JPH03148299A - ポリペプチド、その製造方法、ｄｎａ塩基配列及び形質転換細胞宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトエラスターゼに対する阻止作用を有するポ
リペプチド、その製造方法及びこれを含有する医薬組成
物に関する。本発明は更に、上記ポリにデチドを発現さ
せる（・ｘｐｒ・■）ための宿主の遺伝子学的修飾（ｇ
＠ｎ＠ｔｉｅ　ｍｏｄｌｆｉｅａｔｉｏｎ　）　％これ
によって得られた宿主、上記の修飾操作に使用される遺
伝子物質（ｇ＠ｎ＠ｔｉｅ　ｍａｔ＠ｒ１ｍｌ　）　及
び該物質のための々フタ−に関する。

ヒト白血球エラスター４”　（ＨＬｉ：　）は、ヒト多
形核白血球のアズール好性顆粒（ａｚｕｒｏｐｈｉｌ　
ｇｒａｎｕｌｅ）中に存在するタンツク分解酵素である
。通常の環境下においてこれらの顆粒は／ｆクチリアの
ごとき外来性物質を含有するファｆツームと融合しまた
この粒子（顆粒）はＨＬＥと他のリソソーム酵累（ｌｙ
ｓｏｍａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　）　　との組合せにより代
謝される。しかしながら、ある種の病理学的条件下にお
いては、多形核白血球はエラスチン及びコラ−ｒンのご
とき宿主タンツク質に結合することになり、ＨＬＥも含
めて、上記顆粒の内容物が宿主組織（ｔｉｓｓｕｅ　）
上に直接放出される（　ｒ＠ｌ＠ａｓｅ　）ことがあり
得る。その結果として生ずる宿主組織上でのＨＬＥの劣
化作用（ｄａｇｒａｄａｔｉｖｅ　ａｅｔｌｖｌｔｙ　
）　により組織が損傷を受け、これが気腫（・ｍｐｈｙ
ｓａｍａ　）（２）、底大の呼吸困難症候群（ｒ＠ｓｐ
ｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｔｒ＠ｓｓｓｙｎｄｒｏｍｅ　
）　（１）、乾＠　（ｐｍｏｒＩａｓ１ｇ　）　（３）
及び水胞性皮膚炎（ｂｕｌｌｏｕｓ　ｄｅｒｍａｔｏｓ
ｉｓ　）（Ａ）のごとき疾患の原因となり得ると考えら
れる。

ＨＬＥの強力な（ｐｏｔ＠ｎｔ　）タンツク分解作用が
α１−アンチトリ１シン及びα２−マクログロブリンの
ごとき阻止剤のタンパク分解阻止作用（ａｎｔｉｐｒｏ
ｔｅｏｌｙｔｌｅ　ａｅｔｌｖｌｔｙ　）　によりある
程度緩和される（　ｂａｌａｎｃｅ　）　　ことは知ら
れている。これらの阻止剤は血清及び表皮を含む種々の
組織から検出されている（５．１０）。更に化ト白血球
プロテアーゼの低分子量阻止剤が精液（ＩＩ）、頚部粘
液（１２）、気管支分泌物０３）及び耳下線分泌物（１
４）及びヒト血清（６）中に存在することも知られてい
る。これらの供給源の全てからの阻止剤は免疫反　応活
性（６，１５）又はアミノ酸配列（１０−、１７）　　
の分析から抗ロイコプロテアーゼ又はその代謝産物と同
一であること及び更にトリプシンの強力な阻止剤である
ことが知られている。低分子量阻止剤はＨｏｅｈｍｔｒ
ａｓｓｅｒ等によっても気管支粘液から検出さ−れてお
り（２０、また、乾癖症の皮膚においても検出されてい
る（２２）。トリプシンも阻止する、プロテアーゼに対
する他の阻止剤も文献に記載されている（ＩＬ　１９）
。更に、エラスターゼ阻止剤は犬、ライオン及び猫の顎
下線（ａｕｂｍａｎｄｉｂｍｌａｒ　ｇｌａｎｄ　）か
らも検出されている。

本発明の第」の要旨の一つによれば式（Ｉ）：Ａｌ　ａ
−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ　−
Ｇｌｙ−Ｐｒ　ｏ−Ｖａ　１０−Ｓｓ　ｒ　−Ｔｈ　ｒ
−１，ｙ＠−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−１１ｓ−Ｌｙｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙａ　−Ｃｙａ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓ＠ｒ−Ｃｙｍ−Ｇｌｙ−Ｍ＠ｔ−
Ａｌ　ａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｉｍ、
　（式！）で示される一次構造（ｐｒ１ｍａｒｙ　ｓｔ
ｒｕｅｔｕｒ＊　）の全部又は一部を有するポリペプチ
ド又はそのフラグメントであって、ヒト白血球エラスタ
ーゼに対スる阻止作用を有するポリペプチド又はそのフ
ラグメント及び生体内又は生体外〒上記ポリイデチド又
はそのフラグメントに修飾（ｍｏｄｉｆｙ　）　　Ｌ得
る化合物が提供される。

本発明によれば、−更κ下記の式： ％式％ −ｐｒｏ（ｌｅ−萱１ｓｓ−Ｌ＠ｕ−Ｉｔｓ−ムｒｇ−
Ｃｙ＋ａ−ムｌａ−Ｍ＠ｔ−Ｌ＠ｕ−ＡｓＩｓ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−ム１ｍ＆ーで示される一次構造の全部又は一
部、からなるポリペプチド又はその７ツゲメントｆあっ
て、ヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用を有する
ポリペプチド又はその７．フグメント、及び、生体内又
は生体外で上記／９４デチド又はその７ラダメントに修
飾し得る化合物が提供される。

／９ペプチド又は７ツゲメントは下記の構造＝Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｇ＠ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｂｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−１１ｓ−Ｚｌ
＠−Ｌ＠ｕ−Ｚｌｅ−ムｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ
−Ｌａｗ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｘｉ （上記の式中、Ｘはコ個又はそれ以上のアミノ酸残基ぶ
らなりそしてＸはＡｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌ＠ｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ｔｈ　ｒ−Ａｍｐ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｋ　１　＠　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｃｙ
ｓ　−Ｇ１ｕＧｌｙ−！１＊ｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅ
ｔ−ムＩａ−Ｃｙａ−Ｐｈｓ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−Ｇ１
ｍからなることが好ましい）１有することが好都合〒あ
る。

前記のポリペプチドの前方部分Ｋ１個又はそれ以上のア
ミノ酸残基、例えばＡｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒ。

−Ｖａ　ｌ−；又はＹ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−（上記式中のＹは１個又はそれ以上のアミ
ノ酸からなりセしてＹは例えば Ａｓ　ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−Ａｓ　ｐ−Ｐｒ　ｏ　−
Ｖａ　ｌ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｖａ　ｌ
　−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ−；Ｇｌｙ／Ａｌａ−Ｇｌｎ
／Ｖａｌ−Ａ＠ｐ−Ｌｙｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−；Ａｓｐ
−Ｌｙｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−；又はＧｌｙ／Ｖａｌ−Ｌ
ｙＩ− であり得る）１ｋ存在させ得る。

最も好ましいポリぱデチドは式（１）の構造を有するも
のである。

本発明のポリペプチド又はそのフラグメントは、これら
はヒト白血球エステラーゼ及び豚の膵臓エステラーゼの
ごときプロテアーゼに対する阻止作用を有するが、トリ
プシンに対しては有意な阻止作用を示さないという意味
においてセリンプロテアーゼＫついて特異的な阻止作用
ｔ有することが好ましい。

本発明の４９　．．：ゾテド又はその７ラダメントは、
等電点電気泳動法で測定して、約９．７の−に等電点を
有する。

上記ポリペプチド及びその７ラダメントは遺伝子工学的
方法によって調製し得るが、ヒトの皮膚の乾１症癲皮（
ｐｍｅｒｌａｔｌｅ　ｓｅａｌｅ　）からも取得し得る
。

本発明によれば、更に、ヒト白血球エステ５−ゼに対す
る阻止作用を有するポリペプチドであって、ヒトの皮膚
の乾癖症癲皮（ｐｍｏｒｌａｔｉｅ　ｓｅａｌｅ）から
取得し得るかつ下記の特性ａ）〜ｄ）の１つ又はそれ以
上を有するポリペプチド； ａ）　約９　ｋＤ　の分子量（ＳＤ８−　ＰＡＧ］ｉ：
　Ｋより測定）を有する； ５）−約９．７の等電点（等−電点電気泳動法により測
定）を有する； Ｃ）　ヒト白血球エラスタニゼの他に豚の膵臓エラスタ
ーゼに対する阻止作用を有する；及びｄ）　　）リゾシ
ン、ヒトカテプシンＧ、α−キモトリｌシン及びプラス
ミンｋ対して大きな（ｓｌｇｎｌｆｌｅａｎｔ　）活性
を示さない：又は、ヒト白血球エラスターゼに対する阻
止作用を有する、上記ポリペプチドのフラグメントが提
供される。

ヒトの皮膚から取得し得るポリペプチドとしては単離及
びＮＨＩＫよって取得し得るポリペプチド及びかかるポ
リペプチドのフラグメントが挙げられる。

本発明の好ましいポリペプチドは下記のアミノ酸配列の
５つを含有している： ａ）　　−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−及び最も−好ましくは、上記
アミノ酸配列を含有しｎ・つその前方ＫＸが存在するＮ
−末端アミノ酸配列（Ｎ　−ｔ＠ｒｍｌｎｍｌ　ｓ＠ｑ
ｕｅｎｃｅ　）。上記Ｘは１９個のアミノ酸を含有し得
るアミノ酸配列を表わす；このアミノ酸配列Ｘは下記の
ものであることが好都合である： Ａａｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｐ　−Ｐｒ　ｏ　−Ｖ
ａ　ｌ−Ｌｙｓ−Ｃｌ　ｙ　−Ｇｌ　ｎ　−Ｖａ　ｌ　
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙａ−ｂ）　　−Ａｉｍ−Ｇｉｎ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｔ−８＠ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓ＠
ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−１１ｓ−１１ｓ−Ｌ＠ｕ〜 及び最も好ましくは、上記アミノ酸配列を含有しかつそ
の前方ＫＸが存在するＮ−末端アミノ酸配列。上記のＸ
は６個のアミｊｒＲを含有し得るアミノ酸配列を表わす
；このアミノ酸配列Ｘは下記のものであることが好都合
である： Ｇｌｙ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ｖａｌ−Ａａｐ−Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｍ−ｅ）　　−Ａｌａ−Ｇ１ｗ＆−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ｌｙｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−８
＠ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙ＠−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓ＊ｒ−Ｃｙ
ｓ−及び最も好ましくは、上記アミノ酸配列を含有しか
つその前方ＫＸが存在するＮ−末端アミノ酸配列。上記
のＸは４個のアミノ酸を含有し得るアミノ酸配列を表わ
す；このアミノ酸配列Ｘは下記のものであることが好都
合である： Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ− ４）　　Ａ１ａ−Ｇ１ｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌ
ｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓ＠ｒ−Ｃｙｓ＋−Ｐｒｏ−１１
ｓ−１１ｅ−Ｌ＠ｕ−１１＠−Ａｒｇ−Ｃｙａ−Ａｌａ
−Ｍｅｔ−Ｌ＠ｗ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

−Ａｓｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｅｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｔｋｒ−及び最も好ましくは、上記アミノ酸配列を含有
しかつその前方［Ｘが存在するＮ−末端アミノ酸配列。

上記のＸは２個のアミノ酸残基金含有し得るアミノ酸配
列を表わす；このアミノ酸配列Ｘは下記のものであるこ
とが好都合である： Ｇｔｙ／Ｖａｌ−Ｌｙ＋ｓ ＊）　　Ｌｙｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−８ｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｈ＠ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ−１１ｅ−１１ｓ−Ｌ＠ｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ
−Ａｌｔ−Ｍｅｔ−Ｌａｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ−及び最も好ましくは上記アミノ酸配列を含有す
るＮ−末端アミノ酸配列ｔ有するポリペプチド。

特に好ましいポリペプチドは本発明の＠ｌの要旨におい
て定義したごときポリペプチド、特に式（１）のポリペ
プチドである。

式（１）のポリペプチドはプロテイナーゼ３Ｋ対しても
阻止作用ｔ有する。

本発明のポリぱｌチド及びそのフラグメントは生物学的
に純粋なかつ均質な形で取得し得る。本発明によれば、
更に、 （ａｔｓｏｃ１鳳ｔ＠ｄ　ｎａｔｌｖｅ　ｇｌｙｃｏｓ
ｙｌａｔｉｏｎ　）　Ｙｒ：伴わない、前記で定義した
ごときポリペプチドが提供される。

前記したごときポリペプチドの他に、本発明にはポリペ
プチド同族体（ｈｏｍｅｌｏｇａ・）のコトキ。

ヒト白血球エステラーゼに対する阻止作用を有する他の
生成物も包含される。従って本発明によれば、更に、ヒ
ト白血球エラスターゼに対する阻止作用を有する、前記
で定義したごときポリペプチドの、ポリペプチド同族体
が提供される。

これらのポリぱデチド同族体としては、Ｗ種又はそれ以
上のアミノ酸残基の同一性又は位置の点で前記で定義し
たものと異るポリペプチドが挙げられる。例えばかかる
同族体においてはかかるアミノ酸残基が置換されている
か又はかかるアミノ酸残基が末端又は中間に付加されて
いるか又は削除されていることがあり得る。かかる同族
体はヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用を示しそ
して、所望ならば、豚の算臓エラスター　ゼに対する阻
止作用のごとき、式（夏）のポリペプチドの有する追加
的な活性の一つ又はそれ以上を示し得る。

本発明の製品として、例えば加水分解Ｋ対してより安定
なもの（従って、天然に産出するものより顕著な効果又
はより長時間持αする効果を有し得るもの）、又は、欠
失されるか又は例えばアラニン残基又はセリン残基によ
って置換されるシスティン残基を１個又はそれ以上有す
るかつ微生物系から活性な形で、潜在的により容易に単
離されるものが挙げられる。

本発明のポリペプチド、そのフラグメント及びポリペプ
チド同族体は生物学的に純粋なかつ均質な形で取得し得
る。

本発明のポリペプチドは遺伝子工学的方法Ｋよって好都
合に調製し得る。本発明のポリペプチド同族体はかかる
同族体についてコードする遺伝子の発現により調製し得
る。かかる遺伝子は周知の位置特異的突然変異法（ａｌ
ｔ＠ｄｉｒｅｅｔ＊ｄ　ｍｕｔａｇ＠ｎ＊ｓｉｍ　）に
よる、ｅ　ＤＮＡ及びｒツム遺伝子の修飾（ｍｏｄｉｆ
ｉｃａｔｌｏ難）Ｋより容易に取得し得る。

従って、本発明の別の要旨によれば、組換えＤＮＡ製造
技術（ｒ＠ｅｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｔ＊ｅｈｎｏ
ｌｏｇＦ　）　Ｋより製造されるごとき、ポリＡ：ｆチ
ド（１１記で定義したもの）及びその同族体が提供され
る。

本発明の別の要旨によれば、ポリペプチドをコード（ｅ
ｏｄ１ｍｇ　）する遺伝子物質（ｇ＠ｍ＠ｕｌｅ　ｍａ
ｔ＠ｒｉｍｌ　）からなる複製可能なプラスミド発現ビ
ヒクル（ｒｓｐＨｅａｂｌ＠ｐ１ｍｇｍ１ｄｉｅ　＠ｘ
ｐｒ＠ｓｓｉｏｎ　ｖｓｈｌｅｌｓ　）　　で形質転換
された宿主細胞（ｈｏｓｔ　ｃ＠ｌｌ　）を培養するこ
とにより上記ポリペプチドを発現させついでかく発現さ
れたポリＲｆチドを回収することからなる。前記ポリペ
プチドの製造方法が提供される。

本明細書においては１複製可能なプラスミド発現ビヒク
ル”という用語は最も広い意味で使用されており、例え
ば、染色体外遺伝体− （＊ｘｔｒ　−ｅｈｒｏｍｏｔｏｍａｌ　ｅｌ＠ｍ＠ｎ
ｔ　）　　として細胞内で複製し得るプラスミド及び宿
主ａｍ中に組込む（ｉｎｔ＠ｇｒａｔ・）することによ
り複製し得るプラスミドが包含される。

上記方法は大腸＠　（−Ｅ、　Ｃｏｌｉ　１、酵母又は
哺乳動物細胞のごとき適当な宿主細胞を使用して行い得
る。使用した宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチド
は哺乳動物の炭水化物又は他の真核生物の炭水化物忙よ
りグリコシル化（ｇｌｙｅｏｓｙｌａｔ・）されるか、
又はグリコシル化されないことがあり得る。

所望の代謝物（ｍ＠ｔａｂｏｌｌｔ・）が宿主細胞から
商業的に有用な速度で排出されない場合には、宿主細胞
全培養しつい′Ｑａ胞をそのままで収穫しそして所望の
ポリペプチドを、例えば宿主細胞の生長に必要な栄ｇ！
−を含有する媒体から分離した後、細胞を抽出すること
により回収し得る。代謝物が宿主細胞から、周囲の培養
液に移行する場合には、ポリペプチドは通常の方法で抽
出することにより回収し得る。

従って本発明の別の要旨によれば、前記で定義したごと
きポリＡニア”チドを発現することができる形質転換宿
主（ｔｒａｎｍｔｏｒｍ酊ｔ　ｈｏｓｔ　）であって１
この形質転換宿主は複製可能なプラスミド発現ビヒクル
からなるものでありそして上記ビヒクルは上記ポリペプ
チドについてコードする遺伝子物質であることを特徴と
する形質転換宿主が提供される。

本発明の別の要旨忙よれば、前記で定義したごときポリ
ペプチドについてコードする遺伝子物質からなる複製可
能プラスミド発現ビヒクルを宿主に挿入することにより
、宿主を形質転換することを特徴とする形質転換宿主の
製造方法が提供される。

外来遺伝子物質を宿主中和導入するのに適当な方法は文
献から一般的に知られている。かかる方法はベクターと
外来遺伝子物質からなる複製可能発現ビヒクルを形成さ
せついでこのピヒクルヲ宿主中に導入することからなる
。ビヒクルの宿主中への導入は宿主に適当な処１１！に
行うことにより、例えば大腸菌の場合には、塩化カルシ
ウム溶液で処理することにより促進し得る。

本発明の別の要旨によれば、前記したごときポリペプチ
ドを形質転換宿主中で発現することができる複製可能プ
ラスミド発現ビヒクルが提供される。

従って本発明によれば、更に、前記で定義したごときポ
リ堅デチドについてコードする遺伝子をベクターの適当
な挿入位置に挿入することにより、上記ポリ（デチドの
合成に使用することのできる複製可能１ラスミド発現ビ
ヒクルを得ることをｔ特徴とする複製可能プラスミド発
現ビヒクルの製造方法が提供される。

本発明の別の要旨によれば前記ポリペプチドについてコ
ードするＤＮＡ塩基配列（ＤＮＡ　ｓａｑｕ＠ｎｅｅ）
が提供される。

本発明のＤＮＡ塩基配列としては原核又は真核宿主細胞
内における前記ポリにプチドの発現を保証するのに有用
なりＮＡ塩基配列が挙げられる。本発明のＤＮＡ塩基配
列は特異的に下記のものからなると考えられる： ａ）第１３図に示すごときＤＮＡ塩基配列及びそのフラ
グメント、及び特忙、式（１）のポリペプチドについて
コードするフラグメント又はその相補的ストランド； ５）　ハイブリッド形成により第１３図に示すＤＮＡ塩
基配列又はそのフラグメントを形成するＤＮＡ塩基配列
；及び ８）遺伝暗号のＩＩ　Ｍ　（ｄ＠ｇ＠ｎ＠ｒａｅｙ　）
がない場合、ハイブリッド形成によシ＠１３図に示すＤ
ＮＡ　　塩基配列又はそのフラグメント及び特に式（Ｉ
）のポリ（デチドについてコードするフラグメントを形
成するＤＮＡ塩基配列。

部分ｂ）　中に％異的に包含される塩基配列は、対立遺
伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｅ　ｖａｒＩａｎｔ　）の形
の式（１）のポリペプチドをエンコードする（　ｅｎｅ
ｏｄ・）ｒツムＤＮＡ塩基配列である１部分ｅ）　　に
より特異的に包含される塩基配列は人造ＤＮＡ　（ｍａ
ｎｕｆａｅｔｍｒ＠ｄＤＮＡ　）である。人造ＤＮＡは
ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ８３／　０４０５３　　Ｋ記載
のＡｌｔｏｎ等の方法及びＮａ！ｕｒｌ！％　　第２９
２巻、フ５ロー７６のＥｄｇ＠　　等の方法により容易
に調製し得る。

第１３図に例示される塩基配列のフラグメントとしては
ＥＣ，ＲＩ及びＳａｌｌのごとき制限酵素及びＢｓｐＭ
Ｉ及びＢａｍＨＩ　による逐次的切断（ｓｅｑｕｅｎｔ
ｌａｌｄｉｇｅａｔｉｏｎ　）　により生ずるフラグメ
ント並びに式（１）のポリペプチドについてコードする
フラグメントが挙げられる。第口４図及び第１５図に例
示される塩基配列は部分的ｅＤＮＡ塩基配列であり、第
１６図に例示される塩基配列は完全ｃＤＮＡ塩基配列で
ある。従って、本発明によればＦｌム図又は＠１６図に
示されるごときＤＮＡ塩基配列又はその相補的ストラン
ドρ・ら実質的になるＤＮＡ塩基配列が提供される。

遺伝暗号の縮重により、本発明の適当なポリペプチドに
ついての遺伝子を構成するのに使用し得ルコドンの選択
が実質的に自由になる。宿主について好ましいコドンが
通常選択される。

前記ＤＮＡ塩基配列又はこ九に対応するＲＮＡ又はｅＤ
ＮＡ　の塩基配列の任意の部位にハイブリゾ−シヨンを
行うことのできるポリヌクレオチド！ロープ（ｐｒｏｂ
ｅ　）を構成し得る。興味のある塩基配列を明確に検出
するためには、ヌクレオチドッｏ　−プは、決定するの
に十分な長さの塩基配列とハイブリッド形成（ｈｙｂｒ
ｉｄｉａ・）することのできるヌクレオチド塩基配列か
らなることは理解されるであろう。一般Ｋｆロープは決
定されるべき塩基配列の、少なくともｇ個の共役ヌクレ
オチド（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ　）　においてハイブリッド形成することができるで
あろう。

従って本発明の他の要旨によれば、前記したごときＤＮ
Ａ塩基配列、又はそのフラグメント又は対応するＲＮＡ
塩基配列とハイブリッドを形成することができるヌクレ
オチド塩基配列からなりかつ場合によりラベルされてい
るか（１ｍｂｅｌｌ＠ｄ　）又はマークされている（　
ｍａｒｋ＠ｄ　）　成分を有するポリヌクレオチド　ゾ
ロ−１が提供される。

本発明のポリヌクレオチド　ゾロ−プは従来既知の方法
に従ってラベルするか又はマークすることができる；例
えば任意の好都合な方法に従って放射性同位元素　Ｐで
ラベルするか又は別法として、ハイブリゾ−シヨン技術
で周知の方法により放射性同位元素でラベルすることに
より５５Ｂ−放射性同位元素でラベルしたプローブ（５
５Ｓ−ｒａｄｉｏｌａｂ＠ｌｌ＠ｄ　ｐｒｏｂｅ　）を
得ることができる。別法として％ポリヌクレオチド！ロ
ープは、１ｑｊＮ年３月１５日〜２０日＃Ｃコロラド州
、キーストンで開催された、精製遺伝子（Ｐｕｒｉｆｌ
＠ｄ　Ｇ＠ｎ＠ｓ　）を使用する発生生物学（Ｄ＠ｖｅ
ｌｏｐｍ＠ｎｔ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　）″に関する１９８
Ｍ年のＩＣＮ　−ＵＣＬＡシンポジウムの会報、第ｖ１
巻、　１９８１、第６４フー６５８　頁に記載されるり
、ＣｊＦａｒｄ　　等の方法によりビオチン又はこれに
類似する化合物でラベルするか又は英国、ケンプリッチ
で開催された第６０４回引・ｃｈ＠ｍｉｃａｌＳｏｅｌ
＠ｔｙ　Ｍ＠ｅｔｉｍｇ　（１９８Ｍ年７月雪日）のア
プストラクトに記載されるり、Ｂ、Ｍａｌｅｏｍｎ等の
方法により酵素ラベルする（・ｎりｍｅ−１ｍｂ＠ｌｌ
＠ｄ　）こともできる。

本発明の別の要旨によれば、少なくとも前記したごとき
ポリペプチドのフラグメントを結合させるのに有用な抗
体が提供される。本明細書中で使用される抗体”という
用語は、他のものを示す記載がない限り、ポリクロナー
ル及びモノクロナールのごとき無傷の（ｉｎｔａｅｔ　
）抗体及び抗体フラグメント並びに英国特許出ｍ第２．
１８８．１５８３号明細書に記載されるごときキメラ抗
体（ｅｈｉｍ＠ｒｉｅａｎｔｌｂｏｄｙ　）　　ｔ−意
味する。本明細書において１フラグメント”という用語
は、他のものを示す記載がない限り、抗体の結合領域（
ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅｇｌｏｎ　）ＹＩ−含有するフラ
グメントを意味する。かかるフラグメントはｒｅ　　部
分（Ｆｅ　ｐｏｒｔｉｏｎ　）　　を欠いているフラグ
メントと定義されるＦａｂ　ｍ　フラグメント例えば°
Ｆａｂ　、　Ｆａｂ　　及びＦ（ａｂ　）２　　フラグ
メント！あり得るか又は無傷抗体中の■鎖（ｈ＠ａｖｙ
　ｃｈａｉｎ　）成分を連結しているジスルフィド結合
の還元的開裂（ｒ＠ｄｕｅｔＩｖｅ　ｃｌ＠ａｖａｇｅ
　）　　により得られる、いわゆる１半分子”　（”　
ｈａｌｆ　−ｍｏｌ＠ｃｕｌｅ　）　フラグメントであ
り得る。

本発明の抗体は、所望ならば、例えば本発明のポリヌク
レオチドゾロ−１との関係で述べたごときラベル又はマ
ーカー成分を担持し得る。すなわち、例えば抗体は蛍光
マーカーを含有し得る。しかしながら、本発明の抗体は
ラベル又はマーカー成分を担持する必要はない。すなわ
ち、例えば本発明の抗体は、本発明の抗体に属する種（
ｓｐ＠ｅｌ・Ｓ）の抗体に対する抗体である第二抗体（
日・Ｃ・ｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ　）　　によって検出し
得る。第２抗体はラベルされた成分又はマーカー成分を
有するであろう。

かかる抗体又はプローブは前記し丸ごときポリペプチド
又は対応する虱又は適当な場合にはＲＮムが存在するか
又は存在しないかを検出するのに使用することができ、
従ってエラ名ターゼに対する阻止作用を有する物質が存
在するか又は存在しないかを検出するのに使用すること
ができる。

すなわち、上記ｆＯ−プ又は抗体は、エラスターゼによ
って誘発される状態が、少なくとも部分的に、エラスタ
ーゼ阻止物質の不存在によって生起され得るか否かを示
すのに使用し得る。

本発明のポリペプチドのエラスターゼ阻止剤として作用
するための効力は、ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ　
）の低分子量べｌチド基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に対
する作用を本発明の化合物が阻止する能力により決定さ
れる。阻止剤の効力は阻止剤とＨＬＥとの相互反応によ
り形成される錯体の解離定数ｋｌの反応動力学的測定値
（ｋｉｎ＠ｔｉｃ　ｄ＠ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　）を
得ることにより評価する。基質としてはに、ＮａｋａＪ
ｉｍｍ　　等によりＪ、Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、。　２
５４　：４０２フー４０３２（１９７９）　Ｋ記載され
ており、また、Ｔ、Ｔ＠ｓｈｉｍａ等によりＪ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈ＠ｍ、、　２５７　：　Ａ　９゜５０８５−５
０引（１９８２）に記載されているごとき、ア−ニライ
ド　メトキシスクシニル−アラニル−アラニル−ゾロリ
ル−バリン−ｐ−ニトロアニライドが使用される。これ
らの研究に使用される■１酵素はＥｌａｓｔｉｎ　Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ　社（ミズリー州、セントルイス）から入
手することができ、あるいは、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ
　Ｂｌｏｅｈ＠ｍｉａｔｒｙ　ｈ　　＠目巻％５フー６
７頁（ｅ９８３）　　Ｋ記載されるＢ、Ｒ，Ｕｌｓｅａ
ｒａｌｌｏ　　等の方法によって精製し得る。

前記したごときポリペプチドは、そのままあるいは既知
の適当な方法で精製して使用することができそして例え
ば薬理学的に許容され得る稀釈剤又は担体と混合するこ
とにより製剤化し得る。投与は当業者に既知の種々の経
路で行い得る。＊に、投与は非経口的投与例えば鼻内投
与、直腸投与、肺投与により行うことができ、あるいは
、筋肉内注射又は皮下注射のごとき注射により行い得る
。

医薬組成物は使用されるべき投与方法に応じて製剤され
るであろう、例えば、医薬組成物が真円投与される場合
には、組成物を粉末化工アゾールとして調製し得る：ま
た、組成物を注射によって投与する場合には、組成物は
無菌溶液又は懸濁液として調製し得る。適当な稀釈剤と
しては水溶液が挙げられセして緩衝剤及び表面活性剤の
ごとき添加剤を添加し得る。

本発明の医薬組成物には放出制御農剤 （ｃｏｎｔｒｏｌｌ＠ｄ　ｒｅｌ＠ａｓｅ　ｆｏｒｍｕ
ｌａｔｉｏｎ　）　　も包含される。例えば本発明のポ
リペプチドを生分解性重合体中にカプセル封入するか又
はかかる重合体のマトリックス中に分散させ、その結果
ポリペプチドを重合体マトリックスの分解が進むにつれ
て放出させることができる。放出持続製剤 （ｓｕｍｔａｌｎｅｄ　ｒｅｌ＠ａｓｅ　ｆｏｒｍｕｌ
ａｔｉｏｎ　）中で使用するのに適当な生分解性重合体
としては、水性の生理学的な環境下に置いたとき、加水
分解により徐々に分解するＩリエステルが挙げられる。

ポリペプチドを長時間に亘って放出する特定の医薬組成
物は欧州特許第５ＪｌＡｇ　Ｉ号明細＠に記載されてい
る。

この組成物においてはポリペプチド（ｐｏｌｙａｅｔｉ
ｄｅ）が使用されており、水性の生理学的環境下に置い
た場合、ポリペプチドは実質的に全てのポリペプチドが
放出されるまで、組成物から連続的に放出される。

本発明のポリペプチドは、エラスターゼにより誘発され
る組織のタン／ぞり質の分解が原因である症状の処置に
有用ｆある。

本発明のポリはデチドは炎症状態、肺の症状、皮膚の症
状及び粘液分泌を伴う症状を処置するために１必要なと
きに、温血動物、特にヒトに投与し得る。本発明のポリ
ペプチドが有用であり得る症状の例としては、アテロー
ム性動豚硬化症、関節炎、気腫、成人の吸収器症候群（
ｒ・すｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍ・）、ノウ胞性線
維症、気管支炎、急性非リンパ球（ｎｏｗ　−１ｙｍｐ
ｈｏｂａｓｔｉｅ　）　　白血病及び乾癖が挙げられる
。

本発明によれば、更に、上記したごとき病気の処１１に
使用される医薬の製造における、前記ポリペプチド又は
その同族体の使用も提供される。

本発明によれば、更ｋ、本発明のポリペプチド又はその
同族体の有効量を温血動物、例えばヒトに投与して上記
したごとき病気を処置することを特徴とする温血動物の
病気の処置方法が提供される。

以下においては本発明を実施例及び添付図面により例示
する。

乾癖又はアトピー性皮膚炎に罹っている患者の皮膚から
偏度（ｓｅａｌ・）を採取し、プールしそして１〜１０
０ｔの／ぐツヂを得た。正常なヒトのカルス（皮膚硬結
）　（ｃａｌｌｕ＋ｓ　）　　を含有する癲皮材料を蒸
留水（Ｉ　Ｏ〜２００１２／）　ＫＪＩ！濁さセ、１４
クエン酸及びギ酸を使用して懸濁液の−を２．８に調節
し、１０容量鳴のエタノールで稀釈しついで凍結した（
−８０°Ｃ）。ついでウルトラトラックス（ｕｌｔｒａ
ｔｕｒｒａｘ　）　（氷上で１時間、超音波処理（１５
分、４００ワット）、ウルトラトラックス（１時間）及
び遠心分離（５０００Ｘ　ｔで１０分間）を行うことに
より機械的に破砕した。得られた沈降物を５０１エタノ
ール及び５０チクエン酸塩／ギ酸塩で再び抽出し、両方
の抽出操作で得られた上澄液を一緒にした。一緒にした
抽出物を限外ｒ過（Ａｒｎｉｅｏｎ　ＹＭ５　）　　ｔ
ｃより濃縮しついで０．０１　Ｍギ酸アンモニウム（ｐ
Ｈ４，０）を経てｒ過して（ｄｉａｆｌｌｔｒａｔｓ　
）粗抽出物を得た。

上記の単離操作により得られた粗抽出物を（下記の方法
に従って）クロマトグラフィーにより精製して、ヒト白
血球エラスターゼに対して阻止作用を有する物質の均質
な試料を得た。

粗抽出物を、最初、カチオン交換ＨＰＬＣＦｃより精製
して、ヒト白血球エラスターゼそれ自体のごとき物質か
らのヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用を有する
物質を分離した。ＷＥ１図に示すごとく、ＨＬＥ　Ｋ対
する阻止作用を有する物質を約２６〜５ｇ分の間に広い
ピークとして溶離した。

プロミネント（ｐｒｏｍｌｎ＠ｎｔ　）阻止剤を含有す
るフラクションを０８−逆相カラム（ＣＢ−ｒ・マｅｒ
ｍ＠ｄ　−ｐｈａｓ・ｅｏｌｕｍｎ　）　　上で更に精
製しついで適当な均質性（ｈｏｍｏｇ＠ｎ・ｔｔｙ）が
認められるまで再びクロマトグラフィーｋかけた（＠２
図参照）。

ＨＬＥ　Ｋ対する阻止作用を有する物質を含有するフラ
クションを一緒にしついｆポリＬＣカラム（Ｐｏｌｙ　
ＬＣｃｏｌｕｍｎ　）　　上でのりｏｗトゲラフイーに
かけた。分離を行って、プロミネント阻止剤であること
が示された成分な★有する物質を得た。

この成分なＣｔａ−逆相クロマトゲラフイーによシ更Ｋ
　Ｗｔ　！ＩＩ　した（纂４図参照）。幾つかの製剤に
おいてｔｉ９５ｊ以上の純度を得るためには（ｃ１Ｂ−
逆相クロマトゲラフイー、ポリＬＣについての分析的操
作により及びＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　における不純物の完
全な不存在及び等電点により示されるごとく）、サイズ
排除り０￥トゲラフイー及び逆相ポリＦ−ＨＰＬＣから
なる追加的なりロマトゲラフイーが必要であった。

カラＡ　　：　ＴＳＫＣＭ３−ＳＷ（７，５ｘ　１５０
ｍ。

ＬＫＢ　Ｂｒｏｍｍａ、スエーデン） 操　作　：２０分間、緩衝液Ａ、流嘉０．５〜１、Ｑｍ
ｊ／分； ３０分間、１００１まで濃度を線状内 配で変化させた緩衝液Ｂ；流嘉１― ／分；２０分間、緩衝液Ｂ；及び５０ 分、緩衝液Ｃ０ 緩ｇＲ液Ａ：Ｏ，ＯｊＭギ酸アンモニクムｐ１１４．０
緩衝液１１：０．５Ｍギ酸アンモニクムＣＭ４．０緩衝
液Ｃ：０．５Ｍギ酸アンモニウム−３，０粗抽出物を上
記条件下でクロマトグラフィー化かけた：その際、１フ
ラクション当９６０滴を自動的ｋ捕集５２８０　ｍｍで
Ｗ−検出を行った。

逆相−Ｃ８−ＨＰＬＣ カラム　：ヌクレオシル（Ｎｕｅｌ＠ｏｓｌｌ　）　３
００−７Ｃ８−■ＰＬＣカラム（２５０Ｘ　１４．？ｘ
ａ　、　Ｍａｅｈｅｒ＠ｙ　−ＮａｇｓＬ　Ｄｕｒ＠ｎ
、ドイツ）。

操　作　：流嘉−３−／分 ２０ｍ２０僑緩衝液Ｂ；７５ｊｌｊ、６０鳴まで濃度を
線状勾配で変化させた 緩衝液Ｂ　；　ｌ　５ｍｌ、　１００憾まで濃度を線状
勾配で変化させたＭ衝液Ｂ； ３０ｒａｌ　、　１００９ｋ緩衝液Ｂ。

緩衝液Ａ：ｏ、ｔ＊ｒｐａ °緩衝液Ｂ：０．ｌ　　鳴ＴＦＡアセトニトリル。

試料を上記条件下でクロマトグラフィー化かけた；　２
３５　ｎｍ″ｒ′ＵＶ−検出を行ｔごかっビークｆの捕
集（ｐａａｋｗｉｓ＠ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　）を行っ
た。６０％緩衝液までの勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ　）　
　で溶離した、阻止作用を有する物質を含有するフラク
ションを一緒Ｋし、凍締乾燥しついで前記と同一のカラ
ム上でかつ同一条件で再びクロマトグラフィー化かけた
。

カラム　：ポリＬＣ力５　Ａ　（２００Ｘ　４．６　ｗ
ｍ　、　：１０ンピア、　ＭＤ、　ＵＳＡ　） 操　　作　　二流属１ｍｊ／分 １０ｍｇ、緩衝液Ａ；３０ｄ、ＳＯＷ まで濃度を線状勾配で変化させた緩 衝液Ｂ １０１Ｌｔ、１００憾まで濃度を線状勾配で変化させた
緩衝液Ｂ；１０−緩衝 ＠Ｂゆ 緩衝液Ａ　：　５　ｍｌｌｉｌＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ３，
１＋２５１７−ｋ　）　ニトリル 緩ｉ１ｉ　ｉｆ　Ｂ　：　５　ｎ＋ＭＫＨ２ＰＯａ　−
０−５Ｍ　Ｋｃｌ−Ｐｊ　３−１　＋　２５鳴ア七トニ
トリル 凍結乾燥試料を緩衝［Ａに溶解しついで上記の条件下で
りａマドグラフィーを行った；その際２２０　ａｍ　で
ＵＶ検定を行いかつピークでの捕集を行つ良。

カラム　：ヌクレオシル１００−５　Ｃ，，（２５ｆ）
　Ｘ４．６　ｗｍ　、　Ｂｆｓｅｈｏｆｆｅ　Ｌ＠Ｏｎ
ｂ＠ＦＩＸ　Ｆ　４７）操　作　：流嘉１ｍ１１７分 ３０分間、ＩＯ憾から４０鴨まで濃 度を線状勾配で変化させた緩衝液Ｂ １０分間、Ｉ００−憾ま−で濃度を線状勾配で変化させ
た緩衝液Ｂ 緩衝＃Ａ：Ｏ，ｌ　　憾ＴＦＡ 緩衝液Ｂニア七トニトリル中の０．１憾ＴＦＡ試料を上
記条件下でクロマトグラフィー化かはその際２１５ｎｍ
　でＷ−検出を行いかつピークでの捕集を行った。必要
に応じて、阻止作用を有する物質を含有するフラクショ
ンを均質性が得られるまで前記と同一の系で再びクロマ
トグラフィーにかけた。

サイズ排除ＨＰＬＣ １５Ａ　　二Ｔ８Ｋ　２０００カラＡ　（６００Ｘ　７
．５　ｍ　。

ＬＫＢ、　Ｂｒｏｍｍａ、スウェーデン）操　作　二流
富１ｍ／分 ０、＃優ＴＦＡ 試料を上記の条件下でりａマドグラフィーｋかけ、その
際、２１５ｍｍ　　でＵＶ検出を行いかつフラクション
当り２０％を捕集した、　Ｍｒ　　はペプチドＶａｌ　
−ｇｌｙ　−ｍ＠ｒ　−ｇｌｕ　、インシュリン、Ｂ−
鎖フラグメン）　２２−３６　．アプロチニン、−鶏卵
アルブミン及び牛血清アルブミンを使用して検量した。

逆相−Ｐｏｌｙ　Ｆ−ＨＰＬＣ カラム　：　Ｐｏｌｙ　Ｆカラム（８０−Ｘ　６．２ｔ
ｍ　。

Ｄｕｐｏｎｔ、　Ｄｒ＠ｌ＠ｉｅｈ、　ドイツ）操　作
　：流高１ｍ／分 ３０ｍ、１０１から４０１まで濃度 を線状勾配で変化させた緩衝液Ｂ； ２１１７、ｌＯＯ％まで濃度を線状勾配で変化させた緩
衝液ＢｉｌＯＭｌｌｌ衝液緩衝ｔＡ：Ｉ憾ＮＨ４ 緩衝液Ｂニアセトニトリル中のＩ　９６　ＮＨ４凍結乾
燥試料を緩衝液ムに溶解しついで上記の条件下でクロマ
、トゲラフイーＫかけた。その際、２１５ｍｍ　でＵＶ
検出を行いかつピークでの捕集を行った。

タンパク質濃度は逆相−ＣＩＩＩ−クロマトグラフィー
における２１５■での吸収の集積（ｉｎｔｅｇｒａｔｌ
ｏｎ）により測定した。検量剤（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ
　）として次のものを使用した二二ビキチン（Ｓｉｇｍ
ｍ　）及び組換え体エグリｙ　（ｒｅｅｏｍｂｉｎａｎ
ｔ　）　Ｃ（Ｃｌｈａ−Ｇ＠ｉｇｙ）。

製造業者の使用説明書に従ってＰｈａｒｍａｃｉａＰｈ
ａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｈａｒｍａａ１ｍ、　Ｆｒ
ｅｉｂｕｒｇｅ　　ドイツ）及び均質な２０９６ＳＤＳ
−ゲルを使用してナトリウム　ドデシル　サルフェート
　ポリアクリルアミドダル電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＧ
Ｅ　）を行った。試料を凍結乾燥しついでＯ，Ｏｆ　−
Ｍ　Ｈ，ＰＯ４°　８　Ｍ尿素、２．５嘔ＳＤＳ及び０
．０２ｊブロモフェノール１ルー中（ｍ６．８）で沸騰
させること（５分間）により還元した。標準としてミオ
グロブリンフラグメン）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　
５８１　馬ミオクロビ”　（Ｓｅｒｖａ）及びエビキチ
ン（Ｓ１ｇｍｍ　）を使用した。銀染色（ｓｉｌｖｅｒ
　ｓｔａｉｍ　）　　を製造業者（Ｓ１ｇｍｍ　）の指
示に従って行った。

等電点電気泳動 Ｓｅｒｖａｌｙｔ　Ｐｒｓｅｏａｔ＠ｓ　ｐｆ１３−１
０及びＴ＠ｓｔ　−Ｍｉｘ９　（Ｓｅｒｖａ　）を使用
して等電点電気泳動を行った。

予備電気泳動（ｐｒａｆｏｒｅｕｓｓ１ｍｇ　）を３ワ
ットで３０分間行いそして銀色素（ｓｔａｉｎ　）　（
ｓｔｇ呻ａ）とクロマシー（Ｃｏｍａｓｍｉｅ　）　　
プルーＲ染色色素を製造業者（Ｓｅｒｖａ　）の指示に
従って使用した。これと並行して、上記Ｐｒ・ｅｏａｔ
＠ｍをスライスし、溶離して、阻止活性ペプチドを局在
化させた。約１Ｉ１１１のスライスを１００μＬ　のア
セトニトリルで溶離した。

溶出液（ｅｌｕａｔ＊　）　　を乾燥させ、２０ＩＩＦ
のＨＬＥを含有するｌｏｃａｔノ緩衝液（０，１Ｍ　Ｈ
ＥＰＥ８．０．５ＭＮａＣ／。　ｌ　％　ＢＳＡ、　ｍ
　７．５　）　Ｋ再溶解させた。３０分間、インキュベ
ート（ｌｎｅｕｂａｔ・）した後、残留ＨＬＥ活性を測
定した。

以下で述べるごとき方法に従って！ロチアーゼ阻止剤に
よる種々の￥ロチアーゼの阻止効果な測定した。その結
果なｍ１表に示す。

ヒト白血球エラスターゼ：　　３ＸＩＯ−”Ｍ　：　２
ｒＩＭＡＡＰＶｐＮｋ豚膵臓エラスターゼ　　　：　　
ｌＸＩＯＭ　　：　０．１ｍＭＡＡＰＶ−Ａｒｃヒトカ
テ１シンＧ　　　　　：　　ｎ　、　１、　　　　　：
　０．５　ｒｒａｌｌ　ＡＡＰＦｐＮＡα−キモトリプ
シン　　　”、ｎ、ｉ、　　　　　：　０．５ｎＭＡＡ
ＰＦｐＮＡトリプシン　　　　　　：　ｎ、ｉ、　　　
　　：　Ｏ，ＩｍＭ１℃ＰＬｐＮＡｎ、Ｌ　：　　阻止
効果なし。

ヒト白血球エラスターゼ（ＥＣ，３，４，７１、３７）
の活性をＮａｋａｊＩｍｍ　等の方法（文献？参照）ｋ
従って測定した。ＨＬＥ　Ｋ対する阻止効果は合成ベゾ
チド　メトキシ−サクシニル−アラニル−プロピル−パ
リルーｐ−ニトロアニライド（ＡＡＰＶｐＮＡ　。

８１１ｍｍ　）を使用して測定した。

試料（Ｇｏｏ　ｐａｔ　）　　及びｇｏｏμＬ　ＨＬＥ
　（２００ｍｇ　／ｍｌ　　；　　Ｅｌａｓｔｉｎ　　
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　　Ｐ
ａｅｉｆｉｃ。

ＭＯ，ＵＳＡ　）を分析用緩衝液（ａｓｓａｙ　ｂｕｆ
ｆ＠ｒ　）（０，ｌ　Ｍ、　ＨＥＰＥＳ、　０．５　Ｍ
　ＮａＣ１，１０＊　ＤＭＳＯ，ｐＨ７，５）中で室温
で３０分間インキエペートした。ついで分析用緩衝液中
の基質（ｇｏｏ　ｓＬ、　０．５　ｍＷ　）を添加した
。

４０５　ｎｍ　での吸光度の変化を８時間まで測定し。

阻止車（至）を残留活性と対照から算定した。解離定数
（Ｋｉ）けＧｒ・・ｎ及びＷｏ　ｒｋ　の方法佼献８参
照）ｋ従って、前記と同一の系内で、２ｍＭ　の基質と
（１μｔ　７ｄ　）　ＨＬＥ　　（最終濃度）を使用し
て測定した。

豚膵臓エラスターゼ（Ｅ、Ｃ，３，４，２１，３６）の
活性を蛍光発性基質（ｆｌｕｏｒｏｇ＠ｎｉｅ　ｓｕｂ
ｓｔｒａｔｅ　）　、メトキシ−サクシニル−アラニル
−アラニル−プロピル−／ｆリル−トリフルオルメチル
クマリン（ん「ｖーＡＦＣ＠　Ｂａｅｈａｍ　、　Ｂｕ
ｄ・ｎｄｏｒｆ　、スイス）を使用して測定した。

エラスターゼ（１００μｔ）と阻止剤（＋００　ａｔ）
を３０分間、プレインキエペートした。ついで基質の溶
液（０，１−溶液、ｌ、ｇＭ！）を添加した。

蛍光試薬（ｆｌｕｏｒ＠ｓｃｅｎｃｅ　）、　Ｅｘ　４
００　Ｅｍ　５０５を添加しついで阻止嘉−を試料の当
初の活性と対照から算出した。解離常数（Ｋｉ）　　は
Ｇｒ・・ｎ及びＷｏｒｋの方法（文献８参照）Ｋ従って
測定した。

カテプシンＧ及びα−キモトリプシンの活性をＮａｋａ
ｊｉｍｍ　等の方法（文献９参照）Ｋ従って、ＨＬＥ−
サクシニルーアラニルーアラニルーデロリルー７二二ル
アラニルーｐ−ニトロアニライｌ（Ｄ同族体（ＡＡＰＦ
ｐＮＡ、　Ｓ１ｇｍａ社）を使用して測定した。阻止車
の測定については、阻止剤の最高濃度は１μｔ／−であ
った；これはカテプシンＧ及びα−キモトリ１シンと比
較して、３倍のモル濃度である。

トリ１シン及びプラスミンに対する阻止効果１００ａｔ
　の阻止剤（嘗βｔ／―）と１００　ｔｓＬのトリｌシ
ン（Ｍμｙ／ｍ）　　又はプラスミン（１ｓｔ　　−／
ｍ）を３０分間インキエペートしついで０．０５Ｍ　ｕ
ｇｐｇｓ及び０．１２　Ｍ　Ｎａ（Ｊ　（ｐＨ７，５）
中の、０．謄ｍＭ　の基質、トシル−グリシル−ゾロリ
ル−リシン−ｐＮＡ　（Ｂｅ＠ｈｒｉｍｇｅｒ＊　Ｍａ
ｎｎｈ＠量ｍ、　ＦＲＧ　）　ｔ添加した。

Ｊ、Ｈｘｐ、Ｍ＠ｄ　　ｌフ漏、３５７−３６２（菖ｑ
ｑｏ＞　　Ｋ記載されているＬｕｄｅｍａｎｍ　の方法
に従って、ヒト多形核白血球を精製した。ヒト白血球エ
ラスターぜ及びカテプシンＧが存在しないことは、Ｎａ
ｋａｊｉｍａ　　の方法（文献８参照）に従って、それ
ぞれ、基質、−メトキシ−サクシニル−アラニル−アラ
ニル−ｌロリルーＪ９リン−ｐ−ニドａアニライド（Ａ
ＡＰｖｐＮｋ）及びサクシニル−アラニル−アラニル−
フェニル−ｐ−ニトロアニライドを使用して、プロテイ
ナーゼ３製剤の活性が示されないことにより確認した・ エラスチノール活性（ｅｌａｓｔｉｎｏｌｙｔｉｅ　ａ
ｅｔｉｖｉｔｙ）は・牛ウーナシ靭帯エラスチン（ｂｏ
ｖｌｎ＠ｌｉｇａｍ＊ｎｔｕｍａｕｅｈａａ　＊１ａｓ
ｔｉｎ　−ＦＩＴＣＥｌａｓｔｉｎ　Ｐｒｏｄｕｅｔｓ
ｓ　ＵＳＡ　）の加水分解により測定した。

プロテイナーゼ３製剤（ｌ　ｓＬ　）　　をカーボネー
ト緩衝ｆＭ　（５０ａｔ、ｏ、　ｉ　Ｍ　）　−Ｎ＊Ｎ
ｓ　（０−０２％）及びＢｒｉｊ　３５　（０，０１９
６）　（ｐＨ８−５）　　中の式（！）のエラスターゼ
阻止剤（０−１４ｆ　）　　と共Ｋ３７°Ｃで３０分Ｍ
ｆレインキエペートした。ついでカーボネート緩衝液（
ｔｏｏ　ｊｔ、　０．１　Ｍ　）、ＮａＮ３（０−０２
憾）及びＢｒｌｊ　３５　（０，０１ｊ　）　（ｍ　Ｌ
５　）　　中のエラスチン−ＦＩＴＣ（１ｗｇ）を添加
した。混合物を穏やかＫ攪拌しなから３７＠Ｃセ４時間
インキニベ−ドジついで６０００　Ｘ　ｔ　で遠心分離
した。上澄液を２０倍に稀釈しついで溶解エラスチン−
ＦＩＴＣの蛍光をＰ・ｒｋｉｎ　Ｅ１ｍ＠ｒ　Ｌ８５０
−マイクロタイタープレートを使用してＥｘ　４ｇ９１
ｋ１１１＠　Ｅｍ　５１３　ｎｍ　　で測定した。蛍光
は酵素を含有していない対照ｋより修正し、酵素を含有
していない対照に対する唾で表わした。

式（１）のポリはプチドはプロテイナーゼ３に対する強
力な阻止剤であり、９．５　Ｘ　Ｉ　０−９Ｍの■Ｃ５
°に相当する活性を有することが認められた。

本発明の阻止剤（ポリペｌチｅ）の分析的サイズ排除ク
ロマトグラフィー（Ｔｓｋ　２０００　）　　は５〜１
０　ＫＤ　の５〜ＩＯｋＤ　の見掛分子量（ａｐｐａｒ
＠ｎｔ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　）　ｋ与えた
（第５図参照）。ＳＤＳ−ＤＡＧＥ　上での本発明の阻
止剤の分子量は約９　ｋＤであり、第５図に示すごとく
、エビキチン（Ｍｗ＝４５００））Ｃ近似する泳動（ｍ
ｉｇｒａｔｉｏｎ　）を示したＯ 本発明の阻止剤の等電点は銀染色法及びグルスライス中
での阻止剤の平行的酵素検出法（ｐａｒａｌｌｅｌ　＠
ｎ＋ｃｙｍｅ　ｄｅｔｅｅｔｌｏｎ　）によって示され
るとと（、ｐＨ９，７であつ九（第６図参照）。

本発明の阻止剤はセリンエラスターゼ厄！及び豚杯臓エ
ラスターゼを阻止することが認められている。しかしな
がら、α−中モトリプシン及びトリプシン及びグラスミ
ンは、少なくとも３倍過剰の阻止剤によって阻止されな
い。ＨＬＢの阻止についての平衡解離定数（Ｘｔ）　　
な、第７図に示すごとく、Ｇｒ・・ｎ及びＷｏ　ｒｋ　
の方法（文献８参照）Ｋ従って測定した。

本発明の阻止剤は酸に対して安定であることも認められ
た。

本発明の阻止剤の精製物約５μＰについて。

ＡｐｐＨ＠ｄ　　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｍ　　Ｍｏｄ＠ｌ
　　４７０　　Ａ　　Ｇａｓ　　ＰｈａｓｅＳｅｑｕ＠
ｎｅ＠ｒを使用してかつフェニルチオとダントインのＭ
ｏｄｅｌ　１２０　Ａオンライン分析により、アミノ酸
配列の分析を行った。この分析により第８図に示すごと
く、３０個のアミノ酸残基の配列が認められたが、シス
ティンについては、同定される残基の存在しないことが
暗示された。アミノ酸の当初の収量（ｙｉ・ｌｄ　）は
分子サイズロー８にダルトンの単鎖ポリイプチドと同等
であった。

精製した本発明の阻止剤（ＩＱμｆ）を水（５０μｔ）
　Ｋ溶解し、６Ｍグアニジン塩酸塩、０．１　Ｍ　）リ
スＪ１イドロクロライドＩ３ＩＩ＆５緩衝液（３０ａｔ
　）と混合した。チューブを窒素でフラッシュしついで
ジチオトレイトール溶液（グアニジン緩衝液中の５０ｓ
ｖ／ｍ溶液５１Ｌ）を添加した。チューブを再び窒素で
フラッシュし、シールしついで３７＠Ｃで４時間保持し
た。グアニジン緩衝液中のヨードアセトアミド（５＋＋
ｖ）を添加し、チ５−−１を再び窒素でフラッシュした
後、チューブを周囲温度で１時間、暗所に保持した。試
料を　Ｏ，ｌ憾トリフルオル酢酸水溶液でＭ―まで稀釈
しついで直ちＫＶｙｄ＠ｅ　ｃ１８カラム（２５Ｘ０．
４６３）ｔｃ供給し丸。

カラムを水中のＯ，１％　）リフルオル酢酸からア七ト
ニトリル中の０．１憾トリフルオル酢酸までの線状勾配
で１Ｍ１１分でフＯ分展開させた。この操作により２つ
のピーク（ＩＩ９図参照）、すなわちクラクション３３
−３４の少量成分とフラクション３５−３６の主要成分
（約６７９１）が得られた。各々の成分を別々に、再び
カルボキサミトメチル化条件下に暴露したが、再度クロ
マトグラフィーにかけた場合、変化は認められず、従っ
て、最初の反応が完結していることが認められた。

カルボキサζトメチル化で得られ九小量成分の半分を、
真空中、ｔｔｏｃで６時間、１％のフェノールを含有す
る６Ｎ塩酸で加水分解した。加水分解物をＬＫＢ　Ａｌ
ｐｈａ＋アミノ酸分析器を使用して分析して、第２表に
示すごとき北本を得た。分析試料は少なかったが、Ｉｆ
ツクグランドコレクション（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｅ
ｏｒｒ＠ｅｔｉｏｎ　）は適用しなかった。

第２表 Ａｓｐ／Ａｓｒ／Ｃｙｍ　　　　　Ｂ、ｇ　　　　　　
４　＋８　ｅｙｅＴｈｒ　　　　　　　　　　　２．１
　　　　　　　　２８ａｒ　　　　　　　　　　　　４
．５　　　　　　　　３Ｇｌｖ℃Ｉｎ　　　　　　　　
　ｓ、ｓ　　　　　　　　　４Ｐｒｏ　　　　　　　　
　　　７．０　　　　　　　８０１７　　　　　　　　
　７．４　　　　　　　５Ａｌｍ　　　　　　　　　　
　　３．０　　　　　　　　３Ｖａｌ　　　　　　　　
　　　　３．０　　　　　　　　３ＭＩｔ　　　　　　
　　　　　　　　　書、６　　　　　　　　　　２１１
５　　　　　　　　　　２．８　　　　　　　　４Ｌ・
ｕ　　　　　　　　　　　　３．４　　　　　　　　３
ｐｈ６　　　　　　　　　　　　　　■、層　　　　　
　　　　　　　８Ｌフ思　　　　　　　　　４．５５ Ａｒ１　　　　　　　　２−３　　　　　　　２Ｃ１：
クラクシヨン３３−３４のＣＡＭ誘導体の残りの半分な
Ｏ，１Ｍ炭酸アンモニウム（５０μＬ）及び０．２Ｍ塩
化カルシウム中たｆＢ解しついでキモトリプシン（Ｗｏ
ｒｔｈｉｎｇｔｏｎｅ　２０　＃ｆ　／ｄ溶液１０μＬ
）で処理した。溶液を３．０Ｃで１時間保持しついセ０
．１１）！７フルオル酢酸水溶液（２００μＬ）で稀釈
しこれをＶｙｄａｅ　Ｃ１８カラムに直接、供給した。

アセトニトリル中のトリフルオル酢酸の濃度ｔ　０．１
憾まで線状勾配で変化させながら、この溶液を６０分Ｍ
、１−／分の割合でカラムに供給した。この操作におい
ては＠１０図に示すごとく３つの主ピークが得られた。

これらのピークの各々を可能な限り配列した（　ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ　）。得られた結果を以下に示す。

Ｃ２：フラクシヨン３５−３６のＣＡＭ誘導体の半分な
上記と同一の条件下でキモトリプレンを用いて消化した
。ＨＰＬＣ状態図（ｐｒｏｆｉｌｅ　）　（ｇ　ｌ　１
図）は分解（ｄｖｇｒａｄａｔｉｏｎ　）がより多く行
われたことな示しているが、ピーク１及び３（＠１０図
）は＠２の消化のビーク１及び８と同一の程度に存在し
ていると思われる。他のピーク、第１０図におけるピー
ク２は第２消化におけるよシ、比較的に１はるかに小さ
く、他の２つと同一の位置において明瞭でないｅ　Ｃ２
からの追加のピーク、すなわち、３．４．６、フ及び９
が配列されている。

これらのピーク（＠８図）はピークツから離れて示され
てお）、このことは６と同一の配列を、これが採用され
る限り、有することを示している。

Ｔ：前記ＣＡＭで得られた主要成分、フラクション３５
＾３６の残部なＯ，ＩＭ炭酸アンモニウム（５０ａｊ）
及び０．２Ｍ塩化カルシフム（ｌ　Ａｔ）中に溶解しつ
いでトリプシン（０，１Ｍ炭酸アンモニウム１０μＬ中
、２００　ａ？　）　　で処理した。溶液を３．０Ｃで
３０分間保持し、Ｏ，ｌ　１　）リフルオル酢酸水溶液
で稀釈しついで直ちＫＣｌａカラムに供給しそしてこの
カラムを他の醪素消化の場合と同様に藤開した（第５図
参照）、この操作においては２つの明確な（ｄ＠ｆｉｎ
ａｂｌ・）生成物のピークが示されかつ出発原料が残留
していないことが示された。関連スルシルフェンスのデ
ーターは纂１図に示されている。

単一アミノ酸分析を行った結果から、アミノ酸含有量が
正確ではｈいが近似的に示され、これはよシ小さいフラ
クションに分解するための酵素の選択に役立った。

直接的アミノ酸配列決定（ｄｉｒｅｃｔ　ｍｅｑｕｅｎ
ｅｉｎｇ　）により最初の３０個の残Ｘｓ（アミノ酸残
基）が示され、これを大型トリ！シンフラグメントＴＩ
Ｏにより確認した。トリプシンを使用した条件下では主
要生成物について大型フラグメントが得られる；すなわ
ち、リシン結合の全てが切断されることがない、全構造
体を包含するこれらのフラグメントはａＩ８図に示され
ている−。切断点は塩基性残基に限定されていた。

これに対して、キモトリプシンは二個の芳香族アミノ酸
残基の後方は切断（ｃｌｓａｖｅ　）−Ｌしいが、２個
のメチオニンの後方及びロイシン−３３の後方は切断し
た。更に、ロイシン−２０の後方で切断が生起した−。

Ｃ−末端グルｊミンは強い￥ロリンビータの後方の〒９
及びｃ２−ｓ−Ｚデチド中に見出される非常に小さいが
検出可能な残基に基づいて決定された。しかしながら、
このＣ−末端グルタミンはかかるＣ−末端残基から予測
された。第８図に包含されていない、種々の他の堅デチ
ドｋより、更に構造の確認を行った。

より小さいａ巴誘導体のクリモトリゾシンによる消化を
行うことＫよりアミノ酸配列の決定を行い、下記のデー
ターを得た： Ｃｔ−ｔ（ｃｆ　Ｃ２−，）　　ＩＩｓ−Ａｒｇ−Ｃｙ
ａ−Ａｌｍ−ｌｉｌｅｔＣ，−５（ｄ　Ｃ２−８）　　
Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ｌｙａ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａ１−Ｇｌｙ／Ｓ＠ｒ−Ｘａａ−Ｌｙ
ｅ−Ｐｒ。

ｃｔｙ− Ｃ，−２Ｌｅｕ−Ａａｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌ＊ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｍ
ｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−１１ｓＬｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｃｙｍ−Ｃｙｓ−ＧｌｖＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ｙｓ
− 人手され友データーからはＣＡＭ誘導体の主成分と小量
成分との間の差は認められなかった。これはＮ−末ｆｉ
において伸長（ｅｘｔ＠ｎｓｉｏｎ　）又は欠失（ｄｅ
ｌ＠ｔｉｏｎ　）　　が生じていることに基づいている
。

決定された構造（第８加）は小さい、主として塩・基柱
のポリペプチドの構造である。この構造体はかかる分子
についての通常高い含有量のプロリンな有してお秒、更
に、グリシン及びシスティンは均密Ｋ取込まれた（　ｔ
ａｇ・）分子を示している。

５７残基のポリペプチドからなる、本発明の阻止剤の他
に、ヒト白血球エラスターゼＫ対する阻止作用を有する
別の物質も単離され、その中のポリペプチドＫついて部
分的にアミノ酸配列を決定した（　ｓ＠ｑｗ・Ｈｅ＠ｄ
　）。下記のごとき結果が得られた： ビーク『：主要成分Ｅ 小量成分Ｄ ビーク［Ｉ：主要成分Ｅ 小量成分Ｄ ビーク■：主要成分Ｂ 小量成分Ｃ ビークＶ：主要成分Ａ 小量成分は主要エラスターゼ阻止剤と 同一の位置から出発している。

成分Ａ： Ａｍｎ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌ
ｙａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａ１−Ｂｅｒ−Ｖｍ１−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｍｐ−Ｌｙｍ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ。

成分Ｂ： Ｇｌｙ７％ｌａ−Ｇｌａ／Ｖａｌ−Ａｍｐ−Ｌｙｍ−Ｖ
ａｔ−Ｌｙｅ−Ａ１ｍ−ロ１亀−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ＝Ｌｙａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａ１−Ｓ＠ｒ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｅ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−Ｓ＠ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
（ｉｓ（ｌｅ−Ｌｅｕ。

放分Ｃ： Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａ１ｍ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−ｇ＠ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓ＠ｒ
−Ｃｙｓ。

成分Ｄ＝ Ｇｌｙ／Ｖａｌ−Ｌｙｅ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ＠
ｒＴｈｒ−Ｌｙｅ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｓ　ｒ−Ｃｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｉ　１　＠−Ｉ　１ｅ−Ｌｍｕ−Ｉ　１　
ｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌ　ａ−Ｍ＠ｔ−Ｌｅｕ−Ａｍ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａａｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｍ−Ｌ＠ａ
−Ｌｙｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ。

成分Ｅ： Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ＠ｒ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｙｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｉ
　１ａ　−１Ｉｓ　−Ｌｅａ−１１ｅ　−Ａｒｇ−Ｃｙ
ｍ−Ａｌａ−Ｍｅ　ｔ　−ｒａｍ　−Ａｍｎ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ。

上記Ｎ−末端アミノ酸配列において、底分ム。

Ｂ及びＣの１−１９．ｌ−６及びｌ−４のアミノ酸配列
の決定は、それぞれ、該アミノ酸配列の後続部分より不
確実である。

単離された追加的成分は本発明の前記阻止剤と類似の性
質、例えば類似の生物学的性質を有することが認められ
た。

かくして、ヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用を
有する物質は、ヒト白血球エラスターゼとＩ：１のモル
比で結合すると考えられる酸安定性のポリペプチドから
なる卓越した（　ｐｒｏｍｉｎ＠ｎｔ　）阻止剤を含有
することが見出された。こ°の阻止剤はカニ＝ｆ　（ｃ
＠ｇ＠　）　　状構造体の形で多数のジスルフィド結合
（このジスルフィド結合が堅デチドな上記形状忙保持し
ている）と結合していると考えられる。エラスターゼ、
特Ｋ　ＨＬＥに対する高い親和性と特異性（ｓｐ＠ｅｉ
ｆｉｔＦ　）は、阻止剤を、エラスターゼＫより誘発さ
れる組織のタンパク分解が原因となっている症状、例え
ば乾癖及び気腫の処置に使用するのに有用なものにせし
めている。前記本発明の卓越した阻止剤と類似する性質
を有する、同種のポリペプチドを示す他のポリペプチド
も単離されている；実際、関連するポリペプチドの部分
的なアミノ酸配列は、本発明の卓越した阻止剤のアミノ
酸配列の少なくとも一部の存在な指示している。

プロテイナーゼ３は、卓越した阻止剤（式！のポリペプ
チド）によって効果的に阻止される、ヒト白血球エラス
ターゼ及び豚膵臓エラスターゼ以外の第３のエラスチン
分解性セリンプロテアーゼである。この阻止剤は皮膚及
び恐らくは他の器官における、ヒト白血球エラスターゼ
によシ生起される組織のタン／ぞり分解の生理学的調節
剤であると考えられるので、この阻止剤がプロテイナー
ゼ３も阻止することは興味のあることであると考えられ
る。両者の酵素、ヒト白血球エステラーゼは好中球（多
形核白血球）のアズール好性顆粒の構成成分でありそし
て両者は、この＃累を気道に点滴した後にハムスターに
気腫状の組織分解を誘発し得る（　Ｋａｏ、　Ｒ，Ｃ，
＊　Ｗｓｈｎｅｒ　Ｎ、Ｇ、Ｓｋｕｂｌｔｚ、　Ｋ、Ｍ
、　ＧｒａｙＢ、Ｈ，Ｊ、Ｒ，Ｈｕｌｄａｌ、　−Ｐｒ
ｏｔｉｎａｍａ　３　Ａ　Ｄｉｓｔｉｎａｔ　Ｈｓｕｎ
ａｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｅｌ＠ａｒ　Ｌ＠ｕｋｏ
ｅｙｔａ　Ｐｒｏｔａｉｎａｓ＠ｔｈａｔｐｒｏｄｕｃ
ｅｓ　Ｂｍｐｈｙｔｅｍａ　ｉｎ　Ｈａｍｓｔａｒｓ　
”　；　Ｊ、　ＣＩｉｎ、　Ｉｎｖ＠ｓｔ。

８２、１９６３−１９７３．１９８ｇ参照）、この阻止
剤はいずれかの酵素に予備吸着させた後に該酵素を阻止
することができるので、エラスターゼにより誘発される
肺の病気及びプロテイナーゼ３により誘発される組織の
分解の治療において有用である。

式（１）のポリペプチド〔卓越した阻止剤”（−ｐｒｏ
ｍｉｎ＠ｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ″）〕　を以下に述
べる方法で合成した。

式（１）のポリペｌチドのアミノ酸配列をエンコードす
るＤＮＡ塩基配列を下記の点を考慮して設計した： １）プラスミドの適当な部位における連結（ｌ１ｇａｔ
ｉｏｎ　）を可能にする一重鎖粘性末端；２）　後続す
る遺伝子操作な促進するための５１−末ｇＩＡにおける
一連の制限エンドヌクレアーヤ塩基配列； −３》　　翻訳終結コドン； ４コード領域の５１−末端のコドンは、通常ム／ＴＫ富
むように選択される。他のコドンは、通常、酵母菌及び
／又は大腸菌（Ｆ、　ｔｏｌｌ）の発現に対して好まし
いものが選択される； 遺伝子は第３表に示す６種類のオ９ｆヌクレオチドから
集成した。

第３表 ＥＬ１１　　　　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＡＧＣＴＣＧ　ＧＴ
Ａ　ＣＣＡ　ＴＡＣＣＴＧＣＡＴ　ＡＴＩＧ　ＣＴＣＡ
ＡＧ　ＡＡＣＣＡＧ　ＴＴＡ　ＡＡＧＧＴＣＣＴＧ　ｌ
ｌｆｆ　ＣＴＡ　ＣＴＡ　Ａ　　　　　　　　　　　６
４ＥＬＩ２　　　ＣＯＴ　ＧＧＣＴＴＡ　ＧＴＡ　ＧＡ
ＣＡＣＡ　（ＸＩ：Ａ　ＣＣＴＴＴＡ　ＡＣＩ　ＧＧＴ
　ＴＣＴ　ＴＧＡＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＣＡαπＡＴＣ舒
Ａα℃庫π℃６６ ＥＬ１３　　　ＧＣＣＡＧＧ　ＴＴＯＴＴＧＴＣＣＴＡ
Ｔ　ｒＡＴ　［１テＧＡＴ　ＴＯＯＴＴＧαＫ　ＴＡＴ
　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＣＣＣＡＣＣＴＡＡ　Ｃ（ＸＩ：　
ＴＴＧ　ｒｌテＧＡＡ　ＧＧ　　　　　　　６８ＫＬＸ
４　　　ＴＣＡ　ＧＴＧ　ＴＣＣＴＴＣＡＡＡ　ＣＡＡ
　ＣＧＧ　ＴｒＡＧＧＴＧＧＧガτんり患α刃Ｏｖα誌 ＡＴ０　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＡＴＡ　ＧＧＡ　ＣＡＡ　Ｇ
ＡＡ　　　　　　６９ＥＬＩ５　　　ＡＣＡ　ＣＴＧ　
ＡＴＩ　ＧＴＣＧＡＧ　ＧＴＡ　ＴＣＡ　ＡＡＡＡＣＴ
　ＧＣＴＧＴＧ　ＡＡＧ　ＧＴｒ　ＣＣＴ　（ａ　ＧＴ
ＡＴＧＧ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＴＯＧ　ＴＴＣＣＡＣＡＡ
Ｔ　ＡＡＴＡＣ７４ ＥＬ１６　　　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＧＴ
ＧＧＡＡ　ＯＧＡ　ＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＡ　ＴＡＣＣＧ
ＣＡＧＧ　ＡＡＣＣｆＴ　ＣＡＣＡＣＯＡＣＩ　ＴＴＴ
ＴＧＡＴＡＣｃｒＧＧＡＧ　ＡＡ　　　　７１オリブヌ
クレオチドの調製 ０．２電クセ　モルスケール上の孔径制御Ｉラス支持体
（ｃｏｎｔｒｏｌｌ＠ｄ　ｐａｒｓぎｌａｓｓ　ｓｕｐ
ｐｏｒｔ　）に結合させた、５′−ジメトキシトリチル
塩基な保護されたヌクレオシド−２−シアノエチル−Ｎ
　、　Ｎ　−；イソプロピルホスホルアミｌイトと保護
されたヌクレオシドから、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＩＩＩｏｇ
ｙｓｔ＊ｍｓ　３１１０　Ａ　ＤＮＡシン七ナイザー上
でＡｐｐＨ＠ｄ　Ｂｉ・膳ｙｓｔ・−社によって示され
ているプロトコールに従って、第３表に示したオリがヌ
クレオチド塩基配列を調製した。

各々のオリがヌクレオチドを、固体支持体から分離しか
つ全ての保護基を除去した後、水（１ｗ１）中に溶解し
た。オリｆヌクレオチド溶液（４００ｇ）Ｋ３Ｍ酢酸ナ
トリウムの溶液（ｐｆ１５．６．４０成）とエタノール
（１ｍ）：２添加し、混合物を−７０＠Ｃで２０時間沈
澱した。かく得られた沈澱を遠心分離によシ捕集しく　
１３　＠　ＯＯＯｒｐｍ＊口０分間）、ベレットをエタ
ノール：水（）：３）混合物（２００μｔ）で洗浄し、
真空中で短時間乾燥しついで水（１５μＬ）及びｒｏＪ
ｌｔのホルムアミド／染料混合物（１０ｒｎＭ　ＮａＯ
Ｈ，０，５ｍ＆ｆ　ＥＤＴＡ、　０．０１１１＋１ａム
ツエノールツルー、　０．０　ｊ％キシレンシアノール
。

８０１４ホルムアミド）Ｋ＃Ｍ解した。

オリゴヌクレオチドを８．３Ｍ尿素を含有する５０　ｍ
Ｍ　）リスーボーレー）　（Ｔｒ１ｍ　−ｂｏｒａｔｅ
　）（ｐＨ８，３）中の１０鳴ポリアクリルアミド上で
精製した。適当な長さのオリゴヌクレオチドを、通常、
最も顕著なパンドなＵＶ造影することによシ同定しく　
Ｎａｒａｎｇ、　ＭＩｔｈｏｄ　１ｍ　Ｔｈｇｙｍａｌ
ｏｇｙ、　ｖｏｌ　６Ｌ　９０−ＩＬ１９７９参照）つ
いでゲルから切除しついで５ｍＭ）リス−ボーレート（
ｐＨ１，３）中で３００　ｍＶ　で３〜４時間電気溶離
（ｅｌｅｅｔｒｏｅｌｕｔ・）した。水溶液をｎ−１タ
ノールで地理することにより（混合し、回転させついで
上部有機層な除去）、約２００μｔまで濃縮した。精製
オリゴヌクレオチドをエタノ−＃（２，５容量）を添加
することにより−７０Ｃで２０時間、０．３　Ｍ酢酸ナ
トリクム溶液から沈澱させた。

遺伝子の集成（ａｓｓｅｍｂｌｙ） オリがヌクレオチド　ＥＬ　１２−　ＥＬ　１５　（各
々ＡＴＰ含有）、１００　ａＭ　ｆＪ　ｘ　−＜　／ｌ
／ミジン、２０　ｍＭ　ｆ）ＤＴＴ％ｊＯｍＭのＭｇＣ
ｊ２．５０　ｍｌｉｌのＴｒｌｓ　−ｎｅｔ　Ｃｍ９．
０）及びＯ，１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液２Ｓ　ｆ
ｉｔ中で、Ｔ４ｄｔリヌクレオチド　キナーゼ（３，６
単位）を便用して３フａＣで２時間ホスホリル化（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ　）　した。溶液を１００”Ｃ
で５分間加熱して反応を完結させついで第４表に示すご
とく、対にして混合して二重鎖（ｄｕｐｌ＠ｘ　）　１
ｍ石を得良（オリブヌクレオチドＥＬＩＩ及びＦ：Ｌ　
１＆　（２Ｓｆｉｔ中、２００　ｍＭ　）　　はホスホ
リル化しないで使用した。

０．３ＭＮ＃酸ｔトリクＡ　（ｐＨ５，６、２００ｐＬ
　）　　及びエタ／　−＃　（８５０Ｊｌｔ）を添加し
、二重鎖を−２０１０で２０時間沈澱させた。得られた
沈−を遠心分離により捕集し、エタノール：水（アニ３
）混合物で洗浄しついで水（５０Ａｔ　）に溶解させた
。最初、溶液な滓謄水浴中でｌｏｏｃで２分間加熱する
ととによりオリブヌクレオチドの対をフニールした。

ついで浴１に：４０″′Ｃまでゆつくシ冷却した（約４
時間）。二重鎖１及び■を含有する溶液を一緒にし、凍
結乾燥しついでＴ４ＤＮＡす、ｆ−ゼ（１単位；ＢＲＬ
　）、　５０　ｍＭのＴｒｉｍ　　（−７，６）、　ｌ
ｏｍＭのｍｃ４゜５１　（Ｗ／Ｗ）　ＰＥＧ　ｇｏｏｏ
、　ｌ−のＡＴＰ及びｌ　ｍＭ　（Ｆ）ＤＴＴ　ｔ含有
する溶液（ＢＲＬ、　Ｆｏｃｕｓ、　Ｖｏｌ　ｇ、　Ｎ
ｏ−ＩｓＷ１ｎｔ＠ｒ　ｊ９Ｊｔ６　）　Ｋ溶解しつい
でＤＮＡを３００Ｃで５分間ついで１６′″Ｃで２０時
間連結させた。３Ｍ酢酸ナトリウム（２０ｔｘｔ）及び
水（１５０μｔ）を添加しついでエタノール（）ｓｏ　
ｔｓｔ）　％：添加しかつ−２０℃　で２０時間冷却す
ることにより生成物を沈澱させた。沈＃を遠心分離によ
り捕集し、エタノール（１１１１１）で洗浄しついで水
（１５μｔ）及びホルムアミド／染料混合物（ＩＱ　ｎ
Ｌ　）中に：溶解しついで５０　ｍＭ　）リス−ボー　
レー）　（ｐｆｊ８．３）％ｔ　ｍＭＥＤＴＡ及び８．
３Ｍ尿素中のＩＯ％ポリアクリルアミドゲル上で精製し
た。１３２塩基及び１３５塩基の長さのＤＮＡ鎖（ｓｔ
ｒａｎｄ　）　　についてのバンド材ートラジオグラフ
イーにより同定しついで個々のオリプヌクレオチド塩基
配列について述べた方法で単一グルスライスから電気溶
離により単離した。

水溶液（ＳＯμｔ）を最初、１００°Ｃで２分間加熱し
ついで４０°Ｃまで４時間で冷却させることによりＤＮ
Ａ鎖をアニールした。

二重鎖Ｉを上記連結反応生成物Ｋ、該生成物の調製につ
いて述べたと同様の方法で、但し、粘性末端なアニール
する前に混合物を４０°ＣＫ加熱して、連結させた。生
成物、すなわち、第１３図に示すごとき遺伝子塩基配列
を８ｔｓポリアクリルアミドゲル上で精製しついでグル
スライスからの電気溶離により前記したごとき方法で単
離した。沈澱させた後、遺伝子を、個々のオリゴヌクレ
オチドについて述べたごとき方法でＴ４ポリヌクレオチ
ド　キナーゼでホスホリル化しついで水（２０μｔ）　
Ｋ溶解した。

第４表 １　　　ＷＩｌ＋ＥＬＩＺ　　　　　　６４　　　　　
　６６■　　　ＥＬＩ３＋ＥＬＩ４　　　　　６８　　
　　　　　　６９１［ＥＬＩ５＋ＥＬＩ６　　　　　　
　　）４　　　　　　　　７仕記した合成遺伝子をマル
チニクロニング配列を含有するプラスミドベクター、ｐ
、ＵＣＩｌｔ　（ＢＲＬ、　５２０−５３６３　ＳＡ　
）由にクローンした。

ベクターを調製するために−１０ｓｔの、ｐｔｒｃｔｇ
を水（４２１１１）及び１０　Ｘ　Ｂ　制限緩衝液（ｎ
ｅｔ、）Ｋ溶解した。制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ
Ｉ　（３μｔ）　（ＢＣＬ、　Ｂ単位／＃ｔ）を添加し
ついで線状化（ｔｔｎｅａｒｔｓ＠ｄ）　ｆラスミドｌ
が、超らせんの（ｓｕｐ＠ｒｃｏｉｌ＠ｄ　）かつニッ
クされた（　ｎｉｃｋ＠ｄ　）環状のものに比べて主体
となるまで、上記の混合物ケ３７°Ｃで＃時間インキュ
ベートした。ＤＮＡ　！エタノールな使用して４°Ｃで
３０分間沈澱させ、エタノール：水（アニ３）混合物で
洗浄しついで水（４４；ｔｓｔ　）及びＩＯＸ高塩濃度
緩衝液（ｈｉｇｈ　ｓａｌｔｂｕｆｆ＠ｒ　）中に溶解
した。制限エンドヌクレアーゼＥｅｏ　ＲＩ　（Ｉ　ｆ
ｉＬ　）　（ＢＣＬ、　９０単位／　ｊＩｊ）を添加し
ついで混合物を、大きなｌｅｅ　Ｒ１−Ｂａｍ　ＨＩフ
ラグメントが主体になるまで３７°Ｃで１時間インキュ
ベートした。ＤＮＡ　ｔｔ−２０６ｃで２０時間沈澱さ
せ、エタノール：水（アニ３）で洗浄しついで水（２０
ｆｉｔ）　Ｋ溶解した。

大きなＲｃｏ　ＲＩ　−Ｒａｍ　ＨＩ　フラグメントを
前記したごとき方法でＩｌｌ調製アガロースｒル上で精
製し、電気溶離しついで沈澱させついで水（２０＃Ａ）
に溶解した。合成遺伝子を結合させるために、ベクター
ＤＮＡ　（ＥｅｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメント水溶
液。

２＃４）、合成遺伝子（前記の水溶液、　５　ａｔ）、
５Ｘリガーゼ緩衝液（６ｔｘＬ　；　２５０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｍ、　ｍ　？、６゜５０　ｒｒｐＪＩｉ　１１１ｇ
Ｃｊ２−２５４　Ｗ　／　Ｖ　ＰＥＧ　１１０００−５
　ｍＭ　ＡＴＰ−。

５　ｍＭ　ＤＴＴ、　ＢＲＬ社製）、水（ｆ５ａｔ）及
びＴ４ＤＮＡ　９　ｆ−ゼ（２μＬ、　１単位／　１１
ｔ）の混合物を１６℃で４時間インキュ峙−トシた。Ｄ
ＮＡ混合物を直接使用して（リグ−シヨン混合物自体１
μを又は水で５倍に稀釈したリグ−シヨン混合物２μｔ
）。

１ｉ：、ｅｏｌｉ　　菌株ＨＢＩＯｌｔ形「転換した。

ＤＮＡ混合物（１又は２μｔ）を氷上のＥ、ｅｏｌｌ　
　コンピテント細胞に添加しついで氷上で４５分間イン
キエペートしついで４２°Ｃで４５秒間熱衝撃を加えた
。氷上に２分間放置後、ｔｏｏａｚのＢｏｇ　緩衝液（
パクトトリプトン（Ｂａｅｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ　）　
２　％　ｍ酵母エキス０、５４　；　ＮａＣＡ　１０　
ｒｎＷｉ　ｚ　ＫＣＬ　２−５　ｒａｄｉｉ　ｐ　Ｎａ
ＣＡ２−ＭｇＳ０４２０　ｍＭ　（各々１０　ｍＭ　）
　；グルコース２０　ｍＭ）を添加し、混合物を３フ０
Ｃで１時間インキュベートした。懸濁液のアリコートか
ら５ミ１７ｔ１１のアンピシリンと共ＫＬプレート上で
コロニーを形成させた（　ｐｌａｔｏ　）。形質転換細
胞の、クローニングされた合成遺伝子について′″Ｍｏ
ｌｓｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　；Ａ−Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″中た　Ｍａｎｉａｔｉｓ等忙
よプ記載され、また英国特許出願第８５０２６０５号明
細＠に記載される標準ｉ方法を使用して、コロニーハイ
ツリダイゼーション分析によりスクリーニングを行つた
。全体で１６０個のコロニーをフィルター（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈ＠ｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ　）上で画線培養しく　
ｓｔｒ＠ａｋ　）、　　３７°Ｃで２０時間生長させ、
分離しく　ｌｙｓ・）ついで乾燥（ｂａｋ・）した。フ
ィルターな、ランダム−ラペルキット（ｌａｎｄｏｍ　
−ｌａｂｅｌ　ｋｉｔ　）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を
使用してオリｆヌクレオチド塩基配列ＥＬＩ３（第１表
）から調製した放射性グローブと６５°Ｃで２０時間ハ
イブリッド形成された。

正のハイツリデーシヨン信号？与える６個のコロニー（
３４，４Ｇ、　４２．１０＆、雪０９及び１５６）を小
さな規模で（１００＋＋１／）、Ｌブイヨン中で３フ０
Ｃで２０時間生長させそして＆ｋｎｉａｔｉｓ等により
′Ｍｏｌ＠ｅｕｌａｒＣｌａｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　”　Ｋ記載されるごと
き方法に従って、プラスミドＤＮＡ　１に：塩化セシウ
ム中での密度勾配遠心により調製した。

ＤＮＡの塩基配列の決定はＳａｎｇｅｒ等により＠Ｐｒ
ｏｅＮａｔ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳん７４５４
６３−５４６７（１９７？）　Ｋ記載される標準チェー
ンターミネーション法（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｅｈａｉｎ
　−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍ＠ｔｈｏｄ　）　　に
従ってＳｅｑｕｅｎｃｅ　（登録商標）　ｋｉｔ　（Ｕ
ｎｌｔ＠ｄ　ＳｔａｔｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ社ｍ）ｌ使用して行った。

オリゴヌクレオチドＥＬＳ１及びｇＬｓ２　（ｍ　Ｓ表
参照）ｔ（シー　ケｙ　ｘ　　プライ？　−（ｓｅｑｕ
ｅｎｃ＠ｐｒ１ｍａｒ）として使用した。

（第」図） ＥＬＳＩ　　　ＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＴＡＣＣＴＧ
ＣＡＴＡＴＧＣフー３２（）ガストラント）１Ｍ２　　
ＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＣＴｌＴＴＴＧＡＴＡＣＣＴＧＧ
　　　　１４４−１６８（ボトムストラアド）クローン
−１５６からのプラスミドＤＮＡｔｉｇ１３図に示すご
とき塩基配列を含有しており、このプラスミドｔコード
ｐＡＧフロと称する。プラスミドＰＡＧ　フ　ｂ　を使
用して標準的な方法により下記のＥ。

ｃｏｌｉ菌株のコンピテント細胞？形質転換した。

ｔｔｎ　ｔ　ｏ　ｔ ＭＳＤ４６２　　（Ｗ３１１０　Ｄｅｌｔａ　ｌａｅ）
ＭＳＤ５２２　　（ＣＧＳＣ６３００）０■５　　Ａｌ
ｐｈａ β−ｆラクドジダーゼ−ヒトエラスターゼ阻止剤融合ヒ
トエラスターゼ阻止−の合成遺伝子塩基配列を商業的に
入手されるベクター、　ｐＵ■２（Ａｍｅｒｍｈａｍ　
Ｉｎｔ＠ｒｎａｔｉｏｎ　ｐｌｅ、−プタイスト条約に
従って寄託）中でクローニングした。このベクターはＪ
９クテリオファージ　ラムダからのＲｐｆＣＩモーター
の転写調節下でβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子
を含有している。このプラスミドは、プラスミドを含有
する形質転換細胞？アンピシリンに対して耐性にするｌ
−ラクタマーゼ遺伝子及びＲＰ７”ａモーターの温度感
受性リプレッサー（ＣＩ　８５７　）　　についての遺
伝子を含有している。

ｇｅｏＲＩ及びＳａｌ　Ｉを使用して逐次消化（ｇ＠ｑ
ｕｅｎｔｌａｌ　ｄｌｇｅｓｔｉｏｎ　）　％ｌ−行い
ついで得られた２２２　ｈｐ　　フラグメントを１嘔ア
ガロースｒル上での電気泳動により精製することにより
、ｐＡＧフロ（ＭＳＤ　５２２から調製）から遺伝子を
単離した。

最初、ＤＮＡ％−ＤＥＡＮ：　ＮＡ　４５はー／ぞ−上
に電気溶離しついでＤＮＡ　ｉ　ＮＡ　４５イー／ぞ−
からＩＭＮ凰Ｃｔ溶液を使用して溶離することによりＤ
ＮＡ　フラグメントｖ上記ｒルから単離した。

ＤＮＡ−々ノドの幅とグルの深さに切断したＮＡ４５に
−パーの小片なＩＸＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　）リス−Ｈ
Ｃ／、　１ｍＭ　−１ｉ：ＤＴＡ　；　ｐｉ　８．０　
）で湿潤させた。湿潤させたＮＡ４５ベーッ−ｔ、ｒル
中のスロット中たｌｌき、溶離すべきバンドの直前で切
断した。電気泳動％：５分間行って、ＤＮＡパー４ドを
ＮＡ４５ペーパー中に吸収させた。ＤＮＡ　ｉ！含有す
るＮＡ４５ペーパーを最初、ＩＸＴＥ緩衝液で洗浄しつ
いで７０°ＣでＮＯ分間、必要に応じて攪拌しながら（
マｏｒｔｅｘｉｎｇ　）、ＩＭ　ＮａＣｔ　（２００ｓ
Ｌ）で２回処理した。ＮａＣｔ　溶液を一緒にし、ＤＮ
Ａχエタノール（１ｍｒ）ｔｔ使用して４°ＣηＩＯ分
間沈澱させた。ＤＮＡ　ｉ遠心分離により捕集し、エタ
ノール：水（アニ　３）で洗浄し、乾燥しついで水（２
０μＬ）Ｋ溶解した。

ベクターを調製するために、５μｔ　ｆ）　ｐＵＥＸ２
　　ｋ高塩濃度緩衝液（ＢＣＬ　；　５０　＃ｔ）中で
、３７°Ｃで１時間、　　ＥｅｏＲＩ及びｇａｌ　Ｉ　
ｔ使用して消化した。

ＤＮＡ　）ｋエタノールな用いて沈澱させ、１嗟アガロ
ース上で精製した。６．７ｋｂ　　ベクターフラグメン
トを電気溶離により前記のＮＡ４５ペーパー上で単離し
、沈澱させついで水（２０ｔｓＬ　）中に溶解させた。

連結な行うために、５μＬのベクターＤＮＡ　（１μｔ
）を、エステラーゼ阻止剤遺伝子フラグメン）（ｌｏａ
Ａ、ｌａｆ）、５ｘリガーゼ緩衝液（ＢＲＬ；６μｔ）
、水（８μｔ）及びＴ４　ＤＮＡ　　リガーゼ（Ｉｇｚ
、＋＃／μｔ）に添加した。連結は１６°Ｃで２０時間
行った。ＤＮＡ混合物な直接又は水で５倍に稀釈して使
用して、合成遺伝子のクローニングについて先に述べた
と同様の方法でＥ、ｅＯｌｉＭＳＤ　４６２及びＭＳＤ
　５２２　Ｍ胞を形質転換した。ＭＳＤ４６２　におい
ては全体でｇ個のコロニーが得られ、ＭＳＤ　５２２に
おいては全体で７５個のコロニーが得られた。６個のＭ
ＳＤ　Ａ６２コロニーと３個のＭＳＤ５２２コロニーに
ついて前記したごときハイツリデーシヨン分析による検
査な一行った。全てのコロニーが正であることが認めら
れ従って３００Ｃ及び４２°Ｃで発現するタン／４′り
質を検討するため、全てのコロニーを小さい規模で生長
させることにより更に分析を行った。これらの小規模で
の生長は下・記のごとく行った： 菌株（ｅｕｌｔｕｒ・）　を振盪インキュベーター（２
５０ｒｐｍ　）内の、０．０２１のカゼイン氷解物、グ
ルコース（２，Ｏｔｉｔ　）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（
ＩｍＭ）、ｃａｃｚ２−：？ｕ２ｏ　（０−ｅ　ｍＭ）
、アンビジリｙ　（Ｓｏｏｔ／３１４及びチアミン（４
μｔ／―）を含有するＭ９培地（ｍ＠ｄｉｕｍ　）フ５
ｄ　中で、３７°Ｃで２０時間生長させた。細胞な新し
い培地に移してＯＤ５５０２０．１としついで００５５
０が０．４　Ｐ−０，５になるまで３７°Ｃでインキュ
ベートしついで４２°Ｃで３時間インキュベートした。

細胞を遠心分離により捕集しついでラエムリ（ｌａ＠ｍ
ｎｌｉ　）　　緩衝液（０，１２５ｍＭ　　）すｘ　−
ＨＣ／、　ｐＨ６４）　ＳＤＳ　（２９１４ｗ／ｖ）、
グＩ）　セ１７　ｙ（２０憾ｗ／ｙ　）　、新たに添加
したβ−メルカプトエタノール（２４ｗ／ｖ　）を含有
スるブロムフェノール（痕跡）中で沸騰させることによ
！）（１００°Ｃ。

１５分）、アリコートを分離（ｌｙｓ・）した。タンｚ
ｅ　２質は２０憾ポリアクリルアミドゲル中でかつクー
マシーツリリアントツルーで染色して電気泳動な行うこ
とにより検査した、　ｌｆｆｆｌＤ　５２２からの３個
のクローン及びＭＳＤ　Ｊ６２からの５個のクローンｄ
全てマーカーのβ−１ラクトシターゼよシ分子量の大き
い新しいタンパク質な産生じモしてβ−ｆラクドジダー
ゼタン／ぞり質は先代（ｐａｒ＠ｎｔ　）ｐｔＪＥｘ２
ベクターによシ産生された。ＭＳＤ　５２２からのクロ
ーンの１つをｐＡＧ　フ　７と称する。

Ｉ−ガラクトシダーゼ−エラスターゼ融合タンパク質（
ＰＡＧ　７７　）　　を発現するＥ、ｃｏｌｉ　ＭＳＤ
　５２２の組換え体菌株（ｒ＠ｅｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓ
ｔｒａｌｎ　）　ｔｔ原液（ｓＬｏｃｋ　）　　から回
収し、アンピシリン（５０μｔ／ｗ、ｌ　）　ｆ補充し
たＬ寒天プレート上に線状に接種しく　ｓｔｒａａｋ　
）ついで３フＣで２０時間インキュベートした。細胞の
ループをこのプレートから、前記したごとき補充された
Ｍ９培地を７５−含有する２５０ｙｘｌエルレンマイヤ
ーフラス”：１４個す各々に移した。これらのフラスコ
をオービタル（ｏｒｂｉｔａｌ）インキュベーター上で
３００　ｒｐｍで振盪すること（ヨシ３７°Ｃで２０時
間ついで４２°Ｃで４時間インキュベートした。

Ｅ、ａｏｌｉ　細胞な回収し、リンス緩衝液（ｌｙｓｔ
ｓｂｕｆｆ＠ｒ　）　（１５＊スクロース、５０　ｍＭ
　ＥＤＴＡ、　５５０−　トリス塩酸、ｐｆｌｇ、ｏ）
ＫＭ濁させついでリゾ−Ａ／ＬＤＳ（それぞれ、０．５
ｍ？／−及び０．０５　％）で処理することにより溶解
しく　ｌｙｓ・）ついで４°Ｃで音波処理な行った（　
ＭＳＥソニケーターを使用；４５秒×４）。

得られた懸濁液を遠心分離し、ベレットフラクションな
水に再び懸濁させついで遠心分離した。

洗浄したはレットを５０ｍＨのＩ−メルカプトエタノー
ルを含有する、リン酸塩で緩衝した生理的食塩水中の６
Ｍグアニジン塩酸塩中で可溶化した。

この溶液なリン酸塩緩衝生理的食塩水で十分に透析しつ
いで得られた沈＃を遠心分離により捕集した。

沈澱１に８０５ポリアクリルアミドゲルを含有ｆる緩衝
液中に溶解しついでｌｏｇ還元性ｒル系を使用してポリ
アクリルアミドダル電気泳動にかけた。

ｒルはクーマシーブルーで染色し、融合タン／ぞり質に
対応するタン／セク質／譬ンドを切取った。これをウサ
ギに抗血清な生ぜしめるための抗原（ｌ薗ｕｇ＠ｎ　）
　　として使用した・上記酵母分泌ベクターは第１８図
に示されているかつブタベスト条約に従って寄託されて
いるものである。このベクターはＭＦアルファ１７”レ
デロ領域内のＳＴＥ　１３プロセッシング信号へのコー
ド配列の融合な可能にする。タンパク質のコード配列を
ＳＴＥ１３シグナルに融合してコードされたタン・（り
質を分泌させる方法を記載している雑文は多数存在する
が、部分的に加工された又は加工されていない融合タン
パク質の分泌又は細胞内での蓄積も報告されている。こ
の問題はＭＰアルファー１プレゲロ領域における他の加
工部位を利用することによ勺回避し得る；例えばＢｌｔ
ｔｅｒ、　Ｇ、Ａ、等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ｇ雪、　５
３３０−５３３４（１９８４）　；　Ｂｒａｋｅ、　Ａ
、Ｊ。

等、Ｐ、Ｎ、Ａ、８．　ｇ＋、　４６４２４６４６（１
９８４）　；　Ｚｓ＠ｂｏ。

Ｋ、Ｍ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｓｍ、　２６１
、５８５８−５８６５（１９８６）　；Ｌｏｉａｏｎ、
Ｇ等、　ｌｉｅ　／　Ｔ＠ｃｈｎｏｌｏｇｙ　　６．　
　フ２−７７（１９８ｇ）　　；Ｅｒｎｍｔ、　Ｊ、Ｆ
、、　ＤＮＡフ３５５−３６０（言９８８）参照。

＄１８図に例示されているｐＤＰ　２５Ｂの構成を以下
で概説する。制限酵累の位置は近似的である。

Ｆｌａａｓ＠ｌ、　Ｍ、Ｃ，等の雑文（Ｇ＠ｎｅｔｉｃ
ｍ　１２１ｅ　２２３−２３６、１９８９）に記載され
る−９５９でのｌｉ：ｃｏＲＩ部位から、Ｋｕｒｊａｎ
、　Ｊ、Ｊ、及びＨｅｒｓｋ韓１ｔｚの雑文（Ｃ＠ｌｌ
、　３０．９３３−９４３．１９８２）　Ｋ記載される
２６３でのＨｉｎｄ　［部位までのＭＦアルファー１プ
ロモーター及びプレプロコード配列ＥｅｏＲＩ　−Ｈｉ
ｎｄ　ｍ　フラグメント。このフラグメントはＫｕｒｊ
ａｎ　及びＨ＠ｒｓｋｏｗｉｔｚの雑文（Ｃｅｌｌ　３
０．９３３−９４３．１９８２　）により記載されるプ
ラスミド６９Ａから誘導し得る。

Ｓａｌ　ｌ　（１６０６）　−Ｅａｐｌ　／　Ａａｔ　
Ｉｆ領域はｐＢＲ３２ｇの２５５０　ｂｐ　８ａｌ　Ｉ
　−Ａａｔ　Ｉｆフラグメントから誘導される（　Ｃｏ
ｖａｒｒ：ｕｂｉａｓ、　Ｌ、等、　Ｇ＠ｍｓ　１１２
５−３５ｅＭｑｇｔ　）。

ＬＥＵ２　遺伝子を含有するＥｓｐ　−Ｉｃｅ　Ｒ目１
）領域はＹＥｐ１３Ｓ　（ＹＩｐ２１３　）から誘導さ
れる（　Ｂｒ＠ｔｈｓＪ、Ｒ，Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｆ
：ｎｚｙｍｏ１、１０１、３０？　−３２５，１９８３
及びＳｈ＠ｒｍａｎ、　　Ｆ−等　ｓ　　］ｉ＆ｔｈｏ
ｄ　　ｉｎ　　Ｙ＠ａｓｔ　　Ｇｅｎ＠ｔｉｅｓ、　　
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１９１ｔ６ｅ　
ｐ　９５　）　ｅ　２　ｓ配列中に存在するＨｉｎｄ　
ｍ部位は、Ｈｌｅａ　ｍ　で切断し、クレナク（Ｋｌ＠
ｎｏ豐）ポリメラーゼを充填しついで再連結するととに
より破壊される。

プラスミドｐｊｋＡＨ５（Ａｎｍｅｒｅｒ、　Ｇ、ｓ　
Ｍｅｔｈｏｄ　１ｍＥｎｚｙｍｏ１、　ｌｏｇ、　１９
２−２０１　）から誘導されるＡＤＣ１ターミネータ−
を含有するＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｓｐｈ　Ｉ　　フラグメ
ントをＴ４／リメラーゼで処理してプラント末ｆ４　（
ｆｌｉｉｓｈ　−ｅｎｄ＠ｄ　）　ＤＮＡを形成させた
、　８ａ１１部位（１１１８図の１６０６に示されてい
る）を切断し、Ｔ４ポリメラーゼを使用して充填した（
ｍＯ。

ＡＤＣＩ　　フラグメントをプラスミド　フラグメント
と連結して、ＭＰアルファー１ｆロモーターから生ずる
転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　）　　を終止するための
適当な配向（ｏｒｉ＠ｎ　ｔａｔｉｏｎ　）　　を有す
るＡＤＣＩターミネータ−を含有する組換え体を形成さ
せる。このクローニングによりＳａｌ　１部位（図示）
及びＨｉｎｄ　ｍ部位（カッコ内）も生成する。このポ
リリンカーを留個のＨｉｎｄ　ｍ　部位だけがクローエ
ッグによシ保存されるよ５に設計した。ｐＤＰ　５２８
　Ｆｉ第１８図に示されるごとき配向のポリリンカーを
含有している。カッコ内に示されるＨｉｎｄ　ｍ部位は
ポリリンカークローニングにより破壊される。

イースト分泌ベクターの修飾 ＪＩＩＩ図に示される￥プラスミドを更に修飾して、Ｍ
Ｐアルファー８プレｆＯ領域内のシグナルイデチドの位
置に制限部位、ｓｐｈ　ＩそしてＫＥＸ　２加工部位Ｋ
　Ｓｔｕ　ｌ　＊−導入するととによシ、タンパク質を
コードするＤＮＡ塩基配列をこれらのプロセッシングシ
グナルに融合させることを可能にし、−エンコードされ
たタンＪり質の細胞外媒体への分泌を促進した。生体外
においては、突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　
）はＡｍ＠ｒｓｈａｎｚ　Ｉｎｔ＠ｒｎａｔｌｏｎａｌ
ｐｌｃ　により、その″Ｏｒ１ｇｏｎｕｅｌ＊ｏｔｉｄ
ｓ　−ｄｉｒ＠ｅｔ＠ｄｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｍｔｓｍ　ｙ＠ｒｓｉｏｎ　２″（
ｃｏｄｅＲＰＮ　１５２３　）　Ｋ詳述されている方法
に従って行った。

この方法で使用される他の操作は当業者には周知のもの
であり、例えば、−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　”−第２
版、　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ−，Ｊ、＋＋Ｆｒｉｔａｅｈ
、　Ｅ−Ｆ、及びＴ、　ＭａｎｌａｔＩｓ、　Ｃ，Ｓ、
Ｈ，１９ｇ９年輪集に記載されている。

エラスターゼ阻止剤をコードする塩基配列をＭＦフルフ
ァ−１”プレ”分泌リーダーに融合することを可能にす
るために、制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｌｏｎ　）及びＴ４
／リメラーゼ処理の後に、ＭＦアルファー１ジフナル配
列の最後のコドン（アミノ酸１９）の第３の塩基で終結
するプラント末端が生ずるよ５ｔＣＳｐｂｌｊｌｌＪ限
酵素部位を設定しｆｔ（例えばｈｎｓｔ。

Ｊ、Ｆ、、　ＤＮＡ　７．３５５−３６０１９８８参照
）。突然変異誘発性（ｍｕｔａｇｅｎｉｅ　）オリがヌ
クレオチド　プライマーを設定しかつ合成して、ＭＰア
ルファー雪。

シグナル塩基配列に必要とされる配列の変化を導入した
。

下記の領域に相補的なプライマーによシ、突然変異誘導
を使用して変化させた塩基が同定（ｉｄｅｎｔｌｆｙ　
）される。

−−−−−−−Ｔ　ＧＣＴ　Ｃ−−−−−−−オリジナ
ルａｌａ　　ｌｅａ　　ａｌａ １７１８１９　　　　　　　　　　　　アミノ酸残基（
Ｋｕｒｊａｎ　＆　　 Ｈ＠ｒｍｋｏｗｉ　Ｌｘ　−１９８２）Ｓｐｈ１部位：
アンダーラインのある部分室＝明細書参照 ｐＤＰ　２５ｇからの小さいＳｓｔ■〜■ｉｎｄ［ＩＩ
フラグメント（第−ｇ図）　ｔ、　Ｓｓｔ　Ｉ　＋　Ｈ
ｌｎｄ　ｍ　をカットしたＲＦ　Ｍｇ２　ｍｐｌｇ　Ｄ
ＮＡ　（ＢＲＬ　５２０−８２２７８Ａ　）中にクロー
ニングした。潜在的に、組換えプラーク（ｒｅｅｏｍｂ
ｌｎａｎｔ　ｐｌａｑｕ＠ｓ　）　（Ｘ　−ｇａｌ＋夏
扇　上で白色）はサイジング（ｓｉｚｉｎｇ　）　　の
ためのＲＦＩＩＮＡの小規模の製剤及びアガロースゲル
電気泳動による制限酵素分析により特徴ずけられる。第
「Ａ図に示すごときオリがヌクレオチド　プライマーを
使用して生体内突然変異誘導実ｇ１を行うために、大規
模の一本鎖鋳型ＤＮＡ製剤をこのフラグメントを含有す
るクローンから生成させた。突然変異（ｍｕｔａｇｓｎ
ｉｓｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　）　　の形質変換を
行った後、Ｉ５−プラークを採り出し、一本鎖鋳型ＤＮ
Ａを調製した。アガロースゲル電気泳動によるサイジン
グを行った後、１１個の鋳型を標準的なチェーンターミ
ネーション配列決定法によりエキスト〒。

て相補的）の出現について試験した。ついで既知のＭＰ
アルファー嘗プロモータ又はコード配列に追加的な変化
が検出されなかった別の配列研究Ｄ・らクローン÷６を
選択した。ついでクローン÷６の鋳型ＤＮＡ製剤（ｐｒ
＠ｐａｒａｔｉｏｎ　）の１０倍稀釈物ヒμｔｙコンビ
テン）ＴＧｌｔＣ形質転換した。プラークを採取し、Ｔ
ＧＩＩ！ａ胞（Ａｍ＠ｒｓｈａｍ　ｋｉｔ　　Ｋ記載）
？予め接種した２ｘＴＹの培地Ｎ―に接種した。これら
の菌株を振盪しながら３７ＤＣで５時間生長させ、ｔｏ
ｏ　ｗの２ｘＴＹメデクムを接種するのに使用した。更
に５時間振盪培養を行った故、二本鎖ＲＦＤＮＡ　ｉ標
準的なプラスミド調製法により調製した。ついでクロー
ン÷６からの小Ｓａｔ　Ｉ−ＨｉｎｄＩフラグメントを
制限酵Ｘによる切断により生成させ、このフラグメント
ｔアガロースｒル電気泳動により分離してから精製した
。ついで精製フラ−グメントを大Ｈｉｎｄ　ｍ−Ｓａｔ
　Ｉ　ｐＤＰ　２５８　　フラグメント（第１５図参照
）Ｋクローニングして、ｐＤＰ２９４％すなわち、推定
上のシグナルペプチド開裂部位を含有するｐＤＰ　２５
Ｂを生成させた。

エ、ラスターゼ阻止剤をコードする塩基配列なＫＰ！２
　　プロセッシングシグナルと融合することを可能にす
るために％Ｓｔｕ　１部位＋１　ＰＣＲ突然変異鰐発に
より導入した。

下記の領域忙相補的なＰＣＲプライマーにより、Ｓｔｕ
　１部位（アンダ一ラインを付けた部分）を導入するた
めに　ＰＣＲ突然変異誘発によシ変化させた塩基が同定
される。

Ｓｔｕ１　　　　　Ｈｉｎｄ［ＩＩ ｓｅｒ　ｌ＠ｕ　ａｓｐ　ｌｙｓ＋　ａｒｇ８１８２８
３　　ｇ４８５　　　　　　　　　　　　　　　　アミ
ノ酸残基（Ｋｕｒｊａ聡＆ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｓ　　１９１ｔ２）２種１１）　Ｐ
ＣＲｆライマーを生成させた。＠１のもの（３３フー）
は上記第２Ａ図に示す塩基とは別の、ＭＰアルファーｌ
配列に類似していた（　Ｋｕｒｊａｎ、　Ｊ−及びＨ＠
ｒｇｋｏｗｌｔｚ、　１、　Ｃａｌｌ　３０．９３３−
９４Ｌ１９８２　）。このプライマーはＰＣＢ生成物中
に新しいＳｔｕ　１部位と現存するＨｉｎｄ　Ｉｌｌ部
位を包含させる−ために設定した。第２の３０マーオリ
ブヌクレオチドプライマーはＮ層ｉ１制限部位ケ包含す
るＭＰアルファー蔭領ｋｌｌ　−２１１〜−２４１（Ｆ
ｌｅｍｍ＠１等、Ｇｅｎｅｔｌｃｓ　１２１　：　２２
３〜２３６．１９８９　）　　Ｋ類似していた。これら
の２種のオリーｆ　１に：ＰＣＲ増幅反応におけるプラ
イマー及びシラスミド（例えばｐＤｐ　２５ｇ）鋳型と
して使用して、約４９０　ｂｐ　　のフラグメントを生
成させることができる。８容量のフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコ−＆（２５：２４：ｌ）で抽出
しついでエタノールで沈澱させた後、ＰＣＲＤＮＡ生成
物を１容量の水に溶解させた。

このＤＮＡｔ　Ｎｓｉ　Ｉ及びＨｉｎｄｌｌｌ制限酵素
で切断した。この反応の生成物をアガロースゲル上に供
給し、約４９０　ｂｐ　　で生ずるバンドを標準的方法
で精製した。

ｐＤＰ　２５ＢのＸｂａ　Ｉ　〜Ｈｉｎｄ　ｍ領域を含
有するｐｔｒｃ　１８　（ＢＲＬ　５２０−５３６３　
ＳＡ　）　　＠−生成させた。

Ｎａｉ　１　部位（１ｅｓａｅｌ　　等の−２２７）は
このシラスミドにおいて少なかった（　ｕｎｌｑｕ・）
。このプラスミド中のＮｓｌ　１−■ｉｎｄｌｌｌフラ
グメントを標準的なりローニング法によシ、新しいＳｔ
ｕ　１部位を含有するＰＣＢ−生成フラグメントで置換
した。

Ｓｔｕ　１部位を含有する６個のクローンを同定した。

クローンナ６Ｆｉジデオキシ配列が正しい位置に新しい
Ｓｔｕ　１部位を含有していること及び公知の配列と異
り、追加的な突然変異がないことを特徴とする。このプ
ラスミドをｐＤＰ　２７３と称する。

ｐＤＰ　２５ｇのＸｂａ　ｌ　−Ｈｌｎ−厘大フラグメ
ント及びｐＤＰ　２７３ρ１らのＸｂａ　ｌ　−ＩＩｉ
ｎｄ　ｍフラグメントを制限＃素切断及びアｉｆＯ−ス
ｒル上での分離によ６調製した。寒天ｒルから精製した
後、これらのフラグメントを連結しそして形質転換して
コンピテントＥ、ｅｏｌｌ　（［１ｌｏｇ　）　Ｋ　し
た。小スケールＤＮＡ標本１に３６個のコロニーから生
成させた。このＤＮＡ　ｌｋ　Ｓｔｕ　ｌ及びＳｓｔｌ
ｉｌ＠酵素で消化した。

クローンナ９％：アガロースｆＡ−電気泳動により目視
し得るごとき正しい制限酵素パターン？有するものとし
て同定した（　ｐＤＰ　２７４　）。ついでｐＤＰ２７
４　ＤＮＡ　ｌ　Ｘｂａ　ｌで切断しついでｐＤＰ　２
５ｇからの小さいＸｂａ　Ｉフラグメントの精製製剤？
用いて連結した。この連結混合物な用いて形質ｕした３
６個のＬＣｏｌｉコロニーから小スケールＤＮＡ製剤を
調製したｍ　ｇｅｏＲＩ　　及びＳｔｕｌ　　で消化し
た後、正しい、当初の自然の向きの小さいＸｂａｌフラ
グメントを含有する２徨やクローンが同定された。更に
操作ン行うために、１つのクローン（ｐＤＰ２８９）、
すなわち、ＫＥＸ２　　プロセッシング部位ＫＳｔｕ　
１部位？有するｐＤｐ　２５８　ン調製した。

ｐＡＧ　フ　６を制限り累ＢＭＰＭＩ　（第１３図参照
）で切断しついでＴ４ポリメラーゼで処理して５″突出
端部（Ｏマ・ｒｈａｎｇ　）　　を充填することにより
プラン）　末端ＤＮＡを生成させた。フェノール：クロ
ロホσん凹 ルで沈澱させた後、上記ＤＮＡ　＊水に溶解しついでＲ
ａｍ　ＨＩ　　制限酵素で消化した。エラスターゼ阻止
剤をコードする小フラグメントｔアｆロースｒルからの
精製することにより単離した。３種のベクターの各々？
以下に述べるごとく消化して、大フラグメント？アガロ
ースゲルから単離した。

ｐｏＰ　２５ｇ　−Ｈｌｎｄ　ｍ　で切断、Ｔ４ポリメ
ラーゼで５′突出端部を充填、　ＢａｍＨＩで切断。

ｐＤＰ　２８９−　Ｓｔｕｌ及びＢａｍＨＩ　で切断。

ｐＤｐ　２９４−　Ｓｐｈｌ　　で切断、〒４ポリメラ
ーゼで処理して３′突出端部を除去、ＢａｍＨＩで切断
。

３種の精製ベクターフラグメントの各々なエラスターゼ
阻止剤フラグメントと連結した。連結混合物の各々の試
料をコンピテントＨＢ　ｌｏｌ　Ｅ、（ｏｌｉ中に移し
た。３種の連結混合物の各々を使用して得られたコロニ
ーから２０〜４０個の小スケールＤＮＡ試料ン調製した
。制限酵素ＢａｍＨＩ　−１−Ｐｓｔｌ　　で消化しつ
いでアｆＣｌ−スグル上でフラグメントを分離するとと
により組換え体を同定した。ＭＰアルファー■とエラス
ターゼ阻止剤をコードする塩基配列との融合において適
当な配列を有するクローンｙｙ　ＤＮＡ塩基配列決定に
より確認した。更に分析を行うために選択されたクロー
ンは下記の通り　である： ｐｏＰ　２８０　ＳＴＥ１３　／エラスターゼ阻止剤融
合物；ｐＤＰ　２５ｇから誘導。

ｐＤＰ　２９８　ＳＩＧＰＥＰ／エラスターゼ阻止剤融
合物；ｐＤＰ　２９４から誘導。

ｐＤＰ　２９９　ＫＥＸ２／エラスターゼ阻止剤融合物
；ｐＤＰ　２８９から誘導。

これらの構造体（ｅｏｎｍｔｒｕｅｔ　）をＪＲＹａ８
ｇ（Ｂｒａｋ＠　等、　　ＩＮ、ム、Ｂ、、　　８１、
４６４２−４６４６．　１９８４）に形質転換した（　
３ｈａｒｍａｎ等）。クローンを接種しついで液状ＹＰ
ＡＤ　（Ｓｈ＠ｒｍａｎ等、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎＹｅ
ａ＠ｔ　Ｇｅｎ＠ｔｌｅａ、　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｍｇ
Ｈａｒｂｏｒ、　１９８６゜Ｐ１６４．１６５　）中、
又はＬＥＵ−ドロツデーアウトメデア（”　ｄｒｏｐ　
−ｏｕｔ″ｍｅｄｉａ　）　（Ｓｙｎｔｈ＠ｔｉｃＣｏ
ｍｐｌ＠ｔ＠Ｍ＠ｄｉｕｍ　ｍｌｎｗｘｓ　ｌ＊ｕｅｉ
ｎ、　Ｓｈ＊ｒｍａａ等。

Ｍ＠ｔｈｏｄ　　ｉｎ　Ｙ＠ａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｍ
、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ＊ｒＨａｒｂｏｒ、　ｐ　１
６４．１６５．１９１１６　）　　中で３０°Ｃで定常
期まで生長させた。活性エラスターゼ阻止剤はｐｏｐ　
２ｇ０クローンからの培養株の上澄液中で検出でき友（
第１９図参照）　、　ｐＤｐ　２９ｇ及びｐｏｐ　２９
９すｃＬ−ンからの阻止剤物質の収量は低かった。

前記構造体を更に、酵母菌株ＸＳ９５−６Ｃ（Ｙｅａｓ
ｔＧｅｎ＠ｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃ＠ｎｔ＠ｒ、　　カ
ルフォルニア大学。

パークレイ、　ＣＡ　９４７２０　）　　Ｋ形質転換し
た。３０′″Ｃで７２時間振倣培養（２５０ｒｐｍ　）
を行い、培養菌が定常期和到達したとき（典型的にはＯ
Ｄ６００＝４〜６）、全細胞をイレクト化することによ
り培養菌上澄液を回収した。以下で述べるごとき酵累効
力評価を行うことにより、活性を培養菌上澄液中で検定
した。生の（ｎａｔｌｖ＠　）　　エラスターゼ阻止剤
を使用する標準曲線（後期参照）Ｋ基づいて、ｐＤＰ　
２９８クローンは３．５　ｆｉｔ　／１１１１　までの
活性エラスターゼ阻止剤を培養菌上澄液に分泌させた◎
組換え体ヒトエラスターゼ阻止剤タンパク質の精製ＳＴ
ＥｌＪ　ｆ口七ツシング部位（ＦＤＰ　２５０　）を使
用して得られる物質及び液状−ＬＥ■ドロツゲ−アウト
”メディア中で生長させたＪＲＹ　＋ｇｇの宿主を下記
の方法で精製した。

培養菌上澄液（２ｚまで；振Ｉ＆フラスコ中で生長）を
０．２２ミツイルターを使用してｒ遇した。ｒ液をアミ
コン（Ａｍｉｅｏｎ　）　　ス／々イラル　コンセント
レータ−中で３０００　Ｍｒカットオツフフィルターを
使用して約１０倍Ｋ１１ｍ縮した。ついで濃縮液を２０
容量のｊｏｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４）を使用して
３回透析した。透析物質を予備平衡化した（　ｐｒｅ　
−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔ＠ｄ　）　　スルホプロピル　
セファロース（Ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ　Ｓ＠ｐｈａ
ｒｏｓ＊　）　　カラＡＫ送入し、ｌＯ−へ５０　ｍＷ
ギ酸アンモニウムを使用して傾瀉溶離した。活性フラク
ションをプールし、濃縮しついでサイズ排除クロマトグ
ラフィー　カラム（Ｐｈａｒｍａｅｉａ、　ＨＲｇｏｏ
　）に通送し、リン酸塩緩衝食塩水で溶離した。

Ｈ−末端塩基配列の決定の際に、弐〇）の成熟（ｍａｔ
ｕｒｅ　）　　／すにデチド（６０％）及び式（１）の
成熟ポリペプチド＋Ｉ個又は２個のｇｌｕ　−ａｌｔア
ミノ酸末端伸長ａ　（ｔｅｒｍｉｎｍｌ　＠ｘｔａｎｍ
ｌｏｎ　）ｔ与えるミクロ不均質（ｍＩｃｒｏｈ＠ｔ＠
ｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　）生成物が得られた。これらの伸
長鎖は酵母菌株による不完全なプロセッシングに基づく
ものと考えられ従ってこれらの末端伸長鎖を有するポリ
ペプチドを式ｑ）の成熟ポリペプチドから５０ｍＭ酢酸
ナトリウム−４，５中のＭｏｎｏＳ　ＨＰＬＣにより、
Ｏ−０，５Ｍの間で濃度を変化させた塩化ナトリウムな
溶離剤として使用して分離した。ミクロ不均質生成物は
乾癖プラークから単離されたポリペプチドによって示さ
れるものと同一の特殊な活性を示すことが認められた。

同様の方法を使用して８　ＩＧＰＥＰ及び■ｘ２プロセ
ッシング部位を使用して得られた構造体を培養すること
により産生されたタン／ぞり質を精製した。

これらの構造体については式（１）の成熟ポリペプチド
についての適当なＮ−末端塩基配列を有する均質な生成
物が得られた。

他の宿主中で生長させた構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　
）について使用した精製法は上記したものと本質的に伺
−である。例えば、シグナルはデチド開裂部位を使用し
て得られた構造体を酵母菌株ＸＳ９５６Ｃ中で生長させ
ついで前記のプロトコールに従って精製して、乾癖！ラ
ークから単離したポリペプチドと同一の特異的な活性を
示す単一の化合物として、式（１）の成熟ポリはプチド
４１１９を得た。

例えば組換え体ＤＮＡ製造技術により式（１）のポリＲ
デチドを製造する際の、式（１）のｄ？ｌＪ−？７”チ
ドの存在とその量は下記の分析法を使用して監視した。

この分析法においては、上記物質の活性はＮ−メトキシ
サクＶニル−ｍｌａ　−ａｌａ　−ｐｒｏ　−ｖａｌ　
−ｐくトロアニライド（ＡＡＰＶ、　Ｓｉｇｍａ社）を
基質として使用して、豚ｐ臓エラスターゼの阻止効果に
より測定した。

試料、例えば、酵母の発酵からの上澄液（１００ｊＩＡ
）　、９ｔ　分析用１ｍ衝液（０，Ｉ　Ｍ　Ｈｓｐｓｅ
　／　０．５　Ｍ　Ｎｌｌｃｌ／−７，５；　Ｒ１ム等
級の牛アルツミン血清を１優含有）と混合した。混合物
を室温で３０分間インキエベートしついで分析用緩衝液
中の基質（ｇｏｏｍ４２．５　ｍＭ　）　　を添加しつ
いで混合物を室温で２分間インキエペートした４１４０
５　ｎｍ　での吸光度や変化率を２分間測定しついで乾
癖プラークから単離した式（１）のポリペプチドを使用
して作成し九標準曲線から活性を算足した（標準物質は
Ｏ〜２．５Ｊ１ｔ／ｄの範囲で使用した）。

前記の方法で製造した組換え体エラスターゼ阻止剤につ
いて上記した方法を使用して、ヒト白血球エラスターぜ
に対する阻止活性を調べた。組換え体ポリペプチドは乾
廖症の皮膚から得られたポリペプチドと同等の阻止活性
を有することが認められた。

１００μｆの粗組換え体エラスターゼ阻止剤をＰｏｌｙ
ＬＣカラム上でクロマトグラフィーにかけ、ヒト臼血球
エラスターゼ阻止ピークを出現させた。２つの主ピーク
（ｌ及び■）が観察された。ビーク１は２１５ｍｍでの
積分吸光度に基づいて、２３　Ａｔのタンパク質と−９
，４ｔｓｔの活性阻止剤（ＭＷ　７０ｇ？。

ＨＬＥで滴定）を含有していた。ピーク■はＬ４ａｔの
タン・す１と６．９　ｔｘｔの活性阻止剤を含有してい
た。従ってこれらのピークは実質的に純粋な阻止剤であ
ると考えられる。１１１１のピーク■とヒト乾癖症皮膚
から得られた式（１）のポリにプチドｅａｔについて共
溶離（ｅｏ＊１ｕｔｉｏｎ　）　　試験を行った結果ピ
ークＩが得られ、皮膚から得られた物質はこの系と同一
であった。このことは、同様に単一ピークを示すＰＲｌ
Ｂ　−ＨＰＬＣによる共溶離試験により更に立証された
。

Ｐ０１７　ＬＣ−ＨＰＬＣのピーク！について％　Ｇｒ
ｓｓｎ及びＷｏ　ｒｋ　の方法に従ってｋｌ　　を測定
することによりＨＬＥ　Ｋ対しての効果を調べた。ピー
ク！はｇ、ｏ　Ｘ　Ｉ　Ｏ”　Ｍのにｉ　　を示し、一
方、ヒトの皮膚からの阻止剤Ｆｉ３．３　ｘ　Ｉ　Ｏ−
ｌｏＭ（１）　ｋｌ　　を示した。

Ｑｒｅｅｎ及びＷｅ　ｒｋ　の方法の精度について、ピ
ーク■の物質はヒトの乾癖症皮膚からのポリにデチドと
同等の活性を有すると考えられる。

上記の粗組換え体阻止剤は約７５係の不活性タンパク質
、５憾の下記のごときＨＬＥ阻止剤、すなわち、Ｐｏｌ
ｙ　ＬＣ−ＨＰＬＣ上での滞留時間の点でヒトの皮膚か
ら得られた式■のポリｋｌチドと相違するＨＬＥ阻止剤
（この相違は恐らくは、ｎ−末端における伸長又は欠失
に基づくものと思われる）及び２０４の下記のごとき阻
止剤、すなわち、ＴＳＫ２０００サイズ排＃％ＨＰＬＣ
，ＲＰｔａ　−ＨＰＬＣ％　ＰＯｌｙＬＣ−ＨＰＬＣに
おける滞留時間及び阻止活性の点でヒトの乾１症皮膚か
ら得られたポリペプチドと同一のＨＬＥ阻止剤（Ｐｏｌ
ｙ　ＬＣ−ＨＰＬＣにおけるピークＩ）からなると考え
られる。

ヒト白崩球エラスターゼ阻止剤の・ｉ＝ＤＮｈ塩基配列
特定のポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の誘導
又は決定（ｄ＠ｒｉマａｔｉｏｎ　）は標準的方法な使
用して行い得る。かかる方法としてはスクリーニング技
術、すなわち、可能なりＮＡ塩基配列の組合せを表わす
混合オリブヌクレオチドを用いる組換え体ｅＤＮＡライ
ブラリーのハイ１リデーショノスクリー二ング及びＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ鎖反応）として知られる方法のごとき
増幅技術が挙げられる。

上記２つの方法によるａＤＮＡライブラリーのスクリー
ニングについての実験プロトコールは”　Ｍｏｌ＠ｅｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　−Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ；
Ｆｒｉｔｓｅｈ。

Ｅ、Ｆ及びＭａｒｉａｔｉｓ、　ｒ、；第２版、Ｃｏｌ
ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｐｒ＠ｍｓ　　に記載されている。

上記した周知の方法を使用して５卓越した阻止剤″（す
なわち式ｌのポリペプチド）についてｃＤＮＡ塩基配列
を決定した。肺のｅＤＮＡラムダｇＨ１ライブラリーを
使用し、第１４図に示すごとき塩基配列を得た。この塩
基配列は第１５図に示すごとく継続するものと考えられ
る。翻訳停止コドンはコード塩基配列の後方に存在しそ
してポリアデニル化シグナルｔＩｉ３よシ前の１５３　
ｂｐ　（１５３ｂｐ　ｆｕｒｔｈｅｒ　３）　　Ｋ存在
すると考えられる。また、２５０　ｂｐ　　イントロン
は遺伝子の３′末端に存在すると考えられる。

更に別の操作においては、ヒトの肺のｅＤＮＡライブラ
リーからのエラスターゼ阻止剤の製剤（ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ　）の主活性成分（及び微量成分）の完全アミ
ノ酸配列をコードするｅＤＮＡクローンを単離した。第
一６図にかかるクローンの」つ（Ｅ１４　）の完全ＤＮ
Ａ塩基配列が示されている。この塩基配列は他の成立の
（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　）　ｅＤＮＡクローン及び
ＰＣＲにより同一のｅＤＮＡから単離されたＤＮＡ　フ
ラグメントからのクローンについても立証された。この
塩基配列はエラスターゼ阻止剤コード領域の他に、上流
”イン一フレーム”（ｉｎ　−ｆｒａｍｅ”）タンパク
質コード配列の存在も示している。上流塩基配列はつぎ
のごとき特徴を有する： ＆〕　エラスターゼ阻止剤タンハり質配列のすぐ上流の
１９アミノ酸コドンは、タン／９り質配列分析により同
定される小ｆ　（ｍｌｎｏｒ　）タンパク質部分（ビル
ジＶ、成分Ａ）ρ１ら誘導されるメンビク質配列データ
ーと一致する。

ｂ）エラスターゼ阻止剤コード配列の開始から−２６〜
＋ＩＯの残基からの反復ペプチド　モチーフの６個のコ
ピー（通常、Ｖ＆ｌ　−Ｌｙｅ　−Ｇｌｙ　−Ｘ　−Ｙ
　ａ　Ｘ　ｆｄ　Ａｓｐ、　Ｖａｌ、　Ｇｉｎ、　Ｐｒ
ｏ、　Ｓｅｔ又はＬｙｓである）。エラスターゼ阻止剤
製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の種々の小量成分のＮ
−末端は特異的なタンノ層り分解開裂の部位であるこの
モチーフと一致しない。

ｅ）　　）ランスメンプランドメインのシグナル配列の
一部を表わし得る、このクローンによジエンコードされ
るＮ−末端は高度に親水性である（ＩＳ残基からの１３
）。

このクローンは従来の見解、すなわちＡＵＧによれば認
識し得る翻訳開始コドンを含有していない。

プライマー伸長の研究の結果は、培養したヒトケラチノ
サイト（ＨＫＥ　７ｇ　）　　からのｍＲＮＡ中で確認
されるｅＤＮＡ塩基配列の開始部の前の約ｇｏ個の塩基
での主転写を示した。他のｍＲＮＡ種（ヒトの肺からの
全ＲＮＡを含む）の範囲内の類似のメツセージの存在は
この方法によっては示されたρ１つた。

膵臓腺癌全ＲＮＡのノザン法分析は約７５０塩基の類似
の転写（ｈｏｍｅｌｏｇｏｕｓ　ｔｒａｎｇｅｒｌｐｔ
　）の存在を−示した。これはプライマー伸長データー
の上記ｃＤＮＡ塩基配列からの、予測されたサイズ（ｐ
ｒ＠ｄｉｃｔ＠ｄ　ａｌｇｏ）　　と不一致ではない（
約１９０塩基のポリアデニル化の長さを仮定して）。

ニュージ−ランド　ホワイトラビットを使用して、式（
１）のポリにデチドに対する抗体を生じさせた。下記の
ワクチンを使用した。

ｌ　式夏のポリペプチドの１６Ｎ−末端アミノ酸残基か
らなる基質（Ａ）をＬ＠ｒｎ＠ｒ　　等の方法（Ｐｒｏ
ｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｇａｄ、　Ｓｅ１、　ＵＳＡ　７
１１　：　３４０３−３４０７）ニ従って、マレイミド
ペンゾイル−ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを
介して牛血情アルブミンとカップルさせたもの。

二　ｆ、質（Ａ）を上記におけるごとく牛スリオグロプ
リンとカップルさせたもの。

３、基質（Ａ）をメチル−牛血清アルデミンとカップル
させたもの。

弘　β−ガラクトシダーゼと式ｌのポリにデチドの融合
タン／饗り質。

上記ｌユ及び３のポリはデチドについて使用した免疫感
作操作は下記の通りである： １回目−フロインド完全補助液中のはプチド２５０μｔ
を皮下投与した； ３９回目−フロインド不完全補助液中のペプチド２５０
μｔを皮下投与した； ６６回目−フロインド不完全補助液中のペプチド２５０
μｔを皮下投与した； 暑０７日目−１１１９のペプチドを補助液を使用しない
で静脈内投与した； １２０回目−採血。

上記偶の融合タンツク質について使用した免疫感作操作
は下記の通りである： １回目−フロインド完全補助液中のタンパク質ワクチン
２００μｔ　を皮下投与した；２２回目−フロインド不
完全補助液中の夕ンノ４り質ワクチン１００ａｆを皮下
投与した；１回目−フロインド不完全補助液中のタンパ
ク質ワクチン２００ｊｌＦを皮下投与した：９４日目−
タンｌ（り質ワクチン１３０ｘｔを補助液を使用しない
で静脈内投与した； Ｍ０７回目−採血。

生成した抗血清の交差反応性（ｇｒａｓｓ　ｒｅａｅｔ
ｌマｔｔｙ）＆　ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ及びウェスタン法
により測定した。

融合タンパク質（前記倶）を使用して生成させた抗血清
は乾癖プラークから単離した式Ｉのポリペプチド及び式
Ｉの組換え￥ポリペプチド（ｌ　ａｔ。

２０００倍に稀釈して検出）及びα−アンチトリ１シン
と交差反応することが認められた。抗血清を非可動化α
１−アンチトリ１シン（５１１１１のシアノｒン１ｃＩ
マイト活性化セファロス４Ｂカラムに結合させたα１−
アンチトリックン２５１１Ｍ？　、　ＰａｒｍａｃＩａ
社）からなるカラムを通過させることにより（４回）、
α−アンチトリプクン交差反応性を除去した（９０１）
、前記１、ユ及び３のペプチドから生じさせた抗血清も
式Ｉの組換え￥ポリペプチドと交差反応した。

種々の体組織を抗血清で処理した；この処理は組織と抗
血清を１：５０の割合で使用しそしてイムノペルオキシ
ダーゼ（ｉｎｍｕｎｏｐ＠ｒ　ｏｘｉｄａｓｅ　）法に
従って行った。肝胆汁系の肝細胞については強い反応性
が認められ、胃内の筋性粘膜については僅かな反応性が
認められ、扁排内のラミナ　スピンナ（ｌａｍｉｎａ　
ｓｐｉｎｏｓａ　）　　及び静脈平滑筋細胞については
僅かな反応性が認められそして皮膚の表皮のストラタム
　コルネウム（ｓｔｒ鳳を晦ｅｏｒｎ＠ｕｍ　）、スト
ラタム　グラヌロスム（ｓｔｒａｔｕｍ　ｇｒａｎｕｌ
ｏｓｍ）、ストラタム　スビノスム（ｓｔｒａｔｕｍ　
ａｐｉｎｏａｍ　）及びストラタム　パサレ（ｓｔｒａ
ｔｕｍ　ｂａｓａｌｅ　）　　については強い反応性が
認められた。

ＡＡＰＥｐＮＡ　　ニスクシエル−アラニル−１０リル
−フェニルアラニル−Ｐ−ニトロアニライド んψｖ−ｕ”ｃ　　：メトキシースクシニルーアラニル
ーアラニル−デロリルーパリルートリ７／ｌ／オロメチ
ルクマリン ＡＡＰＶｐＮＡ　　：メトキシースクシニルーアラエル
ーデロリル−ｄリル−Ｐ−二トロアニライド ＴＧＰＬｐＮＡ：　）シル−グリシル−ｆａリル−リシ
ン−Ｐ−二トロアニライド ＨＬＥ　　　　：ヒト白、血球エラスターゼＴＦＡ　　
　　：｝リフルオル酢酸 ＤＭ８０　　　ニジメチルスルホキシドＰＣＲ：ポリメ
ラーゼ鎖反応−ＤＮＡ〜塩基配列の増幅方法、例えばに
、に１ａｐｐｍ等、Ｎａｋ、Ｂｌｏｌ（Ｃ９フコ）、　
　５６．３４１−３６１１及び欧州脣許出願公開１１１
Ｌ０２０ｇ、ｔ８４号及び−ＭｏｌｓｅｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｍｇ　−Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕ
ａ１ｗ１１２版ｅ　ｇａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、　Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ　ａｎｄＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｍ、　
ＣＢＨ１９８９参照。

Ｇ又ＦｉｃｔＦ　　ニゲリシン Ａ又はＡｌａ　：　　アラニン Ｓ又はＳ＠ｒ　：　　七リン Ｔ又はＴｈｒ　：　　スレオニン Ｃ又はＣｙｓ　：　　システィン Ｎ又ＦｉＡｓｎ：　アスパラギン Ｑ又はＧｌｎ　　：　グルタミン酸 り又はＬａｗ　：　　ロイシン １又はＩＩｓ　　：　イソロイシン ■又はＶａｌ　：バリン Ｍ又はＭ＠ｔ：メチオニン ２又＃ｆ　Ｐｈｅ　　：　フェニルアラニン　　　Ｙ又
Ｉｆ　Ｔｙｒ　：チロシン Ｗ又ｔｉ　Ｔｒｐ　：　　）リデトフアンＰ又はＰｒｏ
　：デロリン Ｄ又はＡｍｐ　：アス／４ラギン Ｅ又はＧｉｎ　：　グルタミン酸 ■又はＨｌａ：　ヒスチジン に又はＬｙｅ　：　　リシン Ｒ又はＡｒｇ　：　アルギニン 第１図は５０Ｆの乾癖症癲皮からの酸性化した抽出物の
カチオン交換クロマトグラフィー（ＴＳＫＣＭ３８Ｅ　
−ＨＰＬＣ）を示す。カラムフラクションを自動的に捕
集しく６０ｆｆａ／フラクション）そしてタンＩ々り質
含有量を２８０　ａｍ　で監視した。フラクションのＨ
ＬＦ：阻止活性（ｉｎ、ｇ　−＋　）を評価した。

各フラクション５ｎＬについて、合成テトラペプチド基
質メトキシ−スクシニル−アラニル−アラニル−プロリ
ル−／ｆリル−ｐ−ニトロアニライドのＨＬＥ　−鍔発
タンＪり分解に対する阻止活性を評価した。阻止活性フ
ラクション（ハツチを付ケた領域）を一緒にし、更に精
製した。

８ｇ２図はカチオン交換クロマトグラフィーから誘導さ
れたフラクションを含有するエラスターゼ阻止剤の逆相
−へークａ−ｔトゲラフイー（ヌクレオシル３００　Ｃ
８ＨＰＬＣである（但し第２の再クロマトグラフィーな
条件とする）、タンパク質含有量を２１５ｎｍで連続的
に記録した。エラスターゼ阻止剤含有フラクションを一
緒Ｅｌ、（ハツチを付けた領域）ついでＰｏｌｙ　ＬＣ
クロマトグラフィーにかけた。

第３図は逆相Ｃ８クロマトグラフィーから誘導されたエ
ラスターゼ阻止剤含有フラクションのポリスルホエチル
アス−セラドアミドクロマトグラフィー　（Ｐｏｌｙ　
ＬＣ−ＨＰＬＣ）　　である。タンパク質含有量＆　２
１５　ｎｍ　で配置した。タンパク質含有量と阻止能力
に基づいて最もすぐれたピークＶ（全体の約２０憾）を
捕集し、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより更忙精製
した・ 第４図はＰｏｌｙ　ＬＣ−ＨＰＬＣから誘導された主エ
ラスターゼ阻止成分の逆相−Ｃ１８−クロマトグラフイ
ル（ヌクレオシＪ／　５　ｅｌａ　−ＨＰＬＣ）である
（但し第２の再クロマトグラフィーを特徴とする特許パ
ッチ付き領域は精製された１卓越した”エラスターゼ阻
止剤を表わす、この製剤を使用して特性決定を行った。

第５図は０．１憾のＴＦＡを溶離剤として使用する７８
Ｋ　２０００　ＨＰＬＣ上での分析ｒルクロマトグラフ
イーによシ決定した、式Ｉのポリベグチドの見掛分子量
（ａｐｐａｒｅｎｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａ＠ｓ　
）である。タンパク質含有量は２１５ｎｍで監視した。

Ｍｒ　　マーカーとして下記のものを使用した： Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−Ｓ＠ｒ　−Ｇｌｕ　Ｍ％Ｖ＝　３
９（Ｌ　イｙ　Ｖユ９　ｙβ−鎖フラグメン）２２−３
０％冒：６５１２．大豆トリプタン阻止剤ＭＷ＝２２．
０００．　　オボムコイド　トリプシン阻止剤ＭＷ　：
　２７００Ｇ、牛血清アルブミンＭＷ　：６７０００　
。

第６図はｇｅｒｖａｌｙｔ（登録商１１）デレコー）ｐ
ｉ（３−１０上での弐Ｉのポリペｌチドの等電点電気泳
動である。標準としてシトクロムＣ（Ｃｙ−ｅ）　、リ
ボヌクレアーゼ人（ｕｔｂＡ）、鯨ρ１らのミオグロブ
リン（Ｍｙｏ　Ｉ　）及び馬からのミオグロブリン（Ｉ
ｉｌｙ。

１１）からなるＳ＠ｒｖａ　Ｔ＠ｘｔ　Ｍｌｘ９′を使
用した。ｒｋを銀で染色するか（頂部に示されている）
か又はスライスし、アセトニトリルで溶離しついで苦ラ
スターゼ阻止活性（ＨＬｇ　−Ｉ）　（下Ｓに示されて
いる）を評価した。

第７図は１卓越した”エラスターゼ阻止剤（式Ｉのポリ
ペプチド）のヒト日血球エラスターゼに阻止効果を示す
、精ｆｉＨＬＥ（組換え体ニグリンＣを用いてＩμｔ／
―に滴定）を１卓越した阻止剤”０．０５−０．８　ａ
ｔ　（逆相Ｃ１ａ　ＨＰＬＣにおいて２１５ｎｍでの集
積吸光度に基づくタンパク質含有量）Ｋ対して滴定した
。酵素と”卓越した”阻止剤を２１　Ｃテ３０　分１ｍ
ｌ、プレインキエペートし、残留活性を、基質として２
ｍＭ　ＡＡＰＶ　−ｐＮＡ　を使用してＥ１分から測定
した。ＫＩ　ＦｉＧｒ・・ｎ及びＷｏ　ｒｋ　の方法（
文献Ｓ）で算定して３ＸＩＯＭであった。

纂ｇ図は卓越した”エラスターゼ阻止剤、すｔｘｂち式
ｌのポリペプチドの塩基配列を示す。

下記のプラスミドをブタＲスト条約に基づいて英国、ス
コツトランド、２３ｍｔ、　Ｍａｅｈａｒ　Ｄｒｉｖｅ
Ａｂａｒｄｅｓｎ　ＡＢ２．　ＩＲＹ所在のＴｈ＠Ｎａ
ｔｌｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔ＠ｒｉａＫ寄託した
。

Ｅ、Ｃｏｌｌ宿主菌株ＣＧＳＣ６３００中のｐＵｃＩｇ
　（ＭＳＤＩ２０ｇ）ｐ　　　　　＃　　　　　＃　　
ｐＵＥＸ２（ＭＳＤｊ２０９）　　−Ｅ、Ｃｏｌｉ宿主
菌株［１１０１中）ｐＤＰ２５ｇ（Ｉｌｌ　１０１　）
（ｐＩＦ２５ｇ（ＨＢ　１０１　））プラスミドｐｎｃ
　１ｇ及びｐＵＦＸ２は１９９０年５月３１日に寄託。

プラスミドｐＤＰ２５ｇは１９９０年５月２８日和寄託
。

１、　　Ｌｅｅ　ＣＬ　Ｆｓｌｎ　ＡＭｅ　Ｌｌｐｐｍ
ａｎｎ　Ｍ、　Ｈｏｌｔｚｍａｎ■＊　Ｋ１ｍｂ＠ｌ　
Ｐ＠　Ｗ＠ｌｎｂａｕｍ　Ｇ、　Ｉｌａａｔｏｌｙｔｉ
ｃＡｃｔｉｖｉｔｙ　ｌｎ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｌａ
ｖａｇｅ　Ｆｌｕｉｄ　ｆｒｏｍＰａｔｉｅｎｔｓ　　
ｗｌｔｈ　　Ａｄｕｌｔ　　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ−
ＤｉｓｔｒｅｓｓＳｙｎｄｒ　０ｍ４１　、　（１９８
１）Ｎｅｗ　ｇｎｇｌ　Ｊ　Ｍａｄ　３０４：　１９２
−１９６゜２、　　Ｊａｎｏｆｆ　Ａ、　Ｅｍｐｈｙｓ
ｓｍａ：　Ｐｒｏｔ＊ｉｎａｓｅ　−Ａｎｔｉｐｒｏｔ
ｅｉｎａｍ＠Ｉｍｂａｌａｎｃ＊、Ｉｎ：　Ｇａｌｌｉ
ｎ　ＪＩ。

Ｇｏｌｄａｔ＠ｉｎ　Ｌ　Ｓｎｙｄ＊ｒｍａｎ　Ｒ（ａ
ｄｓ、）　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：　Ｂａｓｉｃ　
Ｐｒｌｎｅｌｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｌｅａｌ　Ｃ
ｏｒｒｅｌａｔｅａ。

Ｒａｖｅｎ　　Ｐｒ＠ｓｓｓ　　ＮＹｅ　　１９ＢＢ。

３、　　　Ｇｌｌｎｓｋｌ　Ｗ、Ｚａｒａｂｓｋａ　　
Ｚ、Ｊａｂｌｏｎａｋａ　　Ｓｓｌｍｌｅｌａ　　Ｊ、
　　Ｎｏｒｇａｒ＋ｃ＠ｗｍｋｌ　　Ｊ、　　Ｔｈ＠　
ａｅｔｉｖｌｔｙ　　ｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｅ
ｌ＠ａｒ　ｌｅｕｋｏｅｙｔ＠ｎ＠ｕｔｒａｌｐｒｏｔ
＠ｉｎａｓ＠ｓ　　ａｎｄ　　ｔｈ＠ｉｒ　　ｉｎｈｉ
ｂｉｔａｒｍ　　ｉｎ　　ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ　
　ｐｍｏｒｉａｓｉａ　　ｔｒ＠ａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　
　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐ＠ｒｉｔｏｎ＠ａｌ　　ｄｉ
ａｌｙｓｉｓ、（１９ＪｌＯ）Ｊ　　Ｉｎｖｅｓｔ　　
Ｄｅｒｍａｔｏｌフ５：　　４８１−４８７ｔ ４、　　　　Ｂｒｉｇｇｍａｎ　　ＲＡ＊　　Ｓｃｈｅ
ｅｈｔｓｒ　　ＮＭ、　　Ｆｒａｋｉ　　　Ｊ。

Ｌａｚａｒｕｓ　ＧＳ、Ｄ＠ｇｒａｄａｔｉｏｎ　　ｏ
ｆ　　ｔｈ＠　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　　−Ｄｅｒｍａｌ
　　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ　　ｂｙ　ｐｒｏｔ＠ｏｌｙｔｉ
ｅ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ｆｒｏｎｎＨｕｍａｎ　Ｓｋ
ｌｎ　　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎ
ｕｅｌｓａｒＬ＠ｕｋｏｅｙｔ＠ｍ、（１９８４）、Ｊ
　Ｅｘｐ　Ｍａｄ　　１６０：　　１０２フー１０４２
゜５、　　Ｆｒａｌｃｉ　　ＪＥ、Ｈｏｐｓｕ　−Ｈａ
ｖｕ　ＶＫ、Ｈｕｍａｎ　ＳｋＩｎＰｒｏｔｅａｓｅｓ
、Ｐａｒｔｌａｌ　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ａ
ｎｄＣｈａｒａｅｔ＠ｒｉｚａｔｌｏｎ　　ｏｆ　　ａ
　　Ｐｒｏｔ＠ａｓ＠　Ｉｎｈｌｂｉｔｏｒ（１９７２
）、Ａｒｃｈ　Ｄａｒｍ　Ｆｏｒｓｅｈ　２４３：　　
１５３−１６３゜６、　　Ｆｒｙｋｓｍａｒｋ　Ｕ、Ｏ
ｈｌｓｓｏｎ　Ｋ、Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ　Ｍ。

Ｔｅｇｎ＠ｒ　　Ｈ，Ａ　　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　
　ａｓｓａｙ　　ｆｏｒ　　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔａ
ｎｄ　　Ｃｈａｒａｅｔｓｒｉｓａｔｌｏｎ　　ｏｆ　
　ＨｕｍａｎＡｎｔｉｌ＠ｕｋｏｐｒｏｔａａｇ＠　ｉ
ｎ　Ｓ＊ｒｕｍ、（１９８１）■ｏｐｐｅＳ＠ｙｌ＠ｒ
ｓ　Ｚ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　　Ｃｈｕｍ　３６２：　　１
２７３−１２７７、−７、　　Ｎａｋａｊｉｍｍ　Ｋ、
Ｐｏｗ＠ｒｓ　　ＪＣｍ　　Ａｓｈ＠　ＢＭ、Ｚ１ｎｎ
＋＠ｒｍａｎＭ、Ｍａｐｐｉｎｇ　　ｔｈａ　Ｅｘｔ＠
ｎｄ＠ｄ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　　ＢｉｎｄｉｎｇＳｉ
ｔ＠　ｏｆ　　Ｃａｔｈ＠ｐｍｌｎ　　Ｇ　　ａｎｄ　
　Ｈｕｍａｎ　　Ｌ＠ｕｋｏｅｙｔｅＥｌａｓｔａｓｅ
、（１９７９）Ｊ　Ｄｉａｌ　Ｃｈ＠ｍ　２５４：　　
４０２フー４０３２゜８＋　　Ｇｒａｖｎ　　ＮＭ、Ｗ
ｏｒｋ　　Ｅ、　　Ｐａｎｅｒ＠ａｔｉｃ　　Ｔｒｙｐ
ｍｌｎＩｎｈｌｂｉｔｏｒ、２．Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗ
ｉｔｈ　Ｔｒｙｐｍｉｎ、（１９５３）Ｂｌｏｃｂｓｍ
　　Ｊ　　５４：　　３４フー　３５２゜９、　　Ｂｒ
ａｕｎ　ＮＪ＊　　Ｂａｄｆｆｌｅｒ　ＪＬ、Ｖｌｒｅ
ａ　ＧＤｅ　　Ｍａｔｓ　−Ｖｌｒｅａ　Ｇ、Ｍａｓｅ
ｈｌｅｒ　Ｒ，Ｂｌ＠ｔｈ　ＪＧ、８ｅｈｎｅｂｌｌ　
　ＨＰ。

Ｋｌｎｅｔｉｅ　Ｓｔｕｄ１＊ｓ　　ｏｎ　ｔｈｅ　　
Ｉｎｔａｒａｅｔｌｏｎ　ｏｆ　ｌｉ：ｇｌｌｎＣｗｉ
ｔｈ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｅｙｔｅ　Ｅｌａｓｔａ
ａｅ　　ａｎｄＣａｔｈｅｐｍｉｎ　Ｇ、（１９５７）
　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅｍＨｏｐｐｅ　−Ｓａｙｌ＠ｒ３６
ｇ：　　２９９−３０８゜ １０、Ｋｒａｍｓｒ　ＭＤ、Ｊｕｓｔｕａ　Ｃ，Ｔｈ＠
ａｎｔｉｐｒｏｔ＊ｏｌｙｔｉｅｃｏｍｐｏｕｎｄα２
−　ｍａｅｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｉｎ　ｈｕｍａｎ　
ｓｋｉｎ。

（１９ｇ８）Ａｒｃｈ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　Ｒ＠ｇ　ｚ
ｇｏ：　　９３−９６゜Ｓｐｅｒｍａｌｐｌａｓｍｍ−
１ｔｓｏｌｌａｒｕｎｇ　ｄｕｒｅｈＡｆｆｉｎｉｔａ
ｔａｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｌ＠　ａｎｄ　　Ｈｅ
ｍｍｖａｒｈａｌｔ＊ｎ。

（＋９７１）　Ｈｏｐｐａ　−Ｓ＠ｙｌ＠ｒ　ｓ　Ｚ　
Ｐｈｙａｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　３５２：１５９１−１５９
４゜ １２、Ｗａｌｌｎａｒ　Ｏ，Ｆｒｌｔｚ　Ｈ，Ｃｈａｒ
ａｅｔ＠ｒｌｓａｔｌｏｎ　　ｏｆａｎ　　Ａｃｉｄ−
Ｓｔａｂｌｅ　　Ｐｒｏｔｓｌｎａｓｓ　　Ｉｎｈｌｂ
ｉｔｏｒ　　ｉｎ　　ＨｕｍａｎＣｏｒｔｉｃａｌ　　
Ｍｕｃｕｓ、（１９７４）　　■ｏｐｐｓ−Ｓａｙｌ＠
ｒａ　ＺＰｈｙｓｉｏｌ　　Ｃｈａｍ　　３５５：　　
７０９−７１５゜１３、Ｏｈｌｓｓｏｎ　Ｋ、Ｔ＠ｇｎ
＠ｒ　Ｈ，Ａｋｓｓ＋ｓｏｎ　Ｕ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ　Ｐａｒｔｌｍｌ　　Ｃｂａｒａｃｔｓｒｉｘａ
ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａ　　ＬｏｗＭｏｌ＠ｃｕｌａｒ
　Ｗｅｉｇｈｔ　　Ａｅｌｄ　　Ｓｔａｂｌ＠　Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ　　ｆｒｏｍ　　Ｈｕｍ
ａｎ　　Ｂｒｏｎｅｈｉａｌ　　Ｓｅｃｒｅｔｌｏｎ（
１９７７）　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌ＠ｒ　＠　Ｚ　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　３５Ｂ：５８３−５８９゜ １４、Ｏｈｌｓａｏｎ　Ｍｅ　　Ｒｏａｅｎｇｒｅｎ　
Ｍ、Ｔ＊ｇｎ＠ｒ　Ｈ，ＯｈｌｓｓｏｎＫ−Ｑｕａｎｔ
ｉｆｌｅａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｇｒａｎｕｌｏｅｙｔ
ａ　　ＥｌａｍｔａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　　ｉｎ
　　Ｈｕｍａｎ　　Ｍｉｘｅｄ　　Ｓａｌｌｖａ　　ａ
ｎｄ　　ｉｎ　ＰｕｒｅＰａｒｏｔｌｄ　Ｓｓｅｒ＠ｔ
ｉｏｎ、（１９８３）　ＨＯＰＰ＠−Ｓｅｙｌａｒ　ｓ
　ＺＰｈｙｍｉｏｌ　　Ｃｈｅｍ　３６４：　　１３２
３−１３２Ｌ１５、Ｏｈｌｓａｏｎ　Ｋｅ　　Ｔａｇｎ
ｅｒ　Ｈ，Ｆｒｉｔｚ　　Ｈ，ＳｃｈｉｅｓｓｌａｒＭ
、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｌｃａｌ　　Ｓｉｍｉｌａｒｉｔ
ｙ　　ｂｅｔｗｅｅｎ　　ＬｏｗＭｏｌ＠ｃｕｌａｒ　
Ｗｅｉｇｈｔ　Ｔｒｙｐｓｉｎ　−Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐ
ｓｉｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　　ｆｒｏｍ　　Ｈｕｍａ
ｎ　　Ｂｒｏｎｅｈｌａｌ　　Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｎ
ｄ　　Ｓ＠ｍＩｎａｌ　　Ｐｌａｍｍａ、（１９７６）
　　Ｈｏｐｐｅ　　Ｓｍｙｌｔｓｒ　　ｍ　　ＺＰｈｙ
ｓｉｏｌ　　Ｃｈｅｗ　　３５アニ　　１２４１−１２
４４゜１０−．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｒｅ、Ｏｈｌｓａｏ
ｎ　Ｋ、Ｉｓｏｌａｔｌｏｎ。

ｐｒｏｐ＠ｒｔｌ＠ｓ　　ａｎｄ　　ｅｏｍｐｌ＠ｔｓ
　　ａｍｌｎｏ　　ａｃｉｄ　　ｓｅｑｕ＠ｎｃｅｏｆ
　　ｈｕｍａｎ　　ｓ＊ｅｒｅｔｏｒｙ　　ｌｅｕｋｏ
ｅｙｔ＠　ｐｒｏｔ＠ａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ａ　
　ｐｏｔｅｎｔ　　ｌｎｈｉｂｌｔｓｒ　　ｏｒ　　１
ｅｕｋｏｅｙｔ＊ａｌａｍｔａｓ＠、（１９ｇ６）Ｐｒ
ｏｃＮａｔｌ　Ａｅａｄ　ｇｅｌ　ＵＳＡ　８３：６６
９２−６６９６゜ １７、Ｓａ＊ｍａｌｌ＠ｒ　　Ｕ、Ａｒｎｈｏｌｄ　Ｌ
　　Ｆｒｉｔｚ　　Ｈ。

Ｗｉａｄ＠ｎｍａｎｎ　　Ｋ、Ｍａｃｈｌ＠ｌｄｔ　Ｗ
ｅ　　Ｈ＠ｌｎｘ＠ｌ　　Ｒ＠Ａｐｐ＠ｌｈａｎｍ　　
Ｈ，Ｇａｍｍｏｎ　　Ｈ−Ｇ、　　ＬｏｔＬｓｐ＠ｉｅ
ｈ　　Ｆ、　　Ｉｈｓａｃｉｄ−ｓｔａｂｌ＠　ｐｒｏ
ｔ＠ｉｎａｍ＠　ｉｎｈｌｂｌｔｏｒ　　ｏｆ　　ｈｕ
ｍａｎｍｕｃｏｕｓ　　ｓｅｃｒ＠ｔｉｏｎｓ　　（Ｈ
ＵＳＩ−Ｉ、　　ａｎｔｉｌ＠ｕｋｏｐｒｏｔｅａｍ＊
）。

（１９８６）。

１ｇ、Ａｌｂｒ＠ｅｈｔ　　ＧＪ、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓ
ｓｅｒ　　Ｋ、Ｓａｌｉ＠ｒ　　Ｊ−Ｐ。

Ｅｌａｓｔａａｅ　　Ｉｎｈｌｂｉｔｉｏｎ　ｂｙ　　
ｔｈｅ　Ｉｎｔ＠ｒ−Ａｌｐｈａ−Ｔｒｙｐｍｉｎ　　
Ｉｎｈｉｂｔｔｏｒ　　ａｎｄ　Ｄ＠ｒｌｖｅｄ　　Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　　ｏｆＭａｎ　ａｎｄ　Ｃａｔｔ
ｌｅ、　　（１９ｇ３）　Ｈｏｐｐｅ−Ｓ＊ｙｌ−１畠
ｚＰｈｙｓｊａｌ　　Ｃｈｅｗ　　３６４：　　１７０
３−　　ｊ７０ｇ。

１９、Ｆｉｏｒｅｔｔｌ　　Ｅ、Ａｎｇ＠ｌ＠ｔｔｉ　
　Ｍ、Ｃｉｔｒｏ　Ｇ、ＢａｒｒａＤ、Ａｍｅｏｌｉ　
　Ｆ、Ｋｕｎｉｔｚｔｙｐｓ　　Ｉｎｈｌｂｉｔｏｒｓ
　　ｉｎ　ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍ、　　ＩｄａｎｔＩｆ
ｉａａｔｌｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｅｔｅｒｉｓ
ａｔｉｏｎ。

（１９ｇ？）　　Ｊ　　Ｄｉａｌ　　Ｃｈ＠ｗ　　２６
２：　　３５Ｂ＆　　−３５８９゜２０、Ｒｅｉｓｉｎ
ｇｅｒ　ＰＷＭ、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ　Ｋ、Ｇｏ
ｔｔｌｉｅｈｅｒＩ、Ｅｕｌｌｔｚ　Ｍ、Ｗａｅｈｔ＠
ｒ　　Ｅ、Ｔｈｅ　　Ａｍｉｎｅ−ＡｅｉｄＳ＠ｑｕ＠
ｎｃｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｏｕｂｌｅ−Ｈｅａｄ＠ｄ
　ＰｒｏｔａｉｎａｓｓＩｎｈｌｂｉｔｏｒｓ　　ｆｒ
ｏｍ　Ｃａｔ、Ｌｉｏｎ　　ａｎｄ　ＤｏｇＳｕｂｍａ
ｎｄｉｂｕｌａｒ　　Ｇｌａｎｄｓ、　　（１９８））
　　ＢｌｏＩ　　Ｃｈｅｍ　Ｈｏｐｐｅ−Ｓ＠ｙｌｅｒ
　　３６ｇ：　　フ１フーフ２１、Ｓｃｈａｌｗｉｊｋ
　　Ｊ、Ｌａｍｍ＊ｒｓ　ＡＭ、Ｃｈａｎｇ　Ａ、ｖａ
ｎｄｏ　Ｋｅｒｋｈｏｆ　　ＰＣＭ、Ｍｌｓｒ　ＰＤ、
Ａｎ　ＥｐＩｄｓｒｍａｌＥ１ａａｔａｓ＋ｅ　　Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ　　Ｉｎｄｕｃ＠ｄ　　ｂｙ　Ｓｐｏｎ
ｔａｎ＠ｏｕｓｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｉ
ｎ４１ａｍｍａｔｉｏｎ、（Ａｂｓｔｒａｅｔ）（１９
８ｇ）Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　　９Ｉ：
　　３７６。

２２、Ｈｌａｈｓｔｒａｍｓ＠ｒ　Ｋ、Ａｌｂｒｓｓｅ
ｈｔ　ＧＪ、８ｅｈｏｎｂａｒｇｅｒＯＬ、Ｒａｓｅｈ
＠　Ｂｅ　　Ｌｓｍｐａｒｔ　Ｋ、Ａｎ　Ｅｌａｓｔａ
ｇｅ　−Ｓｐｅｃｉｆｉｅ　　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　　
ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　ＢｒｏｎｅｈｉａｌＭｕｅｕａ
、　　（１９８１）　Ｈｏｐｐｓ−Ｓｔｙｌｅビｍ　Ｚ
　Ｐｈｙ＋ａｉｏｌ　Ｃｈｅｍ３６２：　　ｊ３６９−
　　ｊ３７５。

ダ図面の簡単な説明 第１図は乾癖症プラークからの弐夏のポリイプチドの抽
出と精製で使用するカチオン交換クロマトゲラフーを示
す。

第２図は乾癖症プラークからの弐ｌのポリペプチドの抽
出と精製で使用する逆相−ちークロマトグラフを示す・ ＠３図は乾癖症プラークからの式Ｉｆ）ポリペプチドの
抽出と精製で使用するポリ−スルホエチルアスパラトア
ミドクロマトグラフ−を示す。

１１４図は乾癖症プラークからの式夏のポリペプチドの
抽出と精製で使用する逆相−Ｃ１８−クロマトグラフィ
ーな示す。

第５図は式Ｉのポリペプチドの分子量の決定で使用した
分析ｒルクロマトグラフイーな示す。

８ｇ６図は式■のポリイデチドの等点電の決定で使用し
た等電点電気泳動法を示す。

８１１フ図は式１のポリペプチドによるヒト白血球エラ
スターゼの滴定を示す。

第８図は式■のポリはグチドの塩基配列を示す。

ｗＥｑ図〜第１２図は式Ｉのポリペプチドの発現で使用
したＤＮＡ塩基配列を示す。

第１３図は式Ｉのポリペプチドの発現で使用したＤＮＡ
塩基配列を示す。

第１４図及び第１５図は式１のボ９７％デチドについて
の部分的ｅＤＮＡ塩基配列を示す。

第１６図は式ＩのポリペプチドについてのｅＤＮＡの塩
基配列を示す・ 第１３図はプラスミドｐＵＥＸ２を示す。

＠１８図は酵母中で式１の成熟ポリペプチドな発現させ
るのに使用されるプラスミドｐＤＰ２５ｇ　　を示す。

第１９図は酵母中の式！のポリば！チドの蓄積を示す。

ぼ面の浄會（内容に変更なし） 埋１τ １．４ １：ｓｒｔ　？ 　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　轟０　　　
　　１０　　　　２０　　　　　　ｊＬｌ　　　　　　
４０　　　　５ｔｌ　　　　　　６Ｌ１ｍｌ０　　　　
　１０　　　　２０　　　　　　　ｊｌＪ　　ｆｉｌｌ
１：ｔｒｒ　ｒ％ １　　１Ｎ。

、Ｎ Ｃ７Ｃρ市　　　　　Ｍｙｏ　ｌ　　　　　Ｍｙｏ　Ｉ
Ｉ゜゜］ｒＩＴＩ ｐＨ１１１０９８／　　　　　　　　　　。

１：；ｒｔ　Ｏ 団　　　　　　　　　訂。

Ｃ１８（１２ＡＵ フラクション数 ａｌａＧｌｎＧｌｕＰｒｏＶａｌＬｙｓＧ１ｙＰｒｏＶ
ａｌＳｅｒＴｈｒＬｙｓＰｒｏＧｌｙＳｅｒＣｙｓＰｒ
ｏＩｌｅＩｉｅＬｅｕ工１ｅＡｒｇＣｙｓＡｌａＭ＠ｔ
ＬｅｕＡｓｎＰｒｏＰｒｏＡｓｎＡｒｇ６３　　「−−
ＥＬＩ３ Ｃ７５ＬｅｕＬｙｓＡｓ　ｐＴｈ　ｒＡｓｐｃｙｓＰｒ
ｏＧｌｙＩ　ｌ　ｅＬｙｓｌｙｓＣｙｓＣｙｓＧｌｕＧ
ｌｙＳｅｒｃｙｓＧｌｙｒｅ　ｔ１２３　　　　　（−
ａ−ＥＬ工５ ＡｌａＣｙｓＰｈｅＶａｌＰｒｏＧｌｎＥｎｄＥｎｄ１
８３　　Ｇ（ｒＴにＴＴＴＣＧτｉＣＣＡＣＡＡＴＡＡ
ＴＡＧＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＴＴ、％ＴＴ
ＡＴＣＣＴＡＧ　　　２１ＧＥＬＩ６−一一− Ｆ７ｇ、　７４゜ ＡｌａＧｉｎにｉｕＰｒｏＶａｌＬｙｓＣｌｙＰｒｏ７
ａ１５ｅｒτｈｒＬｙｉＰｒｏＣＩ７Ｍ＠ｒＣｙｓＧＣ
Ｇ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＧＴＣＡＡＡαテＣＣＡ
　ＣＴＣτＣＣ＾σ〜鴫αゴαにτＣＣＴＧＣ５Ｏｉｌ
＾ 配列 Ｐｒａ　　ＩＩ＠　ＩＩ＠　ＬＪｕ　　１１＊　Ａｒｇ
　Ｃｐｓ　轟１ａ　ｌｌｅｔ　　Ｌｅｕ　＾ｓｎ　Ｐｃ
ｏ　Ｐｒｏ　＾ｍ　＾ｒｇ　ＣｙｓＬａｕ　Ｌｙｓ　Ａ
ｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　にｌｙ　ｌｉ
＠Ｌ７ｘ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｍ　Ｇｌｕ　Ｃｌｙ　
Ｓ＠ｔＣｙｓ　にｌｙ　Ｎ＠ｔ　　轟１ａ　Ｃｙｓ　　
ｔｈ＠Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ２一丁、Ｃズｔか Ｐ＋＾力さ Ｆ々、１５゜ ＾１ａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇ
１７　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒτｈｒ　Ｌｙ７５　Ｐｒ
ｏ　Ｇｌｙ　Ｓｓｒ　Ｃｙｓ、ＱＳ　ＣＡＡ　ｃ、、ｔ
；　ＣＣＡ　ＧＴＣＡＡＡ　スＪＣＣＡ　ＧＴＣＴＣＣ
ＡσＡＡＧαゴα；ＣＴＣＣＴＧＣ５ＤＮＡ 配列 Ｐｒｏ　　Ｘ１＠　Ｉｌ＠　Ｌｅｕ　　ｌｉｅ　Ａｒｇ
　Ｃｐｓ　　Ａｌａ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　
Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　轟ｘｎ　　＾ｒｇ　ＣｙｓＣＣＣＡ
Ｔｒ　Ａｔｅ　ＴＴＧ　ＡＴＣＣＧに　ＴＧＣＧＣＣａ
ｒｃ　ｔｉｃ　ＡＡＴ　ＣＣＣαゴａａｃ　ｃｃｃ　ｔ
ｃｃＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ
　Ｐｒｏ　にｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　
Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＳｅｒＴｒＧ　ＡＡＡ　ＧＡ
Ｔ　ＡαＧＡＣＴ（：ＣＣＣＡ　Ｇ（：Ａ　ＡＴＺ　戚
ＭＰ　？（：Ｃ面ＧＡＡ　Ｑｌ；ＣＴＣｒＣｙｓ　Ｇｌ
ｙ　Ｎｅｔ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｐｈ＠Ｖａｌ　Ｉｒｏ　
ＧｉｎＴＧＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣ丁ＧｒτＴＣＧＴＴＣ
ＣＣＣＡＩ：τＡ（：ＧＡＣｔＪＡＧＣＪＣＧＧＴＣＸ
Ｔτｃｃｒｃｃａｃｃ丁ｃｒＧ＾＾ττＣ，＋？りＡｌ シグナル １−Ｔ、Ｃメｌ蹟 ＰｃｏメはＧ ＥｅｏＲＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ＸｂａＩＦＬＩＡＧＴＬＶＬＥＡＡＶＴＧＶＰ トー−−−−−フレーム内上流側タンパク配列　−一一
一一一フ０　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　
　　　　　　　１１０ＶＫＧＯＤＴＶＫＧＲＶＰＦＮＧ
ＱＤＰＶＫＧＯＶＳＶＫＧＱＤＫＶＫ ＾１ａＧｌｎＧ１ｕＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｙＰｒ１−
エラスターゼ阻止剤− ＴｒＧＣにＧＧＡＴＧＧＣＣＴにｍＣＧＴＴＣＣＣＣＡ
ＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＣ
ＡＣＣＴＧＴＧＣｒｃｙｓＧ１ｙＭｅ　ｔＡｌａＣｙｓ
ＰｈｅＶａｌＰｒｏＧ１ｎＥｎｄＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡ
ＧＣＴＡＣＡ（１；ＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡ
ＡＧＴＣＣＣｒＧ（ゴＧＣＣＣＴｒＣＣＣＣｒＴＣＣＣ
ＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＴＴＣ
ＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴ
ＣＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡτＡＡＡＧＡＧ
”ｒＴＣＣＧＧｋＡＴＴＣｄぞりＡ　　　　　　　　　
ＥｃｏＲエシグナル Ｇｔ−ｔｑ　１７ Ｉ程 ＩＣＯＲＩ　Ｓｌｌｌ？Ｉ　Ｂ？ｌｌＬＨＩ　　Ｓ？ｌ
Ｉ　　　　Ｐ７ｔＩ手続争市正書（０発） 平成２年７月２５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトの皮膚の乾癬症の痂皮から得ることができるか
   つ下記の性質ａ）〜ｄ）、すなわち、ａ）ＳＤＳ−ＰＡ
   ＧＥにより測定して、約９ｋＤの分子量を有する： ｂ）等電点電気泳動法により測定して、ｐＨ約９．７の
   等電点を有する： ｃ）ヒト白血球エラスターゼの他に豚膵臓エラスターゼ
   に対する阻止作用を有する：及び ｄ）トリプシン、ヒトカテプシンＧ、α−キモトリプシ
   ン及びプラスミンに対して大きな活性を示さない： を有することを特徴とする、ヒト白血球エラスターゼに
   対する阻止作用をポリペプチド、又は、ヒト白血球エス
   テラーゼに対する阻止作用を有する、上記ポリペプチド
   のフラグメント。 ２、ａ）【遺伝子配列があります】 ｂ）【遺伝子配列があります】 ｃ）【遺伝子配列があります】 ｄ）【遺伝子配列があります】：及び ｅ）【遺伝子配列があります】 から選ばれた請求項１に記載のポリペプチド。 ３、【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 及び後記式 I のアミノ酸配列； から選ばれたアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に
   記載のポリペプチド。 ４、式 I ： 【遺伝子配列があります】 （式 I ） の一次構造の全部又は一部を有するポリペプチド又はそ
   のフラグメントであつて、ヒト白血球エラスターゼに対
   する阻止作用を有するポリペプチド又はそのフラグメン
   ト及び生体内又は生体外で上記ポリペプチド又はそのフ
   ラグメントに修飾し得る化合物。 ５、下記の一次構造： 【遺伝子配列があります】 の全部又は一部からなりかつヒト白血球エラスターゼに
   対する阻止作用を有する請求項４記載のポリペプチド及
   びそのフラグメント及び生体内及び生体外で上記ポリペ
   プチド又はそのフラグメントに修飾し得る化合物。 ６、【遺伝子配列があります】 ；及び 【遺伝子配列があります】 から選ばれたアミノ酸残基の１つ又はそれ以上が前方部
   分に存在している請求項４又は５記載のポリペプチド。 ７、組換え体ＤＮＡ製造技術により製造された請求項１
   〜６のいずれかに記載のポリペプチドフラグメント又は
   その同族体。 ８、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ塩基配列。 ９、ａ）第１３図に示されるＤＮＡ塩基配列又はそのフ
   ラグメント又はその相補鎖； ｂ）第１３図に示されるＤＮＡ塩基配列又はそのフラグ
   メントとハイブリツド形成するＤＮＡ塩基配列、又は ｃ）遺伝子コードの縮重がなければ、第１３図に示すＤ
   ＮＡ塩基配列又はそのフラグメントとハイブリッド形成
   するＤＮＡ塩基配列； からなるＤＮＡ塩基配列。 １０、第１３図に示すＤＮＡ塩基配列のフラグメントは
   、式 I のポリペプチドをコードする部分からなる請求
   項９記載のＤＮＡ塩基配列。 １１、第１４図又は第１６図に示されるＤＮＡ塩基配列
   又はその相補鎖から実質的になるＤＮＡ塩基配列。 １２、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドを
   形質転換細胞宿主内で発現することができる複製可能な
   プラスミド発現ビヒクル。 １３、宿主が請求項１２に記載の複製可能なプラスミド
   発現ビヒクルからなる、請求項１〜７のいずれかに記載
   ポリペプチドを発現することができる形質転換細胞縮主
   。 １４、少なくとも、請求項１〜７のいずれかに記載のポ
   リペプチドのフラグメントを結合させるのに有効な抗体
   。 １５、請求項８、９、１０又は１１に記載のＤＮＡ塩基
   配列とハイブリッド形成することのできるヌクレオチド
   配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。 １６、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを
   コードする遺伝子をベクターの適当な挿入部位に挿入し
   、それによつて、請求項１〜７のいずれかに記載のポリ
   ペプチドの合成に向けることができる複製可能なプラス
   ミド発現ビヒクルを得ることを特徴とする、請求項１２
   に記載の複製可能な発現ビヒクルの製造方法。 １７、請求項１２に記載の複製可能なプラスミド発現ビ
   ヒクルで形質転換された宿主細胞を培養することを特徴
   とする、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド
   の製造方法。 １８、請求項１２に記載の複製可能な発現ビヒクルを宿
   主に挿入することにより宿主を形質転換することを特徴
   とする、請求項１３に記載の形質転換宿主の調製方法。 １９、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドと
   薬学的に許容され得る稀釈剤又は担体とからなる医薬組
   成物。