HU215580B

HU215580B - Eljárás antitrombin hatású polipeptidek és ezek termelésére alkalmas gazdaszervezetek előállítására

Info

Publication number: HU215580B
Application number: HU9200620A
Authority: HU
Inventors: Philippe De Taxis Du Poet; Giampaolo Nitti; Paolo Sarmientos; Emanuela Scacheri
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba S.R.L.
Priority date: 1991-02-28
Filing date: 1992-02-25
Publication date: 1999-01-28
Also published as: CZ283458B6; FI920861A0; KR100218818B1; ES2129426T3; US5439820A; NZ241715A; EP0501821A3; MY110327A; HUT64592A; KR920016468A; DE69228015D1; FI920861A; CN1066272A; US5356875A; HU9200620D0; GR3029364T3; AU1122192A; EP0501821A2; DK0501821T3; AU643876B2

Abstract

A találmány tárgyát Hirűdinaria manillensis piócából izőláltantitrőmbin pőlipeptidek előállítási eljárása és a gazdaszervezetekelőállítási eljárása képezi. A találmány szerinti eljárássalelőállítőtt pőlipeptidek aminősavbővítéssel mődifikálhatók egyik vagymindkét végükön, és alávethetők pőszttranszlációs módősításnak is. Azantitrőmbin pőlipeptidek el állíthatók Hirűdinaria manillensis piócaszövetéből vagy szekrétűmából, de a találmány értelmébenszintetizálhatók rekőmbináns DNS-módszerrel is. Ami az űtóbbivőnatkőzást illeti, a találmány gazdasejtvőnalakat is biztősít apőlipeptidek rekőmbináns előállításáhőz. A találmány szerintelőállítőtt antitrőmbin pőlipeptidek jól használhatók vénás trőmbózis,érrendszeri söntelzáródás és trőmbinindűkált, szétszórt, éren belülialvadás kezelésében. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás polipeptidek és ezeket termelő gazdaszervezetek előállítására. A polipeptideket Hirudinaria manilensis piócából izoláltuk. A polipeptideknek antitrombin tulajdonságaik vannak.

A legnépszerűbb antikoaguláns peptidek valószínűleg ahirudinok családjához tartozók. A hirudint eredetileg orvosi piócából, Hirudo medicinalisból izolálták, jól ismert és részletesen tanulmányozott polipeptid jellegű trombin inhibitor¹·².

Ionos kölcsönhatás révén megköti a trombint, így megelőzi a fibrinogén hasítását fibrinné, és ezzel megakadályozza a későbbi fibrincsomó képződését. Állatkísérletek során a hirudin bebizonyította hatásosságát a vénás trombózis, érrendszeri söntelzáródás és a trombin okozta szétszórt, éren belüli alvadás megelőzésében. Ezenkívül a hirudinnak alacsony a toxicitása, nincs (i) Pl vagy kicsi az antigén hatása és nagyon gyorsan távozik a keringésből³.

Az antikoaguláns tulajdonságú polipeptideket egy másik piócafajtából, a Hirudinaria manilensisból (EP- A- 0347376 és WO 90/05143) izolálták. Ez a pióca evolúciós szempontból fejlettebb, mint a Hirudo medicinalis, és ezért olyan antikoaguláns peptideket tud szintetizálni, amelyeknek aminosavszekvenciái eltérhetnek a hirudinétól vagy egyéb ismert hirudinválto10 zatokétól.

Vizsgáltunk egy Hirudinaria manillensis piócákból kapott készítményt. Három új, antitrombin hatású polipeptidet találtunk. A találmány ennek megfelelően a következő aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptid előállítására irányul:

Val Ser Tyr Thr

Cys Val Gly Gly

Asp Gly Ser Gly

Pro Lys Ser Gin

Yaa Ile Leu Asn (ü) P2

Val Ser Tyr Thr

Cys Val Gly Ser

Ser Ser Ser Gly

Pro Lys Ser Gin

Yaa Ile Leu Asn

Asp Cys Thr Glu Ser

Asn Leu Cys Gly Gly

Asn Lys Cys Val Asp

Thr Glu Gly Asp Phe

0

Zaa;

Asp Cys Thr Glu Ser

Asn Val Cys Gly Glu

Asn Gin Cys Val His

Thr Glu Gly Asp Phe

Zaa; és

Gly Gin Asn Tyr Cys Leu

15

Gly Lys His Cys Glu Met

30

Gly Glu Gly Thr Pro Lys

45

Glu Glu Ile Pro Asp Glu

60

Gly Gin Asn Tyr Cys Leu

15

Gly Lys Asn Cys Gin Leu

30

Gly Glu Gly Thr Pro Lys

45

Glu Glu Ile Pro Asp Glu

60

HU 215 580 Β

(iii) P3

Val

Ser

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

Gly

Gin

Asn

Tyr

Cys

Leu

1

5

10

15

Cys

Val

Gly

Ser

Asn

Val

Cys

Gly

Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Gin

Leu

20

25

30

Ser

Gly

Asn

Gin

Cys

Val

His

Gly

Glu

Gly;

35

40

és ezek gyógyászatilag elfogadható sói.

Az aminosavakat hárombetűs kódjaikkal jelöljük (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984). A Yaa maradék Asp és Tyr maradékot, a Zaa - OH-t, - NH₂-t vagy Gly- OH-t jelöl. A sók lehetnek savaddíciós sók. Lehetnek szervetlen savak, például hidrogén-halogenidek, mint sósav; kénsav; foszforsav; vagy pirofoszforsav sói. A sók lehetnek szerves sav sói, például benzolszulfonsav, p-toluol-szulfonsav, metánszulfonsav, ecetsav, tejsav, palmitinsav, sztearinsav, almasav, borkösav, aszkorbinsav vagy citromsav sói. A polipeptidek szabad karboxilcsoportokat is tartalmaznak, és lehetnek Na, Ca, K, Mg vagy ammóniumsók formájában, vagy fiziológiásán elviselhető szerves nitrogéntartalmú bázisok sóiként. A polipeptidek lehetnek belső sók formájában is.

A találmány szerinti polipeptidek tehát lényegében az (i)—(iii) aminosavszekvenciákból állnak. A Hirudinaria manillensis piócákból izolált természetes polipeptidek aminosavszekvenciái az (i) vagy (ii), amelyekben az Yaa, Asp és a Zaa -OH vagy a (iii) részleges aminosavszekvencia. A találmány szerinti polipeptidek antitrombin szer készítése céljából izolálhatok és tisztíthatok.

A polipeptidek előállíthatok úgy, hogy egy vezető szekvencia vagy annak egy része előzze meg őket. A vezető szekvencia lehet természetes vagy idegen vezető szekvencia a sejt szempontjából, amelyben a polipeptid előfordul. A vezető szekvencia képes a polipeptid kiválasztásának irányítására a sejtből. Két, a találmány szerinti természetes polipeptidet a megfelelően hasított vezető szekvenciával fejezünk ki. Jelen lehet a teljes vezető szekvencia vagy egy része, a szekvencia a következő: Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Alá Val Cys Ile Cys Val Ser Gin Alá.

Egy, a találmány szerinti természetes polipeptid vagy annak sói előállíthatok a polipeptid vagy annak gyógyászatilag elfogadható sói izolálásával a Hirudinaria manillensis piócafajta szövetéből vagy szekrétumából. Konkrétabban, a találmány szerinti polipeptid előállítható a WO 90/05143 számú megoldás szerint kapott készítményből, annak nagynyomású folyadékkromatografálásával.

A találmány szerinti polipeptid vagy annak sója a találmány értelmében előállítható továbbá:

(a) egy gazdaszervezettel, amelyet a kívánt polipeptid kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral átalakítottunk, olyan feltételek mellett, hogy a polipeptid kifejeződjön benne; és (b) az így kapott polipeptid vagy gyógyászatilag elfogadható sójának izolálásával.

Ez a megközelítés azon alapul, hogy kinyerjük a kifejezendő polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát és a polipeptidet rekombináns szervezetekben kifejezzük. A genetikailag módosított szervezetek tenyésztésével a teljes biológiai aktivitást mutató kívánt termék előállításához jutunk.

A találmány tárgya továbbá eljárás egy gazdaszervezet előállítására, amely a találmány szerinti, kompatíbilis expressziós vektorral transzformálva.

A gazdaszervezetet, amelyben a találmány szerinti polipeptid kifejezhető, a találmány szerinti kompatíbilis expressziós vektorral transzformált gazdaszervezetből nyertük.

Az expressziós vektor előállítható:

(a) a találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS-szek35 vencia kémiai szintézisével; és (b) az adott DNS-beépítésével egy expressziós vektorba. Másik megoldás szerint az expressziós vektor előállítható (a) a találmány szerinti polipeptidet kódoló cDNS elő40 állításával és izolálásával Hirudinaria manillensis piócafajta mRNS-éből; és (b) az izolált cDNS beépítésével egy expressziós vektorba.

A találmány szerinti polipeptidet következésképpen egy transzformált gazdaszervezetből állítjuk elő, olyan feltételek mellett, hogy a polipeptid kifej eződjön benne. Ha eukarióta gazdaszervezetet használunk, a kapott polipeptid glikozilezett formában is lehet. A polipeptid izolálható így, vagy gyógyászatilag elfogadható sóként.

Ily módon a találmány szerinti polipeptid vagy só tiszta formában előállítható.

A találmány szerinti polipeptidek aminosavval modifikálhatok, egyik vagy mindkét végükön való bővítéssel. Az ilyen bővített szekvenciát tartalmazó polipep55 tidnek természetesen szintén antitrombin hatásúnak kell lennie. Például egy legfeljebb 30 aminosavból álló rövid szekvencia felvihető az egyik vagy mindkét végre.

A találmány szerinti polipeptidek egy vagy több transzláció utáni módosításnak vethetők alá, például szulfatálhatók, COOH-amidálhatók, acilezhetők vagy a a

HU 215 580 Β polipeptidlánc kémiailag változtatható. Például a karboxil-terminálison glicinmaradékot tartalmazó polipeptidet enzimatikusan amidálhatjuk peptidil-glicin alfa-amidáló monooxigenázzal (PAM-enzim).

Antitrombin polipeptid rekombináns DNS-techniká- 5 val való előállítására elkészítettük a találmány szerinti polipeptidet kódoló gént. A DNS-kódoló szekvencia rendszerint nem tartalmaz intronokat. A DNS-szekvenciát izoláljuk és tisztítjuk. A gént olyan expressziós vektorba építjük be, amely képes a rekombináns termék 1C termelését elindítani. A DNS-szekvencia lehet cDNS szekvencia. A DNS-szekvencia lehet szintetikus DNSszekvencia is. A szintetikus gént rendszerint kémiai úton oligonukleotidok szintézisével készítjük, amelyek összességükben a kívánt gént adják. Az oligonukleoti- 1 ΐ dókat azután összekötjük a gén előállítása céljából.

A gén tehát felépíthető hat, kémiai úton szintetizált oligonukleotidból, mindegyikük körülbelül egyharmada egy kettős szálú DNS-gén egyik szálának. Az

OmpA vezető szekvencia:

ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT

TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC oligonukleotidokat összekötjük és hibridizáljuk a kívánt gén előállítására. Ha szükséges, a génszekvencia helyirányított mutagenezissel módosítható egy vagy több kodonváltoztatás erejéig. A gént rendszerint mindkét végén restrikciós hellyel építjük föl, hogy megkönnyítsük a későbbi manipulálását. Előállítható olyan DNSszekvencia, amely a későbbiekben az említett vezető peptidet kódolja. A vezető peptid képes a polipeptid kiválasztásának irányítására azokból a sejtekből, amelyekben a polipeptidet ki akarjuk fejezni. A vezető peptidet kódoló szekvenciát rendszerint a polipeptidet kódoló DNS-szekvencia 5’ végéhez kötjük.

A vezető peptid lehet OmpA vezető peptid, ha a kifejezés bakteriális gazdában, például E. coliban történik. A vezető peptid lehet a vezikuláris sztomatitin vírus G-fehérje vezető peptidje (VSV G-fehérje), ha a kifejezés rovarsejtekben történik. Az OmpA és VSV G-fehérje vezető szekvenciát kódoló megfelelő DNSszekvenciák a következők:

GCA GTG GCA CTG GCT GGT 42

VSV G feherje vezető szekvencia:

ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC TTT TTA TTC ATT GGG GTG 42

AAT TGC

Előállítható olyan DNS-szekvencia, amely azt a fúziós fehérjét kódolja, amely elhasítható és így felszabadul a találmány szerinti polipeptid. Olyan DNS-szekvencia használható, amely a találmány szerinti polipeptid N-terminálisához egy hasítható kötéssel kötődő hordozó polipeptid-szekvenciát kódol. A hasítható kötés lehet például cianogén-bromiddal hasítható.

A polipeptid kifejezésére olyan expressziós vektort építettünk fel, amely a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és amely képes a polipeptid kifejezésére, ha megfelelő gazdaszervezetbe kerül. Megfelelő transzkripciós és transzlációs kontrollelemeket készítettünk, köztük egy DNS-szekvencia promótert, egy transzkripciós terminációs helyet, egy transzlációs start és stop kodont. A DNS-szekvenciát a megfelelő keretben állítjuk elő, hogy lehetővé váljon a polipeptid kifejezése a vektorral kompatíbilis gazdaszervezetben.

Az expressziós vektor rendszerint tartalmaz egy replikációs origót, és kívánt esetben egy választható marker gént, például antibiotikum-rezisztencia gént. A promóter operábilisan kötődik a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciához. Az expressziós vektor lehet plazmid. Ebben az esetben leggyakrabban a P_lrp és Pi_cc/i_acpromoterek közül valamelyiket operábilisan hozzákötjük a DNS-szekvenciához. Másik megoldás, ha az expressziós vektor például vírus. A vírus lehet egy rekombináns bakulovírus, amelyben a polihedrin promóter operábilisan kötődik a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciához.

A polipeptid kifejezésére alkalmas expressziós vektor bármilyen megfelelő módon előállítható.

A polipeptidet kódoló DNS-fragmenset be lehet építeni egy expressziós vektor megfelelő restrikciós helyére, például egy plazmid vektorba.

Egy rekombináns bakulovírus előállítható:

(i) a polipeptidet kódoló gén klónozásával bakulovírus transzfer vektorba, a polihedrin promotertől lefelé (downstream) levő restrikciós helyen; és (ii) bakulovírus-fertőzésre hajlamos rovarsejtek kotranszfektálásával az (i) lépés rekombináns transzfer vektorával és egy érintetlen vad típusú bakulovírus

DNS-sel.

Homológ rekombináció áll elő, aminek eredményeképpen rekombináns bakulovírus kerül a polipeptid génre a polihedrin promotertől lefelé. A bakulovírus transzfer vektor lehet olyan, amely egyetlen klónozó helyet tartalmaz a polihedrin ATG start kodontól lefelé. A kapott rekombináns bakulovírus által kifejezett termék egy fúziós fehérje, amelyben a polihedrin fehérje N-terminális része a polipeptid N-végéhez kötődik. Amint láttuk, hasítható kötés nyerhető a fúzió helyén.

/1

HU 215 580 Β

A (ii) lépésben alkalmazott rovarsejtek rendszerint Spodoptera frugiperda sejtek. A vad típusú bakulovírus rendszerint Autographa californica nukleáris polihedrózis vírus (AcNPV).

A polipeptidet kódoló expressziós vektort megfelelő gazdaszervezetben állítjuk elő. A sejteket átalakítjuk a polipeptid génnel. A transzformált gazdaszervezetet olyan feltételek között állítjuk elő, hogy a polipeptid kifejeződjön benne. A transzformált sejteket például úgy tenyésztjük, hogy lehetővé váljon az expresszió. Bármely összeférhető gazda-vektor rendszer használható.

A transzformált gazdaszervezet lehet prokarióta vagy eukarióta gazdaszervezet. Bakteriális vagy élesztő gazdaszervezet alkalmazható, például E. coli vagy S. cerevisiae. Gram-pozitív baktérium is használható. Gyakran használatos bakteriális gazdaszervezet a B típusú E. coli törzs. Rovarsejtek szintén használhatók, amikor is a bakulovírus expressziós rendszer a megfelelő. A rovarsejtek rendszerint Spodoptera frugiperda sejtek. További lehetőségként az emlős sejtvonal sejtek is transzformálhatok. Transzgenikus állat, például nem humán emlős is kialakítható, amely termeli a polipeptidsejteket.

A kifejezett polipeptid izolálható és tisztítható. Előállítható az (i), (ii) és (iii) aminosavszekvenciák bármelyikével rendelkező polipeptid, amelyben a fenti aminosavszekvenciát egy transzlációs start kodonnak tulajdonítható Met maradék előzi meg. Másik lehetőség, amelyet említettünk, hogy egy fúziós fehérjét állítunk elő, amely tartalmazza a találmány szerinti polipeptid aminosavszekvenciáját, vagyis az (i), (ii) és (iii) fenti szekvenciákat, egy hordozó szekvenciával fuzionálva. Ha a fúziós fehérjében megfelelő kötés alakul ki az (i), (ii) és (iii) aminosavszekvencia és a hordozó szekvencia között, megfelelő szerek segítségével hasítva (i), (ii) és (iii) aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptid szabadítható fel.

A találmány szerinti polipeptid vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója előállítható még:

(a) a polipeptid kémiai szintézisével; és (b) az így kapott polipeptid vagy gyógyászatilag elfogadható sója izolálásával.

A polipeptidek tehát kémiai szintézissel felépíthetők egyedi aminosavakból és/vagy előregyártón peptidekböl vagy kettő, illetve több aminosavból a kívánt polipeptid szekvenciájának megfelelő sorrendben. Szilárd fázisú vagy oldószeres módszerek használhatók. A kapott polipeptid átalakítható gyógyászatilag elfogadható sójává, ha szükséges.

A szilárd fázisú szintézisben a kívánt polipeptid aminosavszekvenciáját sorban a C-terminális aminosavtól kezdve építjük fel, amelyet az oldhatatlan gyantához kötöttünk. Ha a kívánt polipeptidet előállítottuk, lehasítjuk a gyantáról. Ha oldószeres szintézist végzünk, a kívánt polipeptid ugyancsak felépíthető a C-terminális aminosavtól kezdve. E sav karboxilcsoportját megfelelő védöcsoporttal végig védjük, és a szintézis végén ezt a védöcsoportot eltávolítjuk.

Bármelyik technikát is alkalmazzuk, a szilárd fázisút vagy az oldószerest, az összes aminosav, amelyet a reakciórendszerbe adagoltunk, rendszerint védett aminosavcsoportot és aktivált karboxilcsoportot tartalmaz. Az oldalláncon lévő funkcionális csoportokat szintén védjük. A szintézis minden lépése után eltávolítjuk az aminocsoport védöcsoportját. Az oldalláncon lévő funkcionális csoportokat rendszerint a szintézis végén szabadítjuk fel.

A polipeptid átalakítható gyógyászatilag elfogadható sóvá. Átalakítható savaddíciós sóvá szerves vagy szervetlen savval; megfelelő savak az ecetsav, borostyánkősav, sósav. Másik lehetőség, hogy a peptidet karbonsavsóvá alakítjuk, például ammóniumsóvá vagy alkálifémsóvá, például nátrium- vagy káliumsóvá.

A polipeptid vagy gyógyászatilag elfogadható sója alkalmazható gyógyszerkészítményben gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy kötőanyaggal együtt. Az ilyen készítményt rendszerint intravénásán adagoljuk (a hordozó rendszerint steril sóié vagy megfelelő tisztaságú víz). A találmány szerinti polipeptid antitrombin és megfelel a tromboembóliás esetek, például a vérkoaguláció kezelésére, általában embereknél. A polipeptid tehát használható trombózis és tromboembólia gyógyítására vagy megelőzésére, beleértve a műtét utáni trombózis megelőzését, akut sokk kezelésére (pl. szeptikus vagy politraumás sokk), felhasználható koagulopátia gyógyítására, vérdialízishez, vérszeparáláshoz és testen kívüli vérkeringetés esetén. A találmány szerinti megoldás megvalósításában a polipeptidet vagy annak sóját együtt lehet adagolni plazminogén aktivátorral, például szöveti plazminogén aktivátorral.

Az adagolás függ a bevitel speciális formájától és a terápia vagy megelőzés céljától. Az egyes adagok nagysága és az adagolási mód legjobban az adott betegség egyedi mérlegelésével határozható meg; az e célra megfelelő vérfaktorok meghatározási módszerei a szakember számára ismertek. Injekció esetén a találmány szerinti vegyületek gyógyászatilag hatásos adagolási mennyisége körülbelül 0,005-0,1 mg/kg testtömeg között van. A körülbelül 0,01-0,05 mg/kg testtömeg-tartomány a leggyakoribb. Az adagolás intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekció formájában történik. A parenterális adagolásra szolgáló gyógyszerkészítmény egyadagos formában a bevitel módjától függően adagonként körülbelül 0,4- 7,5 mg találmány szerinti vegyületet tartalmaz. A hatóanyagon kívül ezek a gyógyszerkészítmények általában tartalmaznak még puffért, például foszfátpuffert, amely a pH-értéket körülbelül 3,5 és 7 között tartja, valamint nátrium-kloridot, mannitot és szorbitot az izotónia beállítására. Lehetnek fagyasztva szárított vagy oldott formában, oldatok esetében előnyös lehet antibakteriális aktív tartósítószer, például 0,2-0,3% 4-hidroxi-benzoesav-metilészter vagy -etilészter adagolása.

Külsőleg vizes oldat, öblítöszer vagy gél, olajos oldat, szuszpenzió, zsírtartalmú vagy emulgeált kenőcs formájú készítmény is alkalmazható. Vizes oldat formájú készítmény nyerhető például a találmány szerinti hatóanyagok vagy gyógyászatilag elfogadható sóik feloldásával például pH= 4- 6,5 értékű vizes pufferoldatban, és ha szükséges, további hatóanyagok, például gyul1

HU 215 580 Β ladásgátló szer és/vagy polimer kötőanyag, például poli(vinil-pirrolidon) és/vagy tartósítószer hozzáadásával. A hatóanyag koncentrációja körülbelül 0,1-1,5 mg, leggyakrabban 0,25-1,0 mg, körülbelül 10 ml oldatban vagy 10 g gélben.

Külsőleg, olajos formában például úgy alkalmazható a készítmény, hogy a találmány szerinti hatóanyagot vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját olajban szuszpendáljuk, tetszés szerint duzzasztószer, például alumínium-sztearát és/vagy felületaktív anyagok (tenzidek), például polialkoholok zsírsav-monoésztere, mint a glicerinmonosztearát, szorbitánmonolaurát, szorbitánmonosztearát vagy szorbitánmonooleát hozzáadásával, az észterek HLB-értéke (hidrofil-lipofil egyensúly) 10 alatt legyen. Zsírtartalmú kenőcsöt kapunk, például a találmány szerinti hatóanyag vagy sója szuszpendálásával kenhető zsíros vivőanyagban, tetszés szerint egy 10 alatti HLB-értékü tenzid hozzáadásával. Emulgeált kenőcsöt nyerünk a találmány szerinti hatóanyag vagy sója vizes oldatának szétdörzsölésével egy lágy, kenhető zsíros vivőanyagban, 10 alatti HLB-értékü tenzid hozzáadásával. A külsőleg alkalmazandó formák mindegyike tartalmazhat tartósítószert. A hatóanyag koncentrációja körülbelül 0,1-1,5 mg, leggyakrabban 0,25- 1,0 mg körülbelül 10 g vivőanyagra számítva.

A fenti kompozíciókon és az analóg gyógyszerkompozíciókon kívül, amelyeket közvetlenül orvosi felhasználásra szánunk ember vagy emlősök testében, a találmány szerint előállított polipeptid még az élő emberi vagy emlős testen kívüli használatra szánt gyógyszerkészítményekben és orvosi készítményekben is alkalmasak. Az ilyen kompozíciókat és készítményeket olyan vér-antikoagulációs adalékként használjuk, amelyet a testen kívüli keringésre vagy kezelésre (pl. testen kívüli keringetés vagy mű vese-dialízis), tartósításra vagy modifikálásra (pl. vérszeparálás) viszünk. Az ilyen készítmények, mint a tázsoldatok vagy egyszeri adag formában lévő egyéb készítmények összetételüket tekintve hasonlóak a fenti injekciós készítményekhez; viszont a hatóanyag mennyisége vagy koncentrációja célszerűen a kezelendő vér térfogatán alapul, pontosabban annak trombintartalmán. Ebben az összefüggésben figyelembe kell vennünk, hogy a találmány szerinti hatóanyag (szabad formában) teljesen dezaktiválja a tömege ötszörösének megfelelő mennyiségű trombint, fiziológiailag ártalmatlan viszonylag nagy mennyiségben is, és gyorsan távozik a keringésből nagy koncentráció esetén is, tehát nem áll fenn a túladagolás veszélye például még vérátömlesztések esetén sem. Az adott céltól függően a megfelelő adag körülbelül 0,01- 1,0 mg hatóanyag/1 vér, de a felső határ kockázat nélkül még túl is léphető.

Ami az ábrákat illeti, az 1. ábra egy kromatogram, amely az 1. példa HPLC elemzési eredményeit mutatja. A P1-P3 a három csúcsot jelzik, amelyeket az 1. példa szerinti készítmény előállításakor kaptunk, FT az átmenő áramra vonatkozik és 4-AB a 4-amino-benzamidinre.

A 2. ábra a 2(b) példában a tripszinnel emésztett PE- Pl (A) és a PE- P2 (B) görbéi.

A 3. ábra annak a hat oligonukleotidnak a nukleotidszekvenciáját illusztrálja, amelyek a 2. csúcsnak (P2) a legtöbb fehérjéjét kódolják, amelyekben az aminosavmaradék a 61-es helyzetben Asp, és a polipeptidlánc legkisebb aminosava Asn₆₄. A félkövér betűvel szedett szekvencia a Ball helyzetet mutatja, amelyet további felépítésre használtunk. Az ábra alsó része ábrázolja a hat oligó összeállítási módját. A Hindlll és a Pstl helyeket megfelelő manipulációk elvégzése céljából vittük be.

A 4. ábra bemutatja az intermedier Ml 3- P2 plazmid felépítésének vázlatát, ez a plazmid a forrása a Ball- BamHI DNS-fragmensnek minden további P2 felépítés során.

Az 5. ábra vázlatosan illusztrálja az új rekombináns M13 felépítését, ezt OMP-P2-nek neveztük el, és ez hordozza az OmpA vezető peptidhez kötött teljes P2 gént. A vezető fehérje szekvenciát félkövér betűvel ábrázoltuk, míg a Ball tompa véget és a Hindlll ragadós véget aláhúztuk.

A 6. ábra vázlatosan bemutatja a pFC- P2 felépítését, ezt a plazmidot használjuk a P2 fehérje termelésére E. coliban.

A következő példák a találmány jobb megértésére szolgálnak.

A 7. ábra bemutatja az E. coliban P2 előállítására használt pOMPA-P2 plazmid általános szerkezetét. Hagyományos génmanipulációs technikát alkalmaztunk ezen új plazmid előállítására, itt a P2 gén a P_lpp/lac hibrid promoter transzkripcionális kontrollja alatt áll. Még ebben az esetben is az OmpA vezető fehérje szekvencia irányítja a P2 kiválasztását az E. coli periplazmájába.

A 8. ábra illusztrálja a P2 rovarsejtekből való kiválasztásához használt szintetikus oligók nukleotidszekvenciáját és összeállítását. A félkövér betűkkel ábrázolt szekvencia mutatja be a VSV G-fehérje vezető peptidjét.

A 9. ábra a VSV-P2-nek elnevezett új, rekombináns Ml 3 felépítésének vázlatos sémáját adja meg, a teljes P2 gén a VSV G-fehérje vezető peptidjéhez kötődik.

A 10. ábra a pAc- P2 felépítésének vázlatát mutatja be, ezt alkalmaztuk transzfer vektorként a bakulovírus genomhoz. A pAcYMl a kiindulási plazmid, amelyet széles körben alkalmaznak a heterológ szekvenciák akceptoraként a vírushoz való transzferjük során.

A 11. ábra illusztrálja a P2 lánc kezdetét kódoló szintetikus oligók nukleotidszekvenciáját és felépítését. A kiegészítő metioninmaradékot kódoló ATG-kodont félkövér betűvel ábrázoltuk.

A 12. ábra az intracelluláris expresszióhoz használt pAcFTl felépítésének vázlatát mutatja.

A 13. ábra a pAcFTl- P2 nevű új transzfer plazmid vázlatos képe, ez hordozza a polihedrin első 18 aminosavához kötött teljes P2 szekvenciát. Ezt a plazmidot használjuk a heterológ szekvencia transzferjéhez a bakulovírus genomhoz.

A 14. ábra a 3’ végek sokszorosítására szolgáló RACE-módszer vázlatos bemutatására szolgál. Az ábrán a „***TTTT...” jelenti a dT17 adaptor prímért. A diagram egyszerűsített, minden lépésnél csak azt mu1

HU 215 580 Β tatja be, hogyan használjuk fel az előző lépés során képződött új terméket.

A 15. ábra az 5’ végek sokszorosításának RACEmódszerét mutatja be vázlatosan. Az ábrán a „***TTTT...” és a „***” a dT17 adaptor prímért, illetve az adaptor prímért jelölik, sorrendben. A diagram egyszerűsített, mint lépésben csak azt mutatja be, hogyan hasznosítjuk az előző lépés során képződött új terméket.

1. példa

Antitrombin készítményt állítottunk elő Hirudinaria manillensis piócákból a WO 90/05143 alapján, az itt következő a) és b) eljárások szerint:

a) Acetonos extrakció

Az etanolban szárított piócafejeket (2920 g) finoman kis darabokra vágtuk és 40: 60 aceton/víz eleggyel kezeltük (7,5 1). Keveréssel szobahőmérsékleten való homogenizálás után a keveréket 15 percig 2700 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, majd leöntöttük a felülúszót; a szemcséket ismét szuszpendáltuk 40: 60 aceton/víz eleggyel, 30 percig kevertük, majd a keveréket 15 percig 2700 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A felülúszót egyesítettük az előzővel, és jégecettel (9,5 1) 4,5-öspH-ig savanyítottuk. A keveréket 2700 fordulat/perc sebesség mellett 15 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót leöntöttük és az oldat pH-ját 6,0-ra állítottuk be 30%-os ammónia hozzáadásával. 35 °C-on végzett rotációs bepárlás után a koncentrált oldat pH-ját 1,8-ra csökkentettük; a kicsapott szennyezóanyagokat eltávolítottuk centrifugálással, és a nyers antitrombin anyagot a keverékből kilencszeres acetonfelesleggel csaptuk ki. A keveréket azután centrifugáltuk, a szemcséket újra szuszpendáltuk acetonban, majd ismét centrifugáltuk. A kicsapott anyagot azután liofilizáltuk.

b) Ioncserés tisztítás

A nyers antitrombin anyagot vízben feloldottuk, 10 mM ammónium-acetát-pufferrel szemben pH= 4 mellett dializáltuk, majd karboximetil Sepharose oszlopra (CM Sepharose, Pharmacia, 2,6x 30 cm) vittük fel, amelyet előzőleg ugyanazzal a pufferrel kiegyenlítettünk. 100 ml kiindulási pufferrel végzett öblítés után az antitrombin aktív frakciókat 4,5 pH-jú 20 mM ammónium-acetáttal eluáltuk, összegyűjtöttük, majd egyesítettük (1,3 1). További tisztítás céljából az egyesített frakciókat 0,5 1-re töményítettük Minitan készülékben Millipore); a koncentrált oldatot NaOH-dal semlegesítettük, majd Q Sepharose oszlopra vittük, melyet előzőleg 20 mM pH=7 Tris-HCl-dal kiegyenlítettünk. A megkötött anyagot lineáris gradiensű, a kiindulási pufferben 0- 1 M NaCl-ot tartalmazó oldattal eluáltuk. Az antitrombin aktivitást mutató frakciókat egyesítettük, koncentráltuk, és Superdex S-200 oszlopon sótalanítottuk, 20 mM pH= 7,5 Tris- HCl-dal eluálva 4 ml/perc áramlási sebesség mellett. A gélszűréskor kapott aktív oldatot Minitan készülékben töményítettük, majd tovább tisztítottuk gyengén anionos ioncserélő kromatográfiával (DEAE FPLC). Az aktív anyagot Protein Pák

DEAE - 5 PW-oszlopra vettük fel (Waters) és 20 mM pH=6,5 Tris-HCl-an 0,1 M NaCl-gradiens mellett 1,0 ml/perc áramlási sebességnél eluáltuk. Az aktív frakciókat egyesítettük, meghatároztuk a fehérjetartalmat és az aktivitást (fajlagos aktivitás: 800 ATU/mg), majd fagyasztva szárítottuk SpeedVac töményítóben (Savant).

Az így kapott részlegesen tisztított anyagot (fajlagos aktivitása 800 ATU/mg) azután további kromatografálási lépésekre vittük, hogy homogén polipeptidet kapjunk, az itt következő c) és d) pontok szerint:

c) Trombin- Sepharose

A kereskedelmi forgalomban lévő szarvasmarhatrombint (Sigma) tovább tisztítottuk a Lundblad, R. L., 1971, Biochemistry, 10:2501-2506 által leírt módszerrel, majd aktivált Sepharose Cl 6B-hez kötöttük a gyártó (Pharmacia) utasítása szerint. Az oszlopot (1,7 ml/50 mM pH= 8,3 Tris- HCl-dal kiegyenlítettük, és a DEAE-FPLC-ból kapott fagyasztva szárított anyagot (pufferben való oldás után) felvittük. Az oszlopot három mosásnak vetettük alá, akiindulási pufferrel, majd ugyanebben a pufferben oldott 3,0 M NaCldal és ismét a kiindulási pufferrel (mindhárom mosáskor az oszloptérfogat háromszorosával mostunk). Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc volt. A megkötött anyagot 25 mM HCl-ban 0,1 M 4-amino-benzamidint tartalmazó oldat 10 ml-ével eluáltuk. Az aktivitást mutató frakciókat egyesítettük és 50 mM pH= 8,3 Tris- HC1pufferrel PD- 10 oszlopra vittük fel (Pharmacia).

A meg nem kötött anyagot az oszlopról a kiindulási pufferrel eluáltuk, és mivel még antitrombin aktivitást mutatott, visszavittük az oszlopra amíg a teljes aktivitás megkötődött, majd kromatografáltuk.

d) RP-HPLC

Az affinitás kromatográfíával kapott anyagot fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (RP- HPLC) végső tisztításnak vetettük alá C4 Vydac oszlopon (4,6x 250 mm, 5 μ) 20 mM pH= 7,5 nátrium-foszfát mint első eluens segítségével, majd 50%-os vizes acetonitrillel mint módosított eluenssel. Az antitrombin polipeptideket 5-55% lineáris gradiens mellett B eluenssel eluáltuk 45 percig, szobahőmérsékleten, 1,0 ml/perc áramlási sebesség mellett. A kapott kromatogram az 1. ábrán látható.

A fehérjecsúcsokat (220 nm-nél) mutató oldatokat kézzel összegyűjtöttük, vákuumban töményítettük, majd ugyanilyen feltételek mellett újra kromatografáltuk. C4 HPLC után meghatároztuk a tiszta antitrombin polipeptidek fehérjetartalmát, N-terminális szekvenciáját, C-terminális végét és aktivitását in vitro vizsgálatokkal (ATU/NIH teszt és „trombinidó” teszt). Mind a három fehérjecsúcs antitrombin aktivitást mutatott.

Az 1. ábrán Pl-gyel és P2-vel jelölt polipeptidek teljes aminosavszekvenciáit a tripszines és V8 proteázos emésztéssel kapott fehérjék N-terminális szekvenálásával határoztuk meg.

A szekvenciákat (i) és (ii) alatt fentebb láthatjuk. A másik polipeptid (P3) részleges aminosavszekvenciája a (iii) alatt látható fentebb.

HU 215 580 Β

2. példa

Piridil-etilált (PE) Pl és P2 tripszines emésztése és peptidtérképe

a) Redukció/Alkilezés

A Trombin- Sepharose (le. példa) oszlopon affinitás kromatográfíával tisztított aktív frakciókat egyesítettük és PD- 10 oszlopon 10 mM pH= 8,3 Tris- HCl-pufferben ioncserének vetettük alá. Az aktív frakciókat (kb. 50 pgj Speed-Vac centrifugában (Savant) töményítettük és 6M guanidin-HCl/50 mM pH=8,5 Tris-Hűben levő 100 μΐ 1%-os béta-merkapto-etanollal kezeltük, nitrogénáramban, sötétben, 2 órán át szobahőmérsékleten. Azután 4 μΐ 4-vinil-piridint (hígítatlan) adtunk hozzá és a keveréket ismét 2 órán át a fentiek szerint inkubáltuk.

A piridil-etilált polipeptideket a reakcióelegyböl először RP- HPLC-vel nyertük ki C4 Vydac (4,6x 250 mm, 5 pm) oszlopon, 90 perc alatt lineáris gradiens mellett 0,1% TFA-ban 5-65% acetonitrillel, 1,0 ml/perc áramlási sebességnél. Ilyen feltételek között az antitrombin polipeptidek keveréke rosszul válik szét, ezért újra kell kromatografálni ugyanazon az oszlopon nátrium-foszfátos acetonitriles eluálással az ld. példában leírt körülmények között.

Fragmens

A 1-13

14-26

27-36

37-47

37-47(S)

48-64

Fragmens

B 1-13

14-26

27-47

48-64

b) A PE-P1 és PE-P2 tripszines emésztése és peptidtérképe

A tisztított PE-Pl-et és PE-P2-t (10, illetve 20 pg-ot) TPCK-val kezelt tripszinnel (Sigma) emész5 tettük 200 pl 1%-os ammónium-bikarbonáttal pH=8,0 értéken 0,2 M nátrium-foszfát jelenlétében. A tripszint 1: 20 (m/m) enzim-szubsztrát arányban alkalmaztuk és az inkubálást 4 órán át 37 °C-on végeztük. Az emésztést fagyasztva szárítással Savant-ban ál10 lítottuk le.

A tripszines emésztéssel kapott fehérjéket pBondapak C18 oszlopon (3,9x 300 mm, 10 μ, Waters) vagy C4 Vydac (4,6x250 mm, 5 μ) oszlopon választottuk szét 60 perc alatt lineáris gradiens mel15 lett 0,1% TFA-ban 5-65% acetonitrillel eluálva, 1,0 ml/perc áramlási sebességnél (2. ábra). Az eluált csúcsokat kézzel összegyűjtöttük, Savant-ban koncentráltuk, majd aminosavelemzésnek és N-terminális szekvenálásnak vetettük alá pulzáló folyadékfázi20 sú mód. 477A Sequencer készüléken (Applied BioSystems).

A tripszinnel emésztett PE-P1 (A) és PE-P2 (B) C4-HPLC peptid térképezési eredményei a kővetkezőkben láthatók.

Aminosavszekvencia

VSYTDCTESGQNY

CLCVGGNLCGGGK

HCEMDGSGNK

CVDGEGTPKPK

CVDGEGXSPKPK

SQTEGDFEEIPDEDILN

Aminosavszekvencia

VSYTDCTESGQNY

GLCVGSNVCGEGK

NCQLSSSGNQCVHGEGX&PKPK

SQTEGDFEEIPDEDILN (*) X= az aminosavszekvenálással ki nem mutatott maradék;

X= T az aminosavelemzés szerint.

A Pl és P2 teljes aminosavszekvenciái tehát a kővetkezők:

Q

HU 215 580 Β

Pl

Val

Ser

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

Gly

Gin

Asn

Tyr

Cys

Leu

Cys

Val

Gly

Asn

Leu

Cys

Gly

Lys

His

Cys

Glu

Met

Asp

G ly

Ser

Gly

Asn

Lys

Cys

Val

Asp

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Lys

Pro

Lys

Ser

Gin

Thr

Glu

Gly

Asp

Phe

Glu

Ile

Pro

Asp

Glu

Asp

Ile

Leu

Asn

P2

Val

Ser

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

Gly

Gin

Asn

Tyr

Cys

Leu

Cys

Val

Gly

Ser

Asn

Val

Cys

Gly

Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Gin

Leu

Ser

Gly

Asn

Gin

Cys

Val

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Lys

Pro

Lys

Ser

Gin

Thr

Glu

Gly

Asp

Phe

Glu

Ile

Pro

Asp

Glu

Asp

I le

Leu

Asn

3. példa

A P2 gén kémiai szintézise

A nukleotidkódoló szekvenciát az Escherichia coli által „kedvelt” kodonok alapján terveztük^{4 5}. Ezen túlmenően a Ball restrikciós helyet a szintetikus gén 5’ végéhez igen közel építettük be, hogy lehetővé váljon ezen szekvencia beépítése különböző expressziós vektorokba. Valóban, ugyanezt a szintetikus gént használtuk a rekombináns P2 fehérje kifejezésére bakteriális és rovarsejtekben. Rovarsejtek esetén módszereket dolgoztunk ki, amelyekkel P2 fehérjét nyertünk kiválasztással vagy a citoplazmában.

Az összes plazmid DNS-manipulációt a Maniatis és munkatársai⁶ által leírt módszerrel végeztük.

Hat szintetikus komplementáris oligonukleotidot állítottunk elő automata DNS-szintetizáló készülékben (Applied Biosystems), ezek szekvenciája a 3. ábrán látható. Enzimatikus foszforilezés után a hat oligonukleotidot DNS-ligáz segítségével összeállítottuk, és a kapott kettős szálú szekvenciát Ml3 fág vektor mpl8ba építettük be, így előállítva az M13- P2 rekombináns plazmidot, amely a 4. ábrán látható. A P2 génnek az Ml 3 vektorba való beépülését úgy kerültük el, hogy HindlII és PstI helyeket is adtunk a szintetikus oligonukleotidokhoz. A megfelelő nukleotidszekvenciát Sanger-módszerrel igazoltuk egyszálú fág DNS-en⁷.

Az M13-P2 rekombináns plazmidot használtuk P2 gén forrásként a példákban alkalmazott összes expressziós vektorhoz.

4. példa

P2 kifejezése és kiválasztása E. coli sejtekben

Ahhoz, hogy a rekombináns termék a periplazmában kiválasztódjon, a P2 molekulát előfehérje formában kell szintetizálni. Konkrétabban a hatékony ki25 választáshoz szükséges, „vezető fehérjének” nevezett aminosavszekvenciának kell jelen lenni a P2 NH₂ végén⁸· ⁹. Ezt az extra szekvenciát azután in vivő elhasítjuk a kiválasztás folyamán, specifikus E. coli vezető peptidázzal, így a megfelelően kialakult szekvenciát nyerve¹⁰.

Az irodalomban számos kiválasztási rendszert ismertetnek¹¹· ¹². Közülük az E. coli külső membrán fehérjéjének (OmpA) kiválasztási jelén alapuló, korábban leírt¹³ rendszert választottuk. Ezután két további komplementer oligonukleotidot terveztünk, amelyek az OmpA vezető peptidet kódolják, melyet az OmpA Shine- Dalgarno szekvencia előz meg, amely felelős a messenger RNS hatékony transzlációjáért¹⁴.

Szekvenciájuk az 5. ábrán látható, tartalmazza a

10 első aminosavat kódoló P2 gén kezdetét is. A Ball hely jelenléte lehetővé tette e szintetikus darab hozzákötését a P2 kódoló szekvencia maradékához, míg az upstream HindlII hely jelenléte lehetővé teszi az M13 vektorhoz való hozzákötését. így a szintetikus

HindlII-Ball fragmenst hozzákötöttük az M13-P2 Ball-BamHl darabkához és beépítettük az M13mpl8-ba, így egy OMP-P2-nek elnevezett új plazmidot nyertünk. Ezen új plazmidszerkezet vázlatos felépítése szintén az 5. ábrán látható.

Az OMP-P2-ból a P2 gén HindlII-BamHl fragmens formában vágható ki, amely kódolja az OmpA Shine- Dalgarno-t és a P2 kódoló szekvenciát megelőző vezető peptidet. A restrikciós fragmens most készen áll a megfelelő expressziós vektorba való beépí55 tésre. Elméletileg többféle expressziós rendszer használható a heterológ fehérjék magas szintű termelésére baktériumokban. Laboratóriumunkban korábban sikerrel alkalmaztuk a P_lrp promóteren alapuló rendszert¹⁴. A választott promóter esetében sem jelezhető előre az adott polipeptid kifejezési szintje.

n

HU 215 580 Β

A 6. ábrán bemutatott pFC33 plazmidot az irodalom már ismertette¹⁴. Ez ampicillin antibiotikum-rezisztenciát és bakteriális promótert hordoz, amely beindítja az Al proapolipofehérje kifejezését. A pFC33 HindlIImal és BamHl-gyel való emésztése után izoláltuk a nagy HindlII-BamHl fragmenst, amely hordozza az antibiotikum-rezisztencia gént és a promótert, majd hozzákapcsoltuk a P2 gént kódoló OMP- P2 HindlII- BamHl fragmenséhez. E szerkezet részletei a 6. ábrán láthatók. Izoláltuk a pFC-P2 nevű új plazmidot, amely a P2 E. coliban való termelésére szolgáló végső plazmid.

A találmány egyik tárgya a B típusú E. coli törzsek alkalmazása a találmány szerinti P2 és egyéb antitrombin polipeptidek kifejezésére és periplazmában való kiválasztására. Valóban úgy találtuk, hogy a pFC-P2 plazmid beépítése a B típusú E. coli baktériumtörzsekbe magas szintű P2 termeléshez vezet. Érdekes módon az E. coli különböző törzstípusai nem működnek ilyen hatékonyan, és úgy látszik, hogy a gazdatörzs típusa kulcskérdés a P2 sikeres termelése szempontjából.

Többféle E. coli B törzs áll rendelkezésre és használható a P2 előállítására. Leggyakrabban használatos törzsek az ATCC 12407, ATCC 11303, NCTC 10537. Lentebb következik egy példa az NCTC 10537 törzs transzformálására a pFC-P2 plazmiddal, és a transzformáns azt követő tenyésztése.

Az NCTC 10537 törzs kompetens sejtjeit Mandelés Higa-féle kalcium-kloridos eljárással¹⁵ állítottuk elő. Kb. 200 μΐ ilyen sejtkészítményt lx 10⁹ sejt/ml koncentráció mellett transzformáltunk 2 μΐ plazmid DNSsel (kb. 5 μg/ml koncentráció). A transzformánsokat 100 μg/ml ampicillint tartalmazó L-agar lemezeken válogattuk szét. Két kis kolóniát szélesztettünk fa fogvájóval (mindegyik három, körülbelül 1 cm hosszú vonalból áll) L-agarra, amely ugyanazt az antibiotikumot tartalmazta. 12 órás, 37 °C-on végzett inkubálás után az adagokat P2 fehérjetermelés szempontjából teszteltük 10 ml (150 μg/ml ampicillint tartalmazó) LB tápközegre való oltással, és egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. A következő napon a tenyészeteket 1: 100 arányban ugyanolyan ampicillinkoncentrációjú M9 tápközegben hígítottuk, és 6 órán át 37 °C-on inkubáltuk.

E tenyészet 20 ml-ét 1200x g-vel 4 °C-on 10 percig centrifugáltuk. A bakteriális szemcséket újraszuszpendáltuk 2 ml 33 mM Tris-HCl-ben pH= 8 értéken; egy azonos térfogatú második oldatban 33 mM EDTA-t, azután 40% szacharózt adtunk hozzá, és a teljes keveréket enyhe rázatás közben inkubáltuk 37 °C-on 10 percig. A centrifugálást követően a permabilizált sejteket 2 ml hideg vízben szuszpendáltuk, és 10 percig jégen hagytuk. A kapott felülúszót centrifugálással izoláltuk, ez a bakteriális sejtek periplazmás frakciója.

A trombinnak a szintetikus S-2238¹⁶ szubsztrát hasító képessége gátlásán alapuló kromogén próbával mértük az antitrombin aktivitás jelenlétét a P2 termelő sejtek periplazmás frakciójában, de nem mértük a kontroll periplazmás frakciókban.

Hasonló megközelítési módszerrel felépítettünk egy új expressziós/kiválasztási plazmidot a P2 számára, ahol Pipp/i_ac promóter van jelen a P_lrp promóter helyett. Ez az eltérő, pOMP-P2-nek nevezett plazmid a 7. ábrán látható. Ha ezt a plazmidot B típusú E. coli törzsekbe építettük be, magas aktív P2 szinteket nyertünk. A pOMP-P2 felépítéséhez kiindulási plazmidként a Ghrayb és munkatársai¹⁷ által leírt pIN-III-ompA3 plazmidot vettük. A tenyésztési feltételek és a kifejezés indukálása izopropil-béta-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) történt a korábban leírtak szerint¹⁷.

5. példa

P2 fehérje kifejezése és kiválasztása rovarsejtekból

A P2 kiválasztásához a rekombináns rovarsejtekból a P2 kódoló szekvenciát egy vezető peptidhez kellett kötnünk, amelyet ezek a sejtek hatékonyan felismernek. A vezikuláris sztomatitisz vírus (VSV) G-fehérje¹⁸ vezető peptidjét használtuk. A fent leírtakhoz hasonlóan előállítottuk a VSV G-fehérje vezető peptidjét kódoló szintetikus DNS-szekvenciát, melyet a P2 gén kezdete követ, a nukleotidszekvencia a 8. ábrán látható. Ebben az esetben is megfelelő restrikciós helyeket biztosítottunk (HindlII, BamHl és Ball), hogy hozzá tudjuk kötni a P2 gén maradékához és az expressziós vektorhoz.

A szintetikus HindlII- Ball fragmenst hozzákötöttük a P2 gént hordozó M13-P2 tisztított Ball-BamHl fragmenséhez, és beépítettük az Ml3mp 18-ba, amelyet előzőleg HindlII-mal és BamHI-gyel elvágtunk. Ez a szerkezet, amely a VSV- P2-nek elnevezett új plazmidot adta, a 9. ábrán vázlatosan látható. A VSV-P2-böl kivágtuk a BamHl-BamHl DNS-fragmenst, amely hordozza a P2 gént a VSV vezető peptidhez fuzionálva, majd beépítettük a pAcYMl¹⁹ vektorba a 10. ábrán láthatóak szerint. A kapott plazmid neve pAc- P2.

A rovarsejtekben való kifejezéshez a VSV-P2 kódoló szekvenciát transzferálni kell a bakulovírus genomba a polihedrin promóter transzkripciós kontrollja mellett. E célból rovarsejteket ko-transzfektáltunk vad típusú bakulovírus DNS-sel és a pAc- P2 transzfer vektorral. Rovarsejtként Spodoptera frugiperda gazdasejteket választottunk. A kísérlet részletei a következők:

S. frugiperda sejteket transzfektáltunk fertőző AcNPV DNS és plazmid DNS keverékével, amelyek individuális rekombináns transzfer vektorként szolgálnak a Summers és munkatásai²⁰ által leírt eljárás modifikálása után. A vírus DNS egy mikrogrammját 25-100 μg plazmid DNS-sel összekevertük, majd 0,125 M kalcium-kloriddal (végső koncentrációk) 20 mM HEPES puffer jelenlétében pH= 7,5 értéken, 1 mM dinátrium-hidrogén-ortofoszfáttal, 5 mM KC1dal, 140 mM nátrium-kloriddal és 10 mM glükózzal kicsaptuk (teljes térfogat 1 ml).

A DNS-szuszpenziót 10⁶ S. frugiperda sejtek monorétegére oltottuk 35 mm-es szövettenyésztö edényben, és 1 órán át szobahőmérsékleten hagytuk a sejtekhez adszorbeálódni, majd 1 ml tápközeggel kicseréltük. 28 °C-on 3 napon át való inkubálás után a felülúszó folyadékokat begyűjtöttük és plakkokat képeztünk az S. frugiperda sejt monorétegekben. A rekombináns vírust tartalmazó plakkokat a polihedrin hiánya alapján azonosítottuk fénymikroszkópos vizsgálattal. Az ilyen

HU 215 580 Β plakkokból kapott vírusokat kinyertük, és további plakktisztítás után felhasználtuk a polihedrin-negatív vírustörzsek előállítására.

A fent ismertetett eljárással sikerült izolálni egy rekombináns bakulovírust, amelynek genomja a polihedrin promoter kontrollja alatt hordozza a P2 gént és VSV G-fehérje vezető peptidjét. Ezt a vírust használtuk az S. frugiperda sejtek fertőzésére a jól bejáratott eljárások²⁰ szerint, 10-es fertőzési multiplicitás mellett. A fertőzött sejteket azután forgatott tenyészetben vagy monorétegekben tenyésztettük 10% magzati borjúszérum jelenlétében, az irodalomban ismertetett eljárások²⁰szerint. Az S-2238 kromogén vizsgálat mindkét esetben antitrombin aktivitást mutatott a fertőzött sejtek tenyészetének felülúszójában.

6. példa

P2 fehérje kifejezése rovarsejtek citoplazmájában

A P2 fehérje előállítható és összegyűjthető S. frugiperda sejtek citoplazmájában is. Ez a megközelítés rendszerint jobb heterológ fehérjehozamot ad, mivel a polihedrin expressziós szignálját felhasználja, amely egy ki nem választott vírusfehérje.

A nagy mennyiségű rekombináns P2 fehérje előállítására irányuló módszerünk egy fúziós polipeptid kifejezésén alapul, ahol a polihedrin első 18 aminosava egy keretben a P264 aminosavához kötődik. A polihedrin NH₂vég szekvenciája magas szintű expressziót tesz lehetővé²¹. Emellett a polihedrin rész és a P2 szekvencia közé egy metionin maradékot tettünk, amely lehetővé teszi a P2 felszabadulását a hibrid fehérje CNBr-os kezelésekor.

Az előzőekhez hasonlóan szintetikus DNSoligo 5-Tyr fragmenst állítottunk elő, amely lehetővé teszi az M13- P2 Ball- BamHl fragmensének hozzákötését egy megfelelő transzfer vektorhoz. Az új szintetizált darab, amely all. ábrán látható, BamHl és Ball helyeket is tartalmaz a következő manipulációkhoz.

Előállítottunk egy másik transzfer vektort, a pHcFTl-t, amely a polihedrin első 18 aminosavát kódoló nukleotidszekvenciát hordozza (12. ábra). Röviden, a PacYMl¹⁹ EcoRV-BamHl fragmensét helyettesítettük egy szintetikus oligonukleotiddal, amely a polihedrin génszekvencia -92-töl + 55-ig elhelyezkedő nukleotidjait tartalmazta. Egy megfelelő BamHl hely is jelen van ez után a szekvencia után, és ezt használtuk a teljes P2 kódoló szekvencia beépítésére a 13. ábrán bemutatott vázlat szerint. Ezzel a szerkezettel előállítottunk egy új, pAcFTl- P2 nevű plazmidot, amelyet a hibrid gén transzferjéhez használtunk a bakulovírus genomba.

A rekombináns bakulovírus előállítása az 5. példában leírtak szerint ment végbe. Az S. frugiperda sejtek fertőzése a szokásos eljárásokkal²⁰ történt. A fertőzött sejtek tenyésztésével a fúziós fehérje felgyülemlett a citoplazmában. Ez a hibrid fehérje szolgált a rekombináns P2 fehérje forrásául. Az irodalomból több módszer ismert a hibrid CNBr-os hasítására²²·²³. Olson és munkatársai²³ módszerének alkalmazása lehetővé tette a helyes P2 polipeptid szekvencia előállítását. Ez a molekula antitrombin aktivitást mutatott.

7. példa

A P2 fehérje Tyr₆₁ változatának előállítása céljából a fenti 3. példában leírt és a 3. ábrán bemutatott 5-ös és 6-os oligonukleotidokat a következőkkel helyettesítettük:

5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAATACATCCTG

AACTAGTAACTGCA 3' oligo 6-Tyr

5'-GTTACTAGTTCAGGATGTATTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'

Az oligo 5-Tyr-ban az aláhúzott TAC-triplet kódolja a tirozinmaradékot és helyettesíti az eredetileg jelen levő aszparaginsavat kódoló GAC-tripletet. Az oligo 6- Tyr-t megfelelő módon korrigáltuk, hogy teljes komplementaritás álljon fenn a két szál között. A variáns rovarsejtekben vagy E. coliban való kifejezéséhez és/vagy kiválasztásához vezető további lépések ugyanazok, mint a 4- 6. példákban bemutatottak.

oligo 5-Gly

8. példa

Egy glicinnel bővített P2 fehérjeszármazék előállítása céljából a 3. példában leírt és a 3. ábrán bemutatott 5-ös és 6-os oligonukleotidokat a következőkkel helyettesítettük:

5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAACGGTTAGTAACTGCA 3 ' oligo 6-Gly

5' GTTACTACCGTTCAGGATGTCTTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'

1

HU 215 580 Β

Az 5- Gly oligóban az aláhúzott GGT triplet kódolja a glicint, ezt a stop kodon elé építettük be. A 6- Gly oligót úgy változtattuk, hogy teljes komplementaritás álljon fenn a két szál között. A Gly-bövített származék rovarsejtekben vagy E. coli-ban való kifejezéséhez és/vagy kiválasztásához vezető további lépések ugyanazok, mint a 4- 6. példákban.

9. példa

Pl és P2 cDNS klónozás (a) A Hirudinaria manillensis fejekből a teljes RNS-t

Cathala és munkatársai²⁴ módszerével állítottuk elő.

(b) A reverz transzkripciós reakció a következők szerint ment végbe:

gg RNS a piócafejekből 1 hg dT17 adaptor primer 8 hl 5 mM dNTP-keverék 8 hl AMV puffer 5X víz 40 pl-re

A fenti anyagokat jégre tettük, kevertük, majd a keveréket 2 percig 65 °C-on melegítettük, utána jégen kvencseltünk. 10 egység RNSsín-t (Promega) és 20 egység AMV reverz transzkriptázt (Boehringer Mannheim) adtunk hozzá, majd 42 °C-on 2 órán át inkubáltuk. A reakcióelegyet ezután fenol-kloroformmal extraháltuk és izopropanollal kicsaptuk.

(c) Ezután polimeráz láncreakciókat (PCR) hajtottunk végre.

Az egyes PCR-reakciók általános sémája a következő: PCR-keverék:

hl fordítottan átírt RNS 10 hl 10X PCR puffer (Cetus/Perkin/Elmer) hl dNTP-keverék (1,25 mM mindegyik dNTP-böl) 2 hl MgCl₂0,lM dTl7 adaptor primer:

25- 500 pmol az egyes primerekböl víz 100 hl-re.

A reakciókeveréket 95 °C-on 5 percig denaturáltuk, miután 2,5 egység Taq polimerázt (Cetus/Perkin/Elmer) adtunk hozzá, ezután befedtük 80 hl ásványolajjal. A reakciót Cetus/Perkin/Elmer DNS-termikus

ciklizálóban hajtottuk végre.
A ciklusprofil a következő:	1 ciklus
3 perc 2 perc 2 perc 30 másodperc	94 °C 60 °C 72 °C
1 perc	94 °C
2 perc	60 °C
3 perc 30 másodperc	72 °C	30 ciklus
1 perc	94 °C
2 perc	60 °C
5 perc	72 °C	1 ciklus
7 perc távozás 25 °C-on.	72 °C

A maradék Taq polimerázt fenol-kloroformmal és etanolos kicsapással inaktiváltuk; a mintákat - 20 °C-on lehet tárolni. A Pl és P2 cDNS teljes szekvenciák előállítására három kör PCR-sokszorosítást végeztünk. Az összes felhasznált primer szekvenciái lejjebb szerepelnek. Azok a helyek, ahol a degnerációt bevittük az oligonukleotid-szekvenciába, az alternatív szekvenciák segítségével követhetők, ezeket a primer szekvencia alá írtuk (az N azt jelenti, hogy mind a négy nukleotidot felhasználtuk). A restrikciós helyeket, amelyeket a sokszorosított termékek klónozásának elősegítésére vittünk be, aláhúzással jelöltük.

5'GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'

Xhol Sáli

Adaptor primer:

5' GAC TCG AGT CGA CAT CG 3'

Xhol Sáli

Primer 3-8

5' ATC GAA GCT TTA TAC CGA TTG TAC NGA 3'

HindlII C A C C

T o

HU 215 580 Β

Primer 52-56

5' CTA AGG ATC CTT CTT CGA AGT CNC C 3 '

BamHI C A A

Primer 32-37

5' ATC GGA ATT CAG TTC TGG AAA TCA GTG CGT 3'

EcoRI

Primer 5' I

5''CTA AGA ATT CTT CGC AAC TTA TAT GCG TT 3'

EcoRI

Primer 5’ II

5' ATC GGA ATT CTT AAT TCA ATA TAT CTT CAT 3'

EcoRI

Az első sokszorosítási kör

A P2 aminosavszekvencia 3- 8 és 56-52 maradékáig terjedő, 500 pmol teljesen degenerált prímért használtuk ellentétes primerként a PCR-reakcióban.

A cDBS 3’ végek sokszorosítása (RACE-eljárás) 35 Frohman és munkatársai²⁵

A 32- 37 maradékig terjedő génspecifikus prímért építettünk fel a sokszorosítás első körében meghatározott P2 nukleotidszekvencia alapján. Ezt együtt használtuk a dT adaptor primerrel a cDNS sokszorosítására (14. ábra).

A cDNS 5’ végek sokszorosítása (RACE-eljárás) Frohman és munkatársai²⁵ pg piócafejekből származó teljes RNS-t fordítottan átírtuk az előzőekben leírtak szerint annyi eltéréssel, 43 hogy 1 pg génspecifikus primerrel (5Ί) helyettesítettük a dT17 adaptor prímért (lásd 15. ábra). Azután a reakciókeveréket izopropanollal kicsaptuk és a cDNS-termékek első szálát poiadenileztük 5’ végeiken terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (TdT) alkalmazásával a gg következők szerint:

pl cDNS 1 pl 6 mM dATP pl 5X TdT puffer (BRL)

1,1 pl TdT (BRL).

A mintákat 10 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd 16 percig 65 °C-on melegítettük. Azután a reakcióelegyet 500 pl-re hígítottuk desztillált vízzel.

A poliadenilezett termékekből 10 pl-t sokszorosítottunk 10 pmol dT17 adaptor primerrel, 25 pmol adaptor primerrel és a transzkripcióhoz használt első specifikus génhez upstream levő 25 pmol második génspecifikus primerrel (5ΊΙ, lásd 15. ábra).

d) A PCR-termékek elemzése

A sokszorosított termékeket az összes primerben jelen levő restrikciós helyeken hasítottuk. Az emésztett terméket géltisztításnak vetettük alá és pUC13 vektorba szubklónoztuk, amelyet előzőleg ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel emésztettünk. A kívánt inzertet hordozó plazmidokat restrikciós elemzéssel azonosítottuk. A plazmid DNS-t Sequenase-zal (UCB) szekvenáltuk a felhasználói utasítás szerint. Az így kapott Pl és P2 cDNS-szekvenciák és a belőlük következő aminosavszekvenciák itt láthatók. A vezető szekvenciákat aláhúztuk.

a

HU 215 580 Β

Pl cDNA

tea

aaa

ATG Met

TTC Phe

TCT Ser

CTC Leu

AAG Lys

TTG Leu

TTC Phe

GTT Val

GTC Val

TTC Phe

CTG Leu

GCT Alá

GTT Val

TGC

ATC

TGC

GTG

TCT

CAA

GCA

GTG

AGC

TAC

ACT

GAT

TGT

ACG

GAA

Cys

Ile

Cys

Val

Ser

Gin

Alá

Val

Ser

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

TCA

GGC

CAG

AAT

TAT

TGT

CTA

TGC

GTG

GGA

GGT

AAT

CTC

TGC

GGT

Ser

Giy

Gin

Asn

Tyr

Cys

Leu

Cys

Val

Gly

Asn

Leu

Cys

Gly

GGA

GGC

AAA

CAT

TGT

GAA

ATG

GAC

GGT

TCT

GGA

AAT

AAA

TGC

GTC

Gly

Lys

His

Cys

Glu

Met

Asp

Gly

Ser

Gly

Asn

Lys

Cys

Val

GAT

GGG

GAA

GGT

ACT

CCG

AAG

CCT

AAG

AGC

CAG

ACT

GAA

GGC

GAT

Asp

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Lys

Pro

Lys

Ser

Gin

Thr

Glu

Gly

Asp

TTC

GAA

ATC

CCA

GAT

GAA

GAT

ATA

TTG

AAT

TAA

Phu

Glu

I le

Pro

Asp

Glu

Asp

I le

Leu

Asn

End

P2 cDNA

aaa

ATG Met

TTC Phe

TCT Ser

CTC Leu

AAG Lys

TTG Leu

TTC Phe

GTT Val

GTC Val

TTC Phe

CTG Leu

GCT Alá

GTT Val

TGC Cys

ATC

TGC

GTG

TCT

CAA

GCA

GTG

AGC

TAC

ACT

GAT

TGT

ACG

GAA

TCA

Ile

Cys

Val

Ser

Gin

Alá

Val

Ser

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

GGT

CAG

AAT

TAT

TGT

CTA

TGC

GTG

GGA

AGT

/LAT

GTC

TGC

GGT

GGA

Gly

Gin

Asn

Tyr

Cys

Leu

Cys

Val

Gly

Ser

Asn

Val

Cys

Gly

Glu

GGC

AAA

AAT

TGT

CAA

CTG

AGC

AGT

TCT

GGA

AAT

CAG

TGC

GTC

CAT

Gly

Lys

Asn

Cys

Gin

Leu

Ser

Gly

Asn

Gin

Cys

Val

His

GGG

GAA

GGT

ACT

CCG

AAG

CCT

AAG

AGC

CAG

ACT

GAA

GGC

GAT

TTC

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Lys

Pro

Lys

Ser

Gin

Thr

Glu

Gly

Asp

Phe

GAA

ATC

CCA

GAT

GAA

GAT

ATA

TTG

AAT

TAA

cgaacgcatataagt

Glu

Ile

Pro

Asp

Glu

Asp

Ile

Leu

Asn

End

Λ

HU 215 580 Β tgcgaataattctgattttaagacattcccatcgcagctatggctatttacagtatatta ttataaataaagaattgaacgtttacgttgattgta

Irodalmi hivatkozások: 5

1) Markwardt, F. 1970, Methods in Enzymology, 19, p. 924.

2) Markwardt, F. 1985, Biomed. Biochim. Acta. 44, p. 1007.

3) Markwardt, F., Hauptmann, J., Nowak, G., Kiessen, -| q C., and Walsmann, P. 1982. Thromb. Haemostasis

47, p. 226.

4) Dupont D., Keim P., Chui A., Bello R. and Wilson

K., Derivatizer-Analyser User Bulletin No. 1, Applied Biosystems Inc., 1987. -| 5

5) Grosjeans H. and Fiers W., 1982. Gene, 18, p. 199.

6) Maniatis T., Fritsch E. F. and Sambrook J.

1982 Cold Spring Harbor, NY

7) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. 1977,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, p. 5463. 20

8) Blobel G. and Dobberstain B. 1975. J. Cell Biology,

67, 5. p. 83.

9) Pages J. M. 1983, Biochimie, 65, p. 531.

10) Wolfe P. B. 1983. J. Bioi. Chem. 258, p. 12073.

11) Talmadge K., Stahl S. and Gilbert W. 1980. Proc. ₂5 Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 3369.

12) Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K., Fuwa T., Yoda K., Yamasaki M., Tamura G. and Miyake K. 1985.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p. 7212.

13) Henning V., Royer H. D., Teather R. M., 39 Hindennach I. and Hollenberg C. P. 1979. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 76, p. 4360.

14) Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. and Soria M. 1989, Gene 81, p. 129.

15) Mandel M. and Higa A. J. 1970. J. Mól. Biology, 53, p. 154.

16) Krstenansky, J. K., and Mao, S. J. T. 1987. FEBS Lett. 211,p. 10.

17) Ghrayeb J., Kimura H., TakaharaM., Hsiung H., Masui Y. and Inouye M. 1984. EMBO Journal 3, p. 2437.

18) Bailey, M. J., McLeod, D. A., Kang, C., and Bishop, D. H. L. 1989. Virology 769, p. 323.

19) Matsuura, Y., Possee, R. D., Overton, H. A. and Bishop, D. H. L. 1987. J. Gén. Virol. 68, p. 1233.

20) Summers, M. D., and Smith, G. E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555.

21) Luckow, V. A. and Summers, M. D. 1988, Virology, 167, p. 56.

22) Gross E. 1967. Methods in Enzymology, 77, p. 238.

23) Olson H., Lind P., Pohl G., Henrichson C., Mutt V., Jornvall H., Josephson S., Uhlen M. and Laké M. 1987, Peptides, 9, p. 301.

24) Cathala, G., Savouret, J.-F., Mendez, B., West, B. L., Karin, M., Martial, J. A. and Baxter, J. D. (1983) DNA, 2,4: 329-335.

25) Frohman, M. A., Dush, Μ. K. and Martin, G. R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002.

c

HU 215 580 Β

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás a következő aminosavszekvenciákat tartalmazó (i) Pl

Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu 1 5 10 15 Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys 35 40 45 Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu 50 55 60 Yaa Ile Leu Asn Zaa; 65 (ü) P2 Val Ser Tyr Thr Asp Cys ' Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu 1 5 10 15 Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn cys Gin Leu 20 25 30 Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys 35 40 45 Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu 50 55 60 Yaa Ile Leu Asn Zaa. ; és (iii) P3 Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu

1 A

HU 215 580 Β

Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu 20 25 30 Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His Gly Glu Gly; 30 40 polipeptid és gyógyászatilag elfogadható sói - - ahol 10 tése - OH, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet vagy

Yaa jelentése Asp vagy Tyr és Zaa - OH, -NH₂ vagy Gly- OH - előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy gazdaszervezetet állítunk elő, amelyet a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral transzformáltunk olyan feltételek mellett, hogy a polipeptid kifejeződjön benne; és (b) az így kapott polipeptidet vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját izoláljuk. (Elsőbbsége: 1991. 02. 28.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti bármely aminosav szekvenciával rendelkezik, amelyet a teljes vezető szekvencia vagy annak egy része előz meg. (Elsőbbsége: 1991.09. 18.)
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy benne jelen van a következő szekvencia teljesen, vagy ennek egy része: Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Alá Val Cys Ile Cys Val Ser Gin Alá. (Elsőbbsége: 1991.02.28.)
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként egy baktériumot, élesztőt, emlőssejtvonalat, rovarsejtvonalat vagy állatot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1991. 09. 18.)
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként B típusú E. coli vagy Spodoptera frugiperda sejtvonalat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1991.02.28.)
6. Eljárás az 1. igénypont szerinti polipeptid vagy gyógyászatilag elfogadható sója előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) a polipeptidet kémiai úton szintetizáljuk; és (b) az így kapott polipeptidet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját izoláljuk. (Elsőbbsége: 1991. 02. 28.)
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben szilárd fázisú szintézist végzünk. (Elsőbbsége: 1991.02.28.)
8. Eljárás az 1. igénypont szerinti polipeptid vagy gyógyászatilag elfogadható sója előállítására, ahol a polipeptid olyan (i), (ii) és (iii) aminosavszekvenciával rendelkezik, amelyben Yaajelentése Asp, és Zaa jelengyógyászatilag elfogadható sóját a Hirudinaria manillensis piócafajták szövetéből vagy szektérumából izoláljuk. (Elsőbbsége: 1991. 02. 28.)
9. Eljárás az 1- 3. igénypontok bármelyike szerinti 15 polipeptid kifejezésére alkalmas gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy, az említett polipeptidet pre-protein formájában - ahol a vezető peptid a polipeptid NH₂-végénél van - kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk;

20 b) az említett DNS-szekvenciát antibiotikum rezisztens és bakteriális promoter gént hordozó expressziós vektorba inszertáljuk; és

c) egy B típusú E. coli törzset az expressziós vektorral transzformálunk, így a kívánt polipeptid termelésére

25 alkalmas gazdaszervezetet állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1991. 02. 28.)
10. Eljárás az 1- 3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid kifejezésére alkalmas gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy

30 a) egy, az említett polipeptidet pre-protein formájában - ahol a vezető peptid a polipeptid NH₂-végénél van jelen - kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk;

b) az említett DNS-szekvenciát egy transzfer vektorba inszertáljuk;

35 c) rovarsejteket vad típusú bakulovírus DNS-sel és az említett transzfer vektorral ko-transzfektálunk;

d) a DNS-szekvenciát hordozó rekombináns bakulovírust pobhedrin promoter kontroll mellett izoláljuk;

e) rovarsejteket a rekombináns bakulovírussal meg40 fertőzünk, így a kívánt polipeptid termelésére alkalmas gazdaszervezetet állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1991.02.28.)
11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid kódoló DNS-szekvenciát kémiai szintézissel állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1991. 02.

45 28.)
12. A 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid kódoló szekvenciát egy, Hirudinaria manillensis piócafajtából származó mRNSből állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1991. 09. 18.)

50
13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvencia a következőkből áll:

GTTTCTTACACCGACTGCACCGAATCTGGCCAGAACTACTGCCTGTGCGTTGGTTCTAAC

GTTTGCGGTGAAGGTAAAAACTGCCAGCTGTCTTCTTCTGGTAACCAGTGCGTTCACGGT

GAAGGTACGCCGAAACCGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAA

GACATCCTGAACTAG . (Elsőbbsége: 1991.02.28.)

1 1

HU 215 580 Β
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvencia a következőkből áll:

CTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGT GGA GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTC GAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GGA GAT ATA TTG AAT TAA, , (Elsőbbsége: 1991.09 .18.)
15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvencia a következőkből áll:

ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGA GGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA

GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA. (Elsőbbsége: 1991.09.18.)