KR20060036476A

KR20060036476A - 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그 이용

Info

Publication number: KR20060036476A
Application number: KR1020067002626A
Authority: KR
Inventors: 마코토 사와다
Original assignee: 가부시키가이샤 티슈 타겟팅 쟈판
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2006-04-28
Also published as: EP1652855A1; JPWO2005014625A1; JP4806258B2; EP2270027A1; EP2270027B1; EP1652855A4; CN1863815A; WO2005014625A1; AU2004263458A1; US20080199436A1; JPWO2006013650A1; US7927811B2; CA2534899A1; CN100457775C; AU2004263458B2

Abstract

무질서한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 합성하여 파지(phage) 라이브러리로 포함되었다. 파지(phage) 라이브러리는 뇌 이동 활성을 가진 폴리펩티드를 스크리닝하는데 할 수 있다. 그 결과, 뇌 이동 활성을 가진 여러 폴리펩티드를 획득하였다. 상기 폴피펩티드는 공통의 서열을 포함하며, 뇌 이동 활성과 관련된 아미노산 모티브 서열을 분류하는 것에 성공했다.

Description

뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그 이용{Polypeptides having brain-disposition activity and utilization of the same}

본 발명은, 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함한 분자, 및 뇌 이동 활성을 부여하는 약제에 관한 것이다.

다른 기관보다 뇌에서 구강 섭취 또는 주사 등에 의한 투여의 효과적인 농도를 얻기 어려운 이유는 혈액뇌관문(blood brain barrier)이 존재하기 때문이다. 한편, 대량 투여를 통해 뇌 내에서 유효 약 농도를 확보할 수 있지만, 이는 말초 혈액에 과잉 약물을 주입하게 되어, 신장 또는 간 손상 같은 부작용의 원인이 될 수 있다. 그러므로 뇌에 약물을 선택적으로 이동하는 시스템을 개발하는 것이 시급한 실정이며, 많은 연구가 이루어져 오고 있다. 상당수의 연구 및 개발은 혈액뇌관문(bloon brain barrier)를 쉽게 통과하기 위하여, 지용성이 높은 물질이 뇌혈관내 내피세포(cerebrovascular endothelial cell)을 통과하기 쉽다는 성질을 이용하여 약물의 화학적 변형을 통해 약물의 뇌 이동을 촉진시키는 작용과 연관되어 있다. 상기 방법은 약물의 뇌 이동을 최대 수 배정도 개선시키지만, 전체적으로는 거의 오차 범위에 머무는 것에 지나지 않는다. 말초 기관에서 물질이 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)의 세포 간격(intercellular space)으로 투과하는 것과는 반대로, 뇌혈관내 내피세포의 세포(cerebrovascular endothelial cell)의 세포 간격(intercellular space)은 밀착대(tight junction)이라 불리는 특별한 구조를 이루고 있으며, 상기 구조를 통한 혈액 구성 성분의 투과를 거의 볼 수 없다. 그러므로 뇌로의 물질 이동은 물질이 지용성을 가지도록 화학적 변형을 거친 후 세포막으로 직접적으로 투과하도록 해야 한다. 즉, 상기 방법은 말초 장기와는 달리 뇌로의 물질 이동을 위한 우회 방법이 없으므로, 직접적으로 세포 안으로 물질을 투과시키는 것이다. 그러나 지금까지의 메카니즘은 통상의 방법과 달라 그 효율이 수천 또는 수만 배 낮아 뇌 특이적인 약물 이동이라 할 수 없다.

최근 기술적 진보에 따라, 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)에서 발현되는 막 표면 단백질을 표적화하는 방법이 개발되었다. 특히 상기 방법은 뇌 내로 약물을 이동하기 위해 수용체(transporter) 단백질 기능을 이용하므로 효과적이다. 위에서 설명한 바와 같이 세포 간격(intercellular space)을 통한 뇌로의 물질 투과가 거의 없기 때문에, 혈액의 아미노산 또는 당분은 혈액뇌관문(blood brain barrier) 상에서 발현하는 수용체(transporter)에 특이적으로 결합하여 뇌로 이동된다. 트랜스페린 수용체(transferrin receptor)는 수용체 분자(transporter molecule)로서 트랜스페린(transferrin)을 뇌로 이동한다. 트랜스페린 수용체(transferrin receptor)는 뇌 활동에 필수적인 금속효소(metalloenzyme)에 금속 이온을 공급한다. 트랜스페린 수용체(transferrin receptor)를 목적으로한 특이적인 항체를 사용하면 약물의 뇌 수송을 수십배 에서 100배 정도 증가시킬 수 있다고 보고되었다(Ningya Shi and William M. Pardridge, Noninvasive gene targeting to the brain. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97(13):7567-7572, 2000).

그러나 트랜스페린 수용체(transferrin receptor)는 뇌혈관내 내피세포(cerebrovascular endothelial cell)뿐 아니라 간장 및 신장에서도 다량으로 발현된다. 그러므로 상기 시스템을 사용하면 뇌로의 약물 이동 양을 증가시킬 뿐 아니라, 간장 및 신장에도 약물이 도입된다. 따라서, 상기 시스템을 뇌 특이적 이동이라 말하기 어렵다. 그에 더하여, 몇몇 수용체 분자(transporter molecule)와 P-당단백질(P-glycoprotein)같은 항이동 분자(antiporter molecule)를 사용하는 시스템이 보고되었으나 모두 유효성이 확인되지 않았다.

이와는 별도로, 최근 특수 기능성 펩티드를 이용하는 방법이 개발되었다. PTD 서열(PTD sequence)라 불기는 상기 펩티드는 HIV tat 유전자 생산물이 세포핵으로 전위하기 위해 필요한 펩티드 서열로 밝혀졌다. 상기 펩티드는 핵막(neclear membrane)뿐 아니라 모든 종류의 세포막(cell membrane)을 통과하며(Steven R. Schwarze, Alan Ho, Adamina Vocero-Akbani, and Steven F. Dowdy, In Vivo Protein Transduction: Delivery of a Biologically Active Protein into the Mouse. Science 285:1569-1572, 1999), 혈액 내에 주입하면 전신의 장기에 분포할 수 있다. PTD 서열(PTD sequence)은 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)의 세포막을 통과할 수 있으므로 뇌로 물질을 전송할 수 있다. 그러나 말초 장기의 경우 세포막을 통한 PTD 서열(PTD sequence)-매개 이동 및 세포 간격을 통한 투과 모두 효과적이나, 세포 간격을 통한 투과는 뇌에서 일어나지 않으므로 다른 기관에 비해 물질 투과성은 극심하게 낮아진다. 그러므로 상기 기 술 또한 뇌 특이적이라 할 수 없다.

한편, 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)의 기관별 특이성을 규정하는 분자에 대해 최근 보고되었다. 기관의 역할과 특이성에 따라, 전신의 각각 자기는 다른 영양 요구성이나 혈액으로부터 공급되는 여러 가지 인자의 필요도가 다르다. 그러므로 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)는 그 존재 장소에 의해 조금식 다른 특성을 가지는 것이 서서히 밝혀지고 있다. 그에 더하여 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell) 는 혁액 중 존재하는 염증 세포(inflammatory cell) 및 면역 세포(immune cell)와의 직접적인 접점이 됨으로서, 염증이나 병이 진행될 때 상기 세포들이 침윤하는 것을 조절한다. 침입한 세포는 염증시 나타나는 염증성 자동 추적 수용체(inflammatory homing receptor)가 인식하여 병소에 집적되며, 그뿐 아니라 조직 특이적인 혈관내 내피 세포 마커 분자(세포내 우편번호(zip code)라 칭함)가 인식하고 있다고 밝혀졌다. 아직 상기 분자의 역할은 정확히 밝혀지지 않았지만, 상기 분자를 표적화하면 장기의 혈관내 내피 세포까지 표적화 할 수 있다고 생각되어 주목받고 있다(Renata Pasqualini, Erkki Ruoslahti, Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature 380:364-366, 1996).

본 발명은, 이러한 상황을 기초로하여 완성된 것으로서, 본 발명의 목적은 뇌 이동의 활성과 관련된 인자(모티브 서열)를 발견하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 뇌 이동의 활성을 가지는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 분자, 뇌 이동의 활성을 부여하는 약제에 관한 것이다.

본 발명자들은 상기 언급한 과제를 해결하기 위하여 연구를 수행하였다. 세포가 조직으로 침입하는 메카니즘에는 세포 간격을 통과하는 경로(이상세포 경로 : paracellular pathway)와 세포 안을 통과하는 경로(막횡단 경로 : transcellular pathway)가 있다. 막횡단 경로(transcellular pathway)는 특이적 상황에서 발생한다고 추측되고 있다. 본 발명자들은 신경교세포(microglia)가 혈관뇌관문(blood brain barrier)을 손상시키지 않고 뇌 내에 침입하는 현상을 연구하면서, 상기 세포가 막횡단 경로(transcellular pathway)를 유도하는 분자를 가지고 있음을 발견했다(Sawada, M., Imai, F., Suzuki, H., Hayakawa, M., Kanno, T., Nagatsu, T., Brain-specific gene expression by immortalized microglial cell-mediated gene transfer in the mammalian brain. FEBS Lett 433:37-40, 1998).

본 발명자들은 상기 분자의 활성 부위의 펩티드 단편을 사용하여 지금까지 불가능했던 뇌-특이적 표적화 및 물질 이동에 사용할 수 있다는 가설에 도달하였다.

상기 서술한 매카니즘을 유도하는 리간드 분자(ligand molecule)은 신경교 세포(microglia)에 존재하므로, 본 발명자들은 신경교 세포(microglia)에서 mRNA를 분리하고, cDNA 라이브러리(library)를 제작하여 T7 파지(phage)와 혼합하여 뇌 이동 활성을 발현하게 된 파지(phage)를 스크리닝하여 여 상기 리간드 분자를 성공적으로 분리하여 밝혔다.

그에 더하여 본 발명자들은 무작위 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 합성하였고, 상기 DNA를 파지 라이브러리(phage library)와 혼합하여 뇌 이동 활성을 가진 폴리펩티드를 스크리닝하였다.

그 결과, 본 발명자들은 뇌 이동 활성을 가진 복수의 폴리펩티드를 획득하였고, 성공적으로 뇌 이동 활성에 연관된 아미노산 모티브 서열 및 상기 서열의 특성을 발견하였다.

그에 더하여 상기 서술된 모티브 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 피검 동물에 투여하여 상기 폴리펩티드가 뇌 이동 활성을 가지고 있는지 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드가 뇌로 이동하는 매카니즘을 밝히고, 상기 폴리펩티드가 막횡단 경로(transcellular pathway)를 통하여 뇌 조직으로 이동함을 밝혔다. 더욱 특이적으로 본 발명의 펩티드는 전이 유도 활성을 부여하는 분자로서 매우 유용하다.

본 발명의 아미노산 모티브 서열을 포함하거나 상기 아미노산의 특징을 가지는 폴리펩티드는 뇌 이동 활성도를 가질 것이라 생각된다. 그러므로 본 발명자들은 상기 폴리펩티드를 첨가한 분자들은 심지어 파지 입자(phage particle)같은 큰 분자도 뇌 이동 활성을 가짐을 밝혔다. 본 발명자들에 의해 밝혀진 모티브 서열을 포함하는 폴리펩티드는 임의의 분자와 결합하여 상기 분자에 뇌 이동 활성을 부여하는 것이 가능하므로, 모티브 서열을 포함하는 폴리펩티드는 뇌 이동 활성을 부여하는 약제로서 사용할 것이라 생각된다.

상기에서 기술한 것과 같이 본 발명자들은 상기에서 언급한 문제들을 해결하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 뇌 이동 활성도를 가지는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 분자, 및 뇌 이동 활성도를 부여하는 약제에 대한 것으로서, 더욱 구체적으로

(1) 알칼리성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 10%이상 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드(뇌 이동 폴리펩티드);

(2) 환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 펩티드 영역에 있어 알칼리성 아미노산 잔기(K 또는 R)가 10%이상 포함되는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

(3) 환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 펩티드 영역에 적어도 1 이상의 알칼리성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 가지는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

(4) 환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 펩티드 영역에 적어도 1 이상의 알칼리성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 가지는 한편, 상기 환상(cyclic) 영역의 나머지의 아미노산 잔기 중 80%이상이 G, A, V, L, S, T, P, Q, H, N 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

(5) 하기의 아미노산 모티프 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 운성 활성을 가지는 폴리펩티드;

X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁ _,

이 중, X₁는 S, T, N, P, V 또는 L, X₃는 임의의 아미노산, X₄는 G, S, T, C, N, L, Q, 또는 Y를 나타낸다,

(6) (2)항 내지 (4)항에 있어서, 환상(cyclic) 영역에 (5)항에 기재된 아미노산 모티프 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

(7) (5)항 또는 (6)항에 있어서, 아미노산 모티프 서열이 하기의 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁ _,

이 중, X₁는 S, T, N, P 또는 V, X₃는 임의의 아미노산, X₄는 비전하 극성 아미노산(G, S, T, C, N, Q, Y)을 나타낸다,

(8) (5)항 또는 (6)항에 있어서, 아미노산 모티프 서열이 하기의 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드,;

X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁ _,

이 중, X₁는 S, T, P 또는 L, X₃는 임의의 아미노산, X₄는 S, T, C, L, 또는 Q를 나타낸다,

(9) (1)항 내지 (8)항에 있어서, 전이 이동(transmigration) 유도 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

(10) (1)항 내지 (8)항에 있어서, 뇌 혈관 내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)와 결합하는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

(11) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

(a) 서열 번호 1 내지 12 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,

(b) 상기 (a)의 폴리펩티드의 양쪽 말단의 시스테인(cysteine) 끼리 이황 결합(disulfate bond)에 의해 환상(cyclic) 펩티드 영역을 포함하는 폴리펩티드, 및

(c) 서열 번호 1 내지 12 중 어느 하나에 하나 또는 몇 개의 아미노산이 부가(addition), 결실(deletion) 또는 치환(substitution)된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

(12) (1)항 내지 (11)항에 있어서, 폴리펩티드의 길이가 9 아미노산 이내인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

(13) (1)항 내지 (12)항의 폴리펩티드을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(14) (1)항 내지 (12)항의 폴리펩티드와 결합하는 항체;

(15) (1)항 내지 (12)항의 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 임의의 분자에 뇌 이동 활성을 부여하는 약제;

(16) (15)항에 있어서, 임의의 분자가 임의의 폴리펩티드인 것을 특징으로 약제;

(17) (1)항 내지 (12)항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 분자;

(18) (17)항에 있어서, 파지 입자(phage particle) 또는 상기 파지 입자(phage particel)의 외피 단백질(coat protein)인 것을 특징으로 하는 분자;

(19) (17)항에 있어서, (1)항 내지 (12)항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 분자;

(20) (1)항 내지 (12)항 중 어느 한 항의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 뇌 이동 전달자(carrier);

(21) (1)항 내지 (12)항 중 어느 한 항의 폴리펩티드가 미셀(micelle), 리포솜(liposome), 마이크로캅셀(microcapsule)과 결합하는 것을 특징으로 하는 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 전달자(carrier);

(22) (20)항 또는 (21)항의 뇌 이동 전달자(carrier)에 의해 약물이 담지된 구조인 것을 특징으로 하는 뇌 질환 치료제;

(23) (1)항 내지 (12)항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 임의의 분자와 결합시키는 과정을 포함하는 뇌 이동 활성을 가지는 분자의 제조 방법;

(24) 하기의 (a) 내지 (c) 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성 단백질 분자의 제조 방법:

(a) 발현 가능한 상태로 임의의 단백질 분자를 코딩하는 DNA와 (1) 내지 (12) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 결합한 구조의 DNA를 포함하는 발현 벡터를 제작하는 과정,

(b) (a)의 제작한 발현 벡터를 세포에 도입하는 과정,

(c) (a)의 발현 벡터로부터 발현 산물을 회수하는 과정;

(25) 하기의 (a) 및 (b) 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 임의의 분자를 사람을 제외한 동물의 뇌에 이동하는 방법:

(a) 임의의 분자와 (1) 내지 (12) 중 어느 하나의 폴리펩티드와 결합한 구조의 뇌 이동 활성을 가지는 분자를 제조하는 과정,

(b) (a)의 분자를 사람을 제외한 동물 체내에 투여하는 과정;

(26) 하기의 (a) 내지 (c) 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1)항 내지 (12)항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 결합 활성을 가지는 분자를 스크리닝하는 방법:

(a) (1) 내지 (12) 중 어느 하나의 폴리펩티드와 피검 분자를 접촉하는 과정,

(b) 상기 폴리펩티드와 피검 분자와의 결합 활성을 검출하는 과정,

(c) 상기 폴리펩티드와 결합하는 분자를 선택하는 과정;

(27) 하기의 (a) 내지 (d) 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성 폴리펩티드의 스크리닝 방법:

(a) 피검 폴리펩티드를 파지 외피 단백질(phage coat protein) 상에 전시시킨 파지 입자(phage particle)를 제작하는 과정,

(b) 상기 파지 입자(phage particle)를 사람을 제외한 동물에게 투여하는 과정,

(c) 상기 동물의 뇌조직으로부터 파지 입자(phage particle)를 회수하는 과정,

(d) (c) 과정에서 회수된 파지 입자(phage particle)에 전시된 피검 폴리펩티드를 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드로 선택하는 과정;

(28) (27)항에 있어서, 피검 폴리펩티드는 (5)항, (7)항 및 (8)항 중 어느 한 항의 아미노산 모티브 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법;

(29) (27)항에 있어서, 파지(phage)는 M13 파지(phage), 또는 T7 파지(phage)인 것을 특징으로 하는 방법;

(30) (27)항에 있어서, (a) 과정 다음에 뇌혈관 내피 세포(crebrovascular endothelial cell)과 결합하는 파지(phage)를 스크리닝하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법,

을 제공하는 것이다.

본 발명은 뇌 이동 활성을 가진 폴리펩티드를 제공한다. 일반적으로 혈액에서 뇌 조직으로의 물질 이동은 혈액뇌관문(blood brain barrier)이라는 구조에 의해 제한된다. 상기 구조는 유해물질로부터 뇌를 보호한다. 본 발명에서 "뇌 이동 활성"은 폴리펩티드 등의 분자가 체내에 투여되었을 때(예: 정맥 투여), 상기 분자가 뇌 조직 내로 이동되는 활성을 말한다. 본 발명의 폴리펩티드는 뇌 이동 활성(뇌 이동 폴리펩티드)를 가진 폴리펩티드라 할 수 있으나, 예로서 혈액뇌관문의 통과 능력 또는 전이 유도 활성(transcytosis)을 가진 폴리펩티드라고 표현하는 것도 가능한다. 본 발명의 폴리펩티드는 다른 물질(분자)에 결합하여 뇌로 이동시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 "뇌 이동 활성을 부여하는 폴리펩티드", "뇌 이동 펩티드 태그(tag)", 또는 "뇌 이동 활성을 부여하는 약제"라고 표현할 수 있다.

그에 더하여 본 발명자들은 9개 아미노산 길이의 폴리펩티드가 다른 물질(분자)에 대하여 유효한 뇌 이동 활성을 부여함을 밝혔다. 그러므로 적어도 9개 아미노산 정도의 짧은 폴리펩티드도 다른 분자에 유효한 뇌 이동 활성을 부여한다고 말할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 길이는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 100개 아미노산 이내이며, 바람직하게는 15개 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 9개 아미노산 이내이며, 가장 바람직하게는 4 내지 9개 아미노산 길이이다.

후술하는 실시예의 실험에 의해, 하기의 서열을 가지는 폴리펩티드는 뇌 이동 활성을 가지는 것이 판명되었다.

명칭	아미노산 서열
T2J001	CSNLLSRHC　(서열 번호：1)
T2J002	CSLNTRSQC　(서열 번호：2)
T2J003	CVAPSRATC　(서열 번호：3)
T2J004	CVVRHLQQC　(서열 번호：4)
T2J004V3L	CVLRHLQQC　(서열 번호：5)
T2J006	CRQLVQVHC　(서열 번호：6)
T2J007	CGPLKTSAC　(서열 번호：7)
T2J008	CLKPGPKHC　(서열 번호：8)
T2J009	CRSPQPAVC　(서열 번호：9)
T2J012	CNPLSPRSC　(서열 번호：10)
T2J013	CPAGAVKSC　(서열 번호：11)
T2J013V6L	CPAGALKSC　(서열 번호：12)

본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 구현예는 하기의 (서열 1)에 기재된 아미노산 모티브 모티프 서열, 보다 바람직하게는(서열 2) 기재된 아미노산 모티프 서열, 또는 (서열 3)에 기재된 아미노산 모티프 서열을 포함한 폴리펩티드이다. 이를테면, 본 발명의 바람직한 구현예는 하기의(서열 1) 내지(서열 3)의 아미노산 모티브 서열 중 어느 하나를 적어도 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

(서열 1) X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁

이 중, X₁는 S(세린:serine), T(트레오닌:threonine), N(아스파라긴:asparagine), P(프롤린:proline), V(발린:valine) 또는 L(루이신:leucine)；

X₃는 임의의 아미노산；

X₄는 G(글리신:glycine), S(세린:serine), T(트레오닌:threonine), C(시스테인:cycsteine), N(아스파라긴:asparagine), L(루이신:leucine), Q(글루타민:glutamine), 또는 Y(타이로신:tyrosine)을 나타낸다.

(서열 2) X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁

이 중, X₁는 S(세린:serine), T(트레오닌:threonine), N(아스파라긴:asparagine), P(프롤린:proline), 또는 V(발린:valine), 더욱 바람직하게는 S 또는 T;

X₃는 임의의 아미노산；

X₄는 G(글리신:glycine), S(세린:serine), T(트레오닌:threonine), C(시스테인:cycsteine), N(아스파라긴:asparagine), Q(글루타민:glutamine), 또는 Y(타이로신:tyrosine), 더욱 바람직하게는 T, Q 또는 C을 나타낸다. 또한 상기 (R 또는 K)는 더욱 바람직하게는 R이다.

이러한 아미노산(G, S, T, C, N, Q, Y)은, 비전하 극성 아미노산으로 분류된다.

(서열 3) X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁

이 중, X₁는 S(세린:serine), T(트레오닌:threonine), P(프롤린:proline), 또는 L(루이신:leucine)；

X₃는 임의의 아미노산；

X₄는 G(글리신:glycine), S(세린:serine), T(트레오닌:threonine), C(시스테인:cysteine), L(루이신:leucine), 또는 Q(글루타민:glutamine)을 나타낸다.

본 명세서의 아미노산은 일반적으로 사용되는 한 글자 표기(예를 들면, R는 아르기닌, K는 리신)로 기술하였다. 또한, 일반적인 기재 방법으로 N-말단(terminus)부터 C-말단(terminus) 방향 순서로 아미노산 서열을 기술하였다.

본 발명자는 상기 펩티드가 환상(cyclic)화 구조(보다 구체적으로 ,상기 펩티드의 말단의 시스테인(cysteine) 간에 이황 결합(S-S 결합)이 형성되어 환상화됨)를 가지는 폴리펩티드가 한층 더 높은 뇌 이동 활성을 가지는 것을 밝혔다.

따라서 본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 구현예는 환상(cyclic) 구조를 가지는 폴리펩티드이다. 본 발명에서 상술된 모티브 서열을 환상(cyclic) 영역을 구성하는 폴리펩티드에서 찾아낼 수 있다.상기 모티브 서열을 구성하는 아미노산은 4개의 아미노산 잔기로부터 구성된다. 인접하는 아미노산은 보통 서로 펩티드 결합(peptide bond)을 형성하지만, 이들이 시스테인(cysteine) 잔기 일 때 이황 결합(disufide bond)를 형성할 수 있다. 본 발명의 모티브 서열의 "인접한 4개의 아미노산 잔기"는 서로 펩티드 결합을 형성하고 있는 경우에 제한되지 않고, 인접하는 아미노산이 시스테인(cysteine)인 경우에는, 이황 결합(disulfide bond)를 형성할 것이다. 더욱 상세하게는, 상기(서열 1〕내지(서열 3)의 "－"는 통상적으로 펩티드 결합을 의미하지만, 인접하는 아미노산이 시스테인(cysteine)인 경우에는 상기 "－"는 이황 결합(S-S결합)을 뜻한다. 예를 들면, 본 발명의 모티브 서열을 직쇄상(straight-chain) 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 발견할 수 없어도, 환상(cyclic) 구조를 형성함으로써 인접한 아미노산에 의해 본 발명의 모티프가 형성되는 경우가 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예는 상술된 4개의 아미노산으로 구성된 모티프 서열을 포함하는 폴리펩티드라면 상기 모티프 서열 이외의 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않는다.

표 1에 기재된 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드는 하기의 특성을 가진다.

환상(cyclic) 구조를 형성할 수 있는 폴리펩티드 영역(즉, 양쪽 말단의 시스테인(cysteine)을 제외한 아미노산 서열)에 있어서, (1) 모든 폴리펩티드에는 염기성 아미노산의 K 또는 R가 포함되며, (2) 나머지 아미노산 잔기는 다음의 10종의 아미노산[G, A, V, L, S, T, P, Q, H, N] 중에서 선택된 것으로 구성된다.

그러므로 본 발명의 바람직한 구현예에서는 환상(cyclic) 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 영역에 적어도 1 이상의 염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 가지고, 상기 환상(cyclic) 영역의 나머지 아미노산 잔기는 [G, A, V, L, S, T, P, Q, H, N]로 이루어진 아미노산 그룹으로부터 선택되는 것을(일반적으로 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%)을 특징으로 하는(이러한 특징은 본 명세서의 "특징 1"로 기재함) 뇌 이동 활성을 가진 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예는 상기 "특징 1"을 가지는 폴리펩티드이며, 본 발명의 모티프 서열((서열 1) ~(서열 3))을 포함하는 폴리펩티드이다.

그에 더하여, "특징 1"에 대하여 상술한 것처럼, 본 발명의 모든 폴리펩티드는 염기성 아미노산(K 또는 R)이 포함되는 특징이 발견되었다. 예를 들면, 실시예에서 사용된 9개 아미노산의 폴리펩티드에서는 적어도 1개의 염기설 아미노산이 발견되었다(전체 아미노산에 대한 함유율은, 1/9=0.11(11%) 또는 그 이상이다).

그러므로, 본 발명은 하기의 폴리펩티드를 제공한다:

(a) 염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 10%이상 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

(b) 환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 펩티드 영역에 염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)가 10%이상 포함되는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

(c) 환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 펩티드 영역에 적어도 1 이상의 염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 운성 활성을 가지는 폴리펩티드.

본 발명의 폴리펩티드의 상기 길이 상한선은 특별히 제한되는 것은 아니다. 통상적으로 상기 4개의 아미노산 서열의 모티브 또는 상기 "특징 1"을 가지는 7개의 아미노산 또는 그 이상의 길이의 폴리펩티드라면 효과적은 뇌 이동 활성을 가질 것이라 사료된다. 길이의 상한에 대해서도 특히 제한되지 않지만, 일반적으로 50개 아미노산 길이 또는 그 이하, 바람직하게는 35개 아미노산 길이 또는 그 이하의 폴리펩티드는 충분히 뇌 이동 활성을 가지는 것이라고 사료된다. 또한, 상기 폴리펩티드를 포함하는 긴 폴리펩티드도 일반적으로 뇌 이동 활성을 가지므로 본 발명의 폴리펩티드의 길이를 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 환상(cyclic)화 되는 폴리펩티드 영역의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명자는 양쪽 말단에 시스테인(cysteine) 잔기로 구성된 9개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 사용하여 환상(cyclic)화된 펩티드를 일례로 실험에서 보여주었다. 즉, 예를 들면, 10개의 아미노산 혹은 그 이상의 길이의 환상(cyclic) 구조를 가지는 폴리펩티드라도, 본 발명의 모티프 서열 혹은 상술의 "특징 1"을 가지는 폴리펩티드이면, 뇌 이동 활성을 가지는 것이라고 생각된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 환상 펩티드 영역의 길이는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 100개 아미노산 이내이며, 바람직하게는 50개 아미노산 이내이며, 보다 바람직하게는 4~30개 아미노산이며, 더욱 바람직하게는 4~15개 아미노산이며, 한층 더 바람직하게는 4~9개 아미노산이며, 가장 바람직하게는 4~7개 아미노산이다.

또한 바람직한 구현예에서는, 본 발명의 폴리펩티드는 하기의 (A) 및/또는(B)의 기능(활성)을 가지는 것을 특징으로 한다.

(A) 전이(transmigration) 유도 활성(transcytosis) 유도 활성

(B) 뇌혈관내 가죽 세포(cerebrovascular endothelial cell)와 결합하는 활성.

상기(A)의 "전이(transmigraion)"란, 어느 분자가 뇌에 침입할 때, 혈관내 내피세포(vascular endothelial cell)의 세포 간격을 통과하는 것이 아니라, 혈관내 내피세포(vascular endothelial cell) 안을 통과하는 현상을 말한다. 이것은 "trans-endothelial cell migration" "trans cellular pathway" 또는 "transcytosis" 라고 칭한다. 상기 매카니즘에 의해 혈관내 내피세포(vascular endothelial cell)를 통과하는 분자(세포 등)는 그 표면에 신호 분자를 가지며, 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell) 표면상에 있는 수용체를 개입시켜 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)에 상기 현상을 유도하는 것이라고 사료된다(도면 1).

본 발명의 폴리펩티드는 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)에서 상기 전이(transmigration) 유도 활성을 가지는 것이라고 사료된다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 전이(transmigration)를 유도하기 위한 신호 분자로서의 역할을 담당하는 것이라고 사료된다.

상기 신호 분자는 전이(transmigration)의 초기 단계에서 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)(예를 들면, 상기 세포 상의 수용체)와 결합하는 것이라고 생각된다. 따라서, 바람직한 구현예에서는, 본 발명의 폴리펩티드의 특성 중 하나는 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)와 결합하는 활성을 가지는 것이다.

임의의 피검 분자가 상기(A)의 전이(transmigration) 유도 활성을 가지는지 또는 상기 (B)의 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)와 결합하는지 여부는 당업자에 알려진 공지의 방법을 이용해 평가할 수 있다. 일례로서, 형광 표지(fluorescence-labeled)한 피검 분자를 혈관 내에 투여하고, 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)의 동결 절편을 형광 현미경에 의해 관찰함으로써 평가할 수 있다. 또한, 형광 표지된 피검 분자가 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)와의 결합을 관찰되면, 피검 분자는 상기(B)의 활성을 가지는 것과 판정되며, 또한, 형광 표지 된 피검 분자가 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell) 안에서 관찰되면, 피검 분자는 상기(A)의 활성을 가지는 것으로 판정된다.

상기 형광 표지 방법 이외에, 아이소토프 표지(isotope label) 또는 PET 리간드 표지, 마그네타이트(magnetite) 등과 결합시켜 MRI로 검출하는 방법 등이 있다. 상술한 in vivo 방법 이외의 방법으로는, 예로서, 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell) 배양시 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 유도하여 상술한 피검 분자를 투여할 수 있다. 투여한 피검 분자가 혈액뇌관문(blood brain barrier)를 투과하는지 확인하여 상기 (A)의 활성을 가지는지 판정할 수 있고, 세척 후 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)에 피검 분자가 접착하고 있으면 ,상기 (B)의 활성을 가지는 것으로 판정된다.

또한, 본 발명에서 "뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)"는 마우스 MBEC4, 시판되는 사람 유래 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell) BBEC, 우뇌 유래의 일차 배양 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)의 세포, 또는 말초 혈관 유래 혈관내 내피 세포(vascular endothelial cell)와 성상 세포(astrocyte)를 공동 배양하여 혈액뇌관문(blood braion barrier) 기능을 유도한 것 등을 나타낼 수가 있다.

당업자는 상기 세포를 이용하여 임의의 폴리펩티드(합성 펩티드) 또는 상기 펩티드로 구성된 분자의 상기 (A) 또는 (B) 활성 평가를 실시하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 활성도는 하기 실시예에 기재된 방법에 의해, 평가할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 표 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그러나 이는 본 발명의 폴리펩티드의 일례이며, 본 발명의 폴리펩티드는 이에 한정되지 않는다. 본 발명자들은 후술된 실시예에서 표 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 외피 단백질(coat protein)에 발현시킨 파지 분자(phage molecule)가 뇌 이동 활성을 가짐을 밝혔다.

따라서 본 발명은, 하기 (a)~(c) 중 어느 하나로 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

(a) 서열 번호：1~12 중 어느 하나로 기재된 아미노산 서열로부터 구성되는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드의 양쪽 말단의 시스테인(cysteine)끼리 이황 결합(disufide bond)에 의해 환상(cyclic)화된 펩티드 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

(c) 서열 번호：1~12 중 어느 하나로 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 부가(addition), 결실(deletion) 또는 치환(substitution)된 아미노산 서열로 구성된 뇌 이동 활성을 가진 폴리펩티드.

상기 (c)에 대해서, 아미노산 부가(addition), 결실(deletion) 또는 치환(substitution)은 본 발명의 (서열 1)~(서열 3) 이외의 아미노산, 및/또한 본 발명의 "특징 1"을 가지는 폴리펩티드에서 일어나는 것이 바람직하다. 또한 일반적으로 "몇 개"란 2~9의 범위의 수를 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드가 뇌 이동 활성을 나타내는 대상이 되는 생물은 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 가지는 동물이면 특히 제한되지 않지만, 통상적으로 포유동물이며, 바람직하게는, 마우스, 래트, 모래 쥐, 고양이, 소, 원숭이, 혹은 사람이다.

또한 본 발명의 폴리펩티드는 천연 단백질 유래 폴리펩티드, 재조합 단백질 유래 폴리펩티드, 또는 화학 합성 폴리펩티드 등 어느 폴리펩티드도 가능하다. 당업자에 있어서, 임의의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 합성하는 것이 가능하다. 예를 들면, 상기의 모티프 서열을 포함하고, 및/또는 상기 "특징 1"을 가지는 폴리펩티드의 합성은 시판된 폴리펩티드 합성기를 이용하는 당업자에게 공지된 방법으로 실시할 수가 있다.

그에 더하여, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드란 통상적으로 DNA 또는 RNA 쌍방이 포함된다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 상기 DNA의 전사 산물인 RNA는 본 발명에 포함된다.

본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터를 이동하는 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포를 이용한 본 발명의 폴리펩티드 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 벡터로는 삽입한 DNA를 안정적으로 유지하는 것이면 특히 제한되지 않는다. 예를 들면 숙주 세포로 대장균을 이용한다면 클로닝용 벡터로서는 pBluescript 벡터(Stratagene, USA) 등이 바람직하다. 본 발명의 발현벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 이용하는 경우에 유용하다. 발현 벡터는 시험관내, 대장균내, 배양 세포내, 생물 개체내에서 폴리펩티드를 발현하는 벡터이면 특히 제한되지 않는다. 예를 들면, 시험관 내에서는 pBEST 벡터(Promega, USA), 대장균 내에서는 pET 벡터(Invitrogen, USA), 배양 세포내에서는 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물 개체내에서는 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472, 1988) 등이 바람직하다. 본 발명의 벡터로의 DNA 삽입은 제한 효소 자리(restriction enzyme site) 사이트를 이용한 리가제(ligase) 반응에 의해 실시할 수가 있다(Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology edit. Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11. 11, 1987).

본 발명의 벡터가 도입되는 숙주 세포로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 여러 종류의 숙주 세포가 이용된다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 세포로서, 예를 들면, 세균 세포(예：스트렙토코커스(Streptococcus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 바실러스 서브틸리스(Bacillus substilis)), 진균류 세포(예: 효모(Yeast), 아스퍼길루스(Aspergillus)), 곤충 세포(예: 드로소피라 S2(Drosophila S2), 스포돕테라 SF9(Spodoptera SF9)), 동물 세포(예 : CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cell), 및 식물 세포를 사용할 수 있다. 벡터의 숙주 세포 도입은 인산 칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation method), 전기 천공법(electroporation method)(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9. 9), 리포펙타민 방법(lipofectamine method)(GIBCO-BRL, USA), 미세주사법(microinjection method) 등 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.

숙주 세포에서 발현하는 폴리펩티드를 소포체(endoplasmic reticulum)의 루멘(lumen), 페리플라즘 공간(periplasmic space), 또는 세포 외 환경에 분비시키기 위해서, 적절한 분비 신호를 목적 폴리펩티드에 삽입할 수 수 있다. 이러한 분비 신호는 목적 폴리펩티드에 있어서 내인성 또는 이종 신호를 사용하여도 무방하다.

본 발명의 폴리펩티드는 배양 배지에 분비되는 경우 배양 배지를 채취하여 회수한다. 본 발명의 폴리펩티드가 세포 내에서 생산될 때 세포를 용해하여 폴리펩티드를 회수한다.

재조합 세포 배양물로부터 본 발명의 폴리펩티드를 회수해 정제하려면 황산암모늄(ammonium sulfate) 또는 에탄올 침전(erhanol precipitation), 산 추출(acidic extraction), 음이온(anion) 또는 양이온(cation) 교환 크로마토그래피(exchange chromatography), 포스포셀루로오스(phosphocellulose) 크로마토그래피, 소수성 상호작용(phosphobic interaction) 크로마토그래피, 흡착(affinity) 크로마토그래피, 히드록실아파테타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피 및 렉틴(lection) 크로마토그래피를 포함한 공지의 방법을 이용할 수가 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 뇌 이동 활성을 가지므로, 본 발명의 폴리펩티드가 결합한 분자가 뇌 이동 활성을 가지는 것이 기대된다. 본 발명자들은, 통상적으로 뇌 이동 활성이 없는 파지 입자(phage particle)이 외피 단백질(coat protein)에 본 발명의 폴리펩티드를 포함하여 실제 뇌 이동 활성을 획득하는 것을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는, 임의의 분자에 결합하여 상기 분자에 뇌 이동 활성을 부여시키는 기능을 가지는 것이라 사료된다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 분자에 뇌 이동 활성을 부여하는데 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명은 임의의 분자에 뇌 이동 활성을 부여하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약제를 제공한다. 바람직하게는 상기의 아미노산 모티프 서열, 및/또는 상기 "특징 1"을 가지는 폴리펩티드를 포함하는, 뇌에 임의의 분자를 이동하기 위한 펩티드 태그를 제공한다.

본 발명의 상기 펩티드 태그의 일례로서, 후술의 실시예에 기재된 본 발명의 펩티드와 바이오틴(biotin)과의 접합 분자(conjugate molecule)를 들 수 있다. 사기 접합 분자는 임의의 아비딘(avidin) 접합 분자와 결합시킬 수가 있다. 즉, 도면 8이 나타내는 구조를 가지는 뇌 이동 펩티드 접합 분자, 또는 후술의 실시예에 의해 구체적으로 사용된 접합 분자는 바람직한 구현으로 본 발명에 포함된다. 상기 접합 분자를 이용하여 아비딘(avidin) 접합 분자를 뇌로 이동하는 것이 가능하다. 상기 접합 분자를 이용하여 임의 분자를 뇌로 이동하는 방법 또한 본 발명에 포함된다. 그에 더하여 본 발명은 본 발명의 상기 약제에 의해 뇌 이동 활성이 부여된 분자도 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드(약제)에 의해 뇌 이동 활성이 부여되는 분자는 특별히 제한되지 않고, 천연 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 당쇄(single chain), 단백질, 펩티드 등의 단일 화합물, 및 화합물 라이브러리, 유전자 라이브러리 발현 산물, 세포, 세포 추출물, 세포 배양 상층액, 미생물, 미생물 세균 생합성물, 파지(phage), 항원, 항체, 미셀(고분자 미셀 등), 리포솜, 마이크로 캅셀, 펩티드 핵산(PNA), 의약 화합물 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 상기 분자는 필요에 따라서 적절히 표지하는 것도 가능하다. 표지로서는, 방사 표지(radioactive label), 형광 표지(fluorescence label), 효소 표지(enzyme label)등을 들 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드에 의해 뇌 이동 활성이 부여되는 분자 크기는 특별히 제한되지 않지만, 통상적으로 물리적으로 혈액뇌관문을 통과할 수 있는 정도의 크기를 상한으로 한다. 후술의 실시예에서 알려주듯이 통상의 파지(phage) 정도의 크기의 분자도 본 발명의 폴리펩티드의 작용에 의해 혈액뇌관문을 통과하는 것이 가능하다. 따라서, 상기 분자는 파지(phage)와 동일 크기를 나타내는 분자(물질)여도 무방하다. 예를 들면, 상기 분자가 아미노산으로 구성되는 경우에는, 10만개 정도의 아미노산을 함유하는 분자여도 무방하다.

당업자는 상기 분자와 본 발명의 폴리펩티드를 상기 분자의 종류를 고려하여 적당항 공지의 방법을 이용해 결합시키는 것이 가능하다.

일례로서 시판된 커플링 시약(N-결합형, COOH-결합형, 아미노산 잔기 변형형, S-S 결합형 등)을 이용하는 방법, 크로라민(chloramine) T를 이용하는 방법, 이소치아네이트기(isothiocyanate group) 등에 의해 상기 분자와 본 발명의 폴리펩티드를 결합시킬 수 있다.

또한, 상기 분자가 단백질인 경우에는, 상기 단백질과 본 발명의 폴리펩티드의 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드가 결합한 분자를 제작하는 것이 가능하다.

보다 구체적으로는, 하기의 과정을 포함하는 방법에 따라 제작할 수가 있다.

(a) 발현 가능한 상태로 임의의 단백질 분자를 코딩하는 DNA와 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 결합한 구조의 DNA를 포함하는 발현 벡터를 제작하는 과정;

(b) 상기 발현 벡터를 세포에 도입하는 과정; 및

(c) 상기 벡터로부터의 발현 산물을 회수하는 과정.

본 발명은 또한 본 발명의 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드로 구성되는 뇌 이동용 이동자(carrier)를 제공한다. 상기 이동자(carrier)는 "담체(support)" 또는 "이동체(transporter)"라고 표현할 수 있다. 본 발명의 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드도 상기 이동자(carrier)의 예로서 들 수 있다. 더욱 자세하게는, 본 발명의 폴리펩티드와 뇌에 이동해야 할 분자를 직접 결합시켜 상기분자를 뇌에 이동시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 이동자(carrier)의 바람직한 예로는, 본 발명의 폴리펩티드가 미셀(고분자 미셀), 리포솜 또는 마이크로 캅셀과 결합한 구조인 이동자(carrier)를 들 수 있다.

본 발명의 이동자(carrier)를 이용하여 원하는 약제를 뇌에 이동할 수 있다. 예를 들면, 뇌질환에 치료 효과를 가지는 화합물(의약 조성물)을 상기 이동자(carrier)에 담지하여, 상기 화합물을 효율적으로 뇌에 이동하여 유효한 치료 효과를 발휘할 수 있다. 상기 화합물(의약 조성물)을 담지시킨 이동자(carrier) 자체는 뇌질환 치료제 효과를 기대할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 상기 뇌이동용 이동자(carrier)에 약물을 담지한 구조로 구성되는 뇌질환 치료제를 제공한다. 덧붙여 상기 "담지되었다"는 약물을 이동자(carrier)와 직접 결합시킨 상태 또는 약물(의약 조성물)을 이동자(carrier)에 포함하는 상태라도 말할 수 있다.

그에 더하여 본 발명은 본 발명의 뇌 이동 활성을 가진 분자의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법의 바람직한 방법은 임의의 분자에 본 발명의 폴리펩티드를 결합시키는 과정을 포함한, 뇌 이동 활성을 가지는 분자의 제조 방법이다. 또한 상기 분자가 단백질인 경우에는, 본 발명은 바람직한 방법으로 상기 (a)~(c) 과정을 포함한 제조 방법을 제공한다.

더불어 본 발명의 폴리펩티드는 뇌 이동 활성을 부여하려는 분자의 외곽(outside)에 배치하여 상기 분자와 결합시키는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 상기분자의 표면상에 배치되도록 상기 분자와 결합시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 폴리펩티드로서 상기 모티프 서열의 양쪽 끝에 시스테인 잔기(C)를 배치시킨 서열을 포함한 폴리펩티드를 들 수 있다. 폴리펩티드 중의 2개의 시스테인 잔기의 SH기는, 통상적으로 자동 산화(autoxidation)에 의해 가교(crosslink) 결합(disulfide bond)하는 것이 알려져 있다. 이와 같이 2개의 시스테인 간에 가교 결합이 형성되는 것으로, 그 사이에 위치한 모티프 서열을 포함한 폴리펩티드 사슬이 루프 모양으로 돌출하는 것이다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드에 상기와 같은 시스테인 잔기를 도입하므로 본 발명의 폴리펩티드를 효율적으로 분자 표면(외곽)에 배치시키는 것이 가능하다. 그 외에, 본 발명의 폴리펩티드를 외곽에 배치하는 방법으로서 폴리펩티드 사슬을 도입하는 단백질 분자의 외곽에 노출된 도메인에 본 발명의 폴리펩티드를 배치하도록 재조합체를 작성하는 방법; PEG와 같은 가교제(crosslinking agent)를 단백질, 지방질, 인공 이동자(carrier) 등에 결합시켜, PEG 사슬 말단에 폴리펩티드 사슬을 결합시키는 방법; 및 폴리펩티드 사슬을 이동자(carrier) 표면에 화학 결합시키는 방법 등이 있다.

본 발명의 폴리펩티드와 결합시키는 분자로는, 뇌질환 치료를 위하여 뇌조직에 직접 이동시키는 것이 바람직한 화합물 등을 들 수 있다. 상기화합물은 본 발명의 폴리펩티드에 의해 뇌 이동 활성이 부여되어, 그 결과 체내에 투여되었을 때 효율적으로 뇌조직으로 이동되어 치료 효과를 발휘할 것이 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 뇌질환에 대한 치료 효과가 기대되는 뇌 이동 활성을 가지는 분자, 또는 상기 분자를 포함한 약제가 포함된다.

본 발명의 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용한 뇌신경 질환의 치료에 대한 치료 전략으로서 하기와 같이 본 발명을 적용하는 것이 가능하다.

1) 결손(deletion) 또는 변이(mutaion) 등에 의해 양(amount) 또는 활성이 저하된 효소 및 생리 활성 단백질을 보충하는 보충 요법：

유전자 결손이나 유전자 변이에 의해 특정의 효소 또는 단백질이 뇌내에서 결핍되는 것에 의해 생기는 여러 가지 뇌질환에 대하여 결핍된 단백질이나 효소의 유전자를 도입한 세포를 주입함으로서 행해진다. 또한, 특정 신경세포가 변성 탈락되는 파킨슨병이나 알츠하이머 병에 대하여 신경의 변성 탈락에 의해 결핍된 신경전달물질의 합성을 촉진하는 유전자를 주입함으로서 행해진다. 예로서 파킨슨병의 도파민 생합성에 연관된 타이로신 수산화 효소(tyrosine hydroxylase) 및 바이프테린 합성 효소(biopterin synthase) 등의 효소 유전자이다.

2) 변성(degeneration) 등으로 탈락되는 신경세포를 보호하거나 이들의 기능을 강화하는 보호 요법：

상기 요법은 변성 질환이나 뇌허혈 등 다양한 원인으로 생기는 신경세포사를 억제하고, 신경돌기의 재생을 촉진하는 NGF, BDNF, GDNF, NT3 같은 신경 영양 인자(최근 파킨슨병에서는 BDNF나 GNNF가 유효하다라고 하는 것이 보고되었다) 유전자를 발현하는 세포를 주입함으로서 행해진다. 또한, 다발성 경화증과 같이 면역 세포가 관여하는 질환에서는 면역 억제 작용이 있는 TGFβ나 IL-10 유전자를 발현하는 세포를 도입하는 것으로써 행해진다.

3) 종양이나 혈전 등을 제거하는 방법：

상기 방법은 항종양 작용을 가지는 인자를 발현하거나 또는 항암제를 도입한 세포를 뇌에 이동하므로서 행해진다. 혈전 제거에 대해서는 섬유소 분해 효소(fibrinolytuc enzyme)를 발현시킬 수 있다.

4) 유효한 약물을 뇌에만 도입하는 방법：

신경계에 작용하는 약물 중 일부는 높은 말초 독성을 가지며, 일부는 말초신경계에 작용하며, 또한 다른 것들은 혈액뇌관문을 통과하기 어려운 것 등이 있어, 뇌로의 특이적인 약물 이동계가 필요하다. 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 말초 장기에 그다지 영향을 주지 않고 뇌 특이적으로 약물 투여를 할 수 있을 것이다.

5) 뇌질환 예방 시스템으로의 이용법：

원래 신경교 세포(microglia)는 변성이나 염증 부위에 모여 죽은 세포를 제거하며, 손상 복구에 관련하는 성질을 가진다. 또한 신경교 세포는 항종양 작용 및 항바이러스 작용을 가지므로, 뇌내 방어 시스템 역할을 하는 세포이다. 그러므로 상기 성질을 유전자 조작 등으로 강화하므로 단일 질환의 치료 뿐 아니라, 뇌내 방어 시스템 그 자체를 강화에 의해 다양한 질환에 대한 예방 조치에도 응용할 수 있으리라 사료된다.

본 발명의 상기 약제는 본 발명의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함한 뇌 이동 활성을 가지는 분자만을 단일 성분으로 사용할 수 있으며, 또한 공지 제재 제조법에 따라 제재화할 수도 있다. 예를 들면 약제로서 일반적으로 이용되는 적당한 담체, 또는 매체, 예를 들면 멸균수, 생리 식염수, 식물유(예: 참기름, 올리브유 등), 착색제, 유화제(예: 콜레스테롤), 현탁제(예: 아라비아 고무), 계면활성제(예: 폴리옥시에틸렌 경화 피마자기름계 계면활성제), 용해 보조제(예: 인산 나트륨), 안정제(예: 당, 당 알코올, 알부민), 또는 보존제(예: 파라벤) 등으로 조합해 조제할 수 있다. 예로서, 주사제의 제재로서 동결건조품, 주사 용수제 등으로 제공할 수 있다.

본 발명의 체내 투여는, 동맥 내 주사, 정맥 내 주사, 피하 주사 및 비강내, 경기관지 내, 근육 내, 또는 경구적으로 당업자에게 공지의 방법에 의해 실시할 수가 있으며 그 중 바람직하게는 동맥 내 투여이다.

그에 더하여 본 발명에는 본 발명의 상기 약제에 의해 뇌 이동 활성이 부여된 분자가 포함된다. 그 일례로 본 발명의 폴리펩티드를 외피 단백질 상에 발현시킨 파지(phage)를 들 수 있다.

상기 파지(phage)는 특별히 제한되지 않으며, T7 파지(phage), M13 파지(phage)가 적합하다. T7 파지(phage)를 이용할 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 캡시드(capsid)라 불리는 외피 단백질 외곽에 발현시킬 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는(바람직하게는 특이적으로 결합하는) 항체에 관한 것이다. 본 명세서에서 "항체"는 포리크로날 및 단일 클론 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 인간화(humanized) 항체, 및 Fab 또는 다른 면역 글로블린 발현 라이브러리의 산물을 포함한 Fab 단편(fragment)이 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생산하기 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 항체는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 면역 특이적이다. "면역 특이적"이란 항체가 다른 폴리펩티드에 대한 친화성보다 본 발명의 폴리펩티드에 대해서 실질적으로 높은 친화성을 가지는 것을 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 폴리크로날 항체는 하기와 같은 방법으로 획득할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 GST 융합 단백질을 토끼 등의 작은 동물에 면역하여 혈청을 회수한다. 상기 혈청을 황산 암모늄 침전(ammonium sulfate precipitaion), 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 본 발명의 폴리펩티드를 커플링한 친화성(affinity) 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 단일 클론 항체의 경우 본 발명의 폴리펩티드를 마우스 등의 작은 동물에 면역을 실시하여 상기 마우스의 비장을 회수하여 균질화하여 세포를 분리하고, 마우스 골수종 세포와 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등의 시약에 의해 융합시킨다. 융합한 세포(잡종 세포)중 에서 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생산하는 클론을 스크리닝한다. 이후, 획득한 잡종 세포를 마우스 복강 내에 이식하여 상기 마우스의 복수를 회수하여 황산 암모늄 침전(ammonium sulfate precipitaion), 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 본 발명의 폴리펩티드를 커플링한 친화성(affinity) 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드나 이것을 발현하는 세포의 분리, 분류, 및 정제에 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 후술된 본 발명의 폴리펩티드에 대해 결합 활성을 가지는 분자의 스크리닝 방법에 매우 적합하게 사용할 수가 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대해 결합 활성을 가지는 분자의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 방법의 바람직한 방법은 하기의 (a)~(c) 과정을 포함하는 방법이다.

(a) 본 발명의 폴리펩티드와 피검 분자를 접촉시키는 과정;

(b) 상기 폴리펩티드와 피검 분자와의 결합 활성을 검출하는 과정; 및

(c) 상기 폴리펩티드와 결합한 분자를 선택하는 과정.

본 발명의 상기 선별 방법에 따라 본 발명의 폴리펩티드를 리간드(ligand)로 사용하는 수용체를 획득하는 것이 가능하다. 상기 수용체는 뇌 혈관 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)의 전이(transmigration)에 관여하는 것으로 사료된다. 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 획득되는 수용체의 기능적 해석은 전이(transmigration) 매카니즘을 해명해줄 것으로 기대된다. 본 발명의 스크리닝 방법은 또한 내피세포(endothelial cell)의 세포 접착에 관련되는 분자를 획득하는데 매우 유용하이다.

상기 (a) 과정에 있어서 "접촉"은 통상적으로 본 발명의 폴리펩티드 상태에 응해 적합하게 실시된다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드가 정제된 상태이면 정제된 피검 분자(시료)를 첨가함으로써 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드가 세포 내에 발현한 상태 또는 세포 추출액 내에 발현한 상태이면, 각각 세포의 배양액 또는 상기 세포 추출액에 피검 분자(시료)를 첨가함으로써 실시할 수 있다. 피검 분자가 단백질의 경우, 상기 단백질을 코딩하는 DNA를 포함한 벡터를 본 발명의 폴리펩티드가 발현하고 있는 세포에 도입하거나 또는 상기 벡터를 본 발명의 폴리펩티드가 발현한 세포 추출액에 첨가함으로써 실시하는 일도 가능하다.

또한 상기 스크리닝 방법으로 이용하는 피검 분자, 혹은 본 발명의 폴리펩티드는, 필요에 따라서 적절한 방법으로 표지할 수 있다. 표지 방법으로는 방사 표지(radioactive label), 형광 표지(fluorescent label), 효소 표지(enzyme label) 등을 들 수 있다.

상기 결합 활성의 측정은 당업자에 있어 공지의 방법, 예를 들면,이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid) 시스템을 이용한 방법, 면역 침강을 이용한 방법 등에 의해 적합하게 실시할 수 있다. 단백질 간의 상호작용(결합 활성)의 측정 방법으로는 여러 가지의 방법이 알려져 있으며, 본 발명의 결합 활성의 측정은 특정 방법으로 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드와의 결합 활성을 평가하는 피검 분자를 포함한 시료, 즉 세포의 배양 상층액이나 세포 추출물 등을 접촉시킨 후, 본 발명의 항체를 첨가하여 본 발명의 폴리펩티드와 함께 상기 분자를 면역 침강시켜 측정할 수 있다. 그리고 면역 침강한 산물의 전기 영동도가 본 발명의 폴리펩티드만의 경우와 비교해 변화했는지를 근거로 하여 피검 분자와 본 발명의 폴리펩티드와의 결합을 검출할 수가 있다. 또한, 결합이 검출된 시료로부터 피검 분자의 회수는 본 발명의 폴리펩티드와의 결합을 이용한 방법인 친화성(affinity) 크로마토그래피 등을 이용하여 회수할 수 있다.

본 발명의 방법은 단백질 같은 피검 분자를 발현할 것이라고 예상되는 조직 또는 세포에서 유래한 cDNA 라이브러리를 파지(phage) 벡터를 이용하여 제작할 수 있고, 이것을 아가로오스 상에서 발현시켜 필터에 단백질을 이동시킨 후, 표지한 본 발명의 폴리펩티드와 반응시켜 결합하는 피검 분자를 발현하는 플라그를 거출하는 "웨스트 웨스턴 블롯 방법(West Western blotting)"을 실시할 수 있다.

그에 더하여, 고체 등에 고정시킨 본 발명의 폴리펩티드에 합성 화합물, 천연물 뱅크, 또는 랜덤 파지(phage) 펩티드 디스플레이 라이브러리 등을 작용시켜 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 분자를 스크리닝하는 방법; 조합 화학(combinatorial chemistry) 기술을 이용한 대용량 처리(high throughput) 스크리닝 방법을 통한 후보 화합물을 분리하는 방법같이 당업자에 있어 통상 할 수 있는 기술이다.

피검 화합물은 특별한 제한은 없으며, 여러 가지의 공지 화합물이나 펩티드, 또는 파지(phage) 디스플레이 방법을 시도하여 작성된 랜덤 펩티드군을 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 파지(phage)에 제시하고, 상기 랜덤 펩티드군을 제시한 파지(phage)에 이용한 방법인 "이중 파지 제시 방법(double phage display method)"(J. Castillo, B. Goodson and J. Winter, T7 displayed peptides as targets for selecting peptide specific scFvs from M13 scFv display libraries. J Immunol Methods 257(1-2)117-22, 2001)도 본 발명의 스크리닝 방법으로 매우 적합하게 이용할 수 있다.

또한 미생물의 배양 상층액이나, 식물, 해양생물 유래의 천연 성분 등도 스크리닝의 대상이 된다. 그 외, 생체 조직 추출물, 세포 추출액, 유전자 라이브러리의 발현 산물 등이 포함되지만 이에 특히 제한되지 않는다.

폴리펩티드는 이중 사슬 DNA중 하나에 코딩된 통상적인 유전 산물이다. 이 때, 반대편 사슬에 코딩된 아미노산 서열의 펩티드는 안티센스 펩티드라 한다. 안티센스 펩티드는 본래의 펩티드(센스 펩티드)와 상호 반응을 한다고 하는 가설이 Blalock(1984) 등에 의해 제창되어, 이후 센스 펩티드와 안티센스 펩티드가 상호 반응을 한다고 하는 다수의 보고가 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 상보 사슬 서열에 근거한 안티센스 펩티드를 피검 분자로서 본 발명의 스크리닝 방법으로 제공하므로 효율적으로 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 분자를 획득하는 것이 가능하다.

본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 분자는 뇌 이동 활성 저해제, 뇌 이동 활성의 증진 또는 변이 유도제, 수용체 본체(전이(transmigration)를 일으키는 분자)로서 유용하다.

본 발명 또한 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드의 획득 방법에 관한 것이다. 본 발명은 하기의 (a)~(d)과정을 포함하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드의 스크리닝 방법(획득 및 분리 방법)을 제공한다.

(a) 파지(phage) 외피 단백질 상에 피검 폴리펩티드를 제시한 파지 입자(phage particle)을 제작하는 과정;

(b) 상기 파지 입자(phage particle)를 사람이 아닌 동물에 투여하는 과정;

(c) 상기 사람이 아닌 동물의 뇌조직으로부터 파지 입자(phage particle)를 회수하는 과정;

(d) (c) 과정에서 회수된 파지 입자(phage particle)에 제시된 피검 폴리펩티드를 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드로서 선택하는 과정.

상술된 방법의 피검 폴리펩티드 서열은 특별히 제한되지 않으며, 임의의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 이용할 수 있다. 통상적으로 본 발명의 피검 폴리펩티드는 무작위인 아미노산 서열로 구성되는 복수 종류의 폴리펩티드이다. 또한, 상기 아미노산 모티프 서열 또는 상기 모티프 서열 일부를 포함하는폴리펩티드, 또는 상기 "특징 1"을 가지는 폴리펩티드를 피검 폴리펩티드로서 본 발명의 스크리닝 방법으로 제공하므로 효율적으로 본 발명의 방법을 실시할 수 있다.

피검 폴리펩티드의 길이는 파지(phage) 외피 단백질 상에 제시시키는데 허용되는 길이라면 특별히 제한되지 않는다. 당업자는 파지(phage) 종류 등을 고려하여 피검 폴리펩티드의 길이를 적절히 설정할 수 있다.

임의의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드는 당업자에게 공지의 기술을 이용해 용이하게 제작할 수 있다. 예를 들면, 시판된 펩티드 합성기등을 이용하여 피검 폴리펩티드를 제작할 수 있다.

상기 (a) 과정에 있어서 임의의 폴리펩티드를 파지(phage) 외피 단백질 상에 제시하는 방법은 소위 파지(phage) 디스플레이 법으로서 당업자에 있어 일반적으로 공지의 기술이다. 분자 라이브러리는 통상적으로 파지(phage)의 생활환(life cycle)을 이용하여 임의의 폴리펩티드를 파지(phage) 외피 단백질 상에 제시하여 제조한다. 일례로 무질서(ramdom) DNA를 화학 합성하여 유전자 공학 기술을 이용해 파지(phage) DNA에 삽입한다. 상기 DNA를 대장균 등의 숙주 세포에 도입함으로써 파지 분자(phage molecule)를 생합성하고 무질서 DNA에 의해 코딩된 폴리펩티드가 바이러스 외피 단백질 상에 제시된다.

보다 구체적으로 피검 폴리펩티드를 파지(phage) 외피 단백질 상에 제시시킨 파지 입자(phage particle)을 제작하는 과정은 후술된 실시예에 기재된 방법(순서)으로 실시할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법으로 이용되는 파지(phage)는 M13, T7, f1, fd 등의 공지의 파지(phage)를 적합하게 이용할 수 있다. 파지(phage) 외피 단백질로는 pIII, 10A, 10B, 캡시드(Capcid) 등을 들 수 있다. pIII 단백질 상에 제시된 라이브러리는 시판되고 있어 본 발명의 스크리닝 방법에서서는 상기 시판된 라이브러리를 적절히 사용할 수가 있다.

또한, (a) 과정에 의해 제작된 파지 입자(phage particle)의 패닝(panning)에 의하여, (b) 과정 전에 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell) 결합할 수 있는 파지 입자(phage particle)을 선택할 수 있다. 이러한 과정을 통해 본 발명의 스크리닝을 효율적으로 실시하는 것이 가능하다.

패닝법(panning method)은 단백질의 상호작용을 이용한 선택 방법으로, 당업자는 파지(phage)의 종류 등을 고려하여 적절히 실시할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 패닝법(panning method)의 하기와 같은 방법으로 이용할 수 있다. 첫번째로 뇌혈관내 내피 세포(cerebrovascular endothelial cell)에 결합하기 쉬운 파지(phage)를 배양하여 농축하기 위해서, 대조 세포(마우스 신경교종(glioma) 세포)와 반응시키고 비특이적으로 결합하는 파지(phage)를 흡수 제거하여, 한층 더 마우스 뇌 유래의 혈관 내피 세포(cascular endothelial cell)(예: MBEC4)에 특이적으로 접착하는 파지(phage)를 농축한다. 보다 구체적으로는, 후술의 실시예에 기재의 순서에 의해 패닝(panning)을 실시할 수 있다.

상기 (b) 과정에서 파지(phage)를 투여하는 사람이 아닌 동물로서 마우스, 래트, 모래 쥐, 고양이, 소, 원숭이 등을 들 수 있다. 그 외, 가축 동물 혹은 애완동물 동물 등을 들 수 있다.

또한 상기 (b) 과정에서 투여되는 파지(phage)는 반드시 파지 입자(phage particle) 전체일 필요는 없으며, 피검 폴리펩티드를 제시한 외피 단백질만을 사람이 아닌 동물에 투여하여도 본 발명의 스크리닝을 실시하는 것이 가능하다.

사람이 아닌 동물 체내에의 투여는, 통상, 동맥 내 주사, 정맥 내 주사, 피하 주사, 경피 투여, 경구투여등에 의해 실시하지만, 바람직하게는 동맥 내 주사이다.

상기 (c) 과정에서 뇌조직으로부터 파지 입자(phage particle) 회수는 통상적으로 하기와 같이 실시하는 것이 가능하다. 사람이 아닌 동물의 뇌를 회수하여 뇌의 효모현탁액(homogenate)의 연속 희석(serial dilution)을 제작한다. 이 후 사기 희석액을 한천 배지 상에 도말하여 파지(phage)의 플라크를 형성시킨 후 상기 플라크를 선별하여 파지 입자(phage particle)의 회수를 실시한다. 이는 본 발명의 방법은 일례에 불가하며, 당업자는 파지(phage) 종류 등을 고려하여 적정한 방법으로 뇌조직으로부터 파지 입자(phage particle)의 회수를 실시할 수 있다.

상기 (d) 과정에서 선택된 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 따라 그 아미노산 서열을 결정할 수 있다.

또한 본 명세서에 대해 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함시킬 수 있다.

도 1은 내피 세포(endothelial cell)내 전이 매카니즘의 모식도를 나타낸 도면이다.

도 2는 T7 선택 시스템을 이용한 파지(phage) 라이브러리 구축을 도면이다. 사진은 cDNA 단편을 아가로스 겔 상에서 분리한 것으로, 삽입체(insert)가 없는 경우 약 120 bp의 단편이 증폭되지만, 여기에서는 200 bp에서 1 kb 가까운 삽입체를 확인할 수 있었다. 이것은 70-300 아미노산 길이이다.

도 3은 T7 선택 시스템을 이용한 파지(phage) 라이브러리 구축(무질서 펩티드)을 나타낸 도면이다.

도 4는 T7 선택 시스템을 나타낸 도면이다.

도 5는 패닝 방법(panning metohd)을 나타낸 도면이다.

도 6은 서열 번호：23 또는 24 서열을 가지는 파지(phage)의 뇌 이동 활성을 나타낸 도면이다.

도 7은 뇌에서의 파지 타이터(phage titer) 뇌/혈장비를 나타내는 그래프이다.

도 8은 본 발명의 뇌 이동 펩티드 결합체의 구조를 나타낸 도면이다.

도 9는 마우스 뇌에서 본 발명의 펩티드-골드 콜로이드 결합체의 존재를 나타내는 전자 현미경 사진이다.

왼쪽 상하 : 대조군(아비딘-골드 골로이드) : 신경 세포내 골드 콜로이드 표지가 관찰되지 않는다.

상 : 해마 추체 세포(hippocampla pyramidal cell) CA1부터 CA2 지역,

하 : 소뇌 푸르키니에 세포(cerebellar Purkinje cell) 지역,

중앙 상하 : 바이오틴 결합체 T2J002 + 아비딘(Av)-골드 입자 투여,

오른쪽 상하 : 바이오틴 결합체 TJ004 + 아비딘(Ave)-골드 입자를 투여,

펩티드 결합체에 의하여 골드 콜로이드는 뇌실질(cerebral parenchyma)로 이동될 수 있다.

도 10은 추체 세포층(pyramidal cell layer) CA1-CA2 지역에서 본 발명의 펩티드-골드 콜로이드 결합체의 존재를 나타낸 전자 현미경 사진이다.

왼쪽 ： 대조군(아비딘금 콜로이드만 투여): 혈관내 내피에 반응을 볼 수 없다,

중앙 ： 바이오틴 + 펩티드 (1) 군： 바이오틴-결합 T2J002＋아비딘(Av)-골드 입자를 투여한 것,

오른쪽 : 바이오팀 + 펩티드 (2) 군： pre-embedding method(바이오틴-결합 T2J002를 투여하여 초박절편을 제작한 후 아비딘(Av)-골드로 검출하여 관찰)에 의한 면역 반응의 전자 현미경상,

대조군(왼쪽)에서는 혈관내 내피에 반응을 볼 수 없는데에 반하여, 실험군에서는 내피 세포에 면역 반응을 나타내는 DAB 침착이 나타난다(화살표). 내피세포로부터 한층 더 혈관외(뇌실질)에서도 그 반응을 볼 수 있다.

도 11은 본 발명의 펩티드 결합체를 이용한 MBEC4에 대한 투과성 평가 실험의 모식도를 나타낸 도면이다.

도 12는 본 발명의 펩티드 결합체(T2J004)의 MBEC4에 대한 투과성을 나타낸 도면이다. 아비딘-FITC 0.4 nmol/삽입체에 대해서 1:4의 비율로 펩티드를 결합시키고 MBEC4에 대한 투과성의 경시적 변화에 대해 검토하였다.

도 13은 혈액뇌관문 모델에서의 펩티드 결합체에 의한 투과성 증대와 비표지 펩티드에 의한 저해 활성을 나타내는 도면이다.

MBEC4를 이용한 혈액뇌관문 모델에 Av-FITC 및 바이오틴 결합체 T2J004Y＋Av-FITC를 첨가해 하층의 형광 강도를 측정했는데, 약 3배의 투과성 증대를 관찰할 수 있었다. 이 효과는 환상화 T2J004 및 직쇄상 T2J004에 의해 의미 있게 저해되는 것을 알 수 있었다.

도 14는 MBEC4에 있어서의 신경교세포 마크로파지(macrophage)의 투과성 평가 실험의 개략을 나타내는 도면이다.

도 15는 본 발명의 여러 가지 펩티드 결합체를 이용한 MBEC4에 있어서의 투과성을 나타내는 도면이다.

도 16은 4 F11항-M13 파지(phage) 항체에 의한 재조합 뇌 이동 파지(phage)의 뇌내 검출을 나타내는 사진이다.

뇌 이동 파지(phage)(상단)와 대조군 파지(phage)(하단)를 혈관내 투여해 30 분 후 적출한 뇌를 4 F11항-M13 파지(phage) 항체로 염색했는데, 뇌 이동 파지(phage)를 투여한 것에서는 뇌 내에 파지 입자(phage particle)를 검출할 수 있었다.

왼쪽：NIBA 필터에 의한 특이적 결합의 형광 사진,

중앙：WIG 필터에 의한 비특이적 결합의 검출,

오른쪽：Hoechst 23384에 의한 핵 염색(세포의 분류).

도 17은 초점 현미경에 의한 신경교 세포의 트랜스사이토시스(transcytosis) 검출을 나타내는 사진이다.

MBEC4를 이용한 혈액뇌관문 모델에 대해 신경교 세포를 첨가해 4시간 후, 트랜스사이토시스(transcytosis)를 검출할 수 있었다. 사진상에 노란색-주황색으로 보이는 신경교세포가 녹색의 혈관내 네피 세포를 통과하고 있는 상을 관찰할 수 있다.

도 18은 혈관내 내피 세포에 신경교세포를 첨가하여 1시간 경과했을 때 위상차 현미경(왼쪽)과 형광 현미경(오른쪽)의 사진이다.

도 19는 톨루딘 블루(toludine blue) 염색 후 광학 현미경으로 관찰의 결과 사진이다. 신경교 세포(왼쪽)와 마크로파지(macrophage)(오른쪽) 했을 때 MBEC4 혈액뇌관문 모델의 수직 단면의 톨루딘 블루 염색을 실시했다.

도 20은 MBEC4의 전자현미경 관찰의 결과를 나타내는 사진이다. 중앙으로 보이는 검은 띠 모양의 부분이 밀착대(tight junction: 혈액뇌관문에 특징적으로 볼 수 있는 관문 구조)이다.

도 21은 신경교 세포가 혈액뇌관문 모델을 통과할 때 전자현미경으로 관찰한 사진이다.

도 22는 신경교 세포가 혈액뇌관문 모델을 통과하는 전자현미경상을 나타내는 사진이다. 신경교 세포의 돌기가 혈액뇌관문을 형성하는 MBEC4 세포 내로 함입 하는 상을 볼 수 있다.

도 23은 마크로파지(macrophage) 숙주화 세포 Raw264.7의 MBEC4에 대한 접착을 나타내는 사진이다. 마크로파지(macrophage)는 혈액뇌관문을 형성하는 MBEC4에 대해서 느슨하게 접착할 뿐 세포층에의 투과는 볼 수 없었다.

도 24는 마크로파지(macrophage) 숙주화 세포 Raw264.7의 MBEC4에 대한 접착을 나타내는 사진이다. 매크로 살균 바이러스는 혈액뇌관문을 형성하는 MBEC4에 대해서 느슨하게 접착할 뿐이다. 세포층에의 투과는 볼 수 없었다.

　이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

덧붙여 PEG6000는 Wako에서 구입하였고, 트립신(trypin) EDTA, 루리아 브로스 베이스(Luria broth base), 페니실린 스트렙토마이신은 GIBCO에서 구입했다. 또한, EDTA 2Na는 Nacalai에서, Agarose 36G는 Funakoshi에서, T7 Select 1-1 Cloning kit는 Novagen에서 구입했다.

〔 실시예 1〕　세포의 배양

(1) 마우스 203 신경교종(glioma) 세포

203 신경교종(glioma) 세포는 10%의 FCS(GIBCO)와 5㎍/㎖ 인슐린(SIGMA), 0.22% 글루코오스(Katayama)를 포함한 MEM(SIGMA) 배지를 사용하여 37℃으로 5% CO₂의 조건하에서 배양했다. 계대는 10 cm 플레이트(Falcon)에 2 x 10⁵ 세포/7 ㎖이 되도록 하였으며, 7일마다 계대를 실시했다. 패닝(panning)에 사용하는 203 신경교종 세포는 10 cm 플레이트에 2 x 10⁶ 세포/7 ㎖이 되도록 4일 후에 패닝에 사용했다.

(2) 마우스 혈관내 내피 END-D세포

END-D세포는 10% 비활성화 FCS와 100 unit/ ㎖ 페니실린, 100 ㎎／㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(SIGMA) 배지를 이용해 37℃으로 5% CO₂의 조건하에서 배양했다. 계대는 PBS(-)를 사용하여 세척한 후, 5 ㎖ 0.25 % 트립신/ 1 mM EDTA 4 Na를 첨가해 3분동안 방치하고 5 ㎖의 배양액으로 수세하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 침전시켜 상층액을 제거하고 배양배지로 1회 세척한 후 10 cm 플레이트에 3 x 10⁵ 세포 /7 ㎖이 되도록 3-4일마다 계대를 실시했다. 패닝에 사용하는 END-D 세포는 콜라겐 코트를 실시한 10 cm플레이트에 7 ㎖ 배양배지에 3 x 10⁶ 세포가 되도록 하였고 4일 후에 패닝에 사용했다. 콜라겐 코트는 10 cm 플레이트에, 5 ㎍/cm²의 콜라겐(Nitta Gelatin, cellmatrix type I-C)을 가하고 1시간 방치한 후 PBS(-)로 2회 세척하였다.

(3) 마우스 뇌 유래 혈관내 내피 세포 MBEC4

MBEC4 세포는 10% FCS와 5 ㎍/㎖ 헤파린(SIGMA), 30 ㎍/㎖ ECGS(Endothelial cell Growth Supplement；Upstate biotechnology)를 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 37℃으로 5% CO₂ 조건하에서 배양했다. 계대는 0.2% 젤라틴(Katayama)으로 코트 한 10 cm 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/7 ㎖이 되도록 3-4일마다 계대를 실시했다. 패닝에 사용하는 MBEC4는 콜라겐 코트한 10 cm 플레이트에 2 x 10⁶ 세포/7 ㎖이 되도록하여, 4일 후에 패닝에 사용했다.

〔 실시예 2〕　 M13 파지(phage) 디스플레이 라이브러리

1.　대장균 ER2738의 배양

Ph.D. -c7c^TMPhage Display Peptide Library Kit(New England Biolabs, E8120S)의 부속 숙주 대장균 ER2738를 20 ㎍/㎖ 테트라싸이클린(Katayama)을 포함하는 LB 배양배지에서 37℃으로 하룻밤 진탕 배양한 후, 20 ㎍/㎖ 테트라싸이클린(Katayama)를 포함하는 LB 플레이트에 접종하고 ER2738의 워킹 스탁(Working stock)을 사용하였다. 또한, 2주마다 새로운 워킹 스탁을 제작했다.

파지(phage)의 증폭 또는 측정에 사용되는 ER2738는 저장된 워킹 스탁의 단일 콜로니를 선택하여 20 ㎍/㎖ 테트라싸이클린을 포함하는 LB 배양배지에서 37℃ 으로 하룻밤 진탕 배양한 것을 이용했다.

2.　시험관내(In vitro) 패닝(panning)

2-1.　세포 고정

패닝에 사용하는 203 신경교종(glioma) 세포(대조군), END-D 세포, MBEC4 세포가 배양된 10 cm 플레이트에 하기와 같이 세포 고정을 실시했다. 각 세포의 배양배지를 제거하여 5 ㎖ PBS(-)에 의해 1회 세척하고, 4% PFA(Katayama)/PBS(-)를 3 ㎖ 첨가하여 10분간 방치한 후, 5 ㎖ PBS(-)에 의해 3회 세척하여 고정했다. 이 후, 5 ㎖의 2% BSA(SIGMA)/PBS(-)를 가하고 4℃에서 1시간 방치하여 블로킹(blocking)을 실시했다. 각 세포는 파지(phage) 용액을 첨가하기 전, 3 ㎖의 0.1% Tween 20/PBS(-)로 6회 세척하여 사용했다.

2-2.　1차 패닝

1차 패닝에서는 10¹¹ pfu의 M13-c7c 파지(phage) 라이브러리(10 ㎕)를 2 ㎖의 PBS(-)에 용해하여 전량을 203 신경교종(glioma) 세포에 첨가하여 실온에서 10분간 완만하게 교반하여 흡착시켰다. 이 후 상층액을 END-D 세포에 첨가하여 실온에서 10분간 완만하게 교반하여 흡착시켰다. 이 후 상층액을 MBEC4 세포에 첨가하여 실온에서 10분간 완만하게 교반하여 흡착시켰다. 각 세포는 10분간 흡착 처리 후, 5 ㎖의 0.1% Tween 20/PBS(-)로 10회 세정한 후, 1 ㎎/㎖ BSA를 포함한 0.2 M Glycine(Wako)-HCl(pH 2.2)를 2 ㎖ 첨가하여 실온에서 완만하게 교반하여 추출을 실시했다. 추출액 회수 후, 즉시 0.2 M Glycine-HCl(pH 2.2) 2 ㎖로 헹구어 추출액과 함께 1 M Tris-HCl(pH 9.1)를 1.6 ㎖를 첨가하여 중화를 실시했다. Tris는 Boeringer에서 구입했다.

각 세포로부터 파지(phage) 추출액 및 각 과정에서의 파지(phage)의 타이터(titer)는 "2-2-1 파지(phage) 타이터 측정"에 나타낸 방법으로 수행하였다.

MBEC4 세포에서 추출된 파지(phage) 용액은 하기의 "2-2-2 파지(phage)의 증폭 및 정제"에 나타낸 방법에 의해 증폭하여 2차 패닝에 사용했다.

2-2-1. 파지(phage)의 타이터 측정(Titration)

파지(phage) 용액의 타이터(Titer)는 하기와 같이 측정했다.

14 ㎖ 스냅 캡 튜브(Falcon)에 ER2738의 하룻밤 배양액을 250 ㎕와 IPTG(Katayama)/X-gal(Nacalai) 혼합액(50 ㎍/㎖ IPTG/40 ㎍/㎖ X-gal)을 3 ㎕을 첨가하여 용해한 탑 아가로오스(Top Agarose)(6 ㎍/㎖ 아가로오스/LB 배양배지)를 2.5 ㎖ 첨가하여 혼합했다. 즉시 LB/IPTG/X-gal 플레이트에 도말하여 ER2378 라운드 플레이트를 제작했다. 타이터를 정정하는 파지(phage) 용액은 TBS에서 희석 시리즈를 제작하여 ER2378 라운드 플레이트에 10 ㎕씩 블롯하여 흐르지 않는 정도까지 건조시킨 후, 37℃으로 하룻밤 배양했다. 파란색 플라크를 세어 파지(phage) 용액의 타이터를 산출했다.

2-2-2.　파지(phage)의 증폭과 정제

배플이 첨부된 삼각 플라스크를 이용해, ER2738의 하룻밤 배양액의 1/100 부피와 20 ㎍/㎖ 테트라싸이클린을 포함하는 LB 배양배지에 증폭한 파지(phage) 용액을 첨가하여 37℃으로 4.5 ~ 5시간 진탕 배양했다. 이후 10,000 rpm, 4℃로 10분간 원심분리하여 상층액을 회수했다. 상층액을 10,000 rpm, 4℃로 10분간 원심분리하여 ER2738는 완전하게 제거되었다. 상기 상층액에 1/6 부피의 30% PEG/ 3 M NaCl(SIGMA)을 첨가하여 얼음에서 하룻밤 방치하여 파지(phage)를 침전시켰다. 이후 10,000 rpm, 4℃로 45분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 10,000 rpm, 4℃로 10분간 원심분리하여 파지(phage)의 침전을 모았다. 파지(phage)의 침전은 2 ㎖ TBS/0.02% NaN₃(SIGMA)로 완전하게 용해하여 10,000 rpm, 4℃로 5분간 원심분리하여 상층액을 회수했다. 상층액에 0.467 g/㎖이 되도록 CsCl(Wako)를 첨가하여 80,000 rpm, 5℃로 18시간동안 밀도 구배 원심분리를 실시하여 정제된 파지(phage)를 회수했다. 회수한 정제 파지(phage)는 TBS로 투석해 CsCl를 제거하여 0.02%가 되도록 NaN₃를 더해 4℃로 보존했다.

2-3.　2차 패닝

2차 패닝에서는 10¹⁰ pfu의 M13-c7c 파지(phage) 혼합액을 2 ㎖ PBS(-)에 용해하여 전량을 203 신경교종(glioma) 세포에 첨가하여 실온으로 10분간 완만하게 교반하여 흡착시켰다. 이 후, 상층액을 END-D 세포에 첨가하여 실온으로 10분간 완 만하게 교반하여 흡착시켰다. 이 후, 상층액을 MBEC4 세포에 첨가하여 실온으로 10분간 완만하게 교반하여 흡착시켰다. 각 세포는 10분간 흡착 처리 후 5 ㎖의 0.3% Tween 20/PBS(-)로 10회 세척한 후, 1 ㎎/㎖ BSA를 포함한 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)를 2 ㎖ 첨가하여 실온으로 완만하게 교반하여 추출을 실시했다. 추출액은 회수하여 즉시 0.2 M Glycine-HCl(pH 2.2) 2 ㎖로 헹구었고 추출액과 함께 1 M Tris-HCl(pH 9.1)를 1.6 ㎖ 첨가하여 중화를 실시했다.

MBEC4 세포에서 추출된 파지(phage) 용액은 하기의 "2-2-2 파지(phage)의 증폭 및 정제"에 나타낸 방법에 의해 증폭하여 생체내(in vivo) 패닝에 사용했다.

3.　생체내(In vivo) 패닝

3-1.　파지(phage) 주입

생체내(In vivo) 패닝에는 8주령의 마우스 수컷 C57BL를 사용했다. 10¹¹ pfu/300 ㎕ PBS로 상기 정제 파지(phage)를 에테르 마취 후 마우스 좌경동맥에 1회 투여했다. 1분 후 15 ㎎/㎖ EDTA로 코트한 투베르크린(tuberculin)용 시린지(26G)를 이용해 심장에서 채혈하여 즉시 0.2 g/㎖ EDTA/PBS 400 ㎖에서 관류를 실시했다. 관류 종료시 심장 내 관류액을 회수했다. 관류 후 뇌를 회수하였고 타이터 측정을 위한 시료와 조직 절편 작성용으로 일부를 샘플링했다. 타이터 측정용에는 좌뇌를, 절편 제작용으로는 우뇌를 사용했다.

3-2.　조직 샘플의 제작

타이터 측정용 조직은 정랑하여 2 배 부피의 균질화 용액(20 m MPES(SIGMA)/ 0.25 M 수크로오스/1 mM EDTA에 사용 직전에 10 ㎍/㎖ 아프로티닌(Wako), 5 ㎍/㎖ 루펩틴(SIGMA), 1 mM PMSF(Wako)를 첨가)를 첨가하여 얼음에서 균질화 했다. 이후, 균질화 용액과 동량의 100 mM LiCl(Katayama)/PBS를 첨가해 혼합했다.

혈액은 15,000 rpm, 4℃로 10분 동안 원심분리하여 혈장으로 회수해 타이터를 측정했다.

각 조직의 균질액, 혈장, 관류액의 파지(phage) 타이터는 "2-2-1 파지(phage) 타이터 측정"에 나타낸 방법으로 측정하였다.

뇌의 균질액 모두 하기의 "2-2-2 파지(phage)의 증폭 및 정제"에 나타낸 방법에 의해 증폭하여 생체내(in vivo) 패닝에 사용했다.

4.　파지(phage)의 클로닝 및 서열 결정

4-1.　클로닝

시험관 내(In vitro) 패닝 2회 및 생체 내(In vivo) 패닝 1회를 수행한 뇌 균질액 또는 생체 내(In vivo) 패닝 3회 수행한 뇌 균질액으로부터 파지(phage)의 클로닝을 실시했다.

뇌의 균질액의 희석 시리즈를 TBS로 제작하여 상기 "2-2-1 파지(phage) 타이 터 측정" 기재된 방법에 따라 파지(phage)의 플라크를 형성하여, 싱글 플라그를 선별하여 1 ㎖ TBS에 용해하였다. 이 조작을 1회 더 반복하여 파지(phage)의 클로닝을 실시했다.

4-2.　서열 결정(sequencing)

14 ㎖ 스냅 캡 튜브에 1 ㎖ LB 배양 배지와 10 ㎕ ER2738 하룻밤 배양액과 파지(phage) 클론 용액을 100 ㎕ 첨가하여 37℃으로 4.5시간 진탕 배양했다.

5,000 rpm, 4 ℃로 5분간 원심분리하여 ER2738를 침전시켜 상층액을 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 10,000 rpm, 4 ℃로 1분간 원심분리하여 상층액을 새로운 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 이후, 30% PEG/3 M NaCl 400 ㎕ 첨가하여 전도 교반한 후, 4℃로 하룻밤 방치했다.

13,000 rpm, 4℃로 30분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 13,000 rpm, 4℃로 30분간 원심분리하여 남은 상층액을 흡수하여 완전하게 제거했다.

침전한 파지(phage)에 100 ㎕의 Iodide 버퍼(4 M NaI(SIGMA)/1 mM EDTA/10 mM Tris pH8.0)을 첨가하고 부유시켜 완전하게 파지(phage)를 용해시켰다. 이 후, 250 ㎕ 에탄올을 첨가하여 전도 교반한 후 실온에서 10분간 방치했다. 이를 15,000 rpm, 실온에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하였고, 침전물을 1 ㎖ 70% 에탄올로 조심스럽게 세척하여 15,000 rpm, 실온에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물을 데시케이터(deciccator)에서 5분간 건조시켰다. 상기 침전에 30 ㎕ TE를 첨가하여 용해하였고, 이를 서열의 주형으로 사용했다. 서열 결정은 Ph.D. -c7c^TM의 부속인 ―28 gIII 서열결정 프라이머(5＇-GTA TGG GAT AAA CAA C-3＇:서열 번호：13)와 ThermoSequance Cy5. 5 Dyterminator kit(Amersham)를 이용해 GeneRapid SEQ4x4(Amersham)로 결정했다.

5.　파지(phage) 클론 평가

회수된 파지(phage) 클론은 상기 "2-2-2. 파지(phage)의 증폭과 정제"에 기재된 방법에 따라, 증폭과 정제를 실시했다. 정제한 파지(phage) 클론은 파지(phage) 투여량을 10¹⁰ pfu/300 ㎕로 바꾸어 상기 "3. 생체 내(In vivo) 패닝"에 기재된 방법에 따라 뇌 이동 활성을 이용하여 평가했다. 대조군 파지(phage)로서 M13-KE(New England Biolabs, E8101S)(클론 번호 1148)를 사용했다.

〔 실시예 3〕　 T7 파지(phage) 디스플레이 라이브러리

1.　T7 파지(phage) 디스플레이 라이브러리 구축

무질서한 서열을 포함하여 양쪽 말단에 EcoRI 및 HindIII의 제한 효소 자리를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 81-bp(415-15： GAATCCATGCAGAATTTC(XXK)¹⁵AAGCCTGCTACAGACCAT : 서열 번호 14) 또는 86-bp(415-C15C : GATCCATGCAGAATTCCTGC(XXK)¹⁵TGCAAGCTTGCTACAGACCAT: 서열 번호 15)를 T7 파지(phage) 10B 유전자 서열에 추가할 수 있도록 디자인하였고 합성하였다. 대략 올리고뉴클레오티드 1.3 ㎍(50 pmol)를 주형으로 하고, 5' 및 3' 옆프라이머 약 1.9 ㎍(300 pmol)을 이용해 PCR를 실시하여 무질서 서열을 포함한 T7 파지(phage) 디스플레이 라이브러리를 제작했다. 제작한 삽입체를 제한 효소 EcoRI 및 HindIII로 절단하여 아가로오스 젤 상에서 분리, 정제하여, pQE-TriSystem 벡터의 EcoRI 및 HindIII 부위에 삽입하였고 대장균을 이용하여 증폭하였고 무질서 서열을 확인하였다. 확인 후 무질서 서열을 이동하는 플라스미드는 대장균에서 정제되었고, EcoRI 및 HindIII로 절단하였다. 삽입체 단편은 아가로오스 젤 상에서 분리, 정제하였고 T7 파지(phage) 10B 유전자 서열에 삽입하였다(도 2 및 도 3). 10B 유전자 서열에 삽입된 파지(phage)의 시험관 내(in vitro) 패키지는 Novagen의 T7 select Cloning kit의 메뉴얼에 따라 실시하였다. 이하 상술한 프라이머 서열은 아래와 같다;

415-15 5' 옆 프라이머 : GAA TCC ATG CAG AAT TCC(서열 번호：16),

415-15 3' 옆 프라이머 : ATG GTC TGT AGC AAG CTT(서열 번호：17),

415-C15C 5'옆 프라이머 : GAT CCA TGC AGA ATT CCT GC(서열 번호：18),

415-C15C 3'옆 프라이머 : ATG GTC TGT AGC AAG CTT GCA(서열 번호：19)

2.　대장균 BL21, BLT5403의 배양

T7 Select415-1 Cloning kit(Novagen, 70015-3)의 포함된 숙주 세포 대장균 BL21 혹은 BLT5403를 LB 배양 배지에서 37℃으로 하룻밤 진탕 배양하여, LB 플레이트에서 도발하였고, BL21 또는 BLT5403의 워킹 스탁을 제작하였으며, 2주간 마다 새로운 워킹 스탁을 제작했다. 파지(phage)의 증폭 또는 타이터 측정에 사용한 BL21, BLT5403는 워킹 스탁에서 싱글 콜로니를 선별하여 LB 배양 배지에서 37℃로 하룻밤 진탕 배양한 것을 이용했다.

3.　시험관 내(In vitro) 패닝

3-1.　세포의 고정

203 신경교세포 세포(대조군)을 배양한 10 cm 플레이트 3매, MBEC4 세포 1매를 하기의 방법으로 세포 고정을 실시했다. 각 세포에서 배양 배지를 제거해 5 ㎖ PBS(-)로 1회 세척하였고, 4% PFA/ PBS(-)를 3 ㎖ 첨가하여 10분간 방치한 후, 5 ㎖ PBS(-)에 의해 3회 세척하여 고정했다. 이 후, 5 ㎖ 2% BSA/ PBS(-)를 더하고 4℃로 30분간 방치하여 블로킹을 실시했다. 블로킹 용액은 파지(phage)첨가 직전에 흡입에 의해 제거했다.

3-2.　패닝

T7 Select 415-1 Cloning kit(Novagen)에 양쪽 말단을 시스테인으로 사이에 둔 15 잔기의 무작위 펩티드를 제시하도록 삽입체를 첨가한 것을 제작하여 이를 T7 Select 415-c15c 라이브러리로 사용했다(도 4). 시험관 내 패닝에서는 2x10⁹ pfu의 T7 select 415-c15c 라이브러리를 2 ㎖ PBS(-)에 용해시켜 4 cm 플레이트에 도말하였다. 전체 용액은 회수하였고 4 cm 플레이트에 도말하였다. 이 후, 회수한 전 체 용액의 1.1 ㎖을 새로운 튜브로 옮겨2 % Skim milk/ PBS(-)를 1.1 ㎖첨가하여 실온에서 완만하게 10분간 교반했다. 이를 10,000 rpm, 4℃로 10분간 원심분리하였고, 회수된 상층액의 2 ㎖을 첫 번째 203 신경교종(glioma) 세포 플레이트에 첨가하고 "3.1 세포 고정"에 기재되어 있는 방법으로 세포를 고정하고 블럭킹하였다. 이 후, 두 번째 및 세 번째 203 신경교종(glioma) 세포 플레이트에 상층액을 유사하게 처리하였다. 상층액을 MBEC4 세포에 첨가하여 실온에서 완만하게 교반하여 흡착시켰다. 상층액을 제거한 후 10 ㎖ PBS(-)로 3회 세척하였다. 이후 2 ㎖ 0.01% NP-40/PBS(-)로 10분간 완만하게 교반하는 세척을 3회 하였다. 다음에 0.1 % NP-40/PBS(-)로 1회 세정하고, 0.4 ㎖ 0.1% SDS/SM 버퍼로 10분간 완만하게 교반하여, 약하게 결합하고 있는 파지(phage)를 제거했다. 0.6 ㎖ SM 버퍼로 헹줘주고, 0.4 ㎖ 0.5% SDS /SM 버퍼로 10분간 완만하게 교반하여 추출하였고, 친화성이 낮은 파지(phage) 추출액을 제조하기 위하여 0.6 ㎖ SM 버퍼로 헹군 것과 혼합하였다. 이 후 추출은 1% SDS/ SM 버퍼로 10분간 완만하게 교반하여 수행하고, 0.6 ㎖ SM 버퍼로 헹군 것과 합하여 친화성 높은 파지(phage) 추출액으로 사용하였다. 패닝의 개략도는 도 5에 나타낸다.

각 파지(phage) 추출액 및, 각 과정별 파지(phage)의 타이터 측정은 "3-2-1. 파지(phage) 타이터 측정"에 기재된 방법으로 수행하였다. 그에 더하여 100배 또는 그 이상 희석된 파지(phage) 용액을 기준으로 하여 타이터를 계산하였다.

또한, MBEC4 세포에서 추출된 파지(phage) 용액은 하기와 같이 "3-2-2. 파지(phage)의 증폭과 정제"에 기재된 방법과 같이 증폭하여 다음 패닝에 사용했다.

시험관 내 패닝의 8회 실시 후 파지(phage) 클로닝을 실시했다.

3-2-1.　파지의 타이터 측정

파지(phage) 용액의 타이터값은 하기와 같이 측정했다.

14 ㎖ 스냅 캡 튜브에 BL21 혹은 BLT5403의 하룻밤 배양액을 250 ㎕ 첨가였고, 용해한 Top Agarose(6 ㎍/㎖ 아가로오스/LB 배양 배지)를 2.5 ㎖ 첨가하여 혼합했다. 즉시 LB 플레이트에 도말하여 BL21 라운드 플레이트 및 BLT5403 라운드 플레이트를 제작했다. 타이터값을 측정하는 파지(phage) 용액은 SM 버퍼를 이용하여 희석 시리즈를 제작하였고, BL21 라운드 플레이트 및 BLT5403 라운드 플레이트에 10 ㎕씩 블롯하여 흐르지 않는 정도까지 건조시킨 후, 37℃에서 2-4시간 배양해 생긴 플라크를 세어서 파지(phage)용액의 타이터 값을 산출했다. 상기 실시예 2의 "3. 생체 내 패닝" 에서 내부 표준으로서 사용하고 있는 T7 rRNA :T7 select 1-1 kit (NEB, 70010-3)에 rRNA의 cDNA의 일부(5'-CAC CAA GCG TTG GAT TGT TCA CCC ACT AAT AGG GAA CGT GAG CTG GGT TTA GAC CGT CGT GAG ACA GGT TAG TTT TAC CCT ACT GAT GAT GTG TTG TTG CCA TGG TAA TCC TGC TCA GTA CGA GAG GAA CCG CAG GTT CAG ACA TTT GGT GTA TGT GCT TGG CTG AGG AGC CAA TGG GGC GAA GCT ACC ATC TGT GGG ATT ATG ACT GAA CGC CTC TAA GTC AGA ATC CCG CCC AG-3': 서열 번호20)가 첨부된 파지(phage) BL21에서는 증식하지 못하고, 숙주 세포를 BLT5403로 이용했을 경우만 플라크를 형성한다.

3-2-2.　파지(phage)의 증폭과 정제

바플 첨부 삼각 플라스크를 이용해, BL21의 하룻밤 배양액 1/100 부피를 첨가한 LB 배양 배지를 37℃에서 2-3시간 진탕 배양하여, 증폭한 파지(phage) 용액을 더하여 1-3시간 진탕 배양했다(용균한 대장균 세포 찌꺼기양과 탁도의 저하로 판단). 이 후, 계속되어, 10,000 rpm, 4℃로 10분간 원심분리하여 상층액을 회수했다.

상기 상층액에 1/2 부피의 0% PEG/3 M NaCl를 첨가하여 얼음에서 하룻밤 방치해 파지(pahge)를 침전시켰다. 이 후 10,000 rpm, 4℃로 45분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 10,000 rpm, 4℃로 10분간 원심분리하여 파지(phage)의 침전을 회수하였다. 파지(phage)의 침전은 2 ㎖ SM 버퍼로 완전히 용해하여 10,000 rpm, 4℃로 5분간 원심분리하여 상층액을 회수했다. 상층액에 0.5 g/㎖가 되도록 CsCl를 첨가해 80,000 rpm, 15℃로 18시간 동안 밀도 구배 원심 분리를 실시하여 정제 된 파지(phage) 밴드를 회수했다. 회수한 정제된 파지(phage)는 SM 버퍼로 투석하여 CsCl를 제거하였고, 크로로포름 몇 방울을 가하여 4℃로 보존했다.

4.　클로닝

8번째의 시험관내 패닝의 파지(phage) 추출액의 희석 시리즈를 SM 버퍼로 제작하였고, 상기 "3-2-1. 파지(phage)의 타이터 측정"에 기대된 방법에 따라 파지(phage)의 플라크를 형성시켜, 싱글 플라크를 선별하여 1 ㎖ SM 버퍼에 용해하였다. 상기 과정을 1회 반복하여 파지(phage)의 클로닝을 실시했다.

5.　서열 결정

상기 파지(phage) 클론의 일부를 MilliQ 증류수로 100배 희석해 95℃로 5분 가열 후, 즉시 얼음에서 급냉한 것을 PCR의 주형으로 사용하였다. 상기 주형을 1 ㎕를 첨가하였고, 프라이머로서 5'-GCT CTG CGG TAG GTA CTG TT-3'(서열 번호：21)와 5'-CGG TGC CCC AAA GAA TCG GT-3'(서열 번호：22)를 1 μM로 첨가하여, 30 ㎕의 부피로 하기와 같이 PCR를 실시했다. 94℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 2분 과정으로 40회 반응을 실시했다. 이후 에탄올을 사용하여 PCR 산물을 침전시키고 10 ㎕ TE에 용해했다. 이 후 CHROMA SPLIN+TE30 Colulmn(Clontec, K1321-2)를 이용해 컬럼 정제 한 PCR 산물을 서열의 주형으로 사용하였다.

서열 시료는 ThermoSequence Cy5. 5 Dyterminator Kit(Amersham)를 이용해 조제하였고, GeneRapid SEQ4x4에서 서열을 결정했다.

파지(phage) 클론은 상기 "-2-2. 파지(phage)의 증폭과 정제"에 기재된 방법으로 정제하여 생체내 평가에 이용했다.

6.　파지(phage) 클론 평가

6-1.　파지(phage) 주입

생체내 패닝에는 8주령의 마우스 수컷 C57BL를 사용했다. 1시간 동안 UV를 방사하여 멸균한 정제 T7 select 415-c15c 라이브러리 4x10⁶ pfu/200 ㎕ PBS를 에테 르 마취하의 마우스 좌경 동맥에 투여해 마스킹을 실시했다. 5 분 후에, 정제 T7 select415-c15c 클론과 내부 표준으로서 T7 rRNA를 4x10⁶ pfu씩 포함한 파지(phage)혼합액을 200 ㎕ 투여했다. 1분 후에 15 ㎎/㎖ EDTA로 코트 한 투베르클린(tuberculin)용 시린지(26G)를 이용해 심장에서 채혈하였고, 즉시 0.2 g/㎖ EDTA/ PBS 400 ㎖로 관류를 실시했다. 관류 종료시 심장 내의 관류액을 회수했다. 관류 후 뇌를 회수하였으며, 타이터 측정용과 조직 절편 작성용으로 일부를 샘플링 했다. 타이터 측정용에는 좌뇌를, 절편 제작용으로는 우뇌를 사용했다.

6-2.　조직 샘플의 제작

타이터 측정용의 조직을 정량하여 2배 부피의 균질화 용액(20 mM HEPES/ 0.25 M 수크로오스/1 mM EDTA에 사용 직전에 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 5 ㎍/㎖ 루이펩틴, 1 mM PMSF를 첨가)을 첨가하오 얼음에서 균질화했다. 이후 균질화 용액과 동량의 100 mM LiCl/PBS를 첨가해 혼합했다.

혈액은 15,000 rpm, 4℃로 10분간 원심 분리하여 혈장으로 회수되어 타이터를 측정했다.

각 조직의 균질액, 혈장, 관류액은 상기 "3-2-1. 파지(phage)의 타이터 측정"에 기재된 방법으로 파지(phage)의 타이터 값을 결정했다.

각각의 기관이 친화성을 가지는 재조합 파지(phage)는 각각의 조직에서 분리하였다. 이 중, 뇌에서 회수된 파지(phage)를 증식시켜 다시 마우스의 꼬리 정맥 으로부터 주입하여 상기 기재된 분석을 실시했다. 결과적으로, 몇 개의 양성 클론을 분리할 수 있었다. 대표적인 서열을 이하에 나타낸다.

서열 1：MLGDPN-CVKQAVQSSVKHPDLSC-KLAAALE(서열 번호：23)

서열 2：MLGDPN-CPRGLPVTTRLMEKSKC-KLAAALE(서열 번호：24)

이러한 서열을 가지는 파지(phage) 클론을 마우스에 주입했다. 그 결과 뇌에이동될 수 있었다(도 6 및 도 7). 이상의 방법으로, 뇌 특이적으로 전이하는 분자의 후보를 분리할 수 있었다.

그에 더하여, 뇌 이외의 장기를 특이적으로 표적화할 수 있는 분자도 분리할 수 있다고 생각된다. 실제로 도 7에 나타나듯이 뇌 이외의 장기에 친화성을 가지는 파지(phage)를 분리할 수 있었다.

〔 실시예 4〕　뇌 이동 펩티드 결합체

　본 발명자는 뇌 이동성 펩티드 결합체 제작을 실시했다. 상기 결합체는 본 발명의 펩티드 분자 중 시스테인 잔기끼리의 이황 결합에 의해 환상(cyclic) 구조를 취할 수 있어 바이오틴을 접착할 수 있다. 보다 구체적으로는, 도 8에 나타내는 구조를 예시할 수 있다. 상기 결합체는 아비딘 화합물과 결합력을 가진다.

상기 결합체는 골드 콜로이드와 결합시켜 마우스에 투여하여 본 발명의 펩티드의 뇌 이동 활성을 평가하는 실험(투과 전자현미경에 의한 뇌조직 절편의 관찰)을 제공했다. 투과 전자현미경 시료 작성 방법은 표 2에 나타낸다.

블락 제작
1) 전고정	4℃에서 2.5% 글루타알데히드 용액/0.1 M PB 처리
2) 세척	0.1M PBS로 급냉하여 1 내지 2회 세척
3) 후고정	1% 오스뮴 테트라옥사이드 용액/0.1 M PB에서 1시간 동안 얼음에 방치
4) 탈수	에탈올 시리즈 70→80→90→95→100→100→100(%) 차례로 각각 10씩 처리
5) 수지 포매	Epok812 수지 중합 과정 35℃ 12시간; 45℃ 12시간; 60℃ 20시간
절편 제작
1) 트리밍
2) 유리 나이프로 절단하여 절편(2~3 ㎛) 작성
3) 다이아몬드 나이프로 초박절편 (50~100 nm) 작성
4) 전자 염색: 2%초산 우라늄 처리 후1% 구연산으로 처리(각각 3분)
5) 투과 전자 현미경으로 관찰(가속 전압 80 kV)

본 실험에 있어서, 본 발명의 펩티드로서 T2J002(서열 번호：2) 및 T2J004(서열 번호：4)를 이용했다. 마우스 뇌조직(세포)의 전자현미경 사진을 도 9 및 도 10에 나타낸다. 화살표는 골드 입자와 결합한 본 발명의 펩티드 분자의 위치를 나타낸다. 그 결과, 본 발명의 펩티드 결합체 의해 골드 콜로이드를 뇌실질로 이동하는 것에 성공했다. 즉, 본 발명의 펩티드는, 뇌 이동 활성을 가지는 것이 확인되었다.

〔 실시예 5〕　 T2J004Y - 바이오틴 투과 실험

　시약은 하기의 것을 사용하였다:

스트렙토아비딘(Streptavidin), FITC 결합체(벡터 1.0 mg/㎖), T2J004Y-ㅂ바바이오틴, MBEC4 실험을 위한 10% FBS(GIBCO lot.1077859)를 포함하는 DMEM(SIGMA), END-D 실험을 위한 10% FBS(GIBCO lot. 1077859 : 65℃에서 30분동안 불활성화)를 포함하는 DMEM 배지. 상기 "2J004Y-바이오틴"은 서열 번호：4에 나타내는 폴리펩티드를 가진다.

MBEC4(1.26×10⁴ /삽입체), END-D(2×10⁴/삽입체)를 세포 배양 삽입체(FALCON[35]3096: 3.0 μm 기포 크기)에 배양하여 37℃로 5% CO₂하에서 4일간 배양했다.

스트렙토아비딘, FITC 결합체(25 ㎕/삽입체)와 T2J004Y-바이오틴(1.6 nmol/삽입체)를 혼합하여 실온에서 30분간 방치했다. 이 후, 각 배양액으로 250 ㎕을 삽입체의 배양액으로 옮겨놓아 각각의 웰(well)에 배양액 750 ㎕를 참가하였다(세포 배양용 삽입체를 위한 FALCON-24웰). 3, 6, 및 24시간 후 각각의 웰에서 시료 100 ㎕을 덜어내어 Fluoroskan Agent(Thermo Labsystems)를 이용하여 형광도를 측정하였다. 도 11은 본 실험의 개략을 나타낸다.

그 결과, FITC 단독의 경우에 비하여 T2J004Y-바이오틴과 결합시킨 것은 MBEC4에서는 약 8배, END-D에서는 약 4배의 투과를 볼 수 있었다. 또한, 펩티드가 END-D에 비하여 MBEC4에서 2 배량 이상 투과하고 있는 것을 알 수 있어, 투과량은 시간에 비례하여 증가하고 있었다.

〔 실시예 6〕 MBEC4 에서 T2J004Y - 바이오틴 첨가량과 laxnfid 사이의 상관 관계 조사

　아비딘(Avidin)과 바이오틴(Biotin)은 1：4의 비율로 결합한다. 거기서, 스트렙토아비딘 FITC와 반응시키는 T2J004Y-바이오틴의 비율을 바꾸어 MBEC4에 대한 투과량을 검토했다.

시약은 하기를 이용하였다;

스트렙토아비딘, FITC 결합체(VECTOR 1.0 mg/㎖), T2J004Y-바이오틴, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지.

우선 MBEC4(1.26×10⁴/삽입체)를 37℃로 5% CO₂하에서 4일간 배양한 세포에 스트렙토아비딘, FITC 결합체(25 ㎕/삽입체)를 T2JOO4Y-바이오틴 1.6 nmol/삽입체, 0.4 nmol/삽입체, 0.2 nmol/삽입체와 혼합하여 세포에 첨가하고 실온에서 30분간 방치하였다. 혼합된 용액의 부피는 세포 배양액으로 250 ㎕으로 맞추어준다. 세포 배양액의 750 ㎕는 각각의 웰에 첨부하여 Fluoroskan Acsent를 처리한 후 3시간 또는 6시간 후에 형광도를 측정하였다.

투과한 펩티드 양은 첨부한 펩티드의 양과 관련이 있다. 그러나 0.4 nmol/삽입체 펩티드의 첨부와 비교하여 4배의 1.6 nmol 삽입체 펩티드의 첨부하여도 투과한 펩티드의 양은 약 2배 정도였다. 그러므로 1.6 nmol/삽입체 펩티드는 6시간 안에 투과하는 펩티드의 양으로서는 유효 배양 면적(0.3cm²)에 충분히 양인 것이 시사된다(도 12).

〔 실시예 7〕　펩티드에 의한 T2J004Y - 바이오틴 투과 저해

　바이오틴 표지가 없는 펩티드의 사전 처리에 의해 T2J004Y-바이오틴-FITC의 투과가 저해되는지 확인하였다.

시약은 하기의 것을 이용하였다;

스트렙토아비딘, FITC 결합체(VECTOR 1.0 mg/㎖), T2J004Y-바이오틴, MBEC4 실험을 위하여 10% FBS를 포함하는DMEM, CT2J004Y, LT2J004Y. ("CT2J004Y"는 환상(cyclic)을, "LT2J004Y"는 직쇄상의 구조의 분자를 나타낸다. 상기환상(cyclic)은 상기 분자에 포함되는 시스테인 잔기 끼리의 이황 결합에 의한다.)

우선 바이오틴 표지가 없는 펩티드 각 10 nmol/삽입체를 배양액(200 ㎕/삽입체)에 혼합하여 상기의 조건으로 4일간 배양해 둔 삽입체의 배양액에 옮겼다. 30 분 후에 상기 혼합한 펩티드-FITC 혼합액을 배양액으로 50 ㎕ 제조하여 삽입체에 첨가했다. 6시간 후 24 웰 내를 빈번히 교반하여 Fluoroskan Ascent로 형광도를 측정했다.

그 결과 CT2J004Y 및 LT2J004Y 각각은 대략 25% 정도 T2J004Y-바비오틴-FITC 투과를 억제하고 있었다(그림 13).

〔 실시예 8〕파지(phage)사전 처리에 의한 신경교세포 투과 저해

시약은 하기를 사용하였다:

일반적인 세포막 표지를 위한 PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit(SIGMA), 10% FBS를 포함하는 DMEM.

우선 MBEC4(1.26×10⁴ 세포/삽입체)를 삽입체에 접종한 후, 37℃로 5% CO₂하에서 4일간 배양하였고, 대조군 5 ㎕ 및 뇌 이동 펩티드를 제시하는 파지(phage)(10¹³ pfu/㎖) 5 ㎕를 첨가하여 1시간 전 처리를 했다. 신경교세포의 세포막을 PKH26로 염색한 후, 2×10⁵ 세포/삽입체를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 250 ㎕이 되도록 하고 첨가하였다. 세포 배양액 750 ㎕은 웰에 첨가되었으며, 24시간 후에 웰의 바닥 및 배양액 중의 신경교세포의 수를 셌다. 도 14는 본 실험의 개략을 나타낸다.

그 결과 대조군 파지(pahge)에 뇌 이동 펩티드를 제시한 파지(phage)는 MBEC4에서 신경교세포의 투과를 약간 저해하고 있는 것 같았다. 명확한 차이를 얻을 수 없었던 것은 MBEC4의 수용체 수에 대해 리간드인 파지(phage) 또는 신경교세포의 수가 적었기 때문이었다고 사료된다.

〔 실시예 9〕다른 펩티드와 T2J004Y - 바이오틴의 투과성의 비교

　시약은 하기의 것을 사용하였다;

스트렙토아비딘, FITC 결합체(VECTOR 1.0 mg/㎖), T2J004Y-바이오틴, T2J002Y-바이오틴, T2J003Y-바이오틴, MBEC4 실험을 위한 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지.

우선 MBEC4(1.26×10⁴ /삽입체)를 삽입체에 접종하여 37℃로 5% CO₂하에서 4일간 배양했다. 스트렙토아비딘, FITC 결합체(25 ㎕/삽입체)와 T2J004Y-바이오틴, T2J002Y-바이오틴, T2J003Y-바이오틴(각각 1.6 nmol/삽입체)를 혼합하여 실온에서 30분간 방치했다. 이 후, 각 배양액으로 250 ㎕를 제조하여 삽입체 중의 배양액으로 옮겨놓아 웰(세포 배양 삽입체용 플레이트인 FALCON 24 웰)에 750 ㎕ 배양액을 가하였다. 3시간, 6시간, 24시간 후에 웰에서 100 ㎕를 샘플링하여 Fluorskan Ascent를 이용하여 형광도를 측정했다.

그 결과 MBEC4에서 T2J002Y-바이오틴, T2J003Y-바이오틴의 투과비율은 T2J004Y-바이오틴 투과성을 100으로 하여 표시하였다. T2J002Y-바이오틴은 T2J004Y-바이오틴의 20~40% 정도 밖에 투과하지 않았지만, T2J003Y-바이오틴은 대략 1.4배 높이 투과하였다(도 15).

〔 실시예 10〕본 발명의 펩티드를 발현하는 파지(phage)의 뇌 이동 활성

　본 발명의 펩티드를 발현하는 파지(phage)와 대조군 파지(phage)를 혈관내에 투여하여 뇌 이동 활성 검토를 실시했다.

그 결과 본 발명의 펩티드를 발현하는 파지 입자(phage particle)를 뇌 내에서 검출할 수 있었다(도 16).

〔 실시예 11〕신경교세포의 트랜스사이토시스 ( transcytosis ) 활성

　MBEC4를 이용한 혈액뇌관문 모델에서 신경교세포의 트랜스사이토시스(transcytosis) 활성을 관찰했다.

그 결과 신경교세포를 첨가하여 4시간 후 트랜스사이토시스(transcytosis)를검출 할 수 있었다(도 17).

또한, 신경교세포가 혈액뇌관문 모델을 통과할 때 트랜스사이토시스 활성을 전자현미경을 이용해 관찰했다.

그 결과 신경교세포의 돌기가 혈액뇌관문을 형성하는 MBEC4 세포 내에는 함입하는 상이 관찰되었다(도 21 및 도 22).

대조 실험으로서 마크로파지(macrophage)에 대해 같은 실험을 실시했다. 그 결과 마크로파지(macrophage)는 혈액뇌관문을 형성하는 MBEC4에 대해서 느슨하게 접착하여서 세포층의 투과는 볼 수 없었다(도 23 및 도 24).

본 발명자들은 뇌 이동 활성에 관여하는 아미노산 모티프 서열을 처음으로 밝혔으며, 상기 모티브 서열을 포함한 폴리펩티드는 뇌 이동 활성을 가지는 것을 밝혔다. 본 발명의 폴리펩티드는 뇌의 혈관내 내피 세포에 특이적으로 결합하며, 세포 전위 경로(transcelluar pathway)를 유도하므로 물질을 뇌실질에 보내는 것이 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> TISSUE TARGETING JAPAN INC. <120> Polypeptides having brain-disposition activity and utilization of the same <130> 6fpi-01-09 <150> JP 2003-289890 <151> 2003-08-08 <160> 24 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 1 Cys Ser Asn Leu Leu Ser Arg His Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 2 Cys Ser Leu Asn Thr Arg Ser Gln Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 3 Cys Val Ala Pro Ser Arg Ala Thr Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 4 Cys Val Val Arg His Leu Gln Gln Cys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 5 Cys Val Leu Arg His Leu Gln Gln Cys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 6 Cys Arg Gln Leu Val Gln Val His Cys 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 7 Cys Gly Pro Leu Lys Thr Ser Ala Cys 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 8 Cys Leu Lys Pro Gly Pro Lys His Cys 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 9 Cys Arg Ser Pro Gln Pro Ala Val Cys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 10 Cys Asn Pro Leu Ser Pro Arg Ser Cys 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 11 Cys Pro Ala Gly Ala Val Lys Ser Cys 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 12 Cys Pro Ala Gly Ala Leu Lys Ser Cys 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 13 gtatgggata aacaac 16 <210> 14 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (37)..(38) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (40)..(41) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (52)..(53) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (55)..(56) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (58)..(59) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> "n" = a, t, g, or c. <400> 14 gaatccatgc agaatttcnn knnknnknnk nnknnknnkn nknnknnknn knnknnknnk 60 nnkaagcctg ctacagacca t 81 <210> 15 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (36)..(37) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (42)..(43) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (45)..(46) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (48)..(49) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (54)..(55) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (57)..(58) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (60)..(61) <223> "n" = a, t, g, or c. <220> <221> misc_feature <222> (63)..(64) <223> "n" = a, t, g, or c. <400> 15 gatccatgca gaattcctgc nnknnknnkn nknnknnknn knnknnknnk nnknnknnkn 60 nknnktgcaa gcttgctaca gaccat 86 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 16 gaatccatgc agaattcc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 17 atggtctgta gcaagctt 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 18 gatccatgca gaattcctgc 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 19 atggtctgta gcaagcttgc a 21 <210> 20 <211> 236 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 caccaagcgt tggattgttc acccactaat agggaacgtg agctgggttt agaccgtcgt 60 gagacaggtt agttttaccc tactgatgat gtgttgttgc catggtaatc ctgctcagta 120 cgagaggaac cgcaggttca gacatttggt gtatgtgctt ggctgaggag ccaatggggc 180 gaagctacca tctgtgggat tatgactgaa cgcctctaag tcagaatccc gcccag 236 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 21 gctctgcggt aggtactgtt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 22 cggtgcccca aagaatcggt 20 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 23 Met Leu Gly Asp Pro Asn Cys Val Lys Gln Ala Val Gln Ser Ser Val 1 5 10 15 Lys His Pro Asp Leu Ser Cys Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 20 25 30 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 24 Met Leu Gly Asp Pro Asn Cys Pro Arg Gly Leu Pro Val Thr Thr Arg 1 5 10 15 Leu Met Glu Lys Ser Lys Cys Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 20 25 30

Claims

염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 10%이상 함유하는, 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드.
환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 펩티드 영역은 염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)가 10% 이상 포함되는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드.
환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상 펩티드 영역에 적어도 1이상의 염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 가지는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드.
환상(cyclic) 펩티드 영역을 가지며, 상기 환상(cyclic) 펩티드 영역에 적어도 1 이상의 염기성 아미노산 잔기(K 또는 R)를 가지는 한편, 상기 환상(cyclic) 영역의 나머지의 아미노산 잔기중 80%이상이 하기의 아미노산 잔기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

G, A, V, L, S, T, P, Q, H, N.
하기의 아미노산 모티프 서열을 포함하며, 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드;

X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁ _,

상기 식 중, X₁는 S, T, N, P, V 또는 L, X₃는 임의의 아미노산, X₄는 G, S, T, C, N, L, Q, 또는 Y.
제 2항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 환상(cyclic) 영역에 제 5항에 기재된 아미노산 모티프 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 5항 또는 6항에 있어서, 아미노산 모티프 서열이 하기의 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁

상기 식 중, X₁는 S, T, N, P 또는 V, X₃는 임의의 아미노산, X₄는 비전 하극성 아미노산(G, S, T, C, N, Q, Y).
제 5항 또는 6항에 있어서, 아미노산 모티프 서열이 하기의 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

X₁－(R 또는 K)－X₃－X₄, 또는

X₄－X₃－(R 또는 K)－X₁

상기 식 중, X₁는 S, T, P 또는 L, X₃는 임의의 아미노산, X₄는 S, T, C, L, 또는 Q.
제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 전이 이동(transmigriaon) 유도 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌혈관내 내피 세포 (cerebrovascular endothelial cell)와 결합하는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
(a) 서열 번호：1~12 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a)의 폴리펩티드의 양쪽 말단이 시스테인끼리 이황 결합에 의해 환상화(cyclic)된 펩티드 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드; 및

(c) 서열 번호：1~12 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열에 대하여 하나 또는 몇 개의 아미노산이 부가, 결손 혹은 치환된 아미노산 서열로 기재되며, 뇌 이동 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

상기 (a)~(c) 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 길이가 9개 아미노산 이내인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 결합하는 항체.
제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 임의의 분자에 뇌 이동 활성을 부여하는 약제.
제 15항에 있어서, 임의의 분자가 임의의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 약제.
제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성 분자.
제 17항에 있어서, 파지(phage), 또는 상기 파지(phage)의 외피 단백질인 것을 특징으로 하는 분자.
제 17항에 있어서, 분자가 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 분자.
제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드인 것인 것을 특징으로 하는 뇌 운반용 운반자.

.
제 20항에 있어서, 제 1항 내지 12항 중 어느 항의 기재의 폴리펩티드가 미셀, 리포솜, 마이크로캅셀과 결합한 구조인 것을 특징으로 하는 뇌 운반용 운반자.
제 20항 또는 21항의 뇌 운반용 운반자에 약물이 담지된 구조인 것을 특징으로 하는 뇌질환 치료제.
제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 임의의 분자와 결합시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 이동 활성 분자의 제조 방법.
(a) 발현 가능한 상태로 임의의 단백질 분자를 코딩하는 DNA와 제 1항 내지 12항의 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 결합한 구조의 DNA를 포함한 발현 벡터를 제작하는 과정;

(b) 상기 발현 벡터를 세포에 도입하는 과정; 및

(c) 상기 벡터로부터의 발현 산물을 회수하는 과정

을 포함하는 뇌 이동 활성 단백질 분자 제조 방법.
(a) 임의의 분자와 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드가 결합한 구조의 뇌 이동 활성을 가지는 분자를 제조하는 과정; 및

(b) 상기 분자를 사람이 아닌 동물 체내에 투여하는 과정

을 포함하는 임의의 분자를 사람이 아닌 동물의 뇌에 이동시키는 방법.
(a) 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 피검 분자를 접촉시키는 과정;

(b) 상기 폴리펩티드와 피검 분자와의 결합 활성을 검출하는 과정; 및

(c) 상기 폴리펩티드와 결합하는 분자를 선택하는 과정

을 포함하는 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 결합 활성을 가지는 분자의 스크리닝 방법.
(a) 피검 폴리펩티드를 파지(phage) 외피 단백질 상에 제시시킨 파지(phage) 입자를 제작하는 과정;

(b) 상기 파지(phage) 입자를 사람이 아닌 동물에 투여하는 과정;

(c) 상기 사람이 아닌 동물의 뇌조직으로부터 파지(phage) 입자를 회수하는 과정; 및

(d) (c) 과정에서 회수된 파지(phage) 입자에 제시된 피검 폴리펩티드를 뇌이동 활성을 가지는 폴리펩티드로서 선택하는 과정

을 포함하는 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드 스크리닝 방법.
　제 27항에 있어서, 피검 폴리펩티드가 제 5항, 7항, 또는 8항 중 어느 한 항에 기재된 아미노산 모티프 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
　제 27항에 있어서, 파지(phage)는 M13 파지(phage), T7 파지(phage)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 27항에 있어서, (a)과정 이후에 뇌혈관내 내피 세포와 결합하는 파지(phage) 입자를 선택하는 과정을 포함하는 스크리닝 방법.