DE69024104T2

DE69024104T2 - Polypeptide und Polypeptidanaloge mit inhibitorischer Aktivität gegenüber menschlicher Elastase

Info

Publication number: DE69024104T2
Application number: DE69024104T
Authority: DE
Inventors: Enno Prof Christophers; Michael Derek Dr Edge; David Dr Pioli; Jens-Michael Dr Schroder; Oliver Dr Wiedow
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: WIEDOW, OLIVER, PROF. DR.MED., 24105 KIEL, DE
Priority date: 1989-06-09
Filing date: 1990-06-04
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2010-06-05
Also published as: NO902444L; EP0402068A1; DE69024104D1; NO177716C; IL94602A0; DK0402068T3; AU636148B2; NO902444D0; FI902880A0; GR3018401T3; US20060068480A1; US6245739B1; IE902006L; NZ233974A; FI106471B; NO177716B; ES2080800T3; PT94326A; US6893843B2; CA2018592A1

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide, die inhibitorische Aktivität gegenüber menschlicher Elastase besitzen, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, sowie die genetische Modifikation von Wirten zur Expression der Polypeptide, die dadurch erhaltenen Wirte, das bei der Modifikation verwendete genetische Material und die Vektoren dafür.
Human-Leukozyten-Elastase (HLE) ist ein proteolytisches Enzym, das in den azurophilen Granula von menschlichen polymorphkernigen Leukozyten vorhanden ist. Unter normalen Umständen fusionieren diese Granula mit Phagosomen, die Fremdmaterial enthalten, beispielsweise Bakterien, und die Teilchen werden durch eine Kombination von HLE und anderen lysosomalen Enzymen metabolisiert. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen werden jedoch die polymorphkernigen Leukozyten an des Wirts-Protein gebunden, beispielsweise an Elastin und Collagen, und der Inhalt der Granula, einschließlich HLE, kann direkt in das Gewebe freigesetzt werden. Es wird angenommen&sub1; daß die resultierende abbauende Wirkung von HLE auf das Wirts-Gewebe zu einer Gewebeschädigung führt, die eine Rolle bei Erkrankungen wie dem Emphysem (2), dem adulten Atemnotsyndrom (1), der Psoriasis (3) und den Blasendermatosen (4) spielen kann.
Es ist bekannt, daß die starke proteolytische Aktivität von HLE bis zu einem gewissen Grad durch die antiproteolytische Aktivität von Inhibitoren wie Alpha&sub1;-antitrypsin und Alpha&sub2;-macroglobulin ausgeglichen wird. Diese Inhibitoren sind sowohl im Serum als auch in verschiedenen Geweben wie beispielsweise der Epidermis nachgewiesen worden (5,10). Außerdem wurde gezeigt, daß ein Inhibitor menschlicher Leukozyten-Proteasen mit niedrigem Molekulargewicht sowohl in der Samenflüssigkeit (11), dem Gebärmutterhalsschleim (12), dem Bronchialsekret (13) und dem Parotissekret (14) als auch im menschlichen Serum (6) vorhanden ist. Es wurde gezeigt, daß der Inhibitor aus allen diesen Quellen mit Antileukoprotease und ihren Metaboliten identisch ist, nämlich durch Immunreaktion (6, 15) oder durch Aminosäure- Seguenzanalyse (16, 17), und daß es sich auch um einen starken Trypsin-Inhibitor handelt. Inhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht wurden von Hochstrasser et al. (22) auch im Bronchialschleim und in der von Psoriasis befallenen Haut (22) nachgewiesen. In der Literatur wird auch über andere Inhibitoren von Elastase (18, 19) berichtet, die auch Trypsin inhibieren. Außerdem wurden Elastase-Inhibitoren auch in der Glandula submandibularis von Hunden, Löwen und Katzen (20) nachgewiesen.
Gemäß einem ersten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, das die gesamte oder einen Teil der Primärstruktur mit der Formel I aufweist und Fragmente davon, nämlich Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-
(Formel I), wobei das Polypeptid oder die Fragmente inhibierende Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzen, und Verbindungen, die in vivo oder in vitro zu dem Polypeptid oder den Fragmenten modifiziert werden können.
Erfindungsgemäß wird auch ein Polypeptid bereitgestellt, das die gesamte oder einen Teil der folgenden Primärstruktur aufweist und Fragmente davon:
wobei das Polypeptid oder die Fragmente inhibierende Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzen, und Verbindungen, die in vivo oder in vitro zu dem Polypeptid oder den Fragmenten modifiziert werden können.
Zweckmäßigerweise hat das Polypeptid oder haben die Fragmente die folgende Struktur:
wobei X einen oder mehrere Aminosäure-Reste aufweist und vorzugsweise für
steht.
Dem Polypeptid können ein oder mehrere Aminosäure-Reste vorangehen, beispielsweise Ala-Gln-Glu-Pro-Val-; oder Y- Ala-Gln-Glu-Pro-Val-, wobei Y eine oder mehrere Aminosäuren aufweist, bei denen es sich beispielsweise um:
handelt.
Am bevorzugtesten hat das Polypeptid die Struktur mit der Formel I.
Zweckmäßigerweise besitzen die Polypeptide oder Fragmente der vorliegenden Erfindung inhibierende Wirkung, die für Serin-Proteasen spezifisch ist, und zwar derart, daß sie inhibitorische Wirkung gegen Proteasen wie die menschliche Leukozyten-Elastase und die Schweine-Pankreas-Elastase besitzen, jedoch keinerlei signifikante inhibitorische Wirkung gegen Trypsin besitzen. Bevorzugte Polypeptide oder Fragmente der Erfindung besitzen keinerlei signifikante inhibitorische Wirkung gegen menschliches Cathepsin G, Alpha-Chymotrypsin und Plasmin.
Die Polypeptide oder deren Fragmente der vorliegenden Erfindung können einen isoelektrischen Punkt von etwa pH 9,7 aufweisen (durch isoelektrische Fokussierung bestimmt).
Obwohl sie durch gentechnische Verfahren hergestellt werden können, sind die bevorzugten Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch aus Psoriasis-Schuppen der menschlichen Haut erhältlich.
Erfindungsgemäß wird auch ein Polypeptid bereitgestellt, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten- Elastase besitzt, wobei das Polypeptid aus Psoriasis- Schuppen der menschlichen Haut erhältlich ist und eines oder mehrere der folgenden Merkmale besitzt:
a) ein Molekulargewicht von 9 kD (durch SDS-pAGE) bestimmt;
b) einen isoelektrischen Punkt bei etwa pH 9,7 (durch isoelektrische Fokussierung bestimmt);
c) zusätzlich zu menschlicher Leukozyten-Elastase inhibitorische Wirkung gegen Schweine-Pankreas-Elastase;
d) keine signifikante Wirkung gegen Trypsin, menschliches Cathepsin G, Alpha-Chymotrypsin und Plasmin;
oder ein Fragment davon, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzt.
Die aus der menschlichen Haut erhältlichen Polypeptide umfassen solche, die direkt mittels Isolations- und Reinigungsverfahren erhältlich sind sowie auch Fragmente derartiger Polypeptide.
Bevorzugte Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten eine der folgenden Aminosäure-Sequenzen:-
und am bevorzugtesten eine N-terminale Sequenz, welche die obige Sequenz aufweist, der X vorangeht,
wobei X eine Aminosäure-Sequenz darstellt, die 19 Aminosäuren enthalten kann, wobei es sich bei der Sequenz zweckmäßigerweise um
handelt
und am bevorzugtesten eine N-terminale Sequenz, welche die obige Sequenz enthält, der X vorangeht,
wobei X eine Aminosäure-Sequenz darstellt, die sechs Aminosäuren enthalten kann, wobei es sich bei der Sequenz zweckmäßigerweise um
handelt
und am bevorzugtesten eine N-terminale Sequenz, welche die obige Sequenz enthält, der X vorangeht,
wobei X eine Aminosäure-Sequenz darstellt, die vier Aminosäuren enthalten kann, wobei es sich bei der Sequenz zweckmäßigerweise um
Asp-Lys-Val-Lys- handelt
und am bevorzugtesten eine N-terminale Sequenz, welche die obige Sequenz enthält, der X vorangeht, wobei X eine Aminosäure-Sequenz darstellt, die zwei Aminosäure-Reste enthalten kann, bei denen es sich zweckmäßigerweise um Glylval-Lys handelt
und am bevorzugtesten ein Polypeptid, das eine N-terminale Sequenz hat, welche die obige Sequenz aufweist.
Besonders bevorzugte Polypeptide sind die gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung definierten, insbesondere das Polypeptid mit der Formel I.
Das Polypeptid mit der Formel I besitzt auch inhibitorische Wirkung gegen Proteinase 3.
Die Polypeptide und deren Fragmente der vorliegenden Erfindung sind in biologisch reiner und homogener Form erhältlich. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein hier definiertes Polypeptid bereit, das nicht die assoziierte native Glycosylierung aufweist.
Zusätzlich zu den oben definierten Polypeptiden umfaßt die vorliegende Erfindung auch andere Produkte, die inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzen, beispielsweise Polypeptid-Analoge. Daher werden erfindungsgemäß auch Polypeptid-Analoge der oben definierten Polypeptide bereitgestellt, die inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzen.
Diese Polypeptid-Analogen umfassen Polypeptide, die sich von den oben definierten hinsichtlich der Identität oder der Anordnung einer oder mehrerer Aminosäure-Reste unterscheiden. Beispielsweise können derartige Analoge Substitutionen oder terminale oder intermediäre Additionen oder Deletionen derartiger Reste aufweisen. Derartige Analogen würden inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten- Elastase aufweisen und können, wenn dies erwünscht ist, auch eine oder mehrere der zusätzlichen Wirkungen des Polypeptids mit der Formel I aufweisen, beispielsweise die inhibitorische Wirkung gegen Schweine-Pankreas-Elastase. Beispielsweise umfassen projektierte Produkte der Erfindung solche, die stabiler gegen Hydrolyse sind (und deshalb eine ausgeprägtere und länger andauernde Wirkung haben können als sie natürlich vorkommt); oder bei denen einer oder mehrere Cystein-Reste deletiert oder ersetzt sind, z.B. durch Alanin- oder Serin-Reste, und die möglicherweise leichter in aktiver Form aus mikrobiellen Systemen isoliert werden.
Die Polypeptide, Fragmente und Polypeptid-Analogen der vorliegenden Erfindung sind in biologisch reiner und homogener Form erhältlich.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zweckmäßigerweise mit gentechnischen Verfahren hergestellt werden. Die Analogen der vorliegenden Erfindung können durch die Expression von Genen hergestellt werden, die derartige Analogen codieren. Derartige Gene sind ohne weiteres mittels wohlbekannter Verfahren zur ortsspezifischen Mutagenese durch Modifikationen der cDNA und genomischer Gene erhältlich.
Somit wird nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid (wie hier definiert), oder ein Analoges davon bereitgestellt, das durch rekombinante DNA- Technologie hergestellt wurde.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten Polypeptids bereitgestellt, wobei bei dem Verfahren eine Wirtszelle kultiviert wird, die mit einem replizierbaren plasmidischen Expressionsträger transformiert wurde, welcher das das Polypeptid codierende genetische Material enthält, so daß das Polypeptid exprimiert wird, und bei dem das so exprimierte Polypeptid gewonnen wird.
Die hier verwendete Bezeichnung "replizierbarer plasmidischer Expressionsträger" wird in ihrer breitesten Bedeutung verwendet und umfaßt beispielsweise Plasmide, die sich in einer Zelle in Form eines extra-chromosomalen Elements replizieren können, und solche, die sich durch Integration in das genetische Material der Wirtszelle replizieren können.
Das oben erwähnte Verfahren kann unter Verwendung jeder geeigneten Wirtszelle, wie beispielsweise E. coli, Hefe oder Säuger-Zellen, durchgeführt werden. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirt können die Polypeptide der Erfindung mit Säuger- oder anderen eukaryotischen Kohlenhydraten glycosyliert sein oder sie können unglycosyliert sein.
Es ist klar, daß, wenn der gewünschte Metabolit nicht in einer wirtschaftlich geeigneten Menge aus der Wirts-Zelle ausgeschleust wird, der Wirt in Form der intakten Zelle kultiviert und geerntet werden kann und das gewünschte Polypeptid durch anschließendes Extrahieren der Zellen gewonnen werden kann, beispielsweise nach der Abtrennung aus dem Medium, das die für das Wachstum der Wirtszelle erforderlichen Nährstoffe enthält. Wenn der Metabolit aus der Wirtszelle in die umgebende Kultur-Lösung ausgeschleust wird, kann das Polypeptid auf normale Art und Weise durch Extraktion gewonnen werden.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird daher ein transformierter Wirt bereitgestellt, der ein wie oben definiertes Polypeptid exprimieren kann, wobei der Wirt einen replizierbaren plasmidischen Expressionsträger enthält, der das das Polypeptid codierende genetische Material enthält.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten transformierten Wirts bereitgestellt, bei dem ein Wirt durch die Insertion eines replizierbaren plasmidischen Expressionsträgers transformiert wird, der ein ein wie oben definiertes Polypeptid codierendes genetisches Material enthält.
Geeignete Verfahren zur Einführung von fremdem genetischen Material in den Wirt sind im allgemeinen in der Literatur bekannt. Derartige Verfahren umfassen die Bildung eines einen Vektor und das fremde genetische Material aufweisenden replizierbaren Expressionsträgers und Einführung dieses Trägers in den Wirt. Die Einführung des Trägers in den Wirt kann erleichtert werden, indem der Wirt einer geeigneten Behandlung unterzogen wird, beispielsweise im Falle von E. coli eine Behandlung mit Calciumchlorid- Lösung.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein replizierbarer plasmidischer Expressionsträger bereitgestellt, der in einem transformierten Wirt ein oben definiertes Polypeptid exprimieren kann.
Daher wird außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen replizierbaren plasmidischen Expressionsträgers bereitgestellt, bei dem ein Gen, das ein wie oben definiertes Polypeptid codiert, an einer geeigneten Insertionsstelle in einen Vektor insertiert wird, so daß ein replizierbarer plasmidischer Expressionsträger erhalten wird, der die Synthese eines wie oben definierten Polypeptid dirigieren kann.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein oben definiertes Polypeptid codiert.
Die DNA-Sequenzen der Erfindung umfassen Sequenzen, die zur Sicherstellung der Expression eines oben definierten Polypeptids in procaryotischen oder eucaryotischen Wirtszellen verwendbar sind. Die DNA-Sequenzen der Erfindung umfassen konkret folgende:
a) eine DNA-Sequenz wie in Fig. 13 angegeben und Fragmente davon und insbesondere das Fragment, welches das Polypeptid mit der Formel I codiert oder ihr komplementärer Strang;
b) eine DNA-Sequenz, die an eine in Fig. 13 angegebene DNA-Sequenz hybridisiert oder an ein Fragment davon; und
c) eine DNA-Sequenz, die wegen der Degeneration des genetischen Codes an eine in Fig. 13 angegeben DNA-Sequenz hybridisieren wurde oder an ein Fragment davon, und insbesondere an ein Fragment, welches das Polypeptid mit der Formel I codiert.
In Teil b) sind konkret genomische DNA-Sequenzen enthalten, die allele Varianten des Polypeptids mit der Formel I codieren. In Teil c) sind konkret hergestellte DNA-Sequenzen enthalten. Die hergestellten Sequenzen können ohne weiteres nach den Verfahren von Alton et al., der PCT Offenlegungsschrift WO83/04053; und von Edge et al., Nature Band 292, 756 - 762, 1981 erhalten werden.
Die in Fig. 13 veranschaulichten Sequenz-Fragmente, auf die oben Bezug genommen wurde, umfassen sowohl solche, die durch aufeinanderfolgende Verdauung mit Restriktions- Enzymen wie EcoR1 und SalI und BspMI und BamHI erzeugt wurden als auch das Fragment, welches das Polypeptid mit der Formel I codiert. Die in den Fig. 14 und 15 veranschaulichten Sequenzen, auf die oben Bezug genommen wurde, sind cDNA-Teilsequenzen, während es sich bei denen in Fig. 16 um die vollständige cDNA-Sequenz handelt. Daher wird auch eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die im wesentlichen die in den Fig. 14 oder 16 angegebene DNA-Sequenz aufweist oder ihren komplementären Strang.
Die Degeneration des genetischen Codes gestattet eine beträchtliche Freiheit bei der Wahl der Codons, die verwendet werden können, um ein Gen für das bestimmte Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu konstruieren. Normalerweise werden Codons ausgewählt, die vom Wirt bevorzugt werden.
Es können Polynukleotid-Sonden konstruiert werden, die an jeden Teil der oben erwähnten DNA-Sequenz oder einer entsprechenden RNA- oder cDNA-Sequenz hybridisieren können. Es ist klar, daß die Nukleotid-Sonde eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die mit einer ausreichenden Länge an die zu bestimmende Sequenz hybridisiert, so daß sichergestellt ist, daß die Sonde eindeutig die interessierende Sequenz nachweist. Im allgemeinen kann die Sonde an mindestens 8 aufeinanderfolgende Nukleotide der zu bestimmenden Sequenz hybridisieren.
Daher wird nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung eine Polynukleotid-Sonde bereitgestellt, die eine Nukleotid-Sequenz aufweist, welche an eine oben definierte DNA-Sequenz oder ein Fragment davon oder an eine korrespondierende RNA-Sequenz hybridisieren kann, wobei die Sonde gegebenenfalls einen kennzeichnenden Bestandteil oder eine Markierung aufweist.
Die Polynukleotid-Sonden der vorliegenden Erfindung können gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren gekennzeichnet oder markiert werden, beispielsweise können sie auf jede übliche Art und Weise 32P-radiomarkiert werden oder sie können alternativ mit anderen Mitteln radiomarkiert werden, die in der Hybridisierungstechnik wohlbekannt sind, beispielsweise unter Erhalt von ³&sup5;S-radiomarkierten Sonden. Die Sonden können beispielsweise fluoreszierende Markierungen tragen. Alternativ können sie mit Biotin oder einer ähnlichen Spezies markiert sein, nämlich gemäß dem Verfahren von D. C. Ward et al., wie in den Proceedings of the 1981 ICN-UCLA Symposium on Development Biology using Purified Genes, in Keystone, Colorado vom 15. - 20. März 1981 abgehalten, Band XXIII 1981, Seiten 647 - 658, Academic Press, Herausgeber Donald D. Brown et al., beschrieben, oder sie können sogar mit dem Verfahren von A. D. B. Malcomn et al., Abstracts of the 604th Biochemical Society Meeting, Cambridge, England (Tagung vom 1. Juli 1983) enzym-markiert werden.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der zumindestens an ein Fragment eines oben definierten Polypeptids binden kann. Die hier verwendete Bezeichnung "Antikörper" umfaßt, sofern der Kontext nichts anderes vorschreibt, sowohl intakte Antikörper wie polydonale und monodonale Antikörper und Antikörper-Fragmente als auch chimere Antikörper wie die in der UK-Patentanmeldung 2 188 638 beschriebenen. Die hier verwendete Bezeichnung "Fragmente" bezieht sich, sofern sie nicht auf etwas anderes hinweisen soll, auf Fragmente, welche die Bindungsregion des Antikörpers enthalten. Derartige Fragmente können Fragmente vom Fab-Typ sein, die als Fragmente definiert sind, denen der Fc-Teil fehlt, z.B. Fab-, Fab¹- und F(ab¹)&sub2;-Fragmente, oder es kann sich um sogenannte "Halb-Molekül"-Fragmente handeln, die durch reduktive Spaltung der Disulfid-Bindungen erhalten werden, welche die schweren Ketten des intakten Antikörpers verbinden.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann, sofern dies erwünscht ist, einen Kennzeichnungs- oder Marker-Bestandteil tragen, beispielsweise wie oben bezüglich der Polynukleotid-Sonden der vorliegenden Erfindung beschrieben. So können die Antikörper beispielsweise einen Fluoreszenz- Marker tragen. Es ist jedoch nicht erforderlich, daß der Antikörper der vorliegenden Erfindung einen Kennzeichnungsoder Marker-Bestandteil trägt. So kann beispielsweise der Antikörper der vorliegenden Erfindung mit einem zweiten Antikörper nachgewiesen werden, bei dem es sich um einen Antikörper gegen Antikörper der Spezies der Antikörper der vorliegenden Erfindung handelt. Der zweite Antikörper weist einen Kennzeichnungs- oder Marker-Bestandteil auf.
Diese Antikörper oder Sonden können verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines oben definierten Polypeptids oder der korrespondierenden DNA oder RNA, wenn dies zweckmäßig ist, nachzuweisen oder anzuzeigen, und somit die Anwesenheit oder Abwesenheit von Material, das inhibitorische Wirkung gegen Elastase besitzt.
Daher können die Sonden oder Antikörper verwendet werden, um anzuzeigen, ob ein durch Elastase vermittelter Zustand zumindestens zum Teil durch die Abwesenheit einer Elastase inhibierenden Substanz verursacht wird.
Die Fähigkeit der Polypeptide der vorliegenden Erfindung als Elastase-Inhibitor zu wirken, wurde durch die Fähigkeit einer Verbindung der Erfindung, die Einwirkung menschlicher Leukozyten-Elastase (HLE) auf ein Peptid-Substrat mit niedrigem Molekulargewicht zu inhibieren, bestimmt. Die Stärke eines Inhibitors wurde bestimmt, indem eine kinetische Bestimmung der Dissoziations-Konstante Ki des durch durch Wechselwirkung des Inhibitors mit HLE gebildeten Komplexes vorgenommen wurde. Bei dem verwendeten Substrat handelte es sich um das Anilid Methoxysuccinyl-alanyl-alanyl-prolylvaline-p-nitroanilid, nämlich wie von K. Nakajima et al., in the J. Biol. Chem., 254: 4027 - 4032 (1979) und von T. Teshima et al. in J. Biol. Chem., 257: Nr. 9, 5085 - 5091 (1982) beschrieben. Das in diesen Untersuchungen verwendete HLE-Enzym ist von Elastin Products in St. Louis, Missouri erhältlich oder kann gemäß B.R. Viscarello et al., in Preperative Biochemistry, Bd. 13, Seiten 57 - 67 (1983) gereinigt werden.
Die oben definierten Polypeptide können so verwendet werden, wie sie erhalten wurden, oder sie können auf bekannte und geeignete Art und Weise gereinigt und als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden, beispielsweise im Gemisch mit einem pharmazeutischen geeigneten Streckmittel oder Trägermittel. Die Verabreichung kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, die im Fachgebiet bekannt sind. Insbesondere kann die Verabreichung parenteral erfolgen, beispielsweise intranasal, rektal, pulmonal und durch Injektion, beispielsweise durch intramuskuläre oder subkutane Injektion. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden dem zu verwendenden Verabreichungstyp entsprechend formuliert. Wenn die Zusammensetzung beispielsweise intranasal verabreicht werden soll, kann die Zusammensetzung in Form eines gepulverten Aerosols formuliert werden, und wenn die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht werden soll, kann sie in Form einer sterilen Lösung oder Suspension formuliert werden. Geeignete Streckmittel sind beispielsweise wäßrige Lösungen und es können Zusätze wie Puffer und oberflächenaktive Mittel zugegeben werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch Formulierungen mit Langzeitwirkung. Beispielsweise können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem biologisch abbaubaren Polymer eingekapselt sein, oder sie können in einer Matrix aus einem derartigen Polymer dispergiert sein, so daß das Polypeptid in dem Maß freigesetzt wird, wie der Abbau der Polymer- Matrix fortschreitet. Geeignete biologisch abbaubare Polymere zur Verwendung für Formulierungen mit Langzeitwirkung sind beispielsweise Polyester, die durch Hydrolyse allmählich abgebaut werden, wenn sie in eine wäßrige, physiologische Umgebung gebracht werden. Eine besondere pharmazeutische Zusammensetzung, die eine ausgedehnte Freisetzung eines Polypeptids gestattet, ist im europäischen Patent 58481 beschrieben. Bei dieser Zusammensetzung wird ein Polylactid verwendet und wenn sie in eine wäßrige, physiologische Umgebung gelangt, wird aus der Zusammensetzung auf kontinuierliche Art und Weise das Polypeptid freigesetzt, bis im wesentlichen das gesamte Polypeptid freigesetzt ist.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind potentiell nützlich zur Behandlung von Beschwerden, bei denen die durch Elastase vermittelte Gewebeproteolyse eine Rolle spielt.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung (wie hier definiert) können einem Warmblüter, der sie benötigt, verabreicht werden, insbesondere einem Menschen, nämlich zur Behandlung von entzündlichen Zuständen, pulmonaren Beschwerden, Hautbeschwerden und Beschwerden, bei denen die Schleimsekretion eine Rolle spielt. Beispiele für Beschwerden, bei denen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung potentiell nützlich sind, umfassen Atherosklerose, Arthritis, Emphysem, das adulte Respirationssyndrom, cystische Fibrose, Bronchitis, akute nicht-lymphoblastische Leukämie und Psoriasis.
Die vorliegende Erfindung gibt auch die Verwendung eines Polypeptids (wie hier definiert) oder eines Analogen davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen wie den oben erwähnten an.
Daher stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung eines Warmblüters, beispielsweise eines Menschen, bereit, bei dem dem Warmblüter eine wirksame Menge eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung (wie oben definiert) oder ein Analoges davon verabreicht wird, um Krankheiten wie die oben erwähnten zu behandeln.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter beispielhaft veranschaulicht.
Figur 1 veranschaulicht ein Verfahren zur Kationenaustausch-Chromatographie, das zur Extraktion und Reinigung des Polypeptids mit der Formel I aus Psoriasis-Herden verwendet wurde;
Figur 2 veranschaulicht ein Verfahren zur Umkehrphasen-C8-Chromatographie, das zur Extraktion und Reinigung des Polypeptids mit der Formel I aus Psoriasis-Herden verwendet wurde;
Figur 3 veranschaulicht ein Verfahren zur Poly-sulfoethylaspartamid-Chromatographie, das zur Extraktion und Reinigung des Polypeptids mit der Formel I aus Psoriasis- Herden verwendet wurde;
Figur 4 veranschaulicht ein Verfahren zur Umkehrphasen-C&sub1;&sub8;-Chromatographie, das zur Extraktion und Reinigung des Polypeptids mit der Formel I aus Psoriasis- Herden verwendet wurde;
Figur 5 veranschaulicht ein Verfahren zur analytischen Gel-Chromatographie, das zur Bestimmung des Molekulargewichts des Polypeptids mit der Formel I verwendet wurde;
Figur 6 veranschaulicht ein Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung, das zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes des Polypeptids mit der Formel I verwendet wurde;
Figur 7 veranschaulicht die Titration menschlicher Leukozyten-Elastase mit dem Polypeptid mit der Formel I;
Figur 8 zeigt die Sequenz des Polypeptids mit der Formel I ("den prominenten Inhibitor");
Figuren 9 bis 12 veranschaulichen das Verfahren, das zur Sequenzierung des prominenten Inhibitors (das Polypeptid mit der Formel I) verwendet wurde;
Figur 13 veranschaulicht eine DNA-Sequenz, die zum Erhalt der Expression des Polypeptids mit der Formel I verwendet wurde;
Figuren 14 und 15 veranschaulichen cDNA-Teilsequenzen für das Polypeptid mit der Formel I;
Figur 16 veranschaulicht die cDNA-Sequenz für das Polypeptid mit der Formel I;
Figur 17 veranschaulicht das Plasmid pUEX2;
Figur 18 veranschaulicht das Plasmid pDP258, das in dem Verfahren zum Erhalt der Expression eines reifen Polypeptids mit der Formel I in Hefe verwendet wurde; und
Figur 19 veranschaulicht die Ansammlung des Polypeptids mit der Formel I in Hefe.

Isolation des menschlichen Leukozyten-Elastase-Inhibitors

Von der Haut von Patienten mit Psoriasis oder atopischer Dermatitis wurden Schuppen gesammelt, vereinigt und in Chargen von zwischen 1 und 100 g extrahiert. Das Schuppen- Material, das normalen menschlichen Kallus einschloß, wurde in destilliertem Wasser (10 bis 200 ml) suspendiert. Dann wurde der pH der Suspension unter Verwendung von 1 %iger Citronen- und Ameisensäure auf pH 2,8 eingestellt, und dann wurde mit 10 Vol.-% Ethanol verdünnt und eingefroren (-80ºC). Die mechanische Zerkleinerung wurde dann mit einem Ultraturrax (1 h auf Eis), Ultraschall (15 min, 400 Watt), Ultraturrax (1 h) und Zentrifugation (10 min bei 5000 x g) durchgeführt. Die erhaltenen Sedimente wurden mit 50 %igen Ethanol und mit 50 %igem Citrat/formiat (pH 3,0) reextrahiert und die überstände beider Extraktionen wurden vereinigt. Die vereinigten Extrakte wurde durch Ultrafiltration (Amicon YM5) konzentriert und gegen 0,01 M Ammoniumformiat (pH 4,0) unter Erhalt des Rohextraktes diafiltriert.

Reinigung

Der mit dem oben beschriebenen Isolations-Verfahren erhaltene Rohextrakt wurde chromatographisch gereinigt (gemäß den unten beschriebenen Verfahren), um eine homogene Substanzprobe zu erhalten, die inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzt.
Der Rohextrakt wurde zuerst mittels Kationenaustausch-HPLC gereinigt, um Material, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzt, von Material wie der menschlichen Leukozyten-Elastase selber abzutrennen. Wie in Fig. 1 veranschaulicht, wurde Material, das inhibitorische Wirkung gegen HLE besitzt, in Form eines breiten Peaks zwischen etwa 26 und 58 min eluiert. Die den prominenten Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden weiter auf einer C&sub8;-Umkehrphasen-Säule gereinigt und rechromatographiert, bis eine ungefähre Homogenität beobachtbar war (Fig. 2).
Diejenigen Fraktionen, die Material enthielten, das inhibitorische Wirkung gegen HLE besaß, wurden vereinigt und dann auf einer Poly LC-Säule chromatographiert. Die Auftrennung lieferte Material, das einen Bestandteil enthielt, bei dem es sich um den prominenten Inhibitor handelte. Dieser Bestandteil wurde weiter durch C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Chromatographie (Fig. 4) gereinigt. Bei einigen Präparationen waren zusätzliche chromatographische Schritte, nämlich Größenausschluß-HPLC und Umkehrphasen-Poly F-HPLC erforderlich, um mehr als 95 % Reinheit zu erhalten (durch analytische Läufe mittels C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Chromatographie, Poly LC und durch die völlige Abwesenheit von Verunreinigungen in der SDS-pAGE und der isoelektrischen Fokussierung bestätigt).

Kationenaustausch-HPLC

Säule: TSK CM 3 - SW (7,5 x 150 mm, LKB Bromma, Schweden);
Lauf: 20 min Puffer A mit einer Flußrate von 0,5 bis 1,0 ml/min;
30 min linearer Gradient bis 100 % Puffer B mit einer Flußrate von 1,0 ml/min; 20 min Puffer B und 50 min Puffer C.
Puffer A: 0,01 M Ammoniumformiat, pH 4,0,
Puffer B: 0,5 M Ammoniumformiat, pH 4,0,
Puffer C: 0,5 M Ammoniumformiat, pH 3,0.
Der Rohextrakt unter den obigen Bedingungen chromatographiert, wobei automatisch 60 Tropfen pro Fraktion gesammelt wurden, und zwar mit UV-Detektion bei 280 nm. Diejenigen Fraktionen, die Material enthielten, das inhibitorische Wirkung besaß, das durch den Gradienten eluiert wurde, wurden vereinigt, konzentriert und gegen 0,1 %ige TFA diafiltriert.

Umkehrphasen-C&sub8;-HPLC

Säule: Nukleosil 300 - 7 C&sub8; - HPLC Säule (250 x 14,7 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland)
Lauf: Flußrate - 3 ml/min
20 ml 20 %iger Puffer B; 75 ml linearer Gradient bis 60 % Puffer B; 15 ml linearer Gradient bis 100 % Puffer B; 30 ml 100 % Puffer B
Puffer A: 0,1 %ige TFA
Puffer B: 0,1 %ige TFA in Acetonitril
Die Proben wurden unter den obigen Bedingungen mit UV- Detektion bei 215 nm und mit peakweiser Sammlung chromatographiert. Fraktionen, die Material enthielten, das inhibitorische Wirkung besaß, welche mit dem Gradienten auf bis zu 60 % Puffer B eluiert wurden, wurden vereinigt lyophilisiert und auf der gleichen Säule und unter identischen Bedingungen rechromatographiert.

Poly-(2-Sulfoethylasdartamid) - HPLC

Säule: Poly LC-Säule (200 x 4,6 mm, Columbia, MD, USA)
Lauf: Flußrate 1 ml/min
10 ml Puffer A; 30 ml linearer Gradient bis 50 % Puffer B; 10 ml linearer Gradient bis 100 % Puffer B; 10 ml Puffer B
Puffer A: 5 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,1 + 25 % Acetonitril
Puffer B: 5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 M KCl, pH 3,1 + 25 % Acetonitril
Die lyophilisierten Proben wurden in Puffer A solubilisiert und dann unter den obigen Bedingungen mit UV-Detektion bei 220 nm und mit peakweiser Sammlung chromatographiert.

Umkehrphasen-C&sub1;&sub8;-HPLC

Säule: Nucleosil-100-5 C&sub1;&sub8; (250 x 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland)
Lauf: Flußrate 1 ml/min
30 ml linearer Gradient von 10 bis 40 % Puffer B, 10 ml linearer Gradient bis 100 % Puffer B; 10 ml Puffer B
Puffer A: 0,1 %ige TFA
Puffer B: 0,1 %ige TFA in Acetonitril
Die Proben wurden unter den obigen Bedingungen mit UV- Detektion bei 215 nm und mit peakweiser Sammlung chromatographiert. Falls erforderlich, wurden Fraktionen, die Material enthielten, das inhibitorische Wirkung besaß, in dem gleichen System bis zum Erreichen der Homogenität rechromatographiert.

Größenausschluß-HPLC

Säule: TSK 2000-Säule (600 x 7,5 mm, LKB, Bromma, Schweden)
Lauf: Flußrate 1 ml/min 0,1 %ige TFA
Die Proben wurden unter den obigen Bedingungen mit UV- Detektion bei 215 nm chromatographiert und mit 20 Tropfen pro Fraktion gesammelt. Mr wurde unter Verwendung der Peptide Val-gly-ser-glu, Insulin, B-Kettenfragment 22 - 36, Aprotinin, Hühnerei-Albumin und Rinderserum-Albumin geeicht.

Umkehrdhasen-Poly F-HPLC

Säule: Poly-F-Säule (80 x 6,2 mm, Du Pont, Dreieich, Deutschland)
Lauf: Flußrate 1 ml/min
30 ml linearer Gradient von 10 % Puffer B bis 40 % Puffer B; 2 ml linearer Gradient bis 100 % Puffer B; 10 ml Puffer B
Puffer A: 1 %iges NH&sub4;
Puffer B: 1 %iges NH&sub4; in Acetonitril
Die lyophilisierten Proben wurden in Puffer A solubilisiert und unter den obigen Bedingungen mit UV-Detektion bei 215 nm chromatographiert und peakweise gesammelt.

Protein-Bestimmung

Die Protein-Konzentrationen wurden durch Integration der Absorption bei 215 nm in der Umkehrphasen-C&sub1;&sub8;-Chromatographie bestimmt. Die folgenden Eichsubstanzen wurden verwendet: Ubiquitin (Sigma) und rekombinantes Eglin C (Ciba-Geigy).

SDS-pAGE

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-pAGE) wurde unter Verwendung eines Pharmacia Phast Systems (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) und homogenen 20 % SDS-Gelen gemäß den Herstellerinstruktionen durchgeführt. Die Proben wurden lyophilisiert und durch Kochen (5 min) in 0,01 M H&sub3;PO&sub4;, 8 M Harnstoff, 2,5 % SDS, 0,02 % Bromphenolblau, pH 6,8, reduziert. Als Standards wurden Myoglobin-Fragmente (Phamacia) und Pferde-Myoglobin (Serva) und Ubiquitin (Sigma) verwendet. Die Silberfärbungen wurden gemäß den Herstellerinstruktionen (Sigma) durchgeführt.

Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung wurde unter Verwendung von Servalyt Precoates pH 3 - 10 und Testgemisch 9 (Serva) durchgeführt. Es wurde 30 min bei 3 Watt vorfokussiert, und die Silberfärbung (Sigma) oder Coomassieblau-R-Färbung wurden gemäß den Serva-Instruktionen durchgeführt. Parallel dazu wurden die Precoates in Scheiben geschnitten und zur Lokalisierung inhibitorisch wirksamer Peptide eluiert. Die Scheiben von ungefähr 1 mm wurden mit 100 µl Acetonitril eluiert. Die Eluate wurden trocknen gelassen und dann in 100 µl Puffer (0,1 M HEPES, 0,5 M NaCl, 1 % BSA, pH 7,5), der 20 ng HLE enthielt, gelöst. Nach 30 min Inkubation wurde die restliche HLE-Aktivität bestimmt.

Biologische Eigrenschaften

Die Inhibition mehrerer Proteasen durch den prominenten Inhibitor wurde gemäß den im folgenden beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Protease Dissoziations-Konstante (Ki) Substrat Menschliche Leukozyten- Elastase Schweine-Pankreas-Elastase Menschliches Cathepsin G Alpha-Chymotrypsin Trypsin Plasmin (n.i.: keine Inhibition)

Inhibition der menschlichen Leukozyten-Elastase

Die Aktivität der menschlichen Leukozyten-Elastase (EC 3.4.21.37) wurde gemäß dem Verfahren von Nakajima et al. (7) bestimmt. Die Inhibition von HLE wurde unter Verwendung des synthetischen Peptids Methoxy-succinylalanyl-alanyl-prolyl-valyl-p-nitroanilid (AAPVpNA, Sigma) bestimmt.
Die Probe (100 µl) und 100 µl HLE (200 ng/ml; Elastin Products Corporation, Pacific, MO, USA) in Assay-Puffer (0,1 M HEPES, 0,5 M NaCl, 10 % DMSO, pH 7,5) wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde Substrat (800 µl, 0,5 mM) in Assay-Puffer zugegeben.
Die Änderungen der Absorption bei 405 nm wurde bis zu 1 h verfolgt und der Prozentsatz der Inhibition wurde aus der Restaktivität und den Kontrollen berechnet. Die Dissoziations-Konstante (Ki) wurde gemäß dem Verfahren von Green und Work (8) in dem gleichen System unter Verwendung von 2 mM Substrat und (1 µg/ml) HLE (Endkonzentrationen) bestimmt.

Inhibition der Schweine-Pankreas-Elastase

Die Aktivität der Schweine-Pankreas-Elastase (E.C. 3.4.21.36) wurde unter Verwendung des fluorogenen Substrats Methoxy-succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-valyl-trifluormethylcumarin (AAPV-AFC, Bachem, Bubendorf, Schweiz) bestimmt.
Die Elastase (100 µl) und der Inhibitor (100 µl) wurden 30 min vorinkubiert. Dann wurde eine Lösung des Substrats (1,8 ml einer 0,1 mM Lösung) zugegeben. Die Fluoreszenz, Ex 400 Em 505, wurde verfolgt und die prozentuale Inhibition wurde aus der Anfangsaktivität der Proben und der Kontrollen berechnet. Die Dissoziations-Konstante (Ki) wurde gemäß dem Verfahren von Green und Work (8) bestimmt.

Inhibition von Cathepsin G und Alpha-Chymotrypsin

Die Aktivitäten von Cathepsin G und Alpha-Chymotrypsin wurden gemäß dem Verfahren von Nakajima et al. (9) unter Verwendung eines Analogen von HLE - Succinyl-alanyl-alanylprolyl-phenylalanyl-p-nitroanilid (AAPFpNH, Sigma) bestimmt. Für die Inhibitionsversuche betrug die höchste Konzentration an dem Inhibitor 1 µg/ml, was eine dreifache molare Konzentration im Vergleich zu Cathepsin G und Alpha- Chymotrypsin darstellt.

Inhibition von Trypsin und Plasmin

100 µl Inhibitor (1 µg/ml) und 100 µl Trypsin (1 µg/ml) oder Plasmin (1 µg/ml), wie zweckmäßig, wurden 30 min vor der Zugabe des Substrats, 0,1 mM Tosyl-glycyl-prolyl-lysinpNA (Boehringer, Mannheim, FRG), in 0,05 M HEPES, 0,12 M NaCl, pH 7,5 inkubiert.

Inhibition von Proteinase 3

Die Proteinase 3 wurde aus menschlichen polymorphkernigen Leukozyten unter Verwendung des von Ludemann in J. Exp. Med. 171, 357 - 362, 1990 beschriebenen Verfahrens gereinigt. Die Abwesenheit von menschlicher Leukozyten- Elastase und Cathepsin G wurde durch die fehlende Aktivität der Proteinase 3-Präparation mit den Substraten Methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilid (AAPVpNA) bzw. Succinyl-ala-ala-phe-p-nitroanilid gemäß dem Verfahren von Nakajima (7) bestätigt.
Die elastinolytische Aktivität wurde durch Hydrolyse von Rinder-Ligamentum-nuchae-Elastin-FITC (Elastin Products Corporation, USA) bestimmt.
Die Proteinase-3-Präparation (1 µl) wurde bei 37ºC 30 min mit dem Elastase-Inhibitor mit der Formel I (0 - 1 µg) in Carbonat-Puffer (50 µl, 0,1 M), NaN&sub3; (0,02 %), Brij 35 (0,01 %), pH 8,5 vorinkubiert. Elastin-FITC (1 mg) in Carbonat-Puffer (100 µl, 0,1 M), NaN&sub3; (0,02 %), Brij 35 (0,01 %), pH 8,5. Das Gemisch wurde bei 37ºC 4 h unter mildem Schütteln inkubiert und dann bei 6000 x g zentrifugiert. Die überstände wurden 1:20 verdünnt und die Fluoreszenz des solubilisierten Elastin-FITC wurde unter Verwendung eines Perkin Elmer LS 50 Mikrotiterplattenlesers bei Ex 489 nm, Em 513 nm bestimmt. Die Fluoreszenz wurde durch enzymfreie Kontrollen korrigiert und die Inhibition wurde in Form des Prozentsatzes inhibitorfreier Kontrollen ausgedrückt.
Es wurde gefunden, daß das Polypeptid mit der Formel I ein starker Inhibitor von Protinase 3 ist, mit einer Aktivität, die einem IC&sub5;&sub0; von 9,5 x 10&supmin;&sup9;M entspricht.

Charakterisierung

Die analytische Größenausschluß-Chromatographie (Tsk 2000) des prominenten Inhibitors ergab ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 5 und 10 KD (Fig. 5). Das Molekulargewicht des prominenten Inhibitors auf SDS-pAGE betrug etwa 9 KD, und zwar mit einer Wanderung in enger Nachbarschaft mit Ubiquitin (MW 8500) wie in Fig. 5 gezeigt.
Der isoelektrische Punkt des prominenten Inhibitors wurde mit pH 9,7 bestimmt, nämlich wie durch Silber-Färbung und durch parallelen enzymatischen Nachweis des Inhibitors in Gel-Scheiben (Fig. 6) gezeigt.
Es wurde gefunden, daß der prominente Inhibitor die Serin- Elastase HLE und die Schweine-Pankreas-Elastase inhibiert. Jedoch wurden weder Alpha-Chymotrypsin noch Trypsin und Plasmin signifikant durch einen mindestens dreifachen Überschuß an dem Inhibitor inhibiert. Die Gleichgewichts- Dissoziations-Konstante (Ki) für die Inhibition von HLE wurde gemäß dem Verfahren von Green und Work (8) bestimmt, nämlich wie in Fig. 7 gezeigt.
Der Inhibitor erwies sich auch als säurestabil.

Strukturbestimmung des HLE-Inhibitors

Direkte Sequenzierung

Ungefähr 5 µg des gereinigten Materials des prominenten Inhibitors wurden der Sequenz-Analyse unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 470A Gasphasen-Sequenzierers mit einer Model 120A-Online-Analyse der Phenylthiohydantoine unterzogen. Dadurch ergab sich die Sequenz der 30 in Fig. 8 gezeigten Reste, wobei auf die Cysteine durch die Abwesenheit irgendwelcher identifizierter Reste geschlossen wurde. Die Anfangsausbeuten an Aminosäure-Resten war mit mit einem Einzelketten-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 6 - 8 K Dalton verträglich.

Carboxamidomethylierung (CAM)

Der gereinigte prominente Inhibitor (10 µg) wurde in Wasser (50 µl) gelöst und mit 6 M Guanidin-Hydrochlond, 0,1 M Tris-Hydrochlond-Puffer, pH 8,5 (30 µl) gemischt. Das Test-Röhrchen wurde mit Stickstoff gespült und dann wurde eine Dithiothreitol-Lösung zugegeben (5 µl einer 50 mg/ml- Lösungs in Guanidin-Puffer). Das Test-Röhrchen wurde wiederum mit Stickstoff gespült, verschlossen und 4 h bei 37ºC gehalten. Dann wurde Jodacetamid( 5 mg) in Guanidin-Puffer (50 µl) zugegeben und nach weiterem Spülen mit Stickstoff wurde das Röhrchen im Dunklen 1 h bei Raumtemperatur gehalten. Die Probe wurde mit 0,1 %iger wäßriger Trifluoressigsäure auf 1 ml verdünnt und direkt auf eine Vydac-C18-Säule (25 x 0,46 cm) gegeben. Die Säule wurde bei 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser bis 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril während 70 min entwickelt. Dadurch ergaben sich zwei Peaks (Fig. 9), nämlich ein Nebenbestandteil bei den Fraktionen 33 - 34 und ein Hauptbestandteil (ca. 67 %) bei 35 - 36. Jeder Bestandteil wurde separat erneut den Carboxamidomethylierungs-Bedingungen ausgesetzt, aber weitere Chromatographie zeigte, daß sie unverändert blieben, was zeigt, daß die ursprüngliche Umsetzung vollständig war.

Aminosäure-Analyse

Die Hälfte des Nebenbestandteils der Carboxamidomethylierung wurde mit 6 N Chlorwasserstoffsäure, die 1 % Phenol enthielt, unter Vakuum 16 h bei 110ºC hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde unter Verwendung eines LKB Alpha plus- Aminosäure-Analysators analysiert und ergab die in Tabelle 2 gezeigten Verhältnisse. Obwohl die analysierte Probe sehr klein war, wurde keine Hintergrundkorrektur vorgenommen. Tabelle 2 Aminosäure Verhältnis, basierend auf dem 57 AA-Peptid AAS, gefunden im sequenzierten Peptid

Verdauung mit Chymotrypsin

C&sub1;: Die übrige Hälfte des CAM-Derivats in den Fraktionen 33 - 34 wurde in 0,1 M Ammoniumbicarbonat (50 µl) und 0,2 M Calciumchlorid (1 µl) aufgenommen und mit Chymotrypsin (Worthington, 10 µl einer 20 µg/ml-Lösung) behandelt. die Lösung wurde 1 h bei 37ºC gehalten und dann mit 0,1 %iger Trifluoressigsäure in Wasser (200 µl) zur direkten Ladung auf eine Vydac C&sub1;&sub8;-Säule verdünnt. Dann wurde ein linearer Gradient auf 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril 60 min lang mit einer Rate von 1 ml/min laufen gelassen. Dadurch ergaben sich drei Hauptpeaks, nämlich wie in Fig. 10 gezeigt. Jeder davon wurde soweit wie möglich sequenziert und die Ergebnisse sind im folgenden angegeben.
C&sub2;: Die Hälfte des CAM-Produkts in den Fraktionen 35 -36 wurde mit Chymotrypsin unter den gleichen Bedingungen verdaut. Das HPLC-Profil (Fig. 11) zeigte, daß ein fortgeschrittenerer Abbau stattgefunden hatte, obwohl die Peaks 1 und 3 (Fig. 10) im gleichen Ausmaß wie die Peaks 1 und 8 der zweiten Verdauung vorhanden zu sein schienen. Der andere Peak, nämlich 2 in Fig. 10, war in der zweiten Verdauung im Verhältnis viel kleiner und nicht deutlich an der gleichen Position wie die beiden anderen. Die zusätzlichen Peaks von C&sub2;, d.h. 3, 4, 6, 7 und 9, wurden sequenziert. Diese sind abgesondert von Peak 7 gezeigt (Fig. 8), der die gleiche Sequenz wie 6 hatte, soweit sie bestimmt wurde.

Verdauung mit Trypsin

T: Der restliche Teil des CAM-Hauptderivats, Fraktionen 35 - 36, wurde in 0,1 M Ammoniumbicarbonat (50 µl) und 0,2 M Calciumchlorid (1 µl) gegeben und mit Trypsin (200 ng in 10 µl 0,1 M Ammoniumbicarbonat) behandelt. Die Lösung wurde 30 min bei 37ºC gehalten, mit 0,1 %iger wäßriger Trifluoressigsäure verdünnt und sofort auf eine C&sub1;&sub8;- Säule geladen, die wie bei den anderen Enzym-Verdauungen entwickelt wurde (Fig. 5). Dadurch ergaben sich zwei definierbare Produkt-Peaks und es bleib kein Ausgangsmaterial zurück. Die relevanten Sequenz-Daten sind angegeben (Fig. 1).
Es wurde eine einzelne Aminosäure-Analyse durchgeführt, die statt eines genauen lediglich einen ungefähren Amino-Gehalt ergab, was die Auswahl von Enzymen zum Abbau zu kleineren Fragmenten erleichterte.
Die direkte Sequenzierung ergab die ersten 30 Reste und dies wurde durch das lange tryptische Fragment T10 bestätigt. Die Trypsin-Bedingungen gestatteten große Fragmente bei den Hauptprodukten, d.h. es wurden nicht alle Lysin-Bindungen aufgebrochen und diese Fragmente, welche die volle Struktur umfassen, sind in Fig. 8 angegeben. Die Unterbrechungspunkte waren auf basische Reste beschränkt.
Im Gegensatz dazu spaltete Chymotrypsin nicht nach dem einen aromatischen Rest, sondern nach den beiden Methioninen und ebenso nach dem Leucin-33. Außerdem trat nach dem Leucin-20 Spaltung auf.
Das C-terminale Glutamin wurde auf der Grundlage eines sehr kleinen aber nachweisbaren Restes zugeordnet, der sowohl in den T 9- als auch den C 2-3-Peptiden auf starke Prolin- Peaks folgend gefunden wurde. Dies kann jedoch bei einem derartigen C-terminalen Rest erwartet werden. Verschiedene andere chymotryptische Peptide, die nicht in Fig. 8 enthalten sind, lieferten weitere Bestätigung der Struktur.
Die chymotryptische Verdauung des kleineren CAM-Derivats wurde so weit wie möglich sequenziert und ergab die folgenden Daten: Aus den verfügbaren Daten ließen sich die Unterschiede zwischen den CAM-Haupt- und Nebenderivaten nicht erkennen. Dies beruhte nicht auf irgendeiner Verlängerung oder Deletion am N-Terminus.
Bei der festgestellten Struktur (Fig. 8) handelte es sich um die eines kleinen, überwiegend basischen Polypeptids. Es besitzt einen ungewöhnlich hohen Gehalt an Prolin für ein derartiges Molekül und auch das Glycin und das Cystein deuten auf ein stark käfigartiges Molekül hin.
Zusätzlich zu dem prominenten Inhibitor, der ein Polypeptid mit 57 Resten aufweist, wurde weiteres Material isoliert, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten- Elastase besitzt und die Polypeptide darin wurden zum Teil sequenziert. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Peak II - Hauptbestandteil E Nebenbestandteil D
Peak III - Hauptbestandteil D Nebenbestandteil E
Peak IV - Hauptbestandteil B Nebenbestandteil C
Peak V - Hauptbestandteil A Der Nebenbestandteil beginnt bei der gleichen Position wie der Haupt-Elastase- Inhibitor. Bestandteil A: Bestandteil B: Bestandteil C: Bestandteil D: Bestandteil E:
Bei den obigen N-terminalen Sequenzen wurden die Sequenzen 1 - 19, 1 - 6 und 1 - 4 der Bestandteile A, B bzw. C mit weniger Sicherheit bestimmt als der folgende Teil der Sequenz.
Es wurde gefunden, daß die isolierten zusätzlichen Bestandteile ähnliche Eigenschaft wie der prominente Inhibitor haben, beispielsweise ähnliche biologische Eigenschaften.
Es wurde somit gefunden, daß das Material, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzt, einen prominenten Inhibitor enthält, der ein säurestabiles Polypeptid enthält, von dem angenommen wird, daß es an menschliche Leukozyten-Elastase mit einem molaren Verhältnis von 1:1 bindet. Es wird angenommen, daß dieser Inhibitor in einer käfigartigen Struktur gebunden wird, nämlich mit einer Anzahl von Disulfid-Bindungen, die das Peptid in dieser Form halten. Die hohe Affinität und Spezifität für Elastasen und insbesondere für HLE macht den Inhibitor für die Behandlung von Zuständen verwendbar, bei denen die Elastase-vermittelte Gewebe-Proteolyse eine Rolle spielt, beispielsweise bei der Psoriasis und beim Emphysem. Es wurden auch andere Polypeptide isoliert, was auf eine Familie von Polypeptiden mit ähnlichen Eigenschaften wie der prominente Inhibitor hinweist, und in der Tat zeigt die Teilsequenzierung der verwandten Polypeptide die Gegenwart zumindestens einen Teils der Aminosäure-Sequenz des prominenten Inhibitors.
Bei Proteinase 3 handelt es sich um die dritte elastinabbauende Serin-Protease, neben menschlicher Leukozyten- Elastase und Schweine-Pankreas-Elastase, die durch den prominenten Inhibitor (das Polypeptid mit der Formel 1) wirksam inhibiert wird. Da es sich bei diesem Inhibitor um einen physiologischen Regulator der durch menschliche Leukozyten-Elastase vermittelten Gewebe-Proteolyse der Haut und wahrscheinlich auch in anderen Organen zu handeln scheint, ist es von Interesse, daß dieser Inhibitor auch Proteinase 3 inhibiert. Beide Enzyme menschlicher Leukozyten-Elastase sind Bestandteile der azurophilen Granula von Neutrophilen und beide sind in der Lage, in Hamstern nach der Einimpfung des Enzyms in die Luftwege Emphysem-ähnliche Gewebezerstörungen hervorzurufen (Kao, R.C., Wehner N. G., Skubitz K. M., Gray B. H., J. R. Huidal, Protinase 3 A Distinct Human Polymorphonuclear Leukocyte Proteinase that produces Emphysema in Hamsters, J. Clin. Invest. 82, 1963 - 1973, 1988). Da dieser Inhibitor in der Lage ist, jedes Enzym nach der Voradsorption an das Enzym zu inhibieren, ist dieser Inhibitor von potentiellem therapeutischen Wert bei Lungen-Erkrankungen mit durch Elastase und Proteinase 3 vermittelter Gewebezerstörung.

Svnthese des menschlichen Leukozvten-Elastase-Inhibitors

Das Polypeptid mit der Formel I ("der prominente Inhibitor") wurde wie folgt synthetisiert.
Es wurde eine DNA-Sequenz konstruiert, welche die Aminosäure-Sequenz des Polypeptids mit der Formel I codiert, und zwar unter Beachtung des folgenden:
1) Einzelsträngige kohäsive Termini, um die Ligation in geeignete Stellen in einem Plasmid zu gestatten.
2) Eine Reihe von Restriktions-Endonuklease-Sequenzen am 5'-Ende, um die anschließende genetische Manipulation zu erleichtern.
3) Translations-Terminations-Codons.
4) Die Codons am 5'-Ende der codierenden Region wurden normalerweise A/T-reich ausgewählt. Die anderen Codons wurden normalerweise so ausgewählt wie sie zur Expression in Hefe und/oder in E. coli bevorzugt werden. Das Gen wurde aus den in Tabelle 3 gezeigten 6 Oligonukleotiden zusammengesetzt. Tabelle 3 Code Sequenz (5' bis 3') Größe (Basen)

Herstellung der Oligonukleotide

Die in Tabelle 3 gezeigten Oligonukleotid-Sequenzen wurden auf einem Applied Biosystems 380A DNA-Synthesiser aus 5'- Dimethoxytritylbase-geschützten Nukleosid-2-cyanoethyl-N,Ndiisopropylphosphoramiditen und geschützten Nukleosiden hergestellt, die an Glasträgern mit kontrollierten Poren gebunden waren, und zwar im 0,2 µMol Maßstab gemäß den von Applied Biosystems Inc. gelieferten Protokollen.
Jedes Oligonukleotid wurde nach der Spaltung von dem festen Träger und der Entfernung aller Schutzgruppen in Wasser (1 ml) gelöst. Dann wurde eine 3 M Natriumacetat-Lösung (pH 5,6, 40 µl) und Ethanol (1 ml) zu den Oligonukleotid-Lösungen (400 µl) gegeben und die Gemische wurden bei -70ºC 20 h gelagert. Die erhaltenen Niederschläge wurden durch Zentrifugation (13 000 UpM für 10 min) gesammelt und die Pellets wurden mit Ethanol:Wasser (7:3) (200 µl) gewaschen und dann kurz unter Vakuum getrocknet und dann in Wasser (15 µl) und 10 µl eines Formamid/Farbstoff-Gemisches (10 mM NaOH, 0,5 mM EDTA, 0,01 % Bromphenolblau, 0,01 % Xylolcyanol, 80 % Formamid) gelöst.
Die Oligonukleotide wurden auf einem 10 %igen Polyacrylamid-Gel in 50 mM Tris-borat (pH 8,3), das 8,3 M Harnstoff enthielt, gereinigt. Die Oligonukleotide mit der richtigen Länge wurden durch UV-Shadowing (Narang et al., 1979 in Methods in Enzymology Band 68, 90 - 98) identifiziert -normalerweise die herausragendste Bande - aus dem Gel ausgeschnitten und in 5 mM Tris-borat (pH 8,3) bei 300 mV 3 - 4 h elektroeluiert. Die wäßrige Lösung wurde durch Behandlung mit n-Butanol auf etwa 200 µl konzentriert (Mischen, Zentrifugieren und Entfernen der oberen organischen Schicht). Das gereinigte Oligonukleotid wurde bei -70ºC 20 h lang aus einer 0,3 M Natriumacetat-Lösung durch die Zugabe von Ethanol (2,5 Volumina) ausgefällt.

Zusammensetzung des Gens

Die Oligonukleotide ELI2 bis ELI5 (jeweils 200 pM) wurden mit T4-Polynukleotid-Kinase (3,6 Einheiten) phosphoryliert, und zwar 2 h lang bei 37ºC in 25 µl einer Lösung, die ATP (800 pM, enthaltend 25 pM gamma-³²P ATP), 100 µM Spermidin, 20 mM DTT, 10 mM MgC1&sub2;, 50 mM Tris-HCL (pH 9,0) und 0,1 mM EDTA enthielt. Die Lösungen wurden 5 min lang auf 100ºC erhitzt, um die Reaktion abzubrechen, dann wurden sie in Paaren gemischt, nämlich wie in Tabelle 2 gezeigt, um die Doppelstränge I bis III zu ergeben (die Oligonukleotide ELI1 und ELI6 (200 mM in 25 µl) wurden unphosphoryliert verwendet). Dann wurde 0,3 M Natriumacetat (pH 5,6, 200 µl) und Ethanol (850 µl) zugegeben und die Doppelstränge wurden bei -20ºC für 20 h ausgefällt. Die erhaltenen Niederschläge wurden durch Zentrifugation gesammelt und mit Ethanol: Wasser (7:3) gewaschen und dann in Wasser (50 µl) gelöst. Die Oligonukleotid-Paare wurden zusammengeschmolzen, indem die Lösungen zuerst 2 min in einem siedenden Wasserbad auf 100ºC erhitzt wurden. Dann wurde das Bad langsam auf 40ºC (etwa 4 h) abkühlen gelassen. Die Lösungen, welche die Doppeistränge I und II enthielten, wurden vereinigt, lyophilisiert und in 30 µl einer Lösung gelöst, die T4 DNA- Ligase (1 Einheit, BRL), 50 mM Tris (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 5 % (g/v) PEG 8000, 1 mM ATP, 1 mM DTT enthielt (BRL, Focus Band 8, Nr. 1, Winter 1986) und die DNA wurde 5 min bei 30ºC ligiert, anschließend 20 h bei 16ºC. Dann wurde 3 M Natriumacetat (20 µl) und Wasser (150 µl) zugegeben und das Produkt wurde durch Zugabe von Ethanol (750 µl) und 20 h Kühlen auf -20ºC ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und mit Ethanol (1 ml) gewaschen, dann in Wasser (15 µl) und Formamid/Farbstoff-Gemisch (10 µl) gelöst und auf einem 10 %igen Polyacylamid-Gel in 50 mM Tris-borat (pH 8,3), 1 mM EDTA und 8,3 M Harnstoff gereinigt. Die Banden für Stränge mit einer Länge von 132 Basen und 135 Basen wurden durch Autoradiographie identifiziert und zusammen durch Elektroelution aus einem einzelnen Gel-Streifen isoliert, namlich wie oben für individuelle Oligonukleotid-Sequenzen beschrieben. Die DNA-Stränge wurden zusammengeschmolzen, indem sie zuerst in wäßriger Lösung (50 µl) 2 min bei 100ºC erhitzt und dann über 4 h auf 40ºC abkühlen gelassen wurden.
Der Doppelstrang III wurde an das Produkt der obigen Ligation (I und II) gebunden, und zwar im wesentlichen wie für die Präparation des Produkts beschrieben, mit der Ausnahme, daß das Gemisch vor dem Zusammenschmelzen der kohäsiven Enden auf 40ºC erhitzt wurde. Das Produkt, die in Fig. 13 gezeigte Gen-Sequenz, wurde auf einem 8 %igen Polyacrylamid-Gel gereinigt und wie oben beschrieben durch Elektroelution aus einem Gel-Streifen isoliert. Nach dem Ausfällen wurde das Gen mit T4 Polynukleotid-Kinase phosphoryliert, nämlich wie zuvor für individuelle Oligonukleotide beschrieben, und dann in Wasser (20 µl) gelöst. Tabelle 4 Anzahl der Basen im Doppelstrang Oligonukleotide oberen Strang unteren Strang

Klonierung des synthetischen Gens des menschlichen Elastase-Inhibitors

Das oben beschriebene synthetische Gen wurde in den Plasmid-Vektor pUC18 (exBRL 520-5363SA) kloniert, der eine Mehrfach-Klonier-Sequenz enthält.
Zur Vektor-Herstellung wurde 10 µg pUC18 in Wasser (42 µl) und 10 x B Restriktions-Puffer (BLC) gelöst. Dann wurde die Restriktions-Endonuklease BamHI (3 µl) (BCL, 8 Einheiten/µl) zugegeben und das Gemisch wurde 1 h bei 37ºC inkubiert, bis linearisiertes Plasmid gegenüber supergeknäulten und zirkulären Formen mit einem Bruch in einem der beiden Stränge vorherrschte. Die DNA wurde mit Ethanol bei 4ºC 30 min ausgefällt, mit Ethanol:Wasser (7:3) gewaschen und dann in Wasser (44 µl), 10x Hochsalz-Puffer (BCL) gelöst. Dann wurde die Restriktions-Endonuklease EcoRI (1 µl) (BCL, 90 Einheiten/µl) zugegeben und dann wurde das Gemisch bei 37ºC 1 h inkubiert, bis das große EcoRI-BamHI-Fragment vorherrschte. Die DNA wurde 20 h bei -20ºC ausgefällt, mit Ethanol:Wasser (7:3) gewaschen und dann in Wasser (20 µl) gelöst.
Das große EcoRI-Bam HI-Fragment wurde auf einem 1 %igen präparativen Agarose-Gel gereinigt und wie oben beschrieben elektroeluiert und ausgefällt und dann in Wasser (20 µl) gelöst. Zur Ligation des synthetischen Gens wurde ein Gemisch aus Vektor-DNA (2 µl der EcoRI-BamHI-Fragment-Lösung), synthetischem Gen (5 µl der oben beschriebenen wäßrigen Lösung), 5X Ligase-Puffer (6 µl - 250 mM Tris pH 7,6, 50 mM MgCl&sub2;, 25 % g/v PEG8000, 5 mM ATP, 5 mM DTT exBRL), Wasser (15 µl) und T4-DNA-Ligase (2 µl, 1 Einheit/1 µl) 4 h lang bei 16ºC inkubiert. Das DNA- Gemisch wurde direkt verwendet (entweder 1 µl sauberes Ligations-Gemisch oder 2 µl 5x mit Wasser verdünntes Ligations-Gemisch), um den E. coli-Stamm HB101 zu transformieren. Das DNA-Gemisch (1 oder 2 µl) wurde zu den kompetenten E. coli-HB101-Zellen (20 µl, BRL) auf Eis gegeben und das Gemisch wurde auf Eis 45 min inkubiert und dann 45 S einem Hitzeschock von 42ºC ausgesetzt. Nach 2 min auf Eis wurden 100 µl SOC-Puffer (Bactotrypton 2 %, Hefe- Extakt 0,5 %, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl&sub2;, MgSO&sub4; 20 mM (jeweils 10 mM), Glucose 20 mM) zugegeben und das Gemisch wurde 1 h bei 37ºC inkubiert. Aliguots der Suspensionen wurden auf L-Platten mit 50 µl/ml Ampicillin ausplattiert. Die Transformanten wurden auf die Gegenwart des klonierten synthetischen Gens durchmustert, und zwar durch die Kolonie-Hybridisierung-Analyse nach Verwendung von Standard-Verfahren, die in "Molecular Cloning; A Laboratory Manual" von Maniatis et al. (Cold Spring Harbor) und in der UK-Patentanmeldung 8 502 605 beschrieben sind. Insgesamt wurden 160 Kolonien auf Filtern (Schleicher & Schüll) ausgestrichen, 20 h bei 37ºC gezüchtet, lysiert und gebacken. Die Filter wurden 20 h bei 65ºC mit einer radioaktiven Sonde hybridisiert, die aus der Oligonukleotid-Seguenz ELI 3 (Tabelle 1) unter Verwendung eines Zufallsmarker-Kits (Pharmacia) hergestellt worden war. Sechs Kolonien (34, 40, 42, 106, 109 und 156), die ein positives Hybridisierungssignal ergaben, wurden in L-Brühe 20 h bei 37ºC in kleinen Maßstab (100 ml) gezüchtet und die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugation in einem Caesiumchlorid-Gradienten präpariert, und zwar im wesentlichen wie in "Molecular Cloning; A Laboratory Manual" von Maniatis et al. (Cold Spring Harbor) beschrieben.
Die DNA wurde mit dem Standard-Kettenabbruchs-Verfahren sequenziert, das von Sanger et al. in Proc. Nat. Acad Sci. USA 74, 5463 - 5467 (1977) beschrieben wurde, und zwar unter Verwendung eines Seguenase (Warenzeichen)-Kits (United States Biochemical Corporation). Die Oligonukleotide ELS1 und ELS2 (Tabelle 5) wurden als Sequenzierungsstarter verwendet. Tabelle 5 Code Sequenz (5' bis 3') Starterstelle (Figur 1) (oberer Strang) (unterer Strang)
Die Plasmid-DNA aus Klon 156 enthielt die in Fig. 13 gezeigte Seguenz und das Plasmid wurde mit dem Code pAG76 bezeichnet. Das Plasmid pAG76 wurde zur Transformation kompetenter Zellen der folgenden E. coli-Stämme mit Standard-Verfahren verwendet: -
HB1O1
MSD462 (W3110 Delta lac)
MSD522 (CGSC 6300)
DH5 Alpha

Expression eines Fusion-Proteins aus Beta-Galactosidase und dem menschlichen Elastase-Inhibitor.

Die synthetische Gen-Sequenz des menschlichen Elastase- Inhibitors wurde in einen im Handel erhältlichen Vektor, namlich pUEX2 (Amersham International Plc - auch gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt), kloniert. Der Vektor enthielt ein Gen für die Beta-Galactosidase unter der Transkriptions-Kontrolle des PR-Promotors des Bacteriophagen Lamda. Das Plasmid enthielt auch ein Beta-Lactamase-Gen, das die das Plasmid enthaltenden Transformaten gegen Ampicillin resistent macht, und ein Gen für den temperaturempfindlichen Repressor (CI857) des PR-Promotors.
Das Gen wurde aus pAG76 (aus MSD522 hergestellt) isoliert, gefolgt von aufeinanderfolgender Verdauung mit EcoRI und SalI und Reinigung des resultierenden 222bp-Fragments durch Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarose-Gel.
Das DNA-Fragment wurde aus dem Gel zuerst durch Elektroelution der DNA auf DEAE NA45-Papier und dann durch Elution der DNA vom NA45-Papier mit 1M NaCl-Lösung isoliert. Kurz zusammengefaßt wurde das Verfahren wie folgt durchgeführt:--
Ein kleines Stück NA45-Papier, das auf die Breite der DNA- Bande und die Tiefe des Gels zurechtgeschnitten war, wurde mit 1 x TE-Puffer (10 mM Tris HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0) befeuchtet. Das angefeuchtete NA45-Papier wurde in einen Schlitz in dem Gel, der gerade vor der zu eluierenden Bande geschnitten war, gegeben. Die Elektrophorese wurde 5 min fortgesetzt, bis die DNA-Bande in dem NA45-Papier absorbiert war. Das die DNA enthaltende Papier wurde zuerst in 1 x TE-Puffer gewaschen und dann zweimal mit 1 M NaCl (200 µl) 10 min bei 70ºC behandelt, wobei gelegentlich verwirbelt wurde. Die NaCl-Lösungen wurden vereinigt und die DNA wurde mit Ethanol (1 ml) 10 min bei 4ºC ausgefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit Ethanol: Wasser (7:3) gewaschen, getrocknet und in Wasser (20 µl) gelöst.
Zur Vektor-Präparation wurden 5 µg pUEX2 mit EcoRI und SalI in Hochsalz-Puffer (BCL, 50 µl) 1 h bei 37ºC verdaut. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und auf 1 %igen Agarose- Gel gereinigt. Das 6,7 kb-Vektor-Fragment wurde durch Elektroelution auf NA45-Papier wie oben beschrieben isoliert, ausgefällt und in Wasser (20 µl) gelöst.
Zur Ligation wurden 5 µl Vektor-DNA (1 µg) zu dem Elastase- Inhibitor-Gen-Fragment (10 µl, 1 ug), 5x Ligase-Puffer (BRL, 6 µl), Wasser (8 µl) und T4 DNA-Ligase (1 µl, 1 E/µl) gegeben. Ligiert wurde 20 h lang bei 16ºC. Das DNA-Gemisch wurde entweder direkt verwendet oder nach 5X-Verdünnung mit Wasser, um Zellen von E. coli MSD462 und MSD522 zu transformieren, nämlich wie oben zur Klonierung des synthetischen Gens beschrieben. Es wurden insgesamt 8 Kolonien mit MSD462 und 75 mit MSD522 erhalten. Sechs der MSD462-Kolonien und drei der MSD522-Kolonien wurden mittels Hybridisierungs-Analyse wie oben beschrieben untersucht. Alle erwiesen sich als positiv und wurden weiter analysiert, indem sie in einem kleinen Maßstab gezüchtet wurden, um die Proteine zu untersuchen, die bei 37ºC und 42ºC exprimiert werden. Diese Züchtungen im kleinen Maßstab wurden wie folgt durchgeführt:-
Die Kulturen wurden in 75 ml M9-Medium, das 0,02 % Casein- Hydrolysat; Glucose (2,0 g/l), MGSO&sub4;.7H&sub2;O (1 mM), CaCl&sub2;2H&sub2;O (01, mM), Ampicillin (50 µg/ml) und Thiamin (4 µg/ml) enthielt, 20 h bei 37ºC in einem Schüttelinkubator (250 UpM) gezüchtet. Dann wurden die Zellen in frisches Medium (75 ml) überführt, und zwar unter Erhalt einer OD550 von 0,1, und bei 37ºC inkubiert, bis die OD550 0,4 - 0,5 erreichte und dann 3 h bei 42ºC. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und ein Aliquot wurde durch Kochen (100ºC, 15 min) in Laemmli-Puffer (0,125 mM Tris-HCL, pH 6,8), SDS (2 % g/v), Glycerol (20 % g/v), Bromphenolblau (Spuren), das frisch zugegebenes Beta-Mercaptoethanol (2 % g/v) enthielt, lysiert. Die Proteine wurden durch Elektrophorese auf einem 20 %igen Polyacrylamid-Gel und Färben mit Coomassie-Brilliantblau untersucht. Alle drei Klone aus MSD522 und fünf Klone aus MSD462 produzierten ein neues Protein mit einem höheren Molekulargewicht als ein Beta- Galactosidase-Marker und das von dem Eltern-pUEX2-Vektor produzierte Beta-Galactosidase-Protein. Ein Klon aus MSD522 wurde mit pAG77 bezeichnet.

Präpraration des Fusions-Proteins aus Beta-Galactosidase und menschlichem Elastase-Inhibitor

Ein rekombinanter Stamm E. coli MSD522, der das Beta- Galactosidase-Elastase-Inhibitor-Fusions-Protein (pAG77) exprimierte, wurde aus dem Lagervorrat entnommen, auf einer L-Agar-Platte ausgestrichen, die mit Ampicillin (50 µg/ml) ergänzt war, und 20 h bei 37ºC inkubiert. Eine Schleife Zellen wurde von dieser Platte in jeden von 4 x 250 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, die 75 ml M9-Medium enthielten, das wie oben beschrieben ergänzt war. Diese Kolben wurden durch Schütteln mit 300 UpM auf einen Umlauf- Inkubator bei 37ºC 20 h und dann bei 42ºC 4 h inkubiert.

Reinigung des Fusions-Proteins aus Beta-Galactosidase und menschlichem Elastase-Inhibitor

Die E. coli-Zellen wurden geerntet und in Lysis-Puffer (15 % Sucrose, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-Hydrochlond, pH 8,0) suspendiert und durch Behandlung mit Lysozem/LDS (0,5 mg/ml bzw. 0,05 %) gefolgt von Beschallung (4 x 45 s unter Verwendung eines MSE-Beschallers) bei 4ºC lysiert.
Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert und die Pellet-Fraktion wurde in Wasser resuspendiert, gefolgt von Zentrifugation.
Das gewaschene Pellet wurde in 6 M Guanidin-Hydrochlond in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 50 mM beta- Mercaptoethanol enthielt, solubilisiert.
Diese Lösung wurde ausgedehnt gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert und der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt.
Der Niederschlag wurde in SDS-Polyacrylamid-Gel-Lade-Puffer gelöst und der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter Verwendung eines 10 %igen reduzierenden Gel-Systems unterzogen.
Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt und die dem Fusions-Protein entsprechende Proteinbande wurde ausgeschnitten. Diese wurde dann als Immunogen zur Hervorrufung von Antiseren in Kaninchen verwendet.

Prädaration des Elastase-Inhibitors in Hefe Hefe-Sekretions-Vektor pDP258

Der Hefe-Sekretions-Vektor ist in Fig. 18 gezeigt und wurde gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Dieser Vektor ermöglicht die Fusion von codierenden Sequenzen an das STE13- Prozessierungs-Signal in der MF-alpha-1-Präpro-Region. Es gibt eine Anzahl von Berichten, die beschreiben, wie die Fusion von Protein-codierenden Sequenzen an das STE13- Signal zur Sekretion des codierten Proteins führen kann, obwohl auch die Sekretion oder intrazelluläre Ansammlung von teilweise prozessierten und unprozessierten Fusions- Proteinen berichtet wurde. Dieses Problem kann vermieden werden, indem andere Prozessierungs-Stellen in der MFalpha-1-Präpro-Region verwendet werden. Vgl. beispielsweise Bitter G. A, et al., P.N.A.S. 81, 5330-5334 (1984); Brake A. J., et al., P.N.A.S. 81, 4642-4646 (1984); Zsebo K. M., et al., J. Biol. Chem. 261, 5858-5865 (1986); Loison G., et al., Bio/Technology 6, 72-77 (1988); Ernst J. F., DNA 7, 355-360 (1988).
Die Konstruktion des in Fig. 18 dargestellten pDP258 wird im folgenden skizziert. Die Position der Restriktions- Enzym-Stellen ist ungefähr.
Das MF-alpha-1-Promotor und Präpro-codierende Sequenz- EcoRI-HindIII-Fragment von der EcoRI-Stelle bei -959 in Flessel, M. C. et al. (Genetics 121, 223-236, 1989) bis zur HindIII-Stelle bei 263 in Kurjan, J. J. & Herskowitz (Cell 30, 933-943, 1982). Dieses Fragment kann aus dem Plasmid p69a, das von Kurjan & Herskowitz (Cell 30, 933-943, 1982) beschrieben wurde, abgeleitet werden.
Die SalI(1606)-EspI/AatII-Region wurde von dem 2550bp SalI- AatII-Fragment von pBR328 (Covarrubias L. et al., Gene 13, 25-35, 1981) abgeleitet.
Die Esp-EcoR1(1)-Region, die das LEU2-Gen enthält, wurde aus YEp13S(YEp213) (Broach, J.R. Methods in Enzymol. 101, 307-325, 1983 und Sherman, F. et al. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor 1986, S. 95) abgeleitet. Die HindIII-Stelle, die in der 2u-Sequenz vorhanden ist, wurde durch einen Schnitt mit HindIII zerstört, mit Klenov- Polymerase gefüllt und religiert.
Ein HindIII-SphI-Fragment, das den ADC1-Terminator enthielt, der vom Plasmid pAAH5 (Ammerer G., Methods in Enzymol. 101, 192-201) abstammte, wurde mit T4-Polymerase behandelt, um eine DNA mit glatten Enden zu erzeugen. Die Sall-Stelle (bei 1606 in Fig. 18 gezeigt) wurde geschnitten und unter Verwendung von T4-Polymerase aufgefüllt. Das ADC1-Fragment wurde mit dem Plasmid-Fragment ligiert, um eine Rekombinante zu erzeugen, die den ADC1-Terminator in der richtigen Orientierung enthält, und zwar um Transkripte zu terminieren, die von dem MF-alpha-1-Promotor herrühren. Diese Klonierung regenerierte auch die SalI-Stelle (gezeigt) und die HindIII-Stelle (eingeklammert).
Der Polylinker, der die in der Karte gezeigten Stellen enthielt, wurde in die HindIII-Stelle kloniert, die durch die ADC1-Terminator-Klonierung regeneriert wurde. Dieser Polylinker wurde so konstruiert, daß lediglich eine HindIII-Stelle beim Klonieren erhalten bleibt. pDP258 enthält den Polylinker in der in Fig. 18 gezeigten Orientierung. Die in Klammern gezeigte HindIII-Stelle wird beim Klonieren des Polylinkers zerstört.

Modifikation des Hefe-Sekretions-Vektors

Das in Fig. 18 gezeigte Plasmid wurde außerdem modifiziert, um Restriktions-Stellen einzuführen, nämlich SphI an der Signal-Peptidase- und StuI an der KEX2-Prozessierungs- Stelle in der MF-alpha-1-Präpro-Region, um die Fusion von Protein-codierenden DNA-Sequenzen an diese Prozessierungssignale zu ermöglichen und die Sekretion des codierten Proteins in das extrazelluläre Medium zu erleichtern. Die in vitro Mutagenese wurde durchgeführt wie von der Amersham International plc in ihrem "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system version 2" (Code RPN.1523) detailliert beschrieben. Andere bei dieser Arbeit verwendete Verfahren sind dem Fachman bekannt und sind beispielsweise in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" 2. Auflage, Sambrook, J., Fritsch, E. F. & T. Maniatis, C.S.H., 1989 beschrieben.

Einführung der SphI-Stelle an der Prozessierungs-Stelle der Signal-Peptidase

Um die Fusion der den Elastase-Inhibitor codierenden Sequenz an den MF-alpha-1-"Prä"-Sekretionsleader zu ermöglichen, wurde eine SphI-Restriktionsenzym-Stelle konstruiert, so daß nach der Restriktion und der T4- Polymerase-Behandlung ein stumpfes Ende gebildet wird, das an der dritten Base des letzten Codons (Aminosäure 19) der MF-alpha-1-Signal-Sequenz endet (vgl. beispielsweise Ernst J. F., DNA 7, 355-360; 1988). Dann wurde ein mutagener Oligonukleotid-Primer konstruiert und synthetisiert, um die erforderlichen Sequenz-Änderungen in die MF-alpha-1-Signal- Sequenz einzuführen.

Figur 1A

Zu dieser Region komplementärer Primer

identifiziert unter Verwendung von Mutagenese ausgetauschte Basen.
Das kleine SstI-HindIII-Fragment von pDP258 (vgl. Fig. 18) wurde in die Ssti + HindIII-geschnittene RF-M13mp18-DNA (BRL 520-8227SA) kloniert. Potentiell rekombinante Plaques (Weiß auf X-gal + IPTG) wurden durch Präparation von RF-DNA im kleinen Maßstab charakterisiert, nämlich zur Größenbestimmung und Restriktions-Enzym-Analyse durch Agarose-Gel- Elektrophorese. Dann wurde eine Präparation einzelsträngiger Matrizen-DNA im großen Maßstab von einem dieses Fragment enthaltenden Klon hergestellt, nämlich zur Verwendung in in vitro Mutagenese-Versuchen unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers wie in Fig. 1A gezeigt. Im Anschluß an die Transformation der mutagenisierten Population wurden 15 Plaques ausgewählt und die einzelsträngige Matrizen-DNA wurde präpariert. Nach der Größenauf trennung durch Agarose- Gel-Elektrophorese wurden 11 Matrizen durch Standard- Kettenabbruch-Sequenzierung auf das Vorhandensein eines zusätzlichen T-Rests (komplementär zur dem "A", das in Fig. 1A mit dem Sternchen bezeichnet ist) hin untersucht. Klon Nr. 6 wurde dann für weitere Sequenzierungs-Studien ausgewählt, die zeigten, daß im bekannten MF-alpha-1- Promotor oder der codierenden Sequenz keine weiteren Änderungen nachweisbar sind. 1 µl einer 1/100-Verdünnung der Matrizen-DNA-Präparation aus Klon Nr. 6 wurde dann in kompetenten TG1 transformiert. Plaques wurden ausgewählt und in 1 ml Kulturen 2xTY inokuliert, das zuvor mit TG1- Zellen angeimpft worden war (wie im Amersham-Kit beschrieben). Diese Kulturen wurden unter Schütteln 5 h bei 37ºC gezüchtet und verwendet, um 100 ml 2xTY Medium zu inokulieren. Nach weiteren 5 h Schüttelinkubation wurde die doppelsträngige RF-DNA mittels Standard-Plasmid-Präparations-Verfahren präpariert. Dann wurde das kleine SstI- HindIII-Fragment des Klons Nr. 6 (Präparation A) durch Restriktionsenzym-Schnitt erzeugt und das Fragment wurde nach der Auftrennung durch Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde in das große HindIII-SstI-pDP258-Fragment (vgl. Fig. 18) zur Erzeugung von pDP294 kloniert, d.h. pDP258, das eine SphI-Stelle an der putativen Signal-Peptidase-Spaltungsstelle enthält (der "SIGPEP"-Vektor).

Einführung der StuI-Stelle an der KEX2-Prozessierungs- Stelle.

Um die Fusion der den Elastase-Inhibitor codierenden Sequenz an das KEX2-Prozessierungs-Signal zu ermöglichen, wurde durch PCR-Mutagenese eine StuI-Stelle eingeführt.

Figur 2A

Zu dieser Region komplementärer PCR-Primer

identifiziert unter Verwendung der PCR-Mutagenese zur Einführung der StuI-Stelle (unterstrichen) ausgetauschte Basen.
Es wurden zwei PCR-Primer erzeugt. Der erste (33mer) war abgesehen von den oben in Fig. 2A gezeigten Basen homolog zur MF-alpha-1-Sequenz (Kurjan J. & Herskowitz, 1. Cell 30, 933-943, 1982). Dieser Primer wurde konstruiert, um die neue StuI-Stelle und die vorhandene HindIII-Stelle in das PCR-Produkt einzuschließen. Der zweite 30mer-Oligonukleotid-Primer war homolog zur MF-alpha-1-Region -211 bis -241 (Flessel et al., Genetics 121: 223-236, 1989), wobei die NsiI-Restriktions-Stelle bei -227 eingeschlossen war. Unter Verwendung dieser beiden Oligos als Primer und einer Plasmid (z.B. pDP258)-Matrize in einer PCR-Vermehrungs- Reaktion konnte ein Fragment mit ungefähr 490bp erzeugt werden. Nach der Extraktion mit 1 Volumen Phenol: Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und Ethanol-Fällung wurde das PCR-DNA-Produkt in 1 Volumen Wasser aufgenommen. Die DNA wurde mit den Restriktions-Enzymen HsiI und HindIII geschnitten. Das Produkt dieser Reaktion wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen und die bei 490 bp (ungefähr) laufende Bande wurde mit Standard-Verfahren gereinigt.
Dann wurde eine pUC18 (BRL520-5363SA)-Rekombinante erzeugt, welche die XbaI-HindIII-Region von pDP258 enthielt. Die HsiI-Stelle (-227 von Flessel et al.) war in diesem Plasmid einmalig vorhanden. Das HsiI-HindIII-Fragment in diesem Plasmid wurde durch das die neue StuI-Stelle enthaltende PCR-erzeugte Fragment mit Hilfe von Standard-Klonier-Techniken ersetzt. Es wurden sechs Klone identifiziert, die eine StuI-Stelle enthielten. Klon Nr. 6 wurde durch Dideoxy-Sequenzierung charakterisiert und enthielt die neue StuI-Stelle in der richtigen Position und im Vergleich mit veröffentlichten Sequenzen keine weiteren Mutationen. Dieses Plasmid wurde mit pDP273 bezeichnet.
Das große XbaI-HindIII-Fragment von pDP258 und das "StuI"- XbaI-HindIII-Fragment von pDP273 wurden dann durch Restriktions-Enzym-Schnitt und Auftrennung auf Agarose- Gelen präpariert. Nach der Reinigung aus den Agarose-Gelen wurden diese Fragment ligiert und in kompetenten E. coli (HB1O1) transformiert. Aus 36 Kolonien wurden DNA-Präparationen im kleinen Maßstab hergestellt. Die DNA wurde mit den Restriktions-Enzymen StuI und SstI verdaut. Klon Nr. 9 hatte das richtige Restriktions-Enzym-Muster, nämlich wie durch Agarose-Gel-Elektrophorese (pDP274) sichtbar. Die pDP274-DNA wurde dann mit XbaI geschnitten und mit einer gereinigten Präparation des kleinen XbaI-Fragments von pDP258 ligiert. Aus 36 E. coli-Kolonien, die mit diesem Ligations-Gemisch transformiert worden waren, wurden DNA- Präparationen im kleinen Maßstab hergestellt. Nach der Verdauung mit EcoRI + StuI wurden zwei Klone identifiziert, die das kleine XbaI-Fragment in der richtigen nativen Original-Orientierung enthielten. Ein Klon wurde für weitere Arbeiten präpariert (pDP289), d.h. pDP258 mit einer StuI- Stelle an der KEX2-Prozessierungsstelle.

Klonierung des Elastase-Inhibitors-Gens stromabwärts der Hefe-Sekretions-Signale

pAG 76 wurde mit dem Restriktions-Enzym BspMI (vgl. Fig. 13) geschnitten und dann mit T4-Polymerase behandelt, um den 5' Überhang zur Bildung von DNA mit glatten Enden aufzufüllen. Nach der Extraktion mit Phenol:Chloroform: Isoamylalkohol und der Ethanol-Ausfällung wurde die DNA in Wasser gelöst und mit dem Restriktions-Enzym BamHI verdaut. Das den Elastase-Inhibitor codierende kleine Fragment wurde durch Reinigung aus einem Agarose-Gel isoliert. Jeder der 3 Vektoren wurde dann wie unten beschrieben verdaut und die langen Fragmente wurden aus den Agarose-Gelen isoliert.
pDP258 - geschnitten mit HindIII, behandelt mit T4-Polymerase, um den 5'-Überhang aufzufüllen, geschnitten mit BamHI.
pDP289 - geschnitten mit StuI und BamHI.
pDP294 - geschnitten mit SphI, behandelt mit T4-Polymerase, um den 3'-Überhang zu entfernen, geschnitten mit BamHI.
Jeder der drei gereinigten Vektor-Fragmente wurde mit dem Elastase-Inhibitor-Fragment ligiert. Proben jedes der Ligations-Gemische wurden in kompetenten HB1O1-E. coli transformiert. Aus den Kolonien, die mit jedem dieser drei Ligations-Gemische erhalten wurden, wurden 20 - 40 DNA- Proben im kleinen Maßstab präpariert. Die Rekombinanten wurden durch Verdauung mit den Restriktions-Enzymen BamHI + PstI und durch Auftrennung der Fragmente auf Agarose-Gelen identifiziert. Klone mit der richtigen Sequenz an der Fusionsstelle zwischen dem MF-alpha-1-Signal- und der den Elastase-Inhibitor codierenden Sequenz wurden durch DNA- Sequenzierung bestätigt. Die zur weiteren Analyse ausgewählten Klone sind im folgenden angegeben:
pDP280 STE13/Elastase-Inhibitor-Fusion, d.h. von pDP258 abstammend.
pDP298 SIGPEP/Elastase-Inhibitor-Fusion, d.h. von pDP294 abstammend.
pDP299 KEX2/Elastase-Inhibitor-Fusion, d.h. von pDP289 abstammend.
Diese Konstrukte wurden transformiert (Sherman et al.), und zwar in JRY188 (Brake et al., P.N.A.S. 81, 4642-4646, 1984). Die Klone wurde inokuliert und bei 30ºC bis zur stationären Phase in flüssigem YPAD- (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor 1986, S. 164, 165) oder -LEU- "drop-out"-Medium (synthetisches Komplett- Medium minus Leucin in Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, 5. 164, 165, 1986) gezüchtet.
In Überständen von Kulturen der pDP280-Klone (vgl. Fig. 19) konnte aktiver Elastase-Inhibitor nachgewiesen werden. Die Material-Ausbeuten aus den Klonen pDP298 und pDP299 waren niedriger.
Die Konstrukte wurden auch in den Hefe-Stamm XS95-6C (Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkely, CA 94720) transformiert. Nach 27 h Schüttelinkubation (250 UpM) bei 30ºC wurden, nachdem die Kulturen die stationäre Phase (üblicherweise OD600 = 4-6) erreicht hatten, Kultur- Überstände geerntet, indem die ganzen Zellen pelletiert wurden. Unter Verwendung des unten beschriebenen Enzym- Assays wurde die Aktivität in den Kultur-Überständen bestimmt. Bezogen auf Standard-Kurven unter Verwendung von nativem Elastase-Inhibitor (vgl. unten) sekretierten die pDP298-Klone bis zu 3,5 µg/ml aktiven Elastase-Inhibitor in den Kultur-Übers tand.

Reinigung des rekombinanten menschlichen Elastase- Inhibitor-Proteins

Das Material, das unter Verwendung der STE13-Prozessierungsstelle (pDP280) und eines in flüssigem -LEU-"dropout"-Medium gezüchteten JRY188-Wirts erhalten wurde, wurde wie folgt gereinigt.
Die Kultur-Überstände (bis zu 2 1 in Schüttelkolben gezüchtet) wurden unter Verwendung eines 0,22 µ-Filters filtriert. Das Filtrat wurde unter Verwendung eines Filters mit einem Ausschluß von 3000 Mr in einem Amicon-Spiral- Konzentrator ungefähr 10fach konzentriert. Das Konzentrat wurde dann gegen 3 x 20 Volumina 10 mM Ammoniumformat (pH 4) dialysiert. Das dialysierte Material wurde auf eine voräquilibrierte Sulfopropyl-Sepharose-Säule geladen und mit einem 10 mM bis 50 mM Ammoniumformat-Gradienten eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und auf eine Größenausschluß-Säule (Pharmacia HR100) geladen und mit einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung eluiert.
Es wurde ein mikroheterogenes Produkt erhalten, das bei der N-terminalen Sequenzierung das reife Polypeptid mit der Formel I (60 %) und das reife Polypeptid mit der Formel I plus entweder eine oder zwei terminale Glu-ala-Aminosäure- Verlängerungen ergab. Es wird angenommen, daß diese Verlängerungen auf einer unvollständigen Prozessierung durch den Hefe-Stamm beruhen und das Polypeptid mit diesen terminalen Verlängerungen wurde von dem reifen Polypeptid mit der Formel I durch MonoS-HPLC in 50 mM Natriumacetat, pH 4,5 unter Verwendung eines Elutionsmittels abgetrennt, das einen Gradienten von 0 bis 0,5 M Natriumchlorid enthielt. Es wurde gefunden, daß das mikroheterogene Produkt die gleiche spezifische Aktivität hat, die von dem Polypeptid gezeigt wird, das aus Psoriasis-Herden isoliert wurde.
Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um das Protein zu reinigen, das durch Kultivieren von Konstrukten produziert wurde, die unter Verwendung der SIGPEP- und KEX2-Prozessierungs-Stellen erhalten wurden. Mit diesen Konstrukten wurde eine homogene Spezies mit der richtigen N-terminalen Sequenz für das reife Polypeptid mit der Formel I erhalten.
Das Reinigungs-Verfahren, das für Konstrukte verwendet wurde, die in anderen Wirten gezüchtet wurden, war im wesentlichen das gleiche wie oben. Beispielsweise wurde das Konstrukt, das unter Verwendung der Signal-Peptidase- Spaltungsstelle erhalten wurde, im Hefe-Stamm XS 956C gezüchtet und gemäß dem obigen Protokoll gereinigt, und zwar unter Erhalt von 4 mg des reifen Polypeptids mit der Formel I in Form einer einzelnen Spezies, das die gleiche spezifische Aktivität wie das aus Psoriasis-Herden isolierte Polypeptid zeigte.

Assay zur Ermittlung der Gegenwart von Elastase-Inhibitor

Die Gegenwart und Menge des Polypeptids mit der Formel I, beispielsweise während seiner Produktion mittels rekombinanter DNA-Technologie, wurde unter Verwendung des folgenden Assays ermittelt. Bei diesem Assay wurde die Aktivität des Materials durch die Inhibition der Schweine-Pankreas- Elastase (Sigma) unter Verwendung von N-Methoxysuccinylala-ala-pro-val-p-nitroanilid (AAPV, Sigma) als Substrat bestimmt.
Die Probe, beispielsweise der Überstand der Hefe-Fermentation, (100 µl) wurde mit Schweine-Elastase (10 µg/ml) in Assay-Puffer (0,1 M Hepes/0,5 M NaCl/pH 7,5, 1 % RIA-reines Rinderserum-Albumin enthaltend) gemischt. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurde Substrat (800 µl, 2,5 mM) in Assay-Puffer zugegeben und das Gemisch wurde 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Änderungsgeschwindigkeit der Absorption bei 405 nm wurde 2 min lang gemessen und die Aktivität wurde aus einer Standard-Kurve berechnet, die unter Verwendung des aus Psoriasis-Herden isolierten Polypeptids mit der Formel I konstruiert wurde (der Standard wurde im Bereich von 0 bis 2,5 µg/ml) verwendet.

Inhibitorische Wirkung des rekombinanten Elastase- Inhibitors gegen HLE

Der mit den oben beschriebenen Verfahren hergestellte rekombinante Elastase-Inhibitor wurde bezüglich der inhibitorischen Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase untersucht, und zwar unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens. Es wurde gefunden, daß das rekombinante Polypeptid eine inhibitorische Wirkung besitzt, die mit der des aus Psoriasis-Haut erhaltenen Materials vergleichbar ist.

Poly LC-HPLC des rohen rekombinanten Elastase-Inhibitors

100 µg des rohen rekombinanten Elastase-Inhibitors wurden auf einer Poly LC-Säule chromatographiert und ergaben menschliche Leukozyten-Elastase inhibierende Peaks. Es wurden zwei Hauptpeaks (I und II) beobachtet. Peak I enthielt 23 µg Protein, bezogen auf die integrierte Absorption bei 215 nm, und 19,4 µg aktiven Inhibitor (MW 7017, mit HLE titriert). Peak II enthielt 8,4 µg Protein und 6,9 µg aktiven Inhibitor. Daher scheint es sich bei diesen beiden Peaks um im wesentlichen reine Inhibitoren zu handeln. Ein Co-Elutions-Versuch mit 1 µg Peak I und 1 µg des Polypeptids mit der Formel I, das aus menschlicher Psoriasis- Haut erhalten wurde, zeigte, daß Peak I und das aus Haut erhaltene Material in diesem System identisch waren. Dies wurde auch durch einen weiteren Co-Elutions-Versuch mit RP&sub1;&sub8;-HPLC bestätigt, die auch einen einzelnen Peak zeigte.
Peak I der Poly LC-HPLC wurde gegen HLE titriert, um den Ki gemäß dem Verfahren von Green und Work zu bestimmen. Peak I zeigte einen Ki von 8,0 x 10&supmin;¹&sup0; M im Vergleich mit dem Inhibitor aus menschlicher Haut, der einen Ki von 3,3 x 10&supmin;¹&sup0; M zeigte. Unter Berücksichtigung der Genauigkeit des Verfahrens von Green und Work ergibt sich, daß das Material von Peak I eine Aktivität hat, die mit der des Polypeptids vergleichbar ist, das aus menschlicher Psoriasis-Haut erhalten wurde.
Dieser rohe rekombinante Elastase-Inhibitor scheint wie folgt zusammengesetzt zu sein: etwa 75 % inaktives Protein, 5 % eines HLE-Inhibitors, der sich von dem Polypeptid mit der Formel I, das aus menschlicher Haut erhalten wurde, bezüglich der Retensions-Zeit auf Poly LC-HPLC unterscheidet (wahrscheinlich wegen einer Elongation oder Deletion am N-Terminus) und 20 % eines HLE-Inhibitors (Peak I in der Poly LC-HPLC), der mit dem Polypeptid identisch ist, das aus menschlicher Psoriasis-Haut erhalten wurde, und zwar bezüglich der Retentionszeiten in der TSK 2000-Größenausschluß-HPLC, der RP&sub1;&sub8;-HPLC, der Poly LC-HPLC und der inhibitorischen Aktivität.

cDNA-Seguenz des menschlichen Leukozyten-Elastase- Inhibitors

Die Ableitung der ein bestimmtes. Polypeptid codierenden DNA-Sequenzen kann unter Verwendung von Standard-Verfahren durchgeführt werden. Diese Verfahren umfassen Durchmusterungs-Verfahren, d.h. die Hybridisierungs-Durchmusterung von rekombinanten cDNA-Bibliotheken mit gemischten Oligonukleotiden, die mögliche DNA-Sequenz-Kombinationen darstellen, und Vermehrungsverfahren, wie das als PCR (Polymerase-Kettenreaktion) bekannte.
Experimentelle Protokolle für die Durchmusterung von cDNA- Bibliotheken mit Hilfe der beiden obigen Verfahren sind in "Molecular Clonin" - Sambrook J., Fritsch, E. F. und Mariatis T., 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 beschrieben.
Unter Verwendung der oben erwähnten wohlbekannten Techniken wurde die cDNA-Sequenz des "prominenten Inhibitors" (d.h. des Polypeptids mit der Formel I) bestimmt. Es wurde eine Lungen-cDNA-lambda-gt11-Bibliothek verwendet und die in Fig. 14 dargestellte Sequenz wurde erhalten. Es wird angenommen, daß die Sequenz sich wie in Fig. 15 dargestellt fortsetzt. Nach der codierenden Sequenz ist ein Transformations-Terminations-Codon vorhanden und es wird angenommen, daß ein Poly-Adenylierungs-Signal 153bp bei 3' vorhanden ist. Es wird auch angenommen, daß ein 250bp Intron am 3'-Ende des Gens vorhanden ist.
In weiteren Arbeiten wurden cDNA-Klone isoliert, welche die vollständige Aminosäure-Sequenz des aktiven Hauptbestandteils (und Nebenbestandteile) von Präparationen des Elastase-Inhibitors aus einer menschlichen Lungen-cDNA- Bibliothek codieren. Fig. 16 zeigt die vollständige DNA- Sequenz eines derartigen Klons (EI4). Diese Sequenz wurde auch in anderen unabhängigen cDNA-Klonen verifiziert und in DNA-Fragmenten, die aus der gleichen cDNA-Bibliothek durch PCR isoliert wurden. Diese Sequenz zeigt zusätzlich zu der den Elastase-Inhibitor codierenden Region die Gegenwart einer Protein-codierenden Sequenz im Leserahmen stromaufwärts. Diese Stromaufwärts-Sequenz hat die folgenden Merkmale : -
a) Die 19 Aminosäure-Codons unmittelbar stromaufwärts von der Elastase-Inhibitor-Protein-Sequenz sind mit Protein-Sequenz-Daten konsistent, die aus einer Protein- Nebenfraktion (Peak V, Bestandteil A) durch Protein- Sequenz-Analyse ergeleitet wurden. 6
b) Es gibt sechs Kopien eines wiederholten Peptid- Motivs (nominell Val-Lys-Gly-Gln-X-Y, wobei X entweder für Asp, Val, Glu, Pro, Ser oder Lys steht), nämlich von den Resten -26 bis +10 vom Start der den Elastase-Inhibitor codierenden Sequenz. Die N-Termini der verschiedenen Nebenbestandteile von Elastase-Inhibitor-Präparationen sind mit diesem Motiv, bei dem es sich um eine Stelle für die spezifische proteolytische Spaltung handelt, nicht konsistent.
c) Der durch diesen Klon codierte N-Terminus ist stark hydrophob (13 von 18 Resten), so daß es sich um den Teil einer Signal-Sequenz oder einer Transmembran-Domäne handeln kann.
Dieser Klon enthält kein der herkömmlichen Meinung entsprechendes erkennbares Translations-Initiations-Codon, d.h. AUG. Die Ergebnisse von Primer-Extensions-Untersuchungen ergaben den Start eines Haupttranskripts ungefähr 80 Basen vor dem Beginn der cDNA-Sequenz, die in mRNA aus kultivierten menschlichen Keratinocyten (HEK 78) identifiziert wurde. Die Gegenwart einer ähnlichen Boschaft in einer Auswahl anderer mRNA-Spezies (einschließlich der Gesamt-RNA aus menschlicher Lunge) wurde durch diese Technik nicht gezeigt.
Die Northern-Blot-Analyse der Gesamt-RNA aus dem Pankreas- Adeno-Karzinom zeigte die Gegenwart eines homologen Transkripts von ungefähr 750 Basen. Dies ist mit der vorhergesagten Größe aus der obigen cDNA-Sequenz der Primer-Extensions-Daten (unter Annahme einer Polyadenylierungs-Länge von ungefähr 190 Basen) nicht inkonsistent.

Antikörder gegen den Elastase-Inhibitor

Unter Verwendung von weißen Neuseeland-Kaninchen wurden Antikörper gegen das Polypeptid mit der Formel I gerichtet. Die folgenden Impfstoffe wurden verwendet:
1. Substrat (A), welches die 16 N-terminalen Aminosäure-Reste des Polypeptids mit der Formel I enthielt, mittels Maleimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimidester nach dem Verfahren von Lerner et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3403-3407) an Rinderserum-Albumin gekoppelt;
2. Substrat (A), wie oben in 1 an Rinder-Thyroglobulin gekoppelt;
3. Substrat (A), mit Methyl-Rinderserum-Albumin gemischt; und
4. das Fusions-Protein aus Beta-Galactosidase und dem Polypeptid mit der Formel I.
Das für die oben unter 1, 2 und 3 angegebenen Peptide verwendete Immunisierungs-Schema ist im folgenden angegeben:
Tag 1 - 250 µg des Peptids in komplettem Freud'schen Adjuvans wurden subkutan verabreicht;
Tag 39 - 250 µg des Peptids in inkomplettem Freud'schen Adjuvans wurden subkutan verabreicht;
Tag 66 - 250 µg des Peptids in inkomplettem Freud'schen Adjuvans wurden subkutan verabreicht;
Tag 107 - 1 mg des Peptids wurde ohne Adjuvans intravenös verabreicht;
Tag 120 - Ausblutung.
Das für das oben unter 4 angegebene Fusions-Protein verwendete Immunisierungs-Schema ist im folgenden angegeben:
Tag 1 - 200 µg des Protein-Impfstoffs in komplettem Freud'schen Adjuvans wurden subkutan verabreicht;
Tag 22 - 100 µg des Protein-Impfstoffs in inkomplettem Freud'schen Adjuvans wurden subkutan verabreicht;
Tag 61 - 200 µg des Protein-Impfstoffs in inkomplettem Freud'schen Adjuvans wurden subkutan verabreicht;
Tag 94 - 130 µg des Protein-Impfstoffs ohne Adjuvans wurden intravenös verabreicht; und
Tag 107 - Ausblutung.
Die Kreuz-Reaktivität der erzeugten Antiseren wurde unter Verwendung von SDS-PAGE und Western-Blotting untersucht. Es wurde gefunden, daß das unter Verwendung des Fusions- Proteins (4 oben) erzeugte Antiserum mit dem Polypeptid mit der Formel I kreuzreagiert, das aus Psoriasis-Herden isoliert wurde, und auch mit dem rekombinanten Polypeptid mit der Formel I (1 µg nachgewiesen bei einer Verdünnung von 1:2000) und mit α&sub1;-Antitrypsin. Die α&sub1;-Antitrypsin-Kreuzreaktivität wurde entfernt (90 %), indem das Antiserum durch eine Säule geleitet wurde (x 3), die immobilisiertes α&sub1; enthielt (25 mg α&sub1;-Antitrypsin, gebunden an eine Säule mit 5 ml Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose 4B - Pharmacia). Es wurde gefunden, daß die mit den unter 1, 2 und 3 angegebenen Peptiden erzeugten Antiseren ebenfalls mit dem rekombinanten Polypeptid mit der Formel I kreuzreagieren.
Verschiedene Körpergewebe wurden mit den Antiseren unter Verwendung eines Titers von 1:50 und einer Standard-Immunoperoxidase-Technik behandelt. Starke Reaktivität wurde bei Hepatocyten im hepatobihären System gefunden, leichte Reaktivität wurde bei der Muscularis mucosae im Magen gefunden, leichte Reaktivität wurde bei der Lamina spinosa und bei den Zellen der venösen glatten Muskulatur in den Tonsillen gefunden und starke Reaktivität wurde beim Stratum corneum, Stratum granulosum, Stratum spinosum und Stratum basale der Haut-Epidermis gefunden.

Abkürzungen

AAPFpNA Succinyl-alanyl-prolyl-phenylalanyl-pnitroanilid.
AAPV-AFC Methoxy-succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-valyltrifluormethylcumarin.
AAPVpNA Methoxy-succinyl-alanyl-prolyl-valyl-pnitroanilid.
TGPLpNA Tosyl-glycyl-prolyl-lysin-p-nitroanilid.
HLE Human-Leukozyten-Elastase.
TFA Trifluoressigsäure.
DMSO Dimethylsulfoxid.
PCR Polymerase-Kettenreaktion - ein Verfahren zur Vermehrung einer gewünschten DNA-Sequenz, vgl. beispielsweise K. Kleppe et al., J. Mol. Biol (1971), 56, 341 - 361; und die europäische Patentanmeldung mit der Offenlegungs- Nr. 0 201 184; und "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 2. Auflage, Sambrook J., Fritsch, E. F. und T. Maniatis, CSH 1989.

Bezeichnung der Aminosäuren

G oder Gly: Glycin
A oder Ala: Alanin
S oder Ser: Serin
T oder Thr: Threonin
C oder Cys: Cystein
N oder Asn: Asparagin
Q oder Gln: Glutamin
L oder Leu: Leucin
I oder Ile: Isoleucin
V oder Val: Valin
M oder Met: Methionin
F oder Phe: Phenylalanin
Y oder Tyr: Tyrosin
W oder Trp: Trvptophan
P oder Pro: Prolin
D oder Asp: Asparaginsäure
E oder Glu: Glutaminsäure
H oder His: Histidin
K oder Lys: Lysin
R oder Arg: Arginin
Zur Bezeichnung der DNA-Sequenzen wurden die Standard-Bezeichnungen verwendet.

Beschreibung der Figuren 1 bis 8

Figur 1 veranschaulicht die Kationenaustausch-Chromatographie (TSK CM 3 SE-HPLC) eines angesäuerten Extrakts aus 50 g Psoriasis-Schuppen. Die Säulen-Fraktionen wurden automatisch gesammelt (60 Tropfen/Fraktion) und der Protein- Gehalt wurde bei 280 nm aufgezeichnet. Die Fraktionen wurden auf die HLE-inhibierende Wirkung (HLE-I) untersucht.
5 µl jeder Fraktion wurden auf die inhibitorische Wirkung gegen die durch HLE vermittelte Proteolyse des synthetischen Tetrapeptid-Substrats Methoxy-succinyl-alanyl-alanylprolyl-valyl-p-nitroanilid untersucht. Inhibitorisch wirksame Fraktionen (schraffierte Flächen) wurden zur weiteren Reinigung vereinigt.
Figur 2 veranschaulicht die Umkehrphasen-C&sub8;-Chromatographie (Nudeosil 300-C&sub8;-HPLC) von aus der Kationenaustausch- Chromatographie stammenden Elastase-Inhibitor enthaltenden Fraktionen, die einer zweiten Rechromatographie unterzogen wurden. Der Protein-Gehalt wurde bei 215 nm kontinuierlich aufgezeichnet. Elastase-Inhibitor enthaltende Fraktionen wurden vereinigt (schraffierte Flächen) und der Poly LC- Chromatographie unterzogen.
Figur 3 veranschaulicht die Poly-Sulfoethylaspartamid- Chromatographie (Poly LC-HPLC) von aus der Umkehrphasen-C&sub8;- Chromatographie stammenden Elastase-Inhibitor enthaltenden Fraktionen. Der Protein-Gehalt wurde bei 215 nm aufgezeichnet. Der höchste Peak V, basierend auf dem Protein- Gehalt und der inhibitorischen Kapazität (ungefähr 20 % der Gesamten), wurde gesammelt und durch Umkehrphasen-C&sub1;&sub8;- Chromatographie weiter gereinigt.
Figur 4 stellt die Umkehrphasen-C&sub1;&sub8;-Chromatographie (Nudeosil 5-C&sub1;&sub8;-HPLC) des aus der Poly LC-HPLC stammenden Elastase-Inhibitor-Hauptbestandteils dar, der einer zweiten Rechromatographie unterzogen wurde. Die schraffierte Fläche stellt den gereinigten prominenten Elastase-Inhibitor dar. Diese Präparation wurde zur weiteren Charakterisierung verwendet.
Figur 5 gibt das scheinbare Molekulargewicht des Polypeptids mit der Formel I an, das durch analytische Gel- Chromatographie mittels TSK 2000-HPLC mit 0,1 % TFA als Elutionsmittel bestimmt wurde. Der Protein-Gehalt wurde bei 215 nm aufgezeichnet. Als Mr-Marker wurde verwendet: Val- Gly-Ser-Glu, MW 390, Insulin-Beta-Ketten-Fragment 22 - 30, MW 6512, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, MW 22000, Ovomucoid- Trypsin-Inhibitor, MW 27000, Rinderserum-Albumin, MW 67000.
Figur 6 zeigt die isoelektrische Fokussierung des Polypeptids mit der Formel I auf Servalytr-Precoates pH 3 - 10. Als Standard wurde das Serva-Testgemisch 9 verwendet, das aus Cytochrom C (Cy-c), Ribonudease A (Rib A), Wal- Myoglobulin (Myo I) und Pferde-Myoglobulin (Myo II) zusammengesetzt war. Die Gele wurden entweder mit Silber (oben gezeigt) gefärbt oder zerschnitten und mit Acetonitril eluiert und auf die Elastase inhibierende Aktivität (HLE-I) (unten gezeigt) untersucht.
Figur 7 zeigt die Titration der menschlichen Leukozyten- Elastase mit dem prominenten Elastase-Inhibitor (das Polypeptid mit der Formel I). Gereinigte HLE (mit rekombinantem Eglin C auf 1 µg/ml titriert) wurde gegen den prominenten Inhibitor titriert, 0,05 - 0,8 µg (der Protein- Gehalt beruhte auf der integrierten Absorption bei 215 nm in der Umkehrphasen-C&sub1;&sub8;-HPLC). Das Enzym und der prominente Inhibitor wurden bei 21ºC 30 min vorinkubiert und die verbleibende Aktivität wurde aus E 1 min unter Verwendung von 2 mM AAPV-pNA als Substrat bestimmt. Der Ki betrug 3 x 10&supmin;¹&sup0; M, nämlich gemäß dem Verfahren von Green und Work (8) berechnet.
Figur 8 zeigt die Sequenz des prominenten Elastase- Inhibitors, d.h. des Polypeptids mit der Formel I.

Detaillierte Angaben bezüglich der Hinterlegungen nach dem Budapester Vertrag

Die folgenden Plasmide wurden bei The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 LRY, Schottland, UK nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.
pUC18 im E. coli-Wirtsstamm CGSC 6300 (MSD 1208)- Zugangs- Nr. 40290
pUEX2 im E. coli-Wirtsstamm CGSC 6300 (MSD 1209)- Zugangs- Nr. 40289
pDP258(HB101) im E. coli-Stamm HB101 (pDP258 (HB101))- Zugangs-Nr. 40288

Literatur

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Claims

1. Polypeptid, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzt, wobei das Polypeptid aus Psoriasis-Schuppen der menschlichen Haut erhältlich ist und mindestens eine der folgenden Charakteristika besitzt:

a) ein Molekulargewicht von etwa 9 kD (durch SDS-pAGE bestimmt);

b) einen isoelektrischen Punkt bei etwa pH 9,7 (durch isoelektrische Fokussierung bestimmt);

c) zusätzlich zu menschlicher Leukozyten-Elastase inhibitorische Wirkung gegen Schweine-Pankreas- Elastase;

d) keine signifikante Wirkung gegen Trypsin, menschliches Cathepsin G, Alpha-Chymotrypsin und Plasmin;

oder ein Fragment davon, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzt.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäure- Sequenz aufweist, die aus folgendem ausgewählt ist:

a) -Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro

b) -Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser -Cys-Pro-Ile-Ile-Leu

c) -Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser -Cys

d) -Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser -Cys-Pro-Ile-Ile-Lue-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Lue-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys- Leu-Lys-Asp-Thr; und

e) Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die aus folgendem ausgewählt ist:

Asn-Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-Gln-Val-Lys-Gly-Gln-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-;

Gly/Ala-Gln/Val-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-

Pro-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-;

Asp-Lys-Val-Lys-Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys;

Gly/Val-Lys-Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Lue-Asn-Pro-Pro Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr; und

der Sequenz mit der Formel I (im folgenden angegeben).

4. Polypeptid, das im wesentlichen die folgende Primär- Struktur aufweist:

Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Il-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-LysAsp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met- Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln (Formel I).

und Fragmente davon, wobei das Polypeptid oder die Fragmente inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzen, und Verbindungen, die in vivo oder in vitro zu dem Polypeptid oder den Fragmenten modifiziert werden können.

5. Polypeptid nach Anspruch 4, das im wesentlichen die folgende Primärstruktur aufweist und Fragmente davon:

Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-

wobei das Polypeptid oder die Fragmente inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzen, und Verbindungen, die in vivo oder in vitro zu dem Polypeptid oder den Fragmenten modifiziert werden können.

6. Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5, dem ein oder mehrere Aminosäure-Reste vorangehen, die aus folgendem ausgewählt sind:

Asn-Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-Gln-Val-Ser-Val-Lys-Gly-Gln-Asp-Lys- Val-Lys-;

Gly/Ala-Gln/Val-Asp-Lys-Val-Lys-;

Asp-Lys-Val-Lys-; und

Gly/Val-Lys-.

7. Polypeptid-Fragment oder ein Analoges davon wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, das durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurde.

8. DNA-Sequenz, die ein Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert codiert.

9. DNA-Sequenz, die folgendes aufweist: a) die DNA-Sequenz

oder ein Fragment davon, das inhibitorische Wirkung gegen menschliche Leukozyten-Elastase besitzt, oder ihren komplementären Strang;

b) eine DNA-Sequenz, die mit der DNA-Sequenz unter a) hybridisiert; oder

c) eine DNA-Sequenz, die wegen der Degeneration des genetischen Codes an die DNA-Sequenz unter a) hybridisieren würde.

10. DNA-Sequenz nach Anspruch 9, wobei das Fragment der DNA-Sequenz den Teil aufweist, der das Polypeptid

Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Il-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-LysAsp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met- Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln

(Formel I) codiert.

11. DNA-Sequenz, die im wesentlichen die DNA-Sequenz

Ala Gln Glu Pro Val Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys GCG CAA GAG CCA GTC AAA GGT CCA GTC TCC ACT AAG CCT GGC TCC TGC

Pro Ile Ile Leu Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys CCC ATT ATC TTG ATC CGG TGC GCC ATG TTG AAT CCC CCT AAC CGC TGC

Leu Lys Asp Thr Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser

TTG AAA GAT ACT GAC TGC CCA GGA ATZ AAG AAP TGC TGT GAA GGC TCT

Cys Gly Ket Ala Cys Phe Val Pro Gln TGC GGG ATG GCC TGT TTC GTT CCC CAG oder die DNA-Sequenz Poly ASignal EcoRI

oder ihren komplementären Strang aufweist.

12. Replizierbarer plasmidischer Expressionsträger, der in einem transformierten Wirt ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 20 bis 21 exprimieren kann.

13. Transformierter Wirt, der ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 20 bis 21 exprimieren kann, wobei der Wirt einen replizierbaren plasmidischen Expressionsträger nach Anspruch 12 enthält.

14. Antikörper, der an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 20 bis 21 binden kann.

15. Polynukleotid-Sonde, die eine Nukleotid-Sequenz aufweist, welche an eine DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 8, 9, 10 oder 11 hybridisieren kann.

16. Verfahren zur Herstellung eines replizierbaren Expressionsträgers nach Anspruch 12, bei dem ein Gen nach Anspruch 8, das ein Polypeptid nach den Ansprüchen 1 bis 7, 20 oder 21 codiert, an einer geeigneten Insertionsstelle in einen Vektor insertiert wird, so daß sich ein replizierbarer plasmidischer Expressionsträger ergibt, der die Synthese eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 20 oder 21 dirigieren kann.

17. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 20 oder 21, bei dem eine Wirtszelle, die mit einem replizierbaren plasmidischen Expressionsträger nach Anspruch 12 transformiert wurde, kultiviert wird.

18. Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirts nach Anspruch 13, bei dem ein Wirt durch die Insertion eines replizierbaren Expressionsträgers nach Anspruch 12 transformiert wird.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 20 oder 21 in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Streckmittel oder Trägermittel enthält.

20. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das mindestens etwa 70 % rein ist.

21. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das im wesentlichen zu einem einzigen Polypeptid-Peak führt, wenn es der Analyse durch C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Chromatographie unterzogen wird.