PT90798B - Metodos para a producao de novos polipeptideos com actividade anticoagulante - Google Patents

Description

O presente invento r e i U Πί 3 ac t- i vi da de anticoag u I a prepa )'3.çSo ; c efjípos 1 v o e s τ a r ma C êu e s u a ij ti i ização coroo anentes a n

Hzi r? <r*. f r g '.e^zí I.Ihc. n iiied i c i na i s < Hi r udo me o 1 C I n a i i s i r i a. s g ue bdO usadas em t. *5 r a p ia. t π i- r e 03 mu i i 03 pept i deos i c a m e n t e a c t i v o s g u e o c ri r r e ro na sa. I i w de sang :_JPS suga o de ec i a.i inífresss a. hirudina > Uulrt vez c| ^ f ί——* jl a i n ibidor m a. 1 3 ΤΟΓ 7. trornbi na . A hi r udina reage e s P* e c i τ i c e.men 7. c om a ir Ciro d i na e t a. n t o e v 1i a a. c o agulaçAo do s a π g u e Sr lld. o ant igên1 ca, tem u ro a. icidade baixa e a mo í 3c u 1 a. i. n a. 11- e r ^ o j—1 q:ja 30 c o ro p j. e t a π ? s* Π te 0 X C P tr t ·?. d ζλ 0. t· P 0. ' rms . 0 i so i am ento pur i fícacS o e propr i eoa hi rudina f o r <rí m p e v i s t o s por P Waloman n e i 53 ϋ í 931: ) j e a sua es t rui Lira P1 r i ro a. r i a. foi et a.l . C B i o 1 . Chern. H Oppe-.':e yier 356, 379 ( 1 ‘385 ) ] .

Recentemente, cDNês e genes si ntêti cos codi f i cadcrt h i r ud i na. ou de va r i a.n ies da h i r ud i na í oraro c i orv ero nospedí11 ros o? i c ιόο i anos t a i s c o mo ír.sc no >a i c n i a r - s.jL·»: ;j ia (

Ocbsu i t e. i-o n i rud i nab '* appabon t·a.ro no enoan io app>jx1roao^men ·. — a

V· r tj ri Zí f~! i ;'· iH ur udina e.do mis t uro f~ . da P K Wa Γ'j l· ; E' 1 Oíoed . Ο I OC Piem . f-4C 0-a O-O .i eo / v 1 Po / i

BàD ORIGINAL

ρ ν π

rríYi

Cons i derando esta o e s v a. n e a. g em e a 0 ii1 idade de a. 9 ante ant-itr ombóiicos n a. ρ r 0 τ ila. x i a. e terapia. da x.· romboses e es tado seoie 1 h entes exis t-e uíiid forte nec ess i da.de de po I1peti deos c ompe r a. V 0 1 S ê. r 11r ugina no que conce r n e a. a. c t-1 v i d a. o 0 ani1trombó 11 c a 0 r ΟΓ·'» va n ta.9sni; a.p resentem uma dyra.cSo de a. Γ C c*. 0 λ] 5 10πga. Consti tui um objeciiv0 d 0 p r 0 s 0 n 10 invento prop 0r cio n a. r t a. i s ρ* o i ipepti d 0 0 s a n t· 1t r ornbo 1 111 c a.men te a c ti vos. ί ι rud nas , es t ru

Su r p r e e nd a n t0 m e n 10 0 n c o n tr o u —se na. r i a ma. n i 1 I sns i s p r o d u z ρ o 1 i p e p-t í d 0 '_-0 aprese n t- a η u m a. rala. c 0 o r amo ta com u r a. 1 0 q u e a. ρ r 0 s 0 n t a. m t o r x· 0 s a. c x· 1 v x 0

3S'J'9^ r u i 1 -

T QHDFOPIPEE VI. •o i i pep t· í d i n r

St-j! . íj õ b N p (_

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"X: W Γ' P" M K-.E.i1Ub Τ'Kr 1bad original

λ

hlu Γ O 9 é Π Io f e!'iO i I C =«η+. 91 I - Ο X i S. ·., Ο tr Ζ Γ *rr p: )~Ί X a Ο -r1. Χ· Ο Γί ϊΟ t· i ros i na ou um g rupo—SO._ H e seus ss i i

Os poI iρερt-ídsos da fórmula I sSo designados "dsssui f a· t-o-hi rudina. Pb" (Z é hidrogénio) ou "hirudina Ρβ" (Z e o grupo--SO...H > . 0 pol ipspíídao de fórmula II é designado "hirudina PIS". 0 código de um 0. ú π i c a designa os 3 0 g 12 ί n Õ 0 3 0. Γί ) I P: O a C I 005 i A 3. 1 5Γι'! 1 Pró j (' C. hicf.a τ na . (0)ác i d Cr* .j f 1 1 C, i 3. mina, (G)glic ; -s /* u y i i ia ^ ·.·!/! sina, (L ) 1 euc ina , (fi ) met i οπi n G ;_i . í E..) a r ι ráj gluiãmi co , ( I)isoi enci na / *. K. ,J 11 spa p a 5 ina j C p>p rο Ii na (T) treonina, l V /vaiina < Q )gl uiafii i na., (R)argini na , (S >ser i na., i Y ) t-1 ros i na. . U radica. 1 glicosilo 0-li gado á ireonina. T no composto da fórmula II produzido pe I a. sanguessuga H . rnan i 1 I ens i s pode ser representado pela fórmula

. M J O n ^ ·_ 1'inL d M _ - Λ 4· 4 T -V í <r>. ·_ *rf '.· a a 0 ci i c*,L G- O zc ri tf; 1 Pr cH. OL-i 3 galac tose O í_j ma no sa oi-‘ glucose e Fuc é 1 L-·' C O 3 0 . Ú 3 C Ο Γ·'ί P! O 3 t- O 3 da. τ órγγϊΙηia I p roduz1 dos P '=? 2 a 3 a. n g u - = s 12 g a H . ma.η 1 2 2 an3 13 v*3m na π í a ι o r p·· a. r o 0 ! um radi cal g 1 1 cos11 o O—liga OGê . + .--í i 31*5 1 T 1 Γ Λ G r* ΪΓ uri- BAO ΟΒΙβ'ΝΜ-

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ι η ι r 1 L <τλ i ν Γ cr fl I ί

Π?. 7 Ο Γ Π-! S. C?C*=> S ê L-Í S =>a.iS . Uma V' ê Ζ! gL4f COmvÊmí grupOS vr* Γ:"? 1 Π Ο OU guanidina 1 ivres em vèr i us resíduos de íb. Γι': 1 1 noáci dos j us COÍÍlP do invento podem asiar em 7 ΟΓΓίι8 dê 58 1b . j : „ ff . <_ Lj ê rl *_j .L v c*. f_f cd c ida pa r t· i c u 1 s r =eo adequados os sais de a d 1 Ç â O ácida fisioló 9i CS

o iera. dos f o r m a 'do s com ác c i dos 2 no r gân i cos Γ8ΡΓ058 e j a o S c i d o cl o r £ d r i c o ) os fó r i co e á c ido p i r o f o s í i vos êm P'ar t· i c u i a. r O *5 á C 'S 05 á. C 1 OOS Γ» 1 d Γ Ο t“icí 1 I C OS ν C ΟΓί'ίΟ lOêrn Ο c*. C Í Ο Ο SLÍ1 f fj Γ í C Ο ; ci c i do ·-: ¥ ι-. S - i Ηι-χ· fónicos inferiores (como s* O rgáni cos representa- i C O S C IS 1 5 como á C 1 d O Ci U á. C 1 d i_i b 8. I C d Ο u r? S U 1 s u If óni c o), ι d551Γ }> como sc i =1 "I Γ:·| A f s carboxi 1 i cos cofiiij Sê J d. á C 2, O♦_! cr*. C ê t' 1 C U ; ác ido 1 ático, /- ; .-i ·_ ± ‘—1 tico, ác i •do esieáric o , ác i do má 1 i c o , á.c i do i a r t- á r i c o , c id> h; i r r> r? Â r ido citrico C o m o ,· η o e n t s n í s s hiruiinas 4. S =>UêΓ>ί '3 t"* Uí-:O zí C ?.ΓϋυΧ I 1 O i 1 VTíb êfíi Vd]' IOb Γ8'3 1 GUOb u8 c.Hi 1 mOc.C 1 '

bad original

BAD ORIGINAL 1.0:7-,0 prisêiro paSSO·

do poso roo Iõcuíõ" roo is o 1 to é to o t i I poro:.,. ( como sejam enzimas digestivas) são separadas das niroi inss de 0 0 0 da 1 tons . A f 11 f ração· em gel d ura me t o o o c onhec i do· per se. él S adequados são baseados em dext V ·?. n C* S } des tr ano-a.c r i i ar,-· i o as , O í 1 cr crilamidas e similares. Um pr oc esse- de fi1 tração em gel específico foi descrito por J. DodiCBioi. Chem . Hoppe-Seyier 367, 303 (1986)] e utiliza Sepnadex 6 75 (um dexirano intet—1 igado coro epic loridrina) e um tampão pH 7. 8 contendo Na CL 0,3 n. No enian- to, prefere- se S ep na.de > G 5 0 si.-per f i na de •vi do á sua. melhor r e s o 1 u c a o· . Ο OftlO el uente O ácido S. C ir t- ’ C O Ó / 1 ri é muito c o···· ven i en te ρο r que pode ser omi ti do um passo de remoc So de sa 1 s u ò s e q u e n t- e .

Podero igua 1 mente ser usados outros eieentes voláteis tais coroe· ácido fórmico, piridina-ácido acético ou ir i mei i 1 am i ns.-á c i do f órmi co. A amostra é dissolvida no eluente numa concentração de proteínas de 30—70rng/ml , de Preferência 50mg/m1 nupi vo I ume que t O t cr í i Z ã a t rrr 5% do volume de lei to no máxima e apl 2 C b Os. na c o 1 u n a pré-equi1ibr a da.

Num segundo passo· de por i f i cação o e lua to de f i 1 tração em gel pode ser sujei ιο a c r oma iog r a f i a de af inidace com· trombina ligada a uma mairix adequada, corno seja Atfigel ou Sepharose activada, com brometo de c ia.nogénio. A coluna de trombina pode ser preparada do seguinte modo·; Como* primei ro passo, trombina conercia! è purificada por f i1 tração em gel. Como eluente usa-se um iamp-ao na gama cie pH de 6 a 7, 5. A aciivi dado das frac v òeS pode ser detestada co-m um teste de r í -•anulação do sangi-rz1 1F . uarkwsrdt et- a 1 ; inrcimb. haemost. 477 2 >.‘6 (1887)). dum paaso S e U 1 n v e ; a _ f 1 a ·... ·. Õ e a c X I V â :_· s a e · ‘ e u · · 1 o a .·? e a ·. — - r -.-- u r --· o m supori e ce a f i n i da·de , e . g. Affige1s (6i orad) c omo descriro peio f aor i c an t-e A eluicáo do s inibi dores de trombina e eiect-uaoa com benzamidina Este último P r o c e s s o este descrito· p· cr P. Walsmann í F '·- a r maz i e 0 (1981)3. Ass i m,

Pi 1 P C-l i 1 P -ri 'r? c* L 7 1 V cr.'3 rj Cj I co 3 Cr i V 1 O cr. -=:0 ( '50 i. L-i C -3.1 o diluída de uai 1 numa concentração de 10 a SOmg de protei na/fii 1 Por c a oa m1 de voi ume de leito são aplicadas cerca. de 30rng de proteína. A s p r o te í nas não 11godas foram removida por lavagem com soro f i sio 16gi co ou solução diluída de acetato de sódio antes dos peptideos ligados serem eluidos com benzamidina . A coluna de afinida.de pode ser comoina.da com urna coluna de filtração em gel para separar benza— midina das hi rui inas . Removeu-se o sai das f raccões ac t-1 vas que se secaram por 1iofiiização. 1' me a 1 te r na 11 ve a c r um e t u g r e f i a oe c*. f i π i o a de des c r i ta a. t rás é a pu r i f i c a ç So po· r c r omo t og r a. f i a de p e r mu t a a. niónic a . Uni a. vez que o ponto isoeléctri co das hiruli nas é na gama pH—, a aplicação da. amostra a. um p.H entre S e 5, 6 é preferido pois assim uma quantidade considerável de proteína indesejável pode ser remov ida por 1 avagem c o m s o r o f i sio1ògi co antes de. e 1 u i cão das í rac côss 5 ·_ V i Vc*.‘-7 . LpíjíC1 vez que as hirulinas e I uarn em c onc en- t r a. ç de =j S d 1 1 Pt cr r? tf i tfVtf.Otr.z > t- o d a a f am í1ia de hirulin a pode ser eiuida c om um gradiente de passos. Os c o n ta mina n te s coei ui dos podem ser facilmente separaoos no passo de purificação suosequen-te. de em vez de um gradiente de passos se aplicar um gradiente cie sal c on t i nuo , e possível separar isof ormas de hirul mas .

Durante a purificação fina 1 as i soformas de hi ruii nas S a O S e p a. r e i O a. 3 umas das outras. A pur i f i cacão f inal inclui de preferência pei o menos dois pass O S d I ferentes Por exemplo, cf. família de pept idsos é sp i i c ada. numa c o* 1 una de H'r'í_u Rr' 0 1 tí s eluída com grad iente de cr. gua / a C e nitri lo conte nd o 0,1 % de a c 1 do t r i f1uoroacétic o CTFA>. Co1heram-s A-· ,T. 5 í rac cSes d os picos e fo r em de novo cromot ogra ' ada fr i 1 tí :ζ* Γ: * tf 3 f?> 3 S C ordiç ôes E: m seguida, cr sr fraccães do pi co foraríi sujeitas •ri _ rf ! í ! outro re agente de pa •05 i óni coe; como se ja d c i d o n e p t a f 1 u o r o b u t i r i c o em vez de TrA o u u m a Α*.Ρ.·Γά 7 cf z> Cr zf fo 7· cr L 1 ·..· nã r i 3 e. g. empacotamento oe Rp s íIica- f eni1 . BAD ORIGINAL '

tm vez da separacao em fase reversa no último passo de puri f i ca — cão é preferida c romaiogre. f ia de permuta i 6n i ca de a. 1 ta resolução, e. g. com colunas MonoQ no sistema FPLC Pnarnisc ia. Quando se usam eluentes voláteis, e. g. ácido fórmico/a.mónia o passo da remoção de sal pode ser omitido.

Num composto da fórmula I obt i do onde Z é o grupo -SO...H o grupo -SO...H pode ser removido por hidrólise é de preferência e f 01 t-ua O a us a ndo enz i m a s aspei i τ i c os , nom ea 00.,,,0 n c-e a. 'ri 1 s u 11 ata. ses, as quais clivam os grupos éster ou sulfato fenólico para dar grupos hidroxilo fenó- li cos em condicSes suaves. A c 1 i vagem biológica, do grupo hidroxi lo sulfatado pode ser efectuada com a. ajuda de uma preparação de enzimas adequada, com componente ac ti vo enriquecido ou de uma enzima isolada; ou ainda um sistema, enzimá-tico adequado p>ade sei’ empregue 1 n si tu, i . e. em que esteja, di rec tamente presente em material biológico vivo ou mor to, por exemplo um m i c roorgan i smo em cresci mente, ou em fase estac ionâris, uma cultura celular, um homogenato de células ou um autolisado cie células. Em particular, os compostos do invento são tratados nume i.: 1 u c -1: o u s u s p e n s a. u a q u o s a o e Pi" 0 f 0 len ι 10 1· a. r- · ρ: i.· n a d a c u π, ur · a preparação, de arilsulfata.se individual, e. g. a ar i 1 sul fate.se de Heiix pomatie, a uma temperatura norma 1mente empregue em processos enz 1 má11 c:os, por exemplo, na gama entre cerca, cie Xo'·1 e 45 L' 0 e de preferência de 250 a. 300 C έ preferida uma reacção f racamente ácida., i . e a um pH de cerca de é a 7. em particular entre cerca de 5 e 6, valor que e ajustado, com um tampão C OniO 5 e j =*. L-íTít -ri S O 1 U C ã O a P r ,;.· X. : ima da. mente 0, 03 a 0,3 mo 1 a ·’ OU,,, 0 I de U-'i é.c i do c a r ".··;, ·· 1 1 1 c 0 0 rgãnico, com. um metal a 1 c a 11 no ou C ΟΓι'ί i { Tf i ci orgám ca., e . g . com aceta to de sódio ou , de pref erênc ia , a.ceta to de pi;'iciina , cana de pH 5, 4) . A proporc-So ca enzima empregue ρχ,,-ό o substrato (hiruima) aspsuda em geral do actividooe da respec t i va prepa.ra.ç So e é geral mente entre cerca os 1 ; 1 e 1 : 100 , cie pref erênc ia entre cerre de 1 ; 5 s 1:20. é: vantajoso usar bad original \

bad or/gjnal^--Ji por síntese pepiidica. A síntese pode ser eíec tuada de modo c onnec i do psr se [ ver , por exemp 1 o , Hoyoen-Wey 1 , vo 1 umes 15/1 e 15/2; Synthese von Peptiden (sd. E. Wunsch}; Georg Thieme Verlag Stutigart 19743 usando aminoác idos adequadamen te protegidos. Por exemp1o, pequenos f ragmentos peptidi cos compreendendo por exemp1o até 12 resíduos de aminoác idos podem ser preparados e depo i s condensados na ordem predetermi nada para dar os polipeptídeos de a c o p d c o! · · o i; t v e i11 o. Uma. „· u t- r a. a o u r *j u g e η i c e n s i s t e na e 1 o n g a c á o passo a passo da. cadeia pepiidica num suporte polimérico (síntese de Merri field). Para a síntese de po1i pept í deos incluindo um radical treomina O-glicoxilado e/ou um radical tirosina O-su1fa-tado são usadas as correspondentes unidades trsonina e/ou tirosi-na as quais já contem tais substituintes 0 e as condicoes de reac ção são escolhidas de modo a que permaneçam iniacaias as unidades giicosi1-treoni1 e/ou su i í a to-1 i r os i1.

Um terceiro método especislmenie preterido para aprodu-cão dos poi ipeptideos de acordo com o invento, espec ia 1mente aqueles que não contêm quaisquer radicais treonina giico.xi.iada. e/ou tirosina sulfatada, utiliza oe modo conhec ido per se as têc ni cas de? D NA recow i na« te . '9 mé todo compreende cultura de células hospedeiras iransforma.das com um vector híbrido compreendendo um promotor opera c i ona 1 mente 1 i gado a uma. sequência de DNA codificadora de qualquer um dos referidos po i i pep t í deos e isol amento dos rei er i dos po11pep t i deo s e, caso se pretenda, conevrsão de um po1ipept ideo obt ido t endo grupos carboxi1 e/ou amina 1i vres num sai ou conversão de um sai obtido no po1i pep t i- deo livra, Ha is especía 1mente o mé todo é caracterizado pelos passos c ompreendendo a. obtenção de um DNA que codifique um polipeptioeo hirui ma oe acordo com o invento, b. inserção oeste DNA num vector.

8AD ORIGINAL

bAL) ORIGINAL

é expresso numa céiuia hospedei ra transrorrnada com este vec tor de sxprssslo.

Os vec tores híbridos deste invent o sso produzidos, por exemplo, através da inserção de uma sequência, de DNA codificadora do pol ipep t-ídeo hi rui i na num DNA vec tor que contem uma sequência de controle da expressão ide modo a que a sequência de controle da expressão controle a referida sequênc i a de DNA. A esc Cilha de um vec tor adequado base ia-se na célula h o spede i ra u s a. d a. n a. t r a. n s f o r m a. c ã o . S ã o hos p e d e i r o s a d e q u a d o s , po r exemp 1 o, m i c roorgan i smos , tais como leveduras, por exemplo dac c ha r omy ces cerevisia.e e estirpes de bactérias, espec i a 1 mente estirpes de Escher i chia c o1i e também Baciilus suotilis, assim como células de organismos superiores, especia 1 mente linhas celulares esiabelec idas humanas ou animais. As células hospedeiras preferidos são estirpes de S. cerevi siae. rep1ique e oe DNA do £m princípio é adequado qualquer vec tor que expresse no hospedeiro se lecc i onado as s e quénc i a. s invento codi f i c adoras dos pol ipaptídeos o a. h i r u 1 i na.. i*· ·>· e x s m p1 u s de vec tores adequados -a. e: xpressão d OS po1ipeplí deos hi ruiina numa estirpe de E. colι bactê nóf agos , po r exempI o der i v ados de bacteri6fago, ou piasmideos, ta is c or*.>o, espec i a. 1 mente , p 1 asm i deo CcdEl e seus derivados, por exemplo PM£"3 , pSF2124 , p8R317 ou P&R322 . Vec tores adequados contém um repi icão comp1eto e um gene marcador que torna possível a seiec-c ao e identif icocSo dos m i c roorgan i smos t r a n s f o r mados com os Piasmideos cie expressão por meio de uma marca íenotípica. Genes marcadores adequados coferem ao microorganismo, por exemplo, resistência a metais pesados, antibióticos e similares. Ainoa, os vectores preteridos do presente invento contêm além do bAÚ

ORIGINAL 1

J

rep>i icâío e de regiões do gene marcador, sequênc ias de reconnec i -men to para endonuc 1 eases de rsstr ι ς So , de tal t orma que a sequência de DNA codificadora da. hi rui ina e, sempre que adequado, a sequência do controle da expressão,· possam ser inseridas naqueles s i i i o s .

Varias sequênc i as de controle da. expressão podem ser usadas para regular a expressão. As sequências de controle da expressão usadas sao espscia 1 mente as de genes fortemente expressos da célula, hospedeira a ser transformada . No caso do pBRõ22 ser usado corno vsc for bi b r ido s t.. co 1i ser usada como mi c roorgani smo hospedeiro, as sequênc ias de controle da. expressão adequadas (que· cor;têm, inter alia, o promotor e o sítio de ligação ao ribosoma) sSo, por exemplem as do operSo 1 ac top-se, do oper-So trip to fanem do operão ersbinose e simi lares, o promotor do gene da B-iac tamase e o promotor do pago PL e outros. Enquanto o promotor do gene da 8-1 e.c tamase (gene β-lac ) está já cor tido no P11 a.ζ>Γπ i Oeu ρ;Ρ'Ρ·.ox.l1 , e.s o u t ra.b sequanc i as ca _ on t role ca. e -'P pes s so devem ser inseridas no plasmideo. Facultativamente, a sequência de controle da expressão ê operac ionaln.ente ligada a uma sequência de DNA codií i cadora de um peptideo sinal que funciona um E. co 1 i que por sua vez e 1 igado na grelha da lei fura cor rec ta. a.o gene da hi rui i na.

Vec teres híbridos preferidos compreendem um promotor de 1eveduras opsracionalmente ligado a uma primeira sequênc i a de DNA c. odi f i c adora de um peptideo s i na 1 ligado na grelha de leitura cor rec ta a uma segunda sequènc i a de DNA cociif ícadors do pol ;psp-t-ídeo reiulm e uns sequênc;. a ·:··.· DNA contendo sina i s de terminação cie transcr icSo de levedura. 0 promotor de levedura e um promotor regulado tal como PH05, ADH2 ou 6AL1 ou promotor constitutivo. 0 promotor

^0 ORIGINAL

·:ons t i iui i vo de iev=dyra e os preferènc i« der i va.do se gene se iíVedíJlG; d 1 vÍ!!iSí'tíT ÍXP"éSSí ! C OfflO ·= } 0· UU COGlT 1 CídO” ·.;·.·; L-·'··'.'· enzima g1ic o 1 i i :· i c a , c omo se j a o promotor co gene da enoiase, g i i c e r a 1 cie i co - -3-fosfaio-desidrogenase (GAP) e 3-fosfoglicerato- -cinase 1PGK), ainda o promotor AOHi e um promotor encurtado da f o 5 f a ia se ác i da PhOS que foi desprovido dos seys Sitio; de act-ivsçâo a montante. é e speciaimente preferido o promotor GAP e seio f ragmentos f une i ona i s começando no nuc ieotideo -540; -255 ou - i ‘58 s terminando no nuc ieotideo -5 do gene GAP e promotores conititeiivos encurtados PH05 comecando no nucIeotideo entre -200 e -ISO, em partecuiar -i73 e terminando no nu·: ieotideo -9 do gene PH 05 A sequência de DNA codi f i c adora, de um pepiideo s i na. 1 ( "sequência sinal”) deriva de preferência de um gene cie levedura codificador de um po I i pep t i deo que norma. 1 men te o sec reta do . 'ião sequências sinal de levedura, por exemple·, as sequências sinal e prep.ro cios genes de i nvsi' ta.se de levoduig , facior n . f © r omona-ps- p11 d ase i KEX 1 t , ” t o x i na .assassina'' e genes reprimíveis da f osf a- · ··.· ;·· Sc i da i ·οη·. 15) o a sequenc i e sinal de glucoemi la.se de Agper- g i 1 1 us í-ι···:·r i . C o m ·:· alie r n ativa p o d em a e r c c:· n s i· r u idas se g u g n c i a s sinal fundiCjâs por ligacac· oe parte oa seg;uência s n a j. ; se presenieí do - iene na tu r s. 1 men te ligado ao promotor· usado (por exemplo ΡΉ05) c ·:·!· pear te oa sequência s i na 1 os uma out r a proc-eina heterol-oga . 5â í'o pr f r : 1':.^ -a c oívií:- i n-p c op 5 ;;_ 4 = p··- ;'u ier.·· pPr·-· c ; i v-0 -2:^2= p i' ·;. c i o· enc-re a ssouXcia sinai e e.g. a sepuencia se a- ·;. i i í o-.- hiruiinc. Gequencias siicciontis, tais ccao eegoenc i as ρ·χ· au si-o c a Os· r as que pais··· c · o - ·”χ)ο ser puxado·” x se S 3 oe ΡΌΟ assaei-its iripac if iças posam ia. mo em ser i nc 1 u i sas • ias c ·::·'· - .· r oOsc • para Ac; li iar o ^í-ocesisaonio preciso se poíscu- 1 · s pe r : u r· so r a t ; Cor···:· a 1 ternaitva, podem ser geraa?.; proteínas se f usõo r on te· sinais ·; . processemento internos que pomaiss fu a j-‘ p r r r. p r -£ μ is in vivo ou in viiro. For exemplo, os sinais se

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processame H Í-O C O 7. em 0 -ί ίV; PcvS ΐ OlêJ ·__ 1 r?" i-'· 0 g, o· qual e rec onh^c i o o po-·" uma erdese P t :·- OãS 0 de levedura sit 0 0·:.; n. as '-rrU-o· r a na s o o 6o1gi. As sequènci£*s s i na 1 P Γ0 f eridas de c·c o rd o com'· o presente invento· são c> se ._· O ;*q 0 · * 0 PH 05 de ls vedura e do gene oa invertase oe levedura.

Uma sequência cie DNA contendo sinais de ternunaclo da transcncSo de levedura é de prefsrencia a sequência delim i isnte d’ de um gene de levedura que contem sinais adequados á termi na -Cao da transcrição e po1iadeni1acão. São sequências delimitanies S' adequadas as c/o gene de levedura na iura 1 mente ligadas ao promotor usado. A sequência· dei imii. ante preferida ê a o o gene o nuο oe .·. e vr,· cir a . 0 promotor de levedura, a sequência de DfvA facul tati va. codificadora do pepticeo sinal, a sequência de DHA codi f icadora do p-o i i pep t i deo da hirulina e a sequência de DívA contendo s i na i s de terminação de levedura são operaciona1mente 1igadas umas ãs C · a j . e . sso jus 1 ΐ1'-·s tca cie muUe a que as SUaS Γ une des no r Γη ai » sejam mant i das . 0 arranjo e tal que o promotor efectua a expressão conecta do gene da nirulina ifacu1iati-amente precedi-

cJ O a ê U! i I a. a? 1. q Ue η ·_ 1 a. s· 1 na 1 1 , c.· s s 1 ’ "* a. I s* Cl e 1- s·)' m I i '· m, v a c· O a. C- r S n s· C I c a c· cfãc iuam a terminação correcta cia tr ansc r i c a·:· e ρο· 1 i acien ι 1 a -cão· e a sequência sinal facul tati va. e ligada π?, grelha de lei iura conecta ao gene cia hirulina de m.ooo a que o ultimo cooão da sequência sinal fique direc temente ligado ao· primeiro codão oo gene coc; ·. f i cãdoc cio pol ipepticco rr r ç; re e ocor ra secrecao do· •pc· i i pep Ί i deo Hiruiina Se o· pccaoiã ·' e a seouencia sinal cenva-"ar cio· genes ci eron t.es ; o· prometen' e cie pra f e r ene i a ligado a segi-emcia sinal snt-O r, principal sitio oe i-scricão· do mSNA e o ΑΪ6 cic· g erra na tuna 1 men te I xgaoo ac· promotor. A - · ·· ;· ·:.· . sinal devera ter o· proprio A Γ6 para iniciacãc· cia traaucão·. A juncas· des tas sequências p. :·· χ ser xec t-uccc p··:··' .meio cie

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o i i godsox i nuc i i o t i dsos sintéticos adaptadores ponadores da ssquônc i a. cio roconhõc ιοοπόο da ufiia endonuc leass .

Aiém da cassete de expressão, os vec tores híbridos de levedo)’a de acordo com o invento compreendem ume origem de rep1i cacão de levedura. Ass ϊ ηΐ, os vec t or e s tiior ic o· x c ·_· m. p - r s: e η o e m um segment o de DMA de; ' 1 V o' Ofj DMA de dois-micron contendo a ΟΙΊ gern cie rep1icacão ou, 3 ‘ir 3 r? moa.r uma. estirpe de levedura sem DMA de dois-micron, DMA total de do i s mi c ron. é preferido este último t i po de vec tores. Os vec tores h £ b r i dos de scorco com o invento contém o DMA de dois n i c ron completo nome forma linee.ri-cada» i . e. DMA de dois-micron é c1i vado num único sitio com orna endonuclease de restrição, o DMA linearizado á 1igado com os outros componentes do vec tor antes da rscirculancacão. 0 sítio cie restrição foi escolhido de modo a qus a função normal dos

genes ΚΕΡΙ , REP2, e FL.P e os sítios O.E I , S TB, IR 1 e IE2 do DMA de doi s-m i c ron seja mantida . Fa c u 1 ia t i vamen te , o sitio de restrição e escolhido de modo a cue o gene D cio DMA oe doi s—m i c ron seja mantido irtac to São sítios de ealrirgo preferidos o sitio mico Patl situado dentru do geme 0 e o sitio único SmaSI situado T em.· ci ca todos os gemem o sítios referidos. de ú a-· ; i r. a;-

De preferência, os vectores hiorioos de levedura a cor cio com o invente· incluem uma ou ·'···'.-1 s espec i a. 1 men te uma.

U U U. ::.· ii! a i. ci r pe! :r f I 1 r. r ré irt t I V a Ξ· P S '"' ~· 1 S V ér X1 i ’ S S ê té i Γ·'· S Γ C X O origem cie replicarão para um no spede i r o betosano, ss-íc laia Escher i chi a___c: ο ϊ. i .

Com m?!’cas genéticas selecc-tvas pa"a ia-scum uuml-quer r.iarca pamtica poce ser usada pai’a hsihtm a seieccao m trans f o·'manc-.es devido ã expressão f enotípx ca do· gene mercado^' São marcas adequadas pare levedura, por exempdo. as que expressem· resistência a ãntiloóticcs ou, no cama de mutantes de levedura bad ORIGINAL f

-J otróf 1 COS : 90 03 s que c omp 1 --·····.:- ·· t-am 1 osoo s do nosoe doiro. d ene s c 0 r Γ05ΡΟ ndentes c ·:· n ferem·, ρ 0 r e a; e m ρ 1 o res i stência ao ξ? θ n t i b 1 o 11 - >: o = d 4 I hiqrOClC 1 na ou O i OOf:; i t 1 Oct ou pr opor c i oo-arn protot rof i a num mu ta n te do le VOOU Γ ã auxotrófic o, P o r ãmemp1 o o 9000 UKAd , LEU2, LYS2 ou TPP1.

Uma voz que a ampl i f i caçêío doe vectores híbridos de levedura é c onven ien temen te feita em E . c o 11 .. coo vantagem s-ão incluídas numa marca genética de E . co 1 i e numa. origem de rsp liça ç a o de E. co 1 i . Isto pode ser obtido a. partir de pl ssmideos de E, co 1 i tais coroo pSR322 ou um piasrnideo pUC16 ou pUC19 os quais contém origem oe repí ícacSo de £ , c o 1 i e uma mar ca gene t i c a de E. coli que confere resistência a antibióticos tais como seja. arop i c i 1 i na .

0 ·; è f o do p a i" a a p -?· r o o o c A o d e v e c t· o r e s h 11 '' i o o s levedura de acordo coo· o invento coroc-reende iiqacâo da cassete de 1 emeou rã s opiiaucíame·' O O 1 f i c a α o r η o, ; · ' t i pep 1- 1 co n te rido miar cas pedi; O O hospede iro o a r t- e r i a π -a e para um hospedei ro bac t

exp r essa o c onn r eti-mjendo um ->·όρ··:· to r ligado· a uma le-ucnc is do Ohã õ: nó i re o · . :t-a gm i u tc-o de D ti A s e 1 e c í i v a s p a r a 1 e v e o ·. · r n e para o i op n s de ; · e ρ 1 i cacto raia leve oura r I ano na. ordem, prece terrn i naoe. . 0 m-ga i smo-s imr;, snedo i r o 3_t r ansf o r mados hosped sequén QuA é o 1 r 03 i ia cie ontroi o vo 1 o i 1 gua 1 ·'·· -m. te c om O )' ca;·! i sro 5 "π·0-:20s : - jni um v e c v 0n iDnco que c ootor-i uma dl ι I : odoro o o um polxpeptídeo h 1 r u 1 10a crj0 orno sequência de controle da ; d JTÃ '3 a 3 3 %. 0

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J

0 processo para a produção dos referidos organismos hospedei ros compreende t ransiormaçSo de um organismo hospedei ro com um vector híbrido contendo uma sequência de DMA que codifica o polipeptideo hl ruiina e que é regulado por uma sequência de c ο π tr oi e da expressao. c·ao orgaηismos nospede i ros adequâ.oos , ρ·or exepip 1 o , os nucroorganismos atrás referidos, espec i a1men te estirpes de Saccharomyces cerevisiae. ft tra.nsforsiscão com os vectores hibri- d o s d o invento é efectuada, por exemplo, c omo desc rito na 1i tera- tura, por exemp1 o para 3. cerevisiae CA. Hinnen et ai. , Ftoc . Na 11 . Acad . 8 c i . USA 75, 1929 (1978;)], B. subtil ι s ( A n a. q η o s topou- los et al . , J. Eí act-eriol . 81, 741 ( 1961.' - ] e E. c o i i . CM. Mande 1 et al . , J. B ι o 1 . 53, 159 (1970)3.

Us organismos hospedeiros preferidos de acordo com o invento são estirpes de 5. cerevisiae que não possuem certas a c f i v i o a d e s o e ρe P1 c i o a s e i- a i s c οπ ,o a c ΐ· i v ]_ cp.ccs de p eg ~· i o ases A, 5b Y, 8 e/ou a Tais estirpes são conhecidas ou podem ser facilmente preparadas através da introdução da deficiência pretendida em um ou ma is proteases no genoma de levedura por mutagénese dirigi da ou d i srupçKo de genes ou substituição de genes Ccf . H. ftudo 1 ph et al. , Gene, 36. (1935) 87-953 .

Guando se conhece a. sequência genóm ι c a c omo e o caso por exemplo da protease yscEb a carboxipeptidase yscY e carboxi-pepti das.e ysc« , o gene da prot-ease genómi ca pode ser tornado defeciivo por insercSo, subs 11 tu i c-So ou delec cão fazendo uso do processo de mutagénese drigida bem conhecido Lver, por exemplo, M. J. Zolier e M. Smi th (198-3) Methods Enzymol . 100, 4581 que envolve a pr&paracão de o 1i godeox i r r i bonuc1eo t i deo iniciados mutagéni co adequada.men te projec tado . Como ai terna ti va , o gene genómi co da protease pode ser substituído por DMA estranho ou o ______ Ti

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referi d o D N A e s t r a η h o p o de ser inseri d ο π i i m si i ι o de res t r i ç a o adequado do gene da prot-esse.

Conforme referido atrás, as estirpes de levedura preferidas de acordo com o invento nlo possuem ONA endógeno de do i s-m i c r on . Tais est i r pes c i r 0 de Sa c c ha romy c es cerevi s i ae são conhecidas ou podem ser preparadas por .métodos conhecidos no campo [ver, por exemplo, C. P. Hoilenberg (1982) Curr. Top. Mi cr o b i o 1 . I m m u n . 96 , 1191. 0 p r o cesse· a 11 e r n a t i v o que se s e g u e para a preparação de estirpes c i r0 baseia-se no· pressuposto que a remoção do plasmideo de dois-micron por um segundo plasmideo envo 1 ve o· e u r. · o n to da d os ag e π .· do· s i tio o u pera baixar as protei nas REP1 e REP2. Esta redução relativa das proteínas REP1 e REP2 conduziria a. uma. inst-afai 1 idade do· p 1 asm í deo dou s—mi c ron endógena.

De preferencia, o segundo piasmideo usado tem um defeito n •a gene REP1 ou não O p oS5M] . Um exer··p 1 o de ta. 1 piasmideo é pDF‘38 que além do gene REP1 não PO s s u i u m a o a s asir u t- u r a s repet idas invertidas ( IP2) . Isto t o ma a sua expressão de um elevado· número de cópias dependente da comp 1 ementacão da proteína REP1 peio pia sm i deo endógeno dois-mi c ron. Ele possui duas marcas selectxvas para levedura. I URAS usado em situações de elevado e baixo numero de cópias CE. Erhart et- al . ( 1986 > J . Bac ter ιοί 6251 .

Uma estirpe de levedura é Ura e Leu foi transformada com 5 p 1 asmideo pDP3S e se 1 ec c ionadas as colomas Ura + . A seiec-ção em placas sem urac i lo (seleccão Ura) dá uma preferencia de transforma·;ão mui to melhor do que a seleccão em placas sem ieucina (seiec cão Leu), uma vez que o gene URA3 é mu i to me1ho r expresso do que o gene defec ti vo dl_EU2. Se 1eccionou-se urna única c ο· i ó u i a q u e f *j i r e ρ· i c a o a ρ· a. r a ρ· i a. o a d e s s 1 e c ç ã c· i_ e u q u e d a colónias de tamanho e formas variáveis. Algumas das colónias mais

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Ρ novam s. d r r 4- r ΓΪ scen·

C Ο I Ó lenta m e n t· e n a. s e 1 e c c

Una mosc-rc* ρl-ío p 1 asm i d tf o pl*F'x;j sinds cresciment·o 1 ento em seleccão Lel-í imp oe comp; 1 eníencar e3oa ma.r c a . ts c-e l-j 1 c-1 rn fac to pode ser expl i cado

Hi 0

0 Li a s η ί íi*. t ΐ e 2 r a s » A . 0 gene Leu2 em pDP 2'_· ebtd mutage n i zado ou o « t 1 asm i oeo n«ío poce complementa r ieu2 porgue ncío pog e aurnent a r 0 ηúmeν'0 de cópiãSj implicando 0 l.4 e 0 p1 asm i deo do 1s -m i cron »~v á disponível (1. e. percidoi P a r a. complementar 0 P r c· 001· 0 OO e REP1. Esta 3 ·_ ·_-* o -> : b i1idadas podem—se d i s t ingui r o. íift^n te . No p r i m e iro cs.b > o cresc ine ni t- *_ m i n 1 η ι o* obse r v a d o c o m d s reter ides colónia, s (como contra o crescimento zero sbSoluto cie c ê 1 o i. cb 3 sem pOr ·ΐ"Ζ' ) mos^c-ra g e esta presente alguma expr essc^o

?an 1 srnos r r os e d e i r a s t r a n s f o r m u s a n BA0 ORIGINAL 1

Assim, a estirpes hospedeira s transf orneoa X- a 1 s c omo S. cerevisiae ou E. c ο I i , de acordo com o i n vento são cultivadas num meio liquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sa i s i norgâni cos. exemp1 o

Podem ser usadas vá.rias fontes de carbono. de fontes de carbono preferidas os acucares assimiláveis, tais como glucose, ma. 1 tose, manitol, írutose ou lactose ou um acetato como seja acetato de sódio, que pode ser usado sozinho ou em misturas adequadas. Fontes de azoto adequadas incluem, por exemp 1 o, ami noa eidos, tais como casaminoá.c idos , pep t í deos e proteínas e seus produtos de degradação, como seja triptona, pep·tona ou extrac tos de carne, ainda extrac to de levedura, extracio de malte, xarope de milho, assim como sais de amónio, como sejam cloreto, sulfato ou nitrato de amónio que podem ser us a dos sóz i nhos ou em mi stu ras a dequadas. Os sais inorgã ηic o s que podem ser usados incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfates e carbonatos de sódio, potéssio, magnésio e cálcio. Fm adição o meio nutritivo pode também conter substáncias promotoras do c resc imento. Substánc ias que promovem o crescimento incluem, por exemplo , m i c ronut r i en tes , tais coroo ferro, zinco, manganês e similares ou aminoácidos individuais.

Ainda, o meio contem, por exempio, substâncias promot ras do crescimento, tais como micronutrientes, por exemp1o ferro, zinco, manganês s similares e de preferência substancias que exerçam uma pressão selectiva e evitem o c resc imento das células que perderam o p i asm i deo de expressão. Por exemp i o adiciona-se ampi c i I i na a·::· meio qyando um pdasmideo de expressão em F . c o 1 i r\ c on tem um gene amp . 1 a 1 adi cão oe substâncias ant· ibioti c amen te activrxs também têm o ef ei to de matar microorganismos conta.mins.n-tes que são sensíveis ao antibiótico.

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Os vsc iores hi b r idos os levedura comprsêndsndo o DMA coííipiito de goís—Miicron (incluindo uma origem de repi icíceo func ional > são est-aveimente mantidos dentro oe estirpes de £>s!££&s!££'íí}2£ãS.-££££y.JLSJLâS doe nâO POSSUam Círculos do 1 S-r·! 1 C ΓΟΠ endógenos (as chamadas estirpes cir° >de modo cus a cui lura pode ser e fec toada em condicôes de c resc imento nío selec ti vas, i . e. num mei o compIexo. Células hospedeiras contendo plasniideos híbridos coo um promotor constitutivo (e. g. A D Hl , GAP de levedura '> expressam o DNA codificador do hl ruiina controlado pe1o referido promotor sem indução. No entanto, se o referido DNA estiver sob o controle de um promotor regulado < e. g. GAL1 ou PH05 de levedura) a c ompos i-c£o do meio de crescimento tem de ser adaptada para. se obter n 3. v e i s m a '< I os de mhNm trans·: r i to , i. e. quando se usa o promo- tor HHU-b de i evedur a. o m e i o de c resc i men to deve contar uma concentraç So bai xa de 7 Z> 7 -z·. T- ·_! I no rgánico p a. r a. a dearep" e s s ã o deste promotor. r-} c U 1 1- Ο Γ a. e ! aC I Ό a. O a U ο ο Ό cl ’... 1 o c η 1 o a S U ο η V' e -0 c 1 ο η o 1 S . ,—i condiccies de cultura, tais como temperatura , pH dc· me i o e t empo de f ermen tecda são se1ecc i onados de oado a pue sejam produzi aos níveis máximos de hirulina. Uma estirpe hospedeira escolhida de ζ__£ο.Ι.ί ou S__rnpesi.Oi.ae e oe profersrcia cui 1; vaoa em condicòes aeróbias em cultura submersa com aguscro a uma temperatura de C i .1 r c a d e ,. V ~ o U ^ U , li -.7 — '' u I η :' c 1 o o ·.. x i o d x o'C- , U V a 1 u r de pH de 4 a 7, cor exemplo a aproximadamente pHS e durante pelo menos 1 u dias, de preferência -até se ore .·;producdes sa t i sfaoo rias de proteína. trs po 1 i pepi i deos de h: rui ina exprsssos palaa células hospedei ras podem ser acumulados dentro das células ou podem ser serrotados paio o meio de cultura dependendo da construcsô do

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geni 0 5 ta OU Γ-ãO mc luids uma * UuSOC I· : i na i .> e

Πospede 1 Γ O vbdGO

Se o po I i pep t· í ciso de hirulina f o r ssc reta do pa r a o meio pode ser isolado a partir dele por meios convenc ionais. Por exeriíp I o , o primei ro passo consiste gera 1 mente na separação de células do líquido de cultura por me i o de cenir i f uga.ç-ão . 0 sob’·'enadante resul tante pode ser enriqoecido em pol ipept ídeos de hi rui ina. por tratamento com pol leti ieneimina de m, odo a. remover a maior do material nto proteico e piecipitacâo das proteínas por s a i- u r a. v a u o a soí u c a. o com s u 1 τ d io e e aio o n i o . dm ρ o -> _ e r i r tnr i q ue cimento em po2 i pep t i deo de hi ruiina pode ser conseguido por extraccSo do sobrenadant-e de ácido acético com n-buta.no 1 . Outros passos de pur ificac^o incluem por exemp1 o, remoção do sal, processos c romatográf i cos , tais comoc roma.tografia oe permuta* tónica, c romatograf ia de f i 1 traecao em gel , c r oma. t ogra f ia de partição., NPLC, HP LC de f ase reversa e similares. A sepe.r a.çáío dos c ons ti tu mies da m1s fura de p !' o t e ina é ta rnbérM ef 0c tL-í^.c·^. po r d i :· 1 .1 i' e, de aco rdo com a c a r qa por meio de elec viOforese *~Γίϊ gel cru e 1 0 c t p cr í o ;Xr5s s e m v e i a -i cu d* e a c ordo com O tí-MidnnO "vOl-i-C· ui ar P P ’ i, - ί cr U cc UI í i a I. cr1 U n a O- -xep , a cI cr x. a GaP c I a O a. , P; * ..* r c r O m a. Soprai 1 " Ob atmidade, por exemplo com anti corpos, especia 1 mente anticorpos monoc lona.is ou com tromoma a.cop.1 a.da.a um veiculo adequado para crometografia de afinidade ou por outros processos, espoeia 1 meπte os conhecidos da. literatura. em princípio, podem ser ap 1 i c a.oa.s as mesmas técnicas usadas para isolar as hirulinas a partir de extractos de H. mani11ensis.

Se o poIipeptideo de hiruiina não for secrecado ou se pretender isolar qualquer po 1 i pepò-1 deo de niruiina -adicional que

Cr Cr.· t- r r J -r· C; a rr X 1 a O _· r? a S C. S 1 U 1 S , 1 . - r . q ·.' -rr _rr Cr 1- Cr : _· a U - i .· O 1 S _' _' intraceiularmenre ou no espaço per i p1 asma i i c o são necessários passos de pur ifi cação sup1emen ta r es. Assim, no c aso do

M bad original ' j

ρο 1 i psp i i de o hi rui ins ter acumulado dentro da.s c é 1 u 1 as , o p r i me i — ro passo para a sua recuperação consiste na sua 1abertacão do interior celular. Na maior par te dos processos a parede celular e primei ro removi da por digestão enzimáti ca corn glucoxidases. Suòsequen temen te os esferoplas tos resultantes são tratados com detergentes, ta i s c orno triton. Como alternativa são também adequados para rebentar as células forças de cisaihamento (por e.-'.emp 1 u Prense A ; p r e n S a “ '' a O L epa 7 ·.’ 0A 1 I-a v d;j c em ès T eras ‘Se vidro. No caso do polipeptideo hi ru1i na ser sec ratado peias células hospede i r as pera o sspsco periρIasmático podo ser1 usado um protocolo s i mp 1 i f i c ado : A proteína he ter ó Ioga è r e c uper a d asem 1 ise célula r por rernocsío enzimá ti ca da parede celular ou por tratamento com agentes quimicos, e. g. reagentes tio1 ou E07A que dão origem a danificação da parede celular permi ti ndo que o ρ rodut o seja 1ibe r tado.

Dependendo do me t odo eiipregue, compost-os das for m u — ias I e 11 são ootidos Ρ ·Λ forma livre ou na forma de s C’. 1 ^ -_r e adi c ... c o:· çH C i oa ; Sã 7 S i Π te \' PO S ou sais com b a ses . 0 compost-o 1 i v s' e pode =· Γ obtido de moo· 1- C onhec ido a pa r t ir de sais oe a. o i c ão - · 7. I O. “ ..· ' S U V e O S a 7. S O e s d 1 o a e a C 7. O a ! u* r Ό e ; 77 t 1 o a e n 7· e a o e 7. 7- s ve 7 s podem ser obtidos a par ti r oos compostos livres por ree.c c ão c os! ã c i dos , e. 9 . c«i os é.c i dos que f ormam os sais a trás ref er i -dos e por eveporacãoou 1iof i1ização. Os sais internos podem ser obridos -a justand‘0 o pH a um ponto neutro: aoe^uado .

7.0: í l: O p I. P O p e i_ p ;7:7.: pp L7 C. P P. P S L'l 1' A:> 3 A- 11 t. O; j 1 Ί Aj 0 Γ A; T u .· Γ,;

As · .· .· hirulinas oe topíso propr leoades rarosiologi^s i mp.or 7 an tes e p p ro· f 7 1 ã t- i c amen t e ou , esp ec i a I men te t.r., fer λ.ρα;.::.· i BAD ORIGINALj

us compostos de hiriâma de acordo cora o invento sáo

— n 1 O .·. U '-.· í ' rr.7 V 2 1 1 ' - ·._ V' T· P P P L.’ 1 Ο τ’ i c’ O τ p Ρ \7r V' :τ’ : V. V * ! Ό’ ·_· c· ·„· fi V S fr * O tempo interac cSss coní outras proteinasss do sis tema de coaguiaclo

‘-.v*.1 Sτ. ΐ . r-i P:..:.::. I I. I Οθ ·_·τ_* O. I. t I VS Ο VΡ· PememeU P O Dd 1 c· . Lie PiodO semelhante não se observam reaccSss de n i ber sens i b i 1 i da.de ou alérgicas.

De acordo com o invento os novos compostos de hireiina Ρθ·_! tm p:or i-d.n ‘.L' ser Íprddub ίο a. p d r d.p11 d. e í—1 r ο τ i i ax i a oe promooses pòs-operaiór ias, terapia de choque agudo < por exemp1 o para choque séptico ou pol i tr aumá t i co ) , para. a terapia, de c oagu 1 opa. t ias, em hemod i a 1 i se e em c i rculacão sa.ngui nea. êxtracorporal . 0 invente· relac iona-se também em composições farmacéu-ticas que contem pelo menos um dos compostos de acordo com o invento ou um seu sal farmacêuiicamente aceitável, facu1 tapiva — mente juntamenie cor·, um veiculo fa rmacêu ti c amen te aceitável e/ou aditivos.

As c omposic ôes podem se r usadas especia 1 mente nas i ndi caedes atrás referidas, guando são aamini sirados por exemplo , pe.ren tera Imente , corro seja. por via intravenosa , · ni-racu ano? , suocuténea ou i ntramuscu1ar ou tôpicanenis. 0 invento relac iona-se tamoõm com o uso de novos _ ο π ’ρ·_· s p. o s oe a c ο p ο Ί· com o invenPO e corri c i c ess τ .a r ma c eu p-1 cas c onpa ndci-os para. o tratamento profilático ··· tera-võup-: co o·:· r.omem e de animais , especial m en i e para a inioicáo da coaqulacão do sangue dentro e ; uo r.jppo hrriidno . h dosagem defende espec i a 1 mente da foraja espec i f i ca de admιnstracno e da finalidade da ierepua ou prof i 1 áxi a . Õ t arranhe· das doses individuais e o regime de adminisrracâo podem ser RAD ORIGINAL]

melhor determinados atreves de um julgamento individual do caso ou doença pa.r t i cu 1 ar ; os métodos para deteríiii nscSo de factores sanguíneos relevantes necessários para este fim são familiares para. us espec. i al i st-as na mat-er ia . uormd. 1 men te ,· no ca.su de urra injecção a quantidade terapéuticamente eficaz dos compostos de acordo com o invento é numa gama de dosagem entre a.proximadsmente 0,005 e aproximadamente 0,1 mg/kg de peso de corpo. A administra— cão é efec tua.da por injecção intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Assim, as composições farmacêuticas para administração parenteral na forma de dose únicacontendo por dose, dependendo do modo de admiπis tração, entre ap rox i madamen te 0,4 e apreximi a. d a m ente 7,5 m g d o c o m p o s t o de a c o r d o c o m o i n v ento . Alé m d o ingrediente ac tivo estas composições farmacêuticas contém também ge r a. 1 meπ te urn tarnpão , po r exemp 1 o um tampão de f os f a. tos, que se destina a manter o valor de pH entre aproximadamente 3,5 e 7 e t a m b é m cl o ret o de sódi o , m a. n i t o 1 o u s o r b 11 o 1 para a j u s i a. r a i soton i c i da.de . Eles podem estar na forma, liofilizada ou dissolvida, sendo possível para soluções vantejosamente conter um preser-v a t i v o a. n t i - b a c ter i a η o , p o r e x e m p 1 o e n tre 0,2 e 0,3 % de és t e r etílico ou éster meti 1i co do ácido 4-hidrοχi—benzóico.

Uma composição para aplicação tópica pode ser forma de Um-V So 1 UC au d.quu S S. , 1 uC e.o uU g d* 1 J Ufiid So 1 Uo au 1 euSd ·„;U SUdPdn = d.·—1 ou uma pomada contendo gordura ou, especia 1mente, emulsionada. Uma compos!cSo na forma de solução aquosa obtem-se por exemplo, por dissolução dos ingredientes acti vos de acordo com o invento, ou um seu sal farmacéuticamente aceitável, numa solução tampão aquosa entre pH4 e pH 6,5 e caso se pretenda, adição de um outro ingrediente activo, por exemplo um agente a n t i - i n f 1 a ma. i ô r i o e/ou um 1igante polimérico, por exemplo po1ιvιηi1pirro1icona e/ou um preservativo. A concentrarão do ingrediente activo é entre apr ox i madamen te 0,1 e aprox i madamen te 1,Smg, de preferencia entre 0,25 e 1,Orng, em 1Om1 de uma solução ou lOg de um gel.

BAD ORIGINAL ’ A

Obtem-se uma forma oleosa de admiπistração, para apli cação tópica por exemp1o suspendendo o ingrediente activo de acordo com o invento, ou um seu sal terapéu t i c amen te aceitável, num ò 1 eo , f a c u 1 ta 11 vamen te com a aoicã.o o e agentes oe i ol ho ps π i l· , como seja estearato de alumínio e/ou tensoactivos tendo um valor de HL8 (equilíbrio "hidrofí11co-1ipof£ 1ico"> abaixo de 10, tais como monoésteres de ácidos gordos de alcoóis po1i-hídricos, por exemplo monos tear a to de glicerina, mono 1 aura to de sorbiia.no, monosiearaio de sorbiia.no ou monoleato de sorbita.no. Obtern—se uma p o m a. d a c o n t e n d o g o r d u r a , ρ o r e >·: e m p 1 o , s u s p e π d e n d o o ingredie n t- e activo de acordo com o invento ou um seu sa.l , numa base gorda e s p a 1 h ével , f a c u 11 a t i v a m ente c o m a a d i c S o d e u m t- e n s o a c i i v o t e n d o um valor de HLB abaixo de 10. Uma pomada emulsionada é obtida por trituração de uma. solução aquosa, do ingrediente activo de acordo com o invento ou um seu sai, numa base gorda suave espaihá.vel com a adição de um tensoac ti vo tendo um valor de HLB abaixo de 10. Todas estas formas para aplicação tópica podem também conter preservsiivos. A concentração de ingrediente activo é de aproxi-madamente O,1 a aproximadamente 1,Smg, de prsferéncia entre 0,25 e 1,Omg, em ap rox i madamen te lOg de base. h 16 m d a s c ο π * ρ· os i c d e s f a r r ·· a c é u t- i c a s o e s c r i i e. s a i r á. s e c ompos i c 6es f armacêuti cas análogas que se destinam· a uso clínico directo no corpo humano ou de um animai , o presente invento· reiBC íona-se iamoém cor·! composicSes is.rmacéuti ca.s e p:rep'ara.cbes para uso medicinai na. parte externa do corpo humano ou de mamíferos . Tais c orapos i c fies e prepa r a ç 0' e s são usadas espoe i a. 1 mente c orno aditivos ani i c os.gu 1 an tes do sangue que esta a. ser sujeite· a. circulação ou ira tamento fora do corpo < por exemp1o circu1 ação isxtr acorpora 3. ou diõl ise em rins srtir ic isis, , preservação ou modificação (por exemplo hemosepa r a c ão >. Tais preparscCes, como sejam soiucSes "stock"ou a1 ter na i i vamen te preparações na forma de d o seger·· uni L á r i a., s ã o s e m e 1 h a n tes e m c ο m ρ o s i ç â o a s p r e p· a r a c d e s r— bad original ’

para injec cS o desc r 11· a. s a. t r a. a ; n c e π t a n t o , a. q u a. nii d a de o u conca n — troccso de ingrediente ac iivo com vant-ssent bassia-se no vo 1 ume de sangue a. ser tratado ou, ma is prec 1 samente, no seu teôr em trombi na . Re lati vamen te a isto deve—se pensar que o ingrediente activo de acordo com o invento (na fornia livre) desac ti va compie— tamente cerca de 5 vezes a quantidade por peso de trombi na, é fisiológic anten te inofensivo mesmo em quantidades r e 1 a t i vamen te grandes e e eliminado rapidamente da circulacão mesmo em concen— tracSes altas de modo que não há risco de sobredosagem, mesmo, por e.xemp 1 o durante transfusões. Dependendo da finalidade especi-t i c a j a o o g e a g e q u a o a ê de a ρ r o i m a o a. r - e n t e cm (d a aproximaGamente 1.Omg do ingrediente activo/1i tro de sangue se bem que o limite superior possa ainda ser excedido sem qualquer risco. 0 invento está espec i a 1mente relacionado com hirulinas, DdA S, ve c iores hibr i dos, orga n ismos η o s pedeiro s t r n s for m ados e P r e c osoos para a sua ootaiicao como desc r i to nos qxempIos . breve descrição dos desenhos

Na parte experimental que se segue são descritas várias realizações do presente i nvento com referência aos cesenhos juntos em que; r~ i P. i T.7 seu oe s e ni; u s esqueme t-1 c us que η! ;_i s t- r am o síntese i r. v i t r o dos genes do; hirulma PS e P18 incluindo a sequência sinal de PH05 com os codões de levedura preferidos. Os 12 o 1igo-dooxinucleotidoos usados estão indicados por linnas numeradas a cheio e a trace ja.do , respec 11 vamen te . P.ig. 3 i 1 us t r a esquematicamente a construção do plasnudeo pDP3 0 . ixAD l___ original!

.... J

f"' - u s i r a

Fig i t. . a μ*a·.· t SXpresísã pDP34/d p . US t· Γ d.-. i;a£ta_24SS£.iaieDii: oe sanguessugas c ongt11 s.gss n.i£iJ:j.iDci.£.lci_.£OsiOJL.i jls;ds.1í! r gut o c o r i em e t o r a m c o i h i

Chi na) foram i riturados c om um honvjgen i za.oo r de 1 Sm i nas . h e x f r a. c ç So f ‘a i e f e*_ c u a. o a c onvo oes c r i r. »_< por Bagdy et· ai . t fhromb acetona rna a a mistura a.g i t-a:"í r- = f')0 V'd i 5 P Γ *rr C Ipl v / y i ·_·: · am ?.gic Iuoig.gos a. Pcv=> t-c*. duranií IS nu n. (1373)D. 90 litros ( j 1 )ncen·, ra- -P-. + *·; Γ O a ” ! t.' ;»Π 1 Π . 1 > Í~l i J. a C{ i na bruta foi bad original

J com sc ido acét ico 0,1 ri e ligada a de lei to 400m1> pré-squi1ibrada UΓ 9! síeriid de FPLC Γcr·. )' Π * c* C I Cí . H e1 ui c ão foi ef ec tuada cor·· á c 1 d 3. r 0 t. i r i"j Cj f 1M a um C r.wdd, i 0*5 0 j ,2m1/m i n e controlado a 280nm

Colherem-se f raccões de 6ml que se testarem quanto à ac t·i vidade com um ensaio de inibicSo da t-rombina como descrito por S. ríao et al. EAnal . Eh ochem. 161, 514 (1567)3. Este passo dá uma purificação de 4 vezes. As fracçSes aciivas foram secas num iiofiiiza-dor, redissol vidas em 2m 1 0,02M histidina/HCL pH-5,6 (=eluente A) c e n t r i f u 9 a d a. s e o s o b ren a. d a n t e c 1 a r 1 f i c a d o ap 1 i c a d ο π u m a c o 1 u n a de permuta, aniomca de fluxo rápido Q Sepharose (Pharmac ia, 40 c m x í6mm;vo1ume de leito SSm1) ligada a um sistema de FPLC Pharmacia e pré—equi1ibrado com o elemento A. A eiuicSo foi f e i ta com um gradiente de passos discretos a. um cauda 1 de 2m 1 /min : 46 mm 0 % 8 (eluente Eu 0,02M h i s t i d i na / HCL pH 5,6 + 1 li Na.CL), 102 min 15% B, 65 min 100% B. A eiuiçao foi controlada a 2Õ0nm e as fraccdes activas foram reunidas e removido o sai numa coluna de Sephadex G50 fina com 0,010 depois 1 ι o f 11 1 zaoas . Este passo dá ·2· uma pur i f i cac ão de 6 vezes. 0 ma ter 1 a. 1 seco foi então submetido á separação de isoiorma s como descrito no exemplo gue se segue. F.xemp 1 o 6 : r‘u)’1 f 1 c a c áo final e separação de 1 sof 01-mas 0 ma feriai soco f tração de Smg/200 coluna de PP HPLC tamanho, AUr 6 2 a r 1 7 _·. uo r . e . 1 „ , t r i f 1 i.íoroaceti co c encenas numa 7 de de acido e a 1 d u 01 dissolvido em água b ides ti lada. a uma /j 1 . Fraccdes de 200 ..ui foram apl ica Nucieosil Cl 6,6 x 2S0mm, partículas d 214nm, caudal Sml/min. EI isente A; 0,1% e 1 uente B ! acstoni tri lo -r 0,06% Controle a 214nm. Tabela de gradientes

BAD ORIGINAL

1

: i | ί 0fVií-:o l π* i n ] > 1 i i i ! j inicial | I 1,- | í 2 i í 4 i : i 18 1 1 1 A A | i c* 1 \ 1 4 6 J 30 j I 51 ! 1 1 l~i O i i i 54 j 10 i I iT -1 I 1 .·, I t i I_ ' . 4. V ί I J

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J η τ.. e i i 'r *=? C í i v L rV '1 -r·. 1 L-her-i Η P‘ V Θ.:

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X r rt-JU ΐ·«=?!Ϊί <TÍ

t . í“. t J 3 ( 1 13 A D ORIGINAL ,

.-ί . r u ι ι n a l=í j-. i 1 c- ! a. Tri c orn a. c ι o l. i c i ·> i v i d ui de :>n endopr L. r,i luO ui A p ó : hora a. 'r ·! h 1 li ana 1 1 '

Knecht· i. S L-i P Γ c\ y bad original \

I fra 1 1 i 5Γί'ί0ηΙ o PS 0 1 1 4 i ! í I Asp r + Asn 5 < 5) 3 (. ') í i | G1 u + 61 n 6 (6 > s 1 7) | 1 I Ser 3 13) 1 ( 1 ) I ! 212) 1 < 0 ) * | j 61 i 51 5 > d 1:) ! i j Ala. 2 ( 1 ) o C 0) j J A r g 2 12) 1 X C 1 > I { i Pr o 0 (0) *; 13) f t j Va 1 11 1 ) 1 ( 1 ) | í Mei t 1 ( 1 ) o (0) i 1 j Ile 1 ( 1 ) 1 X 11) | 1 Leu 1 0 < 0) 1 X 1 1 ) | í Fen 1 2 ( 1 ) 1 X 11) ! 1 I Cis S (5) 1 11) ; 1— UI 2 ( 2.) 1 ' » » 1 1 { Í_J ·. ϊ Λ ··. ί \ 1 ι 1 T í r 1 1_ 1 1 1 ) 1 X 1 1 ) ί 1 1

Os valores entre parêntesis derivam dos r cise S.o 1 ve r exemp 1 o 4g )

J ia d rj

bad original ! ο \

í Cj 3. G L.-Í Γ 3. η T.· tr c-i. ilOlt-0 cA •2· / C. íjs f ragríientus f o r a nu 3 epa F'LC e a na li J Ί-· — i i - *' *-’ ! P > · . r ; cr ·_ P \ = ·_- * ^ : | f r agmento 1 P18 1-13 14 — T- C ;Γ·νΓ« C ;“« C íT C T ·_ /· -62 í 1 i j Asp + As n 2 ( 2 ) 4 ( 4 ) 2 ( 2) 2 ( 2) 2 ( r | 61u + 61 1 η 1 ( 1 ) 2 ( 2 ) 3 ( 3) 4 ( ,1 > 2 ( 2 > í i j Ser /' O ’l 1 ( 1 ) 2(2) 3 ( p ') 1 ! I i Tre 2 (2 > 2(1) a 2( i ·τ· 1 } í 61 i 1 1(1) Δ ( 5 ) 2 (3) 2 ( 3) í j Arg 1(1) 1( 1 > i í f Pr o 1 2(2) 2( 2 ) i I Vai 1 ( 1 ) 1(1) 1( 1 ) 1 i j Met 1 ( 1 ) i i j lie 1 i 1 ] I X ) } I I Leu 1 ( 1 ) 1 ( 1} 1 ! Fen 1 1 (1) 1(1) 2( 2) i ! Cis 1 ·'· ( 2 ) £ ( 4 ) 1 1 ! Lis 1 2 ( 2 ) 1 C 1 ) 1 ( i ) 1 [ 1 ! His 1 ( 1 ) f t | Tir 1 2 ( 2) } 1 1 m . \ λ j. '_J ι ^ ·—!*'.·! , . _ _{__ _.j__ _j] t Π C 1 cr. C 3. O \ V cr r txempio 4 3 ' · isiduos Tre 46 t ! 1 λΗ j 3 Π ·$ O 0 p Γ 3 C 3 ri f í Ί C 3 Γ cr 3 ui i a do ~7 Λ Λ f Ή* ± p p 4A1 | p _ bad original 1

d3db _1 P6 37-63 + *"*íV A C 3406 _í_ SNAc -λ. s 3 1 f a. t· o 3488 ,1 + SN Ac s 3568 c + SNAc + s + su 1 f 3634 4 -í“ SNAc C; + f u c o 3714 C( S,M Ar .A. S + fuco

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f) Constantes de inibição t r omb i na-h i r u1i n a o de a.s de i SM S h ousa 1 (dor da (w/w i • ·.* cr.

A de ter o i nação cor;· alta- ir omb i na humana de acordo cor·! o ntè iod< •3. R. Stone e J. Hoísieenge CBiochemisiry 25, 4622 (1586)1dá seguintes constantes de inibicAo K I i

PS: K.= 58 ± 2 M i

PI8; K.= 7, 8 ± i PM S > Análise da. sequência das hi rui i nas PS e P18 A sequência de a.m i noac i dos foi determinada pela degradação Edman e.uiomá t i ca em fase sólida da. molécula iniacte. reduzida alquilada e de um seu fragmento C—terminal.

Redução e a 1 qu i 1 a c S.o de h i ru 1 i na PS e P18 ! 50 cg de proteína f oram dissolvidos em 250 ;j 1 de tampão pH8, •=uan i d í na /HCL , 0,50 Tris, 0,2% EDTA) e Smg de di ti o irei iol . A mistura de reacc-Ao foi ga.seada com azoto e mantida durante a 75° C. Em seguida adicionou—se 8 ,ui de v;ni!p;rid;;e e agi t -se durante 2n no escuro. A mistura de reacção foi removido o por ti1 trarão em gel e seca numa centrífuga de vácuo. 0,5 nmo1es foram sujei tos a análise da sequência num sequencis de fase gasosa (modele· 477A e analisador PTH modelo: 120A Applied Siosystems> de acordo com o protocolo do fabricante. : -5 r es i duos podem ser homogeneamente sequenc i a.dos . F ragmen tacão de Frexak i s-('ρ i r i di .1 ei i i ) —PS com endopr o te i nas Lvc Digestão durante a noite a uma razão suos t r a. c to-enz i ma de 20:1 em tampão acetato de 4—etiimorfo1ina 0,1M pH8, 1 à temperai p '«'····’—

RAD OPIf5IM4L ambiente. 100 pmo 1 es do fragmento t-terminal dá uma seq:.'énc is honiogênsa até ao resíduo 62.

Fra.çimentação de hexak is-(piridiletil )-P 18 com brometo de c i onogè-nioícf . Practica. 1 Protein Chemisiry < A . Oarbre , ed ) , J . Wi 1 ey and sons 13803 e com endoproteinase Lys-C dá fragmentos C-terminais s o b r e p ο πiveis.

a de P do MPY T AC TEdGdNQC IC E G N D V C (d Q d Η! N C U1 F DSbtíkKCVEõbGT ^ R K P Q N b G Q H 0 F uP IP — S0.-,H ! í_ !_ I i__

PI8 VSYTDCTSGONYCLCGGNFCõOGKHCEMDGSENKCVC-õeerPKRQT^SGPSOFEEFSLO-DIEQ onoe TT e treonins ϋ-gl i coxi lada. conf orme evidenciado pela ΐτ*. n a. 1 1 e O o -r-./il 1 η·-' a. 1 d o a? e t-a o o s o o eiíVo-L t relfie r Γ 1 a Ο ο ί 0 o. ^ a a (ver Exemp1 o 4e>.

Exemplo 5:Remoção do grupo monoéster de sulfato da hirolina PS A a.c ti vida.de biológica foi determinada a partir da inibição da. tromoina, cuja a.c tivida.de enz i má t i c a é por sua vez determinada usando o sob st re.c to c romogéni co Chromc‘Z ym TH rum procrio da Soehr i nger , Hannhe ι m , Wes t Gerrns.ny, para de ter m i na c ão de trombina

O Cô ti ! ri.jrj ; p,; j dó 5COi'dO COO ãS d I PÕC 1" 1 ZÕ3 í ΟΠΙΟ! 1005 COO O preparação teste.

Ar i 1 so 1 f a ta.se (AP: 8) de Helix pomatia (um produto da Bceimunger, Mann.heim, West Germany), S lU/mg. bad original l· ,·

\

) t c í* r-,

tar§‘o ;· 1 ') F- :<per i^nc ia pre*imina r /ΖΓϊΑΓΑ i^rrondtSu d-* c •r . n r pnf.rsr % i - óptima os hK - t Λ i C« ]' ÍDÍ Γ Λ Γ A !Υ;—Αί-j A Ά A A O uintes so iucdes stock; (A > s o 1 u c a o de nirulins Pò teηαo U ΠΊ 3. C Ο Ή C 0 Π t- P 3. C *3. O de emg/mi, obtida por dis solução, de hi ruiina P6 na solução (C) ·. L-· ) S O 1 U Γ ã o de arilsuifa C'S.S0 C ΟΠΊ uma concsnirscao OS 1,2Smg/m por mi stura de !2S pa r tes da suspensao comsrci ai com 100 Partes da soiu Γ ,§Vj ( C ) r- ) solocã o tampão; solu f— «1 1 , — a 0,1M de acetato A-, pindi- Π3. , Pm c: λ > *+ . bad original ^ j \ Λ ί 2 ·! í~‘rοc e55ο preρara tór io 15 partes por volume da solução A foram misturadas com 10 partes por volume de uma solução B diluída, cuja concentração óptima ma is baixa possível de cada uma das soluções foi determinada na experiência preliminar e ajustada por diluição da solucaô "siock" B com a solução tampão C. A mistura, foi incubada a 25° C durante cerca, de 30—50 minutos, aquecida. rápidamente <.'e. 3. nas condi- c S e s de esteriliz a. cão reiãm ρ a g o > a t é 10 00 C e íniedia t a m e n t e arrefecida para desnaturar a enzima de dessu 1 f a.ta.ç ão . A mistura de reacção CM-Sephadex ca. ti ónico equivalente, caso se deseje após concentração da mistura de reacção m vácuo à temperatura ambiente de acaixo dele. Se necessário, esta separação é repetida até se obter dessulfaio-hiruiins PS com a pureza pretendida (determinado e. g. peio teste inibidor com trombina e/ou análise de aminoác idos > . O produto na for Pia sólida foi obtido po r liofiiização das correspondentes soluções (eluatos). De acordo com a análise de aminoa— eidos ( po r pro teòl i se C-terrni na 1 > o produto puro não possui 0-su 1 f a to oe tirosina e apresenta toda aactivids.de da hirulma P5 no teste de ac ti vi dade inibidora em trombina (e. g. com Chromoz/m i P j v ?.“ r a l r a s r .

rT^WoflfTf^ÔP numa rimos r =Tí¥Si de...3 eρ n a d e x ím· oU uni o u t r o p e r m u t a d o r 3P.; Remoção de resíduos de açúcar 0-1 igados às h i rui i nas P3 e PÍ3 200 ,qg de po 1 ipeptideo foram dissolvidos em 30 .ui da mistura de ani sole/ãc ido tr i f luoromeianossul fonico C 1 m 1 : 2mi "> preparado oe ’ l. a e fiia U t-1 d e ;.Jr o; n 0 e o i~io r as e t-- qe: 1 o — a!—-Ua C _-a 3 _ / „ -..- -..- ocasional. Pm seguida a solução foi neutra 1izada pela adição oe 300 ;.i 1 de amónia a 2,5%. 0 anisoie foi r emo v i do po r ext rac ção com 20 .ui de d i c 1 orometano qus. iro vezes. A remoção foi controisca com o tempo de especirometria de massa. A separação do peptideo livre

BAD ORIGINAL u i ι na r j.

bad original

—xerviP 1 ο 7; Sint-^sg i n vitro dos ganes oa h i r ui ma Pb e da nru li na P 16 ccm codSes preferidos da ievedura

As sequências codificadoras das cassetes de expressão da hi rui ina foram projec tadas com codões preferidos da levedura CB. Ha 1 I ; .J . 8iol. Chem. 257 ( 1582) 30263 para garantir tradução óptima dos mRNAs da hirulina. As sequências codi f icadoras contêm a sequência sinal de- F'HO-5 furtdida na mesma grelha de leitura á sequência codificadora da hirulina P6 e da hirulina PI 3, respec11vamenie. o e sx e rertios -5 coe uuhs s ι π idi-1 cos contêm os exoremos coos i vos o o sitio oe restrição EcoRI. No extremo 3'o codSo de paragem 7A3 é imediatamente seguido dos extremos coesivos do sitio SamHi. A sequência do fragmento de ONA EcoRI-BamHÍ de 251 p:b da hirul ina P6 (HTI-Pb) está apr esentado na Fig. 1. A sequência do fragmento 0 3 DNA Eco P1 —E-a mH í de 243 pb da hirul ira. PI .3 ( H7I-P13.) es tá apr esentado na F i g. 2. As Figs. 1 e 2 também indicam a estie iêp? i a pa r cr cr*. 3 1 Pr t ese ir. vi tro de DNA de cadeia du»I a. 3 intetizõram-se 1 2 ol i godeo XIΠ Ucie Ot ideos usando o método fosfo·' a···ida voCrc H . a r ut fisr s , en?; Onero i cal and Enzyma 11 c bvnthêsis of eene rraumenta (H. G. G-3 3 3 op o A. Lang. Eds. ), Verias Chéaié; W e i ire i m . ml num s mset i j.Zrr 0;_' Γ f—?;—· Iied Siosvstêm s Modelo 3308. A SrdVLÕnC 1 P cos o 1 i gonuc1eo tricôs ;n ei í. V 1 G -cd X S v zr ob p1:' oJ S «rJ ' f ·.* '-1 LJ .d ;~· Ά F i g . 1 e P ig 2 . As sobre mosicdes sbo 30? repecern Os oiigonuc ieot i deos 1 i o f i 1 i - z ·3 o o s f o r a m redissol vidos em SOmN Tr is-HCL pH' 3 , 0 nuno co nc ei- i r a cão de 1 0 pnioies de cada um do s o 1igonuc1eo i i d* O 3 . 0 3 O 1 i qo- ; ' '.o 1eot i deo s f o r am f os for iiados em 20 ;il de 2 orno 7 ris-HCL pHb , 0 ; 1 omH hgCL iOmn Na CL , -3 mo DT7 ; cu a r,·, r] A ’’ a- e b cniadcc s de po ; j. nuc 1 eoi1 oeo-c i nase f £:cehr i nger ) durante 1 h a 57 β f:. Apds .50 Γ· i 1 Π 7 empera fura amoien f cr aV m i s tu r a. foi aquec i o a. durante 5 min a p.p 0 num ri.; nhco--ma r i a e d Cr x xada. 1 e · i c a me n t-e a té d c-emper atura P PO iene e ourante a noite A ÍV; is fura de ol igonuc la· o ... i I eo a e! ι: P:... 1' e 1 r:* do s Hi enfão -guardada 0-i'f ge 1 o . ---•ΚϋΤ’Τ pniom /\

•a P‘ 1 a smideo pUC i 9 ( Pio 1 aos "> f oi tota 1mente c o r bc oft i e BamHi . 0 fragmsnto grande de 2,7kb foi ISO lado preparativo de 0:, t-% oe aga r ose. 0 DNA foi recuperado po r '0a.Ou _ uní num ge1 eiectroer·! D£tu e Η,.,0 numa mo 1es oe f ragmento se de T4 eleição, plí"i ficado por c roma togra fia de perniuta ióni ca precipitacSo com etanol. 0 DNA fox redissolvido em concentração de 0,4 pmoles/ ;jl . 20 ,ul da mistura de o 1 igonuc 1 eot·ideos empare 1 hados (10 ρ cada um dos o 1 i gonuc 1 eo t ϊ deos 1 —.12), 0,4 pmoies do £ c oR I -ÍsnjH I de 2,7Kb do pUCl 9 e 400 unidades de DNA-1 i ga (Bioiabs) foram incubados durante 16h a 15° C.

Usaram-se amostras de 10 ui para transformar células -f“ -f- cornpsienieb h-_. Coli JMi09 ca As células rora.ni semeadas em placas de LS sup 1 ementado com 100 ,ug / ml de amp i c i 1 i na, 7 ,ug/ml de isopropi i-í3-D-1 i o-galac topi ramosido ( IPT6> e 30 ,ug/ml de 5—bromo—4 —c ioro-3-i ndc> 1 i i—8—ga i oc tos i do (XGAlKu 12 colónias tr ansí o r me. das brancss resistentes â amp· i c i 11 na foram cultivadas i nd i v i dua 1 rnense em meie· LE· contendo i 00 .ug/ml de amp i c i 1 i na. . £'reparafH-se DNA de pòesmxdeo pelo mèfouo de Ho I mes ei· al. [Anal, Siochem . 114 ( 1981 > i 9 3õ e anal isou~se pela digestão com as enr imas de restrição EcoPI e BamHI de 2 51 bp ou 24Bpo foram a x nda ·_ · · a i. 1 S a U ..· s x u!' S *.r g U e n c 1 a c. s u O e X N a! e Ti i a ·" ·. Cr a. s a s c a O e las , V.·· Γ, ,· c ± u · e oe Cada. cum i·. sreguenc ia c o r r c c 11, em a·, mu as as c s. o e 1 a s oe cr '· m rai seiecc icnado e ref e··' 1 do corno pUCl9/HTI-P6 para hirulina P6 e paOC/H Γ I —P13 para hiruiin-· P10 rcspec 11 vamen t-e .

ruprcplcr 3 ; Co-ns truc-fo do ρ· 1 aeiçu deo pnJuE-20 7/ GAr’r L~H~ I c onstitu-xidrogemase P-j uBBO ··’/ cr a·· a L —Η ; i —Pfe o uri! pi asm ide o oe i eveour a ma·',;, a expressao oe hirulina. ΡΈ sob cr controla oe um pramotar fivo curso do gene da gli ceraldeído-3-ίosfato- -oe

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(«iAPuri } cie levedura. A sequ^nc ia. codi f icadora f Η ΓI -5-1¾.) de hi ru-1 i na r'5 consiste nos c o odes piefendce de levedura. 10 ,ug do plasmideo pUC19/HTI-Pó foram digeridos com as endonu-c lesses de restrição Ei a mH I e £ c oR I . U í ragmento £ c ort I —b'smH I de '25 i pb foi separado dos outros f ragmentos de DMA num gei preparativo de 1,2% de agarose. As bandas de DMA foram coradas com brometo de etidio e visualizadas com luz Uv a 360nm. A banda de DMA de 251pb foi cortada do gel e e 1 ec troe 1 u í da em tampão TE-E 0,2 x ( TBE ; SOmr! base Tris, 30 mH ácido bórico, 2,5 mil EDTA, pH8,3 f durante 45 mm lOÕmA. Após alteração da polaridade durante 4 5 seg, a solução de DMA foi colhida e aju stada a 0,15M NaCL. 0 DMA foi absorvido cr 1 00 ·,. 1 d o permutador idnico DE52 (What-man) e eluido em 400 .ui de tampão de alto teór salmo ( ÍOíiiM Tris-HCL PH 8,0 , 1mH EDTA > 1 , SM NaCL >. 0 DMA foi precipitado c om etanol e r es suspeirso em 0 numa co ncentracSo de 0,1pmoies/ 1 . U plasmideo p JDt;2f>//oAr E L — HlK iPedido as ρο ter te

Europeia n2225 632: > contem o gene sintético para dessul f ato-hi ru-d i na ( baseado na prsferlrc ia d* uti 1 ização de coddes de Ei coi i ) f und i do na mesma grei fia de leitões com a sequência. sinal da íosfai ase aciaa PH05 de levedura. 0 gene ficou soo o controle de um promotor cons ti tuti vo cubo da. gl i cera 1 dei co-3-f osf a to-desi -drogena.se (6APFL) de levedura no vec tor vai-vem pJDi3207. 10 ,ug do -- 1 asm i de o pJLLfÕi) 7 /d A PP L-H í K foram digeridos com sall e E c ort I . U f ragmento salI-Ec oP1 de 478 pb contem a parte 5a. 1 -Sam do PÍEE322 e o propoto r 6APPL . 0 fragment o de D-NA foi isolado num gel prepara~ iivo de ij , % oe agíro se, e1e c tro eluido e pur i f i c a do ΡΟΓ c r ·.: ····'·. -. · .· ·· gra.f i a ÕG 0E5 .•2 br P r 0 c : p i t. ^ r 0 o C om eta no i 0 DMA r o i ress oapenso em H../0 gogo c ΰ n c en t ra c áo oe 0>, 1 ρ m o i e s / ui ,5 ug GO o JBB 20 7 / UpPS L. —Η I< f o f ' G i d i ‘210 r i d? 5 com 5a11 e •8 a. mH 1 . u f rsgment uf vac t.o g r a ride de β,7L B foi i 5 O i O. GO como descri r.- a. i- r s r- ^

BAD ORIGINAL

. íi. ΡΠΊΟ i 03 GU 7 P dQí-!!^Π t-O P: P ΟΡΟ 7-*_- P O c* i i tC S_'K I }.jtr ·η· / G P;l_! , G , G P;íTfO i

.—l "*· +" y\ .·» <·.·. . v*\ {· .—. C. r· EL' T ΓΖ1 —. r.·. LJ T .-»4 . .* C. J! r~. í—. . V-* + —. v-\ ! , —. —, f— i i j. r— t . T *—'·-· f ? =*. Ϊ f ·-·_· - *-.·Γ\ λ u."jr. '!?· · i „·=· ·_· J. f-·!-.· L ·_· s · vti ·_·*_· <r*. =?·—·-<·_-·=·»;·. j. c< 5 i Hd : ne s1ntêi i co da e 1 evedurs .) e v-' ; s e a} ±/j j. «_ie pi e 2 0 (.> u n i d a d e U π'? e. e m Ci s t· p o. g e i j; p pfi e. P C é i L.-í i e.s c O 7i'i! í r a Pi '=» 7 Ο Ρ Γί ί O. d 0. S re 0.1 Fr) ente em mei c* ·

h j* Γ U J. i Π ct Pt· i P í i r“ O C Pi '_J 3 C OG^bíS 1 FTO o 1 es do f ragnient Ο V ci* C • ΟπίΜ T« í r-.ur-l nU7 C f 1 i I IVL. t- ·- ! ' ; '-· ; 1 OmM de D ίvh 1 1 go.se oe {4· ( B i o 1 im i; 1 da mistura de 1 i ga.c ipete ntes de E. coli HE; i o P1 referi dos Ge 1 tr1 Vtr dC-í P Ό / 0 Ό , i P1 ΓΐίO i θ 5 Go t P O. :Pfi%t0n G O V0 C 7. O P G0 Ό ; / r·. o

f OPcífi! 1 i gâdo DTT , IrnM ATP G55 2 nd i v i doa 1 me π te ero meio LB contendo 100 ,i;g/fnl de emp 1 c 1 x 1 na F' p ^ p e. p i„· L-í z> e ΟγΊη de ρ· χ ρ.·^>π· i oe o p81 ο m e t ο ο ο* ο e Hoifiies et e.i ·. si-jppe ) (i gestões f-j ·_> *- i ·=* z-rr, de 1 I /H i nd 1 11 . Um c 101 7/ )C'---pi7 /Λ·ΛΕΓΙ _UT T _Π'^Γ — v / / Qm 1 1__ f · r x 1 _.» M. .•»ma consirucdo análoga usou-se o fragmento EcoRI— Barri Hl de ii4S P*t! 00 gene s i n ae t1 c c> o a. η 1r u i i na. H1 ·_· (RR i H1 H) . R m γ 1 ene i s ci I a. R ci f ci i d as i g n a d o p .J [) £: 2' 0 7 / G A PF L.—HTI — P1 _·.

Exemplo d ; Construcáο d·.· ρ 1 a.sm ideu p JD207/l·1 H05( —172 — ri Γ í — p>

BAD ORIGINAL ^ j

ι a s i n o í^j c a * i a SÍTi i

PH

H t C;

t-E c o rei o r Γί! VOS d f" 1' aSf!!1- t j. V »*-· prtíenc η i g»: n L*f π t cí r e ci c ç a o c o nj ‘ P O i I Π M; íe Kienow ( 1 íj)l . G c*. *-j 0 / de Dí-!h 1 em 800 j.j 1 de 60 Γί'ιΠ Trls-HCL r-.u 7 C i /‘ir.. Μ M,—.1 ,ΑΛΤΟ ; Ι'-Οϊί/r dri 1 1 dCTP, dGTP, e TTP 0, i mM C ctde GLjÍ Γ ante 30 r» t ui a. t e πϊ Ρ8Γ5. x.· Lrí r ambiente. Após ext racc~o c o ifu feno 1 o DNA f ο ι prt/c ipi ta. d o c o e t a η o 1 . 4, 16 ,ijg do adaptador BamHI (5* —CGGATCCG-3J , Biolabs) foram fosfori lados em 100 ul de 60mM Tris-HCL pH 7,5 , lOmH ngCL._, SmM DTT, 0,5mM ATP e 18 unidades de polinucleotideo-cinase de T4(Boe- C a rnistur hringer) durante 4 5 min a 37° C. Após 10 mm a reaccão foi arrefecida lentamente até â temperatura ambiente. us o i 1 5 o n U C 1 e c* t· ι d e o S a d P t a d r e S e Tf, P1 a. r e 111 a. d s f o r a. m g U a. r d a. d o S a n ^

ΠΛΠ ORIGINAL ^

. > Τ Ο 1 digerido c or.[! ir. c ,-, ρ T e Hi J-J.-Í τ T 7 j’i f ragrm i~ n t-o E c oR I — K i nd I 11 de E-32pb 7 0 1 1=OI a do co ΓίΊ O d esc r 1 t- O a. Ι· Γ -¾ s . 0 τ p a. q ΓίΊ e n i· o o e o N A c o n t e m a. -eqiénc i a s ί na 1 de PH05 f und i da. ne me· sma. grelha de le :tura com a sequénc i a codif 1 C c Cim P da hi ruii na P6 e o fragmento d 0 ΐ-0 Γ ΓίΊ 1 nd v ã JIj cH V Γ 0 1Ί3 cri cão de P !“} *_ ·Γ< 0 F‘ I 0. r> fil i >Ij 0 *_· ρ J D E:207 / Ρ H 0 5 ( Ξ co)-HIR foi cor ta. d o c o m H i ΠΟ 1 II e t> ã. Pt) H I . I so 1 ou “58 Ο Τ P ri0Γlie m t-O V 8C * O P rj 0 6,6Kb. 0 fragmento BamHI-EcoRI de 172pb e o f ragmento EcoRI-H í μ ο I I x as OU -C p· o, u , Ο ρ-* γιί o its de c cies e O > ι pmo I es dc* τ r s. gmento vector de 6,6kb foram ligados em 10 ,ul de 60 mH T r i s-HCL pH 7,5 ,· 1 OroH Hg CL..,, 5 mH Dí T , i rr /! *1 HTr e 40' 0 unidade s de DMA-11 ga. Se de 14 ( B i o 1 a b s) d u r a n t e Sn 0 15 0 C . A 00 pi de celul c*. 5 £ . c o i i HB101 competentes para a 4- ra. nsf erma. V ê O í. ratadas c om cã leio adi c i o nou-se u m ,u 1 d a. m i s t u r a. de 1 X i gação.

12 colónias f vs Λ nsformad as resistentes à aoipic 1 1 I Π d Τ l-· P 0 ΓίΊ cultiv Ga.s 0πί m81 o LB contendo 10 0 ,*J0/ ΠΊ I 08 0.fííp 1 C 1 I 1 na.. Preparo U — 30 Õ ría=i ρ l Α·=;η·} £ H&r: 0 ana1isou -se por digestão com B r.^í-i 7 ^ J J /Hindi I ba lace iοποί'* se c o ia os ί p a. ρ mn co3 00 r e s t- r i c ã o esperad ripíianr.:J-s 0 P ,···, ν' Ti ;c: f) 7 / pp.-jp (' — 1 7 Pi ) —f-jT 1 —P S ragmento EcoRI-Ηι ndí-I I de 629pb do pJ0S207/GAPFl-txernp 1 o o* ' τ oi usado numi.-\ lun51·ruv ?.!id ioga r e s u. 1 t a. n d ο η o pias m í d e ο ρ · J 0 £: 2; 0 7' / PH OS ( — 1 72;)—HTI — P18 .

Exsmp 1 o 10 ·' C o n s t r u c S. o d ο ρ 1 a. s m 1 d e o p 0 p 3 pi •isnn r- ,-i l ,,-l i ! 1 i í ! C*. p< c-<. "i' ·_! ΓίΊ y c e* s C 0 r 0 V ί S 1 Cl dd 0 01· i r pe SC . A Hf 7' ,·-! 3 / r,·. T nu 0 e 2 y rn o i v a. s e i 100 000 .IP i oa 7 ^ r /^4 digerir as par ;H 0 -r; c 0 i í j Ί a r00 ieví?dura a. partir >: células foram incut

BAD ORIGINAL 0 s e s f e r o pias t- o s fora m í 1 03? C Π"· OÍJO a 2b. Adiccionou-se e n t ê. o EDTA para 25mM, brometo de etidio pero Img/mi e cloreto de c e s i o para uma densidade finai de 1, 55g/ml . 0 DNA de p1 asmideo foi separado do DNA c rornossóni co por u11ra.c en t r i f ugacSo durante 42 horas a 42 000 rpm a 15° C. 0 DNA do plasmideo 2 sucron foi cortado do gradiente com uma seringa. 0 brometo de etidio foi removido por extraccSo com isopropa.no 1 saturado com NaCL e o DNA de p]asmídeo foi finalmente precipitado com etanol. 0 DNA do plasmideo dois-micron purificado foi então linearizado com Pstl e clorado no sitio F‘stl de pUC19tJ . Norrander et al. , Gene 26 (1963); 1011 para dar o plasmideo pDPÕl. 0 p 1 as ni ide o p · J D B207 foi digeria o com as e η z i m a s d e restrição ΚρηI e Hpal. 0 fragmento resultante HpaI-ΚρπI de 0, 55pb contem a junção entre a sequência de 2 micron e o promotor defecti vo do geπe dLEU2. 0 plasmideo pUC7/L£U2 contem o f ragmento genómi co de levedura Xhot-Sa 1 I do gene LEU2 CA. Andreadis et ai . , Ce li 6_1_ f 1982 > , -3161c ionado no sitio Sa 11 do p i asm i deo pUCZCJ. vieira e t al. ; Gene 1_8 (163:2), 2531. 0 plasmideo pUC7/LEU2 foi cortado com Κ’ρηΙ e Hpal. 0 fragmento Kpnl-Hpal de 4,-25 kb foi ligado ao 7 r a. g m e- n t- HpaI-K !pa. I de 0,5 οκό de P-JDo 2 0 7 Isto resulta no piasmi— deo pD-l-'80 onde e t o r i gina 1 do i s íTi i C ron/dLED2 tal como no P1 asm i deo pJDE-20 >7 foi col O C τ* Ο Ή O O I- O 3 do gene LEU2 com o seu te rm i na ido- r cor-pl et. o. pDpõ 0 f o i d 198" i do com HpaI e 8a1i e o fragmento de i ,85Kb contendo o gene LEU2 c omp 1 e to foi pur i f i : a. d o a c 1 credo no fragmentei Sa 1 I -Hpa I de Sb 7kb do plasmideo pOrG-1. 0 i a->m i c-ro r cc uitants pDS-33; ( ve; ' F i g . 3 > , foi 1 ineari digestão pare i a i c o m HindíI I na presenca de 50 ,ug/m 1 de de etidio lM. Oester lund et ai . . Gene 20 í :1682) 1211 c o m o f r a g m e n t- o HiηαIII de 1 , 1 / k b contendo o gen e URAS LM. Rose et- ai. , Gene 26 ( 1 884 .) . 1 1 31 . A inser cão do gene URAS foi

BAD ORIGINAL

J

C ν 5= i 8c c i onsdfi por i r ans f o r ma ç ão de E . c ο I i estirpe pyrFCM . Rose et ai. , supra] . Urn c 1 one positivo foi designado ρ 1 asmideo pDP34 ('vsr F i g . -). pDF'34 é um vector vai-vem de levedura-E. coli com a marca. de rasisiénc ia. à ampicilina para. £ . coli e as marcas salsc ii va.s URA3 e dLEU2 para levedura. Ele contem a. sequência, completa de 2 nucron na. forma. A e é proficiente em REP1 , REP2 e FLP.

Exemplo 11;Cionagsne de cassetes de sxprsssao da hirulina em ρ· [.-334 0 plasmideo pDP34 foi digerido com BamHI. Os extremos coesivos do sístio de restncSo foram preenchidos numa reaccâo com ONA-poii-merase K1enow (T. Mania tis et ai. , em "Molecular Cloning. A. Laborator y Manual'" , Cold Sp r i ng Harbor Laborai íry, 1532 ) . 0 DMA foi ainda cortado c om Sa 1 I e o fragmento vector de 11 , 8k b foi iso1ado num gel preparativo de 0,6¾ de agarose. 0 DMA foi recuperado por e 1 e c troe 1 u i c ao e precipi ia.c ão c om etanol . Diferentes cassetes de expressão foram cionadas no f ragmento vector pDP34 entre os s i 11 os ha II e C E;amH i 3 / ex t r erro cerse . 0 plasmideo P-J0Õ207/QAPFL-H ΓI -Pã (ver Exemp 1 o 3) foi digerido com ΗindXII. Os extremos coesivos foram convertidos em extremos cerses com DMA-po1inerose de £. co 1i . 0 DMA foi precipitado· c om 8ir.no i e a. inoa. ciiger iso com z· a 1 i . ο τ r a. gm e n r o o a i i CHindlIID /extremo cerse cie 1 , Ikò contem a cassete de expressão comp1eta com sequências de pBR322, o promotor GAPFL, a sequência sinal de 3Ή05 fundida na mesma grelha de leitura com * sequência codificadora (cocíões preferidos de levedura; da hi rui i na £3 e o fragmento de terminação da transcrição de PH05. 0 fragmento de 1,lkb foi isolado num gel preparativo de 0,8% de agarose, recuperado do gel por e 1 ec t r oe 1 u i ç ão e purificado por c roma.tograf i a de

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\ 0 DNA de c-1 a =;γ(·| i de o f Ο 1 di seri do c Ο Γη &0ΓΠ com ο ο- fragmentos Gê rsatrição C O 1" P ρο τ e p i Ge como pDF'34 / ,C: .Λ C> / Gni FL-HTI-P6 ' v í0 p p i tr i *=* ·_ ·_ i ' *?·) cione \ 2,Ηλ ^ οβ SUmM T r i — t J /· 1 U "7 C =· ί »«_·[_ J- Π / / ·-· , i ΟιΎίΠ _ , Smil DTT, d j -_'Γ|'.*Ρ< A ί X 0 uni dads = •Ij cr1 ! ''-f Í~1 -L 1 ‘3 0 3 0 7 4 ( 8 i o 1 D — j O Li P 0. n L ti1 1 .C O x Lm í a 15 Usou—se Li ΠΊ ‘3 0 1 pa P 0 ti-1"* 0. — + t 1 1 O P P3. P C^í L-í i 0.3 iZ . C O 1 1 LJ i2· 1 . ! 1 L_' X ui oa. colónias t P S. t"l 5 f Ο P ΓίΊ <ri O 0. 3 P 03 1 stentes à 0ΓΓ»ρ 1 C 1 1 ί Π?. 7 O P 0 Γη 0. Π 0 1 13 u-cr ui1.·1 <; -1 7:-: í-i-- tLXSPP 1 o ie 1 , Ikb de pJUB2' Y6APEL.-H T T O 1 ,·· W. I x t i. ·_» *. y 1 •ΗΓΙ-Ρβ e P JD8207/Í 1 s η o v e c tor pDP34 ,~.no-· /: ’ ; PL‘I ·-·*- / GAP·-L-HT •Η ΓI—PS e P L) t~‘ / r'("í U 7’ c=i5seie= - f P c*.’ΡίΓί»0Π vO 3 -· 0. li L Η 1 PiC i ί I J / cfX "L· P 001*. / lhF í~ l — HT i P ‘13 e i deos p.JD 1 / / í"‘m'j5 Exemp 1 X *_ p d Γ Ci P 0. fi i í deos pop •3* 0 / LlHt” ClL- c·. f * I P L-í X 1 Π·:-» Π·_; P i 3.3ΓΗ 1 ;Ij0t

Po»- 7!

J :-:09-3 i 2 3 resistência á c ams.n i c i na : Ft í drmare > R . 0. Gene 56 (1337) foi linearizado com Snai. Os fragmentos de Div.A de ambas as digesldes foram extraídos com fenol e prec i pi tados com ets.noi . Os fragmentos de DMA foram misturados e ligados. A mistura de ligacSo foi usada para transformar [Hnahan, D. J. , Moí. Bioi . 166 ( 1333) 557—530] células competentes E. co 1 i .JM103 CYaniscn— -Per:’on; C. et. al. , Gene 33 ( 1985) 103-113], expressa durante 2n a 37° C em meio· LB e depois semeada, em placas de agar LB suplementado com 50 ng/ml de cananuc i na , 30 «g/ml e 7 ng/mi de IFTG .

Cu1tivaram-se 12 colónias brancas resistentes à canami-cina. 0 DMA de piasmídeo foi ana 1 isado por digestão com Xbal e Ba mH I /Κρη I . Um cione isolado que perdeu a. parte do vector pUC 19 de pDP31 , restaurou a grelha, de leitura D de dois-micron por !'al igacão do sitio PstI e que tem o ext remo cersa do piasmídeo pKÍ 3 inserido no sitio Sn a 8I foi referido como pDPS>5. Os plasmi— deos contêm os f regimentos grande SnaBI-PstI e pequeno PstI-SnaBI do piasmídeo dois-micron c lo nados no sítio Snaí de ρΚ 19. Por realizatao dos sítios PstI iscons t i t u i u-se a grelha de leitura D.

0 piasmídeo pUC18/URA3 no gene URA3 de i,17kb oe levedura f ragmento (HindIII) c1 onado no sítio H i nd111 do vec tor pUC 1S de E. coli com o gene URA3 inser ido na orientado oposta ta 1 corno o gene de resistência à ampicilina. p‘JC13/URA3 foi pare iaimente digerido c om a enzima òde restrição ΗindIII na presença de 50 xg/ml de b r ome to de et-ídxo durante Ih a 37® C. A de bronet·' ítidxo è digest- permi te que um o·,· im.ei ro s í f i c se j a digeri do c: ·: g Η i nd III. mas a suo seque n te intercala*; a de brometo de et ioeo no* DNA linear izado interfere com a digesta*' n s e g -a η o . a i ·. i ·-.·, ·— n 11 g u e ·_ e * : d ·*.· ·. * as i · - · *s m u Γν m * .o e ρ i a. s m i o s _.· 1 i: i zado. A enzima de restrição e o brometo de etídio foram removido; RAD ORIGINAL '

PC' duas sx tr?xc533 C Or>33Clf t, i Vã.S COil! fenoi e O D NA prsc i p 1 t-a.do C 0:V: 0 tí i'iO i .

Este i. - foi . ·η ao tratado com o í ragmento grande da ONA-poI imers.se < enzima f< 1 enow > para preencher 03 extremos 5’ pfoíybct’ sn tes dos si tios HindíII. Este DNA cor·! os extremos !' "pr1. r acc^s r-r· 1 g r c· i-í η’.-πΤί ge I oe a·. 9 are· se Pd7d bcpdrd.r o a vs r 1 os í i'0?fi)ôPt0s , i nc iu > ndo o DNA 1 inear enriquecido em extremos reparados. 0 DNA linear PUC18/URA3 de 3,35kb foi removido do gel 0 0 i 0 c t r c >- 101 do Este DNA foi então aoto-11 gado C Ofií DNA 1 1 gase Tl, usado para trens formar células competentes E . col 1 -JN103 estas sem leadas em pis·.cas YT sup 1 ementadas com 50 ,u s / '' m 1 de arifp 1 i. I r~í cri . P :cr 0 z? 0 0 daspisf e dê coiomas í. ·_ · : ·_· a. 1- r a. r? P1 a. 7' a. 1deniifiçar o P 1 c* zifYj I dJ0O Ls ;, onde 0 s i t 1 0 Hindi 11 não arranja. pUC- adaptador do 1 «do do gene OEA·.:· t 0 1 repa rado cria ndo mm novo sitio cle Í’sS17 í c a._· único Nhe I . 0 p 1 asn í deo "D" f o i diqenoo com a enzima oe r es t r i — ·,. U O “ 1 η O i 11 C O 7 · i :r · v :.· ·__ a Cr t- ·’ erillX’ · ·- Ό o e !'d n 7 o s 7:· T ·_· Pcil preench i dos noma ^eaceso com DNA-ρο 1 inrera.se Klenow. Este DNA foi

e n t ao 1 S to 1' 0 do d: Oui 00 ex C 0 Do O 0 de adapx-sdores Not-I D 6d bd d d d d ,j ; ú 1 00.00 coo DuA-Iigsse Ο0 T-i , U0 0GO 0 <' ”·. o. Γ -ri O 0: 7 0 Γ -ri P cel o 1 S ·. ΟΓ··- · . tooidz E . c 01 1 1N103 que 0 vJ 0 0 G 0 0 ram em piscas TY sop 1 ems vi r.ad·:· ca..-m ~0 a·*/ m 1 de acpicil iie As c o 1 ò··-· 1 0 5 foram despistadas como e trés e o p 1 asm i deo ’Έ" foi 1 den t i r i c ado . onoe o sino Hipcí II foi preenchido e adie icnado em aoa-t-aden' No t I. . 0 piasnicoo "E" roí digerido com a enzima de resir1cSc Saci e oa extremos proiooeren~ fes f orou pree-nc o 1 dos coo ú^õ-poi ipcoosú de TA. Ο ΝχΑ í :· 1 ·χ deo

1 s ti-:'' 0 GO com mm -grande e;:c eaeo de scaptadorei Not i 0 i 1 'DD -..GO c og Cd-d - 1 1 0 o·· :? e de Td. Esta m1st ora de ligação foi O 0 0 d 0 pora tra no- f 0 ΓΟΟ r r 0 lulas co mpeten tes E . c 0 1 1 JNÍ.09 que ror 010 0 0 iVt 0 0. Ο ·0 '0 0ΠΊ P i 0 - -0. 0 de YT supí emen ta do· comi 50 ug/ml de ampicili no. Fez-se r. c. .· ..o : 0 r. 0 doe col ónias como 0 T. P 0 -0 e 1 0 e π t1 f i c oe - se 0 p·· i a s.Vi: O0O

BAD ORIGINAL pL'C 18/ϋκΑ^~Ν , onde as seguènc ias pUCi8 esi3. o agor a dei imi tadas pO 3. L- 1 O Ο Ό ’' Tr r_' t- i' I c Ό U O t 1 \ OO r ί j. O *rr O e -1/ Ir Cl r? cr-O τ: · -™ r, i n ternied i ár 1 os ia,a construção cie pUC í 8/URA3-N ) . D plasmideo põF'95 e pUC 18/URA3-N foram ambos digeridos com Kpní e BamHI resultando em dois f ragmentos cada um deles. Os f rãPCiOiitos cie u-vh τ oram riístuiodce e i i3s.oos e osadus transformar células competentes E. coli JH103. As células foram semeadas em placas de agar l8 sup 1 ementado com i00 .ug/roi de ampicilina, 30 .sig/mi de XGal e 7 ,ug de IFTG.

Cui td varam—se 12 colónias brancas resistentes a ampici-1 ira 0 DNA de pia sm i deo foi analisado por digestão com Hindi II e Pvuí I . Um c I one isolado foi designado pDP8S . c orspr eendendo a seqoênc ia de dois-micron completa proficiente para todas as funcSes conhec idas e o gene URAS clonado no vecior pUC f ver Fig. S ) b > Ç: ] o^agem_de__cassetes de epiesafo em mOFHFG·

Em analcgia com •a Exemp’ lo 11 poHHH foi digerido C Ο'ύ 6amH I. os eooremos coesiv o s í o r a m preenchioos numa reaccéo C OÍVp DNA—po 1 imera.se· Klsnow de 1 0 ; 21, b . 0 nonaon lo Ge. 1 I —ri i nd 111/ sx t- v ror.···:· cara e d ca pi asm i deo pJõécc 0 76 ai HF —Η Γ l ~C—ς. 1 v-5r Exernp 1 o 8 .· r I isolado e lig-aoc· ao fr a gmer; to -oc for

Ana 1 i saram-se 6 colónias t r a n s f or maoa s resissentes A ampicilina 0 0/-A ao plasmideo foi ciigrooo em da^oo e S a 1 ; Cc-a-FI i.jfVi c 1 VV“ oi V/ -i ; en to 5 de r e s i Γ I câo esperados 7 E". 1 sei e c c i o··;a- o o ci - - grado pL- ‘ / o:-r:r L~ H ; I - rã , D· e ,--.030 serrei ha. n t- e O O 7. ev e-se o ml ~ 3- tV* 1 oeo mompo/o •g·" ·'· L· -ΗΓΙ -P - o i-iS r·. Π , -. L·· o fragmento S a 1 I ~ L H 1 nd I I 11 / ;f‘- e t r rr -óC; c·;· ói: -:· 1 ; 1 K o do f Γ -3 9;i:V V i 7. o p: Jo82:07/ GAF F' e- ΗΊ ' j _ p i 8 f v e r Em: emp 1 O '7' BAD ORIGINAL^

ExerooΙο 1 3 I Construção de estirpes hospedeiras de Saccharomycss cerevisiae sem DuA de dois_Micron

Para rsmovsr ο pi asm!deo endógeno dois micron. num priniairo passo i ntroduz i u-se uma deieção, no gene U.RA3 da est i rpe HT246 (DSn 4034; *, leu2-3, 1 eu 2-112, ρ·-ο) para tornar a estirpe auxoiróf i ca para urac i io. HT246 foi transformado com 1 g de P i asm i deo VEpl-3 CBroach, J. R . , S i r a the r n, J . N . , Hicks, J . B . ( i '3 / 3 ) tís ne 3, 1 21- 123 j usando o protoco 1 o d 0 iranst orr-acão descri to por Hi nne n et a 1 . CF'!’ o c . Na. tl Ac a d . 8 c 1 . U8A 75., 1328 ( 1378) ;. 10 g do ρ i 0 0 m i deo PUCI 2 UB A 3 conte rido LX;7 0 G e 1 e C i O no gene ϋη:A3 [Sengsta ‘5 / Ch . Hirnen, A. , Nucieic Ac ias Resea p c n -· > --· —*·- 48 (. 1 yy ./ ) ] t *../ P 0 Γ·· cr d 1 C C 1 o na d os junta mente C C; m o piasmi deo YEp13. Aproximada • iiOn t-0 30 0 0 t- r a n s f or m antes p r Ci f. c- t .róf i as para i eucina f '-Γ?, Πι Γ 0*0 U5P ensos em bm1 do meio mini mo (Difco Yeast Nitrogen Base ser;í a.m i noã : i d os â que se adiei o no u eã de giuco sei Cp 1 % cie I eutiPn, 0 , 1% do oraci io e 0,28¾ de acido T 1 UOO!' ó t i C Ό } 000 P‘0004 no Mosco de ag i ta : ão e incubados durant 0 P:· 0 horas a °C e 180" pm . Os Μ" 0 13 tj f o r τη. r.'· te s :0 '.A 0 P d:' cl· v rd P ! i i “· 0. '0 re s i s ter· tes ”, c« anel ego t A ·. i c á c i Hn t1UOOr Stic o e são portento p ora 0-JOP03 0 0 ·_- ·_· suos11 tu 1 vão no ge ne C Γ ΟΓΟΟ0 SÒfíi 1 _ '_·! r*. 0 -2' p 0 células 00 0 ·:: pcrr:'; 0 ·1 0 p; T oram s o meados em me 7 .·:· c cimo j. e to por i g/ 1 ) : “ 0 P í * ) 0 30 ; t- P 0. C t O de ievedu Γ <?> 1 0 , g 1 UC'10 e 20. apôs crescim ent o durante ΧΈΡΙ $ 30° C l ' ·'· ·'. 7 feri do o p1 0 ! ’ 0 fie 1 o i >i i mo i cia: - e azoi· a da psrs 1eve du- ras D i f c o oeiíi íriiP 00 r idos : sup 1 Γι! n t.· -z1. o _ o m ? d. ..' tj 0 g 1 l.-: ^ . 1 .·' oe I euc ir; 0 ) ; O 0 r' 0 d •;-f 10 c t0 P 0O xot róficos pa ra 0Í P 0 Cl lo. 8a)' I os e.uxo C r ó f :l COS ΪΟΓΟ.ΐη P 0 P i ·: a. d o 3 0 testados quanto a. per da. do pias •0 l deo Cha;r c o·; f e r i ndo 0 L-XO t P Γ 1 0 pa !'a. 1 eu c i na . · ···'· · c o 1 Q)i i a i nd 1 V I ” dua1 ides 1 ‘ 2 00.CÍ 0. í Γ 338 u renu 0 Γ 0O oo ieucina e uraci .1 0 f oí repic ada e 000-00 n ;í_j :..d A p. 0 0 p e ·· i ê n c i a s 7 7' 3.70 f 37 í transf o r m a o a c o m o plasmid e o pDr'38 Cobl-ld O 0. partir do P! i <r> r> ΓτΊ I O 0 o pCr‘oi por digest A o c o m 8- p h I 0 reiigacao do

BAO 0o,rJN5AL fragmento resultante de d , 4kb; ver Fig. 4 j o e portador oe penes marcadores Le.U4' e OnAd í p"otocoio ds transi· ormac do: sopra ) .

As céi L41 as de 1 e v e dura tr ansformadas foram P r i m e i r o sele ·_ cioneoes em P i a. c a a de m e i o m i n i m o para levedura deiiciente em :j r e C I I o ; sup1emen ta das Γ or\i 1eucina e depois transia ridas para me i o fi! í Γί 1 ίϊί ο de r i cien te e ui 1 0L-! c i na e sup1em e nta d o co m uraci I cm 10 c ο 1 & η ι e s c rsscidas durante uma semana foram repicadas e cultivadas indivi-dualmenie em meio liquido completo (supra) durante cerca de cem gerações. Ao fazer-se isto as células perderam o p1asmideo púP38 e ale cer fu pe r c en t-agem s.irmux tuneamente t-amoem c; ρ í asm i deo endógeno dois micron. 10 colónias que requerem uracilo e ieucina foram rapicaocs; o ONA foi preparado, digerido to tal mente com PstI e despistado com DMA de dois micron oe levedura marcado com '"‘Τ' em transferênc ias Southern. Um isolado sem qualquer sinal de hibridaçao foi referido como H44S(a, -1eu2-3, 1eu2~112, ura3 , prb, c i r0 > , um derivado isogénico de levedura estirpe HT2-6 sem dois-fiúcron (cir5 ). F xe a ipio 1 4 ; T r a n s f o r r.-, arg o__de S. cerevisise estirpe

Saccharomyceo cerevlsiae estirpe H^3 foi transi amam cor,· os p 1 asm i coo::::· lALl

oq,nfNAL

\ pDP34/GAF'FL-HTí-PS ρ ΰ Ρ 3— / G A Ρ F L—Η ΤI - Ρ ί 8 ρ υ Ρ 34/GAPEL-ΗίI-Ρ6 P&P34/GAPEL-HTI-Ρ18 ρ0Ρ34/ΡΗ05(-173)-ΗΤI-Ρ6 ρΡΡ34/ΡΗ05(-173)-ΗΤI-Ρ18 PDP9S/6APFL-HTI-P6 PDP3S/QAPFL-HTI-P18 usando ο protocolo do t-ransforrnacão descrito por Hinnen et al. CProc . Natl . Ac d. Sei. USA 75, 1329 ( 1973)1. As células de leve d u r a t r a n s f o r rn a. d a. s r o rara selecc i o n a. d a. s e m ρ i a. c a. s d e m e i o •iiininío para leveduras sup 1 ementado com ieucina. e def i cientes ern urac i lo . C o 1 ó n i a. s de 1 e v e d u r a. t r a. n s f o r rn a d a s i n d i v i d u a. i s f o r a. rn i su i adãb e d e s i gna.gas S a. ccharoravces c e revísiae Sac charomyces c erevis i ae Sac charomyces c e r e v i s i e e Sa. c c ha r orn v c e s cerevisiae Sac charomyces c erevisiae O ctCTi ?. ” Ο !ϊ! V C tr 'S c erevisiae 8 a c c h a. r o rn yces c e rev isiae Saccharomyces c e r e v i s i as e H 44 3 / P D P 3 4 / <3 A P F L—Η Τ I — P 6 H44 9 / p D P 3 4 / G A P F L. - Η ΤΙ- Ρ18 H443/PDP34/GAPEL-HTI-PS H443/PDP34/GAPEL-H ΓI-Ρ18 H443/PDP34/PH05-H~I-PS H443/pDP34/PH05-HΓI-Ρ18 H449/pDP36/GAPFL-HTI-PS H443/pDP36/GAPFL-HTI-PI 8

Exemplo 15; Ferrnenta.c ao de estirpes 'te levedura transformadas numa e e c a. 1 d 1 a. o o r e t o r 1 e i Células de Sa c c ha r orn yces cerevisiae H443/pDP-34/GAPFL--H~I-P6 e de 3a c c ha r osiv c es c e rev ι s i ae H449/pDP34 /6APFL-HT I -Ρ' 18 foram cultivadas em duas préculturas subsequantes de 1Orn1 de meio minimo composto por (g/1>; n

*0 ORIGINAL

A p rimeira précultu p a f 0 i c u 11- i v' a d a cá g p a π t- 0 b 0 .h a 2! S0 G e 1 ·“' o r t-1 π i. A rã tf Q L * m G a. P P tf C L/í x X.· U r a f 0 i í ΠGL G 1 a.Ga L *_íΓίϊ Ga. ρ Γ I Ííia 1 P -τΛ prèc u I i u r a e i π c L-* írr* a a a. g ·_-· r a π t- 0 d p? a 28° C e ISO rpm. 0 meio de cul t.·upa pp 1)")c i pn i 0 C O ΠΪ F1 c- st o por C g/1 ) ; extracio de 1 t-vedu ra 49 s1ucose c f rutose c 7 NH4N03 Γ; F. MqSO a x 7H...0 Ca C0-, í ; 0 5,0 Ca..,<; F'0 , ).- Ç1 P) U i . x1 Ο' 1 f íYít?

}· n i t- x vap

Mi nr Γμ nt

X Γ

Q qua.n n d u I i r

í I 11"} T p a x/pIo 16 r 4 i ; + n- jrar c r i X 3/5 la

·, 1M .-y»y w-,. BAD ORIGINAL ’

\ I n ci 7 01 e 1 u ida. com tampão T '1' i s C 5omM; PH 70 - 3,5 ) . A f rac r ã<_< nc i pa 1 foi ajus 7-0d0. λ C-Ή O ’-i e depo i s apl1 cada numa colu 1”^ ι"Ί A* hadex 'J3 •‘T* 0 3ΌΌ r’' 7 I n cH \ Ϊ 1 í^*i -cr*. νΓ í Tl 0. C ia 100 cm x 4pcnvm 1 v 01 ume de I e 1 t-o m 1 > p 1' é—equ i 1 i b Γ 0. ij C Ofil .4, C i do a. c é i i c í“; 0 1 M e ligada. A L-Tír

iiSvSme. Cj -rr F t' í_ *_ f-r S. Γ ίίϊ a. C 1 a. H 0 í U í C ão Τ Ο I e T e C t L-ί S. d a. COTil Uíll c-*. C 1 d O 0 0 / 1M 0. L4 f? i c a. u d a. 1 O0 ml / m i n e controlado a 28c fnrn . 0 ffi 30 f Γ 0 C Ç Ô03 de 6m 1 0 t est ar 0 Π ( 3 0 ^ I..-Í 0 Ή f O 0 0 C t- 1 V 1 00.00 com a i 0 de * v-^ » f—, ·· f" i 1 ( ± u‘ χ L c1 0 de tr ombi na. r 0 πιο de scri to por S. Mao et a. 1 . Bi 0 c h. lei, s 14 Cl 38 7) j . Es f tTU P a. 3 s O llj 0. Lrífii0 pur 1 T 1 C 0. v 0 de f ra. C Ç*5SS a C 11 Vê.3 f O 1’ 0.Π* SeC SS nUfVl 1 1 Of 1 i Ida. dor i 4 ve: redissol vidas en> 2n;l de 0, 02Μ hist-idina/KCL pHb, 6 C=elusnte A), centr ι τ ugaoa.s e o s o d r 0 re. d θ. π t· θ c lar 1 f 1 cedo sp 1 1 cedo o o ma. c o 1 une?*, de perverta amiónica de fluxo rápido Sepharose Q (.'Pharmacia, 40cm ,x 1 omm / vo 1 ume de lei io 5 O m 1 - 115a.ca a. u m s i 3 cera a PF LC- F'ha r m a. cia. e pre egui 11 brada com eiuente A. h eluiça.u fοi feii-a. c*_*m um 3ra

ente de passos a um c auda1 de 2ml/min: 48ni i n 7E· Celuente E·' ! 02M hisi 1 di na./HCL oH 5 ; β + 1M Ma.CL ) , 102 rn i n 15% B, 85 m i n Λ» U* . Γ0 eluicSo f 0 i contro lada a 2S0nm e as f r 0. c coe => 0. c X-1 vas omdee e reíiiov i do 0 e a 1 num a coluna 8ep Γ'| Λ O eG S 0 fina com 0; 01M 2: c-*. o a s NH ,HCU..., depois liofii A purilicacáo final foi fel ta por HP1C de fas* ( Nuc ieosi 1 C1S e feniisilica) e por c rofiia t -ograf 1 a de permuta, a. niòmcs Mc* no Q c onto descrito no Exemplo 3. As hirulina.s P6 e P18 puras > pr ogliz i cas por 8 . c e r e v i s 1 a. e c o r r e s ρ ο o o o m essenc ia. i mente aos produtos obtidos de acordo com o processo descrito no e. a h i rui i na Pt· resultante não possui _ F. [ _ . _ . su 1 f a. t o na. ir” (= des su 11 a. to—π i r ud 1 na PB f . p a: e m ρ 1 o 1 7 ; u o m ρ o si; a o f a. r m a. c ê u t i ca conte n d o s e m c o m ρ o s t o r i 1 r u 1 1 n a. ρ-'· a. r a. a o m 1 n 1 s t r a. c á ο ρ* a. r e n F e r a. 1

J

BAD ORIGINAL \

He S Ο i U C £5 S S 85 te Γ Í 1 I Hctde.3 pod^íif 58P O 3 a CÍ :emp i o pa r a adm inis i r a cão i n t r a venosa . di r por

Depós 11· o d e Mi cr o o r o a n i s m o s depositadas na Deutsche Sammlung von Γ1 ik. roor gan i smen (QSM), Mascheroder Weg Ib, D—3300 E^raunschwei g (datas de depósitos e números de acessos dados j!

Sa.c c t;aromy c es csrev i si ae H449 : February 18 , i988 , D SM 4413 !

N109.· /r-.no ·:·ο · cr t~'Ui t r jv1 í 09,- / ζ-'Π ρ :ΐ£ > M (-eoruary I M 1 A

Eiscner i c h i a Eischer i c h x a

ORIGINAL f J

Claims (1)

1. h.'eινinaicaçdes : \

   para a produçSo de um ρο 1 ipept·idso selsc- cionado 'do grupo constituído pelo polipeptídeo tendo a O r? ei Γ0 I Π O c*. C 1 d C1 S . ΓΊRYTAC7ESG QNQCI <.·'EGND VCG0QGh‘NCQF DSSGKKCVEG EGT^RKF'QNtG ! ( I > HDFDPIPEE YLS e Ptl o FO1 ipep· t-ideo t- e η d o a seguenc ia de ar·: i nu a c i ___ _ ...__ Vt·YTDC Γ3GQ NYCL<_·GGNF C GDGKHL·EiiDG G·tNKϋVDGEG TPKRfT E·61 DFEEFSLDDI EQ (II) onde T representa treomina cujo grupo Eidroxilo i 1 V V 0 L-' 0íVi 0. Γ8ρΓίτ?0Γι'.·Γ'. O o. ν 0 Γ i) O Gc ΓΪ 1 Q Γ}_: ‘3 1 0 f enó 1 i co da ti resina ou um grupo — SO.-.H e seus sais, carac tenzado ρ o r c o rϊι ρ r e e n o e r ! glicosi lado em esρec ii —'-'lamento do ref rido polipeptídeo a partir dos corpos de sa.nguessupa Hiruoinaria ma.ni ilensis por urra comoina de niètodu-j de prec i p x ' métod o s cr omoto g rá í i co s o ( Γ ni U a uma 1 g u e ι i d>:

   =:n 1 . t e r id 1 EAD ORIGINAL

   t- o dO Pa. ra. a. produ _ sk _ C O 1 d S U Γι'! p o 1 i pep t i os*_* O· nd i c a v ·=*. o 1 f e s 11 í que ·+· { repre = ent-a i reon i na cu j; nó 1 IC o ds tiro is i no. r. í_j um grupo —S Ο.-,Η, carac t-0P 1 x^ado pO Γ C^riípreSIIGyP Ο X S Ο 1 ο. Γϋ 0 ’Π t Ο d1-1 1" 0 Τ Sr ldO p Ο 1 1 p0p t- i Ό0 Ο cH Partir dos corpos da espécie de sanguessuga. Η i r ud i na r i a ma n i 1 I en- SIS ΡΟΓ uma c orn b i nac ão de métodos de F1 r e c l P' i t cr. c ~ o e méto dos c ronia tog r áf i cos e / c a. so se pretenda , a remoção num c omposto da. fórmula I obtido onde Z è o grupo -so ,_,H do grupo monoéster de ácido sul furico PI i t idróiise e/ou, caso se pretenda. , a conver θ' «. rj ci. da um P!C' 1i pep i i de o L-O ·.· x L.O t S f !·->··_· ‘ri rupo s c a ν' b o x 11 o e/ou am 1 n a . vrt'b num Sdi ou a conversâo oe uni i obt ido no compost-u ι i vr:

   tiAD ORIGINAL

   á torno ao Hidrogénio fenói ico da ti r os i na ο T represent-ar nina cujo grupo hidroxiIo está gli cosi lado. nidrogènio f enói i co da f. r 0 o — Sã - Método para a. produção do po 1 ipept-£deo da. 1 de a u Γ dl cos» a reivindicação 1; caracterizado por f órmu i a ! ser o grupo -tu.-, e .Jl g 11cosi1 ado. T representar treoni na cujo grupo hidroxilo está 7§ - Método para a. produção do pol ipeptideo da fórmula II de acordo corn a reivindicação í , caracterizado por TT repre-s e n t a r t r e ο η i n a . Sã - Método para a produção do polipeptideo da fórmula II de acordo com a. reivindicação 1, caracterizado por 7" representar treonina cujo grupo hidroxilo está glicosi lado. Sã - Método para a produção de um DMA codificador de um poiipeptideo de acordo com a reivindicação í, caracterizado por compreenoer; a. a produção do referioo DMA quimicamente ou b. a produção de fragmentos do referieo D?MA quimicamente e ligação dos referidos fragmentos numa ordem p rede te r m i na da. 10s - Método para a produção de um vector híbrido contendo uma sequência d* DMA obtida de acordo com· a reivindicação ΰ e,m que a referida sequência de DMA é comi rodada or uma sequência de contrôlo da expressão; ca "ac ter izecto por compreender a inserção da referida sequência de DMA num DMA vector que contem uma sequência de controlo da expressão de modo a que a referida sequencxa de contraio· da expressão controle a referida sequência de DMA. ti^D ORIGINAL • + V G LA C n >.J G cr L 4 Γ·'ϊ ΐ· r a n s í ci r ro a, d o ΓΘ1 V Í I1G1 caç d.’* go referi do «: ; 1 ,t c a. p -r-· c t-rgon i sírio ho P o p cfVí f-: p t t·· ia g ^ p c p a. π => τ κ 0í'íh i p o C ΟΠ) C: V' 9T Ο Γ i d O V8 C t-O Γ ' i z a f I-: ν' !“· - !- L i a c· o a ; G 0 ·-· LA Π» ICJ

   SAD ORIGINAL