WO2005014625A1 - 脳移行活性を有するポリペプチド、およびその利用 - Google Patents

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amino acid
phage
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Makoto Sawada
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Definitions

  • Patent application title Polypeptide having brain migration activity and use thereof
  • the present invention relates to a polypeptide having brain migration activity, a molecule containing the polypeptide, and a drug imparting brain migration activity.
  • the transferrin receptor is a transport molecule that transports a protein called transferrin, which supplies metal ions to metal-binding enzymes necessary for brain activity, to the brain.
  • Non-Patent Document 1 It is effective to utilize the function of a protein called), and at present, the transfer of drugs to the brain is several dozen to 100 times by targeting the transferrin receptor with a special antibody. It was reported that it could be increased to some extent (see Non-Patent Document 1).
  • transferrin receptor is not expressed only in cerebral vascular endothelial cells, but is also expressed in liver and kidney in a larger amount than cerebral vascular endothelial cells. As the transport volume increases, drug introduction also occurs in the liver and kidneys. Therefore, it cannot be called brain-specific substance transport. In addition, some transporter molecules and those using antiporter molecules such as P-glycoprotein have been reported, but none of them have been confirmed to be effective.
  • PTD sequence a method using a special functional peptide.
  • This is called the PTD sequence has been identified as a peptide sequence necessary for the HIV tat gene product to translocate into the cell nucleus. Since this peptide has a function of not only passing through the nuclear membrane but also passing through all kinds of cell membranes (see Non-Patent Document 2), it can be distributed to organs throughout the body when injected into blood. Since cerebral vascular endothelial cells also pass the PTD peptide through the cell membrane, they can transport substances to the brain.
  • vascular endothelial cells are in direct contact with inflammatory cells and immune cells present in the blood, and control that these cells infiltrate during inflammation and disease states.
  • the invading cells were known to recognize the inflammatory homing receptor that appears during inflammation and accumulate in the lesion, but not only that, but also a tissue-specific vascular endothelial cell molecule (cellular) (It is called zip code) has become apparent.
  • cellular tissue-specific vascular endothelial cell molecule
  • zip code tissue-specific vascular endothelial cell molecule
  • this method can target the vascular endothelial cells of each organ, but it must be devised how to introduce the target molecule into the organ's substance.
  • Nonpatent Literature South Dog 1 Ningya Shi and William M. Pardridge, Noninvasive gene t argeting to the brain.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97, Issue 13, 7567-7572, June 20, 2000
  • Non-Patent Document 2 Steven R. Sc warze, Alan Ho, Adamina Vocero-Akbani, and Steven F. Dowdy, In Vivo Protein Transduction: Delivery of a Biologic ally Active Protein into the Mouse.Science 1999 September 3; 285: 156 9-1572.
  • Non-Patent Document 3 Renata Pasqual ini, Erkki Ruoslahti, Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries.Nature Vol.380, 28, March 1996. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to find a factor (motif sequence) involved in brain translocation activity. Furthermore, an object of the present invention is to provide a polypeptide having brain migration activity, a molecule containing the polypeptide, and a drug imparting brain migration activity.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems. It is known that there are a path through the cell space (paracel lular pathway) and a path through the cell (trans cel lular pathway) as a mechanism for cells to enter the tissue. The latter path was assumed to occur in special circumstances. While we are studying the phenomenon that a special cell (microglia) enters the brain without destroying the blood brain barrier, the cell induces a molecule that induces t rans cel lul ar pathway. Sawada, M., Imai, F., Suzuki, ⁇ ., Hayakawa, ⁇ ., Kanno, ⁇ . : Nagat su, ⁇ . FEBS Let t, 433: 37-40, 1998. Brain-spec if ic gene express i on by immortalized microgl ial ce l l-med iated gene transfer in the mamma 1 i an brain.
  • the present inventors have conceived that the use of a peptide fragment of the active site of this molecule enables brain-specific targeting and substance transport, which had been impossible until now.
  • microglia contains a ligand molecule that induces the above mechanism. Therefore, in order to isolate and identify the molecule, mRNA was separated from microglia and a single cDNA library was obtained. The target molecule was successfully identified by screening the phage that had been prepared and incorporated into T7 phage, and that expressed brain translocation activity.
  • the present inventors synthesized a DNA encoding a polypeptide comprising a random amino acid sequence and incorporated it into a phage library, and screened for a polypeptide having brain migration activity.
  • the present inventors have confirmed that the polypeptide actually has an activity of transferring to the brain by administering a synthetic polypeptide having the motif sequence to a test animal.
  • intensive research is being carried out, and the polypeptide force is transferred to brain tissue by a trans ele llul ar path way mechanism.
  • the peptide of the present invention is very useful as a molecule imparting lance migration inducing ability.
  • the polypeptide having the amino acid motif sequence or the amino acid characteristics of the present invention is considered to have brain translocation activity.
  • the present inventors have revealed that a molecule to which the polypeptide is added exhibits a brain translocation activity even if it is a large molecule such as a phage particle.
  • the polypeptide comprising the motif sequence found by the present inventors can confer brain translocation activity to any molecule by binding to any molecule, and thus includes the motif sequence.
  • Polypeptides are thought to be drugs that confer brain translocation activity.
  • the present invention relates to a polypeptide having brain migration activity, a molecule containing the polypeptide, and a drug imparting brain migration activity, more specifically,
  • a polypeptide having line activity
  • a polypeptide comprising the following amino acid motif sequence, having a brain-transition activity
  • X 3 is any amino acid
  • X 4 is G, S, T, C, N, L, Q, or Y.
  • amino acid motif sequence is the following sequence:
  • ⁇ 3 is any amino acid
  • ⁇ 4 is an uncharged polar amino acid (G, S, ⁇ , C, ⁇ , Q, ⁇ )
  • X is S, T, ⁇ or L
  • X 3 is any amino acid
  • X 4 is S, T, C
  • polypeptide according to any one of [1] to [8], which has an activity of binding to vascular endothelial cells of the brain,
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, deleted, or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 12, and has a brain translocation activity Polypeptide,
  • polypeptide according to any one of [1] to [11], wherein the polypeptide has a length of 9 amino acids or less.
  • a carrier for brain delivery comprising a structure in which the polypeptide according to any one of [1] to [12] is bound to a micelle, a liposome, or a microcapsule,
  • a therapeutic agent for brain disease comprising a structure in which a drug is carried on the brain delivery carrier according to [20] or [21],
  • a method for producing a molecule having brain translocation activity comprising a step of binding the polypeptide according to any one of [1] to [12] to an arbitrary molecule;
  • a method for producing a protein molecule having brain translocation activity comprising the following steps (a) to (c):
  • [1] a step of producing an expression vector comprising a DNA linked to a DNA encoding the polypeptide according to any one of [12] (b) a step of introducing the expression vector into a cell
  • a method for transferring any molecule to the brain of a non-human animal comprising the following steps) and (b):
  • test polypeptide displayed on the phage particles recovered in step (c) as a polypeptide having brain translocation activity
  • the test polypeptide is [5], [7 ]
  • the screening method according to [27] comprising the amino acid motif sequence according to any of [8], [29], wherein the phage is Ml3 phage or T7 phage, [27] Screening method,
  • the present invention provides a polypeptide having brain migration activity.
  • BBB blood-brain barrier
  • brain translocation activity refers to the activity of a molecule such as a polypeptide translocating into brain tissue when administered into the body (for example, intravenous administration).
  • the polypeptide of the present invention can be generally expressed as a polypeptide having brain translocation activity (brain translocation). For example, it can pass through the blood-brain barrier, or induce transmigration (transcytosis). It can also be expressed as a polypeptide having an ability.
  • polypeptide of the present invention has a function of transferring other molecules to the brain by binding to other substances (molecules). Therefore, the present invention Polypeptides can also be expressed as “polypeptides that confer brain translocation activity”, “brain translocation peptides”, and “brain translocation activity conferring agents”.
  • the present inventors have revealed that a 9-amino acid polypeptide can confer effective brain translocation activity on other substances (molecules). Therefore, it can be said that even a short polypeptide of at least about 9 amino acids has a function of imparting effective brain translocation activity to other molecules.
  • the length of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but is, for example, within 100 amino acids, preferably within 15 amino acids, more preferably within 9 amino acids, most preferably 4-9 amino acids. It is acid length.
  • polypeptide of the present invention it is described in the following [Sequence 1].
  • An amino acid motif sequence more preferably an amino acid motif sequence described in [Sequence 2] or a polypeptide comprising the amino acid motif sequence described in [Sequence 3].
  • a polypeptide having at least an amino acid motif sequence of any one of the following [Sequence 1] to [Sequence 3] is provided.
  • X i is S (serine), T ( ⁇ leonine), N (asparagine), P (proline), V (valine) or L (leucine);
  • x 3 is any amino acid
  • x 3 is any amino acid
  • X iG glycine
  • S serotonine
  • T tyrosine
  • C cysteine
  • N asparagine
  • Q glutamine
  • Y tyrosine
  • R or K is more preferably R.
  • these amino acids (G, S, T, C, ⁇ , Q, ⁇ ) are classified as uncharged polar amino acids.
  • X 3 is any amino acid
  • amino acids are described in accordance with a commonly used one-letter code (for example, R is arginine, K is lysine).
  • amino acid sequences are described in the order from N-terminal to C-terminal.
  • the inventor of the present invention provides a polypeptide having a structure in which the peptide is cyclized (more specifically, a disulfide bond (SS bond) is formed between cysteines at both ends of the peptide and cyclized). Further, it was found to have a high brain migration activity.
  • a disulfide bond SS bond
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide having a cyclic structure.
  • the above-mentioned motif sequence can be found for the polypeptide constituting this circular region.
  • the amino acid constituting the motif sequence is composed of 4 amino acid residues adjacent to each other. These adjacent amino acids usually form a peptide bond, but when adjacent amino acids are cysteine residues, they can form a disulfide bond.
  • the “adjacent 4 amino acid residues” in the motif sequence of the present invention is not limited to the case where peptide bonds are formed with each other. When the adjacent amino acids are cysteine, It may be a case where a rufide bond is formed.
  • “one” in the above [sequence 1] to [sequence 3] usually means a peptide bond, but when the adjacent amino acid is cysteine, the “one” is a disulfide bond. (S-S bond) may be used.
  • S-S bond may be used.
  • the motif sequence of the present invention is not found in the amino acid sequence of a polypeptide on a straight chain, the motif of the present invention is formed by amino acids that are adjacent by forming a cyclic structure. It may be done.
  • the type of amino acid sequence other than the above motif sequence is not particularly limited as long as it is a polypeptide containing the above motif sequence consisting of 4 amino acids.
  • polypeptide having brain translocation activity described in (Table 1) has the following characteristics.
  • polypeptide region that can form a cyclic structure (ie amino acid sequence excluding cysteines at both ends), (1) all polypeptides contain the basic amino acid K or R, and (2) the remaining amino acids
  • the residue is composed of any one of 10 amino acids [G, A, V, L, S, T, P, Q, H, N].
  • a polypeptide having a cyclic region which has at least one basic amino acid residue (K or R) in the cyclic region, and the remainder of the cyclic region
  • the amino acid residue is selected from amino acid residues [G, A, V, L, S, T, P, Q, H, N] (usually 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 100%) (this feature may be referred to as “feature 1” in this specification)
  • a polypeptide is provided.
  • the polypeptide has the above-mentioned “Characteristic 1” and comprises the motif sequence of the present invention ([Sequence 1] to [Sequence 3]).
  • all polypeptides of the present invention was found to contain basic amino acids (K or R).
  • K or R the content of all amino acids
  • a polypeptide having brain translocation activity comprising 10% or more of basic amino acid residues (K or R).
  • a polypeptide having a cyclic peptide region which has at least one or more basic amino acid residues (K or R) in the cyclic peptide region, and has a brain transition activity.
  • the upper limit of the length of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but usually a 7 amino acid having a motif of the above-mentioned 4-amino acid sequence or the above-mentioned “Characteristic 1” or longer. If it is a peptide, it is considered to have an efficient brain translocation activity.
  • the upper limit of the length is not particularly limited, but generally, a polypeptide having a length of 50 amino acids or less, preferably 35 amino acids or less, is considered to have sufficient brain translocation activity. In addition, even a longer polypeptide containing the polypeptide usually has a brain translocation activity, so the length of the polypeptide of the present invention is not limited.
  • the length of the polypeptide region to be cyclized is not particularly limited.
  • the present inventor used a 9 amino acid residue polypeptide having a cystine residue at the end for the experiment. That is, for example, even a polypeptide having a cyclic structure with a length of 10 amino acids or longer is a polypeptide having the motif sequence of the present invention or the above-mentioned “feature 1”. If so, it is considered to have brain-transition activity. Therefore, the length of the cyclic peptide region in the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but is, for example, within 100 amino acids, preferably within 50 amino acids, and more preferably 4-30 amino acids. More preferably, it is 4-15 amino acids, more preferably 4-9 amino acids, and most preferably 4-7 amino acids.
  • polypeptide of the present invention is characterized by having the following function (activity) (A) and / or (B).
  • transmigration in (A) above refers to a phenomenon in which when a certain molecule enters the brain, it does not pass through the cell space of the vascular endothelial cell but passes through the vascular endothelial cell. This is also called “trans-endothelial cel l migraUonj", “trans ceilular pathway”, or “transcytosis”, and molecules (cells, etc.) that pass through vascular endothelial cells by this mechanism It is thought that it has a signal molecule and induces the above phenomenon in vascular endothelial cells via a receptor on the surface of vascular endothelial cells (Fig. 1).
  • the polypeptide of the present invention is considered to have an activity of inducing the above-mentioned transmigration to vascular endothelial cells. That is, the polypeptide of the present invention is considered to play a role as a signal molecule for inducing transmigration.
  • the signal molecule is considered to bind to brain vascular endothelial cells (for example, a receptor on the cells) in the early stage of transmigration. Therefore, in a preferred embodiment, the polypeptide of the present invention is characterized by having an activity of binding to brain vascular endothelial cells.
  • test molecule has the above-mentioned (A) transmigration-inducing activity or whether it binds to the above-mentioned (B) brain vascular endothelial cells
  • A transmigration-inducing activity
  • B brain vascular endothelial cells
  • Those skilled in the art can appropriately evaluate using a known method. For example, it can be evaluated by administering a fluorescently labeled test molecule into a blood vessel and observing a frozen section of brain vascular endothelial cells with a fluorescence microscope. For example, if a vascular endothelial cell to which a fluorescently labeled molecule is attached is observed, the test molecule is determined to have the activity (B), and the fluorescently labeled test molecule is present in the vascular endothelial cell. If observed in, the test molecule is determined to have the activity (A) above. '
  • the above fluorescent labeling methods there are methods such as isotope labeling, labeling with PET ligands, detection with MRI by binding to magnetite, and the like.
  • the transmigration-inducing activity can also be obtained. Can be evaluated. If permeation can be confirmed, it is determined to have the activity (A) above, and if it adheres to blood and ductal endothelial cells after washing, it is determined to have the activity (B) above.
  • the “brain vascular endothelial cells” in the present invention include, for example, mouse MBEC4, commercially available human-derived cerebral vascular endothelial cells BBE (; cells such as bovine brain-derived temporarily cultured vascular endothelial cells, and peripheral vascular endothelial cells. It is possible to show those in which cells and astrocytes are co-cultured to induce BBB-like functions.
  • BBE human-derived cerebral vascular endothelial cells
  • examples of the polypeptide of the present invention include polypeptides containing the amino acid sequence described in Table 1 above, but these are examples of the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention is not limited to these.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence shown in Table 1, or the polypeptide The present inventors have shown that phage molecules expressed on the protein actually have brain translocation activity, as shown in the examples described later.
  • the present invention provides the polypeptide described in any of the following (a) to (c).
  • SEQ ID NO: 1 to 12 comprising the amino acid sequence described in any one of 1 to 12
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, deleted, or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 12, and has brain translocation activity Polypeptide with
  • amino acid residues other than the motif sequence of the present invention are preferably added, deleted or substituted. It is also preferred that an amino acid is added, deleted, or substituted so as to have the above “Characteristic 1” of the present invention.
  • “several” means a number in the range of 2-9.
  • the organism to which the polypeptide of the present invention exhibits brain translocation activity is not particularly limited as long as it is an animal having a blood-brain barrier, but is usually a mammal, preferably a mouse, a rat, a gerbil, Cat, ushi, monkey, or hi.
  • the polypeptide of the present invention may be any polypeptide such as a natural protein-derived polypeptide, a recombinant protein-derived polypeptide, or a chemically synthesized polypeptide.
  • a person skilled in the art can synthesize a polypeptide consisting of an arbitrary amino acid sequence.
  • the synthesis of a polypeptide containing the above motif sequence and having Z or “Characteristic 1” is appropriately performed using a method known to those skilled in the art, for example, a commercially available polypeptide synthesizer. can do.
  • a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention is also included in the present invention. included.
  • the polynucleotide usually includes both DNA and RNA. That is, DNA encoding the polynucleotide of the present invention and RNA which is a transcription product of the DNA are encompassed by the present invention.
  • the present invention provides a vector into which the polynucleotide of the present invention has been inserted, the polynucleotide of the present invention or a host cell retaining the vector, and a method for producing the polypeptide of the present invention using the host cell.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA.
  • E. coli is used as the host
  • the pBluescript vector (Stratagene) is used as the cloning vector. And the like are preferable.
  • An expression vector is particularly useful when using a vector for the purpose of producing the polypeptide of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
  • pBEST vector manufactured by Promega
  • PET vector for E.
  • plasm manufactured by Invitrogen
  • pME18S-FL3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mo 1 Cell Biol. 8: 466- for individual organisms 472 (1988)
  • the insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocol in Molecular Biology ed. Ausube l et al. (1987) Publ i sh. John Wiley & Sons. Section 11. 4-11. 11).
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing the polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila). S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CH0, C0S, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells can be exemplified.
  • vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation, Aupulseel et ai. (1987) Publ i sh. John Wiley & Sons. Sec tion 9. 1-9. 9), ribofectin-min method (Current protocol s in Molecul ar Biology ed i. GIBCO-BRL) and other known methods such as a microinjection method.
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest.
  • These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or they may be heterologous signals.
  • the polypeptide of the present invention is recovered when the polypeptide of the present invention is secreted into the medium.
  • the polypeptide of the present invention is produced intracellularly, the cell is first lysed, and then the polypeptide is recovered.
  • ammonium sulfate or ethanol precipitation acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity Known methods including tea chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography can be used.
  • the polypeptide of the present invention Since the polypeptide of the present invention has brain translocation activity, a molecule to which the polypeptide of the present invention is bound is expected to have brain translocation activity.
  • the present inventors have shown that phage particles that normally do not have brain translocation activity actually acquire brain translocation activity by including the polypeptide of the present invention in the outer shell protein. Therefore, the polypeptide of the present invention is considered to have a function of conferring brain translocation activity on an arbitrary molecule by binding to the arbitrary molecule. In other words, the polypeptide of the present invention has a useful application that can impart brain translocation activity to other molecules.
  • the present invention provides a drug for conferring brain translocation activity on any molecule containing the polypeptide of the present invention.
  • the peptide tag of the present invention As an example of the peptide tag of the present invention, the peptide tag of the present invention described in the Examples described later is used. 1 and molecule.
  • the conjugate molecule can be appropriately combined with any molecule bonded to avidin. That is, a brain transiting peptide complex molecule having a structure as shown in FIG. 8 or a conjugate molecule specifically used in the examples described later is included in the present invention as a preferred embodiment.
  • a desired molecule bound to avidin can be transferred to the brain.
  • a method for transferring an arbitrary molecule to the brain using the conjugate molecule is also included in the present invention.
  • the present invention includes molecules that have been imparted with brain translocation activity by the above-mentioned drug of the present invention.
  • the molecule to which brain migration activity is imparted by the polypeptide (drug) of the present invention is not particularly limited.
  • a single compound such as a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a sugar chain, a protein, and a peptide, and a compound Library, gene library expression product, cell, cell extract, cell culture supernatant, microorganism, microbial product, phage, antigen, antibody, micelle (polymer micelle, etc.), ribosome, microcapsule, pep
  • Examples thereof include tide nucleic acid (PNA) and pharmaceutical compounds.
  • the polypeptide of the present invention or the above molecule can be appropriately labeled as necessary. Examples of the label include a radiolabel, a fluorescent label, and an enzyme label.
  • the size of the molecule to which brain migration activity is imparted by the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but usually the upper limit is the size that can physically pass through the blood brain barrier.
  • the molecule to be imparted may be a molecule (substance) having a size equivalent to that of a phage.
  • the molecule given above is composed of amino acids. A molecule containing about 100,000 amino acids may be used.
  • the molecule can be bound to the polypeptide of the present invention.
  • a molecule in which the polypeptide of the present invention is bound is prepared using DNA encoding a fusion protein of the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention. Is also possible.
  • the present invention also provides a brain delivery carrier comprising the polypeptide having the brain transition activity of the present invention.
  • the carrier can also be expressed as “carrier” or “carrier”.
  • the polypeptide itself having brain migration activity of the present invention can also be mentioned as an example of the carrier. That is, by directly binding the polypeptide of the present invention and a molecule to be transferred to the brain, the molecule can be delivered to the brain.
  • preferred embodiments of the carrier of the present invention include, for example, a carrier having a structure in which the polypeptide of the present invention is bound to a micelle (polymer micelle), ribosome, or microcapsule.
  • a desired drug can be transferred to the brain.
  • a compound having a therapeutic effect on brain diseases pharmaceutical group It is possible to efficiently deliver the compound to the brain and to exert an effective therapeutic effect by carrying the composition on the carrier.
  • the carrier itself carrying the compound (pharmaceutical composition) is expected as a therapeutic agent for brain diseases.
  • the present invention provides a therapeutic agent for brain disease comprising a structure in which a drug is carried on the above-mentioned brain delivery carrier of the present invention.
  • the “supported” may be a state where the drug is directly bonded to the carrier, or a state where the drug (pharmaceutical composition) is encapsulated in the carrier.
  • the present invention also provides a method for producing a molecule having brain translocation activity of the present invention.
  • a method for producing a molecule having brain migration activity which comprises the step of binding the polypeptide of the present invention to an arbitrary molecule.
  • this invention provides the manufacturing method containing the said process (a)-(c) as a preferable aspect.
  • the polypeptide of the present invention is preferably bound to the molecule so as to be placed outside the molecule to which brain transfer activity is to be imparted. That is, the polypeptide of the present invention is desirably bound to the molecule so as to be arranged on the surface of the molecule.
  • the polypeptide of the present invention includes a polypeptide comprising a sequence in which cysteine residues (C) are arranged so as to sandwich the motif sequence.
  • C cysteine residues
  • the SH group of two cysteine residues in a polypeptide is usually cross-linked by autoxidation (disulfide bond).
  • autoxidation disulfide bond
  • the polypeptide chain containing the motif sequence located between the two cysteines protrudes in a loop shape. That is, by introducing a cysteine residue as described above into the polypeptide of the present invention, the polypeptide of the present invention can be efficiently arranged on the molecular surface (outside).
  • a method for arranging the polypeptide of the present invention on the outside for example, a method for producing a recombinant so that the polypeptide of the present invention is arranged on a domain exposed to the outside of a protein molecule into which a polypeptide chain is introduced.
  • a cross-linking agent such as PEG is bound to protein, lipid, artificial carrier, etc. Examples thereof include a method of bonding peptide chains and a method of chemically bonding polypeptide chains to the surface of a carrier.
  • Examples of molecules to be bound to the polypeptide of the present invention include compounds that are desirably transferred directly to brain tissue for the treatment of brain diseases. It is expected that the compound is imparted with brain translocation activity by the polypeptide of the present invention, and as a result, when administered into the body, it efficiently migrates to brain tissue and exhibits a therapeutic effect.
  • the present invention includes a molecule having brain translocation activity expected to have a therapeutic effect on the above-mentioned brain diseases, or a drug containing the molecule.
  • the present invention can be applied in the following cases.
  • genes that promote the synthesis of neurotransmitters that are deficient due to degenerative loss of neurons such as tyrosine hydroxylase and popterin synthesis in Parkinson's disease where certain neurons degenerate
  • An enzyme gene of a dopamine biosynthesis system such as an enzyme is conceivable.
  • Degenerative diseases are neurotrophic factors (NGF, BDNF, GDNF, NT3, etc.) that suppress nerve cell death caused by various causes such as cerebral ischemia and promote regeneration of nerve protrusions.
  • NGF neurotrophic factor
  • BDNF BDNF
  • GNNF GNNF
  • TGF i3 and IL-10 genes have immunosuppressive effects in diseases involving immune cells such as multiple sclerosis. This is done by introducing cells that express the offspring.
  • Drugs that affect the nervous system are highly peripheral toxic, have effects on the peripheral nervous system, and do not easily pass through the blood-brain barrier.
  • a specific drug delivery system to the brain is required. It was. By using the polypeptide of the present invention, it is considered that the drug can be administered specifically to the brain with little influence on peripheral organs.
  • microdaria is a cell that should be called a defense system in the brain, so-called anti-tumor action or anti-viral action, because it gathers at the site of degeneration or inflammation and removes dead cells and is involved in damage repair. It can be applied not only to the treatment of a single disease by enhancing its properties by genetic engineering, but also to preventive measures against all diseases by strengthening the brain defense system itself.
  • the drug of the present invention may be composed of only the polypeptide of the present invention or a molecule containing the polypeptide having brain migration activity, or by a known pharmaceutical production method. It can also be formulated.
  • a suitable carrier or medium generally used as a drug such as sterilized water, physiological saline, vegetable oil (eg, sesame oil, olive oil, etc.), coloring agent, emulsifier (eg, cholesterol), suspending agent (Eg, gum arabic), surfactant (eg, polyoxyethylene hydrogenated castor oil surfactant), solubilizer (eg, sodium phosphate), stabilizer (eg, sugar, sugar alcohol, albumin), or In combination with preservatives (eg, parabens), etc.
  • a suitable carrier or medium generally used as a drug such as sterilized water, physiological saline, vegetable oil (eg, sesame oil, olive oil, etc.), coloring agent, emulsifier (eg, cholesterol), suspending agent (Eg, gum arabic),
  • preparations for injection can be provided as lyophilized products or liquids for injection.
  • Administration to the body can be performed by methods known to those skilled in the art, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., intranasally, transbronchially, intramuscularly, or orally.
  • intraarterial administration is preferable.
  • the present invention also includes molecules that have been imparted with brain migration activity by the above-mentioned drug of the present invention.
  • a phage in which the polypeptide of the present invention is expressed on the outer shell protein can be preferably mentioned.
  • the phage is not particularly limited, and for example, T7 phage, M13 phage, etc. can be preferably shown.
  • T7 phage the polypeptide of the present invention can be displayed on the outside of an outer protein called capsid.
  • the present invention relates to an antibody that binds (preferably specifically binds) to the polypeptide of the present invention.
  • antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies, and Fab fragments containing the products of Fab or other immunoglobulin expression libraries.
  • the polypeptides of the present invention or cells expressing them can also be used as an immunogen for producing antibodies that bind to the polypeptides of the present invention.
  • the antibody is preferably immunospecific for a polypeptide of the invention. “Immunospecific” means that the antibody has a substantially higher affinity for a polypeptide of the invention than its affinity for another polypeptide.
  • Antibodies that bind to the polypeptide of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows. Serum is obtained by immunizing a small animal such as a rabbit with the polypeptide of the present invention or a fusion protein thereof with GST. This, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, purification using an affinity column in which the polypeptide of the present invention is coupled, and the like.
  • the polypeptide of the present invention is immunized to a small animal such as a mouse, the spleen is removed from the mouse, and this is ground to separate cells, and mouse myeloma cells and polyethylene glycol are isolated.
  • a clone that produces an antibody that binds to the polypeptide of the present invention is selected from the fused cells (Hypridoma).
  • the obtained hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is used, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G force ram, DEAE ion exchange chromatography, It can be prepared by purifying the polypeptide of the present invention with a affinity ram or the like obtained by coupling.
  • the antibody of the present invention can be used for isolation, identification, and purification of the polypeptide of the present invention and cells expressing the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention can be suitably used in a screening method for molecules having binding activity to the polypeptide of the present invention described later.
  • the present invention provides a method for screening a molecule having binding activity to the polypeptide of the present invention.
  • the method includes the following steps (a) to (c).
  • a receptor having the polypeptide of the present invention as a ligand can be obtained.
  • the receptor is expected to be involved in transmigration in brain vascular endothelial cells.
  • Elucidation of the mechanism of lance migration is highly expected. It is also possible to obtain molecules involved in cell adhesion of endothelial cells, and the screening method of the present invention is very useful.
  • the “contact” in the above step (a) is usually appropriately performed depending on the state of the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention if it is in a purified state, it can be carried out by adding a test molecule (sample) to the purified preparation. If the polypeptide of the present invention is expressed in a cell or in a cell extract, a test molecule (sample) is added to the cell culture solution or the cell extract, respectively. Can be done.
  • the test molecule is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell in which the polypeptide of the present invention is expressed, or the vector of the present invention is used as the polypeptide of the present invention. It can also be performed by adding to the expressed cell extract.
  • test molecule used in the screening method or the polypeptide of the present invention is appropriately labeled as necessary.
  • label include a radiolabel, a fluorescent label, and an enzyme label.
  • the measurement of the binding activity can be appropriately performed by methods well known to those skilled in the art, for example, a method using a yeast hybrid system, a method using immunoprecipitation, and the like.
  • Various methods are known for measuring the interaction (binding activity) between proteins, and the measuring of the binding activity of the present invention is not limited to a specific method.
  • a sample containing a test molecule for evaluating the binding activity to the polypeptide of the present invention for example, a cell culture supernatant or a cell extract is contacted, and then the antibody of the present invention is contacted.
  • the molecule can be immunoprecipitated with the polypeptide of the present invention. And detecting the binding between the test molecule and the polypeptide of the present invention based on whether the electrophoretic mobility of the immunoprecipitated product is changed as compared with the case of the polypeptide of the present invention alone. Can do.
  • the test sample from the sample where binding was detected The child can be collected by a method using the binding with the polypeptide of the present invention, for example, affinity chromatography.
  • a cDNA library using a phage vector is prepared from a tissue or cell expected to express a test molecule such as a protein capable of binding to the polypeptide of the present invention, and this is prepared on agarose. After the expression and transcription of the protein on the filter, the labeled polypeptide of the present invention is reacted to detect plaques expressing the test molecule to be bound.
  • the inventive method can be carried out.
  • a synthetic compound, a natural product bank, or a random phage peptide display library is applied to the polypeptide of the present invention immobilized on a solid phase or the like to screen the binding molecule, or combinatorial
  • a method for isolating candidate compounds by screening using high-throughput chemistry techniques is also a technique that can normally be performed by those skilled in the art.
  • the test compound is not particularly limited, and for example, various known compounds and peptides, or a random peptide group created by applying a phage display method or the like can be used.
  • the so-called “double phage display method” (J. Castillo, B. Goodson and J. Winter: T7 displayed peptides) using the phage displaying the polypeptide of the present invention and the phage displaying the above-mentioned random peptide group.
  • double phage display method J. Castillo, B. Goodson and J. Winter: T7 displayed peptides
  • targets for selecting peptide specific scFvs from M13 scFv display libraries J Immunol Methods: 257: ⁇ 2: 117—22: 2001) can also be suitably used for the screening method of the present invention.
  • culture supernatants of microorganisms and natural components derived from plants and marine organisms are also subject to screening.
  • Other examples include biological tissue extracts, cell extracts, and gene library expression products, but are not particularly limited thereto.
  • Polypeptides which are usually gene products, are encoded by one strand of double-stranded DNA. At this time, assuming that it is encoded by the other chain The peptide of the amino acid sequence is called an antisense peptide.
  • the hypothesis that this antisense peptide interacts with the original peptide (sense peptide) was proposed by Blalock (1984) and others, and since then there have been reports that the sense peptide and antisense peptide interact. Many are known. Accordingly, by using the antisense peptide based on the complementary strand sequence of the DNA encoding the polypeptide of the present invention as a test molecule, the peptide is efficiently bound to the polypeptide of the present invention. It is possible to obtain molecules.
  • Molecules that bind to the polypeptides of the present invention are useful as, for example, brain migration activity inhibitors, inducers of 'increase or modification of brain migration activity, and receptor bodies (molecules that cause transmigration).
  • the present invention also relates to a method for obtaining a polypeptide having brain migration activity.
  • a screening method acquisition / isolation method for a polypeptide having brain translocation activity, comprising the following steps (a) to (d).
  • step (d) Step of selecting phage particles recovered in step (c) as a polypeptide having brain translocation activity
  • the sequence of the test polypeptide in the above method is not particularly limited, and a polypeptide consisting of any amino acid sequence can be used.
  • the test polypeptide of the present invention is a plurality of types of polypeptides having a random amino acid sequence.
  • the polypeptide comprising the amino acid motif sequence or a part of the motif sequence, or the polypeptide having the “characteristic 1” is used as a test polypeptide in the present invention.
  • the length of the test polypeptide is not particularly limited as long as it is allowed to be displayed on the phage coat protein. Those skilled in the art will consider the type of phage and the like. The length of the polypeptide can be set appropriately.
  • test polypeptide can be prepared using a commercially available peptide synthesizer or the like.
  • a method of displaying an arbitrary polypeptide on the phage coat protein is a technique generally known to those skilled in the art as a so-called phage display method.
  • a library of molecules is usually prepared by displaying an arbitrary polypeptide on the phage outer protein.
  • randomized DNA is chemically synthesized and inserted into phage DNA using genetic engineering techniques. By introducing this DNA into a host cell such as E. coli, a phage molecule is biosynthesized, and the polypeptide encoded by the randomized DNA is displayed on the outer protein of the virus particle.
  • the method (procedure) described in the examples described later can be shown as an example of the step of preparing phage particles in which the test polypeptide is displayed on the phage coat protein.
  • phage used in the screening method of the present invention for example, known phages such as M13, T7, i1, and fd can be suitably used.
  • phage outer protein examples include pI I I, 10A, 10B, and Capcid. Libraries and the like presented on the protein are commercially available, and these commercially available libraries can be used as appropriate in the screening method of the present invention.
  • the phage particles produced by the step (a) are selected in advance by panning the phage particles that can bind to the vascular endothelial cells in the brain before the step (b). can do.
  • the present invention Screening can be performed efficiently.
  • the panning method is a selection method using protein interaction, and can be appropriately performed by those skilled in the art in consideration of the type of the fuzzy.
  • An example of the use of the panning method in the screening method of the present invention is as follows. First, in order to concentrate phages that easily bind to brain vascular endothelial cells in culture, they react with the control cells (mouse Dario cells) and do not react. Absorb and remove phages that specifically bind, and concentrate phages that specifically adhere to mouse brain-derived vascular endothelial cells (for example, MBEC4). More specifically, panning can be performed by the procedure described in the examples described later.
  • non-human animals to which the phage particles are administered in the step (b) include mice, rats, gerbils, cats, rabbits, monkeys, and the like. Other examples include livestock animals and pet animals.
  • the phage administered in the above step (b) does not necessarily have to be the entire phage particle.
  • the screening of the present invention can be performed.
  • Administration into a non-human animal body is usually performed by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, transdermal administration, oral administration, etc., preferably intraarterial injection.
  • the phage particles can be usually recovered from the brain tissue as follows. Remove the brain of a non-human animal and make a dilution series of brain homogenates. Subsequently, the diluted solution is spread on an agar medium to form phage plaques, and then the plaques are picked up to collect phage particles.
  • this method is merely an example, and those skilled in the art can appropriately collect phage particles from brain tissue in consideration of the type of phage and the like.
  • amino acid sequence of the polypeptide selected in the above step (d) can be determined by a method known to those skilled in the art. All prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference. Brief Description of Drawings
  • Figure 1 schematically shows the mechanism of trans-endothelial cell migration.
  • FIG. 2 is a diagram and photograph showing the construction of a phage library using the T7 Select System.
  • the photograph shows cDNA fragments separated on an agarose gel.
  • a fragment of about 120 bp is amplified.
  • an insert close to lkb from 200 bp was confirmed. This corresponds to 70-300 amino acids.
  • Fig. 3 is a diagram showing the construction of a phage library (random peptide) using the T7 Select System.
  • Fig. 4 shows the T7 Select System.
  • FIG. 5 is a diagram showing a panning method.
  • FIG. 6 is a photograph showing the brain translocation activity of a phage having the sequence of SEQ ID NO: 23 or 24.
  • FIG. 7 is a graph showing the phage titer in the brain and the brain / plasma ratio.
  • FIG. 8 is a diagram schematically showing the structure of the brain-transferable peptide conjugate of the present invention.
  • FIG. 9 is an electron micrograph showing the presence of the peptide-gold colloid conjugate of the present invention in mouse brain.
  • FIG. 10 is an electron micrograph showing the presence of the peptide-gold colloid conjugate of the present invention in a pyramidal cell layer CA ⁇ CA2.
  • Control group (only avidin gold colloid is administered) No reaction is seen in vascular endothelium.
  • the control group (left) shows no reaction on the vascular endothelium, whereas the experimental group shows the deposition of DAB that shows an immune response on the endothelial cells (arrow). The reaction is seen from the endothelial cells and also outside the blood vessels (brain parenchyma).
  • FIG. 11 is a diagram schematically showing an outline of an evaluation experiment on permeability to MBEC4 using the peptide conjugate of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing the permeability of the peptide conjugate of the present invention (T2J004) to MBEC4.
  • the peptide was bound to avidin-FITC 0.4 nmol / insert at a ratio of 1: 4, and the change with time in permeability to MBEC4 was examined.
  • Figure 13 shows the increase in permeability by peptide conjugates and the inhibitory activity by unlabeled peptides in the blood-brain barrier model.
  • FIG. 14 is a diagram showing an outline of an experiment for evaluating the permeability of microglia or macrophages in MBEC4.
  • FIG. 15 is a graph showing permeability in MBEC4 using various peptide conjugates of the present invention.
  • Figure 16 shows the recombinant brain-transferring phage using the 4F11 anti-phage 13 antibody. It is a photograph which shows detection in the brain.
  • Brain-transferable phage (upper) and control phage (lower) were administered intravascularly, and the excised brain 30 minutes later was stained with 4F11 anti-M13 phage antibody. In the brain-transferred phage, It was possible to detect phage particles.
  • Figure 17 is a photograph showing the detection of microglial transcytosis using a confocal microscope.
  • Fig. 18 is a photograph of a phase contrast microscopic image (left) and a fluorescent microscopic image (right) when microglia was added to vascular endothelial cells after 1 hour.
  • Fig. 19 is a photograph of the results of light microscopic observation after toluidine blue staining. Toluisibli-staining was performed on a vertical section of the MBEC4 blood-brain barrier model with microglia (left) and macrophages (right).
  • FIG. 20 is a photograph showing the results of MBEC4 electron microscope observation.
  • the black belt-like part visible in the center is the tight junction (a barrier structure that is characteristic of the blood-brain barrier).
  • Figure 21 is a photograph showing an electron microscopic image of microglia passing through the blood brain barrier model.
  • Figure 22 shows a photograph showing an electron microscopic image of microglia passing through the blood-brain barrier model. There is an image of microdalial protrusions invading into the MBEC4 cells that form the blood-brain barrier.
  • Figure 23 shows a photograph showing the adhesion of macrophage cell line Raw264. 7 to MBEC4. Is true. Macrophages only loosely adhere to MBEC4, which forms the blood brain barrier. Permeation into the cell layer was not seen.
  • Figure 24 is a photograph showing adhesion of macrophage cell line Raw264. 7 to MBEC4. Macrophages only loosely adhere to MBEC4, which forms the blood brain barrier. Permeation into the cell layer was not seen.
  • PEG6000 was purchased from Wako from Trypsin EDTA, Luria broth base, and penicillin streptomycin from GIBC0.
  • EDTA 2Na was purchased from Nakarai
  • Agarose 36G was purchased from Funakoshi
  • T7Select l-Cloning kit was purchased from Novagen.
  • END- D cells were inactivated for 10 3 ⁇ 4 FCS and 100 uni t / ml Benishirin, 100 mg using a DMEM (SIGMA) was added to I ml streptomycin, and cultured under 5% C0 2 in conditions 37 ° C. Passage was washed once with PBS (-) and then 5 ml of 0.25% trypsin. I ImM EDTA 4Na was added and left to stand for 3 minutes, and the cells were detached by flushing with 5 ml of medium.
  • SIGMA DMEM
  • the cells were precipitated by centrifugation at 1200 rp for 5 minutes, the supernatant was removed, and the cells were washed once with medium, and then 3 x 10 5 cel ls I in a 10 cm dish.
  • MBEC4 cells heparin 10% FCS and / ml SIGMA
  • 30 xg / ml ECG S Endothel ial cel l Growth Supplement; Upstate biotechnology
  • DMEM 5% C0 2 conditions at 37 ° C for Cultured under. Passage is spread on a 10 cm petri dish coated with 0.2% gelatin (Katayama) with 2 X 10 5 cel ls I 7 ml and passaged every 3-4 days
  • MBEC4 used for panning was spread on a collagen-coated 10 cm dish with 7 ml of 2 ⁇ 10 6 cel ls I and used for panning 4 days later.
  • the EERR22773388 which was used to measure the amplification gain of the 2255 and the titer measurement, was used to measure the thickness of this line. Make sure that you have a 2200 ⁇ gg // mmll Using overnight LB culture medium at 37 ° C
  • 10 11 pfu of the M13-c7c phage library (10 1) was dissolved in 2 ml of PBS (-), and the whole volume was added to 203 Darioma cells, and gently shaken at room temperature for 10 minutes. It was adsorbed. Subsequently, the supernatant was added to END-D cells and gently shaken at room temperature for 10 minutes to be adsorbed. Subsequently, the supernatant was added to MBEC4 cells and gently shaken at room temperature for 10 minutes for adsorption.
  • the phage extract from each cell and the phage titer at each step were determined by the method described in “2-2-1. Determination of phage titer” below.
  • the phage solution extracted from MBEC4 cells was amplified by the method described in “2-2-2. Phage amplification and purification” below and used for the second panning.
  • the titer of the phage solution was measured as follows.
  • the phage solution for measuring the titer was prepared as a dilution series with TBS, plotted on the ER2378 laund plate 10 z 1 at a time, dried to the extent that it did not flow, and then cultured at 37 ° C overnight.
  • the titer of the phage solution was calculated by counting the plaques that developed blue. 2-2-2. Phage amplification and purification
  • a phage solution to be amplified was added to LB medium containing 20 ig / ml tetracycline to which 1/100 volume of ER2738 overnight culture solution was added, and cultured at 37 ° C for 4.5 to 5 hours with shaking. . Subsequently, the supernatant was collected by centrifugation at 10000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. ER2738 was completely removed by centrifuging the supernatant at 10000 rp in. 10 minutes at 4 ° C.
  • Each cell was adsorbed for 10 minutes, washed 10 times with 5 ml of 0.3% Tween 20 I PBS (-), and then 0.2 mg Glycine-HC1 (pH 2.2) containing lmg / ml BSA. Extraction was performed by adding 2 ml and gently shaking at room temperature. Collect the extract, immediately rinse with 2 ml of 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), and add 1.6 ml of 1 M Tris-HC 1 (pH 9.1) with the extract. Neutralization was performed.
  • the phage extract from each cell and the phage titer at each step were determined by the method described in “2-2-1. Determination of phage titer” above.
  • the phage solution extracted from MBEC4 cells was amplified by the method described in “2-2-2. Phage amplification and purification” above and used for panning.
  • the blood was centrifuged at 15000 r.p.m. for 10 minutes at 4 ° C, collected as plasma, and the titer was measured.
  • the homogenate, plasma, and perfusate of each tissue were determined for phage titer by the method described in “2-2-1. Phage titration” above.
  • Phages were cloned from either a brain homogenate with one in vitro F nonimve and one in vivo panning or a brain homogenate with three Inr / ra pannings.
  • the supernatant was removed by decantation by centrifugation at 13000 r.p.m. for 30 minutes at 4 ° C, and further centrifuged at 13000 r.p.m. for 30 minutes at 4 ° C, and the remaining supernatant was completely removed by aspiration.
  • the phage was completely dissolved by suspending the precipitated phage by adding Iodided buffer (4M Nal (SIGMA) / lmM EDTA IlOmM Tris pH8.0). Subsequently, 250 ⁇ 1 ethanol was added and the mixture was agitated by inversion, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. This was centrifuged at 15000 r.p.m. for 10 minutes at room temperature to remove the supernatant, the precipitate was gently washed with 1 ml of 70% ethanol, and centrifuged at 15000 r.p.m. for 5 minutes at room temperature. The supernatant was removed by decantation, and the precipitate was dried in a desiccant overnight for 5 minutes.
  • Iodided buffer 4M Nal (SIGMA) / lmM EDTA IlOmM Tris pH8.0.
  • the obtained phage clone was amplified and purified according to the method described in “2-2-2. Phage amplification and purification” above.
  • the purified phage clone was changed to a phage dose of 101 ⁇ pfu I 300 xl, and its ability to migrate to the brain was evaluated using the titer according to the method described in “3. In vivo panning” above.
  • M 13-KE New England Biolabs, E8101S
  • clone number 1148 was used as a control phage.
  • 81 bp (415-15: GAATCC ATGCAGAATTTC (XXK) 15AAGCCTGCTACAGACCAT / SEQ ID NO: 14) that includes a random sequence and has EcoRI and Hindi II restriction enzyme sites at both ends so that it can be incorporated into the T7 phage 10B gene sequence.
  • an oligonucleotide of 86 bp (415-C 15C: GATCCATGCAGAATTCCTGC (XXK) 15TGCAAGCTTGCTACAGACCAT / SEQ ID NO: 1 5) was synthesized and about 1.3 g (50 pfflol) of the template was used as a template, and the primers on the 5 'and 3' sides PCR was performed using about 1.9 g (300 pmol), and an insert for incorporating a T7 phage display library containing a random sequence was prepared.
  • the prepared insert was digested with restriction enzymes EcoRI and Hindlll, separated and purified on an agarose gel, incorporated into the EcoRI and Hindlll sites of pQE-TriSystem vector, amplified with E. coli, and random sequences were confirmed. .
  • a plasmid containing a random sequence was purified from E. coli, digested with EcoRI and Hind 111, the target fragment was separated and purified on an agarose gel, and 10B of T7 phage was also digested with EcoRI and Hindlll. Incorporated into the gene sequence ( Figures 2 and 3). Incorporation into the 10B gene sequence, //? 7 / packaging into the fage was performed according to Novagen's T7 select Cloning kit manual. The primer sequences are shown below.
  • GAATCCATGCAGAATTCC (SEQ ID NO: 1 6)
  • Host E. coli BL 21 or BLT5403 attached to T7 Select415-1 Cloning kit (Novagen, 70015-3) is cultured overnight in LB medium at 37 ° C with shaking, and the streaks on LB plate are treated with BL21 or BLT5403 A working stock was prepared every two weeks.
  • B L2K BLT5403 used for phage amplification and titration was obtained by picking a single colony from this streaked working stock and shaking it overnight at 37 ° C in LB medium.
  • Three 10 cm Petri dishes with 203 Dario cells (used as a control) used for panning and one MBEC4 cell were fixed as follows. Remove cells, wash once with 5 ml PBS (-), add 3 ml of 4% PFA I PBS (-), let stand for 10 minutes, and then wash 3 times with 5 ml PBS (-) It was fixed by doing. Subsequently, 5 ml of 2% BSA / PBS (-) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes for blocking. The blocking solution was removed by aspiration immediately before the addition of phage.
  • T7 Select 415-1 Cloning kit Novagen was prepared by inserting an insert to present 15 residues of random peptides with both ends sandwiched by cysteine, and this was called T7 Select 415-cl5c library.
  • Fig. 4 For in vitro i Nonimbu, 2xl0 9 pfu of T7 select 415-cl5c library was dissolved in 2 ml of PBS (-), added to a 4 cm petri dish and spread to the whole, and then the whole volume was recovered and renewed to a new 4 cm Shaichi It was added to the sauce and spread throughout. Subsequently, 1.
  • Each phage extract and the phage titer at each step were determined by the method described in “3-2-1.
  • the titer is calculated based on a diluted phage solution with a dilution ratio of 100 times or more.
  • phage solution extracted from MBEC4 cells was amplified by the method shown in “3-2-2. Phage amplification and purification” below and used for the next panning.
  • the titer of the phage solution was measured as follows.
  • T7 select 1-1 kit (NEB, 70010-3).
  • plaques are formed only when BLT5403 is used.
  • CsCl was added to the supernatant to 0.5 g / ml, and density gradient centrifugation was performed at 15 ° C for 80000 rpm for 18 hours. The band was recovered. The collected purified phages were dialyzed against SM buffer to remove C s C1, added with a few drops of Chloroform, and stored at 4 ° C.
  • a portion of the phage clone was diluted 100-fold with MiIIiQ water, heated at 95 ° C for 5 minutes, and immediately cooled on ice was used as a PCR template.
  • PCR product was precipitated by etaprecipitation and dissolved in 10 TE.
  • a PCR product column-purified using CHROMA SPLIN + TE30 Colulmn (Clontec, K1321-2) 3 ⁇ 4 was used as a sequence template.
  • Phage clones were purified as shown in “3-2-2. Phage amplification and purification” above and used for evaluation at 7 zr / ra.
  • tissue sample was collected from the heart using a tuberculin syringe (26G) coated with 15 mg / ml EDTA, and immediately perfused with 0.2 g / ml EDTA / PBS, 400 ml. At the end of the perfusion, the perfusate in the heart was collected. After perfusion, the brain was removed and a portion of each organ was sampled for titer measurement and tissue section preparation. The left brain was used for titration measurement and the right brain was used for section preparation. 6-2. Preparation of tissue sample
  • the blood was centrifuged at 15000 r.p.m. 10 min4, collected as plasma, and titered.
  • phage having affinity for each organ was isolated from the above tissue sample. Of these, phages collected from the brain were grown and injected again from the tail vein of mice, and the same analysis as described above was performed. As a result, several positive clones could be isolated. A typical sequence is shown below.
  • Sequence 1 MLGDPN-CVKQAVQSSVKHPDLSC-KLAAALE (SEQ ID NO: 2 3)
  • Phage clones having these sequences were injected into mice. As a result, they were able to localize in the brain (Figs. 6 and 7). In this way, the brain specifically enters Molecular candidates could be isolated.
  • a similar method can be used to isolate molecules that can specifically target organs other than the brain.
  • Fig. 7 it was possible to isolate a phage having affinity for organs other than the brain.
  • the inventor of the present invention has produced a brain-transmissible peptide conduit.
  • the conjugate is a molecule that can take a cyclic structure by a disulfide bond between cysteine residues in the peptide molecule of the present invention, and is further added with piotin. More specifically, the structure shown in FIG. 8 can be illustrated.
  • the conjugate has binding ability with an avidin compound.
  • the above conjugate was bound to a colloidal gold and administered to mice, and used for experiments (observation of brain tissue sections using a transmission electron microscope) to evaluate the brain translocation activity of the peptides of the present invention.
  • Table 2 shows the transmission electron microscope sample preparation protocols.
  • T2J002 SEQ ID NO: 2
  • T2J004 SEQ ID NO: 4
  • FIGS. The arrow indicates the position of the peptide molecule of the present invention bound to the gold particle.
  • the colloidal gold of the present invention succeeded in bringing gold colloid into the brain. That is, it was confirmed that the peptide of the present invention has brain translocation activity.
  • the following reagents were used: Streptavidin, FITC Conjugate (Vector 1. Omg / ml), T2J004Y_Biotin, DMEM (SIGMA) Lan BS
  • T2J004Y-Biotin has the polypeptide shown in SEQ ID NO: 4.
  • FALCON [35] 3096 cell culture inserts 3. Seed into O / xm pore size, 37. C,
  • Biotind.6 nmol / insert was mixed and incubated at room temperature for 30 minutes. After that, prepare 250 1 in each culture solution and replace with the culture solution in insert.
  • the T2J004Y-Biotin in conjugated was about 8 times more transparent with MBEC4 and about 4 times more with END-D.
  • the peptide permeated in MBEC4 more than twice as much as END-D, and the permeation amount increased with time.
  • the amount of peptide that permeated correlated with the amount of peptide added, but four times as much as 1.6 nmol I insert peptide compared to 0.4 nmol I insert peptide added.
  • the amount of peptide that permeated was about twice. From this, the peptide of 1.6 nmol I insert has an effective culture area of insert.
  • CT2J004Y represents a ring
  • LT2J004Y represents a molecule having a linear structure. The ring is due to disulfide bonds between cysteine residues contained in the molecule
  • each lOnmol I insert of peptide without Biotin label was mixed with the culture solution (200 l I insert) and replaced with the culture solution of the insert cultured for 4 days under the above conditions. After 30 minutes, the peptide-FITC mixture, which had been mixed in the same manner as before, was adjusted to 50 l with the culture medium and added to the insert. Six hours later, the inside of 24wel 1 was well stirred, and the fluorescence intensity was measured with Fluorskan Asen.
  • CT2J004Y and LT2J004Y both suppressed transmission of approximately 25% T2J004Y-BiotinDFI (Fig. 13).
  • PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit For general cell membrane labeling (SIGMA), DMEM DBS.
  • the phage that presented the brain migrating peptide seemed to slightly inhibit the permeation of microglia in MBEC4.
  • the clear difference could not be obtained because the number of ligands such as phages and microdalias was less than the number of receptors on the MBEC4 side.
  • T2J002Y-Biotin permeated only about 20-40% of T2J004Y-Biotin, but T2J003Y-Biotin permeated approximately 1.4 times more (Fig. 15).
  • FIG. 15 Brain translocation activity of a phage expressing the peptide of the present invention A phage expressing the peptide of the present invention and a control phage were injected into the blood vessel to examine the brain translocation activity.
  • phage particles expressing the peptide of the present invention could be detected in the brain (FIG. 16).
  • transcytosis activity of microglia passing through the blood-brain barrier model was observed using an electron microscope.
  • the present inventors have found for the first time an amino acid motif sequence involved in brain migration activity, and newly found that a polypeptide containing the motif sequence has brain migration activity.
  • the polypeptide of the present invention specifically binds to vascular endothelial cells of the brain, and further, by inducing the trans cell luar pathway, the substance can be sent into the brain parenchyma.

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Abstract

　ランダムなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNAを合成してファージライブラリーに組み込んだものを作製し、脳移行性を有するポリペプチドのスクリーニングを行った結果、脳移行活性を有する複数のポリペプチドを取得した。これらのポリペプチドは、共通の配列を含んでおり、脳移行活性に関与するアミノ酸モチーフ配列を同定することに成功した。

Description

明細書 脳移行活性を有するポリペプチド、 およびその利用 技術分野
本発明は、 脳移行活性を有するボリペプチド、 該ポリペプチドを含む分子、 並 びに脳移行活性を付与する薬剤に関する。 背景技術
脳は血液脳関門が存在するため、 薬物などを経口摂取しても注射などにより投 与しても、 ほかの臓器に比べて有効濃度が得られにくい特徴がある。 一方、 大量 投与することにより有効な濃度を脳内で確保することが可能にはなるが、 末梢血 液中には大過剰の薬物を注入することになり、 腎障害や肝障害などの副作用の問 題が生じる。 そこで、 脳への選択的薬物輸送のシステムを開発することが必要と なり、 実際に多くの研究がなされてきている。 このような研究開発の多くは、 脂 溶性が高い物質ほど血液脳関門を通過しやすいという脳の血管内皮細胞の性質を 利用した、 薬物そのものの化学修飾による脳移行性の増大をはかるものであった。 このような方法論では薬物の脳移行性が最大数倍程度改善するものの、 全体とし てはほとんど誤差範囲に留まるにすぎないという結果である。 これは、 末梢臓器 への物質の浸透が血管内皮細胞の細胞間隙を通過するのに対して、 脳の血管内皮 細胞は細胞間隙が密着帯という特殊な構造を形成し細胞間隙からの血液成分の浸 透がほとんどみられないため、 脳への物質輸送は脂溶性の化学修飾を行い直接細 胞膜にとけ込ませて浸透させるということを行わなければならない。 つまり、 脳 への物質輸送は末梢臓器と違って迂回路がないため、 正面突破により細胞の中を 浸透させるということを行う方法論である。 しかしそのメカニズムが異なるため、 効率が数千から数万倍低く、 したがって、 脳特異的な薬物輸送とはいえない。 ところが、 最近の技術的な進歩により、 脳血管内皮細胞に発現している膜表面 タンパク質を標的化する方法論が開発されてきた。 特に脳内に薬物を取り込ませ るにはトランスポーター （上述のように脳は細胞間隙からの物質の浸透がないた め、 血液中のアミノ酸や糖分は血液脳関門上に発現するトランスポ一ターに結合 して脳内に特異的に運搬される。 トランスフェリン受容体は脳の活動に必要な金 属結合型酵素に金属イオンを供給するトランスフェリンというタンパク質を脳に 輸送するトランスポ一夕一分子である。 ） と呼ばれるタンパク質の機能を利用す ることが有効であり、 現在、 1、ランスフェリン受容体を特殊な抗体で標的化する ことにより脳への薬物の移行性を数十倍から 1 0 0倍程度増大させることができ ると報告された （非特許文献 1参照） 。
しかし、 トランスフェリン受容体は脳血管内皮細胞だけに発現しているわけで はなく、 肝臓や腎臓にも脳血管内皮細胞より多量に発現しているため、 このシス テムを利用した場合、 脳への輸送量の増大とともに肝臓や腎臓にも薬物導入が起 こる。 従って、 脳特異的物質輸送とは言い難い。 このほか、 いくつかのトランス ポーター分子や P-糖タンパク質のようなアンチポーター分子を利用するものな ど報告されているが、 いずれも有効性が確認できていない。
これとは別に、 特殊機能性ペプチドを利用する方法が最近開発された。 これは PTD配列とよばれるもので、 HIV tat遺伝子産物が細胞の核に移行する場合に必 要なペプチド配列として同定されていた。 このペプチドは核膜を通過するだけで なくあらゆる種類の細胞膜も通過する機能があるため （非特許文献 2参照） 、 血 液中に注入すると全身の臓器に分布することができる。 脳血管内皮細胞も細胞膜 を通して PTD ペプチドが通過するため、 脳への物質輸送をはかることができる。 しかし、 末梢臓器の場合、 PTD配列による細胞膜経由の移入と細胞間隙からの浸 透の両者が有効であるのに対し、 脳は後者の浸透がみられないため、 脳の物質の 浸透率はほかの臓器に比べて遙かに低い。 この技術でも脳特異性が示すことがで きない。 一方、 最近になって、 血管内皮細胞の臓器ごとの特殊性を規定している分子に ついて報告がされるようになった。 生体の各臓器はそれぞれ役割や特殊性によつ て栄養要求性や血液から供給される様々な因子の必要度が異なるため、 それぞれ の臓器に分布する血管内皮細胞はその存在場所によって少しずつ違った特徴を持 つていることが徐々に明らかなつてきている。 さらに、 血管内皮細胞は血液中に 存在する炎症細胞や免疫細胞との直接の接点になっており、 炎症や病態時にそれ らの細胞が浸潤することをコントロールしている。 このときに、 侵入する細胞は 炎症時に現れる炎症性のホーミングレセプターを認識して病巣に集積することが 知られていたが、 それだけではなく、 組織特異的な血管内皮細胞マ一力一分子 (cellular zip codeとよばれている） も認識していることが明らかになつてき た。 この細胞マ一力一分子の役割はまだよくわかっていないが、 すくなくともこ の分子を標的化すれば臓器の血管内皮細胞までは標的化できると考えられ、 注目 されている （非特許文献 3参照） 。 ただ、 この方法では各臓器の血管内皮細胞ま では標的化できるが、 どうやって臓器の実質に目的分子を導入するかを工夫しな ければならない。
(非特許文南犬 1 ) Ningya Shi and William M. Pardridge, Noninvasive gene t argeting to the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97, Issue 13, 7567-7572, June 20, 2000
(非特許文献 2) Steven R. Sc warze, Alan Ho, Adamina Vocero-Akbani, and Steven F. Dowdy, In Vivo Protein Transduction: Delivery of a Biologic ally Active Protein into the Mouse. Science 1999 September 3; 285: 156 9-1572.
(非特許文献 3) Renata Pasqual ini, Erkki Ruoslahti, Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature Vol.380, 28, March 1996. 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 脳移行 活性に関与する因子 （モチーフ配列） を見出すことにある。 さらに、 本発明は、 脳移行活性を有するポリペプチド、 該ポリペプチドを含む分子、 並びに脳移行活 性を付与する薬剤の提供を目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 細胞が組織に侵入 するメカニズムには細胞間隙を通過する経路 （paracel lul ar pathway) と細胞 の中を通過する経路 （trans cel lular pathway) があることが知られている。 後者の経路は特殊な状況で起こると仮定されていた。 本発明者らは、 ある特殊な 細胞 (ミクログリア) が血液脳関門を破壊せずに脳内に侵入する現象を研究して いる内にその細胞には t rans cel lul ar pathwayを誘導する分子が存在すること を見いたした (Sawada, M. , Imai, F. , Suzuki, Η. , Hayakawa, Μ.， Kanno, Τ. : Nagat su, Τ. FEBS Let t, 433 : 37-40, 1998. Brain-spec i f ic gene express i on by immortal ized microgl ial ce l l-med iated gene transfer in the mamma 1 i an brain. ) 。
本発明者らは、 この分子の活性部位のペプチド断片を利用するとこれまで不可 能であつた脳特異的標的化と物質輸送が可能となるものと想到した。
本発明者らは、 ミクログリアには、 上記メカニズムを誘起するリガンド分子が 存在しているものと考えられることから、 その分子を分離同定するために、 ミク ログリアから mRNAを分離し、 cDNAライブラリ一を作製して T7ファージに組み 込み、 脳移行活性を発現するようになったファージをスクリーニングすることで 目的分子の同定に成功した。
さらに本発明者らは、 ランダムなァミノ酸配列からなるポリペプチドをコード する DNAを合成してファージライブラリーに組み込んだものを作製して、 脳移 行活性を有するポリペプチドのスクリーニングを行った。
その結果、 脳移行活性を有する複数のポリペプチドを取得し、 これらのポリべ プチド配列から、 脳移行活性に関与すると考えられるアミノ酸モチーフ配列、 お よび配列の特徴を見出すことに成功した。
さらに本発明者らは、 上記モチーフ配列を有する合成ポリペプチドを被検動物 へ投与することにより、 当該ポリぺプチドが実際に脳への移行活性を有すること を確認した。 また、 本発明のポリペプチドの脳移行のメカニズムを解明すべく鋭 意研究を ΐτい、 該ポリペプチド力 sトランスマイクレ一シヨン (trans ee l lul ar p athway)機構によって、 脳組織へ移行することを明らかにした。 即ち、 本発明の ペプチドは、 卜ランスマイグレーション誘導能を付与する分子としても非常に有 用である。
本発明のアミノ酸モチーフ配列あるいはアミノ酸の特徴を有するポリペプチド は、 脳移行活性を有するものと考えられる。 また、 該ポリペプチドを付加した分 子は、 例えば、 ファージ粒子のような大きな分子であっても、 脳移行活性を示す ことが本発明者らによって明らかとなった。 本発明者らによって見出されたモチ —フ配列を含むポリペプチドは、 任意の分子と結合させることにより、 該分子に 脳移行活性を付与することが可能であり、 従って、 該モチーフ配列を含むポリべ プチドは、 脳移行活性を付与する薬剤となるものと考えられる。
上記の如く本発明者らは、 上記課題の解決に成功し、 本発明を完成させた。 即 ち、 本発明は、 脳移行活性を有するポリペプチド、 該ポリペプチドを含む分子、 並びに脳移行活性を付与する薬剤に関し、 より具体的には、
〔1〕 塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を 1 0 %以上含有する、 脳移行活性 を有するポリペプチド （脳移行性ポリペプチド） 、
〔2〕 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域 において塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) が 1 0 %以上含まれる、 脳移 行活性を有するポリペプチド、
〔3〕 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域 に少なくとも 1以上の塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を有する、 脳移 行活性を有するポリペプチド、
〔4〕 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域 に少なくとも 1以上の塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を有し、 かつ、 該環状領域の残りのアミノ酸残基のうち 8 0 %以上が以下のァミノ酸残基 から選択されることを特徴とする、 脳移行活性を有するポリペプチド、
G、 A、 V、 L、 S、 T、 P、 Q, H、 N
〔5〕 以下のアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドであって、 脳移行活性 を有するポリペプチド、
Xx- (Rまたは K) 一 X3— X4、 または
X4-X3- (Rまたは K) -X,
式中、 は S、 T、 Ν、 Ρ、 Vまたは L、 X3は任意のアミノ酸、 X4は G， S, T, C, N， L, Q, または Yを表す、
〔6〕 環状領域に 〔5〕 に記載のアミノ酸モチーフ配列が含まれる、 〔2〕 〜 〔4〕 のいずれかに記載のポリペプチド、
〔7〕 アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、 〔5〕 または 〔6〕 に記載 のポリペプチド、
X,- (Rまたは K) 一 X3_X4、 または
X4— X3— （Rまたは K) -X]
式中、 XJ S、 T、 Ν、 Ρまたは V、 Χ3は任意のアミノ酸、 Χ4は非電荷 極性アミノ酸 （G, S, Τ, C, Ν, Q, Υ) を表す、
〔8〕 アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、 〔5〕 または 〔6〕 に記載 のポリペプチド、
X,- (Rまたは Κ) — Χ3— Χ4、 または
X4-X3- (Rまたは Κ) -X,
式中、 X は S、 T、 Ρまたは L、 X3は任意のアミノ酸、 X4は S, T, C，
L, または Qを表す、 〔9〕 トランスマイグレーション誘導活性を有する、 〔1〕 〜 〔8〕 のいずれ かに記載のポリペプチド、
〔10〕 脳の血管内皮細胞と結合する活性を有する、 〔1〕 〜 〔8〕 のいずれ かに記載のポリペプチド、
〔1 1〕 以下の （a) 〜 （c) のいずれかに記載のポリペプチド、
(a) 配列番号： 1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリべプチ ド、、
(b) 前記 （a) のポリペプチドの両端のシスティン同士のジスルフイド結合に よって環状化されたペプチド領域を含む、 ポリペプチド、
(c) 配列番号： 1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1または 数個のアミノ酸が付加、 欠失、 もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポ リペプチドであって、 脳移行活性を有するポリペプチド、
〔12〕 ポリペプチドの長さが 9アミノ酸以内である、 〔1〕 〜 〔1 1〕 のい ずれかに記載のポリべプチド、
〔13〕 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド、
〔14〕 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドと結合する抗体、 〔15〕 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドを含有する、 任意 の分子に脳移行活性を付与するための薬剤、
〔16〕 任意の分子が任意のポリペプチドである、 〔15〕 に記載の薬剤、
〔1 7) 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドを含む、 脳移行活 性を有する分子、
〔18〕 分子がファージ粒子、 または該ファージ粒子の外殻夕ンパク質である、 〔17〕 に記載の分子、
〔19〕 分子が 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドとの融合夕 ンパク質である、 〔17〕 に記載の分子、 〔20〕 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドからなる、 脳送達 . 用キャリア、
〔21〕 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドが、 ミセル、 リポ ソームまたはマイクロカプセルと結合した構造からなる、 脳送達用キヤリ ァ、
〔22〕 〔20〕 または 〔21〕 に記載の脳送達用キャリアに薬物が担持され た構造からなる、 脳疾患治療剤、
〔23〕 任意の分子に 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドを結 合させる工程を含む、 脳移行活性を有する分子の製造方法、
〔24〕 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 脳移行活性を有するタンパク質分 子の製造方法、
( a ) 発現可能な状態で任意のタンパク質分子をコードする DNAと、
〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドをコードする D N Aとが結合した構造の D N Aを含む発現べクダーを作製する工程 (b) 前記発現ベクターを細胞へ導入する工程
(c) 前記べクタ一からの発現産物を回収する工程
〔25〕 以下の工程 ) および （b) を含む、 任意の分子を非ヒト動物の脳 へ移行させる方法、
(a) 任意の分子と 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドと が結合した構造の脳移行活性を有する分子を製造する工程
(b) 前記分子を非ヒト動物体内へ投与する工程
〔26〕 以下の工程 （a) 〜 (c) を含む、 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記 載のボリペプチドに対して結合活性を有する分子のスクリーニング方法、
(a) 〔1〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のポリペプチドと被検分子とを 接触させる工程
( b ) 前記ポリぺプチドと被検分子との結合活性を検出する工程 ( c ) 前記ポリペプチドと結合する分子を選択する工程 〔2 7〕 以下の工程 （a ) 〜 （d ) を含む、 脳移行活性を有するポリペプチド のスクリーニング方法、
( a ) 被検ポリペプチドをファージ外殻夕ンパク質上へ提示させたファー ジ粒子を作製する工程
( b ) 該ファ一ジ粒子を、 非ヒト動物へ投与する工程
( c ) 該非ヒト動物の脳組織からファ一ジ粒子を回収する工程
( d ) 工程 （c ) において回収されたファージ粒子に提示された被検ポリ ぺプチドを脳移行活性を有するポリぺプチドとして選択する工程 〔2 8〕 被検ポリペプチドが 〔5〕 、 〔7〕 または 〔8〕 のいずれかに記載の アミノ酸モチーフ配列を含む、 〔2 7〕 に記載のスクリーニング方法、 〔2 9〕 ファージが M l 3ファージまたは T 7ファージである、 〔2 7〕 に記 載のスクリーニング方法、
〔3 0〕 工程 （a ) につづいて、 さらに、 脳の血管内皮細胞と結合するファー ジ粒子を選択する工程、 を含む 〔2 7〕 に記載のスクリーニング方法、 を提供するものである。
本発明は、 脳移行活性を有するポリペプチドを提供する。 一般に血液から脳組 織内への物質の移行は、 血液脳関門（bl ood- brain barr ier ; BBB)と呼ばれる仕 組みによって制限されている。 これによつて脳は有害物質等から守られている。 本発明において 「脳移行活性」 とは、 ポリペプチド等の分子が体内へ投与 （例え ば、 静脈投与等） された際に、 該分子が脳組織内へ移行する活性を言う。 本発明 のポリペプチドは、 通常、 脳移行活性 （脳移行性） を有するポリペプチドである と表現することができるが、 例えば、 血液脳関門の通可能、 あるいはトランスマ ィグレーシヨン （トランスサイト一シス） 誘導能を有するポリペプチドと表現す ることも可能である。 また、 本発明のポリペプチドは、 他の物質 （分子） と結合 させることにより、 他の分子を脳へ移行させる機能を有する。 従って、 本発明の ポリペプチドは、 「脳移行活性を付与するポリペプチド」 、 「脳移行ペプチド夕 グ」 、 「脳移行活性付与剤」 と表現することもできる。
また、 本発明者らは、 9アミノ酸長のポリペプチドが、 他の物質 （分子） に対 し、 有効な脳移行活性を付与できることを明らかにした。 従って、 少なくとも、 9アミノ酸程度の短いポリペプチドであっても、 他の分子に対し有効な脳移行活 性を付与する機能があるものと言える。 本発明のポリペプチドの長さは、 特に制 限されないが、 例えば 1 0 0アミノ酸以内であり、 好ましくは 1 5アミノ酸以内 であり、 さらに好ましくは 9アミノ酸以内であり、 最も好ましくは 4〜 9アミノ 酸長である。
後述の実施例で示す実験によって、 以下の配列を有するポリペプチドは、 脳移 行活性を有することが判明した。
(表 1 )
名称 アミノ酸配列
T2J001 CSNLLSRHC (配列番号： 1 )
T2J002 CSLNTRSQC (配列番号： 2 )
T2J003 CVAPSRATC (配列番号： 3 )
T2J004 CVVRHLQQC (配列番号： 4 )
T2J004V3L CVLRHLQQC (配列番号： 5 )
T2J006 CRQLVQVHC (配列番号： 6 )
T2J007 CGPLKTSAC (配列番号： 7 )
T2J008 CLKPGPKHC (配列番号： 8 )
T2J009 CRSPQPAVC (配列番号： 9 )
T2J012 CNPLSPRSC (配列番号： 1 0 )
T2J013 CPAGAVKSC (配列番号： 1 1 )
T2J013V6L CPAGALKSC (配列番号： 1 2 )
本発明のポリペプチドの好ましい態様においては、 以下の 〔配列 1〕 に記載の アミノ酸モチーフ配列、 より好ましくは 〔配列 2〕 に記載のアミノ酸モチーフ配 列、 または 〔配列 3〕 に記載のアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドである。 換言すれば、 本発明の好ましい態様においては、 以下の 〔配列 1〕 〜 〔配列 3〕 のいずれかのァミノ酸モチーフ配列を少なくとも有するポリペプチドを提供する。
〔配列 1〕 X,- (Rまたは K) — X3— X4、 または
X4-X3- (Rまたは K) -X,
式中、
X iは S (セリン） 、 T (卜レオニン) 、 N (ァスパラギン) 、 P (プロリ ン） 、 V (バリン) または L (ロイシン） ；
x3は任意のアミノ酸；
X ¾G (グリシン） 、 S (セリン） 、 T (チロシン) 、 C (システィン) 、 N (ァスパラギン) 、 L (ロイシン) 、 Q (グルタミン) 、 または Y (チロ シン） ；
を表す。
〔配列 2〕 X,- (Rまたは K) 一 X3— X4、 または
X4-X3- (Rまたは K) -X,
式中、
x s (セリン） 、 T (卜レオニン) 、 N (ァスパラギン) 、 P (プロリ ン） 、 または V (パリン） 〔ただし、 は、 さらに好ましくは Sまたは T] ；
x3は任意のアミノ酸；
X iG (グリシン） 、 S (セリン） 、 T (チロシン) 、 C (システィン) 、 N (ァスパラギン) 、 Q (グルタミン) 、 または Y (チロシン) 〔ただし、 X4は、 さらに好ましくは T、 Qまたは C〕 ；
を表す。 また、 上記 （Rまたは K) は、 さらに好ましくは Rである。 一般的に、 これらアミノ酸 （G、 S、 T、 C、 Ν、 Q、 Υ) は、 非電荷極性 アミノ酸に分類される。
〔配列 3〕 X , - ( Rまたは Κ) — Χ 3— Χ 4、 または
X4 - X 3 - ( Rまたは Κ) - X ]
式中、
X S (セリン） 、 T (トレオニン） 、 P (プロリン） 、 または L (ロイ シン） ；
X 3は任意のアミノ酸；
X 4 « G (グリシン） 、 S (セリン） 、 T (チロシン) 、 C (システィン) 、 L (ロイシン） 、 または Q (グルタミン） ；
を表す。
なお、 本明細書におけるアミノ酸は、 一般的に使用される一文字表記にならつ て記載した （例えば、 Rはアルギニン、 Kはリシン） 。 また、 一般的な記載方法 にならい、 N末から C末方向の順にアミノ酸配列を記載した。
本発明者は、 上記ペプチドが環状化された （より具体的には、 上記ペプチドに おける両端のシスティン間でジスルフイ ド結合（S-S結合）が形成され環状化され た） 構造を有するポリペプチドは、 さらに高い脳移行活性を有することを見出し た。
従って本発明のポリペプチドの好ましい態様においては、 環状構造を有するポ リペプチドである。 本発明においては、 この環状領域を構成するポリペプチドに ついて、 上記モチーフ配列を見出すことができる。 該モチーフ配列を構成するァ ミノ酸は、 互いに隣接する 4アミノ酸残基から構成される。 これら隣接するアミ ノ酸同士は、 通常、 ペプチド結合を形成するが、 隣接するアミノ酸がシスティン 残基同士である場合には、 ジスルフィ ド結合を形成し得る。 本発明のモチーフ配 列における上記 「隣接する 4アミノ酸残基」 とは、 互いにペプチド結合を形成し ている場合に制限されず、 隣接するアミノ酸がシスティンである場合には、 ジス ルフィド結合を形成している場合であってもよい。 即ち、 本明細書における上記 〔配列 1〕 〜 〔配列 3〕 の、 「一」 は、 通常、 ペプチド結合を意味するが、 隣接 するアミノ酸がシスティンである場合には、 該 「一」 はジスルフイド結合（S - S 結合）であってもよい。 例えば、 直鎖上のポリペプチドのアミノ酸配列において、 本発明のモチーフ配列が見出されない場合であっても、 環状構造を形成すること により隣接するようになったアミノ酸によって、 本発明のモチーフが形成される 場合がある。
また、 本発明の好ましい態様においては、 上記の 4アミノ酸からなるモチーフ 配列を含むようなポリべプチドであれば、 上記のモチーフ配列以外のアミノ酸配 列の種類は特に制限されない。
また、 （表 1 ) に記載した脳移行活性を有するポリペプチドは、 以下の特徴を 有する。
環状構造を形成し得るポリペプチド領域 （即ち、 両端のシスティンを除くアミ ノ酸配列） において、 （1 ) 全てのポリペプチドには塩基性アミノ酸の Kまたは Rが含まれ、 （2 ) 残りのアミノ酸残基は、 1 0種のアミノ酸 〔G、 A、 V、 L、 S、 T、 P、 Q、 H、 N〕 のいずれかから構成される。
従って、 本発明の好ましい態様においては、 環状領域を有するポリペプチドで あって、 該環状領域に少なくとも 1以上の塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を 有し、 かつ、 該環状領域の残りのアミノ酸残基がアミノ酸残基 〔G、 A、 V、 L、 S、 T、 P、 Q、 H、 N] から選択される （通常、 8 0 %以上、 好ましくは 8 5 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以上、 最も好ま しくは 1 0 0 %) ことを特徴とする （この特徴を、 本明細書において 「特徴 1」 と記載する場合あり） 、 脳移行活性ポリペプチドを提供する。 本発明のさらに好 ましい態様においては、 上記 「特徴 1」 を有するポリペプチドであって、 本発明 のモチーフ配列 （ 〔配列 1〕 〜 〔配列 3〕 ) を含むポリペプチドである。
また、 上記 「特徴 1」 において記載したように、 本発明の全てのポリペプチド には、 塩基性アミノ酸 （Kまたは R) が含まれるという特徴が見出された。 例え ば、 実施例に使用された 9アミノ酸のポリペプチドにおいては、 少なくとも 1つ の塩基性アミノ酸が見出された （全アミノ酸に対する含有率は、 1 / 9 = 0 . 1 1 ( 1 1 %) 以上） 。
従って、 本発明の一つの態様として、 以下のポリペプチドを提供する。
( a ) 塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を 1 0 %以上含有する、 脳移行活性を 有するポリペプチド。
( b ) 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域に おいて塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) が 1 0 %以上含まれる、 脳移行活性を 有するポリペプチド。
( c ) 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域に 少なくとも 1以上の塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を有する、 脳移行活性を 有するポリペプチド。
本発明のポリペプチドの長さの上限についても、 特に制限されるものではない が、 通常、 上記 4アミノ酸配列のモチーフあるいは前記 「特徴 1」 を有する 7ァ ミノ酸もしくはそれ以上の長さのポリべプチドであれば、 効率的な脳移行活性を 有するものと考えられる。 長さの上限についても特に制限されないが、 一般に 5 0アミノ酸長以下、 好ましくは 3 5アミノ酸長以下のポリべプチドについては、 十分に脳移行活性を有するものと考えられる。 また、 該ポリペプチドを含むさら に長いポリペプチドであっても、 通常、 脳移行活性を有することから、 本発明の ポリペプチドは、 その長さを制限されない。
本発明の好ましい態様において環状化されるポリペプチド領域の長さは、 特に 制限されない。 本発明者は環状化されるペプチドの一例として、 末端にシスティ ン残基を配する 9アミノ酸残基のポリペプチドを実験に供した。 即ち、 例えば、 1 0アミノ酸あるいはそれ以上の長さの環状構造を有するポリペプチドであって も、 本発明のモチーフ配列もしくは上述の 「特徴 1」 を有するポリペプチドであ れば、 脳移行活性を有するものと考えられる。 従って、 本発明のポリペプチドに おける環状ペプチド領域の長さは、 特に制限されないが、 例えば 1 0 0アミノ酸 以内であり、 好ましくは 5 0アミノ酸以内であり、 より好ましくは 4〜3 0アミ ノ酸であり、 さらに好ましくは 4〜1 5アミノ酸であり、 さらに好ましくは 4〜 9アミノ酸であり、 最も好ましくは 4〜7アミノ酸である。
また好ましい態様においては、 本発明のポリペプチドは以下の （A) および/ または （B ) の機能 （活性） を有することを特徴とする。
(A) トランスマイグレーション (トランスサイトーシス) 誘導活性
(B ) 脳の血管内皮細胞と結合する活性
上記 （A) における 「トランスマイグレーション」 とは、 ある分子が脳へ侵入 する際に、 血管内皮細胞の細胞間隙を通過するのではなく、 血管内皮細胞内を通 過する現象を言う。 これは 「trans - endothel ial cel l migraUonj 、 「trans c el lular pathway] 、 もしくは 「トランスサイト一シス」 とも呼ばれ、 このメカ ニズムによって血管内皮細胞を通過する分子 （細胞等） は、 その表面にシグナル 分子を持ち、 血管内皮細胞表面上にある受容体を介して血管内皮細胞に上記現象 を誘導するものと考えられる （図 1 ) 。
本発明のポリぺプチドは、 血管内皮細胞に上記トランスマイグレーションを誘 導する活性を有するものと考えられる。 即ち、 本発明のポリペプチドは、 トラン スマイグレーションを誘導するためのシグナル分子としての役割を担うものと考 えられる。
また、 上記シグナル分子は、 トランスマイグレーションの初期段階において脳 の血管内皮細胞と （例えば、 該細胞上の受容体と） 結合するものと考えられる。 従って、 好ましい態様においては、 本発明のボリペプチドは、 脳の血管内皮細胞 と結合する活性を有することを特徴の一つとする。
任意の被検分子について、 上記 （A) のトランスマイグレーション誘導活性を 有するか否か、 あるいは、 上記 （B ) の脳の血管内皮細胞と結合するか否かは、 当業者においては公知の方法を利用して適宜評価することができる。 一例を示せ ば、 蛍光標識を施した被検分子を血管内に投与し、 脳の血管内皮細胞の凍結切片 を蛍光顕微鏡によって観察することにより評価することができる。 例えば、 蛍光 標識された分子が付着した血管内皮細胞が観察されれば、 被検分子は上記 （B ) の活性を有するものと判定され、 また、 蛍光標識された被検分子が血管内皮細胞 内において観察されれば、 被検分子は上記 （A) の活性を有するものと判定され る。 '
また、 上記蛍光標識方法以外にも、 アイソトープ標識、 PETリガンドによる標 識、 マグネ夕イトなどと結合させて MRIで検出する方法等が挙げられる。 上記 / n r/ra法以外のその他の態様としては、 例えば、 血管内皮細胞の培養系に BBB を誘導して、 上記被検分子を投与することによつても、 トランスマイグレーショ ン誘導活性を評価することができる。 透過が確認できれば、 上記 （A) の活性を 有するものと判定され、 また、 洗浄後に血,管内皮細胞に接着していれば、 上記 ( B ) の活性を有するものと判定される。
また本発明における 「脳の血管内皮細胞」 とは、 例えば、 マウス MBEC4、 市販 のヒト由来脳血管内皮細胞 BBE (；、 牛脳由来の一時培養血管内皮細胞等の細胞、 また末梢血管由来血管内皮細胞とァストロサイトを共培養し BBB様機能を誘導 したもの等を示すことができる。
当業者においては任意のポリペプチド （合成ペプチド） 、 あるいは、 該ぺプチ ドを有する分子について、 これらの細胞を利用して、 上記 （A) または （B ) の 活性の評価を行うことが可能である。 具体的には、 後述の実施例に記載の方法に より、 適宜、 活性を評価することができる。
本発明のポリペプチドとしては、 より具体的には、 例えば、 上述の表 1に記載 のァミノ酸配列を含むポリべプチドを挙げることができるが、 これらは本発明の ポリペプチドの一例であり、 本発明のポリペプチドはこれらに限定されない。 表 1のァミノ酸配列からなるポリペプチド、 もしくは該ポリぺプチドを外殻夕ンパ ク質上に発現させたファージ分子は、 後述の実施例で示すように、 実際に脳移行 活性.を有することが本発明者によって示された。
従って本発明は、 以下の （a ) 〜 （c ) のいずれかに記載のポリペプチドを提 供する。
( a ) 配列番号： 1〜1 2のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリべプチ ドヽ
( b ) 前記 ( a ) のポリペプチドの両端のシスティン同士のジスルフイ ド結合に よって環状化されたペプチド領域を含む、 ポリペプチド
( c ) 配列番号： 1〜1 2のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1または 数個のアミノ酸が付加、 欠失、 もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリべ プチドであって、 脳移行活性を有するポリべプチド
上記 （c ) においては、 本発明のモチーフ配列 （ 〔配列 1〕 〜 〔配列 3〕 ) 以 外のアミノ酸残基において付加、 欠失、 もしくは置換されることが好ましい。 お よび/または、 本発明の上記 「特徴 1」 を有するようにアミノ酸が付加、 欠失、 もしくは置換されることが好ましい。 また、 一般的に 「数個」 とは、 2〜9の範 囲の数を意味する。
本発明のポリべプチドが脳移行活性を示す対象となる生物は、 血液脳関門を有 する動物であれば特に制限されないが、 通常、 哺乳動物であり、 好ましくは、 マ ウス、 ラット、 スナネズミ、 ネコ、 ゥシ、 サル、 もしくはヒ卜である。
また本発明のポリペプチドは、 天然タンパク質由来ポリペプチド、 組換えタン パク質由来ポリペプチド、 または化学合成ポリペプチド等のいずれのポリべプチ ドであってもよい。 当業者においては、 任意のアミノ酸配列からなるポリべプチ ドを合成することが可能である。 例えば、 上記のモチーフ配列を含む、 および Z または上記 「特徴 1」 を有するようなポリペプチドの合成は、 当業者に公知の方 法、 例えば、 市販のポリペプチド合成機等を利用して適宜実施することができる。 さらに本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、 本発明に 含まれる。 上記ポリヌクレオチドとは、 通常、 DNAまたは RNAの双方が含まれる。 即ち、. 本発明のポリヌクレオチドをコードする DNA、 および該 DNAの転写産物で ある RNAは、 本発明に包含される。
本発明は、 本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクター、 本発明のポリヌ クレオチドまたは該ベクターを保持する宿主細胞、 および該宿主細胞を利用した 本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。
本発明のベクターとしては、 挿入した DNAを安定に保持するものであれば特 に制限されず、 例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、 クロ一ニング用べクタ 一としては pBluescriptベクタ一（Stratagene社製）などが好ましい。 本発明の ポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、 特に発現べク ターが有用である。 発現ベクターとしては、 試験管内、 大腸菌内、 培養細胞内、 生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、 例 えば、 試験管内発現であれば pBESTベクター （プロメガ社製） 、 大腸菌であれ ば pETベクタ一 （Invi trogen社製） 、 培養細胞であれば pME18S- FL3ベクター (GenBank Accession No. AB009864) 、 生物個体であれば pME18Sベクタ一 （Mo 1 Ce l l Biol. 8 : 466-472 (1988) ) などが好ましい。 ベクターへの本発明の DNA の挿入は、 常法により、 例えば、 制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行 つこと力 sできる (Current protocol s in Molecular Biology edi t. Ausube l et al. (1987) Publ i sh. John Wi l ey & Sons. Sec t ion 11. 4-11. 11) 。
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 目的に応じ て種々の宿主細胞が用いられる。 ポリぺプチドを発現させるための細胞としては、 例えば、 細菌細胞 (例：ストレプトコッカス、 スタフイロコッカス、 大腸菌、 ス トレブトミセス、 枯草菌） 、 真菌細胞 （例：酵母、 ァスペルギルス） 、 昆虫細胞 (例： ドロソフイラ S2、 スポドプテラ SF9) 、 動物細胞 （例： CH0、 C0S、 HeLa、 C127、 3T3、 BHK, HEK293, Bowes メラノ一マ細胞） および植物細胞を例示する ことができる。 宿主細胞へのベクター導入は、 例えば、 リン酸カルシウム沈殿法、 電気パルス穿孔法 (Current protocol s in Molecul ar Biology ed i t. Ausubel et ai. (1987) Publ i sh. John Wi ley & Sons. Sec t ion 9. 1-9. 9) 、 リボフェク 夕ミン法 （GIBCO- BRL社製） 、 マイクロインジェクション法などの公知の方法で 行うことが可能である。
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、 細胞周辺腔に、 ま たは細胞外の環境に分泌させるために、 適当な分泌シグナルを目的のポリべプチ ドに組み込むことができる。 これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内 因性であっても、 異種シグナルであってもよい。
本発明のポリペプチドの回収は、 本発明のポリペプチドが培地に分泌される場 合は、 培地を回収する。 本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、 そ の細胞をまず溶解し、 その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、 硫酸アン モニゥムまたはエタノール沈殿、 酸抽出、 ァニオンまたはカチオン交換クロマト グラフィー、 ホスホセルロースクロマトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグ ラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 ヒドロキシルアパタイトクロマ トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ とができる。
本発明のポリべプチドは脳移行活性を有することから、 本発明のポリペプチド が結合した分子は脳移行活性を有することが期待される。 本発明者らは、 通常脳 移行活性を有しないファ一ジ粒子が、 その外殻タンパク質に本発明のポリべプチ ドを含むことにより、 実際に脳移行活性を獲得することを示した。 従って、 本発 明のポリペプチドは、 任意の分子に対し結合することにより、 任意の分子につい て脳移行活性を付与させる機能を有するものと考えられる。 即ち本発明のポリべ プチドは、 他の分子に脳移行活性を付与し得る有用な用途を持つ。 本発明は、 本 発明のポリペプチドを含む、 任意の分子に脳移行活性を付与するための薬剤を提 供する。 好ましい態様においては、 上記のアミノ酸モチーフ配列、 および Zまた は上記 「特徴 1」 を有するポリペプチドを含む、 脳に任意の分子を移行させるた めの プチドタグを提供する。
本発明の上記ペプチドタグの一例としては、 後述の実施例に記載の本発明のぺ
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ュゲ一 1、分子を挙げることができる。 該コンジュゲ ート分子は、 アビジンと結合した任意の分子と、 適宜結合させることができる。 即ち、 図 8で示されるような構造を有する脳移行性ペプチドコンジユゲート分子、 あるいは、 後述の実施例によって具体的に使用されたコンジュゲート分子は、 好 ましい態様として本発明に含まれる。 該コンジュゲ一ト分子を用いることにより、 アビジンと結合させた所望の分子を、 脳へ移行させることが可能である。 該コン ジュゲート分子を用いた、 任意の分子を脳へ移行させる方法もまた、 本発明に含 まれる。 さらに本発明には、 本発明の上記薬剤によって脳移行活性を付与された 分子も含まれる。
本発明のポリペプチド （薬剤） によって脳移行活性を付与される分子は、 特に 制限されず、 例えば、 天然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 糖鎖、 タンパク質、 ペプチド等の単一化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遗伝子ライブラリーの 発現産物、 細胞、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 微生物、 微生物産生物、 ファージ、 抗原、 抗体、 ミセル (高分子ミセル等) 、 リボソーム、 マイクロカプセル、 ぺプ チド核酸 (PNA)、 医薬化合物等を挙げることができる。 本発明のポリペプチドも しくは上記分子は必要に応じて適宜標識することも可能である。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識、 酵素標識等を挙げることができる。
また、 本発明のポリペプチドによって脳移行活性を付与される分子の大きさは、 特に制限されないが、 通常は、 物理的に血液脳関門を通過しうる程度の大きさを 上限とする。 後述の実施例で示すように、 通常のファージ程度の大きさの分子も、 本発明のポリべプチドの作用によつて血液脳関門を通過することが可能である。 従って、 上記の付与される分子は、 ファージと同等の大きさを呈する程度の分子 (物質） であってもよい。 例えば、 上記の付与される分子がアミノ酸で構成され る場合には、 1 0万程度のアミノ酸を含有する分子であってもよい。
上記分子と本発明のポリペプチドとは、 当業者においては、 該分子の種類を考 慮して適宜、 公知の方法を利用して結合させることが可能である。
一例を示せば、 市販のカップリング試薬 （N-結合型、 C00H-結合型、 アミノ酸 残基修飾型、 S-S結合型等） を用いる方法、 クロラミン Tを用いる方法、 イソチ ァネート基を導入する方法等により、 該分子と本発明のポリペプチドとを結合さ せることができる。
また、 該分子がタンパク質である場合には、 該タンパク質と本発明のポリぺプ チドとの融合夕ンパク質をコードする D N Aを用いて、 本発明のポリべプチドが 結合した分子を作製することも可能である。
より具体的には、 以下の工程を含む方法によって作製することができる。 ( a ) 発現可能な状態で任意のタンパク質分子をコードする D N Aと、 本発明 のポリペプチドをコードする D N Aとが結合した構造の D N Aを含む発 現ベクターを作製する工程
( b ) 前記発現ベクターを細胞へ導入する工程
( c ) 前記べクタ一からの発現産物を回収する工程
また本発明は、 本発明の脳移行活性を有するポリペプチドからなる脳送達用キ ャリアを提供する。 該キャリアは、 「担体」 あるいは 「運搬体」 と表現すること も可能である。 本発明の脳移行活性を有するポリペプチド自体も、 上記キャリア の例として挙げることができる。 即ち、 本発明のポリペプチドと、 脳へ移行させ るべき分子とを直接結合させることによって、 該分子を脳へ送達させることがで きる。 また、 本発明の上記キャリアの好ましい態様としては、 例えば、 本発明の ポリペプチドが、 ミセル (高分子ミセル) 、 リボソームまたはマイクロカプセル と結合した構造からなるキャリアを挙げることができる。
さらに、 本発明のキャリアを利用することにより、 所望の薬剤を脳へ移行させ ることが可能である。 例えば、 脳疾患に対して治療効果を有する化合物 （医薬組 成物） を、 上記キャリアに担持させることにより、 該化合物を効率的に脳へ送達 させ.、 有効な治療効果を発揮させることが可能である。 該化合物 （医薬組成物） を担持させたキャリア自体は、 脳疾患治療剤として期待される。 従って本発明は、 本発明の上記脳送達用キヤリアに薬物が担持された構造からなる、 脳疾患治療剤 を提供する。 なお、 上記 「担持された」 とは、 薬物をキャリアと直接結合させた 状態でもよいし、 薬物 （医薬組成物） をキャリアに内包させた状態でもよい。 また本発明は、 本発明の脳移行活性を有する分子の製造方法を提供する。 本発 明の製造方法の好ましい態様においては、 任意の分子に本発明のポリペプチドを 結合させる工程を含む、 脳移行活性を有する分子の製造方法である。 また、 該分 子がタンパク質である場合には、 本発明は好ましい態様として、 上記工程 （a ) 〜 （c ) を含む製造方法を提供する。
なお、 本発明のポリペプチドは、 脳移行活性を付与したい分子の外側に配置す るように該分子と結合させることが好ましい。 即ち、 本発明のポリペプチドは、 該分子の表面上へ配置されるように該分子と結合させることが望ましい。
本発明の好ましい態様においては、 本発明のポリペプチドとして上記モチーフ 配列を挟むようにシスティン残基 （C ) を配置させた配列を含むポリペプチドを 挙げることができる。 ポリペプチド中の 2つのシスティン残基の S H基は、 通常、 自動酸化により架橋結合 （ジスルフイド結合） することが知られている。 このよ うに 2つのシスティン間で架橋結合が形成されることにより、 その間に位置する モチーフ配列を含むポリペプチド鎖はループ状に突出することが期待される。 即 ち、 本発明のポリぺプチドに上記のようなシスティン残基を導入することにより、 効率的に本発明のポリペプチドを分子表面 （外側） へ効率的に配置させることが 可能となる。 その他に、 本発明のポリペプチドを外側へ配置させる方法として、 例えば、 ポリペプチド鎖を導入するタンパク質分子の外側に露出するドメインに 本発明のポリペプチドを配置させるように組換え体を作成する方法、 PEGのよう な架橋剤をタンパク質、 脂質、 人工担体などに結合させ、 PEG鎖の末端にポリべ プチド鎖を結合させる方法、 ポリべプチド鎖を担体表面に化学結合させる方法等 が挙げられる。
本発明のポリペプチドと結合させる分子として、 例えば、 脳疾患の治療のため に脳組織へ直接移行させることが望ましい化合物等を挙げることができる。 該化 合物は、 本発明のポリペプチドによって脳移行活性が付与され、 その結果、 体内 へ投与された際に効率的に脳組織へ移行し、 治療効果を発揮することが期待され る。
本発明には、 上記のような脳疾患に対して治療効果が期待される脳移行活性を 有する分子、 または該分子を含む薬剤が含まれる。
本発明の脳移行活性を有するポリペプチドを用いた脳神経疾患の治療に対する 治療戦略としては、 例えば以下の場合に、 本発明を適用することが可能である。
1 ) 欠損または変異などによって量や活性が低下した酵素や生理活性タンパ ク質を補う補充療法：
遺伝子欠損や遺伝子変異により特定の酵素またはタンパク質が脳内で欠 乏することによって生じる様々な脳疾患に対し、 欠乏するタンパク質ゃ酵 素の遺伝子を導入した細胞を注入することにより行われる。 また、 特定の 神経細胞が変性脱落するパーキンソン病やアルツハイマー病に対し、 神経 の変性脱落により欠乏する神経伝達物質の合成を促進するような遺伝子、 たとえばパ一キンソン病におけるチロシン水酸化酵素やピオプテリン合成 酵素などのド一パミン生合成系の酵素遺伝子が考えられる。
2 ) 変性などで脱落する神経細胞を保護し機能を強化する保護療法：
変性疾患ゃ脳虚血など色々な原因で生じる神経細胞死を抑制し、 神経突 起の再生を促す神経栄養因子 (NGF, BDNF, GDNF, NT3など。 特にパーキン ソン病では BDNFや GNNFが有効であることが近年示されている。 ） 遺伝 子を発現する細胞を注入することにより行われる。 また多発性硬化症のよ うに免疫細胞が関与する疾患では免疫抑制作用がある TGF i3や IL- 10遺伝 子を発現する細胞を導入することにより行われる。
3 ) 腫瘍や血栓などを除去するような方法：
抗腫瘍作用を持つ因子を発現させたり、 杭がん剤を導入した細胞を脳に 移入したりすることにより行なわれる。 血栓除去については、 線溶系の酵 素を発現させることが考えられる。
4 ) 有効な薬物を脳にだけ導入するような方法：
神経系に作用する薬物は末梢毒性が高かったり、 末梢神経系に作用を持 つ物、 血液脳関門を通過しにくい物など色々あり、 脳への特異的なドラッ グデリバリーシステムが必要とされていた。 本発明のポリペプチドを用い ることにより、 末梢臓器にあまり影響を与えず脳に特異的に薬物投与がで きると考えられる。
5 ) 脳疾患予防システムとしての利用法：
もともとミクロダリァはその細胞の性質として変性や炎症部位に集まり 死細胞を取り除き損傷修復にも関わったり、 抗腫瘍作用ゃ抗ウィルス作用 を持つ、 いわば脳内防御システムともいうべき細胞であることから、 その 性質を遺伝子操作などで強化することによって、 単一疾患の治療だけでな く、 脳内防御システムそのものの強化を行うことによってあらゆる疾患に 対する予防措置にも応用しうると考えられる。
本発明の上記薬剤は、 本発明のポリぺプチドもしくは該ポリぺプチドを含む脳 移行活性を有する分子のみを成分とするものであってもよいし、 また、 公知の製 剤学的製造法によって、 製剤化することもできる。 例えば、 薬剤として一般的に 用いられる適当な担体、 または媒体、 例えば滅菌水や生理食塩水、 植物油 （例、 ゴマ油、 オリ一ブ油等） 、 着色剤、 乳化剤 （例、 コレステロール） 、 懸濁剤 （例、 アラビアゴム） 、 界面活性剤 （例、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性 剤） 、 溶解補助剤 （例、 リン酸ナトリウム） 、 安定剤 （例、 糖、 糖アルコール、 アルブミン） 、 または保存剤 （例、 パラベン） 、 等と適宜組み合わせて、 生体に 効果的に投与するのに適した注射剤、 経鼻吸収剤、 経皮吸収剤、 経口剤等の医薬 用製剤、 好ましくは注射剤に調製することができる。 例えば、 注射剤の製剤とし ては、 凍結乾燥品や、 注射用水剤等で提供できる。
また体内への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻腔内的、 経気管支的、 筋内的、 または経口的に当業者に公知の方法により行う ことができるが、 好ましくは動脈内投与である。
また本発明には、 本発明の上記薬剤によって脳移行活性を付与された分子も含 まれる。 その一例を示せば、 本発明のポリペプチドを外殻タンパク質上へ発現さ せたファージを好適に挙げることができる。
上記ファージは、 特に制限されないが、 例えば、 T 7ファージ、 M 1 3ファー ジ等を好適に示すことができる。 T 7ファージを用いる場合には、 キヤプシド (Caps i d)と呼ばれる外殻タンパク質の外側に本発明のポリペプチドを提示させ ることができる。
本発明は、 本発明のボリペプチドと結合する （好ましくは特異的に結合する） 抗体に関する。 ここで 「抗体」 には、 ポリクロ一ナルおよびモノクローナル抗体、 キメラ抗体、 一本鎖抗体、 ヒト化抗体、 さらに Fabまたは他の免疫グロブリン 発現ライブラリ一の産物を含む Fabフラグメントが含まれる。
本発明のポリペプチド、 またはそれらを発現する細胞は、 本発明のポリべプチ ドに結合する抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。 抗体 は、 好ましくは、 本発明のポリペプチドに免疫特異的である。 「免疫特異的」 と は、 その抗体が他のポリぺプチドに対するその親和性よりも本発明のポリぺプチ ドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
本発明のボリペプチドに結合する抗体は、 当業者に公知の方法により調製する ことが可能である。 ポリク口一ナル抗体であれば、 例えば、 次のようにして得る ことができる。 本発明のポリペプチドあるいはその GSTとの融合タンパク質を ゥサギ等の小動物に免疫し血清を得る。 これを、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のポリべ プチ.ドをカツプリングしたァフィ二ティ一カラム等により精製することにより調 製する。 また、 モノクローナル抗体であれば、 例えば、 本発明のポリペプチドを マウスなどの小動物に免疫を行い、 同マウスより脾臓を摘出し、 これをすりつぶ して細胞を分離し、 マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬 により融合させ、 これによりできた融合細胞 （ハイプリドーマ） の中から、 本発 明のポリペプチドに結合する抗体を産生するクローンを選択する。 次いで、 得ら れたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水を回収し、 得ら れたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン G力 ラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のポリペプチドをカツプリ ングしたァフィ二ティ一力ラム等により精製することで、 調製することが可能で ある。
本発明の抗体は、 本発明のポリペプチドやこれを発現する細胞の単離、 同定、 および精製に利用することができる。 また本発明のポリペプチドは、 後述の本発 明のポリぺプチドに対し結合活性を有する分子のスクリ—ニング方法において好 適に使用することができる。
本発明は、 本発明のポリペプチドに対し結合活性を有する分子のスクリ一ニン グ方法を提供する。 本発明の上記方法の好ましい態様においては、 以下の工程 ( a ) 〜 ( c ) を含む方法である。
( a ) 本発明のポリペプチドと被検分子とを接触させる工程、
( b ) 前記ポリペプチドと被検分子との結合活性を検出する工程、
( c ) 前記ポリペプチドと結合する分子を選択する工程
本発明の上記スクリーニング方法によって、 例えば、 本発明のポリペプチドを リガンドとする受容体を取得することが可能である。 該受容体は、 脳の血管内皮 細胞におけるトランスマイグレーションに関与することが期待される。 本発明の スクリーニング方法によって取得される受容体の機能を解析することにより、 ト ランスマイグレーションのメカニズムの解明が大いに期待される。 また、 内皮細 胞の細胞接着に関わる分子を取得することも可能であり、 本発明のスクリ一ニン グ方法は非常に有用なものである。
上記工程 （a ) における 「接触」 は、 通常、 本発明のポリペプチドの状態に応 じて適宜、 実施される。 例えば、 本発明のポリペプチドが精製された状態であれ ば、 精製標品に被検分子 （試料） を添加することにより行うことができる。 また、 本発明のポリべプチドが細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状 態であれば、 それぞれ、 細胞の培養液または該細胞抽出液に被検分子 （試料） を 添加することにより行うことができる。 被検分子がタンパク質の場合には、 例え ば、 該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、 本発明のポリペプチド が発現している細胞へ導入する、 または該ベクタ一を本発明のポリペプチドが発 現している細胞抽出液に添加することによって行うことも可能である。
また、 上記スクリーニング方法に用いる被検分子、 もしくは本発明のポリぺプ チドは、 必要に応じて適宜標識して用いられる。 標識としては、 例えば、 放射標 識、 蛍光標識、 酵素標識等が挙げられる。
上記結合活性の測定は、 当業者においては周知の方法、 例えば、 酵母ッ一ハイ プリッドシステムを利用した方法、 免疫沈降を利用した方法等により、 適宜実施 することができる。 タンパク質間の相互作用 （結合活性） の測定方法としては、 種々の方法が知られており、 本発明の結合活性の測定についても、 特定の方法に 限定されるものではない。
—例を示せば、 本発明のポリべプチドとの結合活性を評価する被検分子を含む 試料、 例えば、 細胞の培養上清や細胞抽出物等を接触させ、 その後、 本発明の抗 体を添加して、 本発明のポリベプチドとともに該分子を免疫沈降させることが可 能である。 そして免疫沈降した産物の電気泳動度が本発明のポリペプチドのみの 場合と比較して変化しているか否かに基づいて、 被検分子と本発明のポリべプチ ドとの結合を検出することができる。 また、 結合が検出された試料からの被検分 子の回収は、 本発明のポリペプチドとの結合を利用した方法、 例えば、 ァフィ二 ティークロマトグラフィーなどを用いて実施することができる。
さらに、 本発明のポリペプチドと結合し得るタンパク質等の被検分子を発現し ていることが予想される組織もしくは細胞より、 ファージベクターを用いた cDN Aライブラリーを作製し、 これをァガロース上で発現させてフィルターにタンパ ク質を転写後、 標識した本発明のポリペプチドを反応させ、 結合する被検分子を 発現しているプラークを検出する 「ウェストウエスタンブロッテイング法」 によ つても、 本発明の方法を実施することができる。
また、 固相などに固定させた本発明のポリペプチドに、 合成化合物、 天然物バ ンク、 もしくはランダムファ一ジぺプチドディスプレイライブラリ一等を作用さ せ、 結合する分子をスクリーニングする方法や、 コンビナトリアルケミストリー 技術によるハイスループットを用いたスクリーニングにより候補化合物を単離す る方法も、 当業者においては通常行い得る技術である。
被検化合物としては、 特に制限はなく、 例えば、 種々の公知化合物やペプチド、 あるいはファージディスプレイ法等を応用して作成されたランダムぺプチド群を 用いることができる。 本発明のポリペプチドを提示させたファージと、 上記ラン ダムペプチド群を提示させたファージを用いた、 所謂 「ダブルファージディスプ レイ法」 （J. Castillo, B. Goodson and J. Winter :T7 displayed peptides as targets for selecting peptide specific scFvs from M13 scFv display libraries: J Immunol Methods :257:卜 2 :117— 22:2001) も本発明のスクリ一ニン グ方法に好適に利用することができる。
また、 微生物の培養上清や、 植物、 海洋生物由来の天然成分などもスクリ一二 ングの対象となる。 その他、 生体組織抽出物、 細胞抽出液、 遺伝子ライブラリー の発現産物などが挙げられるが、 これらに特に制限されない。
また、 通常遺伝子産物であるポリペプチドは、 二本鎖 DNAの一方の鎖によつ てコードされている。 このとき、 他方の鎖によってコードされると仮定したとき のァミノ酸配列のぺプチドはァンチセンスペプチドと呼ばれる。 このアンチセン スペプチドは、 本来のペプチド （センスペプチド） と相互反応をするという仮説 . が B l al ock (1984)らにより提唱され、 それ以後センスペプチドとアンチセンスべ プチドが相互反応をするとする報告が多数知られている。 従って、 本発明のポリ ぺプチドをコードする DNAの相補鎖配列に基づくアンチセンスべプチドを被検 分子として、 本発明のスクリーニング方法に供することにより、 効率的に本発明 のボリぺプチドと結合する分子を取得することが可能である。
本発明のポリペプチドと結合する分子は、 例えば、 脳移行活性阻害剤、 脳移行 性活性の'増大や修飾の誘導剤、 受容体本体 （トランスマイグレーションを起こす 分子） として有用である。
また本発明は、 脳移行活性を有するポリペプチドの取得方法に関する。 本発明 の好ましい態様においては、 以下の工程 （a ) 〜 （d ) を含む、 脳移行活性を有 するポリペプチドのスクリーニング方法 （取得 ·単離方法） を提供する。
( a ) 被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒 子を作製する工程、
( b ) 該ファージ粒子を、 非ヒ卜動物へ投与する工程、
( c ) 該非ヒ 1、動物の脳組織からファージ粒子を回収する工程
( d ) 工程 （c ) において回収されたファージ粒子 提示された被検ポリぺプ チドを脳移行活性を有するポリぺプチドとして選択する工程
上記方法における被検ポリぺプチドの配列は特に制限されず、 任意のアミノ酸 配列からなるポリペプチドを用いることができる。 通常、 本発明の被検ポリぺプ チドは、 ンダムなアミノ酸配列からなる、 複数種のポリペプチドである。 また、 本発明の上記方法においては、 上記アミノ酸モチーフ配列もしくは該モチーフ配 列の一部を含むようなポリペプチド、 または上記 「特徴 1」 を有するポリべプチ ドを被検ポリぺプチドとして本発明のスクリ一ニング方法に供することにより、 効率的に本発明の方法を実施するごとも可能である。 また、 被検ポリペプチドの長さは、 ファージ外殻タンパク質上へ提示させるの に許容される長さであれば特に制限されず、 当業者においては、 ファージの種類 等を考慮して、 被検ポリペプチドの長さを適切に設定することができる。
任意のアミノ酸配列からなるポリペプチドの作製は、 当業者においては公知の 技術を用いて容易に行い得ることである。 例えば、 市販のペプチド合成機等を利 用して被検ポリぺプチドを作製することができる。
上記工程 （a ) において、 任意のポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ 提示させる方法は、 所謂ファージディスプレイ法として当業者においては一般的 に公知の技術である。 ファージの生活環を利用して、 任意のポリペプチドをファ ージ外殻タンパク質上に提示させて、 通常、 ライブラリ一化した分子群を調製す る。 一例を示せば、 ランダム化した DNAを化学合成し、 遺伝子工学技術を用い てファージ DNAに挿入する。 この DNAを大腸菌等の宿主細胞へ導入することに より、 ファージ分子が生合成され、 ウィルス粒子の外殻タンパク質上へ上記ラン ダム化 DNAによってコードされるポリぺプチドが提示される。
より具体的には、 被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させた ファージ粒子を作製する工程の一例として、 後述の実施例に記載の方法 （手順） を示すことができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるファージとしては、 例えば、 M13、 T7、 i l、 fd等の公知のファージを好適に用いることができる。 ファージ外殻夕 ンパク質としては、 例えば、 pI I I、 10A、 10B、 Capcid 等を挙げることができる。 pi l l夕ンパク質上へ提示するライブラリ一等は市販されており、 本発明のスク リーニング方法においては、 これらの市販のライブラリ一を適宜使用することが できる。
また、 本発明の好ましい態様においては、 工程 （a ) によって作製されたファ ージ粒子に対し、 工程 （b ) の前に予め、 脳の血管内皮細胞と結合し得るファー ジ粒子をパンニングによって選択することができる。 この操作により、 本発明の スクリーニングを効率的に行うことが可能である。
パンニング法は、 タンパク質の相互作用を利用した選択方法であり、 当業者に おいては、 そのファ一ジの種類等を考慮して適宜実施することができる。 本発明 のスクリーニング方法におけるパンニング法の利用例を示せば、 まず、 脳の血管 内皮細胞に結合しやすいファージを培養下で濃縮するために、 対照細胞 （マウス ダリオ一マ細胞） と反応して非特異的に結合するファージを吸収除去し、 さらに マウス脳由来の血管内皮細胞 （例えば、 MBEC4) に特異的に接着するファージを 濃縮する。 より具体的には、 後述の実施例に記載の手順によってパンニングを実 施することができる。
上記工程 （b ) において、 ファージ粒子を投与する非ヒト動物としては、 例え ば、 マウス、 ラット、 スナネズミ、 ネコ、 ゥシ、 サル等を挙げることができる。 その他、 家畜動物あるいはぺット動物等を挙げることができる。
また、 上記工程 ( b ) において投与されるファージは必ずしもファージ粒子全 体である必要はなく、 例えば、 被検ポリペプチドを提示させた外殻タンパク質の みを非ヒト動物へ投与することによつても、 本発明のスクリーニングを行うこと が可能である。
非ヒト動物体内への投与は、 通常、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射、 経皮 投与、 経口投与等により行うが、 好ましくは動脈内注射である。
上記工程 （c ) において、 脳組織からのファージ粒子の回収は、 通常、 以下の ように行うことが可能である。 非ヒト動物の脳を摘出し、 脳のホモジネートの希 釈シリーズを作製する。 続いて、 該希釈液を寒天培地上へ撒き、 ファージのブラ ークを形成させた後、 該プラークをピックアップし、 ファージ粒子の回収を行う。 ただし、 この方法は一例であって、 当業者においては、 ファージの種類等を考慮 して、 適宜、 脳組織からファージ粒子の回収を行うことができる。
次いで、 上記工程 （d ) において選択されたポリペプチドは、 当業者に公知の 方法によってそのアミノ酸配列を決定することができる。 なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 trans- endothelial cell migrationのメカニズムを模式的に示した 図である。
図 2は、 T7 Select Systemを用いたファージライブラリー構築を示す図およ び写真である。 なお、 写真は、 cDNA断片をァガロースゲル上で分離したもので ある。 インサートが無い場合、 約 120bpの断片が増幅されるが、 ここでは 200bp から lkb近いインサートが確認できた。 これは 70 - 300アミノ酸に相当する。
図 3は、 T7 Select Systemを用いたファージライブラリーの構築 （ランダム ペプチド） を示す図である。
図 4は、 T7 Select Systemについて示す図である。
図 5は、 パンニング方法について示す図である。
図 6は、 配列番号： 23または 24の配列を有するファージの脳移行活性を示 す写真である。
図 7は、 脳におけるファージのカ価ならびに、 脳/血漿比を示すグラフである。 図 8は、 本発明の脳移行性ぺプチドコンジュゲートの構造を模式的に示す図で ある。
図 9は、 マウス脳における本発明のペプチド-金コロイドコンジュゲートの存 在を示す電顕写真である。
左 （上下） ：コントロール群 （アビジン-金コロイド） ：神経細胞内に金コロイ ドの標識は観察されない。 （上） ：海馬錐体細胞（CA1〜CA2領域） （下） ：小 脳プルキンェ細胞領域 中央 (上下) ：ピオチンコンジユゲー卜 T2J002 + アビ ジン (Av)-金粒子 (gold)を投与。 右 （上下） ： ピオチンコンジュゲート T2J004 + アビジン（Av)-金粒子（gold)を投与。 ペプチドコンジュゲートにより金コロ ィドを脳実質に運び込むことができた。
図 1 0は、 錐体細胞層（pyramidal cell layer) CA卜 CA2における、 本発明のぺ プチド-金コロイドコンジュゲートの存在を示す電顕写真である。
左：対照（control)群、 （アビジン金コロイドのみ投与） 血管内皮に反応が見ら れない。 中央： Biotin + peptide (1)群： biotin- conjugated T2J002+Av-gol d投与したもの。 Biotin + peptide (2)群： pre - embedding method (biotin- conjugated T2J002を投与し、 超薄切片作成後 Av_goldで検出して観察） による 免疫反応の EM像。 Control 群 （左） では血管内皮に反応が見られないのに対し、 実験群では内皮細胞に免疫反応を示す DABの沈着が認められる （矢印） 。 内皮 細胞から、 さらに血管外 （脳実質） にもその反応が見られる。
図 1 1は、 本発明のペプチドコンジュゲートを用いた、 MBEC4に対する透過性 の評価実験の概略を模式的に示す図である。
図 1 2は、 本発明のペプチドコンジュゲート（T2J004)の MBEC4に対する透過 性を示す図である。 アビジン- FITC 0.4nmol/insertに対して、 1:4の割合でぺ プチドを結合させ MBEC4に対する透過性の経時的変化について検討した。
図 1 3は、 血液脳関門モデルでのぺプチドコンジユゲートによる透過性の増大 と非標識ペプチドによる阻害活性を示す図である。
MBEC4を用いた血液脳関門モデルに Av- FITCおよびビォチンコンジュゲート Τ 2J004Y+AV-FITCを添加して下層の蛍光強度を測定したところ、 約 3倍の透過性 の増大が観察できた。 この効果は環状化 T2J004および直鎖状 T2J00.4によって 有意に阻害されることがわかった。
図 14は、 MBEC4におけるミクログリアまたはマクロファージの透過性の評価 実験の概略を示す図である。
図 1 5は、 本発明の種々のペプチドコンジュゲートを用いた、 MBEC4における 透過性を示す図である。
図 1 6は、 4F 11抗 Μ 13ファージ抗体によるリコンビナント脳移行性ファージ の脳内検出を示す写真である。
脳移行性ファージ （上段） とコントロールファージ （下段） を血管内投与して 3 0分後の摘出脳を 4F11抗 M13ファージ抗体で染色したところ、 脳移行性ファ ージを投与したものでは脳内にファージ粒子を検出することができた。
左： NIBAフィルターによる特的結合の蛍光写真
中央： WIGフィルタ一による非特異的結合の検出
右： Hoechst 23384による核染色 (細胞の同定)
図 1 7は、 共焦点顕微鏡によるミクログリアのトランスサイトーシスの検出を 示す写真である。
MBEC4を用いた血液脳関門モデルにおいてミクログリアを添加して 4時間後、 トランスサイト一シスが検出できた。 写真上に黄色一橙色に見えるミクログリア が緑色の血管内皮細胞を通過している像が観察できる。
図 1 8は、 血管内皮細胞にミクログリアを添加し 1時間経過したときの位相差 顕微鏡像 （左） と蛍光顕微鏡像 （右） の写真である。
図 1 9は、 トルイジンブルー染色後の光顕観察の結果の写真である。 ミクログ リア （左） とマクロファージ （右） したときの MBEC4血液脳関門モデルの垂直 断面のトルイジンブル一染色を行った。
図 2 0は、 MBEC4の電子顕微鏡観察の結果を示す写真である。 中央に見える黒 い帯状の部分が密着帯 (t ight j unct ion: 血液脳関門に特徴的に見られるバリ ァ構造） 。
図 2 1は、 ミクログリアが血液脳関門モデルを通過する際の電子顕微鏡像を示 す写真である。
図 2 2は、 ミクログリアが血液脳関門モデルを通過する電子顕微鏡像を示す写 真である。 ミクロダリァの突起が血液脳関門を形成する MBEC4細胞内へはつき り陥入する像が見られる。
図 2 3は、 マクロファージ株化細胞 Raw264. 7の MBEC4に対する接着を示す写 真である。 マクロファージは血液脳関門を形成する MBEC4に対して緩く接着す るのみである。 細胞層への透過は見られなかった。
図 2 4は、 マクロファージ株化細胞 Raw264. 7の MBEC4に対する接着を示す写 真である。 マクロファージは血液脳関門を形成する MBEC4に対して緩く接着す るのみである。 細胞層への透過は見られなかった。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明は、 これに限定され るものではない。 なお、 PEG6000は Wako より、 トリプシン EDTA、 ルリアブロス ベース （Luria broth base) 、 ペニシリンストレプトマイシンは GIBC0より購 入した。 また、 EDTA 2Na はナカライより、 Agarose 36G はフナコシより、 T7Se lect l-lCloning ki t は Novagenより購入した。
〔実施例 1〕 細胞の培養
( 1 ) マウス 203ダリオ一マ細胞
203ダリオ一マ細胞は 10 %の FCS (GIBC0) と 5 /^ g / inl インスリン （SIGM A) 、 0. 22% グルコース （片山） を加えた MEM (SIGMA) 中で、 37 で 5 % ( 02の 条件下で培養した。 継代は 10 cmシャーレ （Falcon) に 2 x 105 cel l s I 7 ml で撒き、 7日毎に継代を行った。 パンニング （panning) に使用する 203ダリオ —マ細胞は、 10 cmシャーレに 2 X 106 cel ls / 7 mlで撒き、 4日後にパンニ ングに使用した。
( 2 ) マウス血管内皮 END- D細胞
END- D細胞は 10 ¾ の非働化した FCSと 100 uni t / mlベニシリン、 100 mg I mlストレプトマイシンを加えた DMEM (SIGMA) を用い、 37°Cで 5 % C02の条件 下で培養した。 継代は PBS (-) により 1回洗浄した後、 5mlの 0. 25 % トリプシ ン I ImM EDTA 4Naを添加して 3分静置し、 5 mlの培地でフラッシングするこ とに.より細胞を剥がした。 続いて 1200 r. p. 5分の遠心により細胞を沈殿さ せ、 上清を除いて培地により 1回洗浄した後 10 cmシャーレに 3 X 105 cel l s I
7 mlで撒き、 3- 4日毎に継代を行った。 パンエングに使用する END- Dは、 コラ 5 一ゲンコートを行った 10 cmシャーレに 7 ml の培地中に 3 x 106 cel l sで撒き、 4日後にパンニングに使用した。 コラーゲンコートは 10 cmシャーレに、 / cm2のコラーゲン（新田ゼラチン（株）、 cel lmatrix type I-C) を加え 1時間静 置した後 PBS (-) で 2回洗浄することで行った。 ·
10 ( 3 ) マウス脳由来血管内皮 MBEC4細胞
MBEC4細胞は 10 % の FCSと / ml へパリン （SIGMA) 、 30 x g / ml ECG S (Endothel ial cel l Growth Supplement； Upstate biotechnology) をカロ た DMEM中で、 37°Cで 5 % C02の条件下で培養した。 継代は 0. 2% ゼラチン （片山） でコートした 10 cmシャーレに 2 X 105 cel l s I 7 mlで撒き、 3- 4日毎に継代
15 を行った。 パンニングに使用する MBEC4は、 コラーゲンコートした 10 cmシャ —レに 2 X 106 cel l s I 7 mlで撒き、 4日後にパンエングに使用した。
〔〔実実施施例例 22〕〕 MM1133フファァ
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11.. 大大腸腸菌菌 EERR22773388のの培培養養
2200 PPhh.. DD.. --cc77cc™™PPhhaaggee DDiissppllaayy PPeepptt iiddee LLiibbrraarryy KKii tt ((NNeeww EEnnggllaanndd BBiioollaabbss,, EE88 112200SS))にに附附属属ののホホスストト大大腸腸菌菌 EERR22773388をを、、 2200 gg//mmllテテトトララササイイククリリンン （（片片山山）） をを 含含むむ LLBB培培地地ににてて 3377°°CCでで一一晩晩振振盪盪培培養養しし、、 2200 gg//mmllテテトトララササイイククリリンンをを含含むむ LLBB ププレレーートトににスストトリリーーククししたたももののをを EERR22773388ののワワーーキキンンググスストトッックク ((WWoorrkkiinngg ssttoocc kk)) ととしし、、 22週週間間毎毎にに新新たたななワワーーキキンンググスストトッッククをを作作製製ししたた。。
2255 フファァーージジのの増増幅幅やや力力価価測測定定にに使使用用ししたた EERR22773388ははここののスストトリリーーククししたたヮヮーーキキンン ダダスストトツツククょょりりシシンンググルルココロロニニ一一ををピピッッククアアッッププしし、、 2200 ^^ gg//mmllテテトトララササイイククリリ ンを含む LB培地にて 37°Cで一晩振盪培養した物を用いた
2. In vitro ンニンヴ
2-1. 細胞の固定
パンニングに使用する 203ダリオ一マ細胞 （対照として使用） 、 END- D細胞、 MBEC4細胞のシ一トが形成された 10 cmシャーレ各 1枚ずつはそれぞれ、 当日に 以下のように固定を行った。 各細胞は培地を除去して 5 ml PBS (-) により 1回 洗浄し、 《 PFA (片山） I PBS (-) を 3 ml添加して 10分静置した後、 5ml PBS (-) により 3回洗浄することで固定した。 続いて、 5mlの 2% BSA (SIGMA) I P BS H を加え 4°Cで 1時間静置してブロッキングを行った。 各細胞はファージ溶 液を添加する前に、 3 mlの 0. 1% Tween 20 I PBS (-) で 6回洗浄してから使用 した。
2-2. 1回目のパンニング
1回目のパンニングでは、 1011 pfuの M13- c7c ファ一ジライブラリ一 (10 1)を 2mlの PBS (-) へ溶解し、 全量を 203ダリォーマ細胞へ添加し、 室温で 10 分間緩やかに振盪して吸着させた。 続いて上清を END- D細胞へ添加し、 室温で 1 0分間緩やかに振盪して吸着させた。 続いて上清を MBEC4細胞へ添加し、 室温で 10分間緩やかに振盪して吸着させた。 各細胞は 10分間の吸着処理後、 5mlの 0. 1¾ Tween 20 I PBS (-) で 10回洗浄した後、 lmg/ml BSAを含んだ 0. 2M Glyc ine (Wako) -HC1 ( H 2. 2) を 2ml添加して室温で緩やかに揺する事で抽出を行つ た。 抽出液の回収後、 直ちに 0. 2M Glyc ine-HCl (pH 2. 2) 2mlでリンスして、 抽出液と共に 1M Tr i s- HC1 (pH 9. 1) を 1. 6 ml加えることで中和を行った。 Tr i s は Boeringerより購入した。
各細胞からのファージ抽出液及び、 各ステップでのファージのカ価は、 下記の 「2-2-1. ファージのカ価測定」 に示した方法により求めた。 さらに、 MBEC4細胞より抽出されたファージ溶液は、 下記の 「2 - 2- 2. ファー ジの.増幅と精製」 に示した方法により増幅して 回目のパンエングに使用した。
2-2-1. ファージのカ価測定 （Titration)
ファージ溶液の力価 （Titer) は以下のように測定した。
14mlスナップキャップチューブ （Falcon) に ER2738の終夜培養液を 250 ^ 1 と IPTG (片山） /X-gel (ナカライ） mixture (50 ig/ml IPTG I 40 g/ml X-ge 1) を 3^1加え、 溶解した Top Agarose (6 ig/ml Agaroseノ LB培地） を 2.5m 1添加して混合した。 直ちに、 LB/IPTG/X-gel plateに広げ、 ER2378 laund pla te を作製した。 力価を測定するファージ溶液は TBS にて希釈シリーズを作製し、 ER2378 laund plateへ 10 z 1ずつプロットして、 流れない程度まで乾燥させた 後、 37°Cで一晩培養した。 青く発色したプラークをカウントすることでファー ジ溶液の力価を算出した。 2-2-2. ファージの増幅と精製
バッフル付き三角フラスコを用いて、 ER2738の終夜培養液を 1/100量添加し た 20 ig/mlテトラサイクリンを含む LB培地に増幅するファージ溶液を加えて 3 7°Cで 4.5から 5時間振盪培養した。 続いて、 10000 r. p. m. 10分、 4°Cで遠心し て上清を回収した。 上清を 10000 r. p. in. 10分、 4°Cで遠心する事で ER2738を 完全に除いた。 この上清に 1/6量の 30% PEG I 3M NaCl (SIGMA) を添加して氷 上でー晚静置してファージを沈殿させた。 続いて 10000 r. p. m. 45 分 4°Cで遠 心して、 上清をデカンテーシヨンにより除去し、 更に 10000 r. p. m. 10 分 4°C で遠心して、 ファージの沈殿を集めた。 ファージの沈殿は 2mlの TBS/ 0.02% Na N3 (SIGMA) で完全に溶解し、 10000 r. p. m. 5分、 4でで遠心して上清を回収し た。 上清に 0.467 g/mlになるように CsCl (Wako) を添加して 80000 r. p.m.18 時間 15°Cで密度勾配遠心を行い、 精製されたファージのバンドを回収した。 回 収した精製ファージは TBSで透析して CsClを除去し、 0. 02% になるように NaN3 を加えて 4°Cで保存した。
2-3. 2回目のパンニング
2回目のパンニングでは、 101Q piuの M13- c7c ファージ混合液を 2mlの PBS (- ) へ溶解し、 全量を 203ダリオ一マ細胞へ添加し、 室温で 10分間緩やかに振盪 して吸着させた。 続いて上清を END-D細胞へ添加し、 室温で 10分間緩やかに振 盪して吸着させた。 続いて上清を MBEC4細胞へ添加し、 室温で 10分間緩やかに 振盪して吸着させた。 各細胞は 10分間の吸着処理後、 5mlの 0. 3% Tween 20 I PBS (-) で 10回洗浄した後、 lmg/ml BSAを含んだ 0. 2M Glycine- HC1 (pH 2. 2) を 2ml添加して室温で緩やかに揺する事で抽出を行った。 抽出液は回収し、 直 ちに 0. 2M Glyc ine-HCl (pH 2. 2) 2mlでリンスして、 抽出液と共に 1M Tri s-HC 1 (pH 9. 1) を 1. 6 ml加えることで中和を行った。
各細胞からのファージ抽出液及び、 各ステップでのファージのカ価は、 上記 「2- 2-1.ファージのカ価測定」 に示した方法により求めた。
MBEC4細胞より抽出されたファージ溶液は、 上記 「2- 2-2.ファージの増幅と精 製」 に示した方法により増幅して //? パンニングに使用した。
3. In r/raパンニング
3-1. ファージの注入
In r/'raパンニングには 8週令のマウス雄の C57BLを使用した。 1011 pfu/300 u \ PBSの、 上記の精製ファージをェ一テル麻酔下のマウス左頸動脈より単回投 与した。 1分後に 15mg/ml EDTAでコートしたッベルクリン用シリンジ (26G)を用 いて心臓より採血し、 直ちに 0. 2g/ml EDTA/ PBS, 400 mlにて灌流を行った。 灌流終了時に心臓内の灌流液を回収した。 灌流後、 脳を摘出し、 各臓器より力価 測定用と組織切片作成用に一部をサンプリングした。 力価測定用には左脳を切片 作製用には右脳を使用した。
3- 2. 組織サンプルの調製
力価測定用の組織は秤量し、 2倍量のホモジナイズ溶液 （20mM HEPES (SIGM A) I 0. 25M スクロース/ ImM EDTAに使用直前に lO / g/ml ァプロチニン （Wak 0) 、 5 g/ml ロイぺプチン （SIGMA) 、 ImM PMSF (Wako) を添加） を加え氷上 でホモジナイズした。 続いてホモジナイズ溶液と等量の lOOmM L iC l (片山） / P BSを添加して混合した。
血液は 15000 r. p. m. 10 分 4°Cで遠心し、 血漿として回収し力価を測定した。 各組織のホモジネート、 血漿、 灌流液は、 上記 「2- 2-1.ファージのカ価測 定」 に示した方法でファージのカ価を決定した。
脳のホモジネートは全て、 上記 「2- 2- 2.ファージの増幅と精製」 に示した方 法で増幅および精製を行い、 次の F/ raパンニングに使用した。
4. ファージのクローニングおよび配列決定
4- 1. クローニング
In vitro F ノニンヴを 1回と In vivoパンニングを 1回行った脳のホモジネ 一卜もしくは、 In r/ raパンニングを 3回行った脳のホモジネー卜よりファージ のクローニングを行った。
脳のホモジネートの希釈シリーズを TBSで作製し、 上記 「2- 2-1.ファージの 力価測定」 に記載の方法に従って、 ファ一ジのプラークを形成させ、 シングルプ ラークを 1mlの TBS中にピックアップした。 この操作をもう一度行つてファー ジのクローニングを行った。 4-2. 配列決定 （seduenc ing)
14 mlスナップキャップチューブに 1mlの LB培地と 10 z 1の ER2738終夜培養 液とファージクローン溶液を 100 1添加し、 37°Cで 4.5時間振盪培養した。
50.00 r.p.m. 5分、 4 °Cで遠心して ER2738を沈殿させ、 上清を 1.5mlエツべ ンドルフチューブへ移し、 10000 r.p.m. 1分、 4 °Cで遠心し上清を新しい 1.5m 1エツペンドルフチューブに移した。 続いて、 30% PEG/ 3M NaClを 400 1添加 して転倒攪拌した後、 4°Cでー晚静置した。
13000 r.p.m. 30分、 4°Cで遠心して上清をデカンテーシヨンによって除き、 更に 13000 r.p.m. 30分、 4°Cで遠心して、 残った上清をァスピレートにより完 全に除去した。
沈殿したファージに の Iodided バッファ一（4M Nal (SIGMA) /lmM E DTA I lOmM Tris pH8.0) を添加してサスペンドする事で、 完全にファージを溶 解させた。 続いて 250 ^1のエタノールを添加して転倒攪拌し、 室温で 10分間 静置した。 これを 15000 r.p.m. 10分室温で遠心して上清を除去して、 沈殿を 1 mlの 70% エタノールで緩やかに洗浄し 15000 r.p.m. 5分、 室温で遠心した。 上清をデカンテ一ションにより除去して、 沈殿をデシケ一夕一にて 5分間乾燥 させた。 この沈殿に 30 xlの TEを添加して溶解し、 これを配列のテンプレート として使用した。 配列決定は Ph. D.-c7c™に附属の- 28 gill シーケンシングプ ライマー （5， -GTA TGG GAT AAA CAA C-3' /配列番号： 13) と ThermoSeQua nce Cy5.5 Dyterminator kit (アマシャム） を用いて GeneRapid SEQ4x4(アマ シャム）で決定した。
5. ファージクローンの評価
得られたファージクローンは、 上記の 「2 - 2-2.ファージの増幅と精製」 記載 の方法に従って、 増幅と精製を行った。 精製したファージクローンはファージの 投与量を 101ϋ pfu I 300 xlに変え、 上記 「3. In vivoパンニング」 記載の方法 に従って脳への移行性を力価を用いて評価した。 コントロールファージとして M 13-KE (New England Biolabs, E8101S) (クローンナンバー 1148) を使用した。 〔実施例 3〕 T7ファージディスプレイライブラリー
1. Τ7 ファージディスプレイライブラリ一の構築
ランダムな配列を含み、 両端に EcoRIおよび Hindi I Iの制限酵素サイトを加 え、 T7ファージ 10B遺伝子配列に組み込めるようにした 81 bp (415-15： GAATCC ATGCAGAATTTC (XXK) 15AAGCCTGCTACAGACCAT/配列番号： 1 4)または 86bp (415-C 15C： GATCCATGCAGAATTCCTGC (XXK) 15TGCAAGCTTGCTACAGACCAT/配列番号： 1 5 ) のオリゴヌクレオチドを合成し、 その約 1. 3 g (50pfflol)をテンプレー卜として、 5'および 3'側のプライマ一約 1. 9 g (300pmol)を用いて PCRを行い、 ランダム な配列を含む T7ファージディスプレイライブラリ一組み込み用ィンサ一トを作 製した。 作製したインサートを制限酵素 EcoRIおよび Hindlllで消化してァガ ロースゲルで分離、 精製し、 pQE-TriSystemベクターの EcoRIおよび Hindll lサ イトに組み込み、 大腸菌で増幅して、 ランダムな配列の確認を行った。 確認後、 大腸菌よりランダムな配列を含むプラスミドを精製して EcoRIおよび H i nd 111 で消化し、 目的の断片をァガロースゲルで分離、 精製し、 同様に EcoRIおよび H indl llで消化した T7ファージの 10B遺伝子配列に組み込んだ （図 2および 3 ) 。 10B遺伝子配列への組み込み、 ファ一ジへの //? 7/ パッケージングは Novage nの T7 select Cloning ki tのマニュアルに従い行った。 なお、 上記プライマー 配列を下記に示す。
415-15 5'側プライマ一
GAATCCATGCAGAATTCC (配列番号： 1 6 )
415-15 3'側プライマ一
ATGGTCTGTAGCAAGCTT (配列番号： 1 7 )
415-C15C 5'側プライマー
GATCCATGCAGAATTCCTGC (配列番号： 1 8 )
415-C15C 3'側プライマー ATGGTCTGTAGCAAGCTTGCA (配列番号： 1 9 )
2. 大腸菌 BL21、 BLT5403の培養
T7 Select415-1 Cloning ki t (Novagen, 70015-3) に附属のホスト大腸菌 BL 21もしくは BLT5403を LB培地にて 37°Cで一晩振盪培養し、 LBプレートにスト リークした物を BL21もしくは BLT5403のワーキングストックとし、 2週間毎に 新たなワーキングストックを作製した。 ファージの増幅や力価測定に使用した B L2K BLT5403はこのストリークしたワーキングストックよりシングルコロニー をピックアップし、 LB培地にて 37°Cで一晩振盪培養した物を用いた。
3. In vitro r ノニンヴ
3-1. 細胞の固定
パンニングに使用する 203ダリオ一マ細胞 （対照として使用） のシートが形 成された 10 cm シャーレ 3枚と、 MBEC4細胞 1枚は、 当日に以下のように固定 を行った。 各細胞は培地を除去して 5 ml PBS (-) により 1回洗浄し、 4% PFA I PBS (-） を 3 ml添加して 10分間静置した後、 5ml PBS (-) により 3回洗浄する ことで固定した。 続いて、 5mlの 2% BSA / PBS (-) を加え 4°Cで 30分間静置し てブロッキングを行った。 ブロッキング溶液はファージの添加直前にァスピレー トにより除いた。
3-2. パンニング
T7 Select 415-1 Cloning ki t (Novagen) に両端をシスティンで挟んだ 15残 基のランダムべプチドを提示するようにィンサートを組み込んだ物を作製し、 こ れを T7 Select 415- cl5cライブラリーとした (図 4 ) 。 In vitro i ノニンヴで は、 2xl09 pfu の T7 select 415-cl5c ライブラリーを 2ml の PBS (-) へ溶解し、 4 cmシャーレに添加して全体に広げた後、 全量回収して再度新しい 4 cmシャ一 レに添加して全体に広げた。 続いて全量回収した内の 1. lmlを新しいチューブ に移し、 Skim mi lk I PBS (-) を 1. 1 ml添加して室温で緩やかに 10分間攪 拌した。 これを 10000 r. p. m. 10分、 4°Cで遠心して得られた上清より 2mlを、 上記 「3-1. 細胞の固定」 で示した方法により固定、 ブロッキングを行った 1枚 目の 203ダリオ一マ細胞へ添加して室温で 20分間緩やかに振盪して吸着させた 続いて、 上清を 2枚目、 3枚目の 203ダリオ一マ細胞へも同様に処理した。 続い て、 上清を MBEC4細胞へ添加し、 室温で 30分間緩やかに振盪して吸着させた。 上清をァスピレートにより除き、 10mlの PBS (-) で 3回洗浄した。 続いて、 2ml の 0. 01% NP- 40/ PBS (-) で 10分間緩やかに振盪する洗浄を 3回行った。 次に 0 1 % NP-40/ PBS (-) に変え 1回洗浄し、 0. 4mlの 0. 1% SDS/ SMバッファ一で 10 分緩やかに振盪して、 弱く結合しているファージを除去した。 0. 6mlの SMバッ ファーによりリンスした後、 0. 4mlの 0. 5% SDS ΛΜバッファーで 10分緩やかに 振盪して抽出し、 0. 6mlの SMバッファーでリンスした物と合わせて、 親和性の 低いファージ抽出液とし、 続いて 1% SDS/ SMバッファ一で 10分緩やかに振盪 して抽出し、 0. 6 mlの SMバッファーでリンスした物と合わせて親和性の高いフ ァ一ジ抽出液とした。 パンニングの概略を図 5に示す。
各ファージ抽出液及び、 各ステップでのファージのカ価は、 下記 「3-2-1.フ ァ一ジのカ価測定」 に示した方法により求めた。 力価測定には 100倍以上の希 釈倍率のファージ希釈溶液を元に力価を算出している。
さらに、 MBEC4細胞より抽出されたファージ溶液は、 下記 「3- 2- 2.ファージの 増幅と精製」 に示した方法により増幅して次のパンニングに使用した。
In vitro ンニンヴを 8回行った後ファージのクローニングを行った。
3-2-1. ファージのカ価測定
ファージ溶液の力価は以下のように測定した。
14mlスナップキャップチューブに BL21もしくは BLT5403の終夜培養液を 250 l加え、 溶解した Top Agarose (6 g/ml Agarose I LB培地） を 2. 5ml添加 して混合した。 直ちに、 LB pl ateに広げ、 BL21 l aund pl ateおよび BLT5403 1 aund plateを作製した。 力価を測定するファージ溶液は SMバッファ一にて希釈 シリーズを作製し、 BL21 laund plateおよび BLT5403 l aund pl ateへ 10 lず っブロットして、 流れない程度まで乾燥させた後、 37°Cで 2-4時間培養して生 じたプラークをカウントすることでファージ溶液の力価を算出した。 上記実施例 2の 「3. In vivoパンニンク Ί で内部標準として使用している T7 rRNA ： T7 se lect 1-1 ki t (NEB, 70010-3)に のじ0^のー部（5' -0八 CAA GCG TTG GAT TGT TCA CCC ACT AAT AGG GAA CGT GAG CTG GGT TTA GAC CGT CGT GAG ACA GG T TAG TTT TAC CCT ACT GAT GAT GTG TTG TTG CCA TGG TAA TCC TGC TCA GTA CGA GAG GAA CCG CAG GTT CAG ACA TTT GGT GTA TGT GCT TGG CTG AGG AGC CA A TGG GGC GAA GCT ACC ATC TGT GGG ATT ATG ACT GAA CGC CTC TAA GTC AGA ATC CCG CCC AG- 3' Z配列番号： 2 0 )が組み込まれたファージは、 BL21では増 殖できず、 ホス卜に BLT5403を用いた場合のみプラークを形成する。
3-2-2. ファージの増幅と精製
バッフル付き三角フラスコを用いて、 BL21の終夜培養液を 1/100量添加した LB培地を 37°Cで 2-3時間振盪培養して、 増幅するファージ溶液を加えて更に 1 - 3時間振盪培養した （溶菌した大腸菌のデブリスの量と濁度の低下で判断） 。 続 いて、 10000 r. p. m. 10分、 4°Cで遠心して上清を回収した。
この上清に 1/2量の 30% PEG I 3M NaClを添加して氷上でー晚静置してファ —ジを沈殿させた。 続いて 10000 r. p. m. 45分、 4°Cで遠心して上清をデカンテ —シヨンにより除去し、 更に 10000 r. p. m. 10分、 4°Cで遠心してファージの沈 殿を集めた。 ファージの沈殿は 2mlの SMバッファーで完全に溶解し、 10000 r. P. m. 5分、 4t:で遠心して上清を回収した。 上清に 0. 5 g/mlになるように CsCl を添加して 80000 r. p. m. 18時間 15°Cで密度勾配遠心を行い、 精製されたファ ージのバンドを回収した。 回収した精製ファージは SMバッファ一で透析して C s C1を除去し、 Chloroformを数滴加えて 4°Cで保存した。
4. クローニング
8回目の //? パンニングのファ一ジ抽出液の希釈シリーズを SMバッファ 一で作製し、 上記 「3-2- 1.ファージのカ価測定」 の方法に従って、 ファージの プラークを形成させ、 シングルプラークを lmlの SMバッファ一中にピックアツ プした。 この操作をもう一度行つてファージのクローニングを行つた。 5. 配列決定
上記ファージクローンの一部を Mi l l iQ水で 100倍希釈して 95°Cで 5分加熱後、 直ちに氷冷した物を PCRのテンプレートとした。 このテンプレ一卜を \ ιι \加え、 プライマ一として 5' - GCT CTG CGG TAG GTA CTG TT-3' (配列番号： 2 1 ) と 5 ' -CGG TGC CCC AAA GAA TCG GT-3' (配列番号： 2 2 ) を 1 /xMで添加して、 30 ιι \のサイズで以下のように PCRを実施した。 94°C 1分、 60°C 1分、 72 2分 で 40サイクル反応を行った。 続いてエタ沈により PCR産物を沈殿させ、 10 の TEに溶解した。 続いて CHROMA SPLIN+TE30 Colulmn (Clontec, K1321-2) ¾ 用いてカラム精製した PCR産物を配列のテンプレートとした。
配列サンプルは ThermoSeduence Cy5. 5 Dyterminator Ki t (アマシャム） を 用いて調製し、 GeneRapid SEQ4x4にて配列を決定した。
ファージのクローンは、 上記 「3-2-2.ファージの増幅と精製」 に示したよう に精製して 7z? r/raでの評価に用いた。
6. ファージクローンの評価
6-1. ファージの注入
In r/raパンニングには 8週令のマウス雄の C57BLを使用した。 1時間の UV 照射により滅菌した精製 T7 select 415-cl5c l ibrary 4xl06 pfu/200 1 PBS をエーテル麻酔下のマウス左頸動脈より投与してマスキングを行った。 続いて 5 分後に精製 T7 select415-cl5c クローンと内部標準として T7 rRNAを 4xlOG pf uずつ含んだファージ混合液を 200 ^ 1投与した。 1分後に 15mg/ml EDTAでコー トしたッベルクリン用シリンジ（26G)を用いて心臓より採血し、 直ちに 0. 2g/ml EDTA/ PBS, 400 ml にて灌流を行った。 灌流終了時に心臓内の灌流液を回収した。 灌流後、 脳を摘出し、 各臓器より力価測定用と組織切片作成用に一部をサンプリ ングした。 力価測定用には左脳を切片作製用には右脳を使用した。 6-2. 組織サンプルの調製
力価測定用の組織は枰量し、 2倍量のホモジナイズ溶液 （20mM HEPES I 0. 25
M スクロース/ lmM EDTAに使用直前に 10 g/ml ァプロチニン、 5 x g/ml ロイ ぺプチン、 lmM PMSFを添加) を加え氷上でホモジナイズした。 続いてホモジナ ィズ溶液と等量の lOOrnM LiCl/ PBSを添加して混合した。
血液は 15000 r. p. m. 10分 4でで遠心し、 血漿として回収し、 力価を測定し た。
各組織のホモジネート、 血漿、 灌流液は、 上記 「3-2- 1.ファージのカ価測 定」 に示した方法でファージのカ価を決定した。
上記の組織サンプルより、 各臓器に親和性を有する組み換えファージを分離し た。 このうち、 脳より回収されるファージを増殖させ、 再度マウスの尾静脈から 注入し、 上記同様の分析を行った。 その結果として、 いくつかの陽性クローンが 分離できた。 代表的な配列を以下に示す。
配列 1 ： MLGDPN- CVKQAVQSSVKHPDLSC-KLAAALE (配列番号： 2 3 )
配列 2 ： MLGDPN-CPRGLPVTTRLMEKSKC-KLAAALE (配列番号： 2 4 )
これらの配列を有するファージクローンを、 マウスに注入した。 その結果、 脳 に.局在化させることができた （図 6、 7 ) 。 以上の方法で、 脳特異的に侵入する 分子の候補が単離できた。
さちに同様の方法で、 脳以外の臓器を特異的に標的化できる分子も単離できる と考えられる。 実際に図 7に示すように、 脳以外の臓器に親和性を有するファー ジが分離できた。
〔実施例 4〕 脳移行性べプチドコンジュゲート
本発明者は、 脳移行性ペプチドコンジユゲー卜の作製を行った。 該コンジュゲ ートは、 本発明のペプチド分子中のシスティン残基同士のジスルフィド結合によ つて、 環状構造をとり得るものであり、 さらにピオチンが付加された分子である。 より具体的には、 図 8に示す構造を例示することができる。 該コンジュゲートは、 アビジン化合物と結合能を有する。
上記コンジュゲートは、 金コロイドと結合させてマウスへ投与し、 本発明のぺ プチドの脳移行活性を評価する実験 （透過電子顕微鏡による脳組織切片の観察） に供した。 透過電子顕微鏡試料作成プロトコ一ルを表 2に示す。
(表 2 )
[ブロック作成]
•前固定 1. 5%グルタルアルデヒド溶液 in 0. 1M PB 4°C →
•洗い 0. 1M PBS 1〜2回 氷冷 →
•後固定 1%四酸化オスミウム溶液 in 0. 1M PB 氷冷 約 1時間 →
'脱水 エタノールシリーズ 70→80→90→95→100→100→100 (¾) 各 10 分 →
•樹脂包埋 Epok812 樹脂重合 35°C 12時間 → 45°C 12時間→ 60°C 20時 間 →
•ブロックの完成
[切片作成] • トリミング →
•ガラスナイフで厚切り切片 （2〜3 m厚） 作成 →
•ダイヤモンドナイフで （超薄切片 50〜100nm厚） 作成 →
•電子染色 2%酢酸ウラン → 1%クェン酸鉛 各 3分 →
·透過電子顕微鏡観察 加速電圧 80kV 本実験においては、 本発明のペプチドとして、 T2J002 (配列番号： 2) およ び T2J004 (配列番号： 4) を用いた。 マウス脳組織 （細胞） の電子顕微鏡写真 を図 9、 1 0に示す。 矢印が金粒子と結合した本発明のペプチド分子の存在位置 を表す。 その結果、 本発明のペプチドコンジュゲートにより、 金コロイドを脳実 質に運び込むことに成功した。 即ち、 本発明のペプチドは、 脳移行活性を有する ことが確認された。
〔実施例 5〕 T2J004Y- Biotin透過実験
試薬は以下のものを用いた；ストレプトアビジン（Streptavidin),FITC コン ジュゲート（ベクター 1. Omg/ml)、 T2J004Y_Biotin、 DMEM (SIGMA) 蘭 BS
( GIBCO lot. 1077859 ) MBEC4実験用、 DMEM 10%FBS(GIBCO lot. 1077859 ：
65°C 30分 inactivated) END-D実験用。 （上記 「T2J004Y-Biotin」 は、 配列番 号： 4に示すポリペプチドを有する。 ）
まず、 MBEC4 (1.26 X 104 I insert), END-D ( 2X104 / insert ) を
FALCON [35] 3096 cell culture inserts 3. O/xm pore size に播き込み、 37。C、
5%C02下で 4日間培養した。
ストレプトアビジン， FITC コンジュゲート（25 l/ insert)と T2J004Y -
Biotind.6nmol/ insert)を混合し、 室温で 30分間インキュベートした。 その 後、 各培養液で 250 1に調製し、 insert中の培養液と置き換え、 well
( FALCON 24wellセルカルチヤ一インサート用プレート ） には 750/ilの培養液 を加えた。 3時間、 6時間、 24時間後に wel l中から 100 /x lサンプリングし、 Fluorskan Asent ( Thermo Labsys tems ) を用いて、 蛍光強度を測定した。 図 1 1に、 本実験の概略を示す。
その結果、 FITCのみの場合に比べ、 T2J004Y-Biot inと conj ugateさせたもの は MBEC4では約 8倍、 END-Dでは約 4倍の透過が見られた。 また、 ペプチドが MBEC4において、 END-Dに比べ 2倍量以上透過していることがわかり、 透過量は 経時的に増加していた。
〔実施例 6〕 MBEC4における T2J004Y_Biot in添加量と透過量の相関
アビジン（Avidin)とピオチン（Biot in)は 1： 4の割合で結合する。 そこで、 ス トレブトアビジン FITCと反応させる T2J004Y- Biot inの割合を変え、 MBEC4にお ける透過量を検討した。
試薬は以下のものを用いた；ストレプトアビジン， FITC コンジユゲー卜
(VECTOR 1. Omg/ml) 、 T2J004Y-Biot in, DMEM 丽 BS。
まず、 MBEC4 (1. 26 X 104 / insert)で播き込み、 37°C、 5%C02下で 4日間培養 した細胞に、 Streptavidin, FITC conj ugate ( 25 ^ 1 / insert)に対し、 1. 6 (nmol I insert)、 0. 4 (nmol I insert) , 0. 2 (nmol I insert)の量の T2J004Y- Biot inを混合し、 室温で 30分間インキュベートし、 混合液を培養液で 250 1 に調製し、 insert 中の培養液と置き換えた。 we l l には 750 1 の培養液を加え、 3時間、 6時間後に Fluorskan Asentを用いて、 蛍光強度を測定した。
その結果、 透過してきたペプチドの量は、 添加したペプチドの量と相関してい たが、 0. 4 nmol I insertのペプチドを添加した場合に対し、 4倍の 1. 6 nmol I insertのペプチドを加えても、 透過したペプチドの量は約 2倍程度であった。 このことから 1. 6 nmol I insertのペプチドは、 insertの有効培養面積
(0. 3cm2) の MBEC4のシートを 6時間で透過するべプチドの量としては十分量で あることが示唆される （図 1 2 ) 。 - 5
〔実施例 7〕 ぺプチドによる T2J004Y_Biotin透過の阻害
ピオチン標識のないぺプチドの前処理によって、 T2J004Y- Biotin-FITCの透過 が阻害されるか検討した。
試薬は以下のものを用いた； Streptavidin, FITC conjugate (VECTOR
1. Omg/ml) 、 T2J004Y- Biotin、 DMEM 10%FBS MBEC4実験用、 CT2J004Y, LT2J004Y。 （ 「CT2J004Y」 は環状を、 「LT2J004Y」 は直鎖状の構造の分子を表 す。 なお、 該環状は、 該分子に含まれるシスティン残基同士のジスルフイド結合 による）
まず、 Biotin標識のないペプチド各 lOnmol I insert を培養液（200 l I insert)に混合し、 上記の条件で 4日間培養しておいた insertの培養液と置き 換えた。 30分後に、 先ほどと同様にして混合しておいたペプチド- FITCの混合 液を、 培養液で 50 lに調製し、 insertに添加した。 6時間後に 24wel 1内をよ く攪拌し、 Fluorskan Asenで蛍光強度を測定した。
その結果、 CT2J004Y、 LT2J004Yで、 どちらも其々およそ 25% T2J004Y- BiotinDFI の透過を抑えていた （図 13) 。
〔実施例 8〕 ファージの前処理によるミクログリアの透過阻害
試薬は以下のものを用いた； PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit For general cell membrane labeling (SIGMA)、 DMEM 爾 BS。
まず、 MBEC4 (1.26X 104 cells I insert) を播き込み、 37。C、 5%C02下で 4 日間培養した insertに、 コントロール及び、 脳移行性ペプチドを提示したファ ージ（1013 pfu /ml)5/ilを添加し、 1時間前処理をした。 ミクログリアの細胞膜 を PKH26で染色した後、 2X105 (cells/ insert )づつ、 DMEM 10%FBSで 250/z 1 に調製し、 加えた。 well には 750 xl の培養液を加え、 24時間後に、 well の底、 および培養液中のミクログリアの数をカウントした。 図 14は、 本実験の概略を 示す。
その結果、 コントロールファ一ジに比べ、 脳移行性ペプチドを提示しているフ ァ一ジでは、 MBEC4におけるミクログリアの透過を、 若干阻害しているようであ つた。 明確な差が得られなかったのは、 MBEC4側のレセプターの数に対し、 リガ ンドであるファージゃミクロダリァの数が少なかつた可能性が考えられる。
〔実施例 9〕 他のペプチドと T2J004Y- Biotinの透過性の比較
試薬は以下のものを用いた；ストレプトアビジン， FITC コンジュゲート
(VECTOR 1. Offlg/ml) 、 T2J004Y-Biotin, T2J002Y- Biotin、 T2J003Y- Biotin、 DMEM 10¾FBS MBEC4。
まず、 MBEC4 (1.26X 104 / insert)を insertに播き込み、 37。C、 5%C02下で 4 日間培養した。 ストレプトアビジン， FITC コンジユゲート（ I insert)と T2J004Y- Biotin、 T2J002Y- Biotin、 T2J003Y_Biotin (各々 1.6nmol I insert)を 混合し、 室温で 30分間インキュベートした。 その後、 各培養液で 250 xlに調 製し、 insert中の培養液と置き換え、 well ( FALCON 24wel 1セルカルチヤ一ィ ンサート用プレート ） には 750/ lの培養液を加えた。 3時間、 6時間、 24時間 後に well中から 100 xlサンプリングし、 Fluorskan Asentを用いて、 蛍光強度 を測定した。
その結果、 MBEC4における T2J004Y- Biotinの透過性を 100とした場合の、
T2J002Y-Biotin、 T2J003Y- Biotinの透過する割合を示した。 T2J002Y- Biotinは、 T2J004Y-Biotinの 20〜40%程しか透過しなかったが、 T2J003Y- Biotinはおよそ 1.4倍多く透過していた （図 15) 。 〔実施例 10〕 本発明のペプチドを発現するファージの脳移行活性 本発明のぺプチドを発現するファージと、 コントロールファージを血管内に投 与し、 脳移行活性の検討を行った。
その結果、 本発明のぺプチドを発現するファージ粒子を脳内に検出することが できた （図 1 6 ) 。
〔実施例 1 1〕 ミクログリアの細胞のトランスサイト一シス活性
MBEC4を用いた血液脳関門モデルにおいて、 ミクログリアのトランスサイトー シス活性を観察した。
その結果、 ミクログリアを添加して 4時間後、 トランスサイト一シスが検出で さた （図 1 7 ) 。
また、 ミクログリアが血液脳関門モデルを通過する際のトランスサイトーシス 活性を電子顕微鏡を用いて観察した。
その結果、 ミクロダリァの突起が血液脳関門を形成する MBEC4細胞内へはつ きり陥入する像が観察された （図 2 1、 2 2 ) 。
さらに対照実験として、 マクロファージについて同様の実験を行った。 その結 果、 マクロファージは血液脳関門を形成する MBEC4に対して緩く接着するのみ であり、 細胞層への透過は見られなかった （図 2 3、 2 4 ) 。 産業上の利用の可能性
本発明者らによって、 脳移行活性に関与するアミノ酸モチーフ配列が初めて見 出され、 該モチーフ配列を含むポリペプチドは脳移行活性を有することが新たに 見出された。 本発明のポリペプチドは脳の血管内皮細胞に特異的に結合し、 さら に、 t rans ce l luar pathwayを誘導することにより、 物質を脳実質に送り込むこ とが可能になった。

Claims

請求の範囲
1. 塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を 1 0 %以上含有する、 脳移行活性を 有するポリペプチド。
2. 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域に おいて塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) が 1 0 %以上含まれる、 脳移行 活性を有するポリペプチド。
3. 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域に 少なくとも 1以上の塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を有する、 脳移行 活性を有するポリペプチド。
4. 環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、 該環状ペプチド領域に 少なくとも 1以上の塩基性アミノ酸残基 （Kまたは R) を有し、 かつ、 該 環状領域の残りのアミノ酸残基のうち 8 0 %以上が以下のァミノ酸残基か ら選択されることを特徴とする、 脳移行活性を有するポリべプチド。
G、 A、 V、 L、 S、 T、 P、 Q, H、 N
5. 以下のアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドであって、 脳移行活性を 有するポリペプチド。
X y - (Rまたは K) _X3— X4、 または
X4-X3- (Rまたは K) -X,
式中、 は S、 T、 Ν、 Ρ、 Vまたは L、 X3は任意のアミノ酸、 X4は G, S， T, C， N, L, Q, または Yを表す。
6. 環状領域に請求項 5に記載のアミノ酸モチーフ配列が含まれる、 請求項 2 〜 4のいずれかに記載のポリぺプチド。
7. アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、 請求項 5または 6に記載のポ リペプチド。
Xx- (Rまたは K) 一 X3_X4、 または X4-X3- (Rまたは K) -X,
式中、 丄は S、 Τ、 Ν、 Ρまたは V、 Χ3は任意のアミノ酸、 Χ4は非電荷 極性アミノ酸 （G， S, T, C, N, Q, Y) を表す。
8. アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、 請求項 5または 6に記載のポ リペプチド。
X「 (Rまたは K) 一 X3— X4、 または
X4-X3- (Rまたは K) -X,
式中、 X は S、 T、 Ρまたは L、 X3は任意のァミノ.酸、 X4は S， T, C, L, または Qを表す。
9. トランスマイグレーション誘導活性を有する、 請求項 1〜8のいずれかに 記載のポリペプチド。
10. 脳の血管内皮細胞と結合する活性を有する、 請求項 1〜 8のいずれかに 記載のポリペプチド。
11. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかに記載のポリペプチド。
(a) 配列番号： 1〜 12のいずれかに記載のァミノ酸配列からなるポリべプチ ド。
(b) 前記 (a) のポリべプチドの両端のシスティン同士のジスルフィ ド結合に よって環状化されたペプチド領域を含む、 ポリペプチド。
(c) 配列番号： 1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1または 数個のアミノ酸が付加、 欠失、 もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポ リペプチドであって、 脳移行活性を有するポリペプチド。
12. ポリペプチドの長さが 9アミノ酸以内である、 請求項 1〜11のいずれ かに記載のポリペプチド。
13. 請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌク レオチド。
14. 請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドと結合する抗体。
15. 請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドを含有する、 任意の分 子に脳移行活性を付与するための薬剤。
16. 任意の分子が任意のポリペプチドである、 請求項 15に記載の薬剤。
17. 請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドを含む、 脳移行活性を 有する分子。
18. 分子がファージ粒子、 または該ファージ粒子の外殻タンパク質である、 請求項 17に記載の分子。
19. 分子が請求項 1〜 12のいずれかに記載のポリぺプチドとの融合夕ンパ ク質である、 請求項 17に記載の分子。
20. 請求項 1〜 12のいずれかに記載のポリペプチドからなる、 脳送達用キ ャリア。
21. 請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドが、 ミセル、 リポソ一 ムまたはマイクロカプセルと結合した構造からなる、 脳送達用キャリア。
22. 請求項 20または 21に記載の脳送達用キャリアに薬物が担持された構 造からなる、 脳疾患治療剤。 -
23. 任意の分子に請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドを結合さ せる工程を含む、 脳移行活性を有する分子の製造方法。
24. 以下の工程 (a) 〜 （c) を含む、 脳移行活性を有するタンパク質分子 の製造方法。
(a) 発現可能な状態で任意のタンパク質分子をコードする DNAと、 請 求項 1〜 12のいずれかに記載のポリぺプチドをコ一ドする D N A とが結合した構造の DNAを含む発現べクタ一を作製する工程
(b) 前記発現ベクターを細胞へ導入する工程
(c) 前記ベクターからの発現産物を回収する工程
25. 以下の工程 （a) および （b) を含む、 任意の分子を非ヒト動物の脳へ 移行させる方法。 (a) 任意の分子と請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドとが 結合した構造の脳移行活性を有する分子を製造する工程
(b) 前記分子を非ヒト動物体内へ投与する工程
26. 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 請求項 1〜12のいずれかに記載の ポリべプチドに対して結合活性を有する分子のスクリーニング方法。
(a) 請求項 1〜12のいずれかに記載のポリペプチドと被検分子とを接 触させる工程
( b ) 前記ポリべプチドと被検分子との結合活性を検出する工程
(c) 前記ポリペプチドと結合する分子を選択する工程
27. 以下の工程 （a) 〜 （d) を含む、 脳移行活性を有するポリペプチドの スクリーニング方法。
( a ) 被検ポリぺプチドをファージ外殻夕ンパク質上へ提示させたファー ジ粒子を作製する工程
(b) 該ファージ粒子を、 非ヒト動物へ投与する工程
(c) 該非ヒト動物の脳組織からファージ粒子を回収する工程
(d) 工程 （c) において回収されたファ一ジ粒子に提示された被検ポリ ぺプチドを脳移行活性を有するポリぺプチドとして選択する工程
28. 被検ポリペプチドが請求項 5、 7または 8のいずれかに記載のアミノ酸 モチーフ配列を含む、 請求項 27に記載のスクリーニング方法。
29. ファージが M 13ファージまたは T 7ファージである、 請求項 27に記 載のスクリーニング方法。
30. 工程 （a) につづいて、 さらに、 脳の血管内皮細胞と結合するファージ 粒子を選択する工程、 を含む請求項 27に記載のスクリーニング方法。
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Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007023930A1 (ja) * 2005-08-26 2007-03-01 Tissue Targeting Japan Inc. 脳移行性細胞、およびその利用
JPWO2006013650A1 (ja) * 2003-08-08 2008-05-01 株式会社ティッシュターゲティングジャパン 金属コロイド粒子を含有する脳神経細胞内移行用キャリア
WO2008108242A1 (ja) 2007-03-05 2008-09-12 Proteus Sciences Co., Ltd. 多価結合手を有し代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチド
JP2009536821A (ja) * 2006-05-12 2009-10-22 バハラ バイオテック インターナショナル リミテッド 新規血栓溶解分子及びその製造法
US8710013B2 (en) 2008-04-18 2014-04-29 Angiochem Inc. Pharmaceutical compositions of paclitaxel, paclitaxel analogs or paclitaxel conjugates and related methods of preparation and use
JP2014101300A (ja) * 2012-11-19 2014-06-05 Chiba Univ 脳送達用キャリアおよびその用途
US8828925B2 (en) 2008-10-15 2014-09-09 Angiochem Inc. Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery
US8853353B2 (en) 2008-12-17 2014-10-07 Angiochem, Inc. Membrane type-1 matrix metalloprotein inhibitors and uses thereof
US8921314B2 (en) 2008-10-15 2014-12-30 Angiochem, Inc. Conjugates of GLP-1 agonists and uses thereof
US8969310B2 (en) 2005-07-15 2015-03-03 Angiochem Inc. Potentiation of anticancer agents
US9161988B2 (en) 2009-07-02 2015-10-20 Angiochem Inc. Multimeric peptide conjugates and uses thereof
US9173891B2 (en) 2009-04-20 2015-11-03 Angiochem, Inc. Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog
JP2015203014A (ja) * 2014-04-14 2015-11-16 国立大学法人滋賀医科大学 脊髄組織標的化ペプチド及びその利用
US9221867B2 (en) 2003-01-06 2015-12-29 Angiochem Inc. Method for transporting a compound across the blood-brain barrier
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
US9687561B2 (en) 2012-08-14 2017-06-27 Angiochem Inc. Peptide-dendrimer conjugates and uses thereof
US9914754B2 (en) 2008-12-05 2018-03-13 Angiochem Inc. Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof
US10980892B2 (en) 2015-06-15 2021-04-20 Angiochem Inc. Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1782796A1 (en) * 2004-08-06 2007-05-09 Tissue Targeting Japan Inc. Carrier for migration into cerebral neuron containing metal colloid particle
CN104311653B (zh) * 2005-02-18 2017-12-05 安吉奥开米公司 转运化合物穿过血脑屏障的分子
US20090016959A1 (en) * 2005-02-18 2009-01-15 Richard Beliveau Delivery of antibodies to the central nervous system
US9550827B2 (en) 2007-10-19 2017-01-24 The Regents Of The University Of California Methods for ameliorating and preventing central nervous system inflammation
WO2013016662A1 (en) * 2011-07-28 2013-01-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Diagnosis and treatment of parkinson's disease
CN106279358B (zh) * 2016-08-10 2019-11-22 武汉弘跃医药科技有限公司 一种治疗脑损伤的合成肽
CN113092427A (zh) * 2021-04-02 2021-07-09 南京中医药大学 异硫氰酸荧光素在标记β内啡肽中的应用
CN113480603B (zh) * 2021-07-13 2022-03-01 四川大学 一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽、编码基因及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004015392A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-19 Targeted Molecules Corporation Improved method to identify targeting molecules

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5784162A (en) 1993-08-18 1998-07-21 Applied Spectral Imaging Ltd. Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
EP0690722B1 (en) 1993-03-18 2004-06-30 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for reducing toxicity of biologically-active factors
US5622699A (en) * 1995-09-11 1997-04-22 La Jolla Cancer Research Foundation Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
JP4091152B2 (ja) 1997-09-19 2008-05-28 財団法人化学及血清療法研究所 金コロイドを含む核酸調製物
US6562958B1 (en) * 1998-06-09 2003-05-13 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics
US20020041898A1 (en) 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
US7214786B2 (en) * 2000-12-14 2007-05-08 Kovalic David K Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
JP5175020B2 (ja) 2001-04-30 2013-04-03 サイティミューン サイエンシーズ， インコーポレイテッド コロイド状金属組成物および方法
EP1423412A2 (en) * 2001-09-05 2004-06-02 King's College London Homing peptides
CN1188127C (zh) * 2002-06-07 2005-02-09 复旦大学 一种治疗脑部肿瘤的鼻腔给药制剂
US7749968B2 (en) * 2002-08-05 2010-07-06 The Johns Hopkins University Peptides for targeting the prostate specific membrane antigen
JP4051431B2 (ja) 2002-08-13 2008-02-27 独立行政法人産業技術総合研究所 金コロイド溶液及びその製造方法
KR20060036476A (ko) * 2003-08-08 2006-04-28 가부시키가이샤 티슈 타겟팅 쟈판 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그 이용
EP1782796A1 (en) 2004-08-06 2007-05-09 Tissue Targeting Japan Inc. Carrier for migration into cerebral neuron containing metal colloid particle
US20090092583A1 (en) 2005-08-26 2009-04-09 Makoto Sawada Brain-localizing cells and uses thereof
JP5250849B2 (ja) 2007-03-05 2013-07-31 株式会社医学生物学研究所 多価結合手を有し代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチド

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004015392A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-19 Targeted Molecules Corporation Improved method to identify targeting molecules

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAKOTO SAWADA ET AL: "Brain-specific gene expression by immortalized microglial cell-mediated gene transfer in the mammalian brain", FEBS LETTERS, vol. 433, 1998, pages 37 - 40, XP004258219 *
PASQUALINI R, ET AL: "Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries", NATURE, vol. 380, no. 6572, 28 March 1996 (1996-03-28), pages 364 - 366, XP000986213 *
SCHWARZE SR, ET AL: "In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse", SCIENCE, vol. 285, no. 5433, 1999, pages 1569 - 1572, XP002140133 *
See also references of EP1652855A4 *
YOUNG-SOOK KANG ET AL: "Stability of the Disulfide Bond in an Avidin-Biotin Linked Chimeric Peptide During in vivo Transcytosis Through Brain Endothelial Cells", JOURNAL OF DRUG TARGETING, vol. 8, no. 6, 2000, pages 425 - 434, XP002904280 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9221867B2 (en) 2003-01-06 2015-12-29 Angiochem Inc. Method for transporting a compound across the blood-brain barrier
JPWO2006013650A1 (ja) * 2003-08-08 2008-05-01 株式会社ティッシュターゲティングジャパン 金属コロイド粒子を含有する脳神経細胞内移行用キャリア
US9713646B2 (en) 2005-07-15 2017-07-25 Angiochem Inc. Potentiation of anticancer agents
US8969310B2 (en) 2005-07-15 2015-03-03 Angiochem Inc. Potentiation of anticancer agents
EP1930406A1 (en) * 2005-08-26 2008-06-11 Tissue Targeting Japan Inc. Brain-migrating cell and use thereof
JPWO2007023930A1 (ja) * 2005-08-26 2009-02-26 プロテウスサイエンス株式会社 脳移行性細胞、およびその利用
EP1930406A4 (en) * 2005-08-26 2009-05-06 Proteus Sciences Co Ltd IN THE BRAIN WALKING CELL AND USE THEREOF
WO2007023930A1 (ja) * 2005-08-26 2007-03-01 Tissue Targeting Japan Inc. 脳移行性細胞、およびその利用
JP2009536821A (ja) * 2006-05-12 2009-10-22 バハラ バイオテック インターナショナル リミテッド 新規血栓溶解分子及びその製造法
JP5250849B2 (ja) * 2007-03-05 2013-07-31 株式会社医学生物学研究所 多価結合手を有し代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチド
WO2008108242A1 (ja) 2007-03-05 2008-09-12 Proteus Sciences Co., Ltd. 多価結合手を有し代謝安定性が向上した脳移行性ポリペプチド
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
US8710013B2 (en) 2008-04-18 2014-04-29 Angiochem Inc. Pharmaceutical compositions of paclitaxel, paclitaxel analogs or paclitaxel conjugates and related methods of preparation and use
US8828925B2 (en) 2008-10-15 2014-09-09 Angiochem Inc. Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery
US8921314B2 (en) 2008-10-15 2014-12-30 Angiochem, Inc. Conjugates of GLP-1 agonists and uses thereof
US9914754B2 (en) 2008-12-05 2018-03-13 Angiochem Inc. Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof
US8853353B2 (en) 2008-12-17 2014-10-07 Angiochem, Inc. Membrane type-1 matrix metalloprotein inhibitors and uses thereof
US9173891B2 (en) 2009-04-20 2015-11-03 Angiochem, Inc. Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog
US9161988B2 (en) 2009-07-02 2015-10-20 Angiochem Inc. Multimeric peptide conjugates and uses thereof
US9687561B2 (en) 2012-08-14 2017-06-27 Angiochem Inc. Peptide-dendrimer conjugates and uses thereof
JP2014101300A (ja) * 2012-11-19 2014-06-05 Chiba Univ 脳送達用キャリアおよびその用途
JP2015203014A (ja) * 2014-04-14 2015-11-16 国立大学法人滋賀医科大学 脊髄組織標的化ペプチド及びその利用
US10980892B2 (en) 2015-06-15 2021-04-20 Angiochem Inc. Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis

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