CN100457775C - 具有脑定位活性的多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有脑定位活性的多肽、包含这些多肽的分子以及赋予脑定位活性的药剂。本申请发明人首次揭示了与脑定位活性相关的氨基酸基序序列。包含这种基序序列并具有脑定位活性的多肽按照如下被发现：合成编码包含随机氨基酸序列的多肽的DNA；并将其组合进噬菌体文库中。所制备到的噬菌体文库被用于筛选具有脑定位活性的多肽，由此产生几种这样的多肽。这些多肽包含共有序列，这使得成功地发现了与脑定位活性相关的氨基酸基序序列。包含所述基序序列的本发明的多肽特异性地与脑血管内皮细胞相结合，并诱导跨细胞路径，该路径使得可以进行脑特异性靶向并将物质转运到脑实质中，这在本发明之前是不可能的。

Description

具有脑定位活性的多肽及其用途
技术领域
本发明涉及具有脑定位活性(brain-localizing activity)的多肽，包含这些多肽的分子，以及赋予脑定位活性的药剂。
背景技术
由于血脑屏障的存在，通过口服施用或者注射在脑中获得药物等的有效浓度要比在其他器官中更加困难。虽然可以通过大剂量施用以确保得到有效的药物浓度，但是这将意味着将过量的药物灌注到外周血中，这将产生副作用例如肾脏或肝脏损伤。因此，变得有必要开发一种选择性地将药物转运到脑中的系统。在这方面正在进行大量的研究。这些研究和开发中的大多数都致力于通过利用脑血管内皮细胞的特性对药物本身进行化学修饰以增强脑定位——物质的脂溶性越高，其越容易穿过血脑屏障。这种方法最多将药物在脑中的定位提高数倍，总的来说在误差范围内。在外周器官中，物质渗透穿过血管内皮细胞的细胞间隙，与此相反，在脑中，脑血管内皮细胞的细胞间隙形成称为紧密连接的特殊结构，几乎不允许血液成分穿过。因此，将物质转运到脑必须在对该物质进行化学修饰使之可溶于脂肪且可以直接整合到细胞膜中后，通过渗透进行。更特别地，不同于外周器官，由于没有替代路径用于将物质转运到脑中，这种方法使物质可以直接渗透到细胞中。但是，由于这种机制异于惯常，其效率低数千至数万倍。因此，这种方法不能被认为是脑特异性药物转运。
随着近来的科技进步，已经开发出靶向在脑血管内皮细胞上表达的膜表面蛋白的技术。特别地，利用被称为转运蛋白的蛋白质的功能将药物掺入到脑中是有效的。如上所述，由于几乎没有任何物质通过细胞间隙渗透到脑中，血液中的氨基酸和糖通过与血脑屏障上表达的转运蛋白结合而被特异性地转运到脑中。运铁蛋白受体是将称为运铁蛋白的蛋白质转运到脑中的转运蛋白分子。运铁蛋白给脑活动所必需的金属酶供应金属离子。据报导，使用特化抗体靶向运铁蛋白受体，会使药物在脑中的定位提高数十倍到约上百倍(参见非专利文献1)。
但是，运铁蛋白受体不仅在脑血管内皮细胞中表达，也在肝脏和肾脏中以更大的量表达。因此，当使用这种系统时，随着被转运到脑中的药物的量的增加，该药物也被导入肝脏和肾脏中。因此，这种方法也不能被称为脑特异性脑转运。此外，虽然已经有关于利用多种转运蛋白分子和反转运蛋白(antiporter)分子如P-糖蛋白的系统的报导，这些系统都未被证明是有效的。
此外，最近开发出利用特殊的功能肽的方法。这些肽被称作为PTD序列，并被鉴定为HIV tat基因产物转运到细胞核所必需的肽序列。这些肽不仅穿过核膜，而且穿过所有种类的细胞膜(参见非专利文献2)，因此当该肽被注射到血液中时能够被分布到遍及整个机体的器官中。PTD肽能够将物质转运到脑中，因为它们能够穿过脑血管内皮细胞的细胞膜。但是，尽管PTD序列介导的通过细胞膜的转移和通过细胞间隙的渗透在外周器官中都是有效的，但是通过细胞间隙的渗透在脑中不存在，使得脑中的物质渗透性比在其他器官中低得多。因此，这种技术也不是脑特异性的。
与此同时，最近已经报导了调节血管内皮细胞的器官特异性的分子。基于器官的功能和特异性，机体中的各个器官具有不同的营养需求和对血液供应的各种因子的不同需求程度。逐渐变得清楚的是，分布在器官中的血管内皮细胞根据其所存在的部位具有略微不同的特性。此外，血管内皮细胞作为与血液中存在的炎症细胞和免疫细胞的直接接触点，控制这些细胞在炎症和病理条件下的入侵。然后，通过识别炎症过程中出现的炎症归巢受体(inflammatory homing receptors)以及组织特异性血管内皮细胞标记分子(称为细胞邮递区号，cellularzip codes)，侵入细胞在病灶处积聚。虽然它们的作用还不清楚，但是这些细胞标记正在引起人们的注意，这是由于这些分子的靶向至少使得可以将感兴趣的分子靶向器官的血管内皮细胞(非专利文献3)。但是，虽然这种方法能够将感兴趣的分子靶向各个器官的血管内皮细胞，但还是必须设计出用于将该分子导入器官的实质中的系统。
非专利文献1：Ningya Shi and William M.Pardridge，Noninvasivegene targeting to the brain.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，Issue 13，7567-7572，June 20，2000.
非专利文献2：Steven R.Schwarze，Alan Ho，AdaminaVocero-Akbani，and Steven E.Dowdy，In Vivo Protein Transduction：Delivery of a Biologically Active Protein into the Mouse.Science 1999September 3；285：1569-1572.
非专利文献3：Renata Pasqualini，Erkki Ruoslahti，Organ targetingin vivo using phage display peptide libraries.Nature Vol.380，28，March1996.
发明内容
本发明是在上述情形下完成的。本发明的一个目的是发现与脑定位活性相关的因子(基序序列)。本发明的另一个目的是提供具有脑定位活性的多肽，包含这些多肽的分子，以及赋予脑定位活性的药剂。
本申请发明人进行了专门研究来解决上述的问题。细胞渗透到组织中的机制包括细胞通过细胞间隙的路径(细胞旁路径，paracellularpathways)和细胞穿过细胞的路径(跨细胞路径，transcellularpathways)。后一种路径被认为在特定条件下出现。当研究进入脑而不破坏血脑屏障的特定类型的细胞(小胶质细胞)的现象时，本申请发明人发现这种细胞具有诱导跨细胞路径的分子(Sawada，M.，Imai，E.，Suzuki，H.，Hayakawa，M.，Kanno，T.，Nagatsu，T.FEBS Lett，433：37-40，1998.Brain-specific gene expression by immortalizedmicroglial cell-mediated gene transfer in the mammalian brain)。
本申请发明人想到这种分子的活性位点的肽片段可以被用以确保脑特异性靶向和物质的转运，这到目前为止是不可能的。
诱导上述机制的配体分子被认为存在于小胶质细胞中。因此，本申请发明人通过从小胶质细胞分离mRNA，制备cDNA文库，将该文库插入到T7噬菌体中，并筛选表达脑定位活性的噬菌体，从而成功地分离并鉴定到了感兴趣的分子。
此外，本申请发明人合成了编码包含随机氨基酸序列的多肽的DNA，将它们插入到噬菌体文库中，并筛选具有脑定位活性的多肽。
结果，本申请发明人获得了多种具有脑定位活性的多肽，并且成功地发现了被认为与脑定位活性相关的氨基酸基序序列及其序列特征。
此外，本申请发明人将包含上述基序序列的合成多肽施用给试验动物，证实了这些多肽确实具有转运到脑中的活性。本申请发明人还进行了专门研究来阐明本发明的多肽转运到脑中的机制，并说明了这些多肽通过移行机制(transmigration mechanism)(跨细胞路径)转运到脑组织中。更特别地，本发明的多肽作为赋予移行诱导活性的分子也是非常有用的。
包含本发明的氨基酸基序序列的多肽或其特征性氨基酸可能具有脑定位活性。此外，本申请发明人证明已经连接了这些多肽的分子具有脑定位活性，即使这些分子是大分子例如噬菌体颗粒。将包含本申请发明人所发现的基序序列的多肽连接到任意分子上以赋予这些分子脑定位活性。因此，包含所述基序序列的多肽可以成为赋予脑定位活性的药剂。
如上所述，本申请发明人成功地解决了上述的问题，从而完成了本发明。也就是说，本发明涉及具有脑定位活性的多肽，包含这些多肽的分子，以及赋予脑定位活性的药剂。更特别地，本发明提供了：
[1]一种具有脑定位活性的多肽(脑定位多肽)，其中该多肽的10％或更多是由碱性氨基酸残基(K或R)组成；
[2]一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽包含一环状肽区域，并且其中该环状肽区域的10％或更多是由碱性氨基酸残基(K或R)组成；
[3]一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽包含一环状肽区域，并且在该环状肽区域中有至少一个或多个碱性氨基酸残基(K或R)；
[4]一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽包含一环状肽区域，并且在该环状肽区域中有至少一个或多个碱性氨基酸残基(K或R)，而且该环状肽区域中其余的氨基酸残基的80％或更多选自如下组的氨基酸残基：
G、A、V、L、S、T、P、Q、H和N；
[5]一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽包含氨基酸基序序列：
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、N、P、V或L；X3表示任意氨基酸；X4表示G、S、T、C、N、L、Q或Y；
[6][2]-[4]中任何一项的多肽，其中所述环状肽区域包含[5]的氨基酸基序序列；
[7][5]或[6]的多肽，其中所述氨基酸基序序列为：
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、N、P或V；X3表示任意氨基酸；X4表示不带电的极性氨基酸(G、S、T、C、N、Q或Y)；
[8][5]或[6]的多肽，其中所述氨基酸基序序列为：
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、P或L；X3表示任意氨基酸；X4表示S、T、C、L或Q；
[9][1]-[8]中任何一项的多肽，其中所述多肽具有诱导移行的活性；
[10][1]-[8]中任何一项的多肽，其中所述多肽具有与脑血管内皮细胞结合的活性；
[11]下述(a)-(c)中任何一项的多肽：
(a)包含SEQ ID NO：1-12中的任何一种氨基酸序列的多肽，
(b)包含一个肽区域的多肽，该肽区域通过由(a)的多肽的两末端上的半胱氨酸残基之间形成的二硫键而被环化，和
(c)一种具有脑定位活性并包含一种在SEQ ID NO：1-12中的任何一种氨基酸序列上具有一个或多个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列的多肽；
[12][1]-[11]中任何一项的多肽，其中所述多肽的长度为9个氨基酸或更少；
[13]编码[1]-[12]中任何一项的多肽的多核苷酸；
[14]与[1]-[12]中任何一项的多肽相结合的抗体；
[15]赋予任意分子脑定位活性的药剂，其中该药剂包含[1]-[12]中任何一项的多肽；
[16][15]的药剂，其中所述任意分子是一种任意多肽；
[17]一种具有脑定位活性的分子，其中该分子包含[1]-[12]中任何一项的多肽；
[18][17]的分子，其中所述分子为噬菌体颗粒或者噬菌体颗粒的外壳蛋白；
[19][17]的分子，其中所述分子是与[1]-[12]中任何一项的多肽形成的融合蛋白；
[20]一种脑送达用载体，其中该载体包含[1]-[12]中任何一项的多肽；
[21]一种脑送达用载体，其中该载体包含一种结构，在该结构中[1]-[12]中任何一项的多肽被结合到胶束、脂质体或微囊上；
[22]一种用于脑疾病的治疗剂，其中该治疗剂包含一种结构，在该结构中药物附载在[20]或[21]的脑送达用载体上；
[23]一种用于制备具有脑定位活性的分子的方法，其中该方法包括将[1]-[12]中任何一项的多肽结合到任意分子上；
[24]一种用于制备具有脑定位活性的蛋白质分子的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)制备包含一种可表达形式的DNA的表达载体，其中该DNA具有一种结构，在该结构中编码任意蛋白质分子的DNA被连接到编码[1]-[12]中任何一项的多肽的DNA上，
(b)将该表达载体导入细胞中，和
(c)收集该载体的表达产物；
[25]一种用于将任意分子转运到非人动物的脑中的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)制备具有脑定位活性的分子，其中该分子包含一种结构，在该结构中一种任意分子被结合到[1]-[12]中任何一项的多肽上，和
(b)将该分子施用到非人动物的机体中；
[26]一种筛选具有与[1]-[12]中任何一项的多肽结合的活性的分子的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)将[1]-[12]中任何一项的多肽与测试分子相接触；
(b)检测所述多肽与所述测试分子之间的结合活性，和
(c)选择与所述多肽相结合的分子；
[27]一种筛选具有脑定位活性的多肽的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)制备在其噬菌体外壳蛋白上展示测试多肽的噬菌体颗粒，
(b)将所述噬菌体颗粒施用给非人动物，
(c)从所述非人动物的脑组织中收集噬菌体颗粒，和
(d)选择在步骤(c)中收集的噬菌体颗粒上展示的测试多肽作为具有脑定位活性的多肽；
[28][27]的方法，其中所述测试多肽包含[5]、[7]和[8]中任何一项的氨基酸基序序列；
[29][27]的方法，其中所述噬菌体为M13噬菌体或T7噬菌体；和
[30][27]的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)后选择与脑血管内皮细胞相结合的噬菌体颗粒。
本发明提供了具有脑定位活性的多肽。一般地，将物质从血液转运到脑组织中受到一种称为血脑屏障(BBB)的结构的限制。这一结构使得脑免遭有害物质的损害。在本发明中，“脑定位活性”是指被施用给机体的分子如多肽(例如，通过静脉内施用)转运到脑组织中的活性。本发明的多肽可以是具有脑定位活性的普通多肽(脑定位多肽)，但也可以是例如具有穿过血脑屏障或者能够诱导移行(胞吞转运作用)的多肽。本发明的多肽可以与其他物质(分子)结合以将它们转运到脑中。因此，本发明的多肽可以被称作为“赋予脑定位活性的多肽”、“脑定位肽标记”或“脑定位活性赋予剂”。
此外，本申请发明人揭示了9个氨基酸的多肽能够赋予其他物质(分子)有效的脑定位活性。因此，至少可以说短至9个氨基酸的多肽能够赋予其他分子有效的脑定位活性。对本发明的多肽的长度没有特别限制，但例如为100个氨基酸或更少，优选15个氨基酸或更少，更优选为9个氨基酸或更少，最优选4-9个氨基酸。
在下述实施例中通过试验证明了包含如下序列之一的多肽具有脑定位活性。
表1
名称        氨基酸序列
T2J001      CSNLLSRHC    (SEQ ID NO：1)
T2J002      CSLNTRSQC    (SEQ ID NO：2)
T2J003      CVAPSRATC    (SEQ ID NO：3)
T2J004      CVVRHLQQC    (SEQ ID NO：4)
T2J004V3L   CVLRHLQQC    (SEQ ID NO：5)
T2J006      CRQLVQVHC    (SEQ ID NO：6)
T2J007      CGPLKTSAC    (SEQ ID NO：7)
T2J008      CLKPGPKHC    (SEQ ID NO：8)
T2J009      CRSPQPAVC    (SEQ ID NO：9)
T2J012      CNPLSPRSC    (SEQ ID NO：10)
T2J013      CPAGAVKSC    (SEQ ID NO：11)
T2J013V6L   CPAGALKSC    (SEQ ID NO：12)
在一个优选的实施方式中，本发明的多肽包含下述[序列1]的氨基酸基序序列，更优选[序列2]的氨基酸基序序列或[序列3]的氨基酸基序序列。换句话说，本发明的一个优选的实施方式提供了至少包含以下所示的[序列1]-[序列3]的氨基酸基序序列中的任何一种的多肽。
[序列1]X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中：
X1表示S(丝氨酸)、T(苏氨酸)、N(天冬酰胺)、P(脯氨酸)、V(缬氨酸)或L(亮氨酸)；
X3表示任意的氨基酸；和
X4表示G(甘氨酸)、S(丝氨酸)、T(苏氨酸)、C(半胱氨酸)、N(天冬酰胺)、L(亮氨酸)、Q(谷氨酰胺)或Y(酪氨酸)。
[序列2]X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中：
X1表示S(丝氨酸)、T(苏氨酸)、N(天冬酰胺)、P(脯氨酸)或V(缬氨酸)，且优选为S或T；
X3表示任意的氨基酸；和
X4表示G(甘氨酸)、S(丝氨酸)、T(苏氨酸)、C(半胱氨酸)、N(天冬酰胺)、Q(谷氨酰胺)或Y(酪氨酸)，且更优选为T、Q或C。在上述的(R或K)中，更优选R。
这些氨基酸(G、S、T、C、N、Q和Y)通常被分类为不带电的极性氨基酸。
[序列3]X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中：
X1表示S(丝氨酸)、T(苏氨酸)、P(脯氨酸)或L(亮氨酸)；
X3表示任意的氨基酸；和
X4表示G(甘氨酸)、S(丝氨酸)、T(苏氨酸)、C(半胱氨酸)、L(亮氨酸)或Q(谷氨酰胺)。
在此，氨基酸用常规的单字母代码描述(例如，R为精氨酸，K为赖氨酸)。此外，氨基酸序列按照传统的描述方法以从N末端至C末端的顺序书写。
本申请发明人发现具有一种结构的多肽显示出较高的脑定位活性，在该结构中上述肽被环化(更特别地，通过肽末端的半胱氨酸之间形成的二硫键(S-S键)被环化)。
因此，在一个优选的实施方式中，本发明的多肽具有环状结构。在本发明中，上述基序序列可以在构成这种环状区域的多肽中被发现。构成基序序列的氨基酸由四个邻近的氨基酸残基组成。这些邻近的氨基酸通常相互形成肽键，当它们为半胱氨酸时可以形成二硫键。本发明的基序序列中的“四个邻近的氨基酸残基”不限于那些通过肽键相互结合的氨基酸，而且当这些邻近的氨基酸为半胱氨酸时还可以形成二硫键。更特别地，上述[序列1]-[序列3]中的符号“-”通常是指肽键，当邻近氨基酸为半胱氨酸时，“-”可以指二硫键(S-S键)。例如，即使没有在直链多肽的氨基酸序列中发现本发明的基序序列，本发明的基序可以通过由于环状结构形成而变得相邻的氨基酸形成。
此外，在本发明的优选的实施方式中，只要一种多肽包含上述由4个氨基酸组成的基序序列，对该多肽的非基序氨基酸序列没有特别的限制。
表1中所描述的具有脑定位活性的多肽具有如下特征。
在可能形成环状结构的多肽区域中(即除两末端的半胱氨酸之外的氨基酸序列)，(1)所有多肽包含一个碱性氨基酸，K或R，和(2)其余的氨基酸残基由10种氨基酸(G、A、V、L、S、T、P、Q、H和N)中的任何一种组成。
因此，本发明的一个优选的实施方式提供了具有脑定位活性的多肽；包含环状区域的多肽，在该环状区域中存在至少一个或多个碱性氨基酸残基(K或R)，而其余的氨基酸残基(通常为80％或更多，优选85％或更多，更优选90％或更多，还更优选95％或更多，最优选100％)选自氨基酸残基组[G、A、V、L、S、T、P、Q、H和N](这一特征在本说明书中可以被称作为“特征1”)。在本发明的一个更优选的实施方式中，多肽具有上述述“特征1”，并且包含本发明的基序序列([序列1]-[序列3])。
此外，如上面“特征1”中所述，本发明的全部多肽被发现包含碱性氨基酸(K或R)。例如，在实施例中所使用的9个氨基酸的多肽中，发现了至少一个碱性氨基酸(在总氨基酸中的含量为1/9＝0.11(11％)或更高)。
因此，在本发明的一个实施方式中，提供了如下的肽：
(a)一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽包含10％或更多的碱性氨基酸(K或R)；
(b)一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽包含环状肽区域，并且在该环状肽区域中具有10％或更多的碱性氨基酸残基(K或R)；和
(c)一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽包含环状肽区域，并且在该环状肽区域中具有至少一个或多个碱性氨基酸(K或R)。
对本发明的多肽的长度的上限没有特别的限制。通常，7个氨基酸或更长并包含4个氨基酸序列基序或者前述“特征1”的多肽被认为具有有效的脑定位活性。虽然对长度没有上限，长度为50个氨基酸或以下，或优选长度为35个氨基酸或以下的多肽通常被认为具有足够的脑定位活性。此外，由于包含这些多肽的更长的多肽通常具有脑定位活性，本发明的多肽的长度不受限制。
在本发明的一个优选的实施方式中，对于待环化的多肽区域的长度没有特别限制。在一个试验中，本申请发明人使用了在其两末端包含半胱氨酸残基的9个氨基酸残基的多肽作为待环化的肽的例子。更加特别地，例如，包含长度为10个氨基酸或以上的环状结构的多肽被认为具有脑定位活性，只要该多肽具有本发明的基序序列或“特征1”。因此，本发明的多肽中的环状肽区域的长度不受限制，例如为100个氨基酸或更少，优选50个氨基酸或更少，更优选为4-30个氨基酸，再更优选4-15个氨基酸，甚至更优选4-9个氨基酸，最优选4-7个氨基酸。
此外，在一个优选的实施方式中，本发明的多肽包含以下功能(活性)A和/或B：
(A)移行(胞吞转运作用)诱导活性
(B)脑血管内皮细胞结合活性。
(A)中的术语“移行”是指一种现象，在该现象中某些分子通过穿过血管内皮细胞而不是血管内皮细胞的细胞间隙渗透入脑中。这被称作为“跨内皮细胞迁移”、“跨细胞路径”或者“胞吞转运作用”。通过这种机制穿过血管内皮细胞的分子(细胞等)可能在其表面上具有信号分子，并通过这些细胞表面上的受体在血管内皮细胞中诱导上述现象(图1)。
可以认为本发明的多肽具有在血管内皮细胞中诱导移行的活性。更特别地，本发明的多肽可以用作诱导移行的信号分子。
信号分子被认为在移行的早期结合到脑血管内皮细胞上(例如细胞上的受体)。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的多肽的特征之一是具有与脑血管内皮细胞结合的活性。
任意的测试分子是否具有(A)的移行诱导活性或其是否具有(B)的脑血管内皮细胞结合活性，可以用本领域技术人员熟知的方法进行适当的评估。举例来说，可以通过将一种荧光标记的分子施用到血管中，然后在荧光显微镜下观察脑血管内皮细胞的冷冻横截面进行评估。例如，如果观察到附着了荧光标记的测试分子的血管内皮细胞，基酸序列的多肽。
在(c)的多肽中，氨基酸添加、缺失或取代优选发生在非本发明的基序氨基酸残基([序列1]-[序列3])中，和/或优选在使得所述多肽具有本发明的“特征1”的情况下发生。此外，“几个”通常是指在2-9的范围内的数目。
对于本发明的多肽在其中显示脑定位活性的生物体没有特别的限制，只要该生物体是具有血脑屏障的动物，但是通常为哺乳动物，优选小鼠、大鼠、沙鼠、猫、牛、猴或人。
本发明的多肽可以是来源于天然蛋白质的多肽、来源于重组蛋白的多肽、化学合成的多肽，等等。本领域技术人员可以合成包含任何氨基酸序列的多肽。例如，多肽例如那些包含上述基序序列和/或“特征1”的多肽的合成可以通过使用本领域技术人员已知的方法例如使用市售的多肽合成仪的方法适当地进行。
此外，本发明还包括编码本发明的多肽的多核苷酸。多核苷酸通常包括DNA和RNA。更具体地，编码本发明的多肽的DNA，以及作为这些DNA的转录产物的RNA都包括在本发明中。
本发明提供了插入了本发明的多核苷酸的载体，携带本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞，以及使用所述宿主细胞制备本发明的多肽的方法。
对本发明的载体没有特别的限制，只要所插入的DNA被稳定地维持。例如，当采用大肠杆菌作为宿主时，克隆载体优选为pBluescript载体(Stratagene)等。表达载体特别适用于作为制备本发明的多肽的载体。对表达载体没有特别的限制，只要它们能够在试管、大肠杆菌、培养细胞或生物个体内表达多肽。例如，优选的载体为用于在试管中表达的pBEST载体(Promega)，用于大肠杆菌的pET载体(Invitrogen)，用于培养细胞的pME18S-FL3载体(GenBank登录号AB009864)，用于生物个体的pME18S载体(Mol.Cell Biol.8：466-472基酸序列的多肽。
在(c)的多肽中，氨基酸添加、缺失或取代优选发生在非本发明的基序氨基酸残基([序列1]-[序列3])中，和/或优选在使得所述多肽具有本发明的“特征1”的情况下发生。此外，“几个”通常是指在2-9的范围内的数目。
对于本发明的多肽在其中显示脑定位活性的生物体没有特别的限制，只要该生物体是具有血脑屏障的动物，但是通常为哺乳动物，优选小鼠、大鼠、沙鼠、猫、牛、猴或人。
本发明的多肽可以是来源于天然蛋白质的多肽、来源于重组蛋白的多肽、化学合成的多肽，等等。本领域技术人员可以合成包含任何氨基酸序列的多肽。例如，多肽例如那些包含上述基序序列和/或“特征1”的多肽的合成可以通过使用本领域技术人员已知的方法例如使用市售的多肽合成仪的方法适当地进行。
此外，本发明还包括编码本发明的多肽的多核苷酸。多核苷酸通常包括DNA和RNA。更具体地，编码本发明的多肽的DNA，以及作为这些DNA的转录产物的RNA都包括在本发明中。
本发明提供了插入了本发明的多核苷酸的载体，携带本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞，以及使用所述宿主细胞制备本发明的多肽的方法。
对本发明的载体没有特别的限制，只要所插入的DNA被稳定地维持。例如，当采用大肠杆菌作为宿主时，克隆载体优选为pBluescript载体(Stratagene)等。表达载体特别适用于作为制备本发明的多肽的载体。对表达载体没有特别的限制，只要它们能够在试管、大肠杆菌、培养细胞或生物个体内表达多肽。例如，优选的载体为用于在试管中表达的pBEST载体(Promega)，用于大肠杆菌的pET载体(Invitrogen)，用于培养细胞的pME18S-FL3载体(GenBank登录号AB009864)，用于生物个体的pME18S载体(Mol.Cell Biol.8：466-472(1988))。通过标准方法，例如利用限制性酶切位点的连接酶反应可以将本发明的DNA插入到载体中(Current protocols in MolecularBiology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley&Sons.Section11.4-11.11)。
对插入本发明的载体的宿主细胞没有特别的限制，根据要达到的目的可以使用不同的宿主细胞。用于表达多肽的细胞包括细菌细胞(例如，链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、真菌细胞(例如，酵母和曲霉菌(Aspergillus))、昆虫细胞(例如，果蝇(Drosophila)S2和秋粘虫(Spodoptera)SF9)、动物细胞(例如，CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤细胞)和植物细胞。可以采用已知方法，例如磷酸钙沉淀方法、电穿孔方法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley&Sons.Section 9.1-9.9)、脂质转染胺方法(GIBCO-BRL)以及微注射方法将载体导入宿主细胞中。
为了将宿主细胞表达的多肽分泌到内质网腔、周质间隙或细胞外环境中，可以将合适的分泌信号组合到感兴趣的多肽中。这些信号对于感兴趣的多肽而言可以是内在的或外源的。
当本发明的多肽被分泌到培养基中时，通过收获培养基来收集这些多肽。当本发明的多肽在细胞中生成，通过将溶解细胞来收集这些多肽。
可以通过已知方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸性提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲合层析、羟磷灰石层析和凝集素层析，从重组细胞培养物中收集和纯化本发明的多肽。
由于本发明的多肽具有脑定位活性，这些多肽所结合的分子也被期待具有脑定位活性。本申请发明人证明了当本发明的多肽被结合到通常不具有脑定位活性的噬菌体颗粒的外壳蛋白中时，该噬菌体确实获得了脑定位活性。因此，本发明的多肽被认为通过与任意分子相结合而赋予了这些分子脑定位活性。即本发明的多肽有用在它们能够赋予其他分子脑定位活性。本发明提供了包含本发明的多肽的药剂，用于将脑定位活性赋予给任意分子。在一个优选的实施方式中，提供了用于将任意分子转运到脑中的肽标记，其中该标记包含上述氨基酸基序序列和/或包含上述“特征1”的多肽。
本发明的肽标记的例子包括由本发明的多肽和生物素之间形成的偶联分子，这将在后面的实施例中进行描述。这种偶联分子可以与任何抗生物素偶联分子适当地连接。更特别地，具有如图8中所示结构的脑定位肽偶联分子，或者特别用于以下实施例中的偶联分子被作为优选的实施方式包含在本发明中。通过使用这些偶联分子，可以将所需的偶联了抗生物素的分子转运到脑中。通过使用这些偶联分子将任何分子转运到脑中的方法也包含在本发明中。此外，本发明包括已经被上述的本发明的药剂赋予脑定位活性的分子。
对于被本发明的多肽(药剂)赋予脑定位活性的分子没有特别的限制，包括：单一化合物，例如天然化合物、有机化合物、无机化合物、糖链、蛋白质和肽；以及化合物文库，基因文库的表达产物、细胞、细胞提取物、细胞培养物上清液、微生物、微生物的产物、噬菌体、抗原、抗体、胶束(聚合体胶束等)、脂质体、微囊、肽核酸(PNA)和药物化合物。如果必要，本发明的多肽或者前述的分子可以被适当地标记。所述标记包括放射性标记、荧光标记和酶标记。
对于通过本发明的多肽而被赋予脑定位活性的分子的大小没有特别的限制，但最大一般是使该分子从能够物理穿过血脑屏障的大小。如实施例所证明的那样，具有标准噬菌体大小的分子能够凭借本发明的多肽的作用穿过血脑屏障。因此，这些分子(物质)的大小可能与噬菌体的大小相似。例如，如果将被赋予脑定位活性的分子由氨基酸构成，它们可以包含约100,000个氨基酸。
根据分子的类型，本领域技术人员可以采用已知方法将上述分子与本发明的多肽适当地结合起来。
例如，可以通过使用市售的偶联剂(N结合型、COOH结合型、氨基酸残基修饰型、S-S联接型，等)的方法、使用氯胺T的方法、导入异硫氰酸根基团的方法等，将所述分子和本发明的多肽连接起来。
此外，当所述分子是一种蛋白质时，可以使用编码本发明的蛋白质和多肽的融合蛋白的DNA来制备连接了本发明的多肽的分子。
更特别地，可以通过包含如下步骤的方法来制备这种分子：
(a)制备一种包含可表达形式的DNA的表达载体，其中该DNA具有一种结构，在该结构中编码任意蛋白质分子的DNA被连接到编码本发明的多肽的DNA上；
(b)将所述表达载体导入细胞中；和
(c)收集所述载体的表达产物。
本发明还提供了脑送达用载体，其中该载体包含具有脑定位活性的本发明的多肽。这些载体也可以被称作为“附载物”或“转运蛋白”。在本发明中，具有脑定位活性的多肽本身就是这种载体的例子。即，通过将本发明的多肽直接连接到待转运到脑中的分子上，可以将该分子运送给脑。此外，本发明的载体的优选的实施方式包括包含一种其中本发明的多肽被连接到胶束(聚合体胶束)、脂质体或者微囊上的结构的载体。
此外，通过使用本发明的载体，可以将所需的药剂转运到脑中。例如，通过使用载体来附载一种对脑疾病具有治疗作用的化合物(药物组合物)，该化合物可以被有效地运送给脑，并产生有效的治疗作用。用于附载化合物(药物组合物)的载体本身被期望是脑疾病的治疗剂。因此，本发明提供了用于脑疾病的治疗剂，其包含一种结构，在该结构中一种药物被附载在本发明的载体上用于运送给脑。“被附载”可以指药物被直接结合到载体上的情形或药物(药物组合物)被包含在载体中的情形。
此外，本发明提供了用于制备本发明的具有脑定位活性的分子的方法。在本发明的一个优选的实施方式中，用于制备具有脑定位活性的分子的方法包括将本发明的多肽结合到任意分子上。当该分子为蛋白质时，本发明提供包含上述步骤(a)到(c)的制备方法作为优选的实施方式。
此外，优选用于结合到待赋予脑定位活性的分子上的本发明的多肽位于这些分子的外表面。更具体地，本发明的多肽被期望能以使得所述多肽位于分子表面上的方式结合到该分子上。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明的多肽包括包含一种序列的多肽，在该序列中半胱氨酸残基(C)位于上述基序的两端。该多肽中的两个半胱氨酸残基的SH基团通常通过自身氧化作用而交联(二硫键结合)。一旦这两个半胱氨酸之间形成交联，如上述的位于两个半胱氨酸残基之间的包含所述基序序列的多肽链将形成环状的突出。也就是说，通过将上述半胱氨酸残基导入本发明的多肽，所述多肽可以被有效地置于该分子的表面(外表面)。用于将本发明的多肽置于外表面的其他方法包括：重组生产方法，该方法将本发明的多肽置于待导入所述多肽链的蛋白质分子的外露的结构域上；将交联剂例如PEG与蛋白质、脂质、合成载体等结合，和将多肽链连接到PEG链的末端上的方法；以及将多肽链化学结合到载体表面上的方法。
待结合到本发明的多肽上的分子的例子包括所需的直接转运到脑组织中用于脑疾病治疗的化合物。本发明的多肽赋予了这些化合物脑定位活性。结果，当这些化合物被施用到体内时，它们将被有效地转运到脑组织中并发挥治疗效果。
本发明包括上述具有脑定位活性以及对脑疾病具有潜在的治疗作用的分子，以及包含这些分子的药剂。
本发明的具有脑定位活性的多肽可作为治疗脑神经疾病的治疗策略被应用于如下情形。
1)补充其量和活性已经由于缺失或突变而下降的酶和生物活性蛋白质的补充治疗：
通过注射携带缺乏的蛋白质和酶的基因的细胞对各种由于遗传缺失或突变导致脑中缺乏特定的酶或蛋白质而引起的脑疾病实施这些治疗。对于在帕金森病和阿尔茨海默氏病中特定神经细胞的退行性丢失，可以使用促进神经传递素合成的基因，神经传递素会由于的的退行性丢失而变得缺乏；例如，与多巴胺生物合成有关的酶包括酪氨酸羟化酶和生物蝶呤合酶的基因可以被用于治疗帕金森病。
2)用于保护将会由于变性等而丢失的神经细胞并用于增强其功能的保护治疗：
通过注射表达神经营养因子如NGF、BDNF、GDNF和NT3(进来的发现表明BDNF和GNNF对于帕金森病尤其有效)的基因的细胞来实施这些治疗，这些因子抑制了由各种原因包括变性疾病和脑缺血所引起的神经细胞死亡，并促进神经突的再生。此外，通过导入表达具有免疫抑制作用的TGF-β或IL-10的基因的细胞进行与免疫细胞有关的疾病如多发性硬化的治疗。
3)用于消除肿瘤、血凝块等的方法：
通过表达具有抗肿瘤作用的因子或通过将携带抗肿瘤剂的细胞转移到脑中来实施这些方法。为了消除血凝块，可以表达纤维蛋白溶酶。
4)将有效药物单独导入脑中的方法：
在作用于神经系统的药物中，一些具有高度的外周毒性，一些作用于外周神经系统，而其他的不能容易地穿过血脑屏障；因此，需要特异于脑的药物输送系统。使用本发明的多肽可以将药物特异地施用到脑中，而对外周器官的影响很少。
5)作为脑疾病预防系统的应用：
小胶质细胞是最早聚集在变性或炎症部位以除去死亡细胞的细胞，并参与损伤修复。它们还具有抗肿瘤作用以及抗病毒作用，因而可被称作为脑内防御系统。因此，通过遗传工程等增强这些特性，小胶质细胞不仅可用于单一疾病的治疗，而且还可用于通过增强脑内防御系统自身以预防各种疾病。
本发明的药剂可以只包含本发明的多肽，或者一种包含所述多肽并且具有脑定位活性的分子；或者可以用已知的药物制备方法来配制。例如，通过与合适的常规使用的载体或媒介物例如灭菌水、生理盐水、植物油(例如芝麻油和橄榄油)、着色剂、乳化剂(例如胆固醇)、悬浮剂(例如阿拉伯树胶)、表面活性剂(例如聚氧乙烯硬化蓖麻油表面活性剂)、增解剂(例如磷酸钠)、稳定剂(例如糖、糖醇和白蛋白)或防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)适当地结合，可以将所述药剂配制到适于有效施用于体内的药用制剂中例如注射液(优选)、经鼻制剂、经皮制剂或口服剂。例如，注射液制剂可以以冻干产品、用于注射的溶液等形式提供。
此外，可以通过例如动脉内注射、静脉内注射或皮下注射，以及通过本领域技术人员已知的方法进行的鼻内的、经支气管的、肌内的或者口服的施用来进行体内施用。在这些方法中，优选动脉内施用。
此外，本发明包含已经被本发明的药剂赋予脑定位活性的分子。例如，优选在其外壳蛋白上表达本发明的多肽的噬菌体。
对噬菌体没有特别的限制，但是优选的例子包括T7噬菌体和M13噬菌体。当使用T7噬菌体时，本发明的多肽可以被展示在被称为衣壳的外壳蛋白的外表面上。
本发明涉及与本发明的多肽结合(或优选特异性地结合)的抗体。在本申请中，术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体以及包含其他免疫球蛋白表达文库产物的Fab或Fab片段。
本发明的多肽或表达该多肽的细胞可以被用作用于制备与这一多肽结合的抗体的免疫原。所述抗体优选对本发明的多肽具有特异免疫反应性。术语“特异免疫反应性”意指抗体对本发明的多肽的亲合力实质上高于对其他多肽的亲和力。
可以通过本领域技术人员已知的方法制备与本发明的多肽结合的抗体。例如，可以按照如下获得多克隆抗体。本发明的多肽或其GST融合蛋白被用于免疫小动物例如兔，并收集其血清。通过使用硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱层析、DEAE离子交换层析、使用已经偶联了本发明的多肽的柱的亲合层析等纯化这些血清而制备抗体。对于单克隆抗体的制备，例如，本发明的多肽被用于免疫小动物例如小鼠，摘出它们的脾脏并进行匀浆以分离细胞，使用试剂例如聚乙二醇将这些细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。从生成的融合细胞(杂交瘤)中选择生产与本发明多肽结合的抗体的克隆。接着，将获得的杂交瘤移植到小鼠的腹腔中，从这些小鼠收集腹水，使用硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱层析、DEAE离子交换层析、使用已经偶联了本发明的多肽的亲和柱的亲合层析等纯化所获得的腹水可以制备到单克隆抗体。
本发明的抗体可以被用于分离、鉴定和纯化本发明的多肽或者表达这些多肽的细胞。如下所述，本发明的多肽可被适当地用于筛选具有与本发明的多肽结合的活性的分子的方法中。
本发明提供了筛选具有与本发明的多肽结合的活性的分子的方法。在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括如下步骤：
(a)将本发明的多肽与测试分子接触；
(b)检测所述多肽与测试分子之间的结合活性；和
(c)选择与所述多肽结合的分子。
例如，通过本发明的筛选方法可以获得其配体为本发明的多肽的受体。这种受体有望参与脑血管内皮细胞中的移行。对通过本发明的筛选方法所获得的受体进行功能性分析将有助于移行机制的阐明。本发明的筛选方法在获得与内皮细胞附着相关的分子的方面是十分有用的。
通常，步骤(a)中提及的“接触”是根据本发明的多肽的状况适当地进行。例如，如果本发明的多肽处于纯化状态，可以通过将测试分子(样品)添加到纯化制剂中进行接触。如果本发明的多肽是在细胞或者细胞提取物中表达，可以通过将测试分子(样品)分别添加到细胞培养物或者细胞提取物中进行接触。如果所述测试分子是一种蛋白质，可以通过例如将包含编码所述蛋白质的DNA的载体导入表达本发明的多肽的细胞中，或通过将所述载体添加到表达本发明的多肽的细胞提取物中进行接触。
此外，用于该筛选方法的测试分子和本发明的多肽可以按照需要进行适当地标记进行使用。标记的例子包括放射性标记、荧光标记和酶标记。
可以通过本领域技术人员熟知的方法来测量结合活性，例如利用双杂交系统的方法和利用免疫沉淀的方法。用于测量蛋白质之间的相互作用(结合活性)的各种方法是已知的，对本发明的结合活性的测量不限于特定的方法。
例如，将本发明的多肽与含有其与本发明的多肽的结合活性待评价的测试分子的样品例如细胞培养物悬浮液或细胞提取物相接触，然后本发明的抗体可以被添加到所述分子与本发明的多肽的共免疫沉淀物中。测试分子与本发明的多肽之间的结合可以根据免疫沉淀产物的电泳迁移率是否与单独使用本发明的多肽时获得的电泳迁移率不同来测定。此外，通过利用本发明的多肽的结合的方法例如亲合层析，可以收集在其中检测结合的样品中的测试分子。
此外，可以通过使用噬菌体载体从组织或细胞产生cDNA文库，所述组织或细胞被预测为将表达可以与本发明的多肽相结合的测试分子，例如蛋白质；在琼脂糖上表达该文库；然后将蛋白质转移到滤膜上；将它们与经标记的本发明的多肽反应并进行检测表达与所述经标记的多肽相结合的测试分子的空斑的“West蛋白质印迹”来实施本发明的方法。
此外，本领域技术人员通常使用的技术包括：将固定在固体等上面的本发明的多肽与合成化合物、天然产物库、随机噬菌体肽展示文库等反应，然后筛选与这些多肽相结合的分子的方法；以及使用组合的化学技术，通过高通量筛选分离候选化合物的方法。
对所述的测试化合物没有特别限制，例如，可以使用通过应用噬菌体展示方法生产的各种已知化合物和肽，或一组随机肽。使用展示本发明的多肽的噬菌体和展示上述一组随机肽的噬菌体的“双噬菌体展示方法”(J.Castillo，B.Goodson and J.Winter：T7 displayed peptidesas targets for selecting peptide specific scFvs from M13 scFv displaylibraries：J.Immunol.Methods：257：1-2：117-22：2001)也可适用于本发明的筛选方法中。
此外，微生物的培养上清、植物、来源于海洋生物的天然成分等可以作为筛选目标。其他例子包括活组织提取物、细胞提取液、基因文库的表达产物，等等，但并不特别地限于此。
多肽通常是由双链DNA的一条链所编码的基因产物。被假定为具有由另一条链所编码的氨基酸序列的肽被称作为反义肽。1984年，Blalock等人提出反义肽与原始肽(有义肽)相互作用的假设，此后有过许多关于有义肽和反义肽之间相互作用的报道。因此，通过将来源于编码本发明的多肽的DNA的互补链序列的反义肽作为测试分子用于本发明的筛选方法，可以有效地获得与本发明的多肽相结合的分子。
与本发明的多肽相结合的分子作为脑定位活性的抑试剂、增强或修饰脑定位活性的诱导物、受体(诱导移行的分子)等是有用的。
本发明还涉及用于获得具有脑定位活性的多肽的方法。本发明的一个优选的实施方式提供了筛选具有脑定位活性的多肽的方法(用于获得或分离的方法)，其中该方法包括如下步骤(a)到(d)：
(a)制备在其噬菌体外壳蛋白上展示测试多肽的噬菌体颗粒；
(b)将所述噬菌体颗粒施用给非人动物；
(c)从所述非人动物的脑组织收集噬菌体颗粒；和
(d)选择展示在步骤(c)中收集的噬菌体颗粒上的测试多肽作为具有脑定位活性的多肽。
对上述方法中的测试多肽的序列没有特别的限制，可以使用包含任何氨基酸序列的多肽。通常，本发明的测试多肽是多种类型的多肽，包括随机的氨基酸序列。此外，通过将包含上述氨基酸基序序列或所述基序序列的一部分的多肽或者具有上述的“特征1”的多肽作为测试多肽用于本发明的筛选方法，可以有效地实施本发明的方法。
对所述测试多肽的长度没有特别的限制，只要是可展示在噬菌体外壳蛋白上的可接受长度。本领域技术人员可以根据噬菌体的类型等来设定测试多肽的长度。
通过使用已知的技术，本领域技术人员可以很容易地制备包含任何氨基酸序列的多肽。例如，可以用市售的肽合成仪等来制备测试多肽。
在步骤(a)中用于在噬菌体外壳蛋白上展示任意多肽的方法是本领域技术人员通常知晓为“噬菌体展示方法”的技术。通常通过利用噬菌体的生活周期在噬菌体外壳蛋白上展示任意多肽来制备分子文库。例如，化学合成随机化的DNA，然后采用遗传工程化技术将其插入噬菌体DNA中。通过将这些DNA插入宿主细胞例如大肠杆菌中，噬菌体分子被生物合成，由随机化的DNA所编码的多肽被展示在病毒外壳蛋白上。
更特别地，实施例中描述的方法(程序)是制备在其外壳蛋白上展示测试多肽的噬菌体颗粒的步骤的例子。
可以被用于本发明的筛选方法中的噬菌体是已知的噬菌体，例如M13、T7、f1和fd。噬菌体外壳蛋白的例子包括pIII、10A、10B和衣壳。可以被展示在pIII蛋白质上的文库是市售的，且这些文库可以被适当地用于本发明的筛选方法中。
此外，在本发明的一个优选的实施方式中，通过在步骤(b)之前淘选在步骤(a)中制备的噬菌体颗粒可以选择可与脑血管内皮细胞相结合的噬菌体颗粒。这一程序使得可以有效地进行本发明的筛选。
淘选方法是一种利用蛋白质相互作用的选择方法，可由本领域技术人员根据噬菌体等的类型适当地进行。例如，淘选方法可按如下被用于本发明的筛选方法中。首先，为了通过培养可以容易地与脑血管内皮细胞相结合的噬菌体进行浓缩，通过吸收除去与对照细胞(小鼠神经胶质瘤细胞)反应并且与它们非特异性结合的噬菌体，并浓缩特异性附着到来源小鼠的脑的血管内皮细胞(例如MBEC4)的噬菌体。更特别地，可以利用实施例中描述的程序进行淘选。
在步骤(b)中，被施用所述噬菌体颗粒的非人动物包括小鼠、大鼠、沙鼠、猫、牛和猴子。其他例子包括家畜和宠物。
在步骤(b)中施用的噬菌体不必是整个噬菌体颗粒，可以通过例如仅给非人动物施用展示测试多肽的外壳蛋白实施本发明的筛选方法。
通常通过动脉内注射、静脉内注射、皮下注射、经脑施用、口服施用等施行对非人动物体内的施用，优选通过动脉内注射。
在步骤(c)中，通常可以按照如下从脑组织中收集噬菌体颗粒。从非人动物中摘除脑，制备脑匀浆的连续稀释液。接着，将经稀释的溶液铺在琼脂介质上，形成噬菌体空斑并进行挑选，然后收集噬菌体颗粒。但是，这种方法仅是一个例子，本领域技术人员可以根据噬菌体的类型等从脑组织中适当地收集噬菌体颗粒。
此外，可以通过本领域技术人员知晓的方法测定步骤(d)中选择的多肽的氨基酸序列。
本说明书中所引用的全部现有技术参考文献通过引用被合并到本发明中。
附图说明
图1是跨内皮细胞移行(trans-endothelial cell migration)的机制的示意图。
图2是表示利用T7选择系统的噬菌体文库的结构图和照片。该照片显示了在琼脂糖凝胶上分离的cDNA片段。在不存在插入物时，约120bp的片段被扩增。在此，确认了200bp到近1kb的插入物，其对应于70-300个氨基酸。
图3是利用T7选择系统的噬菌体文库(随机肽)的结构图。
图4描述了T7选择系统。
图5描述了淘选方法。
图6一组显示包含SEQ ID NO：23或24的序列的噬菌体的脑定位活性的照片。
图7是显示脑中的噬菌体滴度以及脑/血浆比的图表。
图8是本发明的脑定位肽偶联物的结构示意图。
图9是一组表明在小鼠脑中存在本发明的肽与胶体金的偶联物的电子显微照片。
左(上和下)：对照组(抗生物素蛋白-胶体金)：在神经细胞中未观察到胶体金标记。(上)：海马锥体细胞(CA1到CA2区)；(下)：小脑浦肯野细胞区。中(上和下)：施用生物素偶联的T2J002+抗生物素蛋白(Av)-金颗粒。右(上和下)：施用生物素偶联的T2J004+抗生物素蛋白(Av)-金颗粒。肽偶联物使得胶体金能够被转运到脑实质(cerebral parenchyma)中。
图10一组表明在锥体细胞层CA1-CA2中存在本发明的肽和胶体金的偶联物的电子显微照片。
左：对照组(仅施用抗生物素蛋白-胶体金)；在血管内皮中未观察到反应。中：生物素+肽组(1)；施用生物素偶联的T2J002+Av-金。生物素+肽组(2)显示通过预先埋植方法进行的免疫反应的电子显微镜(EM)图像，其中通过施用生物素偶联的T2J002、制备超薄切片然后用Ay-金检测进行观察。在对照组(左)的血管内皮中未观察到反应。在试验组中，DAB的沉积表明在内皮细胞中观察到了免疫反应(箭头)。在内皮细胞以及血管外(脑实质)中都观察到这种反应。
图11是使用本发明的肽偶联物用于评价对MBEC4的渗透性的实验的示意图。
图12显示了本发明的肽偶联物(T2J004)的MBEC4渗透性。将抗生物素蛋白-FITC 0.4nmol/插入物以1∶4的比例连接到肽上并检查MBEC4渗透性的时间依赖性变化。
图13表示在血脑屏障模型中肽偶联物对渗透性的提高以及未标记的肽的抑制活性。
与添加Av-FITC相比，将生物素偶联的T2J004Y+Av-FITC添加到用MBEC4制备的血脑屏障模型中显示出当测量较低层的荧光强度时渗透性约提高3倍。这种效果被发现受到环状T2J004和线性T2J004的显著抑制。
图14是用于评价小胶质细胞和巨噬细胞的MBEC4渗透性的实验的示意图。
图15是本发明的各种肽偶联物的MBEC4渗透性的示意图。
图16是一组显示用4F11抗M13噬菌体抗体检测脑中的重组脑定位噬菌体的照片。
将脑定位噬菌体(上)和对照组噬菌体(下)施用到血管中30分钟后摘出脑并用4F11抗M13噬菌体抗体染色。在施用了脑定位噬菌体的脑中检出了噬菌体颗粒。
左：显示使用NIBA滤光片的特异性结合的荧光照片
中：用WIG滤光片检测非特异性结合
右：使用Hoechst 23384的核染色(细胞的鉴定)
图17是一组显示用聚焦显微镜检测小胶质细胞的胞吞转运作用的照片。
在使用MBEC4的血脑屏障模型中，添加小胶质细胞4小时后检出胞吞转运作用。从照片中可以观察到微桔黄色的小胶质细胞穿过绿色的血管内皮细胞的图像。
图18是一组显示在将小胶质细胞添加到血管内皮细胞中1小时后的相差显微镜图像(左)和荧光显微镜图像(右)的照片。
图19是一组显示用甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下的观察结果的照片。添加了小胶质细胞(左)和巨噬细胞(右)的MBEC4血脑屏障模型的垂直切片用甲苯胺蓝染色。
图20是MBEC4的电子显微照片。中间黑色的带状部分是一种紧密连接(可见于于血脑屏障中的特征性障碍结构)。
图21是描述小胶质细胞穿过血脑屏障模型的电子显微镜图像。
图22是显示描述小胶质细胞穿过血脑屏障模型的电子显微镜图像。清晰地观察到小胶质细胞突出到形成血脑屏障的MBEC4细胞中。
图23显示了巨噬细胞系Raw264.7对MBEC4的粘附。巨噬细胞仅松散地粘附到形成血脑屏障的MBEC4上。未观察到对细胞层的渗入。
图24显示了巨噬细胞系Raw264.7对MBEC4的粘附。巨噬细胞仅松散地粘附到形成血脑屏障的MBEC4上。未观察到对细胞层的渗入。
实施本发明的最佳方式
以下，将使用实施例对本发明进行具体的说明，但并非对本发明的限制。PEG6000购自Wako，胰蛋白酶EDTA、Luria肉汤培养基(Luria broth base)和青霉素-链霉素购自GIBCO。此外，EDTA 2Na、琼脂糖36G和T7选择1-1克隆试剂盒分别购自Nacalai、Funakoshi和Novagen。
实施例1 细胞培养
(1)小鼠203神经胶质瘤细胞
在37℃、5％ CO2的条件下，将203神经胶质瘤细胞培养在添加了10％ FCS(GIBCO)、5μg/ml胰岛素(SIGMA)和0.22％葡萄糖(Katayama)的MEM(SIGMA)中。将2×105个细胞/7ml平铺在10cm平板(Falcon)上进行传代培养，细胞每7天传代一次。对于淘选，将203神经胶质瘤细胞以2×106个细胞/7ml平铺在10cm平板上并在4天后用于淘选。
(2)小鼠血管内皮END-D细胞
在37℃、5％ CO2的条件下，将END-D细胞细胞培养在添加了10％灭活FCS、100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM(SIGMA)中。如下进行传代培养。用PBS(-)洗涤细胞一次，接着添加5ml的0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA4Na，静置3分钟，然后用5ml培养基冲洗进行分离。然后，以1200rpm离心5分钟沉淀所述细胞，除去上清液后用培养基洗涤沉淀一次。随后，将细胞以3×105个细胞/7ml平铺到10cm平板上，每3-4天传代一次。将待用于淘选的END-D细胞以3×106个细胞/7ml平铺到胶原包被的10cm平板上并在4天后用于淘选。将5μg/cm2胶原(Nitta Gelatin，cellmatrix typeI-C)倾倒到10cm平板中，静置1小时，然后用PBS(-)洗涤两次来制备胶原包被的平板。
(3)小鼠脑来源的血管内皮细胞MBEC4
在37℃、5％ CO2的条件下，将MBEC4细胞培养在添加了10％FCS、5μg/ml肝素(SIGMA)和30μg/ml内皮细胞生长添加剂(ECGS；Upstate Biotechnology)的DMEM中。将2×105个细胞/7ml平铺到0.2％明胶(Katayama)包被的10cm平板上进行传代培养，细胞每3-4天传代一次。将待用于淘选的MBEC4细胞以2×106个细胞/7ml平铺到胶原包被的10cm平板上，并在4天后用于淘选。
实施例2 M13噬菌体展示文库
1.大肠杆菌ER2738的培养
37℃下，在含有20μg/ml四环素(Katayama)的LB培养基中，将包括在Ph.D.-C7CTM噬菌体展示肽文库试剂盒(New EnglandBiolabs，E8120S)中的宿主大肠杆菌ER2738细胞振荡培养过夜，然后将培养物在含有20μg/ml四环素的LB平板上划线并用作ER2738的工作原种。每间隔两周制备鲜新鲜的工作原种。
从划线的工作原种中挑选单个菌落获得用于噬菌体扩增和滴度测量的ER2738，并于37℃下、在含有20μg/ml四环素的LB培养基中振荡培养细胞过夜。
2.体外淘选
2-1.细胞固定
使用当天按如下所述固定10cm平板，在该平板上形成了用于淘选的一层203小胶质细胞(用作对照)、END-D细胞或MBEC4细胞。通过除去培养基、用5ml PBS(-)洗涤一次、添加3ml 4％ PFA(Katayama)/PBS(-)、静置10分钟、然后用5ml PBS(-)洗涤3次对各种类型的细胞进行固定。接着，通过于4℃往所述细胞中添加5ml 2％ BSA(SIGMA)/PBS(-)并静置1小时进行封闭。在加入噬菌体溶液之前，用3ml 0.1％ Tween 20/PBS(-)洗涤各种类型的细胞6次。
2-2.第一次淘选
在第一次淘选中，将1011pfu的M13-C7C噬菌体文库(10μL)溶解在2ml PBS(-)中，全部加入到203小胶质细胞中并在室温下轻轻振荡10分钟以使之吸附。接着，将上清液添加到END-D细胞中并在室温下轻轻振荡10分钟以使之吸附。接着，将上清液添加到MBEC4细胞中并在室温下轻轻振荡10分钟以使之吸附。在10分钟吸附处理后，用添加了2ml含有1mg/ml BSA的0.2M甘氨酸(Wako)-HCl(pH2.2)的5ml的0.1％ Tween 20/PBS(-)洗涤各类细胞10次并在室温下轻轻振荡进行洗提。收集洗提液后，立即用2ml0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)漂洗细胞，与洗提液合并到一起，并加入1.6ml1M Tris-HCl(pH9.1)进行中和。Tris购自Boehringer。
在各个步骤从各类细胞获得的各种噬菌体洗提液的滴度通过下面在“2-2-1.噬菌体滴定”中说明的方法来测定。
从MBEC4细胞洗提出的噬菌体溶液用下面在“2-2-2.噬菌体扩增和纯化”中说明的方法进行扩增，并用于第二次淘选。
2-2-1.噬菌体滴定
按照如下测定噬菌体溶液的滴度。
将ER2738过夜培养物和3μL IPTG(Katayama)/X-gal(Nacalai)混合物250μL(50μg/ml IPTG；40μg/ml X-gal)添加到14-ml按盖式试管(Falcon)中，再加入2.5ml溶解的Top琼脂糖(于LB培养基中，6μg/ml琼脂糖)并混合。立即将混合物平铺在LB/IPTG/X-gal平板上以制备ER2378圆板。在TBS中制备噬菌体溶液的一系列稀释液用于滴定。将10μL各稀释液吸印到ER2378圆板上，干燥至溶液不再流动，并于37℃培养过夜。通过计数蓝斑数目计算噬菌体溶液的滴度。
2-2-2.噬菌体扩增和纯化
将待扩增的噬菌体溶液添加到含有20μg/ml四环素和1/100体积的ER2738过夜培养物的LB培养基中，然后于37℃在带有调节阻板的锥形烧瓶中振荡培养4.5-5小时。接着，于4℃，以10,000rpm离心该培养物10分钟，收集上清液。于4℃，以10,000rpm离心该上清液10分钟以完全除去ER2738细胞。将1/6体积的30％ PEG/3MNaCl(SIGMA)添加到该上清液中，噬菌体在冰上沉淀过夜。于4℃以10,000rpm离心45分钟后，通过倾析除去上清液，并于4℃下以10,000rpm再离心沉淀10分钟以收集噬菌体沉淀。将噬菌体沉淀完全溶解在2ml TBS/0.02％ NaN3(SIGMA)中，4℃下以10,000rpm离心5分钟，收集上清液。将CsCl(Wako)以0.467g/ml的浓度添加到上清液中，并于15℃以80,000rpm进行密度梯度离心18小时，然后收集代表纯化的噬菌体的条带。用TBS透析所收集的纯化噬菌体以除去CsCl，加入0.02％ NaN3后储存于4℃。
2-3.第二次淘选
在第二次淘选中，将1010pfu的M13-C7C噬菌体混合物溶液溶解在2ml PBS(-)中，并全部添加到203小胶质细胞中。然后于室温下轻轻振荡10分钟以使之被吸附。接着，将上清液添加到END-D细胞中，并于室温下轻轻振荡10分钟以使之被吸附。随后，将上清液添加到MBEC4细胞中，并于室温下轻轻振荡10分钟以使之被吸附。在10分钟吸附处理后，通过用5ml 0.3％ Tween 20/PBS(-)洗涤各种类型细胞10次，然后加入2ml含有1mg/ml BSA的0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)并在室温下轻轻振荡进行洗提。收集洗提液后，立即用2ml 0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)漂洗细胞，与洗提液合并到一起，并加入1.6ml 1M Tris-HCl(pH9.1)进行中和。
在各个步骤来自各类细胞的各种噬菌体洗提液的滴度通过上面在“2-2-1.噬菌体滴定”中说明的方法获得。
从MBEC4细胞洗提出的噬菌体溶液用上面在“2-2-2.噬菌体扩增和纯化”中说明的方法进行扩增，并用于体内淘选。
3.体内淘选
3-1.噬菌体注射
将8周龄的雄性C57BL小鼠用于体内淘选。在乙醚麻醉的条件下，在单次应用中，将1011pfu/300μl PBS的纯化噬菌体施用到小鼠的左侧颈动脉中。1分钟后，用包被有15mg/ml EDTA的结核菌素注射器(26G)从心脏抽血，并立即用400ml 0.2g/ml EDTA/PBS进行灌注。当灌注结束时，收集心脏灌注液。灌注后，摘出脑，从各个脑中取一部分作为样品用于滴定和制备组织切片。左脑被用于滴定，右脑被用于切片制备。
3-2.组织样品的制备
称重用于滴定的组织，加入双倍体积的匀浆溶液(20mM HEPES(SIGMA)/0.25M蔗糖/1mM EDTA，使用前立即添加10μg/ml抑酶肽(Wako)、5μg/ml亮抑酶肽(SIGMA)和1mM PMSF(Wako))后，在冰上进行匀浆。接着，添加与所添加的匀浆溶液等量的体积的100mM LiCl(Katayama)/PBS并进行混合。
于4℃，以15,000rpm离心血液10分钟，收集血浆，并测定滴度。
匀浆、血浆和组织灌注液的噬菌体滴度通过上面在“2-2-1.噬菌体滴定”中所描述的方法来测定。
所有脑匀浆都通过在上面“2-2-2.噬菌体扩增和纯化”中说明的方法进行扩增，并用于如下的体内淘选。
4.噬菌体克隆和测序
4-1.克隆
对已经进行两轮体外淘选和一轮体内淘选的脑匀浆，或对在已经进行三轮体内淘选的脑匀浆进行噬菌体克隆。
用TBS制备脑匀浆的系列稀释液，按照上面在“2-2-1.噬菌体滴定”中描述的方法形成噬菌体空斑，挑选单个空斑，并各自放入1mlTBS中。重复该操作以克隆所述噬菌体。
4-2.测序
将1ml LB培养基、10μL ER2738过夜培养物和100μL噬菌体克隆溶液放置在14ml的按盖式试管中，于37℃下振荡培养4.5小时。
于4℃，以5,000rpm离心5分钟沉淀ER2738细胞。将上清液转移到1.5ml的Eppendorf管中，并于4℃以10,000rpm离心1分钟，将上清液转移到新的1.5ml的Eppendorf管中。接着，加入400μL 30％PEG/3M NaCl，通过倒转混合后，于4℃条件下静置过夜。
于4℃，以13,000rpm离心30分钟后，通过倾析除去上清液，于4℃以13,000rpm进一步离心残留物30分钟，通过抽吸完全除去剩余的上清液。
将100μL碘化物缓冲液(4M NaI(SIGMA)/1mM EDTA/10mMTris pH8.0)添加到沉淀的噬菌体中并悬浮以完全溶解所述噬菌体。接着，加入250μL乙醇并通过倒转混合。在室温下温育10分钟后，在室温下以15,000rpm离心10分钟，并除去上清液。用1ml 70％乙醇轻轻洗涤沉淀物，并在室温下以15,000rpm离心5分钟。通过倾析除去上清液，将沉淀在干燥器中干燥5分钟。将沉淀溶解在30μL TE中并用作序列模板。在Gene Rapid SEQ 4x4(Amersham)中，使用附随在Ph.D.-C7CTM中的-28gIII测序引物(5’-GTA TGG GAT AAACAA C-3’/SEQ ID NO：13)以及Thermo Sequence Cy5.5 DyeTerminator试剂盒(Amersham)进行测序。
5.噬菌体克隆的评价
按照上面在“2-2-2.噬菌体扩增和纯化”中描述的方法扩增和纯化所获得的噬菌体克隆。使用按照上面在“3.体内淘选”中描述的方法所测定到的滴度，其中将噬菌体的剂量改变为1010pfu/300μL，对该纯化的噬菌体克隆转移到脑中的能力进行评价。M13-KE(NewEngland Biolabs，E8101S；克隆编号1148)被用作对照组噬菌体。
实施例3 T7噬菌体展示文库
1.T7 噬菌体展示文库的构建
设计并合成包含具有添加到两末端的EcoRI和Hind III限制性酶切位点并具有81-bp(415-15：GAATCCATGCAGAATITC(XXK)15AAGCCTGCTACAGACCAT/SEQ ID NO：14)或86-bp(415-C15C：GATCCATGCAGAATTCCTGC(XXK)15TGCAAGCTTGCTACAGACCAT/SEQ ID NO：15)的随机序列的寡核苷酸，使得它们能够插入到T7噬菌体10B基因序列中。将约1.3μg(50pmol)该寡核苷酸用作模板，并利用约1.9μg(300pmol)的5’和3’端引物进行PCR来制备包含随机序列的插入物用于插入到T7噬菌体展示文库中。用EcoRI和HindIII限制性酶消化所制备到的插入物、在琼脂糖凝胶上分离、纯化、插入到pQE-TriSystem载体的EcoRI和Hind III位点之间并用大肠杆菌进行扩增。然后确认该随机序列。确认后，从大肠杆菌中纯化出携带随机序列的质粒，并用EcoRI和HindIII进行消化。在琼脂糖凝胶上分离目标片段、纯化并插入到T7噬菌体10B基因序列中，该基因序列已经类似地用EcoRI和HindIII消化(图2和3)。按照附随在T7选择克隆试剂盒(Novagen)中的说明书进行向10B基因序列的插入和体外包装为噬菌体。上述的引物序列如下所示：
415-15    5′端引物GAATCCATGCAGAATYCC(SEQ ID NO：16)
415-15    3′端引物
ATGGTCTGTAGCAAGCTT(SEQ ID NO：17)
415-C15C  5′端引物
GATCCATGCAGAATTCCTGC(SEQ ID NO：18)
415-C15C  3′端引物
ATGGTCTGTAGCAAGCTTGCA(SEQ ID NO：19)
2.大肠杆菌BL21和BLT5403的培养
于37℃，在LB培养基中振荡培养附带在T7选择415-1克隆试剂盒(Novagen，70015-3)中的宿主大肠杆菌BL21或BLT5403细胞过夜，在LB平板上划线以制备BL21或BLT5403工作原种。每两周制备新鲜的工作原种。通过从工作原种中挑选单个克隆，并于37℃将它们在LB培养基中振荡培养过夜获得了用于噬菌体扩增和滴定的BL21和BLT5403细胞。
3.体外淘选
3-1.细胞固定
在使用当天如下固定3个已经在其上形成一层待用于淘选的203小胶质细胞(用作对照)的10cm平板和1个用MBEC4细胞制备的平板。通过除去培养基、用5ml PBS(-)洗涤一次、添加3ml的4％PFA/PBS(-)并将之静置10分钟对各种类型的细胞进行固定。接着，通过加入5ml的2％ BSA/PBS(-)并于4℃静置30分钟对细胞进行封闭。在加入噬菌体之前，立即通过抽吸除去封闭溶液。
3-2.淘选
T7选择415-1克隆试剂盒(Novagen)被用于制备文库，在该文库中插入了插入物使得置于两个半胱氨酸之间的15个残基的随机肽被展示，且该文库被用作T7选择415-c15c文库(图4)。在体外淘选中，将2×109pfu的T7选择415-c15c文库溶解于2ml PBS(-)中并平铺于4cm平板上；收集全部溶液，然后平铺在新的4cm平板上。接着，将所收集的全部溶液中的1.1ml转移到一只新试管中，往其中添加1.1ml的2％脱脂乳/PBS(-)，并在室温下轻轻混合10分钟。于4℃、以10,000rpm离心该混合物10分钟，将所获得的上清液中的2ml添加到第一个203小胶质细胞平板中，该平板已经用上面在“3-1.细胞固定”中说明的方法进行固定和封闭，并且为了吸附，将该平板在室温下轻轻振荡20分钟。接着，用上清液对第二个和第三个203小胶质细胞平板进行类似处理。上清液还被添加到MBEC4细胞中，并在室温下轻轻振荡30分钟以被吸附。通过抽吸除去上清液，用10mlPBS(-)洗涤3次。接着在2ml的0.01％ NP-40/PBS(-)中洗涤3次，并轻轻振荡10分钟。接着，通过用0.1％NP-40/PBS(-)进行洗涤并在0.4ml的0.1％ SDS/SM缓冲液中轻轻振荡10分钟除去松散结合的噬菌体。用0.6ml SM缓冲液进行漂洗，然后在0.4ml的0.5％SDS/SM缓冲液中轻轻振荡10分钟进行洗提，并将洗提液与0.6ml的SM缓冲液漂洗溶液合并以制备低亲合力的噬菌体洗提液。接着，通过在1％ SDS/SM缓冲液中轻轻振荡10分钟进行洗提，并将洗提液与0.6ml SM缓冲液漂洗溶液合并以制备高亲合力的噬菌体洗提液。淘选程序概述于图5中。
通过下面在“3-2-1.噬菌体滴定”中说明的方法测定各步骤的各噬菌体洗提液的滴度。在滴定中，根据稀释100倍以上的噬菌体溶液来计算滴度。
此外，通过下面在“3-2-2.噬菌体扩增和纯化”中说明的方法对从MBEC4细胞洗提出的噬菌体溶液进行扩增，并用于下一轮淘选。
在八轮的体外淘选后，克隆到了噬菌体。
3-2-1.噬菌体滴定
如下测量噬菌体溶液的滴度。
往14ml按盖式试管中添加250μL的BL21或BLT5403的过夜培养物，加入2.5ml溶解的Top琼脂糖(于LB肉汤中，6μg/ml琼脂糖)并进行混合。立即将其平铺在LB平板上以制备BL21圆板和BLT5403圆板。使SM缓冲液制备待测定滴度的噬菌体溶液的系列稀释液，并将这些溶液以10μL的等分试样吸印在BL21圆板和BLT5403圆板上，干燥至溶液不再流动，然后在37℃培养2-4小时。通过计算所形成的空斑数目来计算所述噬菌体溶液的滴度。具有被用作前述实施例2的“3.体内淘选”中的内标的被插入T7 rRNA：T7选择1-1试剂盒(NEB，70010-3)中的rRNA的cDNA的一部分(5’-CAC CAA GCG TTG GAT TGT TCA CCC ACT AAT AGGGAA CGT GAG CTG GGT TTA GAC CGT CGT GAG ACA GGT TAGTTT TAC CCT ACT GAT GAT GTG TTG TTG CCA TGG TAA TCCTGC TCA GTA CGA GAG GAA CCG CAG GTT CAG ACA TTT GGTGTA TGT GCT TGG CTG AGG AGC CAA TGG GGC GAA GCT ACCATC TGT GGG ATT ATG ACT GAA CGC CTC TAA GTC AGA ATCCCG CCC AG-3’/SEQ ID NO：20)的噬菌体不能在BL21中生长，仅当BLT5403被用作宿主时才形成空斑。
3-2-2.噬菌体扩增和纯化
于37℃，将已经加入了1/100体积的BL21过夜培养物的LB培养基在带有调节阻板的锥形烧瓶中振荡培养2-3小时，然后加入待扩增的噬菌体溶液并进一步振荡培养1-3小时(溶解的大肠杆菌碎片的含量和混浊度降低被用作指示剂)。随后，于4℃，以10,000rpm离心该培养物10分钟，并收集上清液。
添加1/2体积的30％ PEG/3 M NaCl后，将上清液静置于冰上过夜，噬菌体被沉淀下来。接着，于4℃，以10,000rpm离心45分钟，通过倾析除去上清液，于4℃以10,000rpm进一步离心10分钟，然后收集噬菌体沉淀。将噬菌体沉淀完全溶解在2ml SM缓冲液中，于4℃以10,000rpm离心该溶液5分钟。然后收集上清液，接着以0.5g/ml往上清液中添加CsCl，于15℃以80,000rpm进行密度梯度离心18小时，并收集代表纯化的噬菌体的条带。用SM缓冲液透析所收集的纯化的噬菌体以除去CsCl，并在添加数滴氯仿后储存于4℃。
4.克隆
用SM缓冲液制备来自第八轮体外淘选的噬菌体洗提液的系列稀释液，根据“3-2-1.噬菌体滴定”的方法形成噬菌体空斑，然后挑选单个空斑，并将各个空斑置于1ml SM缓冲液中。重复该操作一次以克隆噬菌体。
5.测序
将该噬菌体克隆的一部分用MilliQ水稀释100倍，于95℃加热5分钟，然后立即在冰上冷却以制备PCR模板。加入1μL的该模板，加入5’-GCT CTG CGG TAG GTA CTG TT-3’(SEQ ID NO：21)和5’-CGG TGC CCC AAA GAA TCG GT-3’(SEQ ID NO：22)作为引物(各1μM)，如下所述以30μL的规模进行PCR。进行40个反应循环(94℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟)。随后，用乙醇沉淀PCR产物，将沉淀溶解在10μL的TE中。接着，用CHROMASPIN+TE30柱(Clontech，K1321-2)纯化PCR产物以制备序列模板。
用Thermo Sequence Cy5.5Dye Terminator试剂盒(Amersham)制备序列模板，并在Gene Rapid SEQ 4x4上对序列进行测定。
如上面在“3-2-2.噬菌体扩增和纯化”中所述的那样纯化噬菌体克隆，并用于体内评价。
6.噬菌体克隆的评价
6-1.噬菌体注射
将8周龄的雄性C57BL小鼠用于体内淘选。通过1小时UV照射对T7选择415-c15c文库(4×106pfu/200μL PBS)进行灭菌和纯化，在乙醚麻醉进行封闭的条件下将其施用到小鼠的左侧颈动脉中。5分钟后，施用200μL含有纯化的T7选择415-c15c克隆和作为内标的T7rRNA的噬菌体混合物溶液(各4×106pfu)。1分钟后，用以15mg/ml EDTA包被的结核菌素注射器(26G)从心脏抽血，并立即用400ml的0.2g/ml EDTA-PBS进行灌注。当灌注结束时，收集心脏灌注液。灌注后，摘出脑，从各个脑中取一部分作为样品用于滴定和制备组织切片。左脑用于滴定，右脑用于切片制备。
6-2.组织样品制备
称重用于滴定的组织，在加入双倍体积的匀浆溶液(20mMHEPES/0.25M蔗糖/1mM EDTA，使用前立即添加10μg/ml抑酶肽，5μg/ml亮抑酶肽和1mM PMSF)后，在冰上进行匀浆。接着，添加与所添加的匀浆溶液等量的体积的100mM LiCl/PBS并进行混合。
于4℃，以15,000rpm离心血液10分钟，收集血浆，并测定滴度。
通过上面在“3-2-1.噬菌体滴定”中描述的方法测定组织的各匀浆、血浆和灌注液的噬菌体滴度。
从组织样品中分离对各个器官具有亲合力的重组噬菌体。生长从脑回收的噬菌体并再次注射到小鼠的尾静脉中，进行与上述类似的分析。结果，分离到数个阳性克隆。代表性的序列如下所示。
序列1：MLGDPN-CVKQAVQSSVKHPDLSC-KLAAALE(SEQID NO：23)
序列2：MLGDPN-CPRGLPVTTRLMEKSKC-KLAAALE(SEQ IDNO：24)
将包含这些序列的噬菌体克隆注入小鼠，发现它们定位于脑(图6和7)。因此，上面描述的方法能够分离特异性地渗入脑中的候选分子。
此外，通过一种类似方法，可以分离到特异性地靶向除脑以外的器官的分子。实际上，如图7中所示，分离到了对除脑以外的器官具有亲合力的噬菌体。
实施例4 脑定位肽偶联物
本申请发明人制备了脑定位肽偶联物。该偶联物是可以具有环状结构的分子，该环状结构是由于在本发明的肽分子的半胱氨酸残基之间形成二硫键产生的，该分子还可能具有附着于其上的生物素。更特别的例子是图8中所示的结构。该偶联物具有对抗生物素蛋白化合物的亲合力。
该偶联物被结合到胶体金上，并被施用给小鼠，对小鼠进行评价本发明肽的脑定位活性的试验(在透射电子显微镜下观察脑组织切片)。用于制备透射电子显微镜样品的操作被示于表2中。
表2
[制备封闭物]
(i)预固定       4℃，于0.1M PB中的2.5％戊二醛溶液
(ii)洗涤        0.1M PBS，在冰上冷却一次或两次
(iii)后固定     于0.1MPB中的1％四氧化锇，在冰上冷却
                约1小时
(iv)脱水        乙醇系列70→80→90→95→100100
                →100(％)，各10分钟
(v)树脂包埋     于35℃，Epok 812树脂聚合12小时；45℃，
                12小时60℃，20小时
[切片制备]
(i)加工整理(trimming)
(ii)用玻璃刀制备厚切片(2-3μm厚)
(iii)用钻石刀制备超薄切片(50-100nm厚)
(iv)电子染色：2％的乙酸双氧铀，然后用1％柠檬酸铅(各3分钟)
(v)透射电子显微镜观察(80kV的加速电压)
在本试验中，T2J002(SEQ ID NO：2)和T2J004(SEQ ID NO：4)被用作本发明的肽。小鼠脑组织(细胞)的电子显微镜照片示于图9和10中。箭头表示结合金颗粒的本发明的肽分子的位置。结果表明本发明的肽偶联物成功地将胶体金转运到脑实质中。更特别地，本发明的肽被证实为具有脑定位活性。
实施例5 T2J004Y-生物素渗透试验
使用如下试剂：链霉抗生物素蛋白、FITC偶联物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004-生物素加上用于MBEC4试验的DMEM(SIGMA)10％ FBS(GIBCO lot.1077859)和用于END-D试验的DMEM+10％FBS(GIBCO lot.1077859：于65℃灭活30分钟)。上述“T2J004Y-生物素”包含SEQ ID NO：4中所示的多肽。
首先，将MBEC4(1.26×104/插入物)和END-D(2×104/插入物)种植在细胞培养物插入物(FALCON[35]3096；3.0μm孔径)中，并于37℃、在5％ CO2的条件下培养4天。
将链霉抗生物素蛋白、FITC偶联物(25μL/插入物)和T2J004Y-生物素(1.6nmol/插入物)混合，在室温下培养30分钟。随后，用各培养基替换插入物中的培养基将体积调整为250μL，往各孔(用于细胞培养插入物的FALCON 24-孔平板)中添加750μL培养基。在3、6和24小时后，从各个孔中采样100μL，用Fluoroskan Ascent(ThermoLabsystems)测定荧光强度。本试验概述于图11中。
结果，当与单独的FITC的渗透性相比时，FITC-偶联的T2J004Y-生物素的渗透性在MBEC4和END-D分别高8倍和4倍。此外，肽进入MBEC4的渗透性比在END-D中的渗透性高两倍，并且渗透量随时间增加。
实施例6 所添加的T2J004Y-生物素的量与在MBEC4中的渗透量之间的关系
抗生物素蛋白和生物素以1∶4的比例结合。改变将与链霉抗生物素蛋白-FITC反应的T2J004Y-生物素的比例，并检测在MBEC4中的渗透量。
使用如下试剂：链霉抗生物素蛋白、FITC偶联物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004Y-生物素、DMEM+10％ FBS。
首先，种植MBEC4(1.26×104/插入物)，并于37℃、在5％ CO2的条件下培养4天。将与1.6nmol/插入物、0.4nmol/插入物和0.2nmol/插入物的T2J004Y-生物素混合的链霉抗生物素蛋白-FITC偶联物(25μL/插入物)添加到细胞中，并于室温下培养30分钟。用培养基替换插入物中的培养基，将混合溶液的体积调整为250μL。往各孔中添加750μL的培养基，并于3小时和6小时后用Fluoroskan Acsent测量荧光强度。
肽渗透量与所添加的肽的量相关。但是，与添加0.4nmol/插入物的肽相比，添加1.6nmol/插入物的肽(高四倍的量)仅导致肽渗透的量增加约两倍。因此，肽的1.6nmol/插入物似乎足以在6小时内渗透穿过MBEC4层，该MBEC4层具有0.3cm2的有效插入物培养表面积(图12)。
实施例7 肽对T2J004Y-生物素渗透的抑制
检测T2J004Y-生物素-FITC渗透是否被非生物素化的肽预处理抑制。
使用如下试剂：链霉抗生物素蛋白、FITC偶联物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004Y-生物素、用于MBEC4试验的DMEM+10％ FBS、CT2J004Y和LT2J004Y。(“CT2J004Y”是指具有环状结构的分子，“LT2J004Y”是指具有线性结构的分子。所述环状结构通过该分子中的半胱氨酸残基之间的二硫键形成)。
首先，将各种未被生物素化的肽(10nmol/插入物)与培养基(200μL/插入物)混合，以替换用于在前述条件下培养4天的插入物培养基。30分钟后，用培养基将以上述相同方式将被混合的肽-FITC混合物调整为50μL，并添加到插入物中。6小时后，充分搅拌24孔中内容物，并使用Fluoroskan Ascent测量荧光强度。
结果，CT2J004Y和LT2J004Y都单独抑制了T2J004Y-生物素-FITC的渗透约25％(图13)。
实施例8 通过预处理噬菌体抑制小胶质细胞渗透
使用如下试剂：用于一般细胞膜标记的PKH57绿色荧光细胞连接试剂盒(SIGMA)、DMEM+10％ FBS。
首先，将MBEC4细胞(1.26×104/插入物)接种到插入物中，并于37℃、在5％ CO2的条件下培养4天，然后往其中加入5μL对照和5μL呈递脑定位肽的噬菌体(1013pfu/ml)，之后进行1小时的预处理。用PKH26对小胶质细胞膜进行染色后，将2×105个细胞/插入物加入到DMEM+10％ FBS中以制备250μL样品。将750μL培养基加入孔中，24小时后，计数孔底部和培养物中的小胶质细胞的数目。图14是该试验的概括。
结果，与对照组噬菌体相比，呈递脑定位肽的噬菌体似乎稍微抑制小胶质细胞渗透穿过MBEC4。未观察到明显的差别，这可能是因为与MBEC4上的受体数目相比，噬菌体和用作配体的小胶质细胞的数目较少。
实施例9 T2J004Y-生物素和其他肽的渗透性的比较
使用如下试剂：链霉抗生物素蛋白、FITC偶联物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004Y-生物素、T2J002Y-生物素、T2J003Y-生物素、用于MBEC4的DMEM+10％ FBS。
首先，将MBEC4细胞(1.26×104/插入物)接种到插入物中，并于37℃、在5％ CO2的条件下培养4天。将链霉抗生物素蛋白、FITC偶联物(25μL/插入物)和T2J004Y-生物素、T2J002Y-生物素和T2J003Y-生物素(各1.6nmol/插入物)分别混合，并于室温下培养30分钟。随后，用各种培养基替换插入物中的培养基，将混合物调整为250μL，然后将750μL培养基加入各个孔中(用于细胞培养插入物的FALCON 24-孔板)。3、6和24小时后，从孔中采样100μL，用Fluoroskan Ascent测量荧光强度。
将T2J004Y-生物素的MBEC4渗透性视为100来表示T2J002Y-生物素和T2J003Y-生物素的渗透比率的结果。T2J002Y-生物素的渗透性仅为T2J004Y-生物素的渗透性的20-40％，但T2J003Y-生物素的渗透性高出约1.4倍(图15)。
实施例10 表达本发明的肽的噬菌体的脑定位活性
血管内施用表达本发明的肽的噬菌体和对照组噬菌体，并检测脑定位活性。
结果，在脑中检测到表达本发明的肽的噬菌体颗粒(图16)。
实施例11 小胶质细胞的胞吞转运活性
在使用了MBEC4的血脑屏障模型中观察小胶质细胞的胞吞转运作用。
加入小胶质细胞后4小时检测胞吞转运作用(图17)。
此外，用电子显微镜观察小胶质细胞穿过血脑屏障模型时的胞吞转运活性。
结果，清楚地观察到了渗透到形成血脑屏障的MBEC4细胞中的小胶质细胞突起的图像(图21和22)。
此外，作为对照试验，使用巨噬细胞进行了类似的试验。巨噬细胞仅松散地粘附到形成血脑屏障的MBEC4细胞上，而未渗透到细胞层中(图23和24)。
工业实用性
本申请发明人首次揭示了与脑定位活性相关的氨基酸基序序列，并且发现了包含该基序序列的多肽具有脑定位活性。本发明的多肽与脑血管内皮细胞特异性地相结合，并诱导了一种跨细胞路径使得能够将物质转运到脑实质中。
              序列表
<110>株式会社组织定向
<120>具有脑定位活性的多肽及其用途
<130>TTJ-A0301P
<150>JP 2003-289890
<151>2003-08-08
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
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nknnktgcaa gcttgctaca gaccat                                          86
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cgagaggaac cgcaggttca gacatttggt gtatgtgctt ggctgaggag ccaatggggc     180
gaagctacca tctgtgggat tatgactgaa cgcctctaag tcagaatccc gcccag         236
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            20                  25                  30

Claims (18)

1.下述(a)-(b)中任何一项的多肽：
(a)由SEQ ID NO：1-12中的任何一种氨基酸序列组成的多肽；和
(b)由一个肽区域组成的多肽，该肽区域通过由(a)的多肽的两末端上的半胱氨酸残基之间形成的二硫键而被环化。
2.编码权利要求1的多肽的多核苷酸。
3.与权利要求1的多肽相结合的抗体。
4.赋予任意分子脑定位活性的药剂，其中该药剂包含权利要求1的多肽。
5.权利要求4的药剂，其中所述任意分子为任意多肽。
6.一种具有脑定位活性的分子，其中该分子包含权利要求1的多肽。
7.权利要求6的分子，其中所述分子是噬菌体颗粒或噬菌体颗粒的外壳蛋白。
8.权利要求6的分子，其中所述分子是与权利要求1的多肽形成的融合蛋白。
9.一种脑送达用载体，其中该载体包含权利要求1的多肽。
10.一种脑送达用载体，其中该载体包括一种结构，在该结构中权利要求1的多肽被结合到胶束、脂质体或微囊上。
11.一种用于脑疾病的治疗剂，其中该治疗剂包括一种结构，在该结构中药物附载在权利要求9或10的脑送达用载体上。
12.一种用于制备具有脑定位活性的分子的方法，其中该方法包括将权利要求1的多肽结合到任意分子上。
13.一种用于制备具有脑定位活性的蛋白质分子的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)制备包含一种可表达形式的DNA的表达载体，其中该DNA具有一种结构，在该结构中编码任意蛋白质分子的DNA被连接到编码权利要求1的多肽的DNA上；
(b)将该表达载体导入细胞中；和
(c)收集该载体的表达产物。
14.一种具有脑定位活性的分子在制备用于将任意分子转运到脑中药物中的用途，其中该分子包含一种结构，在该结构中一种任意分子被结合到权利要求1的多肽上。
15.一种筛选具有与权利要求1的多肽结合的活性的分子的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)将权利要求1的多肽与测试分子相接触；
(b)检测所述多肽与所述测试分子之间的结合活性；和
(c)选择与所述多肽相结合的分子。
16.一种筛选具有脑定位活性的多肽的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)制备在其噬菌体外壳蛋白上展示测试多肽的噬菌体颗粒；
(b)将所述噬菌体颗粒施用给非人动物；
(c)从所述非人动物的脑组织中收集噬菌体颗粒；和
(d)选择在步骤(c)中收集的噬菌体颗粒上展示的测试多肽作为具有脑定位活性的多肽。
17.权利要求16的方法，其中所述噬菌体是M13噬菌体或T7噬菌体。
18.权利要求16的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)后选择与脑血管内皮细胞相结合的噬菌体颗粒。
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