CN101052408B

CN101052408B - 选择性锚定到心脏脉管系统上的肽和相关结合物和方法

Info

Publication number: CN101052408B
Application number: CN2005800375158A
Authority: CN
Inventors: 张良林; 贾森·A·霍夫曼; 埃尔基·罗斯拉赫蒂
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2005-09-07
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2025-09-07
Also published as: JP2008512391A; CN102558334B; EP1796707A2; WO2006029343A2; WO2006029343A3; CN102558334A; JP5993413B2; EP1796707A4; ATE538806T1; JP2012051934A; EP1796707B1; JP2015038064A; JP6417347B2; CN101052408A; JP2016128505A

Abstract

本发明提供多种分离肽和肽模拟物，其例如可用于构建本发明的结合物(conjugate)，或者当肽自身具有生物活性时，其可以未结合形式用作治疗如下所述的多种心血管疾病中的任一种的治疗剂。因此，本发明提供一种分离肽或肽模拟物，其具有少于60个残基的长度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)或其肽模拟物。本发明进一步提供一种分离肽或肽模拟物，其具有少于60个残基的长度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ IDNO：5)或其肽模拟物，或氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO：6)或其肽模似物。

Description

选择性锚定到心脏脉管系统上的肽和相关结合物和方法

技术领域

无

背景技术

动脉粥样硬化和其后遗症构成西方世界中疾病和死亡的最常见且最重要的起因，这在西方所有的死亡中占到50％。如下文进一步描述，动脉粥样硬化为由于动脉粥样化而引起的血管壁或动脉增厚和无弹性所导致的病症。

在正常心脏中，血管壁是由与具有结缔组织上覆层的血管平滑肌细胞中间层紧密并置的内皮细胞内层组成。内皮细胞内层理想地位于血液与血管壁之间的界面上以转导信号，同时内皮细胞经由产生调控诸如血管紧张性、凝结状态、细胞生长、细胞死亡和白细胞通行的过程的因子来控制血管的稳态平衡。血管平滑肌细胞维持血管回应于血管活性剂之收缩紧张性且释放细胞因子和其它生长因子。平滑肌细胞与成纤维细胞结合产生决定血管结构的胞外基质蛋白和蛋白酶。动脉粥样硬化的最常见形式阻塞性血管疾病的特征在于脂质、炎性细胞、血管平滑肌细胞和胞外基质蛋白在内皮内层与中间层之间的内膜空间中的异常积累(空斑形成)。

动脉粥样硬化的疗法通常预防、遏制或逆转空斑形成过程或刺激新血管形成。然而，用于治疗动脉粥样硬化的药物或其它药剂仅以冠状血管为目标很罕见。更常见的是，全身投与会导致不需的副作用，这是(例如)归因于遍布于全身的全身性毒性作用。举例而言，刺激内皮细胞增殖的血管生成的关键调控因子血管内皮生长因子(VEGF)会促进新血管形成，从而增加通往缺血组织的血流并缓解血管疾病。然而，VEGF也可促进非特异性有丝分裂发生且增强血管生成驱动的疾病(诸如糖尿病性视网膜病)和某些肿瘤。类似地，全身投与血管生成刺激物成纤维细胞生长因子可引起严重的副作用，这是归因于其缺乏对心脏组织的特异性。不幸的是，包括高血压反复发作的这些副作用会限制用于治疗动脉粥样硬化的现有促血管生成疗法的效用。

作为组成血管内层的细胞，内皮细胞是循环药物或其它物质所遇到的最先细胞类型。内皮细胞因此提供用于将治疗物质选择性导向到心脏组织的目标。药物或其它治疗物质对心脏脉管系统的所述选择性靶向将降低或消除诸如全身毒性或恶性转化的不当副作用的风险。治疗物质对心脏脉管系统的选择性靶向也将实现所述物质的高局部浓度，从而降低有效治疗所需的剂量。

因此，需要鉴定活体内选择性结合到心脏脉管系统上的分子。所述分子尤其适用于将治疗剂选择性靶向到心脏以治疗心脏病和诸如动脉粥样硬化的心血管疾病。本发明满足这一需要且提供相关优势。

发明内容

本发明提供多种分离肽和肽模拟物，其(例如)可用于构建本发明的结合物，或者当肽自身具有生物活性时，可以未结合形式用作治疗如下文所述的多种心血管疾病中的任一种的治疗剂。因此，本发明提供具有少于60个残基的长度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。本发明进一步提供具有少于60个残基的长度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)或其肽模拟物或氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO：6)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。

本发明进一步提供包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ ID NO：14)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列CXGRKSKTVZC(SEQ IDNO：15)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本发明另外提供具有少于150个残基的长度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。

本文还提供具有少于50个残基的长度且包括氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO：6)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。

本发明另外提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO：7)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。

本发明进一步提供包括氨基酸序列RNSWKPN(SEQ ID NO：16)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列CXRNSWKPNZC(SEQ IDNO：17)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本文进一步提供包括氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO：9)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。

本发明还提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列RSTRANP(SEQ ID NO：18)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明的分离肽或肽模拟物包括氨基酸序列CXRSTRANPZC(SEQ ID NO：19)或其肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本发明另外提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列PKTRRVP(SEQ IDNO：20)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，分离肽或肽模拟物包括氨基酸序列CXPKTRRVPZC(SEQ ID NO：21)或其肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本文进一步提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列SGMARTK(SEQ IDNO：22)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列CXSGMARTKZC(SEQ ID NO：23)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本文还提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使HLP/CRIP2或其片段与分子文库在适于使分子与HLP/CRIP2特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上HLP/CRIP2结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2的锚定分子。

本发明进一步提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使受体克隆9或其片段与分子文库在适于使分子与受体克隆9特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上受体克隆9结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9的锚定分子

本发明还提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使Sigirr/TIR8或其片段与分子文库在适于使分子与Sigirr/TIR8特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上Sigirr/TIR8结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8的锚定分子

本文进一步提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使MpcII-3相关蛋白或其片段与分子文库在适于使分子与MpcII-3相关蛋白特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上MpcII-3相关蛋白结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合MpcII-3相关蛋白的锚定分子

本发明进一步提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使bc10或其片段与分子文库在适于使分子与bc10特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上bc10结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10的锚定分子

本文也提供在个体中将成分(moiety)导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本发明进一步提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其中对个体投与结合物，所述结合物含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：27的抗体或其抗原结合片段连接的成分，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本文还提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本文进一步提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本发明另外提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本发明还提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO：25)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。本文还提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本发明进一步提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQID NO：27)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。本文还提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQ ID NO：27)的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本文进一步提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合单一Ig IL-2受体相关蛋白(Sigirr/TIR8；SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。举例而言，所述结合物可用于在个体中将成分导向到心脏脉管系统的本发明方法中，所述方法是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本发明还提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33(与内在膜蛋白(integral membrane protein)CII-3(MpcII-3)具有假定类似性的蛋白产物)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。本发明另外提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ IDNO：33的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

本文还提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合鼠科膀胱癌相关蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。本发明另外提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。

附图说明

本专利或申请案文件含有至少一个以彩色绘制的图示。具有彩图的本专利或专利申请公开案的副本将由官方在得到请求和必要费用的支付后提供。

图1绘示用结合细菌双杂交分析的活体外和活体内噬菌体展示技术(phage display)鉴定锚定肽/受体对。(A)平行的锚定肽分离和受体鉴定的原则。将噬菌体展示的肽文库注入小鼠并使其循环，采集组织且接着使其破碎为结合有噬菌体的单细胞。洗除未结合的噬菌体并回收结合的噬菌体，使其在细菌中生长并重复所述过程或通过PCR扩增编码肽的插入物且使其穿入细菌双杂交系统的诱饵载体组份中。在细菌中，富含锚定到所选组织的能力的集合可与可能受体相互作用，从而产生耐羧苄青霉素性(carbenicillin-resistance)。将抗性克隆涂在含X-gal的琼脂上以进行二次筛检，扩增靶和诱饵插入物并从耐羧苄青霉素的LacZ表达细胞测序。(B)通过用抗CD31磁珠进行第三轮活体外选择，经选择的集合比非重组T7噬菌体高出约230倍地活体外结合心脏细胞。(C)当针对活体内锚定到心脏而进一步选择时，活体外/活体内所选集合在心脏脉管系统中比非重组对照噬菌体多积累约190倍。(D)将来自最终集合的编码肽的插入物亚克隆入诱饵载体中，且用肽-诱饵载体和靶载体中的心脏cDNA文库转化细菌。选择经转化细菌以在500μg/ml羧苄青霉素上生长。(E)一些克隆对二级标记物LacZ也呈阳性，这是由在含X-gal的平板上产生蓝色而证实。

图2绘示选择性锚定到心脏的个别噬菌体展示的肽。将从心脏内皮锚定的结合筛检所鉴别的指定肽在T7噬菌体中重新构建并通过静脉内注入小鼠来个别投与。除SEQ IDNO：10外，展示心脏锚定肽的噬菌体相对于非重组噬菌体显著锚定到心脏；此外，在所测试的主要器官中对心脏的锚定具特异性。对展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体记录到最高的特异性(超过300倍)。(A)CRPPR(SEQ ID NO：1)噬菌体锚定到心脏、肾、大脑、肌肉和肺。(B)CARPAR(SEQ ID NO：5)噬菌体锚定到心脏、肾、大脑、肌肉和肺。(C)CKRAVR(SEQ ID NO：7)噬菌体锚定到心脏、肾、大脑、肌肉和肺。(D)CLIDLHVMC(SEQ ID NO：10)噬菌体锚定到心脏、肾、大脑、肌肉和肺。(E)CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)噬菌体锚定到心脏、肾、大脑、肌肉和肺。(F)CPKTRRVPC(SEQ IDNO：12)噬菌体锚定到心脏、肾、大脑、肌肉和肺。

图3绘示展示心脏锚定肽的噬菌体与血管内皮细胞标记物在心脏中协同定位。将噬菌体与荧光素结合番茄凝集素(fluorescein-conjugated tomato lectin)(绿色)一起静脉内注入小鼠，且用兔抗T7抗体和抗兔Alexa594(红色)对心脏组织切片染色。(A)CRPPR(SEQ ID NO：1)噬菌体染色。(B)CARPAR(SEQ ID NO：5)噬菌体染色。(C)CKRAVR(SEQ ID NO：7)噬菌体染色。(D)CLIDLHVMC(SEQ ID NO：10)噬菌体染色。(E)CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)噬菌体染色。(F)CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)噬菌体染色。箭头表示一些代表性双阳性血管(黄色)。放大率200倍。

图4绘示展示心脏锚定肽的噬菌体特异性结合到经同源受体转染的细胞。在双杂交检定(表1)中鉴定的心脏锚定肽的假定受体在293T细胞中由经转染cDNA表达，使用经转染细胞测试在缓冲液中或在代表对应肽中每一者的合成肽(100mg/ml)存在下展示相关心脏锚定肽的同源噬菌体的结合。各噬菌体与表达其假定同源受体的细胞的结合(汽提柱)比与经空白载体对照物转染的细胞的结合(灰柱)多300至500倍。在所有情况下，通过与过量同源肽(黑柱)竞争但不与无关心脏锚定肽(白柱)竞争来抑制噬菌体与经转染细胞的结合。用游离肽CRPPR(SEQ ID NO：1)、CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)和CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)检定四种经转染细胞系中的每一者。(A)表达同源肽CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体与经CRIP2转染的细胞的结合。(B)表达同源肽CKRAVR(SEQ ID NO：7)的噬菌体与经Sigirr转染的细胞的结合。(C)表达同源肽CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)的噬菌体与经MpcII-3相关蛋白SEQ ID NO：33转染的细胞的结合。(D)表达同源肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)的噬菌体与经bc10转染的细胞的结合。

图5绘示心脏锚定肽的受体在心脏中于mRNA水平上高度表达且定位于内皮细胞。(A)四种受体mRNA于不同小鼠心脏、肺、脾、肾、大脑和肌肉中的实时PCR结果，其是表达为心脏中相同mRNA含量的百分比(两个单独实验的平均值)。(B)在分析结束时回收实时PCR产物并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。ST＝100bp梯状DNA。(C)通过原位杂交(红色)定位受体。HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白和bc10在心脏中的内皮细胞中都高度表达。HLP/CRIP2、MpcII-3相关蛋白和bc10mRNA也在心脏实质细胞中高度表达。肺毛细管另外对Sigirr/TIR8和MpcII-3相关蛋白明显呈阳性，同时观察到HLP/CRIP2和belO的一些信号。偶尔在其它组织中发现阳性染色的痕迹。放大率200倍。

图6绘示CRPPR(SEQ ID NO：1)肽和同源受体CRIP2与CD31在心血管的内皮细胞中协同定位。将荧光素结合CRPPR(SEQ ID NO：1)肽静脉内注入小鼠，并在两小时后收集组织以用抗内皮标记物CD31的抗体染色。荧光肽以绿色显示，而CD31标记物以红色显示。(A)SEQ ID NO：1与CD31于心血管中的协同定位。(B)SEQ ID NO：1与CD31于心内膜中的协同定位。(C)在心脏中未观察到对照肽。(D)抗CRIP2抗体染色与CD31协同定位的心脏内皮细胞(红色)。(E)抗CRIP2抗体与所注射的CRPPR(SEQID NO：1)肽在心血管中协同定位。(F)抗CRIP2抗体与所注射的CRPPR(SEQ ID NO：1)肽在心内膜中协同定位。

图7绘示展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体结合到心脏细胞且展示SEQ ID NO：1的噬菌体的锚定被抗CRIP2抗体阻断。将展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体与从心脏制备的细胞悬浮液一起培育，在有和无各种浓度的指定抗体或肽的存在下测量噬菌体结合。(A)鸡抗CRIP2抗体阻断展示SEQ ID NO：1的噬菌体与心脏细胞的结合，使用正常IgY作为阴性对照。(B)游离CRPPR(SEQ ID NO：1)肽对展示SEQ ID NO：1的噬菌体结合的剂量依赖抑制和两种无关心脏锚定肽不进行抑制可证实活体外噬菌体结合系统的特异性。(C)展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体与心脏的活体内锚定受协同注射的抗CRIP2抗体抑制。显示三个独立实验的平均和标准偏差。

图8绘示鼠科富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2)的(A)核苷酸(SEQ ID NO：24)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO：25)序列。Genbank登记号NM_024223。

图9绘示被鉴定为受体克隆9的鼠科RIKEN EST的(A)核苷酸(SEQ ID NO：26)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO：27)序列。Genbank登记号BC026536。

图10绘示鼠科单一Ig IL-2受体相关蛋白(Sigirr/TIR8)的(A)核苷酸(SEQ ID NO：28)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO：29)序列。Genbank登记号BC010806。

图11绘示鼠科嗅觉cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)，所述嗅觉cDNA为经鉴别为受体克隆27的含有富谷氨酰胺区域的蛋白。Genbank登记号AK032239。

图12绘示与内在膜蛋白CII-3(MpcII-3)具有假定类似性的鼠科多肽的(A)核苷酸(SEQ ID NO：32)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO：33)序列。Genbank登记号AK032458。

图13绘示鼠科膀胱癌相关蛋白同系物(bc10)的(A)核苷酸(SEQ ID NO：34)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO：35)序列。Genbank登记号BC026935。

具体实施方式

本发明涉及鉴定高选择性地锚定到心脏脉管系统且可以结合物形式用于将全身性投与的治疗剂或显影剂选择性靶向心脏脉管系统的分子。所述治疗剂的选择性靶向会增加传递到心脏脉管系统的药剂的有效量，同时降低药剂对其它器官具有不利作用的可能性。本发明进一步涉及鉴定用于本发明的锚定分子的同源受体。如下文进一步公开，这些受体在心脏内皮上表达且可用于针对优化选择性锚定到心脏脉管系统的肽或其它分子的特征而筛检。

如本文实例I中所公开，使用活体外和活体内噬菌体选择与细菌双杂交分析的新颖组合来鉴定选择性锚定到心脏脉管系统的肽且鉴定用作这些肽的受体的内皮分子。在用鼠科心脏细胞悬浮液和抗CD31磁珠进行活体外噬菌体选择后，针对与心脏的锚定进行活体内选择，从而导致锚定到心脏的噬菌体集合相对于非重组噬菌体增加近200倍(图1A和1B)。此外，如图1C所示，经活体外/活体内选择的噬菌体与其它组织相比优先定位到心脏上，在心脏中的富集比在大脑、肾、皮肤和骨骼肌中的积累要大20到50倍。

在由细菌双杂交分析用心脏锚定噬菌体集合鉴定的25个假定受体克隆中，大部分为在心肌中大量表达的蛋白。如表1所总结，剩余的6个克隆代表膜或细胞表面蛋白且为锚定肽的假定受体。被表示为受体克隆5的第一个克隆代表心脏LIM-蛋白(HLP)(也称作富半胱氨酸蛋白2(CRIP2))的羧基端92个氨基酸(残基117至208)。全长鼠科HLP/CRIP2核酸和氨基酸序列在本文中分别作为SEQ ID NO：24和25(参看Genbank登记号NM_024223)提供。双杂交分析产生若干结合这一受体的潜在心脏锚定肽。当个别检定时，展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体相对于非重组噬菌体以高出300倍的选择性锚定到心脏(图2A)，且CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)噬菌体相对于非重组噬菌体在心脏锚定中展示约50倍的选择性。这些结果表示肽SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为心脏锚定肽且进一步表明HLP/CRIP2是用作锚定这些肽的受体。

如本文进一步公开，未注释的RIKEN EST(受体克隆9)也被鉴定为与一种或一种以上心脏锚定肽结合的在膜或细胞表面上表达的肽。由受体克隆9代表的RIKEN EST的全长鼠科核酸和氨基酸序列在本文中分别作为SEQ ID NO：26和27(参看Genbank登记号BC026536)提供。在经由双杂交分析鉴定的三种不同肽中，两种肽CARPAR(SEQ IDNO：5)和CPKRPR(SEQ ID NO：6)在于噬菌体上展示时呈现与心脏的选择性锚定(图2B)。

本文所公开的结果进一步鉴定作为心脏锚定肽的受体的单一Ig IL-1受体相关蛋白，其被称为Sigirr或TIR8(受体克隆15)。全长鼠科Sigirr/TIR8核酸和氨基酸序列在本文中分别作为SEQ ID NO：28和29(参看Genbank登记号BC010806)提供。如表1所总结，经由双杂交分析通过结合Sigirr/TIR8而鉴定的三种肽CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO：8)和RGSSS(SEQ ID NO：9)当在噬菌体上展示且活体内检定时显示20至30倍的心脏锚定选择性(参看表1和图2C)。

也如本文所公开的心脏锚定受体为受体克隆36，其代表来自与内在膜蛋白CII-3(MpcII-3)具有假定类似性的RIKEN Fantom系列的未命名的蛋白产物，MpcII-3为作为琥珀酸脱氢酶复合体的一部分的线粒体膜蛋白。这种MpcII-3相关蛋白的核酸和氨基酸序列在本文中分别作为SEQ ID NO：32和33(参看Genbank登记号26328274)提供。经由双杂交分析，鉴定肽CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)与这种受体结合，展示SEQ IDNO：11的噬菌体在活体内个别检定时以约20倍的选择性锚定到心脏(表1和图2E)。本文所公开的其它结果表示鼠科膀胱癌相关蛋白同系物10(bc10)(其为在由膀胱中的前恶性病变发展癌症时受到下调的小膜蛋白)可用作心脏锚定受体。所鉴定的受体克隆46代表bc10的小鼠同系物的一部分。全长鼠科bc10核酸和氨基酸序列在本文中分别作为SEQID NO：34和35(参看Genbank登记号20072483)提供。如表1和图2F所示，表达结合克隆46的两种肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)和CSGMARTKC(SEQ ID NO：13)的噬菌体分别在心脏锚定中展现约60和10倍的选择性。

如本文中另外公开，分析若干心脏锚定肽在活体内结合心脏内皮的能力和其与其假定受体的特异性结合。将展示心脏锚定肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的噬菌体与荧光素结合番茄凝集素(一种血管标记物)个别地注入小鼠，且用抗T7抗体观察噬菌体的定位。如图3A至C、E和F所示，展示SEQ ID NO：1、5、7、11或12的噬菌体存在于心脏内皮中且不存在于其它组织中，而展示肽SEQ ID NO：10的阴性对照噬菌体不存在于心脏和其它组织中。这些结果证实展示肽CRPPR(SEQ ID NO：1)、CARPAR(SEQ ID NO：5)、CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)的噬菌体在活体内定位到心脏脉管系统。另外，实时(RT)PCR和原位杂交分析显示心脏锚定肽的四种同源受体HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白和bc10在心脏内皮中表达。与所检定的其它组织相比，这些受体也优先在心脏中表达(参看图5)。虽然心脏内皮受体HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白和bc10不是仅在心脏中表达，但是其在心脏中的优先表达产生在心脏中以约20至300倍的选择性聚集测试噬菌体的锚定肽。与先前用其它分子观察到的心脏锚定相比，所述在心脏锚定中20至300倍的选择性显著增加。

如本文进一步公开，检定展示同源肽的噬菌体与经全长同源受体转染的细胞结合的能力。如图4所示，表达心脏锚定肽的噬菌体比对照噬菌体高出300至500倍地与经对应同源受体转染的细胞结合，且噬菌体结合在100μg/ml同源肽存在下受到抑制但不受无关锚定肽抑制。这些结果证实心脏锚定肽CRPPR(SEQ ID NO：1)特异性结合受体HLP/CRIP2；心脏锚定肽CKRAVR(SEQ ID NO：7)特异性结合受体Sigirr/TIR8；心脏锚定肽CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)特异性结合MpcII-3相关蛋白受体；且心脏锚定肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)特异性结合受体bc10。

本文所公开的其它结果证实肽CRPPR(SEQ ID NO：1)与同源受体HLP/CRIP2的协同定位。如本文图6所示，来自经静脉内注射的CRPPR(SEQ ID NO：1)肽的荧光与血管标记物CD31在心血管和心内膜中大范围协同定位，而在心脏中未检测到经荧光素标记的对照肽。抗HLP/CRIP2抗体染色也与血管标记物(图6D)和肽CRPPR(SEQ ID NO：1；图6E和6F)在心血管和心脏心内膜中协同定位。使用游离CRPPR(SEQ ID NO：1)肽进行竞争检定以证明CRPPR(SEQ ID NO：1)-噬菌体与具有HLP/CRIP2的心血管的结合的特异性，所述游离CRPPR(SEQ ID NO：1)肽以剂量依赖方式阻断展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体与心脏来源的细胞悬浮液的结合。另外，抗HLP/CRIP2抗体在与噬菌体共同注射时会抑制CRPPR(SEQ ID NO：1)噬菌体锚定(图7C)。这些结果证明肽CRPPR(SEQ ID NO：1)经由特异性结合到HLP/CRIP2上而选择性锚定到心脏脉管系统。

基于上述发现，本发明提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO：25)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。在所述结合物中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏，且其例如可为肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明的结合物包括含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。在另一实施例中，本发明的结合物包括含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。所述锚定肽或肽模拟物视情况可在构形上受限。

多种治疗剂适用于本发明的结合物中，所述结合物并有选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的锚定分子。适用的治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。在一实施例中，本发明提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的锚定分子连接的血管生成剂的结合物。在另一实施例中，本发明提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ IDNO：25)的锚定分子连接的抗血栓形成剂的结合物。

本发明另外提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQID NO：27)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。在一实施例中，本发明的结合物包括含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。在另一实施例中，本发明的结合物包括含有氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO：6)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。多种治疗剂中任一种都适用于本发明的结合物中，所述结合物并有选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQID NO：27)的锚定分子。适用的治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。在一实施例中，本发明提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQ ID NO：27)的锚定分子连接的血管生成剂的结合物。在另一实施例中，本发明提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQ ID NO：27)的锚定分子连接的抗血栓形成剂的结合物。

本文进一步提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合单一Ig IL-2受体相关蛋白(Sigirr/TIR8；SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。作为非限制性实例，适用于所述结合物中的锚定分子可以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏。作为另一非限制性实例，特异性结合Sigirr/TIR8的锚定分子可为锚定肽或肽模拟物。

多种特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定肽和肽模拟物适用于本发明的结合物中，所述结合物包括(但不限于)含有氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO：7)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。适用于本发明的锚定肽和肽模拟物进一步包括(但不限于)含有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQ ID NO：8)或其保守变异体或肽模拟物的肽和肽模拟物，所述肽和肽模拟物可能在构形上受限或可能不在构形上受限。其它适用于本发明的锚定肽和肽模拟物包括(但不限于)那些含有氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO：9)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。

多种治疗剂中的任一种都适用于含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。适用于本发明的治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。在一实施例中，本发明提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的血管生成剂的结合物。在另一实施例中，本发明提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的抗血栓形成剂的结合物。

本文还提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子连接的治疗剂的结合物。在一实施例中，本发明的结合物包括以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏的锚定分子。在另一实施例中，本发明的结合物包括为锚定肽或肽模拟物的锚定分子。在其它实施例中，本发明的结合物包括含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。所述锚定分子可视情况在构形上受限。应了解多种治疗剂中的任一种都可用于本发明的结合物中，所述治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。作为一实例，本发明的结合物可含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子连接的血管生成剂。作为另一实例，本发明的结合物可含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子连接的抗血栓生成剂。

本文还提供含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合鼠科膀胱癌相关蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的治疗剂的结合物。在所述结合物中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏。锚定分子可为(但不限于)肽或肽模拟物。多种特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子中的任一种都可用于本发明的结合物中，所述结合物包括(但不限于)含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的适用锚定分子进一步包括(但不限于)含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO：13)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。适用的锚定分子进一步包括(但不限于)包括氨基酸序列SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物的构形受限形式。

熟习此项技术者了解多种治疗剂中的任一种都可用于本发明的结合物中，所述治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。在一实施例中，本发明的结合物含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的血管生成剂。在另一实施例中，本发明的结合物含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的抗血栓生成剂。

在特定实施例中，本发明的结合物的肽或肽模拟物部分具有限定长度。结合物的肽或肽模拟物部分可具有(但不限于)至多10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000或2000个残基的长度。在其它实施例中，结合物的肽或肽模拟物成分可具有至少5、10、20、30、50、100、150、200、250或300个残基的长度。应了解，术语“结合物的肽或肽模拟物部分”意谓锚定肽或肽模拟物和任何连续蛋白、肽或肽模拟物(例如治疗蛋白或促细胞凋亡肽)中的残基总数。

如本文所公开，肽SEQ ID NO：1和2识别在心脏内皮上表达且在其它组织中不会表达到相同程度的靶“受体”。所述靶受体(本文鉴别为HLP/CRIP2)的内皮和组织选择性表达会形成肽SEQ ID NO：1和2和相关肽和肽模拟物以及其它具有类似结合特异性的分子的选择性锚定活性的基础。基于这些发现，显然在结构上与SEQ ID NO：1和2无关但具有特异性HLP/CRIP2结合活性的分子也将共有选择性锚定到心脏脉管系统的特征。举例而言，可鉴定所述分子与SEQ ID NO：1或2特异性结合或与SEQ ID NO：1或2竞争结合到HLP/CRIP2表达细胞(诸如经本文所公开的HLP/CRIP2转染的293T细胞)的能力。举例而言，如本文实例II中所述，可容易地证实与心脏脉管系统的选择性锚定。

因此，本发明提供选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO：25)的锚定分子。在一实施例中，特异性结合HLP/CRIP2(SEQID NO：25)的锚定分子为除抗体或其抗原结合片段外的分子。在另一实施例中，特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的锚定分子为肽或肽模拟物。除本文所公开的HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)结合分子CRPPR(SEQ ID NO：1)和CGRKSKTVC(SEQID NO：2)外，下文也提供用于鉴定其它在结构上相关或无关的锚定分子的筛检方法。

本文也已鉴定选择性锚定到心脏脉管系统的分子的其它靶受体。受体克隆9(SEQ IDNO：27)已被鉴定为特异性结合心脏锚定肽SEQ ID NO：5和6的受体，且其形成这些肽和其它具有类似结合活性的肽、肽模拟物和其它分子选择性锚定到心脏脉管系统的能力的基础。根据上文，显然在结构上与SEQ ID NO：5或6无关但具有特异性受体克隆9(SEQID NO：27)结合活性的分子也共有选择性锚定到心脏脉管系统的特征。可鉴定所述锚定分子与SEQ ID NO：5或6特异性结合或与SEQ ID NO：5或6竞争结合到受体克隆9(SEQID NO：27)的能力。可使用经纯化SEQ ID NO：27或(例如)经编码SEQ ID NO：27的核酸分子(SEQ ID NO：26)转染的细胞检定特异性结合。

根据上文，本发明提供选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQ IDNO：27)的锚定分子。在一实施例中，特异性结合受体克隆9(SEQ ID NO：27)的锚定分子为除抗体或其抗原结合片段外的分子。在另一实施例中，特异性结合受体克隆9(SEQID NO：27)的锚定分子为肽或肽模拟物。本文公开特异性结合受体克隆9(SEQ ID NO：27)的示范性肽和肽模拟物，且下文提供适用于鉴定选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9(SEQ ID NO：27)的其它锚定分子的筛检方法。

如本文进一步公开，Sigirr/TIR8(一种特异性结合SEQ ID NO：7、8和9的多肽)的内皮和心脏选择性表达形成这些肽和其它具有类似结合活性的肽、肽模拟物和其它分子选择性锚定到心脏脉管系统的能力的基础。根据上文，显然在结构上与SEQ ID NO：7、8或9无关但具有特异性Sigirr/TIR8结合活性的分子也共有选择性锚定到心脏脉管系统的特征。可鉴定所述锚定分子与SEQ ID NO：7、8或9特异性结合或与SEQ ID NO：7、8或9竞争结合到Sigirr/TIR8的能力。可使用经纯化Sigirr/TIR8或(例如)细胞(诸如在以下实例中所公开的经Sigirr/TIR8转染的293T细胞)检定特异性结合。

基于鉴定作为心脏锚定受体的Sigirr/TIR8，本发明提供选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子。在一实施例中，特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子为除抗体或其抗原结合片段外的分子。在另一实施例中，特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子为肽或肽模拟物。本文公开特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的示范性肽和肽模拟物。此外，下文提供适用于常规鉴定选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的其它锚定分子的筛检方法。

肽CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)识别在心脏内皮上选择性表达的另一靶“受体”。归因于MpcII-3相关蛋白SEQ ID NO：33的内皮和组织选择性表达，肽SEQ ID NO：11以及具有类似结合特异性的相关肽、肽模拟物和其它分子可选择性锚定到心脏脉管系统。所述锚定分子包括那些在结构上与SEQ ID NO：11无关但也与MpcII-3相关蛋白SEQ IDNO：33特异性结合的锚定分子。鉴于上文，显然选择性锚定到心脏脉管系统的其它分子可根据其与SEQ ID NO：11特异性结合或与SEQ ID NO：11竞争结合到MpcII-3相关蛋白(包括经纯化的MpcII-3相关蛋白或在细胞表面表达MpcII-3相关蛋白的细胞)的能力加以鉴定。

根据MpcII-3相关蛋白(SEQ ID NO：33)为心脏锚定受体的发现，本发明提供选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子。在一实施例中，特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子为除抗体或其抗原结合片段外的分子。在另一实施例中，特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子为肽或肽模拟物。本文公开特异性结合SEQ IDNO：33的示范性肽和肽模拟物，和适用于鉴定选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的其它锚定分子的筛检方法。

本文经由SEQ ID NO：12和13的特异性结合活性进一步鉴定另一靶受体bc10。所述受体的内皮和心脏选择性表达形成肽SEQ ID NO：12和13以及相关肽、肽模拟物和其它具有类似结合特异性的分子的选择性锚定活性的基础。基于本文所公开的发现，熟习此项技术者了解在结构上与SEQ ID NO：12和13无关的分子在其共有特异性结合bc10的特征时也可选择性锚定到心脏脉管系统。因此，其它锚定分子(例如)可根据其与SEQ IDNO：12或13特异性结合或与SEQ ID NO：12或13竞争结合到靶受体bc10的能力加以鉴定，所述靶受体bc10例如可以经纯化bc10或表达bc10的细胞(诸如经bc10转染的293T细胞)的形式提供。举例而言，如本文实例II中所述，可容易地证实与心脏脉管系统的选择性锚定。

基于bc10为肽SEQ ID NO：12和13的同源受体的发现，本发明提供选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子。在一实施例中，本发明提供特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)且为除抗体或其抗原结合片段外的分子的锚定分子。在另一实施例中，本发明提供特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)且为肽或肽模拟物的锚定分子。肽SEQ ID NO：12和13和其保守变异体在本文中是作为特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的分子而公开的。另外，下文进一步公开的筛检方法适用于鉴定其它锚定分子，其包括(但不限于)锚定肽和肽模拟物。

为方便起见，本文鉴定的5个靶受体HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白和bc10被统称为“心脏锚定受体”。

如上所述，本发明提供多种选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子。如本文所用，术语“分子”广泛用于意谓聚合或非聚合有机化学物，诸如小分子药物；核酸分子，诸如RNA、cDNA或寡核苷酸；肽或肽模拟物；或蛋白，诸如抗体或生长因子受体或其片段，诸如抗体的含抗原结合域的Fv、Fd或Fab片段。在一实施例中，分子为除抗体或其抗原结合片段外的有机化学物。在另一实施例中，分子为肽或肽模拟物。

如本文所用的术语“锚定分子”(homing molecule)意谓在活体内优先于大部分其它组织和脉管系统而选择性定位到心脏脉管系统的任何分子。类似地，术语“锚定肽”或“锚定肽模拟物”意谓在活体内优先于大部分其它组织和脉管系统而选择性定位到心脏脉管系统的肽或肽模拟物。

如本文关于分子所用的术语“选择性锚定”意谓在活体内与大部分其它组织或脉管系统相比优先定位到心脏脉管系统的锚定分子。选择性锚定的特征一般为与诸如大脑、肺、肾和肌肉的其它组织相比，心脏脉管系统中的定位至少高出两倍。锚定分子的特征可为与许多或大部分非肿瘤组织相比，与心脏脉管系统的优先定位是5倍、10倍、20倍或更多倍。应了解锚定分子除选择性锚定到心脏脉管系统外，还可部分地锚定到心脏外部的脉管系统或组织或锚定到心脏外部的小细胞群体。

如上所述，本发明的锚定分子特异性结合本发明的心脏锚定受体中的一种。如本文所用，术语“特异性结合”意谓经测量不同于非特异性相互作用的结合。举例而言，可通过测定与对照分子结合相比的分子结合来测量特异性结合，所述对照分子一般为不具有结合活性的具有类似结构的分子。如果锚定分子经测量对于经同源心脏锚定受体(HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白或bc10)转染的细胞具有比对于不表达同源受体的细胞更高的亲和力，那么也可表示特异性结合。举例而言，经测量更高的亲和力可为与对照细胞相比对于经同源受体转染的细胞的亲和力增加至少100倍、200倍、300倍、500倍或更多倍。举例而言，也可通过用已知受体结合分子进行的竞争抑制来证实结合特异性。

此外，如本文所用的术语特异性结合涵盖低和高亲和力特异性结合。举例而言，特异性结合可由具有至少约10^-4M的Kd的低亲和力锚定分子呈现。举例而言，如果心脏锚定受体具有一个以上的结合位点，那么具有低亲和力的锚定分子可用于靶向心脏脉管系统。特异性结合也可由高亲和力锚定分子(例如具有至少约10^-5M的Kd的锚定分子)呈现。举例而言，所述分子可具有至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、至少约10^-10M的Kd，或者可具有至少约10^-11M或10^-12M或更大的Kd。低和高亲和力锚定分子都适用且为本发明所涵盖。低亲和力锚定分子可用于靶向(但不限于)包括病毒和其它粒子的多价结合物。高亲和力锚定分子可用于靶向(但不限于)多价和单价结合物。

本文还提供并有至少两个各自选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的多价结合物。在特定实施例中，本发明的多价结合物包括至少10个或至少100个所述锚定分子。多种治疗剂适用于本发明的多价结合物，其包括(但不限于)噬菌体和下文进一步描述的其它治疗剂。在一实施例中，本发明提供多价结合物，其含有至少两个各自选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)、受体克隆9(SEQ ID NO：27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)、MpcII-3相关蛋白(SEQ ID NO：33)或bc10(SEQ IDNO：35)的锚定肽或肽模拟物。在另一实施例中，所述结合物含有至少10个各自选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)、受体克隆9(SEQ ID NO：27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)、MpcII-3相关蛋白(SEQ ID NO：33)或bc10(SEQ IDNO：35)的锚定肽或肽模拟物。在另一实施例中，本发明的结合物含有至少100个各自选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)、受体克隆9(SEQID NO：27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)、MpcII-3相关蛋白(SEQ ID NO：33)或bc10(SEQ ID NO：35)的锚定肽或肽模拟物。

在特定实施例中，本发明的多价结合物包括2个或2个以上、3个或3个以上、5个或5个以上、10个或10个以上、20个或20个以上、30个或30个以上、40个或40个以上、50个或50个以上、100个或100个以上、200个或200个以上、300个或300个以上、400个或400个以上、500个或500个以上或100个或100个以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)、受体克隆9(SEQ ID NO：27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)、MpcII-3相关蛋白(SEQ ID NO：33)或bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子。在一实施例中，锚定分子特异性结合同一心脏锚定受体。在另一实施例中，锚定分子具有相同的氨基酸序列。在另一实施例中，多价结合物包括具有不相同氨基酸序列的锚定分子。适用于并有多个锚定分子的本发明多价结合物中的部分包括(但不限于)噬菌体、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和其它病毒、细胞、脂质体、聚合基质、非聚合基质或粒子(诸如金粒子)、微型装置、毫微装置(nanodevice)和毫微级半导体材料。

举例而言，本发明的多价结合物可含有与至少两个各自选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)、受体克隆9(SEQ ID NO：27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)、MpcII-3相关蛋白(SEQ ID NO：33)或bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的脂质体或其它聚合基质。必要时，脂质体或其它聚合基质可与所述锚定分子中的至少10个或至少100个连接。举例而言，适用于所述多价结合物中的锚定分子可独立地包括氨基酸序列SEQ ID NO：1、2、7、8、9、11、12或13或所述序列的保守变异体或肽模拟物。例如，由磷脂或其它脂质组成的脂质体无毒、可为生理学上所接受并且是相对易于制造和投药的可代谢载体(Gregoriadis，Liposome Technology.第1卷(CRCPress，Boca Raton，FL(1984))。所属领域技术人员应了解，在本发明的多价结合物中，脂质体或其它聚合基质在必要时另外可包括另一组份，诸如(但不限于)治疗剂、抗血管生成剂、消炎剂或免疫抑制剂。

本发明提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的抗体或其抗原结合片段。本发明进一步提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。适用于本发明方法的抗体包括(但不限于)单克隆抗体和具有生物活性的抗体。当使用本发明方法将成分导向到心脏脉管系统时，成分可为(但不限于)可检测成分或治疗剂，诸如(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂或病毒载体。下文进一步描述成分和心血管疾病。

本发明也提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：27的抗体或其抗原结合片段来实现的。本发明另外提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其中对个体投与结合物，所述结合物含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：27的抗体或其抗原结合片段连接的成分，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。在本发明的所述方法中，抗体可为(但不限于)单克隆抗体或具有生物活性的抗体。当使用本发明方法将成分导向到心脏脉管系统时，成分可为(但不限于)可检测成分或治疗剂，诸如(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂或病毒载体。

本发明也提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的抗体或其抗原结合片段来实现的。另外，本文还提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。在本发明方法中，抗体可为(但不限于)单克隆抗体或具有生物活性的抗体。如上所述，当使用本发明方法将成分导向到心脏脉管系统时，成分可为(但不限于)可检测成分或治疗剂，诸如(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂或病毒载体。

本文进一步提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的抗体或其抗原结合片段来实现的。本发明也提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。适用于本发明方法的抗体包括(但不限于)单克隆抗体以及具有生物活性的抗体。在用于将成分导向到心脏脉管系统的本发明方法中，成分可为(但不限于)可检测成分或治疗剂，诸如(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂或病毒载体。

本发明另外提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的抗体或其抗原结合片段来实现的。本发明也提供将成分导向到个体的心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的抗体或其抗原结合片段连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。举例而言，可用单克隆抗体或具有生物活性的抗体实施本发明方法。在用于将成分导向到心脏脉管系统的本发明方法中，可使多种成分中的任一种与特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的抗体连接。所述成分包括(但不限于)可检测成分和治疗剂，诸如血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

如本文所用，术语“抗体”是以其最广泛的意义使用以包括多克隆和单克隆抗体，以及保留至少1×10⁵M^-1的对心脏锚定受体的结合活性的抗体多肽片段。所属领域技术人员应了解，选择性锚定到心脏脉管系统的抗体(包括(但不限于)Fab、F(ab′)2和Fv片段)可保留对心脏锚定受体的结合活性且因此包括于抗体定义中。另外，如本文所用的术语“抗体”涵盖特异性结合心脏锚定受体的非天然存在的通常至少含有一个VH和一个VL结构域的抗体和片段，诸如嵌合抗体、人源化抗体和单链Fv片段(scFv)。所述非天然存在的抗体可使用固相肽合成来构建、可重组产生或可(例如)通过使用(例如)下文所述的检定筛检噬菌体展示的文库或其它组合文库来获得，诸如那些由Borrebaeck(编辑)，Antibody Engineering(第2版)New York：Oxford University Press(1995)所述的可变重链和轻链组成的组合文库。

举例而言，也可使用HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白或bc10融合蛋白或编码一部分HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白或bc10的合成肽作为免疫原来制备选择性锚定到心脏脉管系统的抗体。所属领域技术人员应了解，可(例如)使用本文中作为SEQ ID NO：24、26、28、32和34所公开的核酸序列以重组方式产生的经纯化的人类、鼠科或其它HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白或bc10以及HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白或bc10的片段和肽部分可用作提高选择性锚定到心脏脉管系统的抗HLP/CRIP2、抗Sigirr/TIR8、抗MpcII-3相关蛋白或抗bc10抗体的免疫原。应了解适用于作为免疫原的HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白或bc10的片段包括(但不限于)用于产生抗体的片段。所属领域技术人员进一步了解，可通过使半抗原与诸如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)的载体分子偶合而使心脏锚定受体的非免疫原性片段或合成肽具有免疫原性。另外，举例而言，如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988)所述，多种其它载体分子和使半抗原与载体分子偶合的方法在所属领域中是众所周知的。

基于鉴别选择性锚定到心脏脉管系统的分子和其将经连接的治疗剂靶向心脏脉管系统的能力，本发明提供将成分靶向心脏脉管系统的方法和治疗心血管疾病的方法。举例而言，本发明提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。在本发明方法中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏，且其例如可为锚定肽或肽模拟物。在一实施例中，将成分靶向心脏脉管系统的本发明方法依赖含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。在另一实施例中，本发明方法依赖含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。适用于本发明中的锚定肽或肽模拟物可视情况在构形上受限。此外，多种成分中的任一种都可用于本发明方法中，所述成分包括(但不限于)可检测成分，诸如放射性核素和荧光分子。适用于本发明的成分进一步涵盖(但不限于)治疗剂，诸如血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本发明进一步提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：27的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。适用于本发明中的锚定分子可以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏，且其可为锚定肽或肽模拟物。应了解特异性结合SEQ ID NO：27的多种锚定分子中的任一种都可用于将成分靶向心脏脉管系统。所述锚定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物；和含有氨基酸序列CPKRPR(SEQ IDNO：6)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。适用于本发明的成分包括(但不限于)可检测成分，诸如放射性核素和荧光分子；以及治疗剂，诸如血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本文进一步提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。作为非限制性实例，适用于本发明方法中的锚定分子可以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏。作为另一非限制性实例，适用于本发明方法中的锚定分子可为锚定肽或肽模拟物。

多种特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子中的任一种都适用于本发明方法中，所述锚定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO：7)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物；含有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQID NO：8)或其保守变异体或肽模拟物的肽和肽模拟物；和含有氨基酸序列RGSSS(SEQID NO：9)或其保守变异体或肽模拟物的肽和肽模拟物。所述锚定肽和肽模拟物可为(但不限于)线性、环状或在构形上受限。此外，多种成分中的任一种都可用于依赖特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子的本发明方法中。所述成分包括(但不限于)可检测成分，诸如放射性核素和荧光分子；和治疗剂，诸如血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本发明进一步提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。作为非限制性实例，可用以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏的锚定分子或者用为肽或肽模拟物的锚定分子实施本发明方法。在一实施例中，用含有包括氨基酸序列CRSTRANPC(SEQID NO：11)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物的结合物实施本发明方法。在所述方法中，含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)的锚定肽或肽模拟物可视情况在构形上受限。多种成分中的任一种都可用于本发明方法中，所述成分包括(但不限于)可检测成分，诸如放射性核素和荧光分子；和治疗剂，诸如血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本文进一步提供在个体中将成分导向到心脏脉管系统的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的成分的结合物，从而将所述成分导向到心脏脉管系统。适用于本发明中的锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏，且其可为肽或肽模拟物。特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的多种锚定分子中的任一种都可用于本发明方法中。所述锚定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物；和含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQID NO：13)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。所述锚定肽和肽模拟物可用作线性、环状或以其它方式在构形上受限的结构。可用多种成分中的任一种来实施依赖于并入有特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的锚定分子的结合物的本发明方法。适用成分包括(但不限于)可检测成分，诸如放射性核素和荧光分子；以及治疗剂，诸如血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本发明也提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与含有治疗剂的结合物来实现的，所述治疗剂与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQID NO：25)的锚定分子连接结合物。在本发明的所述方法中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏，且其例如可为锚定肽或肽模拟物。特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的多种锚定分子中的任一种都可用于本发明方法中，所述锚定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物；和含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQID NO：2)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。适用于本发明中的锚定肽或肽模拟物可视情况在构形上受限。多种治疗剂中的任一种都可用于根据本发明方法治疗心血管疾病，所述治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本文进一步提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：27的锚定分子连接的治疗剂的结合物来实现的。适用于治疗心血管疾病的锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏。特异性结合SEQ ID NO：27的多种锚定分子中的任一种都可用于本发明方法中，所述锚定分子包括锚定肽或肽模拟物，诸如含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物；和含有氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO：6)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。多种治疗剂中的任一种都可用于根据本发明方法治疗心血管疾病。所述治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本文也提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的治疗剂的结合物来实现的。在本发明方法中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏。特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的多种锚定分子中的任一种都适用于本发明方法中，所述锚定分子包括(但不限于)锚定肽和肽模拟物。举例而言，所述锚定肽或肽模拟物可为具有氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO：7)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物；具有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQID NO：8)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物；或具有氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO：9)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。举例而言，适用于治疗心血管疾病的本发明方法中的锚定肽和肽模拟物可为线性、环状或在构形上受限。多种治疗剂中的任一种都可与本发明方法中特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接，所述治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本发明进一步提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子连接的治疗剂的结合物来实现的。作为非限制性实例，可用以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏的锚定分子或者用为肽或肽模拟物的锚定分子实施所述方法。在特定实施例中，使用包括氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物实施用于治疗心血管疾病的本发明方法。适用于本发明方法中的治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

本发明进一步提供治疗个体的心血管疾病的方法，其是通过对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合鼠科膀胱癌相关蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的治疗剂的结合物来实现的。适用于本发明中的锚定分子包括(但不限于)可以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏的锚定分子，例如(但不限于)锚定肽和肽模拟物。特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的多种锚定分子中的任一种都可用于根据本发明方法治疗心血管疾病。所述锚定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物；和含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO：13)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。如上所述，所述锚定肽和肽模拟物视情况可在构形上受限。适用于本发明方法中的治疗剂包括(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。

如下文进一步论述，本发明的结合物和方法可用于治疗多种心脏病和心血管疾病中的任一种。所述心脏病和心血管疾病包括(但不限于)冠状动脉病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎，其包括自体免疫性血管炎和病毒性血管炎，诸如多发性结节性动脉炎、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strass syndrome)、高安动脉炎(Takayasu′s arteritis)、川崎病(Kawasaki Disease)和立克次体血管炎(Rickettsialvasculitis)；动脉粥样硬化性动脉瘤(atherosclerotic aneurism)；心肌肥大；先天性心脏病(CHD)；缺血性心脏病和绞痛；后天瓣膜疾病/心内膜疾病；原发性心肌病，包括心肌炎；心律不齐；和移植排斥反应。欲根据本发明方法治疗的心脏病和心血管疾病进一步包括(但不限于)代谢性心肌病(诸如充血性、肥大性和限制性心肌病)和心脏移植。与本发明的锚定分子连接的治疗剂将集中在心血管中且可进一步在心肌中积累。因此，本发明的结合物和方法适用于治疗这些和其它心血管或心肌病症。

使用刺激新血管形成(血管生成)的治疗剂的以血管生成为基础的疗法可用于根据本发明方法治疗心血管疾病。血管生成剂可用于治疗(但不限于)缺血性心脏病，其包括慢性心肌缺血和急性心肌梗塞(Ware和Simons，Nature Med.3：158-164(1997))。患有严重血管疾病的许多并非机械血管再造的候选者的患者可受益于以血管生成为基础的疗法，包括那些因血管阻塞而难以旁通的患者、不具有导管的患者和由于并发疾病而并非外科手术候选者的患者。已计算出在美国有314,000,000例病例，且欧盟可能会受益于以血管生成为基础的疗法(Miller和Abrams，Gen.Engin.News18:1(1998))。因此，选择性锚定到心脏脉管系统的分子可与血管生成剂连接并传递给患者，从而刺激血管生成并缓解心血管疾病。

适用于本发明中的血管生成剂也可为天然存在的血管生成生长因子或细胞因子，其通过刺激内皮细胞生长或迁移而诱导或促进血管生成。适用于本发明中的血管生成剂涵盖(但不限于)血管内皮生长因子(VEGF)的异型体(isoform)，诸如VEGF-A，包括VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅；和成纤维细胞生长因子形式，包括(但不限于)FGF-1和FGF-2形式(Ruel和Sellke，Sem.Thor.Cardiovasc.Surg.15：222-235(2003))。如下文进一步论述，本发明的血管生成剂和其它治疗剂可以蛋白治疗剂形式或核酸治疗剂形式经由基因疗法载体传递。

另外被称为血管渗透因子(VPF)的VEGF-A也可用于本发明(Dvorak等人，Am.J. Pathol.146：1029-1039(1995)；Thomas等人，J.Bid.Chem.271：603-606(1996)；Olofsson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 93：2576-2581(1996)；Joukov等人，EMBOJ。15：290-298(1996)；和Harada等人，Am.J.Phvsiol.270：H1791-H1802(1996))。其它VEGF(B、C和D)具有血管生成活性但不能实现内皮渗透。编码VEGF的质粒DNA的转移已显示出会导致在支架植入之后血栓形成和内膜增厚的显著降低(J.Am.Coll.Cardiol.29：1371-1379(1997))。适用于本发明的血管生成剂包括(但不限于)VEGF的重组165kDa异型体，称为rhVEGF，其是由Genentech开发的；编码VEGF的121氨基酸异型体的核酸分子(BioByPass^TM；GenVec/Parke Davis)；和编码VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D的核酸。例如参看Miller和Abrams，上文，1998。

适用于本发明的血管生成剂也可为成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员，诸如FGF-1(酸性)、FGF-2(碱性)、FGF-4或FGF-5(Slavin等人，Cell Biol.Int.19:431-444(1995)；Folkman和Shing，J.Biol.Chem.267：10931-10934(1992))。举例而言，欲与本发明的结合物或方法中选择性锚定到心脏脉管系统的分子连接的FGF可为

(曲弗明(trafermin)，Scios，Inc.(Mountain View，CA)和Wyeth Ayerst Laboratories(Radnor，PA)正在开发的FGF-2的重组形式)或GENERXTM(由Collateral Therapeutics(San Diego，CA)和Schering AG开发的编码FGF-4的腺病毒基因疗法载体)(Miller和Abrams，上文，1998)。

适用于本发明的血管生成剂也可为血管生成素-1(angiopoietin-1)，即通过内皮细胞特异性Tie2受体酪氨酸激酶转导信号的血管生成因子(Davis等人，Cell87：1161-1169(1996))。同VEGF一样，血管生成素-1是正常血管发育所必需的，且其过度表达导致血管生成增加(Suri等人，Cell87：1171-1180(1996))。

适用于本发明的结合物或方法中的治疗剂也可为预防血栓形成的抗血栓形成剂，血栓是在细胞基本组份的捕集下血液因子、主要是血小板和血纤维蛋白的积聚物。通过存在粥样空斑来刺激血栓形成，且血栓形成是急性缺血性心脏病发作的主要原因。适用于本发明的抗血栓形成剂可为(但不限于)IIb/IIIa整合素(integrin)的抑制剂(Coller，Circulation92：2373(1995))；组织因子抑制剂；血纤维蛋白溶酶原活化因子或抗凝血酶剂。

免疫抑制剂也可适用于本发明的结合物和方法中，例如用于治疗心脏移植接受者。应了解免疫抑制剂可用于器官移植接受者通常需要全部寿命的慢性预防性治疗中，或者用于治疗展现一种或一种以上与移植排斥反应一致的症状的患者，或者用作严重排斥反应中的救援药剂(rescue agent)。适用于本发明的结合物和方法中的免疫抑制剂涵盖(但不限于)：类固醇，其包括皮质类固醇和泼尼松龙(prednisolone)；钙调蛋白(calcineurin)抑制剂，诸如Prograf、

、Rapamune、环孢霉素A(cyclosporine A)和其它环孢霉素；抗增殖剂，其包括Cellcept、Imuran(硫唑嘌呤(azathioprine))和CerticanTM(艾罗莫司(everolimus))；和治疗性单克隆抗体，诸如OKT3、ATGAM、抗胸腺细胞球蛋白(thymoglobulin/anti-thymocyte globulin)、地路奇单抗(dicluzimab)和巴利昔单抗(basiliximab)。这些和其它免疫抑制剂都可单独地或以与另一免疫抑制剂或其它治疗剂的组合形式用于本发明的结合物和方法中。

作为减少一种或一种以上炎症症状的分子的消炎剂也可用于本发明的结合物和方法中。所述消炎剂包括(但不限于)类固醇(包括皮质类固醇)和免疫球蛋白以及环氧化酶抑制剂和其它非类固醇消炎药物。在一实施例中，消炎剂为AGI-1067，即胆固醇降低性消炎剂(AtheroGenics；Atlanta，AL)。

抗心律不齐剂也可用于本发明的结合物和方法中，例如用于治疗心律失常，其为心脏的正常周期性和规律机电活性被破坏的病症。因此，在本发明的结合物或方法中，治疗剂可为抗心律不齐剂，诸如局部麻醉剂(I类药剂)、交感拮抗剂(II类药剂)、抗纤颤药剂(III类药剂)、钙通道药剂(IV类药剂)或阴离子拮抗剂(V类药剂)，例如，如Vukmir，Am.J.Emer.Med.13：459-470(1995)；Grant，PACE20：432-444(1-99-7)；Mann，Curr.Med.Res.Opin.13：325-343(1995)；或Lipka等人，Am，Heart J.130：632-640(1995)中所述。作为局部麻醉剂的抗心律不齐剂充当快速钠通道拮抗剂，诸如，抗心律不齐剂可为(但不限于)普鲁卡因胺(procainamide)、奎尼定(quinidine)或丙毗胺(disopyramide)；利多卡因(lidocaine)、苯妥英(phenytoin)、妥卡尼(tocainide)或美西律(mexiletine)；或恩卡胺(encainide)；氟卡尼(flecainide)；劳卡尼(lorcainide)；普萘洛尔(III)(propafenone(III))或莫雷西嗪(moricizine)(Vukmir，上文，1995)。抗心律不齐剂也可为交感拮抗剂(P-肾上腺素拮抗剂)，诸如(但不限于)心得安(propranolol)、艾司洛尔(esmolol)、美托洛尔(metoprolol)、阿替奈尔(atenelal)、醋丁洛尔(acebutolol)；或通过延长作用电位时程(action potential duration，APD)起作用的抗纤颤药剂，例如溴苄铵(bretylium)、胺碘酮(amiodarone)、索他洛尔(II)(sotalol(II))或N-乙酰普鲁卡因胺(N-acetylprocainamide)(Vukmir，上文，1995)。可用作本发明结合物或方法中的治疗剂的其它抗心律不齐剂包括(但不限于)钙通道药剂(诸如维拉帕米(verapamil)、地尔硫卓(diltiazem)和苄普地尔(bepridil))和阴离子拮抗剂(诸如烯丙尼定(alinidine))(Vukmir，上文，1995)。所属领域技术人员应了解，所属领域中已知的这些和其它抗心律不齐剂可为适用于在本发明的结合物或方法中治疗心律失常的治疗剂。

也被称为钙通道阻断剂(CBB)的钙拮抗剂在许多心血管疾病中具有有益作用，其充当平滑肌细胞增殖和迁移的有效抑制剂。使得这些治疗剂适用于治疗动脉粥样硬化和其它心血管疾病的其它特性包括其抑制钙流入血管壁的能力；减少胞外基质合成的能力；促进低密度脂蛋白的摄取和裂解的能力；保护脂蛋白免受氧化修饰的能力；维持内皮细胞功能的能力；和抑制血小板活化的能力。在钙拮抗剂中，氨氯地平(amlodipine)为具有血管选择性的治疗剂(Marche等人，Int.J.Cardiol.62(Suppl)：S17-S22(1997)；Schachter，Int.J.Cardiol.62(Suppl.)：S85-S9O(1997))。可用作适用于本发明的治疗剂的其它钙拮抗剂包括(但不限于)尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、心得安(propanolol)、硝酸异山梨酯(isosorbide dinitrate)、地尔硫卓(diltiazem)和伊拉地平(isradipine)(Nayler(编辑)Calcium Antagonists，第157-260页，London：Academic Press(1988)；Schachter，Int.J.Cardiol.62(增刊)：S9-S15(1997))。提高cAMP或cGMP含量的治疗剂会降低血管平滑肌细胞反应性或增殖，并且在与选择性锚定到心脏脉管系统的分子连接时也是适用的。所述治疗剂包括(但不限于)cAMP磷酸二酯酶抑制剂西洛他索(cilostasol)和来源于内皮的一氧化氮(NO)或一氧化氮产生性血管扩张剂。例如，参看Takahashi等人，J.Cardiovas.Pharm.20：900-906(1992)；和Cornwell等人，Am.J.Phvsiol.267：C1405-1413(1994)。

适用于本发明中的治疗剂也可为抗病毒剂或抗生素药剂。许多研究已报导心内膜炎、动脉粥样硬化和再狭窄与特定细菌和病毒感染、尤其是巨细胞病毒和肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的联系(Cheng和Rivera，Annals of Pharmacotherapy32：1310-1316(1998))。为预防性用于心脏移植物或具有发展动脉粥样硬化的高风险的其它患者中，可对患者投与含有与抗病毒剂(诸如更昔洛韦(ganciclovir))连接的选择性锚定到心脏脉管系统的分子的结合物。可包括在本发明的结合物或方法中的其它抗病毒剂包括(但不限于)利巴韦林(Ribavirin)(病毒唑(Virazole)，1-(3-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)和重组人类白细胞IFN-a A/D(Matsumori等人，Circulation71：834-839(1985)；Matsumori等人，J.Am.Coll.Cardiol.9：1320-1325(1987))。

所述结合物和方法也可用于治疗动脉粥样硬化，动脉粥样硬化与其后果结合组成西方世界疾病和死亡的最常见和最重要的起因。同其它阻塞性血管疾病一样，动脉粥样硬化的特征在于脂质、炎性细胞、血管平滑肌细胞和胞外基质蛋白在内皮内层与中间层之间的内膜空间中的异常积累(空斑形成)。特定而言，对内皮的损伤允许富含胆固醇的低密度脂蛋白(LDL)进入内膜。脂质被噬菌体摄入内膜中，同时经由摄取氧化LDL的受体无关性路径在内膜噬菌体中积累过量的脂质。噬菌体将脂质释放到内膜中并分泌刺激增殖的细胞因子。具有成肌纤维细胞特征的内膜细胞分泌胶原，从而引起空斑在一些情况下变得纤维化。由于病变发展，因此存在基质的压迫性萎缩，且弹性薄层受到破坏。进一步胶原沉积会形成空斑(纤维脂质空斑)的致密纤维帽，其含有游离脂质以及巨噬细胞中的脂质。空斑的脆弱内皮通常溃烂，从而允许血小板积聚和血栓形成。诸如血小板来源生长因子的生长因子通过刺激细胞增殖而引起进一步空斑发展。

内膜平滑肌细胞增殖的增加引起肌内膜增生(myointimal hyperplasia)和内腔变窄(luminal narrowing)。在新生内膜形成中起作用的异常细胞增殖可由诸如血小板来源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)或血管紧张素II的特异性生长因子引起(Ross，Annu.Rev.Physiol.57：791(1995)；Schwartz等人，Circ.Res.77：445(1995)；和Gibbons和Dzau，New Eng.J.Med.330：1431(1994))。

适用于在本发明的结合物和方法中治疗心血管疾病(诸如血管成形术后的内膜增生)的治疗剂可为生长抑制剂，其通过限制新生内膜平滑肌细胞增殖来减少或预防血管疾病。举例而言，疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因和全身性更昔洛韦可用于杀死增殖细胞并限制新生内膜形成。在一项研究中，用编码tk的腺病毒载体感染猪髂股动脉，并且在暴露于更昔洛韦后，在气囊损伤后所看到的新生内膜增厚减少50-87％(Ohno等人，Science，265：781-784(1994)；也参看Guzman等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA91：10732-10736(1994)；Chang等人，Mol.Med1：172-181(1995)；和Simari等人，Circulation92：1-501(1995))。因此，适用于本发明中的治疗剂可为细胞生长抑制剂，诸如(但不限于)胸苷激酶与更昔洛韦的组合。

用于限制新生内膜形成的其它治疗剂在所属领域中也是已知的且包括抑制细胞周期蛋白和原癌基因的基因(Simari和Nabel，Semin.Intervent.Cardiol.1：77-83(1996))。所述治疗剂包括(但不限于)肿瘤抑制基因(诸如p53和成视网膜细胞瘤)以及编码bcl-x、ras的突变体形式和一氧化氮合成酶的基因。作为非限制性实例，成视网膜细胞瘤基因产物(Rb)抑制许多哺乳动物细胞类型中的细胞增殖，且编码活性Rb的重组腺病毒转移到受伤大鼠颈动脉和猪髂动脉中会降低新生内膜形成(Chang等人，Science267:518-522(1994))。已类似地显示p53的基因转移会抑制血管平滑肌细胞增殖(Yonemitsu等人，Circ.Res.82：147-156(1998)；也参看Muller，Prog.Cardiovas.Pis.40：117-128(1997))。显性负ras变异体的直接基因转移也抑制大鼠颈动脉和猪髂股模型中气囊损伤后的内膜发育(Chang等人，J.Clin.Invest.96：2260-2268(1995))。在大鼠颈动脉损伤模型中，一氧化氮成酶的基因转移也限制内膜形成(von der Leyen等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA92：1137-1141(1995))。所属领域技术人员应了解，细胞生长抑制剂也可用作本发明的结合物或方法中的治疗剂。

对抗细胞目标(诸如E2F或各种细胞周期素之一)的诱捕或反义寡核苷酸也可为适用于在本发明方法中限制新生内膜增殖的治疗剂(Morishita等人，Circ.Res.82：1023-1028(1998)；和Mann等人，Circul ati on96：1-41997))。在活体内血管损伤后于血管平滑肌细胞中快速下调的生长遏制同源异形盒(homeobox)基因gax也可为适用于抑制内膜增生的治疗剂(Smith等人，Genes Dev.11：1674-1689(1997)；和Skopicki等人，Circ.Res.80：452-462(1997))。可用于在本发明的结合物或方法中限制内膜增生的其它治疗剂在所属领域中也是已知的(例如参看Laitinen和Yla-Herttuala，Current Opin.Lipid9：465-469(1998))。

本发明的结合物或方法也可用于治疗再狭窄，再狭窄为可能在血管成形术之后发生的内腔尺寸的再度变窄，血管成形术是将气囊插入受阻血管中、然后充气以使变窄区域扩大的程序。经过3到6个月的时程在约30到50％的病例中发生再狭窄，且其包括新生内膜内的细胞增生、血管壁内的血栓组建和总体血管尺寸的收缩。血管成形术剥除通常产生血管平滑肌迁移和增殖的旁分泌抑制剂的内皮细胞的血管。

一氧化氮缺乏与血管舒张受损和粘附性增加相联系，从而使血管组织易于形成动脉粥样硬化病变(Gibbons和Dzau，Science272：689-693(1996))。适用于本发明的结合物和方法中的治疗剂包括(但不限于)内皮细胞型一氧化氮(NO)合酶药剂，其为增强一氧化氮合酶活性的药剂。所述增强一氧化氮(NO)活性的治疗剂涵盖(但不限于)一氧化氮合酶基因和一氧化氮供体药物。在新生内膜形成大鼠模型中将一氧化氮合酶基因转染到气囊损伤后的血管壁中会导致产生一氧化氮并实质上抑制新生内膜形成所必需的细胞增殖、迁移和基质产生(von der Leyen等人，上文，1995)。临床研究也表明一氧化氮供体药物可用于增加一氧化氮活性并治疗再狭窄(Ferguson，Circulation90：4(1994))。

本发明的结合物和方法也可用于治疗充血性心力衰竭(CHF)，其为仅在美国就影响近五百万人的病症。当心脏由于动脉粥样硬化或诸如高血压、心肌梗塞或有缺陷心脏瓣膜的其它病状而受到破坏时，引起充血性心力衰竭。失效的心脏无法有效工作，从而引起体液潴留(fluid retention)、呼吸急促和疲劳。因此，为治疗充血性心力衰竭，可将选择性锚定到心脏脉管系统的分子与诸如(但不限于)TNF抑制剂(诸如重组可溶性TNF诱捕受体Embrel^TM(Immunex Corp.；Seattle，WA))的治疗剂连接。

作为使血管收缩的多肽的内皮素在充血性心力衰竭中也升高。因此，可将选择性锚定到心脏脉管系统的本发明分子与作为内皮素抑制剂(例如小分子药物TBC11251)的治疗剂连接。由Texas Biotechnology Corp.研发的这种药物会抑制内皮素A受体结合，并促进平滑肌细胞的松弛。TBC11251已导致患有中度到严重充血性心力衰竭的患者的显著改善(Potera，Gen.Enein.News18：12(1998))。

用于本发明的结合物或方法中的治疗剂也可为遗传性心脏病的替换基因疗法载体。例如，所述遗传性疾病可为心肌的遗传性疾病，诸如X连接的扩张型心肌病(X-linkeddilated cardiomyopathy)、肥大性心肌病、长QT综合症(Long QT Syndrome)或引起疾病的突变尚未确定的另一疾病(Bowles等人，Cardiovas.Res.35：422-430(1997))。在一个实施例中，用与腺病毒基因疗法载体连接的选择性锚定到心脏脉管系统的分子实施本发明的结合物或方法，所述载体含有编码所要替换基因产物的核酸分子。

举例而言，治疗剂可如Harada等人，J.Clin.Invest.94：623-630(1994)中所述以蛋白形式传递。微球体(例如，经由SO₃残余物可逆吸附诸如bFGF等血管生成因子的7μm直径的微球体)也可与选择性锚定到心脏脉管系统的分子连接以选择性传递用于治疗心血管疾病的微球体。所述微球体留在周围微循环中而不会干扰总流量并经一周时期缓慢释放(Arras等人，NatureBiotech.16：159-162(1998)；也参看Tice和Staas，Nature Biotech.16：134(1998))。单独注入生物可降解的微球体可用于传递血管生成剂或其它治疗剂，其在注入后经一或数月释放，药物释放的速率和持续时间由诸如聚合物类型和微粒大小等因素控制(Maulding，Controlled Release6：167-176(1987)；Tice和Tabibi，第315-339页，Kydonieus(编辑)，Treatise on Controlled Drug DeliveryMarcel Dekker，New York(1992))。基因疗法载体也可与选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子连接以传递编码血管生成剂或其它治疗剂的核酸分子(例如参看Isner等人，Lancet348：370-374(1996)；Giordano等人，Nature Med.2：534-539(1996))。

在所属领域中已知用于在本发明方法中治疗心脏病或心血管疾病的多种合适的基因疗法(例如参看Li等人，Cardiol.41：39-46(1997))。作为非限制性实例，包括反转录病毒载体和腺病毒载体的病毒载体在与选择性锚定到心脏脉管系统的分子连接时可用于基因传递。所述基因疗法载体可包括编码治疗剂的核酸分子，所述治疗剂诸如(但不限于)血管生成剂，诸如VEGF或FGF。举例而言，如Sylven，Drugs of Today38：819-827(2002)；Symes，J.Card.Sure.15：283-290(2000)；和Grines等人，Am.J.Cardiol.92(增刊)：24N-31N(2003)中所述，具有VEGF、FGF和其它血管生成剂形式的基因疗法在所属领域中众所周知。具有无法复制的血清型5腺病毒的血管生成基因疗法在具有慢性稳定型心绞痛的人类体内的安慰剂控制试验中具有有益作用，在所述腺病毒中E1A和E1B基因已在巨细胞病毒启动子的控制下经人类成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)基因替换(Grines等人，上文，2003)。也参看Simari和Nabel，上文，1996；和Indolfi和Chiariello，Cardiologia43：365-373(1998))。因此，在一实施例中，本发明方法依赖于表达治疗基因产物的复制缺陷型重组腺病毒载体。

鉴于上文，应了解多种治疗剂适用于根据本发明方法治疗心血管疾病。适用的治疗剂涵盖(但不限于)血管生成剂、抗血栓形成剂、消炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素药剂、抗病毒剂和病毒载体。所属领域技术人员应了解，在并入本发明的结合物或方法中时，可将这些和额外已知或其它治疗剂选择性导向到心脏脉管系统。此外，心脏病学领域的技术人员应了解，这些和其它治疗剂都可在本发明的结合物和方法中单独或一起使用。应进一步了解，本发明的结合物可含有所述治疗剂中的一种或一种以上并且其它组份可视情况包括在本发明的结合物中。作为实例，在一些情况下，可能需要在锚定分子与治疗剂之间利用寡肽间隔物。例如参看Fitzpatrick和Garnett，Anticancer Drug Design10：1-9(1995)。

应进一步了解多种投药途径适用于本发明方法中。所述途径涵盖全身和局部投药且包括(但不限于)经口投药、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射、经皮扩散或电泳、局部注射和缓释传递装置(包括局部植入的缓释装置，诸如可生物腐蚀或以储集层为基础的植入物)。

本发明进一步提供在个体中显影心脏脉管系统的方法，其是通过下列步骤实现的：对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的锚定分子连接的可检测成分的结合物；并检测结合物。在显影心脏脉管系统的本发明方法中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏，且其例如可为锚定肽或肽模拟物。特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的多种锚定分子可用于根据本发明方法显影心脏脉管系统。所述锚定分子涵盖(但不限于)含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物，和含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。多种可检测成分适用于上述本发明方法中，所述成分例如包括放射性核素和顺磁离子。

本文进一步提供在个体中显影心脏脉管系统的方法，其是通过下列步骤实现的：对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：27的锚定分子连接的可检测成分的结合物；并检测结合物。在显影心脏脉管系统的本发明方法中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏。特异性结合SEQ ID NO：27的多种锚定分子可用于根据本发明方法显影心脏脉管系统。所述锚定分子涵盖(但不限于)锚定肽或肽模拟物，诸如含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物，和含有氨基酸序列CPKRPR(SEQID NO：6)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽或肽模拟物。多种可检测成分适用于显影心脏脉管系统，所述成分例如包括放射性核素和顺磁离子。

本发明另外提供在个体中显影心脏脉管系统的方法，其是通过下列步骤实现的：对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子连接的可检测成分的结合物；并检测结合物。在本发明的显影方法中，锚定分子可以(例如)相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏。此外，多种特异性结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的锚定分子中的任一种都适用于根据本发明方法显影心脏脉管系统，所述锚定分子包括(但不限于)具有氨基酸序列CKRAVR(SEQID NO：7)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物；具有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQ ID NO：8)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物；和具有氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO：9)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。应认识到，适用于本发明的显影方法中的锚定肽和肽模拟物例如可为线性、环状或在构形上受限。适用于显影的可检测成分包括(但不限于)放射性核素和顺磁离子。

本文进一步提供在个体中显影心脏脉管系统的方法，其是通过下列步骤实现的：对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合SEQ ID NO：33的锚定分子连接的可检测成分的结合物；并检测结合物。作为非限制性实例，可用以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏的锚定分子或者用作为肽或肽模拟物的锚定分子实施本发明的显影方法。适用于本发明的显影方法的锚定分子包括(但不限于)锚定肽和肽模拟物，诸如具有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。可用包括(例如)放射性核素和顺磁离子的多种可检测成分中的任一种实施显影心脏脉管系统的本发明方法。

本文也提供在个体中显影心脏脉管系统的方法，其是通过下列步骤实现的：对个体投与含有与选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合鼠科膀胱癌相关蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO：35)的锚定分子连接的可检测成分的结合物；并检测结合物。适用于根据本发明方法显影的锚定分子包括(但不限于)可以相对于非重组噬菌体至少5倍的选择性在活体内锚定到心脏的锚定分子。特异性结合bc10(SEQ ID NO：35)的多种锚定分子中的任一种都可用于根据本发明方法显影心脏脉管系统，所述锚定分子包括锚定肽和肽模拟物，诸如含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物，和含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO：13)或其保守变异体或肽模拟物的锚定肽和肽模拟物。适用于本发明中的锚定肽和肽模拟物可以线性、环状或构形上受限的形式使用。如上所述，适用于显影的可检测成分包括(但不限于)放射性核素和顺磁离子。

本发明的显影方法依赖可检测成分。如本文所用，术语“可检测成分”是指可在活体内投药并随后检测的任何分子。适用于本发明的结合物和显影方法中的示范性可检测成分包括顺磁离子、放射性核素和荧光分子。示范性放射性核素包括铟-111、锝-99、碳-11和碳-13。荧光分子包括(但不限于)荧光素(fiuorescein)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)、藻红蛋白(phycoerythrin)、若丹明(rhodamine)和德州红(Texas red)。当可检测成分为发射伽玛射线的放射性核素(诸如铟-113、铟-115或锝-99)时，可在投与个体后使用固态闪烁检测器使结合物显现。

本文还提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使HLP/CRIP2或其片段与分子文库在适于使分子与HLP/CRIP2特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上HLP/CRIP2结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2的锚定分子。在细胞表面表达HLP/CRIP2的细胞以及经纯化HLP/CRIP2或其片段可用于本发明的筛检方法中。作为非限制性实例，HLP/CRIP2的天然、重组、人类、鼠科(SEQ ID NO：25)和其它变异体和同系物和其片段(诸如(但不限于)经纯化或在细胞表面表达的HLP/CRIP2的CRPPR(SEQ ID NO：1)或CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)结合片段)可用于本发明的筛检方法中。可根据本发明方法筛检的文库包括(但不限于)肽和肽模拟物文库、小分子文库和抗体和其抗原结合片段文库(包括合成单链或其它抗体文库)。在一实施例中，本发明方法包括另一在静脉内注射后检定一种或一种以上所分离的文库分子的定位的步骤。当使用HLP/CRIP2的片段替代全长HLP/CRIP2时，应了解所述片段可为(但不限于)特异性结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的片段。

多种HLP/CRIP2多肽中的任一种都可用于本发明方法中以分离选择性锚定到心脏脉管系统的分子。如本文所用，术语“HLP/CRIP2”意谓在心脏脉管系统中选择性表达并与SEQ ID NO：25具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定实施例中，HLP/CRIP2与SEQ ID NO：25具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。

本发明进一步提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使受体克隆9或其片段与分子文库在适于使分子与受体克隆9特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上受体克隆9结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合受体克隆9的锚定分子。可用在细胞表面表达受体克隆9的细胞以及经纯化受体克隆9或其片段实施本发明方法。作为非限制性实例，受体克隆9(SEQ ID NO：27)的天然、重组、人类、鼠科(SEQ ID NO：27)和其它变异体和同系物和其片段(诸如(但不限于)经纯化或在细胞表面表达的受体克隆9的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6结合片段)可用于本发明的筛检方法中。可根据本发明方法筛检多种文库中的任一种，其包括(但不限于)上文所述的文库。

如本文所用，术语“受体克隆9”意谓在心脏脉管系统中选择性表达并与SEQ ID NO：27具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定实施例中，受体克隆9与SEQ ID NO：27具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。

本发明还提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使Sigirr/TIR8或其片段与分子文库在适于使分子与Sigirr/TIR8特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上Sigirr/TIR8结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合Sigirr/TIR8的锚定分子。在细胞表面表达Sigirr/TIR8的细胞以及经纯化Sigirr/TIR8或其片段可用于本发明的筛检方法中。作为非限制性实例，Sigirr/TIR8的天然、重组、人类、鼠科(SEQ ID NO：29)和其它变异体和物种同系物和其片段(诸如(但不限于)经纯化或在细胞表面表达的SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8结合片段)可用于本发明的筛检方法中。应进一步了解，如上所述，多种文库中的任一种都可用于本发明的筛检方法中。

如本文所用，术语“Sigirr/TIR8”意谓在心脏脉管系统中选择性表达并与SEQ ID NO：29具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定实施例中，Sigirr/TIR8与SEQ ID NO：29具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。

本文进一步提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使MpcII-3相关蛋白或其片段与分子文库在适于使分子与MpcII-3相关蛋白特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上MpcII-3相关蛋白结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合MpcII-3相关蛋白的锚定分子。举例而言，可用在细胞表面表达MpcII-3相关蛋白的细胞或经纯化MpcII-3相关蛋白或其片段实施本发明的筛检方法。作为非限制性实例，MpcII-3相关蛋白的天然、重组、人类、鼠科(SEQ ID NO：33)和其它变异体和物种同系物以及SEQ ID NO：33或人类或其它MpcII-3相关蛋白的片段(包括(但不限于)经纯化或在细胞表面表达的CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)结合片段)可用于本发明的筛检方法中。本发明方法可用于筛检多种文库中的任一种，诸如(但不限于)肽和肽模拟物文库、小分子文库和抗体或其抗原结合片段文库(包括合成单链或其它抗体文库)。

如本文所用，术语“MpcII-3相关蛋白”意谓在心脏脉管系统中选择性表达并与SEQID NO：33具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定实施例中，MpcII-3相关蛋白与SEQID NO：33具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。

本发明进一步提供分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统的锚定分子的方法，其是通过下列步骤实现的：使bc10或其片段与分子文库在适于使分子与bc10特异性结合的条件下接触；检定特异性结合；并从文库中分离一种或一种以上bc10结合分子，从而分离一种或一种以上选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合bc10的锚定分子。在细胞表面表达bc10的细胞以及经纯化bc10或bc10片段可用于本发明的筛检方法中。作为非限制性实例，bc10的天然、重组、人类、鼠科(SEQ ID NO：35)以及变异体和其它物种同系物和其片段(包括(但不限于)经纯化或在细胞表面表达的SEQ ID NO：12结合片段或SEQ ID NO：13结合片段)可用于本发明的筛检方法中。本发明方法可用于筛检上述多种文库中的任一种。

如本文所用，术语“bc10”意谓在心脏脉管系统中选择性表达并与SEQ ID NO：35具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定实施例中，bc10与SEQ ID NO：35具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。

本发明进一步提供多种分离肽和肽模拟物，其例如可用于构建本发明的结合物，或者当肽自身具有生物活性时，可以未结合形式用作治疗如上所述的任何心血管疾病或心肌病的治疗剂。例如，如Ruoslahti，Nat.Rev.Cancer2：83-90(2002)，和Laakkonen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：9381-9386(2004)中所述，其它具有生物活性的锚定肽在所属领域中是已知的。作为一实例，本发明提供具有少于60个残基的长度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供具有少于60个残基的长度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)的分离肽。包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO：1)的本发明的分离肽或肽模拟物例如可具有少于40个残基的长度或少于20个残基的长度。

本发明进一步提供包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ ID NO：14)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ ID NO：14)的分离肽。例如，本发明的分离肽或肽模拟物可在构形上受限且可包括氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)。在其它实施例中，包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ IDNO：14)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物具有少于100个残基的长度、少于60个残基的长度或少于20个残基的长度。在另一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列CXGRKSKTVZC(SEQ ID NO：15)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本发明另外提供具有少于150个残基的长度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供具有少于150个残基的长度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)的分离肽。包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO：5)的本发明的分离肽和肽模拟物可具有(但不限于)少于100个残基、少于60个残基或少于20个残基的长度。

本文还提供具有少于50个残基的长度且包括氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO：6)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供具有少于50个残基的长度且包括氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO：6)的分离肽。包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的本发明的分离肽和肽模拟物可具有多种长度，其包括(但不限于)少于40个残基的长度或少于20个残基的长度。

本发明另外提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO：7)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO：7)的分离肽。包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO：7)的本发明的肽或肽模拟物可具有(但不限于)少于100个残基的长度、少于60个残基的长度或少于20个残基的长度。

本发明进一步提供包括氨基酸序列RNSWKPN(SEQ ID NO：16)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列RNSWKPN(SEQ ID NO：16)的分离肽。作为非限制性实例，本发明的分离肽或肽模拟物可在构形上受限且可具有少于100个残基的长度、少于60个残基的长度或少于20个残基的长度。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列CXRNSWKPNZC(SEQ ID NO：17)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本文进一步提供包括氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO：9)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO：9)的分离肽。在其它实施例中，含有氨基酸序列SEQ ID NO：9的本发明的分离肽或肽模拟物具有少于100个残基的长度、少于60个残基的长度或少于20个残基的长度。

本发明还提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列RSTRANP(SEQ ID NO：18)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。举例而言，本发明提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列RSTRANP(SEQ ID NO：18)的分离肽。作为非限制性实例，本发明的分离肽或肽模拟物可在构形上受限。作为另一非限制性实例，本发明的分离肽或肽模拟物可包括氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)。本发明的分离肽或肽模拟物进一步可具有多种长度中的任一种。作为非限制性实例，本发明的分离肽或肽模拟物可具有少于100个残基、少于60个残基或少于20个残基的长度。在一实施例中，本发明的分离肽或肽模拟物包括氨基酸序列CXRSTRANPZC(SEQ ID NO：19)或其肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本发明另外提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列PKTRRVP(SEQ IDNO：20)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列PKTRRVP(SEQ ID NO：20)的肽。本发明的分离肽或肽模拟物例如可在构形上受限且可包括氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)。在特定实施例中，含有氨基酸序列SEQ ID NO：20的本发明的分离肽或肽模拟物具有少于100个残基、少于60个残基或少于20个残基的长度。在另一实施例中，分离肽或肽模拟物包括氨基酸序列CXPKTRRVPZC(SEQ ID NO：21)或其肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本文进一步提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列SGMARTK(SEQ IDNO：22)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物。在一实施例中，本发明提供具有少于400个残基的长度且包括氨基酸序列SGMARTK(SEQ ID NO：22)的肽。在另一实施例中，本发明的分离肽或肽模拟物在构形上受限。在另一实施例中，本发明的分离肽或肽模拟物包括氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO：13)。本发明的分离肽或肽模拟物进一步可具有多种长度中的任一种。作为非限制性实例，具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的本发明的分离肽或肽模拟物可具有少于100个残基、60个残基或20个残基的长度。在一实施例中，本发明提供包括氨基酸序列CXSGMARTKZC(SEQ ID NO：23)或其肽模拟物的分离肽或肽模拟物，其中X＝0到20个独立选择的残基且Z＝0到20个独立选择的残基。

本发明的肽和肽模拟物是以经分离形式提供的。如本文关于本发明的肽或肽模拟物所用，术语“分离的”意谓肽或肽模拟物是呈相对不含通常在细胞中与肽或肽模拟物相关或在文库或粗制剂中与肽或肽模拟物相关的物质(诸如污染性多肽、脂质、核酸和其它细胞物质)的形式。

因此，本发明提供包括如下文公开的构形上受限、双功能和多价肽和肽模拟物的肽和肽模拟物。如本文所用，术语“肽”广义上用于意谓肽、蛋白、蛋白片段等。如本文所用的术语“肽模拟物”意谓具有作为结构基础的肽的活性的肽样分子。所述肽模拟物包括经化学修饰的肽、含有非天然存在的氨基酸的肽样分子和类肽，且具有活性，诸如获得肽模拟物的肽的选择性锚定活性(例如参看Goodman和Ro，Peptidomimetics for Drug Design，″Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery″第1卷(M.E.Wolff编辑；JohnWiley&Sons1995)，第803-861页)。

多种肽模拟物在所属领域中是已知的且涵盖于本发明内，所述肽模拟物例如包括含有受限氨基酸、模拟肽二级结构的非肽组份或酰胺键等排体(amide bond isostere)的肽样分子。例如，含有受限的非天然存在的氨基酸的肽模拟物包括α-甲基化氨基酸；α，α-二烷基甘氨酸或α-氨基环烷烃羧酸；Nα-Cα环化氨基酸；Nα-甲基化氨基酸；β-或γ-氨基环烷烃羧酸；α，β-不饱和氨基酸；β，β-二甲基或β-甲基氨基酸；β-经取代-2，3-亚甲基氨基酸；N-C^δ或C^α-C^δ环化氨基酸；经取代脯氨酸或另一氨基酸模拟物。例如，模拟肽二级结构的肽模拟物可含有非肽β转角模拟物、γ转角模拟物、β折叠结构的模拟物或螺旋结构的模拟物，其各自在所属领域中众所周知。肽模拟物也可为例如含有酰胺键等排体的肽样分子，所述酰胺键等排体例如逆反式修饰(retro-inverso modification)；经还原的酰胺键；亚甲基硫醚或亚甲基亚砜(methylene-sulfoxide)键；亚甲基醚键；亚乙基键；硫代酰胺键；反式烯烃或氟代烯烃键；经1，5-二取代的四唑环；亚甲基酮(ketomethylene)或氟代亚甲基酮键或另一酰胺等排体。所属领域技术人员应了解这些和其它肽模拟物都涵盖于如本文所用的术语“肽模拟物”的含义中。

鉴别肽模拟物的方法在所属领域中众所周知且(例如)包括筛检含有潜在肽模拟物文库的数据库。举例而言，剑桥结构数据库(Cambridge Structural Database)含有超过300,000种具有已知晶体结构的化合物的集合(Allen等人，Acta Crystallo gr.章节B，35：2331(1979))。由于新的晶体结构得到确定，所以这一结构存放库不断更新，且可在其中筛检具有合适形状(例如与本发明的肽相同的形状)以及与同源受体的潜在几何和化学互补性的化合物。当无法获得本发明的肽的晶体结构时，可使用例如程序CONCORD产生结构(Rusinko等人，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))。另一种数据库化学品目录数据库(Available Chemicals Directory)(Molecular Design Limited，InformationsSystems；San Leandro CA)含有约100,000种市面有售的化合物，且也可进行搜寻以鉴别本发明的肽的潜在肽模拟物，例如在选择性锚定到心脏脉管系统中具有活性的肽模拟物。

包括下文所述的构形上受限、双功能和多价肽和肽模拟物的本发明的肽和肽模拟物可具有多种长度。例如，本发明的肽或肽模拟物可具有少于6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70或80个残基的相对短的长度。本发明的肽或肽模拟物也可用于如下文进一步描述的显著较长的序列的情形中。如本文所用，术语“残基”是指氨基酸或其类似物。应了解，例如含有氨基酸序列SEQ ID NO：1的肽包括并未由其它氨基酸分隔的连续序列形式的指定氨基酸。

本发明的分离肽或肽模拟物可为(但不限于)环状或在构形上受限。如本文关于分子所用，术语“在构形上受限”意谓三维结构随时间实质上维持成一种空间排列的分子，诸如肽或肽模拟物。构形上受限的分子可具有改进的特性，诸如增加的亲和力、代谢稳定性、膜渗透性或可溶性。构形限制方法在所属领域中众所周知且包括(但不限于)环化。

如本文关于肽或肽模拟物所用，术语环状是指在两个非邻近氨基酸或氨基酸类似物之间包括分子内键的结构。可经由共价或非共价键实现环化。分子内键包括(但不限于)主链与主链、侧链与主链和侧链与侧链的键。环化方法包括(但不限于)在非邻近氨基酸或氨基酸类似物的侧链之间形成二硫键；形成内酰胺键，例如在一个氨基酸或其类似物的侧链基团与氨基端残基的N端胺之间；和形成赖氨酸正亮氨酸键和二酪氨酸键。

本发明也提供含有作为(例如)CRPPR(SEQ ID NO：1)、CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)、CARPAR(SEQ ID NO：5)、CPKRPR(SEQ ID NO：6)、CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO：8)、RGSSS(SEQ ID NO：9)、CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)、CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)或CSGMARTKC(SEQ ID NO：13)序列的保守变异体的氨基酸序列的分离肽或肽模拟物。在特定实施例中，本发明提供含有作为SEQ ID NO：1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的保守变异体(其中准确来说只有一个氨基酸经保守取代)的氨基酸序列的分离肽或肽模拟物。在其它实施例中，本发明提供含有作为SEQID NO：1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的保守变异体(其中准确来说有两个氨基酸经保守取代)的氨基酸序列的分离肽或肽模拟物。在其它实施例中，本发明提供含有作为SEQ ID NO：1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的保守变异体(其中准确来说有三、四或五个氨基酸经保守取代)的氨基酸序列的分离肽或肽模拟物。

如本文所用，“保守变异体”为第一氨基酸经具有至少一种类似生化特性的第二氨基酸或氨基酸类似物替换的氨基酸序列，所述类似生化特性例如可为类似大小、变化、疏水性或氢键合能力。举例而言，第一疏水性氨基酸可经诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸或其类似物的第二(不相同)疏水性氨基酸保守取代。类似地，第一碱性氨基酸可经诸如精氨酸或赖氨酸或其类似物的第二碱性氨基酸保守取代。同样地，第一酸性氨基酸可经诸如天冬氨酸或谷氨酸或其类似物的第二酸性氨基酸保守取代，或者诸如苯丙氨酸的芳香族氨基酸可经诸如酪氨酸的第二芳香族氨基酸或氨基酸类似物保守取代。

如本文所公开，选择性锚定到心脏脉管系统的肽或肽模拟物可在显著较长的序列的情形下保持锚定活性。举例而言，5-mer CRPPR(SEQ ID NO：1)在与噬菌体外壳蛋白融合时保持锚定能力，从而证实本发明的肽在埋入较大蛋白序列后可具有选择性锚定活性。因此，本发明提供含有与异源蛋白融合的本发明的肽或肽模拟物的嵌合蛋白。在某些实施例中，本发明提供含有与异源蛋白融合的选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2、受体克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白或bc10的锚定肽或肽模拟物的嵌合蛋白。适用于本发明中的异源蛋白包括(但不限于)具有作为抗体或其抗原结合片段的治疗活性的异源蛋白。在其它实施例中，本发明提供其中含有氨基酸序列SEQ ID NO：1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的肽或肽模拟物或这些序列中之一序列的保守变异体或肽模拟物与异源蛋白融合的嵌合蛋白。如本文关于与本发明的肽或肽模拟物融合的蛋白所用的术语“异源”意谓来源于除编码融合肽的基因或获得融合肽模拟物的来源以外的来源的蛋白。本发明的嵌合蛋白可具有多种长度，其包括(但不限于)至多100、200、300、400、500、800、1000或2000个残基。

本文进一步提供双功能肽，其含有与具有独立功能的第二肽融合的选择性锚定到心脏脉管系统且特异性结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)、受体克隆9(SEQ ID NO：27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)、MpcII-3相关蛋白(SEQ ID NO：33)或bc10(SEQ ID NO：35)的锚定肽。所述双功能肽具有由不同的肽成分所赋予的至少两种功能，且例如可展示除选择性锚定活性之外的促细胞凋亡活性。

本发明进一步提供包括至少两个各自独立结合HLP/CRIP2(SEQ ID NO：25)的基序的分离多价肽或肽模拟物。例如，所述多价肽或肽模拟物可具有至少两个各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其保守变异体或肽模拟物的基序。例如，多价肽或肽模拟物可具有所述基序中的至少三个、至少五个或至少十个，其各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其保守变异体或肽模拟物。在特定实施例中，多价肽或肽模拟物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸序列SEQID NO：1或SEQ ID NO：2或其保守变异体或肽模拟物的相同或不相同的基序。在另一实施例中，多价肽或肽模拟物含有相同的基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO：1或所述序列的保守变异体或肽模拟物组成。在另一实施例中，多价肽或肽模拟物含有相同的基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO：2或所述序列的保守变异体或肽模拟物组成。在其它实施例中，多价肽或肽模拟物含有连续的HLP/CRIP2结合基序，其可相同或不相同。

本文也提供包括至少两个各自独立结合受体克隆9(SEQ ID NO：27)的基序的分离多价肽或肽模拟物。例如，本发明的多价肽或肽模拟物可具有至少两个各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：5或6或所述序列的保守变异体或肽模拟物的基序。应了解，本发明的多价肽或肽模拟物(例如)可包括所述基序中的至少三个、至少五个或至少十个，其各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：5或6或其保守变异体或肽模拟物。在特定实施例中，多价肽或肽模拟物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸序列SEQID NO：5或6或其保守变异体或肽模拟物的相同或不相同的基序。例如，本发明的多价肽或肽模拟物可包括相同基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO：5或6或所述序列的保守变异体或肽模拟物组成。在其它实施例中，多价肽或肽模拟物含有连续的受体克隆9(SEQID NO：27)结合基序，其相同或不相同。

本发明进一步提供包括至少两个各自独立结合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)的基序的分离多价肽或肽模拟物。例如，本发明的多价肽或肽模拟物可具有至少两个各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：7、8或9或所述序列的保守变异体或肽模拟物的基序。应了解，本发明的多价肽或肽模拟物(例如)可包括所述基序中的至少三个、至少五个或至少十个，其各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：7、8或9或其保守变异体或肽模拟物。在特定实施例中，多价肽或肽模拟物具有2、3、4、7、8、7、8、9、10、15或20个氨基酸序列SEQ ID NO：7、8或9或其保守变异体或肽模拟物的相同或不相同的基序。例如，本发明的多价肽或肽模拟物可包括相同基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO：7、8或9或所述序列的保守变异体或肽模拟物组成。在其它实施例中，多价肽或肽模拟物含有连续的Sigirr/TIR8(SEQ ID NO：29)结合基序，其相同或不相同。

本文进一步提供包括至少两个各自独立结合SEQ ID NO：33的基序的分离多价肽或肽模拟物。例如，本发明的多价肽或肽模拟物可具有至少两个各自独立含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或所述序列的保守变异体或肽模拟物的基序。作为非限制性实例，本发明的多价肽或肽模拟物可包括所述基序中的至少三个、至少五个或至少十个，其各自独立含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或其保守变异体或肽模拟物。作为其它非限制性实例，多价肽或肽模拟物可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或其保守变异体或肽模拟物的相同或不相同的基序。本发明的多价肽或肽模拟物例如也可包括相同基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO：11或所述序列的保守变异体或肽模拟物组成。应了解，多价肽或肽模拟物可包括连续或不连续的SEQ ID NO：33结合基序，其可相同或不相同。

本发明也提供包括至少两个各自独立结合bc10(SEQ ID NO：35)的基序的分离多价肽或肽模拟物。SEQ ID NO：35结合基序可连续或不连续，且进一步可相同或不相同。例如，本发明的多价肽或肽模拟物可具有至少两个各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或所述序列的保守变异体或肽模拟物的基序。作为非限制性实例，本发明的多价肽或肽模拟物可包括所述基序中的至少三个、至少五个或至少十个，其各自独立含有氨基酸序列SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或其保守变异体或肽模拟物。作为其它非限制性实例，多价肽或肽模拟物可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸序列SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或其保守变异体或肽模拟物的相同或不相同的基序。在一实施例中，本发明提供包括相同基序的本发明的多价肽或肽模拟物，所述基序是由氨基酸序列SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13的保守变异体或肽模拟物组成。

以下实例旨在说明而非限制本发明。

实例I

鉴别选择性锚定到心脏脉管系统的肽和锚定肽的同源受体

本实例描述使用活体外和活体内噬菌体选择以鉴别选择性锚定到心脏脉管系统的肽，同时结合细菌双杂交检定以鉴别锚定肽的同源受体。

使用抗CD31磁珠对从鼠科心脏组织获得的细胞悬浮液进行心脏内皮细胞的富集度的活体外噬菌体选择以分离血管内皮细胞。在三轮活体外选择后，与非重组噬菌体相比观察到与心脏细胞的活体外结合的230倍强化(图1B)。随后用于锚定到心脏的活体内选择得到相对于非重组噬菌体的锚定以近200倍的增加在活体内锚定到心脏的噬菌体集合。此外，经活体外/活体内选择的噬菌体与其它组织相比优先定位到心脏中。如图1C所示，与大脑、肾、皮肤和骨骼肌中的噬菌体积累相比，心脏中的富集为20到50倍。

如下进行对心脏锚定肽的假定受体的分离。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增心脏锚定噬菌体的编码肽的DNA插入物，将其插入细菌双杂交系统的“诱饵载体”中，并与编码心脏cDNA文库的靶载体共转染到细菌中。高严格度筛检揭示了表明频率与阳性对照相当的诱饵-目标相互作用的菌落，而在不存在两种载体中任一种的情况下未观察到菌落生长(图1D)。此外，用于系统泄漏性的控制在100个菌落中去除75个可能是假阳性的菌落(图1E)。

使用NCBI非冗余数据库分析来自25个剩余候选受体cDNA的同框序列。在所述25个克隆中，19个是在心肌中大量表达的蛋白，诸如肌球蛋白、肌红蛋白、铁蛋白和酮戊二酸脱氢酶。代表表1中所总结的膜或细胞表面蛋白的剩余6个克隆是心脏锚定分子的假定受体。这些结果表明结合活体外/活体内噬菌体展示技术与细菌双杂交分析可快速鉴别心脏锚定肽和其同源受体。

如下进行活体外和活体内噬菌体选择。如Laakkonen等人，Nat.Med.8：751-755(2002)中所述产生在T7Select415-1噬菌体(Novagen；San Diego，CA)上展示的由NNK编码的CX₇C文库。如Clarkson和Lowman(编辑)Phage Display：A Practical Approach Oxford，U.K.：Oxford University Press(2004)中的Hoffman等人，“In vivo and ex vivo selectionsusing phage-displayed libraries”所述进行噬菌体选择和确认。在对心脏细胞进行三轮活体外选择后，在活体内进行三轮选择。为进行活体外选择，使用1mg/ml的胶原酶IA(Sigma；St.Louis，MO)分散组织，从而自鼠科心脏组织制备细胞悬浮液。在4℃下将细胞悬浮液与5×10¹⁰个空斑形成单位(pfu)的CX₇C文库一起培育过夜并随后洗涤以移除未结合的噬菌体。根据制造商说明书，使用磁珠(M450；Dynal；Oslo，Norway)和抗小鼠CD31(PharMingen；San Diego，California)分离血管内皮细胞。如Hoffman等人，上文，2004所述，救援与CD31阳性细胞群体结合的噬菌体并使其在大肠杆菌中扩增。

如下进行活体内淘选。将经活体外选择的噬菌体集合(5×10⁹p.f.u.)静脉内注入小鼠尾部静脉，并使其循环10分钟，然后用DMEM通过左心室小心地灌注小鼠以移除未结合的血管内噬菌体。切除心脏和对照组织(大脑、肾、皮肤和肌肉)，并如Hoffman等人，上文，2004所述回收噬菌体。将从心脏回收的噬菌体再注入小鼠，并重复所述循环总共三次。将非重组噬菌体注入单独小鼠以在各实验中作为对照。

为进行细菌双杂交实验，通过使用引物5′-TCAGGTGTGATGCTCGG-3′(SEQ ID NO：36；正向引物)和5′-GAGTAACTAGTTAACC-3′(SEQ ID NO：31；反向引物)对来自心脏锚定噬菌体的编码肽的DNA插入物进行PCR扩增来构建诱饵质粒文库。用EcoRI和XhoI消化PCR产物，并将其亚克隆到诱饵pBT质粒(Stratagene；La Jolla，CA)中以产生被称为“pBT-hp”的诱饵的重组文库。将pBT-hp质粒转化到XL1-Blue MRF′Kan感受态细胞中，并在100mm LB-氯霉素平板上涂布2μl或5μl细胞以确定主要转化体的总数量。集中剩余转化体并将其涂布在150mm LB-氯霉素平板上。对20个克隆进行测序，发现其具有适当的编码肽的插入物。然后刮削平板，并采集细菌。在涂布2μl和5μl所采集的文库以确定经扩增文库的大小之后，使用市面有售的maxiprep DNA柱从经集中的细菌中纯化pBT-hp质粒集合。根据制造商说明书(Stratagene；La Jolla，CA)，使用经纯化DNA以转化

双杂交系统报告菌株感受态细胞。

将2μl含有小鼠心脏质粒cDNA文库(Stratagene；#982303)的细胞稀释到25ml SOC培养基中，然后将细胞涂覆在25个25cm×25em LB-四环素平板上，由此平板纯化心脏cDNA文库质粒。将平板在30℃下培育24小时，然后采集大约5×10⁶个单独克隆并随后进行质粒纯化。

根据制造商说明书，用双杂交系统(Stratagene)进行细菌双杂交实验。简言之，使用50ng各种质粒共转染pBT-hp和心脏cDNA文库质粒。将共转染体的等分试样(100μl)涂布在选择性LB平板上(500μg/ml羧苄青霉素(carbenicillin))并在37℃下培育20小时，然后对平板的生长进行计分。如对于阳性对照Gal4和Gal11P杂交蛋白所观察到的，在选择性平板上的生长表明在一对杂交蛋白之间存在相互作用。随后，用来自羧苄青霉素平板的个别阳性菌落在X-gal平板上划线以进行二级筛检。在将细胞培育12到14小时后，选择显示X-gal平板呈深蓝色的细胞，并且所述细胞能够于30℃下在LB-氯霉素或LB-四环素(目标和诱饵质粒的标记)的存在下生长过夜。纯化质粒DNA，并用假定诱饵和靶质粒再转化报告菌株。在选择性平板上可再现地生长的克隆被确定为阳性。通过PCR扩增诱饵和靶插入物，随后进行序列分析。使用来自靶载体的序列作为非冗余小鼠基因组的BLASTN搜寻中的查询序列。

实例II

受体-肽对和肽心脏锚定活性

本实例描述通过用展示心脏锚定活性的肽集合进行细菌双杂交分析而被鉴别为心脏锚定肽的假定受体的由膜或细胞表面表达的蛋白。

受体克隆5

如表1所总结，受体克隆5代表心脏LIM-蛋白(HLP)的羧基端92个氨基酸，其也被称为富半胱氨酸蛋白2(CRIP2)和ESP1。在血管心脏中表达(Yu等人，Mech.Dev.116：187-192(2002))的HLP是与Crp-1具有同源性的含LIM结构域的蛋白(Karim等人，Genomics31：167-176(1996)；和van Ham等人，Genes Cells8：631-644(2003))。在来自用HLP克隆进行的双杂交分析的5个阳性菌落中，鉴别三种同源肽：CRPPR(SEQ ID NO：1)存在两次，CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)存在一次且CGNQVDSRC(SEQ ID NO：3)存在两次。在将这些肽克隆到T7Select415-1展示载体中之后，检定其在静脉内注射后锚定到心脏脉管系统的能力。相对于非重组噬菌体，展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体以超过300倍的选择性锚定到心脏(图2A)。如表1所总结，CGRKSKTVC(SEQ ID NO：2)噬菌体在心脏锚定中展示约50倍的选择性，而对于展示CGNQVDSRC(SEQ ID NO：3)的噬菌体未观察到显著的选择性锚定。

受体克隆9

受体克隆9也被鉴别为与一种或一种以上心脏锚定肽结合的膜蛋白。如表1所示，受体克隆9是未注解的RIKEN EST。在通过用受体克隆9进行的双杂交分析鉴别的5个群落中，鉴别到三种肽，即CPSELLLP(SEQ ID NO：4)、CARPAR(SEQ ID NO：5)和CPKRPR(SEQ ID NO：6)。后两种肽展现对心脏的选择性锚定，但第一种却没有(表1和图2B)。

受体克隆154

受体克隆15是被称为Sigirr或TIR8的单一Ig IL-1受体相关蛋白(Thomassen等人，Cytokine11：389-399(1999))。克隆15所代表的蛋白部分含有Sigirr的跨膜结构域以及约190个氨基酸的氨基端胞外部分。已知Sigirr在肾、肺、肠和其它组织的上皮中表达(Thomassen等人，上文，1999；和Polentarutti等人，Eur.Cytokine Netw.14：211-218(2003))，尽管尚未报导心脏或内皮细胞表达。如表1所总结，三种肽通过双杂交分析被鉴别为结合Sigirr。这些肽CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO：8)和RGSSS(SEQ ID NO：9)展示20到30倍的心脏锚定选择性(参看表1和图2C)。

受体克隆27

受体克隆27为假定蛋白，其被注解为含有经确定来自嗅觉cDNA文库的蛋白的富谷氨酰胺区域。所有经分析的五种诱饵克隆都编码相同的肽CLIDLHVMC(SEQ ID NO：10)，其不展示与心脏的特异性锚定(表1和图2D)。

受体克隆36

受体克隆36含有来自RIKEN Fantom套组的未命名蛋白产物的完整编码序列。这种受体经假定与内在膜蛋白CII-3(MpcII-3)类似，MpcII-3是作为琥珀酸脱氢酶复合体的部分的线粒体膜蛋白。通过与克隆36的结合活性鉴别的5种经测序群落中的每一种都编码相同的肽CRSTRANPC(SEQ ID NO：5)，其展示约20倍的心脏锚定选择性(表1和图2E)。

受体克隆46

受体克隆46是人类膀胱癌相关蛋白10的小鼠同系物(bc10)的一部分，bc10是随着从膀胱中的前恶性病变发展癌症而下调的小膜蛋白。作为受体克隆46分离的片段含有bc10的预测胞外结构域的羧基端32个氨基酸。双杂交分析确定两种结合受体克隆46的肽：CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)和CSGMARTKC(SEQ ID NO：13)，其分别展示约60倍和10倍的心脏锚定选择性(表1和图2F)。

总而言之，这些结果表明结合活体内淘选的细菌双杂交分析可用于鉴别器官锚定肽和其同源受体。

如下重建个别噬菌体克隆。合成编码来自所选诱饵质粒的肽的寡核苷酸，在37℃下用T4多核苷酸激酶(PNK；NEB)磷酸化1小时，并在0.08pmol/μl的浓度下退火。将经退火的插入物稀释到0.04pmol/μl并在16℃下用T4连接酶连接到T7Select415-1侧臂(Novagen)中过夜。次日，通过如制造商所述将连接反应物与包装提取物混合来制备完整的重组噬菌体。通过测序确认插入物，并扩增个别克隆以用于如上文实例I所述的活体外和活体内测试。

实例III

噬菌体展示的心脏锚定肽定位到心脏脉管系统中

本实例证明选择性锚定到心脏脉管系统的所公开肽特异性结合由心脏脉管系统活体内表达的受体。

A.噬菌体展示的心脏锚定肽与血管标记协同定位

对如表1所总结的选择性倍数所表明的5种最有效的锚定肽和其假定受体进行进一步表征。分析这些锚定肽在活体内选择性结合心脏内皮的能力和其与其假定受体的特异性结合，还分析所述假定受体在心脏内皮中的表达。将展示特定锚定肽的噬菌体中的每一种都单独静脉内注入具有荧光素结合番茄凝集素以作为血管标记的小鼠中。噬菌体与抗T7抗体的定位表明展示肽CRPPR(SEQ ID NO：1)、CARPAR(SEQ ID NO：5)、CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)的噬菌体存在于心脏内皮中(图3A到C、E和F)。展示CLIDLHVMC(SEQ ID NO：10)的噬菌体是用作阴性对照(图3D)，且通过噬菌体免疫染色发现其也不存在于心脏中(图3D)。在相同条件下在除心脏以外的组织中未检测到6个噬菌体中的任一个。

这些结果证实展示肽CRPPR(SEQ ID NO：1)、CARPAR(SEQ ID NO：5)、CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)的噬菌体在活体内定位到心脏脉管系统。

如下进行免疫组织化学。从BD Pharmingen(San Jose，CA)获得大鼠单克隆抗小鼠CD31(1:100)，并从GenWay(San Diego，CA)获得兔多克隆抗T7噬菌体(1:500)和鸡抗小鼠CRIP2IgY(1:100)。从Molecular Probes(Eugene，OR)获得二级抗体AlexaFluor-488山羊抗大鼠IgG(1:1000)和AlexaFluor-594山羊抗大鼠或兔IgG(1:1000)，并从GenWay获得二级抗体GAYFC-AlexaFluor594山羊抗IgY Fc(1:250)。将冷冻切片与阻断缓冲液(1×PBS中的5％正常山羊血清和0.5％BSA)一起预培育1小时，用PBS洗涤三次并与所关注的一级抗体在4℃下一起培育过夜。在培育过夜后，加入二级抗体并在室温下培育1小时。用PBS洗涤玻片三次并将其固定在具有DAPI的Vectashield封片剂(Mounting Medium)中(Vector Laboratories；Burlingame，California)。通过静脉内注射购自Vector Laboratories的番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素结合荧光素(200μlPBS中的100μg)另外观察血管。

B.与经锚定肽的假定同源受体转染的细胞结合的锚定肽

构建四种假定心脏锚定受体HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白和bc10的全长cDNA，并在293T细胞中表达。如图4所示，展示所述四种同源肽中的每一种的噬菌体与经其对应假定受体转染的细胞结合，这比对照噬菌体高出300到500倍(带点条形图)。另外，噬菌体结合在100μg/ml的同源肽存在下受到抑制(实心条形图)，但不受无关锚定肽抑制(空心条形图)。这些结果证实锚定肽CRPPR(SEQ ID NO：1)特异性结合受体HLP/CRIP2；锚定肽CKRAVR(SEQ ID NO：7)特异性结合受体Sigirr/TIR8；锚定肽CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)特异性结合MpcII-3相关蛋白受体；且锚定肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO：12)特异性结合受体bc10。

如下进行受体转染和噬菌体结合检定。使用Fugene转染试剂(Roche Diagnostics)，以编码HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白和bc10的来源于pMH6的质粒(RocheDiagnostics；Indianapolis，IN)转染293T细胞。简言之，将10μg质粒与700μl无血清DMEM和30μlFugene转染试剂混合并在室温下培育15分钟，然后将混合物加入细胞中。48小时后，使用EDTA从培养皿分离细胞并用PBS洗涤一次。将展示CRPPR(SEQ ID NO：1)、CKRAVR(SEQ ID NO：7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO：11)或CPKTRRVPC(SEQID NO：12)的噬菌体和非重组对照噬菌体(1×10⁹p.f.u)与经转染细胞在4℃下一起培育2小时。通过用PBS中的1％BSA洗涤五次来移除未结合的噬菌体。通过加入细菌来救援结合的噬菌体，如上所述由空斑检定来确定结合效率。

在固相合成仪中使用Fmoc化学在The Burnham Institute肽设备上合成用于竞争检定的肽，随后通过HPLC纯化并通过质谱分析确定其身份。如Wender等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA.97：13003-13008(2000)中所述，合成荧光素结合肽。通过向细胞和噬菌体中加入100μg肽来进行竞争检定，随后在4℃下培育2小时。在用1％PBS洗涤五次后，救援结合的噬菌体并通过空斑检定进行量化。

C.受体mRNA存在于心脏内皮中

使用实时PCR和原位杂交在组织内研究心脏锚定受体的表达。实时PCR分析(图5A)展示肽SEQ ID NO：1的受体HLP/CRIP2在心脏中高度表达并在肺和大脑中以较低程度表达。包括骨骼肌的若干其它组织对HLP/CRIP2mRNA呈阴性。其它心脏锚定受体Sigirr/TIR8、MpcII-3相关蛋白和bc10也在心脏中最高程度地表达，而在其它组织中以较低程度表达(图5A)。通过结合熔解曲线和DNA序列分析的凝胶电泳(图5B)来证实RT-PCR分析的特异性。

使用原位杂交确认RT-PCR分析并确定所关注的受体是否在心脏和其它组织的内皮细胞上表达。如图5C第一行所示，在心脏中存在大量HLP/CRIP2信号且其展现血管表达图样(图5C；第一行)。在肺和大脑中也观察到痕量级表达，但在肾中没有观察到表达。虽然原位杂交在肺中检测到HLP/CRIP2mRNA表达，但是在这一组织中仅检测到很少的CRPPR(SEQ ID NO：1)噬菌体锚定(参看上文)。

Sigirr/TIR8原位杂交分析也证实RT-PCR结果。信号在心脏脉管系统中很强(图5，第二行)，在肺和肾中较弱且在大脑中没有。MpcII-3相关蛋白mRNA存在于心脏中，主要是在心血管中(图5，第三行)。MpcII-3相关蛋白mRNA也存在于一些肺血管中，尽管其并不存在于大脑和肾中。如图5C最后一行另外所示，bc10mRNA存在于心血管中并另外存在于一些肺、肾和肌肉血管中，但不存在于大脑血管中。总而言之，原位杂交结果很大程度上证实以下RT-PCR结果：四种心脏锚定受体都在心脏中最充足地表达。此外，四种心脏锚定受体的mRNA定位在心脏内皮上，这与选择性锚定到肺脉管系统的所公开的肽的定位一致。

基本上如St Croix等人，Science289：1197-1202(2000)所述进行非放射性原位杂交。简言之，使用并入反义引物中的SP6启动子和并入正义引物中的T7启动子，通过PCR扩增来产生经地高辛(digoxigenin，DIG)标记的反义RNA探针。用DIG RNA标记试剂和T7RNA聚合酶(Roche Diagnostics)进行活体外转录。用4％多聚甲醛固定冷冻组织切片，用胃蛋白酶渗透并与RNA探针(200ng/ml)一起在55℃下培育过夜。使用辣根过氧化物酶(HRP)兔抗DIG抗体(DAKO；Carpinteria，CA)来催化使用GenPoint试剂盒的生物素-酪胺(Biotin-Tyramide)沉积以用于信号扩增(DAKO)。通过加入辣根过氧化物酶(HRP)兔抗生物素(DAKO)、生物素-酪胺和碱性磷酸酶(AP)兔抗生物素(DAKO)来实现进一步扩增。在用苏木精复染色的组织切片中，以AP substrate Fast RedTR/Napthol AS-MX(Sigma)检测信号。

基本上如Galang等人，J.Biol.Chem.279：11281-11292(2004)所述进行实时聚合酶链式反应(PCR)检定。简言之，用RNeasy试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)从所关注的器官中提取总RNA，并使用Superscript II First-Strand Synthesis System试剂盒(Invitrogen；Carlsbad，CA)从50ng总RNA制备cDNA。根据制造商说明书，使用LightCycler SYBRgreen DNA master mix进行实时PCR。为进行相对表达分析，使用控制基因磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)的含量使受体表达标准化。将各受体的心脏中GAPDH标准化表达定义为100％，且将其用作比较基础。通过各PCR产物的熔解曲线以及琼脂糖凝胶电泳和DNA序列分析来确认实时PCR的特异性。

实例IV

静脉内注射的CRPPR(SEO ID NO：1)肽与HLP/CRIP2蛋白在心血管中协同定位

本实例展现肽CRPPR(SEQ ID NO：1)与其同源受体HLP/CRIP2的协同定位。

使用抗HLP/CRIP2抗体，将心脏中CRPPR(SEQ ID NO：1)肽的定位与HLP/CRIP2受体的表达相比较。如图6A和6B所示，来自静脉内注射的CRPPR(SEQ ID NO：1)肽的荧光与血管标记CD31在心血管和心内膜中广泛地协同定位。此外，在心脏中未检测到经荧光素标记的对照肽(图6C)。抗HLP/CRIP2染色也与CD31和肽CRPPR(SEQ IDNO：1)在心血管和心脏心内膜中协同定位(图6D到6F)。

使用竞争检定来检定与心脏脉管系统结合的CRPPR(SEQ ID NO：1)-噬菌体的特异性。如图7A和7B所示，CRPPR(SEQ ID NO：1)肽和抗HLP/CRIP2抗体以剂量依赖方式阻断展示CRPPR(SEQ ID NO：1)的噬菌体与心脏来源的细胞悬浮液的结合。作为阴性对照，两种其它心脏锚定肽对CRPPR(SEQ ID NO：1)-噬菌体结合不具有任何作用。此外，共注射的抗HLP/CRIP2抗体也抑制CRPPR(SEQ ID NO：1)-噬菌体的活体内锚定(图7C)。总而言之，这些结果证明肽CRPPR(SEQ ID NO：1)经由特异性结合到HLP/CRIP2上而选择性锚定到心脏脉管系统。

上文以括号或以其它方式提供的所有期刊论文、参考文献和专利引证无论先前是否说明都以全文引用的方式并入本文。

虽然已经参考上文所提供的实例描述本发明，但是应了解可在不偏离本发明精神的情况下作出各种修改。因此，本发明仅受以下权利要求书限制。