CN102245636A - 用于药物递送的依托泊苷和多柔比星结合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物递送领域中的改进。更具体地,本发明涉及具有与诸如鬼臼毒素衍生物(例如,依托泊苷或依托泊苷衍生物,如依托泊苷4’-二甲基甘氨酸)或与多柔比星或多柔比星衍生物的治疗剂具有可水解共价键的多肽。这些多肽结合物可被用作运输治疗剂穿过血脑屏障(BBB)或进入特定的细胞类型(如卵巢、肝、肺或肾脏细胞)的载体。本发明还涉及包括本发明的化合物的药物组合物及其在治疗方法中的应用。
Description
相关申请的参考
本申请要求于2008年10月15日提交的美国临时专利申请第61/105,654号和2009年4月20日提交的美国临时专利申请第61/171,010号的优先权,它们均以引用方式结合于本文作为参考。
技术领域
本发明涉及药物递送领域的改进。更具体地说,本发明涉及具有与诸如鬼臼毒素衍生物(例如,依托泊苷或依托泊苷衍生物,如依托泊苷4’-二甲基甘氨酸)或对多柔比星或多柔比星衍生物的治疗剂的可水解共价键的多肽。这些多肽结合物可被用作运输治疗剂穿过血脑屏障(BBB)或进入到特定细胞类型(如卵巢、肝、肺或肾脏)中的载体。相对于未结合的治疗剂,这些结合物可显示出改善的理化(例如,溶解性提高)和药物特性(例如,增强靶向性从而可使用亚治疗剂量或降低毒性从而可使用超治疗剂量)。本发明还涉及包括本发明的化合物的药物组合物和其在治疗方法中的应用。
背景技术
许多用于这样的疾病的治疗剂具有不理想的副作用(例如,化疗剂),或由于体内稳定性、运输或其他药代动力学特性的原因,这些治疗剂在目标组织中难以达到足够高的浓度或持续足够长的时间从而在目标组织中实现最大治疗效果。因此,需要提高目标器官或组织(如脑、卵巢、肝或肺)中的治疗剂或诊断试剂浓度的方法和组合物。
发明内容
我们已经发展了肽-治疗剂结合物、和其药学可接受的盐,其中依托泊苷通过可水解戊二酸连接子(linker)在2″羟基处共价连接于Angiopep-2多肽(SEQ ID NO:97)(例如方案1所示的化合物(1))。还利用依托泊苷4′-二甲基甘氨酸代替依托泊苷制备了相关的肽-治疗剂结合物,并观察到了性能的提高(例如,溶解性)。
方案1
还使用湖泊酸连接子在14-羟基处将多柔比星共价连接于Angiopep-2多肽(例如,方案2所示的化合物(2)的三盐酸盐)。盐酸多柔比星的共价连接也能够赋予改善的性能(例如,溶解性)。
方案2
相对于对应的未结合的治疗剂,这些结合物能够显示出改善的性能,如改善的理化性能(例如,溶解性提高)和药学性能(例如,增强的靶向性从而可使用亚治疗剂量或降低的毒性从而可使用超治疗剂量)。依托泊苷DMG和盐酸多柔比星结合物的溶解性还可被用于调整给药剂量方案。因此,本发明的特征在于这些化合物,以及相关的化合物。本发明还提供了这些化合物的制造和使用方法。
因此,在一个方面,本发明特征在于包括与选自SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列或其功能性衍生物的化合物,或其药学可接受的盐,其中氨基酸序列包括该氨基酸序列的氨基酸与鬼臼毒素衍生物的共价键。在一些实施方式中,鬼臼毒素衍生物是具有式(I)的结构的化合物:
或其立体异构体或药学可接受的盐,其中
每一个R1、R2和R3独立地选自H,可选取代的C1-6烷基、C(O)R8、P(O)(OR9)(OR10)、S(O)2(OR9),或包括与多肽的氨基酸形成的共价键的可水解连接子Y;
X是O或NR7;
每一个R4、R5和R7独立地选自H,可选取代的C1-6烷基、C(O)R8或包括与多肽的氨基酸形成的共价键的可水解连接子Y;
R6是H,选可取代的C1-6烷基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基,
R8选自可选取代的C1-6烷基或可选取代的芳基;
每一个R9和R10独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、或可选取代的芳基;和
n是1、2、3、4、5、6、7或8;
其中R1、R2、R3、R4、R5和R7之一是Y,且R1、R2、R3、R4、R5和R7中的不超过一个是Y。
在一些实施方式中,Y是-C(O)(CH2)nC(O)-,且n是2、3或4。在某些实施方式中,n是3。
在一些实施方式中,该化合物的药学可接受的盐是单-、双-或三-酸加成盐(例如,单、双或三盐酸盐)。
在一些实施方式中,每一种式(I)的化合物独立地选自:
其中,每一个R2独立地是H、P(O)(OH)2或C(O)CH2N(CH3)2;每一个R6独立地是CH3或2-噻吩;每一个Y选自-C(O)(CH2)nC(O)-;
-[C(O){OCH2CH2}nOC(O)]-;-S(O)2(CH2)nS(O)2-;
-[S(O)2{OCH2CH2}nOS(O)2]-;-[{P(O)(OR9)}(CH2)n{P(O)(OR9)}]-;和
-[{(P(O)(OR9)}(OCH2CH2)nO{P(O)(OR9)}]-;每一个n独立地是1、2、3、4、5或6;并且其中每一个Y共价结合于氨基酸。在一些实施方式中,每一个Y是-C(O)(CH2)nC(O)-或-[C(O){OCH2CH2}nOC(O)]-,并且n是2、3或4。在一些实施方式中,每一个R2是C(O)CH2N(CH3)2。在一些实施方式中,每一种式(I)的化合物是:
在一些实施方式中,本发明的化合物具有以下结构
其中每一个(-式(I))基团代表所示的氨基酸和式(I)的化合物之间的可选共价键,并且其中多肽的氨基酸和所述的式(I)的化合物之间至少有一个共价键。在一些实施方式中,式(I)的两种化合物均连接于氨基酸序列。在其他实施方式中,多肽的位置1处的苏氨酸和位置10和15处的赖氨酸都具有与具有式(I)的结构的化合物的共价键。
在一些实施方式中,R2是H或-C(O)CH2N(CH3)2(即,C-连接的N,N-二甲基甘氨酸)。在其他实施方式中,每一个R2是H。在其他实施方式中,每一个R2是-C(O)CH2N(CH3)2。
在一些实施方式中,可选取代的C1-6烷基独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、或仲己基。在一些实施方式中,C1-6烷基在任意碳上被至少一个可选取代的氨基(例如,NH2或N(CH3)2)取代。
在一些实施方式中,可选取代的C3-10环烷基独立地选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
在一些实施方式中,可选取代的芳基独立地选自苯基、萘基、四氢萘基、茚满基或茚基。
在一些实施方式中,可选取代的杂环基独立地选自氮杂环丙基、氮杂环丁基、1,3-二氮杂环丁基(diazatidinyl)、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、噻吩基(thiranyl)、硫杂环丁基、四氢噻吩基、二硫辛基(dithiolanyl)、四氢噻喃基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、二氧杂环己基、氧硫杂环戊基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁基(thioxanyl)和喹宁环基。
在一些实施方式中,可选取代的杂环基选自吡咯基、吡唑基、咪唑基(imadazolyl)、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹嗪基、噌啉基(cinnolinyl)、喹唑啉基、酞嗪基、萘啶基(napthyridinyl)、喹喔啉基、苯硫基、二苯并硫杂七环基(thiepinyl)、呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基和噁二唑基。
在一些实施方式中,取代的烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基被选自以下取代基中的1、2、3、4、5或6个取代基取代:C1-6烷基;卤素;叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、酰氧基、酰基(-C(O)R)、(-OC(O)R)、烷氧基(-OR)、酰氨基或酰胺基(-NRC(O)R′或-C(O)NRR′)、氨基(-NRR′)、芳基、羧酸(-CO2H)、羧酸酯(-CO2R)、氨甲酰基(-OC(O)NRR′或-NRC(O)OR′)、环烷基、杂环基、羟基(-OH)、异氰基(-NC)、磷酸酯(-P(O)(OR)(OR′))、磺酸酯(-SO2OR)或磺酰基(-SO2R),本文中定义的,其中每一个R或R’独立地选自H、C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。在一些实施方式中,这些取代基未被进一步取代。在其他的实施方式中,这些取代基本身被1、2、3、4、5或6个取代基进一步取代。
在一些实施方式中,R4是Y。在其他的实施方式中,R5是Y。
在其他的实施方式中,氨基酸序列通过所述氨基酸序列的第二个、第三个、第四个或第五个氨基酸共价结合于另外的鬼臼毒素衍生物。在一些实施方式中,该鬼臼毒素衍生物是式(I)的化合物。
在某些实施方式中,式I的化合物具有以下结构:
在其他实施方式中,式(I)的化合物具有以下结构:
在其他的实施方式中,式(I)的化合物具有以下结构:
在其他的实施方式中,每一种式(I)的化合物独立地选自:
其中每一个R8A和R8B独立地是H或可选取代的C1-6烷基,或R8A和R8B结合从而形成可选取代的3-7元环。在一些实施方式中,每一个R8A和R8B是可选取代的C1-6烷基。在其他的实施方式中,每一种式(I)的化合物具有以下结构:
在其他的实施方式中,该化合物具有以下结构:
在具体的实施方式中,该化合物具有结构:
或其药学可接受的盐(例如三盐酸盐),其中在化合物(I)中,依托泊苷是指依托泊苷4’-二甲基甘氨酸。
在某些实施方式中,共价结合于可水解连接子Y的每一个氨基酸是通过所述氨基酸的氨基、胍基、羟基、酚基或硫醇官能团连接的。在一些实施方式中,共价结合可水解连接子Y的氨基酸是赖氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸或精氨酸。
在第二方面,本发明的特征在于包括与选自由SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列基本一致的氨基酸序列或其功能性衍生物的化合物或其药学可接受的盐,其中所述氨基酸序列包括所述氨基酸序列的氨基酸与多柔比星衍生物的共价键,并且其中所述多柔比星衍生物是具有式(II)的结构的化合物:
X1、X2、X3、X4和X5各自独立地选自共价键、O或NR25;
R17、R18、R19、R20、R20、R21、R22、R23、R24和R25各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、可选取代的C2-6烯基、可选取代的C2-6炔基、可选取代的环烷基、可选取代的杂环基、或是可水解的连接子Y;并且
其中R17、R18、R19、R20、R20、R21、R22、R23、R24和R25中之一并且只有一个是Y。
在一些实施方式中,该化合物的药学可接受的盐是单-、双-或三-酸加成盐(例如,单、双或三盐酸盐)。
在某些实施方式中,式(II)的化合物具有以下结构:
在其他的实施方式中,式(II)的化合物具有以下结构:
在某些实施方式中,该化合物具有以下结构:
其中每一个(-式(II))代表所示的氨基酸和式(II)的化合物之间的可选的共价键,并且其中多肽的氨基酸和所述式(II)的化合物之间有至少一个共价键。在一些实施方式中,多肽的位置1处的苏氨酸和位置10和15处的赖氨酸都包括与具有式(II)的结构的化合物的共价键。
在一些实施方式中,Y是-C(O)(CH2)nC(O)-,并且n是2、3或4。在某些实施方式中,n是2。在其他的实施方式中,氨基酸序列通过该氨基酸序列的第二、第三、第四或第五个氨基酸共价结合于具有式(II)结构的化合物。在另一种实施方式中,共价结合于所述可水解连接子Y的每一个氨基酸通过所述氨基酸的氨基、胍基、羟基、酚基或硫醇官能团连接。在某些实施方式中,氨基酸是赖氨酸或苏氨酸。
在一些实施方式中,式(II)的化合物具有以下结构:
在特定的实施方式中,该化合物具有结构:
或其药学可接受的盐(例如,三盐酸盐)。
在另一方面,本发明的特征在于以下化合物,
在前述任一方面中,氨基酸序列可以与表1列出的任意序列或其片段或药学可接受的盐基本一致。在某些实施方式中,氨基酸序列具有Angiopep-1(SEQ ID NO:67)、Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-3(SEQ ID NO:107)、Angiopep-4a(SEQ ID NO:108)、Angiopep-4b(SEQID NO:109)、Angiopep-5(SEQ ID NO:110)、Angiopep-6(SEQ ID NO:111)或Angiopep-7(SEQ ID NO:112)的序列。本发明的氨基酸序列或化合物可被有效地运输到特定细胞类型(例如,肝脏、卵巢、肺、肾脏、脾脏和肌肉细胞中的任意一种、两种、三种、四种或五种)中或可以有效地穿过哺乳动物BBB(例如,Angiopep-1、-2、-3、-4a、-4b、-5和-6)。在一些实施方式中,细胞是卵巢细胞。在另一种实施方式中,结合物能够进入特定的细胞类型(例如,肝脏、卵巢、肺、肾脏、脾脏和肌肉细胞中的任意一种、两种、三种、四种或五种)但是不能有效地穿过BBB(例如包括Angiopep-7的结合物)。在一些实施方式中,细胞是卵巢细胞。多肽可以具有任意长度,例如,至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200或500个氨基酸。在某些实施方式中,多肽的长度是10至50个氨基酸。该结合物可以基本上是纯的。可通过重组遗传技术或化学合成来产生多肽。结合物可以与药学可接受载体一起配制。
表1:示例性多肽
第5、67、76和91号多肽分别包括SEQ ID NO:5、67、76和91的序列,并且于C末端处被酰胺化。
第107、109和110号多肽分别包括SEQ ID NO:97、109和110的序列,并且于N末端处被乙酰化。
在以上的任一方面,多肽可包括具有下式的氨基酸序列:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
其中X1-X19中的每一个(例如X1-X6、X8、X9、X11-X14和X16-X19)独立地是任意的氨基酸(例如,天然存在的氨基酸,如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)或不存在,并且X1、X10和X15中的至少一个(例如2或3个)是精氨酸。在一些实施方式中,X7是Ser或Cys;或X10和X15各自独立地是Arg或Lys。在一些实施方式中,从X1至X19的所有残基(包括X1和X19)与SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116中的任意序列(例如,Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7)的任意氨基酸序列基本一致。在一些实施方式中,氨基酸X1-X19中的至少一个(例如,2、3、4或5个)是Arg。在一些实施方式中,多肽在其N末端、C末端或在N末端和C末端均具有一个或多个另外的半胱氨酸残基。
在上述任意方面的某些实施方式中,多肽可以被修饰(例如,如本文所述的)。多肽可以被酰胺化、乙酰化或两者皆有。这样的多肽修饰可以是位于多肽的氨基末端或羧基末端。本发明的结合物还可包括任意本文所述多肽的模拟肽(例如,本文所述的模拟肽)。多肽可以是多聚体形式(multimeric form),例如二聚体形式(例如,通过半胱氨酸残基结合的二硫键形成的二聚体)。
在某些实施方式中,多肽具有具有至少一个氨基酸置换的本文所述的氨基酸序列(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个取代)。多肽可包含,例如1至12、1至10、1至5、或1至3个氨基酸置换,例如,1至10(例如,9、8、7、6、5、4、3、2个)个氨基酸置换。(一个或多个)氨基酸置换可以是保守或非保守的。例如,多肽可在SEQ ID NO:1、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7中的任意一个的氨基酸序列的对应于位置1、10和15中的一个、两个或三个位置处具有精氨酸。
在上述任意方面,结合物可具体地排除包括SEQ ID NO:1-105和107-116(例如,Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7)中的任意序列或由SEQ ID NO:1-105和107-116(例如,Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7)中的任意序列构成的多肽。在一些实施方式中,本发明的多肽和结合物排除了SEQ ID NO:102、103、104和105的多肽。
在一些实施方式中,氨基酸序列与选自由SEQ ID NO:1-105和SEQID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列或其功能性衍生物具有至少35%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的同一性。在某些实施方式中,氨基酸序列与选自由Angiopep-2(SEQ IDNO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7(SEQ IDNOS:109-112)组成的组中的氨基酸序列具有至少35%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的同一性。在其他实施方式中,氨基酸序列与Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列具有至少35%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的同一性。
在一些实施方式中,氨基酸序列包括选自由SEQ ID NO:1-105和SEQID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列或其功能性衍生物。在某些实施方式中,氨基酸序列是Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、或Angiopep-7(SEQ ID NOS:109-112)的氨基酸序列。
在其他实施方式中,氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:1-105和SEQID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列或其功能性衍生物组成。在某些实施方式中,氨基酸序列是Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、或Angiopep-7(SEQ ID NOS:109-112)的氨基酸序列。
在一些实施方式中,相对于未结合的生物活性剂,本发明的化合物能够改变生物活性剂(例如,鬼臼毒素衍生物,如式(I)的化合物,或多柔比星衍生物,如式(II)的化合物)在目标细胞类型或组织中的积累。在其他实施方式中,本发明的化合物促进了生物活性剂在目标细胞类型或组织中的积累。在某些实施方式中,相对于以未结合的生物活性剂所观察到的,生物活性剂的浓度提高了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1,000%、2,000%、3,000%、4,000%、5,000%、6,000%、7,000%、8,000%、9,000%、10,000%、12,500%、15,000%、17,500%或20,000%。在一些实施方式中,目标细胞类型或组织是脑、卵巢、肝脏、肺、肾脏、脾脏或肌肉。在一些实施方式中,目标细胞类型是脑或卵巢。在某些实施方式中,生物活性剂选自依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG、替尼泊苷、多柔比星或表柔比星。在其他实施方式中,本发明的化合物包括Angiopep-2(SEQID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQID NOS:109-112)的氨基酸序列、或它们的功能性衍生物。
在第三方面,本发明的特征在于包括本文所述的任意本发明的化合物(例如,包括与选自由SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列基本一致的氨基酸序列或其功能性衍生物的化合物,或药学可接受的盐,其中氨基酸序列包括氨基酸序列的氨基酸与式(I)或(II)的化合物(例如,化合物(1)或(2))的共价键)和药学可接受载体的药物组合物。在第四方面,本发明的特征在于治疗或预防性治疗癌症的方法,其中该方法包括向患者给予治疗有效量的本文所述的任意本发明的化合物(例如,包括与选自由SEQ ID NO:1-105和107-116组成的组中的氨基酸序列基本一致的氨基酸序列的化合物,或其功能性衍生物或药学可接受的盐,其中氨基酸序列包括氨基酸序列的氨基酸与式(I)或(II)的化合物的共价键)。在一些实施方式中,化合物是化合物(1)或(2)。在一些实施方式中,鬼臼毒素衍生物选自
其中
Y是H;每一个R2独立地是H或P(O)(OH)2或-C(O)R8;每一个R6独立地是CH3或2-噻吩;每一个Y是-C(O)(CH2)nC(O)-;每一个R8独立地是可选取代的C1-6烷基;和每一n独立地是2、3或4。在一些实施方式中,n是3。在一些实施方式中,每一R2是C(O)R8。在一些实施方式中,R8是包括至少一个可选取代的氨基(例如NH2或N(CH3)2)的C1-6烷基。在某些实施方式中,-C(O)R8是C-连接的氨基酸。在一些实施方式中,鬼臼毒素衍生物是依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷4’-二甲基甘氨酸(依托泊苷DMG)或替尼泊苷。在其他的实施方式中,该化合物是本文所述的多柔比星或多柔比星的任何衍生物(例如,式(II)的化合物)。
在一些实施方式中,该方法包括给药第二种药剂。在其他的实施方式中,该药剂是治疗剂。在某些实施方式中,第二治疗剂也共价结合于本发明的化合物。在其他实施方式中,该第二治疗剂未共价结合于本发明的化合物。在一些实施方式中,该治疗剂是药物、药品、发射辐射的药剂、细胞毒性剂、它们的生物活性片段、或它们的混合物以治疗疾病。在其他实施方式中,给药与另一种治疗方案同时进行。在一些实施方式中,治疗方案是放射疗法、化学疗法、干细胞移植、骨髓移植、外科手术或高温治疗(hyperthermic treatment)。在一些实施方式中,第二治疗剂是包括Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的序列的多肽或由Angiopep-2(SEQ IDNO:97)的序列构成的多肽,优选其中Angiopep-2结合于抗癌剂(例如,紫杉醇),例如ANG1005,其具有以下结构:
ANG1005:
Tx1An2(3∶1结合物)
在美国专利第7,557,182,号还描述了其他的示例性第二治疗剂,其以引用方式结合于本文作为参考。
在一些实施方式中,癌症是脑癌。在其他的实施方式中,脑癌是胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、听神经瘤、腺瘤、星形细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、CNS淋巴瘤、室管膜瘤、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、成神经管细胞瘤(mdl)、退行性(恶性)脑膜瘤、或神经纤维瘤病。在其他的实施方式中,癌症是急性淋巴细胞白血病、急性成髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、静脉内或膀胱内膀胱癌、骨肉瘤、乳腺癌、类癌综合征(小肠)、子宫内膜癌、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、妇科肉瘤、头颈癌(鳞状细胞)、肝癌、霍奇金病(Hodgkin′s disease)、胰岛细胞癌、白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、骨源性肉瘤、卵巢癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、移行细胞性膀胱癌(transitional cell bladder carcinoma)、软组织肉瘤或维尔姆斯氏瘤(Wilms′tumor,肾母细胞瘤)。
在本文所述的任意治疗方法中,本发明的化合物(例如化合物(1)或(2))或其药学可接受的盐可以以相对于未结合的治疗剂(例如,依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷4-二甲基甘氨酸、或多柔比星)的亚治疗剂量或超治疗剂量给予患者。
在另一方面,本发明的特征在于本文所述的本发明的任意化合物的制备方法,其中该方法包括利用双官能可水解连接基团将鬼臼毒素衍生物共价结合于本文所述的任意氨基酸序列的步骤。在一些实施方式中,该氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116,或其功能性衍生物。在其他实施方式中,氨基酸序列包括Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQ IDNOS:109-112)的氨基酸序列。
在一些实施方式中,制备本发明的任意化合物的方法包括以下步骤:
(a)将所述式(I)的化合物与所述双官能可水解连接基团结合从而形成共价加合物;以及
(b)将(a)的加合物与所述氨基酸序列结合;并且
其中在被用于(b)之前加合物(a)可被可选地纯化。
在一些实施方式中,使用相对于式(I)的化合物的1.0-10.0当量的双官能可水解连接基团。例如,可使用1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0当量。在其他实施方式中,使用3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0当量的双官能可水解连接基团。在某些实施方式中,该方法包括使用肽偶联剂。在一些实施方式中,肽偶联剂是N,N,N’,N’-四甲基-O-(苯并三氮唑-1-基)脲四氟硼酸酯(TBTU)。
在一些实施方式中,可水解双官能连接基团选自二羧酸、碳酸氢盐、羧酸酐、二异氰酸酯(盐)或双膦酸。在某些实施方式中,可水解双官能连接基团选自丁二酸、戊二酸、戊二酸酐、或丁酸(butaric acid)。
在一些实施方式中,鬼臼毒素衍生物选自:
其中
Y是H;每一个R2独立地是H或P(O)(OH)2、或-C(O)R8;每一个R6独立地是CH3或2-噻吩;每一个Y是-C(O)(CH2)nC(O)-;每一R8独立地是可选取代的C1-6烷基;并且每一个n独立地是2、3或4。在一些实施方式中,n是3。在一些实施方式中,每一个R2是C(O)R8。在一些实施方式中,R8是包括至少一个可选取代的氨基(例如NH2或N(CH3)2)的C1-6烷基。在某些实施方式中,-C(O)R8是C-连接的氨基酸。在一些实施方式中,鬼臼毒素衍生物是依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG或替尼泊苷。
在本文所述的任意方法或组合物中,化合物的药学可接受的盐可以是单-、双-、三-或四酸加成盐(例如,三盐酸盐)。在本文所述的任意实施方式中,共价结合于多肽的式(I)或(II)的任意化合物(例如,依托泊苷、依托泊苷DMG或多柔比星)是质子化作用位点。例如,在化合物(1)中,1、2或3个依托泊苷DMG部分被质子化,或在化合物(2)中,1个、2个或3个多柔比星部分被质子化从而形成酸加成盐(例如,单-、双-或三盐酸盐)。
本文所使用的术语“C1-6烷基”或“烷基”是指可选取代的C1-6饱和烃基。烷基可以是直链或支链的。烷基的实施例包括,但不限于,甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛集、正癸基、正十一烷基、十二烷基等,其可以具有一个或多个取代基。例如,被取代的烷基可以具有1个、2个、3个、4个、5个或6个取代基。
本文所使用的术语“芳基”是指具有5-14个碳原子的可选取代的单环或多环的芳香族完全碳基团(all carbon moiety)。在本发明的某些实施方式中,“芳基”表示取代或未取代的单环或双环基团。示例性的芳基包括,但不限于,苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等,其可具有一个或多个取代基。芳基还包括杂芳基。
本文所使用的术语“C-连接的氨基酸”是指通过该氨基酸的C末端共价结合于另一化合物(例如本文所述的鬼臼毒素衍生物中的任一种)的氨基酸。
本文所使用的术语“C3-10环烷基”或“环烷基”是指可选取代的饱和的3-10元单环或双环烃环系统。示例性的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、和环庚基。取代的环烷基可具有,例如,1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个取代基。
本文所使用的术语“杂芳基”是指具有5-14个环原子的取代或未取代的单环或多环芳香族基团,其中1个、2个、3个或4个环原子可以选自S、O和N,且剩余的环原子是碳。示例性的杂芳基包括,但不限于,吡咯基、吡唑基、咪唑基(imadazolyl)、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹嗪基(quinolizinyl)、噌啉基(cinnolinyl)、喹唑啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、苯硫基、二苯并硫杂七环基、呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基等,其可具有一个或多个取代基。
本文所使用的术语“杂环的”或“杂环基”是指可选取代的非芳香族的,部分不饱和或完全饱和的3至10元环体系,其包括大小为3至8个原子的单环,和可包括与非芳香环稠合的芳香族五元或六元芳基或杂芳基的双环或三环体系。这些杂环包括那些具有一至三个独立地选自氧、硫和氮的杂原子的杂环,其中氮和硫杂原子可选地被氧化以及氮杂原子被可选的季铵化(quatemize)或取代。在某些实施方式中,术语杂环是指非芳香族的5、6或7元单环,其中至少一个环原子是选自O、S和N的杂原子(其中氮和硫杂原子可被可选地氧化),且其余的环原子是碳,残基通过任意的环原子与其他的分子连接。示例性的杂环基包括,但不限于,氮杂环丙基、氮杂环丁基、1,3-双(羟甲基)咪唑烷基(1,3-diazatidinyl)、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、噻吩基(thiranyl)、硫杂环丁基(thietanyl)、四氢噻吩基、二硫辛基(dithiolanyl)、四氢噻喃基、环氧乙基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、二氧杂环己基、氧硫杂环戊基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁基(thioxanyl)、奎宁环基等,其可具有一个或多个取代基。
本文所使用的术语“药学可接受的盐”是指那些在合理的药物判定范围内适合于与人和动物的组织接触使用,而没有不当的毒性、放射性、过敏反应等并且有相当的合理效益/风险比的酸加成盐。药学可接受的盐是本领域中公知的。例如,在Berge et al.,J.Pharmaceutical Sciences 66:1-19,1977以及Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,(Eds.P.H.Stahl和CG.Wermuth),Wiley-VCH,2008中描述了药学可接受的盐。可在分离和纯化本文所述的化合物的过程中原位制备该盐,或通过使具有一个或多个碱性基团(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)的化合物与理想当量的合适的有机或无机酸进行反应来分开制备。代表性的酸加成盐包括醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天门冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、三氟醋酸盐、三氟甲基磺酸盐、十一酸盐、和戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等,以及无毒的铵盐、季铵盐和胺阳离子,但不限于铵盐、四甲基铵盐、四乙基铵盐、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。理想的是,该“药物可接受酸加成盐”是本文所述的化合物的单-、双-、三-或四酸加成盐(例如,本文所述的化合物的单-、双-、三-或四盐酸盐)。
本文所使用的术语“磷酸盐”是指具有式-OP(=O)(OR′)(OR″)的五价磷基团,其中每一个R’和R”独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基。
当基团被描述为“可选取代”的时候,可选的取代基可独立地选自包括但不限于以下基团的组:C1-6烷基;卤素;叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-NC)、酰氧基、酰基(-C(O)R)、(-OC(O)R)、烷氧基(-OR)、胺基(或酰胺基,amido)(-NRC(O)R′或-C(O)NRR′)、氨基(amino)(-NRR′)、芳基、羧酸(-CO2H)、羧酸酯(-CO2R)、氨甲酰基(-OC(O)NRR′或-NRC(O)OR′)、环烷基、杂环基、羟基(-OH)、异氰基(-NC)、磷酸酯(盐)(-P(O)(OR)(OR′))、磺酸酯(盐)(-SO2OR)、或磺酰基(-SO2R),其中每一R和R’独立地选自H、C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基。被取代的基团可具有,例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个取代基。在一些实施方式中,取代基本身可以通过用如本文所述的那些取代基代替氢而被取代。
“载体”是指能够被运输进入特定的细胞类型(例如,肝脏、卵巢、肺、肾脏、脾脏或肌肉细胞)中或穿过BBB的化合物或分子,例如多肽。载体可以连接(共价或非共价)或结合于药剂,从而能够将药剂运输到特定的细胞类型中或穿过BBB。在某些实施方式中,载体可与存在于癌细胞或脑内皮细胞上的受体结合,从而通过胞转作用可被运输到癌细胞中或穿过BBB。载体可以是分子,通过该分子可获得高水平的穿内皮运输,而不影响细胞或BBB完整性。载体可以是多肽或模拟肽,并且可以是天然存在的或通过化学合成或重组遗传技术产生的。
“结合物”是指连接于药剂的载体。结合可以是通过本质化学性质的结合,如通过连接子,或通过本质的遗传学性质的结合,例如通过重组遗传技术,如具有报告分子(例如,绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、Histag等)的融合蛋白。
“有效运输穿过BBB”的载体是指能够至少如AngioPep-6一样有效穿过BBB(即,在本文所述的原位脑灌注检测中有超过38.5%的AngioPep-1(250nM))的载体。因此,“不能有效运输穿过BBB”的载体或结合物以较低水平被运输至脑(例如,运输效率低于AngioPep-6)。
“有效运输至特定细胞类型”的载体或结合物是与对照物质相比,或在结合物的情况下,与未结合的药剂相比,能够在特定的细胞类型中积累(例如,由于运输进入细胞升高,从细胞流出降低,或两者组合)比对照物质或未结合的药剂高至少10%(例如,25%、50%、100%、200%、500%、1,000%、5,000%或10,000%)指载体或结合物。
“基本纯的”或“分离的”是指已从其他化学成分分离出来的化合物(例如,多肽或结合物)。通常,当其按重量计的至少30%是不含其他成分时,该化合物就是基本纯的。在某些实施方式中,制剂的按重量计至少50%、60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%是不含其他成分的。可通过例如表达编码这样的多肽的重组多核苷酸或通过化学合成多肽来获得纯化的多肽。可通过合适的方法测量纯度,例如,柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或通过HPLC分析。
“类似物”是指来源于原始序列或原始序列的一部分并且可包括一个或多个修饰的多肽;例如,氨基酸序列中的一个或多个修饰(例如,氨基酸增加、缺失、插入或置换),一个或多个氨基酸的骨架或侧链的一个或多个修饰,或向一个或多个氨基酸(侧链或骨架)加入基团或另一分子。类似物在多肽的任一末端或两端或多肽的氨基酸序列内部可具有一个或多个氨基酸插入。类似物可与原始序列或原始序列的一部分具有序列相似性和/或序列同一性(例如,可以是基本相同的)。类似物可包括对其结构的修饰,例如,如本文所述的。两个序列的相似度是基于同一性(相同的氨基酸)百分比和保守置换的比例。通过在氨基酸骨架或侧链中的一个或多个修饰的组合,或基团或另一分子的加入,类似物可与原始序列具有至少35%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%(例如,96%、97%、98%、99%和100%)的序列相似性。倾向于与其他氨基酸相似(保守氨基酸)的示例性氨基酸是本领域中已知的,并且包括如表3中列出的那些氨基酸。
“基本上同一性”是指多肽或核酸表现出与参考氨基酸或核酸序列具有至少35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%或甚至99%的同一性。对于多肽,对比序列的长度一般为至少4个(例如,至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50或100个)氨基酸。对于核酸,对比序列的长度一般为至少60个核苷酸,优选至少90个核苷酸,更优选至少120个核苷酸,或全长。在这里,应理解在与原始多肽的氨基酸相同或相似的类似物的氨基酸之间会发现空位(gap)。空位可包括无氨基酸、一个或多个与原始序列不相同或不相似的氨基酸。本文中包括本发明的载体(多肽)的生物活性类似物。可通过利用Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的n算法GAP、BESTFIT或FASTA使用默认空位权重(default gap weight)来确定同一性百分比。
“功能性衍生物”是指本发明的载体或药剂或结合物的“化学衍生物”、“片段”或“变体”生物活性序列或部分以及它们的盐。载体功能性衍生物能够连接或结合于药剂并且进入特定的细胞类型,从而将药剂运输到该细胞中。
“化学衍生物”是指含有不是载体、药剂或载体-药剂结合物的一部分的另外的化学组成部分的本发明的载体、药剂或结合物,其包括共价修饰。可利用本领域公知的方法通过定向化学合成来制备化学衍生物。可通过使靶向的氨基酸与能够与所选的侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应将这样的修饰引入到蛋白质或肽载体、药剂或载体-药剂结合物中。载体化学衍生物能够穿过BBB或进入特定的细胞类型或在其中累积(例如,本文所述的细胞,如卵巢细胞)。在一种优选的实施方式中,可获得高水平的穿过BBB的穿内皮运输,而不影响BBB完整性。
“片段”是指来源于原始或亲本序列的一部分或来源于所述亲本序列的类似物的多肽。片段包括具有一个或多个氨基酸截断(truncation)的多肽,其中该截断可来源于氨基末端(N-末端)、羧基末端(C-末端)或蛋白质内部。片段可包括与原始序列对应部分相同的序列。本文所述的载体(多肽)的功能片段被包括在本发明中。片段可以是至少5个(例如,至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、28、30、35、40、45、50、60、75、100或150个)氨基酸。本发明的片段可包括,例如,7、8、9或10个氨基酸至18个氨基酸的多肽。片段可具有本文所述的任何修饰(例如,乙酰化、酰胺化、氨基酸置换)。
“非天然存在的氨基酸”是不能天然生的或未在哺乳动物中发现的氨基酸。
“药剂”是指任意化合物,例如抗体、或治疗剂、标记物、示踪物或成像化合物。
“治疗剂”是指具有生物活性的药剂。在某些情况下,治疗剂被用于治疗疾病症状、生理或心理状况、损伤或感染,并且包括抗癌剂、抗生素、抗血管生成剂、和具有中枢神经系统活性水平的分子。
“小分子药物”是指分子量为1000g/mol或更小(例如,小于800、600、500、400或200g/mol)的药物。
“受治疗者”表示人或非人动物(例如,哺乳动物)。
“治疗”受治疗者的疾病、紊乱或病症是指通过向受治疗者给予治疗剂来减少疾病、紊乱或病症的中至少一种症状。
“预防性治疗”受治疗者的疾病、紊乱或病症是指通过向受治疗者给予治疗剂来减少疾病、紊乱或病症的发生频率(例如,预防)。
“癌症”是指其独特特征是可导致不受控制的生长、缺乏分化或能够侵入组织或转移的丧失正常控制的任意细胞增殖。癌症能够在任何组织中或在任何器官中发生。癌症应包括,但不限于,脑、卵巢、肝、肺、肾脏或脾脏的癌症。本文中也描述了其他的癌症。
在本发明的载体或结合物的背景下,“提供”是指使载体或结合物体内或体外与目标细胞或组织接触。可通过将载体或结合物给药于受治疗者来提供载体或结合物。
“给药”或“给予”是指递送模式,包括但不限于,动脉内、鼻内、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、经皮或口服。每日剂量可被分为一、二或多剂量以合适的形式在一段时间内一次、两次或多次给予。
“治疗有效的”或“有效量”是指足以改善、降低、预防、延迟、抑制或阻止所治疗的疾病或病症的症状的治疗剂的量。药剂的治疗有效量不需要治愈疾病或病症,但会提供对疾病或病症的治疗从而使疾病或病症的发作被延迟、阻碍或预防,或疾病或病症的症状得到改善,或改变了疾病或病症的期限,或例如个体中的严重程度减小或恢复加快。“亚治疗剂量”是小于已批准用于患者临床使用的治疗剂的最低有效量的剂量。“超治疗剂量”是超过已批准用于患者临床使用的治疗剂的最高有效量的剂量。亚治疗剂量或超治疗计量的量可根据患者的人口统计(例如,成人、儿科或老年科)或当与另外的治疗剂联合给药使用时(例如,在例如癌症化疗中与其他的治疗剂或治疗方案同时给药时)进行变化。
“病症”是指造成个体的疼痛、不适、患病、疾病或残疾(精神或生理)的任意情况,包括神经疾病、损伤、感染、或慢性或急性疼痛。神经疾病包括脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森氏症、亨廷顿病、和中风。
“药物组合物”是指具有(例如,如本文所述的任意的)药物可接受的稀释液、防腐剂、增溶剂、乳化剂、或佐剂以及治疗有效量的药剂。
通过“治疗剂量”表示根据其毒性或有效性能够用于临床的如药物(不包括载体)的药剂的剂量。通过将药剂与本发明的载体结合,药剂的给药剂量可以低于或高于治疗剂量。
当对于特定特征(例如,温度、浓度、时间等)提到“范围”或“物质的组”时,本发明涉及并且明确地将其中的各个和每一个具体成员和亚范围或亚组合并于本文中。因此,例如,当提到具有9至18个氨基酸的长度时,应理解为各个和每一个单独的长度都具体地包括在本文中,例如,18、17、15、10、9个和其间的任意数目的长度。因此,除非有具体说明,否则本文提到的每一个范围应被理解为是包括端点值。例如,在5至19个氨基酸长度的表示中包括5和19个氨基酸。这同样适用于提到其他参数时,如序列、长度、浓度、元素等。
本文所定义的序列、区域、部分分别包括各个和每一个由此所述的单独的序列、区域和部分以及各个和每一个可能的亚序列、亚区域和亚部分,无论这样的亚序列、亚区域和亚部分是否被定义为肯定性地包括特定的可能性,正如排除特定的可能性或其组合。例如,区域的排除式定义可以这样表述:“如果所述的多肽不短于4、5、6、7、8或9个氨基酸”。否定性限制的其他实例为:包括SEQ ID NO:X的序列,排除了SEQ ID NO:Y的多肽;等。否定性限制的其他实例为:如果所述的多肽不是(不包括或不由其构成)SEQ ID NO:Z。
通过以下的详细描述、附图和权利要求,本发明的其他特征和优点会变得显而易见。
附图说明
图1示出了使用多柔比星-An2(3∶l)(“多柔比星-An2(3∶l)”)结合物对皮下U87(s.c U87)异种移植肿瘤生长的抑制。
图2A示出了通过原位脑灌注测量的3∶1依托泊苷:Angiopep-2结合物(“Etop-An2(3∶1)”)的脑吸收。
图2B示出了通过原位脑灌注测量的3∶1依托泊苷4’-二甲基甘氨酸:Angiopep-2结合物(“EtopDMG-An2(3∶1)”)的脑吸收。
图2C示出通过原位脑灌注测量的多柔比星-An(3∶1)的脑吸收。
图3示出了Etop-An2(3∶l)的原位灌注。
图4A示出了与Etop-An2(3∶1)相比,未结合的依托泊苷的主质吸收。
图4B示出了脑毛细血管去除之后Etop-An2(3∶l)的脑再分配。
图5示出了与未结合的依托泊苷相比,CD-I vs P-gp敲除小鼠中Etop-An2(3∶l)的原位脑灌注。
图6示出了通过Angiopep-2对Etop-An2(3∶l)脑吸收的抑制。
图7示出了与未结合的EtopDMG相比,CD-I vs P-gp敲除小鼠中EtopDMG-An2的原位脑灌注。
图8示出了Etop-An2(3∶1)的等离子体动力学的数据。
图9示出了在小鼠IV推注注射之后EtopDMG-An2的脑分布。
图10示出了Etop-An2(3∶1)的脑分布。
图11示出了在IV推注注射30分钟后,与未结合的依托泊苷相比的Etop-An2(3∶l)的脑分布。
图12示出了在IV推注注射30分钟后,与相未结合的依托泊苷相比的Etop-An2(3∶l)的组织分布。
图13A和图13B分别示出了(DoxSu)3-An2在颅内注射U87胶质母细胞瘤细胞的小鼠中的体内效果。图13A示出了第一次试验(试验1)得到的结果。图13B示出了第二次试验(试验2)得到的结果,其示出了给予化合物(2)导致了平均存活时间统计学显著延长。
具体实施方式
本发明特征在于包括与选自本文所述的氨基酸序列(例如,SEQ IDNO:1-105和SEQ ID NO:107-116)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列或其功能性衍生物的化合物,或其药学可接受的盐,其中所述氨基酸序列包括该氨基酸序列的氨基酸与抗癌剂(例如,鬼臼毒素衍生物、多柔比星、或多柔比星衍生物)的共价键。示例性鬼臼毒素衍生物包括,例如具有式(I)的结构的化合物:
R1、R2和R3各自独立地选自H,可选的取代的C1-6烷基、C(O)R8(例如,C(O)CH2N(CH3)2)、P(O)(OR9)(OR10)、S(O)2(OR9),或包括与多肽的氨基酸的共价键的可水解连接子Y;
X是O或NR7;
R4、R5和R7各自独立地选自H,可选地取代的C1-6烷基、C(O)R8、或包括与多肽的氨基酸的共价键的可水解连接子Y;
R6是H,可选取代的C1-6烷基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基,
R8选自可选取代的C1-6烷基(例如,CH2N(CH3)2)、或可选取代的芳基;
R9和R10各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、或可选取代的芳基;以及
n是2、3或4;和
其中R1、R2、R3、R4、R5和R7之一是Y。在一些实施方式中,R1、R2、R3、R4、R5和R7中的不超过一个是Y。在一些实施方式中,Y是-C(O)(CH2)nC(O)-。在一些实施方式中,每一个R2是H或C(O)CH2N(CH3)2。在某些实施方式中,多肽可与本文所述的多肽具有至少35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或甚至100%的同一性。相对于本文所述的序列之一,多肽可具有一个或多个(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)取代基。在某些实施方式中,氨基酸序列通过所述氨基酸序列的第二、第三、第四、第五或甚至第六个氨基酸以及在氨基酸序列的任意位置处共价结合于另外的鬼臼毒素衍生物(例如,式(I)的化合物)。
本发明的示例性化合物包括,但不限于,那些具有根据(SEQ IDNO:97)的多肽序列的化合物。在一些实施方式中,该化合物具有以下结构:
其中每一个(-式(I))代表所示氨基酸和式(I)的化合物之间的共价键。在某些实施方式中,式(I)的化合物具有以下结构:
其中n是1、2或3,R6是CH3或2-噻吩,且R2是H、-OP(O)(OH)2或-C(O)CH2N(CH3)2,或其任何药学可接受的盐。在一些实施方式中,n是3,R6是CH3且R2是H。在其他的实施方式中,n是3,R6是CH3,且R2是-C(O)CH2N(CH3)2。
下文中更详细地描述了其他的实施方式。
鬼臼毒素衍生物
鬼臼毒素衍生物包括如式(I)描述的那些化合物,例如,依托泊苷、替尼泊苷和它们的衍生物,或其药学可接受的盐。鬼臼毒素衍生物是示例性治疗剂,并且可共价结合于本文所述的任意多肽(例如Angiopep-2)的氨基酸。这些化合物可具有,例如,抗肿瘤活性、抑制拓扑异构酶II的活性或具有抗病毒活性。
依托泊苷和依托泊苷衍生物
依托泊苷(也被称为拓扑杀、足叶乙苷或VP16)是一种具有以下结构的鬼臼毒素衍生物:
依托泊苷的化学结构可进行变化从而产生依托泊苷衍生物。示例性的依托泊苷衍生物是磷酸依托泊苷其中酚-OH被-OP(O)(OH)2所取代,或其任何药学可接受的盐(例如,-OP(O)(ONa)2)。与依托泊苷相比,磷酸依托泊苷水溶解性提高。
其他的依托泊苷衍生物包括其中酚-OH被酰氧基(例如,如本文所述的-OC(O)R8)取代的的衍生物,如以下的化合物:
当共价结合于本文所述的任何多肽时,这些酰化的依托泊苷衍生物相对于依托泊苷也显示出水溶解性提高。
依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG或它们的衍生物可通过将可水解共价连接子Y连接于,例如分子的2”羟基或3”羟基而共价连接于多肽的氨基酸。示例性的连接子可来自于,例如二羧酸,如丁二酸、戊二酸和丁酸,或其任意酸酐。此外,可在酚-OH基团处将共价连接子连接于依托泊苷或其衍生物。
可通过下式来一般性地描述依托泊苷衍生物:
X是O或NR7;
R4、R5和R7各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、或C(O)R8;
R6是H、可选取代的C1-6烷基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基,
R8选自可选取代的C1-6烷基或可选取代的芳基;以及
R9和R10各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、或可选取代的芳基。
当本发明的化合物包括式(I)的依托泊苷衍生物时,R1-R6之一包括本文所述的可水解连接子。在一些实施方式中,Y是-C(O)(CH2)nC(O)-,并且n是2、3或4。在其中R2是C(O)R8的示例性、非限制性实施方式中,R8可以是包括氨基取代基和具有可选的另外取代基的C1-6烷基。在一些实施方式中,C(O)R8是C-连接的α-氨基酸。C-连接的α-氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。
可共价连接于本文所述的任意多肽的式(I)的其他示例性鬼臼毒素衍生物包括替尼泊苷和NK611(方案3)。
方案3
其他的鬼臼毒素衍生物
在美国专利第4,567,253号;第4,609,644号;第4,900,814号;第4,958,010号;第5,489,698号;第5,536,847号;第5,571,914号;第6,051,721号;第6,107,284号;第6,475,486号;第6,610,299号;第6,878,746号;第6,894,075号;第7,087,641号;第7,176,236号;第7,241,595号;第7,342,114号和第7,378,419号;以及美国专利公开第20030064482号、第20030162722号、第20040044058号、第20060148728号和第20070249651号中描述了适合用于本发明的其他鬼臼毒素衍生物,其分别以引用方式结合于本文作为参考。
例如,美国专利第7,176,236号中描述的依托泊苷衍生物可共价结合于本文所述的任意多肽的(例如Angiopep-2)的氨基酸。因此,在一种实施方式中,本发明的化合物包括式(I)的结构
其中
R2和Y如式(I)所述;
X2是-O-、-S-、-NH-、-CO-、-CH=N-、或-CH2NH-;
X3是OR2或N(R2)2;
Z1是共价键,-NHCO-、-CONH-、-OCO-、或-COO-;
Z2是共价-(CH2)oR15,或-(CH2)o合并入Z2中作为5-8元环;
R14是共价键或可选取代的烷基、烯基或苯基;以及
R15是取代的烷基、取代的烯基、或取代的芳基,其中取代基包括至少一个氨基。
在一些实施方式中,X3是-OH、-OC(O)CH2NH2、-OC(O)CH2NHCH3、或-OC(O)CH2N(CH3)2。在其他的实施方式中,X是-NH-。在一些实施方式中,-R14-Z1-Z2-是-(p-C6H4-R16)-,其中R16是-NO2、-F、-CONHCH2CH2C6H5、或-CONHCH2CH2(p-C6H4OH)。
在式(I)或式(I-A)的任意化合物中,基团OR2可以是-OC(O)R8。
在一些实施方式中,所使用的式(I)的化合物或其药学可接受的盐能够改善理化特性(例如,可溶性特性)。例如,当需要可溶性提高时,式(I)的化合物优选是依托泊苷DMG。
多柔比星衍生物
在一些实施方式中,抗癌剂是多柔比星(羟基柔红霉素或 )或多柔比星衍生物,如表柔比星(Ellence或 )、或它们的药学可接受的盐。方案4中示出了这些示例性化合物的结构。多柔比星和多柔比星衍生物可通过本文定义的共价结合于例如14-羟基的可水解共价连接子Y而共价结合于本文所述的任意多肽中的氨基酸。
方案4
可通过以下的式(II)一般性地描述多柔比星衍生物:
X1、X2、X3、X4和X5各自独立地选自共价键、O、或NR25;
R17、R18、R19、R20、R20、R21、R22、R23、R24和R25各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、可选取代的C2-6烯基、可选取代的C2-6炔基、可选取代的环烷基、可选取代的杂环基、或者是如本文定义的可水解连接子Y。
当式(II)的化合物连接于本文所述的任意多肽时,R17、R18、R19、R20、R20、R21、R22、R23、R24和R25之一是Y。在某些实施方式中,R21是Y。式(II)的化合物包括具有式(II-A)的结构的化合物:
Y是本文所述的可水解连接子;X2R18是H或NH2;X3R19是H或OH;且X4R20是H或可选取代的C1-3烷基。在一些实施方式中,可水解连接子Y是-C(O)(CH2)nC(O)-,并且n是2、3或4。在某些实施方式中,式(II)的化合物是:
在美国专利第4,098,884号、第4,301,277号、第4,314,054号、第4,464,529号、第4,585,859号、第4,672,057号、第4,684,629号、第4,826,964号、第5,200,513号、第5,304,687号、第5,594,158号、第5,625,043号和第5,874,412号中可以找到其他的多柔比星衍生物,其分别以引用方式结合于本文作为参考。
在一些实施方式中,使用的式(II)的化合物或其药学可接受的盐可改善理化特性(例如,可溶性特性)。例如,当需要提高可溶性时,式(II)的化合物优选是多柔比星的盐酸盐。
除了Angiopep-2,诸如依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG、替尼泊苷、NK611以及式(I)和式(I-A)的其他化合物的鬼臼毒素衍生物,或多柔比星、表柔比星和其他的多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物)也可共价结合于本文所述的任意多肽(例如,Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、或Angiopep-7)。可水解的连接子,例如包括酯基的连接子,可被用于将抗癌剂(例如,鬼臼毒素衍生物或多柔比星衍生物)共价连接于多肽(例如,本文所述的实施例1)。依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG、它们的其他鬼臼毒素衍生物,多柔比星、表柔比星和其他多柔比星衍生物具有多个重要位置(例如,依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG的2”和3”羟基,以及多柔比星和表柔比星的14羟基)。例如,双官能基(例如,来自于丁二酸、戊二酸、戊二酸酐、或丁酸或其任意酸酐的试剂)可在2”羟基处连接于依托泊苷,或在14羟基处连接于多柔比星。然后可以用肽偶合试剂(如BTTU)活化这些示例性中间体,并用多肽进行处理。其他的肽偶合试剂包括碳二亚胺(例如,二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl))、三唑(例如,1-羟基-苯并三唑(HOBt)和1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt))、相关的苯并三唑肽偶合试剂,如O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲胺六氟磷酸酯(HCTU)、2-(1H-9-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲胺六氟磷酸酯(HATU)、苯并三唑-1-基-氧代-三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸酯(BOP试剂)、和苯并三唑-1-基-氧代三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)和3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)。然后可纯化结合物。纯化该合成步骤的每一种中间体或产物并利用不同的方法来进行验证,如HPLC、薄层液相色谱(thin liquidchromatography)、NMR(13C或1H交换)、熔点、质谱。通过质谱和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析最终的结合物。这可以确定结合于每一个载体的分子(例如,依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG、多柔比星或表柔比星)的数目。
可水解连接
当式(I)的化合物通过可水解连接子Y共价连接于多肽的氨基酸时,该连接子可位于R1、R2、R3、R4、R5或R7处。类似地,当式(II)的化合物通过可水解连接子Y共价连接于多肽的氨基酸时,该连接子可位于R17、R18、R19、R20、R20、R21、R22、R23、R24和R25处。可由二羧酸、碳酸氢盐、羧酸酐、二异氰酸酯(盐)或双膦酸来制备示例性、非限制性的可水解连接子。也可通过下式来描述包括共价结合于本文所述的任意氨基酸序列中的氨基酸的式(I)或式(II)的化合物的化合物
D-G-X-G′-A (III),
其中G和G’各自独立地选自-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-S(O)2O-、-OS(O)2-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、和-OP(O)(OR11)O-;
G共价结合于D,其中D是鬼臼毒素衍生物(例如,式(I)的化合物)或多柔比星或多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物);
G’共价结合于A,其中A是本文所述的氨基酸序列中的氨基酸(例如,表1所述的氨基酸序列,或其功能性衍生物);以及
X是-(可选取代的芳基)-、-(CR12Rn)n-、-O{(CR12Ro)2O}n-、-{(CR12R13)2O(CR12R13)2}n-、或-(CR12R13)oY(CR12R13)p-,其中每一个n、o、p独立地是1-10的整数;
R11是H或低级C1-6烷基;
R12和R13各自独立地选自H、OH或低级C1-6烷基;以及
Y是O、NH、N(低级C1-6烷基)、或-可选取代的芳基。
n、o、p可各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方式中,式(III)中的G-X-G′部分选自-C(O)CH2C(O)-、-C(O)(CH2)2C(O)-、-C(O)(CH2)3C(O)-、-C(O)(CH2)4C(O)-、-C(O)(CH2)5C(O)-、-C(O)(CH2)6C(O)-、-C(O)(OCH2CH2)OC(O)-、-C(O)(OCH2CH2)2OC(O)-、-C(O)(OCH2CH2)3OC(O)-、和-C(O)(OCH2CH2)4OC(O)-。
多肽
本发明的化合物中使用的示例性氨基酸序列包括,但不限于,表1所描述的氨基酸序列。
除了表1所述的氨基酸序列,本发明的特征还在于这些氨基酸序列的片段(例如,功能性片段)。在某些实施方式中,该片段能够进入特定的细胞类型(例如,卵巢、肝脏、肺、肾脏、脾脏或肌肉细胞)或在特定的细胞类型中累积或者能够穿过BBB。多肽的截断可以是从多肽的N末端、多肽的C末端或两者的组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸。其他的片段包括其中多肽的内部部分被删除的序列。
可使用美国申请专利公开第2006/0189515号描述的检测或方法之一,其以引用方式结合于本文作为参考,或通过本领域已知的任意方法来鉴别本发明的其他多肽。例如,可通过常规的多肽合成产生候选载体,并且该候选载体可结合于,例如式(I)或式(II)的化合物,并且给予实验动物。例如,可相对于未经结合物处理的对照(例如,用未结合的药剂处理的),根据注射了肿瘤细胞并且用结合物进行处理的动物的存活率提高的效力来鉴别生物活性载体。
在另一实施例中,可基于原位脑灌注检测中其在主质中的位置来鉴别本发明的生物活性多肽。体外BBB检测,如CELLIALTM Technologies开发的模型,可用于鉴别这样的载体。
还可进行确定在其他组织中的累积的检测,本文描述了示例性检测。可将被标记的本发明的多肽可给予动物,并测量在不同器官中的累积。例如,结合于可检测标记(例如,近红外荧光光谱标记,如Cy5.5)的多肽可以进行活体体内可视化。可将这样的多肽给予动物,并可检测器官中是否存在多肽,从而能够确定多肽在理想器官中的积累速率和积累量。在其他的实施方式中,可用放射性同位素(例如,125I)标记本发明的多肽。然后,将该多肽给予动物。一段时间之后,处死动物并提取动物的器官。使用本领域已知的任意方法测量每一器官中的放射性同位素的量。通过比较特定器官中的标记的候选多肽的量与标记的对照的量,可确定候选多肽的能力,即候选多肽在特定组织中的积累速率和积累量。适合的阴性对照包括已知不能被运输进特定细胞类型中的任意多肽。
例如,Angiopep-1(SEQ ID NO:67)和Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的胺基可被用作药剂的结合位点。为了研究结合中的胺基的作用和其对所有载体的整体运输能力的影响,已基于Angiopep-1和Angiopep-2序列开发了其他载体。这些载体具有可变的反应性胺基和可变的总电荷。这些多肽示于表2。
表2:具有可变的胺基靶标的载体
*Angiopep-3是Angiopep-2的乙酰化的形式。
1Ac代表乙酰化。
修饰的多肽
本发明还可包括具有本文所述的氨基酸序列的修饰的多肽(例如,具有SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116中的任意一个的序列的多肽,如AngioPep-3、AngioPep-4a、AngioPep-4b、AngioPep-5、AngioPep-6或AngioPep-7)并且其中多肽包括共价结合于式(I)或式(II)的化合物的氨基酸。在某些实施方式中,修饰并不会显著破坏所需的生物活性。在一些实施方式中,修饰会造成生物活性的降低(例如,至少5%、10%、20%、25%、35%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、或95%)。在其他的实施方式中,修饰对生物活性没有影响或者会使原始多肽的生物活性增加(例如,至少5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%或1000%)。修饰的多肽可具有或可优化本发明多肽的一种或多种性质,这些性质在某些情况下是需要或理想的。这样的性质包括体内稳定性、生物利用度、毒性、免疫活性、或免疫学特性(immunological identity)。
本发明的多肽可包括通过天然方法(如翻译后加工)或通过本领域已知的化学修饰技术被修饰的氨基酸或序列。修饰可以发生在多肽的任意位置,包括多肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。在给定的多肽的几个位点处可相同或不同程度地存在相同类型的修饰,多肽可包含超过一种类型的修饰。可通过遍在蛋白化(ubiquitination)使多肽分支,其可以是具有或不具有分支的环形。环形、分支或分支环形多肽可通过翻译后天然方法产生或者可以合成产生。其他的修饰包括聚乙二醇化、乙酰化、酰化、加入乙酰氨基甲基(Acm)、ADP-核糖基化、烷基化、酰胺化、生物素化、甲氨酰化、羧乙基化、酯化、共价连接于黄素、共价连接于亚铁血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接药物、共价连接标记(例如,荧光标记或放射性标记)、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白质水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋作用、硒化(selenoylation)、硫酸盐化、转移RNA介导的将氨基酸加入蛋白质,如精氨酰化和遍在蛋白化。
本发明的经修饰的多肽还可包括多肽序列中的氨基酸插入、确实或置换(例如,其中这样的变化基本不改变多肽的生物活性),保守或非保守的置换(例如,D-氨基酸、脱氨基酸)。
例如,在一些实施方式中,通过在肽的N-末端、肽的C-末端或N-末端和C-末端插入一个或多个另外的半胱氨酸残基来修饰氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1-105或SEQ ID NO:107-116)。在本文所述的任意氨基酸序列的氨基或羧基末端加入一个或多个半胱氨酸残基能够有助于这些多肽通过例如,二硫键,与核酸(例如,siRNA分子)或脂质载体结合。例如,可修饰Angiopep-1(SEQ ID NO.67)、Angiopep-2(SEQ ID NO:97)或Angiopep-7(SEQ ID NO:112)从而在氨基末端包括单个半胱氨酸残基(分别为SEQ ID NOS:71、113和115)或在羧基末端包括单个半胱氨酸残基(分别为SEQ ID NOS:72、114和116)。
置换可以是保守的(即,其中的残基被另一个相同的基本类型或类组的残基取代)或非保守的(即,其中的残基被另一种类型的氨基酸取代)。此外,非天然存在的氨基酸可以被天然存在的氨基酸置换(即,非天然存在的保守氨基酸置换或非天然存在的非保守氨基酸置换)。
合成产生的多肽可可包括不是由DNA天然编码的氨基酸(例如,非天然存在的非天然氨基酸)的置换。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有连接于半胱氨酸的硫原子的乙酰氨甲基的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、式NH2(CH2)nCOOH的ω氨基酸(其中n是2-6)、中性的非极性氨基酸,如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、和正亮氨酸。苯基甘氨酸可置换Trp、Tyr或Phe;瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜是中性非极性的,磺基丙氨酸是酸性的,鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可被羟基脯氨酸置换,并且保持构象赋予特性。
可通过置换的诱变来产生类似物,并且其保持原始多肽的生物活性。表3中示出了被确认为是“保守置换”的置换的实例。如果这样的置换产生的是不需要的变化,则可引入其他类型的置换,表3中命名的“示例性置换”或本文中参照氨基酸的分类进一步描述的,并且筛选产物。
通过选择其对于保持(a)置换区域中的多肽骨架的结构,例如平面或螺旋构象,(b)目标位点处的分子的电荷或疏水性,或(c)大多数侧链的效果上有显著差异的置换实现对功能或免疫特性的实质性修饰。一般基于侧链特性将天然存在的残基分为以下几组:
(1)疏水的:正亮氨酸、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe),
(2)中性疏水的:半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)
(3)酸性/带负电荷:天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
(4)碱性:天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
(5)影响链取向的残基:甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro);
(6)芳香族的:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His),
(7)极性的:Ser、Thr、Asn、Gln
(8)碱性带正电荷的:Arg、Lys、His,以及;
(9)带电荷的:Asp、Glu、Arg、Lys、His
表3中列出了其他的保守氨基酸置换。
表3
其他的多肽类似物
本发明的化合物可包括本领域已知的抑肽酶的多肽类似物,其中该类似物包括共价结合于鬼臼毒素衍生物(例如,式(I)的化合物)或多柔比星或多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物)的氨基酸。例如,美国专利第5,807,980号描述了牛胰胰蛋白酶抑制剂(来源于抑肽酶的抑制剂)及其制备方法和治疗应用,其包括SEQ ID NO:102的多肽。这些多肽已经用于治疗特征为组织因子或VIIIa因子的异常出现或异常的量,如异常的血栓形成的病症。美国专利第5,780,265号描述了能够抑制血浆激肽释放酶(plasma kallikrein)的丝氨酸蛋白酶抑制剂,包括SEQ ID NO:103。美国专利第5,118,668号描述了牛胰胰蛋白酶抑制剂变体,包括SEQID NO:105。在国际专利申请公开第WO 2004/060403号中可找到抑肽酶氨基酸序列(SEQ ID NO:98)、Angiopep-1氨基酸序列(SEQ ID NO:67)和SEQ ID NO:104,以及一些生物活性类似物的序列。
在SEQ ID NO:106中示出了编码抑肽酶类似物的示例性核苷酸序列(atgagaccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttctacaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaaatccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag;Genbank登录号:X04666)。该序列在位置16处编码赖氨酸而不是如SEQ ID NO:98中发现的缬氨酸。可通过本领域已知的方法在SEQ ID NO:106的核苷酸序列中引入突变,从而改变在位置16具有缬氨酸的SEQ ID NO:98的多肽产物。使用本领域已知的任意技术可获得其他的突变或片段。
通过进行使用国际申请第PCT/CA2004/000011号公开的合成抑肽酶序列(或其部分)的蛋白质BLAST(Genebank:www.ncbi.nhn.nih.gov/BLAST/)可找到抑肽酶类似物的其他实例。以登录号CAA37967(GI:58005)和1405218C(GI:3604747)可找到示例性的抑肽酶类似物。
多肽衍生物和模拟肽的制备
除了仅由天然存在的氨基酸构成的多肽,模拟肽或多肽类似物也被包括在本发明中。多肽类似物通常作为与模板多肽具有类似特性的非多肽药物用于制药工业。非多肽化合物被命名为“多肽模拟物”或“模拟肽”(Fauchere et al.,Infect.Immun.54:283-287,1986;Evans et al.,J.Med.Chem.30:1229-1239,1987)。结构上与制药用多肽相关的多肽模拟物可被用于产生等同或增强的治疗或预防效果。一般而言,模拟肽的结构类似于范例多肽(paradigm polypeptide)(即,具有生物活性或药用活性的多肽),如天然存在的受体结合多肽,且具有一个或多个通过本领域已知的方法被如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式或反式)、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-等的键可选替代的肽键(Spatola,Peptide BackboneModifications,Vega Data,1(3):267,1983);Spatola et al.(Life Sci.38:1243-1249,1986);Hudson et al.(Int.J.Pept.Res.14:177-185,1979);和Weinstein.B.,1983,Chemistry and Biochemistry,of Amino Acids,Peptides and Proteins,Weinstein eds,Marcel Dekker,New York)。这样的多肽模拟物可具有超过天然存在的多肽的明显优势,包括生产更经济、化学稳定性更好、药用性能提高(例如,半衰期、吸收、效力、效率)、抗原性降低等。
虽然本发明的多肽可有效进入特定的细胞类型(例如,本文所述的那些细胞)中,但由于蛋白酶的存在会使其有效性降低。血清蛋白酶具有特定的底物要求。该底物必须同时具有L-氨基酸和用于切割的肽键。此外,代表血清中蛋白酶活性的最主要成分的肽链外切酶通常作用于多肽的第一个肽键并且需要游离的N末端(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。因此,使用多肽的修饰形式通常是有利的。经修饰的多肽保留了原始L-氨基酸多肽的结构特征,该结构特征赋予了相对于IGF-1的生物活性,而优势是不易受到蛋白酶和/或肽链外切酶切割的影响。
以相同类型的D-氨基酸对共有序列的一个或多个氨基酸的系统置换(例如,D-赖氨酸取代L-赖氨酸)可被用于产生更稳定的多肽。因此,本发明的多肽衍生物或模拟肽可以完全是L,完全是D,或D、L混合的多肽。N末端或C末端存在D-氨基酸使多肽的体内稳定性增加,这是因为肽酶不能利用D-氨基酸作为底物(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。反向D多肽是具有相对于含有L-氨基酸的多肽反向安排的含有D-氨基酸的多肽。因此,L-氨基酸多肽的C末端残基变成了D-氨基酸多肽的N末端,等等。反向D-多肽保持与L-氨基酸多肽相同的三级构象并且从而具有相同的活性,且在体外或体内对于酶降解更稳定,因此比原始多肽具有更高的治疗效力(Brady和Dodson,Nature 368:692-693,1994;Jameson et al.,Nature 368:744-746,1994)。除了反向D-多肽,可通过本领域熟知的方法产生包括共有序列或基本一致的共有序列变异的限制性多肽(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387-418,1992)。例如,可通过加入能够形成二硫桥的半胱氨酸产生约束的多肽(constrainedpolyoeotide),从而产生环状多肽。环状多肽不具有游离的N末端或C末端。因此,它们不受肽链外切酶的蛋白质水解作用的影响,尽管它们也会受到肽链内切酶作用的影响但这不会在肽末端进行切割。除了分别具有N末端或C末端D-氨基酸或其环状结构以外,具有N末端或C末端D-氨基酸的多肽和环状多肽的氨基酸序列通常与其所对应的多肽的序列一致。
可通过常规的固相合成,同时在所选择的环化位置(如氨基和羧基末端)处结合适合的S-保护的半胱氨酸或同型半胱氨酸来制备含有分子内二硫键的环状衍生物(Sah et al.,J.Pharm.Pharmacol.48:197,1996)。在完成链组装之后,可通过(1)通过随后的支持物上的对应的两个游离SH-官能团的氧化选择性去除S-保护基,从而形成S-S键,随后为常规地从支持物去除产物以及合适的纯化程序,或(2)通过从支持物去除多肽同时完成侧链去保护,随后在高度稀释的水溶液中氧化游离SH-官能团来进行环化。
可通过常规的固相合成,同时将合适的氨基和羧基侧链保护的氨基酸衍生物结合到所选择的环化位置处来制备含有分子内酰胺键的环状衍生物。可通过常规的固相化学,同时将具有合适的氨基保护侧链的氨基酸残基和合适的S-保护的半胱氨酸或同型半胱氨酸残基结合到所选择的环化位置处来制备含有分子内-S-烷基键的环状衍生物。
赋予对作用于多肽的N末端或C末端残基的肽酶的抗性的另一种有效方法是在多肽的末端加入化学基团,从而经修饰的多肽不再是肽酶的底物。一种这样的化学修饰是在多肽的任一末端或两个末端进行糖基化。某些化学修饰,尤其是N末端糖基化,已显示在人血清中多肽的稳定性增加(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。提高血清稳定性的其他化学修饰包括,但不限于,加入由1至20个碳原子的低级烷基(如乙酰基)构成的N末端烷基,和/或加入C末端酰胺或取代的酰胺基。尤其是,本发明包括由具有N末端乙酰基和/或C末端酰胺基的多肽构成的修饰的多肽。
本发明还包括含有非多肽的常规部分的其他化学部分的其他类型的多肽衍生物,该衍生物保持了多肽的理想的功能活性。这样的衍生物的实施例包括(1)氨基末端或另一游离氨基的N-酰基衍生物,其中酰基可以是烷酰基(例如,乙酰基、己酰基、辛酰基)、芳酰基(例如,苯甲酰基)或保护基如F-moc(芴基甲基-O-CO);(2)羧基末端或另一游离羧基或羟基的酯;(3)通过与氨或合适的胺反应产生的羧基末端或另一游离羧基的酰胺;(4)磷酸化的衍生物;(5)结合于抗体或其他生物配体的衍生物或其他类型的衍生物。
通过在本发明的多肽中加入氨基酸残基产生的较长多肽序列也包括在本发明中。这样的较长多肽序列被认为与上文描述的多肽具有相同的生物活性(例如,进入特定的细胞类型)。虽然不排除具有大量额外的氨基酸的多肽,但人们已认识到某些大的多肽可能会具有掩盖有效序列的构造从而阻止与靶标(例如,LRP受体家族的成员,如LRP或LRP2)结合。这些衍生物能够起到竞争性拮抗剂的作用。因此,虽然本发明包括具有延伸的本文所述的多肽或多肽衍生物,但理想的是,该延伸不破坏该多肽或衍生物的细胞靶向活性。
包括在本发明中的其他衍生物是由本发明的两种相同的或两种不同的多肽直接彼此共价连接或通过间隔区(spacer),如通过短延伸的丙氨酸残基或蛋白质水解的假定位点(例如,通过组织蛋白酶,见例如美国专利第5,126,249号和欧洲专利第495049号)共价连接而构成的双多肽。本发明多肽的多聚体由相同或不同的多肽或其衍生物形成的分子的聚合物构成。
本发明的特征还在于含有本文所述的多肽或其片段嵌合或融合蛋白质的多肽衍生物,其通过其氨基或羧基末端或同时连接于不同的蛋白质的氨基酸序列。可通过编码该蛋白的核酸的重组表达产生这样的嵌合或融合蛋白质。例如,嵌合或融合蛋白质可含有至少6个本发明的多肽的氨基酸,理想的是其与本发明的多肽具有等同或更大的功能活性。
可通过置换、加入或缺失氨基酸残基改变氨基酸序列从而产生本发明的多肽衍生物,从而根据需要提供功能等效、分子或功能提高或降低的分子。本发明的衍生物包括,但不限于,那些包含其中包括含有功能等效的氨基酸残基的置换的改变了的序列的全部或部分本文所述的多肽的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-112中的任意一个)作为一级氨基酸序列的衍生物。例如,该序列中的一个或多个氨基酸残基可被起功能等效物作用的相似极性的另一个氨基酸残基置换,产生了沉默变化。可从氨基酸所属类别的其他成员中选择该序列中氨基酸的置换。例如,带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非极性(疏水性)氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。不带电的极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带负电的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天门冬氨酸。氨基酸甘氨酸可以包括在非极性氨基酸家族或不带电荷(中性)极性氨基酸家族中。氨基酸家族内产生的置换通常被理解为保守置换。
鉴别模拟肽的试验
如上所述,通过本发明的方法识别的产生的复制多肽的骨架几何结构和药效显示的非肽类化合物(模拟肽)通常具有更高的代谢稳定性、更高的效力、作用时间更长和生物利用率更好的特性。
可利用本领域已知的组合库方法中多种方法中的任一种得到本发明的模拟肽化合物,包括:生物库;可固定空间的平行固相或液相库;需要去卷积(或重叠合法,deconvolution)的合成库方法;“一珠一化合物”库方法;以及使用亲和层析选择的合成库方法。生物库方法限于多肽库,而其他四种方法可应用于多肽、非肽低聚物或化合物的小分子库(Lam,Anticancer Drug Des.12:145,1997)。在本领域中能够找到分子库的合成方法的实例,例如DeWitt et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909,1993);Erb et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422,1994);Zuckermann et al.,J.Med.Chem.37:2678,1994);Cho et al.(Science 261:1303,1993);Carellet al.(Angew.Chem,Int.Ed.Engl.33:2059,1994和出处同上的2061),以及Gallop et al.(Med.Chem.37:1233,1994)。化合物的库可存在于溶液中(例如,Houghten,Biotechniques 13:412-421,1992)或珠子上(Lam,Nature354:82-84,1991)、芯片上(Fodor,Nature 364:555-556,1993)、细菌或孢子(美国专利第5,223,409号)、质粒(Cull et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA89:1865-1869,1992)或噬菌体上(Scott和Smith,Science 249:386-390,1990)或荧光素酶,并且可通过确定合适的底物至产物的变化来检测的酶标记。
一旦鉴别出本发明的多肽,可通过多种标准方法分离和纯化,包括但不限于,不同的溶解性(例如,沉淀)、离心、色谱法(例如,亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱等)或通过用于纯化多肽、模拟肽或蛋白质的任何其他标准技术。可使用本领域已知的任何功能性试验来评价鉴别出的感兴趣的多肽的功能特性。理想的是,使用评价胞内信号传导中的下游受体功能的检测(例如,细胞增殖)。
例如,可使用以下的三阶段方法获得本发明的模拟肽化合物:(1)扫描本发明的多肽来识别靶向于本文所述的特定细胞类型所必需的二级结构;(2)使用构象限制的二肽代替物来精细化(refine)骨架几何结构并提供对应于这些代替物的有机平台;和(3)使用最佳的有机平台显示被设计用于模拟原始多肽的理想活性的候选物库中的有机药效团。更详细地讲,三个阶段如下。在阶段1,扫描主要候选物多肽,缩略其结构以鉴别其活性必需的结构。合成原始多肽的一系列多肽衍生物。在阶段2,使用构象限制的二肽代替物来研究最佳的多肽类似物。吲哚里西啶-2-酮(indolizdin-2-one)、吲哚里西啶-9-酮和喹嗪酮(quinolizidinone)氨基酸(分别为I2aa、I9aa和Qaa)被用作研究最佳多肽候选物的骨架几何结构的平台。这些和相关的平台(综述参见Halab et al.,Biopolymers 55:101-122,2000;和Hanessian et al.Tetrahedron 53:12789-12854,1997)可在多肽的特定区域被引入从而将药效团定位于不同的方向。这些类似物的生物评价鉴别出模拟活性必需的几何结构的改进主要多肽。在阶段3,活性最高的主要多肽的平台被用于显示负责原始多肽的活性的药效团的有机代替物。药效团和支架(scaffold)被组合在平行合成形式中。通过使用本领域中已知方法的其他手段可完成多肽的衍生和上述阶段。
通过本发明的多肽、多肽衍生物、模拟肽或其他小分子确定的结构功能相关性可被用于精细化和制备具有相似或更好的特性的类似分子结构。因此,本发明的化合物还包括与本文所述的多肽具有相同的结构、极性、电荷特性和侧链特性的分子。
总之,根据本文公开内容,本领域普通技术人员能够进行多肽和模拟肽筛选试验,其可用于鉴别将药剂靶向于细胞类型(例如,本文所述的细胞类型)的化合物。本发明的试验可以低通量、高通量或超高通量筛选形式进行。本发明的试验包括适合于自动化进行的试验。
共价结合于另外的药剂的多肽结合物
本文所述的化合物或其功能性衍生物除了包括通过氨基酸共价结合于鬼臼毒素衍生物(例如,具有式(I)的结构的化合物)或多柔比星或多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物)的氨基酸序列,还可包括与另外一种药剂(例如,另一种治疗剂、诊断剂或标记)的共价结合。在某些实施方式中,氨基酸序列还连接于可检测标记物(如放射成像剂)或由可检测标记物标记以用于诊断疾病或病症。这些药剂的实例包括放射成像剂-抗体-载体结合物,其中抗体结合于疾病或病症特异性抗原(例如,用于诊断或治疗)。本发明也考虑到了其他的结合分子。在其他情况下,本发明的化合物或其功能性衍生物连接于另一种治疗剂从而治疗疾病或病症,或可连接于其化合物或由其混合物标记。可通过将载体-药剂结合物给药于患病的个体来治疗疾病或病症,其可以将药剂运输穿过BBB或进入特定的细胞类型。每一种多肽包括至少1、2、3、4、5、6或7种另外的药剂。在其他实施方式中,每一种药剂具有至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20个或更多个多肽与其连接。本发明的结合物能够促进药剂在特定的细胞类型或组织,如受治疗者的脑、卵巢、肝脏、肺、肾脏、脾脏或肌肉中的累积(例如,由于增加摄取或减少排出)。
共价结合于本文所述的任意氨基酸序列(例如,表1列出的或其功能性衍生物)的氨基酸的药剂(例如,鬼臼毒素衍生物,如式(I)的化合物或多柔比星或多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物)、另一种治疗剂、诊断剂或标记物)可在被运输进特定的细胞类型或穿过BBB之后从载体释放。例如,该药剂可通过酶切或载体和药剂之间的化学键的破坏而被释放。然后,被释放的药剂可以在没有载体的存在下以其预定的能力起作用。
其他方法和交联剂可被用于连接本发明的多肽和RNAi试剂。例如,含有5’或3’硫醇的siRNA正义链可通过二硫键被连接于位于多肽的氨基末端或羧基末端的半胱氨酸残基。Muratovska et al(FEBS Letters558:63-68,2004)和Turner et al.(Blood Cells,Molecules,and Diseases 38:1-7,2007)提供了用于将多肽连接于RNA分子的示例性化学键合方法,其通过引用结合到本中作为参考。
治疗剂
治疗剂可以是任意的生物活性剂。例如,治疗剂可以是药品、药物、释放放射性的药剂、细胞毒素(例如,化疗剂),其生物活性片段或它们的混合物以治疗疾病(例如,杀死癌细胞)或其可以是治疗个体中的疾病或病症的药剂。鬼臼毒素衍生物(例如,式(I)的化合物)或多柔比星和多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物)是示例性的有用的治疗剂类别。治疗剂可以是合成产物或真菌、细菌或其他微生物(例如,支原体或病毒)、动物(如爬行动物)或植物来源的产物。治疗剂和/或其生物活性片段可以是酶活化剂和/或其片段,或可通过抑制或阻断重要的和/或必要的细胞途径或通过与重要的和/或必要的天然存在的细胞成分竞争而起作用。其他的治疗剂包括抗体和抗体片段。
本领域已知的任意抗癌剂可以是本发明的结合物的一部分。鬼臼毒素衍生物(例如,式(I)的化合物)或多柔比星和多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物)可以是抗癌剂。其他的抗癌剂也可以结合于本文所述的本发明的化合物。可使用含有有效运输穿过BBB的载体(例如,AngioPep-2、AngioPep-3、AngioPep-4a、AngioPep-4b、AngioPep-5或AngioPep-6)的结合物来治疗脑癌。可通过结合于有效运输进入合适的细胞类型的载体(例如,AngioPep-7)的抗癌剂来治疗卵巢癌、肝癌、肺癌、肾癌或脾脏癌。
结合物活性
包括氨基酸序列的化合物或其药学可接受的盐,其中该氨基酸序列可通过氨基酸共价结合于鬼臼毒素衍生物(例如,具有式(I)的结构的化合物)或多柔比星或多柔比星衍生物(例如,式(II)的化合物))而实现理想的特性,例如相对于未结合的生物活性剂而言,药代动力学改变或组织分布改变(例如,提高向特定组织或细胞类型的递送,如卵巢、肝脏、脑、肺、脾脏或肾脏)。因此,本发明的化合物可被用作载体。诸如AngioPep-2、AngioPep-3、AngioPep-4a、AngioPep-4b、AngioPep-5或AngioPep-6的多肽有效地将药剂运输穿过BBB。像AngioPep-2一样,这些多肽还能够似药剂靶向于其他的细胞类型或组织(例如,卵巢、肝脏、肺、肾脏、脾脏或肌肉)。不能被有效的运输穿过BBB的AngioPep-7多肽被运输至特定的组织(例如,卵巢、肝脏、肺、肾脏、脾脏或肌肉)。当不需要运送穿过BBB时,该活性是有用的。例如,相对于未结合的生物活性剂(例如,依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG、替尼泊苷、多柔比星或表柔比星)观察到的,使用本发明的化合物能够使目标组织中的治疗剂浓度提高10%-20000%之间的任意程度。
因为本发明的化合物能够将药剂运输至特定的组织,因此结合的药剂会产生较低的毒性(例如,较少的副作用),较高的效力(例如,因为药剂由于摄取增加或从组织的排出减少或因为药剂当被结合时具有更高的稳定性,因此药剂在目标组织中浓度提高)或两者的组合。在下文和国际公开第WO 2007/009229号中描述了这样的活性,其以引用方式结合于本中作为参考。
在一些情况下,药剂与载体的结合可以使药剂避免P-糖蛋白(P-gp)的作用,其是一种能够将某些药剂排出细胞的流出泵。通过降低P-pg将药剂排出细胞的能力,可使药剂在细胞中的效力得到提高。因此这些结合物可有效地抑制癌细胞增殖。此外,从体内肿瘤细胞生长获得的结果显示,本发明的载体可靶向于受体LRP。而且,结合可改变未结合的药剂的药代动力学或生物分布。
总结起来,结合物可用于抗原发性肿瘤,包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌和皮肤癌以及产生于原发性肿瘤的转移。
治疗方法
本发明的特征还在于使用本文所述的本发明化合物或其药物组合物的治疗方法。可有效被运送穿过BBB的本发明化合物(例如,该化合物包括通过氨基酸共价结合于鬼臼毒素衍生物(如式(I)的化合物或多柔比星或多柔比星衍生物(例如,式(II))的氨基酸序列)(例如,AngioPep-2、AngioPep-3、AngioPep-4a、AngioPep-4b、AngioPep-5和AngioPep-6)可被用于治疗任何脑或中枢神经系统疾病。示例性的神经疾病包括,但不限于,脑瘤、脊髓瘤(例如,脊索瘤)和脑转移。
脑瘤可以是原发性转移性脑瘤。产生于脑中的脑瘤是原发性脑瘤。由于体内别处的癌症(例如,肺癌、乳腺癌、黑素瘤、结肠癌、肾癌或其他癌症)扩散造成的脑瘤是转移性脑瘤。通过在脑中的位置描述了肿瘤的示例种类,包括脑干肿瘤、小脑桥脑角肿瘤(例如,听神经瘤)、大脑半球肿瘤、额叶肿瘤、顶叶肿瘤、松果体区肿瘤、枕叶肿瘤、颞叶肿瘤、皮层下肿瘤(subcortical tumor)、脑膜脑肿瘤、中线肿瘤(midline tumor)(例如,颅咽管瘤、视神经胶质瘤、以及丘脑和蝶鞍区的肿瘤)、后窝肿瘤(例如,第四脑室肿瘤和小脑肿瘤)。
示例性的脑瘤包括听神经瘤(神经鞘瘤、许旺细胞瘤)、腺瘤、星形细胞瘤(例如,青少年毛细胞星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、肥胖性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、恶性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、和神经胶质肉瘤)、脑干神经胶质瘤,其可以是星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤或混合肿瘤,脉络丛乳头状瘤、中枢神经系统淋巴瘤、室管膜瘤(例如,退行性室管膜瘤)、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤(mdl)、退行性(恶性)脑膜瘤、混合型神经胶质瘤、神经纤维瘤病(多发性神经纤维瘤病(冯·雷克林霍曾氏病,von Recklinghausen’s Disease))、少突神经胶质瘤、和视神经胶质瘤(例如,毛细胞性星形细胞瘤)。
结合物还可被有效运输至肝脏、卵巢、肺、肾脏、脾脏或肌肉,因此还可被用于合适的治疗剂结合从而治疗与这些组织相关的疾病(例如,癌症)。因为AngioPep-7不能被有效地运输至脑,但是能够被有效地运输至如肝脏、肺、肾脏、脾脏或肌肉的组织和细胞,因此当不需要递送至脑的药剂时,包括AngioPep-7的本发明的化合物非常适合作为治疗与这些组织相关的疾病的载体。示例性的肝脏疾病包括肝细胞癌(肝细胞瘤)和肝癌。示例性的肺病包括肺癌,如小细胞癌(例如,燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌、复合性小细胞癌、和转移瘤。转移瘤可以来源于任何组织的癌症,包括乳腺癌(例如,转移性乳腺癌)、结肠癌、前列腺癌(例如,转移性前列腺癌)、肉瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤、和维尔姆斯氏瘤(肾母细胞瘤)。脾脏疾病包括如淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和某些T细胞淋巴瘤的癌症。
可利用本发明的结合物或组合物治疗的其他示例性癌症包括乳腺癌、包括如套细胞淋巴瘤的各种淋巴瘤的头颈癌、腺瘤、鳞状细胞癌、喉癌、视网膜癌、食道癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌(例如,卵巢生殖细胞瘤和卵巢癌)、子宫癌、黑素瘤、结肠直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮瘤、肾细胞癌、胆囊腺癌(gallbladder adenocarcinoma)、腮腺腺癌(parotid adenocarcinoma)、子宫内膜肉瘤、多抗药性癌症;以及增生性疾病和病症,如与肿瘤血管发生相关的新血管形成、黄斑变性(例如,湿型/干型AMD)、角膜新生血管、糖尿病视网膜病、新生血管性青光眼、近视性变性,和其他的增生性疾病和病症,如再狭窄和多囊肾疾病。
如本文所述,可通过经有效运输穿过BBB的本发明化合物或组合物治疗的脑癌包括星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、多形性胶质母细胞瘤、混合性神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、视网膜母细胞瘤、成神经细胞瘤、生殖细胞瘤和畸胎瘤。可通过本发明的化合物或组合物治疗的其他示例性癌症包括蕈样真菌病(也被称为阿-巴二氏综合症(Alibert-Bazinsyndrome)和蕈样肉芽肿)、霍奇金病(霍奇金淋巴瘤)、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、与艾滋病(AIDS)相关的卡波济氏肉瘤、AIDS相关的非霍奇金淋巴瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、难治疗的晚期乳腺癌、睾丸癌(例如,恶性睾丸癌、难治疗的睾丸癌、睾丸生殖细胞瘤)、难治疗的晚期恶性赘生物、弥漫性大B细胞淋巴瘤、骨肉瘤、伯基特淋巴瘤、成人急性淋巴细胞白血病、伯基特白血病、纵膈赘生物、成淋巴细胞性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、浆细胞肿瘤(plasma cell neoplasm)。
本发明的化合物或组合物可通过本领域已知的任何途径给药;例如经口、动脉内、鼻内、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、经皮或口服向受治疗者给药。药剂可以是,例如,抗血管生成化合物。
组合治疗
本发明的化合物可以与其他的治疗剂或其他治疗方案同时给药。在一些实施方式中,其他的治疗剂或药剂也可共价结合于本文所述的多肽或其衍生物(例如,表1的多肽和其衍生物)。在其他的实施方式中,其他的治疗剂或药剂未共价结合于本文所述的多肽。可用于与本发明化合物的组合治疗的示例性治疗方案和治疗剂包括,但不限于:放射治疗、化学治疗、高剂量化学治疗、干细胞移植(例如,自体同源干细胞移植)、骨髓移植、外科手术、切除肿瘤的手术、高温治疗、顺铂、依立替康、盐酸依立替康、卡铂、苯丁酸氮芥托西莫单抗利妥昔单抗(和)、博来霉素、长春新碱、长春碱、环磷酰胺、丙卡巴肼、米托蒽醌、泼尼松、泼尼松龙、吉西他滨紫杉醇异环磷酰胺、甲氨蝶呤、多柔比星地塞米松、环孢素、Rad-001(Certican)、阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素、氟达拉滨、伊达比星、伏立诺他(SAHA)、烟酰胺、AZD2171、米托坦、吉妥珠单抗奥佐米星米托蒽醌、氯法拉滨、天冬酰胺酶、巯嘌呤、粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)、长春地辛、硫鸟嘌呤、VM26、VP16、达卡巴嗪、更生霉素、替莫唑胺、噻替哌、盐酸表柔比星、卡莫司汀、非格司亭、多西他赛、吉非替尼、或它们的药学可接受的盐,或它们的任意组合。
本文所述方法中使用的第二治疗剂还可以是包括Angiopep-2(SEQID NO:97)的序列或由Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的序列构成的多肽,优选其中Angiopep-2结合于抗癌剂(例如,紫杉醇)。可与本文所述任意化合物组合使用的示例性治疗剂是ANG1005,其具有以下结构:
在美国专利第7,557,182号中描述了其他示例性第二治疗剂,其以引用方式结合于本中作为参考。
药物组合物
本发明的药物组合物包括本文所述的本发明化合物,其与药学可接受载体结合。这样的组合物是液体或冻干的或干燥配方,并且包括各种缓冲剂(例如,Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂,诸如白蛋白或明胶的添加剂从而防止表面吸附,洗涤剂(例如,Tween 20、Tween80、Pluronic F68、胆汁酸盐)。增溶剂(例如,甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如,抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如,硫柳汞、苯甲醇、对羟苯甲酸类)、填充物质(bulking substance)或张力改良剂(例如,乳糖、甘露醇)、与蛋白质共价结合的聚合物如聚乙二醇、与金属离子的络合作用,或将材料整合到微粒制备的聚合物化合物中或其上,如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等,或在脂质体、微乳剂、微胶粒(micelles)、单层或多层载体、红细胞影、或原生质球上。这样的组合会影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。控释或缓释组合物包括亲脂性贮存剂(depot)(例如,脂肪酸、蜡、油)中的配方。通过本发明还了解到的是包衣了聚合物(例如,泊洛沙姆或poloxamine)的微粒组合物。本发明组合物的其他实施方式整合了微粒形式的保护包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂以用于各种给药途径,包括肠胃外的、肺部的、经鼻的、口服的、阴道的、直肠途径。在一种实施方式中,药物组合物是肠胃外、癌旁(paracancerally)、经粘膜、经皮、肌肉内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和瘤内给药。
药学可接受载体还包括0.01-0.1M或0.05M磷酸盐缓冲液或0.8%盐溶液。此外,这样的药学可接受载体可以是水溶液或非水溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬混液,包括盐溶液和缓冲介质。肠胃外介质包括氯化钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化Ringer’s或不挥发性油。静脉介质包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如那些基于Ringer’s葡萄糖的电解质补充剂)等。还可具有防腐剂或其他添加剂,例如抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂(collating agent)、惰性气体等。
其他的配方包括脂肪酸(例如,12-羟基硬脂酸)的聚氧化乙烯酯,如HS 15。因此,在一些实施方式中,药物组合物可包括a)本文所述的结合物,b)HS 15和c)水溶液或缓冲剂(例如,pH为5至7的Ringer/Hepes溶液)。配方中的HS 15浓度可以为至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或60%(例如,30%)或这些数字中任意两个之间的任意范围。可根据有效治疗受治疗者所必需的剂量,或所给予的结合物的溶解性必需的酯的量来确定结合物的浓度。例如国际专利公开第WO 2007/009229号中描述了在用于给予紫杉醇结合物的配方中使用Solutol,其以引用方式结合于本作为参考。
肠胃外组合物
可以剂型、配方或通过合适的递送装置或含有常规的、无毒的药学可接受载体或辅剂的植入物通过注射、灌注或植入(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)非肠胃外给药途径来给予药物组合物。这样的组合物的配方和制剂对于药物制剂领域的一般技术人员来说是公知的。
可以以单位剂型(例如,单剂量安瓿)或含有几次剂量并可添加合适的防腐剂的小瓶来提供肠胃外应用的组合物(见下文)。组合物可以是溶液、混悬剂、乳剂、灌注装置或用于植入的递送装置的形式,或其可作为干粉存在,在使用之前用水或另一种合适的介质复原。除了(一种或多种)活性剂,组合物可包括合适的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。可将该(一种或多种)活性剂结合到微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中从而用于控释。此外,该组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂、和/或分散剂。
如上所示,本发明的药物组合物可以是适合于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物,将(一种或多种)合适的活性剂溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体介质中。可使用的可接受的介质和溶剂为水,通过加入适量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲剂将水的pH调节到合适,该缓冲剂为1,3-丁二醇、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液、和等渗氯化钠溶液。含水配方还可含有一种或多种防腐剂(例如,对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙基酯)。在该化合物之一在水中的溶解度不足或仅能微溶解在水中的情况下,可加入溶解增强剂或增溶剂,或者溶剂可包括10%-60%w/w的丙二醇等。
包括本发明化合物的肠胃外组合物或配方的给药可以经在一定的时间周期给予患者,例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、或120分钟,或例如,经0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、或5.0小时。
控释肠胃外组合物
控释肠胃外组合物可以是水混悬液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油混悬液或乳剂的形式。还可将该组合物结合于生物相容性的载体、脂质体、纳米颗粒、植入物或输液装置中。用于制备微球和/或微胶囊的材料是,例如可生物降解/生物蚀解的聚合物,如羟乙酸乳酸聚酯(polygalactin)、聚-(异丁基氰丙烯酸酯)、聚(2-羟基-L-谷氨酰胺)、聚(乳酸)、聚乙醇酸、和它们的混合物。当配制控释肠胃外配方时,可使用的生物相容性载体是碳水化合物(例如,右旋糖苷)、蛋白质(例如,白蛋白)、脂蛋白、或抗体。用于植入物中的材料可以是不可生物降解(例如,聚二甲基硅氧烷)或可生物降解(例如,聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))的材料或它们的组合。
用于口服的固体剂型
用于口服的配方包括含有与无毒的药物可接受赋形剂混合的(一种或多种)活性成分的片剂,这样的配方是本领域的技术人员公知的(例如,美国专利第5,817,307号、第5,824,300号、第5,830,456号、第5,846,526号、第5,882,640号、第5,910,304号、第6,036,949号、第6,036,949号、第6,372,218号,其通过引用结合到本中作为参考)。这些赋形剂可以是,例如,惰性稀释剂或填充剂(例如,蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、包括土豆淀粉的淀粉类、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠);粒化剂和崩解剂(例如,包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括土豆淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐、或褐藻酸);粘结剂(例如,蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯树胶、褐藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化的淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇);和润滑剂、助流剂和防粘剂(例如,硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。其他的药物可接受赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、湿润剂、缓冲剂等。
片剂可以是未包衣的或通过已知技术被包衣,从而可选地延迟在胃肠道中的崩解和吸收,由此提供较长时间的持续作用。包衣可适合于以预定的方式释放药剂(例如,为了实现控释配方)或可适合于直至经过胃部以后才释放药剂(肠溶衣)。包衣可以是糖衣、薄膜包衣(例如,基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸共聚物、聚乙二醇、和/或聚乙烯吡咯烷酮),或肠溶衣(例如,基于甲基丙烯酸共聚物、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫漆、和/或乙基纤维素)。此外,可使用时间延迟材料,例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
固体片剂组合物可包括用于保护组合物免于发生不希望的化学变化(例如,在释放活性物质之前化学降解)的包衣。可以以与上述的《Encyclopedia of Pharmaceutical Technology》中描述的相似的方式将包衣应用于固体剂型。
本发明的组合物可以以片剂混合的,或可以是分开的。在一个实施例中,第一药剂报含在片剂的内部,第二药剂在外表上,从而第二药剂的主要部分在第一药剂的释放之前被释放。
用于口服的配方还可以是咀嚼片或硬明胶胶囊,其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如、土豆淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合,或是软明胶胶囊,其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备以常规方式使用上文所述的片剂和胶囊形式的成分来制备粉末和颗粒。
剂量方案
本文所述或使用本文所述的方法鉴别的任意化合物或组合物的剂量取决于几个因素,包括:给药方法、所治疗的疾病(例如,癌症)、疾病的严重程度、意在治疗或预防癌症、接受治疗的受治疗者的年龄、体重和健康状况。
对于本发明的治疗方法,不希望载体、结合物或组合物对受治疗者的给药被限定于特定的给药、剂量或剂量频率模式;本发明考虑到了所有的给药模式。可以以单一剂量或多剂量向受治疗者给予结合物或组合物。例如,本文所述的或使用本发明的筛选方法鉴别的结合物可以以一周一次给药,例如2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多周给药一次。本发明的化合物还可每天给予持续例如1、2、3、4、5、6或7天或持续1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多周。
给予本发明化合物的时间周期之后或之前是不给予该化合物的时间周期。例如,在给予本文所述的化合物之后,不向患者给予本发明的化合物达1、2、3、4、5、6或7天或达1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多周。在一些实施方式中,在所述时间周期过程中患者可接受其他的治疗剂。可根据治疗需要重复包括将本发明的化合物给予患者的时间周期和其后的不给予本发明化合物的所述时间周期的这些循环周期的化学疗法(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次)。
应理解,对任意特定的受治疗者,应根据个体需要和给药或监督载体、结合物或组合物的给药的人员的专业判断来随时间调整特定的剂量方案。例如,如果较低剂量在本文所述的疾病或病症(例如,癌症)的治疗中不能提供足够的活性,可提高结合物的剂量。反之,如果疾病(例如,癌症)被减轻或消除,则可降低化合物的剂量。
虽然主治医生最终会决定合适的量和剂量方案,但本文所述的化合物、载体、结合物或组合物的治疗有效量可在0.0035μg/kg体重/天至20μg/kg体重/天或0.010μg/kg体重/周至140μg/kg体重/周的范围内。理想的是,治疗有效量的范围是在0.025μg/kg至10μg/kg,例如,每天给予、每隔一天或一周两次,给予至少0.025、0.035、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、或9.0μg/kg体重。此外,治疗有效量可以在0.05μg/kg至20μg/kg的范围内,例如,每周给予、每隔一周或每月一次给予至少0.05、0.7、0.15、0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0或18.0μg/kg体重。此外,化合物的治疗有效量可以在,例如,每隔一天、一周一次或每隔一周给予0.100mg/m2至2000mg/m2的范围内。在一种理想的实施方式中,治疗有效量在1mg/m2至1000mg/m2范围内,例如,每天、每隔一天、一周两次、每周或每隔一周给予至少100、150、400、或800mg/m2的化合物。
例如,使用本文所述的任意给药方法、剂量和剂量方案,本发明的化合物(例如,化合物(I))可用于将鬼臼毒素衍生物(例如,式(I)的化合物,如依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG和替尼泊苷)或用于将多柔比星或多柔比星衍生物(例如,化合物(2)或包括式(II)的化合物的本发明的化合物)给药于患者。因为本发明的化合物可包括与,例如1、2、3、4或5分子的鬼臼毒素衍生物,如式(I)的(例如,依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG和替尼泊苷)或式(II)的(例如,多柔比星或表柔比星)的共价键,该化学计算法可被用于计算和调整给药的剂量(“等效剂量”)。例如,依托泊苷:Angiopep-2(3∶1)结合物(“Etop-An2(3∶1)”)的分子量为4354g/mol,其中依托泊苷含量占分子量的40%。类似地,多柔比星:Angiopep-2(3∶1)结合物的分子量为4178g/mol,其中多柔比星占分子量的40%。利用该信息,可计算被包括在所给予(例如,肠胃外的或经口)的组合物中的本发明的化合物的量,从而向患者给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500mgs/m2/天的鬼臼毒素衍生物(例如,依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG或替尼泊苷)。该剂量可每天对患者给药持续1、2、3、4、5、6或7天。给药周期之后,可以是1、2、3、4、5、6或7天或2、3、4、5、6、7或8周的停药期,不给予本发明的化合物,给药周期/停药周期的循环重复,例如再重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
本发明的化合物(例如,化合物(1)和化合物(2)或其药学可接受的盐)相对于各自的未结合的治疗剂(例如,依托泊苷、依托泊苷4-二甲基甘氨酸或多柔比星)可表现出物理化学和药物性能的提高。例如,对本文所述的示例性细胞类型、组织或器官(例如,脑、卵巢、肝脏、肺、肾脏、脾脏或肌肉)的靶向性提高,从而可以能够以亚治疗剂量使用给药于患者的化合物(例如,化合物(1)和(2))。本发明的化合物相对于各自未结合的治疗剂还可表现出毒性降低,从而可以能够以超治疗剂量向患者给予该化合物。例如,当作为单一静脉注射单独给药时,未结合的多柔比星通常以60-75mg/m范围的剂量方案进行给药,当与另外一种化疗剂组合时,是40-50mg/m2。未结合的依托泊苷或磷酸依托泊苷的一般剂量方案可以是1-5mg/m2/天、1-50mg/m2/天、35-50mg/m2/天、或50-100mg/m2/天的范围。通过本发明的化合物(例如,化合物(1)或化合物(2))的细胞类型、组织或器官靶向性的提高可以允许相对于用于对应的未结合的治疗剂的治疗剂剂量降低(“亚治疗剂量”,即,比对应的未结合的治疗剂的最低有效剂量低,例如是有效剂量的25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、2000、3000、4000或5000分之一)。与本发明的化合物(例如,化合物(1)或化合物(2))相关的毒性降低可以允许使用相对于用于对应的未结合的治疗剂的可被安全地给药于患者的较高剂量(“超治疗剂量”,即比未结合的治疗剂的最大允许剂量高,例如是该最大允许剂量的25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、2000、3000、4000或5000倍)。类似地,物理化学性能的提高也会影响对患者的给药剂量。例如,溶解性提高能够允许给予亚治疗剂量。这些提高的物理化学、药物特性可以使本发明的化合物(例如,化合物(1)或化合物(2))可安全给药于例如儿童或老年患者群体。以下实施例意在说明,而不是限制本发明。
实施例
实施例1:3∶1依托泊苷∶Angiopep-2结合物的合成
可通过鬼臼毒素衍生物(例如,式(I)的化合物,如依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷DMG和替尼泊苷)、双官能可水解连接基团(例如,二羧酸或二异氰酸酯(盐))和本文所述的任意氨基酸序列或其功能性衍生物的组合来实现本发明的化合物的合成。相对于多肽的衍生的鬼臼毒素中间体(例如,2”-戊二酰依托泊苷)等效物的变化可能够合成具有不同化学当量的多肽结合物(例如,“Etop-An2(1∶1)”或“Eto-An2(1∶1)”,其中一分子的依托泊苷结合于Angiopep-2多肽)。
方案5示出了包括共价结合于三个依托泊苷分子的Angiopep-2多肽的化合物(“Etop-An2(3∶l)”或(“Eto-An2(3∶l)”)的合成。
方案5
(2”-戊二酰基)-依托泊苷。在依托泊苷(10g,17mmol)的CHCl3(120mL)溶液中加入戊二酸酐(3.13g,27.4mmol)和DMAP(115mg,0.942mmol)。室温下72小时之后,蒸发混合物,并且使用聚苯乙烯/DVB柱通过反相色谱进行纯化(15%至35%的乙腈(ACN)水溶液,无三氟醋酸(TFA))。粗产物的HPLC显示比例为2∶1的位置异构体(区域异构体,regioisomer)2″-戊二酰基依托泊苷(2″-glu-Etop)和3”-戊二酰基依托泊苷(3″-glu-Etop)的混合物。在蒸发和冻干之后,得到了(2″-戊二酰基)-依托泊苷(4.1g,34%),其为白色粉末。也分离了位置异构体(3″-戊二酰基)-依托泊苷,其为白色固体(2.4g,20%)。通过RP-HPLC确定2″-glu-Etop和3″-glu-Etop的纯度。使用MetaChem Taxsil-3柱和梯度洗脱(1mL/分钟;10%至65%(0.05%TFA水溶液):(0.05%TFA的ACN溶液)经过15分钟),2″-glu-Etop的保留时间为9.00分钟,3″-glu-Etop的保留时间为9.42分钟。2″-glu-Etop(保留时间=9.00分钟)的纯度>98%(99.4%),3″-glu-Etop的纯度>98%(99.6%)。
((2″-戊二酰基)-Etop)3-(Angiopep2)(Etop-An2(3∶l))。在(2″-戊二酰基)-依托泊苷(2.83g,4.025mmol)的无水DMF(400mL)溶液中加入三乙胺(Et3N;0.84mL,6.037mmol)和N’,N’,N’,N’-四甲基-O-(苯并三氮唑-1-基)脲四氟硼酸酯(TBTU;1.32g,4.628mmol)。在室温下搅拌反应混合物1小时(pH=9.3)。通过以10N NaOH(至pH 7.3)调整pH来制备AN2(Angiopep-2,含量75%,3.68g,1.207mmol)的PBS 10X缓冲液(pH7.3;200mL)溶液。用干冰浴冷却之后,向Angiopep-2加入先前活化的酸(4x 100mL),通过加入10N NaOH将混合物的pH调整至7.2。室温一小时之后,过滤反应物从而去除磷酸盐,并蒸发以获得35mL的粗混合物。粗产物的HPLC显示的混合物以3∶1的(3∶1)和(2∶1)的比例结合。通过使用聚苯乙烯/DVB柱的反相色谱(15%至37.5%的ACN水溶液)纯化残余物。纯化之后,将0.1%乙酸加入到合并部分中从而提高可溶性。混合物的蒸发和冻干产生了Etop-An2(3∶1)产物,其为白色固体(596mg,12%)。使用MetaChem Taxsil-3柱和梯度洗脱(1mL/分钟;10%至65%(0.05%TFA水溶液):(0.05%TFA在CAN中的溶液)经过15分钟),发现分离的产物的保留时间为9.36分钟,纯度>95%(97.3%)。m/z (ESI-TOF):2178(+2),1452(+3)。
实施例2:3∶1依托泊苷DMG∶Angiopep-2结合物的合成
实施例1描述的程序可被用于制备包括结合于其他的鬼臼毒素衍生物的肽的化合物。例如,使用方案6所示的合成程序,依托泊苷DMG可被用于制备方案7所示的结合物(″EtopDMG-An2(3∶1)″)。
方案6
方案7
依托泊苷4’-二甲基甘氨酸:依托泊苷(235mg,0.4mmol)和DMAP(73mg,0.6mmol)的混合物于室温搅拌20分钟,边搅拌边在一个容器中加入N,N-二甲基乙酰氯(96mg,0.52mmol)。30分钟之后,根据HPLC结束反应。加入甲酸(1M,DMF中的,5mL),将溶剂浓缩至1mL。
得到的溶液上样于AKTA RPC柱进行纯化(梯度10%至30%的MeCN水溶液,具有0.1%甲酸)。冻干之后,得到了依托泊苷4’-二甲基甘氨酸(“依托泊苷DMG”或“EtopDMG”,180mg,67%),其为无色粉末。1H NMR(CD3OD)δ7.01(1H,s),6.56(1H,s),6.39(2H,s),5.98(2H,d,J=2.9Hz),5.05(1H,d,J=3.4Hz),4.77(1H,q,J=4.9Hz),4.68(1H,d,J=5.4Hz),4.66(1H,d,J=7.8Hz),4.46(2H,s),4.45(1H,dd,J=10.3,8.8Hz),4.31(1H,t,J=8.0Hz),4.17(1H,dd,J=10.3,4.9Hz),3.68(6H,s),3.56(1H,q,J=10Hz),3.54(1H,t,J=9.3Hz),3.52(1H,dd,J=14.2,5.6Hz),3.32(1H,m),3.26(1H,dd,J=9.1,4.1Hz),3.24(1H,dd,J=9.2,5.4Hz),3.02(6H,s),2.96(1H,m),1.33(3H,d,J=4.9Hz).13C NMR(DMSO)δ175.26,168.68,151.35,148.49,147.01,139.39,132.74,129.6,127.28,110.65,110.45,108.02,102.19,102.02,99.25,80.78,75.06,73.39,72.41,68.43,68.01,66.44,59.73,56.63,56.47,45.03,43.86,37.89,20.99;对于C33H39NO14673.2371计算的HRMS(MicroTOF),发现274.2534(M+1)。
依托泊苷4’-二甲基甘氨酸2”-戊二酸:将依托泊苷4’-二甲基甘氨酸(655mg,0.97mmol)和DAMP(18mg,0.15mmol)在氯仿(11mL)的混合物冷却至0℃。连续加入DMF(3mL)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA;0.25mL,1.46mmol),随后加入戊二酸酐(222mg,1.94mmol)。于室温下搅拌反应混合物,通过HPLC监控。两天之后,将溶剂浓缩至3mL。得到溶液上样于AKTA RPC进行纯化(梯度洗脱,10%至30%的MeCN水溶液),冻干之后获得依托泊苷4’-二甲基甘氨酸2”-戊二酸(305mg,40%),其为白色粉末。1H NMR(CD3OD)δ7.0(1H,s),6.53(1H,s),6.39(2H,s),5.99(2H,d,J=4.6Hz),4.97(1H,q,J=7.9Hz),4.78(1H,q,J=4.75Hz),4.74(1H,d,J=7.9Hz),4.68(1H,d,J=5.6Hz),4.45(2H,s),4.41(1H,dd,J=9.6,8.8Hz),4.29(1H,t.J=8.2Hz),4.15(1H,dd,J-10.0,4.5Hz),3.78(1H,t,J=9.4Hz),3.69(6H,s),3.61(1H,t,J=10.2Hz),3.42(1H,td,J=9.6,5.2Hz),3.33(1H,dd,J=8.7,8.2Hz),3.3(1H,dd,J=13.4,5.3Hz),3.02(6H,s),2.93(1H,m),2.26(1H,m),2.16(2H,m),2.02(1H,m),1.64(2H,m),1.32(3H,d,J=4.9Hz).13C NMR(DMSO)δ175.96,175.33,172.46,163.74,151.14,148.96,147.43,139.53,131.90,129.83,126.42,110.20,109.18,107.40,101.91,100.65,99.63,80.39,74.55,73.95,71.55,71.29,68.43,67.82,66.46,56.43,55.35,43.90,43.15,40.82,38.0,32.86,32.59,19.93,19.39。对于C38H45NO17787.2687计算的HRMS(MicroTOF)发现788.2432(M+1)。
(依托泊苷4’-二甲基甘氨酸2”-戊二酸)3-Angiopep-2结合物(“Etop-4′-DMGly-2”-Glu)3-An2”或“EtopDMG-An2(3∶1)”):将DIEA(0.17mL,0.98mmol)逐滴加入依托泊苷4’-二甲基甘氨酸2”-戊二酸(330mg,0.42mmol)和TBTU(145mg,0.46mmol)在DMF(24mL)的混合物中。室温下搅拌混合物50分钟。然后加入Angpep-2(422mg,0.14mmol)在DMSO(1.5mL)和DMF(9mL)中的溶液,随后加入DIEA(0.084mL,0.48mmol)。室温下搅拌混合物20分钟。取等分部分(10mL)进行UPLC分析,并且其显示反应完成。再搅拌10分钟之后,将反应溶液浓缩至3mL,并使用AKTA RPC柱纯化(梯度洗脱,10%至25%的MeCN的的水溶液,具有0.05%甲酸)。冻干之后得到(Etop-4′-DMGly-2″-Glu)3-An2(172mg,26%),其为了无色粉末。MS(MicroTOF),m/z,2305.9327(2+),1537.6443(3+),1153.7463(4+),922.7970(5+)。
实施例3:3∶1多柔比星∶Angiopep-2结合物(″(DoxSu)3-An2″)的合成
可通过方案8所示和本文所述的合成方案来制备多柔比星:angiopep-2结合物。
方案8
Fmoc多柔比星:边搅拌DIEA(1.5mL,8.63mmol)边逐滴加入多柔比星(2.0g,3.45mmol)和9-芴甲基-N-琥珀酰亚氨基碳酸酯(FmocOSu;2.32g,6.9mmol)在DMF(35mL)的溶液中。室温下搅拌混合物3小时并浓缩。得到的残留物与0.1%的TFA水溶液(3×20mL)一起研磨,用Et2O(8×20mL)洗涤。收集产生的固体,真空干燥从而产生Fmoc多柔比星(2.1g,产率80%),其为红色粉末。UPLC纯度,98%。MS(ESI,MicroTOF),788.2411(M+Na)。
FmocDoxSuOH:在搅拌下将DIEA(0.17mL,1.0mmol)逐滴加入Fmoc多柔比星(0.28g,0.366mmol)和丁二酸酐(0.11g,1.1mmol)在DMF(20mL)的溶液中。室温下搅拌混合物,通过UPLC监控。两天之后,去除溶剂并使用Biotage柱(硅胶,DCM中2%至9%的MeOH)纯化以产生FmocDoxSuOH(100mg,产率33%),其为红色粉末。UPLC纯度:95%。MS(ESI,MicroTOF),888.2577(M+Na)。
(FmocDoxSu)3-An2:在搅拌下将DIEA(0.25mL,1.44mmol)逐滴加入FmocDoxSuOH(599mg,0.692mmol)和TBTU(231mg,0.72mmol)在DMF(21mL)的溶液中。室温下搅拌混合物50分钟,然后加入Angpep-2(671mg,0.229mmol)在DMSO(2mL)和DMF(12mL)中的溶液。室温下搅拌混合物20分钟,此时HPLC显示反应完成。再搅拌10分钟之后,去除溶剂并使用Biotage C18柱(40%至80%MeCN的水和0.05%TFA溶液)进行纯化以产生(FmocDoxSu)3An-2(500mg,产率45%),其为红色粉末。UPLC纯度:95%。MS(ESI,MicroTOF),m/z 2423.4239(2+),1615.6190(3+)。
(DoxSu)3-An2:将哌啶(DMF中的20%,1.5mL)加入到(FmocDoxSu)3An-2(260mg,0.053mmol)的DMSO(1mL)和DMF(12mL)溶液中。溶液变成蓝色。搅拌10分钟之后,将溶液冷却至0℃,并用甲酸(DMF中的0.5M,6mL)处理从而得到澄清的红色溶液。使用真空泵去除溶剂,得到的残余物与Et2O(3×10ml)和AcOEt(3×10ml)一起研磨。使用AKTA RPC 30柱(10%至40%MeCN的水和0.15%甲酸溶液)进行纯化以产生(DoxSu)3An-2(82mg,产率37%),其为红色粉末。UPLC纯度:95%。MS(ESI,MicroTOF),m/z 2089.9674(2+),1393.2419(3+),1045.4395(4+)。
实施例3:依托泊苷、依托泊苷-Angiopep、多柔比星、多柔比星-Angiopep结合物对细胞增殖的影响
对于体外细胞增殖试验,将2.5×104至5×104的U87或SK-HEP-I细胞以1mL的终体积接种于24孔组织培养微板的具有10%血清的培养基中,并37℃和5%CO2孵育24小时。然后替换成无血清的培养基并孵育过夜。第二天早上,将药剂新鲜地溶解在二甲亚砜(DMSO)中,并用含有不同浓度的完全培养基重复三次替换培养基。DMSO的终浓度是0.1%。使用的对照是具有细胞而不具有药剂的微板。37℃和5%CO2孵育细胞48至72小时。孵育之后,改变培养基,以1mL含有[3H]-胸苷(1pCi/试验)的完全培养基代替。微板于37℃和5%CO2孵育4小时。去除培养基,于37℃用PBS洗涤细胞。将细胞固定在乙醇∶乙酸(3∶1)的混合物中,用水洗涤,以10%的冰冷的TCA(三氯乙酸)沉淀3次。最后,将500μL的PCA(高氯酸)加入到孔中,并将微板在65℃加热30分钟并在75℃加热30分钟。然后将每个孔中的内容物转移至具有10mL的闪烁液的闪烁计数瓶中,以Packard的液体闪烁计数器Tri-Carb的CPM(每分钟计数)来测量活性。表4示出了使用未结合的依托泊苷、Etop-An2(1∶1)和Etop-An2(3∶l)的细胞增殖试验结果。表5示出了EtopDMG-An2(3∶1)、未结合的依托泊苷DMG、多柔比星/Angiopep-2(3∶l)结合物(“多柔比星-An2(3∶1)”)和未结合的多柔比星得到的结果。
除了体外研究,还研究了在异种移植肿瘤模型中细胞增殖的抑制,图1中示出了这些结果。将U87胶质母细胞瘤细胞(2.5×106)皮下移植到裸鼠的右侧腹。在当肿瘤体积达到150-200mm3的移植后第15天(对应于图1所示的曲线图中的0天)开始治疗。通过以多柔比星(6mg/kg)和多柔比星-An2结合物(20mg/kg和40mg/kg)每周一次静脉推注注射治疗小鼠达三周。将多柔比星-An2结合物在酸化的D5W(5%葡萄糖水溶液)稀释至5mg/ml。
表4
表5
实施例3:原位脑灌注研究
在美国专利第20060189515号中描述的程序被用于原位脑灌注研究,其通过引用结合到本文中作为参考。在本文中会进一步描述这些程序。
实施例3a:Etop-An2(3∶l)
使用本文所述的和Dagenais et al.,J.Cereb.Blood FlowMetab.20(2):381-386(2000)中描述的原位脑灌注技术测量本发明的化合物(例如,Etop-An2(3∶l)、EtopDMG-An2(3∶l)和多柔比星-An2(3∶1))相对于对应的未结合的药物的脑吸收。利用本实验室的用于研究药剂在小鼠脑吸收的原位脑灌注方法测量了[125I]-多肽在小鼠脑毛细血管的内腔(luminal)侧脑吸收。
使用来自Sigma的碘珠通过标准程序碘化多肽。简单地说,将多肽在0.1M磷酸缓冲液,pH6.5(PB)中稀释。每一种蛋白质使用两个碘珠。在Whatman过滤器上以3mL的PB洗涤这些珠子两次,重新分散在60μL的PB中。室温下将来自Amersham-Pharmacia biotech的125I(1mCi)加入到珠子悬浮液中达5分钟。通过加入多肽(100μg)开始每一种的碘化。室温下碘化10分钟之后,通过HPLC去除游离的碘。
简单来说,使麻醉小鼠的右颈总动脉暴露于氯胺酮/甲苯噻嗪(140/8mg/kg i.p.)并且在总动脉的分叉部将其结扎,向(rostral to)枕动脉突出。然后以填充有肝磷脂(25U/mL)和装配有26号针头的聚乙烯管突出地(rostrally)对颈总动脉插管。含有灌注液(充有95%O2和5%CO2的pH7.4的Krebs/碳酸氢盐缓冲液中的[125I]-多肽或[14C]-菊粉)的注射器置于输液泵中(Harvard泵PHD 2000;Harvard Apparatus)并且连接于导管。在灌注之前,通过割断心室消除对侧血流输入。以1.15mL/分钟的流速灌注脑持续所示的时间。14.5分钟的灌注之后,再用Krebs缓冲液灌注脑60秒从而洗掉多余的[125I]-蛋白。然后切掉小鼠的头从而终止灌注,在进行毛细血管清除之前,在冰上分离右半脑。通过TCA沉淀,取均质液、上清液、沉淀物和灌注液的等分试样来测量其[125I]-结合物的含量,并且评价分布的表观体积。
在图2A-图2D和图3中说明了这些实验的结果。在图2A中,原位脑灌注显示Etop-An2(3∶1)的Vd高于未结合的依托泊苷(即,观察到的Etop-An2(3∶1)的斜率大于观察到的未结合的依托泊苷)。在EtopDMG-An2(3∶l)(图2B)相对于未结合的依托泊苷DMG和多柔比星-An2(3∶1)相对于未结合的多柔比星时观察到了相似的趋势(图2C)。如图2C所示,多柔比星-An2(3∶1):未结合的多柔比星的Kin的比值是15。该程序还区分了残留在脑血管隔室中的化合物和那些穿过近腔内皮膜进入脑主质的。图3示出了Etop-An2(3∶1)的原位灌注。在该曲线图的每一组中,左边的柱代表了未结合的依托泊苷,中间的柱代表了EtopDMG-An2(3∶1)(批次1),右边的柱代表了EtopDMG-An2(3∶l)(批次2)。在图4A和图4B中说明了脑毛细血管清除之后的Etop-An2(3∶l)的脑部重新分配。此外,相对于Etop-An2(3∶l)的脑吸收在野生型小鼠和P-gp敲除小鼠中是类似的而言,说明了Etop-An2(3∶l)不是P-gp底物(图5)。在该图中,每一组的左边柱显示了使用CD-1小鼠获得的结果,右边的柱显示了使用P-pg敲除小鼠得到的结果。通过同时给予未结合的多肽可抑制Etop-An2(3∶l)的脑吸收。图6显示了[125I]-Etop-An2(3∶l)与二倍过量的未结合的Angiopep-2共同灌注使主质的Vd降低了27%。
实施例3b:EtopDMG-An2(3∶l)和多柔比星-An2(3∶l)
在表6和图7中示出了使用实施例3a所述的方法测量的EtopDMG-An2(3∶1)相对于未结合的EtopDMG的脑吸收。表6还包括多柔比星-An2(3∶l)和多柔比星的相应数据。相对于未结合的EtopDMG,多柔比星-An2(3∶1)的脑吸收在野生型小鼠和P-gp敲除小鼠中是相似的,表示多柔比星-An2(3∶1)不是P-gp底物。
表6
药物 | 脑Kin(ml/s/g) |
EtopDMG-An2 | 1.4×10-3 |
EtopDMG | 9.0×10-5 |
多柔比星-An2(3∶1) | 3.7×10-3 |
多柔比星 | 2.8×10-4 |
实施例4:3∶1依托泊苷-Angiopep-2结合物的等离子体动力学
图8描述了推注给药之后Etop-An2(3∶l)的等离子体动力学。将放射标记的(125I)Etop-An2(20mg/kg)静脉(i.v)或腹膜内(i.p.)推注注射到重量约25-30g的CD-1小鼠中。注射液由12.5%二甲亚砜(DMSO)、12.5%无水乙醇、25%聚乙二醇400(PEG400)和50%的NaCl/甘氨酸缓冲液构成。以几个时间间隔(0.5、1、2和6小时)通过心脏穿刺收集血液,并处死动物。血液离心之后,在γ计数器(Wizard 1470自动γ计数器)测量等离子体放射性。放射性被表示为每克血浆的被注射的剂量%。使用GraphPad prism软件绘制结果,计算每一注射模式的曲线下的面积(AUC)。然后用i.p.注射后的AUC除以i.v注射的AUC估算腹膜内Etop-An2结合物的生物利用度。计算得到的i.p.给药后的估算的生物利用度为46%。表7示出了静脉推注给药小鼠之后的Etop-An2(3∶1)的药代动力学参数。未结合的依托泊苷的文献数据显示T1/2α=0.13小时(Reddy et al,Journal ofdrug targeting,13(10):543-553(2005))。
表7
实施例5:3∶1依托泊苷DMG-Angiopep-2结合物和3∶1依托泊苷-Angiopep-2结合物的组织分布
通过将标记了多肽或结合物给药于动物并测量该多肽或结合物对小鼠器官的分布(例如,使用3H或125I标记的结合物)来评价药剂与载体的结合对药剂的分布或结合于药剂的多肽的药代谢动力学的影响。可通过包括本文所述的任意多肽(例如,表1所述的多肽,如AngioPep-3、AngioPep-4a、AngioPep-4b、AngioPep-5、AngioPep-6和AngioPep-7或其类似物)进行相似的实验。在这里,将未结合的抗癌剂和结合物作为推注剂静脉注射小鼠。在不同的时间(0.25、0.5、1和4小时)收集组织并且进行均质化。为了定量3H-标记的结合物,以组织增溶剂消化组织匀浆,并在样品中加入10mL的液体闪烁物。在TCA沉淀之后,测量不同组织中的125I标记的结合物的量。定量与组织相关的放射性。使用Prism软件估算曲线(AUC 0-4)下的面积,并对不同组织作图。
图9示出了在推注静脉注射小鼠之后EtopDMG-An2的脑分布。在该图中,每一组的左侧柱显示了通过未结合的依托泊苷的结果,右侧的柱显示了通过Etop-An2(3∶1)得到的结果。图10示出了推注IV或IP给药之后Etop-An2(3∶1)的脑分布。图11比较了推注静脉给药小鼠30分钟之后Etop-An2(3∶1)对未结合的依托泊苷的脑分布。图12示出了与未结合的依托泊苷相比的Etop-An2(3∶l)的脑分布。在该图中,每一组的左侧柱显示了通过未结合的依托泊苷得到的结果,右侧柱显示了通过Etop-An2(3∶l)得到的结果;使用Etop-An2(3∶l)致使被研究的组织中的浓度升高。
实施例6:多柔比星-An2(3∶l)结合物在人脑瘤的小鼠模型中的抗肿瘤效果
根据加拿大动物保护协会(CCAC)的指导原则处理和饲养这些研究中的所有动物。动物方案得到了魁北克大学蒙特利尔分校的动物保护和使用委员会的批准。
通过在裸鼠脑内立体定向接种5×105U87细胞来建立脑内人脑瘤模型。雌性无胸腺裸鼠(Crl:Nu/Nu-nuBR;20-25g,4-6周龄;Charles RiverCanada,St-Constant,QC)被用于肿瘤模型,并且被饲养在无病原体的环境中。在手术前一个小时,小鼠接受皮下注射丁丙诺啡(120/10mg kg-1)。为了肿瘤细胞接种,通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪(120/10mg kg-1)麻醉小鼠,并且将其放置于立体定向仪(Kopf;Tujunga,CA)。在前囱前1.5mm和侧面2.5mm进行头颅钻孔。使用Hamilton注射器以3.5mm的深度经过5分钟注入5μL的无血清细胞培养基中的细胞悬浮液。
接种后3天开始药物治疗(表8)。通过推注尾静脉注射(一周一次)静脉提供治疗化合物(例如,多柔比星或多柔比星-An2(3∶l)结合物)。在5%葡萄糖水溶液(D5W)中制备药物溶液。在每次给药之前新鲜制备注射液。每天监控疾病发展的临床体征和体重。当小鼠达到终末点(体重减少20%),通过一氧化碳窒息处死。
表8
图13A和图13B分别示出了当单独给药(DoxSu)3-An2结合物时或与紫杉醇-Angiopep2结合物组合给药时的效力。图13A示出了一次实验获得的结果,图13B示出了第二组实验获得结果。实验2(图13B)得到的数据的统计分析显示,观察到的27%的提高具有统计显著性(p<0.007)。
其他实施方式
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虽然已连同其特定实施方式描述了本发明,但应理解可以进行其他的改进,并且本申请意在包括总体上遵循本发明原则的本发明的任意改变、应用或改造并且包括这样的相对于本文公开内容的偏离,包括在在本发明相关的领域中的已知或常规的惯例内和适用于前文列出的必要特征和在所附权利要求的范围内。
Claims (92)
1.一种化合物、或其药学可接受的盐,包括与选自由SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列或其功能性衍生物,其中,所述氨基酸序列包括所述氨基酸序列的氨基酸与鬼臼毒素衍生物的共价键,并且其中所述鬼臼毒素衍生物是具有式(I)的结构的化合物或其立体异构体或药学可接受的盐,
其中,R1、R2和R3各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、C(O)R8、P(O)(OR9)(OR10)、S(O)2(OR9),或包括与所述多肽的氨基酸键合的共价键的可水解连接子Y;
X是O或NR7;
R4、R5和R7各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、C(O)R8、或包括与多肽的氨基酸键合的共价键的可水解连接子Y;
R6是H、可选取代的C1-6烷基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基,
R8选自可选取代的C1-6烷基或可选取代的芳基;
R9和R10各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、或可选取代的芳基;以及
其中R1、R2、R3、R4、R5和R7之一并且只有一个是Y。
3.根据权利要求1或2所述的化合物,其中,Y是-C(O)(CH2)nC(O)-并且n是2、3或4。
4.根据权利要求1或2所述的化合物,其中,每一个R2是-C(O)CH2N(CH3)2。
5.根据权利要求1或2所述的化合物,其中,所述氨基酸序列通过所述氨基酸序列的第二个氨基酸共价结合于具有式(I)的结构的化合物。
6.根据权利要求5所述的化合物,其中,所述氨基酸序列通过所述氨基酸序列的第三个氨基酸共价结合于具有式(I)的结构的化合物。
7.根据权利要求1所述的化合物,其中,共价结合于所述可水解连接子Y的每一个氨基酸是通过所述氨基酸的氨基、胍基、羟基、酚基或硫醇官能团连接的。
8.根据权利要求7所述的化合物,其中,共价结合于所述可水解连接子Y的每一个氨基酸是通过氨基官能团连接的。
9.根据权利要求7所述的化合物,其中,所述氨基酸是赖氨酸或苏氨酸。
10.根据权利要求1或2所述的化合物,其中,所述氨基酸序列与选自由Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7(SEQ ID NO:109-112)组成的组中的氨基酸序列具有至少50%的同一性。
11.根据权利要求10所述的化合物,其中,所述氨基酸序列与Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的所述氨基酸序列具有至少70%的同一性。
12.根据权利要求10所述的化合物,其中,所述氨基酸序列与Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的所述氨基酸序列具有至少90%的同一性。
13.根据权利要求1或2所述的化合物,其中,所述氨基酸序列包括Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQ ID NO:109-112)的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的化合物,其中,所述氨基酸序列由Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQ ID NO:109-112)的氨基酸序列组成。
15.根据权利要求14所述的化合物,其中,所述氨基酸序列由Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列组成。
17.根据权利要求16所述的化合物,其中,在所述多肽的位置1处的苏氨酸和位置10和15处的赖氨酸均包括与具有式(I)结构的化合物键合的共价键。
18.根据权利要求16所述的化合物,其中,R2各自独立地是H或P(O)(OH)2。
20.根据权利要求19所述的化合物,其中,n是3。
21.根据权利要求16所述的化合物,其中,每一个R2是C-连接的α-氨基酸。
22.根据权利要求16所述的化合物,其中,R8是包括氨基取代基的C1-6烷基。
23.根据权利要求16所述的化合物,其中,-C(O)R8是二甲基甘氨酸。
24.根据权利要求16所述的化合物,其中,每一个式(I)的化合物独立地选自
其中R8A和R8B各自独立地是H、可选取代的C1-6烷基,或R8A和R8B结合以形成可选取代的3-7元环。
25.根据权利要求24所述的化合物,其中,R8A和R8B各自是可选取代的C1-6烷基。
28.一种药物组合物,包含根据权利要求1-27中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐和药学可接受载体。
29.一种治疗癌症的方法,所述方法包括向患者给予治疗有效量的根据权利要求1-27中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐。
30.根据权利要求29所述的方法,还包括给予第二治疗剂。
31.根据权利要求30所述的方法,其中,所述给药与另外一种治疗方案同时进行。
32.根据权利要求31所述的方法,其中,所述治疗方案是放射治疗、化学治疗、干细胞移植、骨髓移植、外科手术或高温治疗。
34.根据权利要求33所述的方法,其中,R2各自独立地是H或P(O)(OH)2。
35.根据权利要求33所述的方法,其中,每一个R2是-C(O)R8并且R8是包括可选取代的氨基的C1-6烷基。
37.根据权利要求36所述的方法,其中,n是3。
38.根据权利要求29-37中任一项所述的方法,其中,所述第二治疗剂是包括Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的序列的多肽,并且其中所述Angiopep-2结合于抗癌剂。
39.根据权利要求38所述的方法,其中,所述抗癌剂是紫杉醇。
40.根据权利要求38或39所述的方法,其中,所述第二治疗剂是ANG1005,
41.根据权利要求29所述的方法,其中,所述癌症是脑癌。
42.根据权利要求41所述的方法,其中,所述癌症是胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、听神经瘤、腺瘤、星形细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、CNS淋巴瘤、室管膜瘤、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、成神经管细胞瘤(mdl)、退行性(恶性)脑膜瘤、或神经纤维瘤病。
43.根据权利要求42所述的方法,其中,所述癌症是胶质母细胞瘤。
44.一种制造根据权利要求1-27中任一项所述的化合物的方法,所述方法包括利用双官能可水解连接基团将鬼臼毒素衍生物共价结合于选自SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116的氨基酸序列或其功能性衍生物的步骤。
46.根据权利要求45所述的方法,其中,R2各自独立地是H、P(O)(OH)2或-C(O)R8,其中R8是包括氨基取代基的C1-6烷基。
47.根据权利要求46所述的方法,其中,所述双官能可水解连接基团选自琥珀酸、戊二酸、戊二酸酐或丁酸组成的组。
48.根据权利要求47所述的方法,其中,所述氨基酸序列包括Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQ ID NO:109-112)的氨基酸序列。
49.根据权利要求44所述的方法,其中
(a)所述式(I)的化合物首先与所述双官能可水解连接基团结合以形成共价加合物;和
(b)然后(a)的加合物与所述的氨基酸序列结合;其中在用于(b)之前,(a)的加合物可以可选地被纯化。
50.根据权利要求44所述的方法,其中,相对于式(I)的化合物使用1.1-3.0当量的所述双官能可水解连接基团。
51.根据权利要求44所述的方法,其中,(a)的双官能可水解连接基团是戊二酸酐。
52.根据权利要求44所述的方法,其中,所述式(I)的化合物是依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷-4’-二甲基甘氨酸、或替尼泊苷或它们的药学可接受的盐。
53.根据权利要求44或49所述的方法,还包括使用肽偶联剂。
54.根据权利要求53所述的方法,其中,所述肽偶联剂是N,N,N’,N’-四甲基-O-(苯并三氮唑-1-基)脲四氟硼酸酯(TBTU)。
55.一种化合物或其药学可接受的盐,包括与选自由SEQ ID NO:1-105和SEQ ID NO:107-116组成的组中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列,或其功能性衍生物,其中,所述氨基酸序列包括所述氨基酸序列的氨基酸与多柔比星衍生物的共价键,并且其中所述多柔比星衍生物是具有式(II)的结构的化合物或其立体异构体或药学可接受的盐:
X1、X2、X3、X4和X5各自独立地选自共价键、O或NR25;
R17、R18、R19、R20、R20、R21、R22、R23、R24和R25各自独立地选自H、可选取代的C1-6烷基、可选取代的C2-6烯基、可选取代的C2-6炔基、可选取代的环烷基、可选取代的杂环基或是可水解的连接子Y;和
其中R17、R18、R19、R20、R20、R21、R22、R23、R24和R25之一并且只有一个是Y。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的化合物,其中,Y是-C(O)(CH2)nC(O)-,并且n是2、3或4。
59.根据权利要求55-57中任一项所述的化合物,其中,所述氨基酸序列通过所述氨基酸序列的第二个氨基酸共价结合于具有式(II)的结构的化合物。
60.根据权利要求55-57中任一项所述的化合物,其中,所述氨基酸序列通过所述氨基酸序列的第三个氨基酸共价结合于具有式(II)的结构的化合物。
61.根据权利要求60所述的化合物,其中,共价结合于所述可水解连接子Y的每一个氨基酸是通过所述氨基酸的氨基、胍基、羟基、酚基或硫醇官能团连接的。
62.根据权利要求61所述的化合物,其中,共价结合于所述可水解连接子Y的每一个氨基酸是通过氨基官能团连接的。
63.根据权利要求61所述的化合物,其中,所述氨基酸是赖氨酸或苏氨酸。
64.根据权利要求55-57中任一项所述的化合物,其中,所述氨基酸序列与选自由Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7(SEQ ID NO:109-112)组成的组中的氨基酸序列具有至少50%的同一性。
65.根据权利要求64所述的化合物,其中,所述氨基酸序列与Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的所述氨基酸序列具有至少70%的同一性。
66.根据权利要求65所述的化合物,其中,所述氨基酸序列与Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的所述氨基酸序列具有至少90%的同一性。
67.根据权利要求66所述的化合物,其中,所述氨基酸序列包含Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQ ID NO:109-112)的氨基酸序列。
68.根据权利要求67所述的化合物,其中,所述氨基酸序列由Angiopep-2(SEQ ID NO:97)、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQ ID NO:109-112)的氨基酸序列组成。
69.根据权利要求68所述的化合物,其中,所述氨基酸序列由Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列构成。
71.根据权利要求70所述的化合物,其中,所述多肽的位置1处的苏氨酸和位置10和15处的赖氨酸均包括与具有式(II)的结构的化合物键合的共价键。
72.根据权利要求70所述的化合物,其中,Y是-C(O)(CH2)nC(O)-,并且n是2。
73.根据权利要求55所述的化合物,其中,所述化合物具有以下结构:
其中每一个多柔比星或其药学可接受的盐是通过C14羟基处的琥珀酸基连接的。
74.根据权利要求73所述的化合物,其中,所述化合物包含1、2或3个共价连接的多柔比星部分的盐酸盐。
75.根据权利要求73或74所述的化合物,其中,所述化合物是化合物(2)的三盐酸盐。
76.一种药物组合物,包含根据权利要求55-75中任一项所述的化合物和药学可接受载体。
77.一种治疗癌症的方法,所述方法包括向患者给予治疗有效量的权利要求55-75中任一项所述的化合物。
78.根据权利要求77所述的方法,还包括给予第二治疗剂。
79.根据权利要求78所述的方法,其中,所述给药与另一种治疗方案同时进行。
80.根据权利要求79所述的方法,其中,所述治疗方案是放射治疗、化学治疗、干细胞移植、骨髓移植、外科手术或高温治疗。
83.根据权利要求77-82中任一项所述的方法,其中,所述第二治疗剂是包含Angiopep-2(SEQ ID NO:97)的所述序列的多肽,并且其中所述Angiopep-2结合于抗癌剂。
84.根据权利要求83所述的方法,其中,所述抗癌剂是紫杉醇。
86.根据权利要求77所述的方法,其中,所述癌症是急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、静脉内和膀胱内膀胱癌、骨肉瘤、乳腺癌、类癌综合征(小肠)、子宫内膜癌、尤因肉瘤、妇科肉瘤、头颈癌(鳞状细胞)、肝癌、、霍奇金病、胰岛细胞癌、白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、骨源性肉瘤、卵巢癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、移行细胞性膀胱癌、软组织肉瘤或维尔姆斯氏瘤。
87.根据权利要求29所述的方法,其中,所述方法包括亚治疗剂量的鬼臼毒素衍生物或其药学可接受的盐,或根据权利要求77所述的方法,其中所述方法包括亚治疗剂量的多柔比星衍生物或其药学可接受的盐。
88.根据权利要求87所述的方法,其中,所述方法包括亚治疗剂量的依托泊苷或依托泊苷4’-二甲基甘氨酸。
89.根据权利要求87所述的方法,其中,所述方法包括亚治疗剂量的多柔比星。
90.根据权利要求29所述的方法,其中,所述方法包括超治疗剂量的鬼臼毒素衍生物,或根据权利要求77所述的方法,其中所述方法包括超治疗剂量的多柔比星衍生物。
91.根据权利要求90所述的方法,其中,所述方法包括超治疗剂量的依托泊苷或依托泊苷4’-二甲基甘氨酸。
92.根据权利要求90所述的方法,其中,所述方法包括超治疗剂量的多柔比星。
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