JP5250849B2 - 多価結合手を有し代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチド - Google Patents

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Description

本発明は、多価結合手を有し環状化した脳移行性ポリペプチド、該ポリペプチドを含むキャリア分子、並びに、該ポリペプチドを利用した検査試薬に関する。
脳は血液脳関門が存在するため、薬物などを経口摂取しても注射などにより投与しても、ほかの臓器に比べて有効濃度が得られにくい特徴がある。一方、大量投与することにより有効な濃度を脳内で確保することが可能にはなるが、末梢血液中には大過剰の薬物を注入することになり、腎障害や肝障害などの副作用の問題が生じる。そこで、脳への選択的薬物輸送のシステムを開発することが必要となり、実際に多くの研究がなされてきている。このような研究開発の多くは、脂溶性が高い物質ほど血液脳関門を通過しやすいという脳の血管内皮細胞の性質を利用した、薬物そのものの化学修飾による脳移行性の増大をはかるものであった。このような方法論では薬物の脳移行性が最大数倍程度改善するものの、全体としてはほとんど誤差範囲に留まるにすぎないという結果である。これは、末梢臓器への物質の浸透が血管内皮細胞の細胞間隙を通過するのに対して、脳の血管内皮細胞は細胞間隙が密着帯という特殊な構造を形成し細胞間隙からの血液成分の浸透がほとんどみられないため、脳への物質輸送は脂溶性の化学修飾を行い直接細胞膜にとけ込ませて浸透させるということを行わなければならない。つまり、脳への物質輸送は末梢臓器と違って迂回路がないため、正面突破により細胞の中を浸透させるということを行う方法論である。しかしそのメカニズムが異なるため、効率が数千から数万倍低く、したがって、脳特異的な薬物輸送とはいえない。
ところが、最近の技術的な進歩により、脳血管内皮細胞に発現している膜表面タンパク質を標的化する方法論が開発されてきた。特に脳内に薬物を取り込ませるにはトランスポーター（上述のように脳は細胞間隙からの物質の浸透がないため、血液中のアミノ酸や糖分は血液脳関門上に発現するトランスポーターに結合して脳内に特異的に運搬される。トランスフェリン受容体は脳の活動に必要な金属結合型酵素に金属イオンを供給するトランスフェリンというタンパク質を脳に輸送するトランスポーター分子である。）と呼ばれるタンパク質の機能を利用することが有効であり、現在、トランスフェリン受容体を特殊な抗体で標的化することにより脳への薬物の移行性を数十倍から１００倍程度増大させることができると報告された（非特許文献１参照）。
しかし、トランスフェリン受容体は脳血管内皮細胞だけに発現しているわけではなく、肝臓や腎臓にも脳血管内皮細胞より多量に発現しているため、このシステムを利用した場合、脳への輸送量の増大とともに肝臓や腎臓にも薬物導入が起こる。従って、脳特異的物質輸送とは言い難い。このほか、いくつかのトランスポーター分子やP-糖タンパク質のようなアンチポーター分子を利用するものなど報告されているが、いずれも有効性が確認できていない。
これとは別に、特殊機能性ペプチドを利用する方法が最近開発された。これはPTD配列とよばれるもので、HIV tat遺伝子産物が細胞の核に移行する場合に必要なペプチド配列として同定されていた。このペプチドは核膜を通過するだけでなくあらゆる種類の細胞膜も通過する機能があるため（非特許文献２参照）、血液中に注入すると全身の臓器に分布することができる。脳血管内皮細胞も細胞膜を通してPTDペプチドが通過するため、脳への物質輸送をはかることができる。しかし、末梢臓器の場合、PTD配列による細胞膜経由の移入と細胞間隙からの浸透の両者が有効であるのに対し、脳は後者の浸透がみられないため、脳の物質の浸透率はほかの臓器に比べて遙かに低い。この技術でも脳特異性が示すことができない。
一方、最近になって、血管内皮細胞の臓器ごとの特殊性を規定している分子について報告がされるようになった。生体の各臓器はそれぞれ役割や特殊性によって栄養要求性や血液から供給される様々な因子の必要度が異なるため、それぞれの臓器に分布する血管内皮細胞はその存在場所によって少しずつ違った特徴を持っていることが徐々に明らかになってきている。さらに、血管内皮細胞は血液中に存在する炎症細胞や免疫細胞との直接の接点になっており、炎症や病態時にそれらの細胞が浸潤することをコントロールしている。このときに、侵入する細胞は炎症時に現れる炎症性のホーミングレセプターを認識して病巣に集積することが知られていたが、それだけではなく、組織特異的な血管内皮細胞マーカー分子（cellular zip codeとよばれている）も認識していることが明らかになってきた。この細胞マーカー分子の役割はまだよくわかっていないが、すくなくともこの分子を標的化すれば臓器の血管内皮細胞までは標的化できると考えられ、注目されている（非特許文献３参照）。ただ、この方法では各臓器の血管内皮細胞までは標的化できるが、どうやって臓器の実質に目的分子を導入するかを工夫しなければならない。
本発明者らは脳移行活性を示す複数のポリペプチドを取得し、これらのポリペプチド配列から、脳移行活性に関与するアミノ酸モチーフ配列を見出した。そして、該モチーフ配列を含む環状化ポリペプチドは、体内へ投与されると実際に脳組織内へ移行することが実証された(特許文献１参照)。
この脳移行性ポリペプチドと脳内において機能する分子とを結合させることにより、該分子を効率的に脳内へ運搬させることが可能である。例えば、上記脳移行性ポリペプチドと、脳移行活性を持たないPETリガンドを結合させることができれば、リガンドに脳移行性が付与され、脳の生体PETイメージングが可能となると考えられる。
PETイメージングのためにはリガンドもしくはペプチドをポジトロン核種で標識する必要があるが、リガンドとペプチドの結合や、ペプチドへのポジトロン核種の導入には、ペプチド側にアミノ基のように反応性の高い置換基が存在することが必要となる。しかしながら、脳移行性ペプチドには反応に利用できるアミノ基が一つしかなく、リガンドを結合させるとペプチドにポジトロン核種を導入できない等の問題があった。
国際公開番号WO 2005/014625 Ningya Shi and William M. Pardridge, Noninvasive gene targeting to the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97, Issue 13, 7567-7572, June 20, 2000 Steven R. Schwarze, Alan Ho, Adamina Vocero-Akbani, and Steven F. Dowdy, In Vivo Protein Transduction: Delivery of a Biologically Active Protein into the Mouse. Science 1999 September 3; 285: 1569-1572. Renata Pasqualini, Erkki Ruoslahti, Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature Vol.380, 28, March 1996.
本発明は、脳移行活性を持たない分子と結合させるための反応基を有する脳移行性ポリペプチド、および、脳移行活性を持たない分子を効率的に脳移行性ポリペプチドと結合させる方法の提供を課題とする。さらに本発明は、該ポリペプチドを利用した脳内移行用キャリア分子、並びに、該ポリペプチドを利用した検査試薬の提供を課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。上述のように、脳移行性ポリペプチド配列と脳移行活性を持たないPETリガンドを結合させることにより、リガンドに脳移行性が付与され、脳の生体PETイメージングが可能となるものと考えられる。PETイメージングのためにはリガンドもしくはペプチドをポジトロン核種で標識する必要があるが、リガンドとペプチドの結合や、ペプチドへのポジトロン核種の導入には、ペプチド側にアミノ基のように反応性の高い置換基が存在することが必要となる。しかしながら、脳移行性ポリペプチドは通常反応に利用できるアミノ基が一つしかなく、リガンドを結合させるとペプチドにポジトロン核種を導入できないため、現状ではリガンドをポジトロン核種で標識しておいてからペプチドに結合させる必要がある。ポジトロン核種の寿命は短いために（半減期：11Cで約20分、18Fで約110分）、短時間でリガンドを標識しペプチドに結合させることが必要であり、このためペプチドと結合できるポジトロン標識リガンドの種類が制限されるとともに、反応条件や精製条件の設定も難しい。また脳移行性ポリペプチドでは、脳移行性モチーフの両端にシステイン（C）を配置し、CのSH基を利用して環状構造を形成しているが、この環状ペプチドでは、動物生体に投与した場合S-S結合が不安定であり、in vivoでの使用に問題がある。そこで生体内で安定であり、かつ脳移行活性を持たないリガンドに脳移行性を付与し、そのリガンドの標的分子のPETイメージングを可能にする汎用性の高いポジトロン核種標識脳標的化ペプチドを開発することを目的として、脳移行性ポリペプチドの改良を行った。
通常、ポリペプチドへのポジトロン核種の導入法として、ペプチド側の遊離アミノ基を[18F]フルオロベンゾイル([18F]FB)化する方法が一般的であり、この方法は[18F]FBの活性エステル体（[18F]SFB）とアミノ基を持つペプチドを反応させることで容易に達成され、しかもポジトロン核種としては比較的寿命が長い18F原子（半減期約110分）を導入できる。またこのペプチドにさらにもう一つの遊離アミノ基が存在していれば、そのアミノ基へリガンドを結合させることができる。そこで、脳移行性ポリペプチド末端領域のシステイン（C）をε-アミノ基を持つリジン（K）に置換してアミノ基を二つ有するペプチドを合成した。このリジン（K）置換ペプチドの環状化には、脳移行活性に必要な基本側鎖構造に影響を与えず効率よく安価に製造できる方法として、N末端−C末端のアミド結合が適していると考えられる。そこでリジン（K）置換ペプチドのN末端−C末端をアミド結合させることにより脳移行活性に重要な環状構造を維持した環状化ポリペプチドを作製した。
その結果、末端部のリジン同士のアミド結合によって環状化したポリペプチドは、従来のシステイン同士によって環状化されたポリペプチドより、生体内の代謝が安定であることが見出された。即ち、リジン同士のアミド結合を環状化ポリペプチドへ導入することにより、生体内の代謝安定性が向上することが初めて見出された。
また、本発明の環状化ポリペプチドの脳実質への移行を検証するために、ポジトロン核種で標識した本発明の環状化ポリペプチドについてPETイメージングを行った。その結果、本発明の環状化ポリペプチドは、頚動脈投与後すみやかに脳実質へ移行することが確認された。
次に、本発明の環状化ポリペプチドが他の分子を脳内へ運搬することが可能か否かについて検証を行った。脳内へ移行させる分子としてPETリガンドを用い、該PETリガンドをポジトロン核種で標識した本発明の環状化ポリペプチドと結合させた。PETイメージングによって解析した結果、該環状化ポリペプチドは頚動脈投与によりリガンドを脳実質へ移行させることができることが示された。
本発明者らは、リジン同士のアミド結合によって脳移行性ポリペプチドを環状化させることにより、脳移行性ポリペプチドに対し、他の分子との結合のための反応基（結合手）を導入することに成功した。本発明の脳移行性ポリペプチドは、他の分子を結合させることにより、該分子を効率的に脳内へ移行させることが可能であることが確認された。また、リジンを有する該環状化ポリペプチドは、驚くべきことに生体内での分解耐性が飛躍的に向上するという効果を奏することが分かった。
本発明は、脳移行活性を持たない分子と結合させるための反応基を有する脳移行性ポリペプチド、および、脳移行活性を持たない分子を効率的に脳移行性ポリペプチドと結合させる方法、該ポリペプチドを利用した脳内移行用キャリア分子、並びに、該ポリペプチドを利用した検査試薬に関し、より具体的には、
〔１〕脳移行モチーフ配列を含む環状化ポリペプチドであって、少なくともリジン２残基を含むことを特徴とする、多価結合手を有する環状化ポリペプチド、
〔２〕隣接したリジン２残基を有する、〔１〕に記載の環状化ポリペプチド、
〔３〕代謝安定性が向上していることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の環状化ポリペプチド、
〔４〕リジンのεアミノ基にPET核種で標識された分子が結合し、および／または、他のリジンのεアミノ基に脳内受容体のリガンド分子が結合している、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチド、
〔５〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチドを有効成分とする、脳内移行用キャリア分子、
〔６〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチドのリジン残基のεアミノ基に、薬剤が結合していることを特徴とする、脳移行性薬剤、
〔７〕〔４〕に記載の環状化ポリペプチドを有効成分とする、PET検査用試薬、
〔８〕以下の物質を少なくとも構成要素として含む、脳移行性薬剤製造用キット、
（ａ）〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチド
（ｂ）薬剤
〔９〕以下の物質を少なくとも構成要素として含む、PET検査用キット、
（ａ）〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチド
（ｂ）PET核種で標識された分子
〔１０〕両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、多価結合手を有し環状化された脳移行性ポリペプチドの製造方法、
〔１１〕両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチドの製造方法、
〔１２〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチドのリジンのεアミノ基と、薬剤とを結合する工程を含む、脳移行性薬剤の製造方法、
〔１３〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチドのリジンのεアミノ基と、PET核種で標識された分子とを結合する工程を含む、PET検査用試薬の製造方法、
〔１４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の環状化ポリペプチドのリジンのεアミノ基と、脳内受容体リガンド分子とを結合する工程を含む、脳移行性リガンド分子の製造方法、
〔１５〕両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、多価結合手を有する状態で脳移行性ポリペプチドを環状化する方法、
〔１６〕両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、脳移行性ポリペプチドの代謝安定性を向上させる方法、
を、提供するものである。
また本発明は、以下を提供する。
〔１７〕両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドの、多価結合手を有する状態で脳移行性ポリペプチドを環状化する方法における使用。
〔１８〕両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドの、脳移行性ポリペプチドの代謝安定性を向上させる方法における使用。
[C]K004K、[C]C004C、[C]C004CYの模式図である。 [C]C004CY[131I]のin vitro代謝の比較を示す図である。血液：1/5 homogenate 400μL、脳：1/5 homogenate 400μL、肝臓：1/5 homogenate 400μL、血漿（plasma）：x1 50μL。 TLC分析によるin vivo代謝試験の結果を示す写真である。 [C]([18F]FB)-K004K-(L-703,717)合成の模式図である。 肝臓抽出液中でのペプチド代謝試験の結果を示す図およびグラフである。（A）脳標的化ペプチド配列を示す図、（B）肝臓抽出液中での未変化体ペプチドの割合の経時的変化を示すグラフである。 ラット右総頚動脈へ([18F]FB)-K004Kを投与した場合ののイメージング写真である。（A-C）PETイメージング、（D）Ex vivo ARG。 マウス尾静脈へ([18F]FB)-K004Kを投与した場合のイメージング写真である。 ([18F]FB)-K004K-(L-703,717)のイメージング写真である。（A-C）PETイメージング、（D）Ex vivo ARG。 ラット頚動脈のEx vivo ARGの結果を示す写真である。 ARGによるPSLカーブや脳移行率に関する図、表、および写真である。
本発明は、脳移行モチーフ配列を含む環状化ポリペプチドであって、多価結合手を有する環状化ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、少なくともリジン２残基を含むことを特徴とするポリペプチドである（以下、本明細書において「本発明のポリペプチド」と記載する場合あり）。本発明のポリペプチドは、代謝安定性が向上していることを特徴とするものである。
一般に血液から脳組織内への物質の移行は、血液脳関門(blood-brain barrier; BBB)と呼ばれる仕組みによって制限されている。これによって脳は有害物質等から守られている。本発明において「脳移行活性」もしくは「脳移行性」とは、ポリペプチド等の分子が体内へ投与（例えば、静脈投与等）された際に、該分子が脳組織内へ移行する活性を言う。本発明のポリペプチドは、通常、脳移行活性（脳移行性）を有するポリペプチドであると表現することができるが、例えば、血液脳関門の通過能、あるいはトランスマイグレーション（トランスサイトーシス）誘導能を有するポリペプチドと表現することも可能である。また、本発明のポリペプチドは、他の物質（分子）と結合させることにより、他の分子を脳へ移行させる機能を有する。従って、本発明のポリペプチドは、「脳移行活性を付与するポリペプチド」、「脳移行ペプチドタグ」、「脳移行活性付与剤」と表現することもできる。
本発明における脳移行性ポリペプチドは環状であり、該ポリペプチドを構成するアミノ酸数は特に制限されないが、例えば１００アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは９アミノ酸以内であり、最も好ましくは４〜９アミノ酸である。
本発明において脳移行モチーフとは、例えば、以下の〔配列１〕に記載のアミノ酸モチーフ配列、より好ましくは〔配列２〕に記載のアミノ酸モチーフ配列、または〔配列３〕に記載のアミノ酸モチーフ配列を例示することができる(WO 2005/014625)。
〔配列１〕 Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、
Ｘ１はＳ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、Ｖ（バリン）またはＬ（ロイシン）；
Ｘ３は任意のアミノ酸；
Ｘ４はＧ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｃ（システイン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｌ（ロイシン）、Ｑ（グルタミン）、またはＹ（チロシン）；
を表す。
〔配列２〕 Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、
Ｘ１はＳ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、またはＶ（バリン）〔ただし、Ｘ１は、さらに好ましくはＳまたはＴ〕；
Ｘ３は任意のアミノ酸；
Ｘ４はＧ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｃ（システイン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｑ（グルタミン）、またはＹ（チロシン）〔ただし、Ｘ４は、さらに好ましくはＴ、ＱまたはＣ〕；
を表す。また、上記（ＲまたはＫ）は、さらに好ましくはＲである。
一般的に、これらアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ）は、非電荷極性アミノ酸に分類される。
〔配列３〕 Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ1
式中、
Ｘ１はＳ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｐ（プロリン）、またはＬ（ロイシン）；
Ｘ３は任意のアミノ酸；
Ｘ４はＧ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｃ（システイン）、Ｌ（ロイシン）、またはＱ（グルタミン）；
を表す。
なお、本明細書におけるアミノ酸は、一般的に使用される一文字表記にならって記載した（例えば、Ｒはアルギニン、Ｋはリシン）。また、一般的な記載方法にならい、Ｎ末からＣ末方向の順にアミノ酸配列を記載した。
本発明のポリペプチドは、上記モチーフ配列を含み、少なくともリジン２残基を含む環状化ポリペプチドである。
該環状化ポリペプチドに含まれるリジン残基の数は２以上であれば特に制限されないが、通常、モチーフ配列中に存在するリジン残基を除いて２以上存在することが好ましい。また、リジンが存在する部位はモチーフ配列を構成する領域以外であれば特に制限されず、リジンが隣接して存在（-KK-）していてもよいし、２個のリジンの間に他のアミノ酸が１もしくは複数個含むように配置していてもよい(-KXK-, ここでXは任意のアミノ酸を表し、Xの数も制限されない)が、リジン２残基が隣接して存在することが好ましい。即ち、リジン残基同士でアミド結合を形成していることが好ましい。
本発明において「結合手」とは、本発明のポリペプチドと他の分子（例えば、ペプチドを有する分子等）とを結合させるための反応基を指す。具体的には、リジンが有する２つのアミノ基の一方を指し、より具体的にはリジンのεアミノ基を指す。
本発明のポリペプチドが有する結合手は、通常、リジン残基の数に応じて結合手の数も増加する。例えば、リジンが２個含まれている場合には、通常、結合手は２個存在し、この場合を本発明において二価結合手と呼ぶ。また、結合手が複数含まれている場合には、本発明において多価（複数価）結合手と呼ぶ。
本発明のポリペプチドは、環状構造を有するポリペプチドである。本発明においては、この環状領域を構成するポリペプチドについて、上記モチーフ配列を見出すことができる。該モチーフ配列を構成するアミノ酸は、互いに隣接する４アミノ酸残基から構成される。これら隣接するアミノ酸同士は、通常、ペプチド結合（アミド結合）を形成する。
本明細書における上記〔配列１〕〜〔配列３〕の、「−」は、通常、ペプチド結合を意味する。
また、本発明の好ましい態様においては、上記の４アミノ酸からなるモチーフ配列を含み、リジンを２以上含むポリペプチドであれば、上記のモチーフ配列以外のアミノ酸配列の種類は特に制限されない。
また、（表１）に記載した脳移行活性を有するポリペプチドは、以下の特徴を有する。
環状構造を形成し得るポリペプチド領域（即ち、両端のシステインを除くアミノ酸配列）において、（１）全てのポリペプチドには塩基性アミノ酸のＫまたはＲが含まれ、（２）残りのアミノ酸残基は、１０種のアミノ酸〔Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｑ、Ｈ、Ｎ〕のいずれかから構成される。
従って、本発明の好ましい態様においては、環状領域を有するポリペプチドであって、該環状領域に少なくとも１以上の塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）を有し、かつ、該環状領域の残りのアミノ酸残基がアミノ酸残基〔Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｑ、Ｈ、Ｎ〕から選択される（通常、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）ことを特徴とする（この特徴を、本明細書において「特徴１」と記載する場合あり）、脳移行活性ポリペプチドを提供する。本発明のさらに好ましい態様においては、上記「特徴１」を有するポリペプチドであって、本発明のモチーフ配列（〔配列１〕〜〔配列３〕）を含むポリペプチドである。
また、本発明において脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドとしては、例えば、以下のポリペプチドが挙げられる。
（ａ）塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）を１０％以上含有する、脳移行活性を有するポリペプチド。
（ｂ）環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、該環状ペプチド領域において塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）が１０％以上含まれる、脳移行活性を有するポリペプチド。
（ｃ）環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、該環状ペプチド領域に少なくとも１以上の塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）を有する、脳移行活性を有するポリペプチド。
本発明のポリペプチドの好ましい態様としては、上記ポリペプチドを含みかつリジン２残基以上を有する環状化ポリペプチドである。
本発明の好ましい態様において環状化されるポリペプチド領域の長さは、特に制限されないが、例えば１００アミノ酸以内であり、好ましくは５０アミノ酸以内であり、より好ましくは４〜３０アミノ酸であり、さらに好ましくは４〜１５アミノ酸であり、さらに好ましくは４〜９アミノ酸であり、最も好ましくは４〜７アミノ酸である。
また好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは以下の（Ａ）および／または（Ｂ）の機能（活性）を有することを特徴とする。
（Ａ）トランスマイグレーション（トランスサイトーシス）誘導活性
（Ｂ）脳の血管内皮細胞と結合する活性
上記（Ａ）における「トランスマイグレーション」とは、ある分子が脳へ侵入する際に、血管内皮細胞の細胞間隙を通過するのではなく、血管内皮細胞内を通過する現象を言う。これは「trans-endothelial cell migration」、「trans cellular pathway」、もしくは「トランスサイトーシス」とも呼ばれ、このメカニズムによって血管内皮細胞を通過する分子（細胞等）は、その表面にシグナル分子を持ち、血管内皮細胞表面上にある受容体を介して血管内皮細胞に上記現象を誘導するものと考えられる。
本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞に上記トランスマイグレーションを誘導する活性を有するものと考えられる。即ち、本発明のポリペプチドは、トランスマイグレーションを誘導するためのシグナル分子としての役割を担うものと考えられる。
また、上記シグナル分子は、トランスマイグレーションの初期段階において脳の血管内皮細胞と（例えば、該細胞上の受容体と）結合するものと考えられる。従って、好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、脳の血管内皮細胞と結合する活性を有することを特徴の一つとする。
任意の被検分子について、上記（Ａ）のトランスマイグレーション誘導活性を有するか否か、あるいは、上記（Ｂ）の脳の血管内皮細胞と結合するか否かは、当業者においては公知の方法を利用して適宜評価することができる。一例を示せば、蛍光標識を施した被検分子を血管内に投与し、脳の血管内皮細胞の凍結切片を蛍光顕微鏡によって観察することにより評価することができる。例えば、蛍光標識された分子が付着した血管内皮細胞が観察されれば、被検分子は上記（Ｂ）の活性を有するものと判定され、また、蛍光標識された被検分子が血管内皮細胞内において観察されれば、被検分子は上記（Ａ）の活性を有するものと判定される。
また、上記蛍光標識方法以外にも、アイソトープ標識、PETリガンドによる標識、マグネタイトなどと結合させてMRIで検出する方法等が挙げられる。上記in vivo法以外のその他の態様としては、例えば、血管内皮細胞の培養系を用いてBBBモデルを作製し、上記被検分子を投与することによっても、トランスマイグレーション誘導活性を評価することができる。透過が確認できれば、上記（Ａ）の活性を有するものと判定され、また、洗浄後に血管内皮細胞に接着していれば、上記（Ｂ）の活性を有するものと判定される。
また本発明における「脳の血管内皮細胞」とは、例えば、マウスMBEC4、市販のヒト由来脳血管内皮細胞BBEC、牛脳由来の一時培養血管内皮細胞等の細胞、また末梢血管由来血管内皮細胞とアストロサイトを共培養しBBB様機能を誘導したもの等を示すことができる。
当業者においては任意のポリペプチド（合成ペプチド）、あるいは、該ペプチドを有する分子について、これらの細胞を利用して、上記（Ａ）または（Ｂ）の活性の評価を行うことが可能である。
本発明においてモチーフ配列を含むポリペプチドとは、具体的には、以下の配列において両末端のシステイン残基を除いた配列からなるポリペプチドを好適に示すことができる。
（表１）
名称 アミノ酸配列
T2J001 CSNLLSRHC （配列番号：１）
T2J002 CSLNTRSQC （配列番号：２）
T2J003 CVAPSRATC （配列番号：３）
T2J004 CVVRHLQQC （配列番号：４）
T2J004V3L CVLRHLQQC （配列番号：５）
T2J006 CRQLVQVHC （配列番号：６）
T2J007 CGPLKTSAC （配列番号：７）
T2J008 CLKPGPKHC （配列番号：８）
T2J009 CRSPQPAVC （配列番号：９）
T2J012 CNPLSPRSC （配列番号：１０）
T2J013 CPAGAVKSC （配列番号：１１）
T2J013V6L CPAGALKSC （配列番号：１２）
従って、本発明において脳移行モチーフ配列とは、例えば、配列番号：１３〜２４のいずれかに記載の配列を挙げることができる。
本発明の好ましい態様としては、上記のポリペプチドの両末端のシステイン残基がリジンへ置換されたポリペプチドにおいて、両末端の該リジンがアミド結合によって連結した構造の環状化ポリペプチドを例示することができる。
本発明の好ましい態様において「脳移行モチーフ配列を含む環状化ポリペプチド」とは、例えば、配列番号：１３〜２４のいずれかに記載の脳移行モチーフ配列を含むアミノ酸配列であって、該配列の両末端にそれぞれリジンが付加され、該リジン同士がアミド結合によって連結した構造の環状化ポリペプチド（その鎖長は例えば、１００アミノ酸以内であり、好ましくは５０アミノ酸以内であり、より好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１２乃至９アミノ酸であり、最も好ましくは９アミノ酸である。）を例示することができる。
さらに好ましくは、「脳移行モチーフ配列を含む環状化ポリペプチド」は、例えば、配列番号：１３〜２４のいずれかに記載の脳移行モチーフ配列の両末端にそれぞれリジンが付加され、該リジン同士がアミド結合によって連結した構造の環状化ポリペプチドを例示することができる。
また本発明には、上記配列番号：１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドの両末端のシステイン残基がリジンへ置換されたポリペプチドにおいて、両末端の該リジンがアミド結合によって連結した構造の環状化ポリペプチドを適宜改変したポリペプチドが含まれる。
即ち、環状化ポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、本発明のポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは本発明に含まれる。「機能的に同等」とは、例えば、脳移行活性を指す。上記の「複数」とは、２以上の数であれば制限されないが、通常、２〜９程度の少数であり、好ましくは２〜５であり、より好ましくは２または３である。
具体的なアミノ酸配列（例えば、配列番号：１〜１２）が開示された場合においては、当業者であれば、これらアミノ酸配列を基に、適宜アミノ酸が改変された配列からなる環状化ポリペプチドを作製し、当該ポリペプチドについて、脳移行活性を有するか否かを評価することにより、本発明のポリペプチドを適宜選択することが可能である。所望のポリペプチドについては、脳移行活性の有無を評価する方法は、後述の実施例で示すように、例えば、被検ポリペプチドを動物の頚動脈へ投与し、該動物の脳内へ移行するか否かを評価することにより行うことができる。
本発明のポリペプチドが脳移行活性を示す対象となる生物は、血液脳関門を有する動物であれば特に制限されないが、通常、哺乳動物であり、好ましくは、マウス、ラット、スナネズミ、ネコ、ウシ、サル、もしくはヒトである。
また本発明のポリペプチドは、天然タンパク質由来ポリペプチド、組換えタンパク質由来ポリペプチド、または化学合成ポリペプチド等のいずれのポリペプチドであってもよい。当業者においては、任意のアミノ酸配列からなるポリペプチドを合成し、該ポリペプチドを環状化させることが可能である。
例えば、上記のモチーフ配列を有するポリペプチドの合成は、当業者に公知の方法、例えば、市販のポリペプチド合成機等を利用して適宜実施することができる。
また、本発明の環状化ポリペプチドにおける任意のアミド結合が切断された構造の直鎖状ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。当業者であれば、所望の直鎖状ポリペプチドについて、その末端同士を結合させることにより環状化させることは容易である。
本発明の環状化ポリペプチドは、例えば、上記直鎖状ポリペプチドを環状化させることによって作製することができる。上記直鎖状ポリペプチドは、例えば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを、宿主細胞において発現させることによって作製することができる。
該ベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましい。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
該ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
ポリペプチドの回収は、ポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。ポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物からポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
本発明のポリペプチドは、両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させることによって製造することができる。本発明の好ましい態様としては、両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、多価結合手を有し環状化された脳移行性ポリペプチドの製造方法を提供する。
上記の「末端部にリジンを有する」とは、必ずしも末端にリジンが位置する場合に限定されず、末端から２番目以降に位置する場合も含まれる。
上記製造方法によって作製される本発明のポリペプチドは、多価結合手を有する状態で環状化しているという特徴を有する。
従って本発明は、両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、多価結合手を有する状態で脳移行性ポリペプチドを環状化する方法に関する。
また、本発明のポリペプチドは、動物の生体内へ投与した場合に、非常に優れた代謝安定性を示す。従って本発明は、両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチドの製造方法を提供する。さらに本発明は、両末端部にリジンを有する脳移行モチーフ配列を含むポリペプチドについて、両末端部をアミド結合させる工程を含む、脳移行性ポリペプチドの代謝安定性を向上させる方法に関する。
また本発明は、任意の分子を動物の脳へ移行させる方法を提供する。該方法は、好ましくは、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法である。
（ａ）任意の分子と本発明のポリペプチドとが結合した構造の脳移行性の環状化ポリペプチドを製造する工程
（ｂ）前記環状化ポリペプチドを動物体内へ投与する工程
本発明のポリペプチドは脳移行活性を有することから、本発明のポリペプチドが結合した分子は脳移行活性が付与される。従って、本発明のポリペプチドは、任意の分子と結合させることにより、任意の分子について脳移行活性を付与する機能を有するものと考えられる。即ち本発明のポリペプチドは、他の分子に脳移行活性を付与し得る有用な用途を持つ。本発明は、本発明のポリペプチドを含む、任意の分子に脳移行活性を付与するための薬剤を提供する。好ましい態様においては、上記のアミノ酸モチーフ配列を有するポリペプチドを含む、脳に任意の分子を移行させるためのペプチドタグを提供する。
本発明の上記ペプチドタグの一例としては、本発明のペプチドとビオチンとのコンジュゲート分子を挙げることができる。該コンジュゲート分子は、アビジンと結合した任意の分子と、適宜結合させることができる。該コンジュゲート分子を用いることにより、アビジンと結合させた所望の分子を、脳へ移行させることが可能である。該コンジュゲート分子を用いた、任意の分子を脳へ移行させる方法もまた、本発明に含まれる。さらに本発明には、本発明の上記薬剤によって脳移行活性を付与された分子も含まれる。
本発明のポリペプチド（薬剤）によって脳移行活性を付与される分子は、特に制限されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、糖鎖、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物、微生物産生物、ファージ、抗原、抗体、ミセル（高分子ミセル等）、リポソーム、マイクロカプセル、ペプチド核酸(PNA)、医薬化合物等を挙げることができる。本発明のポリペプチドもしくは上記分子は必要に応じて適宜標識することも可能である。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識等を挙げることができる。
また、本発明のポリペプチドによって脳移行活性を付与される分子の大きさは、特に制限されないが、通常は、物理的に血液脳関門を通過しうる程度の大きさを上限とする。通常のファージ程度の大きさの分子も、本発明のポリペプチドの作用によって血液脳関門を通過することが可能である。従って、上記の付与される分子は、ファージと同等の大きさを呈する程度の分子（物質）であってもよい。例えば、上記の付与される分子がアミノ酸で構成される場合には、１０万程度のアミノ酸を含有する分子であってもよい。
上記分子と本発明のポリペプチドとは、当業者においては、該分子の種類を考慮して適宜、公知の方法を利用して結合させることが可能である。
一例を示せば、市販のカップリング試薬（N-結合型、COOH-結合型、アミノ酸残基修飾型、S-S結合型等）を用いる方法、クロラミンTを用いる方法、イソチアネート基を導入する方法等により、該分子と本発明のポリペプチドとを結合させることができる。
また、該分子がタンパク質である場合には、該タンパク質と本発明のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを用いて、本発明のポリペプチドが結合した分子を作製することも可能である。
また本発明は、本発明の脳移行活性を有する環状化ポリペプチドを有効成分として含む脳内移行用キャリア分子を提供する。該キャリアは、「担体」あるいは「運搬体」と表現することも可能である。本発明のポリペプチドと、脳へ移行させるべき分子とを直接結合させることによって、該分子を脳へ移行させることができる。また、本発明の上記キャリアの好ましい態様としては、例えば、本発明のポリペプチドが、ミセル（高分子ミセル）、リポソームまたはマイクロカプセルと結合した構造からなるキャリアを挙げることができる。
さらに、本発明のキャリアを利用することにより、所望の薬剤を脳へ移行させることが可能である。例えば、脳疾患に対して治療効果を有する化合物（医薬組成物）を、上記キャリアに担持させることにより、該化合物を効率的に脳へ移行させ、有効な治療効果を発揮させることが可能である。該化合物（医薬組成物）を担持させたキャリア自体は、脳疾患治療剤として期待される。従って本発明は、本発明の上記脳移行用キャリアに薬物が担持された構造からなる、脳疾患治療剤を提供する。なお、上記「担持された」とは、薬物をキャリアと直接結合させた状態でもよいし、薬物（医薬組成物）をキャリアに内包させた状態でもよい。
また本発明は、本発明の脳移行活性を有する分子の製造方法を提供する。本発明の製造方法の好ましい態様においては、任意の分子に本発明のポリペプチドを結合させる工程を含む、脳移行活性を有する分子の製造方法である。
なお、本発明のポリペプチドは、脳移行活性を付与したい分子の外側に配置するように該分子と結合させることが好ましい。即ち、本発明のポリペプチドは、該分子の表面上へ配置されるように該分子と結合させることが望ましい。
本発明の好ましい態様においては、本発明のポリペプチドとして上記モチーフ配列を挟むようにリジン残基（Ｋ）を配置させた配列を含むポリペプチドを挙げることができる。このようなポリペプチドのN末端のαアミノ基とC末端のカルボキシル基の間でアミド結合（ペプチド結合）を形成させることにより、その間に位置するモチーフ配列を含むポリペプチド鎖はループ状に突出することが期待される。
本発明のポリペプチドと結合させる分子として、例えば、脳疾患の治療のために脳組織へ直接移行させることが望ましい化合物等を挙げることができる。該化合物は、本発明のポリペプチドによって脳移行活性が付与され、その結果、体内へ投与された際に効率的に脳組織へ移行し、治療効果を発揮することが期待される。この場合、脳疾患には脳神経疾患のほか、脊髄神経疾患、あるいは多発性硬化症のような髄鞘の疾患が含まれ、さらには各種脳腫瘍あるいは他の臓器に原発した腫瘍に基づく転移性脳腫瘍などが含まれる。
本発明のポリペプチドのリジンのεアミノ基と、薬剤とを結合する工程を含む、脳移行性薬剤の製造方法もまた、本発明に含まれる。
また、本発明の好ましい態様においては、本発明のポリペプチドをPETイメージング（PET検査等）に利用することが挙げられる。
例えば、本発明のポリペプチド中に含まれるリジンのεアミノ基に、PET核種で標識された分子を結合させることができる。PET核種で標識された本発明のポリペプチドは、脳への移行の様子を、脳の生体イメージング画像解析によって観察することができる。
上記「PET核種」は、一般的なPET検査に利用されるポジトロン核種を好適に用いることができる。具体的には、11C(炭素-11)、13N(窒素-13)、15O(酸素-15)、18F(フッ素-18)、62Cu(銅-62)、68Ga(ガリウム-68)、82Rb(ルビジウム-82)等を例示することができる。
本発明のポリペプチドを、例えば、脳内受容体等の生体機能に重要な働きをしている分子に対するリガンドと結合させることにより、該生体機能分子の機能の検査や、該生体機能分子とリガンドとの結合を阻害する物質のスクリーニングを行うことが可能である。具体的には、脳内受容体リガンドとして例えば、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（脳神経受容体の一種）に対するリガンドであるL-703,717スクシンイミド誘導体、および、心臓ムスカリン受容体のイメージングリガンドで脳移行性のない11C-MQNB (11C-labeled methylquinuclidinyl benzilate)等を挙げることができる。
本発明の好ましい態様においては、リジンのεアミノ基にPET核種で標識された分子が結合し、他のリジンのεアミノ基に脳内受容体のリガンド分子が結合している環状化ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、PET検査用試薬として有用である。
本発明のポリペプチドのリジンのεアミノ基と、PET核種で標識された分子とを結合する工程を含む、PET検査用試薬の製造方法もまた本発明に含まれる。
上記製造方法には、必要に応じて、PETリガンド分子等を本発明のポリペプチドと結合させる工程を含む。
また、ポリペプチドのリジンのεアミノ基と、脳内受容体リガンドとを結合する工程を含む、脳移行性リガンド分子の製造方法もまた本発明に含まれる。
本発明には、上記のような脳疾患に対して治療効果が期待される脳移行活性を有する分子、または該分子を含む薬剤が含まれる。
本発明の上記薬剤は、本発明のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含む脳移行活性を有する分子を成分とするものであってもよいし、また、公知の製剤学的製造法によって、製剤化することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（例、パラベン）等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができる。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤等で提供できる。
また体内への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行うことができるが、好ましくは動脈内投与である。
また本発明は、本発明のポリペプチドと脳内において薬理活性を示す薬剤とを、少なくとも構成要素として含有する、脳移行性薬剤製造用キットを提供する。
さらに本発明は、本発明のポリペプチドとPET核種で標識された分子とを、少なくとも構成要素として含有する、PET検査用キットを提供する。該キットには、必要に応じてさらに脳内受容体リガンド分子を含めることができる。
上記キットには、上述の構成要素に加えて、本発明の方法に利用可能な反応液、バッファー、細胞、ポリヌクレオチド、抗体、検出機器に用いる各種試薬類、あるいはモデル動物等を組み合わせてキットとすることができる。さらにキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
〔実験手法〕
・N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)の合成
t-butyl 4-N,N,N-trimethylammoniumbenzoate（5 mg）を出発物質として、Acetonitrile（0.5 mL）中[18F]KF / Kryptofix222との反応（90℃, 10 min）、引き続く塩酸加水分解（100℃, 5 min）により得られる4-[18F]fluorobenzoic acidをC-18 Sep-Pakにて精製した。精製した中間体4-[18F]fluorobenzoic acidにAcetonitrile（1 mL）中25% tetramethylammnoium hydroxide（20μL）存在下、O-(N-succinimidyl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium tetrafluoroborate （TSTU、15 mg）を加え加熱（90℃, 5 min)、冷却後反応液を5% 酢酸溶液（10 mL）に捕集した。[18F]SFBの精製はC18 Sep-Pakを用いて10% 酢酸で洗浄後、3 mLのDichloromethaneで溶出させた。溶出液を窒素気流下で乾燥させた。
[18F]SFBの合成過程を以下に示す。
Figure 0005250849
・L-703,717スクシンイミド誘導体の合成
FE-21（22.8 mg, 60μmol）を含むN,N-dimethylformamide （DMF）（1 mL）溶液に、60 % NaH（12.07 mg, 303μmol）存在下6-bromohexanoic acid（11.77 mg, 60μmol）を加え、60℃にて2時間加熱した。脱イオン水、0.05 N HClを添加後、反応混合物を酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチルを乾燥、濃縮後得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3 / 酢酸エチル = 2 / 1）にて精製し、C6-FE-21を得た。Acetonitrile（2 mL）中 diisopropylethylamine（11μL）存在下、C6-FE-21（10 mg）とTSTU（11.5 mg）を80℃にて2時間反応させた。反応液を留去して得られる残渣を酢酸エチルに溶かし、水洗、乾燥後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3 / 酢酸エチル = 2 / 1）にて精製すると、FE-21-C6-スクシンイミド誘導体が得られた。本発明ではこれをL-703,717スクシンイミド誘導体として使用した。
L-703,717スクシンイミド誘導体の合成過程を以下に示す。
Figure 0005250849
・[C]K004Kペプチドと[18F]SFBの結合
K004Kペプチド1mgを100μLのDMFに溶解させ、Triethylamine (TEA)添加によりpHを7-8に調整した。調整したペプチド溶液全量を乾燥[18F]SFBに添加し、溶解させた後室温で20-30分反応させた。精製には高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用した。YMC J’sphereカラム（10 x 250 mm）、23% Acetonitrile, 0.1% Trifluofoacetic acid (TFA)イソクラティック溶出、5 mL/minで約8.5 minに溶出されるピークフラクションを分取した。分取したピークフラクションにTween80を20μL添加後ロータリーエバポレーターで300-400μLに濃縮し、インジェクションサンプルとした。
・[C]K004Kペプチドと[18F]SFB、L-703,717スクシンイミド誘導体の結合
K004Kペプチド0.6 mgを100μLのDMFに溶解させ、TEA添加によりpHを7-8に調整した。
調整したペプチド溶液全量を乾燥[18F]SFBに添加し、溶解させた後室温で20-30分反応させた。次にL-703,717スクシンイミド誘導体0.3 mg/25μLのDMF溶液を全量添加し、室温で20-30分間反応させた。精製にはHPLC）を使用し、YMC J’sphereカラム（10x250mm）、38% Acetonitrile, 0.1% TFAイソクラティック溶出、5 mL/minで約19分に溶出されるピークフラクションを分取した。分取したピークフラクションにTween80を30μL添加後ロータリーエバポレーターで300-400μLに濃縮し、インジェクションサンプルとした。
上述の結合手順を以下に記載する。
[18F]SFB (乾燥) 6.4μCi
↓K004K 0.6 mg/110μL DMF, TEA
↓RT 27 min
↓L-703,717, 0.3 mg/25μL DMF
↓RT 33 min
↓18-20 min RI peak 分取
↓減圧乾燥
0.467μCi ([18F]FB)-K004K-(L,703,717)
・Micro PETイメージング
Sprague-Dawleyラットをネンブタール腹腔内投与することにより麻酔し、右総頚動脈より[18F]Fluorobenzoate（FB）標識ペプチドを投与した。投与後30分間Micro PETにより脳のイメージング画像を取得した。
・Ex vivo Autoradiography (ARG)
Sprague-Dawleyラットをネンブタール腹腔内投与することにより麻酔し、右総頚動脈より標識ペプチドを投与した。投与後30分間のMicro PETスキャン終了後脳を摘出しドライアイスにより凍結させた。凍結脳は厚さ0.2μmの水平断の凍結切片を作製し、20-30分間イメージングプレートとコンタクトさせた後、BAS5000を用いてイメージングプレートから信号の取り込みを行い、ARG画像を取得した。
・[C]C004CYの[131I]ヨウ素標識
ヨウ素化反応にはChloramine T法によりヨウ素化を行った。
0.2 M Phosphate buffer 20μLに10 mM [C]C004CY 15μL、[131I]NaI 5μL (100-200μCi)を混和後、0.1M Phosphate bufferで溶解させた15 mM Chloramine T 20μL加え撹拌後、30秒間室温で反応させた。反応溶液は直ちにHPLC精製を行った。Inertsil ODS-2カラム（4.6 x 150 mm）、20% Acetonitrile, 0.1% Trifluofoacetic acid (TFA)イソクラティック溶出、1 mL/minで約16分に溶出されるピークフラクションを分取した。分取したピークフラクションにTween80を5μL添加後凍結乾燥させ、生理食塩水に再溶解させてインジェクションサンプルとした。
・In vivo代謝試験
標識ペプチド（[131I]標識ペプチド；約10μCi, [18F]FB標識ペプチド；約100μCi）をFVB/NJclマウス尾静脈より投与後1分もしくは10分後に血液、脳を採取した。
血液は200μLとりMethanol 1 mLを添加し激しく撹拌した。脳にはMethanolを2 mL添加し、ポッター型ホモジェナイザーでホモジェナイズした。血液、脳のホモジェネートを遠心し、上清を組織抽出液とし、ペプチド成分を回収した。抽出液を薄層クロマトグラフィー（TLC）により展開し（溶媒：Buthanol: Acetic acid: Water=4:1:2）、代謝物スポットの有無を調べた。
・In vitro代謝
以下のプロトコルにて実施した。
脱血組織 あるいは血液
↓ x5 vol. PBS
↓ Homogenize
↓ 400μLずつ分注
↓ 37℃ 5 min pre-incubate
↓ Add [C]C004CY(131I) 20μL
↓ 37℃ incubate
↓ Add MeOH 1 mL
↓ Vortex
↓ 15000 rpm 10 min
↓ Sup
↓ TLC
〔実施例１〕 RI標識ペプチドを用いた代謝試験
脳移行性ペプチドがその活性を発揮するためには脳移行性アミノ酸モチーフが環状構造を保つことが必要である。環状化にはシステインのSH基間のS-S架橋によるものと、N末端のαアミノ基とC末端のカルボシキル基の間でアミド結合（ペプチド結合）を形成することによるものが考えられた。[C]C004CYペプチドでは、配列番号：4の脳移行性アミノ酸配列が2つのシステイン（C）で挟まれた配列を持ち、システインのSH基間のS-S架橋により環状化しており、C末端にヨウ素標識に利用できるチロシン（Y）が追加されている。[C]は環状であることを表す。一方、[C]K004Kペプチドは同じ脳移行性アミノ酸配列の両端にリジン（K）が存在し、N末端のαアミノ基とC末端のカルボシキル基の間でアミド結合（ペプチド結合）を形成することにより環状化したペプチドである。これらを模式図で示す（図1）。
通常ペプチドへのポジトロン核種の導入法として、ペプチド側の遊離アミノ基を[18F]フルオロベンゾイル([18F]FB)化する方法が一般的であり、この方法は [18F]FBの活性エステル体（[18F]SFB）とアミノ基を持つペプチドを反応させることで容易に達成され、しかもポジトロン核種としては比較的寿命が長い18F原子（半減期約110分）を導入できる。[C]C004CYペプチドでは、この反応に利用できる遊離アミノ基はN末端アミノ基だけである。一方、このペプチドにさらにもう一つの遊離アミノ基が存在していれば、そのアミノ基へリガンドを結合させることができる。
そこで、[C]C004CYのチロシン（Y）を除き、両端のシステイン（C）をε-アミノ基を持つリジン（K）に置換してアミノ基を二つ有するペプチドを合成した。このリジン（K）置換ペプチドの環状化には、脳移行活性に必要な基本側鎖構造に影響を与えず効率よく安価に製造できる方法として、N末端−C末端のアミド結合が適していると考えられる。そこでリジン（K）置換ペプチドのN末端−C末端をアミド結合させることにより脳移行活性に必須の環状構造も維持した[C]K004Kを作製した。[C]C004CYや[C]K004Kの模式図を図１に示す。
[18F]SFB、リガンドをそれぞれ脳標的化ペプチドに結合させて脳機能イメージングを行うには、標識体とリガンドの橋渡しをしているペプチドが、血管内注入後脳に到達するまでに分解されないことが必須である。そこで脳標的化ペプチドの基本構造である[C]C004CY、および[C]K004Kが生体内で分解されるどうかを検証するために、放射活性標識した両ペプチドをマウスに投与後1、10分の血液、脳を採取してメタノールでペプチド成分を抽出し薄層クロマトグラフィー（TLC）で展開するin vivo代謝試験を行った。
[C]C004CYにおけるチロシン（Y）のフェニル基をクロラミンT法により[131I]ヨウ素化した[C]C004CY[131I]を利用した。約11.5μCiの[C]C004CY[131I]をFVB/NJclマウスの尾静脈より投与後1、10分の血液、脳を採取し、メタノールにより標識ペプチド成分を抽出した。抽出液をTLC分析し、各組織抽出液と投与に用いた[C]C004CY[131I]のスポットパターンを比較した。
その結果、マウス血液中では投与後1分で[C]C004CY[131I]以外のスポットが検出されたことからすでに分解が始まっており、10分後には[C]C004CY[131I]はほとんど分解されていることがわかった。また脳から検出された[131I]標識体もほとんどすべて分解物であった（図3）。[C]C004CYが生体内でどのように代謝されるかを[C]C004CY[131I]のin vitro代謝試験で検討したところ、血液とインキュベーションしても比較的安定であるが、脳や肝臓のホモジネートとインキュベーションすると速やかに分解され[131I]ヨードチロシンを遊離することがわかった（図2、表2）。以上より[C]C004CY[131I]は血液中では安定であるが、脳を含めた末梢組織中に移行した際に組織中で分解され[131I]ヨードチロシンを遊離し、血液中を循環すると推測される。分解された[131I]ヨードチロシンは芳香族アミノ酸トランスポーターを介して脳実質に取り込まれてしまうため、このようにチロシンを標識した場合には未変化体ペプチドの脳移行を放射活性で計測することは困難である。
Figure 0005250849
[C]K004Kに関しては[C]K004Kと[18F]SFBを反応させ、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（脳神経受容体の一種）に対するリガンドであるが脳移行性が低いL-703,717スクシンイミド誘導体を引き続き反応させることにより[C]([18F]FB)-K004K-(L-703,717)を合成した。合成の模式図を図４に示す。
約130μCiの[C] ([18F]FB)-K004K-(L-703,717)をFVB/NJclマウス尾静脈より投与後10分の血液、脳のTLC分析を行った。その結果、[C] ([18F]FB)-K004K-(L-703,717)は血液、脳から分解物のスポットはほとんど検出されなかったことから、[C]K004Kペプチドが生体内で安定であることが確認された（図３）。
〔実施例２〕 in vitro代謝試験
In vivo代謝試験の結果から[C]K004Kのペプチドは[C]C004CYに比べin vivo で安定であることが示された。この[C]K004Kがどの程度安定性が向上したのか比較するために、アイソトープ標識の代わりに蛍光色素をトレーサーとしマウス肝ホモジネートを用いてin vitroで評価する実験系を作成して比較を行った。
手法を簡略に以下に示す。
マウスLiverに2倍量のHanks' solutionを加えホモジナイズ
↓
遠心して上清を回収。
↓
5倍量のHanks' solutionを添加(肝抽出液)
↓
245μl肝抽出液に5μlのペプチドを添加
↓
37℃で培養
↓
0, 5, 30, 60, 120分後に50μlサンプリング
↓
200μlの70%エタノール(-30℃で予冷)を添加後、Vortex
↓
500μlのクロロホルム(-30℃で予冷)を添加後、激しくVortex
↓
遠心して上清を回収。
↓
等量のDMFを添加、Vortex
↓
遠心して上清を回収
↓
Co-senseを用いてHPLC分析
使用したペプチドはそれぞれ以下の通りである。
[C](Flu)-C004C: 004の配列の両端にCを加えてC同士をジスルフィド結合により環状化したペプチドのN末にFluoresceinで標識した。
[C](Flu)-K004C: 004の配列のN末側にK、C末側にCを加えてN末とC末をペプチド結合させることにより環状化したペプチドのN末にFluoresceinで標識した。
[C](Flu)-K004K: 004の配列の両端にKを加えてN末とC末をペプチド結合させることにより環状化したペプチドのN末にFluoresceinで標識した。
[C](Flu)-C004CYK: 004の配列のN末側にC、C末側にCYKを加えてC同士をジスルフィド結合により環状化したペプチドのN末にFluoresceinで標識した。
[C]C004CYK(Flu): 004の配列のN末側にC、C末側にCYKを加えてC同士をジスルフィド結合により環状化したペプチドのC末K側鎖にFluoresceinで標識した。
その結果、[C](Flu)-K004Kは両端以外の配列を同じくする他のどのペプチドよりも分解に対する耐性が強く、60分のインキュベート後はほとんどのペプチドが10％以下の残存率であるのに対し、約50％が未変化体として残っており、in vivoの試験結果とよく対応していた。K004Kと同様にhomodeticな環状化により作成されたK004Cは、5分で40%まで減少した（図５）。
[C]K004Kは脳標的化ペプチドに複数のアミノ基を付与するために作成したが、結果的には生体内での分解耐性を飛躍的に改善することができた。これはアミノ末端が消失し、エキソペプチダーゼ等の攻撃を受けにくくなったこと、システイン(C)のチオール基のような反応性の高い側鎖がなく生体内因子との非特異的な相互作用が少ないことなどが要因であると推測される。
〔実施例３〕 ペプチドの脳実質への移行
次に[C]K004Kの脳実質への移行を検証するために、[C]K004Kのアミノ基に18F標識したSFBを反応させることによってK004Kペプチドをポジトロン標識し[C] ([18F]FB)-K004K を合成してin vivo脳移行性を検討した。
[C]K004Kに[18F]SFBを添加し、室温で反応させることにより[C] ([18F]FB)-K004Kを合成した。合成した[C] ([18F]FB)-K004K約0.57 mCi/300μLを、Sprague-Dawleyラット右総頸動脈より投与し、マイクロPET（Micro PET）により30分間スキャンを行い脳の生体イメージング画像を取得した。
その結果、投与側の脳にのみ非常に強いシグナルが検出され、反対側および小脳ではほとんどシグナルが検出されなかった（図６A、B、C）。
さらにスキャン後の脳を摘出しEx vivo ARG（Ex vivo Autoradiography (ARG)）を行った。頚動脈投与の場合のPETおよびARGのプロトコルを以下に簡略に示す。
([18F]FB)-K004K 約550μCi/300μL
↓ラット右総頸動脈より投与
PET撮像(30 min)
↓
脳摘出
↓凍結切片の作製
ARG
その結果、投与側の視床、海馬、海馬傍回で非常に強い拡散したシグナルが検出されたが、反対側、小脳ではシグナルがほとんど検出されなかった（図６D）。これらのことから[C] ([18F]FB)-K004Kは頚動脈投与後すみやかに脳実質へ移行し、線条体には移行しにくいことがわかった。
さらに、SFB標識K004Kをマウスの尾静脈に投与した。マウス尾静脈投与の場合のPETおよびARGのプロトコルを以下に簡略に示す。
マウス i.v. 投与
80μCi/ 300μL Saline, 2.5% Evans Blue
スキャン 30 min
その結果、PETでは脳にもある程度のシグナルが見られたが、顔のシグナルが強すぎるため脳が抜けているように見えてしまった。Ex vivo ARGでは脳実質にある程度のシグナルが見られることから尾静注でもある程度は脳に入っていると考えられた（図７）。
〔実施例４〕 リガンドの脳実質への移行
[C]K004Kの脳実質への移行が確認されたことから、次に[C]K004KがPETリガンドを脳内に運搬できるかどうかを検証するために、[C]([18F]FB)-K004K-(L-703,717)のPETイメージングを行った（図８）。[C]K004Kと[18F]SFBを反応させ、L-703,717スクシンイミド誘導体を引き続き反応させることにより[C]([18F]FB)-K004K-(L-703,717)を合成した。合成した[C]([18F]FB)-K004K約0.33 μCi/300μLをSprague-Dawleyラット右総頸動脈より投与し、マイクロPETにより30分間スキャンを行い脳の生体イメージング画像を取得した。
その結果、投与側で強いシグナルが検出され、反対側、小脳でもシグナルが検出された。スキャン後の脳を摘出しEx vivo ARGを行った（図８D、図９）。
上述のマイクロPETおよびEx vivo ARGにおける検証手順を以下に記載する。
333μCi/ 300μL Saline(ca7.5% Tween80)
ラット総頚動脈より投与
↓
PET scan 30 min
↓
Ex vivo ARG
IP contact 30 min
その結果、反対側、小脳を含めた脳全体で拡散したシグナルが検出された。またARG画像のシグナル強度(PSL)から脳移行率を算出したところ、1.34% ± 0.66% ID/g Brainと高い脳移行率を示した。ARGによるPSLカーブや脳移行率に関する図および表を図１０にまとめて示す。
これらのことから[C]K004Kは頚動脈投与によりリガンドを脳実質へ移行させることができることがわかった。
本発明により脳移行活性を維持したまま生体内でも分解を受けにくく、複数の分子の結合が可能な脳移行性ポリペプチドが提供された。本発明のポリペプチドは脳移行活性の低いPETリガンドでも脳実質に運搬することが可能であることがわかった。さらにこの改良型脳標的化ペプチドは二価結合性を有することから、一方にポジトロン核種を導入すればもう一方には同様の反応条件でさまざまなPETリガンドの導入が可能になり、汎用性が高い。また脳疾患治療においても、治療薬剤とポリエチレングリコールなどのように複数の分子の導入が可能であるため、より効果的な治療が期待できる。
本発明によりこれまで血液脳関門を突破できずに開発が断念された多くのPETリガンドや薬剤の新たな可能性を生み出すツールとなる可能性を提供する。
本発明のポリペプチドは、例えば、2つの異なる機能を有する化合物AとBの間を架橋し、かつ架橋によって形成された分子全体に脳移行性を賦与するものであり、例えばAとしてin vivoでは脳に入らないがex vivoでは脳内の受容体と結合して機能を発揮するような分子、BとしてPET核種で標識された分子、を組み合わせれば従来全く不可能だった脳内受容体機能の診断を可能とするような分子の実現が図れる。この例のような、２つの分子AとBの有用な組み合わせは非常に多数考えられる。
18Fはポジトロンを放射するため、このラベルを用いれば、オートラジオグラフィーのほかPETを用いて種々の化合物を結合したペプチドの脳移行性を画像によって評価することができる。種々の化合物が脳内の受容体など生体機能に重要な働きをしている分子と結合するリガンドである場合には、当該生体機能分子の機能を検査したり、当該生体機能分子とリガンドとの結合を阻害する物質のスクリーニングを行うことが可能である。

Claims (13)

  1. 配列番号：１３〜２４のいずれかに記載された脳移行モチーフ配列の両末端部にリジンを有する配列からなるポリペプチドであって、該リジン間のペプチド結合によって環状化され、代謝安定性が向上していることを特徴とする、多価結合手を有する環状化ポリペプチド。
  2. リジンのεアミノ基にPET核種で標識された分子が結合し、および／または、他のリジンのεアミノ基に脳内受容体のリガンド分子が結合している、請求項１に記載の環状化ポリペプチド。
  3. 請求項１に記載の環状化ポリペプチドを有効成分とする、脳内移行用キャリア分子。
  4. 請求項１に記載の環状化ポリペプチドのリジン残基のεアミノ基に、薬剤が結合していることを特徴とする、脳移行性薬剤。
  5. 請求項２に記載の環状化ポリペプチドを有効成分とする、PET検査用試薬。
  6. 以下の物質を少なくとも構成要素として含む、脳移行性薬剤製造用キット。
    （ａ）請求項１に記載の環状化ポリペプチド
    （ｂ）薬剤
  7. 以下の物質を少なくとも構成要素として含む、PET検査用キット。
    （ａ）請求項１に記載の環状化ポリペプチド
    （ｂ）PET核種で標識された分子
  8. 配列番号：１３〜２４のいずれかに記載された脳移行モチーフ配列の両末端部にリジンを有する配列からなるポリペプチドについて、両末端部をペプチド結合させる工程を含む、多価結合手を有し環状化され代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチドの製造方法。
  9. 請求項１に記載の環状化ポリペプチドのリジンのεアミノ基と、薬剤とを結合する工程を含む、代謝安定性が向上した脳移行性薬剤の製造方法。
  10. 請求項１に記載の環状化ポリペプチドのリジンのεアミノ基と、PET核種で標識された分子とを結合する工程を含む、代謝安定性が向上したPET検査用試薬の製造方法。
  11. 請求項１に記載の環状化ポリペプチドのリジンのεアミノ基と、脳内受容体リガンド分子とを結合する工程を含む、代謝安定性が向上した脳移行性リガンド分子の製造方法。
  12. 配列番号：１３〜２４のいずれかに記載された脳移行モチーフ配列の両末端部にリジンを有する配列からなるポリペプチドについて、両末端部をペプチド結合させる工程を含む、多価結合手を有する状態で脳移行性ポリペプチドを環状化する方法。
  13. 配列番号：１３〜２４のいずれかに記載された脳移行モチーフ配列の両末端部にリジンを有する配列からなるポリペプチドについて、両末端部をペプチド結合させる工程を含む、脳移行性ポリペプチドの代謝安定性を向上させる方法。
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