CN105051067B - 用于引起细胞内化的cd20结合免疫毒素及其使用方法 - Google Patents

用于引起细胞内化的cd20结合免疫毒素及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供与CD20抗原结合并且将其从细胞表面位置快速内化至细胞内部的CD20结合蛋白。本发明的CD20结合蛋白包含CD20结合区和志贺菌毒素效应子区。某些公开的CD20结合蛋白杀伤在其表面表达CD20的细胞。此外，本发明公开的CD20结合蛋白可以包含另外的外源物质并且能够将这些另外的外源物质靶向递送至表达CD20的细胞的内部。此类另外的物质可以包括肽、抗原、酶和多核苷酸。这些CD20结合蛋白具有在下列各项中的用途：将其本身内化的方法，表达CD20的细胞的靶向杀伤，将外源物质递送至表达CD20的细胞中，以及治疗多种与表达CD20的细胞有关的疾病，如癌症和免疫病症。

Description

用于引起细胞内化的CD20结合免疫毒素及其使用方法
发明领域
本发明涉及具有结合CD20抗原并且驱使CD20抗原从细胞表面位置向细胞内部快速内化的能力的CD20结合蛋白。这些CD20结合蛋白具有作为用于治疗包括癌症和免疫病症在内的多种疾病的治疗性分子的用途。
发明背景
免疫毒素是将细胞表面结合区如免疫球蛋白结构域与通常源于天然存在的蛋白毒素的毒素区如在细菌或植物中发现的那些结合的嵌合分子。免疫毒素的效力主要取决于其从细胞表面向细胞溶质运输的效率，即始于细胞内化的过程(参见Pirie C等人,J BiolChem 286:4165-72(2011))。
CD20是包括至少26种人和小鼠中的蛋白的被称为跨膜4A(MS4A)家族的多肽家族的成员(Ishibashi K等人,Gene 264:87-93(2001))。对于所有MS4A成员来说，CD20序列预示了形成四次跨膜的跨膜分子的三个疏水区，即确信为对其功能最重要的结构特性。还预示了所提出的第三和第四跨膜结构域与细胞内氨基和羧基末端区域之间的单一细胞外环(Tedder T等人,Proc Natl Acad Sci 85:208-12(1988))。在这个大约40个氨基酸的细胞外环中，大多数抗CD20单克隆抗体(mAbs)，如利妥昔单抗(rituximab)，据信与最重要的残基丙氨酸-170和脯氨酸-172结合。利用CD20的氨基酸163-187的结合CD20的肽片段的抗体的晶体结构已经确认了氨基酸170(丙氨酸)至氨基酸173(丝氨酸)作为针对用于利妥昔单抗(rituximab)和CD20的抗原-抗体相互作用位点(Du J等人,J Biol Chem 282:15073-80(2007))。
据信CD20作为同多聚体(可能是四聚体)存在于细胞表面上，并且电子显微镜已经显示，90％的复合CD20存在于脂筏和微绒毛中的膜中(Li H等人,J Biol Chem 279:19893-901(2004))。脂筏是在细胞质膜中发现的具有高多肽、鞘脂、和胆固醇浓度的微结构域(Brown D,London E,Annu Rev Cell Dev Biol 14:111-36(1998))。微绒毛、或微绒毛通道是自细胞质膜表面的细胞延伸(Reaven E等人,J Lipid Res 30:1551-60(1989))。一些针对CD20的抗体已知仅当分子存在于脂筏中时结合如FMC7(Polyak M等人,Leukemia17:1384-89(2003))，并且其他抗体，如利妥昔单抗，已知增加CD20与筏的结合(Li H等人,见上文)。假设的是，对于所提出的CD20作为通过通常位于脂筏中并且发现与CD20多聚体有关的另一种蛋白B细胞抗原受体(BCR)转换的钙信号的放大器的功能，筏结合是重要的(PolyakM等人,J Biol Chem 283:18545-52(2008))。
靶向CD20抗原的基于抗体的治疗有很多(综述参见Boross P,Leusen J,Am JCancer Res 2:676-90(2012))。作为用于基于在其中治疗物留在细胞表面上从而发挥功能的机制的治疗的靶标的CD20的吸引人的特性之一是在被基于抗体的治疗物结合之后的CD20细胞内化的缺乏(Anderson K等人,Blood 63:1424-33(1984)；Press O等人,Blood69:584-91(1987))。尽管这被证实既是细胞类型特异的又是抗体类型特异的，通常，CD20似乎以比其他细胞表面抗原低得多的速率内化(Beers S等人,Sem Hematol 47:107-14(2010))。
因为通常发现CD20不容易内化，在本领域中，对于CD20抗原作为用于需要在结合之后将治疗物内化至靶标细胞中从而变得有效的治疗的靶标的用途来说，存在问题(Anderson K等人,Blood 63:1424-33(1984)；Press O等人,Blood 69:584-91(1987)；Beers S等人,Sem Hematol 47:107-14(2010))。因此，在用因功效而需要细胞内化的免疫球蛋白型治疗物来靶向CD20抗原中，存在未解决的问题——如何在结合之后将结合了CD20的治疗物驱使至靶标细胞的内部中。例如，基于不足的CD20内化效率，预测基于靶向CD20抗原的免疫毒素的递送的治疗是无效的。因此，在本领域中需要开发有效的组合物、治疗物和治疗方法，其靶向不以有效速率自然内化或在由免疫球蛋白型结构域结合后不自然内化的细胞表面抗原，如CD20。
特别地，在本领域中仍需要确定和开发引发与CD20结合的组合物的复合物的快速且有效的细胞内化的CD20靶向组合物。例如，对于开发靶向B细胞谱系细胞的有效的癌症和免疫调节治疗分子来说，包含引起天然CD20分子细胞内化的源于毒素的区域的细胞毒性CD20结合蛋白是合乎需要的。
发明概述
本发明提供多种用于引起CD20的快速细胞内化的CD20结合蛋白，其包含1)CD20结合区，如免疫球蛋白结构域，以及2)志贺菌毒素效应子区，如SLT-1A的截短物(truncation)。在结合细胞表面上的CD20抗原后，本发明的CD20结合蛋白能够引起包含CD20结合蛋白和CD20抗原的复合物向真核细胞内部中的快速细胞内化。CD20结合区与源于志贺菌毒素亚基A的多肽的连接实现了能够引起天然表达的CD20的快速细胞内化、并且能够将另外的外源物质递送至表达CD20的细胞内部中的基于细胞毒性志贺菌毒素的分子的改造。本发明的CD20结合蛋白具有下列用途：例如，CD20阳性细胞类型的靶向杀伤，递送外源物质，作为诊断剂，以及作为用于治疗患者中的多种病症如癌症、肿瘤以及与B细胞谱系有关的免疫病症的治疗物。
本发明的CD20结合蛋白包含：(a)CD20结合区，所述CD20结合区包含免疫球蛋白型结合区并且能够特异性结合CD20的细胞外部分，以及(b)志贺菌毒素效应子区，所述志贺菌毒素效应子区包含源于志贺菌毒素家族中的至少一个成员的A亚基的氨基酸序列的多肽；其中在将所述CD20结合蛋白施用至在细胞表面上表达CD20的细胞后，所述CD20结合蛋白能够引起包含与CD20结合的CD20结合蛋白的蛋白复合物的快速的细胞内化。
对于本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案来说，CD20结合区包含免疫球蛋白型结合区，所述免疫球蛋白型结合区包含选自由下列各项组成的组的多肽：互补决定区3片段、受约束的FR3-CDR3-FR4多肽、单结构域抗体片段、单链可变片段、抗体可变片段、抗原结合片段、Fd片段、源于纤连蛋白的第10纤连蛋白III型结构域、生腱蛋白III型结构域、锚蛋白重复基序结构域、源于低密度脂蛋白受体的A结构域、脂质运载蛋白、Kunitz结构域、源于蛋白A的Z结构域、源于γ-B晶体的结构域、源于泛素的结构域、源于Sac7d的多肽、源于Fyn的SH2结构域、改造的模拟抗体(antibody mimic)、以及保持CD20结合功能的任何前述各项的任何遗传操作的对应物。
对于某些实施方案来说，CD20结合蛋白能够引起天然存在于细胞表面上的CD20的快速细胞内化。在某些另外的实施方案中，CD20结合蛋白能够在小于约一小时内引起天然存在于细胞表面上的CD20的细胞内化。在某些另外的实施方案中，CD20结合蛋白能够在小于约一小时内引起天然存在于B细胞谱系成员的表面上的CD20的细胞内化。
对于某些实施方案来说，在将CD20结合蛋白施用至在细胞表面上表达CD20的细胞后，CD20结合蛋白能够引起所述细胞的死亡。在某些其他实施方案中，CD20结合蛋白包含缺乏催化活性并且不能够引起细胞死亡的志贺菌毒素效应子区。
对于某些实施方案来说，在将CD20结合蛋白施用至其成员表达CD20的第一群细胞以及其成员不表达CD20的第二群细胞后，相对于所述第二群细胞的成员，CD20结合蛋白对所述第一群细胞的成员的细胞毒性作用至少大3倍。
对于某些实施方案来说，CD20结合蛋白包含志贺菌毒素效应子区，所述志贺菌毒素效应子区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:25、或SEQ ID NO:26的氨基酸75至251或者基本上由其组成。另外的实施方案是这样的CD20结合蛋白，其中志贺菌毒素效应子区包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:25、或SEQ ID NO:26的氨基酸1至241；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:25、或SEQ ID NO:26的氨基酸1至251；和/或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:25、或SEQ ID NO:26的氨基酸1至261，或者基本上由其组成。
对于某些实施方案来说，CD20结合蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、或SEQ ID NO:16的氨基酸，或者基本上由其组成。
在某些实施方案中，CD20结合蛋白包含CD20结合区，所述CD20结合区包含：(a)包含如分别在SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变结构域；(b)包含如分别在SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:23中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变结构域；或(c)包含如分别在SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:27中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:29中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域。另外的实施方案是这样的CD20结合蛋白，其包含免疫球蛋白型结合区，所述免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:4的氨基酸2-245或者基本上由其组成。另外的实施方案是这样的CD20结合蛋白，其包含免疫球蛋白型结合区和志贺菌毒素效应子区，所述免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:4的氨基酸2-245或者基本上由其组成的，所述志贺菌毒素效应子区包含SEQ ID NO:1的氨基酸75-251或者基本上由其组成。另外的实施方案是包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:16或者基本上由其组成的CD20结合蛋白。
在某些实施方案中，CD20结合蛋白包含志贺菌毒素效应子区，所述志贺菌毒素效应子区包含相对于志贺菌毒素家族成员的天然存在的A亚基的突变，所述突变改变志贺菌毒素效应子区的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失或置换。
CD20结合蛋白的某些实施方案还可以用于将另外的外源物质递送至在细胞表面上表达CD20的细胞中。这些实施方案包括CD20结合区，所述CD20结合区包含：(a)能够特异性结合CD20分子的细胞外部分的免疫球蛋白型多肽，(b)志贺菌毒素效应子区，所述志贺菌毒素效应子区包含源于志贺菌毒素家族中的至少一成员的氨基酸序列的多肽，以及(c)另外的外源物质；其中在将所述CD20结合蛋白施用至在细胞表面上表达CD20的细胞后，所述CD20结合蛋白能够引起包含与CD20结合的CD20结合蛋白的蛋白复合物的快速的细胞内化并且能够将另外的外源物质递送至所述细胞的内部。在某些另外的实施方案中，所述CD20结合蛋白包含CD20结合区，所述CD20结合区包含：(a)包含如分别在SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、和SEQ ID NO:8中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变结构域；或(b)包含如分别在SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、和SEQID NO:23中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变结构域；或(c)包含如分别在SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:27中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，和包含如分别在SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:29中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域。
在某些实施方案中，另外的外源物质选自由下列各项组成的组：肽、多肽、蛋白质、和多核苷酸。在某些实施方案中，另外的外源物质包含包括酶在内的蛋白质或多肽。在某些其他实施方案中，另外的外源物质是核酸，如，例如充当小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)的核糖核酸。
在某些实施方案中，另外的外源物质是肽并且该肽是抗原。在某些实施方案中，另外的外源物质是源于细菌蛋白的抗原。在某些其他实施方案中，所述抗原源于癌症中突变的蛋白。另外的实施方案是这样的实施方案，其中所述抗原源于癌症中异常表达的蛋白。再另外的实施方案是这样的实施方案，其中所述抗原源于T细胞互补决定区。
对于某些实施方案来说，所述抗原作为多肽融合的部分而被包含在CD20结合蛋白中，其中肽抗原位于单链蛋白的结合区和毒素效应子区之间。在某些实施方案中，另外的外源物质是源于病毒蛋白的抗原。在某些实施方案中，抗原包含SEQ ID NO:3或者基本上由其组成，即流感基质(influenza Matrix)58-66抗原。在某些另外的实施方案中，CD20结合蛋白包含SEQ ID NO:16或者基本上由其组成。
本发明还包括包含本发明的CD20结合蛋白和至少一种药用赋形剂或载体的药物组合物；以及这种细胞毒性蛋白或包含其的组合物在如在本文中进一步描述的本发明的方法中的用途。
本发明还提供编码本发明的CD20结合蛋白的多核苷酸，包含本发明的多核苷酸的表达载体，以及包含本发明的表达载体的宿主细胞。
此外，本发明提供了快速引起本发明的CD20结合蛋白到表达CD20的细胞中的细胞内化的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的CD20结合蛋白或其药物组合物接触的步骤。类似地，本发明提供了在患者中将被CD20结合蛋白结合的位于细胞表面的CD20内化的方法，所述方法包括向所述患者施用本发明的CD20结合蛋白或药物组合物的步骤。
此外，本发明提供了杀伤表达CD20的细胞的方法，所述方法包括在体外或体内使所述细胞与本发明的CD20结合蛋白或药物组合物接触。
此外，本发明提供了用于将外源物质递送至细胞内部的方法，所述方法包括在体外或体内使所述细胞与本发明的CD20结合蛋白或药物组合物接触。
本发明还提供了用于将外源物质递送至患者中的细胞内部的方法，其中所述细胞在其表面上表达CD20，所述方法包括向患者施用本发明的CD20结合蛋白的步骤。
此外，本发明了杀伤细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的CD20结合蛋白或本发明的药物组合物接触的步骤。在细胞杀伤方法的某些实施方案中，使细胞接触的步骤在体外发生。在某些其他实施方案中，使细胞接触的步骤在体内发生。
此外，本发明提供了治疗患者中疾病、病症、或病况的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的CD20结合蛋白或本发明的药物组合物的步骤。在治疗方法的某些实施方案中，要使用本发明的这种方法治疗的疾病、病症、或病况涉及在细胞表面上表达CD20的细胞或细胞类型，如，例如，癌细胞、肿瘤细胞、或免疫细胞。另外的实施方案是治疗涉及与选自由下列各项组成的组的疾病有关的癌或肿瘤细胞的疾病的方法：骨癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、或骨髓瘤(myeloma)。在该方法的某些实施方案中，所述病症是与选自由下列各项组成的组的疾病有关的免疫病症：淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘(asthma)、克罗恩病(Crohn’s disease)、糖尿病(diabetes)、移植排斥(graft rejection)、移植物抗宿主病(graft-vs.-host disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremicsyndrome)、HIV相关疾病、红斑狼疮(lupus erythematosus)、多发性硬化(multiplesclerosis)、多动脉炎(polyarteritis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriaticarthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、感染性休克(septic shock)、舍格伦综合征(Sjorgren’s syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、和血管炎(vasculitis)。
在本发明的某些实施方案中的是本发明的CD20结合蛋白在制造用于治疗或预防癌症或免疫病症的药物中的用途。在本发明的某些实施方案中的是细胞毒性蛋白或包含所述蛋白的药物组合物，其用于治疗或预防癌症、肿瘤、或免疫病症。
就以下描述、所附权利要求、和附图而言，本发明的这些和其他特征、方面和优点将会变得更好理解。在下文中，可以自由地组合或移除本发明的前述要素以便做出其他实施方案，而无需拒绝这种组合或移除的陈述。
附图简述
图1示出了本发明的示例性CD20结合蛋白的一般结构。
图2通过图表示出了在播散性(disseminated)Raji-luc异种移植模型中施用αCD20scFv::SLT-1A版本1和αCD20scFv::SLT-1A版本2的情况下的全身荧光(total bodyluminescence)的变化。
图3通过图表示出了在施用αCD20scFv::SLT-1A版本1和αCD20scFv::SLT-1A版本2的情况下的Raji-luc异种移植模型小鼠的增加的存活。
图4通过图表示出了在Raji皮下异种移植模型中施用αCD20scFv::SLT-1A版本1和αCD20scFv::SLT-1A版本2的情况下的肿瘤体积的变化。
图5示出了在非人灵长动物研究中在施用αCD20scFv::SLT-1A版本1的情况下的B细胞缺失(depletion)。具体地，分析了表达CD21的CD20+B细胞的子集。
图6示出了在非人灵长动物研究中在施用αCD20scFv::SLT-1A版本1的情况下的B细胞缺失。具体地，分析了不表达CD21的CD20+B细胞的子集。
发明详述
在下文中利用说明性、非限制性的实施方案以及参照附图更充分地描述了本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施并且不应被理解为限于以下给出的实施方案。相反，提供这些实施方案以使本公开对本领域技术人员来说更透彻并且表达本发明的范围。
为了可以更容易地理解本发明，以下定义某些术语。在发明详述中可以发现另外的定义。
如在说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文明确地另外指出，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指代二者。
如在说明书和所附权利要求中使用的，当提及两个物种A和B时，术语“和/或”意指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求中使用的，当提及大于两个物种如A、B、和C时，术语“和/或”意指A、B、或C中的至少一种，或A、B、或C的任何组合中的至少一种(每个物种存在单个或多个的可能性)。
在整个本说明书中，词语“包含(comprise)”或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包含所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组，但是不排除任何其他整数(或组分)或整数(或组分)的组。
在整个本说明书中，使用术语“包括”表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换地使用。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对结合至蛋白质、多肽、或肽中的氨基酸的指代。术语“多肽”包括任何氨基酸或氨基酸残基的聚合物。术语“多肽序列”是指实质上组成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白质”是包含一条或多条多肽链的大分子。“肽”是尺寸小于总计15-20个氨基酸残基的小多肽。
除非另外限定，术语“氨基酸”、“氨基酸残基”或多肽序列包括天然存在的氨基酸，也包括以类似方式起与天然存在的氨基酸的作用的已知的天然氨基酸的类似物。如下表A中的简写名称来描述在本文中提及的氨基酸：
表A.氨基酸命名
名称 3字母 1字母
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸或天冬氨酸盐 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸或谷氨酸盐 Glu E
谷氨酰胺 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
对于多肽来说，短语“保守性置换”是指基本上不改变整体多肽的功能和结构的氨基酸组成的变化(参见Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(蛋白质：结构与分子性质)(W.H.Freeman and Company,纽约(第二版,1992))。
如在本文中所使用的，术语“表达(expressed)”、“表达(expressing)”或“表达(expresses)”是指多核苷酸或核酸翻译为多肽或蛋白质。表达的多肽或蛋白质可以保持在细胞内，成为细胞表面膜的组分，或者被分泌至细胞外空间。
如在本文中所使用的，符号“α”是能够与该符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区的简写。符号“α”用于基于其与该符号后的生物分子结合的能力指示免疫球蛋白型结合区的功能特性。
对于CD20结合蛋白的细胞毒性活性来说，术语“选择性细胞毒性”是指靶向的细胞群和非靶向的旁观者细胞群之间的相对细胞毒性水平，其可以被表示为靶向的细胞类型的半最大细胞毒性浓度(CD50)与非靶向的细胞类型的CD50之比，以显示靶向的细胞类型的细胞杀伤的优先性。
对于本发明的目的来说，术语“效应子”意指提供生物活性，如细胞毒性、生物信号传导、酶催化、亚细胞行程(subcellular routing)、和/或引起因子募集和/或变构效应的分子间结合。
对于本发明的目的来说，短语“源于”意指多肽区包含最初在蛋白质中发现的氨基酸序列并且现在可以包含原始序列的增加、缺失、截短、或其他变化形式以使整体功能和结构基本保守。
引言
因为源于志贺菌毒素亚基A的效应子区引起CD20的细胞内化，本发明解决了改造靶向需要细胞内化以发挥功能的CD20的治疗物的问题。本发明提供与细胞外CD20抗原结合并且将CD20从细胞膜位置快速内化至细胞内部的CD20结合蛋白。某些公开的CD20结合蛋白杀伤在其表面表达CD20的细胞。某些公开的CD20结合蛋白能够将另外的外源物质以分子货物(molecular cargo)的形式精确递送至在其表面上表达CD20的细胞的内部。本发明扩展了免疫毒素药物靶标的范围从而包括CD20并且实现了有效负载(payloads)向表达CD20的细胞的内部的精确递送。
I.本发明的CD20结合蛋白的一般结构
本发明提供了多种用于选择性杀伤特定细胞类型的CD20结合蛋白，各CD20结合蛋白包含：1)用于细胞靶向的包含免疫球蛋白型结合区的CD20结合区以及2)用于细胞杀伤的志贺菌毒素效应子区。CD20靶向免疫球蛋白型结合区与源于志贺菌毒素亚基A的区域的连接实现了强效志贺菌毒素细胞毒性的细胞类型特异性靶向的改造。这种体系是模块化的，其在于，多种志贺菌毒素效应子区和另外的外源物质可以连接至相同的CD20结合区以提供与表达CD20的细胞有关的多种应用。本发明的CD20结合蛋白包含源于志贺菌毒素家族成员的A亚基的志贺菌毒素效应子区，其连接至可以特异性结合横跨真核细胞的外部细胞膜的CD20分子的至少一个细胞外部分的免疫球蛋白型CD20结合区。这种一般结构是模块化的，其在于，不同的CD20结合区可以在不同位置处或利用其间的不同接头连接至源于志贺菌毒素亚基A的效应子区以产生相同的一般结构的变体(参见，例如，图1)。
A.包含免疫球蛋白型结合区的CD20结合区
对于本发明的目的来说，术语“CD20结合区”是指能够特异性结合CD20分子的细胞外部分的多肽区。尽管名称CD20可以指来自多个物种的具有相关结构和多肽序列的多种蛋白质，但对于本发明的目的来说，术语“CD20”是指在哺乳动物中存在的B淋巴细胞抗原CD20蛋白，其精确序列可以基于同种型以及在个体之间稍微变化。例如，在人中，CD20是指由占优势的多肽序列UnitProt P11836和NCBI编号NP 690605.1表示的蛋白；然而，可以存在不同的同种型和变体。多种CD20蛋白的多肽序列已经描述于多个物种中，如蝙蝠、猫、牛、狗、小鼠、狨猴、和大鼠，并且可以基于遗传同源性通过生物信息学在许多其他物种中预测(例如已经在包括狒狒、猕猴、长臂猿、黑猩猩、和大猩猩在内的多种灵长类动物中预测了CD20)(参见Zuccolo J等人,PLoS One 5:e9369(2010)和NCBI蛋白质数据库(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,U.S.))。技术人员将能够鉴别哺乳动物中的CD20蛋白，即使它与所提及的序列略微不同。
CD20分子的细胞外部分是指当CD20分子天然存在于细胞膜中时其暴露于细胞外环境的结构的部分。在此语境中，暴露于细胞外环境意指CD20分子的部分可例如被下列各项接近：抗体或至少小于抗体的结合部分如单结构域抗体结构域、纳米抗体(nanobody)、源于骆驼科动物或软骨鱼类的重链抗体结构域、单链可变片段、或任何数量的免疫球蛋白的改造的备选构架(scaffold)(参见以下)。部分CD20的暴露可以由技术人员使用在本领域中已知的方法通过经验确定。注意，基于其在CD20内的位置而被预测不能接近细胞外空间中的抗体的CD20的某些部分，经验显示其可被单克隆抗体接近(Teeling J等人,J.Immunol.177:362-71(2006))。
CD20结合区通常源于抗体或类似抗体的结构；然而，来自其他来源的备选构架预期在该术语的范围内。在某些实施方案中，CD20结合区来自源于免疫球蛋白的结合区，如抗体互补位(paratope)。在某些其他实施方案中，CD20结合区包含免疫球蛋白型结合区，所述免疫球蛋白型结合区是并非源于任何免疫球蛋白结构域的改造的多肽。存在许多预期作为本发明中的组分的源于免疫球蛋白的结合区。
本发明的CD20结合蛋白包含含有一种或多种能够选择性且特异性地结合CD20的细胞外部分的多肽的免疫球蛋白型结合区。如在本文中所使用的术语“免疫球蛋白型结合区”是指能够结合一种或多种靶标生物分子，如抗原或表位的多肽区。免疫球蛋白型结合区在功能上通过其与靶标分子结合的能力定义，并且所有本发明的免疫球蛋白型结合区都能够结合CD20。免疫球蛋白型结合区通常源于抗体或类似抗体的结构；然而，来自其他来源的备选构架预期在该术语的范围内。
免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被称为Ig结构域的结构域。Ig结构域的长度范围为约70-110个氨基酸残基并且拥有特征性Ig折叠，其中7至9条反平行β股排列为形成夹心状结构的两个β片。Ig折叠通过夹心内表面上的疏水氨基酸相互作用和股中半胱氨酸残基之间的高度保守二硫键来稳定。Ig结构域可以是可变的(IgV或V组)、恒定的(IgC或C组)或中间的(IgI或I组)。一些Ig结构域可能与也被称为抗原结合区(ABR)的互补决定区(CDR)有关，其对于对其表位的抗体结合的特异性来说是重要的。Ig样结构域也发现于非免疫球蛋白中并且基于此被分类为Ig超家族蛋白的成员。HUGO基因命名委员会(HGNC)提供含有Ig样结构域的家族的成员的清单。
免疫球蛋白型结合区可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中例如借助分子工程或通过文库筛选的选择，所述氨基酸序列已经与天然抗体或非免疫球蛋白的Ig样结构域的氨基酸序列有所不同。由于重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区的产生中的相关性，可以重新设计抗体以获得所需的特征，如较小的尺寸、细胞进入(cellentry)、或其他治疗改进。可能的改变有很多并且范围可以为从仅一个氨基酸的改变到例如可变区的完全重新设计。典型地，将进行可变区的改变以便提高抗原结合特征、提高可变区稳定性、或降低免疫原性应答的可能。
存在许多本发明中预期的结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白型结合区。在某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区源于免疫球蛋白结合区，如能够结合CD20的细胞外部分的抗体互补位。在某些其他实施方案中，免疫球蛋白型结合区包含改造的多肽，所述改造的多肽并非源于任何免疫球蛋白结构域而是通过提供对CD20的细胞外部分的高亲和性的结合而和免疫球蛋白结合区一样地发挥作用。这种改造的多肽可以任选地包括包含来自如本文中所述的免疫球蛋白的互补决定区或者基本上由其组成的多肽构架。
在现有技术中存在许多源于免疫球蛋白的结合区和非免疫球蛋白的改造的多肽，其可用于将本发明的CD20结合蛋白靶向表达CD20的细胞。在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白的免疫球蛋白型结合区选自包括下列各项的组：单结构域抗体结构域(sdAb)、纳米抗体、源于骆驼科动物(camelids)的重链抗体结构域(VHH片段)、二价纳米抗体、源于软骨鱼类的重链抗体结构域、免疫球蛋白新型抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、多聚scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)、双特异性串联scFv片段、二硫键稳定的抗体可变(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH 1结构域组成的二硫键稳定的抗原结合(Fab)片段、二价F(ab’)2片段、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、单链Fv-CH3微抗体(minibody)、双特异性微抗体、二聚CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcabs)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受约束的构架区3、CDR3、构架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块化免疫药物(SMIP)结构域、以及保持其互补位和结合功能的前述各项的任何遗传操作的对应物(综述参见，Weiner L,Cell 148:1081-4(2012)；Ahmad Z等人,Clin Dev Immunol 2012:980250(2012))。
根据某些其他实施方案，本发明的CD20结合蛋白的免疫球蛋白型结合区可以包括免疫球蛋白结构域的改造的备选构架，其展现出类似的功能特征，如对CD20的高亲和性和特异性结合，并且能够改造改进的特征，如更高的稳定性或降低的免疫原性。对于本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案来说，免疫球蛋白型结合区选自包括下列各项的组：改造的源于纤连蛋白的第10纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(单抗体，AdNectinsTM，或AdNexinsTM)；改造的源于生腱蛋白的生腱蛋白III型结构域(CentrynsTM)；改造的含有锚蛋白重复基序的多肽(DARPinsTM)；改造的源于低密度脂蛋白受体的A结构域(LDLR-A)(AvimersTM)；脂质运载蛋白(anticalins)；改造的源于蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域；改造的源于蛋白A的Z结构域(AffibodiesTM)；改造的源于γ-B晶体的构架或改造的源于泛素的构架(Affilins)；源于Sac7d的多肽(
Figure GDA0000798920150000151
或affitins)；改造的源于Fyn的SH2结构域
Figure GDA0000798920150000152
以及改造的模拟抗体以及保持其结合功能的前述各项的任何遗传操作的对应物(
Figure GDA0000798920150000153
A,Plückthun A,J Mol Biol 305:989-1010(2001)；Xu L等人,Chem Biol 9:933-42(2002)；Wikman M等人,Protein Eng Des Sel 17:455-62(2004)；Binz H等人,Nat Biotechnol23:1257-68(2005)；Holliger P,Hudson P,Nat Biotechnol 23:1126-36(2005)；Gill D,Damle N,Curr Opin Biotech 17:653-8(2006)；Koide A,Koide S,Methods Mol Biol352:95-109(2007))。
包括在如在本文中所使用的术语“结合区”内的蛋白构建体的非限制性实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH 1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH 1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的CDR。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，它们可以通过合成的接头重组地连接，产生其中VL和VH结构域组对以形成单价分子的单一蛋白链(其被称为单链Fv(scFv))。最常用的接头是15个残基的(Gly4Ser)3肽，但是在本领域中其他接头也是已知的。单链抗体也预期包括在如在本文中所使用的术语“结合区”内。
还预期，提供结合功能的备选构架在如在本文中所使用的术语“结合区”的范围内。备选构架的一些实例包括双抗体、CDR3肽、受约束的FR3-CDR3-FR4肽、纳米抗体(美国专利申请公开2008/0107601)、二价纳米抗体、小模块化免疫药物(SMIP)、鲨鱼可变IgNAR结构域(WO03/014161)、微抗体以及保持靶标分子结合功能的任何片段或化学或遗传操作的对应物。
如在本文中所使用的“源于抗体的序列”意指其中氨基酸序列已经与天然抗体的氨基酸序列不同的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。由于重组DNA技术在抗体的产生中的相关性，可以重新设计抗体以获得所需的特征。可能的改变有很多并且范围为从仅一个或一些氨基酸的改变到例如可变区的完全重新设计。典型地，将进行可变区的改变以便提高抗原结合特征、提高可变区稳定性、或降低免疫原性的风险。
如在本文中所使用的，术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别是指任何天然抗体VH或VL结构域(例如，人VH或VL结构域)及其至少保持相应天然抗体的定性抗原结合能力的任何衍生物(例如，源于天然鼠VH或VL结构域的人源化VH或VL结构域)。VH或VL结构域由被三个CDR中断的“构架”区组成。构架区用于排列用于特异性结合抗原表位的CDR。从氨基端到羧基端，VH和VL结构域二者均包含以下构架(FR)和CDR区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。氨基酸向每个结构域的分配是根据Kabat,Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)(第5版，国立卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,MD,1991)或Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-17(1987)；Chothia等人,Nature 342:878-83,(1989)的定义。VH结构域的CDR 1、2、和3在本文中也分别被称为HCDR1、HCDR2、和HCDR3；VL结构域的CDR 1、2、和3在本文中也分别被称为LCDR1、LCDR2、和LCDR3。
在本发明的CD20结合蛋白的一些实施方案中，结合区包含含有互补决定区或CDR的特定组的抗体或源于抗体的序列。CDR是抗体与其抗原决定簇特异性结合所需的抗体的可变结构域内的限定的序列区域。在本发明的一个实施方案中，CDR的组包括三个源于抗体重链的CDR和三个源于抗体轻链的CDR。在一些实施方案中，三条重链CDR包括：(a)包含如分别在SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变结构域；(b)包含如分别在SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:23中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变结构域；或(c)包含如分别在SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、和SEQ ID NO:27中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，和包含如分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:29中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域。此外，在本发明的某些实施方案中，结合区包含SEQ ID NO:4的氨基酸2至245，或者基本上由其组成。
这种体系是模块化的，这在于，各种不同的免疫球蛋白型结合区可以与同一个志贺菌毒素效应子区一起用于靶向CD20的不同的细胞外表位。技术人员应理解的是，任何能够结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白型的CD20结合区均可以用于设计或选择要与志贺菌毒素效应子区连接的免疫球蛋白型结合区以制备本发明的CD20结合蛋白。
B.源于志贺菌毒素家族成员的A亚基的志贺菌毒素效应子区
对于本发明的目的来说，短语“志贺菌毒素效应子区”是指能够使核糖体失活并且实现细胞毒性和/或细胞生长抑制作用的源于志贺菌毒素家族成员的志贺菌毒素A亚基的多肽区。志贺菌毒素家族成员是指在结构和功能上相关的天然存在的蛋白毒素、特别是从痢疾志贺菌(S.dysenteriae)和大肠杆菌(E.coli)分离的毒素的家族的任何成员(Johannes,Nat Rev Microbiol8:105-16(2010))。例如，志贺菌毒素家族包括从痢疾志贺菌血清型1中分离的真志贺菌毒素(Stx)，从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素1变体(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)，以及从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx仅一个残基不同，并且二者都被称为维罗细胞毒素(Verocytotoxin)或vero细胞毒素(Verotoxin)(VT)(O’Brien,Curr Top MicrobiolImmunol 180:65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体在氨基酸序列水平上彼此仅有约53-60％的相似性，但是它们享有志贺菌毒素家族成员共有的酶活性和细胞毒性的机制(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺菌毒素，如定义的亚型Stx1a、Stx1c、Stx1d、和Stx2a-g(Scheutz F等人,J Clin Microbiol 50:2951-63(2012))。志贺菌毒素家族成员并不天然地限于任何细菌物种，因为编码志贺菌毒素的基因可以经由水平基因转移在细菌物种之间扩散(Strauch E等人,Infect Immun 69:7588-95(2001)；Zhaxybayeva O,Doolittle W,Curr Biol.21:R242-6(2011))。作为物种间转移的实例，在从患者中分离的溶血不动杆菌(A.haemolyticus)的菌株中发现了志贺菌毒素(Grotiuz G等人,J Clin Microbiol 44:3838-41(2006))。一旦编码志贺菌毒素的多核苷酸进入新的亚种或物种，则假定志贺菌毒素氨基酸序列能够由于遗传漂变和/或选择压力形成略微的序列变化而同时仍然保持志贺菌毒素家族成员共有的细胞毒性的机制(参见Scheutz,J Clin Microbiol50:2951-63(2012))。
本发明的志贺菌毒素效应子区包含源于从其天然志贺菌毒素B亚基的任何形式解离的志贺菌毒素A亚基的多肽或者基本上由其组成。此外，本发明的CD20结合蛋白不含任何包含志贺菌毒素B亚基的功能结合结构域或者基本上由其组成的多肽。相反，源于志贺菌毒素A亚基的区域与异源CD20结合区在功能上相关联从而实现向表达CD20的细胞的细胞靶向。
在某些实施方案中，本发明的志贺菌毒素效应子区可以包含全长志贺菌毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:25)、或SLT-2A(SEQ ID NO:26))，或者基本上由其组成，应注意的是，天然存在的志贺菌毒素A亚基可以包括前体形式，所述前体形式在其氨基端含有约22个氨基酸的信号序列，所述信号序列被移除从而产生成熟的志贺菌毒素A亚基。“毒素效应子区”的一个具体实例是源于志贺菌样毒素1(SLT-1)的A链的区域(SEQ ID NO:1)。SLT-1的A链由293个氨基酸组成，并且酶(毒性)结构域跨度为残基1至239。在其它实施方案中，本发明的志贺菌毒素效应子区包含比全长志贺菌毒素A亚基短的截短的志贺菌毒素A亚基，或者基本上由其组成。
志贺菌样毒素1A亚基截短是具有催化活性的，能够在体外使核糖体酶促失活，并且当在细胞内表达时是具有细胞毒性的(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。展现出完全酶活性的最小志贺菌毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。尽管报道的保持基本催化活性的志贺菌毒素A亚基的最小片段是StxA的残基75-247(Al-Jaufy,Infect Immun 62:956-60(1994))，在真核细胞内从头(de novo)表达的StxA截短仅需要至多残基240以到达细胞溶质并且进行核糖体的催化失活(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。
志贺菌毒素效应子区通常可以小于全长A亚基。优选的是，志贺菌毒素效应子区保留从氨基酸位置77至239的多肽区(SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:25)、或SLT-2A(SEQ ID NO:26))或志贺菌毒素家族成员的其他A亚基的等同物。例如，在本发明的某些实施方案中，源于SLT-1A的志贺菌毒素效应子区可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸75至251、SEQID NO:1的1至241、SEQ ID NO:1的1至251、或SEQ ID NO:1的氨基酸1至261，或者基本上由其组成。类似地，在某些实施方案中，源于Stx A的志贺菌毒素效应子区可以包含SEQ IDNO:25的氨基酸75至251、SEQ ID NO:25的1至241、SEQ ID NO:25的1至251、或SEQ ID NO:25的氨基酸1至261，或者基本上由其组成。此外，在某些实施方案中，源于SLT-2的志贺菌毒素效应子区可以包含SEQ ID NO:26的氨基酸75至251、SEQ ID NO:26的1至241、SEQ ID NO:26的1至251、或SEQ ID NO:26的氨基酸1至261，或者基本上由其组成。
本发明还提供了本发明的CD20结合蛋白的变体，其中志贺菌毒素效应子区与天然存在的志贺菌毒素A亚基至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个氨基酸残基(但是不多于保持至少85％、90％、95％、99％以上氨基酸序列同一性的氨基酸残基数目)不同。因此，源于志贺菌毒素家族成员的A亚基的多肽区可以包含增加、缺失、截短、或相对于原始序列的其他改变，只要维持与天然存在的志贺菌毒素A亚基至少85％、90％、95％、99％以上的氨基酸序列同一性即可。
因此，在某些实施方案中，志贺菌毒素效应子区包含与天然存在的志贺菌毒素A亚基如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、Stx(SEQ ID NO:25)、和/或SLT-2A(SEQ ID NO:26)具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％整体序列同一性的氨基酸序列，或者基本上由其组成。
任选地，志贺菌毒素A亚基的全长或截短形式可以包含一个或多个突变(例如置换、缺失、插入或倒位)。在某些强烈细胞毒性的实施方案中，通过宿主细胞转化、转染、感染或诱导的已知方法，或者借助通过细胞靶向与志贺菌毒素效应子区连接的免疫球蛋白型结合区介导的内化，志贺菌毒素效应子区具有足够的序列同一性以在进入细胞后保持细胞毒性。志贺菌毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性最重要的残基被定位至以下残基位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、和精氨酸-176等(Di,Toxicon 57:535-39(2011))。在本发明的实施方案中的任一个中，志贺菌毒素效应子区可以优选但不一定保留细胞毒性活性通常所需的在位置处的一个或多个保守的氨基酸，如在StxA、SLT-1A中的位置77、167、170、和203、或志贺菌毒素家族的其他成员中的等同的保守位置处发现的那些。可以使用多种在本领域内公知的测定中的任何一种或多种来测量本发明的CD20结合蛋白导致细胞死亡的能力，例如其细胞毒性。
在本发明的某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸残基突变或缺失以便降低或消除志贺菌毒素效应子区的细胞毒性活性。可以通过突变或截短来降低或取消志贺菌毒素家族成员的A亚基的细胞毒性。已经显示标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置对于Stx、Stx1、和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等人,Proc Natl Acad Sci USA 85:2568-72(1988)；Deresiewicz R等人,Biochemistry 31:3272-80(1992)；Deresiewicz R等人,Mol Gen Genet 241:467-73(1993)；Ohmura M等人,Microb Pathog 15:169-76(1993)；Cao C等人,Microbiol Immunol 38:441-7(1994)；Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9(1998))。在无细胞核糖体失活测定中，将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变消除了Slt-I A1的酶活性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在利用内质网中Slt-I A1的从头表达的另一种方法中，将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变在所述表达水平上消除了Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe,J BiolChem 280:23310-18(2005))。截短分析表明，StxA的残基75至268的片段在体外仍然保持明显的酶活性(Haddad,J Bacteriol 175:4970-8(1993))。借助在细胞溶质中的从头表达，含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段显示出明显的体外酶活性和细胞毒性(LaPointe,JBiol Chem280:23310-18(2005))。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达不具有细胞毒性，因为其不能逆向移位至细胞溶质中(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。
对于本发明的目的来说，志贺菌毒素效应子区和CD20结合区相对彼此或相对于整个CD20结合蛋白的N端和C端的具体顺序或取向不是固定的(参见，例如，图1)。在以上CD20结合蛋白中，CD20结合区和志贺菌毒素效应子区可以彼此直接连接和/或经由一个或多个插入的多肽序列彼此适合地连接，如利用一个或多个在本领域内公知的接头。
II.本发明的CD20结合蛋白的特定结构变体的实例
在本发明某些实施方案中，CD20结合蛋白包含：包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:25)、或SLT-2A(SEQ ID NO:26)的氨基酸75至251或者基本上由其组成的志贺菌毒素效应子区。另外的实施方案是在其中志贺菌毒素效应子区包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:25)、和/或SLT-2A(SEQ ID NO:26)的氨基酸1至241或者基本上由其组成的CD20结合蛋白。另外的实施方案是在其中志贺菌毒素效应子区包含SLT-1A(SEQ IDNO:1)、StxA(SEQ ID NO:25)、和/或SLT-2A(SEQ ID NO:26)的氨基酸1至251或者基本上由其组成的CD20结合蛋白。另外的实施方案是在其中志贺菌毒素效应子区包含SLT-1A(SEQID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:25)、和/或SLT-2A(SEQ ID NO:26)的氨基酸1至261或者基本上由其组成的CD20结合蛋白。
对于某些实施方案来说，本发明的CD20结合蛋白是包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:16的氨基酸序列或者基本上由其组成的蛋白。
如在本文中所使用的，术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别是指任何抗体VH或VL结构域(例如，人VH或VL结构域)及其保持相应天然抗体的至少定性的抗原结合能力的任何衍生物(例如，源于天然鼠VH或VL结构域的人源化VH或VL结构域)。VH或VL结构域由被三个CDR中断的“构架”区组成。构架区用于排列CDR以用于特异性结合抗原表位。从氨基端到羧基端，VH和VL结构域二者均包含以下构架(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。氨基酸向每个结构域的分配是根据Kunik V等人,PLoS ComputBiol 8:e1002388(2012)和Kunik V等人,Nucleic Acids Res 40:W521-4(2012)的定义，或者备选地根据Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)(第5版，国立卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,MD,1991)；或Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-17(1987)；Chothia等人,Nature 342:878-83,(1989)的定义。
在本发明的某些实施方案中，CDR包括源于抗体重链的三个CDR和源于抗体轻链的三个CDR。在某些实施方案中，三条重链CDR包括SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)、和SEQ ID NO:9(HCR3)，而三条轻链CDR包括SEQ ID NO:9(LCDR1)、SEQ ID NO:10(LCDR2)和SEQ ID NO:11(LCDR3)。此外，在本发明的某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:4的氨基酸2至245，或者基本上由其组成。
在本发明的范围内的是，使用含有对CD20的任何细胞外部分的功能性CD20结合位点、并且甚至更优选地能够以高亲和性(例如由KD表示的)结合CD20的本发明的CD20结合蛋白的多肽的片段、变体、和/或衍生物。例如，本发明提供了可以结合CD20的源于免疫球蛋白的多肽序列。以10-5至10-12摩尔/升、优选小于200nM的解离常数(KD)结合CD20的细胞外部分的任何多肽均可以替代该区域。
因此，在本发明的范围内的是，改变所公开的示例性CD20结合蛋白的免疫球蛋白型结合位点，只要由从所描述的CDR1序列、CDR2序列、和CDR3序列组成的组中选择至少一个多肽序列即可。特别地，但是并非限制，本发明的多肽序列可以基本上由4个构架区(FR1至FR4)和三个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)；或基于一个或多个CDR的存在而展现出靶标生物分子结合功能的此类氨基酸序列的任何适合的片段组成。
在某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区包含：(i)包含如在SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、和SEQ ID NO:8中所示的CDR氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，以及(ii)包含如在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中所示的CDR氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域。在其它实施方案中，免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:4的氨基酸2至245，或者基本上由其组成。
在本发明某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区源自展现出对CD20的特异性高亲和性结合的源于纳米抗体或单结构域免疫球蛋白的区域VHH。通常，纳米抗体由在骆驼科动物和软骨鱼类(Chondrichthyes)中发现的种类的天然存在的单一、单体可变结构域抗体(sdAb)的片段构建。通过截短单一、单体可变结构域以产生较小和较稳定的分子，由这些天然存在的抗体改造出纳米抗体。由于它们的小尺寸，纳米抗体能够与不能接近整个抗体的抗原结合。
III.本发明的CD20结合蛋白的一般功能
本发明提供了多种用于选择性杀伤特定细胞类型的CD20结合蛋白，所述CD20蛋白包含：1)用于细胞靶向的免疫球蛋白型CD20结合区以及2)用于引起细胞内化以及任选的细胞杀伤的细胞毒性志贺菌毒素效应子区。CD20靶向免疫球蛋白型结合区与源于志贺菌毒素亚基A的区域的连接使得强效志贺菌毒素细胞毒性能够特异性靶向至表达CD20的细胞。在它们的优选实施方案中，本发明的CD20结合蛋白能够结合天然存在于细胞表面上的CD20并且进入细胞。一旦内化在靶向的细胞类型内，本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案能够为细胞毒性志贺菌毒素效应子多肽片段提供到靶标细胞的细胞溶质中的路线。一旦在靶向的细胞类型的细胞溶质中，本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案能够使核糖体酶促失活并且最终杀伤细胞。备选地，可以使用无毒性变体递送另外的外源物质和/或标记表达CD20的细胞的内部，以用于诊断目的。
可以通过用于杀伤和/或接收外源物质的本发明的CD20结合蛋白来靶向多种类型的表达CD20的细胞。在预期将本发明的CD20结合蛋白内化的表达CD20的细胞类型中的是在B细胞谱系内的那些。“B细胞谱系”是用于描述例如通过细胞表面标记物在细胞学上或另外地被确定为B细胞本身的那些细胞，或者曾经或当前源于在细胞学上或另外地被确定为B细胞的细胞的那些细胞。术语“B细胞谱系”包括源于B细胞谱系的肿瘤细胞或B细胞谱系的前体。在可以被靶向的表达CD20的细胞类型中的是非正常表达CD20的细胞谱系的发育不良细胞或肿瘤细胞，例如黑色素瘤细胞。尤其是，要用本发明的CD20结合蛋白靶向的表达CD20的细胞包括B细胞谱系或非B细胞谱系的肿瘤细胞，如来自通常不被分类为B细胞但是表达CD20的造血谱系的肿瘤细胞。
A.能够引起CD20的快速内化的CD20结合蛋白
本发明的志贺菌毒素效应子区提供内化功能，将CD20结合蛋白从靶标细胞的外表面移动至靶标细胞的细胞溶质中。然而，这种内化功能也是一种加速功能，其在于，促进或引起了CD20的细胞内化。如在本文中的说明书和权利要求中所使用的，短语“快速内化”是指，与现有技术参考文献分子如单克隆抗体利妥昔单抗相比，本发明的CD20结合蛋白在结合后减少了CD20细胞内化的时间。
对于本发明的目的来说，与利用识别CD20抗原的充分表征的抗体如1H4CD20单克隆抗体的结合的靶标分子内化的时间相比，如果发生内化的时间由于CD20结合蛋白的结合而减少，则认为细胞内化是快速的(Haisma H等人,Blood 92:184-90(1999))。例如，尽管随细胞类型和抗体类型而不同，但是CD20抗原的内化时机通常直到结合后大约六小时才开始达到最大水平。因此，如在本说明书中定义的术语“快速”是小于这种六小时标准内化窗口。在某些实施方案中，快速可以快至小于约一小时，但是也可以包括从约1小时至约2小时、至约3小时、至约4小时、至约5小时的范围；约2小时至约3小时、至约4小时、至约5小时的范围；约3小时至约4小时、至约5小时的范围；以及约4小时至约5小时的范围。
B.通过靶向的志贺菌毒素细胞毒性的细胞杀伤
因为志贺菌毒素家族成员适用于杀伤真核细胞，使用志贺菌毒素效应子区设计的CD20结合蛋白可以显示出强效的细胞杀伤活性。志贺菌毒素家族成员的A亚基包含一旦在细胞的细胞溶质中即能够杀伤真核细胞的酶结构域。本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案利用了这种细胞毒性机制。
在本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案中，在接触表达CD20的细胞以使至少一部分CD20可从细胞外空间接近后，CD20结合蛋白能够引起所述细胞的死亡。可以使用本发明的CD20结合蛋白在靶标细胞的不同状态下，如离体操作的靶标细胞、体外培养的靶标细胞、体外培养的组织样品中的靶标细胞、或体内的靶标细胞，实现CD20阳性“细胞杀伤”。
C.表达CD20的细胞和不表达CD20的细胞之间的选择性细胞毒性
通过使用高亲和性免疫球蛋白型结合区将具有酶活性的志贺菌毒素区的递送靶向至表达CD20的细胞，可以将这种强效细胞杀伤活性限制为优先地杀伤CD20阳性细胞类型。
在某些实施方案中，在将本发明的CD20结合蛋白施用至多种细胞类型的混合物后，与缺少细胞外CD20靶标的细胞类型相比，CD20结合蛋白能够选择性地杀伤显示出细胞外CD20靶标的表达CD20的细胞。因为志贺菌毒素家族成员适用于杀伤真核细胞，使用志贺菌毒素效应子区设计的CD20结合蛋白可以显示出强效的细胞毒性活性。通过使用高亲和性的免疫球蛋白型结合区将具有酶活性的志贺菌毒素区的递送靶向表达CD20的细胞，可以将这种强效细胞杀伤活性限制为仅优先地杀伤表达CD20的细胞。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白能够选择性地或优先地导致两种以上不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型的死亡。这实现了将细胞毒性活性靶向具有高优先性的特定细胞类型，如与不表达任何显著量的细胞外CD20靶标的“旁观者”细胞类型相比至少3倍的细胞毒性作用。这实现了对在细胞表面表达CD20的特定细胞类型的具有高优先性的靶向细胞杀伤，如与不表达显著量的CD20或在细胞表面上不暴露显著量的CD20的“旁观者”细胞类型相比至少3倍的细胞毒性作用。
在某些另外的实施方案中，在将CD20结合蛋白施用至两群不同的细胞类型时，CD20结合蛋白能够在一定剂量下引起在细胞表面上表达CD20的细胞群的如由半最大细胞毒性浓度(CD50)定义的细胞死亡，所述剂量比施用至不表达CD20的细胞群的相同CD20结合蛋白的CD50剂量低至少三倍。
在某些实施方案中，针对在细胞表面上表达CD20的细胞类型群的细胞毒性活性比针对不与实施方案的CD20结合区的任何细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型群的细胞毒性活性高至少3倍。根据本发明，可以依据(a)针对表达实施方案的CD20结合区的细胞外CD20靶标的细胞群的细胞毒性与(b)针对不与实施方案的CD20结合区的任何细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的细胞群的细胞毒性的比率(a/b)来将选择性的细胞毒性量化。在某些实施方案中，细胞毒性比率指示与不表达CD20的细胞或细胞类型群相比，对表达CD20的细胞或细胞类型群的选择性细胞毒性高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍、或1000倍。
这种优先细胞杀伤功能允许本发明的某些CD20结合蛋白在不同状态下和在非靶向的旁观者细胞的存在下，如离体操作的细胞类型的混合物，具有细胞类型的混合物的体外培养组织，或在体内在存在多种细胞类型(例如在原位或在其在多细胞生物内的天然位置)的情况下杀伤靶向的细胞。
此外，CD20结合蛋白的无催化活性的形式可以任选用于诊断功能。本领域中已知的另外的诊断剂与本发明的CD20结合蛋白的缀合使得能够对病人或活检样品中的B细胞谱系的个体免疫细胞或癌细胞的细胞内细胞器(例如高尔基体、内质网、和细胞溶质隔室)进行成像。例如，这可以用于肿瘤细胞类型的诊断，测定随时间的抗癌治疗的进展，和/或评价手术切除肿瘤肿块之后残留癌细胞的存在。
D.另外的外源物质的递送
因为CD20结合蛋白能够在与CD20的细胞外部分结合后引起CD20的细胞内化，本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案可以用于将另外的外源物质递送至表达CD20的细胞的内部。在某种意义上说，整个CD20结合蛋白是将会进入细胞的外源物质；因此，“另外的”外源物质是与核心CD20结合蛋白本身相连又与其不同的物质。
如在本文中所使用的“另外的外源物质”是指通常不在天然靶标细胞内存在的一种或多种分子，其中本发明的CD20结合蛋白可以用于将这种物质特异性地运输至细胞的内部。通常，另外的外源物质选自肽、多肽、蛋白质、和多核苷酸。作为肽的另外的外源物质的一个实例是流感病毒抗原，如流感基质58-66肽(SEQ ID NO:3)。在SEQ ID NO:16中提供了可以将所述抗原递送至表达CD20的靶标细胞中的CD20结合蛋白的一个示例性实施方案。
另外的外源物质可以包括核心CD20结合蛋白结构内的内部多肽序列，如流感基质58-66肽(SEQ ID NO:3)。类似地，另外的外源物质可以包括与CD20结合结构的末端连接的末端定位的多肽序列。可以将该抗原作为另外的外源物质递送至在细胞表面上表达CD20的靶标细胞中的本发明的CD20结合蛋白的某些实施方案是包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:16或者基本上由其组成的CD20结合蛋白。
可以与本发明的CD20结合蛋白连接的外源物质的另外的实例包括抗原如源于细菌蛋白的那些，如作为被细菌感染的抗原递呈细胞的特征的那些。另外的外源物质的另外的实例是在癌中突变的蛋白或在癌中异常表达的蛋白。另外的外源物质的另外实例包括能够充当外源抗原的T细胞互补决定区。
可以与本发明的CD20结合蛋白连接的外源物质的另外实例包括除抗原外的蛋白，如酶。外源物质的另外的类型是多核苷酸。在可以被运输的多核苷酸中的是被制成具有调控功能的那些，如小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)。
外源物质的另外的实例包括抗原如源于细菌蛋白的那些，如作为被细菌感染的抗原递呈细胞的特征的那些。外源抗原的另外实例是源于在癌中突变的蛋白或在癌中异常表达的蛋白的那些。T细胞互补决定区(CDR)也可以充当用于本发明目的的外源抗原。外源物质的另外的实例包括除抗原外的蛋白，如酶。另外类型的外源物质是核酸。在可以被运输的核酸中的是被制成具有调控功能的那些，如小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)。
保持整体结构和功能的本发明的CD20结合蛋白的多肽序列的变化
在某些以上实施方案中，本发明的CD20结合蛋白是变体，其中一个或多个保守性氨基酸置换被引入到多肽区中。如在本文中所使用的，术语“保守性置换”表示一个或多个氨基酸被另一种生物学上相似的氨基酸残基替换。实例包括具有相似特征(例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的氨基酸残基的置换(参见，例如，以下表B)。利用通常不在内源哺乳动物肽和蛋白质中发现的残基的保守性置换的实例是利用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨乙基半胱氨酸、或另一种碱性氨基酸的精氨酸或赖氨酸残基的保守性置换。对于与肽和蛋白质中无表型的置换相关的进一步信息(参见，例如，Bowie J等人，Science 247:1306-10(1990))。在以下方案中的是根据物理化学性质分类的氨基酸的保守性置换。I：中性、亲水性，II：酸和酰胺，III：碱性，IV：疏水性，V：芳族、大体积氨基酸。
表B.保守性氨基酸置换的实例
I II III IV V
A N H M F
S D R L Y
T E K I W
P Q V
G C
在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白可以包含与在本文中叙述的多肽序列相比具有至多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸置换的本发明的多肽区的功能片段或变体，只要其单独地或者作为CD20结合蛋白的组分保持可测量的生物活性即可。作为通过如在免疫球蛋白型结合区或志贺菌毒素效应子区中改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入一个或多个氨基酸而改变CD20结合蛋白的多肽的结果，CD20结合蛋白的变体在本发明的范围内，以便实现所需性质，如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性、和/或改变的血清半衰期。本发明的CD20结合蛋白的多肽还可以具有或不具有信号序列。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白与在本文中叙述的CD20结合蛋白的氨基酸序列中的任一个共享至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上的氨基酸序列同一性，只要其保持可测量的生物活性如细胞毒性、细胞外靶标生物分子结合、酶催化、或亚细胞行程即可。免疫球蛋白型结合区可以与在本文中叙述的CD20结合蛋白的氨基酸序列不同，只要其保持与其细胞外靶标生物分子的结合功能即可。如果ABR的氨基酸序列相同，则将最有可能保持结合功能。例如，基本上由与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:16具有85％同一性的氨基酸组成的CD20结合蛋白，其中出于确定氨基酸同一性程度的目的而忽略形成ABR的氨基酸残基。结合功能可以由技术人员使用标准技术测定。
在某些实施方案中，可以改变志贺菌毒素效应子区以改变志贺菌毒素效应子区的酶活性和/或细胞毒性。这种改变可以或可以不引起改变的志贺菌毒素效应子区是其中的组分的CD20结合蛋白的细胞毒性的改变。可能的改变包括志贺菌毒素效应子区的选自由下列各项组成的组的突变：截短、缺失、倒位、插入和置换。
可以通过突变或截短来降低或取消志贺菌毒素家族成员的A亚基的细胞毒性。已经证明标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置对于Stx、Stx1、和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等人,Proc Natl Acad Sci USA 85:2568-72(1988)；Deresiewicz R等人,Biochemistry 31:3272-80(1992)；Deresiewicz R等人,Mol Gen Genet241:467-73(1993)；Ohmura M等人,Microb Pathog 15:169-76(1993)；CaoC等人,Microbiol Immunol 38:441-7(1994)；Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9(1998))。在无细胞核糖体失活测定中将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变消除了Slt-IA1的酶活性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在利用内质网中Slt-I A1的从头表达的另一种方法中，将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变在所述表达水平上消除了Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短分析表明，残基75至268的StxA的片段仍然保持明显的体外酶活性(Haddad,J Bacteriol 175:4970-8(1993))。通过细胞溶质中的从头表达，含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段显示出明显的体外酶活性和细胞毒性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达不是细胞毒性的，因为其不能逆移位到细胞溶质中(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。
志贺菌毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性最重要的残基被定位至以下残基位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、和精氨酸-176等(Di,Toxicon 57:535-39(2011))。尤其是，含有谷氨酸-E167到赖氨酸和精氨酸-176到赖氨酸突变的Stx2A的双突变构建体完全失活；而Stx1和Stx2中的许多单一突变显示出细胞毒性的10倍降低。此外，截短Stx1A至1-239或1-240降低了其细胞毒性，并且类似地，截短Stx2A至保守疏水残基降低了其细胞毒性。
志贺菌样毒素1A亚基截短是具有催化活性的，能够在体外使核糖体酶促失活，并且当在细胞内表达时是具有细胞毒性的(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。展现出完全酶活性的最小志贺菌毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。尽管报道的保持基本催化活性的志贺菌毒素A亚基的最小片段是StxA的残基75-247(Al-Jaufy,Infect Immun 62:956-60(1994))，在真核细胞内从头表达的StxA截短仅需要至多残基240以到达细胞溶质并且进行核糖体的催化失活(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。
在源于SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:25)、或SLT-2A(SEQ ID NO:26)的某些实施方案中，这些改变包括位置75处的天冬酰胺、位置77处的酪氨酸、位置114处的酪氨酸、位置167处的天冬氨酸、位置170处的精氨酸、位置176处的精氨酸的置换，和/或位置203处的色氨酸的置换。对于技术人员来说，基于现有技术，这种置换的实例将会是已知的，如位置75处的天冬酰胺变为丙氨酸、位置77处的酪氨酸变为丝氨酸、位置114处的酪氨酸变为丙氨酸的置换、位置167处的天冬氨酸变为谷氨酸的置换、位置170处的精氨酸变为丙氨酸的置换、位置176处的精氨酸变为赖氨酸的置换、和/或位置203处的色氨酸变为丙氨酸的置换。
本发明的CD20结合蛋白可以任选地与可以包括本领域中已知的治疗剂和/或诊断剂的一种或多种另外的药剂缀合。
本发明的CD20结合蛋白的生产、制造、和纯化
本发明的CD20结合蛋白可以使用对本领域技术人员来说公知的生物化学工程技术生产。例如，本发明的CD20结合蛋白可以通过标准合成方法利用重组表达系统生产，或者通过任何其他适合的方法生产。因此，CD20结合蛋白可以以多种方式合成，包括，例如包括下列各项的方法：(1)使用标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成CD20结合蛋白的多肽或多肽组分，并且将最终的肽化合物产物分离并纯化；(2)在宿主细胞中表达编码CD20结合蛋白的多肽或多肽组分的多核苷酸并且从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；或(3)进行编码CD20结合蛋白的多肽或多肽组分的多核苷酸的无细胞体外表达，并且回收表达产物；或者通过方法(1)、(2)或(3)的任意组合以获得肽组分的片段，随后将片段结合(例如连接(ligating))以获得肽组分，并且回收肽组分。
可以优选通过固相或液相肽合成来合成本发明的CD20结合蛋白的多肽或多肽组分。本发明的CD20结合蛋白可以适合地通过标准合成方法生产。因此，可以通过例如这样的方法来合成肽，所述方法包括通过标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成肽，并且将最终的肽产物分离并纯化。在该语境中，可以参考WO 1998/11125，或尤其是Fields,G等人,Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成的原理和实践)(Synthetic Peptides(合成肽),Gregory A.Grant,ed.,Oxford UniversityPress(牛津大学出版社),英国,第二版,2002)以及其中的合成实例。
本发明的CD20结合蛋白可以使用在本领域内公知的重组技术制备(生产和纯化)。通常，通过培养转化或转染有包含编码多核苷酸的载体的宿主细胞并且从细胞培养物中回收多肽来制备多肽的方法被描述于，例如Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社),NY,美国,1989)；Dieffenbach等人，PCR Primer:A LaboratoryManual(PCR引物：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社),NY,美国,1995)。任何适合的宿主细胞均可以用于生产本发明的CD20结合蛋白。宿主细胞可以是用一种或多种驱动本发明的多肽表达的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。此外，可以通过修饰编码CD20结合蛋白的多核苷酸来生产本发明的CD20结合蛋白，这导致改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入一个或多个氨基酸，以便实现所需性质，如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性、和/或改变的血清半衰期。
因此，本发明还提供用于根据以上所述方法并且使用编码本发明的多肽的部分或全部的多核苷酸、包含当被引入到宿主细胞中时能够编码本发明的多肽的部分或全部的本发明的至少一种多核苷酸的表达载体、和/或包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞来生产本发明的CD20结合蛋白的方法。
当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达多肽或蛋白时，有利的是从其他组分如宿主细胞因子中分离(或纯化)所需的多肽或蛋白，从而获得高纯度的或基本均质的制剂。纯化可以通过在本领域内公知的方法完成，如离心技术，萃取技术，层析和分馏技术(例如，通过凝胶过滤的尺寸分离、通过离子交换柱的电荷分离、疏水相互作用层析法、反相层析法、在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE等上的层析法、层析聚焦、和蛋白A琼脂糖层析法，以用于移除污染物)，以及沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀。任何数量的生物化学纯化技术均可以用于增加本发明的CD20结合蛋白的纯度。在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白可以任选地以同多聚体形式(即，两个以上相同CD20结合蛋白的蛋白复合物)纯化。
在以下实施例中的是对用于生产本发明的CD20结合蛋白的方法的非限制性实例的描述，以及公开的示例性CD20结合蛋白的CD20结合蛋白制备的具体但非限制性的方面。
包含本发明的CD20结合蛋白的药物组合物
本发明提供CD20结合蛋白，其用于单独地或在药物组合物中与一种或多种另外的治疗剂组合地用于治疗或预防以下更详细描述的病况、疾病、病症、或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、和免疫病症)。本发明还提供药物组合物，其包含本发明的CD20结合蛋白或其根据本发明的药用盐或溶剂化物，以及至少一种药用载体、赋形剂、或载体。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含本发明的CD20结合蛋白的同多聚体和/或异多聚体形式。所述药物组合物将可用于治疗、改善、或预防以下更详细描述的疾病、病况、病症、或症状的方法。预期各个这样的疾病、病况、病症、或症状均为就根据本发明的药物组合物的用途而言的单独的实施方案。本发明还提供用于至少一种如以下更详细描述的根据本发明的治疗方法的药物组合物。
如在本文中所使用的，术语“病人”和“受试者”可互换使用以指代任何生物，通常是脊椎动物如人和动物，其表现出至少一种疾病、病症、或病况的症状、征兆、和/或指征。这些术语包括哺乳动物如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、宠物(例如猫、狗等)以及实验动物(例如小鼠、兔子、大鼠等)的非限制性实例。
如在本文中所使用的，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”以及它们的语法变体是指用于获得有益或所需的临床结果的方法。该术语可以指延缓病况、病症或疾病的发病或发展速度，减轻或缓解与其有关的症状，产生病况的全部或部分消退，或者以上任何的一些组合。对于本发明的目的来说，有益或所需的临床结果包括，但不限于，无论是否是可检测的或不可检测的，症状的减轻或缓解、疾病程度降低、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病发展的推迟或延缓、疾病状态的改善或缓和、以及康复(无论是部分的或全部的)。“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”还可以意指相对于在不接受治疗的情况下的预期存活时间延长存活。需要治疗的受试者(例如人)因此可以是已经遭受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理状态或症状的严重性的增加，并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病况完全停止。
如在本文中所使用的，术语“防止(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”以及它们的语法变体是指用于预防病况、疾病、或病症的发展或者改变病况、疾病、或病症的病理学的方法。因此，“预防”可以指预防或防止的措施。对于本发明的目的来说，有益或所需的临床结果包括，但不限于，无论是否是可检测的或不可检测的，预防或延缓疾病的症状、进展或发展。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未遭受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况延缓疾病的发病，并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病况的永久性预防。因此在某些语境中病况的“预防(preventing)”或“预防(prevention)”可以是指降低发展病况的风险，或者预防或推迟与该病况有关的症状的发展。
如在本文中所使用的，“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种所需治疗效果的组合物(例如治疗组合物或药剂)的量或剂量，如预防或治疗目标病况或有益地缓解与该病况有关的症状。最合乎需要的治疗有效量是将会生产由本领域技术人员为需要其的给定受试者选择的具体治疗的所需功效的量。这种量将会根据各种技术人员理解的因素变化，包括但不限于，治疗性化合物的特性(包括活性、药物动力学、药效学、和生物利用度)，受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、总体身体状况、对给定剂量的响应性、和药物的类型)，药用载体或制剂中载体的性质，以及给药途径。临床和药理学技术的人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对施用化合物的响应并且相应地调节剂量(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学与实践)(Gennaro A,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,美国,第19版,1995))。
包含本发明的CD20结合蛋白的药物组合物的生产或制造
任何本发明的CD20结合蛋白的药用盐或溶剂化物也在本发明的范围内。
本发明语境中的术语“溶剂化物”是指在溶质(在本情况下，为根据本发明的多肽化合物或其药用盐)和溶剂之间形成的定义的化学计量的复合物。相关的溶剂可以是，例如，水、乙醇或另一种药用的、通常为小分子有机物种，如，但不限于，乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，这种溶剂化物通常被称为水合物。
本发明的CD20结合蛋白或其盐可以被配制为为储存或施用而制备的药物组合物，所述药物组合物通常包含在药用载体中的治疗有效量的本发明的化合物或其盐。术语“药用载体”包括任何标准药物载体。用于治疗用途的药用载体是制药领域中公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)(Mack Publishing Co.(A.Gennaro,ed.,1985))。如在本文中所使用的，“药用载体”包括任何和所有生理学上可接受的，即相容的，溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂、和吸收延缓剂等。药用载体或稀释剂包括在适用于口服、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、和经皮)施用的制剂中使用的那些。示例性的药用载体包括无菌水溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的瞬时制备的无菌粉末。可以在本发明的药物组合物中采用的适合的水性和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它们的适合的混合物，植物油如橄榄油，以及可注射有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过维持分散液情况下所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在某些实施方案中，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据所选择的给药途径，可以将CD20结合蛋白或其他药物组分包衣在用于保护化合物免受当通过特定给药途径施用于病人时活性CD20结合蛋白可能会遇到的低pH和其他天然失活条件的作用影响的物质中。
本发明的药物组合物的制剂可以以单位剂型方便地提供并且可以通过任何在药学领域内公知的方法制备。以这种形式，将组合物分为含有适合量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，包装含有离散量的制剂，例如，小包片剂、胶囊、和小药瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊、扁胶囊(cachet)、或片剂本身，或者其可以是适合数量的这些包装形式中的任何一种。其可以以单剂量可注射形式，例如以笔(pen)的形式提供。可以将组合物配制为用于任何适合的施用途径和方式。皮下或经皮施用方式可以特别适用于在本文中所描述的治疗性CD20结合蛋白。
本发明的药物组合物还可以含有佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作，以及通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止存在微生物。组合物中的等渗剂，如糖类、氯化钠等，也可以是合乎需要的。此外，通过包含延缓吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶，可以带来可注射药物形式的延长的吸收。
本发明的药物组合物还任选地包含药用抗氧化剂。示例性的药用抗氧化剂是：水溶性抗氧化剂如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
在另一个方面中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的不同的CD20结合蛋白或任何前述各项的酯、盐或酰胺中的一种或组合，以及至少一种药用载体。
治疗性组合物在制造和储存条件下通常是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其他规则结构。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、醇如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、或任何适合的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，根据本领域内公知的制剂化学，可以维持适当的流动性。在某些实施方案中，等渗剂，例如糖类，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠可以是在组合物中合乎需要的。可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来带来可注射组合物的延长吸收。
用于皮内或皮下施用的溶液或悬浮液通常包括下列各项中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非发挥性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张力(tonicity)调节剂如，例如，氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠，或者具有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸酯等的缓冲液调节pH。此类制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小药瓶中。
通过以所需的量将本发明的CD20结合蛋白以及上述成分中的一种或组合加入适合的溶剂中，当需要时，继之以进行灭菌微过滤，可以制备无菌可注射溶液。通过将活性化合物加入至含有分散介质和其他成分(如上述那些)的无菌载体中，可以制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其除了来自其无菌过滤溶液的任何另外的所需成分之外还产生活性成分的粉末。
当将治疗有效量的本发明的CD20结合蛋白设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时，粘合剂将会是无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。考虑到适合的pH、等渗性、稳定性等，用于制备肠胃外可接受的蛋白质溶液的方法属于本领域技术。除了粘合剂之外，用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选的药物组合物将含有等渗载体如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液、或在本领域中已知的其他载体。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂、或对本领域技术人员来说公知的其他添加剂。
如在本文中其他地方描述的，化合物可以用保护化合物免于快速释放的载体来制备，如受控释放制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。许多用于制备这种制剂的方法申请了专利或是本领域技术人员通常已知的(参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(持续和受控释放药物递送系统)(J.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,NY,美国,1978))。
在某些实施方案中，可以将本发明的药物组合物配制成确保在体内的所需分布。例如，血脑屏障排除许多大型和/或亲水性化合物。为了将本发明的治疗性化合物或组合物靶向至特定的体内位置，可以将它们配制，例如，在可以包含被选择性地运输至特定细胞或器官的一个或多个部分的脂质体中，从而增强靶向药物递送。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素；甘露糖苷；抗体；表面活性剂蛋白A受体；p120联蛋白等。
多核苷酸、表达载体、和宿主细胞
除了本发明的CD20结合蛋白以外，编码这种CD20结合蛋白或其功能部分的多核苷酸也在本发明的范围内。术语“多核苷酸”是术语“核酸”的等同物，二者均包括脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物、核糖核酸(RNA)的聚合物、利用核苷酸类似物产生的这些DNA或RNA的类似物、以及它们的衍生物、片段和同系物。本发明的多核苷酸可以是单链的、双链的或三链的。公开的多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码示例性CD20结合蛋白的多核苷酸，例如，考虑RNA密码子的第三位中可容忍的但是作为不同的RNA密码子编码相同氨基酸的摆动性(wobble)(参见Stothard P,Biotechniques 28:1102-4(2000))。
在一个方面中，本发明提供编码本发明的CD20结合蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可以包括，例如，编码与包含CD20结合蛋白的氨基酸序列中的一个的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上的同一性的多肽的核酸序列。本发明还包括包含与编码本发明的CD20结合蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列，或者任何这种序列的反义序列或互补序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸(或CD20结合蛋白)的衍生物或类似物包括，尤其是，具有与本发明的多核苷酸或CD20结合蛋白基本同源的区域的多核苷酸(或多肽)分子，例如与相同尺寸的多核苷酸或多肽序列相比，或者当与比对的序列(其中所述比对由本领域中已知的计算机同源性程序进行)相比时，至少约45％、50％、70％、80％、95％、98％、或甚至99％的同一性(并且优选的同一性为80-99％)。示例性的程序是使用默认设置的GAP程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8for UNIX,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison,WI,美国)，其使用Smith T,Waterman M,Adv.Appl.Math.2:482-9(1981)的算法。还包括能够与编码本发明的蛋白的序列的互补序列在严格条件下杂交的多核苷酸(参见例如Ausubel F,等人，Current Protocols inMolecular Biology(当前分子生物学试验技术)(John Wiley&Sons,纽约,NY,美国,1993))，以及以下。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols inMolecular Biology(当前分子生物学试验技术)(John Wiley&Sons,NY,美国,Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989)中找到。
此外，本发明还提供包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。可以使用本领域内公知的材料和方法将能够编码本发明的CD20结合蛋白的多核苷酸插入至包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体在内的已知载体中以产生表达载体。这种表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统中产生预期的CD20结合蛋白所需的多核苷酸(例如以下实施例中描述的pTxb1和pIVEX 2.3)。用于与特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统一起使用的包含具体的多核苷酸的表达载体对本领域普通技术人员来说是公知的，可以是使用常规实验确定的，或者可以是购买的。
如在本文中所使用的，术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元直线或环形的多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够提供核酸区段在宿主细胞中的表达的多核苷酸区段。表达单元通常包含均处于可操作构型的转录启动子、编码目标多肽的开放阅读框、和转录终止子。表达载体含有一个或多个表达单元。因此，在本发明上下文中，编码包含单个多肽链(例如与志贺菌毒素效应子区连接的scFv)的CD20结合蛋白的表达载体至少包括用于该单个多肽链的表达单元，而编码包含例如两个以上多肽链(例如与毒素效应子区连接的包含VL结构域的一条链和包含VH结构域的第二链)的表达载体包括至少两个表达单元，各自用于CD20结合蛋白的两条多肽链中的每一个。对于多链CD20结合蛋白的表达，用于每条多肽链的表达单元还可以单独地包含在不同的表达载体中(例如，可以利用已经向其中引入用于每条多肽链的表达载体的单一宿主细胞实现表达)。
能够引导多肽和蛋白的瞬时或稳定表达的表达载体是在本领域内公知的。表达载体通常包括，但不限于下列各项中的一种或多种：异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列，其中的每一个均为在本领域内公知的。任选的调节控制顺序、整合序列、和可以采用的可用标记物是在本领域中已知的。
术语“宿主细胞”是指可以支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，或者真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类、或哺乳动物细胞)。可以使用在本领域中已知的标准技术来实现包含本发明的多核苷酸或能够产生本发明的CD20结合蛋白的宿主细胞系的创建和分离。
在本发明的范围内的CD20结合蛋白可以是在本文中所描述的CD20结合蛋白的变体或衍生物，其是这样产生的：通过改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入一个或多个氨基酸来修饰编码CD20结合蛋白的多核苷酸以可以使其更适用于实现所需性质，如通过宿主细胞的更优的表达。
用于使用本发明的CD20结合蛋白或药物组合物的方法
总体而言，本发明的目的是提供药理学活性剂，以及包含其的组合物，其可以用于预防和/或治疗疾病、病症、和病况，如癌症、肿瘤、免疫病症、或在本文中提到的另外的病理病况。因此，本发明提供使用本发明的CD20结合蛋白和药物组合物杀伤表达CD20的细胞、将另外的外源物质递送至表达CD20的细胞、标记表达CD20的细胞的内部、以及治疗如在本文中所描述的疾病、病症、和病况的方法。
尤其是，本发明的目的是，提供与当前在本领域中已知的药剂、组合物、和/或方法相比具有某些优点的这样的药理学活性剂、组合物、和/或方法。因此，本发明提供使用具有指定的多肽序列的CD20结合蛋白及其药物组合物的方法。例如，可以具体使用SEQ ID NO:1、3、4、6-12、14、16、和/或18-29中的任何多肽序列作为在以下方法中使用的CD20结合蛋白的组分。
本发明提供杀伤表达CD20的细胞的方法，所述方法包括在体外或体内使所述细胞与本发明的CD20结合蛋白或药物组合物接触的步骤。在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白或药物组合物可以用于杀伤在包括不表达CD20的细胞在内的不同细胞类型的混合物(如包含癌细胞、感染的细胞、和/或血细胞的混合物)中的表达CD20的细胞。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白或药物组合物可以用于杀伤在不同细胞类型的混合物中的癌细胞，如在生物体中。在某些实施方案中，当在体外或体内施用于受试者如需要治疗的病人中的细胞群时，单独或与其他化合物或药物组合物组合的本发明的CD20结合蛋白或药物组合物可以显示出强效的细胞杀伤活性。通过使用高亲和性免疫球蛋白型结合区将具有酶活性的志贺菌毒素区的递送靶向CD20，可以将这种强效细胞杀伤活性限制为特异性且选择性地杀伤生物体内的某些细胞类型，如癌细胞、肿瘤细胞、恶性细胞、非恶性肿瘤细胞、或感染的细胞。
术语“癌细胞”或“癌性细胞(cancerous cell)”是指以非正常加速方式生长和分裂的各种肿瘤细胞并且对技术人员来说将会是清楚的。术语癌细胞包括恶性细胞和非恶性细胞二者。通常，癌症和/或肿瘤可以被定义为接受治疗和/或预防的疾病、病症、或病况。包括在癌细胞和/或肿瘤细胞内的癌症和肿瘤(恶性的或非恶性的)对技术人员来说将会是清楚的。
本发明提供杀伤患者中表达CD20的细胞的方法，所述方法包括向患者施用至少一种本发明的CD20结合蛋白或其药物组合物的步骤。
CD20结合蛋白或其药物组合物的某些实施方案可以用于杀伤患者中表达CD20的免疫细胞(无论是健康的或恶性的)。
在本发明的范围内的是，使用本发明的CD20结合蛋白或其药物组合物来对从自患者中取出的分离的细胞群中的B细胞进行体外消除。
此外，本发明提供治疗患者中疾病、病症、或病况的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的CD20结合蛋白或其药物组合物中的至少一种的步骤。可以使用这种方法治疗的预期的疾病、病症、和病况包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、和免疫病症。施用“治疗有效剂量”的本发明的化合物可以造成疾病症状的严重性的降低，无疾病症状周期的频率和持续时间的增加，或由于疾病折磨而导致的损害或残疾的预防。
本发明的化合物的治疗有效量将取决于给药途径、所治疗的哺乳动物的类型、和在考虑中的特定患者的身体特性。对于医学领域的技术从业人员来说，这些因素以及它们与确定这种量的关系是公知的。这种量和施用方法可以进行调节以实现最佳功效，并且可以取决于医学领域中的技术人员公知的因素，如重量、饮食、并存的药物和其他因素。最适用于人类用途的剂量大小和给药方案可以通过由本发明得到的结果来指导，并且可以在适当设计的临床试验中确认。可以通过常规方式、在实验动物中以低剂量开始并且之后在监测效果的同时增加剂量、以及系统性地改变给药方案来确定有效剂量和治疗方案。当为给定受试者确定最佳剂量时，临床医师可以考虑许多因素。这些考虑对技术人员来说是已知的。
可接受的给药途径可以指任何在本领域中已知的施用途径，包括但不限于气雾剂、经肠、经鼻、经眼、经口、经肠胃外、经直肠、经阴道、或透皮(例如，局部施用霜剂、凝胶或软膏，或通过透皮贴剂)。“肠胃外施用”通常是关于在预期作用部位的注射或与预期作用部位的连通，包括肿瘤内注射、眶下、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊髓内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜、或经气管施用。
对于本发明的药物组合物的施用来说，剂量范围通常将为约0.0001至100毫克/千克(mg/kg)的宿主体重，并且更通常为0.01至5mg/kg的宿主体重。示例性剂量可以是0.25mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围。示例性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两或三个月一次或者每三至6个月一次。剂量可以由熟练的健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使特定患者的治疗益处最大化。
本发明的药物组合物通常将会在多种情形下施用于同一位患者。单次给药之间的间隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每两或三个月、每六个月、或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其他标记物，给药之间的间隔也可以是不规律的。本发明的化合物的剂量方案包括以1mg/kg体重或3mg/kg体重将化合物每两至四周施用一次达六个剂量，之后以3mg/kg体重或1mg/kg体重每三个月施用一次的静脉内施用。
利用在本领域中已知的各种方法中的一种或多种，可以经由一种或多种给药途径施用本发明的药物组合物。如技术人员将会理解的是，将会根据所需的结果改变施用的途径和/或模式。用于本发明的CD20结合蛋白或药物组合物的给药途径包括，例如静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓、或其他肠胃外给药途径，例如通过在预期作用部位的注射或输注或者与预期作用部位连通(例如肿瘤内注射)。在其它实施方案中，本发明的CD20结合蛋白或药物组合物可以通过非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜给药途径，例如，鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下、或局部。
可以利用在本领域中已知的各种医疗装置中的一种或多种施用本发明的治疗性CD20结合蛋白或药物组合物。例如，在一个实施方案中，可以利用皮下注射设备施用本发明的药物组合物。本领域中可用于本发明的公知的植入物和模块的实例包括例如，用于受控速率递送的可植入微输注泵；用于通过皮肤施用的装置；用于以精确的输注速率递送的输注泵；用于连续药物递送的变流可植入输注装置；以及渗透药物递送系统。这些和其他此类植入物、递送系统、和模块是本领域技术人员已知的。
本发明的CD20结合蛋白或药物组合物可以单独施用或者与一种或多种其他治疗剂或诊断剂组合施用。组合治疗可以包括与基于待治疗的特定具体患者、疾病或病况选择的至少一种其他治疗剂组合的本发明的CD20结合蛋白或其药物组合物。其他此类药剂的实例包括，尤其是，细胞毒性抗癌症或化疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性小分子或多肽、单链抗体、传统抗体或其片段、或调节一个或多个信号传导途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性治疗方案中是补充的或有益的类似的调节治疗物。
利用本发明的CD20结合蛋白或药物组合物的某些实施方案治疗患者将会导致靶向的细胞的细胞死亡和/或靶向的细胞的生长抑制。因此，本发明的CD20结合蛋白以及包含它们的药物组合物将可用于治疗各种在其中杀伤或消耗靶标细胞可以是有益的病理病症如尤其是癌症、免疫病症、和感染的细胞的方法。本发明提供用于抑制细胞增殖以及治疗细胞病症包括肿瘤形成和过度活跃B细胞的方法。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白和药物组合物可以用于治疗或防止癌症、肿瘤(恶性的和非恶性的)、和免疫病症。
在某些实施方案中，本发明提供用于治疗哺乳动物受试者如人中恶性肿瘤或赘生物以及其他与血细胞有关的癌症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的CD20结合蛋白或药物组合物的步骤。
本发明的CD20结合蛋白和药物组合物具有不同的应用，包括例如，作为抗肿瘤药的用途、在调节免疫应答中的用途、在清除不需要的细胞类型的移植组织中的用途、以及作为诊断剂的使用。本发明的CD20结合蛋白和药物组合物通常是抗肿瘤药——意味着它们能够通过抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或引起它们的死亡来治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟、或扩散。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合蛋白或药物组合物用于治疗B细胞介导的疾病或病症，如，例如白血病(leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)、淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘(asthma)、克罗恩病(Crohn’s disease)、糖尿病(diabetes)、移植排斥(graft rejection)、移植物抗宿主病(graft-vs.-host disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome)、HIV相关疾病、红斑狼疮(lupus erythematosus)、多发性硬化(multiple sclerosis)、多动脉炎(polyarteritis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、感染性休克(septic shock)、舍格伦综合征(Sjorgren’s syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、和血管炎(vasculitis)。
可以将本发明的CD20结合蛋白和药物组合物用于包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的CD20结合蛋白或药物组合物的治疗癌症的方法。被证明具有CD20表达的一些癌症包括，但不限于，B细胞淋巴瘤(包括非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)和霍奇金氏(Hodgkin’s)二者)、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia)、一些T细胞淋巴瘤、和黑色素瘤癌干细胞。在本发明的方法的某些实施方案中，待治疗的癌症选自由下列各项组成的组：骨癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、和骨髓瘤。
可以将本发明的CD20结合蛋白和药物组合物用于包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的CD20结合蛋白或药物组合物的治疗免疫病症的方法。在本发明的方法的某些实施方案中，所述免疫病症与炎症有关，所述炎症与选自由下列各项组成的组的疾病有关：淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘(asthma)、克罗恩病(Crohn’s disease)、糖尿病(diabetes)、移植排斥(graftrejection)、移植物抗宿主病(graft-vs.-host disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome)、HIV相关疾病、红斑狼疮(lupus erythematosus)、多发性硬化(multiple sclerosis)、多动脉炎(polyarteritis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、感染性休克(septic shock)、舍格伦综合征(Sjorgren’s syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、和血管炎(vasculitis)。
在本发明的某些实施方案中的是使用CD20结合蛋白作为用于治疗或预防癌症、肿瘤、或免疫病症的药物的组分。例如，可以用这种药物治疗在患者皮肤上出现的免疫病症以试图减轻炎症。
除了本发明的CD20结合蛋白以外，当适用时，编码这种分子的多核苷酸也在本发明的范围内。术语“多核苷酸”是术语“核酸”的等同物，二者均包括脱氧核糖核酸和核糖核酸的聚合物。这种多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码指定的CD20结合蛋白的多核苷酸，例如，考虑已知的在氨基酸密码子的第三位中容忍的但是编码相同氨基酸的摆动性(wobble)。此外，本发明包括包含在本发明范围内的多核苷酸的表达载体。这种表达载体将包含支持在任何所选择的宿主细胞内产生本发明的CD20结合蛋白所必需的多核苷酸。用于与特定类型的宿主细胞一起使用的包含具体的多核苷酸的表达载体对本领域普通技术人员来说是公知的，可以是使用常规实验确定的，或者可以是购买的。
本发明还提供通过在体内或体外如在患者中使细胞与本发明的CD20结合蛋白接触将CD20结合蛋白迅速内化至所述细胞内部的方法。本发明还提供通过在体内或体外如在患者中使细胞与本发明的CD20结合蛋白接触而杀伤表达CD20的细胞(其中所述细胞在其表面上表达CD20抗原)的方法。
如果本发明的CD20结合蛋白包含外源物质或与其缀合，如上所述，可以在将所述外源物质递送至在其细胞表面上表达CD20抗原的靶标细胞中的方法中使用那些CD20结合蛋白。本发明还提供通过在体内或体外如在患者中使表达CD20的细胞与本发明的CD20结合蛋白接触将外源物质递送至所述细胞内部的方法。
此外，可以在用于治疗癌症的方法中使用本发明的CD20结合蛋白，其中肿瘤或癌细胞在其表面上表达CD20抗原，所述方法包括向需要这种治疗的患者施用本发明的蛋白。被证明具有CD20表达的一些癌症包括，但不限于，B细胞淋巴瘤(包括非霍奇金氏和霍奇金氏二者)、多毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、一些T细胞淋巴瘤、和黑色素瘤癌干细胞。
对于本发明的目的来说，术语“淋巴瘤”包括B细胞淋巴瘤(如非霍奇金氏和霍奇金氏类型)、多毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、T细胞淋巴瘤、和黑色素瘤癌干细胞型淋巴瘤。
以下将本发明的某些实施方案编号为1-40并且参考表C的生物序列：(1)一种用于细胞中CD20抗原的内化的CD20结合蛋白，其中所述蛋白包含对CD20特异的结合区和源于志贺菌样毒素1(SLT-1)的毒素效应子区，其中所述蛋白引起存在于细胞表面上的CD20的快速内化。(2)实施方案1的CD20结合蛋白，其中所述蛋白在小于约一小时内引起B细胞谱系细胞中CD20的内化。(3)权利要求1的CD20结合蛋白，其中所述毒素效应子区包含NO:1的氨基酸75至251(参见表C)。(4)实施方案1的CD20结合蛋白，其中所述毒素效应子区包含NO:1的氨基酸1至251。(5)实施方案1的CD20结合蛋白，其中所述毒素效应子区包含NO:1的氨基酸1至261。(6)实施方案1的CD20结合蛋白，其中所述蛋白是具有细胞毒性的。
(7)实施方案1的CD20结合蛋白，其中所述CD20结合区选自由下列各项组成的组：Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、scFv、双抗体、CDR3肽、受约束的FR3-CDR3-FR4肽、纳米抗体、二价纳米抗体、小模块化免疫药物(SMIP)、鲨鱼可变IgNAR结构域、微抗体、以及保持CD20结合功能的任何片段或化学或遗传操作的对应物。(8)实施方案1的CD20结合蛋白，其中所述结合区是scFv。
(9)实施方案8的CD20结合蛋白，其中所述结合区包含(A)(i)包含如分别在NO:6、NO:7、和NO:8中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，和(ii)包含如分别在NO:9、NO:10、和NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(B)(i)包含如分别在NO:21、NO:22、和NO:23中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，和(ii)包含如分别在NO:24、NO:10、和NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域。
(10)实施方案8的CD20结合蛋白，其中所述CD20结合区包含NO:4的氨基酸2至245。(11)实施方案1的CD20结合蛋白，其中所述CD20结合区包含NO:4的氨基酸2至245并且所述毒素效应子区包含NO:1的氨基酸75至251。(12)实施方案1的CD20结合蛋白，其包含NO:4。(13)一种用于杀伤在其表面上表达CD20的细胞的CD20结合蛋白，其中所述结合区包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含如分别在NO:6、NO:7、和NO:8中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列，所述轻链可变(VL)结构域包含如分别在NO:9、NO:10、和NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列，其中在施用后，所述蛋白能够杀伤在其表面上表达CD20的细胞。
(14)实施方案13的CD20结合蛋白，其中所述CD20结合区包含NO:4的氨基酸2至245。(15)实施方案13的CD20结合蛋白，其中所述CD20结合区包含NO:4的氨基酸2至245并且所述毒素效应子区包含NO:1的氨基酸75至251。(16)实施方案13的CD20结合蛋白，其包含NO:4。
(17)一种CD20结合蛋白，所述CD20结合蛋白用于将外源物质递送至在其表面上表达CD20的细胞中，其中所述蛋白包含对CD20特异的结合区、毒素效应子区、以及外源物质，其中所述毒素效应子区源于志贺菌样毒素1(SLT-1)，其中在施用后，所述蛋白能够将所述外源物质递送至在其表面上表达CD20的细胞中。
(18)实施方案17的CD20结合蛋白，其中所述结合区包含(A)(i)包含如分别在NO:6、NO:7、和NO:8中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，和(ii)包含如分别在NO:9、NO:10、和NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(B)(i)包含如分别在NO:21、NO:22、和NO:23中所示的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的重链可变(VH)结构域，和(ii)包含如分别在NO:23、NO:10、和NO:11中所示的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域。
(19)实施方案18的CD20结合蛋白，其中所述外源物质选自由下列各项组成的组：肽、蛋白质、和核酸。(20)实施方案19的CD20结合蛋白，其中所述外源物质是肽并且所述肽是抗原。(21)实施方案20的CD20结合蛋白，其中所述抗原被编码在所述蛋白的所述结合区和所述毒素效应子区之间。(22)实施方案19的CD20结合蛋白，其中所述抗原源于病毒蛋白。(23)实施方案21的CD20结合蛋白，其中所述抗原是NO:2。(24)实施方案21的CD20结合蛋白，其包含NO:5。(25)实施方案20的CD20结合蛋白，其中所述抗原源于细菌蛋白。(26)实施方案20的CD20结合蛋白，其中所述抗原源于在癌中突变的蛋白。(27)实施方案20的CD20结合蛋白，其中所述抗原源于在癌中异常表达的蛋白。(28)实施方案20的CD20结合蛋白，其中所述抗原源于T细胞CDR区。
(29)实施方案19的CD20结合蛋白，其中所述外源物质是蛋白质。(30)实施方案29的CD20结合蛋白，其中所述蛋白质是酶。(31)实施方案19的CD20结合蛋白，其中所述外源物质是核酸。(31)实施方案30的CD20结合蛋白，其中所述核酸是siRNA。(32)编码实施方案1的CD20结合蛋白的多核苷酸。(33)包含实施方案32的多核苷酸的表达载体。(34)包含实施方案33的表达载体的宿主细胞。
(35)一种将CD20抗原迅速内化至患者细胞中的方法，所述方法包括向患者施用实施方案1-12中任一项的蛋白的步骤。(36)一种杀伤患者中在其表面上表达CD20抗原的细胞的方法，所述方法包括向患者施用实施方案1-16中任一项的蛋白的步骤。(37)一种将外源物质递送至在其表面上表达CD20的患者细胞中的方法，所述方法包括向患者施用实施方案17-31中任一项的蛋白的步骤。(39)一种治疗患者中癌症的方法，其中所述癌症在肿瘤或癌细胞表面上表达CD20抗原，所述方法包括向患者施用实施方案1-31中任一项的蛋白的步骤。(40)实施方案39的方法，其中所述癌症淋巴瘤。
表C.实施方案中1-40中涉及的序列
Figure GDA0000798920150000471
Figure GDA0000798920150000481
Figure GDA0000798920150000491
Figure GDA0000798920150000501
Figure GDA0000798920150000511
通过以下包含源于志贺菌毒素家族成员A亚基的志贺菌毒素效应子区和含有能够结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白型多肽的CD20结合区的CD20结合蛋白的非限制性实例，进一步说明了本发明。
实施例
以下实施例说明了本发明的某些实施方案。然而，应该理解的是，这些实施例仅用于说明目的，并且并非意在也不应被理解为完全限定本发明的状态和范围。所述实施例使用标准技术进行，除了在另外详细描述的情况下，其对本领域技术人员来说是公知的和常规的。
以下实施例显示了示例性CD20结合蛋白选择性地杀伤在其细胞表面上表达CD20的细胞的能力。示例性CD20结合蛋白与由靶向的细胞类型表达的CD20上的细胞外抗原结合并且进入靶向的细胞。内化的CD20结合蛋白为其志贺菌毒素效应子区提供向细胞溶质的路线以使核糖体失活并且随后导致靶向的细胞的凋亡性死亡(apoptotic death)。因此，在CD20结合蛋白与细胞表面CD20形成复合物之后，凭借其引起快速细胞内化的志贺菌毒素效应子区，示例性CD20结合蛋白能够在表达CD20的细胞类型中内化。
这些示例性CD20结合蛋白包括αCD20scFv::SLT-1A版本1(SEQ ID NO:4)、αCD20scFv::SLT-1A版本2(SEQ ID NO:16)、B9E9-SLT-1A(SEQ ID NO:12)、和C2B8-SLT-1A(SEQ ID NO:14)。
实施例1-示例性CD20结合蛋白的构建、制备、和纯化
首先，设计或选择CD20结合区和志贺菌毒素效应子区。在以下实施例中，志贺菌毒素效应子区源于志贺菌样毒素1的A亚基(SLT-1A)。得到含有被克隆至pECHE9A质粒中并且编码SLT-1A的氨基酸1-251的SLT-1A的片段的多核苷酸(Cheung M等人，Mol Cancer 9:28(2010))。
将CD20结合区设计为源于1H4CD20单克隆抗体的重组scFv(Haisma等人(1999),Blood 92:184-90)。通过接头(SEQ ID NO:18)分隔两个免疫球蛋白可变区(VL和VH)。
第二，将结合区和志贺菌毒素效应子区组合以形成单链的重组多肽。在本实施例中，在具有源于编码鼠IgG3分子(SEQ ID NO:20)的多核苷酸的“鼠铰链”多核苷酸的框中，以及在具有编码SLT-1A(SEQ ID NO:1的残基1-251)的多核苷酸的框中，克隆编码源于1H4CD20单克隆抗体的重组scFv的多核苷酸。全长序列以编码被克隆在框中以有助于检测和纯化的多核苷酸序列的
Figure GDA0000798920150000531
(SEQ ID NO:19)开始。利用来自DNA 2.0,Inc.(Menlo Park,CA,美国)的服务，针对在大肠杆菌中的有效表达，对本实施例的多核苷酸序列进行密码子优化，从而产生编码αCD20scFv::SLT-1A版本1的表达载体。
以相似的方式构建并制备包含流感抗原的不同的CD20结合蛋白。DNA 2.0,Inc.(Menlo Park,CA,美国)合成了多种多核苷酸，包括抗原序列(SEQ ID NO:3)，并且使用载体pJ201将所需的多核苷酸组分结合到框中以创建编码以下各项的开放阅读框：单链多肽(从氨基端至羧基端)
Figure GDA0000798920150000532
(SEQ ID NO:19)、源于1H4的重组scFv(上述)、鼠IgG3分子(SEQ ID NO:20)、接头(SEQ ID NO:3)、和源于SLT-1A的序列(SEQ ID NO:1的残基1-251)。出于多肽制备目的，将这种重组的多核苷酸克隆至pTXB1中。同样地，由DNA 2.0,Inc.(Menlo Park,CA,美国)进行针对大肠杆菌中有效表达的密码子优化，以制备编码αCD20scFv::SLT-1A版本2的表达载体。
第三，通过使用用于细菌和无细胞蛋白质翻译系统二者的标准技术制备αCD20scFv::SLT-1A重组CD20结合蛋白的版本1和2二者。之后，使用在本领域内公知的技术纯化和分离CD20结合蛋白。
实施例2–确定示例性CD20结合蛋白的解离常数(KD)
通过基于荧光的流式细胞术测定来确定αCD20scFv::SLT-1A CD20结合蛋白版本1和2二者的细胞结合特征。每个样品含有0.5x106个表达CD20的细胞(Raji(CD20+))或不表达CD20的细胞(BC1(CD20-))并且与100μL的CD20结合蛋白的各种稀释液在具有1％牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem,San Diego,CA,美国)的磷酸盐缓冲盐水Hyclone 1X PBS(Fisher Scientific,Waltham,MA)(在下文中被称为“1X PBS+1％BSA”)中在4摄氏度(℃)温育1小时。选择CD20结合蛋白的最高浓度以引起反应的饱和。将细胞用1X PBS+1％BSA洗涤两次。将细胞与100μL含有0.3μg抗Strep
Figure GDA0000798920150000533
mAb-FITC(#A01736-100,Genscript,Piscataway,NJ,美国)的1X PBS+1％BSA在4℃温育1小时。将细胞用1X PBS+1％BSA洗涤两次，悬浮在200μL的1X PBS中，并且进行流式细胞术。所有样品的基线校正的平均荧光强度(MFI)数据通过从每个实验样品中减去FITC单独样品(阴性对照)的MFI而得到。使用Prism软件(GraphPad Software,San Diego,CA,美国)绘制MFI对“蛋白浓度”的图。使用Prism软件在标题结合饱和(binding-saturation)下的单一位点结合(one-site binding)的函数[Y＝B最大*X/(KD+X)]，使用基线校正数据计算B最大和KD。B最大是MFI中报告的最大特异性结合。KD是以纳摩尔(nM)报告的平衡结合常数。经过多个实验，确定αCD20scFv::SLT-1A版本1对Raji(CD20+)细胞的KD为约80-100nM。在一个实验中，测得与CD20+细胞结合的αCD20scFv::SLT-1A版本1CD20结合蛋白的B最大为约140,000MFI，KD为约83nM(表1)，而在这个测定中没有观察到有意义的与CD20-细胞的结合。在一个实验中，测得与CD20+细胞结合的αCD20scFv::SLT-1A版本2的B最大为约110,000MFI，KD为约101nM(表1)，而在这个测定中没有观察到有意义的与CD20-细胞的结合。
表1.结合特征：示例性CD20结合蛋白的B最大和KD的代表值
Figure GDA0000798920150000541
实施例3-确定示例性CD20结合蛋白的半最大抑制浓度(IC50)
利用使用
Figure GDA0000798920150000543
快速偶联转录/翻译(Quick Coupled Transcription/Translation)试剂盒(L1170Promega Madison,WI,美国)的无细胞体外蛋白质翻译测定来确定αCD20scFv::SLT-1A CD20结合蛋白版本1和2二者的核糖体失活能力。所述试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA(Luciferase T7Control DNA)(L4821Promega Madison,WI,美国)和
Figure GDA0000798920150000542
Quick Master Mix。根据制造商说明书准备核糖体活性反应。
在适合的缓冲液中制备一系列待测αCD20scFv::SLT-1A版本的10倍稀释液并且为每个稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物组分。将在αCD20scFv::SLT-1A蛋白的稀释系列中的各个样品与TNT反应混合物以及荧光素酶T7对照DNA中的每一个合并。将测试样品在30℃温育1.5小时。在温育之后，将荧光素酶测定试剂(E1483Promega,Madison,WI,美国)加入至所有测试样品中并且根据制造商说明通过荧光测量荧光素酶蛋白翻译的量。通过总蛋白的log转化的浓度相对于相对荧光单位的非线性回归分析确定翻译抑制的水平。使用统计学软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,美国)，使用Prism软件在标题剂量响应抑制(dose-response-inhibition)下的log(抑制剂)vs.响应(三参数)的函数[Y＝底部+((顶部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]计算每个样品的半最大抑制浓度(IC50)值。计算实验蛋白和仅SLT-1A的对照蛋白的IC50。通过[(SLT-1A对照蛋白的IC50/实验蛋白的IC50)x 100]计算仅SLT-1A的对照蛋白的百分比。
αCD20scFv::SLT-1A的两个版本对无细胞蛋白合成的抑制作用是强的。多个实验确定αCD20scFv::SLT-1A的两个版本的IC50为大约50皮摩尔(pM)。在一个实验中，αCD20scFv::SLT-1A版本1对蛋白合成的IC50为约38pM或在仅SLT-1A的阳性对照的19％以内(表2)。类似地，在该无细胞测定中，αCD20scFv::SLT-1A版本2对蛋白合成的IC50为约58pM或在仅SLT-1A的阳性对照的18％以内(表2)。
表2.核糖体失活：示例性CD20结合蛋白的代表性半最大抑制浓度(IC50)
Figure GDA0000798920150000551
实施例4-通过免疫荧光测定确定细胞内化
进行免疫荧光研究以便分析与CD20-细胞系(BC-1、Jurkat(J45.01)，和U266)相比在CD20+阳性细胞系(Daudi、Raji、和Ramos)中αCD20scFv::SLT-1A版本1的结合和内化特征。例如，将50nM相应的CD20结合蛋白与0.8x106Raji细胞在37℃温育1小时以允许CD20结合蛋白的结合和内化。之后将细胞用1XPBS洗涤，用BD cytofix/cytoperm(BDBiosciences,San Jose,CA,美国)固定并渗透化(permeabilized)，并且之后用1X BDPerm/WashTM缓冲液(BD Biosciences,San Jose,CA,美国)洗涤两次。将所述细胞与Alexa
Figure GDA0000798920150000552
标记的小鼠抗SLT-1A抗体(BEI Resources,Manassas,VA,美国)在1X BDPerm/WashTM缓冲液中在室温下温育45分钟。之后将细胞洗涤，并且用BD cytofix(BDBiosciences,San Jose,CA,美国)在4℃固定10分钟。之后将细胞用1XPBS洗涤并且在1XPBS中重悬，并且之后使细胞粘附到聚-L-赖氨酸包被的载玻片(VWR,Radnor,PA,美国)上。将载玻片用含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield(Fisher Scientific,Waltham,MA,美国)盖上并且通过Zeiss荧光显微镜(Zeiss,Thornwood,NY,美国)观察。
免疫荧光研究显示，αCD20scFv::SLT-1A版本1和B9E9-SLT-1A在37℃在一小时内结合至细胞表面并且进入表达CD20的细胞中。
实施例5-CD20+细胞杀伤测定：确定CD20结合蛋白的细胞毒性选择性和半最大细胞毒性浓度(CD50)
通过CD20+细胞杀伤测定来确定αCD20scFv::SLT-1A的两种版本的细胞毒性特征。这种测定确定与不表达靶标生物分子的细胞相比CD20结合蛋白杀伤细胞表面上表达CD20的细胞的能力。将细胞铺板(2x103个/孔)在384孔板中的20μL培养基中。将待测的αCD20scFv::SLT-1A蛋白在1X PBS中稀释5倍或10倍并且将5μL的稀释液或缓冲液对照加入至细胞中。仅含有培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与待测αCD20scFv::SLT-1A或仅PBS缓冲液在37℃并且在5％二氧化碳(CO2)的气氛中温育3天。使用
Figure GDA0000798920150000561
荧光细胞活性测定(Luminescent Cell Viability Assay)(G7573Promega Madison,WI,美国)根据厂商说明利用荧光读数器确定总细胞存活或百分比生活力。使用以下等式计算实验孔的“百分比生活力”：(测试RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU)*100。使用Prism软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,美国)对log多肽浓度相对于百分比生活力进行作图，并且使用log(抑制剂)对归一化响应(变化的斜率)分析来确定示例性CD20结合蛋白的半最大细胞毒性浓度(CD50)值。此外，使用这种细胞杀伤测定分析来自淋巴瘤患者的细胞样品以确定αCD20scFv::SLT-1A版本1的细胞毒性特征。
经过多个实验，αCD20scFv::SLT-1A的两种版本显示出与CD20阴性细胞系的细胞杀伤相比具有10至1000倍特异性的CD20特异性细胞杀伤(表3)。αCD20scFv::SLT-1A的两种版本的CD20特异性细胞杀伤特征还与缺乏CD20特异性的组分SLT-1A(251)的杀伤细胞的能力相对比(表3)。测得αCD20scFv::SLT-1A蛋白的两种版本对于CD20+细胞的CD50值为约3-70nM(取决于细胞系)，与之相比的是CD20-细胞系的超过600-2,000(表3)。与细胞表面上表达CD20的细胞相比，αCD20scFv::SLT-1A版本1CD20结合蛋白对于不在细胞表面上表达CD20的CD50大超过100至400倍(较低的细胞毒性)。αCD20scFv::SLT-1A版本对来自患者样品的人淋巴瘤细胞的CD50为约7-40nM(表3)。
表3.选择性细胞毒性：示例性CD20结合蛋白的代表性半最大细胞毒性浓度(CD50)
Figure GDA0000798920150000571
实施例6-比较的CD20+细胞杀伤：确定CD20结合蛋白对CD20+细胞的相对细胞毒性
使用如以上实施例5中所述的Raji细胞(CD20+)中的CD20+细胞杀伤测定来测试三种潜在的细胞毒性CD20结合蛋白。在表4中报告了一组代表性的结果。经过多个实验，与CD20结合蛋白B9E9(SEQ ID NO:12)相比，αCD20scFv::SLT-1A版本1展现出大50至100倍的细胞杀伤功能(表4)。
表4.示例性CD20结合蛋白对CD20+Raji细胞的代表性半最大细胞毒性浓度(CD50)
CD20结合蛋白 CD<sub>50</sub>(nM)
仅SLT-1A的阴性对照 429
αCD20scFv::SLT-1A版本1 2
αCD20scFv-B9E9::SLT-1A 103
实施例7-利用体内异种移植研究确定CD20结合蛋白的靶向细胞毒性
使用两个基于免疫受损小鼠品系的异种移植模型系统研究示例性CD20结合蛋白在体内以及在肿瘤环境中随时间并且以各种剂量杀伤CD20+肿瘤细胞的能力。这些异种移植模型系统依赖于相比于其他免疫系统缺陷尤其缺乏移植物抗宿主应答(graft versushost response)的充分表征的小鼠品系。首先，使用SCID(严重联合免疫缺陷)小鼠研究静脉内肿瘤模型以在整个小鼠内形成播散性肿瘤，从而测试示例性CD20结合蛋白对人肿瘤细胞的体内效果。第二，使用BALBc/裸小鼠研究皮下肿瘤模型以在小鼠上形成皮下肿瘤，从而再次测试示例性CD20结合蛋白对人肿瘤细胞的体内效果。
对于第一异种移植系统，用在200μL PBS中的1x107个源于Raji-luc人淋巴瘤的细胞(Molecular Imaging,Ann Arbor,MI,美国)攻击(challenge)三十二只C.B.-17SCID小鼠(分为四组，每组八只动物)。在肿瘤攻击之后第5-9和12-16天，以下各组通过静脉内施用接受以下各项：组1：PBS；组2：2mg/kg剂量的αCD20scFv::SLT-1A版本2；组3：2mg/kg剂量的αCD20scFv::SLT-1A版本1；和组4：4mg/kg剂量的αCD20scFv::SLT-1A版本1(仅第5-9天)。在第5、10、15、和20天，使用Caliper IVIS 50光学成像系统(Perkin Elmer,Waltham,MA,美国)测量以1x106光子/秒单位(p/s)计的生物荧光。图2示出了αCD20scFv::SLT-1A的两种版本和在两种剂量水平的αCD20scFv::SLT-1A版本1是如何导致与PBS阴性对照相比统计学上显著低的总生物荧光的。总生物荧光的降低反映了用本发明的CD20结合蛋白治疗之后播散性肿瘤负荷(tumor burden)的统计学上显著的降低。图3显示在施用αCD20scFv::SLT-1A的任一版本的情况下存活的统计学上显著的增加。与PBS对照相比，全部治疗将平均存活时间增加了五天。
对于第二异种移植模型，用2.5x106个Raji人淋巴瘤细胞(WashingtonBiotechnology,Simpsonville,MD,美国)皮下攻击二十八只BALBc/裸(分为四组，每组六或七只动物)。利用在本领域中已知的标准方法使用卡尺确定肿瘤体积。将每个小鼠的平均肿瘤体积达到大约160mm3(各组中的一只小鼠具有大于260mm3的肿瘤，因此将其排除)的时间点设定为第0天。在第0-4和7-11天，各组按组接受以下各项的静脉内施用：组1：PBS；组2：2mg/kg剂量的αCD20scFv::SLT-1A版本2；组3：2mg/kg剂量的αCD20scFv::SLT-1A版本1；组4：4mg/kg剂量的αCD20scFv::SLT-1A版本1。测量肿瘤体积并且将其作为研究天数的函数作图。图4显示利用αCD20scFv::SLT-1A版本1的治疗(两种剂量水平)是如何到第24天时导致与PBS对照相比明显减小的肿瘤体积的。这还反映于在表5中报告的到第54天时无肿瘤小鼠数量中。
表5.皮下肿瘤小鼠模型中通过示例性CD20结合蛋白消除肿瘤
Figure GDA0000798920150000591
实施例8-确定CD20结合蛋白在非人灵长动物中的体内效果
将示例性CD20结合蛋白αCD20scFv::SLT-1A版本1施用于非人灵长类动物以便测试体内效果。在肠胃外施用不同剂量的αCD20scFv::SLT-1A版本1后观察猕猴(cynomolgus)灵长类动物中外周血B淋巴细胞的体内消耗。
在一个实验中，在2周内每隔一天用PBS或不同剂量(50、150、和450毫克药物/千克体重(mcg/kg))的αCD20scFv::SLT-1A版本1对十只猕猴灵长类动物进行静脉内注射。之后，分析在第3和8天给药前收集的外周血样品的表达CD20的B淋巴细胞的百分数(图5和6)。在猕猴(cynomolgus monkeys)中，已经通过流式细胞术描述了两个不同的B细胞亚组：(1)表达高水平CD20的CD21阴性、CD40阳性细胞，以及(2)表达较低水平的CD20的CD21阳性和CD40阳性细胞(Vugmeyster Y等人,Cytometry 52:101-9(2003))。在第3天(在以50、150和450mcg/kg给药的动物中减少4、14和45％)和第8天(在以50、150和450mcg/kg给药的动物中减少32、52和75％)观察与来自在治疗前收集的血液样品的基线水平相比的剂量依赖性B细胞减少(表6)。该实验显示，αCD20scFv::SLT-1A版本1能够在体内杀伤CD20阳性、灵长类B细胞。
表6.非人灵长类动物中CD20结合蛋白剂量依赖性的B细胞减少
Figure GDA0000798920150000601
实施例9-源于志贺菌样毒素-1和抗体奥法木单抗(ofatumumab)的CD20结合蛋白
在本实施例中，志贺菌毒素效应子区源于志贺菌样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区αCD20源于单克隆抗体奥法木单抗(ofatumumab)(Gupta I,Jewell R,AnnN Y Acad Sci 1263:43-56(2012))，其包含能够结合人CD20的免疫球蛋白型结合区。
CD20结合蛋白SLT-1A::αCD20的构建、制备、和纯化
将免疫球蛋白型结合区αCD20和志贺菌毒素效应子区连接在一起以形成蛋白。例如，通过表达编码CD20结合蛋白SLT-1A::αCD20的多核苷酸来制备融合蛋白。使用如前面实施例中描述的细菌和/或无细胞蛋白质翻译系统完成SLT-1A::αCD20CD20结合蛋白的表达。
确定CD20结合蛋白SLT-1A::αCD20的体外特征
通过如以上前面实施例中所述的基于荧光的流式细胞术测定来确定本实施例的CD20结合蛋白对CD20+细胞和CD20-细胞的结合特征。测得与CD20+细胞结合的SLT-1A::αCD20的B最大为大约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM的范围内，而在这个测定中没有与CD20-细胞的明显结合。
在如以上前面实施例中所述的无细胞体外蛋白质翻译中确定SLT-1A::αCD20CD20结合蛋白的核糖体失活能力。本实施例的CD20结合蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是明显的。在这个无细胞测定中，SLT-1A::αCD20对蛋白合成的IC50为大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定CD20结合蛋白SLT-1A::αCD20的细胞毒性
使用CD20+细胞通过如以上前面实施例中所述的一般细胞杀伤测定来确定SLT-1A::αCD20的细胞毒性特征。此外，使用CD20-细胞作为与CD20+细胞的比较，通过相同的一般细胞杀伤测定来确定SLT-1A::αCD20的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，对于CD20+细胞，本实施例的CD20结合蛋白的CD50为大约0.01-100nM。与细胞表面上表达CD20的细胞相比，CD20结合蛋白对不在细胞表面上表达CD20的细胞的CD50高大约10-10,000倍(较低的细胞毒性)。
使用动物模型确定CD20结合蛋白SLT-1A::αCD20的体内效果
使用动物模型确定CD20结合蛋白SLT-1A::αCD20对肿瘤细胞的体内效果。使用各种小鼠品系测试在对小鼠中的异种移植肿瘤进行静脉内施用后的CD20结合蛋白的效果，所述小鼠中的异种移植肿瘤由向那些小鼠注射在其细胞表面上表达CD20的人肿瘤细胞而产生。可以使用非人灵长类动物测试SLT-1A::αCD20对外周血B细胞的效果，如以上实施例8中所述。
实施例10-基于CD20结合结构域的各种CD20结合蛋白
在本实施例中，志贺菌毒素效应子区源于志贺菌样毒素1的A亚基(SLT-1A)，志贺菌毒素的A亚基(StxA)，和/或志贺菌样毒素2的A亚基(SLT-2A)。免疫球蛋白型结合区源于来自从表7中选择的并且结合CD20的细胞外部分的分子的免疫球蛋白结构域。使用将CD20表达至细胞表面的CD20+细胞形成本实施例的示例性细胞毒性蛋白并且按照前面实施例中描述的进行测试。
表7.示例性的CD20结合结构域
Figure GDA0000798920150000621
尽管已经通过说明的方式描述了本发明的某些实施方案，显而易见的是，可以利用许多修改、变化和改编以及利用本领域技术人员范围内的等同或备选方案实施本发明，而不背离本发明的精神或超过权利要求的范围。
全部出版物、专利、和专利申请通过引用其全部内容结合在本文中，其程度如同具体地并且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用其全部内容结合一样。美国临时专利申请61/777,130通过引用其全部内容结合。用于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的来自GenBank(国家生物技术信息中心，美国)的所有可电子获得的生物序列信息的全部公开内容分别通过引用完整地结合于此。
Figure GDA0000798920150000631
Figure GDA0000798920150000641
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Figure GDA0000798920150000681
Figure GDA0000798920150000691
Figure GDA0000798920150000701

Claims (83)

1.CD20结合蛋白，所述CD20结合蛋白包含
a)CD20结合区，所述CD20结合区包含能够特异性结合CD20的细胞外部分的单链可变片段(scFv)，其中所述单链可变片段包含：
i)重链可变(VH)结构域，其包含SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8分别表示的HCDR1，HCDR2和HCDR3氨基酸序列，和轻链可变(VL)结构域，其包含SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11分别表示的LCDR1，LCDR2和LCDR3，或
ii)重链可变(VH)结构域，其包含SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23分别表示的HCDR1，HCDR2和HCDR3氨基酸序列，和轻链可变(VL)结构域，其包含SEQ ID NO:24，SEQID NO:10和SEQ ID NO:11分别表示的LCDR1，LCDR2和LCDR3以及
b)志贺菌毒素效应子多肽，其由SEQ ID NO:1的氨基酸1-251组成；
其中将所述CD20结合蛋白施用至在细胞表面上表达CD20的细胞导致所述CD20结合蛋白在小于六小时内快速细胞内化到所述细胞中。
2.权利要求1的CD20结合蛋白，其中将所述CD20结合蛋白施用至在细胞表面上表达CD20的细胞导致所述CD20结合蛋白在小于一小时内快速细胞内化到所述细胞中。
3.权利要求1或2的CD20结合蛋白，其中将所述CD20结合蛋白施用至所述细胞导致天然存在于细胞表面上的CD20在小于六小时内或在小于一小时内快速细胞内化。
4.权利要求1-2中任一项的CD20结合蛋白，其中所述细胞是B细胞谱系的成员。
5.权利要求1-2中任一项的CD20结合蛋白，其中将所述CD20结合蛋白施用至所述细胞导致所述细胞的死亡。
6.权利要求5的CD20结合蛋白，与其成员不表达CD20的第二群细胞相比，在其成员表达CD20的第一群细胞中显示出至少3倍大的细胞毒性作用。
7.权利要求1-2中任一项的CD20结合蛋白，所述CD20结合蛋白包含SEQ ID NO:4或SEQID NO:12中所示的氨基酸序列。
8.权利要求7的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
9.权利要求1的CD20结合蛋白，其中所述CD20结合区包含SEQ ID NO:4的氨基酸2至245。
10.权利要求9的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
11.权利要求9的CD20结合蛋白，所述CD20结合蛋白包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
12.权利要求11的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
13.权利要求1-2中任一项的CD20结合蛋白，所述CD20结合蛋白进一步包含
另外的外源物质；
其中在将所述CD20结合蛋白施用至所述表达CD20的细胞后，所述CD20结合蛋白能够将所述另外的外源物质递送至所述细胞的内部。
14.权利要求13的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
15.权利要求13的CD20结合蛋白，其中所述外源物质选自由下列各项组成的组：肽、蛋白质、和核酸。
16.权利要求15的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
17.权利要求15的CD20结合蛋白，其中所述外源物质包括酶。
18.权利要求15的CD20结合蛋白，其中所述外源物质是核糖核酸。
19.权利要求15的CD20结合蛋白，其中所述外源物质包括抗原。
20.权利要求19的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
21.权利要求19的CD20结合蛋白，其中所述抗原来自细菌蛋白。
22.权利要求21的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
23.权利要求19的CD20结合蛋白，其中所述抗原来自癌症中突变的蛋白或来自癌症中异常表达的蛋白。
24.权利要求19的CD20结合蛋白，其中所述抗原是T细胞互补决定区。
25.权利要求19的CD20结合蛋白，其中所述抗原位于所述蛋白内，在所述CD20结合区和所述志贺菌毒素效应子多肽之间。
26.权利要求25的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
27.权利要求19的CD20结合蛋白，其中所述抗原来自病毒蛋白。
28.权利要求27的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
29.权利要求27的CD20结合蛋白，其中所述抗原包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
30.权利要求29的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
31.权利要求1-2任一项所述的CD20结合蛋白，其为同多聚体或异多聚体的形式。
32.权利要求31的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
33.权利要求5所述的CD20结合蛋白，其为同多聚体或异多聚体的形式。
34.权利要求7所述的CD20结合蛋白，其为同多聚体或异多聚体的形式。
35.权利要求9所述的CD20结合蛋白，其为同多聚体或异多聚体的形式。
36.权利要求11所述的CD20结合蛋白，其为同多聚体或异多聚体的形式。
37.权利要求13所述的CD20结合蛋白，其为同多聚体或异多聚体的形式。
38.权利要求15所述的CD20结合蛋白，其为同多聚体或异多聚体的形式。
39.权利要求1-2任一项所述的CD20结合蛋白，其为药用溶剂化物或药用盐的形式。
40.权利要求39的CD20结合蛋白，其中向所述细胞施用所述CD20结合蛋白导致所述细胞死亡。
41.权利要求5的CD20结合蛋白，其为药学上可接受的溶剂化物或盐的形式。
42.权利要求7的CD20结合蛋白，其为药学上可接受的溶剂化物或盐的形式。
43.权利要求9的CD20结合蛋白，其为药学上可接受的溶剂化物或盐的形式。
44.权利要求11的CD20结合蛋白，其为药学上可接受的溶剂化物或盐的形式。
45.权利要求13的CD20结合蛋白，其为药学上可接受的溶剂化物或盐的形式。
46.权利要求15的CD20结合蛋白，其为药学上可接受的溶剂化物或盐的形式。
47.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-46中任一项的CD20结合蛋白和至少一种药用赋形剂或载体。
48.权利要求47的药物组合物，其中至少一种药用载体选自生理可接受的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂、吸收延缓剂、无菌水溶液或分散液或无菌粉末，或其中所述药用载体包含水性或非水性载体。
49.权利要求48所述的药物组合物，其中所述水性载体选自水，醇，多元醇及其混合物。
50.权利要求49所述的药物组合物，其中所述醇是乙醇。
51.权利要求49所述的药物组合物，其中所述多元醇是甘油，丙二醇或聚乙二醇。
52.权利要求48所述的药物组合物，其中所述非水性载体是植物油或可注射的有机酯。
53.权利要求52所述的药物组合物，其中所述可注射的有机酯是油酸乙酯。
54.权利要求47或48的药物组合物，其还包含以下的一种或多种：佐剂；抗菌剂或抗真菌剂；等渗剂；吸收延迟剂；包衣；药用抗氧化剂；表面活性剂；缓冲剂和/或稳定剂。
55.权利要求54所述的药物组合物，其中所述佐剂是防腐剂，湿润剂，乳化剂或分散剂。
56.权利要求54所述的药物组合物，其中所述抗菌剂或抗真菌剂是对羟苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚或山梨酸。
57.权利要求54所述的药物组合物，其中所述等渗剂是糖，多元醇或氯化钠。
58.权利要求57所述的药物组合物，其中所述多元醇为甘露醇或山梨醇。
59.权利要求54所述的药物组合物，其中所述吸收延迟剂是单硬脂酸铝或明胶。
60.权利要求54所述的药物组合物，其中所述包衣是卵磷脂。
61.权利要求54的药物组合物，其中所述药用抗氧化剂是水溶性抗氧化剂；油溶性抗氧化剂；或金属螯合剂。
62.权利要求61所述的药物组合物，其中所述水溶性抗氧化剂是抗坏血酸，半胱氨酸盐酸盐，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠或亚硫酸钠。
63.权利要求61的药物组合物，其中所述油溶性抗氧化剂是抗坏血酸棕榈酸酯，丁羟茴醚(BHA)，丁羟甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯或α-生育酚。
64.权利要求61所述的药物组合物，其中所述金属螯合剂是柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸或磷酸。
65.权利要求47的药物组合物，其被配制为口服、直肠、鼻、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、皮内或经皮施用。
66.权利要求47的药物组合物，其中所述CD20结合蛋白包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12表示的多肽，或由其组成。
67.权利要求66的药物组合物，其中所述CD20结合蛋白由SEQ ID NO:4表示的多肽组成。
68.权利要求47的药物组合物，其中所述CD20结合蛋白包含SEQ ID NO:4和其中所述药物组合物包含柠檬酸盐缓冲液，丙二醇，和选自糖或山梨糖醇的等渗剂。
69.能够编码权利要求1-38中任一项的CD20结合蛋白的核酸。
70.表达载体，所述表达载体包含权利要求69的核酸。
71.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求69的核酸或权利要求70的表达载体。
72.在小于六小时内快速引起CD20结合蛋白到表达CD20的细胞中的细胞内化的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-46中任一项的CD20结合蛋白体外接触的步骤。
73.将外源物质递送至表达CD20的细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求15-30中任一项的CD20结合蛋白体外接触的步骤。
74.杀伤表达CD20的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-46中任一项的CD20结合蛋白体外接触的步骤，其中在将所述CD20结合蛋白施用于所述细胞以后，所述CD20结合蛋白能够导致所述细胞死亡。
75.权利要求73或权利要求74的方法，其中所述表达CD20的细胞是B细胞谱系的成员。
76.权利要求73或74所述的方法，其中所述表达CD20的细胞是黑素瘤细胞。
77.权利要求73或74所述的方法，其中所述表达CD20的细胞是瘤性造血细胞。
78.权利要求1-46中任一项的CD20结合蛋白或权利要求47-68任一项的药物组合物在制备用于治疗患者中疾病、病症、或病况的药物中的用途，其中所述疾病、病症、或病况涉及在细胞表面上表达CD20的肿瘤细胞、或免疫细胞。
79.权利要求78的用途，其中所述肿瘤细胞是癌细胞。
80.权利要求79的用途，其中所述癌细胞与选自由下列各项组成的组的疾病有关：骨癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、和骨髓瘤。
81.权利要求78的用途，其中所述病症是与选自由下列各项组成的组的疾病有关的免疫病症：
淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关疾病、红斑狼疮、多发性硬化、多动脉炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、感染性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎、和血管炎。
82.权利要求1-46中任一项的CD20结合蛋白或权利要求47-68中任一项的药物组合物在制备用于治疗或预防涉及细胞表面表达CD20的细胞或细胞类型的肿瘤、免疫病症、或微生物感染的药物中的用途。
83.权利要求82的用途，其中所述肿瘤是癌症。
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