KR20220133944A

KR20220133944A - 인간 혈액-뇌 장벽 표적화 항체

Info

Publication number: KR20220133944A
Application number: KR1020227029486A
Authority: KR
Inventors: 에릭 브이. 슈스타; 찰스 씨. 스터츠; 루카스 굴라티스; 줄리아 게오르기에바
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 2020-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2022-10-05
Also published as: EP4096709A4; AU2021212760A1; WO2021154978A3; EP4096709A2; WO2021154978A2; US20230331835A1

Abstract

본 발명은 혈액-뇌장벽에 특이적으로 결합하여 이를 전위시키는 단일쇄 가변 단편(scFv) 항체를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 사용 방법을 제공한다.

Description

인간 혈액-뇌 장벽 표적화 항체

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2020년 1월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/966,860에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참고로 포함된다.

연방 후원 연구에 관한 성명서

이 발명은 국립 보건원에서 수여한 NS071513 및 DOD/DTRA에서 수여한 HDTRA1-15-1-0012에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

서열 목록

서열 목록은 이 출원과 함께 제공되며, "960296_04088_ST25.txt"라는 명칭의 서열 목록의 ASCII 텍스트 파일로 제출되며, 크기는 38.2KB이며, 2021년 1월 2일에 생성되었다. 서열 목록은 출원과 함께 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되며, 전체가 참조로 본원에 통합된다.

도입

혈액-뇌 장벽(BBB)은 전신 투여 후 중충신경계(CNS)에서 생물학적 제제의 실질적인 축적을 방지하여, 신경 장애에 대한 새로운 치료법을 제한한다. 뇌에서, 혈관 네트워크는 CNS로 분자의 세포주위 이동을 제한하는 긴밀한 접합에 의해 연결된 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)로 구성되어, 혈액-매개(blood-borne) 물질의 뇌 흡수를 제어한다(1). 예를 들어, 표적화되지 않은 항체의 뇌 흡수는 순환하는 항체 수준의 ~0.1%로 제한되어(2), 전신적으로 투여되는 생물학적 제제의 치료 효과를 방해한다. 그러나, 분자 수송체의 호스트는 운반체-매개된(mediated) 및 수용체-매개된 수송(RMT) 메커니즘에 의해 BMEC를 가로질러 필요한 영양소의 선택적 통과를 허용하는 BMEC에 의해 발현된다. 따라서 장벽 특성을 우회하는 한 가지 접근 방식은 먼저 BMEC의 혈액 측에 있는 RMT 수용체와 결합하고 표적화 항체 및 임의의 부착된 치료학적 카고(cargo)의 BMEC를 가로질러 뇌로의 통과세포외배출을 촉발할 수 있는 항체로 BBB RMT 시스템을 표적화함으로써 BBB RMT 시스템을 채택하는 것으로 구성된다(3). 두 가지 두드러진 예는 트랜스페린(TfR)(4) 및 인슐린(IR) 수용체에 대한 항체이다(5). 이러한 시스템은 BBB를 가로질러 수송을 매개하는 동안 다소 비효율적이고 비특이적이며 해로운 오프-타겟 효과를 초래할 수 있다(6-8). 항체 공학 전략에 의해 이러한 효과를 완화하는 것이 가능하지만(9), 이러한 문제를 해결할 수 있는 새로운 BBB RMT-표적화 항체 쌍의 발견에 대한 상당한 필요성이 남아 있다.

새로운 항체-RMT 쌍을 식별하기 위해 여러 접근 방식이 구현되었다(10). BBB 내피 세포의 게놈 및 프로테옴 프로파일링은 바시긴 및 CD98 중쇄와 같은 새로운 BBB RMT 표적을 식별하는데 도움이 되었다(11); 그러나, 오믹스 데이터로부터 식별된 무슨 BBB 단백질이 실제로 BBB 수송할 수 있는지 선험적으로 결정하는 것은 어려울 수 있다. 대조적으로 다양한 BBB 기질에 대한 큰 항체 라이브러리의 표현형 스크리닝은 RMT 표적에 대한 사전 지식 없이 동족 항체-RMT 쌍을 식별하는데 사용될 수 있다(10). 그러나, 새로운 항체-RMT 쌍에 대한 생체내(12, 13) 및 시험관내(11, 14) 대형 라이브러리의 표현형 스크리닝은 제한된 성공을 보였으며, 단지 소수의 새로운 BBB 표적화 항체가 분리된다. 생체내 스크리닝 과제는 파아지 항체 라이브러리가 관련 클론을 마스킹하는 높은 배경 회수율로 인해 어려움을 겪는 반면(15), 시험관내 바이오패닝으로부터 식별된 항체는 배양시 단백질 발현 프로파일의 잠재적인 변경으로 인해 생체내 항원과 종종 교차 반응하지 않는다는 발견을 포함한다. 또한, 인간 시험관내 BBB 모델은 본질적으로 누출되기 때문에, 항체 라이브러리의 기능적 통과세포외배출 스크린의 효과를 제한한다. 따라서, 생체내에서 뇌 혈관계를 효과적으로 표적화할 수 있는 새로운 항체-RMT 쌍이 당업계에 여전히 필요하다.

개요

본 발명은 분리된 혈액-뇌 장벽(BBB)-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 분리된 혈액-뇌 장벽(BBB)-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) SEQ ID NO: 26 (GFTFSGYW)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 27 (IKGDGTDI)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 28 (ARDLRQTHWFDS)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 29 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 30 (SSRDTSGNHVL)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (b) SEQ ID NO: 2 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 3 (ISYDGSNK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 4 (ARDSKGQSVRNRFDP)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 5 (NLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 6 (NSRDSSGNLVV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (c) SEQ ID NO: 8 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 9 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 10 (ARGWKYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 11 (EGIYHW)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 KA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 12 (QQYHTISRT)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (d) SEQ ID NO: 14 (GFTFSSST)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 15 (VSYDGNTQ)를 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 16 (AGLWGSLLGYFQH)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 17 (QGVNNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 AA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 18 (QQAHSFPPT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (e) SEQ ID NO: 20 (GFTFSTYW)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 21 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 22 (ATPTGDSDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 23 (SLRSYY)을 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GQ를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 24 (HSRDSSGNHVL)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (f) SEQ ID NO: 32 (GFTFSTYW)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 33 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 34 (ATPTGDSDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 35 (QDIGNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 DA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 36 (QKLSSYPLT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (g) SEQ ID NO: 38 (GFTFSNYA)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 39 (ISGSGSST)를 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 40 (AKTSGWPYYFDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 41 (SSNIGNNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 DN을 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 42 (CSYAGSSTLV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (h) SEQ ID NO: 44 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 45 (VSGTGVST)를 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 46 (ARGLDWKSTPIDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 47 (QSISGW)을 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 48 (LQDYNGWT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (i) SEQ ID NO: 50 (GFTVSSNY)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 51 (IKQDGSEK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 52 (ARGGEEKNSGYYGDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 53 (SLRSYY)을 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 QD를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 54 (QAWDSSTAHYV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (j) SEQ ID NO: 56 (GFTFSSYV)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 57 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 58 (AKQNWYFDL)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 59 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 60 (NSRDSRGTHLEV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (k) SEQ ID NO: 62 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 63 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 64 (AKSQGWAGDFDF)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 65 (SSDIGTYNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 EV를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 66 (CSYAGSSTLV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; 또는 (l) SEQ ID NO: 68 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 69 (ISSNGAIT)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 70 (VKDLKPSSWPPIYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 SEQ ID NO: 71 (SLRTYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 72 (NSRDSSGNHHVV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 25에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (c) SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (d) SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (e) SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (f) SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (g) SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (h) SEQ ID NO: 43 또는 SEQ ID NO: 43에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (i) SEQ ID NO: 49 또는 SEQ ID NO: 49에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (j) SEQ ID NO: 55 또는 SEQ ID NO: 55에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (k) SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 61에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; 및 (l) SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 67에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;

일부 양태에서, 본 개시내용은 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다: (a) SEQ ID NO: 25; (b) SEQ ID NO: 1; (c) SEQ ID NO: 7; (d) SEQ ID NO: 13; (e) SEQ ID NO: 19; (f) SEQ ID NO: 31; (g) SEQ ID NO: 37; (h) SEQ ID NO: 43; (i) SEQ ID NO: 49; (j) SEQ ID NO: 55; (k) SEQ ID NO: 61; 및 (l) SEQ ID NO: 66.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 BBB에 제제를 표적화하는 방법으로서, 항체는 제제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BBB를 특이적으로 표적화할 수 있는, 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 치료제를 대상체의 BBB에 표적화하는 방법으로서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 항체는 치료제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BBB를 특이적으로 표적화하고 전위시킬 수 있는, 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.

도면의 간단한 설명
도 1. 시험관내 BBB 모델에 대한 항체 라이브러리 스크리닝. (A) 파아지 디스플레이 스크린에 대한 계획. 단계 1: 뇌 선택성을 촉진하기 위한 노력의 일환으로 배양된 인간 심장 및 폐 내피 세포에서 파아지 scFv 라이브러리의 사전-차감. 단계 2: 사전-차감 단계로부터의 상청액은 다음으로 iPSC-유래된 BMEC와 인큐베이션하여 항체 보유 파아지의 결합 및 내재화를 허용한다. 항체 풀은 3 라운드의 단계 2 내재화 스크리닝을 거쳤다. 단계 3: 다음에 내재화 파아지는 3h 동안 Transwell 포맷으로 BMEC의 혈액 측에 투여되어 통과세포외배출을 허용하였다. 회수된 scFv-보유 파아지 입자를 추가 분석으로 처리하였다. (B) 트랜스-내피 전기 저항(TEER)의 함수로서 Transwell 시스템의 기저외측, 뇌 측 챔버에서 회수된 관련 없는 항-보툴리눔 신경독소 scFv를 디스플레이하는 파아지의 수. (C) BMEC-결합 파아지의 풍부화는 스크리닝 단계 2 동안 파아지 항체 풀의 FACS-분석에 의해 관찰된 바와 같이 scFv를 디스플레이하였다. 각각의 스크리닝 라운드 후 파아지-디스플레이된 scFv로 표지된 BMEC의 대표적인 히스토그램이 도시된다. 세포의 수(카운트: Y-축)는 세포의 파아지 항체 표지화의 형광 강도의 함수(X-축)로 주어진다. 모든 실험에서, BMEC는 파아지 항체 풀과 인큐베이션하고, 세포-결합은 항-M13 항체에 의해 검출하였다. 기하 평균은 각각 라운드 R1 - 80.6, R2 - 27, R3 - 10.9, 비결합 파아지 - 3.16이다. (D) BMEC 결합 표현형을 디스플레이하는 클론을 결정하기 위해 BMEC를 사용한 클론 파아지 면역세포화학의 대표적인 이미지. 스케일 바, 50μm. 패널 C) 및 D)의 경우, 비결합 파아지는 항보툴리눔 신경독소 scFv를 디스플레이한다.
도 2. 항체 결합 특성. (A) 토끼 IgG Fc 영역에 직접적으로 연결된 scFv가 있는 ScFv-Fc 작제물. (B) HEK293F 세포에서의 발현 및 단백질 A/G 정제 후 scFv-Fc 항체의 비환원, 쿠마시 블루-염색된 SDS-PAGE 겔 분석. 분자량이 표시된다. (C) 선택된 클론의 겉보기 평형 결합 친화도. 표는 최적의 평형 결합 친화도(Kd) 및 관련 95% CI에 대한 숫자 값을 보여준다. (D) BMEC로의 항체의 결합 및 내재화. 생세포를 4℃에서 항체(5 μg/ml)와 함께 인큐베이션하고, 후속하여 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 막을 저온 완충액으로 세척하고, 막 결합 분획을 항-토끼 Fc AlexaFluor555 항체(적색)로 표지시켰다. 고정 및 투과 후, 내재화된 항체는 항-토끼 Fc AlexaFluor488 항체(녹색)로 표지하였다. 이미지는 표면형광 현미경으로 촬영하였다. 스케일 바, 20 μm. (E) 항체의 온도-의존적 내재화. 4℃에서 내재화된 항체 형광 신호 값은 37℃에서 세포 당 총 신호로 정규화된다. 스튜던트 T-테스트에 의해 평균±S.D., n=3, *p<0.05으로 보고된다. (F) 인간 및 마우스 뇌 미세혈관에 결합하는 ScFv-Fc. 인간 및 마우스 뇌의 냉동절편을 CD31(녹색)에 대해 면역표지하여 혈관을 시각화하고 5 μg/ml scFv-Fc(적색)와 인큐베이션하여 scFv-Fc 결합을 식별하였다. 핵산은 청색으로 시각화된다. 이미지는 공초점 현미경으로 촬영되었다. 스케일 바, 20 μm.
도 3. 마우스 정맥내 투여 후 항체의 뇌 표적화. (A) 항체(5 mg/kg)를 마우스에 정맥내 주사하였다. 주사 1시간 후, 마우스를 전신 관류시키고, 뇌를 수집하였다. ScFv-Fc(적색)는 형광 항-토끼 Fc AlexaFluor555 항체로 표지하였고, 혈관(녹색)은 관류 완충액에 존재하는 DyLight488 렉틴으로 가시화시켰다. 5개의 분석된 항체 중 4개는 내피 세포의 점상 구조로 뇌 혈관계에 축적된다. 클론 46.1(노란색 화살표)을 주사한 마우스의 뇌 절편에서 혈관후 면역반응이 관찰되었다. 이미지는 표면형광 현미경으로 촬영하였다. 스케일 바, 20 μm. (B) 콜라겐 IV(청색)에 대한 scFv-Fc(적색)의 국소화를 보여주는 z-스택의 공초점 이미지. A)에서와 같은 혈관(녹색), 핵(청록색). 클론 3, 26 및 46.1은 콜라겐 IV(머지의 보라색 및 백색 화살표)와 공동국소화된다. 클론 17은 콜라겐 IV와 공동국소화를 보이지 않으나, 확산 실질 염색이 검출되었다. (C) scFv-Fc(적색) 및 GFAP+ 성상교세포(청색)의 공동-국소화는 머징된 공초점 이미지(보라색)에서 관찰될 수 있다. 패널 B) 및 C)의 황색 화살표는 혈관 후, GFAP-뇌 세포에서 항체의 축적을 나타낸다. 모든 패널에서 회색조 이미지가 포함되어 머징된 이미지에 묘사된 개별 채널의 평가를 지원한다. 스케일 바, 20 μm.
도 4. 항체의 장기 생체 분포. 항체(5 mg/kg)를 마우스에 정맥내 주사하였다. 주사 1시간 후, 마우스를 전신 관류시키고, 기관을 수집하였다. ScFv-Fc는 형광 항-토끼 Fc AlexaFluor555 항체(적색)로 면역표지하였고, 혈관은 관류된 DyLight488 렉틴(녹색)으로 시각화시켰다. 백색 및 황색 화살표는 각각 간세포 및 신장 상피 세포에서 클론 46.1의 점 접합 국소화를 가리킨다. 이미지는 표면형광 현미경으로 촬영하였다. 스케일 바, 20 μm.
도 5. ScFv-Fc 뇌 축적의 정량화. 클론 17 및 46.1을 마우스(n=4)에 정맥내 주사하였다. 1시간 후, 마우스를 전신 관류시키고, 뇌를 수집하고, 항체를 추출하였다. A) 뇌 추출물에서 항체의 농도는 재료 및 방법에 설명된 대로 ELISA로 결정되었다. 양측 쌍이 없는 스튜던트 t 테스트에 의한 Ctrl-Fc와 비교하여 평균±S.E.M., † p<0.005, * p<0.05로 보고된다. B) 항체의 말단 혈장 농도로부터 뇌 대 혈장 비율을 계산하였다. 양측 쌍이 없는 스튜던트 t 테스트에 의한 Ctrl-Fc와 비교하여 평균±S.E.M., * p<0.005, † p<0.05로 보고된다.
도 6. ScFv는 iPSC-유래된 BMEC에 결합하고 내재화된다. ScFv(13.2 μg/ml)는 4:1 몰 비율로 마우스 항-c-myc 항체와 미리 이량체화시켰다. BMEC를 scFv-다이머와 함께 4℃에서 인큐베이션한 다음 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 막을 저온 완충액으로 세척하고, 막 결합 분획은 얼음 상에서 항-마우스 AlexaFluor555 항체(적색)로 표지하였다. 고정 및 투과화 후, 내재화된 scFv는 항-마우스 AlexaFluor488 항체(녹색), 핵(파란색)으로 표지하였다. 이미지는 표면형광 현미경으로 촬영하였다. 음성 대조군은 항보툴리눔 신경독소 scFv(Ctrl-scFv)이다. 스케일 바, 20 μm.
도 7. 경쟁적 BMEC 결합 검정. 가용성 수용체 엑토도메인과의 경쟁 후 각 scFv-Fc 또는 대조군 항-TfR 또는 항-IR 항체의 결합 신호를 경쟁 부재 하에 결합에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균±S.D.로 표시되며, 이는 3개의 독립적인 실험에서 계산되었다. * p<0.05 스튜던트 t 테스트를 사용한 비경쟁 대조군 대비.
도 8. 항체 3, 9 및 26의 기관 생체분포. 항체는 도 4에 기술된 바와 같이 투여 및 검출되었다. ScFv-Fcs(적색) 및 혈관(녹색)을 시각화하였다. 이미지는 표면형광 현미경으로 촬영하였다. 스케일 바, 20 μm.
도 9. 항체의 토끼 Fc 영역에 융합된 뉴로텐신의 활성. 뉴로텐신 수용체 1을 발현하는 리포터 세포주에 다양한 농도의 자유 뉴로텐신(NT), scFv-46.1을 보유하는 항체(46.1-NT) 및 가변 림프구 수용체 결합 적혈구 항원을 코딩하는 제어 서열(CTRL-NT)을 투여하고, 수용체의 활성은 농도의 함수로 플롯팅하였다.
도 10. 항체-뉴로텐신 컨쥬게이트에 대한 마우스의 체온. 마우스의 체온은 안와후동을 통해 항체-뉴로텐신 컨쥬게이트의 투여 전 및 후에 측정하였다. 시간 0은 주입 시간이다(n=4). ScFv-46.1-토끼Fc-뉴로텐신-항체 컨쥬게이트를 투여받은 마우스의 체온 감소는 뉴런 발현에 대한 뉴로텐신 수용체 1의 관여 및 따라서 혈액-뇌 장벽을 가로질러 표적화된 수송을 나타낸다.

상세한 설명

본 발명이 기술되기 전에, 본 발명은 설명된 변화될 수 있기 때문에 설명된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 화학물질, 세포주, 벡터, 동물, 기구, 통계적 분석 및 방법론을 기술하고 공개할 목적으로 본원에 참고로 포함된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

조성물:

본 발명은 분리된 혈액-뇌 장벽(BBB)-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뇌(예를 들어, 혈액 뇌 장벽 내피)에 특이적으로 결합한다. 용어 "특정하게" 또는 "선택적으로"는 혈액 뇌 장벽을 형성하는 뇌 혈관의 내피 표면에 결합할 수 있는 항체를 설명하기 위해 본원에 상호교환적으로 사용된다. "결합"이란 표준 방법(예를 들어, 조직 절편 면역형광 검정)을 사용하여 주어진 조직의 내피에서 항체를 검출할 수 있음을 의미한다. 또한, 일부 구현예에서, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BBB에 결합하고, BBB를 가로질러 전위된다. 하기 기술된 바와 같이, BBB를 가로지르는 전위는 생체내(예를 들어, 마우스 모델)에서 또는 트랜스웰 조직 배양 BBB-모델을 사용하여 시험관내에서 검출될 수 있다.

본원에 개시된 실시예에서, 본 발명자들은 스크리닝 기질로서 인간 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)-유래 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)에 의존하는 새로운 스크리닝 방법을 기술한다. iPSC-유래된 BMEC는 잘 발달된 밀착 접착을 갖고, 주요 BBB 마커를 발현하며, 가장 중요하게는, 수송체 발현 프로파일 측면에서 일차 인간 BMEC 및 급성으로 분리된 인간 BMEC 둘 모두의 합리적인 팩시밀리이다(16-19). 파아지 디스플레이 scFv 라이브러리로 통과세포외배출 스크린을 수행하기 위해 iPSC-유래된 BMEC를 사용함으로써, 본 발명자들은 인간 BBB 항원과 반응하고 생체내에서 쥐과동물 뇌 혈관계를 표적으로 할 수 있는 항체의 코호트를 확인하였다. 리드 후보는 BMEC로의 결합 및 내재화 뿐만 아니라 뇌 조직 절편에서 인간 및 마우스 BBB 둘 모두에 대한 결합을 나타내었다. 항체는 한 특정 클론 46.1-scFv를 정맥내 투여한 후 쥐과동물 BBB를 표적으로 하였으며, 뇌 축적(8.1 nM)에서 26배 증가를 나타내었다. 더욱이, 클론 46.1-scFv는 혈관후 세포와 연관되는 것으로 밝혀져 CNS 치료학적 전달에 대한 잠재적 유용성을 시사한다. 따라서, 본 개시내용은 BBB에 특이적인 다수의 BBB-특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되어 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자로부터의 항원-결합 도메인을 포함하는 기타 분자에 관한 것이다. 적합한 항체 분자는 비제한적으로, 단일쇄 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체, 항원-결합 단편(예를 들어, 상보성 결정 영역(CDR) 도메인), 및 유전자 조작된 항체를 포함하는 전체 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgM 또는 IgD), 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 항체 단편을 포함한다. 따라서, 임의의 형태의 항체, 항체 단편 또는 항체-유래된 단편은 생체내에서 BBB에 결합하는 능력을 보유하는 한 본 발명에 사용될 수 있다.

전술한 바와 같이, 용어 "항체"는 항원 결합 도메인을 포함하는 "항체 단편" 또는 "항체-유래된 단편"을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 단편"은 항원 결합 기능을 나타내는 임의의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, ds-scFv, Fd, dAb, TandAb 이량체, 미니 바디, 모노바디, 디아바디 및 이의 다량체 및 이중특이적 항체 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 기술된 CDR 및 ScFv 서열은 당업계에 잘 알려져 있고 기술된 재조합 또는 화학적 합성 기술을 포함하는 통상적인 기술을 사용하여 항체 및 항체 단편으로 유전자 조작될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단편"은 생물학적 관련성 단편(즉, 기능적 단편)을 나타낸다. 예를 들어, 단편은 항원 결합에 기여하거나 이를 가능하게 하거나, 항원 결합 부위의 일부 또는 전부를 형성하거나, 항원이 이의 천연 리간드와 상호작용하는 것을 방지하는 데 기여할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 본원에 개시된 중쇄 가변 영역(V_H 도메인) 및 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단편은 항체 또는 V_H 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역(CDRH) 중 하나 이상, 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDRL) 또는 V_L 도메인 중 하나 이상을 포함하여 항원 결합 부위를 형성한다. 단편은 생체내에서 BBB에 결합하는 능력을 보유하는 경우 본 방법 및 키트에 사용하기에 적합하다.

본 발명에 개시된 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터의 불변 영역을 포함하는 인간 항체로 변형될 수 있다. 용어 "재조합 인간 항체" 또는 "키메라 인간 항체"는 SP2-0, NS0 또는 CHO 세포(CHO K1과 같은)와 같은 숙주 세포로부터 또는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체 또는 폴리펩티드에 대해 유전자이식된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리되는 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태의 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 일부 구현예에서, 불변 영역을 갖는다.

본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 임의의 적절한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 시험관내 또는 생체내에서 생성될 수 있으며, 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 재조합 공급원으로부터 유래되고/거나 유전자전이 동물 또는 유전자전이 식물에서 생성될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편은 일반적으로 항원 결합 부위를 포함하는 항체의 적어도 중쇄 가변 영역(V_H)을 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함한다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역과 같은 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하도록 제조될 수 있다. 또한, 항체 또는 항체 단편은 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이러한 불변 영역의 전부 또는 일부는 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 이러한 불변 영역에 대한 적절한 서열은 당업계에 잘 알려져 있고 문서화되어 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 중쇄 도메인을 포함하거나 이로 구성된 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: (a) (i) SEQ ID NO: 26 (GFTFSGYW)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 27 (IKGDGTDI)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 28 (ARDLRQTHWFDS)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (b) (i) SEQ ID NO: 2 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 3 (ISYDGSNK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 4 (ARDSKGQSVRNRFDP)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (c) (i) SEQ ID NO: 8 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 9 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 10 (ARGWKYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (d) (i) SEQ ID NO: 14 (GFTFSSST)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 15 (VSYDGNTQ)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 16 (AGLWGSLLGYFQH)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (e) (i) SEQ ID NO: 20 (GFTFSTYW)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 21 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 22 (ATPTGDSDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (f) (i) SEQ ID NO: 32 (GFTFSTYW)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 33 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 34 (ATPTGDSDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (g) (i) SEQ ID NO: 38 (GFTFSNYA)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 39 (ISGSGSST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 40 (AKTSGWPYYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (h) (i) SEQ ID NO: 44 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 45 (VSGTGVST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 46 (ARGLDWKSTPIDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (i) (i) SEQ ID NO: 50 (GFTVSSNY)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 51 (IKQDGSEK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 52 (ARGGEEKNSGYYGDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (j) (i) SEQ ID NO: 56 (GFTFSSYV)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 57 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 58 (AKQNWYFDL)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; (k) (i) SEQ ID NO: 62 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 63 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 64 (AKSQGWAGDFDF)를 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인; 또는 (l) (i) SEQ ID NO: 68 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 69 (ISSNGAIT)를 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 70 (VKDLKPSSWPPIYFDY)를 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인. 일부 구현예에서, 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 가변 경 도메인을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하거나 하기로 구성된다: (a) (i) SEQ ID NO: 26 (GFTFSGYW)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 27 (IKGDGTDI)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 28 (ARDLRQTHWFDS)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인 및 (i) SEQ ID NO: 29 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 30 (SSRDTSGNHVL)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (b) (i) SEQ ID NO: 2 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 3 (ISYDGSNK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 4 (ARDSKGQSVRNRFDP)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 5 (NLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 6 (NSRDSSGNLVV)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (c) (i) SEQ ID NO: 8 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 9 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 10 (ARGWKYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 11 (EGIYHW)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 KA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 12 (QQYHTISRT)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (d) (i) SEQ ID NO: 14 (GFTFSSST)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 15 (VSYDGNTQ)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 16 (AGLWGSLLGYFQH)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 17 (QGVNNY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 AA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 18 (QQAHSFPPT)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (e) (i) SEQ ID NO: 20 (GFTFSTYW)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 21 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 22 (ATPTGDSDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 23 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GQ를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 24 (HSRDSSGNHVL)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (f) (i) SEQ ID NO: 32 (GFTFSTYW)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 33 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 34 (ATPTGDSDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 35 (QDIGNY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 DA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 36 (QKLSSYPLT)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (g) (i) SEQ ID NO: 38 (GFTFSNYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 39 (ISGSGSST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 40 (AKTSGWPYYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 41 (SSNIGNNY )를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 DN을 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 42 (CSYAGSSTLV)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (h) (i) SEQ ID NO: 44 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 45 (VSGTGVST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 46 (ARGLDWKSTPIDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 47 (QSISGW)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 48 (LQDYNGWT)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (i) (i) SEQ ID NO: 50 (GFTVSSNY)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 51 (IKQDGSEK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 52 (ARGGEEKNSGYYGDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 53 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 QD를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 54 (QAWDSSTAHYV)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (j) (i) SEQ ID NO: 56 (GFTFSSYV)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 57 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 58 (AKQNWYFDL)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 59 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 60 (NSRDSRGTHLEV)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; (k) (i) SEQ ID NO: 62 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 63 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 64 (AKSQGWAGDFDF)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 65 (SSDIGTYNY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 EV를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 66 (CSYAGSSTLV)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인; 또는 (l) (i) SEQ ID NO: 68 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 69 (ISSNGAIT)을 포함하는 CDHR2 영역, 및 (iii) SEQ ID NO: 70 (VKDLKPSSWPPIYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 71 (SLRTYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 72 (NSRDSSGNHHVV)을 포함하는 CDRL3 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 도메인.

일부 구현예에서, 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하거나 하기로 구성된다: (a) (i) SEQ ID NO: 26 (GFTFSGYW)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 27 (IKGDGTDI)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 28 (ARDLRQTHWFDS)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 29 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 30 (SSRDTSGNHVL)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (b) (i) SEQ ID NO: 2 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 3 (ISYDGSNK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 4 (ARDSKGQSVRNRFDP)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 5 (NLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 6 (NSRDSSGNLVV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (c) (i) SEQ ID NO: 8 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 9 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 10 (ARGWKYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 11 (EGIYHW)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 KA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 12 (QQYHTISRT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (d) (i) SEQ ID NO: 14 (GFTFSSST)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 15 (VSYDGNTQ)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 16 (AGLWGSLLGYFQH)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 17 (QGVNNY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 AA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 18 (QQAHSFPPT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (e) (i) SEQ ID NO: 20 (GFTFSTYW)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 21 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 22 (ATPTGDSDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 23 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GQ를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 24 (HSRDSSGNHVL)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (f) (i) SEQ ID NO: 32 (GFTFSTYW)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 33 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 34 (ATPTGDSDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 35 (QDIGNY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 DA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 36 (QKLSSYPLT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (g) (i) SEQ ID NO: 38 (GFTFSNYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 39 (ISGSGSST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 40 (AKTSGWPYYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 41 (SSNIGNNY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 DN을 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 42 (CSYAGSSTLV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (h) (i) SEQ ID NO: 44 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 45 (VSGTGVST)를 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 46 (ARGLDWKSTPIDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 47 (QSISGW)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GA를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 48 (LQDYNGWT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (i) (i) SEQ ID NO: 50 (GFTVSSNY)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 51 (IKQDGSEK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 52 (ARGGEEKNSGYYGDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 53 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 QD를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 54 (QAWDSSTAHYV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (j) (i) SEQ ID NO: 56 (GFTFSSYV)을 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 57 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 58 (AKQNWYFDL)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 59 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 60 (NSRDSRGTHLEV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; (k) (i) SEQ ID NO: 62 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 63 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 64 (AKSQGWAGDFDF)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 65 (SSDIGTYNY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 EV를 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 66 (CSYAGSSTLV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; 또는 (l) (i) SEQ ID NO: 68 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, (ii) SEQ ID NO: 69 (ISSNGAIT)을 포함하는 CDHR2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 70 (VKDLKPSSWPPIYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및 (i) SEQ ID NO: 71 (SLRTYY)를 포함하는 CDRL1 영역, (ii) 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 (iii) SEQ ID NO: 72 (NSRDSSGNHHVV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인.

일부 구현예에서, 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 25에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (c) SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (d) SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (e) SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (f) SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (g) SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (h) SEQ ID NO: 43 또는 SEQ ID NO: 43에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (i) SEQ ID NO: 49 또는 SEQ ID NO: 49에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (j) SEQ ID NO: 55 또는 SEQ ID NO: 55에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; (k) SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 61에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; 및 (l) SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 67에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열. 적합한 분리된 혈액-뇌 장벽(BBB)-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 scFv46.1, scFv3, scFv9, scFv17, scFv26, scFv6i, scFv5A, scFv2, scFv4B, scFv5E-0.4, scFvB3-R3 또는 scFv22Ch를 포함하거나 이로 구성된다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 25에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 25에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 25 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 30-32) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 25 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 29, 아미노산 서열 GE, 및 SEQ ID NO: 30)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 1 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 2-4) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 5, 아미노산 서열 AN, 및 SEQ ID NO: 6)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 7에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 7 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 9-11) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 7 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 11, 아미노산 서열 KA, 및 SEQ ID NO: 12)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 13에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 13 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 16-18) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 13 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 17, 아미노산 서열 AA, 및 SEQ ID NO: 18)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 19에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 19 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 22-25) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 19 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 23, 아미노산 서열 GQ, 및 SEQ ID NO: 24)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 31에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 31 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 37-39) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 31 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 35, 아미노산 서열 DA, 및 SEQ ID NO: 36)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 37에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 37 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 44-46) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 43 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 41, 아미노산 서열 DN 및 SEQ ID NO: 42)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 43에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 43에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 43 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 51-53) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 43 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 47, 아미노산 서열 GA 및 SEQ ID NO: 48)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 49에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 49에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 49 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 58-60) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 49 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 53, 아미노산 서열 QD, 및 SEQ ID NO: 54)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 55에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 55에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 55 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 65-67) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 55 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 59, 아미노산 서열 GE, 및 SEQ ID NO: 60)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 61에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 61에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 61 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 72-74) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 61 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 65, 아미노산 서열 EV, 및 SEQ ID NO: 66)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 67에서 발견되는 폴리펩티드에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 67에 대해 적어도 50% 동일성, 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 대안적으로 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 단백질은 SEQ ID NO: 67 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 (예를 들어, SEQ ID NO. 79-81) 내에서 적어도 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 67 내에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3(예를 들어, SEQ ID NO: 71, 아미노산 서열 AN, 및 SEQ ID NO: 72)과 100% 서열 동일성을 추가로 갖는다.

일부 구현예에서, 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되는 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다: (a) SEQ ID NO: 25; (b) SEQ ID NO: 1; (c) SEQ ID NO: 7; (d) SEQ ID NO: 13; (e) SEQ ID NO: 19; (f) SEQ ID NO: 31; (g) SEQ ID NO: 37; (h) SEQ ID NO: 43; (i) SEQ ID NO: 49; (j) SEQ ID NO: 55; (k) SEQ ID NO: 61; 및 (l) SEQ ID NO: 66.

본 발명은 또한 본원에 개시된 BBB-선택적 항체 및 항원-결합 단편의 변형된 형태를 포함한다. 예를 들어, 개시된 항체의 친화성, 특이성 또는 기타 특성을 수정하기를 원할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된다. 용어 "인간화된 항체"는 항원 특이성을 제공하는 상이한 종으로부터 취한 항체 단편을 포함하도록 인간 항체 프레임워크가 변형된 항체를 나타낸다. 이 용어는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체를 포함한다. 예를 들어, 인간 항체의 초가변 영역 잔기가 요망되는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류)으로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체될 수 있다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있고, 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나 및 전형적으로 2개 또는 3개 가변 도메인 모두를 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 루프에 상응하며, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 일부 양태에서, 인간화된 항체는 또한 임의적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 자세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명은 scFV46.1 또는 본원에 기술된 다른 scFv(scFv3, scFv9, scFv17, scFv26, scFv6i, scFv5A, scFv2F, scFv4B, scFv5E-0.4, scFvB3-R3, scFv22Ch)로부터의 CDR 도메인을 포함하는 인간화된 scFv 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

추가로, 본원에 개시된 scFv(즉, 전체 scFv 또는 이의 단편)로부터의 하나 이상의 CDR을 대안적 스캐폴드에 이식하기를 원할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 다른 종의 전체 IgG 스캐폴드 또는 인간 또는 다른 기원 종의 scFv 스캐폴드 내에 이식된다. 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 항체의 CDR(들) 또는 scFv를 인코딩하는 DNA 서열을 대안적 스캐폴드로 전달하는데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 본원에 사용된 용어 "단일쇄 가변 단편", "단일쇄 단편 가변" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L) 가변 영역의 융합 단백질을 지칭하고, 약 10개 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결되어 있다. 링커는 가용성을 위한 세린 또는 트레오닌 뿐만 아니라 유연성을 위한 글리신이 풍부할 수 있으며, V_H의 N-말단을 V_L의 C-말단과 연결하거나 그 반대로 연결할 수 있다. ScFv는 대장균 또는 사카로마이세스 세레비시애와 같은 미생물 세포 배양에서 종종 생성될 수 있다. ScFv는 또한 조직 배양, 예를 들어 포유동물 또는 인간 세포주에서 생성될 수 있다. ScFv는 예를 들어, 유세포 분석, 면역조직화학 및 인공 T 세포 수용체의 항원-결합 도메인과 같은 많은 용도를 갖는다. 본 발명은 scFv를 개시한다. 일 구현예에서, scFv는 본원에 기재된 바와 같은 3개의 중쇄 가변 도메인, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3, 및 3개의 경쇄 가변 도메인, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 함유한다. 일부 구현예에서, 추가적인 폴리펩티드 서열은 항체 또는 단편이 BBB에 결합할 수 있도록 (및 일부 예에서 BBB에 결합하고 전위할 수 있도록) 항체 또는 단편의 적절한 3차원 항원 결합 부위의 형성을 허용하도록 CDR1, CDR2 및 CDR3을 연결하는 데 사용된다.

일부 구현예에서, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되어 "항체 컨주게이트"를 형성한다. 일부 바람직한 구현예에서, 항체 및 제제는 BBB를 전위시킬 수 있다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제제에 컨쥬게이션될 수 있으며, BBB에 결합하여 제제를 운반하는 BBB를 가로질러 전위될 수 있으며, 이러한 제제는 뇌 내에서 측정가능한 양으로 축적될 수 있다(마우스 모델에서 입증된 바와 같이). 적합한 제제는 BBB를 통해 뇌로 전달하고자 하는 임의의 제제, 예를 들어 치료학적 신경계 제제 또는 검출 제제를 포함한다.

일반적으로, 항체를 화합물에 컨쥬게이션, 연결 및 커플링하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[문헌 [Nat Biotechnol. (2005) 23(9):1137-46; Cancer Immunol Immunother. (2003) 52(5):328-37; and Adv Drug Deliv Rev. (2003) 55(2):199-215] 참조]. 예를 들어, 본 발명의 항체를 일차 아민을 통해 제제에 연결하기를 원할 수 있다(문헌 [Pharmaceutical Research (2007) 24(9): p. 1759-1771] 참조). 예를 들어, 항체 또는 제제의 리신 잔기는 트라우트 시약(2-이미노티올란.HCL)을 사용하여 작용기화되어 티올을 생성할 수 있다. 이제 리신 잔기에 부착된 티올 기는 말레이미드-작용기화된 약물 또는 벡터와 반응하여 안정한 티오-에테르 결합을 발생시킨다. 입체 장애를 줄이기 위해 폴리-에틸렌 글리콜과 같은 화학적 스페이서를 임의적으로 사용할 수 있다. 대안적으로, 항체를 제제에 비공유적으로 연결하기를 원할 수 있다. 예를 들어, 비오틴/스트렙타비딘 상호작용을 사용할 수 있다(그 전체가 참고로 포함된 문헌 [Pharmaceutical Research(2007) 24(9): p. 1759-1771] 참조). 항체 또는 제제의 리신 잔기는 많은 상업적 방법 중 하나를 이용하여 바이오티닐화될 수 있다(예를 들어, N-하이드록시석신이미드 비오틴 유사체). 그 후, 항체 또는 제제(어느 것이든 이전 단계에서 변형되지 않은 것)는 스트렙타비딘 또는 이의 변이체 중 하나(예를 들어, 뉴트라비딘)에 컨쥬게이션될 것이다. 모노바이오티닐화된 시약 및 스트렙타비딘-컨쥬게이션된 카운터파트는 조합되고, 거의 공유 결합 친화도가 시약을 함께 유지시킬 것이다. 컨쥬게이션은 임의적으로 절단가능 또는 비-절단가능 링커로 달성될 수 있다.

일부 예에서, 제제는 융합 단백질로서 항체 폴리펩티드 서열과 동시에 번역되는 폴리펩티드이다. 약리학적 또는 치료학적 관련 펩티드와의 융합 단백질로서 항체를 발현하기를 원할 수 있다. 예를 들어, 단백질 링커 및 단백질 치료제를 사용하여 본 발명의 scFv를 발현시키기를 원할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술(예를 들어, 제한 효소 기반 서브클로닝 또는 상동성 기반 서브클로닝)을 사용하여 표적화 벡터를 갖는 프레임에 제제를 인코딩하는 DNA 서열을 배치할 수 있다. 임의적으로, 단백질 링커를 첨가하여 입체 장애를 피할 수 있다. 그 후, 융합 단백질은 세포(예를 들어, 효모, 박테리아, 곤충 또는 포유동물 세포)에서 하나의 펩티드로 생성되고, 사용 전에 정제된다. 제제는 전체 단백질일 필요는 없음을 유의한다. (예를 들어, 이는 하나 초과의 펩티드를 갖는 단백질에서 서브유닛으로서의 단일 펩티드 사슬일 수 있다. 다른 펩티드는 벡터 융합과 함께 공동-발현될 수 있으며, 세포 내에서 또는 분비 후 회합되도록 허용될 수 있다).

본원에 사용된 용어 "제제"는 본 발명의 항체의 정제, 확인, 검출, 진단, 영상화 또는 치료학적 용도를 허용하는 임의의 유용한 모이어티를 포함한다. 제제는 의도된 적용(예를 들어, 특징 질병의 치료)의 목적에 따라 선택된다. 일부 구현예에서, 제제는 치료제, 약학적 제제 또는 이들의 조합물이다. 예시적인 치료제는 비제한적으로, 약제, 생물학적 제제, 독소, 독소 단편, 알킬화제, 효소, 항생제, 항대사물질, 항증식제, 화학요법제, 호르몬, 신경전달 물질, DNA, RNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 압타머, 진단제, 방사선불투과성 염료, 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 자기 표지, 나노입자, 마커 화합물, 렉틴, 세포 막 투과성을 변경시키는 화합물, 광화학적 화합물, 소분자, 리포솜, 미셀, 유전자 치료 벡터, 바이러스 벡터, 면역학적 치료 작제물 및 기타 약물을을 포함한다. 구체적으로, 신경학적 약물 또는 대상체의 뇌에 작용하는 약물은 본 발명에서 사용하기에 적합하다.

본원에 사용하기 위해, 용어 "항체 컨쥬게이트"는 제제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 상기 기재된 항체를 포함한다.

다른 구현예에서, 제제는 진단제 또는 영상화제이다. 적합한 영상화제는 비제한적으로, 에피토프 태그, 검출가능한 마커, 방사성 마커 및 나노입자를 포함한다. 적합한 에피토프 태그는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로 특히 6-히스티딘(His), 헤마글루티닌(HA), cMyc, GST, Flag 태그, V5 태그, NE-태그를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 정제 태그(즉, 다른 비-특이적 단백질로부터의 항체의 분리를 허용하는 제제)로서 사용된다. 적합한 검출가능한 마커는 발광 마커, 형광 마커(예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트[pi]아지닐아민 플루오레세인, 그린 형광 단백질(GFP), 레드 형광 단백질(RFP), 스펙트럼의 자외선(UV) 부분에서의 파장에서 여기되는 블루 형광 염료(예를 들어, AMCA (7-아미노-4-메틸코우마린-3-아세트산); Alexa Fluor 350), 청색 광에 의해 여기되는 녹색 형광 염료(예를 들어, FITC, Cy2, Alexa Fluor 488), 녹색광에 의해 여기되는 적색 형광 염료(예를 들어, 로다민, Texas Red, Cy3, Alexa Fluor dyes 546, 564 및 594), 또는 적외선에 의해 여기되는 염료(예를 들어, Cy5), 단실 클로라이드 및 피코에리트린), 또는 효소 마커(예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코스-6-포스파타제 및 아세틸콜린에스테라제)를 포함한다. 적합한 방사성 마커는 비제한적으로 ¹²⁵l, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다. 금속 나노입자 및 기타 금속 킬레이트를 포함하는 적합한 나노입자는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로 금 나노입자(B. Van de Broek et al., ACSNano, Vol. 5, No. 6, 4319-4328, 2011), 양자점(A. Sukhanova et al., Nanomedicine, 8 (2012) 516-525), 자기 나노입자(Fe₃O₄), 은 나노입자, 나노쉘 및 나노케이지를 포함한다.

관심 물질을 폴리펩티드, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 연결하는 통상적인 연결 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Ternynck and Avrameas, 1987, "Techniques immunoenzymatiques" Ed. INSERM, Paris or G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2010, Academic Press] 참조). 많은 화학적 가교 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 가교 시약은 동종이작용기성(즉, 동일한 반응을 겪는 2개의 작용기를 가짐) 또는 이종이작용기성(즉, 2개의 상이한 작용기를 가짐)일 수 있다. 수많은 가교 시약은 상업적으로 이용가능하다. 이들의 사용에 대한 제세한 지침은 시중의 공급업체에서 용이하게 구할 수 있다. 폴리펩티드 가교 및 컨쥬게이트 제조에 대한 일반적인 참고문헌은 [WONG, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press (1991)]이다.

BBB-표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물이 또한 본원에서 고려된다. 조성물은 제제에 컨쥬게이션된 BBB-표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 조성물은 추가로 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 요망되는 투여 경로에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, BBB-표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약학적 활성 화합물이 로딩된 리포솜, 나노입자 또는 기타 유사한 담체와 조합되어 제공될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Sugano et al., Antibody Targeting of Doxorubicin-loaded Liposomes Suppresses the Growth and Metastatic Spread of Established Human Lung Tumor Xenografts in Severe Combined Immunodeficient Mice Cancer Research 60, 6942-6949, Dec. 15, 2000 and Martin et al., Nanomaterials in Analytical Chemistry, Analytical Chemistry News &Features, May 1, 1998; pp. 322 A-327 A] 참조). 본원에 사용된 바와 같은 문구 "약학적 활성 화합물과 조합된 항체"는 제조 방법에 의해 제한되지 않으며, 이러한 조성물은 비제한적으로 당업계에 공지된 컨쥬게이팅, 연결, 커플링 및 데코레이팅 기술에 의해 생성될 수 있다.

나노입자는 직경 1 내지 100 나노미터(nm)인 물질의 입자이며, 예를 들어, 특히 지질-기재 나노입자, 중합체성 나노입자(예를 들어, 자연 또는 합성 물질, 단량체, 사전형성된 중합체로부터 합성됨, 폴리머좀, 덴드리머, 중합체 미셀, 나노스피어 등 포함), 무기 나노입자(예를 들어, 실리카, 산화철, 금 등)를 포함하는 많은 다양한 물질로 제조될 수 있다.

리포솜은 하나 이상의 인지질 이중층을 포함하는 소포이다. 이러한 소포는 수성 내부 공동에 수용성 분자를 캡슐화하는데 사용될 수 있는 반면, 수불용성 분자는 지질 이중층의 소수성 영역에 포함될 수 있다. 리포솜은 작거나(0.025-0.05 μm) 클 수 있다(0.05-10 μm). 임의적으로, 본원에 기재된 리포솜은 약 50-5,000 nm, 약 50-1,000 nm, 또는 5,000 nm 또는 1,000 nm 미만의 직경을 가질 수 있다. 리포솜은 단일라멜라(하나의 지질 이중층을 가짐) 또는 다중라멜라(2개 이상의 지질 이중층을 가짐)일 수 있으며, 리포솜 집단은 단일라멜라 및 다중라멜라 리포솜을 모두 함유할 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [Akbarzadeh et al., Nanoscale Res. Letters, 8:102-110 (2013)] 참조. 다중라멜라 리포솜은 임의적으로 지질 이중층 사이의 가교를 포함할 수 있다. 이러한 가교는 예를 들어 보론산 에스테르 또는 티오케탈 가교를 포함한다. 리포솜은 천연 또는 합성 공급원으로부터의 인지질을 사용하여 제조될 수 있다. 리포솜은 당업계에 공지되어 있으며, 양이온성 지질, 중성 지질 또는 비-양이온성 지질을 포함할 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

내부 공동은 리포솜의 가장 안쪽의 지질 이중층 내부의 공간이며, 이중층 공간 또는 층간 공간은 임의의 두 지질 이중층 사이의 공간이다. 예를 들어, 3개의 지질 이중층을 갖는 다중라멜라 리포솜에서, 내부 공동은 첫 번째(가장 안쪽) 지질 이중층 내의 공간일 것이며, 이중층간 공간은 첫 번째 및 두 번째(중간) 지질 이중층 사이의 공간일 것이며, 또 다른 이중층간 공간은 두 번째 및 세 번째(가장 바깥쪽) 지질 이중층 사이에 있을 것이다.

리포솜 지질 이중층을 제조하는데 사용되는 지질은 비제한적으로, 인지질, 스핑고지질, 글리코스핑고지질, 포화된 글리세리드, 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), 합성 인지질 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 임의적으로, 지질 이중층의 하나 이상의 지질은 하이드록실 기 및/또는 디올 헤드 기를 함유한다. 임의적으로, 지질 이중층에서 지질의 탄화수소 사슬은 동일하거나 거의 동일한 길이이다.

지질 이중층의 지질은 하나 이상의 상이한 유형의 지질을 포함할 수 있다. 2개 이상의 지질은 함께 패킹되어 이중층을 형성할 수 있으며, 특정 지질은 이중층의 소수성 부분 내로 통합될 수 있다. 지질 이중층은 지질 연속성일 수 있거나 이중층의 섬으로 구성될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 다양한 지질의 탄화수소 사슬은 동일하거나 상이한 길이일 수 있음을 또한 이해해야 한다.

리포솜 지질 이중층은 전형적으로 주요 구조 분자로서 지질을 함유하지만, 이중층 또는 지질 자체는 하나 이상의 추가 성분을 함유할 수 있다. 임의적으로, 추가 성분은 비제한적으로 세정제, 단백질-컨쥬게이션된 분자, 페길화된 분자 및 지방족 앵커를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 추가의 성분은 예를 들어, 소수성 상호작용, 지질 이중층에의 비공유 부착, 또는 지질 이중층에 대한 공유 부착(예를 들어, 지질 헤드 기와의 결합 형성을 통해)에 의해 지질 이중층에 삽입될 수 있다. 리포솜 지질 이중층의 추가 성분은 비제한적으로 막 유동성, 투과성, 유연성, 융합성, 안정성, 전하/정전기, 대칭, 세포 흡수, 분해 등을 포함하는 지질 이중층의 특성을 변경할 수 있다. 예를 들어, 지질 이중층에의 콜레스테롤의 첨가는 리포솜의 투과성 및 유동성을 감소시키는 반면, PEG는 순환 기간을 증가시킨다. 예를 들어, 그 전체가 참조로 본원에 통합된 문헌 [Bozzuto et al., Intl J. of Nanomedicine, 10: 975-999 (2015)] 참조.

BBB에 결합하는 개시된 항체 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 제공된다. 제제에 컨쥬게이션되고/거나 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 조성물은 대상체에 투여하기 위한 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 투여의 양과 시점은 원하는 결과를 달성하기 위해 치료하는 임상의의 재량에 달려 있다. 항체는 전신 또는 국소(예컨대, 정맥내, 척추강내, 두개내) 투여를 위해 제형화될 수 있다. 한 예에서, 항체는 정맥내 투여와 같은 비경구 투여를 위해 제형화된다.

본원에 사용된 바와 같은 "약학적 조성물"은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 치료학적 유효량의 항체를 의미한다. "약학적으로 허용되는" 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로 예를 들어, 적합한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 리포솜, 나노입자 및 애주번트를 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 비제한적으로 0.01 내지 0.1 M, 및 바람직하게는 0.05 M 인산염 완충액 또는 0.9% 염수를 포함한다. 또한, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼일 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브유 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체는 등장성 용액, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 염수 및 완충된 매질을 포함하는 현탁액을 포함한다.

본 개시내용의 약학적 조성물은 액체 또는 동결건조된 또는 달리 건조된 제형을 포함할 수 있으며, 다양한 완충제 함량(예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 인산염), pH 및 이온 강도의 희석제, 첨가제, 예컨대 표면에 대한 흡수를 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴, 세정제(예를 들어, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, 담즙산염), 가용화제(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 보존제(예를 들어, 티메로살, 벤질 알콜, 파라벤), 완충 물질 또는 장성 변형제(예를 들어, 락토스, 만니톨), 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 단백질에의 공유 부착, 금속 이온과의 착물화, 또는 중합성 화합물, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등의 미립자 제조물 내로의 또는 상으로의 또는 리포솜, 마이크로에멀젼, 미셀, 밀라멜라 또는 다중라멜라 소포, 적혈구 고스트 또는 스페로플라스트 상으로의 물질의 혼입을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 것이다. 제어 또는 지속 방출 조성물은 친유성 데폿(예를 들어, 지방산, 왁스, 오일)에서의 제형을 포함한다.

약학적 조성물은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건과 비슷하게 만들기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 추가 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제, 독성 조절제, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등을 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 항체는 동결건조된 형태로 제공되고, 투여 전 멸균수 또는 식염수로 재수화된다. 일부 구현예에서, 항체는 공지된 농도의 멸균 용액으로 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 조성물은 0.9% 염화나트륨, USP를 함유하는 주입 백에 첨가될 수 있으며, 일부 경우에 0.5 내지 15 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 보존적 또는 중요하지 않은 치환 또는 결실을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 BBB-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하고, 일부 예에서, BBB-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 외의 제제를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 전사의 조절을 허용하는 이종성 전사 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 적절한 제어 서열에 연결되어 세포에서 이의 번역 조절을 허용할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 제제 포함)을 발현하는 세포, 및 본원에 개시된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다 . 일부 구현예에서, 세포는 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 세포는 항체를 발현할 수 있는 임의의 세포일 수 있으며, 원핵 또는 진핵 세포일 수 있음을 이해해야 한다. 적합한 세포는 비제한적으로, 진균, 포유동물 세포, 곤충 세포(예를 들어, 바쿨로바이러스 발현 시스템 사용), 식물 세포(예를 들어, 옥수수, 쌀 또는 애기장애)를 포함한다. 일반적으로 문헌 [Verma, R. et al., J Immunol Methods. 1998 Jul. 1; 216(1-2):165-81] 참조. 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 계대 수에 관계 없이 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.

방법:

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 BBB로 및/또는 이를 가로질러 제제를 표적화하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 개시된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 이들 방법에서, 항체는 (1) 직접적으로 또는 간접적으로 제제에 연결되고, (2) BBB를 특이적으로 표적화할 수 있으며, (3) 일부 예에서, 이 조직을 표적화한 후 BBB를 전위시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 대상체의 뇌에서 nM 수준으로 축적될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 정맥내 주사를 통해 또는 복강내 및 피하 방법을 통해 투여된다. 이러한 방법은 정제된 BBB-표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편(본원에 기재된)과 조합된 약학적으로 활성 또는 치료학적 화합물을 항체/이의 항원-결합 단편이 대상체 뇌로 혈액 뇌 장벽에 및/또는 혈액 뇌 장벽을 가로질러 제제의 전달을 지시하도록 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 BBB에 대해 치료제를 표적화하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 개시된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법에서, 항체가 BBB로 및/또는 BBB를 가로질러 대상체의 뇌로 치료제 전달을 지시하도록 치료제에 항체가 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.

본 방법에서, 항체는 동결건조된 형태로 제공될 수 있으며, 투여 전 멸균수 또는 식염수로 재수화될 수 있다. 대안적으로, 항체는 공지된 농도의 멸균 용액으로 제공될 수 있다. 또한, 항체 조성물은 0.9% 염화나트륨, USP를 함유하는 주입 백에 첨가될 수 있으며, 일부 경우에 0.5 내지 15 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.

키트:

최종 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본원에 기술된 방법을 수행하는데 사용될 수 있다.

정의:

투여. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는" 및 "투여"는 대상체에 약학적 제조물을 제공하는 임의의 방법을 지칭한다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 경구 투여, 경피 투여, 흡입에 의한 투여, 비강 투여, 국소 투여, 질내 투여, 안과 투여, 귀내 투여, 뇌내 투여, 직장 투여, 설하 투여, 협측 투여 및 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 경막내 투여 및 피하 투여와 같은 주사를 포함하는 비경구 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 투여는 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 다양한 양태에서, 제조물은 치료학적으로 투여될 수 있으며; 즉 기존 질병 또는 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다.

키메라 항체. 용어 "키메라 항체"는 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조된, 하나의 공급원 또는 종으로부터의 가변 영역(즉, 결합 영역) 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터의 불변 영역을 포함하는 인간 항체로 변형될 수 있다. 용어 "키메라 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 분리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대한 유전자이식된 숙주 세포(예를 들어, SP2-0, NS0 또는 CHO 세포) 또는 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태의 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 일부 구현예에서, 불변 영역을 갖는다. "키메라 항체"의 다른 형태는 클래스 또는 하위 클래스가 원래 항체의 클래스 또는 하위 클래스에서 변형되거나 변경된 것이다. 이러한 "키메라" 항체는 "클래스-전환 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체를 생성하는 방법은 현재 당업계에 잘 알려진 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술을 포함한다.

상보성 결정 영역(CDR). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 면역글로불린(항체) 및 T 세포 수용체에서 이들 분자가 이들의 특이적 항원에 결합하는 가변 사슬의 일부를 지칭한다. 분자의 가장 가변적인 부분으로서 CDR은 림프구에 의해 생성된 항원 특이성의 다양성에 결정적이다. 항원 수용체의 가변 도메인의 아미노산 서열에는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)이 비연속적으로 배열되어 있다. 항원 수용체는 전형적으로 2개의 가변 도메인(2개의 상이한 폴리펩티드 사슬 상: 중쇄 및 경쇄)으로 구성되기 때문에, 항원과 집합적으로 접촉할 수 있는 각 항원 수용체에 대해 6개의 CDR이 있다. 단일 전체 항체 분자는 2개의 항원 수용체를 가지며, 따라서 12개의 CDR을 함유한다. 60개의 CDR은 오량체 IgM 분자에서 찾을 수 있다. 가변 도메인 내에서, CDR1 및 CDR2는 폴리펩티드 사슬의 가변(V) 영역에서 발견될 수 있고, CDR3은 V의 일부, 다양성(D, 중쇄만) 및 연결(J) 영역 모두를 포함한다. 면역글로불린 및 T 세포 수용체와 관련된 대부분의 서열 변이가 CDR에서 발견되기 때문에, 이러한 영역은 때때로 초가변 영역으로서 지칭된다. 이들 중, CDR3은 경쇄 영역의 경우의 VJ와 중쇄 경우의 VDJ의 재조합에 의해 인코딩되어 가장 큰 가변성을 나타낸다. 항체의 3차 구조는 새로운 항체를 분석하고 설계하는데 중요하다.

모노클로날 항체. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조물을 지칭한다. 모노클로날 항체는 또한 "인간 모노클로날 항체"를 포함하며, 이는 단일 결합 특이성을 나타내며, 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 및 불변 영역을 갖는다. 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있으며, 이는 불멸화된 세포에 융합된 인간 경쇄 전이유전자 및 인간 중쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 인간외 동물(예를 들어, 유전자이식 마우스)로부터 수득된 B 세포를 포함한다.

서열 동일성의 백분율. "서열 동일성의 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 창에 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 부분이 두 서열의 최적 정렬에 있어서 참조 서열(이는 추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 발생하여 일치하는 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 일치하는 위치의 수를 비교 창의 총 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 단백질 및 핵산 서열 동일성은 당업계에 잘 알려진 Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST")를 사용하여 평가하였다(Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268; Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402). BLAST 프로그램은 바람직하게는 단백질 또는 핵산 서열 데이터베이스로부터 수득되는 테스트 서열 및 쿼리 아미노산 또는 핵산 서열 사이에서 "고득점 분절 쌍"으로서 본원에서 지칭되는 유사한 절편을 식별함으로써 상동성 서열을 식별한다. 바람직하게는, 고득점 분절 쌍의 통계적 유의성은 통계적 유의성 공식(Karlin and Altschul, 1990)을 사용하여 평가되며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 통합된다. BLAST 프로그램은 기본 파라미터 또는 사용자가 제공한 수정 파라미터와 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 아미노산 서열의 "서열 동일성"이라는 용어는 일반적으로 적어도 40%의 폴리펩티드 서열 동일성을 의미한다. 폴리펩티드의 바람직한 동일성 퍼센트는 40% 내지 100%의 임의의 정수일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예는 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 포함한다.

폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적인 동일성"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드가 적어도 25% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 대안적으로, 동일성 퍼센트는 25% 내지 100%의 임의의 정수일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예는 본원에 기술된 프로그램; 바람직하게는 기술된 바와 같은 표준 파라미터를 사용하는 BLAST를 사용하여 참조 서열과 비교하여 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 이들 값은 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치 등을 고려하여 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 상응하는 단백질 동일성을 결정하기 위해 적절하게 조정될 수 있다.

본 발명의 목적상 아미노산 서열의 "실질적인 동일성"은 일반적으로 적어도 40%의 폴리펩티드 서열 동일성을 의미한다. 폴리펩티드의 바람직한 동일성 퍼센트는 40% 내지 100%의 임의의 정수일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예는 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 포함한다.

단백질. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접한 잔기의 알파-아미노와 카르복시 기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 변형된 아미노산(예를 들어, 인산화된, 글리케이트된, 글리코실화된 등) 및 아미노산 유사체를 포함하는 단백질 아미노산의 중합체를 지칭한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 비교적 큰 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 반면, 용어 "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드와 관련하여 사용되지만, 당업계에서 이러한 용어의 사용은 중복된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인코딩된 유전자 생성물 및 이의 단편을 언급할 때 본원에 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 생성물, 자연 발생 단백질, 상동체, 이종상동체, 파라로그, 단편 및 기타 등가물, 변이체, 단편 및 전술한 것의 유사체를 포함한다. 본 발명의 항체는 폴리펩티드이다.

대상체. 본원에 사용된 바와 같은 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물 및 비-포유동물을 지칭한다. "포유동물"은 비제한적으로, 인간, 인간 외 영장류(예를 들어, 침팬지, 기타 유인원 및 원숭이 종), 농장 동물(예를 들어, 소, 말, 양, 염소 및 돼지), 가축(예를 들어, 토끼, 개 및 고양이), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스 및 기니피그)를 포함하는 실험 동물을 포함하는 포유강의 임의의 구성원을 의미한다. 비포유동물의 예는 비제한적으로 새 등을 포함한다. 용어 "대상체"는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 한 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.

치료제. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료제"는 유기체(인간 또는 비인간 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 요망되는 약리학적, 면역원성 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 물질의 임의의 합성 또는 자연 발생 생물학적 활성 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산, 유전자 작제물 등과 같은 분자를 포함하는 약물, 화학요법제 및 생물약제로 전통적으로 간주되는 화합물 또는 화학물질을 포함한다. 치료제의 예는 Merck Index(14판), Physicians' Desk Reference(64판) 및 The Pharmacological Basis of Therapeutics(12판)와 같은 잘 알려진 참고 문헌에 설명되어 있으며, 이들은 비제한적으로 질병 또는 질병의 치료, 예방, 진단, 치료 또는 완화에 사용되는 물질; 신체의 구조나 기능에 영향을 미치는 물질 또는 생리학적 환경에 배치된 후 생물학적으로 활성이 되거나 더 활성화되는 전구약물을 포함한다.

치료. 본 발명의 목적상 "치료하는" 또는 "치료"는 질병, 병태 또는 장애를 퇴치할 목적으로 대상체의 관리 및 보살핌을 설명한다. 치료는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하여 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 완화하거나, 질병, 병태 또는 장애를 제거하는 것을 포함한다. 구체적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뇌 또는 신경계 장애를 치료하거나 뇌에 국한된 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

벡터. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터" 또는 "재조합 벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 이것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 발현 벡터를 포함하는 벡터는 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 인코딩된 폴리펩티드의 발현 및 벡터의 적절한 증식에 필요한 이종성 서열을 포함한다. 이종성 서열(즉, 폴리펩티드와 상이한 종으로부터의 서열)은 폴리펩티드의 발현을 허용하는 이종 프로모터 또는 이종 전사 조절 영역을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이종 프로모터", "프로모터", "프로모터 영역" 또는 "프로모터 서열"은 일반적으로 유전자의 전사 조절 영역을 지칭하며, 이는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측에서 또는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역 내에서 또는 폴리뉴클레오티드의 인트로 내에서 발견될 수 있다. 전형적으로, 프로모터는 세포에서 RNA 중합효소에 결합하고, 다운스트림(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 전형적인 5' 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 결합되고, 업스트림(5' 방향)으로 확장되어 배경 위에서 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는 데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함한다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위는 물론 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(콘센서스 서열)이 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 카세트가 또한 고려된다. 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 전사의 조절을 허용하는 이종 전사 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 본 발명은 또한 숙주 세포에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 전사 조절을 허용하는 전사 프로모터의 제어 하에 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 카세트를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 적절한 제어 서열에 연결되어 숙주 세포에서 이의 번역 조절을 허용할 수 있다.

숙주 세포. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 발현 카세트 또는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다. 숙주 세포는 본 발명의 항체를 발현할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 비제한적으로 포유동물 세포 및 효모 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포일 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭하며, 이러한 세포의 자손도 포함된다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 계대 수에 관계 없이 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.

본 발명은 하나 이상의 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었으며, 명시적으로 언급된 것 외에도 많은 등가물, 대안, 변형 및 수정이 가능하고 본 발명의 범위에 있음이 이해되어야 한다.

이미 기재된 것 이외에 많은 추가적인 변형이 본 발명의 개념을 벗어남이 없이 가능함이 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시내용을 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. "포함하는"이라는 용어의 변형은 비배타적인 방식으로 요소, 구성 요소 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석되어야 하며, 따라서 참조된 요소, 구성 요소 또는 단계는 명시적으로 언급되지 않은 다른 요소, 구성 요소 또는 단계와 조합될 수 있다. 특정 요소를 "포함하는" 것으로 언급된 구현예는 또한 이러한 요소로 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는" 것으로서 고려된다. "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"이라는 용어는 MPEP 및 관련 연방 순회 해석에 따라 해석되어야 한다. "본질적으로 구성되는"이라는 과도기 문구는 특정 물질 또는 단계에 대한 청구 범위를 청구된 발명의 "기본적이고 새로운 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는" 것으로 제한한다. "구성되는"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제하는 폐쇄된 용어이다. 예를 들어, 서열과 관련하여 "구성되는"은 SEQ ID NO에 열거된 서열을 나타내며, SEQ ID를 그 일부로 함유할 수 있는 더 큰 서열을 나타낸다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 고려하여 더욱 완전히 이해될 것이다.

실시예

혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지르는 약물 전달은 신경계 질환 치료제의 개발에 중요한 장애물로 남아 있다. 뇌로의 혈액-매개 치료제의 낮은 침투는 종종 BBB를 포함하는 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)의 제한적 특성에 기인할 수 있다. 성공적으로 활용되기 시작한 한 가지 전략은 표적 치료제를 뇌로 이동시키는 수단으로서 내인성 수용체-매개된 통과세포외배출(RMT) 시스템을 사용하는 것이다. 공지된 RMT 표적 및 이들의 동족 표적 시약의 한계에는 뇌 특이성, 뇌 흡수 수준 및 오프-타겟 효과가 포함되어, 새롭고 잠재적으로 개선된 뇌 표적화 시약-RMT 쌍에 대한 조사를 유도한다. 하기 실시예에서, 본 발명자들은 새로운 RMT-표적화 항체 쌍을 발굴할 모델 BBB 기질로서 인간 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)-유래된 BMEC-유사 세포를 효율적으로 사용하였다. 비면역 인간 단일-사슬 가변 단편(scFv) 파아지 디스플레이 라이브러리는 iPSC-유래된 BMEC에의 결합, 내재화 및 통과세포외배출에 대해 스크리닝하였다. 리드 후보는 BMEC로의 결합 및 내재화 뿐만 아니라 뇌 조직 절편에서 인간 및 마우스 BBB 둘 모두에 대한 결합을 나타내었다. 항체는 뇌 축적(8.1 nM)에서 26배 증가를 나타내는 한 특정 클론 46.1-scFv를 정맥내 투여한 후 쥐과동물 BBB를 표적화하였다. 게다가, 클론 46.1-scFv는 혈관후 실질 세포와 연관되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 BBB를 가로지르는 성공적인 수용체-매개된 수송을 나타낸다. 이러한 새로운 BBB 표적화 리간드는 치료 분자의 뇌로의 수송을 향상시킬 수 있다.

재료 및 방법:

실험 설계: 샘플 크기: 샘플 크기는 특정 검정에 의존적이고, 도면 범례에 표시된다. 데이터 수집 중단 규칙: 시험관내 및 생체내 검정 둘 모두에 대해 방법 및 도면 범례에 명시된 대로 사전 정의된 종료점에서 데이터를 수집하였다. 데이터 포함/제외 기준: 생성된 데이터는 원고에 포괄적으로 표시된다. 이상치: 임의의 제시된 데이터 세트에서 이상치 데이터 포인트는 제거하지 않았다. 종점 선택: 연구 종점은 각 검정에 대해 미리 정의되었으며 아래 방법 섹션에 기록되어 있다. 복제: 모든 시험관내 검정은 방법 섹션에 설명된 바와 같이 다중 복제로 수행되었으며 동물 수는 존재하는 경우 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 측정하기 위해 전력을 공급하였다. 연구 목적: 이 연구의 전반적인 목표는 시험관내에서 혈액-뇌 장벽과 상호작용하고 이를 가로질러 수송할 수 있을 뿐만 아니라 전신 투여 후 생체내에서 혈액-뇌 장벽을 표적으로 할 수 있는 항체를 식별하고 특성 규명하는 것이었다. 연구 대상 또는 조사 유닛: iPSC-유래된 BMEC, 인간 및 쥐과 조직 절편, C57BL6 마우스. 실험 설계: 통제된 실험실 실험이었다. 초기 스크린은 파아지 상에 디스플레이된 리드 scFv를 식별하였다. 후속하여, scFv를 생성하고, 쥐과동물 및 인간 조직 결합, BMEC 내재화 및 쥐과동물 뇌 흡수에 대해 분석하였다. 무작위화: 마우스를 무작위로 대조군 및 테스트 항체 그룹에 할당하였다. 블라인딩: 개별 연구원이 유전자 클로닝으로부터 쥐과동물 투여에 이르기까지의 과정의 각 단계를 수행하여 이 개념 증명 연구에서 블라인딩을 비실용적으로 만들었다는 점을 감안하여 연구원들은 일반적으로 블라인딩하지 않았다.

세포 배양: BMEC 분화는 IMR90-C4 iPSC 라인 및 레티노산 유도를 사용하여 이전에 설명된 대로 수행하였다(17,18). 분화 8일째에, BMEC를 콜라겐/피브로넥틴 코팅된 조직 배양 플레이트 또는 1 μm 기공 크기 폴리-에스테르 트랜스웰(Corning #CLS3462)에 플레이팅하였다. 일차 인간 폐 및 심장 미세혈관 내피 세포(hLEC 및 hCEC, CC-2527 및 CC-7030)를 LONZA (Walkersville, MD)로부터 수득하고, 제조업체의 지시에 따라 배양하였다.

파아지 스크린: 모든 스크리닝 방법은 이전에 설명된 fd-tet 기반 인간 scFv 라이브러리를 사용하여 Zhou 및 Marks에 설명된 프로토콜로부터 조정된다(22, 42, 43). 처음에, 인간 scFv 라이브러리를 T-75 플라스크에서 성장한 hLEC 및 hCEC에 대한 연속 적용에 의해 미리 차감하였다. 모든 스크리닝 라운드는 각 세포 유형에 적합한 배양 배지에서 수행하였다. 각 라운드에서 10¹¹ 콜로니 형성 유닛(CFU)을 융합성 세포 단층에 적용하였다. 사전-차감 라운드는 얼음 위에서 1hr 동안 단층에서 라이브러리를 인큐베이션하여 수행한 반면, BMEC에 대한 내재화 라운드는 37℃에서 1hr 동안 BMEC에서 파아지 라이브러리를 인큐베이션하여 수행하였다. 파아지 내재화 후, 배지를 흡인시키고, 세포를 스트리핑 완충액 I(150 mM NaCl, 100 mM 글리신, pH 2.5)로 1X 및 스트립핑 완충액 II(500 mM NaCl, 50 mM 글리신, 0.2M 우레아, pH 2.8)으로 2X 5분 동안 RT에서 세척하여 막 결합 파아지를 제거하였다. BMEC를 트립신 처리에 의해 분리하고, 4℃에서 5분 동안 300 g에서 회전시켰다. 그 후, 세포 펠렛을 빙냉 용해 완충액(트리에탄올아민 100 mM)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하고, 중화하였다(Tris-HCl pH 7.4). 각 선택 라운드로부터 용출된 파아지는 대수기 대장균 TG1 세포를 감염시키는데 사용하였다. 파아지 입자를 박테리아로부터 구조하고, 증폭시키고, 이전에 기술된 바와 같이 항체 스크리닝의 후속 라운드에 사용하였다(30). 총 1회의 사전 차감 및 3회의 내재화 라운드를 수행하였다.

통과세포외배출 스크린의 경우, 세 번째 내재화 라운드의 10¹¹ CFU를 최소 TEER이 1000ohm-cm²인 1 μm 기공 크기 트랜스웰의 BMEC 단층의 상단에 투여하고, TG1 감염에 대한 하단 챔버로부터 파아지 함유 배지를 수확하기 전에 37℃에서 3hr 동안 통과세포외배출을 허용하였다. 경쟁 통과세포외배출 스크린 선택을 위해, 세 번째 내재화 라운드의 10¹¹ CFU를 1 μM의 가용성 scFv 3 및 22Ch와 함께 BMEC 상에 투여하고, TG1 감염을 위해 바닥 챔버로부터 파아지 함유 배지를 수확하기 전에 37℃에서 3hr 동안 통과세포외배출을 허용하였다.

개별적 파아지-감염된 TG1 콜로니를 밤새 성장시키고, DNA를 열 추출하고, scFv 유전자에 측접한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. 프라이머 서열은 각각 정방향 및 역방향 프라이머에 있어서 5′-TTTTTGGAGATTTTCAACGTGA-3′ (SEQ ID NO: 73), 및 5′-GAATTTTCTGTATGAGGTTTTGCTAAA-3′ (SEQ ID NO: 74)이었다. 그런 다음 PCR 단편을 Sanger 시퀀싱하였다.

파아지 면역세포화학: BMEC를 상기 기술된 바와 같이 96-웰 조직 배양 플레이트 상에서 정제하였다. 검정 일에 BMEC의 각 웰은 40% 염소 혈청(PBSCMG) (Sigma- Aldrich, #G6767)이 보충된 칼슘 및 마그네슘을 지닌 250 μL의 PBS (PBSCM; 1 mM의 염화칼슘 및 0.5 mM의 황산마그네슘을 갖는 PBS)로 차단하였다. 웰을 250 μL의 PBSCM으로 3회 세척하였다. 다음으로, 세포를 실온에서 10분 동안 파라포름알데하이드(PFA, PBS 중 4% w/v)로 고정시켰다. 파아지 보유 박테리아의 밤새 배양물을 원심분리하고, 각 샘플로부터의 50 μL의 파아지 함유 상청액을 100 μL의 새로운 PBSCMG의 존재하에 BMEC 상에서 직접적으로 인큐베이션하였다. 플레이트를 4℃에서 1hr 동안 인큐베이션한 후, 1회 세척하였다. PBSCMG에 1:500으로 희석된 항-M13 항체(GE healthcare #27942001)를 각 웰에서 1hr 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBSCM으로 세척하고, 이차 항체인 염소 항-마우스 AlexaFluor488과 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 PBSCM으로 3회 세척하고, PFA로 실온에서 8분 동안 후속 고정하였다. 그 후, 플레이트를 올림푸스 에피형광 현미경 (Center Valley, PA)에서 이미지화하였다.

가용성 scFv 및 scFv-Fc 제조: 가용성 scFv-His6 융합체 생성을 위한 하기 방법은 (30)에 설명된 프로토콜을 기반으로 한다. ScFv 분비 플라스미드로 형질전환된 박테리아 밤새 배양물을 사용하여 100 μg/mL 암피실린 및 0.1% 글루코스를 함유하는 2xYT 배지를 접종한 다음, 이를 OD₆₀₀ nm 0.9에 도달할 때까지 37℃에서 성장시켰다. 1mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG, Fisher Scientific, #50213380)를 첨가하여 발현을 유도하고, 박테리아를 30℃에서 4 hr 동안 성장시켰다. 박테리아를 수확하고, 100 μg/mL로의 DNAse I (Roche Applied Sciences, # 10104159001) 및 완전 Mini 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche Applied Sciences, # 11836153001)가 보충된 주변세포질 추출 완충액(PPB, 200 g/L 수크로스, 1 mM EDTA, 30 mM tris-HCl, pH 8.0) 이어서 DNAse I 및 완전 Mini 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 삼투성 쇼크 완충액(OSB, ddH2O 중의 5 mM 황산마그네슘)과 연속 인큐베이션하여 scFv를 회수하였다. 생성된 용액을 주사기 필터 멸균시키고, PBS + 10 mM 이미다졸에 대해 투석하였다. scFV를 정제를 위해 제조업체가 권장하는 프로토콜을 사용하여 Qiagen Ni-Nta Spin Columns (Qiagen #31014)으로 미정제 추출물로부터 정제하였다. 정제된 scFv를 용출시키고, 후속하여 PBS에 대해 투석하고, scFv의 순도는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크리-라미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 코마시에 블루 염색으로 확인하였다. 가용성 scFv를 PBSG(PBS 중 10% 염소 혈청) 중에서 2hr 동안 4:1 몰비로 토끼 폴리클로날 항 c-myc 항체(Thermo fisher #PA1-981)와 사전 이량체화시키고, 모든 후속 검정을 위해 이량체로서 사용하였다.

scFv-Fc 융합 생성을 위해 표준 PCR 증폭, 제한 소화 및 결찰 절차를 통해 NheI 및 AgeI 제한 부위를 이용하여 pIRES-토끼 Fc 벡터(44)로 서브클로닝함으로써 ScFv 유전자를 토끼 Fc 영역에 융합시켰다. 음성 대조군으로서 인간 H 항원 트리사카라이드에 결합하는 가변 림프구 수용체에의 동일한 토끼 Fc의 융합을 이용하였다(44, 45; 음성 대조군, Ctrl-Fc). HEK 293F 형질감염을 위한 대규모 DNA 정제는 ZymoPURE II 플라스미드 키트(Zymo Research # D4200)로 수행하고, 293펙틴(ThermoFisher #12347019) 형질감염 시약을 사용하였다. 그 후, 형질감염된 배양물을 가습화된 인큐베이터에서 37℃, 8% CO₂, 135 rpm에서 5일 동안 인큐베이션하고, scFv-Fc를 함유하는 상청액을 원심분리 및 여과를 통해 세포 덩어리로부터 분리하였다. scFv-Fc를 단백질 A/G 크로마토그래피 (ThermoFisher #20423)를 통해 투명한 상청액으로부터 정제하였다. 100 mM 시트르산 (pH 3)으로 용출한 후, 용액을 1M Tris-염기(pH 9)로 중화하고 단백질 농축기(ThermoFisher #88502)로 농축한 후 4℃ 보관하였다. 총 단백질 농도는 ExPASy(web.expasy.org/protparam/)에 의해 생성된 UV 280 흡광도 및 흡광 계수를 사용하여 정량화하였다.

세포 기반 검정: 막 결합 및 세포내이입 검정: BMEC를 Lab Tek II 챔버 슬라이드(Nunc #154917) 상에서 정제하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, 30min 동안 얼음 상에서 차단 완충액 PBSG(PBS 중 10% 염소 혈청)와 인큐베이션하였다. 사전-이량체화된 scFv (13.2 μg/ml) 또는 scFv-Fc (5 μg/ml)를 BMEC에 첨가하고, 얼음 상에서 추가 30 min 동안 인큐베이션하여 결합되게 하였다. 그 후, 챔버 슬라이드를 37℃에서 45분 동안 옮겨 내부화를 허용하였다. 그 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 얼음 위에서 30min 동안 PBSG에서 1:1000의 항-토끼 AlexaFluor555와 인큐베이션하여 scFv-Fc의 막-결합 분획을 표지하였다. 세포를 얼음 위에서 한 번 세척하고, 얼음 위에서 4% PFA로 10 min 동안 고정시키고, 2 min 동안 0.2% Triton X로 투과가능하게 하였다. PBSG 중 1:1000의 항-토끼 AlexaFluor488을 사용하여 RT에서 30분 동안 내재화된 분획을 표지하였다. 마지막으로, 세포를 세척하고, DAPI(Invitrogen, P36935)를 지닌 ProLong Gold 변색 방지 시약을 탑재하였다. 이미지는 Zeiss Axio Imager Z2 Upright 현미경에서 획득하였다.

내재화 검정: BMEC를 96-웰 평평-바닥 플레이트에서 정제하였다 (Corning #3539948). 세포를 무혈청 내피 배지에서 37℃에서 1hr 동안 혈청 결핍시켰다. 무혈청 배지에 희석된 1μM 정제된 scFv-Fc를 세포에 적용하였다. 온도 의존성 내재화 실험을 위해, 샘플의 한 그룹을 37℃에서 인큐베이션하고, 동일한 농도의 scFv-Fc를 갖는 한 그룹을 4℃에서 1hr 동안 인큐베이션하였다. scFv-Fc 인큐베이션 후, 세포 막-결합 항체를 얼음 상에서 5X 산 세척(100 M 시트르산 pH 3)에 의해 스트립핑하였다. 세포를 4% PFA로 8 min 동안 고정하고 차단하고 오디세이 차단 완충액(LICOR #927-40000)에 희석한 0.1% Triton X로 15 min 동안 투과가능하게 하였다. 내재화된 scFv-Fc를 IRdye800CW 염소-항-토끼 IgG pAb (LICOR #925-32211)와 4℃에서 1hr 동안 인큐베이션에 의해 검출하고, 각 웰의 세포 수를 CellTag (LICOR # 926-041090)로 측정하였으며, 이 둘 모두는 오디세이 차단 완충액으로 희석한 것이다. 일차 항체 인큐베이션 후, BMEC를 얼음 상에서 PBS 0.05% Tween-20으로 7X 세척하고, 각 웰로부터의 신호는 3mm 초점 오프셋 및 169 μm 해상도를 갖는 LICOR Odyssey Imager로 측정하였다. 각 웰의 ScFv-Fc 신호는 총 세포 수를 등가의 CellTag 신호로 나누어 정규화하였다.

평형 결합 측정: BMEC를 96-웰 평평 바닥 플레이트에서 정제하고 PBS로 2X 세척하고, 8min 동안 2% PFA로 고정하였다. 고정된 세포를 LICOR 이미징을 위해 상기 설명된 바와 같이 차단하고 투과가능하게 하였다. 겉보기 평형 친화도 적정 측정은 실온에서 2hr 동안 1nM 내지 1μM 범위의 다양한 농도의 scFv-Fc와된 세포를 인큐베이션하여 수행하였다. 4℃에서 PBS 0.05% Tween-20으로 광범위하게 세척한 후, 세포를 상기 기술된 바와 같이 scFv-Fc 검출을 위해 및 IRdye 시약 및 CellTag를 사용한 총 세포 수 평가를 위해 표지하였다. scFv-Fc에 의해 결합된 세포 항원의 분획을 배경 차감, 총 세포 수 정규화된 결합 신호를 사용하여 정량화하고, 데이터는 겉보기 해리 상수(K_D)를 결정하기 위해 이분자 평형 결합 모델에 적합시켰다.

경쟁 검정: scFv-Fc를 실온에서 30분 동안 PBS와 1% BSA 중 재조합 수용체 엑토-도메인 단백질 rIR R&D Systems #1444-IR) 및 rhTfR (R&D Systems # 2474-TR)의 10XK_D 농축물과 사전-인큐베이션한 후, 96 웰 플레이트에서 혈청 결핍 BMEC에 적용하여 scFv-Fc가 막 항원에 결합되게 하였다. 플레이트를 2hr 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 광범위하게 세척하고, 고정하고 상기 기술된 바와 같이 검출을 위해 IRdye 시약으로 표지하였다. 수용체-경쟁 scFv-Fc의 총 신호는 비경쟁 scFv-Fc 신호 강도와 비교하였다.

SDS-PAGE: scFv-Fc를 환원 시약 없이 샘플 완충액을 함유하는 SDS와 혼합하고, 10 min 동안 가열한 후 4-12% Bis-Tris 겔 (ThermoFisher #NP0321) 상으로 로딩하였다. 겔을 코마시 블루로 염색하였다.

유세포 분석: BMEC를 상기 기재된 바와 같이 6 웰 플레이트에서 배양하였다. 세포 (~2x10⁶ 세포/샘플)를 PBS로 세척하고, 1hr 동안 37℃에서 베르센(versene) 처리하여 배양 플레이트로부터 분리하였다. 세포를 1.5 mL 튜브에 옮기고, 회전하면서 PBS 1% BSA와 1hr 동안 4℃에서 차단하였다. 10¹¹ CFU의 파아지(각 라운드의 패닝 또는 음성 대조군 항-보툴리눔 독소 scFv 디스플레이 파아지)를 차단된 BMEC와 함께 4℃에서 1hr 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 PBS 1% BSA로 3X 세척하여 약하게 결합된 파아지를 제거하고, 상기 기술된 바와 같이 항-M13 항체로 표지하였다. 세포를 2회 세척하고, 유동 완충액 (PBS + 0.1% BSA + 5 mM EDTA)에 재현탁하고, 유세포 분석기(Becton Dickinson FACSCalibur)에서 분석하였다.

인간 및 마우스 뇌 동결절편의 면역표지화: 인간 뇌 조직 샘플을 University of Wisconsin-Madison Institutional Review Board의 승인을 받아 입수하였으며, 샘플을 급속 동결하였다. 마우스 뇌를 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 인간 및 마우스 조직을 8 및 30 μm 절편으로 Thermo Scientific Microm HM 525 상에서 동결절편화시켰다. 상응하는 항원의 알려지지 않은 구조로 인해 여러 고정 모드를 사용하였다. 면역표지화 전에, 절편을 RT에서 20 min 동안 4% PFA로 고정시키거나 20 min 동안 -20℃에서 저온 아세톤에서 고정하였다. 일부 경우에, 절편을 scFv-Fc와 인큐베이션한 후 후속 고정하였다. PFA로 고정된 절편은 추가로 PBS 중 0.2% Tx-100으로 투과가능하게 하였다. 절편을 실온에서 30 min 동안 PBS 중의 10% 염료 혈청(PBSG)으로 차단하였다. ScFv-Fc(5 μg/ml)를 4℃에서 24hr 동안 인간 및 마우스 뇌 절편에서 인큐베이션하였다. 인간 절편에서, 혈관을 마우스 항-인간 PECAM1/CD31 (Cell Sciences #MON6002-1)로 표지하고, 2hr 동안 RT에서 PBSG에서 1:50으로 및 이차 염소 항-마우스 AlexaFluor488 (1:1000)로 희석하였다. 마우스 뇌 절편의 혈관을 렉틴 LelDyLight488 (Vector laboratories Lel Dylight488)로 직접 표지하였다. 테스트 항체를 PBSG 중의 염소 항-토끼 AlexaFluor555 (1:1000)로 표지하였다. 절편에 DAPI (Invitrogen, P36935)가 있는 ProLong Gold 변색 방지 시약을 장착시키고, 마우스 및 인간 뇌를 Leica SP8 3X STED Confocal에서 분석하였다.

항체의 IV 투여 후 마우스 뇌 동결절편의 면역표지화: 동물 연구는 University of Wisconsin-Madison의 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인을 받았다. 5-6주령 마우스 C57BL6에 5 mg/kg의 용량으로 scFv-Fc를 안와후 경로를 통해 정맥내 주사하였다. 마우스는 100 U/ml 헤파린, 4 μg/ml 형광 표지된 렉틴(LEL Dylight488 Vector Laboratories) 및 0.1% BSA가 보충된 PBS로 5 min 동안 5 ml/min으로 전신 관류로 처리한 후 PBS 중의 4% PFA로 추가로 5분 관류시켰다. 뇌, 심장, 폐, 간, 신장 및 척수를 수집하고 액체 질소에서 급속 동결하고 -80℃에 보관하였다. 8 또는 30 μm의 절편을 Thermo Scientific Microm HM 525 상에서 만들었다. 면역표지화 전에, 절편을 1hr 동안 공기 건조시키고, 30 min 동안 0.05% 사포닌으로 투과가능하게 하고, RT에서 30 min 동안 PBSG로 차단하였다. 결합된 scFv-Fc를 시각화하기 위해 절편을 0.05% 사포닌을 갖는 PBSG에서 1:1000으로 희석된 항-토끼 AlexaFluor555-컨쥬게이션된 이차 항체(Invitrogen #A21428)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 단계는 PBS 중 0.05% 사포닌으로 수행하였다. 절편에 DAPI (Invitrogen, P36935)를 갖는 ProLong Gold 변색 방지 시약을 탑재하고, Zeiss Axio Imager Z2 Upright 현미경으로 분석하였다. 또한, 주입된 마우스 뇌의 30 μm 절편을 GFAP(신경교섬유질산성단백질) 및 콜라겐 IV에 대해 면역표지화하였다. 각각 10% 염소 또는 당나귀 혈청으로 차단하고 상기 기술된 바와 같이 투과가능하게 한 후, 절편은 실온에서 2hr 동안 상응하는 차단 완충액과 0.05% 사포닌 중의 마우스 항-GFAP (BD Pharmingen #556329) 또는 염소 항-콜라겐 IV(Milipore Sigma #AB769)과 인큐베이션하였다. 절편을 PBS 중의 0.05% 사포닌으로 세척하고, 이차 항체와 인큐베이션하였다: GFAP 검출에 있어서 항-토끼 AlexaFluor555 (Invitrogen #A21428) 및 항-마우스 AlexaFluor647 (Invitrogen #A-21235) 또는 콜라겐 IV 검출에 있어서 항-토끼 AlexaFluor555 (Invitrogen #A31572) 및 항-염소 AlexaFluor647 (Invitrogen #A-21447). 이미지는 Leica SP8 3X STED Confocal로 촬영하고 ImageJ로 처리하였다.

ELISA로 마우스 뇌의 항체 정량화: 5-6주령의 마우스 C57BL6에 20 mg/kg 용량의 scFv-Fc를 정맥내 주사하였다. 1hr 후, 혈액을 샘플링하고 간단히 회전시키고 혈장을 분석할 때까지 -80℃에서 동결시켰다. 100 U/ml 헤파린 및 0.1% BSA가 보충된 PBS로 10 min 동안 5 ml/min의 속도로 전신 관류 후 뇌를 제거하였다. 다음으로, 축적된 항체를 추출하기 위해 이전에 설명된 바와 같이 Complete Mini EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche Diagnostics)를 사용하여 PBS 중의 1% NP-40에서 뇌를 균질화하였다(11). 조직으로부터 항체가 추출되게 하기 위해 뇌를 4℃에서 24hr 동안 회전시켰다. 4℃에서 20 min 동안 14,000 rpm으로 원심분리한 후 상청액을 수집하였다. 뇌 추출물을 즉시 분석하거나 -80℃에서 동결시켰다. 신선하거나 냉동된 샘플에서 항체 뇌 농도의 차이가 관찰되지 않았다.

Nunc Maxisorp 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 0.2M NaCO₃/NaHCO₃에 희석된 항-HA 태그 항체 1 μg/ml(Thermo Fisher Scientific #MA1-12429)로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween-20으로 각각 5 min씩 3회 세척하고 세척 완충액 중 2% BSA로 차단하였다. 뇌 추출물을 희석하지 않고 플레이트에 첨가하고 혈장 샘플을 차단 완충액에 희석하였다. 농도가 알려진 항체를 처리되지 않은 마우스로부터 제조된 NP-40 뇌 추출물로 상기 설명한 바와 같이 정확히 희석하고 연속 희석액에 추가하여 뇌 농도 계산을 위한 표준 곡선을 만들었다. 최종 혈장 농도를 결정하기 위한 표준 곡선은 차단 완충액에 희석된 알려진 농도의 항체로부터 만들었다. 실온에서 2hr 인큐베이션 후, 샘플을 흡인하고, 플레이트를 각각 5 min씩 3회 세척하고, 항-토끼 HRP 항체(Sigma #A6154)를 실온에서 1hr 동안 첨가하였다. 결합되지 않은 검출 항체를 각각 5 min씩 6회 세척하고 1-Step Ultra TMB-ELISA 기질 용액(ThermoFisher Scientific #34028)을 첨가하였다. 흡광도는 Infinite M200(Tecan) 플레이트 판독기에서 450 nm에서 측정하였다. 뇌 샘플에서 검출의 하한은 클론 46.1, 17 및 Ctrl-Fc에 대해 각각 1.03 nM, 0.02 nM 및 0.44 nM이었다. 클론 46.1 및 Ctrl에 대한 혈장 농도는 ELISA로, 클론 17에 대해서는 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

마우스에서 온도 측정: 뉴로텐신(UniProtKB - Q9D3P9(NEUT_MOUSE))을 표준 클로닝 기술을 사용하여 관례적으로 도입된 BamHI 및 Not1 제한 부위 사이의 (G4S)₂ 링커를 통해 토끼 Fc 영역에 pIRES-토끼 Fc 벡터(44) 내로 융합하였다. ScFvs 46.1 및 RBC36은 상기 설명한 바와 같이 뉴로텐신 함유 벡터에 서브클로닝하였다. 앞서 설명한 바와 같이 뉴로텐신 항체 컨쥬게이트를 생성시키고 정제하였다. 뉴로텐신의 활성은 제조업체 프로토콜에 따라 PathHunter eXpress NTSR1 CHO-K1 β-Arrestin GPCR 검정(Eurofins, No. 93-0280E2CP0M)을 이용하여 측정하였다.

온도 측정 프로브 - 로거(Star Oddi, DST-nanoT)를 무균 기술을 사용하여 C57BL6 마우스(약 15 g)의 복강에 이식하였다. 마우스를 5일 동안 회복시켰다. 72시간 동안 Buprenorphine SR-Lab(Zoopharma) 1 mg/kg으로 진통을 제공하였다. PBS (1 mg/kg)에 용해된 ScFv-토끼Fc-뉴로텐신-항체 컨쥬게이트(20 mg/kg) 또는 뉴로텐신(Sigma, No. N6383)을 안와후동에 주사하였다. 주사 2일 후 마우스를 희생시키고 로거를 제거하고 기록을 등록하였다.

통계 분석: 통계 분석은 양측의 짝을 이루지 않은 스튜던트 t 테스트로 수행하였으며, p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 시험관 내 실험을 위해 각 리드 항체를 이의 적절한 대조군과 직접 비교하였다. 생체 내 실험을 위해 각 리드 항체를 Ctrl-Fc와 직접 비교하여 뇌 흡수의 중요성을 결정하였다.

결과:

iPSC-유래된 BMEC 모델을 이용한 파아지 디스플레이 스크리닝

BBB를 통과세포외배출할 수 있는 항체에 대한 표현형 스크린의 주요 과제는 대부분의 현재 BBB 모델의 고유한 세포주위 누출이다. 파아지 디스플레이 항체 라이브러리가 혈액 측 구획에 추가되는 2 구획 장벽 모델의 설정(도 1a, 단계 3)에서, 세포주위 누출은 RMT에 의해 BMEC를 실제로 통과해야 하는 잠재적으로 가치있고 희귀한 클론을 마스킹하는 뇌 측 구획에서 상당한 비특이적 파아지 회수를 발생시킬 것이다. 이 오랜 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 인간-공급원 물질의 이점을 비특이적 파아지 회수를 원친적으로 제한할 수 있는 강력한 장벽 특성(18)과 조합시킨 iPSC-유래된 BMEC BBB 모델을 사용하였다. 이들 BMEC가 BBB에 의해 발현되는 마커 모음을 발현하며, 영양 수송체, 약물 유출 수송체 및 큰 분자 RMT 시스템(17,18)을 포함하는 수송체 단백질의 숙주는 이들이 또한 수송체 기반 스크리닝(20, 21)에 매우 적합할 수 있음을 시사한다. 실제로, 경내피 전기 저항(TEER)에 의해 평가된 바와 같이 장벽 품질이 다양한 iPSC-유래된 BMEC 단층에 관련 없는 파아지가 적용되었을 경우, 하단 웰로의 비특이적 파아지 통과가 100-200 ohm-cm² 범위의 전통적인 BBB 모델 TEER 범위에서 매우 높다는 것이 발견되었다 (도 1b). 그러나 이러한 관련 없는 파아지 수송은 인간 iPSC-기반 시스템에 의해 고유하게 달성되는 범위인 약 1000 ohm-cm² 초과에서 크게 감소하였다. 따라서 파아지의 크고 해로운 배경을 피하기 위해 본 발명자들은 본 발명자들의 스크리닝 절차의 통과세포외배출 구성 요소에 대해 적어도 1000 ohm-cm²의 장벽을 갖는 BMEC를 사용하였다.

전체 스크리닝 절차는 도 1a에 도시되어 있다. fd-tet 파아지의 표면에 디스플레이된 5x10⁸ 비면역 인간-유래된 scFv의 라이브러리(22)를 스크리닝에 사용하였는데, 이는 다가 디스플레이가 통과세포외배출의 요건인 내재화(23)가 가능한 항체 쪽으로 스크린을 편향시키는 데 도움이 될 수 있기 때문이다. 먼저, 일반적인 내피 항원에 대한 파아지 결합을 탈풍부화시켜 BBB 선택성을 얻기 위해 인간 폐 및 심장 내피 세포에서 라이브러리 사전-차감 단계를 수행하였는데(도 1a, 단계 1), 이는 전사체학 연구가 BBB에 대한 폐 및 심장 세포 사이의 합리적으로 밀접한 관계를 보여주었기 때문이다(24). 다음으로, 결합 및 내재화 능력을 갖는 scFv를 풍부하게 하고 엄격한 통과세포외배출 라운드에 대한 이러한 클론의 오버샘플링을 증가시키기 위해 3회의 BMEC 결합 및 내재화 스크리닝 라운드를 수행하였다. 이 3 라운드 동안 사전 차감된 풀의 10¹¹ 파아지를 결합 단계로 얼음 위에서 먼저 BMEC에서 인큐베이션한 다음 파아지 내재화를 허용하기 위해 37℃에서 인큐베이션하였다(도 1a, 단계 2). BMEC 단층의 표면은 후속적으로 낮은 pH 세척으로 파아지 입자를 제거하고, 세포를 용해시키고, 내재화된 파아지를 박테리아에서 회수하였다. 3회의 결합 및 내재화 라운드 후, 파아지 풀은 회수된 파아지 풀을 사용한 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 BMEC-결합 scFv에 대해 실질적으로 풍부화되었다(도 1c). 다음으로, BMEC 단층에 걸쳐 통과세포외배출이 가능한 scFv-디스플레이 파아지를 확인하기 위해, 내재화 파아지 풀을 Transwell 시스템에서 BMEC의 상단 챔버에 첨가하고, 하단 챔버로부터 파아지가 회수되기 전에 3시간 동안 통과세포외배출되도록 하였다(도 1a, 단계 3i). 총 220개의 파지 클론이 하단 챔버에서 분리되었으며(추가된 10¹¹개의 파지 중에서), 이는 스크린의 엄격함을 나타낸다. BMEC 단층에 대한 파아지 면역화학은 그 실질적인 장벽에도 불구하고 단층을 통해 누출된 비특이적 파아지와 대조적으로 BMEC와 진정으로 상호작용하는 항체를 확인하기 위해 수행하였다(도 1d). 시퀀싱 시, 12개의 독특한 scFv가 파아지 디스플레이 포맷으로 BMEC에 결합할 수 있었다. 또한, 3 및 22Ch로 명명된 2개의 클론이 통과세포외배출 파아지 풀(142/220 서열, 표 1)의 >60%를 나타내고, BMEC 통과세포외배출 능력을 포화시켜 다양성을 잠재적으로 마스킹하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 회수된 scFv의 다양성을 확장하기 위해 scFv 클론 3 및 22Ch를 가용성 단백질로서 생성하고 경쟁적 통과세포외배출 스크린을 수행하는 데 사용하였다. 포화 조건에서 가용성 scFv를 내재화 파아지 항체 풀과 함께 상단 챔버에 첨가하여 scFv 3 및 22Ch를 디스플레이하는 파아지와 BMEC 사이의 상호작용을 감소시켰다(도 1a, 단계 3ii 및 재료 및 방법). 하단 챔버에 축적된 개별 파아지 클론을 분리하고 시퀀싱하였다. 클론 3과 22Ch는 가용성 scFv 경쟁 후 통과세포외배출된 분획에서 발견되지 않았으며, 경쟁적 통과세포외배출 접근법은 총 22개의 리드 scFv에 대해 파아지 디스플레이 포맷으로 BMEC에 결합하는 10개 더 독특한 scFv를 발생시켰다.

표 1. 통과세포외배출 스크린으로부터의 ScFv 빈도.

ScFv는 BMEC로 내재화되어 인간 및 마우스 뇌 미세혈관에 결합한다.

통과세포외배출 라운드에서 확인된 BMEC-결합 scFv를 서브클로닝하고, 박테리아로 발현시키고, 정제하였다. 22개의 scFv 중 총 15개가 후속 평가를 허용하는 수준으로 생성될 수 있다. 가용성 scFv를 BMEC에 펄싱한 후, 15개의 scFv 중 12개가 BMEC에 결합되었고, 10개가 또한 BMEC로의 명확한 내재화를 나타내었다(표 2 및 도 6). 추가 평가를 위해 scFv를 scFv-Fc 융합체로 재포맷하고 HEK293F 세포에서 발현시키고 정제하였다(도 2a). 6개의 클론(3, 9, 26, 17, 46.1 및 22Ch)을 시험관 내 평가 및 후속 생체 내 평가를 위해 충분한 양으로 생성하였다. 예상된 바와 같이, scFv-Fc 포맷화된 항체는 비환원 조건하에서 ~100kDa의 이량체로 이동하였다(도 2b). BMEC 단층으로의 결합에 대한 scFv-Fc의 겉보기 친화도(K_D)가 결정되었고 20-200nM의 범위였다(도 2c). 재포맷화된 scFv-Fc 융합체가 BMEC에 결합하고 내재화하는 능력을 유지하는지 확인하기 위해 scFv-Fc를 BMEC에 적용하였다. 6개의 검정된 scFv-Fc 각각은 BMEC에 결합하고 내재화하는 능력을 보존하였다(도 2d). 6개 항체 중 5개는 유사한 결합 및 내재화 외형을 보여주었다(클론 3, 9, 17, 22Ch 및 26). 표면 결합 항체는 BMEC 표면(도 2d, 적색)에 걸쳐 분포되었으며, 내재화된 항체가 종종 세포내 소포를 연상시키는 핵주위인 반점(도 2d, 녹색)에서 발견되었다. 대조적으로, 내재화된 46.1-scFv-Fc의 주요 분획은 세포-세포 접합부로 트래피킹(trafficking)되었다. 정량적 내재화 검정은 BMEC 단층으로 수행되었고, 테스트된 6개 클론 중 5개는 세포내이입 과정을 암시하는 통계적으로 유의한 온도 의존적 내재화를 나타내었다(도 2e).

표 2. 항체 속성. (ND - 결정되지 않음)

다음으로, BBB의 시험관내 모델링은 표면 수용체의 변형된 발현을 발생시킬 수 있기 때문에(25), 확인된 항체가 뇌 조직의 BBB에 결합하는 능력의 관점에서 생체내 관련성을 조사하였다. 먼저, 인간 뇌 절편에 대한 scFv의 결합을 평가하였다. 12개의 항체 중 10개는 조직 절편의 인간 뇌 미세혈관 상의 동족 항원에 결합한다(도 2f 및 표 2). 전임상 평가를 수행해야 할 필요성을 감안할 때 본 발명자들은 또한 마우스 BBB 항원에 대한 항체 교차 반응성도 테스트하였다. 인간 절편에서 BBB 결합을 갖는 10개의 scFv 중 9개는 또한 마우스 BBB에 결합하였다(도 2f 및 표 2). ScFv-Fc로서 합리적인 수율로 생성될 수 있고 BMEC 내재화 및 인간 및 마우스 BBB 둘 모두에 대한 결합을 나타내는 클론만을 추가로 평가하였다(3, 9, 26, 17, 46.1 및 22Ch).

마우스에서 정맥 투여 후 항체가 뇌 미세혈관과 실질에 축적된다

다음으로 인간 및 마우스 뇌 절편 둘 모두에서 뇌 미세혈관에 대한 결합을 보여준 scFv-Fc를 정맥내 투여 후 뇌 표적화에 대해 테스트하였다. 마우스에 5 mg/kg의 scFv-Fc 정맥내 투여량을 투여하고 항체를 1시간 동안 순환되게 하였다. 미결합 항체 분획은 생리 식염수를 사용한 전신 관류에 의해 혈관으로부터 제거하였다. 관류액은 또한 혈관의 루멘을 시각화하기 위해 형광 표지된 렉틴을 함유하였다. 고정 후, 전체 뇌를 제거하고, 면역조직화학으로 검사하였다. 뇌 절편의 면역조직화학 분석은 5개의 주사된 항체 중 4개가 루미날 BBB 항원을 표적으로 하는 것으로 밝혀졌다(3, 17, 26 및 46.1, 도 3a). 클론 3-, 26- 및 46.1-scFv-Fc는 세포내 소포와 유사한 점상 구조(도 3a, 흰색 화살표)로 볼 수 있으며, 이는 생체내 뇌 내피 세포에서 수용체-매개된 흡수를 시사하는 반면, 클론 17의 경우 혈관 표지가 약간 더 확산되었다(도 3a). 또한, 혈관과 관련된 혈관 주위 돌기에서 46.1 주사된 마우스에서 혈관후 항체가 검출되었다(도 3a, 노란색 화살표).

BBB 내피세포를 통한 수송의 모습을 감안할 때, 본 발명자들은 BBB 내피세포의 혈액 측으로부터 내피세포의 뇌 측으로의 항체 수송의 지표로서 BBB 기저막 성분인 콜라겐 IV(26)와의 공동-국소화 및 공초점 현미경에 의한 항체 국소화를 추가로 평가하였다. 공초점 Z-스택 이미지의 3차원 재구성은 분석된 항체 중 3개(3, 26 및 46.1)가 콜라겐 IV와 적어도 부분적으로 공동-국소화를 나타내는 것으로 나타났으며, 이는 BBB 내피의 뇌 측으로의 항체 트래피킹을 나타낸다(도 3b, 흰색 화살표, 보라색 머지). 대조적으로, 클론 17은 혈관후 조직의 배경 위에서 혈관후 세포와 관련된 일부 핵주위 국소화로 일관되게 검출될 수 있다는 점에도 불구하고 콜라겐 IV와 공동-국소화를 나타내지 않는다(도 3b, 노란색 화살표).

위에서 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 미세혈관에 인접한 혈관후 과정에서 클론 46.1을 자주 관찰하였다(예를 들어, 도 3a, 노란색 화살표). 이러한 과정의 세포 기원을 결정하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 성상교세포 마커인 신경교섬유질산성단백질(GFAP)로 마우스 뇌 절편을 표지하였다(도 3c). 클론 46.1은 GFAP+ 성상세포 과정과 관련된 점으로 명확하게 식별될 수 있다(도 3c). 46.1-scFv-Fc에 양성인 성상교세포는 분석된 시상단면에 걸쳐 고르지 않게 분포되어 있었으며, 해마 영역에서 가장 빈번하게 발생하는 경향이 있었다. 비-혈관 기원의 다른 미확인된 CNS 세포는 또한 클론 46.1을 축적할 가능성이 있다(도 3c, 노란색 화살표). 종합하면, 면역형광법은 클론 17과 46.1이 BBB를 가로질러 이동하며, 클론 46.1은 혈관주위 성상교세포와 명백한 혈관후 연관성을 나타냄을 시사한다.

클론 17과 46.1이 BBB를 가로지를 수 있는 능력을 감안할 때, 본 발명자들은 이들이 잘 연구된 트랜스페린(TfR) 또는 인슐린 수용체(IR)를 인식하는지 조사하였다. 세포 표면 결합 검정 전에 scFv-Fc를 과량의 재조합 수용체 엑토도메인과 사전 인큐베이션함으로써 scFv-Fc가 TfR 또는 IR과 실질적으로 상호작용하는지를 결정하기 위해 경쟁적 결합 검정을 사용하였다. 두 클론 46.1 및 17의 세포 표면 결합은 경쟁 리간드 중 어느 것에 의해서도 실질적으로 감소되지 않았다(도 7). IR 경쟁의 존재 하에 17 및 46.1 결합 둘 모두에서 약간의 감소가 있었지만, 항-인간 IR 대조군 항체가 가용성 IR 엑토도메인에 의해 경쟁될 때 관찰된 80% 감소와 비교하면 상당히 작았다. 이러한 데이터는 17 및 46.1에 대해 관찰된 다양한 트래피킹 패턴과 함께 이 두 scFv가 TfR 또는 IR을 표적으로 하지 않는다는 것을 나타낸다.

항체는 정맥 투여 후 다양한 생체분포를 보인다.

스크린 디자인에 내장된 사전-차감 단계를 감안하여(도 1a), 본 발명자들은 또한 후보 항체의 잠재적인 뇌 선택성을 평가하고자 하였다. 이를 위해, 면역조직화학을 이용하여 항체 흡수를 정성적으로 평가하였다. 혈관이 고도로 발달된 기관으로서 심장 및 폐는 물론 주요 청소 기관이 간 및 신장에서의 항체 국소화를 평가하였다. 척수의 경부 및 흉부 분절을 항체 존재에 대해 추가로 분석하였다. 기관 생체분포의 정성적 분석은 표 3에 요약되어 있으며, 클론에 대한 대표적인 이미지는 도 4 및 도 8에 도시되어 있다. 조직-특이적 세포 분포의 차이에도 불구하고 클론 3 및 17은 모든 분석된 기관에서 발견되었다. 대조적으로, 클론 26은 심장, 폐 또는 신장 조직에서 검출되지 않았다(도 4a). 클론 46.1은 심장 미세혈관에서 검출되지 않았으며, 뇌 미세혈관에 대해 적어도 부분적인 선택성을 보였다. 클론 46.1에서 특히 관심을 끈 것은 간과 신장에서의 세포 국소화로, 이는 이들 기관에서 세포횡단 접합부 트래피킹을 시사하였다. 예를 들어, BBB 내피 세포와 같은 간세포는 밀착 접합에 의해 분리된 정점 및 기저외측 막으로 분극되어 있다(27). 클론 46.1은 간세포의 세포-세포 접합부에 국소화된 것으로 발견될 수 있다(도 4, 흰색 화살표). 또한, 클론 46.1은 신장 세뇨관 상피 세포의 세포-세포 접합부에서 명확하게 국소화되어 있음을 확인할 수 있었다(도 4, 노란색 화살표). 마지막으로, 본 발명자들은 항체가 척수에 축적될 수 있는지의 여부를 결정하고자 하였다. 클론 3, 9, 17 및 46.1은 클론 9가 BBB 미세혈관에 결합하지 않았다는 점에도 불구하고 척수를 관통하는 모세혈관의 내피 세포 내에서 발견되었다. 전반적으로, 후보 항체의 다양한 기관 및 조직 분포는 기관 및 세포 수준 모두에서 이들의 흡수 및 수송에 관여하는 상이한 수용체를 가리킨다.

표 3. 항체 기관 생체분포 요약. (+ 양성, - 음성, ND 결정되지 않음)

정맥내 투여 후 scFv-Fc 뇌 축적의 정량화

클론 17 및 46.1의 혈관후 뇌 축적을 나타내는 면역형광 분석을 감안하여, 본 발명자들은 정맥 투여 후 전체 마우스 뇌에서의 축적을 추가로 정량화하였다. 20 mg/kg의 ScFv-Fc를 주사하고 1시간 동안 순환되게 하였다. 혈관계로부터 결합되지 않은 항체를 제거하기 위한 전신 관류 후, 뇌를 분리하고, 균질화하고, 항체를 추출하였다. 뇌 추출물(혈관 관련 및 실질)에서 항체의 농도는 ELISA로 측정하였다(도 5a). 클론 46.1의 측정된 농도(8.1±1.2 nM)는 음성 대조군-Fc의 농도(0.31±0.11 nM)보다 26배 더 높았다. 클론 17은 또한 대조군보다 약 9배 높게 뇌에서 축적되었다(2.79 ± 0.63 nM). 또한, 말단 혈장 내 항체 농도를 측정하였고, 뇌 농도는 혈장 농도에 대한 비율로 나타내었으며(도 5b), 이는 다시 대조군(0.015%) 대비 뇌에서 클론 46.1(0.72%) 및 17(0.28%)의 선택적 흡수를 나타내었다.

ScFv-Fc는 BBB를 가로질러 컨쥬게이션된 페이로드를 전달한다

분자 페이로드로의 융합 후 scFv-Fc가 BBB를 가로지르는 능력을 유지하는지의 여부를 테스트하기 위해 scFv-46.1을 세포 표면 수용체 뉴로텐신 수용체 1(NTR1)에 대한 리간드인 뉴로텐신에 융합시켰다. ScFv-46.1-토끼Fc-뉴로텐신-항체 컨쥬게이트(뉴로텐신 UniProtKB - Q9D3P9 (NEUT_MOUSE) 서열은 www.uniprot.org/uniprot/Q9D3P9#PRO_0000019528에서 발견됨)는 뉴로텐신 수용체 1을 발현하는 리포터 세포주에서 NTR1을 활성화시키는 것으로 나타났으나, 대조군 Fc 융합부에 융합된 뉴로텐신 또는 자유 뉴로텐신보다 더 낮을 친화성을 갖는다(도 9). ScFv-46.1-토끼Fc-뉴로텐신-항체 컨쥬게이트를 후안와동을 통해 마우스에 투여한 경우, 약 1시간에 걸쳐 체온의 현저한 감소가 관찰되었으며(도 10), 이는 뉴런 발현 시 뉴로텐신 수용체 1의 관여를 나타낸다. 이에 비해, 3배 몰 과량의 유리 뉴로텐신 및 대조군 Fc 뉴로텐신 융합은 이 동일한 기간 동안 체온 감소를 나타내지 않았다. 따라서 scFv-46.1은 이 리간드에 컨쥬게이션될 때 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 능력을 유지하며, 이는 뇌에 치료제를 전달하기 위한 이러한 항체의 잠재력을 입증한다.

논의:

이 연구에서 본 발명자들은 인간 BBB 항원을 표적으로 하고, 전신 투여 후 쥐과동물 BBB를 표적으로 하고 통과세포외배출하기 위한 항체를 식별하기 위한 독창적인 항체 스크리닝 전략을 개발하였다. 본 발명자들의 기능적 스크리닝 전략은 iPSC-유래된 BMEC-유사 세포를 스크리닝 기질로서 사용하였다. 중요하게는, 이러한 BBB 모델의 세포주위 견고성은 하부 챔버에서 파아지의 비특이적 축적을 제한하는 열쇠였으며, 이는 BMEC를 가로질러 진정으로 통과세포외배출할 수 있는 클론의 회수를 마스킹할 것이다. 이 엄격한 스크리닝 필터는 추가 특성 규명시 생체내 BBB에서 표적화 및 트래피킹이 가능한 리드 분자 세트로 이어지는 scFv 패널의 식별을 허용하였다. iPSC 기반 BMEC-유사 모델은 많은 BBB 수송 속성을 모델링하는 데 합당한 충실도를 갖는 것으로 나타났지만(17, 18, 21), 모든 BBB 기능을 완전히 복제할 수는 없다(16, 19, 28). 그러나 BMEC에 결합한 12개의 scFv 중 10개는 조직 절편에서 인간 BBB에도 결합하였다. 대조적으로, 불멸화 또는 일차 BMEC 기질을 사용하는 다른 스크린은 생체 내 관련성을 갖는 항체를 거의 생성하지 않았다(29, 30). 스크리닝 패러다임은 또한 BBB-선택적 항체 쪽으로 스크린을 편향시키려는 시도에서 인간 폐 및 심장 내피 세포에 대한 사전 차감 단계를 포함한 반면, 생체 분포 분석은 항체가 다양한 조직 선택성을 가졌음을 나타내었다. 이러한 데이터는 사전 차감 방법이 리드 분자의 생체 내 선택성에 대해 최소한의 이점을 제공한 다른 시험관 내 스크리닝 결과를 반영한다(14, 23, 30-32). 이러한 발견은 스크리닝 기질로서의 iPSC-BMEC 시스템의 유효성을 뒷받침하며, 모델의 장벽 특성과 함께 본원에 설명된 전략은 추가 항체-BBB 수송체 조합을 식별하고 조작하는 미래의 노력을 촉진할 수 있다.

BMEC에 결합하는 것으로 확인된 대부분의 scFv(12개 중 9개)도 내재화되었으며, 이는 내재화 및 통과세포외배출 스크리닝 단계가 항체-수용체 조합을 내포작용하기 위해 풍부화되었음을 나타낸다. 내재화 항체의 백분율은 파아지 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 사용하는 다른 BBB 스크린보다 훨씬 더 높았다(29, 30). ScFv는 온도 의존적 방식으로 BMEC와 상호작용하고 세포 내 점으로 발견되었으며, 이는 RMT가 세포 흡수의 주요 경로임을 시사한다. 특히, scFv 46.1은 독특한 흡수 패턴을 가졌으며, 즉, 세포질 46.1을 함유하는 구조가 거의 없었고, 대부분의 항체가 세포-세포 접합부에서 점으로 발견될 수 있었으며, 이는 겉보기에 재순환 또는 분해 구획과 구별된다(33, 34). 46.1에 의해 표적화된 수용체의 식별은 향후 작업의 중심이지만, 본 발명자들은 BBB에서 그러한 항체 수송 프로파일을 설명하는 어떠한 문헌도 발견하지 못하였다. 내재화된 항체의 이 독특한 세포내 분포 외에도, 수용체 엑토도메인 경쟁 실험은 RMT 표적이 트랜스페린 또는 인슐린 수용체가 아니라는 것을 나타내었고, 이는 46.1-수용체 시스템이 뇌 전달을 위한 새로운 잠재적 플랫폼을 나타낸다는 것을 시사한다.

이러한 새로운 항체-수용체 쌍의 가능성은 정맥내 투여 후 생체내에서 추가로 확인되었다. 5개의 scFv-Fc 중 4개는 순환 1시간 후에 마우스 뇌 내피에 축적되었다. 클론 3, 26 및 46.1은 뇌 미세혈관을 따라 명확한 세포내 소포 국소화를 생성하였다. 콜라겐 IV 공동국소화를 통해, 이들 각각의 클론이 또한 뇌 내피 세포의 뇌 측으로 트래피킹되었음이 명백하였다. 항체가 혈관계를 떠나면 1000배 빠르게 희석되어 후속의 혈관후 검출을 방해한다(35). 그러나 항체가 성상교세포나 뉴런과 같은 혈관후 세포에 또한 결합하면 이는 재농축되어 쉽게 검출될 수 있다(36, 37). 이러한 방식으로, GFAP+ 성상세포 족돌기 및 세포체와 연관되어 있는 것으로 밝혀진 클론 46.1의 혈관후 축적을 관찰할 수 있었다. 또한, 46.1-함유 성상교세포 부근의 GFAP-뇌 세포에서 46.1이 점으로서 검출되었다. 이러한 발견은 BBB를 가로질러 클론 46.1의 완전한 통과세포외배출 및 뇌 실질에서 이의 분포에 대한 명확한 증거를 제공하였다. 클론 17은 혈관 기저막과 공동-국소화되지 않았다. 그러나, 때때로 핵주위 연관성이 있는 혈관후 조직 구획 내에서 배경 위에서 재현 가능하게 관찰될 수 있었다. GFAP+ 성상교세포와의 46.1 연관성만큼 명확하지는 않지만 클론 17 또한 새로운 항체-수용체 조합으로서의 가능성을 제시한다.

클론 17과 46.1의 뇌 축적을 벤치마킹하기 위해 본 발명자들은 다음으로 뇌에 도달하는 항체의 양을 정량화하였다. 20 mg/kg으로 정맥내 투여하고 순환 시간 1시간 후에 각각 클론 46.1(8.1 nM, 0.72% 뇌/혈장)의 뇌 농도는 대조군보다 26배 높았고, 클론 17(2.8 nM, 0.28% 뇌/혈장)에 있어서는 9배 높았다. 이러한 뇌 흡수 수준은 조작된 항-트랜스페린 항체에 대해 이전에 보고된 뇌 농도와 유사하다(37-39). 이러한 비교 연구에서와 같이, 뇌 실질에 있는 항체와 혈관 내피에 격리된 항체 둘 모두를 포함하는, 전체 조직으로부터의 뇌 추출물을 준비하였다. 본 발명자들의 면역형광 데이터와 조합하면, 1시간 시간 창 내에 항체가 혈관후 뇌 조직에 축적된다는 것이 분명하다. 궁극적으로 항체 흡수 수준은 비표적 조직에서의 항원 결합, 용량 제한, 항체 친화도 및 결합활성(6, 7, 34, 38, 41)을 포함한 수많은 요인(40)에 의해 제어된다. 예를 들어, 46.1의 폐, 간 및 신장으로의 상당히 광범위한 말초 분포를 감안하면, 컨쥬게이션된 약물 페이로드의 특이성이 핵심 고려 사항이 될 것이다. TfR을 포함하여 편재적으로 발현되는 수용체를 표적으로 하는 개발 중인 다른 BBB 항체도 페이로드 선택과 단백질 공학을 조합하여 효능을 극대화해야 하는 유사한 과제에 직면해 있다(7, 36, 38). 따라서, 항체 및 페이로드 조작 전략은 여기에 설명된 새로운 항체-수용체 시스템의 추가 개발에 중요할 것이다. 요약하면, 본 발명자들은 혈관후 축적을 포함하여 상당한 뇌 흡수를 나타내는 새롭고 유망한 항체를 확인하였다. 중요하게는, 번역 고려 사항에 있어서, 본 발명자들의 항체는 마우스 및 인간 항원에 대한 교차 반응성을 보여준다. 이 작업은 뇌에 치료제를 전달하기 위한 플랫폼으로의 이러한 리드 항체의 개발을 가능하게 할 수 있을 것이다.

서열:

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Stutz, Charles Goulatis, Loukas Georgieva, Julia <120> HUMAN BLOOD-BRAIN BARRIER TARGETING ANTIBODIES <130> 960296.04088 <150> 62/966,860 <151> 2020-01-28 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv3 <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Lys Gly Gln Ser Val Arg Asn Arg Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro 130 135 140 Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly 145 150 155 160 Asp Asn Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Ile Leu Val Leu Tyr Ala Asn Thr His Arg Pro Ser Ser 180 185 190 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu 195 200 205 Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn 210 215 220 Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Gly 245 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - 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scFv5E-0.4CDRH1 <400> 56 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv5E-0.4CDRH2 <400> 57 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv5E-0.4CDRH3 <400> 58 Ala Lys Gln Asn Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv5E-0.4CDRL1 <400> 59 Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv5E-0.4CDRL3 <400> 60 Asn Ser Arg Asp Ser Arg Gly Thr His Leu Glu Val 1 5 10 <210> 61 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFvB3-R3 <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Gln Gly Trp Ala Gly Asp Phe Asp Phe Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala 130 135 140 Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser 145 150 155 160 Ser Asp Ile Gly Thr Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro 165 170 175 Gly Tyr Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr His Cys 210 215 220 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Gly 245 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFvB3-R3CDRH1 <400> 62 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFvB3-R3CDRH2 <400> 63 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFvB3-R3CDRH3 <400> 64 Ala Lys Ser Gln Gly Trp Ala Gly Asp Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFvB3-R3CDRL1 <400> 65 Ser Ser Asp Ile Gly Thr Tyr Asn Tyr 1 5 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFvB3-R3CDRL3 <400> 66 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Thr Leu Val 1 5 10 <210> 67 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv22Ch <400> 67 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Ala Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Asp Leu Lys Pro Ser Ser Trp Pro Pro Ile Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln 130 135 140 Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Lys Ile Thr Cys 145 150 155 160 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Arg 165 170 175 Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Leu Tyr Ala Asn Thr His Arg Pro 180 185 190 Ser Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 210 215 220 Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His His Val Val Phe Gly Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv22ChCDRH1 <400> 68 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv22ChCDRH2 <400> 69 Ile Ser Ser Asn Gly Ala Ile Thr 1 5 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv22ChCDRH3 <400> 70 Val Lys Asp Leu Lys Pro Ser Ser Trp Pro Pro Ile Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv22ChCDRL1 <400> 71 Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr 1 5 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - scFv22ChCDRL3 <400> 72 Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His His Val Val 1 5 10 <210> 73 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - Forward primer for amplifying scFv genes <400> 73 Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala 1 5 10 15 Ala Cys Gly Thr Gly Ala 20 <210> 74 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - Reverse primer for amplifying scFv genes <400> 74 Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly Ala Gly 1 5 10 15 Gly Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala 20 25

Claims

(a) SEQ ID NO: 26 (GFTFSGYW)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 27 (IKGDGTDI)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 28 (ARDLRQTHWFDS)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 29 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 30 (SSRDTSGNHVL)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(b) SEQ ID NO: 2 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 3 (ISYDGSNK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 4 (ARDSKGQSVRNRFDP)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 5 (NLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 6 (NSRDSSGNLVV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(c) SEQ ID NO: 8 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 9 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 10 (ARGWKYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 11 (EGIYHW)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 KA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 12 (QQYHTISRT)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(d) SEQ ID NO: 14 (GFTFSSST)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 15 (VSYDGNTQ)를 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 16 (AGLWGSLLGYFQH)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 17 (QGVNNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 AA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 18 (QQAHSFPPT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(e) SEQ ID NO: 20 (GFTFSTYW)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 21 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 22 (ATPTGDSDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 23 (SLRSYY)을 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GQ를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 24 (HSRDSSGNHVL)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(f) SEQ ID NO: 32 (GFTFSTYW)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 33 (INQDGTAE)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 34 (ATPTGDSDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 35 (QDIGNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 DA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 36 (QKLSSYPLT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(g) SEQ ID NO: 38 (GFTFSNYA)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 39 (ISGSGSST)를 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 40 (AKTSGWPYYFDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 41 (SSNIGNNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 DN을 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 42 (CSYAGSSTLV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(h) SEQ ID NO: 44 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 45 (VSGTGVST)를 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 46 (ARGLDWKSTPIDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 47 (QSISGW)을 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GA를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 48 (LQDYNGWT)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(i) SEQ ID NO: 50 (GFTVSSNY)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 51 (IKQDGSEK)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 52 (ARGGEEKNSGYYGDY)를 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 53 (SLRSYY)을 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 QD를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 54 (QAWDSSTAHYV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(j) SEQ ID NO: 56 (GFTFSSYV)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 57 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 58 (AKQNWYFDL)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 59 (SLRSYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 GE를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 60 (NSRDSRGTHLEV)을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인;
(k) SEQ ID NO: 62 (GFTFSSYA)를 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 63 (ISGSGGST)을 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 64 (AKSQGWAGDFDF)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 65 (SSDIGTYNY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 EV를 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 66 (CSYAGSSTLV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인; 또는
(l) SEQ ID NO: 68 (GFTFSSYA)을 포함하는 CDRH1 영역, SEQ ID NO: 69 (ISSNGAIT)를 포함하는 CDHR2 영역 및 SEQ ID NO: 70 (VKDLKPSSWPPIYFDY)을 포함하는 CDHR3 영역을 포함하는 중쇄 도메인, 및
SEQ ID NO: 71 (SLRTYY)를 포함하는 CDRL1 영역, 아미노산 서열 AN을 포함하는 CDRL2 영역 및 SEQ ID NO: 72 (NSRDSSGNHHVV)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 도메인을 포함하는, 분리된 혈액-뇌 장벽(BBB)-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 항체가
(a) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 25에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(c) SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(d) SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(e) SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(f) SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(g) SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(h) SEQ ID NO: 43 또는 SEQ ID NO: 43에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(i) SEQ ID NO: 49 또는 SEQ ID NO: 49에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(j) SEQ ID NO: 55 또는 SEQ ID NO: 55에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열;
(k) SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 61에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열; 및
(l) SEQ ID NO: 67 또는 SEQ ID NO: 67에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 항체가
(a) SEQ ID NO: 25; (b) SEQ ID NO: 1; (c) SEQ ID NO: 7; (d) SEQ ID NO: 13; (e) SEQ ID NO: 19; (f) SEQ ID NO: 31; (g) SEQ ID NO: 37; (h) SEQ ID NO: 43; (i) SEQ ID NO: 49; (j) SEQ ID NO: 55; (k) SEQ ID NO: 61; 및 (l) SEQ ID NO: 66으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간화된 항체 또는 이의 인간화된 항원-결합 단편인, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간 또는 다른 종 기원의 전체 IgG 스캐폴드 또는 인간 또는 다른 종 기원의 scFv 스캐폴드 내에 생착되는, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단일쇄 가변 단편(scFv)인, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 BBB에 결합하고 BBB를 가로질러 전위될 수 있는, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 뇌에 특이적으로 결합하는, BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제9항에 있어서, 제제가 치료제, 약학적 제제, 진단제, 영상화제, 검출제, 면역학적 치료 작제물 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제9항 또는 제10항에 있어서, 제제가 치료제, 약학적 제제 또는 이들의 조합물인, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제9항 또는 제10항에 있어서, 제제가 진단제 또는 영상화제인, BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 제제가 BBB를 전위시킬 수 있는, BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편.
제10항 또는 제11항에 있어서, 치료제가 약물 또는 생물학적 제제인, BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열.
제15항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 세포, 또는 제16항 또는 제17항의 벡터를 포함하는 세포.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 BBB에 제제를 표적화하는 방법으로서, 항체는 제제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BBB를 특이적으로 표적화할 수 있는, 방법.
제19항에 있어서, 제제가 표적화 후 BBB를 가로지를 수 있는, 방법.
제19항에 있어서, 제제가 대상체의 뇌에서 nM 수준으로 축적될 수 있는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 BBB에 치료제를 표적화하는 방법으로서, 항체는 치료제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, BBB-선택적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BBB를 특이적으로 표적화하고 전위시킬 수 있는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 BBB-선택적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트.