CN109415424B

CN109415424B - 肽及其纳米颗粒制剂

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Publication number: CN109415424B
Application number: CN201780040936.9A
Authority: CN
Inventors: 穆罕默德·埃尔-塔纳尼; 保罗·麦卡伦; 艾哈迈德·法希姆
Original assignee: University of Bradford
Current assignee: University of Bradford
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2037-05-02
Also published as: GB2549798A; US20210188929A1; CN109415424A; WO2017187206A1; US11999770B2; EP3448877A1; GB201607593D0; US20190119340A1

Abstract

本发明涉及肽、用于产生所述肽的方法、所述肽的纳米颗粒制剂、以及这些新的肽和新的纳米颗粒制剂作为蛋白‑蛋白相互作用的抑制剂的用途，特别是用于在治疗与RAN基因过表达相关的疾病中的应用。

Description

肽及其纳米颗粒制剂

发明领域

本发明涉及一种用于产生RanGDP及其特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子RCC1的抑制剂的方法、RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的肽抑制剂以及这些抑制剂在医学中的用途。本发明还涉及所述抑制剂的纳米颗粒制剂及其用于治疗与RAN基因的过表达相关的疾病的用途。

发明背景

术语癌症涉及以异常细胞生长为特征的一系列疾病。细胞的异常新的生长被称为赘生物(neoplasm)。赘生物中的细胞通常比正常细胞更快速地生长，并且如果不治疗会继续生长。随着赘生物生长，赘生物可以影响并损伤邻近结构，并且可能最终损害宿主生物体的存活。赘生物可以是良性的或恶性的(癌性的)，并且通常被称为肿瘤(tumour)。如本文使用的，术语肿瘤用于指恶性的(癌性的)赘生物。因此，提及肿瘤的治疗和癌症的治疗在本文具有相同的含义，而提及乳腺癌或乳腺肿瘤及其治疗指起源于乳腺的癌症或肿瘤或其治疗，而不是起源于另一器官并且通过转移(metastasis)过程扩散至乳腺的肿瘤。起源于其他器官或部位的肿瘤或癌症以类似的方式提及。源自转移(metastasis)过程的肿瘤被称为转移瘤(metastases)或继发性肿瘤。

Hanahan和Weinburg(“The Hallmarks of Cancer”，Cell 100(1):57-70)假设了存在被称为癌症的疾病所共有的许多特征或标志，即(i)癌细胞刺激其自身生长；(ii)癌细胞抵抗原本可能停止其生长的抑制信号；(iii)癌细胞抵抗其程序性细胞死亡(它们规避凋亡)；(iv)癌细胞可以无限增殖；(v)癌细胞刺激为肿瘤提供营养物的血管的生长(血管生成)；和(vi)癌细胞侵入局部组织并扩散至远端部位处(转移)。无论所有癌症是否表现出随后被补充的全套标志(“Hallmarks of Cancer:The Next Generation”Cell 144(5):646-674)，明显的是，通过靶向这些标志提供了对癌细胞施加选择性杀伤作用的机会。

癌细胞沉迷于致癌基因或致癌途径(Weinstein，Science 2002；297:63-4)，所述致癌基因或致癌途径通常独特存在或过度活化，并且对肿瘤细胞生长和存活必不可少。癌症中两种最频繁失调的信号传导途径是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTORC1和Ras/MEK/ERK[促分裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶(ERK；MEK)]途径(Grant，J Clin Invest2008；118:3003-6)。这些生长信号传导途径通常通过调节转录因子进入或离开核的移位发挥其最终作用，从而改变转录物组，并且因此改变表达物组(expressome)(Kau&Silver，Drug Discov Today 2003；8:78-85)。几种致癌基因或肿瘤抑制转录因子诸如NF-κB、FOXO1、p53和β连环蛋白，以及非转录因子诸如存活蛋白(survivin)的活性由它们亚细胞定位调节。因此，已经提出了将核质转运与生长和存活信号传导途径的解偶联作为用于癌症疗法的潜在靶。

肿瘤或癌症通常通过其发生的原发部位，即肿瘤最初发展处指代，并且通常也通过提及其进一步的特征，例如其生长是否受激素刺激或它们是否表达某些受体指代。因此，位于乳腺中的原发肿瘤被称为乳腺癌，而其生长受激素诸如雌激素、孕酮和睾酮刺激的肿瘤被称为激素依赖性癌症。其生长受雌激素的存在刺激的乳腺癌被称为雌激素受体阳性(ER+ve)乳腺癌。这是重要的，因为了解肿瘤特征指示什么样的治疗性干预措施可能是有效的。例如，ER+ve肿瘤的治疗可以包括雌激素剥夺(estrogen deprivation)，例如通过用芳香化酶抑制剂阻断雌激素生物合成，或用选择性雌激素受体调制物诸如他莫昔芬(tamoxifen)阻断源自雌激素配体与其受体的相互作用的信号。用于治疗ER+ve肿瘤的这些治疗性干预措施阻止了雌激素受体的正常转录活化，从而阻断了雌激素刺激的肿瘤生长。通常，在以初始ER+ve状态表现出之后，乳腺癌肿瘤发展为激素难治状态(hormonerefactory state)，此时它们的生长不依赖于雌激素，因为，例如通过突变，雌激素受体采用甚至在雌激素不存在下雌激素受体被转录活化的形式，这样的肿瘤也称为雌激素受体阴性(ER-ve)肿瘤。类似地，表达孕酮受体并且其生长对孕酮的存在敏感的乳腺癌被称为孕酮阳性(PR+ve)乳腺癌，而其生长不依赖于孕酮受体的表达的那些乳腺癌被称为孕酮受体阴性(PR-ve)乳腺癌。

乳腺癌的另一种常见亚型是HER2阳性乳腺癌，一种过表达人类表皮生长因子2的乳腺癌亚型。已开发出许多HER2靶向疗法，实例包括抗HER2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)以及抗体-药物-缀合物曲妥珠单抗emtansine。

对于ER、PR和HER2为阴性的乳腺癌，即其生长不依赖于ER、PR或HER2状态的那些肿瘤类型，通常被称为三阴性乳腺癌。罹患三阴性乳腺癌的患者目前具有最差的总存活率和无病存活率。用于患有三阴性乳腺肿瘤的患者的治疗选择相对有限(Ontilo等，Clin MedRes.2009Jun；7(1-2):4-13)，其中除非患者具有BRCA1突变，目前的治疗范式通常涉及手术和辐射(如果适合的话)与使用剂诸如蒽环类、紫杉烷类或铂类化学治疗剂诸如卡铂的细胞毒性化学疗法的组合。对提供用于在治疗这样的状况中使用以改进这样的患者的临床预后的新的疗法存在明显需求(Andre&Zielinski，Ann Oncol(2012)23(增刊6)：vi46-vi51)。本发明的一个目的是提供对癌症诸如三阴性乳腺癌有效且耐受良好的新疗法。

RAS致癌基因家族的成员RAN是编码GTP结合核蛋白Ran的基因。在许多癌症中观察到RAN基因的过表达，并且该过表达与不良预后相关。例如，已经示出了RAN过表达与体外和体内癌细胞的侵袭性增加相关(Kurisetty等，Oncogene 2008,27,7139-49)，即RAN过表达的癌细胞被观察到快速生长并且表现出高转移潜力。此外，体外研究已经证明，相对于在正常细胞及活化的KRas突变体细胞(相对于它们的等基因KRas野生型对应物)中诱导的，在癌细胞中用SiRNA或shRNA沉默RAN基因诱导更大程度的凋亡。因此观察到癌细胞比其正常对应物对RAN状态的变化更敏感。还观察到RAN沉默促进具有与PI3K/Akt/mTORC1和Ras/MEK/ERK信号传导途径的活化相关的突变的癌细胞中的凋亡(Yuen等，Clin Cancer Res 2011；18(2)；1-12)。因此，提出了RAN作为用于其中PI3K/Akt/mTORC1和Ras/MEK/ERK途径被活化的癌症表型的潜在治疗性靶。

由RAN基因编码的25kDa蛋白，Ran(Ras相关核)蛋白，是G蛋白GTP酶，其在GDP结合状态(RanGDP)和GTP结合状态(RanGTP)之间循环，其调节核质转运、有丝分裂纺锤丝组装和有丝分裂后核包膜动力学。

取决于Ran与GTP还是GDP结合，Ran以不同的构象存在。在其GTP结合状态下，Ran能够结合核转运蛋白(输入蛋白和输出蛋白)，核转运蛋白是参与真核细胞的核和细胞质之间输入和输出分子的一组蛋白。输入蛋白在核中与RanGTP结合后释放分子货物(cargo)，而输出蛋白必须在核中结合RanGTP以与它们的输出货物形成三元复合物，以将分子货物转运至细胞质。

Ran的主要核苷酸结合状态取决于它是位于核(RanGTP)还是位于细胞质(RanGDP)，RanGTP在核内通过Ran与其特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)(染色体浓缩调节因子1，本文中称为RCC1)的相互作用形成，RCC1在Ran的核苷酸结合袋上催化GDP交换为GTP。在细胞质中，通过RanGAP和RanBP1将RanGTP水解为RanGDP释放能量，并使Ran、输出蛋白和货物的三元复合物解离，从而释放从核输出的货物。细胞质RanGDP继而通过小蛋白NTF2(核转运因子2)输入到核中，在核中RCC1然后可以催化Ran上的GDP交换为GTP并完成Ran循环。

在有丝分裂期间，Ran循环参与有丝分裂纺锤体组装和染色体分离后的核包膜重组装。在前期期间，核孔处的RanGTP-RanGDP比率的陡峭梯度随着核包膜变为渗漏和分解(disassemble)而破坏。当核孔蛋白RanBP2(Nup358)和Ran GTP酶活化蛋白(RanGAP)移动至动粒处时(在动粒处它们促进纺锤丝附着至染色体上)，当RCC1保持与染色质附着时，RanGTP在染色体周围保持高浓度。此外，RanGTP通过与核转运机制类似的机制来促进纺锤体组装：纺锤体组装因子诸如NuMA和TPX2的活性通过与输入蛋白结合被抑制。通过释放输入蛋白，RanGTP活化这些因子，并且因此促进有丝分裂纺锤体的组装。在分裂末期，RanGTP水解和核苷酸交换是子核的重整核包膜处囊泡融合所必需的。

本发明的一个目的是提供一种用于通过靶向Ran治疗癌症的新的治疗策略。为此，本发明提供了一种生成Ran-RCC1蛋白/蛋白相互作用的肽抑制剂的方法、Ran-RCC1蛋白/蛋白相互作用的肽抑制剂、以及这些新的抑制剂在医学中，例如在癌症的治疗中，特别是其中PI3K/Akt/mTORC1和Ras/MEK/ERK途径被活化的癌症表型中的用途。过表达Ran的疾病包括但不限于某些乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、血液癌、脑癌和肾癌，并且包括目前与不良患者预后相关的那些癌症，诸如三阴性乳腺癌。

发明概述

在本发明的第一方面，提供了一种用于制备RanGDP-RCC1蛋白/蛋白相互作用的肽抑制剂的方法，所述方法包括步骤：

i)鉴定Ran蛋白序列(SEQ ID NO：1)的区段，所述Ran蛋白序列(SEQ ID NO：1)的区段被预测为在RanGDP-RCC1复合物的形成或稳定中与RCC1相互作用；和

ii)制备6个至25个氨基酸的肽，所述6个至25个氨基酸的肽具有包含对应于步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分的至少6个氨基酸的连续序列的序列，

其中，所述肽任选地在其N末端处具有在对应的Ran的区段中不存在的半胱氨酸残基，并且其中，不算在所述N末端处的任选的半胱氨酸残基，所述肽与步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分具有至少80％的同源性或相对于步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分具有不多于2个点的缺失或突变。

在一个实施方案中，本发明的方法提供了一种肽，所述肽与步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分90％或100％同源。

在一个实施方案中，步骤i)中鉴定的Ran的区段选自MAAQGEPQVQFKLVLVGDG(SEQID NO：2)；RKVKAKSIVFHRKK(SEQ ID NO：3)；或PALAAQYEHDLEVAQTTALP(SEQ ID NO：4)。

在一个实施方案中，在步骤i)中鉴定的Ran的区段是MAAQGEPQVQFKLVLVGDG(SEQID NO：2)。

在一个实施方案中，所述方法的肽产物的长度为8个至20个或10个至20个氨基酸。在一个实施方案中，所述方法的肽产物的长度为从11个至15个氨基酸，例如长度为11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。

在另一个方面，本发明提供了一种肽，所述肽由包含以下氨基酸序列的6个至25个氨基酸组成：

(X)_m-Y

其中：X＝Cys；m＝0或1；并且Y含有包含在MAAQGEPQVQFKLVLVGDG(SEQ ID NO:2)；RKVKAKSIVFHRKK(SEQ ID NO:3)；或PALAAQYEHDLEVAQTTALP(SEQ ID NO:4)中存在的6个氨基酸的连续序列的氨基酸序列，此外，其中a)Y是与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的包含相同数目氨基酸的序列的部分具有至少80％的同源性的序列；或b)Y是对应于SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的部分具有不多于2个点的缺失或突变的序列；或其药学上可接受的形式。

在一个实施方案中，根据本发明的肽具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的包含相同数目氨基酸的部分90％或100％同源的基团Y。

在一个实施方案中，根据本发明的肽具有与SEQ ID NO:2的一部分80％、90％或100％同源的基团Y，并且整数m＝1。在一个实施方案中，根据本发明的肽具有包含Ala-Gln-Gly-Glu(AQGE)基序并且与SEQ ID NO:2的一部分80％、90％或100％同源的基团Y，并且整数m＝1。

在一个实施方案中，根据本发明的肽具有结构SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQID NO:7。

在另外的方面，本发明涉及一种纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂包含根据本发明的肽或任选地由本发明的方法获得的RanGDP-RCC1的抑制剂。

在另外的方面，本发明涉及一种RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的抑制剂，用于在医学中使用。

在一个实施方案中，用于在医学中使用的RanGDP-RCC1相互作用的抑制剂是根据本发明的方法获得的RanGDP-RCC1相互作用的肽抑制剂或根据本发明的肽。

在另外的方面，本发明提供了根据本发明的肽或其药学上可接受的形式用于制备药物的用途，任选地，其中所述药物用于治疗癌症。

在另外的方面，本发明为有相应需要的患者提供一种治疗方法，所述方法包括施用RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的步骤，任选地，其中所述患者患有癌症。

附图说明

为了使本发明能够被充分理解，参照以下附图描述本发明及其实施方案，所述附图不意图限制本发明的范围。

图1示出了聚合物类型对(A)包含SEQ ID NO:5的肽的纳米颗粒的尺寸、(B)ζ电位(zeta potential)、(C)包封效率和(D)体外肽释放的作用。值为平均值±SD，n＝3。对于1A-1C，与PLGA相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。与5％PEG-PLGA相比，^ΔP＜0.05。

图2示出了外部水相体积对包含SEQ ID NO:5的肽的纳米颗粒的(A)尺寸、(B)ζ电位、(C)包封效率和(D)体外肽释放的作用。值为平均值±SD，n＝3。对于2A-2C，对于每种聚合物类型，与50mL相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。对于每种聚合物类型，与75mL相比，ΔP＜0.05，ΔΔp＜0.01，ΔΔΔp＜0.001。

图3示出了肽载量对包含SEQ ID NO:5的肽的纳米颗粒的(A)尺寸、(B)ζ电位、(C)包封效率和(D)体外肽释放的作用。值为平均值±SD，n＝3。对于3A-3C，对于每种聚合物类型，与6％肽载量相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。对于每种聚合物类型，与4％肽载量相比，ΔP＜0.05，ΔΔp＜0.01，ΔΔΔp＜0.001。

图4示出了肽(SEQ ID NO:5)聚合物相互作用对(A)纳米颗粒尺寸、(B)ζ电位、(C)包封效率和(D)体外肽释放的作用。值为平均值±SD，n＝3。对于4A-4C，对于每种聚合物类型，与PBS相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5示出了SEQ ID NO:5肽装载的纳米颗粒(F18)(A)在配制后和(B)在体外释放7天后的SEM图像。图5C是在释放7天后肽的电子喷雾质谱。

图6示出了如通过流式细胞术确定的不同类型的SEQ ID NO:5肽纳米颗粒在24小时后的定量细胞摄取。单独直方图表示(A)F16、(B)F17和(C)F18纳米颗粒(关于这些制剂的信息参见表1和2)的细胞摄取阳性百分比，以及(D)纳米颗粒F16、F17和F18的每一种的细胞摄取的直接比较。值为平均值±SD，n＝3。与所有其他处理相比，***p<0.001。

图7示出了对照细胞(A-C)、用香豆素6处理的细胞(D-F)和用香豆素6+SEQ ID NO:5的肽装载的纳米颗粒(F18)处理的细胞(G-L)在处理24小时后用DAPI(第一列)、FITC(第二列)染色以及第一列和第二列的合并(第三列)的荧光显微镜图像。

图8示出了在不同剂量的SEQ ID NO:5的游离肽和SEQ ID NO:5的肽纳米颗粒F18(标记的肽NP)在24小时、48小时、72小时和96小时后的MDA-MB-231细胞存活力结果。

图9示出了在不同剂量的SEQ ID NO:5的游离肽和SEQ ID NO:5的肽纳米颗粒F18(标记的肽NP)在24小时和48小时后的MDA-MB-231细胞周期分析结果。

图10示出了在用游离形式和纳米颗粒(NP)形式的SEQ ID NO:7(C末端肽)、SEQ IDNO:6(中段(Med))和SEQ ID NO:5(N末端)的肽处理后的MDA-MB-231乳腺癌细胞存活力以及对照和未装载的纳米颗粒(NP)处理的细胞的存活力。

图11示出了用游离形式和纳米颗粒(NP)形式的SEQ ID NO:7(C末端肽)、SEQ IDNO:6(中段)和SEQ ID NO:5(N末端)的肽处理后的A549肺癌细胞存活力以及对照和未装载的纳米颗粒(NP)处理的细胞的存活力。

图12示出了SEQ ID NO:5(N末端)装载的纳米颗粒对MDA-MB231侵袭的抑制作用。

图13示出了SEQ ID NO:5(N末端)装载的纳米颗粒对MDA-MB231迁移的抑制作用。

图14示出了Ran活化测定的结果，其证明了SEQ ID NO:5的肽抑制剂对RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的直接活性。

图15示出了AlphaScreen^TM测定的结果，其指示SEQ ID NO:5的抑制剂直接抑制RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用。

发明详述

Ran是Ras超家族的成员，其调节核质转运、有丝分裂纺锤丝组装以及有丝分裂后核包膜动力学。Ran通过GTP-GDP循环充当分子开关，其中GTP结合构象和GDT结合构象之间的转化控制其与不同效应物的相互作用。RanGTP通过Ran与其特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的相互作用在核内形成，所述鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)在本文中称为RCC1，其在Ran的核苷酸结合袋上催化GDP交换为GTP(并且反之亦然)。本发明涉及产生在RanGDP的RCC1特异性结合袋中的RCC1的结合的肽抑制剂的方法。本发明还涉及用竞争性抑制RanGDP的RCC1特异性结合袋中的RCC1的结合的肽破坏Ran-GDP和RCC1之间的正常相互作用。本发明还涉及用于在医学中使用，并且特别是用于治疗癌症的RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的抑制剂以及这些抑制剂的有利制剂。

RanGDP-RCC1抑制剂及其制备方法

在本发明的第一个方面，提供了一种用于制备RanGDP-RCC1蛋白/蛋白相互作用的肽抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

i)鉴定Ran蛋白序列(SEQ ID NO:1)的区段，所述Ran蛋白序列(SEQ ID NO:1)的区段被预测为在RanGDP-RCC1复合物的形成或稳定中与RCC1相互作用；和

ii)制备6个至25个氨基酸的肽，所述6个至25个氨基酸的肽具有包含对应于步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分的至少6个氨基酸的连续序列的序列，其中，所述肽任选地在其N末端处具有在对应的Ran的区段中不存在的半胱氨酸残基，并且其中，不算在所述N末端处的任选的半胱氨酸残基，总体上所述肽与步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分具有至少80％的同源性，或相对于步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分具有不多于2个点的缺失或突变。

本发明人已鉴定出三个感兴趣的位点，用于产生RanGDP-RCC1相互作用的肽抑制剂。这些位点基于Ran蛋白(SEQ ID NO:1)的二级结构以及从Ran和RCC1之间的复合物的蛋白晶体学获得的二级结构以及Ran-RCC1相互作用的生物化学研究(例如突变对复合物形成和RCC1催化的GDP-GTP交换动力学的影响)获得的知识被鉴定。例如，Ran的二级结构和突变作用研究的知识提供了对Ran的哪些片段参与RanGDP-RCC1复合物的形成和功能的洞察。这是因为RanGDP-RCC1复合物的形成是一个动态过程，并且涉及在通过X射线晶体学提供的静态图像中观察不到的多种相互作用。换言之，Ran-RCC1蛋白晶体结构中不与RCC1紧密接近的Ran的二级结构的基序可以对Ran-RCC1复合物形成的动力学作出重要贡献，并且因此可以表示用于抑制剂的重要的靶。

Ran-RCC1相互作用的蛋白晶体学，例如蛋白晶体结构1i2m，提供了关于两个大分子之间的冷冻复合物的细节，并且允许鉴定每个蛋白上足够接近(在

内)的残基(它们贡献了有利结合的能量贡献)。两种蛋白之间的相互作用可以涉及例如氢键、π堆积或疏水相互作用。因此，计算分析允许鉴定在Ran的GDP/GTP结合位点之外的能够与RCC1结合的Ran的那些氨基酸残基。应用该信息，在计算机(in silico)中产生涉及选择长度从4个至25个氨基酸的Ran天然氨基酸序列的片段的计算机设计过程，并用虚拟对接方法评价所述片段与RCC1的相互作用。然后将具有最佳评分的肽通过常规技术合成，并且评价其对靶的活性。该方法提供了用于产生Ran-RCC1相互作用的肽抑制剂的可预测方法，所述肽抑制剂是天然Ran蛋白的片段。发现在所鉴定的肽片段的N末端处添加半胱氨酸残基是有利的，因为所得肽更加可溶，并且因此更适合于直接治疗应用。没有发现添加该半胱氨酸残基对RanGDP-RCC1抑制有任何显著不良作用。具有八个或更多个氨基酸残基的肽序列获得最佳评分。

Ran-RCC1的蛋白晶体结构揭示，在复合物形成时，蛋白Ran和RCC1埋藏了约

的大的溶剂可及表面积。从1i2m的结构中可以观察到Ran的24个残基和RCC1的25个残基参与接触形成。Ran与其RCC1相互作用的位点集中在P环(残基19至20)、开关II(残基67至76)和螺旋α3(残基93至110)和螺旋α4(残基134、137和140)周围。在设计抑制剂时，计算分析揭示在P环周围并且朝向N末端的二级蛋白结构包括转角(残基2至5)和链(残基10至17)、在α4螺旋周围的区域(在残基129至142的区域中)是特别令人感兴趣的。

Ran-RCC1的共晶体结构还揭示了Ran和Ras超家族的其他成员之间的差异，即存在以保守的C末端DEDDDL基序(残基211至216)结束的长C末端延伸。在Ran中，与DEDDDL基序邻近的C末端区域由连接体和位于蛋白开关区对面的螺旋(残基191至205)组成。生物化学研究和结构研究已经示出了该C末端开关与G结构域分离，并且在GTP结合状态下是柔性的。在Ran RCC1复合物中，从178开始的Ran蛋白残基很大程度上是无序的。在将C末端端部锚定到G结构域上的区域中，观察到了与RanGDP和RanGTP结构相比的大的构象变化。因此，尽管在Ran-RCC1蛋白晶体结构中，RCC1本身未呈现为与Ran的C末端直接相互作用，但是RCC1呈现出与Ran的129-142区域中的残基相互作用，使得RCC1与Lys130的冲突重新定位Ran的残基129-142，使得它们将在空间上干扰RanGDP中的C末端螺旋，继而导致C末端从G结构域核心的释放。因此，鉴定出RCC1在诱导C末端开关方面可能具有积极作用，并且这得到了体外实验的支持，该体外实验示出了用△²¹¹DEDDDL Ran突变体，RCC1催化的GDP释放显著更快。本发明人已经示出了，对于Ran，G19V突变抑制RCC1催化的GDP至GTP交换反应，并且因此鉴定了用于干扰RanGDP-RCC1相互作用的潜在区域。当研究该区域中的相互作用时，与Ran(SEQID NO:1)的残基2至5处的转角重叠的AQGE残基似乎显示出对抑制特别重要。

以上洞察引导本发明人评价至少部分地跨越以下的肽片段作为RanGDP与RCC1结合的抑制剂：i)Ran的N末端区域(即Ran的残基1至19)；ii)不具有GTP共有序列DEDDL的Ran的C末端区域(即Ran的残基191-210)；以及iii)在蛋白晶体结构1i2m中被鉴定为富含与RCC1相互作用的残基的在α4螺旋周围的Ran的残基(即Ran的残基129至142)。针对靶向这些区域(SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)的RanGDP-RCC1的三种抑制剂获得的数据证实了该分析，并且支持用于产生RanGDP-RCC1的肽抑制剂的一般方法，包括获取在这三个区域中蛋白序列的高度保守片段，该高度保守片段长度为至少8个氨基酸并且与鉴定区域中的Ran序列的片段具有80％或更多的同源性、或与对应于鉴定区域中的Ran的天然序列相比具有不多于两个缺失。因此，根据本发明的方法允许以仅基于Ran、RanGDP-RCC1复合物的结构和生物化学知识，以可预测的方式产生Ran-RCC1相互作用的新的抑制剂。

在优选的实施方案中，本发明的方法的步骤i)中鉴定的序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的任一个。该方法允许鉴定RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的竞争性抑制剂，并且因此提供直接获取可以直接或以其药学上可接受的形式使用以抑制RanGDP和RCC1的正常相互作用的肽化合物。该方法的肽产物可以在医学中潜在地使用。

在一个实施方案中，本发明的方法的肽产物特征在于在其末端处的半胱氨酸残基。在N末端处掺入半胱氨酸残基可以有利地改进肽抑制剂的溶解度，并且因此有利于作为药物直接施用，或进一步转化为可选的药学上可接受的形式诸如前药，或缀合至可选的递送系统诸如纳米颗粒或抗体。例如，设想本发明的抑制剂可以以任何药学上可接受的形式，例如以抗体-药物缀合物或与纳米颗粒递送系统缀合的形式施用。

在一个实施方案中，本发明的方法的肽产物的长度为从8个至20个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的方法的肽产物的长度为从10个至20个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的方法的肽产物的长度为从11个至15个氨基酸。重要的是平衡肽抑制剂的长度(其通常赋予对靶较高的亲和力)与对将肽药物有效递送至其作用位点的需求(当肽太长时，该有效递送有时可能受损)。

本发明的肽抑制剂可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。如本方法中使用的，标准肽合成涉及使用适当保护形式的相关氨基酸，将通常在其N末端处保护以避免二聚化的第一氨基酸(或肽片段)的C末端羧基与第二氨基酸(或肽片段)的N末端氨基基团连接，凭借肽偶联反应以在第一氨基酸和第二氨基酸(或肽片段)之间形成酰胺键以形成二肽(或如果一种或更多种起始材料是肽片段，则形成大肽)。然后产物肽的N末端可以被脱保护以形成起始材料，用于第二循环酰胺键形成，随后是脱保护。在肽链已经达到期望的长度后，从N末端和C末端两者去除保护基团，以得到所期望的产物。肽合成可以根据期望在液相或固相中进行。固相有利地允许方法自动化，因为纯化涉及简单的洗涤步骤，其中未结合的副产物或试剂通过洗涤或过滤去除。N末端氨基基团的保护基团通常是氨基甲酸酯，诸如Fmoc基团和Boc基团，尽管存在一系列可选的基团。如果需要侧链保护基团，例如，当序列中存在具有反应性侧链基团的氨基酸，例如半胱氨酸的巯基基团、丝氨酸的羟基基团或谷氨酸的羧酸时，则可以使用保护基团，诸如苄基衍生物或叔丁基。酰胺键形成反应通常用试剂诸如DIC、PyBOP、DEPBT、HATU、HBTU催化，所述试剂与碱诸如Hunig’s碱(N,N-二异丙基乙胺)组合使用。通常使用的固体支撑物包括聚苯乙烯树脂、聚酰胺树脂和基于PEG的树脂或混合树脂诸如tentagel。可以酌情选择标准的脱保护试剂，诸如三氟乙酸(用于Boc)和哌啶(用于Fmoc)或熟知的其替代物。用于从肽的固体支撑物上去除肽的裂解试剂也是熟知的，并且取决于所使用的固体支撑物。固体支撑物可以从本领域已知的任何系统中选择。

因此，本发明的方法提供了直接获取RanGDP-RCC1相互作用的肽抑制剂。RanGDP-RCC1相互作用的这些抑制剂适合于在医学中使用，例如，用于在治疗以RAN基因上调为特征的状况中使用。RanGDP-RCC1相互作用的抑制剂能够治疗的一种这样的状况是癌症，例如RAN基因被过表达的癌症。在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的肽抑制剂的长度为从8个至25个氨基酸。长度为从10个至15个氨基酸的肽抑制剂是特别优选的。优选的是，肽抑制剂与本发明的方法的步骤i)中鉴定的Ran的区段之一的一部分具有至少80％或90％同源性。在一些优选的实施方案中，通过本发明的方法产生的肽抑制剂具有与步骤i)中鉴定的RAN的区段之一的一部分相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了一种RanGDP-RCC1相互作用的肽抑制剂。根据本发明的肽抑制剂是RanGDP的RCC1结合袋中的Ran和RCC1之间相互作用的竞争性抑制剂。这些抑制剂通过直接与RCC1结合起作用，并且因此阻断RanGDP-RCC1复合物的形成。RanGDP-RCC1复合物的阻断阻止RanGDP从细胞质转运回细胞核，并且因此阻止核中RanGTP的再生。由于抑制了在有丝分裂(细胞分裂)过程期间的有丝分裂纺锤体组装和染色体分离后核包膜重组装中发挥关键作用的正常Ran循环，根据本发明的RanGDP-RCC1的抑制剂可以在医学中使用。特别地，RanGDP-RCC1的肽抑制剂可以用于治疗过表达RAN基因的状况。某些癌症类型，例如某些乳腺癌、肺癌、卵巢癌、血液癌、脑癌和肾癌，包括目前与不良患者预后相关的癌症诸如三阴性乳腺癌可以通过使用根据本发明的肽抑制剂被良好治疗。根据本发明的RanGDP-RCC1的抑制剂适合于治疗实体肿瘤和白血病(血液癌)。

在一个实施方案中，根据本发明的肽抑制剂包含与Ran的N末端区域的残基1至19(SEQ ID NO:2)的6个氨基酸的部分相同的、任选地以半胱氨酸残基结束的氨基酸序列。Ran的N末端周围的区域具有一个二级结构，该二级结构包含在位置3至5处的转角、在位置10至17和18至22的β链以及在位置23至27和31至35处的螺旋。应用本发明的方法，确定与Ran的位置3至12的氨基酸同源的10个氨基酸的序列将有效地抑制RanGDP的RCC1结合袋内的Ran与RCC1的相互作用。因此，制备了在其N末端处具有Cys残基的该序列CAQGEPQVQFK(SEQ IDNO:5)并且评价其活性。用SEQ ID NO:5的肽获得的结果在下文中描述，并且在图中示出。

在优选的实施方案中，与Ran的N末端结构域具有高同源性的本发明的肽抑制剂包含在天然肽的残基3至6处被发现的氨基酸序列AQGE。由缺失实验获得的结果表明AQGE片段赋予RanGDP-RCC1相互作用的特别良好的抑制活性。因此，靶向N末端区域(SEQ ID NO:2)的本发明的肽抑制剂优选在其整体结构中具有该AQGE基序。

在一个实施方案中，根据本发明的肽抑制剂包含与Ran的中心区域的残基129至142(SEQ ID NO:3)的6个氨基酸的部分相同的、任选地以半胱氨酸残基结束的氨基酸序列。在Ran的中心的区域具有一个二级结构，该二级结构包含在位置112-114、117至122和126-128处的β链以及在位置133至135和138至142处的螺旋。应用本发明的方法，确定与Ran的位置124至135的氨基酸同源的12个氨基酸的序列将有效地抑制Ran与RCC1的相互作用。因此，制备在其N末端上具有Cys残基的该序列CVDIKDRKVKAKS(SEQ ID NO:6)，并且评价其活性。用SEQ ID NO:6的肽获得的结果在下文中描述，并且在图中示出。

在一个实施方案中，根据本发明的肽抑制剂包含与位于Ran的C末端区域中的残基191至210(SEQ ID No:4)的6个氨基酸的部分相同的、任选地以半胱氨酸残基结束的氨基酸序列。Ran的C末端周围的区域具有一个二级结构，该二级结构包含位置185至187的转角、在位置191至205和211至215处的螺旋。应用本发明的方法，确定与Ran的位置196至210的氨基酸同源的14个氨基酸的序列将有效地抑制Ran与RCC1的相互作用。因此制备在其N末端处具有Cys残基的该序列CQYEHDLEVAQTTALP(SEQ ID NO:7)，并且评价其活性。用SEQ ID NO:7的肽获得的结果在下文描述，并且在图中示出。

除了具有与被鉴定为用于抑制剂开发的感兴趣的位点的Ran的片段(即SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)完全同源的序列的肽抑制剂，预期与天然肽的对应片段具有80％或90％的同源性的根据本发明的肽序列也可以显示出足够的抑制活性，以在治疗上有用。同样地，对应于抑制肽的片段(其对应于被鉴定为用于抑制剂开发的感兴趣的位点的Ran的片段(即SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4))相对于例如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4之一的一部分具有不多于2个点的缺失或突变的肽序列也被认为具有重要治疗潜力。

下文提供了根据本发明通过一个或两个点突变产生的序列的实例，其中突变位点被加下划线。基于公知常识中这样的突变如何能够用于调节肽抑制剂活性的知识，根据本发明的其他序列上的类似点突变对本领域技术人员将是明显的。

通过缺失来自SEQ ID NO:5的残基产生的序列的实例与SEQ ID NO:5一起在下文显示，为了便于参考。基于公知常识中这样的突变如何能够用于调节肽抑制剂活性的知识，根据本发明的其他序列上的类似点突变对本领域技术人员将是明显的。

如从图10和图11中的数据可以观察到，当作为纳米颗粒给药时，肽抑制剂SEQ ID5、6和7都显示出针对MDA MB-231三阴性乳腺癌细胞和A549肺癌细胞的体外增殖的显著活性。这些细胞系显示出针对相关人类肿瘤细胞系的活性并被广为接受作为体内治疗活性，并且最终作为潜在的临床应用的一线指示(indicator)。

此外，图12和图13提供了关于在用SEQ ID NO:5的肽处理后观察到的对于MDA MB-231细胞观察到的细胞侵袭和迁移的数据。该数据表明，除了抑制细胞增殖之外，抑制RanGDP-RCC1相互作用可以减少经处理的细胞的侵袭性并显著减少它们的转移潜力。

图14显示了Ran活化测定中获得的结果。泳道1为活化的Ran复合物的阳性对照，且泳道2为MDA MB-231细胞裂解物，泳道3为装载GDP并与RanBP1琼脂糖珠孵育的MDA MB-231细胞裂解物(阴性对照)。泳道4，装载了GTPγS并与RanBP1琼脂糖珠孵育的MDA MB-231细胞裂解物(阳性对照)。泳道5，通过N末端肽处理的MDA MB231细胞裂解物。泳道6，装载GD并用N末端肽SEQ ID NO:5处理的MDA MB-231细胞裂解物，泳道7，装载GTPγS并用与RanBP1琼脂糖珠孵育的N末端肽SEQ ID NO:5处理MDA MB231细胞裂解物。该实验显示，在天然的(native)细胞中SEQ ID NO:5的肽扰乱Ran-GDP和RCC1的相互作用(比较泳道2与泳道5)，因为抑制剂的添加敲低了蛋白水平。该实验还显示了，N末端肽扰乱了远离GTP结合袋的Ran-RCC1之间的相互作用(比较泳道4&7)。因此可以观察到N末端肽SEQ ID NO:5通过与RCC1直接结合扰乱Ran-RCC1之间的相互作用。

SEQ ID NO:5的抑制剂对RanGDP-RCC1相互作用的直接作用也通过AlphaScreen^TM测定来研究。该测定采用用于以微板格式研究生物分子相互作用的基于珠的(bead-based)化学，首字母缩略词ALPHA表示放大发光接近均相测定(Amplified LuminescentProximity Homogeneous Assay)。简言之，该系统使用两种光敏珠类型，第一供体珠和第二受体珠，所述第一供体珠可以吸收来自外部光源的光，所述第二受体珠可以首先吸收来自供体珠的能量(如果珠紧密接近)，并且然后继而发光。Ran蛋白附着至供体珠且RCC1蛋白附着至受体珠。在肽抑制剂的不存在的情况下，Ran和RCC1的相互作用使珠保持紧密接近，并且来自受体珠的发射是可检测的。在SEQ ID NO:5的抑制剂的存在的情况下，来自受体珠的发射被实质上减少，表明根据本发明的抑制剂直接靶向Ran-RCC1相互作用。如从图15可以观察到，在GTP的不存在的情况下，观察到复合物形成的45％抑制。

Ran活化测定和AlphaScreen^TM测定的结果强烈支持可归因于RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的抑制的例如在图10-13中的对细胞系的活性。该原理证据提供了RanGDP-RCC1蛋白-蛋白相互作用的抑制剂在医学中并且特别是在治疗癌症，诸如三阴性乳腺癌(MDAMB-231细胞是人类三阴性乳腺癌细胞)中的潜在用途的令人信服的证据。

药物/治疗方法

一个方面提供了如根据本发明定义的RanGDP-RCC1相互作用的抑制剂，用于作为药物使用。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗或减轻如本文提及的一个或更多个器官的组织中的癌症的方法。在一个实施方案中，根据本发明的这样的方法包括以下的一个或更多个步骤：将有效量的根据本发明的肽、或包含一种或更多种这样的肽的药物组合物施用或释放至有相应需要的个体。在一个实施方案中，根据本发明的这样的施用或释放的步骤是同时的、顺序的或单独的。

在一个实施方案中，如本文提及的有需要的个体是得益于根据本发明的肽或药物组合物的施用的个体。在一个实施方案中，这样的个体罹患一个或更多个器官的组织中的恶性赘生物(肿瘤)。在优选的实例中，肿瘤过表达Ran。在一个实施方案中，癌症选自乳腺癌、肺癌、卵巢癌或肾癌。在一个实施方案中，癌症是PI3K/Akt/mTORC1和/或Ras/MEK/ERK途径被活化的癌症。在一个实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

在一个实施方案中，个体是任何人类，男性或女性、婴儿、中年或老年。

如本文使用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”指出于抵抗状况、疾病或紊乱的目的而对患者的管理和护理。该术语意图包括针对患者罹患的指定状况的全方位(full spectrum)治疗，诸如出于以下目的施用肽或组合物：减轻或缓解症状或并发症；延缓状况的进展，部分阻止临床表现、疾病或紊乱；治愈或消除状况、疾病或紊乱；和/或预防或减少获得状况、疾病或紊乱的风险，其中“预防(preventing)”或“预防(prevention)”应理解为指的是出于阻碍状况、疾病或紊乱的发展的目的而对患者的管理和护理，并且包括施用活性化合物以防止或减少症状或并发症的发作的风险。待治疗的患者优选地为哺乳动物，特别是人类。然而，动物，诸如小鼠、大鼠、犬、猫、牛、马、绵羊和猪的治疗也在本发明的范围内。根据本发明待治疗的患者可以是多种年龄，例如，成人、儿童、16岁以下的儿童、6-16岁的儿童、2-16岁的儿童、2个月至6岁的儿童或2个月至5岁的儿童。

所提及的肽是根据本发明的RanGDP-RCC1抑制剂，并在上文详细描述。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种根据本发明的肽，用于在治疗哺乳动物的一个或更多个器官的组织中的癌症中使用。在一个实施方案中，所述治疗是改善性的和/或治愈性的。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人类(智人(homo sapiens))。

在一个实施方案中，当提及一个或更多个器官的组织时，所述器官选自由乳腺、肺、卵巢、前列腺、血液、脑和肾组成的组。

本发明的肽抑制剂的制剂

存在许多用于递送肽的策略，本领域技术人员可以采用所述策略来优化根据本发明的Ran-GDP-RCC1相互作用的肽抑制剂的递送。传统上，用于肽药物递送的最常用的方法是注射，但这并不总是合适的，因为除了与快速系统清除相关的潜在问题之外，很难确定肽可以以足够的浓度递送至作用部位。对于某些肿瘤，诸如在前列腺中发现的那些肿瘤，本发明的肽抑制剂可以直接施用至作用部位，即器官。即使如此，已知的是跨越细胞膜的有效的肽转运必须被实现。因此，需要提供一种其中肽可以达到其预期的作用部位的制剂。因此，当考虑根据本发明的RanGDP-RCC1的肽抑制剂的制剂时，需要考虑许多因素，诸如不良细胞分布、缺乏选择性递送和多药耐受性的潜在问题。因此，非常期望提供用于潜在的肽药物的递送策略，以便它们能够被递送至它们的作用部位，即癌细胞。

肽递送的一种已经建立的策略涉及将肽药物包封在合适的颗粒载体系统中，从而允许肽药物的体内命运由载体系统的特性而不是其自身的物理化学和转运特性确定。因此，可以通过控制药物释放的速率和部位实现增加的治疗指数。因此，本发明的肽抑制剂的制剂选择包括使用颗粒载体系统，诸如脂质体、微球、胶束和纳米颗粒。

在过去四十年中评价了具有多种形式、多种特征的生物可降解聚酯基质在许多创新的方法中的使用。例如，掺入到PLGA共聚物中，并用于治疗晚期前列腺癌和乳腺癌的乙酸戈舍瑞林肽于1998年被FDA批准。该递送系统可以保护肽并将肽缓慢释放到系统循环中，在系统循环中肽可以达到其靶部位。同年，FDA批准了掺入于聚合物载体中的另外两种肽药物，第一种是表明用于(indicated for)晚期前列腺癌和乳腺癌的治疗的乙酸亮丙瑞林的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)微球制剂，并且第二种是基于装载乙酸奥曲肽的PLGA的控制释放制剂，用于神经内分泌紊乱和类癌综合征中的肿瘤治疗。于2000年，双羟萘酸曲普瑞林的基于PLGA的微粒制剂获得监管部门批准用于晚期前列腺癌和其他适应症。设想，这样的方法很可能适合于递送根据本发明的新的抑制肽。

在过去脂质体和胶体纳米颗粒已被用于包封生物活性的药物，诸如肽、蛋白和DNA，它们被证明了通过细胞膜渗透和细胞内递送。聚合物纳米颗粒(NP)提供了几个优点，并且由聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)制成的那些是特别有益的。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的本发明的抑制剂的纳米颗粒制剂。在一个实施方案中，包含PLGA的本发明的抑制剂的纳米颗粒制剂是基于PLGA/聚乙二醇(PEG)嵌段共聚物纳米颗粒的。在一个实施方案中，PLGA/PEG嵌段共聚物纳米颗粒的％PEG含量为从1％至15％。在一个实施方案中，PLGA/PEG嵌段共聚物纳米颗粒的％PEG含量为从2.5％至10％。在一个实施方案中，PLGA/PEG嵌段共聚物纳米颗粒的％PEG含量为5％至10％之间。增加PEG含量有利地改进了包封效率。认为PEG的作用是提供肽可以容易驻留在其中的相对亲水的环境。来自PLGA/PEG纳米颗粒的肽的体外释放也有利地比PLGA纳米颗粒的体外释放更快且更高。这可能与抑制剂更快和更充分的释放至体内的作用部位良好相关。

本发明的纳米颗粒制剂通常使用乳化溶剂蒸发或通过溶剂置换技术制备。在一个实施方案中，乳化溶剂蒸发技术用于形成本发明的RanGDP-RCC1抑制剂的纳米颗粒制剂。相对于游离肽抑制剂，本发明的纳米颗粒制剂有利地增强生物物理化学特性并且实现对癌细胞的控制的细胞毒性和凋亡效力。根据本发明的纳米颗粒制剂具有100nm至400nm的平均直径。在一个实施方案中，根据本发明的纳米颗粒制剂具有150nm和300nm之间的平均直径。在一个实施方案中，根据本发明的纳米颗粒制剂具有从-3至-10mV的ζ电位。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒制剂具有0.3和0.4之间的平均多分散指数(polydispersityindex)。有利地，本发明的肽纳米颗粒在RanGDP被定位的细胞质中的定位可以介导阻断肽和RanGDP之间的相互作用，因此通过抑制剂和靶的共定位(colocation)增加给药的抑制剂的效力。

在一个实施方案中，本发明提供了一种RanGDP-RCC1抑制剂的纳米颗粒制剂。在一个实施方案中，本发明提供了一种根据本发明的或根据本发明的方法制备的肽RanGDP-RCC1抑制剂的纳米颗粒制剂。

第二活性成分

在一些实施方案中，本发明的肽与一种或更多种第二活性成分组合或包含一种或更多种第二活性成分，该第二活性成分被认为是其他治疗性化合物或其药学上可接受的衍生物。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的用于治疗的方法还包括同时或顺序且以任何合适的比率施用一种或更多种第二活性成分的一个或更多个步骤。在一个实施方案中，这样的第二活性成分例如选自用于治疗或预防一个或更多个器官的组织中的癌症或与一个或更多个器官的组织中的癌症的治疗相关的症状和并发症的化合物。在一个实施方案中，这样的第二活性成分预期用于治疗与初始治疗相关的副作用或旨在克服或抑制可能在癌症中出现的耐受性。因此，一种或更多种第二活性成分可以针对治疗癌症，治疗或抑制呕吐、阻断药物外排泵或增强Ran GDP-RCC1相互作用的肽抑制剂的抗癌作用。

在一个实施方案中，根据本发明的治疗方法包括以下步骤：其中如本文定义的药物组合物或肽与一种或更多种第二活性成分同时、顺序或单独地组合施用。在优选的实施方案中，第二治疗剂和RanGDP-RCC1抑制剂的作用是协同的。

部件试剂盒

在一个实施方案中，本发明提供了一种部件试剂盒。在一个实施方案中，根据本发明的部件试剂盒包含如本文定义的用于治疗一个或更多个器官的组织中的癌症的一种或更多种肽或组合物。在一个实施方案中，根据本发明的试剂盒允许同时、顺序或单独施用如本文描述的肽或第二活性成分。

在本发明的一个实施方案中，部件试剂盒包含如本文描述的一种或更多种第二活性成分。

施用和剂量

根据本发明，在一个实施方案中，将包含如本文定义的RanGDP-RCC1相互作用的肽抑制剂的组合物以药学上有效剂量或治疗有效量施用至有治疗需要的个体。

在一个实施方案中，根据本发明的肽的治疗有效量是足以治愈指定疾病或紊乱及其并发症、预防指定疾病或紊乱及其并发症、减少指定疾病或紊乱及其并发症的风险、减轻或部分阻止指定疾病或紊乱及其并发症的临床表现的量。对特定治疗目的有效的量将取决于紊乱的严重程度和种类以及受试者的体重和一般状态。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。

在本发明的一个实施方案中，组合物以从1mg/天至5000mg/天的剂量施用；诸如从1mg/天至100mg/天，诸如10mg/天至50mg/天，诸如100mg/天至250mg/天，诸如250mg/天至500mg/天，诸如500mg/天至750mg/天，诸如750mg/天至1000mg/天，诸如1000mg/天至2000mg/天，诸如2000mg/天至2500mg/天，或诸如2500mg/天至5000mg/天。活性抑制剂的剂量范围通常是在1mg/kg体重至100mg/kg体重范围内，诸如从1mg/kg体重至50mg/kg体重，并且更具体地20mg/kg体重。

在一个实施方案中，根据本发明的剂量施用一次或数次/天，诸如从1次至6次/天，诸如从1次至5次/天，诸如从1次至4次/天，诸如从1次至3次/天，诸如从1次至2次/天，诸如从2次至4次/天，诸如从2次至3次/天。在一个实施方案中，包含根据本发明的肽的组合物术前施用(操作(operation)或手术(surgery)之前)和/或围手术期(peroperatively)施用(操作或手术期间)。

施用途径

应当理解，优选的施用途径将取决于待治疗受试者的一般状况和年龄、待治疗状况的性质、待治疗组织在体内的位置以及所选择的活性成分的制剂。

在本发明的一个实施方案中，施用途径允许肽跨越血脑屏障。

系统性治疗

在一个实施方案中，施用途径允许将肽引入到血流中，以最终靶向期望的作用部位。

在一个实施方案中，施用途径是任何合适的途径，诸如肠道途径(包括口服、直肠施用、经鼻施用、经肺施用、经颊施用、舌下施用、经皮施用、脑池内施用和腹膜内施用)和/或肠胃外途径(包括皮下施用、肌内施用、鞘内施用、静脉施用和皮内施用)。

用于这样的施用的合适剂型可以通过常规技术制备。

肠胃外施用

肠胃外施用是不为口服/肠道途径从而药物避免肝脏中的首过降解的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括任何注射和输注，例如弹丸注射(bolus injection)，或持续输注，诸如静脉施用、肌内施用或皮下施用。此外，肠胃外施用包括吸入和局部施用。

因此，在一个实施方案中，肽或组合物被局部施用以跨越将要被给予物质或肽的动物的任何粘膜，例如在鼻、阴道、眼睛、口、生殖道、肺、胃肠道、或直肠中，例如鼻或口的粘膜，并且因此，肠胃外施用还可以包括经颊施用、舌下施用、经鼻施用、直肠施用、阴道施用和腹膜内施用，以及通过吸入或安置的肺和支气管施用。在一些实施方案中，肽局部施用以跨越皮肤。

在一个实施方案中，采用静脉施用、皮下施用和肌内施用形式的肠胃外施用。

在一个实施方案中，根据本发明的肽或组合物用作局部治疗，即直接引入至作用部位。因此，肽可以直接应用于皮肤或粘膜，或者肽可以注射到作用部位，例如注射到病变组织中或注射到直接导向病变组织的终动脉(end artery)中。

可选的药物制剂

在一个实施方案中，根据本发明的肽或其药学上可接受的衍生物以单剂量或多剂量单独地或与药学上可接受的载体或赋形剂组合施用。根据本发明的药物组合物或化合物可以根据常规技术，诸如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro编著，Mack Publishing Co.，Easton，PA，2000中公开的那些技术，用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂配制。

在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的衍生物”包括药学上可接受的盐，这指示对患者无害的盐。这样的盐包括药学上可接受的碱加成盐或酸加成盐以及药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。药学上可接受的衍生物还包括化合物的酯和前药、或可以被生物代谢为活性化合物的化合物的其他前体、或化合物的晶体形式。

药物组合物或药学上可接受的组合物可以被具体配制用于通过任何合适的途径施用，诸如肠道途径、口服途径、直肠途径、经鼻途径、经肺途径、经颊途径、舌下途径、经皮途径、脑池内途径、腹膜内途径和肠胃外(包括皮下、肌内、鞘内、静脉和皮内)途径。

在本发明的实施方案中，本发明的药物组合物或化合物被配制用于跨越血脑屏障。

用于口服施用的药物组合物包括固体剂型，诸如硬胶囊或软胶囊、片剂、锭剂(troche)、糖衣丸(dragees)、丸剂、糖锭剂(lozenge)、粉末和颗粒剂(granule)。在适当的情况下，它们可以用包衣诸如肠溶包衣制备，或者它们可以根据本领域熟知的方法被配制以提供活性成分的控制释放，诸如持续或延长释放。在同一固体剂型中，可以组合两种活性成分，以提供一种活性成分的控制释放和另一种活性成分的立即释放。

用于口服施用的液体剂型包括溶液、乳液、水性悬浮液或油性悬浮液、糖浆和酏剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包括无菌水性和非水性可注射溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及在使用前在无菌可注射溶液或分散液中重构的无菌粉末。储库可注射制剂也被认为是在本发明的范围内。

其他合适的施用形式包括栓剂、喷雾剂、软膏、乳膏/洗剂、凝胶、吸入剂、皮肤贴剂、植入物等。

在一个实施方案中，根据本发明的用于使用的化合物或肽通常用作游离物质或药学衍生物，诸如其药学上可接受的酯或诸如其盐。后者的实例是：具有游离碱官能度的化合物的酸加成盐和具有游离酸官能度的化合物的碱加成盐。术语“药学上可接受的盐”指根据本发明的用于使用的化合物的无毒盐，该盐通常通过使游离碱与合适的有机酸或无机酸反应、或者通过使酸与合适的有机碱或无机碱反应来制备。当根据本发明的用于使用的化合物包含游离碱官能度时，这样的盐通过用化学当量的药学上可接受的酸处理化合物的溶液或悬浮液以常规方式制备。当根据本发明的用于使用的化合物包含游离酸官能度时，这样的盐通过用化学当量的药学上可接受的碱处理化合物的溶液或悬浮液以常规方法制备。具有羟基基团的化合物的生理学上可接受的盐包括该化合物的阴离子形式与合适的阳离子，诸如钠离子或铵离子组合。非药学上可接受的其他盐可以用于制备本发明的化合物，并且这些形成本发明的另外的方面。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗环血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、葡醛酸盐(glucaronate)、蔗糖盐(saccharate)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即，1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。

在本发明的一个实施方案中，本发明的肽呈结晶形式，例如共结晶形式或结晶形式的水合物。

术语“前药(prodrug)”指在体内例如，通过在血液中水解或在细胞诸如例如基底神经节细胞中代谢快速转化以产生以上式的母体化合物的肽。以下提供了充分的讨论：T.Higuchi和V Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”，the A.C.S.SymposiumSeries第14卷，以及Bioreversible Carriers in Drug Design，Edward B.Roche编著，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987年，两者在此通过引用并入。前药的实例包括本发明的化合物的药学上可接受的无毒的酯类。本发明的化合物的酯类可以根据常规方法“March’s Advanced Organic Chemistry，第五版”，M.B.Smith&J.March，John Wiley&Sons，2001制备。

在一个实施方案中，对于肠胃外施用，采用根据本发明的用于使用的肽在无菌水性溶液、水性丙二醇溶液或芝麻油或花生油中的溶液。在适当的情况下，水性溶液应当适当缓冲，并且使液体稀释剂与例如足够的生理盐水或葡萄糖等渗。水性溶液特别适合于静脉施用、肌内施用、皮下施用和腹膜内施用。待采用的无菌水性介质都易于通过本领域技术人员已知的标准技术可得。

合适的药物载体包括惰性固体稀释剂或填料、无菌水性溶液和多种有机溶剂。固体载体的实例是乳糖、白土(terra alba)、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸和纤维素的低级烷基醚。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。此外，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何持续释放材料，诸如单独的或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。然后，通过将根据本发明的用于使用的化合物与药学上可接受的载体组合而形成的药物组合物以适合于所公开的施用途径的多种剂型容易地施用。制剂可以通过药学领域中已知的方法方便地以单位剂量形式呈现。

适合于口服施用的本发明的制剂可以被呈现为离散的单元，诸如胶囊或片剂，其各自包含预定量的活性成分，并且其可以包括合适的赋形剂。

此外，口服可用制剂可以呈粉末或颗粒、水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或水包油或油包水液体乳液的形式。

意图用于口服使用的组合物可以根据任何已知的方法制备，并且这样的组合物可以包含选自由甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂组成的组的一种或更多种剂以提供药学上美观且可口的制剂。片剂可以包含与适合于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以为，例如：惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术对它们进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并从而提供较长时间的持续作用。例如，可以采用时间延迟材料(诸如单硬脂酸甘油脂或二硬脂酸甘油酯)。它们也可以通过美国专利第4,356,108号；第4,166,452号和第4,265,874号(其内容通过引用并入本文)中描述的技术包衣，以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮于植物油，例如，花生油(arachis oil)、橄榄油、芝麻油或椰子油中或者悬浮于矿物油诸如液体石蜡中来配制。油性悬浮液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。可以添加诸如以上陈述的那些的甜味剂和调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存。

适合于通过添加水制备水性悬浮液的可分散粉末和粒剂提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或更多种防腐剂混合的活性化合物。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂的实例通过以上已经提到的那些示例。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

包含根据本发明的用于使用的肽的药物组合物还可以呈水包油乳液的形式。油相可以为植物油，例如橄榄油或花生油、或矿物油，例如液体石蜡或其混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄耆胶)、天然存在的磷脂(例如大豆卵磷脂)、和源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如失水山梨醇单油酸酯)以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。乳液还可以包含甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖来配制。这样的制剂还可以包含缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂和着色剂。药物组合物可以呈无菌可注射水性悬浮液或油性悬浮液的形式。该悬浮液可以使用以上描述的合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据已知方法配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。中水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液在可以被采用的可接受的媒介物和溶剂之中。另外，无菌的不挥发性油被方便地用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用使用合成的甘油单酯或甘油二酯的任何温和的不挥发性油。另外，脂肪酸诸如油酸可用于制备可注射剂(injectables)。

组合物也可以呈栓剂形式，用于直肠施用本发明的化合物。这些组合物可以通过将化合物与在常温为固体但在直肠温度为液体的合适的无刺激性赋形剂混合来制备并且因此将在直肠中融化以释放药物。这样的材料包括，例如可可脂和聚乙二醇。

本发明的肽也可以以脂质体递送系统的形式，诸如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡施用。脂质体可以由多种磷脂形成，诸如但不限于胆固醇、硬脂胺或磷脂胆碱。

另外，本发明的一些肽可以与水或普通有机溶剂形成溶剂化物。这样的溶剂化物也包括在本发明的范围内。

因此，另外的实施方案提供了药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的用于使用的肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药、以及一种或更多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

实施例

通过以下实施例举例说明本发明，以下实施例不意图限制本发明的范围。

材料

具有50:50乳酸/乙醇酸比率的PLGA (

RG 503H，MW 34kDa)和两种PLGA共PEG嵌段共聚物(

RGP d 5055(5％MW 5kDa的PEG)和

RGP d50105(10％5kDa分子量的PEG))从Boehringer Ingelheim(Ingelheim，Germany)购买。11个氨基酸的肽Cys-Ala-Gln-Gly-Glu-Pro-Gly-Val-Gly-Phe-Lys(SEQ ID NO:5)通过标准方法合成，并且以具有≥94％的纯度的白色冻干粉末获得。聚乙烯醇(PVA，87％-89％水解，分子量3100-50000)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)从Sigma Chemical Co.(St.Louis，USA)获得。改良的Lowry蛋白测定试剂盒从Pierce Ltd.(Rockford，IL)获得。二氯甲烷、乙腈和三氟乙酸为HPLC级，而其他试剂为分析级。工作中使用的水按1型标准(

25℃为18.2MΩcm)产生。

使MDA-MB-231乳腺癌细胞在37℃湿化的95％空气和5％CO₂中的补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、2mmol l^-1L-谷氨酰胺、100U ml^-1青霉素和100μg ml^-1链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的Dlbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长，其中在每间隔三天后更换培养基。

肽装载的纳米颗粒(NP)的制备

本研究中采用改良的复乳溶剂挥发法[Int J Pharmaceutics，499(2016)236-246]。将抗Ran-GTP酶阻断肽溶解于0.2mL水性溶剂中以形成内部水相，并与含5％w/v不同聚合物的2mL二氯甲烷(DCM)混合，然后通过使用Silverson L5T均质机(SilversonMachines，UK)以6,000rpm乳化2分钟。在搅拌下将初级乳液(w/o)直接注入到1.25％w/vPVA溶液中，并且以10,000rpm继续乳化另外6分钟以使用相同均质条件产生复乳。将最终乳液在真空下用磁力搅拌来搅拌过夜，以使有机溶剂完全蒸发。在纳米球形成后，将它们在4℃以22,000g离心30分钟，用超纯水和2％w/v蔗糖溶液洗涤3次，然后冻干(Labconco，Kansas City，Missouri)。将最终产品储存于环境温度的干燥器中。

为了制备荧光肽装载的NP，将香豆素6(100mg)添加至DCM相中，作为对以上描述的程序的唯一改变。在药物装载效率、粒径、多分散指数(PDI)和ζ电位方面评价包含香豆素6的NP。方法变量，诸如聚合物类型、肽载量、外部水相的体积和内部水相肽聚合物相互作用物的组成以及用于定义每种NP制剂的标识代码列于表1中。

NP表征

将冻干的NP样品(5.0mg)用Milli-Q水稀释至合适的浓度，以得到推荐的100 000个计数/秒的散射强度，并用涡旋混合悬浮5分钟。平均直径和尺寸分布使用MalvernZetasizer 5000(Malvern Instruments，UK)在90°的固定的角度通过光子关联光谱学(PCS)分析。所有测量以一式三份进行。

使用激光多普勒测速法(Malvern Zetasizer 5000，Malvern Instruments，UK)，将表面电荷定量为ζ电位。将冻干样品用0.001M KCl稀释。通过应用Smoluchowski方程从电泳迁移率的平均值计算出ζ电位。所有测量以一式三份进行。

使用扫描电子显微术(FEI Quanta 400 FEG SEM)研究了NP表面形态。将粉末样品安装到金属短柱(metal stub)上，然后在真空下涂覆金层，然后扫描。

肽载量和包封效率的确定

肽含量通过从冻干的NP中直接提取和通过基于未包封的肽的确定的间接程序两者来确定。在直接方法中，包封效率通过使用二甲基亚砜(DMSO)的普通溶剂溶解法确定。将冷冻干燥的NP(10mg)准确称重，溶解于1mL DMSO中，并且添加至含0.5％SDS的0.1N NaOH溶液中。在室温静置1小时后，悬浮液变透明。肽浓度通过Lowry法[Journal of ControlledRelease，107(2005)310-319]测量，得到载量百分比(w/w，肽质量/单位质量的干燥NP)。实际肽载量与理论肽载量的比较给出包封效率百分比。

间接方法使用1.0ml min^-1流速的反相色谱法[Journal of Controlled Release，82(2002)429-440](

C18-5柱，5μm)与UV检测(254nm)确定上清液中未包封的肽含量。使用包括两种溶剂混合物(溶剂A在乙腈中的0.1％TFA；溶剂B在水中的0.1％TFA)的流动相洗脱梯度。

从添加的肽的初始量和在NP制造后保留在悬浮液中的未包封的肽之间的差异计算NP中的肽包封。将每个样品以一式三份测定，并且将使用两种不同测定方法的结果的平均值表示为肽包封率百分比。

体外释放研究

将肽装载的NP样品(5.0mg)悬浮于1.0ml PBS(pH 7.4)溶液中，并且使用往复震荡水浴(100rpm)伴随搅拌在37℃孵育。在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时的预定时间间隔采集样品，对这些样品更换新鲜PBS，以22,000g离心5分钟，并且通过HPLC测定一式三份地确定上清液中肽的浓度。

肽完整性的评价

在7天的体外释放后，确定包封的肽在配制并从聚合物NP释放后的稳定性。使用HPLC-MS(Applied Biosystems API 4000 LC/MS/MS)直接分析包含肽的水性释放介质。以1.0ml min^-1的流速的流动相包括溶剂B(在乙腈中的0.1％TFA)在30分钟的运行时间内在溶剂A(在水中的0.1％TFA)中的线性梯度。使用C18反相柱分离约10μl-20μl的样品。

软件包(Thermo scientific，USA)用于数据获取和分析。

MDA-MB-231细胞的接种

收获汇合后的MDA-MB-231细胞，并且将悬浮液以1200rpm(4℃)离心5分钟以沉淀细胞。将沉淀物重悬在完全生长培养基中。使用血细胞计数器对悬浮液样品(10μl)进行细胞计数。

NP制剂的细胞摄取

香豆素6装载的NP制剂的细胞摄取使用流式细胞术和荧光显微术来评价[J PharmPharmacol 64(2012)61-67]。对于FACS分析，将香豆素6标记的NP(F16、F17和F18)悬浮于

培养基中，并且添加至在6孔板中的MDA-MB-231细胞中，持续24小时。将细胞通过胰蛋白酶化取出，并且重悬于FACS缓冲液中。在对用香豆素6处理的和未染色的MDA-MB-231细胞进行对照染色后，通过在FITC通道中门控阳性香豆素6染色来定量NP的细胞摄取。对于每个测定，以三次重复进行三个独立的实验。

肽装载的NP的细胞摄取和细胞定位通过荧光显微术通过每孔分析5个视野来定性地评价。香豆素6装载的NP(F18)进入MDA-MB-231细胞的胞内摄取在处理后24小时使用荧光成像(Olympus IX70)来检测。使用数码摄影(Olympus DP-71，Olympus，Center Valley，PA，USA)捕获图像。将MDA-MB-231细胞接种到包含两个固定盖玻片和2.0mL生长培养基的6孔板中。在用无菌PBS洗涤细胞后，将盖玻片取出，用固定培养基安装在玻璃载玻片上并进行检查。未处理的MDA-MB-231细胞和用香豆素6溶液处理的细胞用作阳性对照和阴性对照。

细胞毒性研究

优化的包含SEQ ID NO:5的肽的肽NP制剂(F18)的细胞毒性通过评价细胞存活力(MTT测定)来测量。将MDA-MB-231细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种在24孔板(NalgenNunc International，Ochester，NY)中，并且孵育24小时以允许60％-70％汇合和足够的粘附。将细胞用不同浓度的肽装载的NP、游离肽(SEQ ID NO:5)和空白NP处理。在24小时、48小时、72小时和96小时后，将处理的细胞用500μl PBS洗涤并且将500μl的在完全培养基中的15％MTT染料溶液添加至每个孔中。将板在37℃和5％CO₂孵育另外3小时。然后将上清液弃去，添加500μl DMSO，并且用力混合溶液。在酶标仪(Fluostar Omega，BMG Lab Tech GMBH，Germany)中在570nm(参考波长630nm)处测量每个孔的光密度。该实验以一式三份进行并重复三次。确定各浓度的平均值±SD。将细胞存活率百分比确定为处理的细胞的吸光度(570nm)相对于对照细胞中的吸光度(570nm)的比率。将未处理的细胞的吸光度设定为100％。将IC₅₀定义为将信号相对于对照减少50％所需要的样品的浓度。

细胞周期分析

为了确定肽(SEQ ID NO:5)装载的NP对细胞生长的作用，将培养的细胞用与细胞存活力测定中使用的相同剂量的游离肽和肽装载的NP处理。在处理24小时和48小时后，将细胞悬浮于PBS中，并且通过添加70％冰冷的甲醇固定。通过将RNA酶(1.0μg ml^-1)添加至样品中处理细胞并且重悬于碘化丙啶(PI)染色液(5.0μg ml^-1)中来处理。PI荧光强度使用流式细胞术在585nm处通过FL-2A滤光器来确定。流式细胞术数据使用Cyflogic(v.1.2.1)软件分析。如先前描述的[PLoS ONE，6(2011)e23640]，将凋亡细胞的定量通过流式细胞术确定处于细胞周期分析中的亚G1区(亚二倍性)的细胞的百分比。

统计学分析

将结果呈现为以平均值±SD，并且使用单因素方差分析(ANOVA)随后是Tukey事后检验进行统计学分析。P＜0.05的值被认为是统计学上显著的。

表1.肽(SEQ ID NO:5)装载的NP的方法变量和对应的标识符

*PBS--磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)

表2.不同方法变量对肽(SEQ ID NO:5)装载的NP尺寸、PDI、ζ电位和包封效率的作用

*所有值为平均值±SD，n＝3。

结果讨论

用肽(SEQ ID NO:5)装载的聚合物NP通过复乳溶剂挥发法来制造，并且确定其物理化学参数，诸如平均粒径、PDI、ζ电位、包封效率和体外释放谱。研究不同制剂变量对肽装载的NP的物理化学特性的影响，以优化肽装载的NP的制剂，并且确保合适的NP尺寸、高肽载量和受控的治疗作用。

聚合物类型的作用

研究了由三种不同聚合物产生的不同肽装载的NP(F1、F4和F7)的物理化学特征。PLGA NP(F1)的尺寸(330.0±20.1nm)显著大于由5％和10％PEG-PLGA二嵌段共聚物的PEG化聚合物制备的NP F4(250.2±12.8nm)和F7(217.3±11.1nm)(p<0.001)(图1A)。这归因于共价连接的亲水PEG嵌段在改变PLGA聚合物的物理化学特性中的作用，该作用导致形成较小的颗粒。所有NP制剂具有低多分散指数，范围从0.26至0.39。增加NP基质中的PEG分数，导致平均NP直径减小，这与其他研究中报道的发现类似。

NP的δ-电位在稳定性中发挥重要作用。与PEG化的PLGA NP(F4和F7)相比，F1显示出更高的负δ-电位值(-18.9±2.6mV)(p<0.001)(图1B)。将PEG分数从5％增加至10％对δ-电位不具有作用。PEG-PLGA NP具有相对地接近中性的较低负ζ-电位，这是由于存在表面定位的PEG链，该PEG链避开了负责颗粒表面总体负电荷的游离羧基基团。

增加聚合物骨架中的PEG分数导致肽包封的显著增加(p<0.01)。包封效率从PLGA中的(37.0％±2.2％)增加到10％PEG-PLGA中的(54.9％±2.6％)(图1C)。在二嵌段类型中，PEG链将其自身朝向胶束中的水相定向，包围包封的肽。二嵌段共聚物类型促进了蛋白药物的高药物载量和包封效率。PEG-PLGA聚合物的这种贡献被认为是由于由PEG区段产生的包封的肽可以容易地驻留在其中的相对亲水的微环境。10％PEG-PLGA的较高包封效率被认为是部分地由于其在二氯甲烷中的较低溶解度导致较短的固化时间，以及由此而来的较高的包封效率。

体外释放谱显示，当与PLGA NP相比时，来自PEG化的PLGA NP的肽的突释更快且显著更高(p<0.001)。与来自F1释放的51.5％±1.5％相比，F4和F7在首个24小时内释放约62.6％±2.5％和70.4％±6％的肽(图1D)。

外部水相体积的作用

使用三种不同体积的外部相(50mL、75mL和100mL)研究该方法变量对PLGA(F1、F2和F3)、5％PEG-PLGA(F4、F5和F6)和10％PEG-PLGA(F7、F8和F9)的不同NP制剂的物理化学特性的作用。PVA溶液的体积从50mL增加至100mL导致不显著的PLGA NP尺寸增加(p>0.05)(图2A)以及PDI从0.26±0.04至0.45±0.02的显著增加(p<0.001)。然而，对于5％和10％PEG化的PLGA NP，观察到PDI的微小增加以及分别从250nm至325nm和从217nm至274nm的显著尺寸增加。反过来，对于5％和10％PEG化的PLGA NP，外部PVA溶液增加至100ml分别导致5％和10％PEG化的PLGA NP的尺寸从250.3±12.8nm至325.5±27nm(p<0.01)和从217.3±11.1nm至274.8±19.6nm的显著增加。然而，观察到PDI值的降低不显著(p>0.05)。

具有不同体积的外部水相的肽装载的NP的制备对ζ电位不具有显著作用(p>0.05)(图2B)。包封效率随着连续相体积增加而增加(图2C)。例如，当与1/25的较高的分散相与连续相的比率(DP/CP)相比时，当DP/CP比率降低至1/50时，包封效率显著增加(p<0.05)，分别为36.9％(PLGA)、31.5％(5％PEG-PLGA)和24.6％(10％PEG-PLGA)。可能的是，大体积连续相几乎为稀释有机溶剂提供漏槽(sink condition)条件，以便DCM即刻被提取，导致聚合物的快速固化，这最终导致亲水肽的更高截留。体外释放谱表明，外部相体积影响来自不同聚合物的初始突释和控制释放模式(图2D)。从具有与F3、F6和F9相比较低的外部体积的F1、F4和F7观察到的更高的突释。事实上，由于聚合物固化速率降低，孔隙率随着DP/CP比率增加而增加。对于低的外部体积，固化较慢。水能够从任一水相(外部和内部)流入到聚合物结构中，这产生水填充的通道或孔。因此，发生较高的初始突释。然而，对于F3、F6和F9，聚合物适度快地固化，且水不太能够与基质相互作用，导致致密结构和低的初始释放。

肽载量的作用

在该研究中使用三种不同的载量(6％、4％和2％)以研究对PLGA(F3、F10和F11)、5％PEG-PLGA(F6、F12和F13)和10％PEG-PLGA(F9、F14和F15)的不同NP制剂的物理化学特征的作用。降低肽载量导致PLGA NP尺寸的不显著降低(p>0.05)(图3A)。然而，将PEG-PLGA制剂中肽载量从6％降低至2％导致NP尺寸的显著降低(p<0.001)。对于5％和10％PEG化的NP，NP尺寸分别从325.5±27nm降低至178.5±25.7nm，和从274.8±19.6nm降低至161.8±15.7nm。由于PEG部分的存在，增加肽载量使与NP表面结合的量增加，这导致平均NP直径的增加。PDI值在肽载量的降低后减少，对表面电荷不具有显著作用(图3B)。肽载量对所有类型NP中的包封效率均具有显著影响。肽载量的降低导致包封效率的显著增加(p<0.05)(图3C)。包封效率从50.7％±4.4％增加至67.7％±6.9％(PLGA)，从59.9％±6.9％增加至77.5％±3.1％(5％PEG-PLGA)和从68.4％±2.1％增加高至80.5％±6.1％(10％PEG-PLGA)。

释放谱和初始突释与肽装载的程度密切相关(图3D)。具有2％载量的F3、F6和F9的释放谱比6％载量的那些显著更低(P＜0.01)。与分别来自F11、F13和F15的31.5％±1.0％、40.3％±1.5％和45.5％±1.5％相比，观察到分别来自F3、F6和F9的41.4％±2.2％、52.5％±3.2％和59.4％±2.0％的初始突释。在初级乳液液滴中使用增加的量的肽增强朝向外部水相的浓度梯度，这导致向外扩散增加。

药物聚合物相互作用的影响

研究了肽与聚合物相互作用对NP特性的影响。将肽溶解于两种水性溶剂类型(PBS和0.1M HCl pH 1.0)中，以研究可能的离子相互作用对PLGA(F11和F16)、5％PEG-PLGA(F13和F17)和10％PEG-PLGA(F15和F18)的不同NP制剂的物理化学表征的影响。RanGDP-RCC1抑制剂肽(SEQ ID NO:5)是中性肽，具有1234Da的MW和约6.0的等电点(pl)。溶解于PBS中的肽因为其几乎中性的电荷而不可能与阴离子PLGA聚合物相互作用。可选地，在0.1M HCI中，肽在使其称为阳离子的pH溶解。由于SEQ ID NO:5的肽在酸性pH具有正电荷，预期该肽的碱性氨基酸残基和PLGA中未加帽的羧酸末端端部基团之间的静电相互作用在肽的包封和释放中发挥关键作用。

预测的肽聚合物相互作用对NP尺寸和PDI不具有显著影响(图4A)，尽管存在它影响最终NP的ζ电位值(p>0.05)的证据(图4B)。相反地，肽和聚合物之间的相互作用有助于增加所有聚合物类型的包封效率。观察到PLGA聚合物的肽包封效率的急剧增加(p<0.001)，其超过其他PEG化聚合物的包封效率的增加(图4C)。当与PEG化的PLGA共聚物相比时PLGA中更普遍的游离羧基基团的丰度可以解释这一观察结果。该离子相互作用将有利地延缓肽在制备过程期间向外部水相的扩散，并阻止不想要的损失。相对于末端加帽的变体，在携带游离羧基末端基团的未加帽的聚合物内的包封阳离子肽通常是优选的。

聚合物和蛋白之间的相互作用被预测为影响从最终递送系统的释放。PLGA NP的体外释放谱显示出在初始突释后是在孵育期的剩余时间期间的更缓慢的释放谱(图4D)。为了确认离子相互作用，将不同量的NaCl添加至释放介质中(数据未示出)，并且将体外释放谱进行比较。结果显示在较高浓度的NaCl的更多释放。对于PLGA NP，在0.0M NaCl的突释为20.1％±2％，其通过添加0.5M NaCl而增加至42.7％±3.4％。介质的离子强度的增加通过屏蔽带电荷的离子基团减少离子相互作用的程度。这些结果表明，肽和PLGA之间存在离子相互作用。这样的相互作用可以解释肽从PLGA NP的缓慢释放。这些结果揭示，肽从PLGA NP的释放不仅受聚合物的降解或侵蚀(erosion)控制，而且还由于可能的离子相互作用。然而，对于PEG化的PLGA聚合物，当聚合物完全降解时，可以释放包封的肽。因此，肽释放受聚合物的降解速率支配，如在7天内达到90％释放。这表明肽和聚合物之间的相互作用不影响肽在PEG化的PLGA NP内及其在释放期间的稳定性。通过质谱进一步确定了稳定性，质谱确认肽的质量在从F18体外释放后未改变(图5C)。

扫描电子显微术

为了获取肽装载的NP(F18)的表面形态、聚集或粘附，使用SEM以使颗粒表面可视化。SEM图像显示均匀尺寸的光滑球形形状，没有颗粒粘附或聚集的迹象(图5A)。从SEM获得的平均尺寸与通过激光衍射获得的平均尺寸相当。在体外释放7天后，耗尽的NP样品呈现为具有更多孔和迷宫样(labyrinthine)的结构。该结构通过水性释放介质侵蚀聚合物后的药物扩散而产生(图5B)。

纳米颗粒的细胞摄取

研究了MDA-MB231乳腺癌细胞对PLGA和PEG化的PLGA NP的细胞摄取效率。体外细胞摄取的研究结果示于图6和图7中。图6A-6D中显示了定量流式细胞术分析，该分析反映了处理24小时后乳腺癌细胞中香豆素6装载的肽NP的存在。在用10％PEG化的NP处理后具有阳性染色的细胞百分比显著高于从PLGA和5％PEG-PLGA制备的所有其他NP制剂(p<0.001)。与分别具有11.4％±3.7％和18.1％±7.3％的F16和F17相比，F18显示了具有54.8％±12.7％阳性细胞的更高细胞摄取。这些结果显示，具有最低粒径(162nm)、最高PEG含量和最低ζ电位(-4.5mV)的F18引起MDA-MB-231细胞的最大摄取。

当与PLGA NP相比时，由于PEG化，PEG化的PLGA NP显示显著更高的细胞摄取，特别是对于10％PEG-PLGA共聚物类型。这表明，粒径是细胞摄取的关键决定因素。荧光显微术研究确认，F18显示出在MDA-MB-231细胞中的最大摄取(图7)。虽然肽NP主要定位于细胞质区室中，但是在核周区中观察到一定的荧光强度(图7G-L)。细胞对香豆素6溶液的摄取显示出最小的内化作用(图7D-F)。基于纳米颗粒系统的这些定量和定性的结果，被评价的10％PEG化的PLGA NP显示出最大的细胞摄取。此外，肽纳米颗粒在RanGDP被定位在其中的细胞质中的定位可以介导阻断肽和RanGDP之间的相互作用。由于这些观察结果，由于F18在测试癌细胞中的增强的细胞摄取，其被选择用于进一步研究。

体外细胞毒性

肽装载的NP对MDA-MB-231细胞系的细胞毒性作用在2μM、4μM和8μM的游离肽和肽装载的NP(F18)处理24小时、48小时、72小时和96小时后通过MTT测定评价。产生剂量作用曲线以检测引起50％生长抑制的药物浓度(IC50)。结果表明，空白NP和在该研究中评价的浓度的游离肽对乳腺癌细胞不具有显著的细胞毒性(图8)。游离肽缺乏显著的细胞毒性可能反映了由于该特定肽跨越细胞膜的低效转运，仅小量的游离肽到达细胞质。肽装载的NP降低细胞存活力，并且持续到治疗后多达4天，实现了持续的细胞毒性作用。肽装载的10％PEG-PLGA NP在MDA-MB-231细胞中的平均IC50值为3.6μM，这是在24小时内达到的。纳米颗粒(NP)可以将肽递送至其亚细胞位点，保护其免于降解，并且使得能够与RCC1的相互作用，并且因此抑制RanGDP-RCC1。在处理24小时、48小时、72小时和96小时后，当与游离肽相比时，肽装载的纳米颗粒(NP)实现更低的细胞存活力和更大的细胞毒性。

细胞周期分析

对MDA-MB-231细胞的细胞周期分析的结果揭示，用肽装载的纳米颗粒(NP)处理的癌细胞被阻滞在G0/G1期和G2/M期的有丝分裂阶段。肽装载的纳米颗粒(NP)在48小时后显示更强的作用。分别与使用类似浓度的24小时后14.2％和37.7％结果相比，在4μM和8μM浓度的肽装载的NP在48小时后引起31.2％和55.4％的显著更高的G0/G1期阻滞。同时，在肽装载的NP处理后，细胞的生长速率也被减少，而用游离肽处理的细胞未受影响。这确认了肽通过抑制RanGTP形成对Ran的阻断作用及其在细胞有丝分裂中的作用。

Ran活化测定

RAN活化测定的结果提供于图14中。在该图中，泳道1为阳性对照(活化的Ran蛋白)；泳道2，MDA MB-231细胞裂解物；泳道3，装载GDP并与RanBP1琼脂糖珠孵育的MDA MB-231细胞裂解物(阴性对照)；泳道4，装载与RanBP1琼脂糖珠孵育的GTPγS的MDA MB-231细胞裂解物(阳性对照)；泳道5，用SEQ ID 5的肽处理的MDA MB-231细胞裂解物；泳道6，装载GD并用SEQ ID 5的肽处理的MDA MB-231细胞裂解物；和泳道7，装载GTPγS并用与RanBP1琼脂糖珠孵育的SEQ ID 5的肽处理的MDA MB-231细胞裂解物。

该实验证明，SEQ ID 5的肽抑制剂扰乱天然细胞中Ran-GDP和RCC1之间的相互作用(比较泳道2与泳道5)。该实验还显示，SEQ ID 5的肽抑制剂扰乱远离GTP结合袋的RanGDP-RCC1之间的相互作用(比较泳道4&泳道7)。从这些结果中可以得出结论，SEQ ID 5的肽抑制剂通过结合通常在RanGDP-RCC1复合物的形成或稳定中结合RanGDP的区域中的RCC1来干扰Ran-RCC1之间的正常相互作用。

序列表

<110> 布拉德福德大学

<120> 肽及其纳米颗粒制剂

<130> P10120WO01

<160> 21

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Ala Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys Leu Val Leu Val

1 5 10 15

Gly Asp Gly Gly Thr Gly Lys Thr Thr Phe Val Lys Arg His Leu Thr

20 25 30

Gly Glu Phe Glu Lys Lys Tyr Val Ala Thr Leu Gly Val Glu Val His

35 40 45

Pro Leu Val Phe His Thr Asn Arg Gly Pro Ile Lys Phe Asn Val Trp

50 55 60

Asp Thr Ala Gly Gln Glu Lys Phe Gly Gly Leu Arg Asp Gly Tyr Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Ala Gln Cys Ala Ile Ile Met Phe Asp Val Thr Ser Arg Val

85 90 95

Thr Tyr Lys Asn Val Pro Asn Trp His Arg Asp Leu Val Arg Val Cys

100 105 110

Glu Asn Ile Pro Ile Val Leu Cys Gly Asn Lys Val Asp Ile Lys Asp

115 120 125

Arg Lys Val Lys Ala Lys Ser Ile Val Phe His Arg Lys Lys Asn Leu

130 135 140

Gln Tyr Tyr Asp Ile Ser Ala Lys Ser Asn Tyr Asn Phe Glu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Leu Trp Leu Ala Arg Lys Leu Ile Gly Asp Pro Asn Leu Glu Phe

165 170 175

Val Ala Met Pro Ala Leu Ala Pro Pro Glu Val Val Met Asp Pro Ala

180 185 190

Leu Ala Ala Gln Tyr Glu His Asp Leu Glu Val Ala Gln Thr Thr Ala

195 200 205

Leu Pro Asp Glu Asp Asp Asp Leu

210 215

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Ran的N-末端序列(残基1至19)

<400> 2

Met Ala Ala Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys Leu Val Leu Val

1 5 10 15

Gly Asp Gly

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Ran的残基129-142

<400> 3

Arg Lys Val Lys Ala Lys Ser Ile Val Phe His Arg Lys Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Ran的C-末端区域(残基191至210)

<400> 4

Pro Ala Leu Ala Ala Gln Tyr Glu His Asp Leu Glu Val Ala Gln Thr

1 5 10 15

Thr Ala Leu Pro

20

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Cys Ala Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Cys Val Asp Ile Lys Asp Arg Lys Val Lys Ala Lys Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Cys Gln Tyr Glu His Asp Leu Glu Val Ala Gln Thr Thr Ala Leu

1 5 10 15

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Cys Glu Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Cys Ala Ser Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Cys Ala Gln Met Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Cys Ala Gln Gly Phe Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Cys Ala Gln Gln Arg Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Cys Arg Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Cys Ala Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Cys Ala Gln Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 16

Cys Ala Gln Gly Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Cys Ala Gln Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 18

Cys Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 19

Ala Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 20

Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 21

Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys

1 5

Claims

1.一种肽，所述肽由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。

2.一种RanGDP-RCC1蛋白相互作用的抑制剂，用于治疗癌症，其中所述抑制剂为根据权利要求1所述的肽。

3.根据权利要求2所述的抑制剂，其中所述癌症选自包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、血液癌、脑癌和肾癌的组。

4.根据权利要求2所述的RanGDP-RCC1蛋白相互作用的抑制剂用于制备纳米颗粒制剂的用途。

5.根据权利要求2或权利要求3所述的抑制剂的纳米颗粒制剂。

6.根据权利要求5所述的纳米颗粒制剂，其中所述纳米颗粒包含聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的纳米颗粒制剂，其中所述纳米颗粒除了包含所述抑制剂之外，还包含聚乳酸-乙醇酸共聚物/聚乙二醇(PEG)嵌段共聚物。

8.根据权利要求7所述的纳米颗粒制剂，其中PEG相对于PLGA的含量为从1％至15％。

9.根据权利要求5、6和8中任一项所述的纳米颗粒制剂，其中所述纳米颗粒具有从100nm至400nm的平均直径。

10.根据权利要求7所述的纳米颗粒制剂，其中所述纳米颗粒具有从100nm至400nm的平均直径。

11.根据权利要求1所述的肽用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗癌症。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述癌症选自包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、血液癌、脑癌和肾癌的组。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的用途，其中所述肽被配制为纳米颗粒制剂。