CN107266553A - 高效人白细胞介素ⅱ突变体融合蛋白及其应用 - Google Patents

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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

本发明“高效人白细胞介素II突变体融合蛋白及其应用”属于生物技术的医药新产品，特别公开了一种低毒高效的人白介素II突变体融合蛋白的构造及其用途。其特征在于：由组成多肽的氨基酸序列在人白介素II的氨基酸位点发生突变，突变的多肽与人IgG Fc构成融合蛋白。本发明的白介素II突变体融合蛋白降低了诱导抑制性调节T细胞的功能，同时显著增加了白介素II对自然杀伤细胞和T杀伤细胞的免疫活性。白介素II的突变体融合蛋白可用于刺激免疫系统，通过提高杀伤肿瘤效应细胞与抑制性细胞的比例来增强抑制肿瘤生长功能，从而提高其临床疗效和应用范围。

Description

高效人白细胞介素II突变体融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物技术的医药新产品，特别涉及一种具有高效免疫激活功能的人白细胞介素II突变体融合蛋白及其用途。
背景技术
白细胞介素II(interleukin-2，IL-2，白介素II)是T淋巴细胞分泌的一种淋巴因子(人白介素II由133个氨基酸组成的蛋白质多肽链，分子量为15KD)，是维持免疫系统中T细胞和NK细胞正常功能的最重要的激活因子。白介素II能促进T细胞成熟、维持T细胞活性，还能促进细胞毒性T淋巴细胞的活性，并使其转化为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；促进自然杀伤(NK)细胞的活性，并诱导杀伤肿瘤的淋巴因子细胞和杀伤细胞(CTL)的增长。白介素II具有增强人体免疫功能，激活自然杀伤细胞，扩增T淋巴细胞的作用，能诱导和激活淋巴因子激活的杀细胞(LAK)及肿瘤浸润淋巴细胞，这些细胞都有杀伤外源微生物感染细胞以及癌变细胞的作用。由于白介素II具有显著的增强免疫作用，故它有很好的抗病毒、抗癌作用和广泛的临床应用潜力。白介素II对肾细胞癌、黑素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、结肠直肠癌有较明显疗效，对肝癌、软巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌等有不同程度的疗效。在我国白介素II已广泛应用于临床癌症治疗和病素感染(中国重组人白介素II行业格局研究与投资前景报告)。
通过促进T细胞和NK细胞成熟和增殖，白介素II具有诱导抗肿瘤免疫的功效，并于1992年通过FDA批准高剂量用于黑色素瘤和肾细胞癌的临床治疗。由于白介素II有三种不同的结合受体(α，β和Y受体)，其中α受体(CD25)主要表达在T抑制细胞和肺上皮细胞表面，其结合位点在人白介素II的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位点(α受体的口袋)(Science308：1477)，结合以后通过信号的转导促进抑制T细胞增殖。因此，在这些位点的氨基酸突变可能会降低α受体(CD4CD25)和白介素II的亲和力，从而进一步影响促进调节性T细胞的能力，所以减弱α受体结合的白介素II基因突变将有减少促进抑制T细胞增殖活性的功能。同时，突变体减少对肺上皮细胞α受体的结合，从而降低和消除高剂量引起肺水肿的毒副作用。最后，白介素II在体内通过肾脏代谢较快，半衰期较短(J Immunol 130：2203-2208；Cancer Res 50：2009-2017)。在低剂量下，白细胞介素II促进免疫功能的作用微小。因此，由于注射的白介素II体内半衰期短，其在临床上应用和疗效受到限制，其临床应用也有非常大的局限性。所以有必要制造一种可以即能减少副作用，又能延长白介素II体内半衰期，增加其体内的滞留时间的新蛋白体。
发明内容
针对现有白细胞介素II存在的缺陷，本发明提供提供了一种低毒高效副作用小的突变体，保持激活自然杀伤细胞及肿瘤浸润淋巴细胞功能，同时通过融合蛋白的形式来增加其在体内的半衰期，来增强其对免疫系统激活的功能，从而扩大其在临床上的疗效及应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本高效人白细胞介素II突变体融合蛋白的特征在于：由组成多肽的氨基酸序列在白介素IIα和β受体结合点突变，突变的位点在人白介素II的65，80，81，85，86，92和125氨基酸位点；同时在突变体的C端加入IgG4Fc蛋白序列，最后形成397个氨基酸序列的融合蛋白。
所述突变体包括一个完整长度的人白介素II的分子或融合蛋白。
通过基因合成反应合成人白介素II突变体融合蛋白基因，经过纯化扩增酶切，将合成的基因连接重组至多重宿主表达载体，该重组质粒的表达突变的白介素II融合蛋白。一个或多个氨基酸突变的白介素II表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行蛋白的生产和纯化。测试显示，白细胞介素II突变体融合蛋白大大降低或失去促进调节性T细胞的能力，减少或消除其毒副作用，同时增加激活自然杀伤细胞和T杀伤性细胞的增值能力，增加治疗后NK细胞和T细胞对抑制性T细胞的比例。由于T细胞和NK细胞是免疫系统控制肿瘤的主要效应细胞，可以预见本人白细胞介素II突变体融合蛋白将会在临床增加治疗癌症的效用。
本发明通过对氨基酸定点替代和增加融合蛋白片断，白细胞介素II突变体融合蛋白降低了诱导调节性T细胞的功能，减少或消除其毒副作用，同时增强了白介素II对NK和T杀伤细胞免疫活性的属性。白细胞介素II突变体融合蛋白可用于刺激免疫系统，增强抑制肿瘤生长功能，增加其抑制体内固体肿瘤生长的效用，从而提高其临床疗效和应用范围。同时，与其他治疗组合，或作用一种疫苗成分，治疗肿瘤和病毒感染，达到协同作用的效果。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为人原生体白介素II的氨基酸分子序列；
图2为白细胞介素II突变体融合蛋白的氨基酸序列；
图3为白细胞介素II突变体融合蛋白纯化后的胶染色图；
图4为小黑鼠分别连续注射人白介素II原生体和白介素II突变体融合蛋白4天后的脾CD8和NK流式细胞图：1，对照组，2，人白介素II原生体，3，人白介素II突变体融合蛋白；
图5为小黑鼠分别连续注射人白介素II原生体和白介素II突变体融合蛋白4天后的脾CD4和CD25流式细胞图：1，对照组，2，人白介素II原生体，3，人白介素II突变体融合蛋白；
图6为小黑鼠分别连续注射人白介素II原生体和白介素II突变体融合蛋白4天后的脾CD8+T细胞与CD4+CD25+细胞数量比例图：1，对照组，2，人白介素II原生体，3，人白介素II突变体融合蛋白；
图7为小黑鼠分别连续注射人白介素II原生体和白介素II突变体融合蛋白4天后的脾NK细胞与CD4+CD25+细胞数量比例图：1，对照组，2，人白介素II原生体，3，人白介素II突变体融合蛋白。
具体实施方式
实施例1：
人白介素II突变体库的建设
根据人白介素II的氨基酸序列(基因库NM-000586)(图1)对基因序列进行突变。采用重叠延伸法合成人白细胞介素II突变体融合蛋白基因(图2)，进一步克隆到多功能表达载体。这些载体转染到中国仓鼠卵巢细胞中，细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，72小时后取上清液，进一步通过固定化金属离子亲和层析纯化为白细胞介素II突变体融合蛋白(图3)。纯化的蛋白经过电泳检测确认分子量，并进一步用在体内的免疫细胞增殖研究。
实施例2：
突变体白介素II对促进抑制(CD4CD25+)T细胞，NK细胞和CD8+T细胞活性测定
小黑鼠分别通过腹腔注射白介素II原生体或白介素II突变体融合蛋白，原生体每日剂量为20微克共计4天，白介素II突变体融合蛋白为4微克共计4天，第5天收集脾脏，并使用CD25，CD8，NK1.1和CD4抗体染色法对脾细胞进行染色。最后用流式细胞仪测定和数据分析。图4和5中显示，与原生体相比，白介素II突变体融合蛋白增强了对NK(从14.7％到26.8％)和CD8(从14.9％到23.7％)细胞扩增的功能，同时减弱了对CD4+CD25+调节性细胞的扩增(从4.11％到0.97％)。
实施例3：
突变体白介素II融合蛋白与原生体白介素II蛋白对效应细胞与抑制性细胞比例的影响
如附图6，7所示，小白鼠分别通过腹腔注射白介素II原生体或白介素II突变体融合蛋白，与原生体相比，白介素II突变体融合蛋白增加了NK细胞与调节性抑制细胞的比例(从3.8到24.1)(图7)，增加了CD8与调节性抑制细胞的比例(从4.0到23.8)(图6)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种低毒高效副作用小的人白细胞介素II突变体，其特征在于由组成多肽的氨基酸序列在白介素II上氨基酸65，80，81，85，86，92和125一个或多个位点突变。
2.在权利1的基础上，在C末端加入人IgG Fc序列，形成人白细胞介素II突变体融合蛋白，其特征在于包括一个完整长度的白介素II分子的融合蛋白增加白介素II在体内的半衰期。
3.根据权利要求1，2所述的人白介素II突变体融合蛋白的用途为降低其诱导抑制细胞(包括CD4+CD25+调节性细胞)和减少副作用的功能。
4.根据权利要求1，2所述的人白介素II突变体融合蛋白的用途为增加控制肿瘤的效应细胞(包括CD8+细胞与NK细胞)，并增加效应细胞与调节性细胞的比例。
5.根据权利要求1，2，3，4所述的低诱导抑制性T细胞的人白介素II突变体融合蛋白的用途为单独使用或与其他治疗组合，例如作为一种疫苗的成分。
6.根据权利要求1，2，3，4，5所述的人白介素II突变体融合蛋白在控制肿瘤的用途，其范围包括所有人白介素II原生体在临床上的应用，包括但不限于肾细胞癌、黑素瘤、淋巴瘤、结肠直肠癌，肝癌、软巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌等。
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