KR102110127B1 - 세포 내재화를 유도하기 위한 ｃｄ20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법 - Google Patents

세포 내재화를 유도하기 위한 ｃｄ20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CD20 항원에 결합하여 CD20 항원을 세포 표면 위치로부터 세포의 내부로 신속하게 내재화하는 CD20-결합 단백질을 제공한다. 본 발명의 CD20-결합 단백질은 CD20 결합 영역 및 시가 독소 효과기 영역을 포함한다. 특정의 개재된 CD20-결합 단백질은 이들의 표면에서 CD20을 발현하는 세포를 사멸시킨다. 추가로, 현재 개재된 CD20-결합 단백질은 추가의 외인성 물질을 포함할 수 있고 추가의 외인성 물질을, CD20을 발현하는 세포의 내부로 표적화하여 전달될 수 있다. 이러한 추가의 물질은 펩타이드, 항원, 효소, 및 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 CD20-결합 단백질은 내재화 자체의 방법, CD20을 발현하는 세포의 표적화된 사멸, 외인성 물질의 CD20을 발현하는 세포내로의 전달, 및 암 및 면역 질환과 같은, CD20을 발현하는 세포를 포함하는 다양한 질병의 치료의 방법에서 용도를 갖는다.

Description

세포 내재화를 유도하기 위한 ＣＤ20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법{CD20-BINDING IMMUNOTOXINS FOR INDUCING CELLULAR INTERNALIZATION AND METHODS USING SAME}
본 발명은 세포 표면 위치로부터 세포 내부로 CD20 항원에 대한 결합 및 이의 신속한 내재화 능력을 지닌 CD20-결합 단백질에 관한 것이다. 이들 CD20-결합 단백질은 암 및 면역 질환을 포함하는 다양한 질병의 치료용 치료학적 분자로서의 용도를 지닌다.
면역독소는 면역글로불린 도메인(immunoglobulin domain)으로부터 유도되는 것과 같은 세포표면 결합영역 및 세균 또는 식물에서 발견된 것들과 같은, 천연적으로 발생하는 단백질 독소로부터 전형적으로 유도되는 독소영역을 결합한 키메라 분자이다. 면역독소의 효능은, 세포 내재화와 함께 시작하는 공정인, 세포 표면으로부터 세포질로 이전하는데 있어서의 이의 효능에 크게 의존한다[참조: Pirie et al. , J Biol Chem 286: 4165-72 (2011)].
CD20은 사람 및 마우스에서 적어도 26개의 단백질을 포함하는 막-스패닝(membrane-spanning) 4A(MS4A) 계열로 공지된 폴리펩타이드의 계열의 구성원이다[참조: Ishibashi et al, Gene 264: 87-93 (2001)]. 모든 MS4A 구성원의 경우, CD20 서열은, 이의 기능에 중추적인 것으로 여겨지는 구조적 특징인, 막을 4배 확장한 전이막 분자를 형성하는 3개의 소수성 영역을 예측하고 있다. 또한 제안된 제3 및 제4의 전이막 도메인과 세포내 아미노- 및 카복시-말단 영역 사이에 단일의 세포외 루프가 예측된다[참조: Tedder et al., Proc Natl Acad Sci, 85: 208-12 (1988)]. 이는, 리툭시마브와 같은 항-CD20 모노클로날 항체(mAb)의 대부분이 가장 중요한 잔기인 알라닌-170 및 프롤린-172과 결합하는 것으로 여겨지는 대략 40개 아미노산의 당해 세포내 루프내에 있다. CD20의 163 내지 187번 아미노산을 사용하여 CD20의 펩타이드 단편에 결합하는 항체의 결정 구조는 리툭시마브와 CD20에 대한 항원-항체 상호작용 지점으로서 173번 아미노산을 통한 170번 아미노산(알라닌)인 것으로 확인되었다[참조: Du et al,J Biol Chem 282: 15073-80 (2007) ].
CD20은 단독-다량체, 유사하게는 사량체로서 세포 표면에 존재하는 것으로 여겨지며, 전자 현미경은, 복합체화된 CD20의 90%가 지질 뗏목(lipid raft) 및 미세융모에 존재하는 것으로 밝혀졌다[참조: Li et al., J Biol Chem 279: 19893-901(2004)]. 지질 뗏목은 고 폴리펩타이드, 스핑고지질, 및 콜레스테롤 농도를 지닌 혈장 막에서 발견된 미세-도메인이다[참조: Brown and London Annu Rev Cell Dev Biol, 14: 111-36 (1998)]. 미세융모, 또는 미세융모 채널은 혈장 막 표면으로부터의 세포 연장부이다[참조: Reaven et al. , J Lipid Res 30: 1551- 60(1989)]. CD20에 대한 일부 항체는, 분자가 FMC7과 같은 지질 뗏목에 존재하는 경우에만 결합하는 것으로 알려져 있으며[참조: Polyak et al., Leukemia 17: 1384-89(2003)] 리툭시마브와 같은 다른 것은 CD20의 뗏목으로의 연합을 증가시키는 것으로 알려져 있다(참조: Li et al, 상기 참조). 뗏목 연합은 지질 뗏목내에 일반적으로 위치하는 다른 단백질인, B-세포 항원 수용체(BCR)를 통해 형질도입되는 칼슘 신호의 증폭인자로서의 CD20의 제안된 기능에 중요한 것으로 가설화되어 있으며 CD20 다량체와 관련된 것으로 밝혀졌다[참조: Polyak et al., J Biol Chem 283: 18545-52(2008)].
CD20 항원을 표적화하는 항체-계 치료요법은 다수이다[참조: Boross and Leusen, Am J Cancer Res, 2:676-90(2012), 참조용]. 치료제가 세포 표면에 남아서 기능하는 메카니즘을 기본으로 하는 치료요법용 표적으로서 CD20의 매력적인 특징들 중의 하나는 항체-계 치료요법에 의해 결합된 후 CD20 세포 내재화의 결여이다[참조: Anderson et al., Blood 63: 1424-33; Press et al., (1987) Blood 69: 584-91(1984)]. 이것은 세포형 및 항체형 특이적인 것으로 입증되어 있지만, 일반적으로, CD20은 다른 세포 표면 항원보다는 훨씬 적은 비율로 내재화되는 것으로 여겨진다[참조: Beers et al. Sem in Hematol, 47: 107-14 (2010)].
CD20은 용이하게 내재화되지 않는다는 일반적인 발견으로 인하여 효과적으로 되기 위해서는 결합 후 표적 세포 내로 내재화시키기 위한 치료제를 필요로 하는 치료요법에 대한 표적으로서의 CD20 항원의 유용성에 대해 당해 분야에서 의문이 제기되어 있다[참조: Anderson et al, Blood 63: 1424-33(1984); Press et al, Blood 69: 584-91(1987); Beers et al. Sem in Hematol, 47: 107-14(2010)]. 따라서, 효능을 위한 세포 내재화 - 치료제에 결합된 CD20을 결합 후 표적 세포의 내부로 넣는 방법을 필요로 하는 면역글로불린-형 치료제를 사용하여 CD20을 표적화하는데 있어서 해결되지 않은 문제가 존재한다. 예를 들면, CD20 항원을 표적화하는 면역독소의 전달을 기본으로 하는 치료제는 불충분한 CD20 내재화 효능을 기본으로 하여 효과적이지 않은 것으로 예측된다. 따라서, CD20과 같이 면역글로불린형 도메인에 의한 결합시 또는 효율적인 비율로 천연적으로 내재화되지 않는 세포-표면 항원을 표적화하는 효과적인 조성물, 치료제, 및 치료학적 방법을 개발하는 것이 당해 분야에서 요구되고 있다.
특히, CD20에 결합된 조성물의 복합체의 신속하고 효과적인 세포 내재화를 개시(trigger)하는 CD20-표적화된 조성물을 확인하여 개발하는 것이 당해 분야에 요구되고 있다. 예를 들면, 천연의 CD20 분자의 세포 내재화를 유도하는 독소-기원한 영역을 포함하는 세포독성 CD20-결합 단백질은 B-세포 계통의 세포를 표적화하는 효과적인 암 및 면역-조절 치료제 분자의 개발을 위해 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 1) 면역글로불린 도메인과 같은 CD20 결합 영역, 및 2)SLT-1A와 같은 시가 독소(Shiga toxin) 효과기 영역을 포함하는, CD20의 신속한 세포 내재화를 유도하기 위한 다양한 CD20-결합 단백질을 제공한다. 세포 표면에 CD20 항원의 결합시, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 CD20-결합 단백질 및 CD20 항원을 포함하는 복합체의 진핵 세포의 내부로의 신속한 세포내 내재화를 유도할 수 있다. CD20 결합 영역과 시가-독소-소단위-A-유도된 폴리펩타이드의 연결은 부정적으로 발현된 CD20의 신속한 세포 내재화를 유도할 수 있고, 또한 추가의 외인성 물질을 CD20을 발현하는 세포의 내부로 전달할 수 있는 세포독성 시가-독소계 분자의 가공을 가능하도록 한다. 본 발명의 CD20-결합 단백질은 예를 들면, CD20 양성 세포형의 표적화된 사멸, 진단제로서, 외인성 물질의 전달, 및 암, 종양, 및 B-세포 연결과 관련된 면역 질환과 같이 환자에서 다양한 상태의 치료용 치료제로서의 용도를 갖는다.
본 발명의 CD20-결합 단백질은 (a) 면역글로불린형 결합 영역을 포함하고 CD20의 세포외 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 CD20 결합 영역 및 (b) 시가 독소 계열의 적어도 하나의 구성원의 A 소단위의 아미노산 서열로부터 기원한 폴리펩타이드를 포함하는 시가 독소 효과기 영역을 포함함으로써; CD20-결합 단백질을 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포로 투여시, CD20-결합 단백질은 CD20에 결합된 CD20-결합 단백질을 포함하는 단백질 복합체의 신속한 세포 내재화를 유도할 수 있다.
본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정 구현예의 경우, CD20 결합 영역은 상보성 결정 영역 3 단편, 구속된 FR3-CDR3-FR4 폴리펩타이드, 단일-도메인 항체 단편, 일본쇄 가변 단편, 항체 가변 단편, 항원-결합 단편, Fd 단편, 피브로넥티온-기원한 10번째 피브로넥틴형 III?도메인, 테나크신형(tenacsin type) III 도메인, 안키린 반복 모티프 도메인, 저-밀도 지단백질-수용체-기원한 A-도메인, 리포칼린, 쿠니츠 도메인(Kunitz domain), 단백질-A-기원한 Z 도메인, 감마-B 결정성-기원한 도메인, 유비퀴틴-기원한 도메인, Sac7d-기원한 폴리펩타이드, Fyn-기원한 SH2 도메인, 가공된 항체 모사체, 및 CD20 결합 기능성을 보유하는 앞서의 것들 중 어느 것의 어떠한 유전적으로 조작된 대응물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함하는 면역글로불린-형 결합 영역을 포함한다.
특정의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 세포의 표면에 천연적으로 존재하는 CD20의 신속한 세포 내재화를 유도할 수 있다. 특정의 추가의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 세포의 표면에 천연적으로 존재하는 CD20의 세포 내재화를 약 1시간 미만내에 유도할 수 있다. 특정의 추가의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 B-세포 계통의 구성원의 표면에 천연적으로 존재하는 CD20의 세포 내재화를 약 1시간 미만에 유도할 수 있다.
특정의 구현예에서, CD20-결합 단백질을 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포로 투여시, CD20-결합 단백질은 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 특정의 다른 구현예에서, CD20-결합 단백질은 촉매 활성을 결여하고 세포의 사멸을 유발할 수 없는 시가 독소 효과기 영역을 포함한다.
특정의 구현예에서, 이의 구성원이 CD20을 발현하는 제1 집단, 및 이의 구성원이 CD20을 발현하지 않는 세포의 제2 집단에 CD20-결합 단백질의 투여시, 세포의 제2 집단의 구성원에 대해 세포의 제1 집단의 구성원에 대한 CD20-결합 단백질의 세포독성 효과는 적어도 3배 더 크다.
특정의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 서열 번호 1, 서열 번호 25, 또는 서열 번호 26의 75 내지 251번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 시가 독소 효과기 영역을 포함한다. 추가의 구현예는, 시가 독소 효과기 영역이 서열 번호 1, 서열 번호 25, 또는 서열 번호 26의 1 내지 241번 아미노산; 서열 번호 l, 서열 번호 25, 또는 서열 번호 26의 1 내지 251번 아미노산; 및/또는 서열 번호 1, 서열 번호 25, 또는 서열 번호 26의 1 내지 261번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 시가 독소 효과기를 포함한다.
특정의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 16의 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
특정의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 (a) 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 및 서열 번호 l1 각각에 나타낸 바와 같은 LCDRl, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; (b) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 24, 서열 번호 10, 및 서열 번호 11 각각에 나타낸 바와 같은 LCDRl, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (c) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 27 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 28, 서열 번호 10, 및 서열 번호 29 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 CD20 결합 영역을 포함한다. 추가의 구현예는 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 면역글로불린-형 결합 영역을 포함하는 CD20-결합 단백질이다. 추가의 구현예는 서열 번호 4의 아미노산 2 내지 245를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 CD20-결합 단백질 및 서열 번호 1의 75 내지 251번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 시가 독소 효과기 영역을 포함하는 CD20-결합 단백질이다. 추가의 구현예는 서열 번호 4 또는 서열 번호 16을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 CD20-결합 단백질이다.
특정의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 적어도 하나의 아미노산 잔기 결실 또는 치환으로부터 선택된 돌연변이인, 시가 독소 효과기 영역의 효소 활성을 변화시키는 시가 독소 계열의 구성원의 천연적으로 존재하는 A 소단위에 대한 돌연변이를 포함하는 시가 독소 효과기 영역을 포함한다.
CD20-결합 단백질의 특정의 구현예는 또한 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포내로 추가의 외인성 물질을 전달하기 위해 이용될 수 있다. 이들 구현예는 (a) CD20 분자의 세포외 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-형 폴리펩타이드, (b) 시가 독소 계열의 적어도 하나의 구성원의 아미노산 서열로부터 기원한 폴리펩타이드를 포함하는 시가 독소 효과기 영역, 및 (c) 추가의 외인성 물질을 포함하는 CD20 결합 영역을 포함함으로써; CD20-결합 단백질을 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포로 투여시, CD20-결합 단백질은 CD20에 결합된 CD20-결합 단백질을 포함하고 추가의 외인성 물질을 세포의 내부로 전달할 수 있는 단백질 복합체의 신속한 세포 내재화를 유도할 수 있다. 특정의 추가의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 (a) 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8 각각에서 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 및 서열 번호 l1 각각에서 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (b) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23 각각에서 나타낸 바와 같은 HCDRl, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 24, 서열 번호 10, 및 서열 번호 l1 각각에 나타낸 바와 같은 LCDRl, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (c) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 27 각각에 나타낸 바와 같은 HCDRl, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 28, 서열 번호 10, 및 서열 번호 29 각각에 나타낸 바와 같은 LCDRl, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함하는 CD20 결합 영역을 포함한다.
특정의 구현예에서, 추가의 외인성 물질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 및 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정의 구현예에서, 추가의 외인성 물질은 효소를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정의 다른 구현예에서, 추가의 외인성 물질은 예를 들면, 작은 억제 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)로서 기능하는 리보핵산과 같은 핵산이다.
특정의 구현예에서, 추가의 외인성 물질은 펩타이드이고 당해 펩타이드는 항원이다. 특정의 구현예에서, 추가의 외인성 물질은 세균 단백질로부터 기원한 항원이다. 특정의 다른 구현예에서, 항원은 암 속에서 돌연변이된 단백질로부터 기원한다. 추가의 구현예는, 항원이 암 속에서 비정상적으로 발현된 단백질로부터 기원한 것이다. 여전히 추가의 구현예는, 항원이 T-세포 상보성 결정 영역으로부터 기원한 것이다.
특정의 구현예에서, 항원은, 펩타이드 항원이 결합 영역과 일본쇄 단백질의 독소 효과기 영역 사이에 위치하는 폴리펩타이드 융합체의 일부로서 CD20-결합 단백질내에 포함된다. 특정의 구현예에서, 추가의 외인성 물질은 바이러스 단백질로부터 기원한 항원이다. 특정의 구현예에서, 항원은 서열 번호 3을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진, 인플루엔자 매트릭스(influenza Matrix) 58-66 항원이다. 특정의 추가의 구현예에서, CD20-결합 단백질은 서열 번호 16을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명의 CD20-결합 단백질 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물; 및 본원에 추후 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에서 이러한 세포독성 단백질 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정한 구현예를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 및 또한 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 세포(들)을 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 본 발명의 CD20-결합 단백질의 CD20 발현 세포(들)내로의 세포 내재화를 신속하게 유도하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 환자에게 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에서 본 발명의 CD20-결합 단백질에 의해 결합된 세포 표면 국재화된 CD20을 세포 표면에 국재화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포(들)을 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물과 접촉시킴을 포함하여, CD20을 발현하는 세포(들)을 사멸시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포(들)을 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물과 접촉시킴을 포함하여, 세포(들)의 내부로 외인성 물질을 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명은 환자에게 본 발명의 CD20-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에서 이의 표면에 CD20을 발현하는 세포(들)의 내부로 외인성 물질을 전달하는 방법을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 세포를 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 본 발명의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 특정의 구현예에서, 세포(들)을 접촉시키는 단계는 시험관내에서 일어난다. 특정의 다른 구현예에서, 세포(들)을 접촉시키는 단계는 생체내에서 일어난다.
또한, 본 발명은 질병, 질환 또는 상태의 치료가 요구되는 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에서 질병, 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 당해 방법을 사용하여 치료할 질병, 질환, 또는 상태는 예를 들면, 암 세포, 종양 세포, 또는 면역 세포와 같은 세포 표면에 CD20을 발현하는 세포(들)또는 세포 유형(들)을 포함한다. 추가의 구현예는 골암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 또는 골수종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병과 관련된 암 또는 종양 세포를 포함하는 질병을 치료하는 방법이다. 당해 방법의 특정의 구현예에서, 질환은 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병(Crohn's disease), 당뇨병, 이식 거부반응, 이식편대숙주질환, 하시모토 갑상선염, 용혈성 요독증후군, HIV-관련 병, 홍반성 루푸스, 다발 경화증, 다발성 동맥염, 건선, 건선 관절염, 류마티스성 관절염, 피부경화증, 패혈성 쇼크, 소그렌 증후군(Sjorgren's syndrome), 궤양성 대장염, 및 맥관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병과 관련된 면역 질환이다.
본 발명의 특정의 구현예 중에는 암 또는 면역 질환의 치료 또는 예방용 의약의 제조시 본 발명의 CD20-결합 단백질의 용도가 있다. 본 발명의 특정의 구현예 중에는 세포독성 단백질 또는 암, 종양, 또는 면역 질환의 치료 또는 예방시 사용하기 위한 상기 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 있다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 국면 및 장점은 다음의 설명, 첨부된 특허청구범위, 및 첨부된 도면과 관련하여 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명의 앞서의 성분은 본원의 이후 이러한 조합 또는 제거에 반하는 어떠한 기술없이, 다른 구현예를 이루기 위하여 조합되거나 자유로이 제거될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 예시적인, 비-제한 구현예, 및 첨부된 도면에 대한 참조문헌을 사용하여 이후 보다 완전히 설명한다. 그러나, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며 하기 설정한 구현예에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 이들 구현예가 제공됨으로써, 당해 기재내용은 당해 분야의 숙련가에게 본 발명의 범위를 완전하게 전달한다.
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 특정의 용어를 하기 정의한다. 추가의 정의는 본 발명의 상세한 설명내에서 찾을 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 것으로서, 용어 하나("a," "an") 및 그것("the")은, 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 단수 및 복수 참조물 둘 다를 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 것으로서, 2개의 종을 언급하는 경우 용어 "및/또는"은 A 및 B 중 적어도 하나를 의미한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 것으로서, A, B 및 C와 같은, 2개 이상의 종을 언급하는 경우 용어 "및/또는"은 A, B, 또는 C 중의 적어도 하나, 또는 A, B, 또는 C의 어느 조합중의 적어도 하나(단수 또는 다수의 가능성의 각각의 종과 함께)를 의미한다.
당해 명세서 전체에서, 용어 "포함하다(comprise)" 또는, "포함하다" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 기술된 정수(또는 성분) 또는 정수(또는 성분)의 그룹을 포함함을 내포하지만, 어떠한 다른 정수(또는 성분) 또는 정수의 그룹(또는 성분)의 배제가 아닌 것으로 이해될 것이다.
당해 명세서 전체에서, 용어 "포함하는(including)"은 "포함하나 이에 한정되지 않는"을 의미하는데 사용된다. "포함하는" 및 "포함하나 이에 한정되지 않는"은 상호교환적으로 사용된다.
용어 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산"은 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드내로 혼입된 아미노산에 대한 참조물을 포함한다. 용어 "폴리펩타이드"는 아미노산 또는 아미노산 잔기의 어떠한 중합체도 포함한다. 용어 "폴리펩타이드 서열"은 폴리펩타이드를 물리적으로 포함하는 일련의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 말한다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 거대분자이다. "펩타이드"는, 아미노산 크기가 총 15 내지 20개 미만의 잔기인 소 폴리펩타이드이다.
용어 "아미노산" "아미노산 잔기" 또는 폴리펩타이드 서열은 천연적으로 존재하는 아미노산을 포함하며, 달리 제한하지 않는 한, 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연 아미노산의 공지된 유사체를 포함한다. 본원에 언급된 아미노산은 표 A에서와 같이 단축된 정의에 의해 기술된다:
[표 A]
아미노산 명명법
Figure 112019059778651-pat00001
폴리펩타이드와 관련하여 어구 "보존적 치환"은 전체 폴리펩타이드의 기능 및 구조를 실질적으로 변경시키지 않는 폴리펩타이드의 아미노산 조성에 있어서의 변화를 말한다[참조: Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (2nd ed., 1992)].
본원에 사용된 것으로서, 용어 "발현된", "발현하는" 또는 "발현하다"는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산의 폴리펩타이드 또는 단백질로의 해독을 말한다. 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질은 세포내에 남아서, 세포 표면 막의 성분이 되거나 세포외 공간내로 분비될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 기호 "α"는 기호에 따라 생물분자에 결합할 수 있는 면역글로불린-형 결합 영역에 대한 속기이다. 기호 "α"는 기호를 따라 생물분자에 결합하는 이의 능력을 기본으로 하는 면역글로불린-형 결합 영역의 기능적 특징을 말하는데 사용된다.
CD20-결합 단백질의 세포독성 활성과 관련하여 용어 "선택적 세포독성"은 표적화된 세포 집단과 비-표적화된 방관자 세포 집단 사이의 상대적인 수준을 말하며, 이는 표적화된 세포형의 세포 사멸의 바람직성을 나타내기 위한 표적화되지 않은 세포형에 대한 최대 세포독성 농도의 1/2(CD50)을 능가하는 표적화된 세포형에 대한 CD50의 비로서 나타낼 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "효과기"는 인자 및/또는 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 보충하는 세포독성, 생물학적 시그날링, 효소적 촉매분해, 소세포 경로설정, 및/또는 세포내 결합과 같은 생물학적 활성을 제공함을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해서, 어구 "로부터 기원한"은, 폴리펩타이드 영역이 단백질에서 원래 발견된 아미노산 서열을 포함하며, 원래의 서열로부터 첨가, 결실, 트렁케이션(truncation), 또는 다른 변경을 이제 포함함으로써 전체적인 기능 및 구조가 실질적으로 보존됨을 의미한다.
도입
본 발명은, 시가-독소-소단위-A 기원한 효과기 영역이 CD20의 세포 내재화를 유도하므로 기능을 위한 세포 내재화를 필요로 하는 CD20을 표적화하는 치료제를 가공하기 위한 문제를 해결한다. 본 발명은 세포외 CD20 항원에 결합하여 세포 막 위치로부터 세포의 내부로 CD20을 신속하게 내재화시키는 CD20-결합 단백질을 제공한다. 특정의 기재된 CD20-결합 단백질은 이들의 표면에서 CD20을 발현하는 세포를 사멸한다. 특정의 기재된 CD20-결합 단백질은 이들의 표면에서 CD20을 발현하는 세포의 내부로 분자 카르고(molecular cargo)의 형태로 추가의 외인성 물질을 정밀하게 전달할 수 있다. 본 발명은 공통의 면역독소-약물화가능한 표적을 확장시켜 CD20을 포함하고 CD20을 발현하는 세포의 내부로 패이로드(payload)의 정밀한 전달을 가능하도록 한다.
I. CD20-결합 단백질의 일반적인 구조
본 발명은 특이적인 세포 유형의 선택적인 사멸을 위한 다양한 CD20-결합 단백질을 제공하며, 당해 본 발명의 CD20-결합 단백질은 1) 세포 표적화를 위한 면역글로불린형 결합 영역을 포함하는 CD20 결합 영역 및 2) 세포 사멸을 위한 시가 독소 효과기 영역을 포함한다. CD20을 표적화하는 면역글로불린형 결합 영역과 시가-독소-소단위-A-기원한 영역의 연결은 강력한 시가 독소 세포독성의 세포형 특이적인 표적화의 가공을 가능하도록 한다. 이러한 시스템은, 다양한 시가 독소 효과기 영역 및 추가의 외인성 물질이 동일한 CD20 결합 영역에 연결되어 CD20을 발현하는 세포를 포함하는 다양한 적용을 제공한다는 점에서 모듈형(modular)이다. 본 발명의 CD20-결합 단백질은 진핵 세포의 외부 세포 막에 걸쳐있는(spanning) CD20 분자의 적어도 하나의 세포외 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린형 CD20 결합 영역에 연결된 시가 독소 계열의 구성원의 A 소단위로부터 기원한 시가 독소 효과기 영역을 포함한다. 이러한 일반적인 구조는 다양한 위치에서 시가-독소-소단위-A 기원한 효과기 영역에 연결될 수 있거나 이들 사이의 상이한 링커와 함께 동일한 일반적인 구조의 변형을 생산한다(참조: 예를 들면, 도 1).
A. 면역글로불린-형 결합 영역을 포함하는 CD20 결합 영역
본 발명의 목적을 위해, 용어 "CD20 결합 영역"은 CD20 분자의 세포외 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 영역을 말한다. 명칭 CD20이 다양한 종으로부터의 관련된 구조 및 폴리펩타이드 서열을 지닌 다수의 단백질을 말할 수 있지만, 본 발명의 목적을 위해, 용어 "CD20"은, 이의 정확한 서열이 동형을 기본으로 및 개인대 개인으로 약하게 변할 수 있는 포유동물에 존재하는 B-림프구 항원 CD20 단백질을 말한다. 예를 들면, 사람에서 CD20은 우세한 폴리펩타이드 서열UnitProt PI 1836 및 NCBI 수탁번호 NP 690605.1로 나타낸 단백질을 말하지만; 상이한 동형 및 변이체가 존재할 수 있다. 다양한 CD20 단백질의 폴리펩타이드 서열은 박쥐, 고양이, 소, 개, 마우스, 마모셋, 및 랫트와 같은 다양한 종에서 기술되어 왔으며, 유전적 상동성(예를 들면, CD20은 개코원숭이, 마카크(macaque), 긴팔원숭이, 침팬지, 및 고릴라)를 포함하는 다양한 영장류에서 예측되어 왔다)[참조: Zuccolo J et al., PLoS One 5: e9369 (2010)] 및 NCBI 단백질 데이타베이스(National Center for Biotechnology Information, U.S.)을 기본으로 하는 다수의 다른 종에서 생물정보학에 의해 예측될 수 있다. 숙련된 기술자는, CD20이 참조된 서열과 약간 상이하다고 해도, 포유동물에서 CD20 단백질을 확인할 수 있을 것이다.
CD20 분자의 세포외 부위는, CD20 분자가 세포막에 천연적으로 존재하는 경우 세포외 환경에 대해 노출된 이의 구조 중의 일부를 말한다. 당해 내용에서, 세포외 환경에 대한 노출은, CD20 분자의 부위가 예를 들면, 낙타류 또는 연골 어류로부터 기원한 항체 또는 단일-도메인 항체 도메인, 나노바디(nanobody), 중쇄 항체 도메인과 같은 항체보다 더 작은 적어도 하나의 결합 잔기, 일본쇄 가변 단편, 또는 면역글로불린에 대한 어떠한 수의 가공된 대체 스캐폴드(scaffold)(하기 참조)에 의해 접근가능함을 의미한다. CD20의 일부의 노출은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 숙련가에 의해 경험적으로 측정될 수 있다. CD20내에서 이의 위치를 기본으로 세포외 공간내에서 항체에 접근가능하지 않은 것으로 예측되었던, CD20의 일부 부위는 모노클로날 항체에 의해 접근가능함이 경험적으로 밝혀졌다[참조: Teeling J et al., J. Immunol. Ill: 362-71 (2006)].
CD20 결합 영역은 일반적으로 항체 또는 항체-유사 구조로부터 기원하나; 다른 공급원으로부터의 대체 스캐폴드는 당해 용어내에서 고려된다. 특정의 구현예에서, CD20 결합 영역은 항원 파라토프(paratope)와 같은, 면역글로불린-기원한 결합 영역으로부터 기원한다. 특정의 다른 구현예에서, CD20 결합 영역은 어떠한 면역글로불린 도메인으로부터 기원하지 않는 가공된 폴리펩타이드인 면역글로불린-형 결합 영역을 포함한다. 본 발명에서 성분으로서 고려된 다수의 면역글로불린-기원한 결합 영역이 존재한다.
본 발명의 CD20-결합 단백질은 CD20의 세포외 부위에 선택적으로 및 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 면역글로불린-형 결합 영역을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "면역글로불린형 결합 영역"은 항원 또는 에피토프와 같이, 하나 이상의 표적 생물분자에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 영역을 말한다. 면역글로불린-형 결합 영역은 결합하여 분자를 표적화하는 이들의 능력에 의해 기능적으로 정의되며 본 발명의 모든 면역글로불린형 결합 영역은 CD20을 결합시킬 수 있다. 면역글로불린-형 결합 영역은 일반적으로 항체 또는 항체-유사 구조로부터 기원하지만; 다른 공급원으로부터의 대체 스캐폴드도 본 용어의 영역내에서 고려된다.
면역글로불린(Ig) 단백질은 Ig 도메인(domain)으로 공지된 구조적 도메인을 갖는다. Ig 도메인은, 길이가 약 70 내지 110개의 아미노산 잔기 범위이며 특징적인 Ig-배(fold)를 지니고, 여기서 전형적으로 7 내지 9개의 역평행 베타 쇄(antiparallel beta strand)는 샌드위치형 구조를 형성하는 2개의 베타 쉬이트(beta sheet)로 배열된다. Ig 배는 샌드위치의 내부 표면상의 소수성 아미노산 상호작용 및 쇄내 시스테인 잔기 사이의 고도로 보존된 이황화물 결합에 의해 안정화된다. Ig 도메인은 가변성(IgV 또는 V-세트), 고정적(IgC 또는 C-세트) 또는 중간(Igl 또는 I-세트)일 수 있다. 일부 Ig 도메인은 항원 결합 영역(ABR)으로서 또한 언급된 상보성 결정 영역(CDR)과 연관될 수 있는데, 즉, 이들의 에피토프에 대한 항체 결합의 특이성에 중요하다. Ig-유사 도메인은 또한 비-면역글로불린 단백질에서 발견되며 단백질의 Ig 상과(superfamily)의 구성원으로서의 기준으로 분류된다. HUGO 유전자 명명법 위원회(Gene Nomenclature Committee: HGNC)는 Ig-유사 도메인을 함유하는 계열 구성원의 목록을 제공한다.
면역글로불린-형 결합 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 폴리펩타이드 서열일 수 있으며, 여기서 아미노산 서열은 천연의 항체 또는 예를 들면, 분자 가공 또는 라이브러리 스크리닝에 의해 선택된 비-면역글로불린 단백질의 Ig-유사 도메인의 것으로부터 변하였다. 면역글로불린-형 결합 영역의 생성시 재조합체 DNA 기술 및 시험관내 라이브러리 스크리닝의 관련성으로 인하여, 항체는 보다 작은 크기, 세포 도입, 또는 다른 치료학적 개선과 같은 바람직한 특성을 수득하도록 재설계될 수 있다. 가능한 변화는 많으며 예를 들면, 단지 하나의 아미노산의 변화 내지 예를 들면 가변 영역의 완전한 재설계의 범위일 수 있다. 전형적으로, 가변 영역내 변화는 항원-결합 특성을 개선시키거나, 가변 영역 안전성을 개선시키거나, 면역원성 반응에 대한 잠재능을 감소시키기 위해 이루어질 것이다.
본 발명에서 고려된 CD20의 세포외 부위에 결합하는 다수의 면역글로불린-형 결합 영역이 존재한다. 특정의 구현예에서, 면역글로불린-형 결합 영역은 CD20의 세포외 부위에 결합할 수 있는 항체 파라토프와 같은, 면역글로불린 결합 영역으로부터 기원한다. 특정의 다른 구현예에서, 면역글로불린-형 결합 영역은 어떠한 면역글로불린 도메인으로부터도 기원하지 않으나 CD20의 세포외 부위에 대해 고-친화성 결합을 제공함으로써 면역글로불린 결합 영역과 유사하게 기능하는 가공된 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 가공된 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 면역글로불린으로부터의 상보성 결정 영역을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 폴리펩타이드 스캐폴드를 임의로 포함할 수 있다.
CD20을 발현하는 세포에 대해 본 발명의 CD20에 결합하는 단백질을 표적화하는데 유용한 다수의 면역글로불린-기원한 결합 영역 및 비-면역글로불린 가공된 폴리펩타이드가 선행 기술에 존재한다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질의 면역글로불린-형 결합 영역은 단일-도메인 항체 도메인(sdAb), 나노바디, 낙타류로부터 기원한 중쇄 항체 도메인(VHH 단편), 2가 나노바디, 연골 어류로부터 기원한 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), VNAR 단편, 일본쇄 가변(scFv) 단편, 다량체화 scFv 단편(디아보디, 트리아보디, 테트라보디), 이특이적인 탄뎀(tandem) scFv 단편, 이황화물 안정화된 항체 가변(Fv) 단편, VL, VH, CL 및 CH 1 도메인으로 이루어진 이황화물 안정화된 항원-결합(Fab) 단편, 2가 F(ab')2 단편, 중쇄 및 CHI 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 일본쇄 FV-CH3 미니보디, 이특이적 미니보디, 이량체성 CH2 도메인 단편(CH2D), Fc 항원 결합 도메인(Fcab), 분리된 상보성 결정 영역 3(CDR3) 단편, 구속된 골격 영역 3, CDR3, 골격 영역 4(FR3-CDR3-FR4) 폴리펩타이드, 소 모듈식 면역약제(SMIP) 도메인, 및 이의 파라토프 및 결합 기능을 보유하는 앞서의 어떠한 유전적으로 조작된 대응물을 포함하는 그룹으로부터 선택된다[참조: Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al, Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012), 참조용].
특정의 다른 구현예에 따라서, 본 발명의 CD20-결합 단백질의 면역글로불린-형 결합 영역은 CD20에 대한 고 친화성 및 특이적인 결합과 같은 유사한 기능적 특성을 나타내고 보다 큰 안전성 또는 감소된 면역원성과 같은 개선된 특성의 가공을 가능하도록 하는 면역글로불린 도메인에 대한 가공된, 대안의 스캐폴드를 포함할 수 있다. 본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정의 구현예의 경우, 면역글로불린-형 결합 영역은 가공된, 피브로넥틴-기원한, 10th 피브로넥틴 형 111(10Fn3) 도메인(모노보디, AdNectinsTM 또는 AdNexinsTM); 가공된, 테나크신-기원한, 테나크신형 III 도메인(CentrynsTM); 가공된, 안키린 반복물 모티프 함유 폴리펩타이드(DARPinsTM); 가공된, 저-밀도 지단백질-수용체 기원한, A 도메인(LDLR-A)(AvimersTM); 리포칼린(안티칼린); 가공된, 프로테아제 억제제-기원한, 쿠니츠 도메인(Kunitz domain); 가공된, 단백질-A-기원한, Z 도메인(AffibodiesTM); 가공된, 감마-B 결정성 기원한 스캐폴드 또는 가공된, 우비퀴틴-기원한 스캐폴드(아필린스); Sac7d-기원한 폴리펩타이드(Nanoffitins®또는 아피틴); 가공된, Fyn-기원한, SH2 도메인(Fynomers®); 및 가공된 항체 모사체(mimic) 및 이의 결합 기능성을 보유하는 앞서의 어떠한 유전적으로 조작된 대응물을 포함하는 그룹으로부터 선택된다[참조: Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989- 1010 (2001); Xu L et al, Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007)].
본원에 사용된 것으로서 용어 "결합 영역"내에 포함된 단백질 작제물의 비제한적 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH 1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역(hinge region)에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; 및 (vi) 분리된 CDR을 포함한다.
또한 Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 합성 링커에 의해 재조합적으로 결합하여, VL 및 VH 도메인이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일의 단백질 쇄를 생성할 수 있다[일본쇄 Fv(scFv)로 공지됨]. 가장 일반적으로 사용된 링커는 15-잔기(Gly4Ser)3 펩타이드이지만, 다른 링커 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 일본쇄 항체는 또한 본원에 사용된 것으로서 용어 "결합 영역"내에 포함되는 것으로 의도된다.
결합 기능을 제공하는 대안의 스캐폴드는 본원에 사용된 것으로서 용어 "결합 영역"의 영역내에 있는 것으로 또한 예상된다. 대한의 스캐폴드의 일부 예는 디아보디, CDR3 펩타이드, 구속된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드, 나노바디(미국 특허원 공보 제2008/0107601호), 2가 나노바디, 작은 모듈식 면역약제(SMIP), 상어 가변성 IgNAR 도메인(WO 03/014161), 미니보디 및, 표적 분자 결합 기능을 보유한 어떠한 단편 또는 화학적으로 또는 유전적으로 조작된 대응물을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 "항체-기원한 서열"은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 의미하며, 여기서 아미노산 서열은 천연의 항체의 것으로부터 변한다. 항체의 생성시 재조합 DNA 기술의 관련성으로 인하여, 항체는 바람직한 특성을 수득하도록 재설계될 수 있다. 가능한 변화는 많으며 예를 들면, 가변 영역의 단지 1개 또는 약간의 아미노산의 변화 내지 완전한 재설계의 범위이다. 전형적으로, 가변 영역내 변화는 항원-결합 특성을 개선시키거나, 가변 영역 안전성을 개선시키거나, 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 이루어질 것이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "중쇄 가변 (VH) 도메인" 또는 "경쇄 가변 (VL) 도메인" 각각은 어떠한 천연 항체 VH 또는 VL 도메인(예를 들면, 사람 VH 또는 VL 도메인) 및 또한 상응하는 천연 항체의 적어도 정량적인 항원 결합능을 보유하는 이의 어떠한 유도체(예를 들면, 천연의 쥐 VH 또는 VL 도메인으로부터 기원한 사람화된 VH 또는 VL 도메인)를 말한다. VH 또는 VL 도메인은 3개의 CDR에 의해 차단된 "골격" 영역으로 이루어진다. 골격 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적인 결합을 위해 CDR을 정렬하기 위해 제공된다. 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지, VH 및 VL 도메인 둘 다는 다음의 골격(FR) 및 CDR 영역: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 카밧(Kabat), Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991), 또는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk), J. Mol. Biol. 196: 901-17 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-83, (1989)에 따른다. VH 도메인의 CDR 1, 2, 및 3은 또한 본원에서 각각 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3으로 언급되며 VL 도메인의 CDR 1, 2, 및 3 또한 본원에서 각각 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로서 언급된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 결합 영역은 상보성 결정 영역의 구체적인 세트, 또는 CDR을 포함하는 항체-기원한 서열 또는 항체를 포함한다. CDR은 이의 항원성 결정인자에 대한 항체의 특이적인 결합에 필요한 항체의 가변 도메인내 정의된 서열 영역이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, CDR 집합은 항체의 중쇄로부터 기원한 3개의 CDR 및 항체의 경쇄로부터 기원한 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 3개의 중쇄 CDR은 (a) 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8 각각에 나타낸 바와 같은 HCDRl, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 및 서열 번호 ll 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; (b) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23 각각에 나타낸 바와 같은 HCDRl, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 24, 서열 번호 10, 및 서열 번호 l1 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (c) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 27 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR 1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 28, 서열 번호 10, 및 서열 번호 29 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함한다. 또한, 본 발명의 특정의 구현예에서, 결합 영역은 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
당해 시스템은, 다양한, 다른 면역글로불린-형 결합 영역이 동일한 시가 독소 효과기 영역과 함께 사용되어 CD20의 상이한 세포외 에피토프를 표적화한다는 점에서 모듈식이다. CD20의 세포외 부위에 결합할 수 있는 면역글로불린 형의 어떠한 CD20 결합 영역도 시가 독소 효과기 영역에 연결되어 본 발명의 CD20-결합 단백질을 생산할 수 있음은 숙련가에 의해 명백할 것이다.
B. 시가 독소 계열의 구성원의 A 소단위로부터 기원한 시가 독소 효과기 영역
본 발명의 목적을 위해, 어구 "시가 독소 효과기 영역"은 리보소옴을 불활성화시키고 세포독성 및/또는 세포정지 효과를 작동시킬 수 있는 시가 독소 계열의 구성원의 시가 독소 A 소단위로부터 기원한 폴리펩타이드 영역을 말한다. 시가 독소 계열의 구성원은 구조적으로 및 기능적으로 관련된, 명백하게는 에스. 다이센테리아에(S. dysenteriae) 및 이. 콜라이(E. coli)로부터 분리된 독소인 천연적으로 발생하는 단백질 독소의 계열의 어떠한 구성원을 말한다[참조: Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105- 16 (2010)]. 예를 들면, 시가 독소 계열은 에스. 다이센테리아에 혈청형 1로부터 분리된 실제 시가 독소(Stx), 장출혈성 이. 콜라이의 혈청형으로부터 분리된 시가-형 독소 1 변이체(SLTl 또는 Stxl 또는 SLT-1 또는 Slt-I), 및 장출혈성 이. 콜라이의 혈청형으로부터 분리된 시가-형 독소 2 변이체(SLT2 또는 Stx2 또는 SLT-2)를 포함한다. SLTl은 Stx로부터의 단지 하나의 잔기에 의해 상이하며, 둘 다 베로세포 독소 또는 베로 독소(VT)로 언급되어 왔다[참조: O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)]. SLTl 및 SLT2 변이체는 아미노산 서열 수준에서 서로 단지 약 53 내지 60% 유사하지만, 이들은 시가 독소 계열의 구성원에 대해 일반적인 효소 활성 및 세포독성의 메카니즘을 공유한다[참조: Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)]. 정의된 혈청형 Stxla, Stxlc, Stxld, 및 Stx2a-g와 같은 39개 이상의 상이한 시가 독소가 기술되었다[참조: Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)]. 시가 독소 계열의 구성원은, 시가-독소를 암호화하는 유전자가 수평 유전자 전달(horizontal gene transfer)을 통해 세균 종 중에서 확산될 수 있으므로 어떠한 세균 종으로 천연적으로 한정되지 않는다[참조: Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol. 21 : R242-6 (2011)]. 종간 전달의 예로서, 시가 독소는 환자로부터 분리된 에이. 해몰리티쿠스(A. haemolyticus)의 균주에서 발견되었다[참조: Grotiuz G et al., J Clin Microbiol AA: 3838-41 (2006)]. 시가 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 새로운 아종 또는 종에 도입되면, 시가 독소 아미노산 서열은 시가 독소 계열의 구성원에 대해 일반적인 세포독성 메카니즘을 여전히 유지하면서 유전적 이동(genetic drift) 및/또는 선택적인 압력으로 인하여 약간의 서열 변이를 진행할 수 있는 것으로 추측된다[참조: Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)].
본 발명의 시가 독소 효과기 영역은 이의 천연의 시가 독소 B 소단위의 어떠한 형태로부터 해리된 시가 독소 A 소단위로부터 기원한 폴리펩타이드를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다. 또한, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 시가 독소 B 소단위의 기능성 결합 도메인을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 어떠한 폴리펩타이드도 포함하지 않는다. 오히려, 시가 독소 A 소단위 기원한 영역은 이종의 CD20 결합 영역과 기능적으로 연관되어 CD20을 발현하는 세포에 대한 세포 표적화를 작동시킨다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 시가 독소 효과기 영역은 완전한 길이의 시가 독소 A 소단위[예를 들면, SLT-1A(서열 번호 l), StxA(서열 번호 25), 또는 SLT-2A(서열 번호 26)]를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어질 수 있으며, 천연적으로 발생하는 시가 독소 A 소단위는, 제거되어 성숙한 시가 독소 A 소단위를 생산하는 이의 아미노-말단에서 약 22개 아미노산의 시그날 서열을 함유하는 전구체 형태를 포함할 수 있다. "독소 효과기 영역"의 하나의 구체적인 예는 시가-형 독소 1(SLT-1)(서열 번호 l)의 A 쇄로부터 기원한 것이다. SLT-1의 A 쇄는 1 내지 239번의 효소(독성) 도메인 스패닝 잔기를 지닌 293개의 아미노산으로 구성된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 시가 독소 효과기 영역은 완전한 길이의 시가 독소 A 소단위보다 짧은 트렁케이트된 시가 독소 A 소단위를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
시가-형 독소 1 A 소단위 트렁케이션은 시험관내에서 리보소옴을 효소적으로 불활성화시킬 수 있는, 촉매적으로 활성이며, 세포내에서 발현되는 경우 세포독성이다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 완전한 효소 활성을 나타내는 가장 작은 시가 독소 A 소단위 단편은 SltlA의 1 내지 239번 잔기로 구성된 폴리펩타이드이다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 실제 촉매 활성을 보유하는 것으로 보고된 시가 독소 A 소단위의 가장 작은 단편이 StxA의 75 내지 247번 잔기이었지만[참조: Al-Jaufy, Infect Imtnun 62: 956-60 (1994)), 진핵 세포내에서 새로이 발현된 StxA 트렁케이션은 세포질에 도달하기 위해 단지 240번 이하의 잔기를 필요로 하며 리보소옴의 촉매적 불활성화를 발휘한다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)].
시가 독소 효과기 영역은 완전한 길이의 A 소단위보다 일반적으로 더 작을 수 있다. 시가 독소 효과기 영역은 77 내지 239번 아미노산 위치로부터의 폴리펩타이드 영역(SLT-1A 서열 번호 l, StxA 서열 번호 25, 또는 SLT-2A 서열 번호 26) 또는 시가 독소 계열의 구성원의 다른 A 소단위내 등가물을 유지하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 특정의 구현예에서, SLT-1A로부터 기원한 시가 독소 효과기 영역은 서열 번호 l의 75 내지 251번 아미노산, 서열 번호 1의 1 내지 241번 아미노산, 서열 번호 1의 1 내지 251번 아미노산, 또는 서열 번호 1의 1 내지 261번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다. 유사하게, Stx로부터 기원한 시가 독소 효과기 영역은 서열 번호 25의 75 내지 251번 아미노산, 서열 번호 25의 1 내지 241번, 서열 번호 25의 1 내지 251번, 또는 서열 번호 25의 1 내지 261번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어질 수 있다. 추가로, SLT-2로부터 기원한 시가 독소 효과기 영역은 서열 번호 26의 75 내지 251번 아미노산, 서열 번호 26의 1 내지 241번, 서열 번호 26의 1 내지 251번, 또는 서열 번호 26의 1 내지 261번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CD20-결합 단백질의 변이체를 추가로 제공하며, 여기서 시가 독소 효과기 영역은 천연적으로 존재하는 시가 독소 A 소단위와는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 아미노산 잔기까지(그러나 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 아미노산 서열 유사성을 유지하는 것 이상은 아니다) 상이하다. 따라서, 시가 독소 계열의 구성원의 A 소단위로부터 기원한 폴리펩타이드 영역은, 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 아미노산 서열 유사성이 천연적으로 발생하는 시가 독소 A 소단위에 대해 유지되는 한 원래의 서열로부터의 첨가, 결실, 트렁케이션, 또는 다른 변경을 포함할 수 있다.
따라서, 특정의 구현예에서, 시가 독소 효과기 영역은 SLT-1A(서열 번호 l), Stx(서열 번호 25), 및/또는 SLT-2 A(서열 번호 26)와 같은 천연적으로 존재하는 시가 독소 A 소단위에 대해 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.7%의 전체적인 서열 동질성(overall sequence identity)을 지닌 아미노산 서열을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
임의로, 시가 독소 A 소단위의 완전한 길이 또는 트렁케이트된 버젼은 하나 이상의 돌연변이(예를 들면, 치환, 결실, 삽입 또는 역위)를 포함할 수 있다. 강력하게 세포독성인 특정의 구현예에서, 시가 독소 효과기 영역은, 숙주 세포 형질전환, 형질감염, 감염 또는 유도의 공지된 방법에 의해서, 또는 시가 독소 효과기 영역과 결합된 면역글로불린-형 결합 영역을 세포형 표적화함으로써 중재된 내부화에 의해, 세포 내로 도입된 후에 세포독성을 보유하기에 충분한 서열 동질성을 갖는다. 시가 독소 A 소단위에서의 효소 활성 및/또는 세포독성을 위한 가장 중요한 잔기는 다음의 잔기-위치에 맵핑되었다: 특히, 아스파라긴-75, 타이로신-77, 글루타메이트-167, 아르기닌-170, 및 아르기닌-176 (Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)). 본 발명의 구현예들 중의 어느 하나에서, 시가 독소 효과기 영역은 StxA, SLT-1A에서 위치 77, 167, 170 및 203에서 발견된 것들과 같은 위치에서, 또는 세포독성 활성을 위해 전형적으로 필요한 시가 독소 계열의 다른 구성원 내의 동등한 보존된 위치에서 하나 이상의 보존된 아미노산을 바람직하지만 필수적이지는 않게 유지시킬 수 있다. 세포 사멸, 예를 들면 이의 세포독성을 유발하기 위한 본 발명의 CD20-결합 단백질의 능력은 당해 분야에 잘 공지된 다수의 검정 중의 어느 하나를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 특정의 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 시가 독성 효과기 영역의 세포독성 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 돌연변이시키거나 삭제할 수 있다. 시가 독소 계열의 구성원의 A 소단위의 세포독성은 돌연변이 또는 트렁케이션에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 위치-표지된 타이로신-77, 글루타메이트-167, 아르기닌-170, 타이로신-114, 및 트립토판-203은 Stx, Stxl, 및 Stx2의 촉매 활성을 위해 중요한 것으로 밝혀졌다[참조: Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al, Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al, Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al, Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)]. 글루타메이트-167 및 아르기닌-170 둘 다의 돌연변이는 세포-유리 리보솜 불활성화 검정에서 Slt-I Al의 효소 활성을 제거시켰다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 소포체에서 Slt-I A의 새로운 발현을 사용하는 다른 시도에서, 글루타메이트-167 및 아르기닌-170 둘 다의 돌연변이는 이러한 발현 수준에서 Slt-I A1 단편 세포독성을 제거하였다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 트렁케이션 분석은, 75 내지 268번 잔기로부터의 StxA의 단편은 시험관내에서 유의적인 효소 활성을 여전히 보유함을 입증하였다[참조: Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)]. 1 내지 239번 잔기를 함유하는 Slt-I A1의 트렁케이트된 단편은 세포질에서 새로운 발현에 의해 시험관내에서 유의적인 효소 활성 및 세포독성을 나타내었다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 소포체에서 1 내지 239번 잔기에 대해 트렁케이트된 Slt-I A1 단편의 발현은, 이것이 세포질내로 역전위(retrotranslocate)될 수 없으므로 세포독성이 아니었다[참조: LaPointe, J. Biol Chem 280: 23310-18 (2005)].
본 발명의 목적을 위하여, 구체적인 순서 또는 배향은 서로 관련하여 또는 전체 CD20-결합 단백질의 N-말단(들) 및 C-말단(들)과 관련하여 시가 독소 효과기 영역 및 CD20 결합 영역에 대해 고정되지 않는다(참조: 예를 들면, 도1). 상기 CD20-결합 단백질에서, CD20 결합 영역 및 시가 독소 효과기 영역은 서로 직접 연결될 수 있고/있거나 당해 분야에 잘 공지된 하나 이상의 링커를 사용하는 것과 같은 하나 이상의 개입된 폴리펩타이드 서열을 통해 적합하게 연결될 수 있다.
II. CD20-결합 단백질의 특이적인 구조적 변이의 예
본 발명의 특정의 구현예 중에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 SLT-1A(서열 번호 1), StxA(서열 번호 25), 또는 SLT-2A(서열 번호 26)의 75 내지 251번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 시가 독소 효과기 영역을 포함한다. 추가의 구현예는, 시가 독소 효과기 영역이 SLT-1A(서열 번호 l), StxA(서열 번호 25), 및/또는 SLT-2A(서열 번호 26)의 1 내지 241번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 CD20-결합 단백질이다. 추가의 구현예는, 시가 독소 효과기 영역이 SLT-1A SLT-1A(서열 번호 1), StxA(서열 번호 25), 및/또는 SLT-2A(서열 번호 26)의 1 내지 251번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 CD20-결합 단백질이다. 추가의 구현예는, 시가 독소 효과기 영역이 SLT-1A(서열 번호 1), StxA(서열 번호 25), 및/또는 SLT-2A(서열 번호 26)의 1 내지 261번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 CD20-결합 단백질이다.
특정의 구현예의 경우, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 것이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "중쇄 가변(VH) 도메인" 또는 "경쇄 가변(VL) 도메인" 각각은 어떠한 항체 VH 또는 VL 도메인(예를 들면, 사람 VH 또는 VL 도메인) 및 또한 상응하는 천연 항체(예를 들면, 천연의 쥐 VH 또는 VL 도메인으로부터 기원한 사람화된 VH 또는 VL 도메인)의 적어도 정성적인 항원 결합 능력을 보유하는 이의 어떠한 유도체를 말한다. VH 또는 VL 도메인은 3개의 CDR에 의해 차단된 "골격" 영역으로 이루어진다. 골격 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적인 결합을 위해 CDR을 정렬하도록 제공된다. 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지, VH 및 VL 도메인 둘 다는 다음의 골격(FR) 및 CDR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 문헌[참조: Kunik V et al., PLoS Comput Biol 8: el002388 (2012) 및 Kunik V et al., Nucleic Acids Res. 40: W521-4 (2012)]에 따르거나 달리는 면역학적 목적의 단백질의 서열, 카밧(Kabat) 정의에 따른다[참조: 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901- 17 (1987); 또는 Chothia et al, Nature 342: 878-83 (1989)].
본 발명의 특정의 구현예에서, CDR은 항체의 중쇄로부터 기원한 3개의 CDR 및 항체의 경쇄로부터 기원한 3개의 CDR을 포함한다. 특정의 구현예에서, 3개의 중쇄 CDR은 서열 번호 7(HCDR1), 서열 번호 8(HCDR2), 및 서열 번호 9(HCR3)를 포함하는 반면, 3개의 경쇄 CDR은 서열 번호 9(LCDR1), 서열 번호 10(LCDR2) 및 서열 번호 11(LCDR3)을 포함한다. 또한, 본 발명의 특정의 구현예에서, 면역글로불린-형 결합 영역은 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
CD20의 어떠한 세포외 부위에 대한 기능성 CD20 결합 부위를 함유하고, 심지어 보다 바람직하게는 CD20에 고 친화성(예를 들면, KD로 나타낸 바와 같음)으로 결합할 수 있는 본 발명의 CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 및/또는 유도체를 사용하는 것은 본 발명의 영역내에 있다. 예를 들면, 본 발명은, CD20에 결합할 수 있는 면역글로불린-기원한 폴리펩타이드 서열을 제공한다. 어떠한 폴리펩타이드도 CD20의 세포외 부위에 10-5 내지 10-12몰/리터의 해리 상수(KD), 바람직하게는 200nM 미만으로 결합하는 당해 영역을 치환할 수 있다.
따라서, 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열이 기술되는 CDR1 서열, CDR2 서열, 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 한, 기재된 예시적인 CD20-결합 단백질의 면역글로불린-형 결합 부위를 변경시키는 것은 본 발명의 영역내에 있다. 특히, 그러나 제한하지 않고, 본 발명의 폴리펩타이드 서열은 4개의 골격 영역(FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3); 또는 하나 이상의 CDR의 존재를 기본으로한 표적 생물분자 결합 기능성을 나타내는 이러한 아미노산 서열의 어떠한 적합한 단편으로 필수적으로 이루어질 수 있다. 특정의 구현예에서, 면역글로불린-형 결합 영역은 (i) 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8에 나타낸 바와 같은 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 9, 서열 번호 10, 및 서열 번호 11에 나타낸 바와 같은 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역글로불린-형 결합 영역은 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
본 발명의 특정의 구현예 중에서, 면역글로불린-형 결합 영역은 CD20에 대해 특이적으로 높은 친화성 결합을 나타내는 나노바디 또는 일본쇄 도메인 면역글로불린-기원한 영역 VHH로부터 기원한다. 일반적으로, 나노바디는 낙타류 및 연골 어류(연골어강)에서 발견된 종류의 천연적으로 존재하는 단일의, 단량체성 가변 도메인 항체(sdAb)의 단편으로부터 제작된다. 나노바디는 단일의, 단량체성 가변 도메인을 트렁케이트함으로서 이들 천연적으로 존재하는 항체로부터 가공되어 보다 작고 보다 안정한 분자를 생성한다. 이들의 작은 크기로 인하여, 나노바디는 전체 항체에 접근할 수 없는 항원에 결합할 수 있다.
III. CD20-결합 단백질의 일반적인 기능
본 발명은 1) 세포 표적화를 위한 면역글로불린형 CD20 결합 영역 및 2) 세포 내재화를 유도하고, 임의로, 세포 사멸을 또한 유도하기 위한 세포독성 시가 독소 효과기 영역을 포함하는, 특이적인 세포 유형의 선택적인 사멸을 위한 본 발명의 다양한 CD20-결합 단백질을 제공한다. CD20 표적화 면역글로불린형 결합 영역과 시가-독소-소단위-A-기원한 영역의 연결은, CD20을 발현하는 세포에 대해 특이적으로 강력한 시가 독소 세포독성의 표적화가 가능하도록 한다. 이들의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 세포 표면 상에 천연적으로 존재하는 CD20에 결합하여 세포내로 도입될 수 있다. 표적화된 세포형내에서 내재화되면, 본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정의 구현예는 표적 세포의 세포질내로 세포독성 시가 독소 효과기 폴리펩타이드 단편을 정규화할 수 있다. 표적화된 세포형의 세포질내에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정의 구현예는 리보좀을 효소적으로 불활성화시키고 궁극적으로 세포를 사멸시킬 수 있다. 달리는, 비-독성 변이체를 사용하여 추가의 외인성 물질을 전달하고/하거나 진단 목적으로 위해 CD20을 발현하는 세포의 내부를 표지할 수 있다.
CD20을 발현하는 다양한 유형의 세포를 외인성 물질을 사멸시키거나 수용하기 위해 본 발명의 CD20-결합 단백질에 의해 표적화할 수 있다. 본 발명의 CD20-결합 단백질을 내재화하는 것으로 기대된 CD20을 발현하는 세포형 중에는 B-세포 계통내의 것들이 있다. "B-세포 계통"은 세포학적으로 또는 달리는 예를 들면, 세포 표면 마커를 통해서 B-세포 자체로서 확인된 세포들이다. 용어 "B-세포 계통"은 B-세포 계통 또는 B-세포 계통에 대한 전구체로부터 기원한 신생물 세포를 포함한다. 표적화될 수 있는 CD20을 발현하는 세포형 중에는 CD20을 정상적으로 발현하지 않는 세포 계통의 형성 이상 또는 신생물 세포, 예를 들면, 흑색종 세포가 있다. 특히, 본 발명의 CD20-결합 단백질로 표적화될 CD20을 발현하는 세포는 B-세포로서 일반적으로 분류되지 않지만 CD20을 발현하는 조혈 세포 계통으로부터의 신생물 세포와 같은, B-세포 계통 또는 비-B-세포 계통의 신생물 세포를 포함한다.
A. CD20의 신속한 내재화를 유도할 수 있는 CD20-결합 단백질
본 발명의 시가 독소 효과기 영역은 표적 세포의 외부 표면으로부터 표적 세포의 세포질내로 CD20-결합 단백질을 이동시키는, 내재화 기능을 제공한다. 그러나, 당해 내재화 기능은 또한, CD20의 세포 내재화가 촉진되거나 유도된다는 점에서 가속화 기능이다. 본원의 명세서 및 특허청구범위에 사용된 것으로서, 어구 "신속한 내재화"는 모노클로날 항체 리툭시마브와 같은, 선행 기술의 참조 분자와 비교하여 결합 시 CD20 세포 내재화를 위한 시간을 감소시키는 본 발명의 CD20-결합 단백질을 말한다.
본 발명의 목적을 위해, 세포 내재화는, CD20-결합 단백질의 결합으로 인하여 발생할 내재화를 위한 시간이 1H4 CD20 모노클로날 항체와 같은, CD20 항원을 인식하는 잘-특성화된 항체의 결합으로 표적 분자의 내재화를 위한 시간과 비교하여 감소되는 경우 신속한 것으로 고려된다[참조: Haisma et al. , Blood 92: 184-90(1999)]. 예를 들면, CD20 항원에 대한 내재화 시간은, 비록 세포형 및 항체 형의 경우 가변적이라고 해도, 결합 후 대략 6시간까지는 전형적으로 최대 수준에 도달하기 시작하지 않는다. 따라서, 본 명세서내에 정의된 것으로서 용어 "신속한"은 당해 6시간의 표준 내재화 윈도우(standard internalization window) 미만이다. 특정의 구현예에서, 약 1시간 미만으로 빠를 수 있지만, 또한 약 1 시간 내지 약 2 시간, 약 1 시간 내지 약 3 시간, 약 1 시간 내지 약 4 시간, 약 1 시간 내지 약 5 시간의 범위; 약 2 시간 내지 약 3 시간, 약 2 시간 내지 약 4 시간, 약 2 시간 내지 약 5 시간의 범위; 약 3 시간 내지 약 4 시간, 약 3 시간 내지 약 5 시간의 범위; 및 약 4 시간 내지 약 5 시간의 범위를 포함할 수 있다.
B. 표적화된 시가 독소 세포독성을 통한 세포 사멸
시가 독소 계열의 구성원은 진핵 세포를 사멸시키기 위해 조정될 수 있으므로, 시가 독소 효과기 영역을 사용하여 설계된 CD20-결합 단백질은 강력한 세포-사멸 활성을 나타낼 수 있다. 시가 독소 계열의 구성원의 A 소단위는 세포의 세포질에서 일단 진핵 세포를 사멸시킬 수 있는 효소 도메인을 포함한다. 본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정 구현예는 당해 세포독성 메카니즘의 장점을 취한다.
본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정의 구현예에서, CD20의 적어도 일부가 세포외 공간으로부터 접근가능하도록 CD20을 발현하는 세포를 접촉시키면, CD20-결합 단백질은 세포의 사멸을 유발할 수 있다. CD20 양성 "세포 사멸"은 생체외 조작된 표적 세포, 시험관내에서 배양된 표적 세포, 시험관내에서 배양된 조직 시료내 표적 세포, 또는 생체내 표적 세포와 같은 표적 세포의 변화된 조건하에서 본 발명의 CD20-결합 단백질을 사용하여 달성할 수 있다.
C. CD20을 발현하는 세포와 비-CD20을 발현하는 세포 사이의 선택적인 세포독성
고-친화성 면역글로불린-형 결합 영역을 사용하여 효소적으로 활성인 시가 독소 영역의 CD20을 발현하는 세포로의 전달을 표적화함으로써, 이러한 강력한 세포-사멸 활성은 CD20 양성 세포형을 우선적으로 사멸시키기 위해 제한할 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질을 세포형의 혼합물에 투여시, CD20-결합 단백질은 세포외 CD20 표적을 결여하는 세포형과 비교하여 세포외 CD20 표적을 나타내는 CD20을 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 시가 독소 계열의 구성원이 진핵 세포를 사멸시키기 위해 조정되므로, 시가 독소 효과기 영역을 사용하여 설계된 CD20-결합 단백질은 강력한 세포독성 활성을 나타낼 수 있다. 고-친화성 면역글로불린형 결합 영역을 사용하여 효소적으로 활성인 시가 독소 영역의 CD20을 발현하는 세포로의 전달을 표적화함으로써, 이러한 강력한 세포 사멸 활성은 CD20을 발현하는 세포만을 우선적으로 사멸시키도록 제한될 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 2개 이상의 상이한 세포형의 혼합물내에서 특이적인 세포형의 사멸을 선택적으로 또는 우선적으로 유발할 수 있다. 이는 세포외 CD20 표적의 어떠한 유의적인 양도 발현하지 않은 "바이스탠더(bystander)" 세포형보다 적어도 3배의 세포독성 효과와 같은, 높은 우선권으로 특이적인 세포형에 대해 세포독성 활성을 표적화할 수 있다. 이는 유의적인 양의 CD20을 발현하지 않거나 세포 표면에서 유의적인 양의 CD20을 노출시키지 않는 "바이스텐더" 세포형보다 적어도 3배의 세포독성 효과와 같이, 높은 우선권으로 특이적인 세포형에 대한 세포독성 활성의 표적화가 가능하다. 이는 유의적인 양의 CD20을 발현하지 않거나 세포 표면에 유의적인 양의 CD20을 노출시키지 않는 "바이스탠더" 세포형보다 적어도 3배의 세포독성 효과와 같은, 높은 우선권으로 세포 표면에 CD20을 발현하는 특이적인 세포형의 표적화된 세포-사멸을 가능하도록 한다.
특정의 추가의 구현예에서, 세포형의 2개의 상이한 집단에 대한 CD20-결합 단백질이 투여 시, CD20-결합 단백질은 CD20을 발현하지 않는 세포 집단에 대해 동일한 CD20-결합 단백질의 CD50 투여량보다 적어도 3배 낮은 투여량에서 세포 표면상에 CD20을 발현하는 세포 집단에서 최대 세포독성 농도의 1/2(CD50)까지 정의된 세포 사멸을 유발할 수 있다.
특정의 구현예에서, 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포형의 집단에 대한 세포독성 활성은 구현예의 CD20 결합 영역의 어떠한 세포외 CD20 표적과 물리적으로 커플링되지 않은 세포형의 집단에 대한 세포독성 활성보다 적어도 3배 더 높다. 본 발명에 따라서, 선택적인 세포독성은 (b) 구현예의 CD20 결합 영역의 어떠한 세포외 CD20 표적과 물리적으로 커플링되지 않은 세포형의 세포 집단에 대한 세포독성에 대해 구현예의 CD20 결합 영역의 세포외 CD20 표적을 발현하는 세포의 집단에 대한 세포독성의 비(a/b)의 측면에서 정량화될 수 있다. 특정의 구현예에서, 세포독성 비는 선택적인 세포독성의 지표이며, 이는 CD20을 발현하지 않는 세포의 집단 또는 세포형과 비교하여 CD20을 발현하는 세포의 집단 또는 세포형보다 적어도 3배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 75배, 100배, 250배, 500배, 750배, 또는 1000배 더 높은 선택적인 세포독성의 지표이다.
이러한 우선적인 세포 사멸 기능은, 표적화된 세포가 변화된 조건 및 세포형의 생체외 조작된 혼합물, 세포형의 혼합물을 지닌 시험관내 배양된 조직, 또는 생체내 다수의 세포형의 존재하에서(예를 들면, 다중세포 유기체내에서 자체내 또는 이의 천연 위치에서) 본 발명의 특정의 CD20-결합 단백질에 의해 사멸되도록 한다.
또한, CD20-결합 단백질의 촉매적으로 불활성인 형태는 임의로 진단 기능을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 CD20-결합 단백질에 대한 당해 분야에 공지된 추가의 진단제의 접합은 환자 또는 생검 시료에서 B-세포 계통의 개개 면역 세포 또는 암 세포의 세포내 기관(예를 들면, 골지체, 소포체, 및 세포질 구획)의 영상화를 가능하도록 한다. 예를 들면, 이는 신생물 세포형을 진단하고/하거나, 시간에 따른 항암 치료요법의 진행을 평가하고/하거나 종양 덩어리의 외과적 절개 후 잔류 암 세포의 존재를 평가하는데 유용할 수 있다.
D. 추가의 외인성 물질의 전달
CD20-결합 단백질은 CD20의 세포외 부위에 대한 결합 후 CD20의 세포 내재화를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정의 구현예를 사용하여 추가의 외인성 물질을 CD20을 발현하는 세포의 내부로 전달할 수 있다. 하나의 의미에서, 전체 CD20-결합 단백질은 세포내로 도입될 외인성 물질이므로; "추가의" 외인성 물질은 코어 CD20-결합 단백질 자체보다는 다른 것에 연결된 물질이다.
본원에 사용된 것으로서 "추가의 외인성 물질"은 흔히 천연의 표적 세포내에 일반적으로 존재하지 않는 하나 이상의 분자를 말하며, 여기서 본 발명의 CD20-결합 단백질을 사용하여 이러한 물질을 세포 내부로 특이적으로 수송할 수 있다. 일반적으로, 추가의 외인성 물질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 및 폴리뉴클레오타이드로부터 선택된다. 펩타이드인 추가의 외인성 물질의 하나의 예는 인플루엔자 매트릭스 58-66 펩타이드(서열 번호 3)와 같은, 인플루엔자 바이러스 항원이다. 이러한 항원을, CD20을 발현하는 표적 세포내로 전달할 수 있는 CD-20 결합 단백질의 하나의 예시적인 구현예는 서열 번호 16에서 제공된다.
추가의 외인성 물질은 인플루엔자 매트리스 58-66 펩타이드(서열 번호 3)와 같은 코어 CD20-결합 단백질 구조내의 내부 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 추가의 외인성 물질은 CD20-결합 구조의 말단에 연결된 말단에 위치한 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 추가의 외인성 물질로서 상기 항원을, 세포 표면에서 CD20을 발현하는 표적 세포내로 전달할 수 있는 본 발명의 CD20-결합 단백질의 특정의 구현예는 서열 번호 4, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 16을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 CD20-결합 단백질이다.
본 발명의 CD20-결합 단백질에 연결될 수 있는 외인성 물질의 추가의 예는 세균에 감염된 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)의 특징과 같은, 세균 단백질로부터 기원한 것들과 같은 항원을 포함한다. 추가의 외인성 물질의 추가의 예는 암에서 돌연변이된 단백질 또는 암에서 비정상적으로 발현된 단백질이다. 추가의 외인성 물질의 추가의 예는 외인성 항원으로서 기능할 수 있는 T-세포 상보성 결정 영역을 포함한다.
본 발명의 CD20-결합 단백질에 연결될 수 있는 외인성 물질의 추가의 예는 효소와 같은, 항원 이외의 단백질을 포함한다. 외인성 물질의 추가의 유형은 폴리뉴클레오타이드이다. 수송될 수 있는 폴리펩타이드중에는 소 방해(small interfering) RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)와 같은, 조절 기능을 갖도록 제형화된 것이 있다.
*외인성 물질의 추가의 예는 세균에 감염된 항원-제시 세포의 특성과 같은, 세균 세포로부터 기원한 것과 같은 항원을 포함한다. 외인성 항원의 추가의 예는 암에서 비정상적으로 발현하는 단백질 또는 암 속에서 돌연변이된 단백질로부터 기원한 것이다. T-세포 상보성 결정 영역(CDR)은 또한 본 발명의 목적을 위해 외인성 항원으로서 작용할 수 있다. 외인성 물질의 추가의 예는 효소와 같은, 항원 이외의 단백질을 포함한다. 외인성 물질의 추가의 유형은 핵산이다. 수송될 수 있는 핵산 중에는 소 방해 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)와 같은, 조절 기능을 가지도록 제형화된 것이다.
전체 구조 및 기능을 유지하는 CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드 서열내 변이
특정의 상기 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은, 폴리펩타이드 영역(들)내에 도입된 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 존재하는 변이체이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "보존적 치환"은, 하나 이상의 아미노산이 다른, 생물학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환되어 있음을 나타낸다. 예에는 아미노산 잔기의 유사한 특징, 예를 들면, 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산 및 방향족 아미노산(참조: 예를 들면, 하기 표 B)에 의한 치환을 포함한다. 내인성의, 포유동물 펩타이드 및 단백질에서 일반적으로 발견되지 않는 잔기에 의한 보존적 치환의 예는 아르기닌 또는 라이신 잔기의, 예를 들면, 오르니틴, 카나바닌, 아미노에틸시스테인, 또는 다른 염기성 아미노산의 보존적 치환이다. 펩타이트 및 단백질내 표현형적으로 사일런트인(silent) 치환에 관한 추가의 정보는 문헌[참조: 예를 들면, Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)]에 있다. 도식에서 하기는 물리화학적 특성에 의해 그룹화된 아미노산의 보존적 치환이다. I: 중성의 친수성, II: 산 및 아미드, III: 염기성, IV: 소수성, V: 방향족의, 부피가 큰 아미노산.
[표 B]
보존적 아미노산 치환의 예
Figure 112019059778651-pat00002
특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은, 측정가능한 생물학적 활성만을 보유하거나 CD20-결합 단백질의 성분을 보유하는 한, 본원에 인용된 폴리펩타이드 서열과 비교하여 최대, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드 영역의 기능적 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. CD20-결합 단백질의 변이체는, 변화된 세포독성, 변화된 세포정지 효과, 변화된 면역원성, 및/또는 변화된 혈청 반감기와 같은 바람직한 특성을 달성하기 위하여, 면역글로불린-형 결합 영역 또는 시가 독소 효과기 영역내와 같은, 하나 이상의 아미노산을 변경시키거나 하나 이상의 아미노산을 결실 또는 삽입시킴으로써 CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드를 변화시킨 결과로서 본 발명의 영역내에 있다. 본 발명의 CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드는, 시그날 서열과 함께 또는 이의 부재하에 추가로 존재할 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 세포독성, 세포외 표적 생물분자 결합, 효소적 촉매작용, 또는 소세포 경로와 같은, 측정가능한 생물학적 활성을 보유하는 한, 본원에 인용된 CD20-결합 단백질의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 아미노산 서열 동질성을 공유한다. 면역글로불린-형 결합 영역은, 이의 세포외 표적 생물분자에 대한 결합 기능성을 보유하는 한, 본원에 인용된 CD20-결합 단백질의 아미노산 서열과는 상이할 수 있다. 결합 기능성은, ABR의 아미노산 서열이 동일한 경우 대부분 보유되는 경향이 있을 것이다. 예를 들어, 아미노산 동질성의 정도를 측정할 목적으로, ABR을 형성하는 아미노산 잔기가 무시되는 서열 번호 4 또는 서열 번호 16에 대해 85%의 아미노산 동질성으로 필수적으로 이루어진 CD20-결합 단백질은 특허청구범위의 영역내에 있다. 결합 기능성은 표준 기술을 사용하여 숙련가에 의해 측정될 수 있다.
특정의 구현예에서, 시가 독소 효과기 영역은 시가 독소 효과기 영역의 효소 활성 및/또는 세포독성이 변화하도록 변경될 수 있다. 이러한 변화는, 이의 변경된 시가 독소 효과기 영역이 성분인 CD20-결합 단백질의 세포독성에 있어서의 변화를 생성할 수 있거나 생성하지 않을 수 있다. 가능한 변경은 트렁케이션, 결실, 전환, 삽입 및 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 시가 독소 효과기 영역에 대한 돌연변이를 포함한다.
시가 독소 계열의 구성원의 A 소단위의 세포독성은 돌연변이 또는 트렁케이션에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 타이로신-77, 글루타메이트-167, 아르기닌-170, 타이로신-114, 및 트립토판-203으로 표지된 위치는 Stx, Stxl, 및 Stx2의 촉매 활성에 중요한 것으로 밝혀졌다[참조: Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 24 i: 467-73 (1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)]. 글루타메이트-167 및 아르기닌-170 둘 다에서의 돌연변이는 세포 유리된 리보소옴 불활성화 검정에서 Slt-I A1의 효소 활성을 제거하였다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 소포체에서 Slt-I Al의 새로운 발현을 사용한 다른 시도에서, 글루타메이트-167 및 아르기닌-170 둘 다의 돌연변이는 이러한 발현 수준에서 Slt-I Al 단편 세포독성을 제거하였다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 트렁케이션 분석은, 75 내지 268번 잔기로부터의 StxA의 단편이 시험관내에서 여전히 유의적인 효소 활성을 보유하고 있음을 입증하였다[참조: Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)]. 1 내지 239번 잔기를 함유하는 Slt-I Al의 트렁케이션된 단편은 시험관내에서 유의적인 효소 활성 및 세포질내에서 새로운 발현에 의해 세포독성을 나타내었다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 소포체에서 1 내지 239번 잔기에 대해 트렁케이트된 Slt-I Al 단편의 발현은 세포질내에서 재전위될 수 없으므로 세포독성이 아니었다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)].
시가 독소 A 소단위에서 효소 활성 및/또는 세포독성을 위한 가장 중요한 잔기를 다음 잔기-위치에 맵핑(mapping)하였다: 다른 것들 중에서 아스파라긴-75, 타이로신-77, 글루타메이트-167, 아르기닌-170, 및 아르기닌-176[참조: Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)]. 특히, 글루타메이트-E167-에서-라이신 및 아르기닌-176-에서-라이신으로의 돌연변이를 함유하는 Stx2A의 이중-돌연변이체 작제물은 완전히 불활성화되었으나; Stxl 및 Stx2에서 많은 단일의 돌연변이는 세포독성에 있어서 10배의 감소를 나타내었다. 또한, StxlA의 1-239 또는 1-240으로의 트렁케이션은 이의 세포독성을 감소시켰고, 유사하게, Stx2A의 보존된 소수성 잔기로의 트렁케이션은 이의 세포독성을 감소시켰다.
시가-형 독소 1 A 소단위 트렁케이션은 촉매적으로 활성이며, 시험관내에서 리보소옴을 효소적으로 불활성화시킬 수 있고, 세포내에서 발현되는 경우 세포독성이다[참조: LaPointe, J Biol Che 280: 23310-18 (2005)]. 완전한 효소 활성을 나타내는 가장 작은 시가 독소 A 소단위 단편은 SltlA의 1 내지 239번 잔기로 구성된 폴리펩타이드이다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)]. 실질적인 촉매 활성을 보유하는 것으로 보고된 시가 독소 A 소단위의 가장 작은 단편이 StxA의 75 내지 247번 잔기였지만[참조: Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)], 진핵 세포내에서 새로이 발현된 StxA 트렁케이션은 세포질에 도달하여 리보소옴의 촉매적 불활성화를 발휘하는데 단지 240개 이하의 잔기를 필요로 한다[참조: LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)].
SLT-1 A(서열 번호 1), StxA(서열 번호 25), 또는 SLT-2A(서열 번호 26)로부터 기원한 특정의 구현예에서, 이들 변화는 75번 위치에서 아스파라긴, 77번 위치에서 타이로신, 114번 위치에서 타이로신, 167번 위치에서 아스파르테이트, 170번 위치에서 아르기닌, 176번 위치에서 아르기닌의 치환 및/또는 203번 위치에서 트립토판의 치환을 포함한다. 이러한 치환의 예는 75번 위치에서 아스파라긴의 알라닌으로의 치환, 77번 위치에서 타이로신의 세린으로의 치환, 114번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환, 167번 위치에서 아스파르테이트의 글루타메이트로의 치환, 170번 위치에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환, 176번 위치에서 아르기닌의 라이신으로의 치환, 및/또는 203번 위치에서 트립토판의 알라닌으로의 치환과 같이, 선행 기술을 기준으로 하여 숙련가에게 공지될 것이다.
본 발명의 CD20-결합 단백질은 당해 분야에 공지된 치료제 및/또는 진단제를 포함할 수 있는 하나 이상의 추가의 제제에 임의로 접합될 수 있다.
CD20-결합 단백질의 생산, 제조, 및 정제
본 발명의 CD20-결합 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 생화학적 가공 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 표준 합성 방법에 의해, 재조합체 발현 시스템의 사용에 의해, 또는 어떠한 다른 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 예를 들면, (1) 표준 고체-상 또는 액체-상 방법을 단계별로 또는 분획 조립으로 사용하여 CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 성분을 합성하고, 최종 펩타이드 화합물 생성물을 분리하여 정제하는 단계; (2) CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포내에서 발현시키고 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 발현 생성물을 회수하는 단계; 또는 (3) CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 세포-유리된 시험관내 발현, 및 발현 생성물을 회수하는 단계를 포함하는 방법; 또는 (1), (2) 또는 (3)의 방법의 어떠한 조합에 의해 펩타이드 성분의 단편을 수득하고, 당해 단편들을 연속적으로 결합(예를 들면, 연결)시킴으로써 펩타이드 성분을 수득하고, 당해 펩타이드 성분을 회수하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성할 수 있다.
본 발명의 CD20-결합 단백질의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 성분을 고체-상 또는 액체-상 펩타이드 합성에 의해 합성하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 CD20-결합 단백질은 표준 합성 방법으로 제조할 수 있다. 따라서, 펩타이드는 예를 들면, 당해 펩타이드를 표준 고체-상 또는 액체-상 방법에 의해 단계별로 또는 단편 조립에 의해 합성하는 단계, 및 최종 펩타이드 생성물을 분리하여 정제하는 단계에 의해 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 제WO 1998/11125호 또는, 특히 Fields, G et al., Principles and Practice of Solid-Phase PeptideSynthesis(Synthetic Peptides, Gregory A. Grant (ed.), Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002) 및 이의 합성 실시예를 참조할 수 있다.
본 발명의 CD20-결합 단백질은 당해 분야에 잘 공지된 재조합체 기술을 사용하여 제조(생산 및 정제)할 수 있다. 일반적으로, 암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 폴리펩타이드를 회수함으로써 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 문헌[참조: 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)]에 기술되어 있다. 어떠한 적합한 숙주 세포도 사용하여 본 발명의 CD20-결합 단백질도 생산할 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 구동하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염되거나, 형질전환되거나, 형질도입되거나 형질감염된 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 변화된 세포독성, 변화된 세포정지 효과, 변화된 면역원성, 및/또는 변화된 혈청 반감기와 같은 바람직한 특성을 달성하기 위하여 하나 이상의 아미노산을 변경시키거나 하나 이상의 아미노산을 결실 또는 삽입시키는 것을 생성하는 CD20-결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 변형에 의해 생산될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 인용된 방법에 따라서 및 본 발명의 폴리펩타이드 중의 일부 또는 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 본 발명의 CD20-결합 단백질을 생산하는 방법, 숙주 세포, 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포내로 도입시키는 경우 본 발명의 폴리펩타이드중 일부 또는 모두를 암호화할 수 있는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
폴리펩타이드 또는 단백질을 숙주 세포 또는 세포-유리된 시스템에서 재조합체 기술을 사용하여 발현시키는 경우, 고 순도이거나 실질적으로 상동성인 제제를 수득하기 위하여, 숙주 세포 인자와 같은 다른 성분으로부터 요구되는 폴리펩타이드 또는 단백질을 분리하는 것이 유리하다. 정제는 원심분리 기술, 추출 기술, 크로마토그래피 및 분획 기술(예를 들면, 겔 여과에 의한 크기 분리, 이온-교환 컬럼에 의한 전하 분리, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 실리카 또는 DEAE 등과 같은 양이온-교환 수지, 크로마토포커싱(chromatofocusing), 및 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로즈 크로마토그래피), 및 침전 기술(예를 들면, 에탄올 침전 또는 황산암모늄 침전)과 같은, 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 달성할 수 있다. 어떠한 수의 생화학적 정제 기술도 사용하여 본 발명의 CD20-결합 단백질의 순도를 증가시킬 수 있다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 임의로 단독-다량체성 형태(예를 들면, 2개 이상의 동일한 CD20-결합 단백질의 단백질 복합체)로 정제될 수 있다.
실시예에서 하기는 본 발명의 CD20-결합 단백질의 제조방법의 비-제한 실시예, 및 또한 특이적이지만 개재된, 예시적인, CD20-결합 단백질을 위한 CD20-결합 단백질 생산의 비-제한된 국면의 설명이다.
CD20-결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물
본 발명은 하기 추가로 상세히 기술된 상태, 질병, 질환, 또는 증상(예를 들면, 암, 악성 종양, 비-악성 종양, 및 면역 질환)의 치료 또는 예방을 위한, 약제학적 조성물 속에서 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 사용하기 위한 본 발명의 CD20-결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 CD20-결합 단백질, 또는 본 발명에 따른, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물과 함께 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 CD20-결합 단백질의 단독-다량체 및/또는 이종-다량체 형태를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 하기 추가로 상세히 설명된 질병, 상태, 질환, 또는 증상을 치료하거나, 완화시키거나, 예방하는 방법에 유용할 것이다. 이러한 질병, 상태, 질환, 또는 증상 각각은 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 용도와 관련하여 별도의 구현예인 것으로 고려된다. 본 발명은 하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 적어도 하나의 치료 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "환자" 및 "피검자'는 적어도 하나의 질병, 질환, 또는 상태의 증상, 신호, 및/또는 조짐을 나타내는, 일반적으로 사람 및 동물과 같은 척추동물을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 영장류, 가축 동물(예를 들면, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 등), 반려 동물(예를 들면, 고양이, 개, 등) 및 실험실 동물(예를 들면, 마우스, 토끼, 랫트, 등)의 비-제한적 예와 같은 포유동물을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, "치료하다", "치료하는," 또는 "치료" 및 이의 문법적 변이체는 유리하거나 바람직한 임상 결과를 수득하기 위한 시도를 말한다. 당해 용어는 유리하거나 요구된 임상 결과를 수득하기 위한 시도를 말한다. 당해 용어는 상태, 질환 또는 질병의 발병 또는 발달 속도를 지연시키고, 이와 관련된 증상을 감소시키거나 완화시키며, 상태, 또는 상기 어느 것의 일부 조합의 완전하거나 부분적인 퇴화를 생성하는 것을 말할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유리하거나 요구되는 임상 결과는 검출가능하거나 검출불가능한 것에 상관없이, 증상의 감소 또는 완화, 질병의 정도의 축소, 질병의 상태의 안정화(예를 들면, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 저하, 질병 상태의 완화 또는 경감, 및 차도(부분적이거나 전체적인 것에 상관없이)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 또한 치료를 제공받지 않는 경우에 예측된 생존 시간과 관련하여 생존을 연장시킴을 의미할 수 있다. 따라서, 치료가 요구되는 피검자(예를 들면, 사람)은 문제의 질병 또는 질환으로 이미 영향받은 피검자일 수 있다. 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 치료의 부재와 관련하여 병리학적 상태 또는 증상의 중증도에 있어서의 증가의 억제 또는 감소을 포함하며, 관련 질병, 질환, 또는 상태의 완전한 중지를 내포하는 것을 필수적으로 의미하지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "예방하다", "예방하는", "예방" 및 이의 문법적 변형은 상태, 질병, 또는 질환의 병리학의 발달을 예방하거나, 변경시키기 위한 시도를 말한다. 따라서, "예방"은 예방학적 또는 예방적 척도를 말할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유리하거나 바람직한 임상 결과는 검출가능하거나 검출불가능한 것에 상관없이, 질병의 증상, 진행 또는 발달의 예방 또는 지연을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 "예방"은 치료의 부재와 관련하여 질병의 발병을 지연시키는 것을 포함하며, 관련 질병, 질환 또는 상태의 영구적인 예방을 내포함을 필수적으로 의미하지 않는다. 따라서, 상태를 "예방하는" 또는 이의 "예방"은 상태의 발달 위험을 감소시키거나, 상태와 관련된 증상의 발달을 예방하거나 지연시키는 것을 말한다.
본원에 사용된 것으로서, "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 표적 상태를 예방하거나 치료하거나 상태와 관련된 증상을 유리하게 완화시키는 것과 같은, 피검자에서 적어도 하나의 바람직한 치료학적 효과를 생성하는 조성물(예를 들면, 치료학적 조성물 또는 제제)의 양 또는 투여량이다. 가장 바람직한 치료학적 유효량은 이를 필요로 하는 제공된 피검자에 대해 당해 분야의 숙련가가 선택한 특수 치료의 바람직한 효능을 생성할 양이다. 당해 양은 치료학적 화합물의 특성(활성, 약동학, 약력학, 및 생이용성), 피검자의 생리학적 상태(나이, 성별, 질병 유형, 질병 단계, 일반적인 육체적 상태, 제공된 용량에 대한 반응성, 및 의약 유형), 제형 중 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들의 특성, 및 투여 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 숙련가에 의해 이해되는 다양한 인자에 따라 변할 것이다. 임상 및 약리학적 분야의 기술자는 통상의 실험을 통해, 즉 화합물의 투여에 대한 피검자의 반응을 모티터링하고 용량을 상응하게 조절함으로써 치료학적 유효량을 측정할 수 있을 것이다[참조: 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)].
CD20-결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 생산 또는 제조
본 발명의 CD20-결합 단백질 중의 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 또한 본 발명의 영역내에 있다.
본 발명의 내용에서 용어 "용매화물"은 용질(이 경우, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염)과 용매 사이에 형성된 정의된 화학량론의 복합체를 말한다. 이와 관련하여 용매는 예를 들면, 물, 에탄올 또는 아세트산 또는 락트산과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다른 약제학적으로 허용되는, 전형적으로 소 분자 유기 종일 수 있다. 문제의 용매가 물인 경우, 이러한 용매화물은 일반적으로 수화물로서 언급된다.
본 발명의 CD20-결합 단백질, 또는 이의 염은 약제학적으로 허용되는 담체 속에, 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 이의 염을 전형적으로 포함하는, 저장 또는 투여용으로 제조된 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 표준 약제학적 담체 중의 어느 것도 포함한다. 치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 약제학 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985)]에 기술되어 있다. 본원에 사용된 것으로서, "약제학적으로 허용되는 담체"는 어떠한 및 모든 생리학적으로 허용되는, 즉, 상용성의, 용매, 분산 매질, 피복제, 항미생물제, 등장성, 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 경구, 직장, 비강 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내, 및 경피) 투여를 포함한다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 처방전에 따라 조제된 제제용 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 야채 오일, 및 에틸올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 및 표면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 특정의 구현예에서, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여(예를 들면, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 선택된 투여 경로에 따라서, CD20-결합 단백질 또는 다른 약제학적 성분은, 활성 CD20-결합 단백질이 특수한 투여 경로에 의해 환자에게 투여되는 경우 직면할 수 있는 저 pH의 작용 및 다른 천연의 불활성화 조건으로부터 화합물을 보호하도록 의도된 물질 속에 피복시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 편리하게는 단위 용량형으로 제공될 수 있고 약제학 분야에서 잘 공지된 방법 중의 어느 것으로도 제조할 수 있다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 투여량으로 분할된다. 단위 투여량 형태는 포장된 제제일 수 있으며, 당해 포장은 별개의 양의 제제를 함유하는데, 예를 들면, 바이알(vial) 또는 앰플 속의 포장된 정제, 캅셀제, 및 산제일 수 있다. 단위 용량형은 또한 캅셀제, 카쉐제(cachet), 또는 정제 자체일 수 있거나, 이는 적절한 수의 이들 포장된 형태 중의 어느 것일 수 있다. 이는 단일 투여량의 주사가능한 형태, 예를 들면, 펜의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 어떠한 적합한 투여 경로 및 수단을 위해 제형화될 수 있다. 피하 또는 경피 투여 방식이 본원에 기술된 치효학적 CD20-결합 단백질에 특히 적합할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 부형제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 멸균 과정, 및 다양한 항미생물 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 혼입 둘 다에 의해 보증될 수 있다. 조성물 내로의 슈가, 염화나트륨 등과 같은 등장성 제제가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은, 흡수를 지연시키는 제제의 혼입에 의해 유발될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항산화제를 임의로 포함한다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 항산화제는 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중황산나트륨, 아황산나트륨 등과 같은 수용성 항산화제; 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; 및 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제이다.
다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 상이한 CD20-결합 단백질, 또는 앞서의 어느 것의 에스테르, 염 또는 아미드, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
치료학적 조성물은 전형적으로 멸균성이고 제조 및 저장 조건하에서 안정하다. 조성물은 용액, 미세유액, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 차원의 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올과 같은 알코올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 다른 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복제의 사용에 의해, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지함에 의해 및 당해 분야에 잘 공지된 제형 화학에 따라 표면활성제를 사용함에 의해 유지될 수 있다. 특정의 구현예에서, 등장성 제제, 예를 들면, 슈가, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가 알코롤 또는 염화나트륨이 조성물 속에서 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 속에 흡수를 지연하는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유발할 수 있다.
경피 또는 피하 적용에 사용된 액제 또는 현탁제는 전형적으로 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항미생물제; 아스코르브산 또는 중황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이팅제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제; 및 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 등장성 조절제 중의 하나 이상을 포함한다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기, 또는 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 등과 같은 완충제로 조절할 수 있다. 이러한 제제는 앰플, 1회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여량 바이알 속에 포함될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 본 발명의 CD20-결합 단백질을 상술한 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 속에 필요한 양으로 혼입시킨 후, 필요할 경우, 멸균 미세여과에 의해 제조할 수 있다. 분산제는 활성 화합물을 분산 매질 및 위에서 기술된 것들과 같은 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 혼입함으로써 제조할 수 있다. 멸균 주사가능한 액제의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 멸균-여과된 이의 용액으로부터 어떠한 추가의 요구되는 성분 외에 활성 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
본 발명의 치료학적 유효량의 CD20-결합 단백질이 예를 들면, 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여되도록 설계되는 경우, 결합제는 발열원이 없는, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 적절한 pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여, 비경구적으로 허용가능한 단백질 용액을 제조하는 방법은 당해 분야의 기술내에 있다. 정맥내, 피부, 또는 피하 주사용의 바람직한 약제학적 조성물은 결합제 외에, 염화나트륨 주사, 링거 주사(Ringer's injection), 덱스트로즈 주사, 덱스트로즈 및 염화나트륨 주사, 락테이트화된 링거액 주사와 같은 등장성 비히클, 또는 당해 분야에 공지된 다른 비히클을 함유할 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 안정화제, 방부제, 완충제, 항산화제, 또는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
본원의 어딘가에 기술된 바와 같이, 화합물은 이식물, 경피 패취, 및 미세봉입된 전달 시스템을 포함하는, 서방성 제형과 같은, 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 에티렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은, 생분해가능한, 생접합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 많은 방법은 특허되어 있거나 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)].
특정의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 생체내에서 요구된 분포를 보증하도록 제형화될 수 있다. 예를 들면, 혈액-뇌 장벽은 많은 거대한 및/또는 친수성 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료학적 화합물 또는 조성물은 특수한 생체내 위치에 표적화하기 위해서, 이들은 예를 들면, 특수한 세포 또는 기관내로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있는 리포좀 속에 제형화됨으로써 표적화된 약물 전달을 향상시킬 수 있다. 예시적인 표적화 잔기는 폴레이트 또는 바이오틴; 만노시드; 항체; 표면활성제 단백질 A 수용체; p120 카텝신 등을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명의 CD20-결합 단백질 외에, 이러한 CD20-결합 단백질, 또는 이의 기능적 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 영역내에 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 용어 "핵산"과 동일하며 이들 둘 다는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA)의 중합체, 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된 이들 DNA 또는 RNA의 유사체, 이의 유도체 단편 및 동족체를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄, 이본쇄, 또는 삼본쇄일 수 있다. 개재된 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, RNA 코돈의 제3 위치에서 내성화될 것으로 공지된 워블(wobble)을 고려하여, 상이한 RNA 코돈과 동일한 아미노산을 여전히 암호화하는 예시적인 CD20-결합 단백질을 암호화할 수 있는 모든 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 구체적으로 개재되어 있다[참조: Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)].
하나의 국면에서, 본 발명은 본 발명의 CD20-결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 단편 또는 유도체를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, CD20-결합 단백질의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 50%, 55% , 60% , 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 CD20-결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 단편 또는 유도체, 또는 어떠한 이러한 서열의 안티센스 또는 상보체에 대해 스트링전트 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 CD20-결합 단백질)의 유도체 또는 유사체는 특히 예를 들면, 동일한 크기의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 비하여 또는 정렬이 당해 분야에 공지된 컴퓨터 상동성 프로그램에 의해 수행된 정렬된 서열과 비교하여 적어도 약 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98%, 또는 심지어 99% 유사성(바람직한 유사성은 80 내지 99%이다)까지 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 CD20-결합 단백질에 대해 실질적으로 상동성인 영역을 가진 폴리뉴클레오타이드(또는 폴리펩타이드) 분자를 포함한다. 예시적인 프로그램은 스미쓰 티(Smith T), 워터만 엠(Waterman M)[참조: Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math. 2: 482-9 (1981)]의 알고리즘을 사용하는, 디폴트 셋팅(default setting)을 사용한 GAP 프로그램[위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), UNIX의 경우 버젼 8, 제조원: 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 유니버시티 리서치 파크 소재의 이다. 또한 스트링전트 조건[참조: 예를 들면, Ausubel F, et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993)], 및 하기의 조건하에서 본 발명의 단백질을 암호화하는 서열의 보충물에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다. 스트링전트 조건은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989)]에서 발견할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 영역내의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다. 본 발명의 CD20-결합 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드는 세균 플라스미드, 바이러스 벡터 및 파아지 벡터(phage vector)를 포함하는 공지된 벡터내로, 당해 분야에 잘 공지된 물질 및 방법을 사용하여 삽입함으로써 발현 벡터를 생산할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 선택된 어떠한 숙주 세포 또는 세포-유리된 발현 시스템(예를 들면, 하기 실시예에 기술된 pTxbl 및 pIVEX2.3)내에서 고려된 CD20-결합 단백질의 생산을 지지하는데 필요한 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 숙주 세포 또는 세포-유리된 발현 시스템의 특수 유형과 함께 사용하기 위한 발현 벡터를 포함하는 특수한 폴리뉴클레오타이드는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있으며, 통상의 실험을 사용하여 측정할 수 있거나, 구매할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 단위를 포함하는 선형 또는 환형의, 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 용어 "발현 단위"는 목적한 폴리펩타이드를 암호화하고 숙주 세포내에서 핵산 분절(segment)의 발현을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 분절을 나타낸다. 발현 단위는 전형적으로 전사 프로모터, 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임, 및 전사 터미네이터를 모든 판독가능한 배열로 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 발현 단위를 함유한다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 일본쇄 폴리펩타이드 쇄(예를 들면, 시가 독소 효과기 영역에 연결된 scFv)를 포함하는 CD20-결합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 단일의 폴리펩타이드 쇄에 대한 적어도 하나의 발현 단위를 포함하는 반면, 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩타이드 쇄(에를 들면, VL 도메인을 포함하는 하나의 쇄 및 독소 효과기 영역에 연결된 VH 도메인을 포함하는 제2의 도메인)를 포함하는 CD20-결합 단백질은 CD20-결합 단백질의 2개의 폴리펩타이드 쇄 각각에 대해 하나씩 적어도 2개의 발현 단위를 포함한다. 다중-쇄 CD20-결합 단백질의 발현을 위해, 각각의 폴리펩타이드 쇄에 대한 발현 단위는 또한 상이한 발현 벡터(예를 들어, 발현은, 각각의 폴리펩타이드에 대한 발현 벡터가 도입된 단일의 숙주 세포로 달성될 수 있다)에 별도로 함유될 수 있다.
폴리펩타이드 및 단백질의 일시적이거나 안정한 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 발현 벡터는 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 이종 시그날 서열 또는 펩타이드, 복제 오리진(origin of replication), 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분(enhancer element), 프로모터, 및 전사 종결 서열; 이들 각각은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 사용될 수 있는 임의의 조절성의 조절 서열, 통합 서열, 및 유용한 마커는 당해 분야에 공지되어 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지할 수 있는 세포를 말한다. 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵 세포 또는 진핵 세포(예를 들면, 효모, 곤충, 양서류, 조류, 또는 포유동물 세포)일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 본 발명의 CD20-결합 단백질을 생산할 수 있는 숙주 세포주의 생성 및 분리는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 달성할 수 있다.
본 발명의 영역내에서 CD20-결합 단백질은 숙주 세포에 의해 보다 임의의 발현과 같은, 바람직한 특성을 달성하기에 보다 적합하도록 할 수 있는 하나 이상의 아미노산을 결실시키거나 삽입시키거나 하나 이상의 아미노산을 변경시킴에 의해 CD20-결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시킴으로써 생산된, 본원에 기술된 CD20-결합 단백질의 변이체 또는 유도체일 수 있다.
CD20-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물을 사용하는 방법
일반적으로, 본 발명의 목적은 암, 종양, 면역 질환, 또는 본원에 언급된 추가의 병리학적 상태와 같은 질병, 질환, 및 상태의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 약리학적으로 활성인 제제, 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 CD20 발현 세포를 사멸시키고, 추가의 외인성 물질을 CD20을 발현하는 세포내로 전달하고, CD20 발현 세포의 내부를 표지(labeling)하며, 본원에 기술된 바와 같은 질병, 질환, 및 상태를 치료하기 위한 본 발명의 CD20-결합 단백질 및 약제학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명의 목적은 당해 분야에 현재 공지된 제제, 조성물 및/또는 방법과 비교하여 특정의 장점을 갖는 이러한 약리학적으로 활성인 제제, 조성물, 및/또는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 구체적인 폴리펩타이드 서열을 지닌 CD20-결합 단백질 및 이의 약제학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 서열 번호 l, 3 ,4 , 6-12, 14, 16, 및/또는 18 내지 29에서의 폴리펩타이드 서열 중 어느 것도 다음의 방법에 사용된 CD20-결합 단백질의 성분으로서 구체적으로 이용될 수 있다.
본 발명은 세포를 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, CD20을 발현하는 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 사용하여 암 세포, 감염된 세포, 및/또는 조혈 세포를 포함하는 혼합물과 같은, 비-CD20 발현 세포를 포함하는 상이한 세포형의 혼합물 속에서 CD20을 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 사용하여 유기체내에서와 같은 상이한 세포형의 혼합물 속에서 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 약제학적 조성물과 함께 치료를 필요로 하는 환자에서와 같은 피검자에서 시험관내 또는 생체내에서 세포의 집단에 투여되는 경우 강력한 세포-사멸 활성을 나타낼 수 있다. CD20에 대한 고-친화성 면역글로불린형 결합 영역을 사용하여 효소적으로 활성인 시가 독소 영역의 전달을 표적화함으로써, 당해 강력한 세포-사멸 활성을 암 세포, 신생물 세포, 악성 세포, 비-악성 종양 세포, 또는 감염된 세포와 같은 유기체내에서 특정의 세포형을 특이적으로 및 선택적으로 사멸시키도록 제한할 수 있다.
용어 "암 세포" 또는 "암성 세포"는 비정상적으로 가속화된 양식으로 성장하여 분열하는 다양한 신생물 세포를 말하며 숙련가에게 명백할 것이다. 용어 암 세포는 악성 및 비-악성 세포 둘 다를 포함한다. 일반적으로, 암 및/또는 종양은 치료 및/또는 예방을 받아들일 수 있는 질병, 질환, 또는 상태로서 정의될 수 있다. 암 세포 및/또는 종양 세포에 의해 포함된 암 및 종양(악성 또는 비-악성)은 기술자에게 명백할 것이다.
본 발명은 환자에게 적어도 하나의 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에서 CD20을 발현하는 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.
CD20-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물의 특정의 구현예를 사용하여 환자에서 CD20을 발현하는 면역 세포(건강한 또는 악성에 상관없이)를 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물을 환자로부터 제거된 분리된 세포 집단으로부터의 B 세포의 생체외 고갈 목적을 위해 이용하는 것은 본 발명의 영역내에 있다.
또한, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에서 질병, 질환, 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 당해 방법을 사용하여 치료될 수 있는 고려된 질병, 질환, 및 상태는 암, 악성 종양, 비-악성 종양, 및 면역 질환을 포함한다. 본 발명의 화합물의 "치료학적 유효 용량"의 투여는 질병 증상의 중증도에 있어서의 감소, 질병 증상이 없는 기간의 빈도 및 기간의 증가, 또는 질병 피해로 인한 손상 또는 장애의 예방을 초래할 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료학적 유효량은 투여 경로, 치료되는 포유동물의 유형, 및 고려하의 특수 환자의 육체적 특성에 의존할 것이다. 당해 양을 측정하기 위한 이들 인자 및 이들의 관계는 의학 분야에서 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 당해 양 및 투여 방법을 조절하여 최적 효능을 달성하고, 의학 분야의 숙련가에게 잘 공지된, 체중, 식이, 현재의 의약 및 다른 인자와 같은 인자에 의존할 수 있다. 사람용으로 가장 적절한 용량 크기 및 투여 요법은 본 발명에 의해 수득된 결과에 의해 안내될 수 있으며, 적절히 설계된 임상 시험에서 확인될 수 있다. 효과적인 용량 및 치료 프로토콜은 실험실 동물에서 저 투여량으로 시작한 후 효과를 모니터링하는 동안 용량을 증가시키고, 용량 요법을 또한 전신적으로 변화시킴으로써 통상의 수단으로 측정할 수 있다. 제공된 피검자에 대해 최적의 용량을 측정하는 경우 임상의에 의해 다수의 인자가 고려될 수 있다. 이러한 고려는 숙련가에게 공지되어 있다.
허용되는 투여 경로는 에어로졸, 장내, 비강, 안과, 경구, 비경구, 직장, 질내, 또는 경피(예를 들면, 크림제, 겔제 또는 연고제의 국소 투여, 또는 경피 패취의 수단에 의함)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 분야에 공지된 어떠한 투여 경로도 말할 수 있다. "비경구 투여"는 전형적으로 종양내 주사, 눈아래, 주입, 동맥내, 관절내, 심장내, 피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척추강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 관절하, 피하, 경점막, 또는 경기관(transtracheal) 투여를 포함하는, 의도된 작용 부위에서 또는 이와 연관된 주사와 관련된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여를 위해, 용량 범위는 일반적으로 약 0.0001 내지 100 milligrams per kilogramn (mg/kg)의 숙주 체중, 및 보다 일반적으로 0.01 내지 5mg/kg의 숙주 체중일 것이다. 예시적인 용량은 0.25mg/kg의 체중, 1mg/kg의 체중, 3mg/kg의 체중, 5mg/kg의 체중 또는 10mg/kg의 체중 또는 1 내지 10mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1일 1회 또는 2회 투여, 또는 주당 1회 또는 2회, 매 2주에 1회, 매 3주에 1회, 매 4주에 1회, 1개월에 1회, 매 2 또는 3개월에 1회 또는 매 3 내지 6개월에 1회이다. 용량은 특별한 환자에 대해 치료학적 이점을 최대화시키는데 요구되는 숙련된 건강 보호 전문의에 의해 선택되고 재조절될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다수의 경우에서 동일한 환자에게 전형적으로 투여될 것이다. 단일 용량 사이의 간격은 예를 들면, 2 내지 5일, 매주, 매달, 매 2 또는 3개월, 매 6개월, 또는 매년일 수 있다. 투여 사이의 간격은 피검자 또는 환자에서 혈액 수준 또는 다른 마커를 조절하는 것을 기본으로 하여 불규칙적일 수 있다. 본 발명의 화합물에 대한 용량 요법은 1mg/kg의 체중 또는 3mg/kg의 체중의 정맥내 투여를 포함하며, 당해 화합물은 6회의 용량에 대해 매 2 내지 4주에 투여된 후 매 3개월마다 3mg/kg의 체중 또는 1mg/kg의 체중으로 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법중의 하나 이상을 사용하여, 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 숙련가에게 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 바람직한 결과에 따라 변할 것이다. 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물에 대한 투여 경로는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수, 또는 예를 들면 의도된 작용 부위(예를 들면, 종양내 주사)에서 또는 이와 연관된 주사 또는 주입에 의한 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물은 국소, 상피 또는 점막 투여 경로와 같은 비-비경구 경로, 예를 들면, 비강내, 경구, 질내, 직장내, 설하, 또는 국소 투여될 수 있다.
본 발명의 치료학적 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 하나 이상의 다양한 의료 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 침이없는 피하 주사 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 공지된 이식물 및 모듈의 예는 예를 들면, 조절된 속도의 전달을 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프; 피부를 통한 투여용 장치; 정밀한 주입 속도에서 전달을 위한 주입 펌프; 연속적인 약물 전달을 위한 가변성 유동의 이식가능한 주입 장치; 및 삼투압 약물 전달 시스템을 포함하여, 당해 분야에 존재한다. 이들 및 다른 이러한 이식물, 전달 시스템, 및 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제 또는 진단제와 함께 투여될 수 있다. 조합 치료요법은 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 특수한 환자, 치료되는 질병 또는 상태를 기본으로 선택된 적어도 하나의 다른 치료제와 조합된 이의 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 다른 이러한 제제의 예는 특히, 세포독성, 항암 또는 화학치료제, 소염제 또는 항-증식제, 항미생물제 또는 항바이러스제, 성장 인자, 사이토킨, 진통제, 치료학적으로 활성인 소 분자 또는 폴리펩타이드, 일본쇄 항체, 이의 전통적인 항체 또는 단편, 또는 하나 이상의 시그날링 경로를 조절하는 핵산 분자, 및 치료학적 또는 예방학적 치료 요법에서 유리한 보충물 또는 기타일 수 있는 유사한 조절 치료제를 포함한다.
본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물의 특정의 구현예를 사용한 환자의 치료는 표적화된 세포의 세포 사멸 및/또는 표적화된 세포의 성장의 억제를 초래할 것이다. 자체로서, 본 발명의 CD20-결합 단백질, 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은, 표적 세포를 사멸하거나 고갈하는 것이 유리할 수 있는 다양한 병리학적 질환, 예를 들면, 특히 암, 면역 질환, 및 감염된 세포를 치료하는 방법에서 유리할 것이다. 본 발명은 세포 증식을 억제하고, 신생물 및 과활성 B-세포를 포함하는 세포 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질 및 약제학적 조성물을 사용하여 암, 종양(악성 및 비-악성), 및 면역 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명은 사람과 같은 포유동물 피검자에서 악성 또는 신생물 및, 암과 관련된 다른 혈액 세포를 치료하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 이를 필요로 하는 피검자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 CD20-결합 단백질 및 약제학적 조성물은 예를 들면, 항-신생물제제로서의 용도, 면역 반응을 조절하는데 있어서의 용도, 원치않는 세포형의 이식 조직을 제거하는데 있어서의 용도, 및 진단제로서의 용도를 포함하는 다양한 적용을 갖는다. 본 발명의 CD20-결합 단백질 및 약제학적 조성물은 일반적으로 항-신생물 제제이며 - 이들이 성장을 억제하고/하거나 암 또는 종양 세포의 사멸을 유발함으로써 신생물 또는 악성 세포의 발달, 성숙, 또는 확산을 치료하고/하거나 예방할 수 있음을 의미한다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 사용하여 예를 들면, 백혈병, 림프종, 흑색종, 아밀로이드증, 강직성 척수염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식 거부, 이식편대숙주질환, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 용혈성 요독성 증후군, HIV-관련 질병, 홍반성 루푸스, 다발 경화증, 다발동맥염, 건선, 건선 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈성 쇼크, 소그렌 증후군(Sjorgren's syndrome), 궤양성 결장염, 및 혈관염과 같은 B-세포 매개된 질병 또는 질환을 치료한다.
본 발명의 CD20-결합 단백질 및 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게, 치료학적 유효량의 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 암을 치료하는 방법에서 이용될 수 있다. CD20의 발현을 가진 것으로 밝혀진 일부 암은 B-세포 림프종(비-호지킨 및 호지킨 둘 다를 포함함), 모발 세포 백혈병, B-세포 만성 림프세포 백혈병, 일부 T-세포 림프종, 및 흑색종 암 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법의 특정의 구현예에서, 치료되는 암은 골암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 및 골수종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 CD20-결합 단백질 및 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게, 유효량의 본 발명의 CD20-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 면역 질환을 치료하는 방법에서 이용될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정의 구현예에서, 면역 질환은 아밀로이드증, 강직성 척수염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식 거부, 이식편대숙주질환, 하시모토 갑상선염, 용혈성 요독성 증후군, HIV-관련 질병, 홍반성 루푸스, 다발 경화증, 다발동맥염, 건선, 건선 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈성 쇼크, 소그렌 증후군, 궤양성 결장염, 및 혈관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병과 관련된 염증에 관한 것이다.
본 발명의 특정의 구현예 중에는 암, 종양, 또는 면역 질환의 치료 또는 예방용 의약의 성분으로서 CD20-결합 단백질을 사용하는 것이 있다. 예를 들면, 환자의 피부에 나타나는 면역 질환은 염증을 감소시키기 위한 노력에서 이러한 의약을 사용하여 치료할 수 있다.
본 발명의 CD20-결합 단백질 외에, 적용가능한 경우, 이러한 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 영역내에 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 용어 "핵산"과 동일하며, 이들 둘 다는 데옥시리보핵산 및 리보핵산의 중합체를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 아미노산 코돈의 세번째 위치에서 내성이 되는 것으로 고려된 워블을 고려하나, 여전히 등가의 아미노산을 암호화하는, 구체적인 CD20-결합 단백질을 암호화할 수 있는 모든 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 영역내의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 선택된 어떠한 숙주 세포내에서 본 발명의 CD20-결합 단백질의 생산을 지지하는데 필수적인 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 숙주 세포의 특수형과 함께 사용하기 위한 발현 벡터를 포함하는 구체적인 폴리뉴클레오타이드는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있으며, 통상의 실험을 사용하여 측정할 수 있거나, 구입할 수 있다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 CD20-결합 단백질과 환자내에서와 같은, 생체내 또는 시험관내에서 접촉시킴으로써, CD20-결합 단백질을 세포의 내부로 신속하게 내재화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 CD20을 발현하는 세포를 본 발명의 CD20-결합 단백질과 환자내에서와 같은 생체내 또는 시험관내에서 접촉시킴으로써 CD20을 발현하는 세포를 사멸시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 이의 표면에 CD20 항원을 발현한다.
본 발명의 CD20-결합 단백질이 위에서 기술한 바와 같은 외인성 물질을 포함하거나 이와 접합하는 경우, 이들 CD20-결합 단백질은 위에서 기술한 바와 같은 외인성 물질을 이의 세포 표면에서 CD20을 발현하는 표적 세포내로 전달하는 방법에서 이용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 CD20-결합 단백질을 세포와 환자내에서와 같은 생체내 또는 시험관내에서 접촉시킴으로써 CD20을 발현하는 세포의 내부내로 외인성 물질을 전달하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 CD20-결합 단백질은 암을 치료하는 방법에서 이용될 수 있으며, 여기서, 종양 또는 암 세포는 이의 표면에서 CD20 항원을 발현하며, 당해 방법은 본 발명의 단백질을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함한다. CD20을 발현하는 것으로 밝혀진 일부 암은 B-세포 림프종(비-호지킨 및 호지킨 둘 다 포함), 모발 세포 백혈병, B-세포 만성 림프성 백혈병, 일부 T-세포 림프종, 및 흑색종 암 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "림프종"은 B-세포 림프종(예를 들면, 비-호지킨 및 호지킨형), 모발 세포 백혈병, B-세포 만성 림프세포성 백혈병, T-세포 림프종, 및 흑색종 암 줄기 세포형 림프종을 포함한다.
본 발명의 특정의 구현예는 하기의 1 내지 40으로 번호매김되고 생물학적 서열의 경우 표 C에서 언급되어 있다: (1) 세포내에서 CD20 항원의 내재화를 위한 CD20-결합 단백질, 여기서 당해 단백질은 CD20에 대해 특이적인 결합 영역 및 시가형 독소 1(SLT-1)로부터 기원한 독소 효과기 영역을 포함하며, 여기서 당해 단백질은 세포의 표면에 존재하는 CD20의 신속한 내재화를 유도한다. (2) 구현예 1의 CD20-결합 단백질, 여기서 당해 단백질은 약 1시간 미만에서 B-세포 계통 세포내 CD20의 내재화를 유도한다. (3) 청구항 1의 CD20-결합 단백질, 여기서 당해 독소 효과기 영역은 서열 번호 1의 75 내지 251번 아미노산을 포함한다(참조: 표 C). (4) 구현예 1의 CD20-결합 단백질, 여기서 상기 독소 효과기 영역은 서열 번호 1의 1 내지 251번 아미노산을 포함한다. (5) 구현예 1의 CD20-결합 단백질, 여기서, 상기 독소 효과기 영역은 서열 번호 1의 1 내지 261번 아미노산을 포함한다. (6) 구현예 1의 CD20-결합 단백질, 여기서 당해 단백질은 세포독성이다.
(7) 구현예 1의 CD20-결합 단백질, 여기서 당해 CD20 결합 영역은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, dAb 단편, scFv, 디아보디, CDR3 펩타이드, 구속된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드, 나노바디, 2가 나노바디, 소 모듈러 면역약제(SMIP), 상어 가변 IgNAR 도메인, 미니보디, 및 CD20 결합 기능을 보유하는 특정 단편 또는 화학적으로 또는 유전적으로 조작된 대응물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (8) 구현예 1의 CD20-결합 단백질, 여기서 당해 결합 영역은 scFv이다.
(9) 구현예 8의 CD20-결합 단백질, 여기서 상기 결합 영역은 (A)(i) 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8 각각에 나타낸 바와 같은 HCDRl, HCDR2, HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 9, 서열 번호 10, 및 서열 번호 11 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (B)(i) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23 각각에 나타낸 바와 같은 HCDRl, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 24, 서열 번호 10, 및 서열 번호 11 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함한다.
(10) 구현예 8의 CD20-결합 단백질, 여기서, 상기 CD20 결합 영역은 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함한다. (11) 구현예 1의 CD20-결합 단백질, 여기서 상기 CD20 결합 영역은 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함하고, 상기 독소 효과기 영역은 서열 번호 1의 75 내지 251번 아미노산을 포함한다. (12) 서열 번호 4를 포함하는, 구현예 1의 CD20-결합 단백질. (13) 이의 표면에 CD20을 발현하는 세포를 사멸시키기 위한 CD20-결합 단백질, 여기서 결합 영역은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8 각각에 나타낸 바와 같은 HCDRl, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 및 서열 번호 11 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함함으로써 투여시, 상기 단백질은 이의 표면에 CD20을 발현하는 세포를 사멸할 수 있다.
(14) 구현예 13의 CD20 결합-단백질, 여기서 CD20 결합 영역은 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함한다. (15) 구현예 13의 CD20 결합-단백질, 여기서 CD20 결합 영역은 서열 번호 4의 2 내지 245번 아미노산을 포함하며, 상기 독소 효과기 영역은 서열 번호 1의 75 내지 251번 아미노산을 포함한다. (16) 서열 번호 4를 포함하는 구현예 13의 CD20 결합-단백질.
(17) 이의 표면에 CD20을 발현하는 세포내로 외인성 물질을 전달하기 위한 CD20 결합 단백질, 여기서 당해 단백질은 CD20에 대해 특이적인 결합 영역, 독소 효과기 영역(여기서, 당해 독소 효과기 영역은 시가-유사 독소 1(SLT-1)으로부터 기원한다), 및 외인성 물질을 포함함으로써, 투여시, 상기 단백질은 이의 표면에 CD20을 발현하는 세포내로 외인성 물질을 전달할 수 있다.
(18) 구현예 17의 CD20-결합 단백질, 여기서 당해 결합 영역은 (A)(i) 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 9, 서열 번호 10, 및 서열 번호 11 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (B)(i) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 (ii) 서열 번호 23, 서열 번호 10, 및 서열 번호 11 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함한다.
(19) 구현예 18의 CD20-결합 단백질, 여기서 외인성 물질은 펩타이드, 단백질, 및 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (20) 구현예 19의 CD20 결합-단백질, 여기서 상기 외인성 물질은 펩타이드이고 당해 펩타이드는 항원이다. (21) 구현예 20의 CD20 결합-단백질, 여기서 항원은 결합 영역과 단백질의 독소 효과기 영역 사이에서 암호화된다. (22) 구현예 19의 CD20 결합-단백질, 여기서 항원은 바이러스 단백질로부터 기원한다. (23) 구현예 21의 CD20 결합-단백질, 여기서 항원은 서열 번호 2이다. (24) 서열 번호 5를 포함하는 구현예 21의 CD20 결합-단백질. (25) 구현예 20의 CD20 결합-단백질, 여기서 항원은 세균 단백질로부터 기원한다. (26) 구현예 20의 CD20 결합-단백질, 여기서 항원은 암내에서 돌연변이된 단백질로부터 기원한다. (27) 구현예 20의 CD20 결합-단백질, 여기서 항원은 암내에서 비정상적으로 발현된 단백질로부터 기원한다. (28) 구현예 20의 CD20 결합-단백질, 여기서 항원은 T-세포 CDR 영역으로부터 기원한다.
(29) 구현예 19의 CD20 결합-단백질, 여기서 외인성 물질은 단백질이다. (30) 구현예 29의 CD20 결합-단백질, 여기서 단백질은 효소이다. (31) 구현예 19의 CD20 결합-단백질, 여기서 외인성 물질은 핵산이다. (31) 구현예 30의 CD20 결합-단백질, 여기서 핵산은 siRNA이다. (32) 구현예 1의 CD20 결합-단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. (33) 구현예 32의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터. (34) 구현예 33의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
(35) 환자에게 구현예 1 내지 12 중의 어느 하나의 단백질을 투여하는 단계를 포함하여, 환자의 세포내로 CD20 항원을 신속하게 내재화하는 방법. (36) 환자에게 구현예 1 내지 16 중의 어느 하나의 단백질을 투여함을 포함하여, 이의 표면에서 CD20 항원을 발현하는 환자에서 세포를 사멸시키는 방법. (37) 환자에게 구현예 17 내지 31 중의 어느 하나의 단백질을 투여하는 단계를 포함하여, 이의 표면에서 CD20을 발현하는 환자의 세포내로 외인성 물질을 전달하는 방법. (39) 환자에게 구현예 1 내지 31 중의 어느 하나의 단백질을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에서 암을 치료하는 방법(여기서, 당해 암은 종양 또는 암 세포 표면에서 CD20 항원을 발현한다). (40) 암이 림프종인 구현예 39의 방법.
[표 C]
구현예 1 내지 40에서 언급된 서열
Figure 112019059778651-pat00003
Figure 112019059778651-pat00004
Figure 112019059778651-pat00005
Figure 112019059778651-pat00006
Figure 112019059778651-pat00007
본 발명은 시가 독소 계열의 구성원의 A 소단위로부터 기원한 시가 독소 효과기 영역 및 CD20의 세포외 부위에 결합할 수 있는 면역글로불린형 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 결합 영역을 포함하는 CD20-결합 단백질의 다음의 비-제한적인 예에 의해 추가로 나열된다.
도 1은 예시적인 본 발명의 CD20-결합 단백질의 일반적인 구조를 나타낸다.
*도 2는 Raji-luc 이종이식체 모델에서 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1(MT-3724) 및 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2(MT-3727)의 투여에 의한 전체 체 발광성에 있어서의 변화를 그래프적으로 나타낸다.
도 3은 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1(MT-3724) 및 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2(MT-3727)의 투여에 의한 Raji-luc 이종이식체 모델 마우스의 증가된 생존을 그래프적으로 나타낸다.
도 4는 Raji-luc 피하 이종이식체 모델에서 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1(MT-3724) 및 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2(MT-3727)의 투여에 의한 종양 용적에 있어서의 변화를 그래프적으로 나타낸다.
도 5는 αCD20scFv::SLT-lA 버전 1(MT-3724)의 투여에 의한 비-사람 영장류 연구에서 B-세포 고갈을 나타낸다. 구체적으로, CD21을 발현한 CD20+ B-세포의 소세트를 분석하였다.
도 6은 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1(MT-3724)의 투여에 의한 비-사람 영장류 연구에서 B-세포 고갈을 나타낸다. 구체적으로, CD21을 발현하지 않았던 CD20+ B 세포의 소세트를 분석하였다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 특정의 구현예를 입증한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 설명할 목적으로 제공되며 본 발명의 조건 및 영역에 대한 전체적인 정의인 것으로 의도하지도, 특정하게 해석되지도 않음이 이해되어야 한다. 실시예는 달리 상세히 기술된 것을 제외하고는, 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되고 통상적인, 표준 기술을 사용하여 수행되었다.
다음의 실시예는 이들의 세포 표면에서 CD20을 발현한 세포를 선택적으로 사멸시키는 예시적인 CD20-결합 단백질의 능력을 입증한다. 예시적인 CD20-결합 단백질은 표적화된 세포형에 의해 발현된 CD20 상의 세포외 항원에 결합하여 표적화된 세포내로 도입된다. 내재화된 CD20-결합 단백질은 이들의 시가 독소 효과기 영역를 통해 세포질로 도입되어 리보소옴을 불활성화시키고 후속적으로 표적화된 세포의 세포자멸사적 사멸을 유발한다. 따라서, 예시적인 CD20-결합 단백질은, CD20-결합 단백질이 세포 표면 CD20과 함께 복합체를 형성한 후 신속한 세포 내재화를 유발하는 이들의 시가 독소 효과기 영역으로 인해 CD20을 발현하는 세포형내에서 내재화할 수 있었다.
이들 예시적인 CD20-결합 단백질은 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1(서열 번호 4), αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2(서열 번호 16), B9E9-SLT-1A(서열 번호 12), 및 C2B8-SLT-1A(서열 번호 14)를 포함한다.
실시예 1 - 예시적인 CD20-결합 단백질의 작제, 생산, 및 정제
우선, CD20 결합 영역 및 시가 독소 효과기 영역을 설계하거나 선택하였다. 하기 실시예에서, 시가 독소 효과기 영역은 시가-형 독소 1의 A 소단위(SLT-1A)로부터 기원하였다. 폴리뉴클레오타이드는 pECHE9A 플라스미드내로 클로닝된 SLT-1A의 단편을 함유하고 SLT-1A의 1 내지 251번 아미노산을 암호화하도록 수득하였다[참조: Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)].
CD20 결합 영역은 1H4 CD20 모노클로날 항체로부터 기원한 재조합체 scFv로서 설계하였다[참조: Haisma et al. (1999), Blood 92: 184-90]. 2개의, 면역글로불린, 가변 영역(VL 및 VH)을 링커(서열 번호 18)로 분리하였다.
둘째로, 결합 영역 및 시가 독소 효과기 영역을 합하여 일본쇄의, 재조합체 폴리펩타이드를 형성하였다. 당해 실시예에서, 1H4 CD20 모노클로날 항체로부터 기원한 재조합체 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 쥐 IgG3 분자(서열 번호 20)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로부터 기원한 "쥐 힌지(murine hinge)" 폴리뉴클레오타이드와 프레임내에서 및 SLT-1A(서열 번호 l의 1 내지 251번 잔기)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 프레임내에서 클로닝시켰다. 완전한 길이의 서열은 검출 및 정제를 촉진시키기 위하여 프레임내에 클로닝된 폴리뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 Strep-tag®서열 번호 19)로 시작한다. 당해 실시예의 폴리뉴클레오타이드 서열은 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1을 암호화한 발현 벡터를 생산하기 위해 DNA 2.0, Inc.(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)로부터의 서비스를 사용하여 이. 콜라이(E. coli)내에서 효율적인 발현을 위하여 최적화된 코돈이었다.
인플루엔자 항원을 포함하는 상이한 CD20-결합 단백질을 유사한 방식으로 작제하고 생산하였다. DNA 2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)은 항원 서열(서열 번호 3)을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오타이드를 합성하였으며, 요구된 폴리뉴클레오타이드 성분은 벡터 pJ201을 사용하여 프레임내에서 연결시켜 다음의 일본쇄 폴리펩타이드(아미노-말단으로부터 카복시-말단까지) Strep-tag®서열 번호 19), lH4-기원한 재조합체 scFv(후술됨), 쥐 IgG3 분자(서열 번호 20), 링커(서열 번호 3), 및 SLT-lA-기원한 서열(서열 번호 l의 1 내지 251번 잔기)를 암호화하는 개방 판독 프레임을 생성하였다. 당해 재조합체 폴리뉴클레오타이드를 폴리펩타이드 생산 목적을 위해 pTXBl내로 클로닝하였다. 다시, 이. 콜라이내에서 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화를 DNA 2.0(캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 수행하여 암호화된 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2를 암호화한 발현 벡터를 생산하였다.
세번째로, αCD20scFv::SLT- 1A 재조합체 CD20-결합 단백질의 버젼 1 및 2 둘 다를 세균 및 세포-유리된, 단백질 해독 시스템 둘 다에 대해 표준 기술을 사용하여 생산하였다. 이후에, CD20-결합 단백질을 정제하고 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 분리하였다.
실시예 2 - 예시적인 CD20-결합 단백질의 해리 상수(KD)의 측정
αCD20scFv::SLT-lA CD20-결합 단백질의 버젼 1 및 2 둘 다의 세포 결합 특성을 형광성계 유동 세포측정 검정으로 측정하였다. 각각의 시료는 0.5 x 106의 CD20을 발현하는 세포(Raji (CD20+)) 또는 비-발현 세포(BC1 (CD20-))를 함유하였으며 하이클론(Hyclone) 1X phosphate buffered saline (PBS)(제조원: 매사츄세츠주 왈탐 소재의 Fisher Scientific) + 1% bovine serum albumin (BSA)(제조원: 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Calbiochem)(이후 "IX PBS+1%BSA"로 언급함)중 100μL의 CD20-결합 단백질의 다양한 희석액과 함께 1시간 동안 4 degree Celsius(℃)에서 항온처리하였다. CD20-결합 단백질의 최대 농도를 선택하여 반응이 포화되도록 하였다. 세포를 1X PBS+1%BSA로 2회 세척하였다. 세포를 4℃에서 0.3μg의 항-Strep tag　 mAb-FITC(# A01736-100, 제조원: 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 Genscript)를 함유하는 100μl의 1X PBS+1% BSA와 함께 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 세포를 1X PBS+1% BSA로 2회 세척하고, 200μl의 1X PBS 속에 현탁시키고, 유동 세포분석에 적용하였다. 모든 시료에 대한 기본선 교정된 평균 형광성 강도(MFI) 데이타는 FITC 만의 시료(음성 대조군)의 MFI를 각각의 실험 시료로부터 감하여 수득하였다. 그래프를 "단백질의 농도"에 대한 MFI를 프리즘 소프트웨어(Prism software)(제조원: 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 GraphPad Software)를 사용하여 플롯팅하였다. 1-부위 결합의 프리즘 소프트웨어 기능[Y = Bmax*X / (KD + X)]을 두부 결합-포화(heading binding-saturation) 하에 사용하여, Bmax 및 KD를 기본선 교정된 데이타를 사용하여 계산하였다. Bmax는 MFI로 보고된 최대 특이적인 결합이다. KD는 나노몰(nM)로 보고된, 평형 결합 상수이다.
[1] 다수의 실험에 걸쳐서, Raji(CD20+) 세포에 대한 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1의 KD는 약 80 내지 100nM로 측정되었다. 하나의 실험에서, CD20+ 세포에 결합하는 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1 CD20-결합 단백질에 대한 Bmax는 약 140,000MFI이었으며 KD는 약 83nM(표 1)인 반면, 당해 검정에서 관찰된 CD20-세포에 대한 의미있는 결합은 없었다. 하나의 실험에서, CD20+ 세포에 결합하는 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2에 대한 Bmax는 약 110,000MFI인 것으로 측정되었으며 KD는 약 101nM(표 1)인 반면, 당해 검정에서 관찰된 CD20-세포에 대한 의미있는 결합은 없었다.
Figure 112019059778651-pat00008
실시예 3 - 예시적인 CD20-결합 단백질의 최대 억제 농도의 1/2(IC 50 )의 측정
αCD20scFv::SLT-lA CD20-결합 단백질의 버젼 1 및 2 둘 다의 리보소옴 불활성화 능력을 세포-유리된, 시험관내 단백질 해독 검정으로 TNT®Quick 커플링된 전사/해독 키트(제조원; 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 L1 170 Promega)를 사용하여 측정하였다. 당해 키트는 루시퍼라제 T7 대조군 DNA(제조원: 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 L4821 Promega) 및 TNT®퀵 마스타 혼합물(Quick Master Mix)을 포함한다. 리보소옴 활성 반응을 제조업자의 지시에 따라 제조하였다.
시험할 αCD20scFv::SLT-l A 버젼의 일련의 10배 희석물을 적절한 완충액 속에서 제조하고 일련의 동일한 TNT 반응 혼합물을 각각의 희석물에 대해 생성하였다. 일련의 αCD20scFv::SLT-lA 단백질 희석물 속의 각각의 시료를 TNT 반응물 혼합물 각각과 루시퍼라제 T7 대조군 DNA와 함께 합하였다. 시험 시료를 1.5시간 동안 30℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 루시퍼라제 검정 시약(제조원: 위스콘신주 매디슨 소재의 E1483 Promega)를 모든 시험 시료에 가하고 루시퍼라제 단백질 해독의 양을 제조업자의 지시에 따라 발광성으로 측정하였다. 해독 억제의 수준을 상대적인 발광 단위에 대한 총 단백질의 로그-형질전환된 농도의 비-선형 회귀 분석으로 측정하였다. 통계 소프트웨어(제조원: 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 GraphPad Prism)를 사용하여, 최대 억제 농도의 1/2(IC50) 값을 각각의 시료에 대해 log(억제제) 대 반응(3개의 매개변수) [Y = 하단 + ((상단-하단) / (1+10^(X-LogIC50)))]의 프리즘 소프트웨어 기능을 사용하여 두부 투여량-반응-억제 하에 계산하였다. 실험 단백질 및 SLT-1A-만의 대조군 단백질에 대한 IC50을 계산하였다. SLT-1A-만의 대조군 단백질의 퍼센트는 [(SLT-1A 대조군 단백질의 IC50 / 실험 단백질의 IC50) x 100]으로 계산하였다.
세포-유리된 단백질 합성에 있어서 αCD20scFv::SLT-lA의 버젼 둘 다의 억제 효과는 강력하였다. 다중 실험은, αCD20scFv::SLT-lA 둘 다의 IC50이 약 50피코몰(pM)인 것으로 측정되었다. 하나의 실험에서, 단백질 합성에 있어서 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1의 IC50은 약 38 pM 이거나 SLT-lA-만의 양성 대조군의 19%이었다(표 2). 유사하게, 당해 세포-유리된 검정에서 단백질 합성시 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2의 IC50은 약 58pM 이거나 SLT-lA-만의 양성 대조군의 18%이었다(표 2).
Figure 112019059778651-pat00009
실시예 4 - 면역형광성 검정에 의한 세포 내재화의 측정
면역형광성 연구를 수행하여 CD20-세포주(BC-1, Jurkat(J45.01), 및 U266)와 비교한 것으로서 CD20+ 양성 세포주(Daudi, Raji, 및 Ramos)에서 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1의 결합 및 내재화 프로파일을 분석하였다. 예를 들면, 50nM의 각각의 CD20-결합 단백질을 0.8 x 106의 Raji 세포와 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하여 CD20 결합-단백질의 SLT-1A 부분의 결합 및 내재화를 허용하였다. 이후에 세포를 1X PBS로 세척하고, 고정시키고 BD 사이포픽스/사이토펌(cytofix/cytoperm)(제조원: 미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD Biosciences)으로 투과시키고, 1X BD Perm/WashTM 완충액(제조원: 미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD Biosciences)으로 2회 세척하였다. 세포를 1X BD Perm/WashTM 완충액 중 Alexa Fluor®555 표지된 마우스 항-SLT-lA 항체(제조원: 미국 버지니아주 마나사스 소재의 BEI Resources)으로 45분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후에 세포를 세척하고, BD 사이토픽스(제조원: 미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD Bio sciences)로 10분 동안 4℃에서 고정시켰다. 이후에 세포를 1X PBS로 세척하고 1X PBS 속에 재현탁시킨 후 폴리-L-라이신 피복된 유리 슬라이드(제조원: 미국 펜실바니아주 라드노 소재의 VWR)위에 부착되도록 하였다. 슬라이드를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)-함유 벡타쉬드(Vectashield(제조원: 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재의 Fisher Scientific)로 커버슬립하고 짜이즈 형광 현미경(Zeiss Fluorescence Microscope(제조원: 미국 뉴욕주 토른우드 소재의 Zeiss)로 관찰하였다.
면역혈광성 연구는, αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1 및 B9E9-SLT-1A이 세포 표면에 결합하여 37℃에서 1시간내에 CD20을 발현하는 세포내로 도입함을 나타내었다.
실시예 5 - CD20+ 세포 사멸 검정: CD20-결합 단백질의 세포독성 선택성 및 최대 세포독성 농도의 1/2(CD 50 )의 측정
αD20scFv::SLT-1A의 버젼 둘 다의 세포독성 프로파일을 CD20+ 세포 사멸 검정으로 측정하였다. 당해 검정은 표적 생물분자를 발현하지 않는 세포와 비교하여 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포를 사멸하는 CD20-결합 단백질의 능력을 측정한다. 세포를 384 웰 플레이트(well plate) 속에서 20μL 배지 속에서 플레이팅(웰당 2 x 103)하였다. 시험할 αCD20scFv::SLT-lA 단백질을 1X PBS로 5배 또는 10배 희석시키고, 5μL의 희석물 또는 완충액 대조군을 세포에 가하였다. 배지만을 함유하는 대조군 웰을 기본선 교정에 사용하였다. 세포 시료를 시험할 αCD20scFv::SLT-lA 또는 완충제만으로 3일 동안 37℃에서 및 5% 이산화탄소(C02)의 대기 속에서 항온처리하였다. 전체 세포 생존 또는 생존 퍼센트를
CellTiter-Glo®발광성 세포 생존능 검정(제조원: 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 G7573 Promega)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 측정하였다. 실험 웰의 생존능 퍼센트를 다음 방정식을 사용하여 계산하였다: (시험 RLU - 평균 배지 RLU) / (평균 세포 RLU - 평균 배지 RLU) * 100. 로그 폴리펩타이드 농도 대 생존능 퍼센트를 프리즘(제조원: 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 GraphPad Prism)에서 플로팅하고 log(억제제) 대 표준화된 반응(가변성 기울기 분석)을 사용하여 예시적인 CD-20 결합 단백질에 대한 최대 세포 독성 농도의 1/2(CD50)을 측정하였다. 또한, 림프종 환자로부터의 세포 시료를 당해 세포 사멸 검정에서 분석하여 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1의 세포독성 프로파일을 측정하였다.
다수의 실험에 걸쳐, αCD20scFv::SLT-lA의 버젼 둘 다는, CD20 음성 세포주의 세포 사멸과 비교하여 10 내지 1000배 특이성으로 CD20-특이적인 세포 사멸을 입증하였다(표 3). αCD20scFv::SLT-lA의 버젼 둘 다의 CD20-특이적인 세포 사멸 프로파일은 또한 세포를 사멸하는 SLT-1A(251) 능력과 대조적이었으며, 이는 CD20-특이성을 결여하였다(표 3). αCD20scFv::SLT-lA 단백질의 버젼 둘 다의 CD50 을 CD20-세포주의 경우 600 내지 2,000 이상과 비교하여, 세포주에 따라 CD20+ 세포의 경우 약 3 내지 70nM인 것으로 측정되었다(표 3). αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1 CD20-결합 단백질의 CD50은 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포와 비교하여 세포 표면에서 CD20을 발현하지 않았던 세포의 경우 100 내지 400배 이상 더 컸다. 환자 시료로부터 사람 림프종 세포에 대한 αCD20scFv::SLT-l A 버젼의 CD50 값은 약 7 내지 40nM이었다(표 3).
Figure 112019059778651-pat00010
실시예 6 - 비교성의 CD20+ 세포 사멸: CD20+ 세포에 대한 CD20-결합 단백질의 상대적인 세포독성의 측정
3개의 잠재적인 세포독성 CD20-결합 단백질을 실시예 5에서 상기 기술된 바와 같이 라지(CD20+)에서 CD20+ 세포 사멸 검정을 사용하여 시험하였다. 대표적인 결과의 세트를 표 5에 보고한다. 다수의 실험에 걸쳐서, αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1은 CD20-결합 단백질 B9E9(서열 번호 12)와 비교하여 50 내지 100배 더 큰 세포 사멸 기능을 나타내었다(표 4).
Figure 112019059778651-pat00011
실시예 7 - 생체내 이종이식체 연구를 사용한 CD20-결합 단백질에 대한 표적화된 세포독성의 측정
면역-절충된 마우스 균주를 기본으로 한 2개의 이종이식체 모델 시스템을 사용하여 시간에 따라 및 다양한 용량에 대해 생체내에서 및 종양 환경에서 CD20+ 종양 세포를 사멸시키는 예시적인 CD20-결합 단백질의 능력을 연구하였다. 이들 이종이식체 모델 시스템은 다른 면역 시스템 결핍증 중에서, 이식체 대 숙주 반응을 결여하는 잘-특성화된 마우스 균주에 의존한다. 우선, 정맥내 종양 모델을 SCID(중증의 복잡한 면역 결핍증) 마우스를 사용하여 연구함으로써 마우스 전체에서 전파된 종양을 생성시켜 사람 종양 세포에서 예시적인 CD20-결합 단백질의 생체내 효과를 시험하였다. 둘째로, 피하 종양 모델을 BALBc/누드 마우스를 사용하여 연구하여 마우스에서 피하 종양을 생성시켜, 다시 사람 종양 세포에서 예시적인 CD20-결합 단백질의 생체내 효과를 시험하였다.
제1의 이종이식체 시스템의 경우, 32마리의 C.B.- 17 SCID 마우스(8마리 동물의 4개 그룹)를 200μL의 PBS 속에서 1 x 107 라지-luc 사람 림프종 기원한 세포(제조원: 미국 미주리주 안 아르보 소재의 Molecular Imaging)로 챌린지하였다. 종양 챌린지 후 5 내지 9일 및 12 내지 16일째에 그룹에게 그룹 당 다음을 정맥내 투여를 통해 제공하였다: 그룹 1 : PBS; 그룹 2: 2mg/kg의 투여량에서 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2; 그룹 3: 2mg/kg의 투여량에서 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1; 및 그룹 4: 4mg/kg의 투여량에서 ccCD20scFv::SLT-lA(5 내지 9일만). 1 X 106 양성자/초 단위(p/s)에서, 생물발광성을 캘리퍼(Caliper) IVIS 50 광학 영상 시스템(제조원; 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재의 Perkin Elmer)르 사용하여 5, 10, 15, 및 20일째에 측정하였다. 도 2는, αCD20scFv::SLT-lA의 버젼, 및 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1 둘 다가 둘 다의 용량 수준에서 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 유의적이지 않은 총 생물발광성을 생성함을 나타낸다. 전체 생물발광성에 있어서의 감소는 본 발명의 CD20-결합 단백질을 사용한 치료 후 전파된 종양 부담에 있어서 통계적으로 유의적인 감소를 반영하였다. 도 3은 αCD20scFv::SLT-lA의 하나의 버젼의 투여로 생존에 있어서 통계적으로 유의적인 증가를 나타낸다. 평균 생존 연령은 음성 대조군과 비교한 모든 치료로 5일까지 증가하였다.
제2의 이종이식체 모델의 경우, 28마리의 BALBc/누드(6 또는 7마리의 동물의 4개 그룹)를 2.5 x 106의 라지 사람 림프종 세포(제조원: 미국 매릴랜드주 심슨빌 소재의 Washington Biotechnology)로 피하 챌린지하였다. 종양 용적을 당해 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 캘리퍼스(Calipers)를 이용하여 측정하였다. 0일째에, 각각의 마우스에 대한 평균 종양 용적이 대략 160 mm3(각각의 그룹으로부터 1마리의 마우스는 260 mm3를 초과하는 종양을 가졌으므로 이는 배제하였다)에 도달하였다. 0 내지 4일 및 7 내지 11일째에 그룹에게 그룹 당 다음을 정맥내 투여로 제공하였다: 그룹 1: PBS; 그룹 2: 2mg/kg의 투여량에서 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 2; 그룹 3: 2mg/kg의 투여량에서 αCD20scFv::SLT-1A 버젼 1; 그룹 4: 4mg/kg의 투여량에서 otCD20scFv::SLT-lA 버젼 1. 종양 용적을 측정하고 연구일의 함수로서 그래프화하였다. 도 4는, αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1(용량 수준 둘 다에서)이 24일까지를 통해 PBS 대조군과 비교하여 통계적으로 감소된 종양 용적을 생성하였음을 입증한다. 이는 또한 표 5에 보고된, 54일 전체에서 종양이 없는 마우스 수를 반영한다.
Figure 112019059778651-pat00012
실시예 8 - 비-사람 영장류에서 CD20-결합 단백질의 생체내 효과의 측정
예시적인 CD20-결합 단백질 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1을 비-사람 영장류에 투여하여 생체내 효과를 시험하였다. 시노몰구스 영장류에서 말초 혈액 B 림프구의 생체내 고갈은 상이한 투여량의 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1의 비경구 투여 후 관찰되었다.
하나의 실험에서, 10마리의 시노몰구스 영장류에게 PBS 또는 αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1을 상이한 투여량(50, 150, 및 450 마이그로그램의 약물/킬로그램의 체중(mcg/kg))을 2주 동안 격일로 정맥내 주사하였다. 이후에, 3일 및 8일째 투여 전 수집한 말초 혈액 시료를 CD20를 발현하는 B-림프구의 퍼센트에 대해 분석하였다(도 5 및 6). 시노몰구스 원숭이에서, 2개의 분명한 B-세포 소세트가 기술되어 있다; 유동 세포분석에 의해서 보다, 고 수준의 CD20을 발현하는 CD21 음성, CD40 양성 세포, 및 저 수준의 CD20을 발현하는 CD21 양성 및 CD40 양성[참조: Vugmeyster et al.., Cytometry 52: 101-9 (2003)]. 치료 전에 수집한 혈액 시료로부터의 기본선 수준과 비교하여 투여량 의존성의 B-세포 고갈이 3일째(50, 150 및 450mcg/kg에서 투여된 동물에서 4, 14 및 45% 감소) 및 8일째(50, 150 및 450mcg/kg에서 투여된 동물에서 32, 52 및 75% 감소)에 관찰되었다(표 6). 당해 실험은, αCD20scFv::SLT-lA 버젼 1이 생체내에서 CD20 양성, 영장류 B-세포를 사멸시킬 수 있음을 나타내었다.
Figure 112019059778651-pat00013
실시예 9 - 시가-유사 독소-1 및 항체 오파투무마브의 A 소단위로부터 기원한 CD20-결합 단백질
당해 실시예에서, 시가 독소 효과기 영역은 시가-유사 독소 1(SLT-1A)으로부터 기원한다. 면역글로불린-형 결합 영역 αCD20은 모노클로날 항체 오파투무마브[참조: Gupta I, Jewell R, Ann N Y Acad Sci 1263: 43-56 (2012)]로부터 기원하며, 이는 사람 CD20과 결합할 수 있는 면역글로불린-형 결합 영역을 포함한다.
CD20-결합 단백질 SLT-lA::αCD20의 작제, 생산, 및 정제
면역글로불린-형 결합 영역 αCD20 및 시가 독소 효과기 영역을 함께 연결시켜 단백질을 형성시켰다. 예를 들면, 융합 단백질은 CD20-결합 단백질 SLT- lA::αCD20을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시켜 생산한다. SLT-lA::αCD20 CD20-결합 단백질의 발현은 앞서의 실시예에 기술된 바와 같이, 세균 및/또는 세포-유리된, 단백질 해독 시스템을 사용하여 달성한다.
CD20-결합 단백질 SLT-lA::αCD20의 시험관내 특성의 측정
CD20+ 세포 및 CD20- 세포에 대한 본 실시예의 CD20-결합 단백질의 결합 특성을 앞서의 실시예에서 위에서 기술한 바와 같이 형광성-계, 유동-세포분석 검정에 의해 측정하였다. CD20+ 세포에 대한 SLT- lA::αCD20 결합에 대한 Bmax는 대략 50,000 내지 200,000 MFI인 것으로 측정되며, KD는 0.01 내지 100nM인 반면, 당해 검정에서 CD20-세포에 대해 유의적인 결합은 없다.
SLT-1A::αCD20 CD20-결합 단백질의 리보소옴 불활성화 능력을 앞서의 실시예에서 위에 기술된 바와 같이, 세포 유리된, 시험관내 단백질 해독으로 측정한다. 세포-유리된 단백질 합성에 있어서 본 실시예의 CD20-결합 단백질의 억제 효과는 유의적이다. 당해 세포-유리된 검정에서 단백질 합성에 있어서 SLT-1A::αCD20의 IC50은 대략 0.1 내지 100pM이다.
세포-사멸 검정을 사용한 CD20-결합 단백질 SLT-lA::αCD20의 세포독성의 측정
SLT-lA::αCD20의 세포독성 특성은 앞서의 실시예에서 위에서 기술된 바와 같은 일반적인 세포-사멸 검정으로 측정한다. 또한, SLT-lA::αCD20의 선택적인 세포독성 특성은 CD20+ 세포와 비교한 것으로서 CD20-세포를 사용한 동일한 일반적인 세포-사멸 검정으로 측정한다. 당해 실시예의 CD20-결합 단백질의 CD50은 세포주에 따라 CD20+ 세포의 경우 대략 0.01 내지 100nM이다. CD20-결합 단백질의 CD50은 세포 표면에서 CD20을 발현하지 않는 세포와 비교하여 세포 표면에서 CD20을 발현하지 않는 세포의 경우 대략 10 내지 10,000배 더 크다(세포독성 거의 없음).
동물 모델을 사용한 CD20-결합 단백질 SLT-lA::αCD20의 생체내 효과의 측정
동물 모델을 사용하여 신생물 세포에서 CD20-결합 단백질 SLT-lA::αCD20의 생체내 효과를 측정한다. 다양한 마우스 균주를 사용하여 이들의 세포 표면에서 CD20을 발현하는 사람 신생물 세포의 이들 마우스내로의 주입으로부터 생성되는 마우스내 이종이식체 종양에서의 정맥내 투여 후 CD20-결합 단백질의 효과를 시험한다. 비-사람 영장류를 사용하여 실시예 8에서 위에 기술된 바와 같이 말초 혈액 B-세포에서 SLT-lA::αCD20의 효과를 시험할 수 있다.
실시예 10 - 다양한 CD20 결합 도메인에서 다양한 CD20-결합 단백질
당해 실시예에서, 시가 독소 효과기 영역은 시가-유사 독성 1(SLT-1A), 시가 독소(StxA), 및/또는 시가-유사 독소 2(SLT-2A)의 A 소단위로부터 기원한다. 면역 글로불린-형 결합 영역은 표 8로부터 선택되고 CD20의 세포외 부분에 결합하는 분자로부터의 면역글로불린 도메인으로부터 기원한다. 당해 실시예의 예시적인 세포독성 단백질을 생성하고 세포 표면으로의 CD20으로 표현되는 CD20+세포를 사용한 앞서의 실시예에 기술된 바와 같이 시험한다.
Figure 112019059778651-pat00014
본 발명의 특정 구현예가 설명의 방식으로 기술되어 있지만, 본 발명이 본 발명의 취지를 벗어나거나 특허청구범위의 영역을 초과하지 않고, 많은 변형, 변화 및 조정으로, 및 당해 분야의 숙련가의 영역내에 있는 다수의 등가물 또는 대안 해결법의 사용으로 실시될 수 있음이 명백할 것이다.
모든 공보, 특허, 및 특허원은, 각각의 개개 공보, 특허 또는 특허원이, 이의 전문을 참조로 포함하는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 경우와 동일한 정도로 이의 전문이 참조로 본원에 포함되어 있다. 미국 가특허원 제61/777,130호는, 이의 전문이 참조로 포함된다. 본원에 인용된 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열에 대한 진뱅크(GenBank)(미국 생물기술 정보에 대한 국립 센터: National Center for Biotechnology Information)로부터의 모든 전자적으로 이용가능한 생물학적 서열 정보의 완전한 개재내용이 상기 전체 참조로 각각 포함되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MOLECULAR TEMPLATES, INC. <120> CD20-BINDING PROTEINS FOR INDUCING CELLULAR INTERNALIZATION AND METHODS USING SAME <130> 13-03C-PCT <140> PCT/US2014/23198 <141> 2014-03-11 <150> 61/777,130 <151> 2013-03-12 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 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<223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1305)..(1305) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1308)..(1308) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1314)..(1314) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1317)..(1317) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1320)..(1320) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1326)..(1326) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1338)..(1338) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1341)..(1341) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1347)..(1347) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1350)..(1350) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1353)..(1353) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (1356)..(1356) <223> a, c, t, 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300 aaytaytayg gnwsnwsnta ygtntggtty ttygaygtnt ggggngcngg nacnacngtn 360 acngtnwsnw snggnwsnac nwsnggnwsn ggnaarccng gnwsnggnga rggnwsncar 420 athgtnytnw sncarwsncc nacnathytn wsngcnwsnc cnggngaraa rgtnacnatg 480 acntgymgng cnwsnwsnws ngtnwsntay atggaytggt aycarcaraa rccnggnwsn 540 wsnccnaarc cntggathta ygcnacnwsn aayytngcnw snggngtncc ngcnmgntty 600 wsnggnwsng gnwsnggnac nwsntaywsn ytnacnathw snmgngtnga rgcngargay 660 gcngcnacnt aytaytgyca rcartggath wsnaayccnc cnacnttygg ngcnggnacn 720 aarytngary tnaargartt yccnaarccn wsnacnccnc cnggnwsnws nggnggngcn 780 ccnggnathy tnggnttygt nttyacnytn aargarttya cnytngaytt ywsnacngcn 840 aaracntayg tngaywsnyt naaygtnath mgnwsngcna thggnacncc nytncaracn 900 athwsnwsng gnggnacnws nytnytnatg athgaywsng gnwsnggnga yaayytntty 960 gcngtngayg tnmgnggnat hgayccngar garggnmgnt tyaayaayyt nmgnytnath 1020 gtngarmgna ayaayytnta ygtnacnggn ttygtnaaym gnacnaayaa ygtnttytay 1080 mgnttygcng ayttywsnca ygtnacntty ccnggnacna cngcngtnac nytnwsnggn 1140 gaywsnwsnt ayacnacnyt ncarmgngtn gcnggnathw snmgnacngg natgcarath 1200 aaymgncayw snytnacnac nwsntayytn gayytnatgw sncaywsngg nacnwsnytn 1260 acncarwsng tngcnmgngc natgytnmgn ttygtnacng tnacngcnga rgcnytnmgn 1320 ttymgncara thcarmgngg nttymgnacn acnytngayg ayytnwsngg nmgnwsntay 1380 gtnatgacng cngargaygt ngayytnacn ytnaaytggg gnmgnytnws nwsngtnytn 1440 ccngaytayc ayggncarga ywsngtnmgn gtnggnmgna thwsnttygg nwsnathaay 1500 gcnathytng gnwsngtngc nytnathytn aaytgycayc aycaygcnws nmgngtngcn 1560 mgn 1563 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 18 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 19 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 20 Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro 1 5 10 15 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 21 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 22 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 23 Ala Gln Leu Arg Pro Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 24 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 25 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 25 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140 His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190 Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile 210 215 220 Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240 Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255 Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His 260 265 270 Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg 275 280 285 Arg Thr Ile Ser Ser 290 <210> 26 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 26 Asp Glu Phe Thr Val Asp Phe Ser Ser Gln Lys Ser Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Ser Ile Arg Ser Ala Ile Ser Thr Pro Leu Gly Asn Ile Ser 20 25 30 Gln Gly Gly Val Ser Val Ser Val Ile Asn His Val Leu Gly Gly Asn 35 40 45 Tyr Ile Ser Leu Asn Val Arg Gly Leu Asp Pro Tyr Ser Glu Arg Phe 50 55 60 Asn His Leu Arg Leu Ile Met Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Ala Gly 65 70 75 80 Phe Ile Asn Thr Glu Thr Asn Ile Phe Tyr Arg Phe Ser Asp Phe Ser 85 90 95 His Ile Ser Val Pro Asp Val Ile Thr Val Ser Met Thr Thr Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Ser Ser Leu Gln Arg Ile Ala Asp Leu Glu Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Gly Arg His Ser Leu Val Gly Ser Tyr Leu Asp Leu Met Glu 130 135 140 Phe Arg Gly Arg Ser Met Thr Arg Ala Ser Ser Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Ile Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Pro Ala Leu Ser Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Thr Met Thr 180 185 190 Ala Gln Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Ile Ser Asn Val 195 200 205 Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Glu Gly Val Arg Ile Gly Arg Ile Ser 210 215 220 Phe Asn Ser Leu Ser Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Val Ile Leu Asn 225 230 235 240 Cys His Ser Thr Gly Ser Tyr Ser Val Arg Ser Val Ser Gln Lys Gln 245 250 255 Lys Thr Glu Cys Gln Ile Val Gly Asp Arg Ala Ala Ile Lys Val Asn 260 265 270 Asn Val Leu Trp Glu Ala Asn Thr Ile Ala Ala Leu Leu Asn Arg Lys 275 280 285 Pro Gln Asp Leu Thr Glu Pro Asn Gln 290 295 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 28 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 10 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 29 Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5

Claims (64)

  1. a) 면역글로불린-형 결합 영역을 포함하고 CD20의 세포외 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 CD20 결합 영역; 및
    b) (i) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 75 내지 251번 아미노산;
    (ii) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 241번 아미노산;
    (iii) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 251번 아미노산; 및
    (iv) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 261번 아미노산;
    으로부터 선택된 하나의 서열과 적어도 85% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 시가 독소 효과기 폴리펩타이드;
    를 포함하는 CD20-결합 단백질로서,
    상기 CD20-결합 단백질을 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포에 투여하면 상기 CD20-결합 단백질이 6시간 이내에 상기 세포 속으로 신속한 세포 내재화(cellular internalization)를 초래하고;
    상기 CD20-결합 단백질이 단독-다량체(homo-multimer)또는 이종-다량체(hetero-multimer)인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  2. a) 면역글로불린-형 결합 영역을 포함하고 CD20의 세포외 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 CD20 결합 영역; 및
    b) (i) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 75 내지 251번 아미노산;
    (ii) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 241번 아미노산;
    (iii) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 251번 아미노산; 및
    (iv) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 261번 아미노산;
    으로부터 선택된 하나의 서열과 적어도 85% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 시가 독소 효과기 폴리펩타이드;
    를 포함하는 CD20-결합 단백질로서,
    상기 CD20-결합 단백질을 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포에 투여하면 상기 CD20-결합 단백질이 6시간 이내에 상기 세포 속으로 신속한 세포 내재화(cellular internalization)를 초래하고;
    상기 CD20-결합 단백질이 약학적으로 허용가능한 용매화물(solvate) 또는 염(salt)인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  3. 서열번호 4, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16에서 나타난 서열과 적어도 85% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 그 폴리펩타이드 만으로 이루어지는 CD20-결합 단백질로서,
    상기 CD20-결합 단백질이 CD20-결합 활성을 갖고; 상기 CD20-결합 단백질을 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포에 투여하면 상기 CD20-결합 단백질이 6시간 이내에 상기 세포 속으로 신속한 세포 내재화(cellular internalization)를 초래하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 단독-다량체(homo-multimer) 또는 이종-다량체(hetero-multimer)인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 약학적으로 허용가능한 용매화물(solvate) 또는 염(salt)인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  6. 제3항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 세포독성, 효소적 촉매작용 또는 소세포 경로설정(subcellular routing) 중에서 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 CD20 결합 영역과 시가 독소 효과기 폴리펩티드 사이에 링커(linker)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 1 시간 이내에 세포내로 세포 내재화를 할 수 있는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CD20-결합 영역이 상보성 결정 영역 3 단편, 구속된 FR3-CDR3-FR4 폴리펩타이드, 단일-도메인 항체 단편, 단일-쇄 가변성 단편, 항체 가변성 단편, 항원-결합 단편, Fd 단편, 피브로넥틴-유도 제10 피브로넥틴형 III 도메인, 테낙신 제III형 도메인, 안키린 반복체 모티프 도메인, 저-밀도-지단백질-수용체-유도 A-도메인, 리포칼린, 쿠니츠 도메인(Kunitz domain), 단백질-A-유도 Z 도메인, 감마-B 결정성-유도 도메인, 유비퀴틴-유도 도메인, Sac7d-유도 폴리펩타이드, Fyn-유도 SH2 도메인, 및 CD20-결합 기능을 보유한 전술한 어느 하나의 유전적으로 조작된 대응물로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질을 상기 세포에 투여하면 상기 CD20-결합 단백질이 6시간 이내 또는 1시간 이내에 세포의 상기 표면에서 천연적으로 존재하는 CD20의 신속한 세포 내재화(cellular internalization)를 유도하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 B-세포 계통의 구성원인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질을 상기 세포에 투여하면 상기 세포의 사멸을 유발하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 구성원이 CD20을 발현하지 않는 제2 세포 집단에 비교해서 구성원이 CD20을 발현하는 제1 세포 집단에서 적어도 3배 이상인 세포독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시가 독소 효과기 폴리펩타이드가
    (i) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 75 내지 251번 아미노산;
    (ii) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 241번 아미노산;
    (iii) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 251번 아미노산; 및
    (iv) 서열번호 1, 서열번호 25, 또는 서열번호 26의 1 내지 261번 아미노산;
    의 폴리펩티드 서열을 포함하거나 그 폴리펩티드 서열만으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 CD20 결합 영역이:
    a) 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인, 및 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 ll 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인;
    b) 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인, 및 서열번호 24, 서열번호 10, 및 서열번호 11 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인; 또는
    c) 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 27 각각에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인, 및 서열번호 28, 서열번호 10, 및 서열번호 29 각각에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인;
    으로 이루어지는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  16. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 시가 독소 효과기 폴리펩타이드가 상기 시가 독소 효과기 폴리펩타이드의 효소 활성을 변화시키는 시가 독소 계열의 구성원의 천연적으로 존재하는 A 소단위에 대한 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 적어도 하나의 아미노산 잔기 결실 또는 치환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 CD20 결합 영역이 서열번호 4, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16에서 나타난 폴리펩타이드를 포함하거나 그 폴리펩타이드 만으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CD20 결합 영역이 서열번호 4에 나타낸 폴리펩타이드를 포함하거나 그 폴리펩타이드만으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 추가의 외인성 물질을 추가로 포함하고, 그럼으로써 상기 CD20-결합 단백질을 CD20 발현 세포에 투여 시, 상기 CD20-결합 단백질이 상기 추가의 외인성 물질을 상기 세포 속으로 전달할 수 있는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 외인성 물질이 펩타이드, 단백질, 또는 핵산인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 외인성 물질이 효소, 리보핵산, 또는 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항원이 세균 단백질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 상기 항원이 암 속에서 돌연변이된 단백질 또는 암에서 비정상적으로 발현된 단백질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  24. 제21항에 있어서, 상기 항원이 T-세포 상보성 결정 영역인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  25. 제21항에 있어서, 상기 항원이 상기 CD20-결합 영역과 시가 독소 효과기 폴리펩타이드 사이의 단백질 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  26. 제21항에 있어서, 상기 항원이 바이러스 단백질로부터인 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항원이 서열번호 3에 나타난 상기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나 그 펩타이드만으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 CD20-결합 단백질.
  28. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중의 어느 한 항에 따른 CD20-결합 단백질을 암호화할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
  29. 제8항에 따른 CD20-결합 단백질을 암호화할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
  30. 제15항에 따른 CD20-결합 단백질을 암호화할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
  31. 제17항에 따른 CD20-결합 단백질을 암호화할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
  32. 제28항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  33. 제28항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  34. 제32항의 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  35. 제31항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  36. 제31항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  37. 제35항의 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  38. 6시간 이내에 CD20-발현 세포내로의 CD20-결합 단백질의 세포 내재화를 신속하게 유도하는 시험관내 방법에 있어서,
    상기 방법이 상기 세포를 제1항 내지 제4항 및 제6항 중의 어느 한 항의 CD20-결합 단백질과 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 1시간 이내에 CD20-발현 세포내로 내재화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 외인성 물질을 CD20-발현 세포 속으로 전달하는 시험관내 방법에 있어서,
    상기 방법은 상기 세포를 제1항 내지 제4항 및 제6항 중의 어느 한 항의 CD20-결합 단백질과 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 CD20-발현 세포가 B-세포 계통, 흑색종 세포 또는 신생물 조혈 세포의 종양 구성원인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. CD20-발현 세포를 사멸시키는 시험관내 방법에 있어서,
    상기 방법은 상기 세포를 제1항 내지 제4항 및 제6항 중의 어느 한 항의 CD20-결합 단백질과 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 세포에 상기 CD20-결합 단백질 투여 시, 상기 CD20-결합 단백질은 상기 세포의 사멸을 유발할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 CD20-발현 세포가 B-세포 계통, 흑색종 세포 또는 신생물 조혈세포의 종양 구성원인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 CD20-결합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 질병, 장애, 또는 상태를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질병, 장애, 또는 상태가 암, 종양, 또는 면역질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  45. 제8항의 CD20-결합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 질병, 장애, 또는 상태를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질병, 장애, 또는 상태가 암, 종양, 또는 면역질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  46. 제14항의 CD20-결합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 질병, 장애, 또는 상태를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질병, 장애, 또는 상태가 암, 종양, 또는 면역질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  47. 제15항의 CD20-결합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 질병, 장애, 또는 상태를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질병, 장애, 또는 상태가 암, 종양, 또는 면역질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  48. 제17항의 CD20-결합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 질병, 장애, 또는 상태를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질병, 장애, 또는 상태가 암, 종양, 또는 면역질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  49. 제44항에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체가 생리학적으로 허용가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 등장화제, 흡수 지연제, 멸균 수용액 또는 분산액, 또는 멸균 분말이고; 또는 상기 약학적으로 허용가능한 담체가 물, 알콜, 폴리올 및 이들의 혼합물과 같은 수성 또는 비-수성 담체; 식물성 기름; 또는 에틸올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 방부제, 습윤제, 유화제 또는 분산제와 같은 보조제; 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 또는 소르브산과 같은 항균제 또는 항곰팡이제; 설탕, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리 알콜, 또는 염화나트륨과 같은 등장화제; 모노스테아르산 알루미늄 또는 젤라틴과 같은 흡수 지연제; 레시틴과 같은 코팅제; 약학적으로 허용가능한 항산화제; 계면활성제; 완충제; 및 안정제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 항산화제가 아스코르빈산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설파이트, 또는 나트륨 설파이트와 같은 수용성 항산화제; 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 레시틴, 프로필갈레이트, 또는 알파-토코페롤과 같은 유용성(oil-soluble) 산화 방지제; 또는 구연산, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 소르비톨, 타르타르산, 또는 인산과 같은 금속 킬레이트제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  53. 제44항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 서열번호 4에 제시된 폴리펩타이드를 포함하거나 그 폴리펩타이드만으로 이루어지고, 상기 약학 조성물이 시트르산 완충액, 프로필렌 글리콜, 및 설탕 또는 소르비톨로부터 선택된 등장화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  54. 제44항에 있어서, 경구, 직장 또는 비강 투여용으로 제제되거나, 또는 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 또는 경피 투여와 같은 비경구 투여용으로 제제되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  55. 제44항에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 상태가 암 세포, 종양 세포, 또는 세포 표면상에 CD20을 발현하는 면역 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  56. 제44항에 있어서, 상기 암 또는 종양이 골암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 및 골수종으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 상태이거나; 또는 상기 면역 장애가 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 하시모토 갑상선염, 용혈성 요독 증후군, HIV-관련 질환, 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 다염, 건선, 건선 관절염, 류마티스성 관절염, 경피증, 패혈성 쇼크, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 및 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 상태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  57. 제48항에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체가 생리학적으로 허용가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 등장화제, 흡수 지연제, 멸균 수용액 또는 분산액, 또는 멸균 분말이고; 또는 상기 약학적으로 허용가능한 담체가 물, 알콜, 폴리올 및 이들의 혼합물과 같은 수성 또는 비-수성 담체; 식물성 기름; 또는 에틸올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 방부제, 습윤제, 유화제 또는 분산제와 같은 보조제; 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 또는 소르브산과 같은 항균제 또는 항곰팡이제; 설탕, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리 알콜, 또는 염화나트륨과 같은 등장화제; 모노스테아르산 알루미늄 또는 젤라틴과 같은 흡수 지연제; 레시틴과 같은 코팅제; 약학적으로 허용가능한 항산화제; 계면활성제; 완충제; 및 안정제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 항산화제가 아스코르빈산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설파이트, 또는 나트륨 설파이트와 같은 수용성 항산화제; 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 레시틴, 프로필갈레이트, 또는 알파-토코페롤과 같은 유용성(oil-soluble) 산화 방지제; 또는 구연산, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 소르비톨, 타르타르산, 또는 인산과 같은 금속 킬레이트제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  61. 제48항에 있어서, 상기 CD20-결합 단백질이 서열번호 4에 제시된 폴리펩타이드를 포함하거나 그 폴리펩타이드만으로 이루어지고, 상기 약학 조성물이 시트르산 완충액, 프로필렌 글리콜, 및 설탕 또는 소르비톨로부터 선택된 등장화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  62. 제48항에 있어서, 경구, 직장 또는 비강 투여용으로 제제되거나, 또는 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 또는 경피 투여와 같은 비경구 투여용으로 제제되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  63. 제48항에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 상태가 암 세포, 종양 세포, 또는 세포 표면상에 CD20을 발현하는 면역 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  64. 제48항에 있어서, 상기 암 또는 종양이 골암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 및 골수종으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 상태이거나; 또는 상기 면역 장애가 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 하시모토 갑상선염, 용혈성 요독 증후군, HIV-관련 질환, 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 다염, 건선, 건선 관절염, 류마티스성 관절염, 경피증, 패혈성 쇼크, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 및 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 상태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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