CN111278847B - 分子导向系统肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了包含与一种或多种分子导向系统(MGS)肽缀合的抗体的组合物。公开了治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述有需要的受试者施用有效量的与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中所述抗体靶向参与疾病过程的细胞内靶标。公开了靶向细胞内靶标的方法，其包括施用与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中所述抗体靶向细胞内靶标。

Description

分子导向系统肽及其用途
背景技术
对将治疗性抗体递送至特定细胞类型和所述细胞内的特定定位的系统性细胞靶向系统存在迫切的需要。
在过去十年内治疗性单克隆抗体(MAb)市场已经急剧增长到超过$70B，并且预计到2020年增长到$125B。目前市场上有47种已被FDA批准用于一系列疾病的治疗性MAb。然而，MAb不是细胞可透过的，因此它们局限于细胞外和细胞表面治疗靶标。这在细胞内留下了无法利用MAb疗法的大量治疗靶标，特别是蛋白质-蛋白质相互作用。MAb调节蛋白质-蛋白质相互作用的能力原本特别强大，使得其不能穿透细胞并调节细胞内蛋白质-蛋白质相互作用构成了危及生命的疾病(如传染病、癌症和其他挑战性且难治性疾病)的治疗中的主要未满足需要。
发明内容
MAb调节蛋白质-蛋白质相互作用的能力非常强大；它们不能穿透细胞并调节细胞内蛋白质-蛋白质相互作用构成了危及生命的疾病的治疗中的主要未满足需要。将治疗性MAb递送至特定靶细胞和所述细胞内的正确区室的能力将具有许多社会保健益处。MGS-MAb组合将产生一类新的安全且有效的细胞内作用药物，其具有治疗迄今为止“无成药性(undruggable)”靶标的潜力。本文公开了利用分子导向系统(MGS)肽的组合物和方法，其提供了用于治疗新出现的传染病和生物恐怖的新治疗策略，用于癌症、糖尿病、神经性和神经变性疾病以及甚至基因遗传性疾病的新型疗法。
公开了包含与一种或多种分子导向系统(MGS)肽缀合的抗体的组合物。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中所述抗体靶向细胞内靶标。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。在一些方面，所述单克隆抗体是抗Ras单克隆抗体。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中所述一种或多种MGS肽包含序列EHPWFNMWSWATQVQE(SEQ ID NO:38)、YPGSPTQYPSSMHEYHSSSE(SEQ ID NO:39)、AHTIDDEWASYHMQQWNSPP(SEQ ID NO:40)、FEEFYSRQSNTIPYPQQYKG(SEQ ID NO:41)、THGNKHQSWTYPSEINHKNY(SEQ ID NO:19)、NLADTWTQTQQHDFHVLRGTR(SEQ ID NO:20)、GYSWWQPNWPSSTWDT(SEQ ID NO:21)或其组合。在一些方面，所述一种或多种MGS肽包含序列EHPWFNMWSWATQVQE(SEQ ID NO:38)。公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中所述一种或多种MGS肽包含序列SEQ ID NO:1、2、3、34、35、36、37、38、39、40、41、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、5、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76或77或其组合
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中所述一种或多种MGS肽定位至一种或多种细胞内靶标。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中所述一种或多种MGS肽定位至一种或多种细胞内靶标，其中所述细胞内靶标是溶酶体、高尔基体、内质网、细胞质或细胞核。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中所述抗体经由接头与所述一种或多种MGS肽缀合。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中与所述一种或多种MGS肽缀合的所述抗体是融合蛋白。
公开了靶向细胞内靶标的方法，其包括施用与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中所述抗体靶向细胞内靶标。在一些方面，所述细胞内靶标是溶酶体、高尔基体、内质网、细胞质或细胞核。
公开了治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述有需要的受试者施用有效量的与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中所述抗体靶向参与疾病过程的细胞内靶标。在一些方面，所述有需要的受试者患有传染病、癌症、糖尿病、神经性或神经变性疾病、基因遗传性疾病，或已暴露于生物恐怖剂(bioterrorism agent)。
所公开的方法和组合物的另外优点将在以下描述中部分地阐述，并且将从所述描述中部分地理解，或者可通过实践所公开的方法和组合物而习知。所公开的方法和组合物的优点将借助在随附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应了解上文一般描述与下文详细描述均仅仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的本发明。
附图说明
并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图说明所公开方法和组合物的若干实施方案，并且与描述一起用于阐释所公开方法和组合物的原理。
图1是分子导向系统的示意图。分子靶向肽将通过FOX-Three技术鉴定。所述肽将货物特异性地递送至靶细胞，同时避免在其他细胞中的摄取。在内化后，肽将把货物引导到细胞内的期望定位。接头可以是稳定的或被设计成在到达其靶标后释放货物。所述系统是模块化的，使得货物实际上可以是任何生物活性化合物。
图2是FOX-Three平台的示意图。所述方法是通用的，并且已经产生了用于许多不同细胞类型的MGS。对亚细胞定位的另外选择进一步扩大了平台的实用性，并为MGS开辟了新的治疗机会。
图3是示出可以通过使治疗性MAb靶向特定的亚细胞器而操纵的细胞过程的实例的图。
图4A、4B和4C示出在体外和体内将大单克隆抗体递送到细胞中的分子导向系统(MGS)肽。具有生物素标签(“柄”)的肽MGS偶联于抗生物素抗体。用荧光标签标记所述抗体。图A.将MGS肽-抗体与活细胞一起在培养基中孵育。抗体在细胞中的摄取通过流式细胞术确定，并归一化为没有MGS肽的抗体摄取。图B.抗体的摄取通过荧光显微镜检查确定，并在左图中用红色“点”指示。MGS肽可以将抗体递送到期望定位。使用内化货物并将其引导到细胞中的高尔基体的MGS肽，将抗体递送到所述亚细胞区室。图C.将MGS肽-抗体静脉内注射到荷瘤小鼠中。在设定的时间点，使用近红外成像确定肿瘤中抗体的摄取。
图5示出抗Ras MAb的MGS肽-递送。
图6是示出用H1299.2-HA-Ras-MAb治疗的Nu/Nu小鼠中的H2009肿瘤生长的图。
图7是示出细胞内递送货物解决阻碍药物开发的两个关键问题的分子递送系统的图。
图8示出本文公开的MGS肽的定位。
图9示出活性治疗剂向期望的亚细胞定位的递送。
图10示出满足亲和力和特异性量度的七种MGS肽。在上图中从上到下列出的肽序列是：SEQ ID NO:38、39、40、41、19、20和21。
图11示出Ras是可以用MGS肽靶向的癌蛋白。
图12示出针对mAb和MGS肽的1:1配对优化的缀合。
图13示出功能阻断性抗RAS单克隆抗体(Y13-259)的RAS抗体选择。杂交瘤于1982年分离。它是大鼠IgG1单克隆抗体，识别K-、N-和H-RAS，并与野生型RAS和突变型RAS结合。所述抗体结合RAS的开关II区中的氨基酸。克隆Y13-259 scFv片段。在通过电穿孔法进行的基于细胞的测定中，抗体阻断RAS的促有丝分裂活性。
图14示出MGS肽H2009.1–Y13-259减少KRAS的下游靶标的激活。曲美替尼(Trametinib)(及其他下游激酶抑制剂)的局限性是：仅破坏RAS的许多途径之一，毒性、耐药性几乎总是在6-18个月内出现，并且RAS介导的途径之间的交互应答(cross-talk)导致补偿。
图15示出MGS肽H2009.1–Y13-259对非小细胞肺癌细胞系具有细胞毒性，IC50为1.5μM。通过生物素-链霉亲和素缀合将抗RAS抗体偶联于MGS肽H2009.1。将不同的浓度与H2009细胞(人非小细胞肺癌细胞系)一起孵育。使用细胞TiterGlo测定在72H时测量细胞活力。
图16示出用MGS肽H1299.2-HA-Ras-MAb治疗的Nu/Nu小鼠中的H2009肿瘤生长。
图17示出使用MGS肽-Ras mAb的细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的靶向。使用H358人肺癌皮下肿瘤。KRAS G12C突变。在第0、7、14和25天，对每只小鼠静脉内注射25μg MAb。
图18示出MGS序列的表格。所选序列栏中的序列具有SEQ ID NO:34-70，从上到下分别列出。优化序列栏具有SEQ ID NO:71-77，从上到下分别列出。
图19A、19B和19C示出多聚化支架的结构。图19A示出可用于2种MGS肽的位点特异性马来酰亚胺键联以及使用另外的反应基团(R')的货物分子的可用键联的二聚体核心。图19B示出可用于4种MGS肽的位点特异性马来酰亚胺键联以及使用另外的反应基团(R')的货物分子的可用键联的四聚体核心。图19C示出原型二聚体核心，其具有用于连接2种MGS肽的单独的化学反应性基团R和用于连接货物的R'。可用的反应性基团包括但不限于叠氮基、醛基、酰肼、酯等。
图20A、20B和20C示出MGS肽与抗体的直接缀合及其细胞内递送。
图21示出用于肽与抗体缀合的SiteClick方法。
图22示出H358细胞在MSG 2009.1-抗Ras Ab治疗后表现出降低的活力。1治疗，50nM Ab，72小时连续暴露。
图23示出在MGS内化中受体再循环相对于新受体合成的作用。
图24汇总了3种不同化合价型式的肽HCC15.2(单体、二聚体和四聚体)在4种不同NSCLC细胞系上的细胞摄取的关键动力学特征，其示出肽亲和力在二聚化时显著增强，而在四聚化时适度改善。另外的实验表明MGS-肽化合价的差异可以改变细胞使肽受体再循环的能力，从而允许另外控制货物摄取。
图25示出4种MGS在4种NSCLC细胞系上的测定的有效剂量、化学计量和摄取速率。
具体实施方式
通过参考以下具体实施方案及其中包括的实施例的详细描述以及附图及其之前和之后的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。
应当理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组合物不限于特定合成方法、特定分析技术或具体试剂，并且因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的并且不意图具有限制性。
本文提及的所有出版物都以引用的方式并入本文，以结合所引用的出版物公开并描述方法和/或材料。本文中讨论的出版物仅仅提供它们在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发明无权先于这些出版物。此外，本文中提供的公布日期可能不同于实际的公布日期，它们可能需要单独确认。
公开了材料、组合物和组分，其可以用于所公开的方法和组合物的产物，可以与所述产物结合使用，可以用于制备所述产物，或者是所述产物。本文公开这些和其他材料，并且应了解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可能未明确地公开这些化合物的每个不同个别和共同组合以及排列的特定提到，但是其各自在本文中特定地预期并描述。例如，如果公开并讨论了缀合物并且讨论了可以对包括MGS肽的多个分子进行的多种修饰，除非特定地相反指示，否则特定地预期所述缀合物的每一种组合和排列以及可能的修饰。因而，若公开一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并公开组合分子的实例A-D，则即使没有单独列举每种情况，每种情况也被单独和整体地预期。因此，在所述实例中，特定地预期组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个，并且应当认为是从A、B和C；D、E和F；以及示例性组合A-D的公开内容中公开。同样，还特定地预期并公开这些的任何子集或组合。因此，例如，特定地预期A-E、B-F和C-E的亚组，并且应当认为是从A、B和C；D、E和F；以及示例性组合A-D的公开内容中公开。所述概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有可执行的各种附加步骤，应理解这些附加步骤中的每一个可与所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合一起执行，并且特定地预期每种此类组合并且应将其视为被公开。
A.定义
应理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不意图限制将仅由随附权利要求限定的本发明的范围。
必须指出，除非上下文明确地另外规定，否则如本文和随附权利要求所使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个/种指示物。因此，例如，提及“一种MGS肽”包括多种这样的MGS肽，提及“所述MGS肽”是提及本领域技术人员已知的一种或多种MGS肽及其等同物，诸如此类。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或材料可以发生或存在或者可以不发生或不存在，并且该描述包括其中事件、情况或材料发生或存在的情况和其中事件、情况或材料不发生或不存在的情况。
如本文所用，术语“受试者”是指可以例如出于实验、诊断和/或治疗目的施用本文公开的组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物如非人灵长类动物和人；禽类；家养或农场动物如猫、犬、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验动物如小鼠、大鼠和豚鼠；兔；鱼；爬行动物；动物园和野生动物)和/或植物。通常，“受试者”是动物，包括哺乳动物，如人和灵长类动物；等等。
如本文所用，术语“患者”是指患有疾病或病症的受试者。术语“患者”包括人和兽医学受试者。在所公开方法的一些方面，“患者”已被诊断为需要治疗自身免疫病症，例如，在施用步骤之前。
如本文所用，术语“氨基酸序列”是指表示氨基酸残基的缩写、字母、字符或词语的列表。本文所用的氨基酸缩写是氨基酸的常规单字母代码，并且表示如下：A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸。
如本文所用的“多肽”是指任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白质。多肽由连续氨基酸组成。术语“多肽”涵盖天然存在或合成的分子。
另外，如本文所用，术语“多肽”是指通过肽键或经修饰的肽键彼此连接的氨基酸，例如肽等排体(peptide isosteres)等，并且可含有除20种基因编码的氨基酸以外的经修饰氨基酸。多肽可以通过天然过程如翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。修饰可以发生在多肽中的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定多肽的几个位点。另外，给定多肽可以具有许多类型的修饰。修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价交联或环化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、二硫键形成、去甲基化、半胱氨酸或焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸盐化和转运RNA介导的向蛋白质中添加氨基酸，如精氨酰化。(参见Proteins-Structureand Molecular Properties第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson编著,Academic Press,New York,第1-12页(1983))。
如本文所用，短语“核酸”是指能够通过Watson-Crick碱基配对与互补核酸杂交的天然存在或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA或RNA还是DNA-RNA杂合体、单链还是双链、有义还是反义。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物(例如，BrdU)和非磷酸二酯核苷间键(例如，肽核酸(PNA)或硫代二酯键)。具体地，核酸可以包括但不限于DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合
如本文所用，“样品”是指动物；来自动物的组织或器官；细胞(在受试者体内，直接取自受试者，或保持在培养物中或来自培养细胞系的细胞)；细胞裂解物(或裂解物级分)或细胞提取物；或包含来源于细胞或细胞材料的一种或多种分子(例如多肽或核酸)的溶液，其如本文所述进行测定。样品还可以是包含细胞或细胞组分的任何体液或排泄物(例如但不限于血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁)。
如本文所用，“调节”是指通过增加或减少进行改变。
如本文所用，化合物的“有效量”是指足以提供所需效果的化合物的量。所需的精确量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗疾病(或潜在的遗传缺陷)的严重程度、所用的具体化合物、其施用模式等。因此，不可以指定精确的“有效量”。然而，本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定适当的“有效量”。
如本文所用，“分离的多肽”或“纯化的多肽”是指基本上不含该多肽在自然界中通常与之相关联的材料的多肽(或其片段)。本发明的多肽或其片段可以例如通过从天然来源(例如，哺乳动物细胞)中提取，通过表达编码所述多肽的重组核酸(例如，在细胞或无细胞翻译系统中)或通过化学合成所述多肽而获得。另外，多肽片段可通过这些方法中的任一种或通过切割全长蛋白质和/或多肽而获得。
如本文所用，“分离的核酸”或“纯化的核酸”是指不含在本发明的DNA所来源的生物体的天然存在的基因组中处于该基因侧翼的基因的DNA。因此，该术语包括例如重组DNA，其被并入载体中，如自主复制质粒或病毒；或被并入原核生物或真核生物的基因组DNA中(例如转基因)；或以单独分子的形式存在(例如，通过PCR、限制性内切核酸酶消化或化学或体外合成产生的cDNA或基因组或cDNA片段)。它还包括为编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。术语“分离的核酸”还指RNA，例如由分离的DNA分子编码的，或化学合成的，或与至少一些细胞组分例如其他类型的RNA分子或多肽分子分离或基本上不含所述细胞组分的mRNA分子。
如本文所用，“预防”是指使得癌症的易感性增加的受试者得癌症的机会最小。
如本文所用，“特异性结合”是指抗体识别其同源抗原或靶标(例如，所公开的合成MGS序列)并与其实际发生相互作用，并且不显著识别其他抗原或靶标并与其相互作用；这样的抗体可以是通过本领域众所周知的技术产生的多克隆抗体或单克隆抗体。
如本文所用，“探针”、“引物”或寡核苷酸是指限定序列的单链DNA或RNA分子，其可以与含有互补序列的第二DNA或RNA分子(“靶标”)碱基配对。所得杂合体的稳定性取决于发生的碱基配对的程度。碱基配对的程度受如探针与靶分子之间的互补程度和杂交条件的严格程度之类的参数的影响。杂交严格程度受如温度、盐浓度和如甲酰胺的有机分子的浓度之类的参数的影响，并通过本领域技术人员已知的方法确定。对能够编码所公开的MGS序列的核酸(例如，基因和/或mRNA)具有特异性的探针或引物与能够编码与其杂交的所公开的MGS序列的核酸区域具有至少80％-90％序列互补性，优选地至少91％-95％序列互补性，更优选地至少96％-99％序列互补性，并且最优选地100％序列互补性。探针、引物和寡核苷酸可通过本领域技术人员众所周知的方法以放射性或非放射性方式可检测地标记。探针、引物和寡核苷酸用于涉及核酸杂交的方法，如：核酸测序、通过聚合酶链式反应进行的逆转录和/或核酸扩增、单链构象多态性(SSCP)分析、限制性片段多态性(RFLP)分析、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shiftassay，EMSA)。
如本文所用，“特异性杂交”是指探针、引物或寡核苷酸在高严格条件下识别基本上互补的核酸(例如，能够编码所公开的MGS序列的核酸)并与其实际发生相互作用(即，碱基配对)，并且基本上不与其他核酸碱基配对。
如本文所用，“高严格条件”是指允许杂交与在含有pH 7.2的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA(部分V)的缓冲液中，在65℃的温度下，或在含有48％甲酰胺、4.8XSSC、pH 7.6的0.2M Tris-Cl、1X Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和0.1％SDS的缓冲液中，在42℃的温度下，使用长度为至少40个核苷酸的DNA探针产生的杂交相当的条件。用于高严格杂交如PCR、Northern、Southern或原位杂交、DNA测序等的其他条件是分子生物学领域的技术人员众所周知的。(参见，例如，F.Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,NY,1998)。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗剂、预防剂和/或诊断剂(例如，与抗体缀合的MGS肽)的量，当施用给患有或易患疾病、病症和/或病状的受试者时，所述量足以治疗、减轻、改善、缓解、减轻所述疾病、病症和/或病状的症状，预防、延迟所述疾病、病症和/或病状的发作，抑制所述疾病、病症和/或病状的进展，降低所述疾病、病症和/或病状的严重程度和/或减少所述疾病、病症和/或病状的发病率。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全地减轻、改善、缓解、延迟具体疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发作，抑制所述具体疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的进展，降低所述具体疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的严重程度和/或减少所述具体疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发病率。例如，“治疗”微生物感染可以指抑制微生物的存活、生长和/或传播。可以出于减少发展与疾病、病症和/或病状相关的病理的风险的目的，向没有表现出疾病、病症和/或病状的征兆的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病状的早期征兆的受试者施用治疗。在一些实施方案中，治疗包括将一种或多种所公开的组合物递送至受试者。
如本文所用，术语“抗体”还包括全长抗体和完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在、可酶促获得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术由例如完整抗体分子衍生，所述标准技术如蛋白水解消化或重组基因工程改造技术，其涉及编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的操纵和表达。这种DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。DNA可以用化学方法或通过使用分子生物学技术进行测序和操纵，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元。如本文所用，表述“抗原结合片段”内还涵盖其他工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
本文所述的抗体可以是重组的、嵌合的或人源化的抗体。术语“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。“人源化抗体”具有通过一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同于来源于非人物种的抗体的序列的序列，使得当施用于人受试者时，与非人物种抗体相比，人源化抗体不太可能诱导免疫应答，和/或诱导不太严重的免疫应答。
范围在本文中可表述为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表述这样的范围时，除非上下文另外特定指示，否则还特定地预期并考虑公开从一个具体值和/或至另一个具体值的范围。类似地，除非上下文另外特定指示，否则当通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，应理解，具体值形成应被认为是公开的另一个特定预期的实施方案。还应当理解，除非上下文另外特定指示，否则每个范围的端值不论是相对于另一个端值，还是独立于另一个端值都是有意义的。最后，应当理解，除非上下文另外特定指示，否则明确公开的范围内包含的所有单个值和值的子范围也被特定地预期并且应当被认为是公开的。无论在具体情况下是否明确公开这些实施方案中的一些或全部，前述内容都适用。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本发明方法和组合物的实践或测试，但是特别有用的方法、装置和材料如所描述的那样。本文引用的出版物及其所引用的材料据此通过引用特定并入。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发明无权先于所述公开。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的论述陈述其作者所声称的内容，并且本申请人保留质疑所引用文件的准确性和相关性的权利。应清楚理解，尽管在本文提及了多个出版物；但这一提及并不构成承认任何这些文件形成本领域的普通常识的一部分。
在本说明书的描述和权利要求全篇中，词语“包括(comprise)”和所述词语的变体(如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”)是指“包括但不限于”，并且不意图排除例如其他添加物、组分、整数或步骤。具体地，在陈述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，特别地预期每个步骤都包括所列出的内容(除非所述步骤包括如“由……组成”之类的限制性术语)，这意味着每个步骤都不旨在排除例如未在步骤中列出的其他添加物、组分、整数或步骤。
B.组合物
公开了用于制备所公开组合物的组分以及将在本文公开的方法内使用的组合物本身。本文公开这些和其他材料，并且应了解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可能未明确地公开这些化合物的每个不同个别和共同组合以及排列的特定提到，但是其各自在本文中特定地预期并描述。公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物。在一些方面，抗体靶向细胞内靶标。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中抗体是单克隆抗体。在一些方面，单克隆抗体可以是抗Ras单克隆抗体。
MGS肽。本文公开了MGS或靶向肽。这些肽可以选择性地结合细胞。可以在所公开的组合物中使用或修饰的MGS肽的实例可以包括但不限于McGuire等人,Sci Rep.2014年3月27日；4:4480中公开的一种或多种MGS肽。还可用于所公开的组合物和方法中的MGS肽的实例包括但不限于表1以及图9和10中所示的MGS序列。
表1.肽序列。
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SEQ ID NO:71-77是优化的MGS肽。通过对利用FOX-3平台技术鉴定的单个亲本肽序列施加修饰获得优化的肽。这些修饰用于鉴定亲本序列内细胞特异性结合和内化所需的必需氨基酸。这些修饰是通过丙氨酸扫描和亲本肽的氨基末端区域和c末端区域的截短的组合获得的。PEG11提供对MGS肽的C末端的保护，提供肽与通过C末端的半胱氨酸连接的货物分子之间的间隔子，并增强MGS-肽的溶解性。通过乙酰化(CH3CO-)和/或d-氨基酸如d(Leu)在氨基末端形成的修饰防止由血液中的肽酶造成的降解。不存在可以应用于所有MGS肽的均一长度的优化肽，并且需要测试所有变化以确认对肽摄取和稳定性的影响。在肽73中，使用YC以允许我们通过280nm处的吸光度来监测肽合成和浓度。在不添加酪氨酸(Y)的情况下，所述肽将明显更难以监测。
公开了包含序列CH3CO-YAAWPASGAWT-PEG11-C-NH2(SEQ ID NO:71)、CH3CO-LQWRRNFGVWARYRL-PEG11-C-NH2(SEQ ID NO:72)、CH3CO-d(Leu)-RGDLATLRQL-PEG11-YC-NH2(SEQ ID NO:74)、CH3CO-LQWRRNFGVWARYRL-PEG11-C-NH2(SEQ ID NO:75)、CH3CO-FHAVPQSFYT-PEG11-C-NH2(SEQ ID NO:76)或CH3CO-FHAVPQSFYT-PEG11-C-NH2(SEQ ID NO:77)的经修饰的肽。
公开了表1中描述的MGS肽中的任一种。
在一个方面，所述组合物包含一种或多种MGS肽和抗体。在一个方面，所述组合物包含一种或多种本文公开的MGS肽和抗体。在一个方面，用于跨脂质膜运输的膜可透性缀合物可以包含一种或多种MGS肽和抗体。
在一个方面，一种或多种MGS肽可以是本文公开的MGS肽中的任一种。在一个方面，一种或多种MGS肽包含SEQ ID NO:1、2、3、34、35、36、37、38、39、40、41、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、5、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、81、82、83、84或其组合。
在一个方面，一种或多种MGS肽包含SEQ ID NO:1、2、3、34、35、36、37、38、39、40、41、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、5、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、81、82、83或84。在一个方面，一种或多种MGS肽可以是SEQ ID NO:3。在一个方面，所述组合物可以包含一种或多种MGS肽，例如，在一些方面，所述组合物可以包含一种、两种、三种、四种或五种MGS肽。在一个方面，一种或多种MGS肽可以形成四聚体支架蛋白。在一个方面，本文所公开的一种或多种MGS肽可以是截短的。
在一个方面，一种或多种MGS肽可以是经修饰的。在一个方面，一种或多种MGS肽可以在N末端乙酰化。在一个方面，一种或多种MGS肽可以与抗体化学缀合。在一个方面，化学缀合物可以是聚乙二醇(PEG)。在一个方面，PEG单元的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多。在一个方面，PEG单元的数目可以具有足够的长度，以将一种或多种MGS肽与抗体分离，从而防止一种或多种MGS肽与抗体之间的任何空间干扰。例如，本文公开了包含化学缀合物的组合物，其中化学缀合物是PEG，并且PEG包括11个PEG单元。在一个方面，一种或多种MGS肽包含SEQ ID NO:3，其中SEQ ID NO:3可以在N末端乙酰化，并且可以与PEG化学缀合；和抗体，其中抗体可以与PEG共价连接。
公开了包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体的组合物，其中一种或多种MGS肽包含序列EHPWFNMWSWATQVQE(SEQ ID NO:38)、YPGSPTQYPSSMHEYHSSSE(SEQ ID NO:39)、AHTIDDEWASYHMQQWNSPP(SEQ ID NO:40)、FEEFYSRQSNTIPYPQQYKG(SEQ ID NO:41)、THGNKHQSWTYPSEINHKNY(SEQ ID NO:19)、NLADTWTQTQQHDFHVLRGTR(SEQ ID NO:20)、GYSWWQPNWPSSTWDT(SEQ ID NO:21)或其组合。在一些方面，一种或多种MGS肽包含序列EHPWFNMWSWATQVQE(SEQ ID NO:38)。
在所公开的组合物的一些方面，一种或多种MGS肽定位至一种或多种细胞内靶标。例如，细胞内靶标可以是但不限于溶酶体、高尔基体、内质网、细胞质或细胞核。可以靶向任何亚细胞区室。
抗体和一种或多种MGS肽可以蛋白质通常缀合或连接的任何方式缀合。在一些方面，抗体可以经由接头与一种或多种MGS肽缀合。例如，在一些情况下，接头可以是肽接头或核酸接头。在一些方面，接头可以是可裂解接头。在一些方面，与一种或多种MGS肽缀合的抗体是融合蛋白。换句话说，与一种或多种MGS肽缀合的抗体可以作为包含若干不同肽的一种长蛋白质产生，而不是作为单独的肽产生然后再缀合或连接在一起。在一些方面，MGS肽可以使用任何已知的缀合方法与抗体缀合，所述缀合方法包括但不限于SiteClick化学。
在所公开的组合物的一些方面，抗体还可以包含标记。例如，本文公开的组合物可以包含可检测标记。此类可检测标记可以包括但不限于被设计用于检测(例如，纯化或定位)所表达的多肽或序列的标签序列。标签序列包括，例如，绿色荧光蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、聚组氨酸、c-myc、血凝素或FlagTM标签，并且可以与所编码的核酸融合。此类可检测标记可以包括但不限于荧光剂、酶标记或放射性同位素。
在一些方面，所公开的组合物可以是药物组合物。例如，在一些方面，公开了包含组合物和药学上可接受的载体的药物组合物，所述组合物包含与一种或多种MGS肽缀合的抗体。“药学上可接受的”是指如本领域技术人员熟知的，选择的材料或载体将使活性成分的任何降解最小化并使受试者中的任何不良副作用最小化。载体的实例包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷酸盐缓冲盐水或多囊脂质体。例如，PG:PC:胆固醇:肽或PC:肽可以用作本发明的载体。其他合适的药学上可接受的载体及其制剂描述于Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy(第19版)，A.R.Gennaro编，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995中。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使制剂等渗。药学上可接受的载体的其他实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH可以是约5至约8，或约7至约7.5。另外的载体包括缓释制剂，如含有组合物的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为成型制品的形式，例如膜、支架(其在血管成形术过程中植入血管中)、脂质体或微粒。本领域技术人员将显而易知，取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。这些载体最典型地将是用于将药物施用于人的标准载体，包括溶液如无菌水、盐水和生理pH下的缓冲溶液。
药物组合物还可以包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂等，只要不损害本发明的多肽、肽或缀合物的预期活性即可。药物组合物还可包含一种或多种活性成分(除了本发明的组合物之外)，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
如本文所公开的药物组合物可以被制备用于口服或肠胃外施用。被制备用于肠胃外施用的药物组合物包括被制备用于静脉内(或动脉内)、肌内、皮下、腹膜内、经粘膜(例如鼻内、阴道内或直肠)或经皮(例如局部)施用的那些。气雾剂吸入也可用于递送融合蛋白。因此，可以制备用于肠胃外施用的组合物，其包含溶解或悬浮在可接受载体中的融合蛋白，所述可接受载体包括但不限于水性载体，如水、缓冲水、盐水、缓冲盐水(例如PBS)等。所包括的一种或多种赋形剂可以有助于接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。在组合物包含固体组分(在它们可用于口服施用时)的情况下，一种或多种赋形剂可以用作粘结剂或填充剂(例如，用于配制片剂、胶囊等)。在组合物被配制用于应用于皮肤或粘膜表面的情况下，一种或多种赋形剂可以是用于配制乳膏、软膏等的溶剂或乳化剂。
药物组合物可以是无菌的，并且通过常规灭菌技术灭菌或无菌过滤。水性溶液可以包装以便原样使用，或冻干，本公开涵盖的冻干制剂可以在施用前与无菌含水载体混合。药物组合物的pH通常将在3与11之间(例如，在约5与9之间)或在6与8之间(例如，在约7与8之间)。可以将固体形式的所得组合物以多个单剂量单位包装，每个单位包含固定量的一种或多种上述药剂，如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以包装在容器中以获得灵活的量，如在被设计用于局部应用的乳膏或软膏的可挤出管中。
C.方法
公开了靶向细胞内靶标的方法，其包括施用治疗有效量的一种或多种所公开的组合物。
公开了靶向细胞内靶标的方法，其包括施用与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中抗体靶向细胞内靶标。在一些方面，细胞内靶标可以是溶酶体、高尔基体、内质网、细胞质或细胞核。可以靶向任何亚细胞区室。
在一个方面，技术人员可以确定所公开的组合物或所公开的融合蛋白或所公开的融合蛋白的有效剂量、有效时间方案或有效施用途径，以便诱导靶向细胞内靶标，使得可以使细胞内靶标失活。
还公开了治疗有需要的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中抗体靶向参与疾病过程的细胞内靶标。
在本文的任何所公开方法的一个方面，本文所述的组合物、缀合物或融合蛋白可以与一种或多种另外的疗法组合。在一个方面，组合物、缀合物或融合蛋白可以单独施用或与其他生物活性剂组合成适于施用给受试者的组合物。在一个方面，本文所公开的涉及治疗患有癌症或处于患癌症风险中的受试者的方法、组合物、缀合物或融合蛋白可以与例如治疗有效量的放射疗法、免疫疗法或化学疗法或其组合相组合。组合疗法可以作为共制剂施用或分开施用。当分开施用时，可以同时或顺序地施用组合疗法。可以使用本领域常规方法制备制剂。
可以将上述药物组合物配制成包括治疗有效量的如本文所公开的组合物、缀合物或融合蛋白。治疗性施用涵盖预防性应用。基于基因检测和其他预后方法，与其患者协商的医师可以选择预防性施用，其中患者对一种或多种自身免疫疾病具有临床上确定的倾向性或增加的易感性(在一些情况下，大大增加的易感性)，或患者对癌症具有临床上确定的倾向性或增加的易感性(在一些情况下，大大增加的易感性)。
本文所述的药物组合物可以足以延迟、减少或优选地预防临床疾病发作的量施用于受试者(例如，人受试者或人患者)。因此，在一些方面，受试者是人受试者。在治疗应用中，将组合物以足以至少部分地改善体征或症状或抑制(并优选地阻止)病状的症状、其并发症和后果的进展的量施用于已患有或被诊断患有自身免疫疾病的受试者(例如人受试者)。将足以实现这一点的量定义为“治疗有效量”。药物组合物的治疗有效量可以是实现治愈的量，但是该结果只是可以实现的若干结果之一。如同所指出的那样，治疗有效量包括提供治疗的量，其中癌症的发作或进展被延迟、阻碍或预防，或者自身免疫疾病或自身免疫疾病的症状得到改善。一种或多种症状可以不那么严重。可以加快已经被治疗的个体的康复。
本文所公开的药物组合物中的缀合物或融合蛋白的总有效量可以作为单剂量，以大丸剂形式或通过输注经相对短的时间段施用给哺乳动物，或者可以使用分次治疗方案进行施用，其中多次剂量经更长的时间段施用(例如，每4-6、8-12、14-16或18-24小时或每2-4天、1-2周一次剂量，或每月一次)。可选地，足以维持血液中的治疗有效浓度的连续静脉内输注也在本公开的范围内。
存在于本文所述的组合物中并在应用于哺乳动物(例如人)的如本文公开的方法中使用的抗体的治疗有效量可以由本领域普通技术人员通过考虑年龄、体重和其他一般状况的个体差异(如上文所提及)进行确定。因为本公开的组合物、缀合物和融合蛋白在血清和血流中可以是稳定的，并且在一些情况下更具特异性，所以包含任何单独组分的组合物、缀合物和融合蛋白的剂量可以低于(或高于)未结合时任何单独组分的有效剂量。因此，在一些方面，与抗体单独或不作为缀合物或融合蛋白的一部分施用时相比，所施用的抗体当作为缀合物或融合蛋白的一部分施用时可以具有增加的功效或减少的副作用。
在一些方面，有需要的受试者患有传染病、癌症、糖尿病、神经性或神经变性疾病、基因遗传性疾病、溶酶体病、线粒体病，或已暴露于生物恐怖剂。
D.载体
公开了包含编码一种或多种所公开的组合物的核酸序列的载体。在一些方面，载体仅包含能够编码一种或多种所公开的MGS肽的核酸序列。
E.试剂盒
上述材料以及其他材料可以以任何合适的组合包装在一起，作为可用于执行或帮助执行所公开的方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组分经过设计并适于在所公开的方法中一起使用，那么所述试剂盒是有用的。例如，公开了包括一种或多种所公开的组合物的试剂盒。
在一些方面，试剂盒包括MGS肽和单克隆抗体以及用于缀合的说明书。
在一些方面，试剂盒包括细胞系，所述细胞系包含编码一种或多种MGS肽的核酸序列。
实施例
A.实施例1
直到最近，还没有报道靶向细胞内/亚细胞组分的系统性方法。适当的FOX-Three技术是用于系统性发现能够将MAb递送至细胞和亚细胞靶标的MGS的平台。FOX-Three平台用三种关键属性鉴定MGS：瞄准追踪(home in on)期望细胞类型的能力、触发细胞摄取的能力，以及将有效负载递送至靶细胞内的离散定位的能力。在图1中示出MGS的概述。
FOX-Three平台基于建立的噬菌体展示文库，所述文库含有109-1012个基于候选肽的MGS成员，可以针对靶细胞和亚细胞系统快速筛选以鉴定特异性靶向的MGS(图2)。肽是一类熟知的生物分子，其易于通过生物学方法和通过人造化学方法合成。因此，FOX-Three平台的能力在其速度和灵活性上都得到了证明。它可以应用于任何细胞类型，不管关于所述细胞的分子特征的认识如何，都能在2-4周内产生前导MGS。然后，为了最佳性能，容易地对基于所选肽的MGS进行工程改造。表2示出使用FOX-Three技术鉴定的MGS。
表2.通过FOX-Three技术鉴定的MGS
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FOX-Three平台已经被证实用于细胞和亚细胞组分的靶向。许多经过验证的MGS处于各种开发阶段(表1和2)，以用于多种细胞靶向系统。已经建立了将多种有效负载与肽MGS缀合而不破坏它们的靶向能力的方法。已经证明所选的MGS将药物、显像剂、纳米粒子、DNA和蛋白质递送至培养基和动物模型中的靶细胞。尽管已经建立了细胞靶向，并且存在许多用于靶向靶细胞表面的基于竞争性抗体的技术，但是先前不知道细胞内MGS。细胞内靶向的重要性示于图3中，其示出细胞的复杂结构。例如，如果MAb被捕获到细胞中的高尔基体或其他定位，那么旨在结合参与细胞核中的DNA复制的蛋白质的MAb的递送在治疗上是无效的。近期精细调整了FOX-Three筛选方法以包括亚细胞定位靶向作为选择标准。已经分离了积聚在癌细胞内部的溶酶体、自噬体和高尔基体中以及靶向质膜的MGS(图3)。已经证明MGS的治疗效果取决于递送到正确的亚细胞定位。
鉴于大量的细胞类型、疾病状态、细胞内细胞器和可递送的有效负载，FOX-Three平台的潜力是巨大的。可以开发用于产生优化MGS的“工具箱”的稳健平台，其可以递送针对选择的疾病细胞类型和亚细胞组分的MAb的聚焦组(focused set)。为此，FOX-Three平台可以用于扩大可以靶向的亚细胞器的数目(图3)。可以执行一组具有量化标志(quantitativemilestone)的实验。
在一些方面，可以研究靶向非小肺癌细胞系并积聚在溶酶体、高尔基体和线粒体中的3种MGS的合成、表征和优化。
在一些方面，三种分离的MGS可以用于将生物活性抗体细胞内递送至溶酶体、高尔基体和线粒体。可以证明在这些亚细胞组分中的每一个中的特异性蛋白质靶向的调节。
在一些方面，可以鉴定靶向病毒感染的细胞的至少5种MGS。此外，亚细胞定位可以扩大为包括溶酶体、高尔基体、线粒体、内质网、细胞质和细胞核。
将治疗性MAb递送至特定靶细胞和所述细胞内的正确区室的能力可以具有许多社会保健益处。MGS-MAb组合可以产生一类新的安全且有效的细胞内作用药物，其具有治疗迄今为止“无成药性”靶标的潜力。这开辟了用于治疗新出现的传染病和生物恐怖的新治疗策略，用于癌症、糖尿病、神经性和神经变性疾病以及甚至基因遗传性疾病的新型疗法。MGS-MAb组合药物可以为这种新型药物类别开创全新的市场，至少像MAb的当前市场大小$70B一样大，从而实际上影响每一种疾病状态并在现代医学中产生重大突破。
FOX-Three发现MGS并以前所未有的速度提供细胞内靶向性人治疗性抗体的快速开发，以对新出现的威胁产生极其安全且快速的应答。
所开发的FOX-Three MGS工具箱可以递送多种其他有效负载。虽然MAb的递送是重点，但重要的是注意MGS可以递送许多不同的有效负载并具有其他临床应用(表1和2)。MGS可以递送小分子药物、显像剂、纳米粒子、DNA、放射性核素和其他蛋白质。MGS可以用于疾病的早期检测和作为伴随诊断。早期疾病检测通常是临床结果的主要决定因素。伴随诊断可以跟踪对治疗的应答，允许治疗的快速变化，从而在必要时节省时间和成本。MGS-治疗剂可以用于多种疾病状态的靶向治疗剂(小分子、核酸、合成大分子如聚合物和蛋白质)、体外和体内诊断、癌症的个性化疗法、细胞内纳米粒子递送和创新的免疫疗法。
所述技术具有快速产生靶向病原体感染细胞的MGS-MAb的能力，从而以几周相对几年改善了对现有和新出现的病原体的治疗。目前的技术太慢，以至于不能开发用于进化病毒的靶向治疗。
所述技术通过递送先前细胞不可透过的化合物而开辟了用于治疗多种疾病的新类型的治疗剂，使得能够实现用于保护战士的全新武器
所述技术提供检测和中和潜在的细胞内病毒感染的能力，否则所述感染可能在整个社区中重新激活或传播/重新传播。
所述技术可以快速开发可以在诊断和用于生物学读出的传感器技术中使用的MGS。
B.实施例2
MGS可以影响多种疾病的治疗，并开辟新的治疗选择。靶向蛋白相互作用产生一类新的细胞内作用药物，所述药物具有治疗“无成药性”靶标的潜力。治疗适应症包括癌症、新出现的传染病和生物恐怖、心脏病、糖尿病、纤维化、神经性和神经变性疾病。MGS具有广泛的适用性，并且可以用于递送小分子药物、显像剂、核酸和蛋白质递送、纳米粒子和细胞疗法。
小肽-MGS在体外和体内将大单克隆抗体递送到细胞中。小肽将不能携带几乎大于其分子量60倍的MAb。细胞仅用MAb处理，没有发生细胞摄取。但是当MAb与一种已鉴定的MGS肽缀合时，观察到细胞摄取增加20-4000倍。肽不仅在细胞内部递送细胞不可透过的MAb，而且连接MAb不改变所述肽在期望的亚细胞定位积聚的能力。
肽-MGS可以递送MAb并且细胞摄取增加20-380倍(图4A)。肽-MGS可以将MAb递送到如MGS所决定的离散亚细胞定位。(图4B)。肽-MGS可以将MAb重新定向到肿瘤，并将MAb保留在肿瘤中大于72H(图4C)。肿瘤摄取增加2-4倍，而非特异性组织(例如，肾和肝)摄取减少。
对于肽(MGS)可以如何将货物递送至正确的亚细胞定位的另一实例以及这种精确递送的重要性，测试了2种不同的肽治疗性缀合物。第一种肽(MGS)是特异性结合NSCLC细胞的高尔基体靶向肽(图9)。将所述肽(MGS)与DNA损伤剂倍癌霉素缀合。所述缀合物在药物与肽之间具有接头，所述接头必须被溶酶体中存在的酶裂解，以变得具有活性并到达细胞核。然而，当用所述缀合物处理细胞时，尽管事实上这是一种非常有效的药物，但实际上它对这些细胞是无毒的。这是因为所述肽在高尔基体中积聚并在其中螯合。
肽-MGS可以递送细胞不可透过的治疗剂(蛋白质毒素、皂草素和DNA烷化剂、倍癌霉素)并且特异性地杀死癌细胞。亚细胞定位决定治疗的功效。MGS-皂草素缀合物的初步数据显示出在动物中的抗肿瘤功效。
图10示出七种MGS肽及其亚细胞定位区室。首先推进肽EHPWFNMWSWATQVQE(SEQ IDNO:38)(H2009.2)。该肽的化合价已经得到优化，它与3种不同的非小细胞肺癌细胞结合，其中与正常对照细胞的结合最少，它在细胞内递送MAb，并且以80nM的效力有效地递送细胞不可透过的蛋白-毒素以在癌细胞中诱导细胞死亡。
图11示出Ras是癌症增殖中的关键节点，并且对药物而言具有挑战性。治疗Ras的MAb治疗方法将降低细胞中的总Ras水平，改变细胞定位以防止激活，并将Ras保持处于无活性状态。
图17示出与未治疗或仅用MAb治疗相比肿瘤生长的减少。没有观察到明显的毒性。
图20示出直接缀合不破坏MGS介导细胞摄取的能力。MGS与MAb之间的较长接头增加靶细胞中的摄取。具有相同化学反应性基团的双功能接头用于在MAb(NHS酯化学)与MGS-肽(马来酰亚胺化学)之间形成缀合物。SMCC没有PEG间隔子，而PEG-12和PEG-24分子在化学反应性基团之间具有更短或更长的PEG重复单元，这增强MGS-肽与其细胞受体相互作用的能力，而没有来自MAb蛋白的空间位阻。如所证明的，PEG-24间隔子使得MAb-MGS缀合物的摄取比具有较短间隔臂的2种缀合物的摄取高。
图23展示了一些MGS肽如何结合再循环的细胞受体以及一些MGS肽如何结合需要新合成的细胞受体。MGS_H2009.1 v4结合细胞受体，所述细胞受体快速再循环回到细胞表面，在那里其可在另一MGS分子中穿梭。MGS_H1299.2 v4、HCC15.1 v4和HCC15.2 v8结合细胞受体，所述细胞受体在内化后大部分降解，并且发生新的受体合成以便内化更多的MGS。
MGS_H1299.2 v4的细胞受体是EphA2。在对EphA2的研究过程中获得了以下结果。细胞中EphA2的减少消除了MGS_H1299.2 V4结合。增加细胞中的EphA2增加了MGS_H1299.2V4结合。MGS_H1299.2 V4结合来自裂解细胞的EphA2，并结合纯化的EphA2：Kd 3.2nM。EprhrinA1和MGS_H1299.2 V4竞争结合。最后，MGS_H1299.2 V4诱导EphaA2内化并与溶酶体中的受体共定位。
本领域技术人员将显而易见，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以对本发明做出各种修改和变化。通过考虑本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他方面对于本领域技术人员而言将是显而易见的。意图仅将本说明书和实施例认为是示例性的，其中本发明的真实范围和精神由随附权利要求来指示。
本领域技术人员将认识到或者能够仅仅使用常规实验确定本文所述的方法和组合物的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在由以下权利要求涵盖。
本文还提供以下项目：
1.一种组合物，其包含与一种或多种分子导向系统(MGS)肽缀合的抗体。
2.如项目1所述的组合物，其中所述抗体靶向细胞内靶标。
3.如项目1-2中任一项所述的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.如项目3所述的组合物，其中所述单克隆抗体是抗Ras单克隆抗体。
5.如项目1-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种MGS肽包含序列EHPWFNMWSWATQVQE(SEQ ID NO:38)、YPGSPTQYPSSMHEYHSSSE(SEQ ID NO:39)、AHTIDDEWASYHMQQWNSPP(SEQ ID NO:40)、FEEFYSRQSNTIPYPQQYKG(SEQ ID NO:41)、THGNKHQSWTYPSEINHKNY(SEQ ID NO:19)、NLADTWTQTQQHDFHVLRGTR(SEQ ID NO:20)、GYSWWQPNWPSSTWDT(SEQ ID NO:21)或其组合。
6.如项目1-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种MGS肽包含序列SEQ IDNO:1、2、3、34、35、36、37、38、39、40、41、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、5、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76或77或其组合。
7.如项目5所述的组合物，其中所述一种或多种MGS肽包含序列EHPWFNMWSWATQVQE(SEQ ID NO:38)。
8.如项目1-6中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种MGS肽定位至一种或多种细胞内靶标。
9.如项目8所述的组合物，其中所述细胞内靶标是溶酶体、高尔基体、内质网、细胞质或细胞核。
10.如项目1-9中任一项所述的组合物，其中所述抗体经由接头与所述一种或多种MGS肽缀合。
11.如项目1-9中任一项所述的组合物，其中与所述一种或多种MGS肽缀合的所述抗体是融合蛋白。
12.一种靶向细胞内靶标的方法，其包括施用与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中所述抗体靶向细胞内靶标。
13.如项目12所述的方法，其中所述细胞内靶标是溶酶体、高尔基体、内质网、细胞质或细胞核。
14.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述有需要的受试者施用有效量的与一种或多种MGS肽缀合的抗体，其中所述抗体靶向参与疾病过程的细胞内靶标。
15.如项目14所述的方法，其中所述有需要的受试者患有传染病、癌症、糖尿病、神经性或神经变性疾病、基因遗传性疾病，或已暴露于生物恐怖剂。
16.一种经修饰的肽，其包含序列CH3CO-YAAWPASGAWT-PEG11-C-NH2。
17.一种经修饰的肽，其包含序列CH3CO-LQWRRNFGVWARYRL-PEG11-C-NH2。
18.一种经修饰的肽，其包含序列CH3CO-d(Leu)-RGDLATLRQL-PEG11-YC-NH2。
19.一种经修饰的肽，其包含序列CH3CO-FHAVPQSFYT-PEG11-C-NH2。
序列表
<110> SRI国际(SRI International)
<120> 分子导向系统肽及其用途
<130> 37794.0002P1
<150> US 62/530,633
<151> 2017-07-10
<160> 84
<170> PatentIn 3.5版
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<400> 43
Phe His Ala Val Pro Gln Ser Phe Tyr Thr Ala Pro
1 5 10
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Glu Ala Met Asn Ser Ala Glu Gln Ser Ala Ala Val Val Gln Trp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Arg Ile
20
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Met Thr Val Cys Asn Ala Ser Gln Arg Gln Ala His Ala Gln Ala Thr
1 5 10 15
Ala Val Ser Leu
20
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Leu Thr Val His Gly Arg Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Ser Trp Asn Arg
1 5 10 15
Arg Ala Phe Pro
20
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Ser Val Glu Tyr Trp Gly Glu Arg Met Tyr Tyr Asp Val Met Glu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Phe Ser
20
<210> 48
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Phe Ala Ala Lys Arg Ala Glu Trp Trp Asp Pro Gly Gln Leu Trp Asp
1 5 10 15
Ala Val Trp Asn
20
<210> 49
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Gln Glu Ala Leu Glu Glu Trp Phe Trp Lys Met Met Pro Trp Ser Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Gln
20
<210> 50
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Thr Trp Thr Asp Phe Gly Gln Trp Pro Trp Pro Phe Gly Ala Glu Gly
1 5 10 15
Thr Arg Ala Phe
20
<210> 51
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Met Asp Gly Ala Thr Trp Trp Thr Gln Leu Asp Pro Leu Leu Val Trp
1 5 10 15
Glu Gly Glu Thr
20
<210> 52
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Ser Ala Asp Trp Phe Gln Gly Pro Ala Glu Trp Leu Leu Glu Gly Trp
1 5 10 15
Met Gly Pro Leu
20
<210> 53
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Met Arg Gly Gln Thr Gly Lys Leu Pro Thr Glu His Phe Thr Asp Thr
1 5 10 15
Gly Val Ala Phe
20
<210> 54
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Met Thr Gly Lys Ala Ala Ala Pro His Gln Glu Asp Arg His Ala Asn
1 5 10 15
Gly Leu Glu Gln
20
<210> 55
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Met Glu Lys Leu Pro Leu Ser Lys Thr Gly Arg Thr Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Val Ser Pro Pro
20
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Thr Asn Ser Cys Arg Gly Asp Trp Leu Cys Asp Ala Val Pro Glu Lys
1 5 10 15
Ala Arg Val
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Ser Ala Lys Thr Ala Val Ser Gln Arg Val Trp Leu Pro Ser His Arg
1 5 10 15
Gly Gly Glu Pro
20
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Lys Ser Arg Glu His Val Asn Asn Ser Ala Cys Pro Ser Lys Arg Ile
1 5 10 15
Thr Ala Ala Leu
20
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Trp Leu Ser Glu Ala Gly Pro Val Val Thr Val Arg Ala Leu Arg Gly
1 5 10 15
Thr Gly Ser Trp
20
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Thr Gly Gly Glu Thr Ser Gly Ile Lys Lys Ala Pro Tyr Ala Ser Thr
1 5 10 15
Thr Arg Asn Arg
20
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Ser His His Gly Val Ala Gly Val Asp Leu Gly Gly Gly Ala Asp Phe
1 5 10 15
Lys Ser Ile Ala
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Ser Asn Ser Pro Leu Gly Leu Lys Asp Glu Ala Thr Gln Arg Leu Val
1 5 10 15
Leu Glu Gln Ala Lys Trp Leu Ala
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Gly Pro Glu Asp Thr Ser Arg Ala Pro Glu Asn Gln Gln Lys Thr Phe
1 5 10 15
His Arg Arg Trp
20
<210> 64
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Ser Gly Glu Thr Gly Ser Asn Leu Val Gly His Glu Leu Asp Phe Arg
1 5 10 15
Pro Gly Ser Pro Ser Pro
20
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Arg Tyr Ser Pro Ala Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ser Val Ser Lys Glu
1 5 10 15
Leu Leu Arg Val
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Gly Gln Glu Leu Gly Ala Trp Thr Arg Ser Lys Gly Pro Glu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ser Val Leu
20
<210> 67
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Ala Ser Thr Trp Arg Gly Thr Ser Ala Gly Gly Asn Arg Leu Glu Lys
1 5 10 15
Met Glu Val Thr
20
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Leu Ser Gly Thr Pro Glu Arg Ser Gly Gln Ala Val Lys Val Lys Leu
1 5 10 15
Lys Ala Ile Pro
20
<210> 69
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Gly Ala Trp Glu Ala Val Arg Asp Arg Ile Ala Glu Trp Gly Ser Trp
1 5 10 15
Gly Ile Pro Ser
20
<210> 70
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Ala Met Asp Met Tyr Ser Ile Glu Asp Arg Tyr Phe Gly Gly Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Glu Val Gly
20
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> PEG11-C-NH2
<400> 71
Tyr Ala Ala Trp Pro Ala Ser Gly Ala Trp Thr
1 5 10
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> PEG11-C-NH2
<400> 72
Leu Gln Trp Arg Arg Asn Phe Gly Val Trp Ala Arg Tyr Arg Leu
1 5 10 15
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> PEG11-YC-NH2
<400> 73
Arg Gly Asp Leu Ala Thr Leu Arg Gln Leu
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Leu为d(Leu)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> PEG11-YC-NH2
<400> 74
Leu Arg Gly Asp Leu Ala Thr Leu Arg Gln Leu
1 5 10
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> PEG11-C-NH2
<400> 75
Leu Gln Trp Arg Arg Asn Phe Gly Val Trp Ala Arg Tyr Arg Leu
1 5 10 15
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> PEG11-C-NH2
<400> 76
Phe His Ala Val Pro Gln Ser Phe Tyr Thr
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> PEG11-C-NH2
<400> 77
Phe His Ala Val Pro Gln Ser Phe Tyr Thr
1 5 10
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Phe His Ala Val Pro Gln Ser Phe Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
His Ala Val Pro Gln Ser Phe Tyr Thr
1 5
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 80
Phe His Ala Val Pro Gln Ser Phe Tyr Thr
1 5 10
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Leu为d(Leu)
<400> 81
Leu Arg Gly Asp Leu Ala Thr Leu Arg Gln Leu
1 5 10
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 82
Tyr Ala Ala Trp Pro Ala Ser Gly Ala Trp Thr
1 5 10
<210> 83
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 83
Leu Gln Trp Arg Arg Asp Asp Asn Val His Asn Phe Gly Val Trp Ala
1 5 10 15
Arg Tyr Arg Leu
20
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 84
Lys Gln Tyr Ala Thr Pro Arg Val Phe Trp Thr
1 5 10

Claims (11)

1. 一种组合物，其包含直接地或经由接头与一种或多种分子导向系统MGS肽化学缀合的抗体，其中所述肽选自SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82和SEQ ID NO: 84。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体和/或所述肽靶向细胞内靶标。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述单克隆抗体是抗Ras单克隆抗体。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述细胞内靶标是溶酶体、高尔基体、内质网、细胞质或细胞核。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体经由接头与所述一种或多种MGS肽缀合。
7.如权利要求1所述的组合物，其中与所述一种或多种MGS肽缀合的所述抗体是融合蛋白。
8. 一种靶向细胞内靶标的方法，其中所述方法为体外方法，其包括施用直接地或经由接头与一种或多种MGS肽化学缀合的抗体，其中所述抗体靶向细胞内靶标，并且其中所述肽选自SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82和SEQ ID NO: 84。
9. 如权利要求8所述的方法，其中SEQ ID NO: 38的细胞内靶标是溶酶体；SEQ ID NO:72的细胞内靶标是溶酶体/自噬体；SEQ ID NO: 81的细胞内靶标是高尔基体；SEQ ID NO:76、82和84的细胞内靶标是亚细胞区室。
10. 一种肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO: 76、SEQ IDNO: 81、SEQ ID NO: 82或SEQ ID NO: 84中所示的氨基酸序列。
11.与一种或多种MGS肽缀合的抗体在制备用于治疗患有非小细胞肺癌的有需要的受试者的组合物中的用途，其中所述组合物选自根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，并且其中有效量的所述组合物被施用至所述有需要的受试者，其中所述抗体靶向参与疾病过程的细胞内靶标。
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A cancer specific cell-penetrating peptide,BR2,for the efficient delivery of an scFv into cancer cells;Lim K J,Sung B H,Shin J R,et al.;《PloS one》;20130611;第8卷(第6期);文章摘要、第10页左栏第二段 *
Lim K J,Sung B H,Shin J R,et al..A cancer specific cell-penetrating peptide,BR2,for the efficient delivery of an scFv into cancer cells.《PloS one》.2013,第8卷(第6期),第e66084-e66094页. *

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