JPH08504568A - ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子ＶＩＩａ−組織因子複合体の阻害因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 因子ＶＩＩａ−ＴＦ複合体を阻害する（阻害定数：５００ｎＭ以下）ＢＰＴＩから誘導される化合物、該化合物を含有する薬剤組成物および該化合物の使用法が開示される。また、該化合物をコード化する単離された核酸セグメント、該核酸セグメントとプロモーターを含むベクター、転質転換された宿主細胞、および該宿主細胞を使用することによる該化合物の製造法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子 ＶＩＩａ−組織因子複合体の阻害因子 発明の分野 この発明は、ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される阻害因子（インヒビタ ー）およびこれらの調製法と治療的使用法に関する。 発明の背景 ウシ膵トリプシン阻害因子（ＢＰＴＩまたはアプロチニンとも呼ばれる）は、 ３個のジスルフィド橋による内部架橋を伴った５８個のアミノ酸残基を有するポ リペプチドである［フリッツ（Ｆritz、Ｈ）およびブラデラー（Ｗunderer、Ｇ ）、Ａrzneim．−Ｆorsch／Ｄrug Ｒes．、第３３巻、第４７９頁〜第４９４頁 参照］。成熟野性型ＢＰＴＩのアミノ酸配列は次の配列（Ｉ）で表される。 （配列ＩＤ Ｎo．２） 成熟折りたたみタンパク質においては、ジスルフィド結合は、次のシステイン 対の間に形成される：５〜５５、１４〜３８および３０〜５１。 ＢＰＴＩもしくはトリプシンと複合化したＢＰＴＩ変異体、カリクレイン、ト リプシノーゲンおよび無水トリプシンの結晶構造においては、阻害因子の２つの ループが、残基１１〜１９および３４〜３９において、セリンプロテアーゼと界 面を形成する［ボード（Ｂode、Ｗ．）ら、Ｅur．J．Ｂiochem．、第１４４巻、 第１８５頁〜第１９０頁（１９８４年）参照］。これらの残基は、標的プロテア ーゼに対する阻害因子の特異性を規定する主要な原因であると考えられている。 特異性は、特異的プロテアーゼに対する阻害因子の効力または親和性と関係す る（即ち、Ｋiが小さいほど、特異性は高く、例えば、５００nＭまでのＫiは、 この出願では特異的であるとみなされる）。セリンプロテアーゼの配列との組合 せにおいては、プロテアーゼ阻害因子の親和性と特異性が、プロテアーゼと阻害 因子の界面の両側での配列変異に起因するということが提案されている［クレイ トン（Ｃreighton、Ｔ．Ｅ．）およびダービー（Ｄarby、Ｎ．J．）、ＴＩＢＳ ）第１４巻、第３１９頁〜第３２５頁参照］。選択性は、２種の特異的なプロテ アーゼに対する特異的阻害因子の阻害定数の差に関係する。 当該分野においては、セリンプロテアーゼの阻害因子または基質の配列は、・・・ −Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１'−Ｐ２'−Ｐ３'−Ｐ４'−・・・で表されること が多い（ＰおよびＰ'はアミノ酸を示す）。基質の場合、タンパク質分解による 開裂部位は、残基Ｐ１とＰ１'の間で発生するものとして規定される［シェヒタ ー（Ｓchechter、Ｉ）およびベルガー（Ｂerger、Ａ）、Ｂiochem．Ｂiophys． Ｒes．Ｃommun．第２７巻、第１５７頁（１９６７年）参照］。基質中のＰ−カ ルボニルとＰ'−窒素原子間の結合は開裂性結合と呼ばれることが多い。 セリンプロテアーゼの主要な特異性は、開裂性結合の前に直接結合する残基の 特性によって規定される。残基Ｐ１は、野性型または天然のＢＰＴＩ配列のリシ ン１５に対応する。残基Ｐ１と共に開裂性結合を包囲する残基は、次の配列（Ｉ Ｉ）で表されるＢＰＴＩの［活性部位ループ（active site loop）」と呼ばれる ことが多い［ラスコウスキー（Ｌaskowski、Ｍ．Jr．）およびカトウ（Ｋato、 Ｉ）、Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．、第４９巻、第５９３頁〜第６２６頁（１９８０ 年）参照］。 （配列ＩＤ Ｎo．２） Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１'、Ｐ２'、Ｐ３'およびＰ４'は、異なるセリンプロテア ーゼを差別化する阻害因子に対して二次的な特異性を伝える。ＢＰＴＩにおいて は、残基３４〜３９から成る第二のループは、特定のセリンプロテアーゼの活性 部位を有する接触領域も形成し、特異性に寄与する。 特定のセリンプロテアーゼに対してより特異的な阻害効果をもたらすＢＰＴＩ の類似体が報告されている。一つの類似体においては１５位と４２位のアミノ酸 を変え、また、別の類似体においては１５位、１７位および４２位のアミノ酸を 変えたＢＰＴＩの残基３〜５８から成るポリペプチドが、血漿カリクレインを阻 害し（Ｋiは１〜０.１）、また、因子Ｘaを阻害するが（この場合の阻害定数は 比較的小さく、１８００〜１５０nＭである）、因子ＶＩＩaまたはトロンビンは 阻害しないことが報告されている［ノリス（Ｎorris、Ｋ．）およびペーターセ ン（Ｐetersen、Ｌ．Ｃ．）、「アプロチニン類似体とその製造法」、ＥＰ３３ ９，９２４号（１９８９年１１月２臼発行）参照］。 リポタンパク質が関係するヒト血漿の凝固阻害因子（ＬＡＣＩ）は３つの縦列 に結合した領域から成る。これらの領域の各々はＢＰＴＩと相同性を示す。この ２７６−アミノ酸阻害因子は、その第二の領域によって因子Ｘaを阻害し、また 、その第一の領域によって因子ＶＩＩa−組織因子複合体を阻害することが報告 されている［ギラード（Ｇirard、Ｔ．Ｊ．）ら、ネイチャー、第３３８巻、第 ５１８頁〜第５２０頁（１９８９年）参照］。因子ＶＩＩa−組織因子複合体の 阻害は、因 子Ｘaが不存在のときは弱いが、因子Ｘaが存在するとかなり強くなる［カランダ ー（Ｃallander、Ｓ．）ら、J．Ｂiol．Ｃhem．、第２６７巻、第８７６頁〜第 ８８２頁（１９９２年）参照；但し、この文献は本発明の先行技術ではない］。 ＬＡＣＩの第一領域と因子Ｘの軽鎖から成る組換え融合タンパク質が、因子ＶＩ Ｉa−組織因子複合体の阻害因子であることが報告されている［ギラードら、Ｅ Ｐ４３９，４４２号（１９９１年７月３１日発行）参照］。ＬＡＣＩの最初の２ つの領域を有する組換タンパク質は因子ＶＩＩa−組織因子阻害因子である［ブ ローズ（Ｂroze）ら、米国特許第５，１０６，８３３号（１９９２年４月２１日 ）明細書参照；但し、この文献は本発明の先行技術ではない］。 発明の概要 この発明は、因子ＶＩＩa−組織因子（ＴＦ）複合体の生体内外での生活性に 対する強力な阻害活性を有するように処理されたＢＰＴＩの誘導体に関する（該 処理法については後述する）。第一の観点によれば、本発明は、５００nＭ以下 、好ましくは１００nＭ以下、より好ましくは１０nＭ以下の阻害定数（Ｋi）を 示す程度で因子ＶＩＩa−ＴＦを阻害するＢＰＴＩから誘導される化合物によっ て特徴づけられる。 「化合物」という用語は、ヒト膵トリプシン阻害因子を含む天然に存在するＢ ＰＴＩとその類似体の場合のように、５８個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を 有するポリペプチド鎖に関するだけでなく、因子ＶＩＩa−ＴＦの阻害因子とし ての活性とは関係のない位置が置換した１個もしくはそれ以上のこれらのアミノ 酸を有する化合物も意味する。例えば、このような置換には、グリシンによるバ リンの置換、１個もしくはそれ以上の荷電アミノ酸による同一もしくは反対荷電 アミノ酸の置換、および１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失等が含まれる。 さらに、ＢＰＴＩ誘導体の因子ＶＩＩa−ＴＦに対する阻害活性にはほとんども しくは全く影響を与えないようにして、１個もしくはそれ以上のアミノ酸をＢＰ ＴＩ−類似体のポリペプチド鎖中に導入してもよい。このような置換は、天然に 存在するアミノ酸のいずれを用いておこなってもよく、あるいは、当該分野で既 知 の標準的な方法によって製造される合成アミノ酸を用いておこなってもよい。本 発明の特に好ましい観点においては、特別に選択された部位において、最終的に 得られるコード化ＢＰＴＩ−類似体に因子ＶＩＩa−ＴＦに対する阻害活性を付 与するように選択された特異的な位置において変化をもたらすＢＰＴＩ−類似体 の所望のアミノ酸配列をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ） を合成することによって当該化合物は誘導される。このような誘導法の一例を以 下に説明する。この場合、遺伝子工学的な方法によって突然変異体ＢＰＴＩ化合 物を調製した。 「類似体」という用語は、ＢＰＴＩに類似し、ＢＰＴＩの３個のジスルフィド 結合を付与されたＢＰＴＩと同一の二次元的または三次元的構造を実質的に有す る天然もしくは合成の化合物を意味する。 特に、ＢＰＴＩ−類似体であって、因子ＶＩＩａ−ＴＦ阻害活性を有する化合 物には次の構造から成るか、または実質上次の構造から成る化合物が含まれる： この場合、 Ｘ₁₁はアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン 、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラ ニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリン を示し、 Ｘ₁₃はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、 グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニ ルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたは バリンを示し、 Ｘ₁₄はアラニン、システイン（Ｘ₃₈がシステインのとき）、グリシンまたはセ リ ンを示し、 Ｘ₁₅はアルギニンまたはリシンを示し、 Ｘ₁₆はアラニンまたはグリシンを示し、 Ｘ₁₇はアラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチ ジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロ リン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ₁₈、Ｘ₁₉およびＸ₂₀はいずれかの天然のアミノ酸を示し、 Ｘ₃₄はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸 、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチ オニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、 チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ₃₅はフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンを示し、 Ｘ₃₆はアラニン、グリシンまたはセリンを示し、 Ｘ₃₈はアラニン、システイン（Ｘ₁₄がシステインのとき）、グリシンまたはセ リンを示し、 Ｘ₃₉はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸 、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチ オニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、 チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ₄₅はフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンを示し、 Ｘ₄₆はいずれかの天然のアミノ酸を示す。 特に好ましい態様においては、誘導化合物には次の構造を有する化合物が含ま れる： この場合、 Ｘ₁はアラニンまたはアルギニンを示し、 Ｘ₁₁はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリ ン、トレオニンまたはバリンを示し、 Ｘ₁₃はアラニン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオ ニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを 示し、 Ｘ₁₄はシステインを示し、 Ｘ₁₅はアルギニンまたはリシンを示し、 Ｘ₁₆はアラニンまたはグリシンを示し、 Ｘ₁₇はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはチロシンを示し 、 Ｘ₁₈はヒスチジン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンを示し、 Ｘ₁₉はアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リ シン、プロリン、トレオニンまたはバリンを示し、 Ｘ₂₀はアルギニンまたはセリンを示し、 Ｘ₃₄はアスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラ ニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ₃₅はチロシンを示し、 Ｘ₃₆はグリシンを示し、 Ｘ₃₈はシステインを示し、 Ｘ₃₉はアルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロ イシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンを示し 、 Ｘ₄₅はフェニルアラニンを示し、 Ｘ₄₆はアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、フェニルアラニン、トリプト ファンまたはチロシンを示す。 第二の観点によれば、本発明は、前記の化合物をコード化する単離された核酸 セグメントによって特徴づけられる。 「単離された」という用語は、核酸が天然では自然に発生しない状態で提供さ れることと意味し（もっとも、ヌクレオチドの核酸配列は天然に存在する配列と 同一であってもよい）、好ましくは宿主細胞ゲノム内、発現ベクター内または他 のベクター内において、複製され、転写され、本発明による所望の阻害因子を形 成するように翻訳されるような状態で存在することを意味する。また、この用語 は、核酸の均質溶液も意味する。 好ましい態様においては、核酸セグメントは少なくとも１５０個の塩基を含ん でおり、核酸セグメントの転写を調整するプロモーター領域を有するベクター、 例えば、プラスミド、ファスミド、コスミドまたはファージ内で提供される。こ れに関連する観点においては、本発明は、このようなベクターを含有する宿主細 胞によって特徴づけられる。 「プロモーター領域」および「転写」という用語は、当該分野において認識さ れている意味で使用する。 さらに別の観点によれば、本発明は、ベクターが宿主細胞内において前記化合 物を発現させる条件下において、該化合物をコード化する該ベクターを含有する 該宿主細胞を増殖させることによる該化合物の調製法によって特徴づけられる。 好ましくは、該化合物は、これを細胞周辺腔または培養上澄み中へ分泌させる分 泌シグナル配列に結合させる。 該化合物の調製法の好ましい態様には、次の工程（a）〜（c）が含まれる： （a）該化合物コード化する発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞の 栄養培地内での培養を開始させ、 （b）該化合物が生産されるのに十分長い時間にわたって培養をおこない、次 いで、 （c）該化合物を培地から回収する。 本発明には、貯蔵後に投与される薬学的に許容される組成物であって、薬学的 に許容されるキャリヤーまたは希釈剤と共に前記の化合物を薬学的に有効な量含 有する組成物が包含される。 本発明にはまた、本発明による化合物を治療的に有効な量投与することを含む 、組織因子および／または因子ＶＩＩaの異常な発現または量によって特徴づけ られる哺乳類の病気の予防法または治療法が包含される。例えば、本発明には、 異常な血栓症によって特徴づけられる哺乳類の病気の予防法または治療法が包含 される。「異常な」という用語は、哺乳類の一般的な母集団で観察される場合と は異なる量または型の組織因子または因子ＶＩＩaを示すものであって、当該分 野で認識されている用語である。 本発明のさらにまた別の特徴や利点は、本発明の好ましい態様と請求の範囲に 関する以下の記載によって明らかにする。 図面の簡単な説明 まず第一に、図面について簡単に説明する。 図１は、ＢＰＴＩ分子表面と因子ＶＩＩa基質結合部位のモデルとの間の三次 元的な相互作用を示す模式図である。点線で示す表面は、因子ＶＩＩaの基質結 合部位と接触することが予想されるＢＰＴＩ分子の部分を表す。ＢＰＴＩ部分（ 下方）と因子ＶＩＩa（上方）のポリペプチド鎖は黒色のリボンで表す。 図２はベクターpＭa５−ＰＩを示す模式図である。pＭa５−ＰＩの地図は次の （i）〜（vi）の特徴を有する：（i）Ｃo１Ｅ１型複製開始点（ＯＰＩ）、（ii ）複製開始点を含む線状ファージf１の遺伝子間領域（f１ ＯＰＩ）、（iii） アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子（bla）、（iv）アンバー 停止コドンを導入する突然変異によって非機能化されたクロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ遺伝子（cat−am）、（v）Ｐtac／phoＡ／ＢＰＴＩ発 現カセット、および（vi）ファージfdの中心転写ターミネーターの２つのコピー （fdＴ）。相補ベクターpＭc５−Ｐ１は、cat遺伝子が機能的で（クロラムフェ ニコール耐性を付与する）、bla遺伝子がアンバー停止コドンを有するという点 を除けば、pＭa５−ＰＩと同一である。拡大した領域はＰtacプロモーターの位 置、phoＡ分泌シグナルをコードするＤＮＡセグメント、ＢＰＴＩから誘導され た遺伝子および関連する制限部位を示す。シークエンシングプライマーは、図２ の上部に示すように、ＢＰＴＩコー ディング領域のすぐ下流にベクター配列にアニール化される。該プライマーは、 本発明による因子ＶＩＩa−ＴＦに対する有用な阻害因子をコード化するＤＮＡ 配列を決定するのに使用することができる。 図３はＢＰＴＩコーディング領域の組立に使用した４種のオリゴヌクレオチド のＤＮＡ配列（５'〜３'）を示す。 図４は、pＭa５−ＰＩの構成に用いた種々のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列 を示す。特に、図４aは、受容体ベクターpＭa５−１９またはpＭc５−１９（こ れらは、まとめてpＭa／c５−１９で表す）の関連する部分を示す。ベクターの 構成を示すこれらの略語で用いるように、「a」はアンピシリン耐性をもたらす 配列に関するものであり、「c」はクロラムフェニコール耐性をもたらす配列に 関し、また、「a／c」はアンピシリン耐性とクロラムフェニコール耐性の両方を もたらす配列を示す。ＥcoＲＩ／ＸbaＩフラグメントは、pＭa／c５−８のマル チクローニング部位中に存在する［スタンスセンス（Ｓtanssens）ら、Ｎucl． Ａcids Ｒes．、第１７巻、第４４４１頁〜第４４５４頁（１９８９年）参照］ ・Ｐtacプロモーターの−３５と−１０のボックス、シャイン−ダルガルノ（Ｓh ine−Ｄalgarno；ＳＤ）配列、phoa遺伝子から誘導された分泌シグナルおよびい くつかの関連する制限部位を示す。図４bは４種の化学的に合成したオリゴヌク レオチドから成る二本鎖のＢＰＴＩ−コーディングフラグメントを示す。ＢＰＴ Ｉ−オリゴヌクレオチドは、ＫpnＩによってオープンにされたpＭc５−１９ベク ターと結合させ、ＤＮＡポリメラーゼＩ［クレナウ（Ｋlenow）フラグメント］ を用いて処理した後、ＨindＩＩＩを用いて消化させた。これによって、ＢＰＴ Ｉコーディング領域の５'−末端はphoＡ分泌シグナルに融合され、一方、３'− 末端のＨindＩＩＩ−接合点はフレーム内の（in−frame）ＴＡＡ翻訳停止コドン を発生させる。 図５は、ＢＰＴＩから誘導されてＰＩＩＩコートタンパク質に融合された突然 変異タンパク質の５つのコピーをもたらす線状ファージを示す模式図である。 図６は、本発明による因子ＶＩＩaに対する強力な阻害因子をもたらすファー ジの単離法を示す模式図である。 図７は、pＨＩＬＳ１大腸菌−ピキア・パストリス（Ｐichia pastoris）シャ トルベクターの模式図である。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子（Ａ mp）と大腸菌の複製源（ori）を有する大腸菌プラスミドpＢＲ３２２のセグメン トを含む。この部分は、f１−バクテリオファージの複製源（f１−ori）も含む 。ピキア・パストリスエレメント（ＡＯＸ、ＰＨＯ１、ＨＩＳ４）は以下の実施 例１０で規定される。関連する制限部位はＢg１２、Ｓac１、Ｎsi１、Ｘho１、 Ｓma１、ＥcoＲＩ、ＢamＨ１、Ｘba１およびＳtu１で示される。 図８は、得られたヒト血漿中の５Ｌ１５の組織因子活性化に対する線量応答曲 線を示す。５Ｌ１５の存在下で活性トロンビンの最大値があらわれる時間を、阻 害因子の不存在下で活性トロンビンの最大値があらわれる時間で割った比として 、相対遷延（relative prolongation）を計算した。 図９は、ヒト血漿中の５Ｌ１５とヒルジン（Ｈirudin）の組織因子活性化に対 する効果を示すトロンビン発生曲線である。図中、正方形の符号は対照を示し（ 抗凝固因子を含まない場合）、三角形の符号は５Ｌ１５の濃度が０.６６３μＭ の場合を示し、円形の符号は５Ｌ１５の濃度が３.９３８μＭの場合を示し、ゴ チックの正方形の符号はヒルジン（０.１μＭ）の場合を示す。 好ましい態様の詳細な説明 ＢＰＴＩ−誘導体 特定のセリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、プラスミン）に対するＢＰ ＴＩの特異性を、プロテアーゼ基質結合部位と接触するＢＰＴＩ分子の表面部分 を構成するアミノ酸の特性によって決定する。図１において点で表示する表面は 、因子ＶＩＩaの基質結合部位と接触すると予想されるＢＰＴＩ分子の部分を示 す（組織因子との複合体中の因子ＶＩＩaのプロテアーゼ領域は構造中のトリプ シンに類似するものと想定する）。ＢＰＴＩ分子のポリペプチド鎖は下方の黒色 リボンで表示される。因子ＶＩＩa構造体と形態、電荷、極性および疎水性の点 で最適な適合性が得られるように接触表面を修飾する方法により、アミノ酸を置 換するか、挿入するか、または欠失させることによってＢＰＴＩから化合物を誘 導する ことができる。このようにしてＢＰＴＩから誘導される化合物は因子ＶＩＩaに 対する強力な阻害因子である（ＢＰＴＩ自体は因子ＶＩＩaに対しては有意な阻 害効果を示さない）。接触領域の外側のアミノ酸の修飾または除去によっては、 接触領域の構造がこのような変化により乱されない限り、阻害因子の結合特性は 影響を受けない。図１に示すものと類似のＢＰＴＩモデルを考察することにより 、接触領域の形態は主として（もっぱらではない）残基１１、１３、１４、１５ 、１６、１７、１８、１９、２０、３４、３５、３６、３８、３９、４５および ４６によって規定されるものと推定される。従って、ＢＰＴＩから誘導される本 発明による阻害因子はこれらの部位において阻害活性を高めるように修飾されて いる。該阻害因子の他の部位は、このような修飾にほとんどまたは全く影響を及 ぼさないような変化を受けていてもよい。これらの阻害因子は、インビボおよび インビトロにおいて因子ＶＩＩa−ＴＦの活性を阻害するように最適化された塩 基性ＢＰＴＩ構造を有する。このような誘導体は、以下に説明するようにして、 標準的な手順によって調製することができる。しかしながら、ＢＰＴＩ構造にお ける最適な変化の同定は、ランダム化突然変異法またはＢＰＴＩアミノ酸の配列 もしくは構造の系統的変更法によっておこなうことができる。これらの方法を以 下に例示するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。部位特異的突然変異誘発 本発明において有用な因子ＶＩＩa−ＴＦの阻害因子は、微生物の体内で発現 されたＢＰＴＩ遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって同定できる。例えば、 スタンスセンスらの報文［Ｎucl．Ａcids Ｒes．第１７巻、第４４４１頁〜第 ４４５４頁（１９８９年）］に記載の手順により、合成遺伝子をベクター内で形 成させ、これを標準的な方法によって突然変異誘発させる。特に、ＢＰＴＩコー ディング領域は化学的に合成されるので、ヌクレオチド配列は、大腸菌のコドン 使用頻度に匹敵するように適合する（即ち、合成された遺伝子は、ポリペプチド 生産に悪影響を及ぼすＡＧＡおよびＡＧＧ Ａrg−モジュレーター−コドンを欠 くように調製する）。要所要所に配置させた他の遺伝子操作を促進する制限部位 を取 込むことができる。１位のアルギニンをアラニンで置換させることにより、大腸 菌のシグナルペプチダーゼによる適切な処理をおこなう。 固有の、適切に折りたたまれたジスルフィド結合によって結合されたＢＰＴＩ 誘導体を生産する大腸菌の発現系を確証するために、ＢＰＴＩから誘導された突 然変異タンパク質を、分泌シグナルペプチドをコード化するＤＮＡフラグメント に遺伝子を融合させることによって、ペリプラスム間隙へ誘導することができる 。オリゴヌクレオチドをコード化するＢＰＴＩ誘導体はpＭa／c５−１９と直接 結合させる（pＭa／c５−１９はpＭa５−１９またはpＭc５−１９を示す）。こ のベクター（図２参照）はＩＰＴＧ−誘導Ｐtacプロモーター、およびＫpnＩ部 位に基づいて利用可能なように調製されたアルカリ性ホスファターゼ（phoＡ） 遺伝子の分泌シグナルをコード化する部分を有する［スタンスセンスら、Ｎucl ．ＡcidsＲes．第１７巻、第４４４１頁〜第４４５４頁（１９８９年）参照］。 ＢＰＴＩ誘導体−コーディング領域の組立に使用した４種のオリゴヌクレオチド の配列を図３に示す。図４には、pＭa／c５−１９の関連部分および完全なＢＰ ＴＩ誘導体−コード化核酸フラグメントを示す。pＭa／c５−１９ベクター内で のＢＰＴＩ−相似遺伝子の構築については、以下の実施例１において詳述する。 ベクターpＭa５−ＰＩおよびpＭc５−Ｐ１は本発明において有用である。何故 ならば、これらのベクターは線状ファージf１の遺伝子間領域に宿っているので 、発現、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発およびシークエンシングは同じ レプリコンによっておこなわれるからである。突然変異構築実験はステンセンス らの報文［Ｎucl．Ａclds Ｒes．、第１７巻、第４４４１頁〜第４４５４頁（ １９８９年）］に記載の方法と実質上同一の方法によっておこなった。ＢＰＴＩ から誘導された阻害性化合物８２c５および９５c１２をコード化する遺伝子の構 築については以下の実施例２において説明する。 大規模生産のためには、特異的阻害因子をコード化する遺伝子を分泌生産系、 例えば、Ｐichia酵母発現系［フィリップス・ペトローレアム・カンパニー（Ｐh illips Ｐetroleum Ｃompany）から入手］へ転移させることができる。因子Ｖ ＩＩ a−ＴＦに対する特定の阻害因子の発現に用いたベクターについては、以下の実 施例１０において説明する。組換えタンパク質は標準的な方法、例えば、イオン 交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによって培養 培地から精製することができる。この精製例については実施例３において説明す る。ランダム突然変異誘発 因子ＶＩＩa−ＴＦに対する特異的な阻害因子は、ＢＰＴＩの全遺伝子または プロテアーゼ阻害因子の接触領域に含まれる残基の特定のセットのランダム突然 変異誘発によって得ることができる。ＢＰＴＩから誘導されるこの種の突然変異 ポリペプチドのライブラリーは、適当な酵素アッセイ法、例えば、以下の実施例 ４に記載の方法を用いることによって因子ＶＩＩa−ＴＦの阻害に対するスクリ ーニング処理に付すことができる。あるいは、因子ＶＩＩa−ＴＦの強力な阻害 因子を単離する方法を利用してもよい。例えば、ラドナー（Ｌadner）らによる 米国特許第５，０９６，８１５号（１９９２年３月１７日）明細書に記載の方法 により、線状ファージコートタンパク質を含む融合タンパク質として突然変異体 −ＢＰＴＩを発現させることができる。因子ＶＩＩa−ＴＦの阻害因子として作 用するファージは「パンニング（panning）」と呼ばれる方法によって単離する ことができる［パームレイ（Ｐarmley）ら、ジーン（Ｇene）、第７３巻、第３ ０５頁〜第３１８頁（１９８８年）参照］。突然変異体−ＢＰＴＩの特定のライ ブラリーの構築例については以下の実施例７において説明する。また、パンニン グのプロトコルについては実施例８において説明する。ＢＰＴＩから誘導される好ましい化合物 本発明による好ましい化合物は、因子ＶＩＩaに対するＫiが５００nＭよりも 小さな化合物である。このような化合物を以下に例示する。これらの阻害因子は 、括弧内に示す置換以外は、ＢＰＴＩと同じアミノ酸配列を有する。 別の好ましい誘導体は、因子ＶＩＩa−ＴＦに対するＫiが５０nＭよりも小さ な化合物であり、次の化合物が例示される。 さらに別の好ましい誘導体は、因子ＶＩＩa−ＴＦに対するＫiが５nＭよりも 小さな化合物であり、次の化合物が例示される。 有用性および製剤 血液の凝固は、セリンプロテアーゼの数種の特異的な酵素源が限定されたタン パク質加水分解によって活性化される一連の増幅反応の最終段階である。この活 性化反応の開始と伝播は、凝固の外因性経路と内因性経路を経ておこなわれる［ マッキー（Ｍackie、Ｉ．J．）およびブル（Bull、Ｈ．Ａ．）、「正常な止血と その調節」、Ｂlood Ｒeviews、第３巻、第２３７頁〜第２５０頁（１９８９年 ）参照］。両方の経路は、因子Ｘaの形成において、高度に相互依存しており、 また、収斂 性がある。因子Ｘaは血液凝固カスケードにおいては、トロンビンを生成する最 後から２番目の段階を触媒する。トロンビンは血漿内のフィブリノゲンを分裂さ せることによって血塊を形成させる。凝固の初期段階の一つは、血管の内皮細胞 が損傷されたときの組織因子の発現である。組織因子に結合した活性化因子ＶＩ Ｉ（ＶＩＩa）は因子ＩＸおよびＸを活性化させ、血液凝固の内因性経路と外因 性経路への進行を開始させることによって重要な役割を果たす。 凝固カスケードの初期段階の妨害によって、因子ＶＩＩa−ＴＦに対して強力 で選択的なこの活性化活性の阻害因子を、組織因子の発現に関係する疾患、特に 異常な止血に関係する疾患の治療薬として使用できる。例えば、因子ＶＩＩa− ＴＦの阻害因子は、血栓治療中または血管形成手術中の血管再閉塞を防止するの に使用できる。また、該阻害因子は、敗血性ショックと関係する散在性の血管内 凝固障害、特定のウイルス感染症および癌の治療にも使用できる。これについて は、組換え組織因子経路阻害因子が、エンドトキシンによって引き起される散在 性の血管内凝固障害からウキザを保護する実施例によってさらに説明する。 本発明の最も好ましい化合物は、因子ＶＩＩa−ＴＦ複合体の選択的阻害因子 である。治療患者の潜在的な止血能に最小の影響しか及ぼすことなく、病原性の 血栓形成を抑制することは該化合物の重要な特徴である。この結果、治療中の出 血性合併症の発生率は低減することになる。本発明による化合物は、阻害定数の 比、即ち、（他の酵素に対するＫi）／（因子ＶＩＩa−ＴＦ複合体に対するＫi ）の値が約１０、好ましくは約１００のとき、他のセリンプロテアーゼ（トリプ シンを除く）に比べて、因子ＶＩＩa−ＴＦ複合体に対して「選択性」があるも のとする。この場合、本発明による化合物のＫiは、因子ＶＩＩa−ＴＦ複合体並 びに他の凝固酵素、例えば、カリクレイン、因子ＸＩa、因子ＶＩＩa、因子Ｘa 、トロンビン、フィブリン溶解酵素、プラスミン、組織プラスミノゲン活性化因 子（tＰＡ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、および抗凝固酵素、タンパク質Ｃに対し て決定される。好ましくは、プラスミンまたはタンパク質Ｃに対するＫiを因子 ＶＩＩa−ＴＦ複合体のＫiと比較することによって、本発明による化合物の選択 性を評価する。こ のような利点がない場合であっても、この種の特異性を有さない本発明による阻 害因子は有用である。 本発明には、貯蔵後に投与されるように調製された薬剤組成物であって、薬学 的に有効量の前記化合物および薬学的に許容されるキャリヤーまたは希釈剤を含 有する薬剤組成物が包含される。治療用に許容されるキャリヤーまたは希釈剤は 薬学の分野においては周知であり、例えば、次の文献に記載されている:「レミ ングトン（Ｒemington）の薬科学」、マック・パブリッシング社（Ｍack Ｐubl ishing Ｃo．）、ゲンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇennaro）編、１９８５年。該薬剤組成 物には防腐剤、安定剤、色素および調味剤を配合してもよい。例えば、防腐剤と して、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp−ヒドロキシ安息香酸エステル 類を添加してもよい（上記文献、第１４４９頁参照）。さらに、抗酸化剤および 沈澱防止剤を使用してもよい（上記文献参照）。 本発明による組成物は経口投与用の錠剤、カプセルまたはエリキシル、直腸投 与用坐剤または注射投与用滅菌溶液もしくは懸濁液等として調製して使用に供し てもよい。注射用製剤は、液状の溶液もしくは懸濁液、注射前に液状の溶液もし くは懸濁液に調製するのに適した固体、または乳濁液等の常套の形態に調製して もよい。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、マンニトール、ラク トース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウムおよび塩酸システイン 等である。さらに、所望により、注射用薬剤組成物には、少量の無毒性助剤、例 えば、湿潤剤およびpＨ緩衝剤等を配合してもよい。また、所望により、吸収促 進剤、例えばリポソーム等を用いてもよい。 本発明には、異常な血栓症によって特徴づけられる病気の予防法もしくは治療 法が包含される。投与に必要な該組成物の薬学的有効量は、投与経路および処置 される哺乳類のタイプや身体的な特徴によって左右される。投与量は最適な効能 が得られるように調整されるが、体重、ダイエットおよび併用する薬剤等の要因 並びに医学の分野の当業者に認識される他の要因によって左右される。 本発明による上記方法の実施に際しては、前述の化合物もしくは組成物を単独 もしくは併用して使用してもよく、あるいは他の治療剤もしくは診断剤と併用し てもよい。これらの化合物はインビボ、通常は哺乳類、好ましくは人体で使用す ることができ、また、インビトロでも使用できる。インビボで使用する場合、該 化合物もしくは組成物は種々の方法（例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投 与、筋肉内投与、結腸内投与、直腸内投与、鼻腔内投与または腹膜内投与等）に より、種々の投与量で投与することができる。 当業者には容易に理解されるように、有効なインビボ投与量および特定の投与 方法は処理される哺乳類の年令、体重および種類、使用する特定の化合物、並び にこれらの化合物を用いる特定の用途等によって左右される。所望の効能を得る ために必要な有効投与量は当業者によって容易に決定できる。一般的には、該化 合物の投与を比較的少ない投与量から開始し、所期の効能が得られるまで投与量 を増大させてゆくことによって決定される。 本発明による化合物の投与量は所望の効能と治療上の徴候に応じて広範囲に変 化させることができる。一般的には、投与量は体重１ｋｇあたり約０.０１μg〜 １００mg、好ましくは約０.０１μg〜１０mgである。好ましい投与法は非経口投 与法、例えば、日毎の静脈内投与法である。実施例１ ： ｐＭａ５−ＰＩベクターにおけるＢＰＴＩ遺伝子の構築 化学的に合成した４つのオリゴヌクレオチドを利用して、ＢＰＴＩコード化領 域を集めた（例えば、Ｐｓｔ２０５、７４−ｍｅｒ；Ｐｓｔ２０６、７８−ｍｅ ｒ；Ｐｓｔ２０７、１０２−ｍｅｒおよびＰｓｔ２０８、１０２−ｍｅｒ；図３ を見よ）。合成した後、オリゴヌクレオチドを分取ゲル電気泳動により精製し、 酵素的にリン酸化した。その後、そのオリゴヌクレオチドを対を形成するように アニールさせた：その目的でそれぞれの適したオリゴヌクレオチド５０ｐｍｏｌ 含有混合液２０μｌを１００℃で３分間加熱し、その後その混合液を室温（約２ ０℃）まで冷やした。オリゴヌクレオチドＰｓｔ２０５およびＰｓｔ２０６をア ニールすることにより、平滑末端ＳｔｙＩ断片が得られる；同様にしてオリゴヌ クレオチドＰｓｔ２０７およびＰｓｔ２０８はＳｔｙＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を 形成する。続いて、これらの断片は一緒になって図４Ｂに示すように二本鎖ＢＰ ＴＩコード化領域全体を構成する。 受容体ｐＭｃ５−１９をＫｐｎＩ制限により開き、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク レノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片）で処理し、３′−オーバーハンギング（ｏｖｅｒ ｈａｎｇｉｎｇ）末端を切除した後、ＨｉｎｄＩＩＩ（図４Ａ；標準的な手順に より他の同等のベクターを容易に指定し、かつ使用することができる。）で消化 した。この材料は上述した２つのＢＰＴＩ断片と結合した。ｌａｃｌ^q株ＷＫ６ を結合混合物で形質転換した。このベクターを形質転換することのできるｌａｃ Ｉ^q対立形質を含有する他の大腸菌株はＪＭ１０１、７１−１８（ヤニッシュ− ペロンら、ジーン、３３：１０３〜１９９（１９８５））、またはＸＬ１−ブル ー（Ｂｌｕｅ）（バロックら、バイオテクニークス、５：３７６〜３７９（１９ ８７））を含有する。 任意に選び出した１２のＣｍ^R形質転換の制限分析に基づいて、５つのクロー ン（指定のｃ２、ｃ８、ｃ９、ｃ１０およびｃ１１）を保持した。それに続くこ れらのクローンの配列決定により、構築スキームにより予測されるｐｈｏＡシグ ナルとＢＰＴＩコード化領域との間の正確な結合を確認した；しかしながら、５ つの全てのクローンには１またはそれ以上の不必要なヌクレオチド置換体が含ま れていることがわかった。クローンｃ９（結果的にＡｓｎ４３Ｌｙｓアミノ酸置 換となるＣ−＞Ａ置換を含有する）およびｃ１０（結果的にＬｅｕからＶａｌへ の変異となるＣ−＞Ｇ置換を含有する）は、野生型ＢＰＴＩをコード化するベク ターを構築するのに用いられた。この目的でｃ９の小さなＥｃｏＲＩ／ＳｔｙＩ 断片およびｃ１０の小さなＳｔｙＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の両方をポリアクリル アミドゲルより精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＭａ５− ８に結合した。正確な制限パターンを示している得られたクローンのうちの１つ を保持した。このクローンは、配列決定により、意図したＢＰＴＩコード化領域 を含むことが示され、これをｐＭａ５−ＰＩと称した。変異体を構築するために 、相補的ｐＭｃ−ＰＩも構築した。後者のベクターはＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ（Ｘ ｂａＩ部位はＨｉｎｄＩＩＩ部位のすぐ下に存在する；図４を見よ）発現カセッ トをｐＭａ５−ＰＩからｐＭｃ５−８に転移することにより得た。 Ｐ_tacプロモーターの抑制解除に際して、ｐＭａ５−ＰＩまたはｐＭｃ５−Ｐ Ｉのいずれかを有するＷＫ６細胞は、トリプシン抑制活性の出現により示される ように、ＢＰＴＩの合成を支配することがわかった。この活性は浸透ショックに よりなくなり、ＢＰＴＩが細胞周辺腔に蓄積することを示した。その発現レベル は非常に低いため、総細胞抽出物のゲル電気泳動の分画に続くクマシー染色によ り蛋白質を視覚化することはできなかった。この活性測定値から、ＢＰＴＩ蛋白 質のレベルは培地１リッターあたり約１ｍｇになることが計算で求められた（Ｏ Ｄ_600nm＝±４）。ここで報告された生成物レベルを、同様の発現系を用いて他 者により見いだされたレベルと比較することができる。マークスら、ジェイ・バ イオル・ケム、２６１：７１１５〜７１１８（１９８６）およびゴールデンバー グら、バイオケミストリー、２７：２４８１〜２４８９（１９８８）。精製（以 下を見よ）後、組換えＢＰＴＩはＮ−末端配列に処した。その結果は、ｐｈｏＡ −ＢＰＴＩ前駆体が正しい手順を経ているということを示す。実施例２ ： 部位特異的変異誘発処理によるＢＰＴＩ誘導分子の遺伝子コード化 一般的手法構築 ｐＭａ／ｃ５−１９ベクターに含まれるＢＰＴＩ遺伝子の野生型または変異形 態を部位特異的変異誘発処理することにより、本発明によるインヒビターを得る ことができる。部位特異的変異誘発処理の一般的なプロトコールには以下の６工 程が含まれている。 １． 一本鎖ＤＮＡの調製 ｐＭａ５−ＰＩ、ｐＭｃ５−ＰＩまたは適切な誘導体（１００μｇ／ｍｌアン ピシリンまたは２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを追加したＬＢ培地中、３ ７℃で成育した）を含むＷＫ６細胞の一夜培地を、抗生物質を含有しない新鮮な 培地で１：５０に希釈した。細胞を濃度約２×１０⁸／ｍｌまで増殖させ、ヘル パーファージＭ１３ＫＯ７（ビエイラら、メソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１５３：３〜１１（１９８７） ）で感染多重度２０にて感染させた。５〜１６時間インキュベートした後、ウイ ルスおよび疑似ウイルス粒子を上澄みから回収し、本質的にはサムブルックら、 モレキュラー・クローング−Ａラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ｐ．４．２９（１９８９））で 記載されているようにして一本鎖ＤＮＡを抽出した。その収量（一般的には１〜 ４μｇ／ｍｌ培地）を紫外分光法により決定した（ε_260nm＝２．８６×１０^-2 ｃｍ²／μｇ）。 ２． ＤＮＡ断片の調製 ｐＭｃ５−ＰＩまたはｐＭａ５−ＰＩプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩＩ およびＳｐｈＩ（両方の制限部位は独特であり、これを図４に示す）で完全に消 化した。その大きな断片を本質的にはヴァイスランダー（Ｗｅｉｓｌａｎｄｅｒ ）、エル（Ｌ．）、アナル・バイオケム（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、９８： ３０５〜３０９（１９７９）に記載されているようにして、低融点アガロースゲ ルから回収した。既知量のＤＮＡのバンド強度と比較して、エチジウムブロミド で染色したアガロースゲル上で断片の収量を定量した。 ３． ギャップ二重ＤＮＡ（ｇｄＤＮＡ）の構築 工程２で述べた大きなゲル精製ＳａｃＩＩ／ＳｐｈＩ断片、および工程１から の一本鎖形態の相補的ベクターの変質／再生によりｇｄＤＮＡを得た。断片（０ .１ｐｍｏｌ）と一本鎖ＤＮＡ（０．５ｐｍｏｌ）のＡ３５μｌ水性混合物（２ ｍＭ未満の塩を含有する）を７０℃で５分間培養した；次いで、７０℃の１．５ ＭＫＣｌ／１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５μｌを添加し、その混合 物を室温まで冷却した。アガロースゲル上のハイブリダイゼーション混合物の１ アリコートの電気泳動により、ｇｄＤＮＡの生成を監視した。ｇｄＤＮＡの移動 度は、緩和完全二本鎖ｐＭａ５−ＰＩの移動度と区別することができなかった。 ４． 変異誘発オリゴヌクレオチドのアニールおよびギャップ充填／密封反応 合成オリゴヌクレオチドにより目的のアミノ酸を置換した。 そのオリゴヌクレオチドを酵素でリン酸化し、分取ゲル電気泳動により精製し た。ヴ（Ｗｕ）ら、オリゴヌクレオチド・シンセシス−ａ・プラクティカル・ア プローチ、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、オクスフォー ドおよびワシントンＤＣ、ｐｐ．１３５〜１５１（エディット・ガイト（Ｅｄｉ ｔ．Ｇａｉｔ）、Ｍ．Ｊ．１９８４）。 オリゴヌクレオチド１０ピコモルをｇｄＤＮＡ含有のハイブリダイゼーション 混合物８μｌに添加した。この混合物を６５℃で５分間加熱した後、室温まで冷 却した。１０倍希釈緩衝液（６２５ｍＭ ＫＣＩ、２７５ｍＭ トリス−ＨＣＩ 、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰおよび４つのｄ Ｎ ＴＰ′ｓそれぞれ０．２５ｍＭ、ｐＨ７．５）４μｌを水で最終的に体積が４０ μｌに調節し、ＤＮＡポリメラーゼＩ１ユニット（クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断 片）、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ５ユニットを添加した。その混合物を室温で４ ５分間培養した。 ５． 形質転換および分離 ポリメラーゼ／リガーゼ反応混合物のアリコート（５μｌ）を用いて、菌株Ｗ Ｋ６ｍｕｔＳを形質転換させた。ツェル（Ｚｅｌｌ）ら、ジ・エンボ・ジャーナ ル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）、６：１８０９〜１８１５（１９８７ ）。その形質転換混合物のアリコート（１／１０）を培地（２５μｇ／ｍｌクロ ラムフェニコールまたは１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を選んで流し、形質転 換効率を測定した；通常、１００〜１０００個の形質転換細胞が得られた。残り の形質転換混合物を用いて、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールまたは１００ μｇ／ｍｌアンピシリンを追加したＬＢ培地１０ｍｌに接種した。一夜増殖させ た後、プラスミドＤＮＡを単離し、これを用いてｓｕ^-菌株ＷＫ６（ツェルら、ｓｕｐｒａ ）を形質転換させ、再度適切な抗生物質耐性を選択した。 ６． 目的変異体の同定 任意に採出した二、三のクローンの一本鎖ＤＮＡ（工程１に従って調製した） を配列した。変異体のコード化領域全体の配列決定は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ とＢＰＴＩコード化領域のすぐ下のベクター配列にアニールするシングル・プラ イマー（図４）とを用いる、ターバーおよびリチャードソンのジデオキシ・チェ イン・ターミネーション法、米国特許第４，９９４，３７２号、に従って行った 。インヒビター８２ｃ５をコード化するｐＭｃ５ＰＩ８２ｃ５の構築 本発明による幾つかのインヒビターは突然変異誘発を何回か繰り返した後に得 られ、中間体の構築が発現される間、中断される。そしてコード化蛋白質を精製 し、分析した。これらと同じ変異は、異なった親遺伝子と異なったオリゴスクレ オチドを用いることにより、より少数の繰り返しまたは異なった配列順序で導入 することができる。それゆえに、以下に示される実施例は単に蛋白質の技術的な サイクルを説明するものであって、限定的に解釈すべきではない。中間体として 用いられる幾つかのベクターも、本発明によるファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒ ビターをコード化する。下記の表は、オリゴスクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、およ びベクターを用いる８２ｃ５変異体の構築を示す。 ^★ 変異体ＢＰＴＩは本発明によるファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒビタ ーであることを示す。 ^a このベクターは機能性変異体ＢＰＴＩをコード化しない。７ｂｐ削除 により、幾つかの隣接塩基と同様にコドン３９を除去する。これは、ＡからＴの 置換と合わせて、独自のＡｆｌＩＩ制限部位を作り出す。コード化領域が回復す る場合（ｐＭａ５ＰＩ５６ｃ１およびｐＭａ５ＰＩ５２ｃ１９の構築）、ＷＫ６ の形質転換（前述の工程５）前のＷＫ６ｍｕｔＳ形質転換細胞から単離したプラ スミドＤＮＡのＡｆｌＩＩ消化により、全ての非変異体子孫を効果的に排除する 。インヒビター９５ｃ１２をコード化するｐＭａ５ＰＩ９５ｃ１２の構築 下記の表は、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、およびベクターを用いる９ ５ｃ１２変異体の構築を示す。 ^b 変性オリゴスクレオチドＰｓｔ３０２は以下のコドンの導入に対して 設計された：ＡＡＧ、Ｌｙｓ；ＡＡＴ、Ａｓｎ；ＧＡＧ、Ｇｌｕ；ＧＡＴ、Ａｓ ｐ；ＣＡＧ，Ｇｌｎ；ＣＡＴ、Ｈｉｓ；ＴＡＴ、ＴｙｒおよびＴＡＧ、アンバー 終止コドン。 ^★ 変異体ＢＰＴＩは本発明によるファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒビタ ーであることを示す。突然変異誘発オリゴスクレオチド 上で挙げられたベクターの構築に用いられた突然変異誘発オリゴスクレオチド の配列は、下記の表で示される： 実施例３： 大腸菌から組換えＢＰＴＩ誘導インヒビターの精製 大腸菌細胞を、バッフル・フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋｓ）中クロ ラムフェニコールまたはアンピシリン（含有する型のベクターが必要とする場合 、ｐＭａ５はアンピシリンを、ｐＭｃ５はクロラムフェニコールを必要とする） を含有するＬＢ培地２５０ｍｌで３７℃にて増殖させた。ＩＰＴＧ０．１ｍＭの 添加により３時間後に細胞が誘発し、一夜増殖した。大腸菌細胞の溶解はマーク ス、シー・ビー（Ｃ．Ｂ．）ら、ジェイ・バイオロ・ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．）２６１：７１１５〜７１１８（１９８６）で記載されたのと同様に行っ た。湿った細胞約１ｇを、２０％スクロースおよび５０ｍＭ ＥＤＴＡを含有す るｐＨ８の４０ｍＭトリス緩衝液１．５ｍｌに懸濁させた。リゾチーム２．５ｍ ｇを添加した後、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ １．１５ｍｌ およびＮａＣｌ（５Ｍ）０．３ｍｌを添加した。室温で１５分経過後、ｐＨ７． ８の２００ｍＭ ＴＥＡ緩衝液２．５ｍｌを添加した後、ＣａＣｌ₂（１Ｍ）０． １５ｍｌおよびＭｇＣｌ₂（１Ｍ）０．１ｍｌおよびＤＮＡｓｅＩ １０μｇを 更に添加した。その懸濁液を２５℃にて２０分間撹拌した。大部分の蛋白質が２ ％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加することにより沈澱し、遠心分離することに より除去した。さらに精製するために、ＴＣＡの上澄みをＮａＯＨ添加により中 和した。 ある特定の精製方法は以下の工程からなる： １． ＴＣＡの上澄みをｐＨを４．０に、伝導度を５ｍＳ／ｃｍ以下にそれそ れ氷酢酸およびＭｉｌｌｉＱ（試薬等級）水で調節した。その希釈したＴＣＡの 上澄みを濾過した。 ２． エス（Ｓ）−セファロース・ファスト・フロー（１０×１００ｍｍ）の カチオン交換クロマトグラフィーを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化し、０〜 １ＭＮａＣｌ（流速１ｍｌ／分）の線状勾配４０ｍｌで溶出させた。ファクター ＶＩＩ−ＴＦインヒビター（実施例７に記載されるアミドリチック・アッセイ（ ｔｈｅ ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｓｓａｙ）を用いて決定される）を含有する フラクションを採取し、貯蔵した。 ３． 貯蔵したフラクションをビダック・リバース・フェイズ（Ｖｙｄａｃ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ）Ｃ１８カラムに注入し、０．１％ＴＦＡ中の１０ ％〜４５％アセトニトリルの２０分勾配（１ｍｌ／分）で溶出させた。 ４． 凍結乾燥。 別の精製方法は以下の工程を含む： １． トリプシン−セファロースの親和性クロマトグラフィーを、ｐＨ７．８ の１００ｍＭ ＴＥＡ、３００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し、ｐＨ７．８の１００ｍ Ｍ ＴＥＡ５カラム体積、３００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、２０ｍＭ ＨＣｌ、ｐ Ｈ１．８の５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出させた。 ２． ｐＨ５の１０〜５００ｍＭ酢酸アンモニウムの線状勾配１０カラム体積 を用いる、モノ−エス（Ｍｏｎｏ−Ｓ）のカチオン交換クロマトグラフィー。 ３． ＨＰＬＣ Ｃ４カラムのリバース・フェイズ・クロマトグラフィー、０ ．１％ＴＦＡ中、イソプロパノール０〜３５％勾配での溶出。 ４． 凍結乾燥。実施例４ ： トリプシン、ファクタ−Ｘａ、トロンビン、ファクタ−ＸＩＩａの 酵素アッセイ、およびプラズミン・アミドリチック・アッセイ 以下のアッセイは、本発明による有用なインヒビター、つまり低いファクター ＶＩＩａ−ＴＦＫ_i、および好ましくは他の酵素に対して相対的に高いＫ_iを有す るインヒビター、を決定するのに役に立つ。 簡単に言えば、以下のものを９６−ウェル・マイクロタイター・プレート・ウ ェル（下の表を見よ）に添加した：ＴＢＳＡ５０μｌ（ｐＨ７．４の１００ｍＭ トリス、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ）；インヒビター５０μｌ（Ｔ ＢＳＡで希釈される、必要な様々な濃度のもの）；プロテアーゼ５０μｌ（ＴＢ ＳＡで希釈され適切な濃度のもの）。そのプレートを室温で３０分間または２時 間培養した（ファクターＸａ）；色素生成基質５０μｌを添加した（必要なら水 で希釈する）。室温で１０〜３０分間４０５〜６５０ｎＭで、その初速度を測定 し た。 「ｐＮＡ」は、パラ−ニトロフェニルアニリドを示す 「Ｃｂｏ」は、ベンジルオキシカルボニルを示す 「Ｂｚ」は、ベンゾイルを示す 抑制定数を決定するために、様々なインヒビター（［Ｉ_t］）および基質濃度 で初速度（ｖ_i）を測定して、それぞれの基質濃度で得られたデータを以下の式 に代入することにより、みかけの抑制定数を決定した： V_i/V_o = {([E_t] - [I_t] - K_i ^★) + [([I_t] + K_i ^★ - [E_t])² + 4K_i ^★[E_t]}^1/2}/2[E_t] 式中、ｖ_oは抑制されない初速度であり、［Ｅ_t］は酵素の総濃度である。基質濃 度を０として、Ｋ_i ^★値を推定することにより、真の抑制定数の値が得られた。ファクターＶＩＩａのためのアミドリチック・アッセイ 同体積のファクターＶＩＩａ（０．８％ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＣａＣｌ₂を含 有するＴＢＳ中１０ｎＭ）および組織ファクター（０．０３％トリトンＸ−１０ ０を含有するＴＢＳ中４０ｎＭ）を合わせて、室温で３０分間培養した。ＶＩＩ ａ／ＴＦ複合体１００μｌをインヒビター５０μｌと混合し、３０分間培養した 。反応は基質、一般的には０．４ｍＭ Ｓ−２２８８（Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａ ｒｇ−ｐＮＡ）、を添加することにより開始され、生成物形成の初速度を決定し た。抑制定数（Ｋ_i）を上の式から決定した。活性蛋白質Ｃのためのアミドリティック・アッセイ 再構成凍結乾燥ヒト正常皿漿を蛋白質Ｃ源として用いた。酵素（Ｋａｂｉ）を 活性化する蛋白質Ｃを希釈した血漿に添加し、活性蛋白質Ｃ濃度およそ５ｎＭを 得た。活性蛋白質Ｃ溶液５０μｌをＴＢＳＡ１００μｌまたはＴＢＳＡ中に希釈 したインヒビターと合わせ、３７℃で３０分間培養した。２ｍＭＳ−２３６６（ ＜Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）５０μｌを添加し、生成物形成の初速度を 、マイクロタイター・プレート・リーダー（ｒｅａｄｅｒ）で４０５ｎｍにて測 定した。インヒビターの総濃度（［Ｉ_t］）が酵素の総濃度を越える場合、抑制 定数を下式から決定した： ｖ。／ｖ_i＝１＋［Ｉ_t］／Ｋ_i 典型的なインヒビター濃度は０．５と５μＭの間で変化する。 実施例５： 選択ファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒビターに対する抑制定数 幾つかの変異体ＢＰＴＩファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒビターを、実施例２ で記載された方法を用い部位特異的変異処理により製造するかまたは実施例７で 記載される任意のライブラリーから入手した。これらの変異体ＢＰＴＩファクタ −ＶＩＩａ−ＴＦインヒビターを、大腸菌で生産し、実施例３と同様にして精製 した。実施例４と同様にして酵素的手法を用いて、ファクタ−ＶＩＩａ−ＴＦを 含有する幾つかのセリンプロテアーゼに対する抑制定数を決定した。選択インヒ ビターのファクターＶＩＩａ−ＴＦに対する抑制定数は下のように与えられる。 実施例６： ＢＰＴＩ誘導ファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒビターの選択性 ファクターＶＩＩａ−ＴＦの前述のインヒビターの選択性は、治療患者の止血 ポテンシャルの最小の効果をもって発病学的トロンボシスの発症を抑制するとい う能力に関し、これらの化合物の重要な特徴である。この結果、治療期間は出血 性合併症の出現率が減少する。凝固がカスケード的に増幅するという性質を考え る場合、トロンビンおよびファクターＸａに対してファクターＶＩＩａ−ＴＦを 特異的に抑制するという作用の重要性は明らかである。それゆえに、臨床的に適 切な抗血栓効果を得るために必要な選択性ファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒビタ ーの投薬量は、同じ効能を有するトロンビンインヒビターまたはファクターＸａ のインヒビターよりもかなり少ないであろう。全体的に見て、凝固カスケードに おける個々の酵素に対するインヒビターの選択性が大きければ大きいほど、治療 期間中に望ましくない副作用が起こるおそれが少なくなる。 ８２ｃ５と名付けられたファクターＶＩＩａ−ＴＦインヒビターはＢＰＴＩ中 に、以下の置換を含有する：１Ａｌａ １１Ａｓｐ １５Ａｒｇ １７Ｉｌｅ１ ９Ｌｙｓ ３９Ｐｈｅ ４６Ｇｌｕ。インヒビター８２ｃ５は、低いナノモル範 囲にある抑制定数でファクターＶＩＩａ−ＴＦを抑制する。それは、生理学的な 条件下で、準可逆的な結合性をするファクターＶＩＩａ−ＴＦのゆるやかで強い 結合インヒビターである。 ８２ｃ５のファクターＶＩＩａ−ＴＦに対する選択性はファクターＸａに対す る時の約１００倍である。トロンビンおよび活性蛋白質Ｃは、ファクターＶＩＩ ａ−ＴＦについてのＫ_i値周辺の濃度では８２ｃ５により抑制されない。 ＢＰＴＩと同様に、８２ｃ５は有効なトリプシンインヒビターである。トリプ シンが特異的プロテアーゼでないため、これは予想外のことではない；その抑制 プロフィールは、周りの残基の耐性に多大の影響力を有するＰ１残基（Ａｒｇま たはＬｙｓ）により大きく決定される。 プラズミンはフィブリン凝塊を分解するため、血栓崩壊中重大な役をつとめて いる。しかしながら、プラズミンは血栓崩壊治中によく遭遇する出血の問題と関 連があると信じられてもいる。非常に効果的なプラズミンインヒビターであるア プロチニン（ＢＰＴＩ）を管理することにより、出血を減少させることができる 。ＢＰＴＩと比較して、抑制定数約１００ｎＭの８２ｃ５のプラズミンに対する 親和性は約１０００倍低下する。重要なファクターＶＩＩａ−ＴＦ抑制を維持す る一方で、本発明による他のＢＰＴＩ変異体はプラズミン活性を実質的に低下さ せた。 実施例７： ファージ・ライブラリーの基本構成の構築 方法によっては因子ＶＩＩａ−ＴＦインヒビターの選定の有ることを考慮して 、突然変異ＢＰＴＩ遺伝子をfd−tetのごとき繊維状イ・コリ・ファージのＰ− ＩＩＩコート・プロテインに融合した。ザッヒャーＩＩＩらのジーン９： １２ ７−１４０（１９８０）。 図５はpＭa５−ＰＩの構築のために使用される種々のオリゴヌクレオチドのＤ ＮＡ配列を示している。 クンケルの方法はジーンＩＩＩ変異細胞（ＩＩＩ）をオリゴヌクレオチド指向 突然変異誘発によって加工するために使用された。クンケル著Ｐroc．Ｎatl．Ａ cad．Ｓci．ＵＳＡ ８２:４８８−４９２（１９８５）。 分泌シグナル ＢspＭＩＩ ＫasＩ 成熟Ｐ−ＩＩＩ （配列ＩＤ Ｎo．１２） この方法ではＢＰＴＩ遺伝子（上述のpＭa／c５−ＰＩベクターからの）または 適当なＢＰＴＩ誘導遺伝子を上述のＢspＭＩＩ−ＫasＩフラグメントのごとく構 成ＩＩＩ中に導入した。 ２Ｌと称されるライブラリーの構築 ＢＰＴＩの１５から２０個のアミノ酸残基をランダムに突然変異誘発させるた めに、フレームシフトと共にＰstＩとＡpaＩ部位を担持するＢＰＴＩ−誘導遺伝 子を含む新しいベクターpＭc５−ＰＩ２８c５を構築した。 この２８c５突然変異遺伝子は以下のオリゴヌクレオチドを使用して構築した 。 ２８c５突然変異遺伝子を有するファージはfd−２８c５と呼ばれる。このフレ ームシフトは突然変異誘発オリゴヌクレオチドがfd−２８c５中に挿入されたと き修正された。この方法ではオリゴヌクレオチドが不完全に挿入されたときは野 性型ＢＰＴＩ−発現ファージの大きなバックグラウンドが避けられる。 fd−２８c５に挿入された突然変異誘発オリゴヌクレオチド（Ｐst２４０）は （ＩＶ）: （配列 ＩＤ Ｎo．１５） （式中、ＲはＡとＧとの等モル混合物; ＮはＧ、Ａ、ＴおよびＣのいずれか； およびＫはＧおよびＴのいずれかである）で示される退化コード化配列を含む。 これはＬys１５がＡrgまたはＬysで、Ａla１６、Ａ1a１７、Ｉle１８、Ｉle１ ９、Ａrg２０が２０個の天然アミノ酸のいずれかで置換されていてもよい。 突然変異誘発オリゴヌクレオチド（ＰＳＴ２４０）と第２の重複オリゴヌクレ オチド（ＰＳＴ２４１、Ｖ）はＴaq−ポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡフラグ メントに変えた。 （配列ＩＤ Ｎo．１６） ＡpaＩとＰstＩでの消化に次いで突然変異誘発フラグメントをfd−２８c５置 換型ＤＮＡの巨大ゲル−精製ＡpaＩ−ＰstＩフラグメントに連結した。連結試料 をＷＫ６大腸菌細胞を電気穿孔するために使用した。テトラサイクリン１０μｇ ／mＬを加えたＬＢプレート上で形質転換細胞を選択した。 （a） ３Ｌ−ライブラリーの構築 このライブラリーはＢＰＴＩ中の幾つかの固定アミノ酸置換体、即ちＰro１３ Ｉle、Ｌys１５Ａrg、Ａrg３９ＬeuおよびＬys４６Ｇluを含む。加えて１６から １９位には全ての可能なアミノ酸残基が見られる。新しいベクター、pＭa５−Ｐ １８９をＰst３４４を用いたpＭc５−ＰＩ４c２のオリゴヌクレオチド仲介突然 変異誘発により構築した。 新しいベクターpＭa５−ＰＩ８９は以下のＢＰＴＩ誘導配列を含む。 このベクター中のＢspＭＩＩ−ＫasＩフラグメントのファージ・ゲノム（第１ ３〜１４頁に記載したごとき加工遺伝子変異株ＩＩＩ）への伝達はfd−８９をも たらす。ＶＩの配列はフレーム・シフトの存在の故に機能プロテインに対しては コードしない。ヌクレオチド３５および６５間の配列は突然変異誘発オリゴヌク レオチドの容易な挿入および親ファージ（ＦspＩ）に対する対抗選択のための制 限部位（ＢbsＩ）を提供する。ライブラリーの構築は突然変異誘発オリゴヌクレ オチドＰst３４５によってfd−８９の小さなＢbsＩフラグメントの置換を含む。 このクローニングは（ＶＩ）に示された２個の翻訳領域をフレーム内にもたらす 。突然変異誘発オリゴヌクレオチドは退化コード化配列を含み、そこではＮはＧ 、Ａ、ＴおよびＣのいずれかであり、およびＫはＧおよびＴのいずれかである。 Ｐst３４５を２個の"ハーフ−サイト"オリゴヌクレオチド（Ｐst３４６および Ｐst３４７以下参照）にハイブリダイズし、（ＶＩ）に示されるＢbsＩに対して 相補的な付着末端（cohesive termini）を形成した。２個のＢbsＩ部位の開裂 は非相補的付着末端（cohesive ends）を作るので、適当に配向した突然変異誘 発フラグメントの挿入が確保される。突然変異誘発オリゴヌクレオチドを挿入す るために使用される条件は本質的にはＣwirlaらのＰroc． Ｎatl．Ａcad．Ｓci ．ＵＳＡ：８７， ６３７８−６３８２， １９９０に記載されている。連結Ｄ ＮＡを電気穿孔法によって大腸菌 ＷＫ６２（自発的に生じたＷＫ６のＦ^-誘導 体）に形質転換された。形質転換はテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上で行 った。 ５Ｌ−ライブラリーの構築 意図されたライブラリーは以下の置換体を含む。 位置 11:Xxx（=全ての可能な残基） 13:Xxx 15:Arg 17:Leu/Ile 18:His 19:Lys/Asn/Thr/Met/Ile/Gln/His/Pro/Leu 34:Xxx 39:Xxx 46:Glu 突然変異誘発オリゴヌクレオチド、Ｐst３７４およびＰst３７５は以下の一つ のレター・コードで示される退化配列をふくむ： ＮはＧ、Ａ、ＴおよびＣのいずれかである。 ＨはＡ、ＴおよびＣのいずれかである。 ＤはＡ、ＴおよびＧのいずれかである。 ＳはＧおよびＣのいずれかである。 ＭはＡおよびＣのいずれかである。 ＫはＧおよびＴのいずれかである。 オリゴヌクレオチドＰst３７４とＰst３７５をアニーリングしてＸhoＩとＥag Ｉ付着末端（cohesive termini）を有する２本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。 このフラグメントを連結してfd−８９（ＶＩ）の巨大ゲル−精製ＸhoＩ−ＥagＩ フラグメントとした。連結ＤＮＡを電気穿孔法によって、大腸菌ＷＫ６２（自発 的に 生じたＷＫ６のＦ^-誘導体）に形質転換した。形質転換細胞をテトラサイクリン 含有ＬＢ寒天上で培養した。実施例８ ：その表面上へファクターVIIａ-ＴＦインヒビターを発現するファージ のパニング 図６に於いては、ある特定のパニングプロトコルでは、変異体ＢＰＴＩ分子を その表面上に発現するファージの懸濁液をファクターVIIａ-ＴＦと一緒にインキ ュベートした。ファクターVIIａ-ＴＦに結合したファージを、アガロースに結合 した非中和抗-VIIａモノクローナル抗体によって他のファージと分離した。２Ｌ ライブラリーのパニング用に次の方法を用いた。 プレートからテトラサイクリン抵抗性トランスフォーマントを掻き落とすこと により変異体ＢＰＴＩ-ファージを単離した。細胞懸濁液（ＬＢ媒体）を遠心分 離により２回精製し、ＰＥＧ沈殿により浮遊物からファージを回収した。ファー ジの粒をＴＢＳ（ＴＲＩＳで緩衝した生理食塩水、ｐＨ７.４）中に再懸濁した 。約１０¹⁰個の感染粒子（０.５ｍｌ）を２００ｎＭのファクターVIIａ（ＮＯＶ Ｏ社製）、４００ｎＭの組織ファクター（コーバス（Ｃｏｒｂａｓ）社製）、１ ０ｍＭのＣａＣｌ₂、ＴＢＳ中の０.５％濃度ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０と混 合した。懸濁液を室温で１時間インキュベートした。ＣＮＢｒ-活性化したセフ ァローズＣ１４Ｂ上に固定化した抗−VIIａ-Ｍａｂの０.１８ｍｇ懸濁液の０.１ ｍｌを添加し、更に室温で１時間インキュベートした。遠心分離によってゲルを 除去し、０.５％のツウィーンを含む１ｍｌのＴＢＳと５ｍＭのＣａＣｌ₂で１０ 回洗浄した。結合ファージを０.１５ＭのＮａＣｌ、０.０５％のＢＳＡ、０.５ ％のツウィーンおよび５ｍＭのＣａＣｌ₂を含む０.１Ｎの塩酸／グリシン（ｐＨ ２）の０.５ｍｌで２回溶出した。溶出したファージを、１ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ ８）を添加して中和し、菌株ＷＫ６を植え付け、テトラサイクリン抵抗性コロニ ーを塗布して増殖した。クワーラ、エス・イー（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ.Ｅ.）他著、 「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス ユー・エ ス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、第８７巻、第 ６３ ７８−６３８２頁（１９９０年）。ファージを上記のようにして回収し、２５ｎ Ｍおよび１ｎＭのファクターVIIａを用いてインキュベートした以外は上記の方 法でパニング-増殖工程を２回繰り返した。２および３ラウンドのパニングを行 った後、ファージＤＮＡを精製し、標準法により配列を決定した。サンブルック （Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他著、「モレキュラー・クローニング−ア・ラボラトリー ・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１ ９８９年、第４.２９頁。テイバーおよびリチャードソン（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）著、米国特許第4,994,372号明細書。選ばれたファージ のクローンについて、実施例４に記載したファクターVIIａ−ＴＦのアミド分解 活性の妨害性を試験した。 もうひとつの好ましいパニングプロトコルでは、ファージを過剰の組織ファク ター（０.５％のツウィーン２０を含むＴＢＳと５ｍＭのＣａＣｌ₂）の存在下で ビオチンを結合したファクターVIIａとともにインキュベートした。ファクターV IIａ-ＴＦに結合したファージを、ストレプトアビジンを被覆した磁化性ビーズ （ダイナル（Ｄｙｎａｌ））にビオチンを結合したファクターVIIａを結合する ことによって分離し、上記のように低ｐＨで溶出した。ファクターVIIａは、実 質的にメーカー（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））の指示にしたがって ビオチン-ＸＸ-ＮＨＳを用いてビオチンを結合した。この方法は１０ｎＭのファ クターVIIａを用いて３Ｌライブラリーを３ラウンドパニングするために用いた 。ビオチンを結合したファクターVIIａは５Ｌライブラリーのパニングのために も使用し、ひとつの実験では１０ｎＭのファクターVIIａを用いて３ラウンド行 い、第２の実験ではファクターVIIａを１０ｎＭ用いて２ラウンド行った後１ｎ Ｍを用いて１ラウンドを行った。実施例９ ：ファクターVIIａを指定した（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）非中和モノクロー ナル抗体の同定および精製 必要とするモノクローナル抗体のハイブリドーマの調製および同定は、ハーロ ー、イー（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ.）他著「アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マ ニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」 、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８年）の中の例に記載されてい る標準法を用いて行う。これらの抗体は上記の方法で使用するにおいて有用であ る。 プールした（ｐｏｏｌｅｄ）人の血漿から単離した精製人ファクターVIIａで 雌のＢＡＬＢ／ｃ系ハツカネズミに免疫を付与する。完全フロイントアジュバン トを第１次免疫付与のために使用し、不完全フロイントアジュバントを二次免疫 注射による免疫付与のために使用する。免疫付与の経路は腹腔内および皮下の両 方である。融合前の３日間、ハツカネズミに、生理食塩水中の精製ファクターVI Iａによる静脈内潅流注射を施す。脾臓を取り出し、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄 腫に融合し、次いで標準ハイブリドーマ法にかけた。 ファクターVIIａ-の酵素活性の妨害を受けずにファクターVIIａ抗原と反応す るハイブリドーマ抗体を同定するためにスクリーニングを行った。簡略的には、 ９６ウエル（ｗｅｌｌ）のポリ塩化ビニル製ミクロタイタープレートをアフィニ ティー精製したヤギの抗-ハツカネズミＩｇＧ（例えば、シグマ・ケミカル・コ ンパニー社（セント・ルイス、ミズーリ）の商品）で受動被覆した。抗体被覆プ レートを子牛アルブミンで遮断し、培養した浮遊物（少なくとも１：５０に希釈 して）をプレートに固定する。プレートを洗浄して結合していない抗体を取り除 き、ファクターVIIａを加えてからインキュベートする。プレートを洗浄して結 合していないファクターVIIａを取り除く。ネガティブのコントロールとしては 無関係なモノクローナル抗体を分泌する細胞系から得られるハイブリドーマ培養 浮遊物、滅菌培養媒体および緩衝物質が含まれる。 精製したモノクローナル抗体にはファクターVIIａ−ＴＦの妨害作用がないこ とが実施例４に記載の発色アッセイを用いて確認されている。 モノクローナル抗体を上記のように使用するために、これをメーカーの指示に したがって、ＣＮＢｒ−活性化セファローズＣＬ４Ｂ上に固定化する。この固定 化に先立って、イミュノグロブリンＩｇＧを、メーカーの指示にしたがってバイ オラッド・ラボラトリーズのマップス（ＭＡＰＳ）IIシステムを用いて、問題の ハツカネズミハイブリドーマ細胞系を含むハツカネズミの腹水症の腹水から精製 する。実施例１０ ：メチロトロフィック・イースト・ピチア・パストリス（Ｍｅｔｈｙ ｌｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中での８２ ｃ５分泌ベクターの構築および発現 ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のメタノール利用経 路での第１の酵素であるアルコールオキシダーゼはメタノール中で発育する間に 約３０％の可溶性細胞蛋白質を構築する。これに対し、この酵母が、グルコース またはグリセロールのような抑制性（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ） -炭素源の過剰 量の存在下で増殖する場合は、アルコールオキシダーゼは存在しない。メタノー ル利用経路のいくつかの遺伝子はクローン化され、特性が評価されてきた。これ らのメタノール誘導性プロモーターの部位が配列決定され、種々の発現ベクター を構築するために用いられてきた。 ピチア菌体ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）および大腸菌−ピチア（Ｅ．ｃｏｌｉ− Ｐｉｃｈｉａ）シャトル・ベクターｐＨＩＬＳ１およびｐＨＩＬＤ４（この後で 説明される）はピチア・イースト発現系の一部であり、フィリップス・ペトロリ アム・カンパニー（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ）か らライセンスされたものである。 電気泳動、多量複写要素（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）のス クリーニング、メタノール利用（Ｍｕｔ）表現型の決定および発酵を含むすべて の酵母操作はフィリップス・ペトロリアム・カンパニーから提供された操作マニ ュアルにしたがって行った。 ｐＨＩＬＳ１プラスミド（図７）は次のピチア・パストリス要素を含んでいる ： １）５’ＡＯＸ１、Ｘｈｏ１、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩクロ ーニング部位を持つＰＨ０１シグナルペプチドに融合したアルコールオキシダー ゼ約１０００ｂｐのセグメント。 ２）３’ＡＯＸ１、アルコールオキシダーゼ末端配列の約２５６ｂｐのセグ メント。 ３）ホストＧＴＳ１１５中で不完全ｈｉｓ４遺伝子を補完するために、２． ４ｋｂフラグメント上に含まれるピチア・パストリスヒスチジノールデヒドロゲ ナーゼ遺伝子、ＨＩＳ４。 ４）部位指定融合のために５’ＡＯＸ１部位とともに必要とされる３'ＡＯ ＸＩＤＮＡの部位。 このベクター中では、ＰＨ０１分泌シグナルのＡＴＧ開始コドンはＡＯＸ１遺 伝子のＡＴＧと同じ位置で正確にＡＯＸ１プロモーターの下流に位置している。 ＰＨ０１シグナル配列と５'ＡＯＸ１及び３'ＡＯＸ１配列との間の結合は次の ようである： 更なる操作（クローニング、部位-指定変異誘発）を可能にするために、「発現 カセット」として後述のｐＨＩＬＳ１ベクターの小さいＳａｃｌ−Ｘｂａｌフラ グメントをＳａｃｌ-Ｘｂａｌにより消化されたｐＭｃ５-１９上で変換してｐＭ ｃ５-ｐｐＳ１を得た。ＰＨＯ１分泌シグナルの後に部位指定された変異誘発に よってＳａｃIIｎｏ制限部位を導入し、このシグナルへの非相同遺伝子のフレー ム融合を可能にした。生成した配列は次の通りである： ＳａｃIIにより消化し、クレノフ処理（Ｋｌｅｎｏｖ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に より平滑断端された生成ベクターｐＭｃ５-ｐｐＳ５により、ＰＨＯ１シグナル を最後のアミノ酸へ正確に近付けることができる。 標準操作法を使用して、ｐＭｃ５-ｐｐＳ５の誘導体であるｐＭｃ５-ｐｐＳＰ ８２ｃ５を構築してきた。このベクター中では合成した前方−配列（ｐｒｏ−ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｐ）に続く８２ｃ５とコード付けした配列がＰＨＯ１分泌シ グナル（Ｓ）へフレーム融合される。使用する前方-配列は、アルファ-ファクタ ーリーダー配列に基づいてクレメンツ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）ら〔「ジェン（Ｇｅ ｎｅ）」、第１０６巻、第２６７〜２７２頁（１９９１年）〕が設計したふたつ の１９-ａａ前方-配列のひとつであり次のアミノ酸組成を有する： （配列 ＩＤＮｏ．２３） 前方-配列はアルファ-ファクターＫＥＸ２開裂部位（Ｌｙｓ-Ａｒｇ）をもって 終わる。 ピチア・パトリシス発現ベクターｐＨＩＬ４-ＳＰ８２ｃ５は発現カセットを ｐＭｃ５-ｐｐＳＰ８２ｃ５からｐＨＩＬ４ベクターコンテキスト（ｃｏｎｔｅ ｘｔ）へ再導入し、ｐＨＩＬ４の相当する部位を置換することにより構築する。 ｐＨＩＬ４ベクターはｐＨＩＬＳ１の他の要素に加えて、ＨＩＳ４と３'ＡＯＸ １の間に挿入された細菌カナマイシン抵抗遺伝子を含む。これは抗生物質Ｇ４１ ８に対する高レベルの抵抗性という面で選抜する（ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ）こと により、発現カセットの多量コピーをもったピチアトランスフォーマントを選別 するために用いられる。 ピチア菌株ＧＴＳ１１５中のｐＨＩＬ４−ＳＰ８２ｃ５の形質転換（電気泳動 法）後、Ｈｉｓ＋トランスフォーマントを、Ｐａｏｘプロモーターをメタノール とともに加えたのち振盪フラスコ中での８２ｃ５の生成に関して評価した。培養 媒体中でのトリプシン妨害活性の発現によって示されるように、８２ｃ５の合成 と分泌を指定するクローンが９０ｍｇ／ｌまで見いだされた。 精製後、組替体８２ｃ５をＮ-末端配列決定にかけた。その結果ではＰＨ０１- ｐｒｏ-８２ｃ５プレカーサーが正確に複製された。実施例１１ ：人血漿中のトロンビン生成の妨害 人血漿中の抗凝固剤の能力を評価するためにトロンビン生成の測定を用いるこ とができる。ベギュアン（Ｂｅｇｕｉｎ）他著、「６８トロンビン・ヘモスティ プティックス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）」、第１３６−１４２頁（１ ９９２年）。 クエン酸化した人血漿を１ｍｌ分−８０℃で保存した。血漿はレプティラーゼ溶 液（血漿１ｍｌに対して２０μｌ）を加えて脱繊維素を行った。レプティラーズ 溶液はメーカー（ベールヒンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ）社）の指示にしたがって調製した。３７℃で１０分後、凝固した血 漿を氷中へ移してさらにもう１０分間保持した。それから凝固物を小さなプラス チック製へらに巻き付けて取り除いた。 脱繊維素血漿２４０μｌに次のものを加えた：リン脂質２０μｌ（１,２-ジオ レオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホセリンと１,２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ -３-ホスホコリンの２０／８０（モル比）混合物の２７μＭ）およびインヒビタ ー６０μｌ（５Ｌ１５またはヒルジン）を（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５ ）、１７５ｍＭＣのＮａＣｌ、０.０５％のＢＳＡ中に）必要とする濃度で。コ ントロール実験は５Ｌ１５またはヒルジンを加えないで行った。ＣａＣｌ₂０.１ Ｍ中の人組替組織ファクターの十分量（６０μｌ）を添加することによりトロン ビンの生成を誘発し、２.５分でトロンビンはほぼ２５０ｎＭのピークとなった 。 ３０秒毎に、１０μｌの血漿溶液を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７. ３５）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．５％のＢＳＡ、２０ｍＭのＥＤＴＡおよび２ ００μＭの基質（Ｓ２２３８）を４９０μｌ含むキュベットへ取り出した。２分 後キュベット中の反応を１Ｍのクエン酸の３００μｌで停止した。サンプリング と停止の正確な時刻を押しボタン付きのピペットを用いて直接パーソナルコンピ ュータ 上に記録した。 トロンビン濃度は２波長スペクトロフォトメーター上の４０５および５００ｎ ｍでのキュベットの吸光度を測定して決定した。 人血漿中でのトロンビン生成に対する抗凝固剤の効果の例を図９に示した。こ れによると、５Ｌ１５（０.６６３および３.９３８μＭ）は既に評価の定まって いるトロンビンインヒビター（ヒルジン；０.１μＭ）に匹敵する。このトロン ビン生成曲線から、トロンビン最大生成が現れる時間の遅れに及ぼす効果を測定 することにより抗凝固能を評価することができる。５Ｌ１５によるこの遅延の投 与量依存性は図８に示してある。 他の実施態様は以下に記載の請求の範囲にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 リプカ、ウィリアム・チャールズ アメリカ合衆国92121カリフォルニア、サ ン・ディエゴ、レッド・ロック・ドライブ 10819番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．５００ｎＭより低い妨害定数をもつ、ファクターXIIａ-組織ファクター複合 体の生物活性を妨害するＢＰＴＩから誘導される化合物。 ２．ファクターXIIａ-組織ファクターに対して１００ｎＭより低い妨害定数をも つ請求項１に記載の化合物。 ３．ファクターXIIａ-組織ファクターに対して１０ｎＭより低い妨害定数をもつ 請求項１に記載の化合物。 ４．次の構造を含む請求項１に記載の化合物： （式中、 Ｘ₁₁はアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン 、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラ ニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリ ン； Ｘ₁₃はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸 、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチ オニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、 チロシン、またはバリン； Ｘ₁₄はアラニン、またはＸ₃₈がシステイン、グリシンまたはセリンの時にはシ ステイン； Ｘ₁₅はアルギニンまたはリジン； Ｘ₁₆はアラニンまたはグリシン； Ｘ₁₇はアラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチ ジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロ リン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン； Ｘ₁₈、Ｘ₁₉およびＸ₂₀は任意の天然アミノ酸； Ｘ₃₄はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸 、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチ オニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、 チロシン、またはバリン； Ｘ₃₅はフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン； Ｘ₃₆はアラニン、グリシンまたはセリン； Ｘ₃₈はアラニン、Ｘ₁₄がシステインの時にはシステイン、グリシン、またはセ リン； Ｘ₃₉はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸 、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチ オニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、 チロシン、またはバリン； Ｘ₄₅はフェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンであり； Ｘ₄₆は任意の天然アミノ酸である）。 ５．Ｘ₁₁がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、ス レオニン、またはバリン； Ｘ₁₃がアラニン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、フェニルアラニン 、プロリン、チロシン、またはバリン； Ｘ₁₄がシステイン； Ｘ₁₅がアルギニン、またはリジン； Ｘ₁₆がアラニンまたはグリシン； Ｘ₁₇がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、またはチロシン； Ｘ₁₈がヒスチジン、イソロイシン、またはチロシン； Ｘ₁₉がグルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、プロリン 、スレオニンまたはバリン； Ｘ₂₀がアルギニンまたはセリン； Ｘ₃₄がアスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラ ニン、セリン、スレオニン、チロシン、またはバリン； Ｘ₃₅がチロシン； Ｘ₃₆がグリシン； Ｘ₃₈がシステイン； Ｘ₃₉がアルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジン、ロイシン、フ ェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン； Ｘ₄₅がフェニルアラニンであり； Ｘ₄₆がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、フェニルアラニン、トリプト ファンまたはチロシン： である請求項４に記載の化合物。 ６．次の構造を含む請求項４または５に記載の化合物： （ただし、Ｘ₁はアラニンまたはアルギニンである）。 ７．次の構造を含む請求項４または５に記載の化合物： （ただし式中、 Ｘ₁はアラニンまたはアルギニン Ｘ₁₁はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プリロン、セリ ン、スレオニン、またはバリン； Ｘ₁₃はアラニン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオ ニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、またはバリン ； Ｘ₁₄はシステイン； Ｘ₁₅はアルギニン、またはリジン； Ｘ₁₆はアラニンまたはグリシン； Ｘ₁₇はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、またはチロシン； Ｘ₁₈はヒスチジン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはチロシン； Ｘ₁₉はアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リ ジン、プロリン、スレオニン、またはバリン； Ｘ₂₀はアルギニンまたはセリン； Ｘ₃₄はアスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラ ニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン； Ｘ₃₅はチロシン； Ｘ₃₆はグリシン； Ｘ₃₈はシステイン； Ｘ₃₉はアルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロ イシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン； Ｘ₄₅はフェニルアラニン；であり Ｘ₄₆はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、フェニルアラニン、トリプト ファン、またはチロシンである）。 ８．以下のものからなる群から選ばれる請求項５に記載の化合物： ９．以下のものからなる群から選ばれる妨害定数ファクターが５０ｎｍより低い 請求項５に記載の化合物： １０．請求項１〜９のいずれかの化合物をコード化している単離核酸セグメント 。 １１．以下のものからなる群から選ばれる妨害定数ファクターが５ｎｍより低い 請求項５に記載の化合物： １２．請求項１０に記載の核酸セグメントおよび上記核酸セグメントの転写を制 御するために核酸セグメントに関連した位置にあるプロモーター部位とを含むベ クター。 １３．細胞膜を通して上記化合物の分泌を引き起こすアミノ酸配列をコード化し ている核酸セグメントを更に含む請求項１２に記載のベクター。 １４．請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。 １５．宿主細胞がバクテリアである請求項１４に記載の宿主細胞。 １６．宿主細胞がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ.）で ある請求項１５の宿主細胞。 １７．宿主細胞が真核性細胞である請求項１４の宿主細胞。 １８．宿主細胞が酵母細胞である請求項１７の宿主細胞。 １９．宿主細胞がピチア・パストリスである請求項１８の宿主細胞。 ２０．ベクターが上記細胞中で上記化合物の発現を生じる条件下で、上記化合物 をコード化しているベクターを運搬している宿主細胞を増殖させることを含む請 求項１〜９のいずれかに記載の化合物の調製方法。 ２１．更に、培養媒体から宿主細胞を分離すること、この宿主細胞から上記化合 物を除去すること、および物理的分離手段によって上記化合物を精製することを 含む請求項２０に記載の方法。 ２２．上記化合物が培養媒体中へ分泌される条件下でシグナル配列に結合した上 記化合物をコード化しているベクターを運搬している宿主細胞を増殖することを 含む請求項１〜９のいずれかに記載の化合物の調製方法。 ２３．更に、培養媒体から宿主細胞を除去すること、この宿主細胞から上記化合 物を除去すること、および物理的分離手段によって上記化合物を精製することを 含む請求項２２に記載の方法。 ２４．医薬として許容できるキャリアおよび請求項１〜９のいずれかに記載の化 合物の医薬的に効果的な量を含む医薬組成物。 ２５．異常な組織ファクター発現を特徴とする症状を予防および／または治療す る目的で哺乳類に使用するための請求項２４に記載の医薬組成物。 ２６．異常な組織ファクター発現を特徴とする症状の哺乳類に請求項１〜９に記 載の化合物を医薬的に許容できる量を投与することを含む予防または治療方法。 ２７．上記症状が更に異常血栓形成を特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２８．異常な組織ファクター発現を特徴とする症状の哺乳類に請求項２４に記載 の医薬組成物を投与することを含む予防または治療方法。 ２９．上記症状が更に異常血栓形成を特徴とする請求項２８に記載の方法。