DE58907266T2

DE58907266T2 - Polypeptide mit einer die Koagulierung hemmenden Wirkung.

Info

Publication number: DE58907266T2
Application number: DE58907266T
Authority: DE
Inventors: Markus Gerhard Dr Gruetter; Reinhard Dr Maschler; Fritz Raschdorf; Verena Steiner
Original assignee: Ciba Geigy AG; UCP Gen Pharma AG
Current assignee: Novartis Ag Basel Ch Ucp Gen-Pharma Ag Zuerich
Priority date: 1988-06-11
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2009-06-03
Also published as: DE58907266D1; IE891856L; EP0347376A3; PT90798A; PT90798B; EP0347376A2; DK283889A; EP0347376B1; AU3630189A; DK283889D0; AU625375B2; JPH02117697A; ES2052062T3; CA1339106C; US5114922A; IE61809B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide mit gerinnungshemmender Wirkung, Verfahren und Mittel zu deren Herstellung, Arzneimittel, die solche Polypeptide enthalten, und deren Verwendung als gerinnungshemmende Mittel.
Heilblutegel (Hirudo medicinalis) wurden seit Jahrhunderten in Heilverfahren verwendet. Unter den vielen biologisch wirksamen in der Egelsaliva vorkommenden Peptiden ist Hirudin von besonderem Interesse, da es als stärkster Thrombininhibitor bekannt ist. Hirudin reagiert spezifisch mit Thrombin und verhindert dadurch die Blutgerinnung. Es ist nicht antigenisch, weist eine geringe Toxizität auf und das unveränderte Molekül ist fast vollständig über die Nieren ausscheidbar. Gewinnung, Reinigung und die pharmazeutischen Eigenschaften von Hirudin wurden P. Walsmann et al. [Pharmazie 36, 653 (1981)] zusammengestellt und die primäre Struktur wurde von J. Dodt et al. [Biol. Chem. Hoppe-Seiler 366, 379 (1985)] aufgeklärt.
Kürzlich wurden cDNSn und synthetische Gene, die Hirudin oder Hirudinvarianten kodieren, geklont und in mikrobielle Wirte, wie Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae, exprimiert [vergl. Europäische Patentanmeldungen Nr. 158 564 und 168 342]. Obwohl den Expressionsprodukten die Sulfatmonoestergruppe bei Tyr&sup6;³ fehlt - und sie daher als "Desulfatohirudine" bezeichnet wurden - stellte sich heraus, daß sie etwa die gleiche biologische Aktivität aufweisen, wie natürliches Hirudin, worin der Tyrosinrest als Sulfatmonoester vorliegt.
Obwohl das hohe therapeutische Potential von Hirudin unanfechtbar und allgemein anerkannt ist, stellt die vergleichbar kurze Halbwertszeit von Hirudin, wenn es an Tiere verabreicht wurde [vergl. F. Markwardt, Biomed. Biochem. Acta 46, 237 (1987)], ein potentielles Problem dar, das durch weitere Untersuchungen gelöst werden sollte. In Anbetracht dieses Nachteils und der außerordentlichen Brauchbarkeit antithrombotischer Mittel zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen und ähnlichen Zuständen besteht starker Bedarf für Polypeptide, die hinsichtlich der antithrombotischen Wirksamkeit zu Hirudin vergleichbar sind und vorteilhafterweise eine längere Wirkungszeit aufweisen. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche antithrombotisch wirksamen Polypeptide bereitzustellen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß der Egel Hirudinaria manillensis Polypeptide erzeugt, die als Hirulline bezeichnet werden und eine entfernte Verwandtschaft zu Hirudin in struktureller Hinsicht aufweisen und starke antithrombotische Wirkungen zeigen.
Folglich betrifft die Erfindung ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Polypeptid mit 63 Aminosäuren der Aminosäuresequenz
und dem Polypeptid mit 62 Aminosäuren und der Aminosäuresequenz
worin T* Threonin darstellt, dessen Hydroxylgruppe frei oder glycosyliert vorliegt und Z ein phenolisches Wasserstoffatom von Tyrosin oder eine Gruppe -SO&sub3;H bedeutet, und Salze davon.
Die Polypeptide der Formel I werden als "Desulfatohirullin P6" (Z bedeutet Wasserstoff) oder als "Hirullin P6" (Z bedeutet die Gruppe -SO&sub3;H) bezeichnet. Das Polypeptid der Formel II wird als "Hirullin P18" bezeichnet.
Der in den Formeln I und II verwendete Einbuchstaben-Code bezeichnet die nachstehenden Aminosäuren:
(A) Alanin, (C) Cystein, (D) Asparaginsäure, (E) Glutaminsäure, (F) Phenylalanin, (G) Glycin, (H) Histidin, (I) Isoleucin, (K) Lysin, (L) Leucin, (M) Methionin, (N) Asparagin, (P) Prolin, (Q) Glutamin, (R) Arginin, (S) Serin, (T) Threonin, (V) Valin, (Y) Tyrosin.
Der Glycosylrest, O-gebunden zu Threonin T* in der Verbindung der Formel II, erzeugt durch den Egel H. manillensis kann durch die Formel
-SNAc - S - Fuc (A)
wiedergegeben werden, worin SNAc entweder N-Acetylgalactosamin oder N-Acetylglucosamin bedeutet, S entweder Galactose oder Mannose oder Glucose darstellt und Fuc Fucose bedeutet. Die von dem Egel H. manillensis erzeugten Verbindungen der Formel I haben größtenteils einen zu Threonin T* O-gebundenen Glycosylrest, der wiedergegeben werden kann durch die Formel
-SNAc - S (B)
worin SNAc und S die vorstehend angeführten Bedeutungen aufweisen. Ein kleiner Teil der Verbindungen der Formel I, die von dem Egel H. manillensis erzeugt werden, schließen einen Threoninrest T* ein, der einen Glycosylrest der vorstehend dargestellten Formel (A) trägt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in freier Form oder in Form ihrer Salze vorliegen. Da sie freie Amino- und Guanidinogruppen mit verschiedenen Aminosäureresten aufweisen, können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form ihrer Säureadditionssalze vorliegen. Geeignete Säureadditionssalze sind insbesondere physiologisch tolerierbare Salze mit üblichen therapeutisch verträglichen Säuren. Repräsentative anorganische Säuren sind Halogenwasserstoffsäuren (wie Chlorwasserstoffsäure) und auch Schwefelsäure, Phosphorsäure und Pyrophosphorsäure. Repräsentative organische Säuren sind insbesondere Arensulfonsäuren (wie Benzolsulfon- oder p-Toluolsulfonsäure), oder Niederalkansulfonsäuren (wie Methansulfonsäure) sowie Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure und Zitronensäure. Da das Hirullin auch freie Carbonsäuregruppen in verschiedenen Aminosäuren enthält, die dem gesamten Peptid einen sauren Charakter verleihen, können sie ebenfalls in Form ihrer Salze vorliegen, beispielsweise als Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalze oder auch als Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder einer physiologisch tolerierbaren organischen stickstoffhaltigen Base. Da sie jedoch gleichzeitig freie Carbonsäuregruppen enthalten und freie Amino(Guanindino)gruppen, können sie auch in Form ihrer inneren Salze vorliegen.
Ein Verfahren zur Herstellung der neuen Polypeptide umfaßt das Gewinnen des Polypeptids aus den Körpern der Egelart Hirudinaria manillensis durch eine Kombination von Fällungsverfahren und chromatografischen Verfahren und, falls erwünscht, Entfernen in einer erhaltenen Verbindung der Formel I, worin Z die Gruppe -SO&sub3;H darstellt, der Schwefelsäuremonoestergruppe durch Hydrolyse und/oder, falls erwünscht, Entfernen des Glycosylrestes in einer durch Hydrolyse oder Säurespaltung erhaltenen Verbindung der Formel I oder II und/oder, falls erwünscht, Umwandeln eines erhaltenen, mit freien Carbonsäure- und/oder Aminogruppen ausgestatteten Polypeptids in ein Salz oder Umwandeln eines erhaltenen Salzes in die freie Verbindung.

Gewinnen von Hirullinen aus Hirudinaria manillensis

Die Gewinnung von erfindungsgemäßen Hirullinen erfolgt in an sich bekannter Weise. Somit werden Egel, zugehörig zur Art Hirudinaria manillensis (Herkunft beispielsweise China) gesammelt, getötet und anschließend eingefroren. Vorzugsweise werden ganze Egel verarbeitet, obwohl der Kopfbereich, der mehr Hirullin enthält, auch verwendet werden kann. Die Entfernung des Kopfes ist jedoch ein sehr zeitaufwendiges Verfahren, da tausende Egel erforderlich sind, um eine minimale Menge reinen Materials zu erhalten. Vor der Extraktion werden die gefrorenen Egel in einem Blatthomogenisator vermahlen. Rohe Hirulline fallen in kalten organischen Lösungsmitteln, wie Aceton oder Ethanol, aus. Ein geeignetes Verfahren, das angepaßt werden kann, wurde von D. Bagdy et al. [Thromb. Res. 2, 229 (1973)] beschrieben. Das Präzipitat wird vorzugsweise gefriergetrocknet und vor weiterer Reinigung kühl aufbewahrt.
Der erhaltene Rohextrakt wird einer Kombination chromatografischer Verfahren unterzogen, beispielsweise Gelfiltration, Affinitätschromatografie unter Verwendung von polyklonalen oder, vorzugsweise, monoklonalen Antihirullin-Antikörpern (die durch bekannte Verfahren hergestellt werden können) oder insbesondere mit Thrombin als Affinitätsreagenz, Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatografie, Ionenaustauschchromatografie, wie Kationen- oder Anionenaustauschchromatografie, Chromatografie an Kieselgel, Aluminiumoxid oder Hydroxyapatit und dergleichen.
Als erster Reinigungsschritt ist Gelfiltration sehr nützlich, da Proteine höheren Molekulargewichts (wie Verdauungsenzyme) von den Hirullinen, die 7000 Dalton aufweisen, abgetrennt werden. Die Gelfiltration ist ein an sich bekanntes Verfahren. Geeignete Gele basieren auf Dextranen, Dextranacrylamiden, Polyacrylamiden und dergleichen. Ein spezielles Gelfiltrationsverfahren wurde von J. Dodt [Biolo. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803 (1986)] beschrieben und benutzt Sephadex G 75 (ein mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran) und einen Puffer mit pH 7,8, der 0,3 M NaCl enthält. Sephadex G 50 superfine ist jedoch bevorzugt, da es eine bessere Auftrennung liefert. Als Elutionsmittel ist 0,1 M Essigsäure sehr zweckmäßig, da ein darauffolgender Entsalzungschritt unterbleiben kann. Andere flüchtige Elutionsmittel, wie Ameisensäure, Pyridinessigsäure oder Triethylaminameisensäure können ebenfalls verwendet werden. Die Probe wird in dem Elutionsmittel in einem Volumen, das sich auf höchstens 5 % des Bettvolumens beläuft bei einer Proteinkonzentration von 30-70 mg/ml, vorzugsweise 50 mg/ml, gelöst und auf eine vorkonditionierte Säule gegeben.
In einem zweiten Reinigungsschritt wird das Eluat aus der Gelfiltration einer Affinitätschromatografie an einer geeigneten Matrix, wie Affigel oder Bromcyan-aktivierter Sepharose, mit daran gebundenem Thrombin unterzogen. Die Thrombinsäule wird wie nachstehend hergestellt: Im ersten Schritt wird handelsübliches Thrombin durch Gelfiltration gereinigt. Als Elutionsmittel wird ein Puffer im pH-Bereich von 6 bis 7,5 verwendet. Die Aktivität der Fraktionen kann mit einem Blutgerinnungstest festgestellt werden [F. Markwardt et al. Thromb. Haemost. 47, 226 (1987)]. In einem nächsten Schritt werden die aktiven Fraktionen gesammelt und an einen Affinitätsträger, beispielsweise Affigele (Biorad), nach Vorschrift des Herstellers, gebunden. Die Elution von Thrombininhibitoren wird mit Benzamidin ausgeführt. Das letztere Verfahren wird von P. Walsmann [Pharmazie 36, 860 (1981)] beschrieben. Demnach wird die aktive Hirulline enthaltende Probe in verdünnter NaCl-Lösung bei einer Konzentration von 10 bis 50 mg Protein/ml gelöst. Pro ml Bettvolumen werden etwa 30 mg Protein angewendet. Die nichtgebundenen Proteine werden mit Salzlösung oder verdünnter Natriumacetatlösung heruntergewaschen, bevor die gebundenen Peptide mit Benzamidin eluiert werden. Die Affinitätssäule kann mit einer Gelfiltrationssäule kombiniert werden, um Benzamidin von den Hirullinen abzutrennen. Aktive Fraktionen werden entsalzen und gefriergetrocknet.
Eine Alternative zur vorstehend beschriebenen Affinitätschromatografie ist die Reinigung durch Anionenaustauschchromatografie. Da der isoelektrische Punkt der Hirulline im Bereich von pH 4 liegt, ist die Anwendung einer Probe bei einem pH-Wert von 5 bis 5,6 bevorzugt, da somit eine beträchtliche Menge des ungewünschten Proteins mit Salzlösung fortgewaschen werden kann, bevor die Elution der aktiven Fraktionen beginnt. Da Hirulline bei hohen Salzkonzentrationen eluiert werden, kann die Hirullinfamilie mit einem Stufengradienten eluiert werden. Die miteluierten Verunreinigungen können in einfacher Weise durch einen anschließenden Reinigungsschritt abgetrennt werden. Wenn anstelle des Stufengradienten ein flacher Salzgradient verwendet wird, ist es möglich, Isoformen von Hirullinen zu trennen.
Während der Endreinigung werden Isoformen von Hirullinen voneinander getrennt. Die Endreinigung schließt vorzugsweise mindestens zwei unterschiedliche Schritte ein. Beispielsweise wird die Peptidfamilie auf eine RP C18 HPLC- Säule aufgegeben und mit Wasser/Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA), eluiert. Einzelne Peakfraktionen werden gesammelt und erneut unter den gleichen Bedingungen chromatografiert. Dann werden die Einzelpeakfraktionen mit einem anderen Ionenpaarreagens behandelt, wie Heptafluorbuttersäure anstelle von TFA oder einer anderen stationären Phase, beispielsweise einer Umkehrphasenphenylkieselgelfüllung. Anstelle der Umkehrphasentrennung ist hochauflösende Ionenaustauschchromatografie, beispielsweise mit MonoQ-Säulen des Pharmacia FPLC-Systems als letzter Schritt bei der Reinigung bevorzugt. Wenn flüchtige Elutionsmittel, zum Beispiel Ameisensäure/Ammoniak, verwendet werden, kann ein Entsalzungsschritt unterbleiben.
In einer erhaltenen Verbindung der Formel I, worin Z die Gruppe -SO&sub3;H bedeutet, kann die Gruppe -SO&sub3;H durch Hydrolyse entfernt werden. Hydrolyse wird vorzugsweise unter Verwendung spezifischer Enzyme, nämlich Arylsulfatasen, ausgeführt, die phenolische Sulfatestergruppen zu freien phenolischen Hydroxygruppen unter milden Bedingungen spalten. Die biologische Spaltung der Sulfathydroxylgruppe kann mit Hilfe einer geeigneten Enzymzubereitung mit angereicherter aktiver Komponente oder einem isolierten Enzym bewirkt werden oder weiterhin kann ein geeignetes Enzymsystem in situ angewendet werden, d.h. eines, das direkt in einem lebenden oder toten biologischen Material vorliegt, zum Beispiel ein wachsender oder ruhender Mikroorganismus, eine Zellkultur, ein Zellhomogenisat oder Autolysat. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer wässerigen, vorzugsweise gepufferten, Lösung oder Suspension mit einer einzelnen Arylsulfatasezubereitung, zum Beispiel Arylsulfatase von Helix pomatia bei einer Temperatur, die normalerweise für enzymatische Verfahren angewendet wird, beispielsweise im Bereich von etwa 20 bis 45ºC, vorzugsweise 25 bis 30ºC, behandelt werden. Eine schwach saure Reaktion ist bevorzugt, d.h. ein pH-Wert von etwa 4 bis 7, insbesondere etwa 5 bis 6, wobei der Wert mit einem Puffer, wie einer etwa 0,03 bis 0,3 M Lösung eines Salzes von einer organischen Carbonsäure mit einem Alkalimetall oder mit einer organischen Base, beispielsweise Natriumacetat oder vorzugsweise Pyridinacetat (etwa pH 5,4) eingestellt wird. Das Verhältnis von angewendetem Enzym zu Substrat (Hirullin) hängt im allgemeinen von der Aktivität der betreffenden Zubereitung ab und beträgt gewöhnlich etwa 1:1 bis 1:100, vorzugsweise etwa 1:5 bis 1:20. Es ist vorteilhaft, Enzyme mit größtmöglicher Reinheit und Aktivität zu verwenden. Da die Arylsulfatase nicht nur die Entfernung, sondern auch die Einführung der Sulfatgruppe katalysiert und die Einstellung des Gleichgewichts von Ausgangsmaterialien und Endprodukten bewirkt, ist es vorteilhaft, in Vorversuchen für jede Enzymzubereitung die optimale Konzentration, das Substratverhältnis und die zur Desulfatation erforderliche Zeit zu ermitteln. In der Regel ist die Reaktion nach einigen Minuten vollständig. Die Qualität des Reaktionsproduktes ist jedoch auch bei längerem Kontakt (bis zu etwa 4 Stunden) mit dem aktiven Enzym (beispielsweise, wenn das Reaktionsgemisch stehengelassen wird) nicht verschlechtert.
Der Verlauf der enzymatischen Sulfatgruppenentfernung kann durch Bioanalyse der aus dem Reaktionsgemisch entnommenen Proben verfolgt werden. Beispielsweise ist die Enzymaktivität durch kurzzeitiges Erhitzen der Probe (für etwa 3 Minuten) auf etwa 100ºC zerstört und das Substrat wird mit Carboxypeptidase Y behandelt. In der Regel ist der Abbau der Peptidkette nach etwa 15 Minuten soweit fortgeschritten, daß die Sulfat-enthaltende und/oder freie Aminosäure in Stellung 61 (Tyr&sup6;¹) vollständig abgespalten ist und ist somit bereit zur Bestimmung in einem üblichen Aminosäureanalysator.
In einer erhaltenen Verbindung der Formel I oder II mit einem O-gebundenen Glycosylrest kann der Glycosylrest in üblicher Weise entfernt werden, beispielsweise durch Hydrolyse oder Säurespaltung, wie durch Behandlung mit Trifluormethansulfonsäure in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Anisol, vorzugsweise unter Kühlen, um die Reaktionstemperatur auf etwa 0 bis 5ºC zu halten. Andere aus der Literatur bekannte Verfahren können ebenfalls verwendet werden.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der neuen Peptide umfaßt die chemische Synthese der Polypeptide durch Peptidsynthese. Die Synthese kann üblicherweise ausgeführt werden [siehe beispielsweise Houben-Weyl, Bände 15/1 und 15/2; Synthese von Peptiden (Herausgeber E. Wünsch); Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974] unter Verwendung geeignet geschützter Aminosäuren. Zum Beispiel können kurze Peptidfragmente, die beispielsweise bis zu 12 Aminosäurereste umfassen, hergestellt werden und anschließend in vorbestimmter Reihenfolge unter Erhalt der erfindungsgemäßen Polypeptide kondensiert werden. Eine andere Möglichkeit besteht in der schrittweisen Verlängerung der Peptidkette an einem Polymerträger (Merrifield-Synthese). Für die Synthese von Polypeptiden, einschließlich eines O-glycosylierten Threoninrestes und/oder eines O-sulfatierten Tyrosinrestes, werden entsprechende Threonin- und/oder Tyrosineinheiten verwendet, die bereits solche O-Substituenten enthalten, und die Reaktionsbedingungen werden derart ausgewählt, daß die Glycosylthreonyl- und/oder Sulfatotyrosyleinheiten intakt bleiben.
Ein drittes besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden, insbesondere jenen, die keine glycolysierten Threonin- und/oder sulfatierten Tyrosinreste enthalten, macht Gebrauch von an sich bekannten rekombinanten DNS-Techniken. Das Verfahren umfaßt das Züchten von Wirtszellen, transformiert mit einem Hybridvektor, umfassend einen Promotor, operabel gebunden an eine für die vorstehend genannten Polypeptide kodierende DNS-Sequenz und Gewinnen der Polypeptide und, falls erwünscht, Umwandeln des erhaltenen mit freien Carbonsäure- und/oder Aminogruppen ausgestatteten Polypeptids in ein Salz oder Umwandeln eines erhaltenen Salzes in das freie Polypeptid. Insbesondere ist das Verfahren gekennzeichnet durch die Schritte, umfassend
a. Bereitstellen einer DNS, die für ein erfindungsgemäßes Hirullinpolypeptid kodiert,
b. Inserieren dieser DNS in einen Vektor,
c. Einführen des erhaltenen Hybridvektors in einen Wirtsorganismus durch Transformation,
d. Züchten des transformierten Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die Expression des Hirullinpolypeptids erlauben, und
e. Gewinnen des Hirullinpolypeptids oder eines Salzes davon.

DNSn' die für Hirulline kodieren

Die Erfindung betrifft eine DNS, die für ein Hirullinpolypeptid kodiert, insbesondere für Hirullin P6 oder Hirullin P18.
Die DNSn der Erfindung haben an ihren Enden vorzugsweise kurze flankierende Sequenzen, die beispielsweise 3 bis 10 Nukleotide umfassen, die geeignete Restriktionsstellen einschließen und die die Insertion der DNS in einen Vektor ermöglichen.
Die DNSn der Erfindung können gemäß an sich bekannter Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die DNSn chemisch hergestellt werden oder Fragmente davon können durch chemische Synthese hergestellt werden und enzymatisch in vorbestimmter Weise zusammengefügt werden.
Die chemische Synthese der DNSn wird durch an sich bekannte Verfahren ausgeführt. Geeignete Verfahren sind von S.A. Narang [Tetrahedron 39, 3 (1983)] beschrieben und in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 146785.

Die Herstellung von Hybridvektoren, die eine für ein Hirullinpolypeptid-kodierende DNS enthalten

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Hybridvektor, der eine für ein Hirullinpolypeptid kodierende DNS-Sequenz enthält, wobei die DNS-Sequenz in solcher Weise durch eine Expressionskontrollsequenz gesteuert wird, daß Hirullinpolypeptid in einer mit diesem Expressionsvektor transformierten Wirtszelle exprimiert wird.
Die erfindungsgemäßen Hybridvektoren werden beispielsweise durch Insertion einer DNS-Sequenz, die für das Hirullinpolypeptid kodiert, in eine Vektor-DNS, die eine Expressionskontrollsequenz enthält, die die Expressionskontrollsequenz der DNS-Sequenz steuert, hergestellt.
Die Wahl für einen geeigneten Vektor basiert auf der für die Transformation bereitgestellten Wirtszelle. Geeignete Wirte sind beispielsweise Mikroorganismen, wie Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, und Bakterienstämme, beispielsweise Stämme von Escherichia coli und ebenfalls Bacillus subtilis sowie Zellen höherer Organismen, beispielsweise etablierte menschliche oder tierische Zellinien. Bevorzugte Wirtszellen sind Stämme von S. cerevisiae.
Im Prinzip ist ein beliebiger Vektor geeignet, der in dem ausgewählten Wirt die erfindungsgemäßen für die Hirullinpolypeptide kodierenden DNS-Sequenzen repliziert und exprimiert.
Beispiele für Vektoren, die zur Expression der Hirullinpolypeptide in einem E. coli-Stamm geeignet sind, sind Bakteriophagen, beispielsweise Derivate eines Bakteriophagen, oder Plasmide, beispielsweise das Plasmid ColE1 und dessen Derivate, zum Beispiel pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322. Bevorzugte Vektoren leiten sich vom Plasmid pBR322 ab. Geeignete Vektoren enthalten ein komplettes Replicon und ein Markergen, das die Selektion und Identifizierung der mit dem mit den Expressionplasmiden transformierten Mikroorganismen über einen phänotypischen Marker ermöglicht. Geeignete Markergene verleihen dem Mikroorganismus beispielsweise Resistenz gegen Schwermetalle, Antibiotika und dergleichen. Des weiteren enthalten bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung neben dem Replicon- und den Markergenbereichen, Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, so daß die für das Hirullinpolypeptid kodierende DNS-Sequenz und, falls geeignet, die Expressionskontrollsequenz an jenen Stellen inseriert werden kann.
Verschiedene Expressionskontrollsequenzen können verwendet werden, um die Expression zu regulieren. Die verwendeten Expressionskontrollsequenzen sind insbesondere jene stark exprimierter Gene der Wirtszelle, die transformiert werden sollen. Im Falle der Verwendung von pBR322 als Hybridvektor und E. coli als Wirtsorganismus sind geeignete Expressionskontrollsequenzen (die unter anderem den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthalten) beispielsweise jene des Lactoseoperon, Tryptophanoperon, Arabinoseoperon und dergleichen, der Promotor des β-Lactamasegens und der Promotor des Phagen λPL und andere. Während der Promotor des β-Lactamasegens (β-Lac-Gen) bereits im Plasmid pBR322 enthalten ist, müssen die anderen Expressionskontrollsequenzen in das Plasmid inseriert werden. Gegebenenfalls ist die Expressionskontrollsequenz operabel zu einer DNS-Sequenz gebunden, die ein Signalpeptid operabel in E. coli kodiert, was wiederum in das geeignete Leseraster des Hirullingens gebunden ist.
Bevorzugte Hybridvektoren umfassen einen Hefepromotor, operabel gebunden an eine erste DNS-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, das in dem richtigen Leseraster einer zweiten DNS-Sequenz gebunden ist, die für das Hirullinpolypeptid kodiert, und eine DNS-Sequenz, die Hefetranskriptionsterminationssignale enthält.
Der Hefepromotor ist ein regulierter Promotor, wie der PHO5-, ADH2- oder GAL1-Promotor, oder ist ein konstitutiver Promotor. Der konstitutive Hefepromotor ist vorzugsweise abgeleitet von einem stark exprimierten Hefegen, wie einem Gen, das für ein glycolytisches Enzym kodiert, wie der Promotor des Enolase-, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP)- und 3-Phosphoglyceratkinase-(PGK)gens, weiterhin der des ADH1-Promotors und ein verkürzter Saure-Phosphatase-PHO5- Promotor ohne dessen Aktivierungsstellen stromaufwärts. Besonders bevorzugt sind der GAP-Promotor und funktionelle Fragmente davon, ausgehend bei Nukleotid zwischen -550 und -180, insbesondere beim Nukleotid -540, -263 oder -198, und endend beim Nukleotid -5 des GAP-Gens und verkürzte konstitutive PHO5-Promotoren, ausgehend bei Nukleotid zwischen -200 und -150, insbesondere bei -173 und endend bei Nukleotid -9 des PHO5-Gens.
Die DNS-Sequenz, die ein Signalpeptid ("Signalsequenz") kodiert, ist vorzugsweise abgeleitet von einem Hefegen, das für ein Polypeptid kodiert, das in üblicher Weise ausgeschüttet wird. Hefesignalsequenzen sind beispielsweise die Signal- und Präprosequenzen der Hefeinvertase-, α-Faktor-, Pheromonpeptidsase-(KEX1)-, "Killertoxin"- und reprimierbare Säurephosphatase(PHO5)gene und die Glucoamylasesignalsequenz von Aspergillus awamori. Alternativ dazu können fusionierte Signalsequenzen konstruiert werden durch Ligierung eines Teils der Signalsequenz (falls vorliegend) des natürlich an den verwendeten Promotor gebundenen Gens (beispielsweise PHO5) mit einem Teil der Signalsequenz eines anderen heterologen Proteins. Jene Kombinationen sind begünstigt, die eine genaue Spaltung zwischen der Signalsequenz und beispielsweise der Hirullinaminosäuresequenz erlauben. Zusätzliche Sequenzen, wie Pro- oder Spacersequenzen, die spezifische Verarbeitungssignale tragen können oder nicht, können ebenfalls bei den Konstruktionen eingeschlossen sein, um eine genaue Verarbeitung der Vorstufenmoleküle zu erleichtern. Alternativ dazu können fusionierte Proteine mit inneren Verarbeitungssignalen erzeugt werden, die eine genaue Reifung in vivo oder in vitro erlauben. Beispielsweise enthalten die Verarbeitungssignale einen Lys-Arg-Rest, der von einer in den Golgimembranen angeordnete Hefeendopeptidase erkannt wird. Die bevorzugten Signalsequenzen gemäß vorliegender Erfindung sind jene des Hefe-PHO5-Gens und des Hefeinvertasegens.
Eine DNS-Sequenz mit Hefetranskriptionsterminationssignalen ist vorzugsweise die 3'-flankierende Sequenz eines Hefegens, das geeignete Signale für die Termination der Transkription und Polyadenylierung enthält. Geeignete 3'-flankierende Sequenzen sind beispielsweise jene des natürlicherweise an den verwendeten Promotors gebundenen Hefegens. Die bevorzugte flankierende Sequenz ist jene des Hefe-PHO5-Gens.
Der Hefepromotor, die für das Signalpeptid kodierende optionale DNS-Sequenz, die für das Hirullinpolypeptid kodierende DNS-Sequenz und die Hefetranskriptionsterminationssignale-enthaltende DNS-Sequenz sind operabel miteinander verbunden, d.h. sie sind in solcher Weise nebeneinander angeordnet, daß sie ihre normalen Funktionen beibehalten. Die Anordnung ist derart ausgelegt, daß der Promotor geeignete Expression des Hirullingens bewirkt (gegebenenfalls ist eine Signalsequenz vorangestellt), die Transskriptionsterminationssignale einen richtigen Abbruch der Transkription und der Polyadenylierung bewirken, und die optionale Signalsequenz in dem geeigneten Leseraster des Hirullingens in solcher Weise gebunden ist, daß das letzte Codon der Signalsequenz direkt an das erste Codon des für das Hirullinpolypeptid kodierenden Gens gebunden ist und Hirullinpolypeptidausscheidung stattfindet. Wenn der Promotor und die Signalsequenz von unterschiedlichen Genen stammen, ist der Promotor vorzugsweise an die Signalsequenz zwischen dem Beginn der Haupt-mRNS und dem ATG des natürlicherweise an den Promotor gebundenen Gens gebunden. Die Signalsequenz sollte ihren eigenen ATG für den Translationsstart aufweisen. Die Verbindung dieser Sequenzen kann mit Hilfe synthetischer Oligodesoxynukleotidlinker bewirkt werden, die die Erkennungssequenz einer Endonuklease tragen.
Außer der Expressionskassette umfassen die erfindungsgemäßen Hefehybridvektoren einen Hefereplikationsstartpunkt. Folglich umfassen die Hybridvektoren ein DNS-Segment, das aus Zwei-Mikron-DNS stammt, die den Replikationsstartpunkt enthält oder wenn ein Zwei-Mikron-DNS-freier Stamm der Hefe verwendet wird, insgesamt Zwei-Mikron-DNS enthält. Letzterer Vektorentyp ist bevorzugt. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Hybridvektoren enthalten die vollständige Zwei- Mikron-DNS in linearisierter Form, d.h. die Zwei-Mikron-DNS wird einmal mit einer Restriktionsendonuklease aufgespalten und die linearisierte DNS wird mit den anderen Bestandteilen des Vektors vor der Rezirkularisierung verbunden. Die Restriktionsstelle wird derart ausgewählt, daß die normale Funktion der REP1-, REP2- und FLP-Gene und der ORI-, STB-, IR1- und IR2-Stellen der Zwei-Mikron-DNS beibehalten werden. Gegebenenfalls wird die Restriktionsstelle derart ausgewählt, daß das D-Gen der Zwei-Mikron-DNS intakt bleibt. Bevorzugte Restriktionsstellen sind die einzigartige PstI-Stelle, angeordnet innerhalb des D-Gens, und die einzigartige SnaBI- Stelle, angeordnet außerhalb aller der genannten Gene und Stellen.
Vorzugsweise schließen die Hefehybridvektoren der Erfindung einen oder mehrere, insbesondere einen oder zwei, selektive genetische Marker für Hefe ein und einen solchen Marker und einen Replikationsstartpunkt für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli.
Als selektive Genmarker für Hefe kann ein beliebiges Markergen verwendet werden, das die Selektion für Transformanten aufgrund phenotypischer Expression des Markergens erleichtert. Geeignete Marker für Hefe sind beispielsweise jene, die antibiotische Resistenz exprimieren oder im Falle von auxotrophen Hefemutanten, Gene die Wirtsläsionen vervollständigen. Entsprechende Gene übertragen beispielsweise Resistenz gegen Antibiotika G418, Hygromycin oder Bleomycin oder verursachen Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, beispielsweise dem URA3-, LEU2-, LYS2- oder TRP1-Gen.
Da die Verstärkung der Hefehybridvektoren zweckmäßigerweise in E. coli erfolgt, sind vorteilhafterweise ein E. coli genetischer Marker und ein E. coli-Replikationsstartpunkt eingeschlossen. Diese können von E. coli-Plasmiden erhalten werden, wie pBR322 oder einem pUC-Plasmid, beispielsweise pUC18 oder pUC19, die sowohl E. coli-Replikationsstartpunkt als auch E. coli-genetischen Marker enthalten, die Resistenz gegen Antibiotika, wie Ampicillin, übertragen.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Hefehybridvektoren umfaßt Binden der Expressionskassette, umfassend einen Hefepromotor, operabel gebunden an eine für das Hirullinpolypeptid kodierende gebundene DNS-Sequenz und die DNS-Fragmente mit selektiven genetischen Markern für Hefe und für einen bakteriellen Wirt und Replikationsstartpunkte für Hefe und für einen bakteriellen Wirt in vorbestimmter Reihenfolge.

Transformierte Wirtsorganismen

Die Erfindung betrifft gleichfalls Wirtsorganismen, die mit einem Hybridvektor transformiert sind, der eine für ein Hirullinpolypeptid kodierende DNS-Sequenz enthält, wobei die DNS durch eine Expressionskontrollsequenz gesteuert wird.
Das Verfahren zur Herstellung der Wirtsorganismen umfaßt Transformieren eines Wirtsorganismus mit einem Hybridvektor, enthaltend eine DNS-Sequenz, die für das Hirullinpolypeptid kodiert und die durch eine Expressionskontrollsequenz gesteuert wird.
Geeignete Wirtsorganismen sind beispielsweise die vorstehend genannten Mikroorganismen, insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae. Die Transformation mit Hybridvektoren der Erfindung wird beispielsweise gemäß der in der Literatur beschriebenen Verfahrensweise ausgeführt, beispielsweise für S. cerevisiae [A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)], B. subtilis [Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)] und E. coli [M. Mandel et al., J. Biolo. 53, 159 (1970)].
Die bevorzugten Wirtsorganismen der Erfindung sind Stämme von S. cerevisiae, denen bestimmte Peptidaseaktivitäten, wie Peptidasen A-, B-, Y-, S- und/oder α-Aktivitäten fehlen. Solche Stämme sind bekannt und können leicht durch Einführen des gewünschten Einzel- oder Mehrfachproteasenmangel in das Hefegenom durch ortsgerichtete Mutagenese oder Gen-Sprengung oder Allelumtausch hergestellt werden [vergl. H. Rudolf et al., Gene, 36 (1985) 87-95]. Wenn die genomische Sequenz bekannt ist, wie es beispielsweise in Protease yscB, Carbopeptidase yscY und Carboxypeptidase yscα der Fall ist, kann das genomische Proteasegen durch Insertion, Substitution oder Deletion mangelhaft gestaltet werden, wobei Substitution oder Deletion von bekannten ortsgerichteten Mutageneseverfahren Gebrauch machen [siehe zum Beispiel M. J. Zoller und M. Smith (1983) Methods Enzymol. 100, 468], die die Zubereitung eines geeignet gestalteten mutagenen Oligodesoxyribonukleotidprimers einschließt. Alternativ dazu kann das Genomproteasegen durch Fremd-DNS ersetzt werden oder die Fremd-DNS kann in eine geeignete Restriktionsstelle des Proteasegens inseriert werden.
Wie vorstehend erwähnt, fehlt den erfindungsgemäßen bevorzugten Hefestämmen die endogene Zwei-Mikron-DNS. Solche cirº-Stämme von Saccharomyces cerevisiae sind bekannt oder können durch bekannte Verfahren hergestellt werden [siehe zum Beispiel C. P. Hollenberg (1982) Curr. Top. Microbiol. Immun. 96, 119]. Das nachstehende alternative Verfahren zur Herstellung von cirº-Stämmen basiert auf der Annahme, daß Heilen des Zwei-Mikron-Plasmids mit einem zweiten Plasmid eine Erhöhung der Dosierung der STP-Stelle einschließt, um REP1- und REP2- Proteine auszutitrieren. Diese relative Verminderung von REP1- und REP2-Proteinen würde zu einer Instabilität des endogenen Zwei-Mikron-Plasmids führen.
Vorzugsweise weist das zweite verwendete Plasmid einen Defekt auf oder ihm fehlt das REP1-Gen. Ein Beispiel für ein Plasmid ist pDP38, dem neben REP1-Gen eine der invertierten Wiederholungsstrukturen (IR2) fehlt. Dies macht dessen hohe Kopiezahl-Expression abhängig von der Komplementation des REP1-Proteins durch das endogene Zwei-Mikron-Plasmid. Es enthält zwei hefeselektive Marker: URA3, verwendet sowohl in Hoch- als auch Niederkopiezahlensituationen und dLEU2, anwendbar lediglich in Systemen hoher Kopiezahl [E. Erhart et al. (1968) J. Bacteriol. 625].
Ein Hefestamm, der Ura&supmin; und Leu&supmin; ist, wird mit pDP38 transformiert und hinsichtlich Ura&spplus;-Kolonien selektiert. Die Selektion von Uracil-freien Platten (Uraselektion) gibt eine viel bessere Transformationshäufigkeit als die Selektion auf Leucin-freien Platten (Leu-Selektion), da das URA3-Gen viel besser exprimiert wird als das defekte dLEU2-Gen. Eine Einzelkolonie wird ausgewählt und auf eine Leu-selektionsplatte gestrichen, die Kolonien verschiedener Größe und Form ergibt. Einige der kleinsten Kolonien werden auf Ura-Selektionsplatten verstrichen und auf Leu-Selektionsplatten replica-plattiert. Jene Kolonien werden ausgewählt, die unter Ura-Selektion wachsen können, jedoch nur sehr gering unter Leu-Selektion. Wachstum auf Ura-Selektionsplatten zeigt, daß das Plasmid pDP38 noch vorliegt und daß das bloße langsame Wachstum unter Leu-Selektion nicht auf den Verlust dieses Plasmids zurückzuführen ist und Abwesenheit von Wachstum unter Leu-Selektion impliziert, dar pDP38 nicht in der Lage ist, diesen Marker zu ergänzen. Letztere Tatsache kann in zweierlei Weise erklärt werden: A. Das LEU2-Gen auf pDP38 ist mutiert oder B: Das Plasmid kann nicht Leu2 ergänzen, da es nicht seine Kopiezahl erhöhen kann, was bedeutet, daß das Zwei-Mikron-Plasmid nicht in der Lage ist (d.h. verloren hat), das REP1-Genprodukt zu komplementieren. Diese zwei Möglichkeiten können leicht voneinander unterschieden werden. Im ersten Fall zeigt das ersichtliche minimale Wachstum mit den Kolonien (wie gegen das absolute Nullwachstum der Zellen ohne pDP38), daß etwas LEU2-Expression vorliegt. Der zweite Punkt kann direkt geprüft werden, da in Abwesenheit des Zwei-Mikron-Plasmid pDP38 lediglich als ARS-Typ-Plasmid wirkt, d.h. es wird sehr instabil, so daß die meisten Kolonien es nach einigen Generationen verlieren. Folglich werden, wenn eine singuläre Kolonie auf eine YPD-Platte gestrichen wird und singuläre Kolonien genommen und auf Uracil-freie Platten replica-plattiert werden, dann nur einige unter Ura-Selektion wachsen. Nicht wachsende Kolonien werden durch Hybridisierung für pUC und Zwci-Mikron-Sequenzen untersucht. Kolonien, die keine Hybridisierungssignale zeigen, sind frei von Plasmid pDP38 und endogenen Zwei-Mikron-Plasmiden (cirº-Stämmen).

Züchtung der transformierten Wirtsorganismen

Die transformierten Wirtsorganismen werden gemäß bekannten Verfahren gezüchtet.
Somit werden die transformierten Wirtsstämme, wie S. cerevisiae- oder E. coli-Stämme erfindungsgemäß in einem flüssigen Medium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, gezüchtet.
Verschiedene Kohlenstoffquellen sind üblich. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit, Fructose oder Lactose oder ein Acetat, wie Natriumacetat, die einzeln oder in geeigneten Gemischen verwendet werden können. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und deren Abbauprodukte, wie Tryptone, Peptone oder Fleischextrakte, weiterhin Hefeextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser sowie Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die einzeln oder in geeigneten Gemischen verwendet werden können. Anorganische Salze, die verwendet werden können, sind beispielsweise Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium. Darüberhinaus kann das Nährmedium auch wuchsfördernde Substanzen enthalten. Substanzen, die das Wachstum fördern, sind beispielsweise Spurenelemente, wie Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, oder einzelne Aminosäuren.
Des weiteren enthält das Medium beispielsweise wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, und vorzugsweise Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen verhindern, die das Expressionsplasmid verloren haben. Beispielsweise wird Ampicillin zu dem Medium zugegeben, wenn ein E. coli-Expressionsplasmid ein amp -Gen enthält. Solch eine Zugabe von antibiotisch wirksamen Stoffen hat die Wirkung, daß kontaminierende Mikroorganismen, die auf Antibiotika empfindlich reagieren, abgetötet werden.
Hefehybridvektoren, die vollständige Zwei-Mikron-DNS umfassen (einschließliche eines funktionellen Replikationsstartpunktes) werden innerhalb der Stämme von Saccharomyces cerevisiae stabil gehalten, die frei von endogenen Zwei-Mikron-Kreisen (sogenannte cirº-Stämme) sind, so daß die Züchtung unter nichtselektiven Wuchsbedingungen ausgeführt werden kann, d.h. in einem komplexen Medium.
Wirtszellen, die Hybridplasmide mit einem konstitutiven Promotor enthalten (z.B. Hefe ADH1, GAP), exprimieren die Hirullin-kodierende DNS, gesteuert durch den Promotor, ohne Induktion. Wenn jedoch die DNS sich unter der Kontrolle eines gesteuerten Promotors befindet (beispielsweise Hefe-GAL1 oder- PHO5), muß die Zusammensetzung des Nährmediums angepaßt werden, um einen maximalen Grad an mRNS-Transkripten zu erhalten, d.h. wenn der Hefe-PHO5-Promotor verwendet wird, muß das Nährmedium eine geringe Konzentration anorganischen Phosphats zur Derepression dieses Promotors enthalten.
Die Züchtung wird durch Anwendung üblicher Techniken ausgeführt. Die Züchtungsbedingungen Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit werden in solcher Weise ausgewählt, daß maximale Hirullinspiegel erzeugt werden. Ein ausgewählter E. coli- oder S. cerevisiae-Wirtsstamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in submerser Kultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 25 bis 40ºC, vorzugsweise bei etwa 30ºC bei einem pH-Wert von 4 bis 7, beispielsweise etwa pH 5, und für mindestens 1 bis 3 Tage gezüchtet, vorzugsweise bis befriedigende Proteinmengen erhalten werden.
Die durch die Wirtszellen exprimierten Hirullinpolypeptide können innerhalb der Zellen akkumuliert werden oder in das Kulturmedium ausgeschieden werden in Abhängigkeit von der Genkonstruktion (d.h. ob eine Signalsequenz eingeschlossen ist) und in Abhängigkeit vom verwendeten Wirt.
Wenn das Hirullinpolypeptid in das Zellmedium ausgeschieden wird, kann es daraus in üblicher Weise gewonnen werden. Beispielsweise besteht der erste Schritt gewöhnlich im Abtrennen der Zellen aus der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren. Der erhaltene Überstand kann mit Hirullinpolypeptiden angereichert werden durch Behandeln mit Polyethylenimin, so daß das meiste des nichtproteinischen Materials zurückbleibt und Fällen der Proteine durch Sättigen der Lösung mit Ammoniumsulfat. Eine weitere Anreicherung des Hirullinpolypeptids kann erreicht werden durch Extrahieren des essigsauren Überstands mit n-Butanol. Andere Reinigungschritte schließen beispielsweise Entsalzen, chromatografische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatografie, Gelfiltrationschromatografie, Verteilungschromatografie, HPLC, Umkehrphasen-HPLC und dergleichen ein. Die Trennung der Bestandteile des Proteingemisches wird auch durch Dialyse gemäß der Ladung bewirkt mit Hilfe von Gelelektrophorese oder durch trägerfreie Elektrophorese gemäß der Molekulargröße mit Hilfe einer geeigneten Sephadexsäule, durch Affinitätschromatografie, beispielsweise mit Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, oder mit Thrombin, gekuppelt an einen geeigneten Träger zur Affinitätschromatografie, oder durch andere Verfahren, insbesondere jene, die in der Literatur bekannt sind. Prinzipiell können die gleichen Verfahren zur Isolierung des Hirullins aus H. manillensis-Extrakten verwendet werden.
Wenn das Hirullinpolypeptid nicht ausgeschieden wird, oder wenn es gewünscht ist, daß zusätzliches Hirullinpolypeptid, das mit den Zellen verbunden ist, zu gewinnen, d.h. daß intrazellulär oder im periplasmatischem Raum formuliert ist, werden einige zusätzliche Reinigungsschritte erforderlich. So besteht im Falle, daß das Hirullinpolypeptid innerhalb der Zellen akkumuliert wurde, der erste Schritt zur Gewinnung daraus in der Freisetzung des Zellinneren. In den meisten Verfahren wird die Zellwand zunächst durch enzymatische Verdauung mit Glycosidasen entfernt. Anschließend werden die erhaltenen Sphäroplasten mit Detergentien wie Triton behandelt. Alternativ dazu sind mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (zum Beispiel X-Press, French-Press) oder Schütteln mit Glaskugeln zum Aufbrechen der Zellen geeignet. In dem Fall, bei dem Hirullinpolypeptid durch die Wirtszellen in den periplasmatischen Raum ausgeschieden wird, kann eine vereinfachte Verfahrensweise verwendet werden: das heterologe Protein wird ohne Zellyse durch enzymatische Entfernung der Zellwand oder durch Behandeln mit chemischen Mitteln gewonnen, z.B: Thiolreagentien oder EDTA, die Zellwandschäden verursachen, damit das Produkt freigesetzt wird.
In Abhängigkeit von dem angewendeten Verfahren werden die Verbindungen der Formeln I und II in der freien Form oder in Form der Säureadditionssalze, inneren Salze oder Salzen mit Basen erhalten. Die freie Verbindung kann in bekannter Weise aus den Säureadditionssalzen erhalten werden. Therapeutisch verträgliche Säureadditionssalze können wiederum aus den freien Verbindungen durch Umsetzung mit Säuren, beispielsweise mit jenen Säuren, die vorstehend genannte Salze bilden, durch Verdampfen oder Lyophilisieren gewonnen werden. Die inneren Salze können durch Einstellen des pH-Werts zu einem geeigneten neutralen Punkt erhalten werden.

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die erfindungsgemäßen neuen Hirulline haben wertvolle pharmakologische Eigenschaften und können prophylaktisch oder insbesondere therapeutisch verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Hirullinverbindungen sind spezifische Inhibitoren für Thrombin, während sie keine Wechselwirkung zu anderen Proteinasen des Blutgerinnungssystems zeigen. Die wirksame Toxizität ist extrem gering. In ähnlicher Weise wurden keine hypersensiblen Reaktionen oder allergischen Reaktionen beobachtet.
Die neuen erfindungsgemäßen Hirullinverbindungen können daher zur Therapie und Prophylaxe von Thrombosen und Thromboembolien, einschließlich der Prophylaxe postoperativer Thrombosen, für akute Schocktherapie (beispielsweise für septischen oder polytraumatischen Schock), zur Therapie von Verbrauchskoagulopathien, bei Hämodialysen, Bluttrennungen und bei extrakorporalem Blutkreislauf verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger- und/oder Hilfsmittel, umfassen.
Die Mittel können insbesondere bei vorstehend genannten Indikationen zur Anwendung kommen, wenn sie beispielsweise parenteral, wie intravenös, intracutan, subcutan oder intramuskulär oder örtlich verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung neuer erfindungsgemäßer Verbindungen und betrifft Arzneimittel, die diese enthalten zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere für die vorstehend genannten klinischen Syndrome, besonders zur Hemmung der Blutgerinnung innerhalb und außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
Die Dosierung hängt insbesondere von der spezifischen Form der Verabreichung und dem Zweck der Therapie oder der Prophylaxe ab. Die Höhe der einzelnen Dosen und der Verabreichungsplan können am besten mit Hilfe einer individuellen Einschätzung des besonderen Krankheitszustandes bestimmt werden; die Verfahren zur Bestimmung der relevanten Blutfaktoren, die zu diesem Zweck erforderlich sind, sind dem Fachmann bekannt. Normalerweise liegt im Falle einer Injektion die therapeutisch wirksame Menge an erfindungsgemäßen Verbindungen im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht. Ein Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,05 mg/kg Körpergewicht ist bevorzugt. Die Verabreichung kann durch intravenöse, intramuskuläre oder subcutane Injektion bewirkt werden. Folglich enthalten Arzneimittel zur parenteralen Verabreichung in Einzeldosisform pro Dosis in Abhängigkeit von der Verabreichungsform etwa 0,4 bis etwa 7,5 mg erfindungsgemäße Verbindung. Zusätzlich zu dem Wirkstoff dieses Arzneimittels kann gewöhnlich ein Puffer enthalten sein, beispielsweise ein Phosphatpuffer, der den pH-Wert zwischen etwa 3,5 und 7 hält und ebenfalls Natriumchlorid, Mannit oder Sorbit zur Einstellung der Isotonie. Sie können in gefriergetrockneter oder gelöster Form vorliegen und es ist möglich für Lösungen, daß sie vorteilhafterweise ein antibakteriell wirksames Konservierungsmittel enthalten, beispielsweise 0,2 bis 0,3 % 4-Hydroxybenzoesäuremethylester oder -ethylester.
Ein Mittel zur örtlichen Anwendung kann in Form einer wässerigen Lösung, einer Lotion oder eines Gels oder einer öligen Lösung oder Suspension in einer Fett-enthaltenden oder insbesondere emulgierten Salbe vorliegen. Ein Mittel in Form einer wässerigen Lösung wird beispielsweise durch Lösen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder eines therapeutisch verträglichen Salzes davon in einer wässerigen Pufferlösung von pH 4 bis pH 6 und, falls erwünscht, Zugabe eines weiteren Wirkstoffes, beispielsweise eines Mittels gegen Entzündungen und/oder eines polymeren Bindemittels, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon und/oder eines Konservierungsstoffes erhalten. Die Konzentration an Wirkstoff beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0 mg, in 10 ml einer Lösung oder 10 g eines Gels.
Eine ölige Form der Verabreichung zur örtlichen Anwendung wird beispielsweise durch Suspendieren des erfindungsgemäßen Wirkstoffes oder eines therapeutisch verträglichen Salzes davon in einem Öl, gegebenenfalls unter Zugabe eines Quellungsmittels, wie Aluminiumstearat und/oder Tensiden mit einem HLB-Wert ("hydrophiler-lipophiler Ausgleich") unterhalb 10, wie Fettsäuremonoester oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerinmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat oder Sorbitanmonooleat erhalten. Eine Fett-enthaltende Salbe wird beispielsweise durch Suspendieren des erfindungsgemäßen Wirkstoffes oder eines Salzes davon in einer streichfähigen Fettgrundlage, gegebenenfalls unter Zusatz eines Tensids mit einem HLB-Wert unterhalb 10 erhalten. Eine emulgierte Salbe wird durch Verreiben einer wässerigen Lösung des erfindungsgemäßen Wirkstoffs oder eines Salzes davon in einer weichen verstreichfähigen Fettgrundlage unter Zusatz eines Tensids mit einem HLB-Wert unterhalb 10 erhalten. Alle diese Formen örtlicher Anwendung können auch Konservierungsstoffe enthalten. Die Konzentration an Wirkstoff beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0 mg, in etwa 10 g Grundlage.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Mitteln und Arzneimittelanaloga dazu, die zur direkten medizinischen Verwendung im menschlichen oder Säugetierkörper vorgesehen sind, betrifft die vorliegende Erfindung auch Arzneimittel, umfassend Zubereitungen für medizinische Verwendung außerhalb des lebenden Körpers von Menschen oder Säugetieren. Solche Mittel und Zubereitungen werden insbesondere als gerinnungshemmende Zusätze für Blut verwendet werden, das Kreislauf oder Behandlung außerhalb des Körpers unterzogen wird (beispielsweise für extrakorporalen Kreislauf oder Dialyse in künstlichen Nieren), Konservierung oder Modifizierung (beispielsweise Bluttrennung). Solche Zubereitungen, wie Stammlösungen oder alternative Zubereitungen in Einzeldosisform sind ähnlich in der Zusammensetzung zu den Injektionszubereitungen, die vorstehend beschrieben werden; die Menge oder Konzentration an Wirkstoff beruht jedoch vorteilhafterweise auf dem zu behandelnden Blutvolumen oder genauer auf dessen Thrombingehalt. In diesem Zusammenhang darf nicht vergessen werden, daß der erfindungsgemäße Wirkstoff (in freier Form) das etwa 5-fache der Gewichtsmenge an Thrombin vollständig desaktiviert, daß er auch in relativ hohen Mengen physiologisch unschädlich ist und aus dem Blutkreislauf rasch auch in hohen Konzentrationen entfernt werden kann, so daß keine Gefahr für eine Überdosis, beispielsweise sogar während Transfusionen, besteht. In Abhängigkeit von dem speziellen Zweck beträgt die geeignete Dosis etwa 0,01 bis etwa 1,0 mg Wirkstoff/pro Liter Blut, obwohl die obere Grenze ohne Gefahr überschritten werden kann.
Die Erfindung betrifft insbesondere Hirulline, DNSn, Hybridvektoren, transformierte Wirtsorganismen und Verfahren zu deren Herstellung, wie sie in den Beispielen beschrieben werden.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Im nachstehenden experimentellen Teil werden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Hinweis auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben:
Figuren 1 und 2 sind Schemata, die die in vitro-Synthese von Hirullin P6- und -P18-Genen, einschließlich der PHO5-Signalsequenz mit den bevorzugten Hefecodonen darstellen. Die verwendeten 12 Oligodesoxynukleotide werden durch bezifferte Vollinien bzw. Punktlinien dargestellt.
Figur 3 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pDP33.
Figur 4 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pDP34 und pDP38.
Figur 5 zeigt schematisch die Konstruktion des Expressionsplasmids pDP34/GAPFL-HTI-P6.
Figur 6. zeigt schematisch das Plasmid pDP96.

Experimenteller Teil

Beispiel 1: Herstellung des Rohextrakts

30 kg gefrorene Egel Hirudinaria manillensis (Ursprungs- und Sammelort China) werden mit einem Blatthomogenisator zerkleinert. Die Extraktion wird, wie von Bagdy et al. beschrieben, ausgeführt [Thromb. Res. 2, 229 (1973)]. 90 Liter kaltes 80 %-iges Vol./Vol. Aceton werden zu der Egelaufschlämmung zugegeben und das Gemisch wird bei 0ºC für 15 Minuten gerührt. Unlösliche Proteine fallen nach Zugabe von NaCl zu einer Endkonzentration von 0,4 M und Trichloressigsäure (TCA) zu einer Endkonzentration von 0,4 M unter konstantem Rühren für 60 Minuten aus. Die unlöslichen Proteine werden durch Dekantieren und Verwerfen abgetrennt. Der Extraktionsschritt wird mit dem Überstand wiederholt. Diesmal werden 30 Liter kaltes 80 %-iges Vol./Vol. Aceton, enthaltend NaCl und TCA, verwendet. Rohes Hirullin wird durch Zugabe von zwei Volumen kalten Acetons zu dem Extrakt bei -10ºC ausgefällt. Nach Zentrifugieren wird der Niederschlag mit kaltem Aceton gewaschen und gefriergetrocknet.

Beispiel 2: Reinigung des Rohextrakts

1 g Extrakt wird in 20 ml 0,1 M Essigsäure gelöst, zentrifugiert und der klare Überstand wird auf eine Säule mit Sephadex G50 superfine (Pharmacia 100 cm x 26 mm; 400 ml Bettvolumen), konditioniert mit 0,1 M Essigsäure und verbunden an das Pharmacia FPLC-System, gegeben. Die Elution wird mit 0,1 M Essigsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min ausgeführt und bei 280 nm verfolgt. 6 ml-Fraktionen werden gesammelt und hinsichtlich der Aktivität geprüft mit einer Thrombininhibierungsbestimmung, wie von S. Mao et al. [Anal. Bioch. 161, 514 (1987)] beschrieben. Dieser Schritt ergibt eine vierfache Reinigung. Die aktiven Fraktionen werden gefriergetrocknet, wie der in 2 ml 0,02 M Histidin/HCl- Lösung pH 5,6 (=Elutionsmittel A) gelöst, zentrifugiert und der kalte Überstand auf eine Säule mit Sepharose-Schnellfluß- Anionenaustauscher Q gegeben (Pharmacia, 40 cm x 16 mm; Bettvolumen 66 ml), verbunden an das Pharmacia FPLC-System und konditioniert mit Elutionsmittel A. Die Elution wird mit einem Stufengradienten bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min ausgeführt: 48 min 0 % B (Elutionsmittel B: 0,02 M Histidin/HCl pH 5,6 + 1 M NaCl), 102 min 15 % B, 65 min 100 B. Der Versuch wird bei 280 nm verfolgt und die aktiven Fraktionen werden gesammelt und an einer Säule mit Sephadex G50 fine mit 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3; entsalzt und anschließend gefriergetrocknet. Dieser Schritt ergibt eine sechsfache Reinigung.
Das getrocknete Material wird nun Trennung in Isoformen gemäß nachstehenden Beispielen unterzogen.

Beispiel 3: Letztliche Reinigung und Trennung der Isoformen

Das getrocknete Material wird in bidestilliertem Wasser bei einer Konzentration von 9 mg/200 ul gelöst. 200 ul- Portionen werden auf eine C18 RP HPLC-Säule, 8 x 250 mm, 7 um Teilchengröße, AUFS 2 bei 214 nm, Fließgeschwindigkeit 5 ml/min gegeben. Elutionsmittel A: 0,1 % Trifluoressigsäure, Elutionsmittel B: Acetonitril + 0,08 % Trifluoressigsäure. Monitor 214 nm. Gradiententabelle: Zeit (min) Beginn 10
Einzelpeakfraktionen werden manuell gesammelt und sofort mit einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Eine aliquote Menge (10 ul) wird 1:1000 verdünnt und hinsichtlich Antithrombinaktivität geprüft. Die aktiven Fraktionen werden wiederum unter den gleichen Bedingungen chromatografiert.
Die zwei reichlichsten Peakfraktionen werden ausgewählt (bezeichnet mit Hirullin P6 und Hirullin P18) und dem nächsten Reinigungsschritt an einer Umkehrphasen-HPLC-Säule Vydac 219 TP Phenylkieselgel RP HPLC-Säule (4,6 x 150 ml; 5 um Poren) unterzogen. Fließgeschwindigkeit 1 ml/min, Elutionsmittel und Gradienten wie vorher. Bis zu 70 ug Protein werden auf die Säule aufgegeben. Die Fraktionen werden gesammelt und sofort mit einer Vakuumzentrifuge getrocknet.
Der letzte Reinigungsschritt wird an einem Pharmacia FPLC-System mit einer Anionenaustauschersäule (Mono Q, 5 x 50 mm) ausgeführt.
Elutionsmittel A: 0,05 M HCOONH&sub4; pH 5,1
Elutionsmittel B: 0,05 M HCOOH, Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/min.
Die zu reinigende Peakfraktion wird in 1 ml Elutionsmittel A gelöst und auf die Säule aufgebracht.
Monitor: 280 nm. Elutionsgradient: Zeit (min) Beginn
Die Fraktionen werden gesammelt und mit einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Der erhaltene Feststoff liegt als reines Hirullin vor (Reinheit etwa oder mehr als 99 %). Tabelle 1: Ausbeute und Schlußreinigung Schritt Gesamtprotein zu reinigende Menge Phenyl Mono Q Hirullin reines Hirullin P6

Beispiel 4: Charakterisierung der Hirulline

a) Retentionszeiten mit der Mono Q-Säule
Bedingungen siehe Beispiel 2
Hirullin P6 28,6 min
Hirullin P18 30,1 min
b) Retentionszeiten mit der Phenyl RP HPLC-Säule
Bedingungen siehe Beispiel 2
Hirullin P6 16,4 min
Hirullin P18 24,75 min

c) Aminosäureanalyse der gesamten Moleküle

Etwa 1,5 ug jeder Isoform werden für 24 Stunden mit 6 M HCl bei 110ºC hydrolysiert und anschließend, wie von R. Knecht beschrieben [Anal. Chem. 58, 2375 (1986)], analysiert. Die Hydrolysate haben die nachstehende Zusammensetzung: Aminosäure Insgesamt
Die Werte in den Klammern und die Gesamtzahl an Aminosäuren werden von den Sequenzdaten abgeleitet (siehe Beispiel 4g).
* Die O-glycosylierten Thr-Reste erscheinen nicht in den Sequenzdaten.

d) Aminosäureanalyse der Fragmente

Hirullin P6:

Fragmentierung: 200 ug Hirullin P6 werden mit 50 ul frisch hergestellter Perameisensäure innerhalb 2 Stunden bei -4ºC oxidiert. Nach Zugabe von 100 ul Wasser wird die Probe gefriergetrocknet, anschließend in 50 ul 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer gelöst. 5 ug Endoproteinase Lys-C in 150 ul 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; werden zugegeben. Nach 5 Stunden wird die Hydrolyse mit 5 ul Essigsäure gestoppt. Die Fragmente werden durch HPLC getrennt und wie von R. Knecht (siehe vorstehend) beschrieben, analysiert. Fragment
Die Werte in den Klammern sind von den Sequenzdaten abgeleitet (siehe Beispiel 4g).
* Der O-glycosylierte Thr&sup4;³-Rest erscheint nicht in den Sequenzdaten.

Hirullin P18:

Fragmentierung: 20 ug Hirullin P18 werden, wie bei Hirullin P6 beschrieben, oxidiert. Das oxidierte Polypeptid wird in 50 ul 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer gelöst und 2 ul Thermolysinlösung, enthaltend 1 ug Enzym, wird zugegeben. Die Probe wird über Nacht bei 37ºC aufgeschlossen. Die Fragmente werden durch HPLC abgetrennt und wie von R. Knecht (siehe vorstehend) analysiert. P18-Fragment
Die Werte in den Klammern sind von den Sequenzdaten abgeleitet (siehe Beispiel 4g).
* Die O-glycosylierten Thr&sup4;³-Reste erscheinen nicht in den Sequenzdaten.

e) Molekulargewichtsbestimmung durch ²&sup5;²Cf-Plasmadesorptionszeit bei der Flugmassenspektrometrie

Hirullin P6:

Molekulargewicht 7415,9 Daltons P6-Fragment 37-63:
Die Zuckerkette ist abgeleitet von dem Fragment 37- 63. Die nachstehenden Molekulargewichte werden erhalten: Masse Fragment Sulfat Fucose
Die massenspektrometrischen Daten zeigen, daß Thr&sup4;³ ein O-Glycosylrest der Formel -SNAc-S-Fuc oder teilweise -SNAc-S enthält, wobei SNAc N-Acetylgalactosamin oder N-Acetylglucosamin, S Galactose, Mannose oder Glucose und Fuc Fucose bedeutet.

Hirullin P18:

Molekulargewicht 7198,6 Daltons
P18-Fragment 36-53:
Teilweise Entfernung der Zucker (siehe Beispiel 6) und massenspektrometrische Bestimmung zeigen, daß Thr&sup4;&sup6; einen O-Glycosylrest der Formel -SNAc-S-Fuc enthält, wobei die Abkürzungen die vorstehenden Bedeutungen aufweisen.
Die exakte Natur der Reste SNAc und S wurde noch nicht bestimmt.

f) Thrombin-Hirullin-Inhibierungskonstanten

Die Bestimmung mit menschlichem α-Thrombin gemäß dem Verfahren von S. R. Stone und J. Hofsteenge [Biochemistry 25, 4622 (1986)] gibt nachstehende Inhibierungskonstanten Ki:
P6: Ki = 58 ± 2 fM
P18: = 7,8 ± 1 pM

g) Sequenzanalyse der Hirulline P6 und P18

Die Aminosäuresequenz wird durch automatischen Festphasen-Edman-Abbau des intakten reduzierten und alkylierten Moleküls und eines C-endständigen Fragments davon bestimmt.
Reduktion und Alkylierung von Hirullinen P6 und P18:
50 ug Protein werden in 250 pl Puffer pH 8,6 (6 M Guanidin/HCl, 0,5 M Tris, 0,2 % EDTA) und 5 mg Dithiothreitol gelöst.
Das Reaktionsgemisch wird mit Stickstoff gespült und für 6 Stunden bei 75ºC belassen. Anschließend werden 3 ul Vinylpyridin zugegeben und für 2 Stunden in der Dunkelheit geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wird durch Gelfiltration entsalzt und auf einer Vakuumzentrifuge getrocknet.
0,5 nMol werden Sequenzanalyse in einem Gasphasensequenzer (Modell 477A und PTH-Analysator Modell 120A von Applied Biosystems) gemäß der Vorschrift des Herstellers unterzogen. 35 bis 45 Reste können homogen sequenziert werden.
Fragmentierung von Hexakis-(pyridylethyl)-P6 mit Endoproteinase Lys-C: Aufschluß(Verdau) über Nacht bei einem Substrat-Enzymverhältnis 20:1 (Gew./Gew.) in 0,1 M 4-Ethylmorpholinacetatpuffer pH 8,1 bei Raumtemperatur. 100 pMol des C-endständigen Fragments geben eine homogene Sequenz bis zu Rest 62.
Fragmentierung von Hexakis-(pyridylethyl)-P18 mit Bromcyan [vergl. Practical Protein Chemistry (A. Darbe, ed.), J. Wiley and Sons 1986] und mit Endoproteinasen Lys-C zu C- endständigen überlappenden Fragmenten.
Sequenzen P6 und P18:
worin T* O-glycosyliertes Threonin ist, wie durch Aminosäureanalyse und massenspektrometrische Daten bewiesen (siehe Beispiel 4e).

Beispiel 5: Entfernung der Sulfatmonoestergruppe aus Hirullin P6

Die biologische Aktivität wird aus der Inhibierung von Thrombin bestimmt, dessen enzymatische Aktivität wiederum mit Hilfe des chromogenen Substrats Chromozym TH (ein Produkt von Boehringer, Mannheim, Deutschland, für Thrombin- und Hirudinbestimmung) gemäß bekannter Anweisungen bestimmt wurden, die mit der Testzubereitung geliefert werden.
Arylsulfatase (ARS) von Helix pomatia (ein Produkt von Boehringer, Mannheim, Deutschland), 5 IU/mg.
Die enzymatische Aktivität wird durch das bekannte Verfahren von Leon et al. [Biochem. J. 75, 612-617] unter Verwendung des chromogenen Substrats p-Nitrophenolsulfat (1,8 mM/l in der Charge) bestimmt.

Desulfatierung

(1) Vorangehendes Experiment (zur Bestimmung der optimalen ARS-Konzentration)

(a) nachstehende Stammlösungen werden hergestellt:
(A) Hirullin P6-Lösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml, erhalten durch Lösen von Hirullin P6 in Lösung (C).
(B) Arylsulfataselösung mit einer Konzentration von 1,25 mg/ml: durch Vermischen von 25 Teilen einer handelsüblichen Suspension mit 100 Teilen einer Lösung (C).
(C) Pufferlösung: 0,1 M wässerige Lösung von Pyridinacetat, pH 5,4.

(b) Verfahren

Eine Reihe von Proben wird erhalten durch Vermischen der nachstehenden Bestandteile: jede Probe enthält 15 ul einer Lösung A < entspricht 30 ul Hirullin) und 10 ul Lösung B (entspricht 12,5 ul Arylsulfatase) oder einer Lösung, bei der die Konzentration des Enzyms auf 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 und 1/32 der ursprünglichen Konzentration durch Verdünnen von Lösung B mit dem Puffer C eingestellt wird. Jede Probe von 25 ul wird für 60 min bei 25ºC inkubiert, anschließend für 3 min bei 100ºC erhitzt, um Sulfatase zu denaturieren, rasch abgekühlt und hinsichtlich des Gehalts an freiem und sulfatiertem Tyrosin (gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren) analysiert.

(2) Zubereitungsverfahren

15 Volumenteile Lösung A werden mit 10 Volumenteilen einer verdünnten Lösung B vermischt, deren optimal geringste mögliche Konzentration jeder Lösung in dem vorangehenden Versuch bestimmt wurde, und durch Verdünnen der Stammlösung B mit Pufferlösung C eingestellt wurde. Das Gemisch wird bei 25ºC für etwa 30-60 min inkubiert, kurz erhitzt (z.B. unter den Bedingungen der Blitzsterilisierung) auf 100ºC und rasch abgekühlt, um das desulfatisierende Enzym zu denaturieren. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Säule mit Sephadex G50 oder G75, CM Sephade , Wofatit CP, Amberlite IRC oder einem ähnlichen Kationenaustauscher, falls erwünscht, nach Konzentrieren des Reaktionsgemisches im Vakuum oder unterhalb Raumtemperatur abgetrennt. Falls erforderlich, wird diese Abtrennung wiederholt bis Desulfatohirullin P6 gewünschter Reinheit (bestimmt beispielsweise durch den Inhibitortest mit Thrombin und/oder Aminosäureanalyse) erhalten wird. Das Produkt in Festform wird durch Gefriertrocknen der entsprechenden Lösungen (Eluate) erhalten. Gemäß der Aminosäureanalyse (durch C-endständige Proteolyse) ist das reine Produkt frei von Tyrosin-O-Sulfat und weist die vollständige Aktivität von Hirullin P6 in dem Inhibitoraktivitätstest an Thrombin auf (beispielsweise mit Chromozym TH, siehe vorstehend).

Beispiel 6: Entfernen der O-gebundenen Zuckerreste aus Hirullinen P6 und P18

200 ug Polypeptid werden in 30 ul frisch hergestelltem Gemisch aus Anisol/Trifluormethansulfonsäure (1 ml:2 ml) gelöst und für 3 Stunden in Eiswasser unter gelegentlichem Schütteln gehalten. Die Lösung wird dann durch Zugabe von 300 ul 2,5 % Ammoniak neutralisiert. Anisol wird durch vierfaches Extrahieren mit 20 ul Dichlormethan entfernt. Die Entfernung wird über die Zeit durch Flugmassenspektrometrie verfolgt. Abtrennen von glycolysiertem Material von freiem Peptid wird durch HPLC ausgeführt. Die entglycosylierten Hirulline werden durch Massenspektrometrie charakterisiert (vergl. Beispiel 4e).
entglycosyliertes Desulfatohirullin P6: best. 6972,9 (ber. 6970,60)
entglycosyliertes Hirullin P18: best. 6687,7 (ber. 6687,05)

Beispiel 7: In vitro-Synthese von Hirullin P6- und Hirullin P18-Genen mit bevorzugten Hefecodonen

Die kodierenden Sequenzen der Hirullinexpressionskassetten wurden mit bevorzugten Hefecodonen versehen [B. Hall, J. Biol. Chem. 257 (1982) 3026], um optimale Translation der Hirullin-mRNSn zu garantieren. Die kodierenden Sequenzen enthalten die PHO5-Signalsequenz, fusioniert im Raster der Kodierungssequenz von Hirullin P6 bzw. Hirullin P18. Die 5'-Enden der synthetischen DNSn enthalten die kohäsiven Enden der EcoRI-Restriktionsstelle. Am 3'-Ende wird das Stoppcodon TAG unmittelbar von den kohäsiven Enden der BamHI-Stelle gefolgt. Die Sequenz des 251 bp EcoRI-BamHI DNS-Fragmentes von Hirullin P6 (HTI-P6) ist in Figur 1 gezeigt. Die Sequenz des 248 bp EcoRI-BamHI DNS-Fragmentes von Hirullin P18 (HTI-P18) ist in Figur 2 dargestellt.
Figuren 1 und 2 zeigen auch die Strategie für die in vitro-Synthese der doppelsträngigen DNS. 12 Oligodesoxynukleotide werden jeweils unter Verwendung der Phosphoramiditmethode synthetisiert [M. H. Caruthers, in: Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H. G. Gassen und A. Lang, Herausg.), Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland] an einer Synthesevorrichtung von Applied Biosystems Modell 380B. Die Sequenz der individuellen Oligonukleotide ist in Figur 1 und Figur 2 dargestellt. Die Überlappung ist einmalig. Die gefriergetrockneten Oligonukleotide werden in 50 mMol Tris-HCl pH 8,0 bei einer Konzentration von 10 pMol/ul wieder gelöst. 10 pMol von jedem der 12 Oligonukleotide werden gemischt. Die Oligonukleotide werden phosphoryliert in 20 ul 25 mMol Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM NaCl, 3 mM DTT, 0,4 mM ATP und 4 Einheiten Polynukleotidkinase (Boehringer) für 1 Stunde bei 37ºC. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch für 5 min bei 95ºC in einem Wasserbad erhitzt und langsam auf Raumtemperatur in dem Wasserbad über Nacht abkühlen lassen. Das wärmebehandelte (Annealing) Oligonukleotidgemisch wird dann auf Eis gelagert.
Plasmid pUC19 (Biolabs) wird bis zur Vollständigkeit mit EcoRI und BamHI geschnitten. Das große 2,7 kb-Fragment wird an einem präparativen 0,6 % Agarosegel isoliert. Die DNS wird durch Elektroelution gewonnen und durch DE52-Ionenaustauschchromatografie und Ethanolfällung gereinigt. Die DNS wird in H&sub2;O bei einer Konzentration zu 0,4 pMol/ul wieder gelöst.
20 ul des wärmebehandelten (Annealing) Oligonukleotidgemischs (10 pMol jeweils von Oligonukleotiden 1 bis 12), 0,4 pMol des 2,7 kb EcoRI-BamHI-Fragments von pUC19 und 400 Einheiten T4 DNS-Ligase (Biolabs) werden für 16 Stunden bei 15ºC inkubiert.
10 ul aliquote Mengen werden verwendet, um kompetente E. coli JM109 Ca&spplus;&spplus;-Zellen zu transformieren. Die Zellen werden auf LB-Agarplatten plattiert, ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin, 7 ug/ml Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid (IPTG) und 30 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid (XGAL). 12 transformierte Ampicillin-resistente weiße Kolonien wuchsen einzeln in dem 100 ug/ml Ampicillin-enthaltenden LB-Medium auf. Plasmid-DNS wird durch das Verfahren von Holmes et al. hergestellt [Anal. Biochem. 114 (1981) 193] und durch EcoRI und BamHI-Restriktionsaufschluß(-verdau) analysiert. Plasmid- DNSn mit einem 251 bp oder 248 bp EcoRI-BamHI-Insert werden weiter durch DNS-Sequenzieren an beiden Strängen analysiert. Ein Klon mit der korrekten Sequenz an beiden DNS-Strängen wird selektiert und als pUC19/HTI-P6 für Hirullin P6 bzw. pUC19/HTI-P18 für Hirullin Pl8 bezeichnet.

Beispiel 8: Konstruktion des Plasmids pJDB207/GAPFL-HTI-P6

pJDB207/GAPFL-HTI-P6 ist ein Hefeplasmid zur Expression von Hirullin P6 unter der Steuerung eines kurzen, konstitutiven Promotors des Hefeglyceraldehyd-3-phosphatdihydrogenase (GAPDH)-Gens. Die kodierende Sequenz (HTT-P6) von Hirullin P6 besteht aus bevorzugten Hefecodonen.
10 ug Plasmid pUC19/HTI-P6 werden mit Restriktionsendonukleasen BamHI und EcoRI aufgeschlossen. Das 251 bp EcoRI- BamHI-Fragment wird von anderen DNS-Fragmenten an einer präparativen 1,2 % Agarosegelsäule getrennt. Die DNS-Banden werden mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht bei 360 nm sichtbar gemacht. Die 251 bp-DNS-Bande wird aus dem Gel geschnitten und in 0,2 x TBE-Puffer (TBE: 90 mM Trisbase, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) für 45 Minuten bei 100 mA elektroeluiert. Nach Änderung der Polarität für 45 Sekunden wird die DNS-Lösung konzentriert und auf 0,15 m NaCl eingestellt. Die DNS wird auf einem 100 ul-Bett DE52-Ionenaustauscher (Whatman) adsorbiert und mit 400 ul eines stark salzhaltigen Puffers eluiert (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl). Die DNS wird ethanolgefällt und in H&sub2;O zu einer Konzentration von 0,1 pMol/ul resuspendiert.
Plasmid pJDB207/GAPFL-HIR (Europäische Patentanmeldung Nr. 225 633) enthält das synthetische Gen für Desulfatohirudin (basierend auf der Verwendung des E. coli-Codons), fusioniert im Raster zur Signalsequenz von saurer Hefephosphatase (PHO5). Das Gen ist unter der Kontrolle eines kurzen konstitutiven Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPFL)- Promotors der Hefe am Shuttlevektor pJDB207. 10 ug des Plasmids pJDB207/GAPFL-HIR werden mit Sall und EcoRI aufgeschlossen. Das 478 bp SalI-EcoRI-Fragment enthält den Sal-Bam pBR322-Teil und den GAPFL-Promotor. Das DNS-Fragment wird an einem präparativen 0,8 % Agarosegel isoliert, elektroeluiert und durch DE52-Chromatografie und Ethanolfällung gereinigt. Die DNS wird in H&sub2;O bei einer Konzentration von 0,1 pMol/ul resuspendiert. 5 ug pJDB207/GAPFL-HIR werden mit SalI und BamHI aufgeschlossen. Das große 6,7 kb-Vektorfragment wird, wie vorstehend beschrieben, isoliert.
0,2 pMol des 478 bp SalI-EcoRI-Promotorfragments, 0,2 pMol des 251 EcoRI-BamHI-Fragments, enthaltend die PHO5-Signalsequenz und das Gen für das synthetische Hirullin P6 (HTI-P6 mit bevorzugten Hefecodonen) und 0,1 pMol des 6,7 kb-Vektorfragments werden in 10 ul 60 mMol Tris-HCl pH 7,5, 10 mMol MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 200 Einheiten T4 DNS-Ligase (Biolabs) für 6 Stunden bei 15ºC ligiert. Ein ul aliquote Menge des ligierten Gemisches wird verwendet, um kompetente E. coli HB101-Zellen zu transformieren.
12 transformierte Ampicillin-resistente Kolonien werden einzeln in 100 ug/ml Ampicillin-enthaltendem LB-Medium wachsen lassen. Plasmid-DNS wird durch das Verfahren von Holmes et al. hergestellt (siehe vorstehend) und mit SalI/HindIII-Doppelaufschlüssen analysiert. Ein Einzelklon mit dem erwarteten Restriktionsmuster wird als pJDB207/GAPFL- HTI-P6 bezeichnet.
In einer analogen Konstruktion wird das 248 bp EcoRI- BamHI-Fragment des Gens für synthetisches Hirullin P18 (HTI- P18) verwendet. Ein Einzelklon wird als pJDB207/GAPFL-HTI-P18 bezeichnet.
In analoger Weise kann die Konstruktion mit dem 543 bp SalI-EcoRI-Promotorfragment vom Plasmid pJDB207/GAPEL-HIR (Europäische Patentanmeldung Nr. 225 633) ausgeführt werden. Die erhaltenen neuen Plasmide werden als pJDB207/GAPEL-HTI-P6 und pJDB207/GAPEL-HTI-P18 bezeichnet.

Beispiel 9: Konstruktion von Plasmid pJDB207/PHO5(-173)-HTI- P6

pJDB207/PHO5(-173)-HTI-P6 ist ein Hefeplasmid für die Expression von Hirullin P6 unter der Kontrolle eines kurzen PHO5-Promotors. Das PHO5(-173)-Promotorelement umfaßt die Nukleotidsequenz von Hefe-PHO5-Promotor aus Stellung -9 bis -173 (BstEII-Restriktionsstelle), hat aber keine regulatorischen Sequenzen stromaufwärts (UAS). Der PHO5(-173)-Promotor verhält sich daher wie ein konstitutiver Promotor.
Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (EP 225 633) enthält die volle Länge regulierten PHO5-Promotors mit einer EcoRI- Stelle, eingeführt an Stelle -8 hinsichtlich des ATG der PHO5-Signalsequenz und der kodierenden Sequenz von Desulfatohirudin.
20 ug Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR werden mit BstEII aufgeschlossen. Die kohäsiven Enden der Restriktionsfragmente werden in einer Reaktion mit Klenow-DNS-Polymerase (1 Einheit/ug DNS) in 200 ul 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM jeweils dATP, dCTP, dGTP, TTP für 30 Minuten bei Raumtemperatur gefüllt. Nach Phenolextraktion der DNS wird mit Ethanol gefällt.
4,16 ug BamHI-Linker (5'-CGGATCCG-3', Biolabs) werden in 100 ul 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP und 18 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (Boehringer) für 45 min bei 37ºC phosphorylisiert. Nach 10 min bei 75ºC wird das Reaktionsgemisch langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die wärmebehandelten (Annealing) Oligonukleotid-Linker werden bei -20ºC gelagert.
4 pMol des [BstEII]/glattes Ende-Fragmente von Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR werden für 16 Stunden bei 15ºC mit dem hundertfachen Überschuß des phosphorylierten und wärmebehandelten (Annealing) BamHI-Linkers in 208 ul 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 800 Einheiten T4-DNS-Ligase (Biolabs) inkubiert. Nach Inaktivierung der Ligase für 10 min bei 85ºC wird der Überschuß an Linker durch Fällung der DNS in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat pH 6,0 und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNS wird mit BamHI und EcoRI aufgeschlossen. Die DNS-Fragmente werden an präparativen 0,8 % Agarosegel getrennt. Das 172 bp BamHI-EcoRI-Promotorfragment wird aus dem Gel durch Elektroelution und Ethanolfällung gewonnen. Die DNS wird bei einer Konzentration von 0,1 pMol/ul resuspendiert.
Plasmid pJDB207/GAPFL-HTI-P6 (siehe Beispiel 8) wird mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen. Das 632 bp EcoRI- HindIII-Fragment wird, wie vorstehend beschrieben, isoliert. Das DNS-Fragment enthält die PHO5-Signalsequenz, fusioniert im Raster zu der Kodierungssequenz von Hirullin P6 und dem PHO5-Transkriptionsterminationsfragment. Plasmid pJDB207/PHO5 (Eco)-HIR wird mit HindIII und BamHI geschnitten. Das 6,6 kb- Vektorfragment wird isoliert.
0,2 pMol jeweils des 172 bp BamHI-EcoRI-Fragments und 632 bp EcoRI-HindIII-Fragments und 0,1 pMol des 6,6 kb-Vektorfragments werden in 10 ul 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten T4-DNS-Ligase (Biolabs) für 6 Stunden bei 15ºC ligiert. Eine 1 ul aliquote Menge des Ligierungsgemisches wird zu 100 ul Calcium-behandelten transformationskompetenten E. coli HB101-Zellen gegeben.
12 transformierte, Ampicillin-resistente Kolonien werden in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, gezüchtet. Plasmid DNS wird hergestellt und durch BamHI und SalI/HindIII-Aufschlüsse analysiert. Ein Klon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird selektiert und als Plasmid pJDB207/PHO5(-173)-HTI-P6 bezeichnet.
Das 629 bp EcoRI-HindIII-Fragment von pJDB207/GAPFL- HTI-P18 (siehe Beispiel 8) wird in einer analogen Konstruktion verwendet, die zu Plasmid pJDB207/PHO5(-173)-HTI-P18 führt.

Beispiel 10: Konstruktion von Plasmid pDP34

Hefe-Zwei-Micron kovalent geschlossene Kreis-DNS wird aus Saccharomyces cerevisiae-Stamm S288C gewonnen. Zellen werden mit 5 ug/ml Zymolyase (100 000 Einheiten/ug) für 20 min bei 37ºC unter Aufschluß der Zellwände inkubiert. Die Spheroplasten werden mit 2 % SDS lysiert. EDTA wird zu 25 mM zugegeben, Ethidiumbromid zu 1 mg/ml und Cäsiumchlorid zu einer Enddichte von 1,55 g/ml. Plasmid-DNS wird aus der Chromosomen-DNS durch Ultrazentrifugieren für 42 Stunden bei 42 000 U/min bei 15ºC abgetrennt. Die 2-Mikron-Plasmid-DNS wird aus dem Gradienten mit einer Spritze geschnitten. Das Ethidiumbromid wird durch Extraktion mit NaCl-gesättigtem Isopropanol entfernt und die Plasmid DNS wird schließlich mit Ethanol gefällt. Die gereinigte 2-Mikron-Plasmid-DNS wird dann mit PstI linearisiert und in der PstI-Stelle von pUC19 geklont [J. Norrander et al., Gene 26 (1983), 101] unter Erhalt von Plasmid pDP31.
Plasmid pJDB207 wird mit den Restriktionsenzymen KpnI und HpaI aufgeschlossen. Das erhaltene 0,55 kb HpaI-KpnI- Fragment enthält die Verbindung zwischen der 2-Mikron-Sequenz und dem defektiven Promotor des dLEU2-Gens.
Plasmid pUC7/LEU2 enthält das hefegenomische 2,2 kb XhoI-SalI-Fragment des LEU2-Gens [A. Andreadis et al., Cell 31 (1982), 319], geklont in der SalI-Stelle des Plasmids pUC7 [J. Vieira et al., Gene 19 (1982), 259]. Plasmid pUC7/LEU2 wird mit KpnI und HpaI geschnitten. Das 4,25 kb KpnI-HpaI- Fragment wird an das 0,55 kb HpaI-KpnI-Fragment von pJDB207 ligiert. Dies führt zum Plasmid pDP30, wo die ursprüngliche Zwei-Mikron/dLEU2-Fusion, wie im Plasmid pJDB207 gegenüber dem LEU2-Gen mit dessen vollständigem Terminator angeordnet ist. pDP30 wird mit HpaI und SalI aufgeschlossen und das 1,85 kb Fragment mit dem vollständigen LEU2-Gen wird gereinigt und in das 8,7 kb SalI-HpaI-Fragment von Plasmid pDP31 geklont.
Das erhaltene Plasmid, pDP33 (siehe Figur 3) wird durch Teilaufschluß mit HindIII in Gegenwart von 50 ug/ml Ethidiumbromid linearisiert [M. Oesterlund et al., Gene 20 (1982) 121] und mit 1,17 kb HindIII-Fragment, enthaltend das URA3- Gen, ligiert [M. Rose et al., Gene 29 (1984), 113]. Die Insertion für das URA3-Gen wird ausgesucht durch Transformation in den E. coli-Stamm pyrF [M. Rose et al., siehe vorstehend]. Ein positiver Klon wird als Plasmid pDP34 (siehe Figur 4) bezeichnet.
pDP34 ist ein Hefe-E. coli-Shuttlevektor mit einem Ampicillinresistenzmarker für E. coli und die URA3 und die dLEU2-hefeselektiven Marker. Es enthält die vollständige Zwei-Mikron-Sequenz in der A-Form und ist REP1-, REP2- und FLP-befähigt.

Beispiel II: Klonen von Hirullin-Expressionskassetten in PDP34

Plasmid pDP34 wird mit BamHI aufgeschlossen. Die kohäsiven Enden der Restriktionsstellen werden in einer Reaktion mit Klenow DNS-Polymerase aufgefüllt (T. Maniatis et al., in: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die DNS wird zusätzlich mit SalI geschnitten und das 11,8 kb Vektorfragment wird an präparativem 0,6 % Agarosegel isoliert. Die DNS wird durch Elektroelution und Ethanolfällung gewonnen. Unterschiedliche Expressionskassetten werden in das pDP34-Vektorfragment zwischen SalI und [BamHI]/glattes Ende-Stellen geklont.
Plasmid pJDB207/GAPFL-HTI-P6 (siehe Beispiel 8) wird mit HindIII aufgeschlossen. Die kohäsiven Enden werden zu glatten Enden durch Klenow-DNS-Polymerase umgewandelt. Die DNS wird ethanolgefällt und zusätzlich mit Sall aufgeschlossen. Das 1,1 kb SaII-[HindIII]/glattes Ende-Fragment enthält die komplette Expressionskassette mit pBR322-Sequenzen, den GAPFL-Promotor, die PHO5-Signalsequenz, fusioniert im Raster der Kodierungssequenz (vorzugsweise Hefecodone) von Hirullin P6 und das PHO5-Transkriptionsterminations (abbruch)fragment. Das 1,1 kb Fragment wird an präparativen 0,8 % Agarosegel isoliert, aus dem Gel durch Elektroelution gewonnen und durch DE52-Ionenaustauschchromatografie und Fällen mit Ethanol gereinigt. 0,2 pMol des 1,1 kb Fragments und 0,1 pMol des 11,8 kb Vektorfragments werden in 10 ul 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 400 Einheiten T4 DNS-Ligase (Biolabs) für 16 Stunden bei 15ºC ligiert. Eine 1 ul aliquote Menge wird verwendet, um E. coli HB101 Ca²&spplus;-Zellen zu transformieren. 5 transformierte, Ampicillin-resistente Kolonien werden analysiert. Plasmid-DNS wird mit BamHI und SalI/BamHI aufgeschlossen. Ein Klon mit den korrekten Restriktionsfragmenten wird ausgewählt und als pDP34/GAPFL-HTI- P6 bezeichnet (siehe Figur 5).
In analoger Weise werden die 1,1 SalI- [HindIII]/glattes Ende-Fragmente von pJDPB207/GAPEL-HTI-P6, pJDPB207/GAPFL-HTI-P18 und pJDPB207/GAPEL-HTI-P18 (siehe Beispiel 8) und Plasmide pJDPB207/PHO5(-173)-HTI-P6 und pJDPB207/PHO5(-173)-HTI-P18 (siehe Beispiel 9) in den pDP34- Vektor geklont, was zu den Plasmiden pDP34/GAPEL-HTI-P6, pDP34/GAPFL-HTI-P18, pDP34/GAPEL-HTI-P18, pDP34/PHO5(-173)- HTI-P6 und pDP34/PHO5(-173)-HTI-P18 führt.

Beispiel 12: Die Hirullinexpressionskassetten in Plasmid DP96

pDP96 wurde als Alternative zu pDP34 konstruiert. Der wesentliche Unterschied in der Konstruktion von pDP96 ist die Verwendung der einzigartigen SnaBI-Stelle in dem Zwei-Mikron- Kreis zum Klonen, im Vergleich zur PstI-Stelle in pDP34. In pDP96 sind alle bekannten offenen Leseraster des Zwei-Mikron-Kreis, einschließlich des D-Leserasters, intakt. Daher sollte der Vektor für alle bekannten Zwei-Mikron-Funktionen in der Lage sein.

a) Konstruktion von Plasmid pDP96

Plasmid pDP31 (Beispiel 10) wird mit PstI und SnaBI zu drei Fragmenten aufgeschlossen. Plasmid pK19 [das die Kanamycinresistenz überträgt; Pridmore, R. D., Gene 56 (1987) 309-312] wird mit SmaI linearisiert. Die DNS-Fragmente von beiden Aufschlüssen werden mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNS-Fragmente werden gemischt und ligiert. Das Ligierungsgemisch wird transformiert [Hanahan, D. J., Mol. Biol. 166 (1983) 557-580] in kompetenten E. coli- JM109-Zellen [Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33 (1985) 103- 119], für 2 Stunden bei 37ºC in LB-Medium exprimiert und dann auf LB-Agarplatten, ergänzt mit 50 ug/ml Kanamycin, 30 ug/ml XGal und 7 ug/ml IPTG plattiert.
12 weiße Kanamycin-resistente Kolonien werden gezüchtet. Plasmid DNS wird durch XbaI- und BamHI/KpnI-Aufschlüsse analysiert. Ein einzelner Klon, der den pUC19-Vektorteil von pDP31 verloren hat, wiederhergestellt am Zwei-Mikron-D-Leseraster durch erneute Ligierung der PstI-Stelle und der das glatte pK19-Plasmidende in die SnaBI-Stelle inseriert hat, wird als pDP95 bezeichnet. Das Plasmid enthält die großen SnaBI-PstI und die kleinen PstI-SnaBI-Fragmente des Zwei-Mikron-Plasmids, geklont an der SnaI-Seite von pK19. Durch erneute Ligierung der PstI-Stellen wird das D-Leseraster rekonstituiert.
Plasmid pUC18/URA3 besteht aus dem 1,17 kb Hefe-URA3- Gen (Hindlll-Fragment), geklont an der Hindlll-Seite von E. coli-Vektor pUC18 mit dem URA3-Gen, inseriert in gegensätzlicher Ausrichtung wie das Ampicillinresistenzgen. pUC18/URA3 wird teilweise mit dem Restriktionsenzym HindIII in Gegenwart von 50 ug/ml Ethidiumbromid für 1 Stunde bei 37ºC aufgeschlossen. Die Zugabe von Ethidiumbromid zu dem Aufschluß erlaubt eine erste Stelle, die durch HindIII aufgeschlossen werden soll, jedoch stört die anschließende Interkalation von Ethidiumbromid in der linearisierten DNS beim Aufschluß der zweiten Stelle, die sich somit mit linearisierter Plasmid-DNS anreichert. Das Restriktionsenzym und Ethidiumbromid werden durch zwei aufeinanderfolgende Phenolextraktionen entfernt und die DNS wird mit Ethanol gefällt. Diese DNS wird mit dem DNS-Polymerase-Großfragment (Klenowenzym) unter Füllung der 5'-Überhänge der Hindlll-Stellen behandelt. Diese endreparierte DNS wird an Agarosegel laufen lassen zum Abtrennen verschiedener Fragmente, einschließlich angereicherter und endreparierter linearer. Die lineare 3,35 kb pUC18/URA3-DNS wird aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert. Diese DNS wird selbst ligiert mit T4-DNS-Ligase, transformiert in kompetente E. coli-JM109-Zellen und auf YT-Platten, ergänzt mit 50 ug/ml Ampicillin, plattiert. Kolonien werden ausgesucht, wie vorstehend, um Plasmid "D" zu identifizieren, worin die Hindlll-Stelle bei der pUC-Linker-Angriffsseite des URA3-Gens endrepariert wurde und eine neue NheI-Restriktionsstelle schafft.
Plasmid "D" wird mit dem Restriktionsenzym HindIII vollständig aufgeschlossen und die 5'-Überhänge werden in einer Reaktion mit Klenow-DNS-Polymerase gefüllt. Diese DNS wird mit einem großen Überschuß von NotI-Linkern (GCGGCCGC), ligiert mit T4-DNS-Ligase, transformiert in kompetente E. coli-JM109-Zellen und auf YT-Platten, ergänzt mit 50 ug/ml Ampicillin, plattiert. Die Kolonien werden wie vorstehend ausgesucht und Plasmid "E" wird identifiziert, wo die HindIII-Stelle repariert und ein NotI-Linker addiert wurde. Plasmid "E" wird mit dem Restriktionsenzym SacI aufgeschlossen und 3'-Überhänge werden mit T4-DNS-Polymerase repariert. Die DNS wird dann mit einem großen Überschuß NotI-Linkern vermischt und mit T4-DNS-Ligase ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in kompetente E. coli-JM109-Zellen transformiert und auf YT-Platten, ergänzt mit 50 ug/ml Ampicillin, plattiert. Kolonien werden wie vorstehend ausgesucht und Plasmid pUC18/URA3-N wird identifiziert, wobei die pUC18-Sequenzen nun durch NotI-Restriktionsstellen flankiert sind (Plasmide "D" und "E" sind lediglich Zwischenprodukte bei der Konstruktion von pUC18/URA3-N).
Plasmid pDP95 und pUC18/URA3-N werden beide mit KpnI und BamHI aufgeschlossen und führen jeweils zu zwei Fragmenten. Die DNS-Fragmente werden mischligiert und zur Transformation kompetenter E. coli-JM109-Zellen verwendet. Die Zellen werden auf LB-Agarplatten, ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin, 30 ug/ml XGal und 7 ug/ml IPTG, plattiert.
12 weiße, Ampicillin-resistente Kolonien wachsen auf. Plasmid-DNS wird mit HindIII- und PvuII-Aufschlüssen analysiert. Ein einzelner Klon wird als pDP96 bezeichnet, umfassend die gesamte Zwei-Mikron-Sequenz, befähigt für alle diese bekannten Funktionen, und das URA3-Gen, geklont in den pUC- Vektor (siehe Figur 6).

b) Klonen von Hirullinexpressionskassetten in pDP96

In Analogie zu Beispiel 11 wird pDP96 mit BamHI aufgeschlossen. Die kohäsiven Enden werden in einer Reaktion mit Klenow-DNS-Polymerase gefüllt. Die DNS wird weiter mit SalI geschnitten. Das 10,2 kb Vektorfragment wird isoliert. Das 1,1 kb SalI-[HinIII]/glattes Ende-Fragment des Plasmid pJDB207/GAPFL-HTI-P6 (siehe Beispiel 8) wird isoliert und an das Vektorfragment ligiert.
6 transformierte, Ampicillin-resistente Kolonien werden analysiert. Plasmid-DNS wird mit BamHI und SalI/BamHI aufgeschlossen. Ein Klon der erwarteten Restriktionsfragmente wird ausgewählt und als pDP96/GAPFL-HTI-P6 bezeichnet. In ähnlicher Weise wird Plasmid pDP96/GAPFL-HTI-P18 unter Verwendung des 1,1 kb Sali-[HindIII]/glattes Ende-Fragment von pJDB207/GAPFL-HTI-P18 (siehe Beispiel 8) hergestellt.

Beispiel 13: Konstruktion von Zwei-Mikron-DNS-freien Saccharomyces cerevisiae-Wirtsstämmen

Um das endogene Zwei-Mikron-Plasmid zu entfernen, wird in einem ersten Schritt eine Deletion in das URA3-Gen von Stamm HT246 (DSM 4084; α, leu 2-3, leu 2-112, prb) eingeführt, um den Stamm für Uracil auxotroph zu machen. HT246 wird mit 1 ug Plasmid YEp13 [Broach, J. R., Strathern, J. N., Hicks, J. B. (1979) Gene 8, 121-123] unter Verwendung des von Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] beschriebenen Vorgehens transformiert. 10 ug Plasmid pUC12- ura3Δ, enthaltend eine Deletion in dem URA3-Gen [Sengstag, Ch., Hinnen A., Nukleic Acids Research 15, 233-246 (1987)], werden zusammen mit dem Plasmid YEp13 zugegeben. Etwa 3000 Leucin-prototrophe Transformanten werden in 5 ml Minimalmedium resuspendiert (Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren mit zugegebenen 2 % Glucose, 0,1 % Leucin, 0,1 % Uracil und 0,25 % Fluororotsäure) in einem kleinen Schüttelkolben und für 60 Stunden bei 30ºC und 180 U/min inkubiert. Die Transformanten, die aufwachsen, sind resistent gegen das toxische Analogon Fluororotsäure und tragen daher eine Umstellung in dem chromosomalen URA3-Gen durch ura3Δ. Die gewachsenen Zellen werden auf vollständigem Medium ausplattiert, das aus (g/l): Pepton 20, Hefeextrakt 10, Glucose 20 besteht und nach Aufwuchs für 48 Stunden bei 30ºC auf Minimalmedium (Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren mit zugegebenen 2 % Glucose und 0,1 % Leucin) replica-plattiert, um Uracilauxotrophe festzustellen. Verschiedene Auxotrophe werden herausgenommen und hinsichtlich Verlust an Plasmid YEp13 geprüft, das Leucinauxotrophie überträgt. Eine einzelne Kolonie (bezeichnet Tr889), die Leucin und Uracil erfordert, wird herausgenommen und für weitere Versuche verwendet.
Tr889 wird mit Plasmid pDP38 transformiert [erhalten von Plasmid pDP34 durch Aufschluß mit SphI und erneuter Ligierung des erhaltenen 8,4 kb-Fragments; vergl. Figur 4], das sowohl Markergene LEU2 als auch URA3 (Transformationsprotokoll, siehe vorstehend) trägt. Transformierte Hefezellen werden zunächst auf Hefeminimalmediaplatten, denen Uracil fehlt, ergänzt mit Leucin, ausgewählt und dann auf Minimalmedium, dem Leucin fehlt und das mit Uracil ergänzt wurde, replicaplattiert. 10 schwach wachsende Kolonien werden ausgewählt und einzeln in einem Flüssigvollmedium (siehe vorstehend) über etwa 100 Generationen gezüchtet. Dadurch verlieren die Zellen das pDP38-Plasmid und zu einem gewissen Ausmaß gleichzeitig auch das endogene Zwei-Mikron-Plasmid. 10 Uracil- und Leucin-erfordernde Kolonien werden ausgewählt, die DNS wird präpariert, die DNS wird vollständig mit PstI aufgeschlossen und mit ³²P-markierter Hefe-Zwei-Mikron-DNS aus Southern- Blots als Sonden versehen. Ein Isolat ohne ein Hybridisierungssignal wird als H449 bezeichnet (a, leu2-3, leu2-112, ura3Δ, prb, cirº), ein isogenes Zwei-Mikron-freies (cirº)- Derivat des Hefestammes HT246.

Beispiel 14: Transformation von S. cerevisiae-Stamm H449

Saccharomyces cerevisiae-Stamm H449 wird transformiert mit den Plasmiden
unter Verwendung des Transformationsprotokolls, beschrieben von Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. Transformierte Hefezellen werden auf Hefeminimalmediumplatten, ergänzt mit Leucin und ohne Uracil, selektiert. Einzelne transformierte Hefezellen werden isoliert und bezeichnet als Saccharomyces cerevisiae

Beispiel 15: Fermentation transformierter Hefestämme im Labormaßstab

Zellen von Saccharomyces cerevisiae H449/pDP34/GAPFL- HTI-P6 und von Saccharomyces cerevisiae H449/pDP34/GAPFL-HTI- P18 werden in zwei aufeinanderfolgenden Vorkulturen auf 10 ml Minimalmedium, bestehend aus (g/l), gezüchtet:
Difco Yeast Nitrogen Base 6,7
Asparagin 10
Leucin 1
Glucose 20
Die erste Vorkultur wird für 60 Stunden bei 28ºC und 180 U/min gezüchtet. Die zweite Vorkultur wird mit 2 % der ersten Vorkultur beimpft und für 24 Stunden bei 28ºC und 180 U/min inkubiert. Das Hauptkulturmedium besteht aus (g/l):
Hefeextrakt 49
Glucose 5
Fructose 57
NH&sub4;NO&sub3; 0,5
MgSO&sub4; x 7H&sub2;O 1,0
CaCO&sub3; 5,0
Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2; 2,0
Die Hauptkultur wird mit etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml beimpft und bis zu 72 Stunden bei 28ºC und 180 U/min inkubiert. Etwa 1 x 10&sup9; Zellen/ml werden am Ende der Fermentation erhalten. An verschiedenen Zeitpunkten während der Fermentation werden aliquote Mengen der Kulturen entnommen, die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und der Kulturüberstand hinsichtlich Hirullin durch HPLC (infra) analysiert.

Beispiel 16: Gewinnung der Hirulline aus Kulturbrühen von transformierten S. cerevisiae

Die Kulturbrühe wird mit Amberlite XAD-7 vermischt und wird Adsorption für etwa 4 Stunden bei 25ºC unterzogen. Die Zellen werden von dem Harz in einer Säule abgetrennt. Nach Waschen mit 1 M NaCl wird das Harz mit Tris-Puffer (50 mM, pH 7,0-8,5) eluiert. Die Hauptfraktion wird auf pH 2,9 eingestellt und auf eine Sephadex G50 superfine Säule (Pharmacia 100 cm x 26 mm; 400 ml Bettvolumen) konditioniert mit 0,1 M Essigsäure, gegeben und an ein Pharmacia FPLC-System angeschlossen. Die Elution wird mit 0,1 M Essigsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min ausgeführt und bei 280 nm verfolgt. 6 ml-Fraktionen werden gesammelt und hinsichtlich Aktivität mit einer Thrombininhibierungsbestimmung geprüft, wie von S. Mao et al. beschrieben [Anal. Bioch. 161, 514 (1987)]. Dieser Schritt ergibt eine Vierfache Reinigung. Die aktiven Fraktionen werden gefriergetrocknet, zurückgelöst in 2 ml 0,02 M Histidin/HCl pH 5,6 (=Elutionsmittel A), zentrifugiert und der klare Überstand wird auf eine Q-Sepharoseschnellflußanionenaustauschersäule (Pharmacia, 40 cm x 16 mm; Bettvolumen 66 ml) angeschlossen an ein Pharmacia FPLC-System, und konditioniert mit Elutionsmittel A, gegeben. Die Elution wird mit einem Stufengradienten bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min ausgeführt: 48 min 0 % B (Elutionsmittel B: 0,02 M Histidin/HCl pH 5,6 + 1 M NaCl), 102 min 15 % B, 65 min 100 % B. Der Versuch wird bei 280 nm verfolgt und die aktiven Fraktionen werden gesammelt und an einer Sephadex G50 fine Säule mit 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3; entsalzt und gefriergetrocknet.
Die Schlußreinigung wird durch Umkehrphasen-HPLC (Nucleosil C18 und Phenylkieselgel) und durch Mono Q-Anionenaustauschchromatografie, wie beschrieben in Beispiel 3, ausgeführt. Die reinen Hirulline P6 und P18, erzeugt durch S. cerevisiae, entsprechen im wesentlichen den Produkten, die gemäß dem Verfahren beschrieben in Beispiel 6 erhalten wurden, d.h. dem erhaltenen Hirullin P6 fehlt die Sulfatmonoestergruppe an Tyr&sup6;¹ (=Desulfatohirullin P6).

Beispiel 17: Arzneimittel, enthaltend eine Hirullinverbindung zur parenteralen Verabreichung

Eine Lösung, die eine Hirullinverbindung gemäß einem der Beispiele 3, 5 oder 16 enthält, wird gegen 0,9 %-ige NaCl-Lösung dialysiert. Die Konzentration der Lösung wird dann durch Verdünnen mit derselben NaCl-Lösung auf 0,2 mg/ml oder 2 mg/ml eingestellt. Diese Lösungen werden durch Ultrafiltration (Membranen mit 0,22 um Poren) sterilisiert.
Die sterilisierten Lösungen können direkt verwendet werden, beispielsweise für intravenöse Verabreichung.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die nachstehenden Mikroorganismusstämme wurden bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-3300 Braunschweig (Hinterlegungsdaten und -nummern sind angegeben) hinterlegt:
Saccharomyces cerevisiae H449: 18. Februar 1988, DSM4413;
Escherichia coli JM109/pDP38: 19. Februar 1988, DSM 4414;
Escherichia coli JMl09/pDP34: 14. März 1988, DSM 4473;

Claims

1. Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Polypeptid der Aminosäuresequenz

und dem Polypeptid der Aminosäuresequenz

worin T* Threonin darstellt, dessen Hydroxylgruppe frei oder O-glycosyliert vorliegt und worin Z ein phenolisches Wasserstoffatom von Tyrosin oder eine Gruppe -SO&sub3;H bedeutet, und Salze davon.

2. Polypeptid der Formel I nach Anspruch 1, worin Z das phenolische Wasserstoffatom von Tyrosin darstellt und T* die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen aufweist.

3. Polypeptid der Formel I nach Anspruch 1, worin Z das phenolische Wasserstoffatom von Tyrosin darstellt und T* Threonin darstellt.

4. Polypeptid der Formel I nach Anspruch 1, worin Z das phenolische Wasserstoffatom von Tyrosin darstellt und T* Threonin darstellt, dessen Hydroxylgruppe glycosyliert ist, gewonnen aus dem Egel Hirudinaria manillensis.

5. Polypeptid der Formel I nach Anspruch 1, worin Z die Gruppe -SO&sub3;H bedeutet und T* Threonin darstellt, dessen Hydroxylgruppe glycosyliert ist, gewonnen aus dem Egel Hirudinaria manillensis.

6. Polypeptid der Formel II nach Anspruch 1, worin T* Threonin darstellt.

7. Polypeptid der Formel II nach Anspruch 1, worin T* Threonin darstellt, dessen Hydroxylgruppe O-glycosyliert ist, gewonnen aus dem Egel Hirudinaria manillensis.

8. Arzneimittel, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1.

9. Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

10. Verfahren zur Inhibierung von Thrombin im Blut außerhalb des Körpers, umfassend das Inkontaktbringen des Blutes mit einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon.

11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Salzes davon, umfassend

a. Gewinnen des Polypeptids aus den Körpern der Egelarten Hirudinaria manillensis durch eine Kombination von Fällungsverfahren und chromatografischen Verfahren oder

b. chemisches Synthetisieren des Polypeptids durch Peptidsynthese, oder

c. Züchtung von Wirtszellen transformiert mit einem Hybridvektor, umfassend einen Promotor, operabel gebunden an eine für das Polypeptid kodierenden DNS-Sequenz, und Gewinnen des Polypeptids

und, falls erwünscht, Entfernen in einer erhaltenen Verbindung der Formel I, worin Z die Gruppe -SO&sub3;H darstellt, der Schwefelsäuremonoestergruppe durch Hydrolyse und/oder, falls erwünscht, Entfernen des Glycosylrestes in einer durch Hydrolyse oder Säurespaltung erhaltenen Verbindung der Formel I oder II, und/oder, falls erwünscht, Umwandeln eines erhaltenen mit freien Carbonsäure- und/oder Aminogruppen ausgestatteten Polypeptids in ein Salz oder Umwandeln eines erhaltenen Salzes in die freie Verbindung.

12. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Salzes davon, worin T* Threonin darstellt, dessen Hydroxylgruppe glycosyliert ist und Z das phenolische Wasserstoffatom von Tyrosin oder eine Gruppe -SO&sub3;H bedeutet, umfassend Gewinnen des Polypeptids aus den Körpern der Egelarten Hirudinaria manillensis durch eine Kombination von Fällungsverfahren und chromatografischen Verfahren und, falls erwünscht, Entfernen in einer erhaltenen Verbindung der Formel I, worin Z die Gruppe -SO&sub3;H bedeutet, der Schwefelsäuremonoestergruppe durch Hydrolyse und/oder, falls erwünscht, Umwandeln eines erhaltenen mit freien Carbonsäure- und/oder Aminogruppen ausgestatteten Polypeptids in ein Salz oder Umwandeln eines erhaltenen Salzes in die freie Verbindung.

13. DNS-Kodierung für ein Hirullinpolypeptid nach Anspruch 1.

14. Hy bridvektor, enthaltend eine DNS-Sequenz kodierend für ein Hirullinpolypeptid nach Anspruch 1, wobei die DNS-Sequenz durch eine Expressionskontrollsequenz gesteuert wird.

15. Wirtsorganismus, transformiert mit einem Hybridvektor, enthaltend eine für ein Hirullinpolypeptid nach Anspruch 1 kodierende DNS-Sequenz, dessen DNS durch eine Expressionskontrollsequenz gesteuert wird.

16. Polypeptid, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 11.

17. Polypeptid, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 12.