Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-
21 24 27 30 33 36
Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-
39 42 45 48 51 54 57
Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-
60 63 66 69 72 75
Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-
78 81 84 87 90 93
Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-
96 99 102 105 108 111 114
Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-
117 120 123 126 129 132
Ser-Tyr-Cys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-
135 138 141 144 147 150
Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-
153 156 159 162 165 168 171
Val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-Ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-
174 177 180 183 186 189
Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His
192 195 198 201 204 207
<210>序列相对应的序列标识符：2
<211>序列长度：206个氨基酸
<212>序列的类型：PRT
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：2
Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-
3 6 9 12 15 18
Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-
21 24 27 30 33 36
Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-
39 42 45 48 51 54 57
Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-
60 63 66 69 72 75
Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-
78 81 84 87 90 93
Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-
96 99 102 105 108 111 114
Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-
117 120 123 126 129 132
Ser-Tyr-Cys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-
135 138 141 144 147 150
Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-
153 156 159 162 165 168 171
Val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-Ser-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-
174 177 180 183 186 189
Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His
192 195 198 201 204
Claims (5)
1.一种血管生成抑制剂，其特征在于该血管生成抑制剂是具有整合素、肝素亲和性和结合能力的蛋白，其序列为
Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Lys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His
2.根据权利要求1所述的血管生成抑制剂，其特征在于：在多肽Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Lys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala的羧基端连接有对整合素家族具有亲和性和结合能力的多肽-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His。
3.根据权利要求l或2所述，血管生成抑制剂的生产方法，其特征在于：构建羧基端含有-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His序列的内皮抑素基因，进行基因工程表达，分离纯化重组蛋白质。
4.根据权利要求1或2所述，其特征在于羧基端X无或为任意一种天然或非天然氨基酸。
5.根据权利要求1或2或4所述血管生成抑制剂，在制备治疗人类新生血管生成有关疾病实体瘤药物中的应用。
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