JP2894354B2 - 組換えｄｎａ技術によつて産生されたウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異型、それらの方法、発現ベクターおよび組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用 - Google Patents
組換えｄｎａ技術によつて産生されたウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異型、それらの方法、発現ベクターおよび組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 アプロチニンは、トリプシン、キモトリプシン、プラ
スミンおよびカリクレインのようなプロテイナーゼの阻
害剤として作用する、58アミノ酸のよく特徴づけられた
基本蛋白質である。それは種々の病気、例えば、過線維
芽溶解性出血および外傷性出血のショックの処置のため
に価値ある薬物、トラシロール（Trasylol（商標）と命
名されている、となった。
スミンおよびカリクレインのようなプロテイナーゼの阻
害剤として作用する、58アミノ酸のよく特徴づけられた
基本蛋白質である。それは種々の病気、例えば、過線維
芽溶解性出血および外傷性出血のショックの処置のため
に価値ある薬物、トラシロール（Trasylol（商標）と命
名されている、となった。
最近、アプロチニン分子の位置15における残基リジン
を他のアミノ酸で置換すると、アプロチニンに比較して
変更された阻害のスペクトルをもつ、価値あるプロテイ
ナーゼ阻害剤が生ずることが立証された［H.ツシェシェ
（Tschesche）ら、（1985）、特許出願ドイツ国公開明
細書（DOS）39 693、1985年５月15日］。導入されたア
ミノ酸に依存して、これらの修飾された阻害剤は、例え
ば、膵臓からおよび白血球および／または血漿カリクレ
インからのエラスターゼの阻害剤として作用することが
できる。アプロチニン変異型はアプロチニンの半合成的
転化によって得ることができる［H.ツシェシェ（Tsches
che）ら、ドイツ国公開明細書（DE−OS）33 39 693号］
が、得ることのできる量は比較的少ない。さらに、この
方法は位置15におけるリジン残基に加えてアミノ酸の複
数の置換を可能としない。
を他のアミノ酸で置換すると、アプロチニンに比較して
変更された阻害のスペクトルをもつ、価値あるプロテイ
ナーゼ阻害剤が生ずることが立証された［H.ツシェシェ
（Tschesche）ら、（1985）、特許出願ドイツ国公開明
細書（DOS）39 693、1985年５月15日］。導入されたア
ミノ酸に依存して、これらの修飾された阻害剤は、例え
ば、膵臓からおよび白血球および／または血漿カリクレ
インからのエラスターゼの阻害剤として作用することが
できる。アプロチニン変異型はアプロチニンの半合成的
転化によって得ることができる［H.ツシェシェ（Tsches
che）ら、ドイツ国公開明細書（DE−OS）33 39 693号］
が、得ることのできる量は比較的少ない。さらに、この
方法は位置15におけるリジン残基に加えてアミノ酸の複
数の置換を可能としない。
したがって、組換えDNAおよび関連する技術の応用
は、阻害の所望の特異性および効能をもつアプロチニン
同族体を大量に製造する最も適当な方法であろうと考え
られてきた。
は、阻害の所望の特異性および効能をもつアプロチニン
同族体を大量に製造する最も適当な方法であろうと考え
られてきた。
この分野において、既知のアミノ酸配列の蛋白質をコ
ードする（以下、「蛋白質の遺伝情報を指定する」とい
う場合あり）DNAは、ゲノムDNA配列またはmRNAに対して
相補的であるcDNA配列を使用して調製できる。次いで、
アミノ酸の置換は、例えば、部位特異性突然変異発生に
よって導入することができる。
ードする（以下、「蛋白質の遺伝情報を指定する」とい
う場合あり）DNAは、ゲノムDNA配列またはmRNAに対して
相補的であるcDNA配列を使用して調製できる。次いで、
アミノ酸の置換は、例えば、部位特異性突然変異発生に
よって導入することができる。
既知の一次構造のの蛋白質の遺伝情報を指定するDNA
を得る他の可能性は、遺伝暗号に従いコドンを選択し、
そして合成遺伝子を調製することである。
を得る他の可能性は、遺伝暗号に従いコドンを選択し、
そして合成遺伝子を調製することである。
組換え体微生物および／または真核細胞の中において
異質DNAの発現する方法は知られている。
異質DNAの発現する方法は知られている。
本発明の目的は、高度の特異性と高い阻害効能とを兼
備する。製薬学的に有用なポリペプチド／蛋白質を提供
することである。前記ポリペプチドは、組換えDNA技術
によって製造できる。アプロチニンおよびその変異型の
アミノ酸配列をもつペプチドである。用語「変異型」
は、もとのアプロチニン配列中のアミノ酸の１または２
以上が他の天然に産生するアミノ酸によって置換されて
いる、ポリペプチドを意味する。このような置換の好ま
しい位置は、酵素−阻害剤複合体内の標的酵素に密接す
る位置である。これらは位置12、13、14、15、16、17、
18、34、38および39である。接触領域中には位置20は含
まれないが、その基本的性質はある場合においてカリク
レイン阻害のために重要であることがある。
備する。製薬学的に有用なポリペプチド／蛋白質を提供
することである。前記ポリペプチドは、組換えDNA技術
によって製造できる。アプロチニンおよびその変異型の
アミノ酸配列をもつペプチドである。用語「変異型」
は、もとのアプロチニン配列中のアミノ酸の１または２
以上が他の天然に産生するアミノ酸によって置換されて
いる、ポリペプチドを意味する。このような置換の好ま
しい位置は、酵素−阻害剤複合体内の標的酵素に密接す
る位置である。これらは位置12、13、14、15、16、17、
18、34、38および39である。接触領域中には位置20は含
まれないが、その基本的性質はある場合においてカリク
レイン阻害のために重要であることがある。
したがって、本発明によれば、ウシ膵臓トリプシン阻
害剤（アプロチニン、BPTI）の配列を本質的に有し、位
置15、16、17、18、34、39および52におけるアミノ酸の
１または２以上が天然に産生するアミノ酸によって置換
されており、ただし １、15位置においてアミノ酸Gly、Ala、Val、Leu、Il
e、Met、Arg、Thr、Phe、Ser、TrpまたはTyrのいずれか
によって置換されているアプロチニン、 ２、１、に記載するような位置15における置換に加え
て、さらに位置52においてアミノ酸Glu、Leu、Val、Thr
またはSerのいずれかによって置換されているアプロチ
ニン、 ３、Ｎ−末端アミノ酸Arg−１の前に追加のMetを有する
１、および２、に記載するアプロチニン変異型、および ４、Val−15−Ser−16−Ile−17−アプロチニン、 を除外することを特徴とするペプチド、が提供される。
害剤（アプロチニン、BPTI）の配列を本質的に有し、位
置15、16、17、18、34、39および52におけるアミノ酸の
１または２以上が天然に産生するアミノ酸によって置換
されており、ただし １、15位置においてアミノ酸Gly、Ala、Val、Leu、Il
e、Met、Arg、Thr、Phe、Ser、TrpまたはTyrのいずれか
によって置換されているアプロチニン、 ２、１、に記載するような位置15における置換に加え
て、さらに位置52においてアミノ酸Glu、Leu、Val、Thr
またはSerのいずれかによって置換されているアプロチ
ニン、 ３、Ｎ−末端アミノ酸Arg−１の前に追加のMetを有する
１、および２、に記載するアプロチニン変異型、および ４、Val−15−Ser−16−Ile−17−アプロチニン、 を除外することを特徴とするペプチド、が提供される。
したがって、また、 位置15において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Ty
r、Trp、Met、Ala、Thr、Ser、Gln、Asn、ArgまたはLy
s、 位置16において、アミノ酸Val、Met、Thr、Ser、Gl
n、Asn、Gly、ArgまたはAla、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Ty
r、Trp、Met、Ala、Thr、Ser、Gln、Asn、Gly、His、Ly
sまたはArg、 位置18において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Me
t、Thr、GluまたはGly、 位置34において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Ty
r、Trp、AlaまたはThr、 位置39において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Ty
r、Trp、Met、Ala、Thr、Ser、Glu、Gln、Asn、Gly、Ar
g、Lys、AspまたはPro、および 位置52において、Leu、Ile、Val、Met、Thr、Ser、Gl
u、Gln、Asp、LysまたはArg、 を含むペプチドは、好ましい。
r、Trp、Met、Ala、Thr、Ser、Gln、Asn、ArgまたはLy
s、 位置16において、アミノ酸Val、Met、Thr、Ser、Gl
n、Asn、Gly、ArgまたはAla、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Ty
r、Trp、Met、Ala、Thr、Ser、Gln、Asn、Gly、His、Ly
sまたはArg、 位置18において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Me
t、Thr、GluまたはGly、 位置34において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Ty
r、Trp、AlaまたはThr、 位置39において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Ty
r、Trp、Met、Ala、Thr、Ser、Glu、Gln、Asn、Gly、Ar
g、Lys、AspまたはPro、および 位置52において、Leu、Ile、Val、Met、Thr、Ser、Gl
u、Gln、Asp、LysまたはArg、 を含むペプチドは、好ましい。
さらに好ましくは、本発明によれば、次のペプチドが
提供される： １、位置15において、アミノ酸Val、LeuまたはIle、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Gln、Th
r、Met、Trp、Tyr、Phe、AsnまたはArg、 位置39において、アミノ酸Glu、Asp、Asn、Thr、Va
l、Leu、Ile、GlnまたはArg、および 位置52において、Thr、GluまたはMet、 を含むペプチド ２、位置15において、アミノ酸Val、LeuまたはIle、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Gln、Th
r、Met、Trp、Tyr、Phe、AsnまたはArg、 位置39において、アミノ酸GluまたはArg、および 位置52において、Thr、GluまたはMet、 を含むペプチド。
提供される： １、位置15において、アミノ酸Val、LeuまたはIle、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Gln、Th
r、Met、Trp、Tyr、Phe、AsnまたはArg、 位置39において、アミノ酸Glu、Asp、Asn、Thr、Va
l、Leu、Ile、GlnまたはArg、および 位置52において、Thr、GluまたはMet、 を含むペプチド ２、位置15において、アミノ酸Val、LeuまたはIle、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Gln、Th
r、Met、Trp、Tyr、Phe、AsnまたはArg、 位置39において、アミノ酸GluまたはArg、および 位置52において、Thr、GluまたはMet、 を含むペプチド。
３、位置15において、アミノ酸Val、LeuまたはIle、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、ValまたはArg、 位置39において、アミノ酸GluまたはArg、および 位置52において、Thr、GluまたはMet、 を含むペプチド ４、位置15におい、アミノ酸Val、LeuまたはIle、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、ValまたはArg、 位置39において、アミノ酸GluまたはArg、および 位置52において、Thr、GluまたはMet、 を含むペプチド。
４、位置15において、アミノ酸ValまたはLeu、 位置17において、アミノ酸Leu、 位置39において、アミノ酸GluまたはArg、および 位置52において、Thr、GluまたはMet、 を含むペプチド。
であるペプチド。
本発明は、また、組換えDNA技術によって蛋白質の発
現のある方法のために重要である分子内の位置、ことに
位置52に関する。
現のある方法のために重要である分子内の位置、ことに
位置52に関する。
本発明は、さらに、位置−１におけるメチオニンおよ
び／またはリーダーペプチドをさらに含有する、上に概
説した配列を有するポリペプチド／蛋白質に関する。用
語「リーダーペプチド」は、本発明の文脈において、発
現産生物の分泌を促進するシグナル配列を意味するばか
りでなく、かつまたアプロチニンまたはアプロチニン変
異型配列より前にシグナル配列およびリンカー配列を含
有する配列を意味する。さらに、用語「リーダー配列」
は、高い発現を可能とし、および／または分子の精製を
促進するはたらきをする、分子の両端における配列を意
味する。
び／またはリーダーペプチドをさらに含有する、上に概
説した配列を有するポリペプチド／蛋白質に関する。用
語「リーダーペプチド」は、本発明の文脈において、発
現産生物の分泌を促進するシグナル配列を意味するばか
りでなく、かつまたアプロチニンまたはアプロチニン変
異型配列より前にシグナル配列およびリンカー配列を含
有する配列を意味する。さらに、用語「リーダー配列」
は、高い発現を可能とし、および／または分子の精製を
促進するはたらきをする、分子の両端における配列を意
味する。
本発明は、また、上に概説した配列を有するが、阻害
活性を部分的にまたは完全に保持するように、分子の端
の一方または双方において、１または複数のアミノ酸に
よって短縮されている、ポリペプチド／蛋白質に関す
る。
活性を部分的にまたは完全に保持するように、分子の端
の一方または双方において、１または複数のアミノ酸に
よって短縮されている、ポリペプチド／蛋白質に関す
る。
上に特定したアプロチニンの相同体（変異型）は、プ
ロテイナーゼの過剰量の存在に関する病気、例えば、膵
臓エラスターゼ（膵臓炎）、血清エラスターゼ（動脈硬
化症）、結合組織の障害を伴う慢性および急性の炎症に
おける白血球エラスターゼ、脈管壁の障害、壊死の病気
および肺組織の変性において治療学的に使用できる。免
疫学的プロセスによる炎症反応、例えば、リウマチ様関
節炎、または心筋抑制因子およびショック症候群におい
て、リボソームの酵素、とくに白血球エラスターゼが演
ずる役割は等しく重要である。
ロテイナーゼの過剰量の存在に関する病気、例えば、膵
臓エラスターゼ（膵臓炎）、血清エラスターゼ（動脈硬
化症）、結合組織の障害を伴う慢性および急性の炎症に
おける白血球エラスターゼ、脈管壁の障害、壊死の病気
および肺組織の変性において治療学的に使用できる。免
疫学的プロセスによる炎症反応、例えば、リウマチ様関
節炎、または心筋抑制因子およびショック症候群におい
て、リボソームの酵素、とくに白血球エラスターゼが演
ずる役割は等しく重要である。
組換えDNAおよび関連する技術の応用は、所望の特異
性および阻害の効能を有するアプロチニン相同体を大量
で製造する最も適当な方法であろうことが、認識され
た。
性および阻害の効能を有するアプロチニン相同体を大量
で製造する最も適当な方法であろうことが、認識され
た。
また、合成遺伝子がlac Z遺伝子に融合されている構
成［E.アウエルスワルド（Auerswald）ら（1985）、特
許出願英国特許（UK）8607523号］または融合されてい
ない構成［v.ウイルケン−バーグマン（Wilcken−Bergm
an）ら（1986）、EMBO J.,5,3219−3225］を使用する組
換えDNA技術によって、アプロチニンの相同体を得られ
ることが立証された。さらに、アプロチニンの天然コー
ド配列は、pho A遺伝子のシグナル配列との融合として
発現された（アルカル性ホスファターゼ）［B.マークス
（Marks）ら（1986）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），204,7115−711
8］。
成［E.アウエルスワルド（Auerswald）ら（1985）、特
許出願英国特許（UK）8607523号］または融合されてい
ない構成［v.ウイルケン−バーグマン（Wilcken−Bergm
an）ら（1986）、EMBO J.,5,3219−3225］を使用する組
換えDNA技術によって、アプロチニンの相同体を得られ
ることが立証された。さらに、アプロチニンの天然コー
ド配列は、pho A遺伝子のシグナル配列との融合として
発現された（アルカル性ホスファターゼ）［B.マークス
（Marks）ら（1986）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），204,7115−711
8］。
遺伝子の融合を使用してバクテリア宿主において、と
くに小さい異質蛋白質を高度に発現することは、しばし
ば、容易である。これは種々の理由による。宿主細胞に
おいて異質ポリペプチドの蓄積に影響を及ぼすと思われ
る因子は、次のものを包含する： （１）異質ポリペプチドは、宿主細胞のプロテイナーゼ
によって効率よく分解されうる。
くに小さい異質蛋白質を高度に発現することは、しばし
ば、容易である。これは種々の理由による。宿主細胞に
おいて異質ポリペプチドの蓄積に影響を及ぼすと思われ
る因子は、次のものを包含する： （１）異質ポリペプチドは、宿主細胞のプロテイナーゼ
によって効率よく分解されうる。
（２）異質ポリペプチドは、細胞への毒性作用を有する
ことがある。
ことがある。
10,000ダルトンより大きい分子量を有する異質蛋白質
の広範な種類はE.coliにおいて細胞内的に首尾よく発現
されてきているが、小さい異質ポリペプチドの多数が試
みられてきたにもかかわらず、発現に成功した比較的わ
ずかである。
の広範な種類はE.coliにおいて細胞内的に首尾よく発現
されてきているが、小さい異質ポリペプチドの多数が試
みられてきたにもかかわらず、発現に成功した比較的わ
ずかである。
この問題を克服するためのある数の努力において、融
合ポリペプチドが使用されてきている。このようなアプ
ローチの欠点は、次のものを包含する： （１）挿入された構造遺伝子は、融合相手のAUG開始コ
ドンに関して適切なリーディングフレーム中に存在しな
くてはならない。
合ポリペプチドが使用されてきている。このようなアプ
ローチの欠点は、次のものを包含する： （１）挿入された構造遺伝子は、融合相手のAUG開始コ
ドンに関して適切なリーディングフレーム中に存在しな
くてはならない。
（２）異質ポリペプチドは、融合ポリペプチドを化学的
にあるいは酵素的に切出さなくてはならない。したがっ
て、所望の蛋白質はそれぞれの切断部位を含有してはな
らない。この事実は、多くの場合において、重大な問題
を提供する。
にあるいは酵素的に切出さなくてはならない。したがっ
て、所望の蛋白質はそれぞれの切断部位を含有してはな
らない。この事実は、多くの場合において、重大な問題
を提供する。
しかしながら、遺伝子の多数のコピーを含有するプラ
スミドを使用して小さいポリペプチドを発現すること
は、時には、可能である［v.ウイルケン−バーグマン
（Wilcken−Bergman）ら（1986）、EMBO J.,５,3219−3
225］。
スミドを使用して小さいポリペプチドを発現すること
は、時には、可能である［v.ウイルケン−バーグマン
（Wilcken−Bergman）ら（1986）、EMBO J.,５,3219−3
225］。
劣化および／または毒性の問題を克服するための他の
可能性は、分泌系において異質蛋白質を発現することで
ある。バクテリア、酵母菌および菌類の分泌系を使用で
きる。分泌を得るためには、適当なリンカー配列は、Ｎ
−末端より前の対応するアミノ酸配列が分泌すべき蛋白
質を処理するシグナルペプチダーゼのための処理部位を
含むように、アプロチニンまたはアプロチニン変異型の
５′−端に結合しなくてはならない。
可能性は、分泌系において異質蛋白質を発現することで
ある。バクテリア、酵母菌および菌類の分泌系を使用で
きる。分泌を得るためには、適当なリンカー配列は、Ｎ
−末端より前の対応するアミノ酸配列が分泌すべき蛋白
質を処理するシグナルペプチダーゼのための処理部位を
含むように、アプロチニンまたはアプロチニン変異型の
５′−端に結合しなくてはならない。
本発明は、アプロチニン相同体の遺伝情報を指定する
合成DNAに関する。とくに、本発明は、第３図に示す配
列を有する、以後「マスター遺伝子（master gene）」
と呼ぶDNAおよび／またはその機能的同等体に関する。
用語「機能的同等体（functional equvalent）」は、本
発明の文脈において、いくつかのコドンにおいて、塩基
の１、２または３つが、蛋白質中に組込むべきアミノ酸
へ影響を及ぼさないで他の塩基によって置換されてい
る、上のDNA配列の誘導体を、また、意味する（遺伝暗
号の同義性）。
合成DNAに関する。とくに、本発明は、第３図に示す配
列を有する、以後「マスター遺伝子（master gene）」
と呼ぶDNAおよび／またはその機能的同等体に関する。
用語「機能的同等体（functional equvalent）」は、本
発明の文脈において、いくつかのコドンにおいて、塩基
の１、２または３つが、蛋白質中に組込むべきアミノ酸
へ影響を及ぼさないで他の塩基によって置換されてい
る、上のDNA配列の誘導体を、また、意味する（遺伝暗
号の同義性）。
アプロチニン分子の変異型を産生するために、ある種
のアミノ酸のためのコドンが他のアミノ酸のためのコド
ンによって置換されるような方法で、マスター遺伝子を
組換えDNA技術（例えば、部位特異的突然変異発生）に
よって修飾する。このアプローチを使用すると、本発明
によるアプロチニン相同体（例えば、前述のアプロチニ
ン変異型）の遺伝情報を指定する種々のDNA配列を得る
ことができる。
のアミノ酸のためのコドンが他のアミノ酸のためのコド
ンによって置換されるような方法で、マスター遺伝子を
組換えDNA技術（例えば、部位特異的突然変異発生）に
よって修飾する。このアプローチを使用すると、本発明
によるアプロチニン相同体（例えば、前述のアプロチニ
ン変異型）の遺伝情報を指定する種々のDNA配列を得る
ことができる。
このような置換におけるコドンは、５〜12ページに記
載した好ましいアミノ酸のためのコドンである。使用す
る発現系に依存して、本発明のDNAは、また、５′−末
端より上流に追加の配列を有する、表１に列挙するポリ
ペプチド変異型の１つの遺伝情報を指定するDNAである
ことができる。
載した好ましいアミノ酸のためのコドンである。使用す
る発現系に依存して、本発明のDNAは、また、５′−末
端より上流に追加の配列を有する、表１に列挙するポリ
ペプチド変異型の１つの遺伝情報を指定するDNAである
ことができる。
本発明のほかの目的は、ポリペプチドの遺伝情報を指
定するDNAを含有する発現ベクター（プラスミド）であ
る。これらのプラスミドは宿主有機体の形質転換に使用
される。本発明は、また、このような形質転換された有
機体に関する。形質転換に適する多数の種々の有機は、
この分野において知られている。プラスミドの性質は、
主として、使用する宿主有機体に依存する。
定するDNAを含有する発現ベクター（プラスミド）であ
る。これらのプラスミドは宿主有機体の形質転換に使用
される。本発明は、また、このような形質転換された有
機体に関する。形質転換に適する多数の種々の有機は、
この分野において知られている。プラスミドの性質は、
主として、使用する宿主有機体に依存する。
本発明のDNAを含有するプラスミドで形質転換された
宿主生物は、アプロチニン相同体の産生に使用される。
この産生は、次の工程を含む： （１）宿主生物を適当な条件下に培養し、 （２）前記培養物からペプチドを回収し、そして （３）前記ペプチドを精製する。
宿主生物は、アプロチニン相同体の産生に使用される。
この産生は、次の工程を含む： （１）宿主生物を適当な条件下に培養し、 （２）前記培養物からペプチドを回収し、そして （３）前記ペプチドを精製する。
ポリペプチドの精製は、蛋白質化学において既知の方
法、例えば、沈殿、クロマトグラフィーおよび電気泳動
によって達成することができる。前述のリーダーペプチ
ドはこのような精製においてすぐれた道具である。なぜ
なら、その特性を使用して精製を促進できるからである
［１つの例は、次の文献に記載されている:S.J.ブルー
バー（BruverおよびH.M.サッセンフェルド（Sassenfel
d）（1985）、バイオテクノロジーにおける傾向（Trend
s in Biotechnology）、３、119−122］。
法、例えば、沈殿、クロマトグラフィーおよび電気泳動
によって達成することができる。前述のリーダーペプチ
ドはこのような精製においてすぐれた道具である。なぜ
なら、その特性を使用して精製を促進できるからである
［１つの例は、次の文献に記載されている:S.J.ブルー
バー（BruverおよびH.M.サッセンフェルド（Sassenfel
d）（1985）、バイオテクノロジーにおける傾向（Trend
s in Biotechnology）、３、119−122］。
本発明は、また、上に概説したペプチドからなる製薬
学的組成物および調製物および前記製薬学的組成物の調
製における前記ペプチドの使用に関する。このような製
薬学的組成物は、前述の適用において非常の有用であ
る。
学的組成物および調製物および前記製薬学的組成物の調
製における前記ペプチドの使用に関する。このような製
薬学的組成物は、前述の適用において非常の有用であ
る。
本発明は、無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤に
加えて、本発明の化合物の１または２種以上を含んでな
る製薬学的組成物または本発明の化合物の１または２種
以上から成る製薬学的組成物、およびこれらの製薬学的
組成物を調製する方法を包含する。
加えて、本発明の化合物の１または２種以上を含んでな
る製薬学的組成物または本発明の化合物の１または２種
以上から成る製薬学的組成物、およびこれらの製薬学的
組成物を調製する方法を包含する。
本発明は、また、投与単位の形態の製薬学的調製物を
包含する。これは、製薬学的調製物が個々の部分の形
態、例えば、錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピ
ル、坐薬およびアンプル剤の形態であることを意味し、
その活性化合物の含量は個々の投与量の数分の１あるい
は多数倍に相当する。投与単位は、例えば、１、２、３
または４倍の個々の投与量、あるいは個々の投与量の1/
2、1/3または1/4を含有することができる。個々の投与
量は、好ましくは、１回の投与で与えられかつ通常１日
量の全部、半分または３分の１または４分の１に相当す
る量の活性化合物を含有する。
包含する。これは、製薬学的調製物が個々の部分の形
態、例えば、錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピ
ル、坐薬およびアンプル剤の形態であることを意味し、
その活性化合物の含量は個々の投与量の数分の１あるい
は多数倍に相当する。投与単位は、例えば、１、２、３
または４倍の個々の投与量、あるいは個々の投与量の1/
2、1/3または1/4を含有することができる。個々の投与
量は、好ましくは、１回の投与で与えられかつ通常１日
量の全部、半分または３分の１または４分の１に相当す
る量の活性化合物を含有する。
無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤とは、すべて
の種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤およ
び配合助剤であると解釈すべきである。
の種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤およ
び配合助剤であると解釈すべきである。
述べることのできる好ましい製薬学的調製物は、錠
剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピル、丸剤、坐薬、
溶液、懸濁液および乳濁液、泥膏、軟膏、ゲル、クリー
ム、ローション、粉末およびスプレーである。
剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピル、丸剤、坐薬、
溶液、懸濁液および乳濁液、泥膏、軟膏、ゲル、クリー
ム、ローション、粉末およびスプレーである。
錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび顆粒剤は、活性
化合物の１種または２種以上を、次の普通の賦形剤と一
緒に含有できる：（ａ）充填剤および増量剤、例えば、
澱粉、ラクトース、グルコース、マンニトールおよびシ
リカ、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロ
ース、アルギン酸塩類、ゼラチンおよびポリビニルピロ
リドン、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）
崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナ
トリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、お
よび（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウム化合
物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールまたはグ
リセロールモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例えば、
カオリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑剤、例
えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸
マグネシウムおよび固体のポリエチレングリコール、ま
たは上の（ａ）〜（ｉ）に記載した物質の混合物。
化合物の１種または２種以上を、次の普通の賦形剤と一
緒に含有できる：（ａ）充填剤および増量剤、例えば、
澱粉、ラクトース、グルコース、マンニトールおよびシ
リカ、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロ
ース、アルギン酸塩類、ゼラチンおよびポリビニルピロ
リドン、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）
崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナ
トリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、お
よび（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウム化合
物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールまたはグ
リセロールモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例えば、
カオリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑剤、例
えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸
マグネシウムおよび固体のポリエチレングリコール、ま
たは上の（ａ）〜（ｉ）に記載した物質の混合物。
錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび顆粒剤は、普通
の被膜および外殻を含有することができ、これらは不透
明化剤を含むことができ、そして、また、活性化合物の
１種または２種以上のみを、あるいは優先的に、腸管の
特定の部分において、必要に応じて遅延した方法で、放
出するような組成物であることができ、ここで使用でき
る埋め込み組成物の例はポリマー物質およびワックスで
ある。
の被膜および外殻を含有することができ、これらは不透
明化剤を含むことができ、そして、また、活性化合物の
１種または２種以上のみを、あるいは優先的に、腸管の
特定の部分において、必要に応じて遅延した方法で、放
出するような組成物であることができ、ここで使用でき
る埋め込み組成物の例はポリマー物質およびワックスで
ある。
活性化合物の１種または２種以上は、必要に応じて前
述の賦形剤の１種または２種以上と一緒に、マイクロカ
プセル化した形態にすることもできる。
述の賦形剤の１種または２種以上と一緒に、マイクロカ
プセル化した形態にすることもできる。
坐薬は、活性化合物の１種または２種以上に加えて、
普通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例えば、ポリエ
チレングリコール、脂肪、例えば、カカオ脂肪、高級エ
ステル（例えば、C14−アルコールとC16−脂肪酸とのエ
ステル）またはこれらの物質の混合物を含有することが
できる。
普通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例えば、ポリエ
チレングリコール、脂肪、例えば、カカオ脂肪、高級エ
ステル（例えば、C14−アルコールとC16−脂肪酸とのエ
ステル）またはこれらの物質の混合物を含有することが
できる。
軟膏、泥膏、クリームおよびゲルは、活性化合物の１
種または２種以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、動
物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィン、澱
粉、トラガカント、セルソース誘導体、ポリエチレング
リコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク
および酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有することが
できる。
種または２種以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、動
物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィン、澱
粉、トラガカント、セルソース誘導体、ポリエチレング
リコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク
および酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有することが
できる。
散剤およびスプレーは、活性化合物の１種または２種
以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、ラクトース、タ
ルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム
およびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含
有することができる。スプレーは、慣用の噴射剤、例え
ば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することがで
きる。
以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、ラクトース、タ
ルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム
およびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含
有することができる。スプレーは、慣用の噴射剤、例え
ば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することがで
きる。
溶液および乳濁液は、活性化合物の１種または２種以
上に加えて、慣用の賦形剤、例えば、溶媒、可溶化剤お
よび乳化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロ
ピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルア
ルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、
1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、
油、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ胚油、オリ
ーブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセロール、グリセ
ロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコー
ル、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸
エステル、またはこれらの混合物を含有することができ
る。
上に加えて、慣用の賦形剤、例えば、溶媒、可溶化剤お
よび乳化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロ
ピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルア
ルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、
1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、
油、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ胚油、オリ
ーブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセロール、グリセ
ロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコー
ル、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸
エステル、またはこれらの混合物を含有することができ
る。
非経口的投与のために、溶液および乳濁液は、また、
血液と等張性の無菌の形態にすることができる。
血液と等張性の無菌の形態にすることができる。
懸濁液は、活性化合物の１種または２種以上に加え
て、慣用の賦形剤、例えば、液状希釈剤、例えば、水、
エチルアルコールまたはプロピレングリコール、懸濁
剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、
ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンのエ
ステル、微結晶性セルロール、メタ水酸化アルミニウ
ム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこ
れらに混合物を含有することができる。
て、慣用の賦形剤、例えば、液状希釈剤、例えば、水、
エチルアルコールまたはプロピレングリコール、懸濁
剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、
ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンのエ
ステル、微結晶性セルロール、メタ水酸化アルミニウ
ム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこ
れらに混合物を含有することができる。
前述の配合形態は、また、染料、防腐剤および、芳香
および風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油
およびユーカリ油、および甘味剤、例えば、サッカリン
を含有することができる。
および風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油
およびユーカリ油、および甘味剤、例えば、サッカリン
を含有することができる。
治療学的に活性な化合物は、好ましくは、前述の製薬
学的調製物中に、全混合物の約0.1〜99.5重量％、好ま
しくは約0.5〜95重量％の量で存在する。
学的調製物中に、全混合物の約0.1〜99.5重量％、好ま
しくは約0.5〜95重量％の量で存在する。
前述の製薬学的調製物は、また、本発明による化合物
に加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含有すること
ができる。
に加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含有すること
ができる。
前述の製薬学的調製物は、既知の方法に従い通常の方
法で、活性化合物の１種または２種以上を賦形剤の１種
または２種以上と混合することによってつくられる。
法で、活性化合物の１種または２種以上を賦形剤の１種
または２種以上と混合することによってつくられる。
活性化合物または製薬学的組成物は、局所的、経口
的、非経口的、腹腔内および／または経直腸的に、好ま
しくは経口的または非経口的、例えば、静脈内または筋
肉内に投与することができる。
的、非経口的、腹腔内および／または経直腸的に、好ま
しくは経口的または非経口的、例えば、静脈内または筋
肉内に投与することができる。
一般に、人間の医学および獣医学において、所望の結
果を得るためには、本発明による活性化合物の１種また
は２種以上を24時間毎に約0.5〜約500mg/kg体重、好ま
しくは５〜100mg/kg体重の合計量で、適当ならば数回に
分けて投与することが有利であることがわかった。個々
の投薬物は、好ましくは、本発明による活性化合物の１
種または２種以上を約１〜約250mg/kg体重、とくに３〜
60mg/kg体重の量で含有する。しかしながら、前述の投
薬量からはずれなければならないことがあり、特にその
ことは処置すべき患者の性質および体重、病気の性質お
よび重さ、調製物の性質および薬剤の投与方法、投与を
行う時間または間隔に依存する。
果を得るためには、本発明による活性化合物の１種また
は２種以上を24時間毎に約0.5〜約500mg/kg体重、好ま
しくは５〜100mg/kg体重の合計量で、適当ならば数回に
分けて投与することが有利であることがわかった。個々
の投薬物は、好ましくは、本発明による活性化合物の１
種または２種以上を約１〜約250mg/kg体重、とくに３〜
60mg/kg体重の量で含有する。しかしながら、前述の投
薬量からはずれなければならないことがあり、特にその
ことは処置すべき患者の性質および体重、病気の性質お
よび重さ、調製物の性質および薬剤の投与方法、投与を
行う時間または間隔に依存する。
かくして、ある場合には、活性化合物は前述の量より
も少量で十分であり、一方他の場合には前記量を超えな
ければならない場合も起こるであろう。必要な特定の最
適な投与量および活性化合物の投与方法は、この分野に
精通するものにとっては、その専門知識に基づき容易に
決定することができる。
も少量で十分であり、一方他の場合には前記量を超えな
ければならない場合も起こるであろう。必要な特定の最
適な投与量および活性化合物の投与方法は、この分野に
精通するものにとっては、その専門知識に基づき容易に
決定することができる。
合成遺伝子 以下において、アプロチニンおよびアプロチニン相同
体の遺伝情報を指定する遺伝子の合成の方法を記載す
る： アプロチニンおよびその相同体の既知の蛋白質配列を
使用して、これらのポリペプチドの遺伝情報を指定する
DNA配列を設計した。すべての可能な塩基の置換（遺伝
暗号の同義性）ならびにすべての可能な制限部位を、ま
た、合成DNA配列の設計において考慮した。
体の遺伝情報を指定する遺伝子の合成の方法を記載す
る： アプロチニンおよびその相同体の既知の蛋白質配列を
使用して、これらのポリペプチドの遺伝情報を指定する
DNA配列を設計した。すべての可能な塩基の置換（遺伝
暗号の同義性）ならびにすべての可能な制限部位を、ま
た、合成DNA配列の設計において考慮した。
合成アプロチニンおよび相同体のための得られた主な
設計は、第１図、第２図および第３図に示されている。
合成マスター遺伝子は４つのブロック（α、β、γ、
δ）から成り、それらの各々は両端に制限エンドヌクレ
アーゼのための認識部位を有する（参照、また、実施例
３、第１図）。これは、例えば、融合しない発現または
融合蛋白質としての発現のための、DNAの容易な修飾お
よび変更を可能とする。所望の蛋白質が酵素的または化
学的方法によって融合から遊離されうるか、あるいはペ
リプラスミック空間中の分泌の間に遊離されるような方
法で、融合蛋白質は設計される。
設計は、第１図、第２図および第３図に示されている。
合成マスター遺伝子は４つのブロック（α、β、γ、
δ）から成り、それらの各々は両端に制限エンドヌクレ
アーゼのための認識部位を有する（参照、また、実施例
３、第１図）。これは、例えば、融合しない発現または
融合蛋白質としての発現のための、DNAの容易な修飾お
よび変更を可能とする。所望の蛋白質が酵素的または化
学的方法によって融合から遊離されうるか、あるいはペ
リプラスミック空間中の分泌の間に遊離されるような方
法で、融合蛋白質は設計される。
蛋白質工学の合計のスペクトルはこの構成を使用して
可能となる。遺伝子の増幅は適当なリンカー配列を添加
することによって得ることができる。アミノ酸の置換
は、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位に属する
ものを除外して、すべての位置において可能である。こ
れら（および他のすべて）は、例えば、部位特異的突然
変異発生を使用して、当業者によって変化させることが
できる。合成遺伝子のクローニングのために選択したプ
ラスミドはpUC 8であった［J.ビエイラ（Vieira）およ
びJ.メッシング（Messing）（1982）、遺伝子（Gen
e）、19、259］。プラスミドはＰ−Ｌバイオケミカルス
（Biochemicals）から商業的に入手可能である。合成遺
伝子はpUC 8中においてクローニングし、そしてスーパ
ーコイルDNA配列決定法によって配列決定する［K.J.チ
ェン（Chen）およびP.H.シーバーグ（Seeburg）（198
5）、DNA、４、165−170］。
可能となる。遺伝子の増幅は適当なリンカー配列を添加
することによって得ることができる。アミノ酸の置換
は、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位に属する
ものを除外して、すべての位置において可能である。こ
れら（および他のすべて）は、例えば、部位特異的突然
変異発生を使用して、当業者によって変化させることが
できる。合成遺伝子のクローニングのために選択したプ
ラスミドはpUC 8であった［J.ビエイラ（Vieira）およ
びJ.メッシング（Messing）（1982）、遺伝子（Gen
e）、19、259］。プラスミドはＰ−Ｌバイオケミカルス
（Biochemicals）から商業的に入手可能である。合成遺
伝子はpUC 8中においてクローニングし、そしてスーパ
ーコイルDNA配列決定法によって配列決定する［K.J.チ
ェン（Chen）およびP.H.シーバーグ（Seeburg）（198
5）、DNA、４、165−170］。
発現プラスミド アプロチニン相同体を融合蛋白質として発現するた
め、適当な遺伝子が（１）lac Z遺伝子（β−ガラクト
シダーゼ）の解読領域の３′−末端に融合しているプラ
スミド［U.リュザー（Ｒther）およびB.ミュラー−ヒ
ル（Ｍller−Hill）（1983）、EMBO J.,２,1971−197
4］または（２）ファージMS−２のポリメラーゼのアミ
ノ酸98のコドンに融合しているプラスミド［E.レマルト
（Remault）ら、遺伝子（Gene）、15、81−93］。
め、適当な遺伝子が（１）lac Z遺伝子（β−ガラクト
シダーゼ）の解読領域の３′−末端に融合しているプラ
スミド［U.リュザー（Ｒther）およびB.ミュラー−ヒ
ル（Ｍller−Hill）（1983）、EMBO J.,２,1971−197
4］または（２）ファージMS−２のポリメラーゼのアミ
ノ酸98のコドンに融合しているプラスミド［E.レマルト
（Remault）ら、遺伝子（Gene）、15、81−93］。
ペリプラスミック空間中にあるいは培地中に分泌され
たアプロチニン相同体を発現するために、それぞれの遺
伝子をα−アミラーゼベクター中にクローニングした
［M.A.サリバン（Sullivan）ら（1984）、遺伝子（Gen
e）、29、21−26］。遺伝子はブロックαの５′−末端
にXbaI−切断部位を導入することによって修飾した。こ
のような構成は、分泌の間、内因性リーダーペプチダー
ゼによって一次翻訳産生物を切断して、所望のアプロチ
ニンまたはアプロチニン変異型の生じさせることを可能
とする。
たアプロチニン相同体を発現するために、それぞれの遺
伝子をα−アミラーゼベクター中にクローニングした
［M.A.サリバン（Sullivan）ら（1984）、遺伝子（Gen
e）、29、21−26］。遺伝子はブロックαの５′−末端
にXbaI−切断部位を導入することによって修飾した。こ
のような構成は、分泌の間、内因性リーダーペプチダー
ゼによって一次翻訳産生物を切断して、所望のアプロチ
ニンまたはアプロチニン変異型の生じさせることを可能
とする。
合成アプロチニンおよびアプロチニン変異型を適切な
クローニング部位中におよび正しいリーディングフレー
ム中に挿入すると、すべての場合において、所望の融合
蛋白質が得られる。
クローニング部位中におよび正しいリーディングフレー
ム中に挿入すると、すべての場合において、所望の融合
蛋白質が得られる。
E.coli菌株M15を、次の３つの発現プラスミドpES44.
1.1、pES45.1.3またはpCH2742の１つで形質転換し、そ
してドイチェ・サンムルング・フォン・ミクロオルガニ
スメン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen,D−3
400 Gttingen,Grisebachstr.8/FRG）に、次に示す番
号で受託された： E.coli RRI ΔM15 pES 44.1.1 DSM 4157 E.coli RRI ΔM15 pES 45.1.3 DSM 4158 E.coli RRI ΔM15 pCH 2742 DSM 4159 アプロチニン変異型の効能 表１に示す位置におけるアプロチニンのアミノ酸配列
を変化させることによって、驚くべきことには、ヒト白
血球エラスターゼに向かう阻害活性を有意の増加できる
ばかりでなく、かつまたヒトカテプシンＧまたはヒト膵
臓エラスターゼＩにような他のセリンプロテアーゼの効
力ある阻害剤である変異型を発見できることがわかっ
た。
1.1、pES45.1.3またはpCH2742の１つで形質転換し、そ
してドイチェ・サンムルング・フォン・ミクロオルガニ
スメン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen,D−3
400 Gttingen,Grisebachstr.8/FRG）に、次に示す番
号で受託された： E.coli RRI ΔM15 pES 44.1.1 DSM 4157 E.coli RRI ΔM15 pES 45.1.3 DSM 4158 E.coli RRI ΔM15 pCH 2742 DSM 4159 アプロチニン変異型の効能 表１に示す位置におけるアプロチニンのアミノ酸配列
を変化させることによって、驚くべきことには、ヒト白
血球エラスターゼに向かう阻害活性を有意の増加できる
ばかりでなく、かつまたヒトカテプシンＧまたはヒト膵
臓エラスターゼＩにような他のセリンプロテアーゼの効
力ある阻害剤である変異型を発見できることがわかっ
た。
ヒト白血球エラスターゼに対して増大した阻害活性を
示すアプロチニン変異型の例は、位置17におけるアミノ
酸ロイシンを含有するものである。それらは、位置17に
もとのアミノ酸アルギニンを有する変異型を使用して見
出されるよりもほとんど１桁にすぐれるKi値を示すこと
がわかった。これらの阻害剤を示す効能の改良は、ま
た、より関連のある試験モデルにおいて、例えば、内皮
下のマトリックスを使用する分析アッセイにおいて、あ
るいはハムスターにおける急性肺の炎症のモデルにおい
て立証された。
示すアプロチニン変異型の例は、位置17におけるアミノ
酸ロイシンを含有するものである。それらは、位置17に
もとのアミノ酸アルギニンを有する変異型を使用して見
出されるよりもほとんど１桁にすぐれるKi値を示すこと
がわかった。これらの阻害剤を示す効能の改良は、ま
た、より関連のある試験モデルにおいて、例えば、内皮
下のマトリックスを使用する分析アッセイにおいて、あ
るいはハムスターにおける急性肺の炎症のモデルにおい
て立証された。
ヒト白血球エラスターゼに加えて他の白血球プロテア
ーゼ、例えば、カテプシンＧを阻害するアプロチニン変
異型の例は、位置15および17にアミノ酸ロイシンを含有
する変異型である。
ーゼ、例えば、カテプシンＧを阻害するアプロチニン変
異型の例は、位置15および17にアミノ酸ロイシンを含有
する変異型である。
ヒト膵臓エラスターゼＩを阻害するアプロチニン変異
型の例は、位置39にアミノ酸グルタメートおよび位置17
にロイシンを含有するものである。
型の例は、位置39にアミノ酸グルタメートおよび位置17
にロイシンを含有するものである。
材料および方法 合成遺伝子、組換えプラスミドおよび合成遺伝子を含
有する発現ベクターは、次の材料および方法を使用して
調製しかつ特性づけることができる： １）酵素 DNAポリメラーゼ、クレノー;T4−リガーゼ（0.9単位
／μｌ）；リゾチーム;RNase Aポリヌクレオチドキナー
ゼ［ベーリンガー，マンハイム（Boeringer,Mannheim）
から］。
有する発現ベクターは、次の材料および方法を使用して
調製しかつ特性づけることができる： １）酵素 DNAポリメラーゼ、クレノー;T4−リガーゼ（0.9単位
／μｌ）；リゾチーム;RNase Aポリヌクレオチドキナー
ゼ［ベーリンガー，マンハイム（Boeringer,Mannheim）
から］。
制限酵素［ベーリンガー，マンハイム（Boeringer,Ma
nnheim）、ベセスダ・リサーチ・ラブス（Bethesda Res
earch Labs）およびバイオラブス（Biolabs）から］
を、製造業者の指示に従って使用した。
nnheim）、ベセスダ・リサーチ・ラブス（Bethesda Res
earch Labs）およびバイオラブス（Biolabs）から］
を、製造業者の指示に従って使用した。
２）試薬 ARP、dATP、TTP［シグマ（Sigma）から］； DTE、チミジン［サーバ（Serva）、ハイデルベルグか
ら］； サッカロース［ベセスダ・リサーチ・ラブス（Bethes
da Research Labs）から］； ジアミノピメリン酸、塩化ルビジウム［シグマ（Sigm
a）から］； すべての他の試薬は分析等級であった［メルク（Mer
k）、ダーマシュタット（Dermastadt）および／または
シグマ（Sigma）］。
ら］； サッカロース［ベセスダ・リサーチ・ラブス（Bethes
da Research Labs）から］； ジアミノピメリン酸、塩化ルビジウム［シグマ（Sigm
a）から］； すべての他の試薬は分析等級であった［メルク（Mer
k）、ダーマシュタット（Dermastadt）および／または
シグマ（Sigma）］。
２）DNA/プラスミド プラスミドpUC 8;5′−ホスホリル化Bam Hlリンカー
［Ｐ−Ｌバイオケミカルス（Biochemicals）］［ファー
マシア（Pharmacia）］； プラスミドpUR 278［U.リュザー（Ｒther）および
B.ミュラー−ヒル（Ｍller−Hill）（1983）、EMBO
J.,２,1971−1974］； プラスミドpPLc24は、W.フィーアス（Fiers）（ゲン
ト大学、ベルギー）から得た［pPLc24の構成:E.レマル
ト（Remault）ら、遺伝子（Gene）、15、81−93］。
［Ｐ−Ｌバイオケミカルス（Biochemicals）］［ファー
マシア（Pharmacia）］； プラスミドpUR 278［U.リュザー（Ｒther）および
B.ミュラー−ヒル（Ｍller−Hill）（1983）、EMBO
J.,２,1971−1974］； プラスミドpPLc24は、W.フィーアス（Fiers）（ゲン
ト大学、ベルギー）から得た［pPLc24の構成:E.レマル
ト（Remault）ら、遺伝子（Gene）、15、81−93］。
４）菌株 E.coli RRI M15［ATCCから（No.35 102）］;E.coli C
600［pcI 857］は、W.フィーアス（Fiers）（ゲント大
学、ベルギー）から得た［pPLc24の構成:E.レマルト（R
emault）ら、遺伝子（Gene）、15、81−93;E.coli C 60
0:ATCC 23724］。
600［pcI 857］は、W.フィーアス（Fiers）（ゲント大
学、ベルギー）から得た［pPLc24の構成:E.レマルト（R
emault）ら、遺伝子（Gene）、15、81−93;E.coli C 60
0:ATCC 23724］。
５）培地 バクト−トリプトン；バクト−酵母−エキス；バクト
−寒天［ディフコ（DIFCO）から］； LB−培地（１リットルについて）:10gのバクト−トリ
プトン、5gのバクト−酵母−エキス、10gのNaCl、NaOH
でpH7.5に調節した。
−寒天［ディフコ（DIFCO）から］； LB−培地（１リットルについて）:10gのバクト−トリ
プトン、5gのバクト−酵母−エキス、10gのNaCl、NaOH
でpH7.5に調節した。
カッパ1776−培地（１リットルについて）:25gのバク
ト−トリプトン、7.5gのバクト−酵母−エキス、20mlの
１モルのトリス−HCl pH7.5、を950mlの蒸留水中に溶解
し、そしてオートクレーブ処理する。冷却後、次の試薬
を添加した:5mlの１モルの塩化マグネシウム、10mlの１
％のジアミノピメリン酸、10mlの0.4％のチミジン、25m
lの20％のグルコース（すべての添加した溶液は機能的
によって滅菌した）。
ト−トリプトン、7.5gのバクト−酵母−エキス、20mlの
１モルのトリス−HCl pH7.5、を950mlの蒸留水中に溶解
し、そしてオートクレーブ処理する。冷却後、次の試薬
を添加した:5mlの１モルの塩化マグネシウム、10mlの１
％のジアミノピメリン酸、10mlの0.4％のチミジン、25m
lの20％のグルコース（すべての添加した溶液は機能的
によって滅菌した）。
寒天板は、15gのバクト−寒天を１リットルの適当な
培地に添加することによって調製した。
培地に添加することによって調製した。
６）抗生物質 クロランフェニコールおよびカナマイシン−サルフェ
ート［ベーリンガー，マンハイム（Boeringer,Mannhei
m）から］。
ート［ベーリンガー，マンハイム（Boeringer,Mannhei
m）から］。
アンピシリンおよびテトラサイクリン［サーバ（Serv
a）、ハイデルベルグ、から］。
a）、ハイデルベルグ、から］。
７）緩衝液および溶液 10ミリモルの 水中 ATP: 10×リガーゼ−混合物:0.5モルのトリス−HCl（pH7.
5）;0.1モルのMgCl2;0.1モルのDTE;10ミリモルのATP 10×SP−50:100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100ミ
リモルのMgCl2;500ミリモルのNaCl;10ミリモルのDTT 10×SP−100:100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100
ミリモルのMgCl2;1モルのCaCl2;10ミリモルのDTT 10×SP−0:100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100ミ
リモルのMgCl2;10ミリモルのDTT 20×Ｅ−緩衝液:0.8モルのトリス;0.4モルの酢酸ナトリ
ウム;40ミリモルのEDTA;pH8.3ZnCl2、10ミリモルのスパ
ーミジン 形質転換緩衝液（次のように調製した）:15gのサッカ
ロース、1mlの3.5モルのKOH、1mlの１モルのCaCl2、2ml
の5.0モルのRbCl、アクアバイデスト（aquabidest）で5
0mlにし、10％酢酸でpH6.2に調節し、1mlの4.5モルのMn
Cl2を添加し、10％酢酸でpH5.8にし、100mlにアクアバ
イデストを充填し、そしてろ過滅菌する。
5）;0.1モルのMgCl2;0.1モルのDTE;10ミリモルのATP 10×SP−50:100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100ミ
リモルのMgCl2;500ミリモルのNaCl;10ミリモルのDTT 10×SP−100:100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100
ミリモルのMgCl2;1モルのCaCl2;10ミリモルのDTT 10×SP−0:100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100ミ
リモルのMgCl2;10ミリモルのDTT 20×Ｅ−緩衝液:0.8モルのトリス;0.4モルの酢酸ナトリ
ウム;40ミリモルのEDTA;pH8.3ZnCl2、10ミリモルのスパ
ーミジン 形質転換緩衝液（次のように調製した）:15gのサッカ
ロース、1mlの3.5モルのKOH、1mlの１モルのCaCl2、2ml
の5.0モルのRbCl、アクアバイデスト（aquabidest）で5
0mlにし、10％酢酸でpH6.2に調節し、1mlの4.5モルのMn
Cl2を添加し、10％酢酸でpH5.8にし、100mlにアクアバ
イデストを充填し、そしてろ過滅菌する。
TE緩衝液:10ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）、0.1ミリ
モルのEDTA 10×NT−緩衝液:0.5モルのトリス−HCl（pH7.2）;0.17M
gCl2、１ミリモルのDTE リゾチーム混合物:50ミリモルのグルコース、１ミリモ
ルのEDTA中2mg/ml、10ミリモルのトリス−HCl pH8.0、
使用前新しく調製する。
モルのEDTA 10×NT−緩衝液:0.5モルのトリス−HCl（pH7.2）;0.17M
gCl2、１ミリモルのDTE リゾチーム混合物:50ミリモルのグルコース、１ミリモ
ルのEDTA中2mg/ml、10ミリモルのトリス−HCl pH8.0、
使用前新しく調製する。
フェノール／セバグ（Sevag）:80％のフェノールおよび
１容量のセバグ（クロロホルム：イソアミルアルコー
ル、24:1）の混合物 TEABC−緩衝液：蒸留水中の１モルのトリエチルアミ
ン、気体のCO2でpH7.2に調節した。
１容量のセバグ（クロロホルム：イソアミルアルコー
ル、24:1）の混合物 TEABC−緩衝液：蒸留水中の１モルのトリエチルアミ
ン、気体のCO2でpH7.2に調節した。
10×PNK−混合物:0.5トリス−HCl（pH7.6）、0.1モルの
MgCl2、50ミリモルのMDTE、１ミリモルのEDTA 10×リガーゼ−混合物:0.5モルのトリス−HCl（pH7.
4）、0.1モルのMgCl2、0.1モルのDTE、10ミリモルのATP 方法 組換えDNAの研究のための標準法は、マニアチス（Man
iatis）ら（1982）、分子クローニング（Molecular Clo
ning）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク
州、コールド・スプリング・ハーバー、米国、に記載さ
れているようにして使用した。
MgCl2、50ミリモルのMDTE、１ミリモルのEDTA 10×リガーゼ−混合物:0.5モルのトリス−HCl（pH7.
4）、0.1モルのMgCl2、0.1モルのDTE、10ミリモルのATP 方法 組換えDNAの研究のための標準法は、マニアチス（Man
iatis）ら（1982）、分子クローニング（Molecular Clo
ning）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク
州、コールド・スプリング・ハーバー、米国、に記載さ
れているようにして使用した。
標準のエタノール沈殿 DNA沈殿を溶解するか、あるいは溶液を0.3モルの酢酸
ナトリウムに調節し、２体積のエタノールを添加し、−
70℃において15分間インキュベーションし、そして遠心
した。沈殿を80％のエタノールで２回洗浄し、そして真
空乾燥した。
ナトリウムに調節し、２体積のエタノールを添加し、−
70℃において15分間インキュベーションし、そして遠心
した。沈殿を80％のエタノールで２回洗浄し、そして真
空乾燥した。
標準のフェノール抽出 溶液をフェノール／セバグ（1:1）とよく混合し、遠
心し、そしてフェノール相を1/10体積のTE−緩衝液また
は水で再抽出した。水性相をプールした。
心し、そしてフェノール相を1/10体積のTE−緩衝液また
は水で再抽出した。水性相をプールした。
DNAの標準の脱リン酸化 完全に消化しかつ精製したDNAを水中に溶解し、そし
て１×CIP−緩衝液（標準の体制48μｌ）に調節した。3
0分後、１μｌのコウシ腸ホスファターゼを37℃におい
て添加することによって反応を開始し、再び１μｌのCI
Pを添加した。１時間後、５μｌの５ミリモルのEGTAを
添加することによって停止し、そして65℃で10分間イン
キュベーションした。平滑末端または切除した５′末端
をもつDNAを脱リン酸化するために、それぞれ、37℃に
おいて15分間および56℃において15分間反復してインキ
ュベーションした。DNAをフェノール／セバグで抽出
し、そしてエタノールで沈殿させた。
て１×CIP−緩衝液（標準の体制48μｌ）に調節した。3
0分後、１μｌのコウシ腸ホスファターゼを37℃におい
て添加することによって反応を開始し、再び１μｌのCI
Pを添加した。１時間後、５μｌの５ミリモルのEGTAを
添加することによって停止し、そして65℃で10分間イン
キュベーションした。平滑末端または切除した５′末端
をもつDNAを脱リン酸化するために、それぞれ、37℃に
おいて15分間および56℃において15分間反復してインキ
ュベーションした。DNAをフェノール／セバグで抽出
し、そしてエタノールで沈殿させた。
標準の結合 標準の結合のため、ベクターより５倍モル過剰の断片
を使用した。最後のDNAの濃度は25μl/mlであった。DNA
を少量のTE−緩衝液中に溶解した。30μｌの標準の体積
で１×リカーゼ混合物（50ミリモルのトリス−HCl pH7.
4、10ミリモルのMgCl2、１ミリモルのATP）中のT4 DNA
リガーゼを使用して、14℃で16時間結合を実施した。
を使用した。最後のDNAの濃度は25μl/mlであった。DNA
を少量のTE−緩衝液中に溶解した。30μｌの標準の体積
で１×リカーゼ混合物（50ミリモルのトリス−HCl pH7.
4、10ミリモルのMgCl2、１ミリモルのATP）中のT4 DNA
リガーゼを使用して、14℃で16時間結合を実施した。
標準の制限エンドヌクレアーゼの消化 制限エンドヌクレアーゼの消化は、主として供給者の
マニュアルに従って実施した。
マニュアルに従って実施した。
精製した塩不含DNAを緩衝液（使用した酵素に依存し
てＳ−０、Ｓ−50またはＳ−100）中に溶解し、そして
適当量の酵素で消化した。最後に、材料をフェノールで
抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。
てＳ−０、Ｓ−50またはＳ−100）中に溶解し、そして
適当量の酵素で消化した。最後に、材料をフェノールで
抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。
アガロースゲルの電気泳動後のDNA断片の標準の単離 DNA断片をアガロースゲルの電気泳動によって分離し
［参照、T.マニアチス（Maniatis）ら（1982）、分子ク
ローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）］、臭化エチジウムで着色し、そして長波
長の紫外線の下で切出した。スライスを透析袋中に入
れ、0.5×Ｅ−緩衝液を充填し（容量比、緩衝液：ゲル
のスライス15:1）そして緩衝液で良好に取囲まなくては
ならない。気泡を含まない密閉した袋を、0.5×Ｅ−緩
衝液を充填し透析室内に入れた。電気泳動を200Vで30分
間実施し、次いで電流の極性を逆転してDNAを透析袋の
壁から解放した。ゲルのスライスを取囲む緩衝液を注意
して取り出し、そしてDEAEまたはDE 52カラム（上を参
照）でさらに精製した。
［参照、T.マニアチス（Maniatis）ら（1982）、分子ク
ローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）］、臭化エチジウムで着色し、そして長波
長の紫外線の下で切出した。スライスを透析袋中に入
れ、0.5×Ｅ−緩衝液を充填し（容量比、緩衝液：ゲル
のスライス15:1）そして緩衝液で良好に取囲まなくては
ならない。気泡を含まない密閉した袋を、0.5×Ｅ−緩
衝液を充填し透析室内に入れた。電気泳動を200Vで30分
間実施し、次いで電流の極性を逆転してDNAを透析袋の
壁から解放した。ゲルのスライスを取囲む緩衝液を注意
して取り出し、そしてDEAEまたはDE 52カラム（上を参
照）でさらに精製した。
標準の形質転換手順 形質転換は、D.ハナバン（Hanaban）（1983）、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.B
i o l.）、166、557−580、の手順に従い実施した。
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.B
i o l.）、166、557−580、の手順に従い実施した。
単一のコロニーを接種しそしてカッパ1776培地中で増
殖させた（37℃、200rpmの振盪機）宿主菌株の培養物の
20mlの１夜の培養物の1mlを使用して、100mlの予備加温
した（37℃）のカッパ1776培地を接種した。
殖させた（37℃、200rpmの振盪機）宿主菌株の培養物の
20mlの１夜の培養物の1mlを使用して、100mlの予備加温
した（37℃）のカッパ1776培地を接種した。
この培養物を同一条件下に培養した。細胞の増殖を0.
2光学濃度（OD）（500nm）で停止させた。４℃に冷却し
そして遠心した後、細胞の沈殿物を20mlの氷冷形質転換
緩衝液中に再懸濁させ、そして０℃において５分間イン
キュベーションした。懸濁液を再び遠心（3000rpm、４
℃、15分）し、そして沈殿を4mlの氷冷形質転換緩衝液
中に再懸濁させた。200μｌのアリコートに７モルのDMS
Oを添加した後、細胞を氷水中でさらに15〜60分間イン
キュベーションした。このような完全な細胞のアリコー
トに、20μｌのTE−緩衝液中に溶解したDNAを添加し、
そしてこの混合物を氷水中で20分間インキュベーション
し、次いで３分間42℃でインキュベーションした。次い
で、1mlの予備加温した（37℃）カッパ1776培地をこの
ようなアリコートで接種し、そして37℃で１時間培養し
た。形質転換体を平板培養するため、細胞を遠心し（30
00rpm、15分、４℃）、YT培地中に再懸濁させ、インジ
ケーター平板（indicator plate）上に配置した。期待
する数の形質転換体に従い、適当量の懸濁液を平板培養
に使用した。
2光学濃度（OD）（500nm）で停止させた。４℃に冷却し
そして遠心した後、細胞の沈殿物を20mlの氷冷形質転換
緩衝液中に再懸濁させ、そして０℃において５分間イン
キュベーションした。懸濁液を再び遠心（3000rpm、４
℃、15分）し、そして沈殿を4mlの氷冷形質転換緩衝液
中に再懸濁させた。200μｌのアリコートに７モルのDMS
Oを添加した後、細胞を氷水中でさらに15〜60分間イン
キュベーションした。このような完全な細胞のアリコー
トに、20μｌのTE−緩衝液中に溶解したDNAを添加し、
そしてこの混合物を氷水中で20分間インキュベーション
し、次いで３分間42℃でインキュベーションした。次い
で、1mlの予備加温した（37℃）カッパ1776培地をこの
ようなアリコートで接種し、そして37℃で１時間培養し
た。形質転換体を平板培養するため、細胞を遠心し（30
00rpm、15分、４℃）、YT培地中に再懸濁させ、インジ
ケーター平板（indicator plate）上に配置した。期待
する数の形質転換体に従い、適当量の懸濁液を平板培養
に使用した。
標準の急速分析プラスミド単離 記載する手順は、H.C.バーンボイム（Birnboim）およ
びJ.ドリイ（Doly）（1979）、核酸の研究（Nucl.Acids
Res.）、７、1513およびT.マニアチス（Maniatis）ら
（1982）、分子クローニング（Molecular Cloning）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）の方法の修正法である。
分析すべき形質転換体の各々について、2mlの１夜の培
養物を調製した（37℃、16時間、回転車）。培養物の1.
5mlを１分間12,000×ｇで遠心した。沈殿をリゾチーム
混合物の新しく調製した溶液中に再溶解し、そして20℃
で５分間インキュベーションした。１％のSDSを含有す
る新しく調製した氷冷0.2ミリモルのNaOHを添加した
後、試料を５分間氷上でさらにインキュベーションし
た。染色体DNAおよび蛋白質を沈殿させるために、150μ
ｌの酢酸カリウム、pH7.8、を添加した。氷上で５分間
インキュベーションしそして10分間12,000×ｇで遠心し
た後、上澄みを新しい管に移し、そしてセバグ（Seva
g）で抽出した。500μｌのイソプロパノールを水性相に
添加した。次いで、この混合物を−20℃で30分間インキ
ュベーションした。遠心（10分、12,000×ｇ）後、沈殿
を80％のエタノールで洗浄し、そして簡単に真空乾燥し
た。
びJ.ドリイ（Doly）（1979）、核酸の研究（Nucl.Acids
Res.）、７、1513およびT.マニアチス（Maniatis）ら
（1982）、分子クローニング（Molecular Cloning）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）の方法の修正法である。
分析すべき形質転換体の各々について、2mlの１夜の培
養物を調製した（37℃、16時間、回転車）。培養物の1.
5mlを１分間12,000×ｇで遠心した。沈殿をリゾチーム
混合物の新しく調製した溶液中に再溶解し、そして20℃
で５分間インキュベーションした。１％のSDSを含有す
る新しく調製した氷冷0.2ミリモルのNaOHを添加した
後、試料を５分間氷上でさらにインキュベーションし
た。染色体DNAおよび蛋白質を沈殿させるために、150μ
ｌの酢酸カリウム、pH7.8、を添加した。氷上で５分間
インキュベーションしそして10分間12,000×ｇで遠心し
た後、上澄みを新しい管に移し、そしてセバグ（Seva
g）で抽出した。500μｌのイソプロパノールを水性相に
添加した。次いで、この混合物を−20℃で30分間インキ
ュベーションした。遠心（10分、12,000×ｇ）後、沈殿
を80％のエタノールで洗浄し、そして簡単に真空乾燥し
た。
標準のDNA配列決定 標準の段配列決定は、製造業者のプロトコル［急速か
つ簡単なプラスミドの配列決定のためのガイドライン
（Guidelines for Quick and Simple Plasmid Sequenci
ng）、ベーリンガー，マンハイム（Boeringer,Mannhei
m）（1986）］に記載されるようにして実施した。
つ簡単なプラスミドの配列決定のためのガイドライン
（Guidelines for Quick and Simple Plasmid Sequenci
ng）、ベーリンガー，マンハイム（Boeringer,Mannhei
m）（1986）］に記載されるようにして実施した。
バクテリア菌株の増殖および誘導 バクテリアの培養物は、適当な抗生物質を補足した培
地中で増殖させた。β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質
の発現を試みるため、発現プラスミドpES44.1.1またはp
ES45.1.3で形質転換したE.coli RRI M15を2mlのLB−ア
ンピシリン培地中に接種した。振盪フラスコ内で37℃に
おいて12〜16時間増殖させた後、1mlの試料を直接使用
して、0.2ミリモルのIPTGを含有する100mlのLB−アンピ
シリン培地を接種した。アプロチニン遺伝子のインサー
トをもたないpUR278を含有するクローンを、陰性の対照
を提供する条件下に培養した。攪拌しながら37℃で12〜
16時間増殖させた後、１ベックマン（Beckman）JA 10ロ
ーター中で10分間500rpmで遠心することによって細胞を
収穫した。
地中で増殖させた。β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質
の発現を試みるため、発現プラスミドpES44.1.1またはp
ES45.1.3で形質転換したE.coli RRI M15を2mlのLB−ア
ンピシリン培地中に接種した。振盪フラスコ内で37℃に
おいて12〜16時間増殖させた後、1mlの試料を直接使用
して、0.2ミリモルのIPTGを含有する100mlのLB−アンピ
シリン培地を接種した。アプロチニン遺伝子のインサー
トをもたないpUR278を含有するクローンを、陰性の対照
を提供する条件下に培養した。攪拌しながら37℃で12〜
16時間増殖させた後、１ベックマン（Beckman）JA 10ロ
ーター中で10分間500rpmで遠心することによって細胞を
収穫した。
標準SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ラエムリ（Laemmli）,U.K.（1979），ネイチュアー
（Nature）、277、680ページ、およびまたB.D.ヘイムス
（Hames）およびD.リックウッド（Rickwood）、1981、
蛋白質のゲル電気泳動（Gel electrophoresis of prote
ins）、IRLプレス・リミテッド、オックスフォード、に
従うSDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動を用いて蛋
白質を検出した。
（Nature）、277、680ページ、およびまたB.D.ヘイムス
（Hames）およびD.リックウッド（Rickwood）、1981、
蛋白質のゲル電気泳動（Gel electrophoresis of prote
ins）、IRLプレス・リミテッド、オックスフォード、に
従うSDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動を用いて蛋
白質を検出した。
約１×109の細胞を遠心し、SDS試料緩衝液（70ミリモ
ルのトリス、10％のグリセロール、１％のSDS、５％の
β−メルカプトエタノール、0.1ミリモルのEDTA）中に
再溶解し、95℃で５分間インキュベーションし、そして
レーンの各々に適用した。電気泳動後、ゲルをクーマッ
シーブルー（Coomassie blue）で着色した。
ルのトリス、10％のグリセロール、１％のSDS、５％の
β−メルカプトエタノール、0.1ミリモルのEDTA）中に
再溶解し、95℃で５分間インキュベーションし、そして
レーンの各々に適用した。電気泳動後、ゲルをクーマッ
シーブルー（Coomassie blue）で着色した。
アミノ酸配列の決定 約0.5〜２ナノモルの蛋白質を30μｌのTFA中に可溶化
した。試料を3mgのポリブレンで予備処理したガラス繊
維のフィルターに適用した。配列の分析は、ヘウィック
（Hewick）［R.M.ヘウィック（Hewick）、M.W.フンカピ
ラー（Hunkappiller）、L.E.フード（Hood）、W.ドレガ
ー（Dreger）1981、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、256、7990−7997］
に従って、アプライド・バイオシステムス・インコーポ
レーテッド（Applied Biosystems Inc.）（米国）から
の気相蛋白質配列決定装置によって実施した。各工程に
おいて遊離したアミノ酸フェニルチオヒダントイン誘導
体は、シアノ−HPLCカラム（デュポン）およびベイレウ
サー（Beyreuther）［K.ベイレウサー（Beyreuther）、
B.ビースラー（Biesler）、J.ボウウェンス（Bowen
s）、R.ディルドロップ（Dildrop）、K.ネウファー（Ne
ufer）、K.スチューバー（Stber）、S.ザイス（Zai
s）、R.エーリング（Ehring）、P.ゼイベル（Zabel）
（1983）、蛋白質化学における現代の方法（Modern Met
hods in protein chemistry）、303−325、ウォルター
・デ・グルイター（Walter de Gruyter）＋カンパニー
（Co.）、ベルリン］に記載される分離システムを使用
して分析した。ウォーターズ（Waeters）HPLCシステ
ム、M510ポンプ、WISP710オートインゼクター、LC−分
光光度計M481およびシマズ積分装置Ｃ−R3Aを含む、を
使用した。
した。試料を3mgのポリブレンで予備処理したガラス繊
維のフィルターに適用した。配列の分析は、ヘウィック
（Hewick）［R.M.ヘウィック（Hewick）、M.W.フンカピ
ラー（Hunkappiller）、L.E.フード（Hood）、W.ドレガ
ー（Dreger）1981、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、256、7990−7997］
に従って、アプライド・バイオシステムス・インコーポ
レーテッド（Applied Biosystems Inc.）（米国）から
の気相蛋白質配列決定装置によって実施した。各工程に
おいて遊離したアミノ酸フェニルチオヒダントイン誘導
体は、シアノ−HPLCカラム（デュポン）およびベイレウ
サー（Beyreuther）［K.ベイレウサー（Beyreuther）、
B.ビースラー（Biesler）、J.ボウウェンス（Bowen
s）、R.ディルドロップ（Dildrop）、K.ネウファー（Ne
ufer）、K.スチューバー（Stber）、S.ザイス（Zai
s）、R.エーリング（Ehring）、P.ゼイベル（Zabel）
（1983）、蛋白質化学における現代の方法（Modern Met
hods in protein chemistry）、303−325、ウォルター
・デ・グルイター（Walter de Gruyter）＋カンパニー
（Co.）、ベルリン］に記載される分離システムを使用
して分析した。ウォーターズ（Waeters）HPLCシステ
ム、M510ポンプ、WISP710オートインゼクター、LC−分
光光度計M481およびシマズ積分装置Ｃ−R3Aを含む、を
使用した。
酸の加水分解およびアミノ酸分析 約1mlの蛋白質をバイレックス管に入れ、これに0.05
％の２−メルカプトエタノールを含有する６モルのHCl
（一定沸点のHCl）の200μｌ［I.T.ポッツ（Potts）Jr.
1969、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bio
cheim.）、131、１−15］を添加した。管を真空下に密
閉し、そして110℃で22時間インキュベーションした。
加水分解物を急速に乾燥し、150μｌの0.2モルのクエン
酸ナトリウム緩衝液pH2.2中に再溶解しそしてろ過し
た。蛍光検出器およびシマズＣ−R2AX積分装置を装備し
たバイオトロニック（Biotronic）LC5000アミノ酸分析
装置で、アミノ酸を分析した。アミノ酸は、J.R.ベンソ
ン（Benson）、P.E.ヘアー（Hare）、1975、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Nati.Acad.Sci.）USA、72、619−622に
本質的に記載されるようにして、ｏ−フタルジアルデヒ
ドとの反応後、定量した。
％の２−メルカプトエタノールを含有する６モルのHCl
（一定沸点のHCl）の200μｌ［I.T.ポッツ（Potts）Jr.
1969、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bio
cheim.）、131、１−15］を添加した。管を真空下に密
閉し、そして110℃で22時間インキュベーションした。
加水分解物を急速に乾燥し、150μｌの0.2モルのクエン
酸ナトリウム緩衝液pH2.2中に再溶解しそしてろ過し
た。蛍光検出器およびシマズＣ−R2AX積分装置を装備し
たバイオトロニック（Biotronic）LC5000アミノ酸分析
装置で、アミノ酸を分析した。アミノ酸は、J.R.ベンソ
ン（Benson）、P.E.ヘアー（Hare）、1975、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Nati.Acad.Sci.）USA、72、619−622に
本質的に記載されるようにして、ｏ−フタルジアルデヒ
ドとの反応後、定量した。
白血球エラスターゼについての阻害アッセイ 白血球エラスターゼは、K.ナカジマら（1979）、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）、254、4027に記載されるようにして決定し
た。アッセイの条件は次の通りであった： 基質（原溶液） ジメチルホルムアミド中の0.1モ
ルのメトキシスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−バリン−ｐ−ニトロ−アニリン。
この原溶液は−18℃で貯蔵した。
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）、254、4027に記載されるようにして決定し
た。アッセイの条件は次の通りであった： 基質（原溶液） ジメチルホルムアミド中の0.1モ
ルのメトキシスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−バリン−ｐ−ニトロ−アニリン。
この原溶液は−18℃で貯蔵した。
基質（量／試験） 6.5μｌ 基質−供給者 ベイチェム（Bachem）ブンデルド
ルフ／スイス 酵素（原溶液） 50％のエチレングリコール中の0.
01mg/mlのヒト白血球エラスターゼ。この原溶液は−18
℃で貯蔵した。
ルフ／スイス 酵素（原溶液） 50％のエチレングリコール中の0.
01mg/mlのヒト白血球エラスターゼ。この原溶液は−18
℃で貯蔵した。
酵素（量／試験） ５μｌ 酵素−供給者 エラスチン・プロダクツ・カンパ
ニー（Elastin Products Company）パシフィック／米国 緩衝液 0.2モルのトリス/HCl、pH8.0＋0.
05％のツイーン80 一般手順 阻害剤の試料を、最終体積（基質の添加後）0.65mlに
なるような量の緩衝液で希釈した。次に、酵素を添加
し、そしてこの混合物を室温で30分間放置した。最後
に、基質溶液を添加し、そして405nmにおけ光学濃度の
増加を引続いて各試料について自動的に記録した。最初
の10分間の光学濃度の直線的増加（OD）を、酵素の活性
として取った。
ニー（Elastin Products Company）パシフィック／米国 緩衝液 0.2モルのトリス/HCl、pH8.0＋0.
05％のツイーン80 一般手順 阻害剤の試料を、最終体積（基質の添加後）0.65mlに
なるような量の緩衝液で希釈した。次に、酵素を添加
し、そしてこの混合物を室温で30分間放置した。最後
に、基質溶液を添加し、そして405nmにおけ光学濃度の
増加を引続いて各試料について自動的に記録した。最初
の10分間の光学濃度の直線的増加（OD）を、酵素の活性
として取った。
阻害活性を決定するために、阻害剤を添加したときお
よび添加しないときの酵素の活性を測定した。阻害の程
度（％）を、次のようにして決定した： 阻害剤でヒト白血球エラスターゼを滴定したとき得られ
るKi値の決定 約200ngのヒト白血球エラスターゼを900μｌの0.2モ
ルのトリス−緩衝液pH8.0、各々0.05％のツイーン80を
含む、中の溶液の１系列に、異なる量の阻害剤を添加す
る。試験緩衝液で体積を985μｌに補足した後、この混
合物を室温で少なくとも２時間保持する。次いで、10μ
ｌの基質原溶液−59mgのMeOSuc−Ala−Ala−Pro−Val−
pNA/1mlジメチルスルホキシド−および990μｌの試験緩
衝液から構成された混合物の15μｌを、サーモスタット
制御のクベットホルダー内で30℃に５分間平衡にした
後、各試料に添加し、そして405nmにおける光学濃度の
増加を決定した。Ki値はM.W.エンピー（Empie）および
M.ラスコウスキー（Laskowski）Jr.、バイオケミストリ
ー（Biochemistry）、21、2274−2284（1982）に従い、
次の等式を使用して計算する： この等式において、［Ef］および［If］は、それぞ
れ、複合体化しない酵素および複合体化しない阻害剤の
モル濃度である；［EI］は酵素阻害剤複合体のモル濃度
である。
よび添加しないときの酵素の活性を測定した。阻害の程
度（％）を、次のようにして決定した： 阻害剤でヒト白血球エラスターゼを滴定したとき得られ
るKi値の決定 約200ngのヒト白血球エラスターゼを900μｌの0.2モ
ルのトリス−緩衝液pH8.0、各々0.05％のツイーン80を
含む、中の溶液の１系列に、異なる量の阻害剤を添加す
る。試験緩衝液で体積を985μｌに補足した後、この混
合物を室温で少なくとも２時間保持する。次いで、10μ
ｌの基質原溶液−59mgのMeOSuc−Ala−Ala−Pro−Val−
pNA/1mlジメチルスルホキシド−および990μｌの試験緩
衝液から構成された混合物の15μｌを、サーモスタット
制御のクベットホルダー内で30℃に５分間平衡にした
後、各試料に添加し、そして405nmにおける光学濃度の
増加を決定した。Ki値はM.W.エンピー（Empie）および
M.ラスコウスキー（Laskowski）Jr.、バイオケミストリ
ー（Biochemistry）、21、2274−2284（1982）に従い、
次の等式を使用して計算する： この等式において、［Ef］および［If］は、それぞ
れ、複合体化しない酵素および複合体化しない阻害剤の
モル濃度である；［EI］は酵素阻害剤複合体のモル濃度
である。
実施例 実施例１ Val−15−アプロチニン変異型の遺伝情報を指定するDNA
断片の合成および精製 遺伝子を構成するオリゴヌクレオチド（第２図参照）
を、固相合成法に従い調製した。オリゴマーのための合
成法は、プロトン活性化、保護した２′−デオキシリボ
ヌクレオチドホスホルアミダイトを利用した。すべての
順次の工程は、アプライド・バイオシステム380DNA合成
装置で保護したヌクレオチド、溶媒、化学物質、および
この製造業者から得た試薬を使用して自動化した方法で
実施した。また、同一製造業者からの固相支持体は、制
御した孔のガラスであり、これに出発３′−ヌクレオチ
ドはすでに取付けられていた。ある種の修正は、製造業
者の操作の指示および使用の報告に従って、自動化反応
サイクル中に導入した。合成が完成したとき、オリゴマ
ーを製造業者の推奨に従いDNA合成装置内で、脱遮断し
そして固体の支持体から切離した。
断片の合成および精製 遺伝子を構成するオリゴヌクレオチド（第２図参照）
を、固相合成法に従い調製した。オリゴマーのための合
成法は、プロトン活性化、保護した２′−デオキシリボ
ヌクレオチドホスホルアミダイトを利用した。すべての
順次の工程は、アプライド・バイオシステム380DNA合成
装置で保護したヌクレオチド、溶媒、化学物質、および
この製造業者から得た試薬を使用して自動化した方法で
実施した。また、同一製造業者からの固相支持体は、制
御した孔のガラスであり、これに出発３′−ヌクレオチ
ドはすでに取付けられていた。ある種の修正は、製造業
者の操作の指示および使用の報告に従って、自動化反応
サイクル中に導入した。合成が完成したとき、オリゴマ
ーを製造業者の推奨に従いDNA合成装置内で、脱遮断し
そして固体の支持体から切離した。
オリゴマーを含有する水溶液に濃水酸化アンモニウム
とともに55℃に４〜24時間密閉したバイアル中で加熱す
ることによって、遮断基を除去した。生ずる溶液を蒸発
させ、残留物を0.01モルの重炭酸トリエチルアンモニウ
ム緩衝液、pH7.0（TEAB緩衝液）中に溶解した。この溶
液をセファデックス（Sephadexσ）のゲルろ過樹脂のク
ロマトグラフィーにかけた。このカラムを同一のTEAB緩
衝液中で調製しかつ溶離した。空隙体積で溶離される物
質をプールし、そして溶液を蒸発させた。
とともに55℃に４〜24時間密閉したバイアル中で加熱す
ることによって、遮断基を除去した。生ずる溶液を蒸発
させ、残留物を0.01モルの重炭酸トリエチルアンモニウ
ム緩衝液、pH7.0（TEAB緩衝液）中に溶解した。この溶
液をセファデックス（Sephadexσ）のゲルろ過樹脂のク
ロマトグラフィーにかけた。このカラムを同一のTEAB緩
衝液中で調製しかつ溶離した。空隙体積で溶離される物
質をプールし、そして溶液を蒸発させた。
残留物の一部（260nmにおける吸収単位の10〜40％）
を装入緩衝液（組成:0.1％のブロモフェノールブルー、
0.1％のキシレンシアノール、10ミリモルの二ナトリウ
ムEDTA、ホルムアルデヒド中）中に溶解し、ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動によってさらに精製した。ゲル
の大きさ18×32mmであり、厚さは1.5mmであった。この
方法で精製した各オリゴマーについてのウェルの大きさ
は幅２〜5cmであり、そして５つまでのオリゴマーを単
一ゲルで精製した。ゲル中のポリアクリルアミドゲルの
濃度は、所望の産生物の鎖の長さに依存して、14〜20％
で変化した。長いオリゴマーについて、14％のアクリル
アミドゲルが好ましいが、短いオリゴマーは20％までの
アクリルアミドゲルで精製した。ゲルは、また、７モル
の尿素およびトリス−ボレートEDTA緩衝液（0.1モルの
トリス、0.1モルのボレート、２ミリモルのEDTA pH8.
3）を含有した。展開緩衝液は同一のトリス−ボレートR
DTA混合物であった。電気泳動は20〜60ワットの一定電
力で18〜６時間実施した。このような標準化された技術
は、アプライド・バイオシステムから入手可能な種々の
ユーザーの情報の報告から得られる。
を装入緩衝液（組成:0.1％のブロモフェノールブルー、
0.1％のキシレンシアノール、10ミリモルの二ナトリウ
ムEDTA、ホルムアルデヒド中）中に溶解し、ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動によってさらに精製した。ゲル
の大きさ18×32mmであり、厚さは1.5mmであった。この
方法で精製した各オリゴマーについてのウェルの大きさ
は幅２〜5cmであり、そして５つまでのオリゴマーを単
一ゲルで精製した。ゲル中のポリアクリルアミドゲルの
濃度は、所望の産生物の鎖の長さに依存して、14〜20％
で変化した。長いオリゴマーについて、14％のアクリル
アミドゲルが好ましいが、短いオリゴマーは20％までの
アクリルアミドゲルで精製した。ゲルは、また、７モル
の尿素およびトリス−ボレートEDTA緩衝液（0.1モルの
トリス、0.1モルのボレート、２ミリモルのEDTA pH8.
3）を含有した。展開緩衝液は同一のトリス−ボレートR
DTA混合物であった。電気泳動は20〜60ワットの一定電
力で18〜６時間実施した。このような標準化された技術
は、アプライド・バイオシステムから入手可能な種々の
ユーザーの情報の報告から得られる。
電気泳動の完結後、ゲルをプラスチックラップで包
み、そしてオリゴマーを紫外線でシャドーウイング（sh
adowing）することによって可視化した。シャドーウイ
ングは、包んだゲルを蛍光性薄層クロマトグラフィー板
上に配置し、そしてゲルを短い波長の紫外線源で見るこ
とによって達成する。所望の産生物は最も遅い移動する
主要なブルーのDNA断片として、このシャドーウイング
技術によって、現れる。所望のバンドをゲルから切除す
る。DNAのオリゴマーは、エピゲネ（EpiGene）Ｄ−Gel
σ電気泳動装置を使用して、粉末状ジエチルアミノエチ
ル（DEAE）セルロース上にゲルスライスから溶離する。
オリゴマーをセルロースから１モルのTEAB緩衝液で溶離
することによって回収する。オリゴマーを含有する緩衝
液を蒸発させ、残留物を0.01モルのTEAB緩衝液中に溶解
し、次いでセファデックス（Sephadexσ）Ｇ−50のカラ
ムに前述のように通過させて脱塩する。
み、そしてオリゴマーを紫外線でシャドーウイング（sh
adowing）することによって可視化した。シャドーウイ
ングは、包んだゲルを蛍光性薄層クロマトグラフィー板
上に配置し、そしてゲルを短い波長の紫外線源で見るこ
とによって達成する。所望の産生物は最も遅い移動する
主要なブルーのDNA断片として、このシャドーウイング
技術によって、現れる。所望のバンドをゲルから切除す
る。DNAのオリゴマーは、エピゲネ（EpiGene）Ｄ−Gel
σ電気泳動装置を使用して、粉末状ジエチルアミノエチ
ル（DEAE）セルロース上にゲルスライスから溶離する。
オリゴマーをセルロースから１モルのTEAB緩衝液で溶離
することによって回収する。オリゴマーを含有する緩衝
液を蒸発させ、残留物を0.01モルのTEAB緩衝液中に溶解
し、次いでセファデックス（Sephadexσ）Ｇ−50のカラ
ムに前述のように通過させて脱塩する。
空隙体積中で溶離する物質をプールし、そして凍結乾
燥して最終産生物を得る。
燥して最終産生物を得る。
上に概説した手順を使用して、精製したオリゴマーの
各々の約0.5〜5.0 A 260単位が得られた。
各々の約0.5〜5.0 A 260単位が得られた。
実施例２ Val−15−Glu−52−アプロチニンのための合成マスター
遺伝子の構成およびプラスミドpUC8中に挿入してpRK54.
1.1.を産出する方法 マスター遺伝子の設計は第１図に示されている。それ
は構成ブロックα、β、γおよびδから構成されてお
り、そして第２図に示す15の精製したオリゴヌクレオチ
ドを集成することによって構成する。第３図に示すDNA
配列は、開始コドンATG、２つの末端コドン、TAGおよび
TAA、末端制限部位EcoRI、HindIIIおよびBamHIおよび内
部の制限部位を含む。これらの部位の選択は解読配列の
クローニングおよびその修飾を促進した。
遺伝子の構成およびプラスミドpUC8中に挿入してpRK54.
1.1.を産出する方法 マスター遺伝子の設計は第１図に示されている。それ
は構成ブロックα、β、γおよびδから構成されてお
り、そして第２図に示す15の精製したオリゴヌクレオチ
ドを集成することによって構成する。第３図に示すDNA
配列は、開始コドンATG、２つの末端コドン、TAGおよび
TAA、末端制限部位EcoRI、HindIIIおよびBamHIおよび内
部の制限部位を含む。これらの部位の選択は解読配列の
クローニングおよびその修飾を促進した。
この合成遺伝子を発生するために使用した構成は、断
片のほかに、材料および方法において詳述したように、
ポリヌクレオチドキナーゼ、T4DNAリガーゼおよび制限
エンドヌクレアーゼを使用した。
片のほかに、材料および方法において詳述したように、
ポリヌクレオチドキナーゼ、T4DNAリガーゼおよび制限
エンドヌクレアーゼを使用した。
15の精製したオリゴヌクレオチド断片を、50ミリモル
のTEABC（重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液、pH7.
5）中に最終濃度10pモル／μｌで溶解した。すべての断
片のリン酸化は４つの別々の部分で実施した（断片１、
3;断片２、４、6;断片５、７、９、11、13;断片８、1
0、12、14、16）。調製の目的で、それぞれ、断片の各
々の80pモルを１×PNK−混合物、２μモルのATP、0.5μ
Ciの32γATP/10pモルの断片、10単位PNK/pモルの断片の
混合物中に溶解し、合計の体積を次のようにした：断片
１、３について300μl;断片２、４、６について400μl;
断片５、７、９、11、13について400μl;断片８、10、1
2、14、16について700μｌ）。すべての部分はフェノー
ル化し、エタノール沈殿させ、洗浄し、そして乾燥し
た。
のTEABC（重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液、pH7.
5）中に最終濃度10pモル／μｌで溶解した。すべての断
片のリン酸化は４つの別々の部分で実施した（断片１、
3;断片２、４、6;断片５、７、９、11、13;断片８、1
0、12、14、16）。調製の目的で、それぞれ、断片の各
々の80pモルを１×PNK−混合物、２μモルのATP、0.5μ
Ciの32γATP/10pモルの断片、10単位PNK/pモルの断片の
混合物中に溶解し、合計の体積を次のようにした：断片
１、３について300μl;断片２、４、６について400μl;
断片５、７、９、11、13について400μl;断片８、10、1
2、14、16について700μｌ）。すべての部分はフェノー
ル化し、エタノール沈殿させ、洗浄し、そして乾燥し
た。
ハイブリダイゼーションの目的で、断片１、３および
断片２、４、６（ブロックＡ）を、合計の体積120μｌ
で、１×リガーゼー混合物中に溶解しかつ混合し、70℃
で５分間インキュベーションし、室温に５時間以内に冷
却した。他の断片（ブロックＢ）を240μｌで同一手順
に従ってハイブリダイゼーションした。
断片２、４、６（ブロックＡ）を、合計の体積120μｌ
で、１×リガーゼー混合物中に溶解しかつ混合し、70℃
で５分間インキュベーションし、室温に５時間以内に冷
却した。他の断片（ブロックＢ）を240μｌで同一手順
に従ってハイブリダイゼーションした。
結合の目的で、ブロックＡの溶液を12μｌの10ミリモ
ルのATP、12μｌの100ミリモルのDTE、20μｌのT4 DNA
リガーゼで補足し、そしてブロック溶液を２倍量で補足
した。反応は14℃で７時間実施した。この後、10μｌの
T4 DNAリガーゼをブロックＡについて添加し、そして20
μｌをブロックＢについて添加し、そして再び14化合物
で45分間インキュベーションした。この混合物をフェノ
ール化し、エタノール沈殿させ、そして乾燥した。
ルのATP、12μｌの100ミリモルのDTE、20μｌのT4 DNA
リガーゼで補足し、そしてブロック溶液を２倍量で補足
した。反応は14℃で７時間実施した。この後、10μｌの
T4 DNAリガーゼをブロックＡについて添加し、そして20
μｌをブロックＢについて添加し、そして再び14化合物
で45分間インキュベーションした。この混合物をフェノ
ール化し、エタノール沈殿させ、そして乾燥した。
得られたブロックＡを90μｌの１×SP−100および10
μｌのEcoRI（10U/μｌ）、中に溶解し、ブロックＢを
１×SP−50および10μｌのBamHI中に溶解し、そして37
℃で１時間インキュベーションした。反応をフェノール
抽出およびエタノール沈殿によって停止させ、６％のポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動を実施し、そしてDNA
ブロックを実施例１に記載するのと同一手順に従って回
収した。
μｌのEcoRI（10U/μｌ）、中に溶解し、ブロックＢを
１×SP−50および10μｌのBamHI中に溶解し、そして37
℃で１時間インキュベーションした。反応をフェノール
抽出およびエタノール沈殿によって停止させ、６％のポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動を実施し、そしてDNA
ブロックを実施例１に記載するのと同一手順に従って回
収した。
等量の放射性標識ブロックＡおよびＢを水中に溶解
し、１×リガーゼ混合物に調節し、ゾーン最後の合成へ
の結合のため前述のようにハイブリダイゼーションし
た。したがって、３μｌの10ミリモルのATP、３μｌの1
00ミリモルのT4 DNAリガーゼを22μｌのハイブリダイゼ
ーション混合物を添加し、そして14℃で７時間インキュ
ベーションした。再び、１μｌのT4 DNAリガーゼを添加
し、そしてこの反応を14℃で45分間実施した。結合産生
物をフェノール抽出およびエタノール沈殿によって精製
した。標準の制限酵素の消化（BamHI 1.5μｌ、EcoRI
1.5μｌの二重消化）をSP−20中で実施した。この物質
をフェノール抽出し、そしてエタノール沈殿の前に、水
溶液を３ミリモルのMgCl2、0.3モルの酢酸ナトリウムに
調節した。次いで、６％のポリアクリルアミドゲルの電
気泳動を実施し、そして遺伝子を実施例１に記載するの
と同一手順に従って回収した。
し、１×リガーゼ混合物に調節し、ゾーン最後の合成へ
の結合のため前述のようにハイブリダイゼーションし
た。したがって、３μｌの10ミリモルのATP、３μｌの1
00ミリモルのT4 DNAリガーゼを22μｌのハイブリダイゼ
ーション混合物を添加し、そして14℃で７時間インキュ
ベーションした。再び、１μｌのT4 DNAリガーゼを添加
し、そしてこの反応を14℃で45分間実施した。結合産生
物をフェノール抽出およびエタノール沈殿によって精製
した。標準の制限酵素の消化（BamHI 1.5μｌ、EcoRI
1.5μｌの二重消化）をSP−20中で実施した。この物質
をフェノール抽出し、そしてエタノール沈殿の前に、水
溶液を３ミリモルのMgCl2、0.3モルの酢酸ナトリウムに
調節した。次いで、６％のポリアクリルアミドゲルの電
気泳動を実施し、そして遺伝子を実施例１に記載するの
と同一手順に従って回収した。
この手順によって得られた合成Val−15−Glu−52−ア
プロチニンマスター遺伝子を、次のようにして、EcoRI/
BamHI消化したpUC8中に挿入した［J.ビエイラ（Vieir
a）およびJ.メッシング（Messing）（1982）、遺伝子
（Gene）、19、259］： 精製したpUC8DNA（約30pモル）をEcpRIおよびBamHIで
標準の制限エンドヌクレアーゼの消化条件下に２回消化
して、小さい内部のEcoRI−BamHI断片を切出した。この
調製物をコウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化し、アガ
ロースゲルの電気泳動によって分離し、そしてこのベク
ターの大きいEcoRI−BamHI断片を精製した（標準の条
件）。
プロチニンマスター遺伝子を、次のようにして、EcoRI/
BamHI消化したpUC8中に挿入した［J.ビエイラ（Vieir
a）およびJ.メッシング（Messing）（1982）、遺伝子
（Gene）、19、259］： 精製したpUC8DNA（約30pモル）をEcpRIおよびBamHIで
標準の制限エンドヌクレアーゼの消化条件下に２回消化
して、小さい内部のEcoRI−BamHI断片を切出した。この
調製物をコウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化し、アガ
ロースゲルの電気泳動によって分離し、そしてこのベク
ターの大きいEcoRI−BamHI断片を精製した（標準の条
件）。
pRK54.1.1.の構成（第４図参照）は、合計量の精製し
た合成アプロチニン遺伝子を1pモルのベクターと結合す
ることによって実施した（1.8単位のT4 DNAリガーゼ
Ｂ、１×リガーゼ混合物、合計の体積45μｌ、14℃にお
ける７時間のインキュベーション、１単位のT4 DNAリガ
ーゼの添加および14℃における45分間の再インキュベー
ション）。
た合成アプロチニン遺伝子を1pモルのベクターと結合す
ることによって実施した（1.8単位のT4 DNAリガーゼ
Ｂ、１×リガーゼ混合物、合計の体積45μｌ、14℃にお
ける７時間のインキュベーション、１単位のT4 DNAリガ
ーゼの添加および14℃における45分間の再インキュベー
ション）。
D.ハナハン（Hanahan）からの形質転換の手順に従
い、E. coli RRI M15［A.カルニンス（Kalnins）ら（19
83）、EMBO J.,2,593;ATCC 35102］を宿主細胞として使
用した。15「白色の（white）」形質転換体を、200μg/
mlのアンピシリンを含有する指示平板上に取った。すべ
ての15の形質転換体を、バーンボイム（Birnboim）およ
びドリイ（Doly）1979の急速分析プラスミド分離法の修
正法に従いスクリーニングした。したがって、15の試料
の沈殿を１μｇのRNアーセを含有する30μｌの１×SP−
100中に再溶解した。EcoRIおよびBamHIを使用する制限
消化を実施した。
い、E. coli RRI M15［A.カルニンス（Kalnins）ら（19
83）、EMBO J.,2,593;ATCC 35102］を宿主細胞として使
用した。15「白色の（white）」形質転換体を、200μg/
mlのアンピシリンを含有する指示平板上に取った。すべ
ての15の形質転換体を、バーンボイム（Birnboim）およ
びドリイ（Doly）1979の急速分析プラスミド分離法の修
正法に従いスクリーニングした。したがって、15の試料
の沈殿を１μｇのRNアーセを含有する30μｌの１×SP−
100中に再溶解した。EcoRIおよびBamHIを使用する制限
消化を実施した。
電気泳動後、15の形質転換体のうちの４つはほぼ200
塩基対の長さのEcoRI−BamHI断片を有するプラスミドDN
Aを含有することがわかった。このEcoRI−BamHI断片を
有するすべての形質転換体を大規模に増殖させ、そして
各々からのプラスミドを分離しそしてさらに分析した。
それらのうち２つを材料および方法において記載するよ
うな標準の配列決定手順によって配列決定し、すべては
Val−15−Glu−52−アプロチニン遺伝子の配列を含有し
た。
塩基対の長さのEcoRI−BamHI断片を有するプラスミドDN
Aを含有することがわかった。このEcoRI−BamHI断片を
有するすべての形質転換体を大規模に増殖させ、そして
各々からのプラスミドを分離しそしてさらに分析した。
それらのうち２つを材料および方法において記載するよ
うな標準の配列決定手順によって配列決定し、すべては
Val−15−Glu−52−アプロチニン遺伝子の配列を含有し
た。
実施例３ 組換えプラスミドpNH02.1.1.（Val−15−Leu−17−Glu
−52−アプロチニン）、pNH16.1.1（Val−15−Leu−17
−Glu−39−Glu−52−アプロチニン）、pRK126.1.24（V
al−15−Leu−17−アプロチニン）およびpRK113.1.1（V
al−15−Leu−17−Thr−52−アプロチニン） 組換えプラスミドpNH02.1.1.（第５図）は、合成Val
−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン遺伝子のための
解読領域を含有する。組換えプラスミドpNH16.1.1.（第
６図）は、合成Val−15−Leu−17−Glu−30−Glu−52−
アプロチニン遺伝子のための解読領域を含有する。
−52−アプロチニン）、pNH16.1.1（Val−15−Leu−17
−Glu−39−Glu−52−アプロチニン）、pRK126.1.24（V
al−15−Leu−17−アプロチニン）およびpRK113.1.1（V
al−15−Leu−17−Thr−52−アプロチニン） 組換えプラスミドpNH02.1.1.（第５図）は、合成Val
−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン遺伝子のための
解読領域を含有する。組換えプラスミドpNH16.1.1.（第
６図）は、合成Val−15−Leu−17−Glu−30−Glu−52−
アプロチニン遺伝子のための解読領域を含有する。
プラスミドpNH02.1.1.（Val−15−Leu−17−Glu−52
−−アプロチニン）は、Argの代わりに位置17にLeuのた
めのコドンを含有する、ApaI−StuI断片であるβ−ブロ
ックの交換によって構成した（第７図）。
−−アプロチニン）は、Argの代わりに位置17にLeuのた
めのコドンを含有する、ApaI−StuI断片であるβ−ブロ
ックの交換によって構成した（第７図）。
合成ssDNA断片β−EA10Aおよびβ−EA10B（第７図）
の約100pモルのを20ulの水中に溶解し、95℃に５分間加
熱し、そして室温にゆっくり冷却した（５時間）。ハイ
ブリダイゼーションした非リン酸化断片を、ApaI−StuI
断片を欠くpRK54.1.1からの1.5pモルの精製DNAと結合し
た。
の約100pモルのを20ulの水中に溶解し、95℃に５分間加
熱し、そして室温にゆっくり冷却した（５時間）。ハイ
ブリダイゼーションした非リン酸化断片を、ApaI−StuI
断片を欠くpRK54.1.1からの1.5pモルの精製DNAと結合し
た。
E. coli RRI M15の形質転換を、結合混合物の50％を
使用して実施した。1500の形質転換体から24を分析プラ
スミド単離および制限分析によって試験した。
使用して実施した。1500の形質転換体から24を分析プラ
スミド単離および制限分析によって試験した。
すべは陽性であり、そしてそれらのうち２つを材料お
よび方法において記載するように配列決定した。形質転
換体pNH02.1.1をそれ以上の実験のために使用した。
よび方法において記載するように配列決定した。形質転
換体pNH02.1.1をそれ以上の実験のために使用した。
Val−15−Leu−17−Glu−39−Glu−52−アプロチニン
遺伝子を含有するプラスミドpNH16.1.1を、位置39にArg
の代わりにGluのためのコドンを含有するpNH02.1.1のSt
uI−SstII断片であるγ−ブロックの簡単な交換によっ
て構成した。
遺伝子を含有するプラスミドpNH16.1.1を、位置39にArg
の代わりにGluのためのコドンを含有するpNH02.1.1のSt
uI−SstII断片であるγ−ブロックの簡単な交換によっ
て構成した。
合成ssDNA断片γ−EA 2Aおよびγ−EA 2Bの約100pモ
ル（第７図）を、20μｌの水中に溶解し、95℃に５分間
加熱し、そして室温にゆっくり冷却した（５時間）。ハ
イブリダイゼーションした非リン酸化断片を、StuI−Ss
tII断片を欠くpNH02.1.1からの1.5pモルの精製DNAと結
合した。
ル（第７図）を、20μｌの水中に溶解し、95℃に５分間
加熱し、そして室温にゆっくり冷却した（５時間）。ハ
イブリダイゼーションした非リン酸化断片を、StuI−Ss
tII断片を欠くpNH02.1.1からの1.5pモルの精製DNAと結
合した。
E. coli RRI M15の形質転換を結合混合物の50％を使
用して実施した。E. coliの形質転換体は、分析プラス
ミド単離および制限分析によって試験した。陽性のクロ
ーンを材料および方法において記載するように配列決定
した。形質転換体pNH16.1.1をそれ以上の実験のために
使用した。
用して実施した。E. coliの形質転換体は、分析プラス
ミド単離および制限分析によって試験した。陽性のクロ
ーンを材料および方法において記載するように配列決定
した。形質転換体pNH16.1.1をそれ以上の実験のために
使用した。
プラスミドpRK126.1.24（Val−15−Leu−17−Met−52
−アプロチニン）を、Gluの代わりに位置52にスレオニ
ンのためのコドンを含有する−ブロックの交換によっ
て、pNH02.1.1から誘導した。
−アプロチニン）を、Gluの代わりに位置52にスレオニ
ンのためのコドンを含有する−ブロックの交換によっ
て、pNH02.1.1から誘導した。
合成ssDNA断片−EA IAおよびEA 1Bの100pモル（第７
図）を、20μｌの水中に溶解し、95℃に５分間加熱し、
そしてゆっくり室温に冷却した（５時間）。ハイブリダ
イゼーションの非リン酸化断片を、SstII−BamHI断片を
欠くpNH02.1.1からの1.5pモルの精製したDNAと結合し
た。
図）を、20μｌの水中に溶解し、95℃に５分間加熱し、
そしてゆっくり室温に冷却した（５時間）。ハイブリダ
イゼーションの非リン酸化断片を、SstII−BamHI断片を
欠くpNH02.1.1からの1.5pモルの精製したDNAと結合し
た。
E. coli RRI M15の形質転換は、結合混合物の50％を
使用して実施した。E. coli形質転換体を分析プラスミ
ド分離および制限分析によって試験した。陽性クローン
を材料および方法において記載するように配列決定し
た。形質転換体pRK126.1.1をそれ以上の実験のために使
用した。
使用して実施した。E. coli形質転換体を分析プラスミ
ド分離および制限分析によって試験した。陽性クローン
を材料および方法において記載するように配列決定し
た。形質転換体pRK126.1.1をそれ以上の実験のために使
用した。
プラスミドpRK113.1.1（Val−15−Leu−17−Thr−52
−アプロチニン）を、グルタミン酸の代わりに位置52に
スレオニンのためのコドンを含有する−ブロックの交換
によって、pNH02.1.1から誘導した。
−アプロチニン）を、グルタミン酸の代わりに位置52に
スレオニンのためのコドンを含有する−ブロックの交換
によって、pNH02.1.1から誘導した。
合成ssDNA断片−EA7Aおよび−EA7Bの約100pモル（第
７図）を、20μｌの水中に溶解し、95℃に５分間加熱
し、そして室温にゆっくり冷却した（５時間）。ハイブ
リダイゼーションした非リン酸化断片を、SstII/BamHI
断片を欠くpNH02.1.1からの1.5pモルの精製したDNAと結
合した。
７図）を、20μｌの水中に溶解し、95℃に５分間加熱
し、そして室温にゆっくり冷却した（５時間）。ハイブ
リダイゼーションした非リン酸化断片を、SstII/BamHI
断片を欠くpNH02.1.1からの1.5pモルの精製したDNAと結
合した。
E. coli RRI M15の形質転換を結合混合物の50％を使
用して実施した。E. coliの形質転換体を、分析プラス
ミド単離および制限分析によって試験した。陽性のクロ
ーンを、材料および方法において記載するように配列決
定した。形質転換体pRK113.1.1をそれ以上の実験に使用
した。
用して実施した。E. coliの形質転換体を、分析プラス
ミド単離および制限分析によって試験した。陽性のクロ
ーンを、材料および方法において記載するように配列決
定した。形質転換体pRK113.1.1をそれ以上の実験に使用
した。
実施例４ 発現プラスミドpES044.1.1.pES045.1.3、pNH05.1.1お
よびpNH21.1 E. coli中のアプロチニン変異型遺伝子の発現のため
の実施例は、前記遺伝子をlacZ遺伝子［U.リュザー（Ｒ
ther）およびB.ミュラー−ヒル（Ｍller−Hill）
（1983）、EMBO J.,2,1971−1974］と、あるいはファー
ジMS−２のRNAポリメラーゼのＮ−末端部分［レマルト
（Remault）ら（1981）、遺伝子（Gene）、15、81−9
3］と融合体として発現させることによって与えられ
る。
よびpNH21.1 E. coli中のアプロチニン変異型遺伝子の発現のため
の実施例は、前記遺伝子をlacZ遺伝子［U.リュザー（Ｒ
ther）およびB.ミュラー−ヒル（Ｍller−Hill）
（1983）、EMBO J.,2,1971−1974］と、あるいはファー
ジMS−２のRNAポリメラーゼのＮ−末端部分［レマルト
（Remault）ら（1981）、遺伝子（Gene）、15、81−9
3］と融合体として発現させることによって与えられ
る。
プラスミドpNH02.1.1（Val−15−Leu−17−Glu−52−
アプロチニン）およびpNH16.1.1（Val−15−Leu−17−G
lu−39−Glu−52−アプロチニン）から得られたアプロ
チニン遺伝子を、発現プラスミドpUR 278［U.リュザー
（Ｒther）およびB.ミュラー−ヒル（Ｍller−Hil
l）（1983）、EMBO J.,2,1971−1974］中に結合した。
アプロチニン）およびpNH16.1.1（Val−15−Leu−17−G
lu−39−Glu−52−アプロチニン）から得られたアプロ
チニン遺伝子を、発現プラスミドpUR 278［U.リュザー
（Ｒther）およびB.ミュラー−ヒル（Ｍller−Hil
l）（1983）、EMBO J.,2,1971−1974］中に結合した。
発現ベクターpUR 278中の合成アプロチニン遺伝子を
クローニングするため、クローニング部位BamHIおよびH
indIIIを選択した。したがって、BamHI部位を遺伝子の
５′−EcoRI末端に添加し、そしてHindIII部位を３′−
末端において使用することによって、アプロチニンを修
飾することが必要であった（第８図参照）。
クローニングするため、クローニング部位BamHIおよびH
indIIIを選択した。したがって、BamHI部位を遺伝子の
５′−EcoRI末端に添加し、そしてHindIII部位を３′−
末端において使用することによって、アプロチニンを修
飾することが必要であった（第８図参照）。
プラスミドpNH02.1.1の5pモルを、50μｌの１×SP−1
00中においてEcoRI（1.5pモル／μｌ）で37℃において
５時間完全に消化した。
00中においてEcoRI（1.5pモル／μｌ）で37℃において
５時間完全に消化した。
この物質の突起する５′EcoRI末端を、DNAポリメラー
ゼＩ（クレノー断片）、dATPおよびTTPで酵素的に充填
した。
ゼＩ（クレノー断片）、dATPおよびTTPで酵素的に充填
した。
このDNAの5pモルを２μｌの10ミリモルのdATP、２μ
ｌの10ミリモルのTTP、５μｌの10×NT−緩衝液および3
9μｌの水中に溶解した。次いで、２μｌのDNAポリメラ
ーゼＩ（クレノー断片、５単位／μｌ）を添加し、そし
て室温においてインキュベーションした（30分）。
ｌの10ミリモルのTTP、５μｌの10×NT−緩衝液および3
9μｌの水中に溶解した。次いで、２μｌのDNAポリメラ
ーゼＩ（クレノー断片、５単位／μｌ）を添加し、そし
て室温においてインキュベーションした（30分）。
この物質をフェノール抽出、エタノール沈殿させ、80
％のエタノールで２回洗浄し、そして20μｌのTE−緩衝
液中に溶解した。平滑末端をもつこの物質の20μｌを、
BamHIリンカーとの結合に使用した。したがって、200p
モルのリン酸化BamHIリンカーを10pモルのDNA末端に結
合し（標準の結合条件、4.5μｌのT4 DNAリガーゼ、合
計の体積60μｌ）、14℃で18時間インキュベーションし
た。この反応混合物をフェノール／セバグで抽出し、エ
タノール沈殿させ、洗浄し、乾燥し、そして10μｌのTE
中に溶解した。
％のエタノールで２回洗浄し、そして20μｌのTE−緩衝
液中に溶解した。平滑末端をもつこの物質の20μｌを、
BamHIリンカーとの結合に使用した。したがって、200p
モルのリン酸化BamHIリンカーを10pモルのDNA末端に結
合し（標準の結合条件、4.5μｌのT4 DNAリガーゼ、合
計の体積60μｌ）、14℃で18時間インキュベーションし
た。この反応混合物をフェノール／セバグで抽出し、エ
タノール沈殿させ、洗浄し、乾燥し、そして10μｌのTE
中に溶解した。
BamHIおよびHindIII末端をもつ合成アプロチニン遺伝
子を調製するため、「リンカード（linkered）」洗浄プ
ラスミド（10pモル）を、まずHindIIIで切断し（10.5p
モルのhit/μｌ、５時間、37℃）、次いでBamHIで切断
した（40pモル、20時間、37℃、標準の条件）。断片を
1.8％のアガロースゲルの電気泳動後単離し、そして注
意して精製した（標準の手順参照）。
子を調製するため、「リンカード（linkered）」洗浄プ
ラスミド（10pモル）を、まずHindIIIで切断し（10.5p
モルのhit/μｌ、５時間、37℃）、次いでBamHIで切断
した（40pモル、20時間、37℃、標準の条件）。断片を
1.8％のアガロースゲルの電気泳動後単離し、そして注
意して精製した（標準の手順参照）。
ベクターの調製 親のベクターpUR 278（約5pモル）を、まず、HindIII
で切断し（標準の条件）、フェノール／セバグの抽出に
よって精製し、エタノール沈殿させ、再溶解し、次いで
BamHIで消化した（標準の条件）。この物質を１％のア
ガロースゲル上に装入し、電気泳動し、単離し、そして
標準の条件に従い精製して、合成アプロチニン遺伝子と
結合において競争するであろう、18塩基対の長さのBamH
I−HindIII断片を除去した。
で切断し（標準の条件）、フェノール／セバグの抽出に
よって精製し、エタノール沈殿させ、再溶解し、次いで
BamHIで消化した（標準の条件）。この物質を１％のア
ガロースゲル上に装入し、電気泳動し、単離し、そして
標準の条件に従い精製して、合成アプロチニン遺伝子と
結合において競争するであろう、18塩基対の長さのBamH
I−HindIII断片を除去した。
結合および形質転換 結合のため、0.3pモルのベマター、1.5pモルの断片
（ほぼ）、２単位のT4 DNAリガーゼを使用した（標準の
条件、合計の体積30μｌ、インキュベーション、14℃に
おいて４時間）。
（ほぼ）、２単位のT4 DNAリガーゼを使用した（標準の
条件、合計の体積30μｌ、インキュベーション、14℃に
おいて４時間）。
形質転換はE. coli RRIデルタM15を宿主として使用
し、結合の３分の１を用いて実施した（標準の条件）。
173の「ブルー」のコロニーを、200μｇのアンピシリン
/mlを含有する指示板上に配置した。これから、12の形
質転換体を、さらに、急速分析プラスミド分離によって
分析した（標準の条件）。ベクターの結合によって受容
された形質転換体の百分率に基づいて計算して、173の
形質転換体のうち30はバックグラウンドの形質転換体で
あろう。この結果は12の形質転換体のプラスミドの制限
分析によって確証された。それらのうちの８つは陽性で
あり、約200塩基対のBamHI−HindIII制限断片を示し
た。陽性の受容体プラスミドを、また、アプロチニン遺
伝子内でSstII独特制限部位によって直線化した。塩基
配列の分析を材料および方法において記載する標準の手
順に従って実施すると、プラスミドpES44.1.1.は所望の
アプロチニンDNA断片を挿入していることが明らかにさ
れた（第８図参照）。プラスミドpES44.1.1を、それ以
上の分析および発現の研究に使用した。プラスミドpES4
5.1.3の構成は、精確に同一の手順によって、pNH16.1.1
からのVal−15−Leu−17−Glu−39−Glu−52−Ｈアプロ
チニン遺伝子を使用して実施した。陽性の組換え体プラ
スミドpES45.1.3は正しいDNA配列を示し、そしてこの構
成体をそれ以上の分析および発現の研究に使用した。
し、結合の３分の１を用いて実施した（標準の条件）。
173の「ブルー」のコロニーを、200μｇのアンピシリン
/mlを含有する指示板上に配置した。これから、12の形
質転換体を、さらに、急速分析プラスミド分離によって
分析した（標準の条件）。ベクターの結合によって受容
された形質転換体の百分率に基づいて計算して、173の
形質転換体のうち30はバックグラウンドの形質転換体で
あろう。この結果は12の形質転換体のプラスミドの制限
分析によって確証された。それらのうちの８つは陽性で
あり、約200塩基対のBamHI−HindIII制限断片を示し
た。陽性の受容体プラスミドを、また、アプロチニン遺
伝子内でSstII独特制限部位によって直線化した。塩基
配列の分析を材料および方法において記載する標準の手
順に従って実施すると、プラスミドpES44.1.1.は所望の
アプロチニンDNA断片を挿入していることが明らかにさ
れた（第８図参照）。プラスミドpES44.1.1を、それ以
上の分析および発現の研究に使用した。プラスミドpES4
5.1.3の構成は、精確に同一の手順によって、pNH16.1.1
からのVal−15−Leu−17−Glu−39−Glu−52−Ｈアプロ
チニン遺伝子を使用して実施した。陽性の組換え体プラ
スミドpES45.1.3は正しいDNA配列を示し、そしてこの構
成体をそれ以上の分析および発現の研究に使用した。
プラスミドpNH05.1.1（Val−15−Leu−17−Glu−52−
アプロチニン）（第９図参照）およびpNH21.1.（IVal−
15−Leu−17−Glu−39−Glu−I52−アプロチニン）の構
成は、第９図に示す手順を用いて実施した。Val−15−L
eu−17−Glu−52−アプロチニン遺伝子は、pNH02.1.1か
らEcoRI−HindIII断片として得た。発現ベクターpPLc24
中のクローニングのため、遺伝子の５′−EcoRI末端にB
amHI部位を加えることによってアプロチニン遺伝子を修
飾することが必要であった。これは遺伝子のpUR 278中
へのクローニングについて上に記載したようにして実施
した。修飾した遺伝子は、BamHIおよびHindIIIで制限し
たベクターpPLc24中に挿入した。pPLc24はW.フィーアス
（Fiers）（ゲント大学、ベルギー）から入手した。こ
の構成において、アプロチニン遺伝子をフレームにおい
てファージMS−２のRNAポリメラーゼのＮ−末端部分に
接続する［レマルト（Remault）ら、遺伝子（Gene）、1
5、81−93（1981）］。プラスミドpNH05.1.1をそれ以上
の分析および発現のために使用した。
アプロチニン）（第９図参照）およびpNH21.1.（IVal−
15−Leu−17−Glu−39−Glu−I52−アプロチニン）の構
成は、第９図に示す手順を用いて実施した。Val−15−L
eu−17−Glu−52−アプロチニン遺伝子は、pNH02.1.1か
らEcoRI−HindIII断片として得た。発現ベクターpPLc24
中のクローニングのため、遺伝子の５′−EcoRI末端にB
amHI部位を加えることによってアプロチニン遺伝子を修
飾することが必要であった。これは遺伝子のpUR 278中
へのクローニングについて上に記載したようにして実施
した。修飾した遺伝子は、BamHIおよびHindIIIで制限し
たベクターpPLc24中に挿入した。pPLc24はW.フィーアス
（Fiers）（ゲント大学、ベルギー）から入手した。こ
の構成において、アプロチニン遺伝子をフレームにおい
てファージMS−２のRNAポリメラーゼのＮ−末端部分に
接続する［レマルト（Remault）ら、遺伝子（Gene）、1
5、81−93（1981）］。プラスミドpNH05.1.1をそれ以上
の分析および発現のために使用した。
プラスミドpNH21.1.1は、pNH05.1.1についてと同一の
方法で、プラスミドpNH16.1.1から得られた修飾したEco
RI/HindIII断片を、BamHIおよびHindIIIで制限したプラ
スミドpPLc24中に結合することによって調製した。
方法で、プラスミドpNH16.1.1から得られた修飾したEco
RI/HindIII断片を、BamHIおよびHindIIIで制限したプラ
スミドpPLc24中に結合することによって調製した。
実施例５ α−アミラーゼ分泌ベクターpCH2742の構成 E. coli分泌ベクターpCH237中のクローニングのた
め、Val−15−Leu−17−Met−52−アプロチニンのため
の遺伝子をArg−１のためのコドンにXbaI部位を導入す
ることによって修飾した。この目的で、pRK126.1.24をE
coRIで制限し、DNAポリメラーゼ（大きい断片）の存在
下にdNTPで充填し、XbaIリンカー（バイオラブス1010）
を制限部位中に結合して（第10図参照）pWB260を得た。
pWB260をXbaIおよびXhoIにおいて制限し、ベクターを単
離し、そして２つの合成DNA断片（WB14およびWB15）か
ら成るリンカーをpWB260中に結合してpWB2601を得た
（第10図参照）。
め、Val−15−Leu−17−Met−52−アプロチニンのため
の遺伝子をArg−１のためのコドンにXbaI部位を導入す
ることによって修飾した。この目的で、pRK126.1.24をE
coRIで制限し、DNAポリメラーゼ（大きい断片）の存在
下にdNTPで充填し、XbaIリンカー（バイオラブス1010）
を制限部位中に結合して（第10図参照）pWB260を得た。
pWB260をXbaIおよびXhoIにおいて制限し、ベクターを単
離し、そして２つの合成DNA断片（WB14およびWB15）か
ら成るリンカーをpWB260中に結合してpWB2601を得た
（第10図参照）。
α−アミラーゼ分泌ベクターの構成は次のようにして
実施した： B.スブチリス（subtilis）からのα−アミラーゼシグ
ナル配列は、バシルス・スブチシリス（Bacillus subti
lis）DSM［ドイチェ・サンムルング・フォン・ミクロオ
ルガニスメン（Deutsche Sammlung fr Mikroorganism
en,Gttingen］から、染色体DNAの部分的Sau3A消化物
をpMK3のBamHI中にクローニングすることによって誘導
した［M.A.サリバン（Sullivan）ら（1984）、遺伝子
（Gene）、29、21−26］。α−アミラーゼ遺伝子をもつ
3kbのDNA断片を含有するクローンの１つを、α−アミラ
ーゼ構造遺伝子の部分を欠失してpALK1を産生すること
によって修飾した［M.A.コートネイ（Courtney）、ロチ
ェスター大学、ニューヨーク、微生物学部、との個人的
コミュニケーション］。pALK1のDNA配列は、B.スブチリ
ス（subtilis）1A289からのα−アミラーゼと広い相同
性をもつ、230bpのEcoRI−BSstEII断片上に、可能なリ
ボソーム結合部位（BBS）およびシグナル配列を明らか
にした［参照、第11図中のDNA配列およびM.ヤング（Yan
g）ら（1983）、核酸の研究（Nucl. Acids Res.）、1
1、237−249］。E. coli中のα−アミラーゼシグナル配
列のプロセシングはアミノ酸位置31の後に起こった［W.
ブランス（Bruns）、未公表の結果］ので、ala31にNheI
−制限部位を導入した。この目的で、pALK1［M.A.コー
トネイ（Courtney）、ロチェスター大学、から供給され
た］から、α−アミラーゼのシグナル配列の大きい部分
および可能なエスディー（Shine−Dalgarno）部位を含
有する180bpのEcoRI−HaeIII断片を分離した（第12図中
の断片Ａ）。断片Ｂ（第12図）、アミラーゼシグナル配
列のコドン13におけるNheI部位を発生する合成リンカー
を、断片Ａ（第12図）と一緒に、pBR322中に結合し、Ec
oRIおよびNheIで切断した（pWB226）。pWB226をBamHIに
おいて制限し、そしてdNTPで充填した後、HindIII−リ
ンカー（バイオラブス1002）をベクター中に結合してpW
B2024を産生した。
実施した： B.スブチリス（subtilis）からのα−アミラーゼシグ
ナル配列は、バシルス・スブチシリス（Bacillus subti
lis）DSM［ドイチェ・サンムルング・フォン・ミクロオ
ルガニスメン（Deutsche Sammlung fr Mikroorganism
en,Gttingen］から、染色体DNAの部分的Sau3A消化物
をpMK3のBamHI中にクローニングすることによって誘導
した［M.A.サリバン（Sullivan）ら（1984）、遺伝子
（Gene）、29、21−26］。α−アミラーゼ遺伝子をもつ
3kbのDNA断片を含有するクローンの１つを、α−アミラ
ーゼ構造遺伝子の部分を欠失してpALK1を産生すること
によって修飾した［M.A.コートネイ（Courtney）、ロチ
ェスター大学、ニューヨーク、微生物学部、との個人的
コミュニケーション］。pALK1のDNA配列は、B.スブチリ
ス（subtilis）1A289からのα−アミラーゼと広い相同
性をもつ、230bpのEcoRI−BSstEII断片上に、可能なリ
ボソーム結合部位（BBS）およびシグナル配列を明らか
にした［参照、第11図中のDNA配列およびM.ヤング（Yan
g）ら（1983）、核酸の研究（Nucl. Acids Res.）、1
1、237−249］。E. coli中のα−アミラーゼシグナル配
列のプロセシングはアミノ酸位置31の後に起こった［W.
ブランス（Bruns）、未公表の結果］ので、ala31にNheI
−制限部位を導入した。この目的で、pALK1［M.A.コー
トネイ（Courtney）、ロチェスター大学、から供給され
た］から、α−アミラーゼのシグナル配列の大きい部分
および可能なエスディー（Shine−Dalgarno）部位を含
有する180bpのEcoRI−HaeIII断片を分離した（第12図中
の断片Ａ）。断片Ｂ（第12図）、アミラーゼシグナル配
列のコドン13におけるNheI部位を発生する合成リンカー
を、断片Ａ（第12図）と一緒に、pBR322中に結合し、Ec
oRIおよびNheIで切断した（pWB226）。pWB226をBamHIに
おいて制限し、そしてdNTPで充填した後、HindIII−リ
ンカー（バイオラブス1002）をベクター中に結合してpW
B2024を産生した。
分泌ベクターpCH237は、pUC8においてアミラーゼシグ
ナル配列をIacZプロモーターより後に動かすことによっ
て構成した（第12図）。この構成において、Iac′Ｚの
リーディングフレームをTAA−停止コドンで停止させる
べきである（第11図、断片ＡのDNA配列において位置−5
8/−56）。同一mRNA上の蛋白質合成の再開は、位置−10
における停止コドンから下流の約50塩基のα−アミラー
ゼの可能なエスディー部位にリボソームを結合した後、
起こるであろう。
ナル配列をIacZプロモーターより後に動かすことによっ
て構成した（第12図）。この構成において、Iac′Ｚの
リーディングフレームをTAA−停止コドンで停止させる
べきである（第11図、断片ＡのDNA配列において位置−5
8/−56）。同一mRNA上の蛋白質合成の再開は、位置−10
における停止コドンから下流の約50塩基のα−アミラー
ゼの可能なエスディー部位にリボソームを結合した後、
起こるであろう。
Val−15−Leu−17−Met−52−アプロチニンの発現の
ため、アプロチニン遺伝子をpWB2601からXbaI−HindIII
断片として単離し、そしてpCH237中のα−アミラーゼシ
グナル配列の後に組込み、NheIおよびHindIIIで制限し
てpCH2472を得る（第13図）。
ため、アプロチニン遺伝子をpWB2601からXbaI−HindIII
断片として単離し、そしてpCH237中のα−アミラーゼシ
グナル配列の後に組込み、NheIおよびHindIIIで制限し
てpCH2472を得る（第13図）。
実施例６ E. coli中で発現されたMS−２−Val−15−Leu−17−Glu
−39−Glu−52−アプロチニンおよび／またはMS−２−V
al−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン融合蛋白質の
単離 MS−２−アプロチニン融合蛋白質を発現させるため
に、プラスミドpNH05.1.1またはpNH21.1.1で形質転換さ
れたE. coliC600［pcI857］を、30g/lの酵母エキス、30
g/lの牛肉エキスおよび1g/lのK2HPO4を含有するブロス
中で培養した。pHを7.0に調節した。100mlのブロスを１
のエルレンマイヤーフラスコに入れ、そして121℃で2
0分間オートクレーブ処理した。同一培地中で培養した
種子培養物とともに28℃で８時間インキュベーションし
た後、フラスコを280rpm（振盪直径:5cm）で回転振盪機
上で４時間28℃においてインキュベーションした。その
時間までに、培養物の光学濃度は約４であった（700nm
において測定した）。次いで、温度を42℃に上げ、そし
てインキュベーションをさらに３時間続けた。その時間
までに、細胞は合計の細胞蛋白質の約15％の量の融合蛋
白質を含有した。融合蛋白質は、標準のポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動によって、17％のアクリルアミドの
濃度を用いかつクーマッシーブルーで着色することによ
って可視化することができた。
−39−Glu−52−アプロチニンおよび／またはMS−２−V
al−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン融合蛋白質の
単離 MS−２−アプロチニン融合蛋白質を発現させるため
に、プラスミドpNH05.1.1またはpNH21.1.1で形質転換さ
れたE. coliC600［pcI857］を、30g/lの酵母エキス、30
g/lの牛肉エキスおよび1g/lのK2HPO4を含有するブロス
中で培養した。pHを7.0に調節した。100mlのブロスを１
のエルレンマイヤーフラスコに入れ、そして121℃で2
0分間オートクレーブ処理した。同一培地中で培養した
種子培養物とともに28℃で８時間インキュベーションし
た後、フラスコを280rpm（振盪直径:5cm）で回転振盪機
上で４時間28℃においてインキュベーションした。その
時間までに、培養物の光学濃度は約４であった（700nm
において測定した）。次いで、温度を42℃に上げ、そし
てインキュベーションをさらに３時間続けた。その時間
までに、細胞は合計の細胞蛋白質の約15％の量の融合蛋
白質を含有した。融合蛋白質は、標準のポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動によって、17％のアクリルアミドの
濃度を用いかつクーマッシーブルーで着色することによ
って可視化することができた。
加熱誘導細胞を培養ブロスから5000rpmにおける15分
間の遠心によって集め、10ml/gの湿潤重量の緩衝液Ａ
（0.1モルのトリス−HC1、pH7.5、10ミリモルのEDTA、
５ミリモルのβ−メルカプトエタノールおよび５ミリモ
ルのベンズアミジン−HClを含有する）中に再懸濁さ
せ、そして激しい攪拌の下に0.2mg/mlのリゾチーム［約
100,000単位、フルカ（Fluka）AG、スイス］とともに30
分間30℃でインキュベーションした。
間の遠心によって集め、10ml/gの湿潤重量の緩衝液Ａ
（0.1モルのトリス−HC1、pH7.5、10ミリモルのEDTA、
５ミリモルのβ−メルカプトエタノールおよび５ミリモ
ルのベンズアミジン−HClを含有する）中に再懸濁さ
せ、そして激しい攪拌の下に0.2mg/mlのリゾチーム［約
100,000単位、フルカ（Fluka）AG、スイス］とともに30
分間30℃でインキュベーションした。
次いで、懸濁液を４複合体に冷却し、そしてフレンチ
圧力セル（アミコ、米国）に18000psiにおいて２回通過
させて、細胞膜を破壊した。不溶性物質を10000rpmで30
分間遠心すること（ベックマンJA−10）によって回収
し、そして上澄みを廃棄した。
圧力セル（アミコ、米国）に18000psiにおいて２回通過
させて、細胞膜を破壊した。不溶性物質を10000rpmで30
分間遠心すること（ベックマンJA−10）によって回収
し、そして上澄みを廃棄した。
沈殿を、２モルの尿素を添加した緩衝液Ａ中で、前述
のように２回再懸濁および遠心した。上澄みを再び廃棄
した。
のように２回再懸濁および遠心した。上澄みを再び廃棄
した。
次いで、沈殿を10ml/gの湿潤重量の緩衝液Ｂ（0.05モ
ルのトリス−HCl、pH8..5、８モルのグアニジン−HClお
よび10ミリモルのβ−メルカプトエタノールを含有す
る）中に溶解し、この溶液を30分間18000rpmで遠心する
こと（ベックマンJA−20）によって清浄にし、そして10
0mlを緩衝液Ｃ（0.05モルのトリス−HCl pH7.5、６モル
の尿素および10ミリモルのβ−メルカプトエタノールを
含有する）と平衡化したセファクリル（Sephacryl）Ｓ
−300（ファーマシアAB、スウェーデン）を充填したカ
ラム上に装入した。10mlの分画を集め、そして融合蛋白
質を含有する分画をSDS−PAGEによって還元性条件下に
同定した。ピークの分側を一緒にし、そして水に対して
広範に透析した。これらの条件下に、融合蛋白質は沈殿
し、そして30分間10000rpmの遠心（ベックマンJA−10）
によって集めた。融合蛋白質の沈殿を−70℃で貯蔵し
た。
ルのトリス−HCl、pH8..5、８モルのグアニジン−HClお
よび10ミリモルのβ−メルカプトエタノールを含有す
る）中に溶解し、この溶液を30分間18000rpmで遠心する
こと（ベックマンJA−20）によって清浄にし、そして10
0mlを緩衝液Ｃ（0.05モルのトリス−HCl pH7.5、６モル
の尿素および10ミリモルのβ−メルカプトエタノールを
含有する）と平衡化したセファクリル（Sephacryl）Ｓ
−300（ファーマシアAB、スウェーデン）を充填したカ
ラム上に装入した。10mlの分画を集め、そして融合蛋白
質を含有する分画をSDS−PAGEによって還元性条件下に
同定した。ピークの分側を一緒にし、そして水に対して
広範に透析した。これらの条件下に、融合蛋白質は沈殿
し、そして30分間10000rpmの遠心（ベックマンJA−10）
によって集めた。融合蛋白質の沈殿を−70℃で貯蔵し
た。
第14図は、典型的な分離を示す。融合蛋白質を含有す
る分画は棒で示されている。
る分画は棒で示されている。
実施例７ 精製したMS−２−融合蛋白質からの生物活性Val−15−L
eu−17−Glu−52−アプロチニンの調製 融合蛋白質（実施例６に従って調製した）を約5ml/10
0mgの湿潤重量の70％ギ酸中に溶解し、そして臭化シア
ン（メチオニン:CNBrの比＝1:250）で18時間窒素の下に
室温において処理した［ウィトコップ（Witkop）ら（19
68）、サイエンス（Science）、162、318−326］。次い
で、切断混合物を水で10〜20倍に希釈し、そしてギ酸お
よび残留物CNBrを減圧下に除去した。
eu−17−Glu−52−アプロチニンの調製 融合蛋白質（実施例６に従って調製した）を約5ml/10
0mgの湿潤重量の70％ギ酸中に溶解し、そして臭化シア
ン（メチオニン:CNBrの比＝1:250）で18時間窒素の下に
室温において処理した［ウィトコップ（Witkop）ら（19
68）、サイエンス（Science）、162、318−326］。次い
で、切断混合物を水で10〜20倍に希釈し、そしてギ酸お
よび残留物CNBrを減圧下に除去した。
この濃厚な溶液を５モルのNaOHでpH7.5に処理し、そ
して固体の尿素を８モルの最終濃度に添加した。25ミリ
モルのβ−メルカプトエタノールを添加しそして２時間
37℃でインキュベーションした後、この溶液を１夜20体
積の緩衝液Ｄ（0.05モルの酢酸ナトリウム p H5.2、６
モルの尿素および10ミリモルのβ−メルカプトエタノー
ルを含有する）に対して８℃で透析した。
して固体の尿素を８モルの最終濃度に添加した。25ミリ
モルのβ−メルカプトエタノールを添加しそして２時間
37℃でインキュベーションした後、この溶液を１夜20体
積の緩衝液Ｄ（0.05モルの酢酸ナトリウム p H5.2、６
モルの尿素および10ミリモルのβ−メルカプトエタノー
ルを含有する）に対して８℃で透析した。
Val−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニンを復元す
るために、緩衝液Ｄ中で平衡化したCM−セファロースの
ファストフロー（ファーマシアAB、スウェーデン）を充
填したカラム（2.5×5cm）上に装入した。このカラムを
緩衝液Ｄ（約８〜10カラム体積）で洗浄し、150mlの緩
衝液Ｄおよび150mlの緩衝液Ｅ（0.05モルの酢酸ナトリ
ウム、pH5.2、２ミリモルのβ−メルカプトエタノー
ル）の間で形成した直線の勾配で展開し、次いで0.05モ
ルの酢酸ナトリウムpH5.2（約２〜３カラム体積）で簡
単に洗浄した。最後に、復元したVal−15−Leu−17−Gl
u−52−アプロチニンを0.05モルの酢酸ナトリウムpH5.
2、0.5モルのNaClを含有する、で溶離した（第15図参
照）。
るために、緩衝液Ｄ中で平衡化したCM−セファロースの
ファストフロー（ファーマシアAB、スウェーデン）を充
填したカラム（2.5×5cm）上に装入した。このカラムを
緩衝液Ｄ（約８〜10カラム体積）で洗浄し、150mlの緩
衝液Ｄおよび150mlの緩衝液Ｅ（0.05モルの酢酸ナトリ
ウム、pH5.2、２ミリモルのβ−メルカプトエタノー
ル）の間で形成した直線の勾配で展開し、次いで0.05モ
ルの酢酸ナトリウムpH5.2（約２〜３カラム体積）で簡
単に洗浄した。最後に、復元したVal−15−Leu−17−Gl
u−52−アプロチニンを0.05モルの酢酸ナトリウムpH5.
2、0.5モルのNaClを含有する、で溶離した（第15図参
照）。
NaCl−溶離液のピーク分画（SDS−PAGEによって同定
した）を集め、そして20ミリモルのヘペス（Hepes）、p
H6.5、に対して広範に透析して、同一緩衝液中で平衡化
したモノ（Mono）Ｓカラム（1ml）（FPLC、ファーマシ
ア、スウェーデン）でさらに精製した。アプロチニン変
異型を含有するピーク分画を集め、0.1モルの重炭酸ア
ンモニウムに対して広範に透析し、そして適当なアリコ
ートで凍結乾燥した。
した）を集め、そして20ミリモルのヘペス（Hepes）、p
H6.5、に対して広範に透析して、同一緩衝液中で平衡化
したモノ（Mono）Ｓカラム（1ml）（FPLC、ファーマシ
ア、スウェーデン）でさらに精製した。アプロチニン変
異型を含有するピーク分画を集め、0.1モルの重炭酸ア
ンモニウムに対して広範に透析し、そして適当なアリコ
ートで凍結乾燥した。
通常、0.5〜1.5mgの精製したVal−15−Leu−17−Glu
−52−アプロチニンが、培養ブロス１リットルにつき回
収された。
−52−アプロチニンが、培養ブロス１リットルにつき回
収された。
精製した蛋白質は、アミノ酸組成、が線状配列（位置
１〜25）、分子量および逆相HPLC上の挙動に関するかぎ
り、期待した特性を有した（実施例９）。
１〜25）、分子量および逆相HPLC上の挙動に関するかぎ
り、期待した特性を有した（実施例９）。
実施例８ E. coli RRI M15 pCH27242中で発現したVal−15−Leu−
17−アプロチニンの単離 pWB2742で形質転換したE. coli RRI M15を１夜の培養
物上で増殖させた。この培地は３％の牛肉エキス（ギブ
コ）、1.5％の酵母エキス（ギブコ）、0.5％のK2HPO4お
よび４％のモルホリノエタンスルホン酸を蒸留水中に溶
解して含有した。100mlの培地を１リットルのエルレン
マイヤーフラスコに入れ、そして121℃で20分間オート
クレーブ処理した。冷却後、蒸留水中に溶解しそしてろ
過により滅菌したアンピシリンを50μg/mlの最終濃度に
添加した。Val−15−Leu−17−アプロチニンを調製する
ため、フラスコを28℃において同一培地中で増殖させた
１夜の培養物の1mlを接種した。500nmで測定した光学濃
度が約１となるまで、フラスコを回転振盪機上で280rpm
で３時間インキュベーションした。その時、1acプロモ
ーターの誘導は１ミリモルのイソプロピルチオガラクト
シド（シグマ）の添加により実施した。発酵を20時間続
け、そして細胞を8000rpmの遠心により収穫した（10
分、４℃、ローターA6.14をもつコントロン・セントリ
コン（Kontron Centrikon）Ｈ−401）。
17−アプロチニンの単離 pWB2742で形質転換したE. coli RRI M15を１夜の培養
物上で増殖させた。この培地は３％の牛肉エキス（ギブ
コ）、1.5％の酵母エキス（ギブコ）、0.5％のK2HPO4お
よび４％のモルホリノエタンスルホン酸を蒸留水中に溶
解して含有した。100mlの培地を１リットルのエルレン
マイヤーフラスコに入れ、そして121℃で20分間オート
クレーブ処理した。冷却後、蒸留水中に溶解しそしてろ
過により滅菌したアンピシリンを50μg/mlの最終濃度に
添加した。Val−15−Leu−17−アプロチニンを調製する
ため、フラスコを28℃において同一培地中で増殖させた
１夜の培養物の1mlを接種した。500nmで測定した光学濃
度が約１となるまで、フラスコを回転振盪機上で280rpm
で３時間インキュベーションした。その時、1acプロモ
ーターの誘導は１ミリモルのイソプロピルチオガラクト
シド（シグマ）の添加により実施した。発酵を20時間続
け、そして細胞を8000rpmの遠心により収穫した（10
分、４℃、ローターA6.14をもつコントロン・セントリ
コン（Kontron Centrikon）Ｈ−401）。
細胞を500mlの0.01モルのトリス緩衝液pH8.0中で均質
にし、そして砕いた氷で冷却しながら400Wで超音波によ
り、すべての細胞の95％より多くが破壊されるまで、破
壊した。30mlの過塩素酸（72％）をこの懸濁液（700m
l）に攪拌しながら添加した。30分後、上澄みを遠心（2
0分/6000rpm）により回収した。それを飽和トリス塩基
溶液の添加により中和し、そしてBrCnの方法によってセ
ファロースCL4B上に固定化した50mlのゲル床抗アプロチ
ニン（アプロチニンに対してウサギ中でレイズした）上
に通過させた。溶離液中に活性物質は見出せなかった。
ゲルを順次に0.2トリス緩衝液pH8.0および水で洗浄し、
これによって活性は脱着されなかった。活性は0.2モル
の酢酸、HClでpH1.9に調節した、で溶離することによっ
て脱着することができた。この溶離液を凍結乾燥し、そ
して5mlの0.02モルのヘペス緩衝液pH6.0中に再溶解し
た。それ以上の精製は、モノ（Mono）Ｓ （ファーマシ
ア、スウェーデン）のFPLCにより、NaCl（０〜0.5モ
ル）の増大する勾配を使用して達成した。活性は分画41
〜47中に見出され（第18図参照）、これをプールし、透
析しそして凍結乾燥した。
にし、そして砕いた氷で冷却しながら400Wで超音波によ
り、すべての細胞の95％より多くが破壊されるまで、破
壊した。30mlの過塩素酸（72％）をこの懸濁液（700m
l）に攪拌しながら添加した。30分後、上澄みを遠心（2
0分/6000rpm）により回収した。それを飽和トリス塩基
溶液の添加により中和し、そしてBrCnの方法によってセ
ファロースCL4B上に固定化した50mlのゲル床抗アプロチ
ニン（アプロチニンに対してウサギ中でレイズした）上
に通過させた。溶離液中に活性物質は見出せなかった。
ゲルを順次に0.2トリス緩衝液pH8.0および水で洗浄し、
これによって活性は脱着されなかった。活性は0.2モル
の酢酸、HClでpH1.9に調節した、で溶離することによっ
て脱着することができた。この溶離液を凍結乾燥し、そ
して5mlの0.02モルのヘペス緩衝液pH6.0中に再溶解し
た。それ以上の精製は、モノ（Mono）Ｓ （ファーマシ
ア、スウェーデン）のFPLCにより、NaCl（０〜0.5モ
ル）の増大する勾配を使用して達成した。活性は分画41
〜47中に見出され（第18図参照）、これをプールし、透
析しそして凍結乾燥した。
実施例９ Val−15−Leu−17−アプロチニン変異型の蛋白質の科学
的特性づけ 合計のアミノ酸分析を材料および方法に記載するよう
にして実施した。
的特性づけ 合計のアミノ酸分析を材料および方法に記載するよう
にして実施した。
Val−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン、 Val−15−Leu−17−Thr−52−アプロチニン、 Leu−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン、 Val−15−Leu−17−Glu−39−Glu−52−アプロチニン、 および Val−15−Leu−17−Met−52−アプロチニン、 のアミノ酸組成に関して得られた結果は、次の通りであ
った： Ｎ−末端アミノ酸配列を、材料および方法に記載する
ようにして決定した。25サイクル後に得られたアミノ酸
配列は次の通りであった： E. coli RRI M15 pCH 2742の発酵によって得られたVal
−15−Leu−17−Met−52−アプロチニンの約30％は、Ｎ
−末端に追加のAla残基を含有した。これはα−アミラ
ーゼシグナル配列中のAla−30（第11図）をGlnで置換す
ることによって回避できる。
った： Ｎ−末端アミノ酸配列を、材料および方法に記載する
ようにして決定した。25サイクル後に得られたアミノ酸
配列は次の通りであった： E. coli RRI M15 pCH 2742の発酵によって得られたVal
−15−Leu−17−Met−52−アプロチニンの約30％は、Ｎ
−末端に追加のAla残基を含有した。これはα−アミラ
ーゼシグナル配列中のAla−30（第11図）をGlnで置換す
ることによって回避できる。
実施例10 Val−15−Leu−17−アプロチニン変異型の反応速度定数
の決定 Ki値は材料および方法に記載するようにして決定し
た。Val−15−Glu−52−およびVal−15−Leu−17−Glu
−52−アプロチニンの量を増加することによりヒト白血
球エラスターゼ（HLE）の阻害を、第18図に示す。アプ
ロチニン変異型を暢いて得られたヒト白血球エラスター
ゼ、ヒト脾臓エラスターゼＩおよびヒトカテプシンＧの
阻害についての典型的なKi値は次の通りであった：
の決定 Ki値は材料および方法に記載するようにして決定し
た。Val−15−Glu−52−およびVal−15−Leu−17−Glu
−52−アプロチニンの量を増加することによりヒト白血
球エラスターゼ（HLE）の阻害を、第18図に示す。アプ
ロチニン変異型を暢いて得られたヒト白血球エラスター
ゼ、ヒト脾臓エラスターゼＩおよびヒトカテプシンＧの
阻害についての典型的なKi値は次の通りであった：
第１図は、合成Val−15−Glu−52−アプロチニンマスタ
ー遺伝子の設計を示す。 第２図は、合成Val−15−Glu−17−52−アプロチニン遺
伝子の構成のために使用した15オリゴヌクレオチド断片
のDNA配列を示す。 第３図は、プラスミドpRK54.1.1中の合成Val−15−Glu
−52−アプロチニンマスター遺伝子のDNA配列を示す。 第４図は、組換えプラスミドpRK54.1.1を示す。 第５図は、Val−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン
遺伝子のDNA配列および組換えプラスミドpNH02.1.1の制
限地図を示す。 第６図は、Val−15−Leu−17−Glu−39−Glu−52−アプ
ロチニン遺伝子のDNA配列および組換えプラスミドpNH1
6.1.1の制限地図を示す。 第７図は、断片β−EA10AおよびＢ、γ−EA2Aおよび
Ｂ、δ−EA1AおよびＢ、およびδ−EA7AおよびＢのDNA
配列を示す。 第８図は、発現プラスミドpES44.1.1の構成を示す。 第９図は、発現プラスミドpNH05.1.1の構成を示す。 第10図は、ベクターpWB2601の構成を示す。 第11図は、プラスミドpALK1からのα−アミラーゼリー
ダーのDNA配列を示す。 第12図は、プラスミドpCH237の構成を示す。 第13図は、プラスミドpCH2472の構成を示す。 第14図は、６モルの尿素および10ミリモルのβ−メルカ
プトエタノールを含有する50ミリモルのトリスpH8.5中
のセファクリル（Sephacryl ）Ｓ−300のゲルろ過によ
るMS−２−Val−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン
融合蛋白質の精製を示す。プールの分画は棒によって示
されている。 第15図は、CM−セファロース（Sepharose ）によるVal
−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニンの精製を示す。
プールの分画は棒によって示されている。 第16図は、モノ（Mono S ）カラムによるVal−15−Leu
−17−Glu−52−アプロチニンの精製を示す。プールの
分画は棒によって示されている。 第17図は、Val−15−Leu−17−Glu−52−およびVal−15
−Leu−17−Glu−39−Glu−52−アプロチニンのHPLC−
クロマトグラフィーを示す。 上のグラフにおいて、３ナノモルのVal−15−Leu−17−
Glu−52−アプロチニンをベイカーボンド（Bakerbond）
RP−18−幅の孔カラム（250×4.6mm）のクロマトグラフ
ィーにかけた。条件：流速0.7ml/分；検出 210nm;炉温
度40℃；溶液A 0.1％のTFA、溶液B 0.1％のTFA/60％のA
CN;勾配:0分 ０％のＢ、10分０％の結合、70分 100％
のＢ、80分 ０％のB;検出210nm。 下のグラフにおいて、４ナノモルのVal−15−Leu−17−
Glu−39−Glu−52−アプロチニンをベイカーボンド（Ba
kerbond）BP−18−幅の孔カラム（250×4.6mm）のクロ
マトグラフィーにかけた。条件：流速0.7ml/分；検出
210nm;炉温度40℃；溶液A 0.1％のTFA、溶液Ｂ 0.1％
のTFA/60％のACN;勾配:0分 ０％のＢ、10分０％の結
合、70分 100％のＢ、80分 ０％のB;検出210nm。 第18図は、モノ（Mono S ）カラムによるVal−15−Leu
−17−アプロチニンのクロマトグラフィーを示す。詳細
は実施例８に記載されている。 第19図は、Val−15−Glu−52−およびVal−15−Leu−17
−Glu−52−アプロチニンの量を増加することによるヒ
ト白血球エラスターゼの阻害を示す。 グラフにおいて、Val−15−Glu−52−アプロチニンは−
−−０−−−で示し、そしてVal−15−Leu−17−Glu−5
2−アプロチニンは・・・×・・・で示されている。ヒ
ト白血球エラスターゼの濃度は5.5×10-9モルである。
ー遺伝子の設計を示す。 第２図は、合成Val−15−Glu−17−52−アプロチニン遺
伝子の構成のために使用した15オリゴヌクレオチド断片
のDNA配列を示す。 第３図は、プラスミドpRK54.1.1中の合成Val−15−Glu
−52−アプロチニンマスター遺伝子のDNA配列を示す。 第４図は、組換えプラスミドpRK54.1.1を示す。 第５図は、Val−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン
遺伝子のDNA配列および組換えプラスミドpNH02.1.1の制
限地図を示す。 第６図は、Val−15−Leu−17−Glu−39−Glu−52−アプ
ロチニン遺伝子のDNA配列および組換えプラスミドpNH1
6.1.1の制限地図を示す。 第７図は、断片β−EA10AおよびＢ、γ−EA2Aおよび
Ｂ、δ−EA1AおよびＢ、およびδ−EA7AおよびＢのDNA
配列を示す。 第８図は、発現プラスミドpES44.1.1の構成を示す。 第９図は、発現プラスミドpNH05.1.1の構成を示す。 第10図は、ベクターpWB2601の構成を示す。 第11図は、プラスミドpALK1からのα−アミラーゼリー
ダーのDNA配列を示す。 第12図は、プラスミドpCH237の構成を示す。 第13図は、プラスミドpCH2472の構成を示す。 第14図は、６モルの尿素および10ミリモルのβ−メルカ
プトエタノールを含有する50ミリモルのトリスpH8.5中
のセファクリル（Sephacryl ）Ｓ−300のゲルろ過によ
るMS−２−Val−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニン
融合蛋白質の精製を示す。プールの分画は棒によって示
されている。 第15図は、CM−セファロース（Sepharose ）によるVal
−15−Leu−17−Glu−52−アプロチニンの精製を示す。
プールの分画は棒によって示されている。 第16図は、モノ（Mono S ）カラムによるVal−15−Leu
−17−Glu−52−アプロチニンの精製を示す。プールの
分画は棒によって示されている。 第17図は、Val−15−Leu−17−Glu−52−およびVal−15
−Leu−17−Glu−39−Glu−52−アプロチニンのHPLC−
クロマトグラフィーを示す。 上のグラフにおいて、３ナノモルのVal−15−Leu−17−
Glu−52−アプロチニンをベイカーボンド（Bakerbond）
RP−18−幅の孔カラム（250×4.6mm）のクロマトグラフ
ィーにかけた。条件：流速0.7ml/分；検出 210nm;炉温
度40℃；溶液A 0.1％のTFA、溶液B 0.1％のTFA/60％のA
CN;勾配:0分 ０％のＢ、10分０％の結合、70分 100％
のＢ、80分 ０％のB;検出210nm。 下のグラフにおいて、４ナノモルのVal−15−Leu−17−
Glu−39−Glu−52−アプロチニンをベイカーボンド（Ba
kerbond）BP−18−幅の孔カラム（250×4.6mm）のクロ
マトグラフィーにかけた。条件：流速0.7ml/分；検出
210nm;炉温度40℃；溶液A 0.1％のTFA、溶液Ｂ 0.1％
のTFA/60％のACN;勾配:0分 ０％のＢ、10分０％の結
合、70分 100％のＢ、80分 ０％のB;検出210nm。 第18図は、モノ（Mono S ）カラムによるVal−15−Leu
−17−アプロチニンのクロマトグラフィーを示す。詳細
は実施例８に記載されている。 第19図は、Val−15−Glu−52−およびVal−15−Leu−17
−Glu−52−アプロチニンの量を増加することによるヒ
ト白血球エラスターゼの阻害を示す。 グラフにおいて、Val−15−Glu−52−アプロチニンは−
−−０−−−で示し、そしてVal−15−Leu−17−Glu−5
2−アプロチニンは・・・×・・・で示されている。ヒ
ト白血球エラスターゼの濃度は5.5×10-9モルである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＮ (72)発明者 ボルフガング・ブレンス ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル１・カイザー‐ビルヘルム‐アレー 37 (72)発明者 デイートリツヒ・ヘルライン ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル１・パウル‐エールリツヒ‐シユトラ ーセ 20 (72)発明者 ゲルト・ラインハルト ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル１・アムエツブツシユ 55アー (72)発明者 オイゲン・シユナベル ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル11・シメルベーク ６ (72)発明者 ベルナー・シユレーダー ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル１・クラウデイウスベーク ９ (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 16，Ｎｏ．９，Ｐ．1531−1541（1977) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 260，Ｎｏ．21，Ｐ．11451−11455 （1985) Ｂｉｏｃｈｅｎ．Ｊ．，Ｖｏｌ．233, Ｎｏ．２，Ｐ．443−450（1986)
Claims (18)
- 【請求項１】ウシ膵臓トリプシン阻害剤（アプロチニ
ン、BPTI）の配列を有し、少なくとも位置15および17に
おけるアミノ酸の２つが下記アミノ酸により、そして場
合により、位置16、18、34、39および52におけるアミノ
酸の１または２以上がさらに下記アミノ酸により、すな
わち 位置15においては、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Me
t、Ala、Thr、Ser、Gln、AsnまたはArgにより、 位置16においては、Val、Met、Thr、Ser、Gln、Asn、Gl
yまたはArgにより、 位置17においては、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Me
t、Ala、Thr、Ser、Gln、Asn、Gly、HisまたはLysによ
り、 位置18においては、Leu、Val、Phe、Met、Thr、Gluまた
はGlyにより、 位置34においては、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Alaまた
はThrにより、 位置39においては、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Me
t、Ala、Thr、Ser、Glu、Gln、Asn、Gly、Lys、Aspまた
はProにより、 位置52においては、Leu、Ile、Val、Thr、Ser、Glu、Gl
n、Asp、LysまたはArgにより、 置換されているペプチドであって、インビトロでヒト白
血球エラスターゼに対してLeu−15−Leu−17−Glu−52
−アプロチニンと同等またはそれを超える阻害活性を有
するが、ただし Val−15−Ser−16−Ile−17−アプロチニン、 を除外することを特徴とするペプチド。 - 【請求項２】位置15において、アミノ酸Val、Leuまたは
Ileを、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Gln、Thr、M
et、Trp、Tyr、PheまたはAsnを、 位置39において、アミノ酸Glu、Asp、Asn、Thr、Val、L
eu、IleまたはGlnを、そして 位置52において、アミノ酸ThrまたはGluを、 含有する請求項１記載のペプチド。 - 【請求項３】位置15において、アミノ酸Val、Leuまたは
Ileを、 位置17において、アミノ酸Leu、Ile、Val、Gln、Thr、M
et、Trp、Tyr、PheまたはAsnを、 位置39において、アミノ酸Gluを、あるいは 位置52において、アミノ酸ThrまたはGluを、 含有する請求項１記載のペプチド。 - 【請求項４】位置15において、アミノ酸Val、Leuまたは
Ileを、 位置17において、アミノ酸Leu、IleまたはValを、 位置39において、アミノ酸Gluを、あるいは 位置52において、アミノ酸ThrまたはGluを、 含有する請求項１記載のペプチド。 - 【請求項５】位置15において、アミノ酸ValまたはLeu
を、 位置17において、アミノ酸Leuを、 位置39において、アミノ酸Gluを、あるいは 位置52において、ThrまたはGluを、 含有する請求項１記載のペプチド。 - 【請求項６】Val−15−Leu−17−、 Val−15−Leu−17−Glu−52−、 Val−15−Leu−17−Thr−52−、 Val−15−Leu−17−Glu−39−、 Val−15−Leu−17−Glu−39−Glu−52−、 Val−15−Leu−17−Glu−39−Thr−52−、 Leu−15−Leu−17−、 Leu−15−Leu−17−Glu−52−、 Leu−15−Leu−17−Thr−52−、 Leu−15−Leu−17−Glu−39−、および Leu−15−Leu−17−Glu−39−Thr−52−アプロチニン からなる群より選ばれる、請求項１記載のペプチド。
- 【請求項７】位置１におけるArgの前にまたは位置58に
おけるAlaの後に、アミノ酸またはペプチド配列を有す
る請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。 - 【請求項８】位置１においてメチオニンを、そして／ま
たはリーダーペプチドをさらに含有する請求項１〜７の
いずれかに記載のペプチド。 - 【請求項９】分子の一端または両端において１つまたは
複数のアミノ酸が短縮されている請求項６記載のペプチ
ド。 - 【請求項１０】組換えDNA技術によって産生された請求
項１〜９のいずれかに記載のペプチド。 - 【請求項１１】請求項１〜10のいずれかに記載のペプチ
ドをコードするDNA。 - 【請求項１２】上流にメチオニンのためのコドンまたは
リーダーペプチドをコードするDNAを、あるいは下流に
１または２以上の追加のアミノ酸のためのコドンもさら
に含む請求項11記載のDNA。 - 【請求項１３】請求項11または12記載のDNAを含んでな
る発現ベクター。 - 【請求項１４】請求項13記載の発現ベクターで形質転換
された宿主生物体であって、グラム陰性もしくはグラム
陽性細菌、酵母または糸状菌である宿主生物体。 - 【請求項１５】請求項１〜９のいずれかに記載のペプチ
ドを生産するのに使用するための請求項14記載の宿主生
物体。 - 【請求項１６】ａ）適当な条件下で宿主生物体を培養
し、 ｂ）培養物からペプチドを単離し、そして ｃ）得られたペプチドを精製する工程を含む請求項１〜
９のいずれかに記載のペプチドの製造方法であって、前
記宿主生物体が請求項13記載の発現ベクターにより形質
転換されていることを特徴とする方法。 - 【請求項１７】請求項１〜９のいずれかに記載のペプチ
ドを含んでなるヒト白血球エラスターゼの過剰量の存在
に起因する疾患を治療するための製薬学的調製物。 - 【請求項１８】エシェリキャ・コリー（Escherichia co
li）RRIΔM15pES 44.1.1（DSM 4157）、同RRIΔM15pES
45.1.3（DSM 4158）または同RRIΔM15pCH 2742（DSM 41
59）。
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