JP4954293B2 - 改変毒素を選択および生産する方法、改変毒素を含む複合体、およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
優先権の利益を、 2007年8月22日出願のHongesheng Su、Philip J. Coggins、John R. McDonaldおよびLaura M. McIntosh の「METHODS OF SELECTING AND PRODUCING MODIFIED TOXINS, CONJUGATES CONTAINING MODIFIED TOXINS, AND USES THEREOF」と第する米国仮出願第60/965,977号および、2006年12月29日出願のHongesheng Su、Philip J. Coggins、John R. McDonald およびLaura M. McIntoshの「METHODS OF SELECTING AND PRODUCING MODIFIED TOXINS, CONJUGATES CONTAINING MODIFIED TOXINS, AND USES THEREOF」と題する米国仮出願第60/878,166号に対して主張する。
毒性が低下した改変毒素を選択および同定する方法が提供される。毒性が低減した改変毒素、およびかかる改変毒素を含む複合体も提供される。かかる改変毒素、またはその複合体を生産する方法が提供される。かかる複合体は、炎症反応に関与する細胞の増殖、遊走、および生理活性に関連する疾患の治療方法において有用である。
炎症反応は、望ましくない 外因性物質(例えば、微生物)および内因性物質(例えば、癌細胞クローン)を体から排除するために; 細胞細片を排除し、組織および創傷治癒に参加するために組織 傷害または外傷の部位に蓄積する免疫防御細胞および関連する組織固有細胞(tissue residantial cells)によって媒介される。残念なことに、例えば、白血球の不適切な活性化に起因するこれらのレパラトリー(reparatory)(炎症性)プロセスに関与する分子機構は、二次組織損傷を惹起することがあり得、それは、いくつかの炎症性および免疫調節性疾患の病原および持続性症状に寄与する。
本明細書において、炎症性 または免疫調節性 疾患または症状の病理に関係する細胞性メディエーターを標的化する治療用分子の生産方法および改変毒素 複合体の使用を提供する。具体的には、改変毒素 ポリペプチド、改変毒素 ポリペプチドを含む複合体および改変毒素 ポリペプチドを作成および調製する方法が提供される。改変毒素 ポリペプチド(および/またはそれらを含む複合体)は、それらが発現する宿主細胞において低減された毒性を示し、そのように改変されていない毒素 ポリペプチドと比較してより高レベルの発現を可能とする。改変は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列において起こる。
アウトライン
A.定義
B. リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)、その選択、発現および生産
C.リボソーム不活性化タンパク質(RIP) および作用の方法
1.例示的なRIP
志賀毒素
2.RIP 毒素 阻害剤
4-APP およびその他のアデニン類似体
D.改変毒素またはその複合体の選択方法
1. 候補RIP タンパク質またはその複合体
2. RIPまたはその複合体の宿主細胞への導入
a.トランスフェクション
b.形質転換
c.エレクトロポレーション
3.発現、選択および同定
4.活性評価
a.タンパク質 合成 アッセイ
b.脱プリン アッセイ
c.細胞増殖/生存/生存度 アッセイ
E. 例示的な改変毒素
改変 SA1 毒素
F.標的化剤およびその複合体
1.標的化剤
a.ケモカイン
i.リガンド
ii.ケモカイン受容体
iii.ケモカイン/ケモカイン 受容体細胞プロファイル
iv.例示的なケモカイン標的化剤
b.非ケモカイン サイトカイン
c.抗体 リガンド 部分
d.その他の標的化剤および受容体標的
増殖因子
2.リンカー 部分
a. 例示的なリンカー
i.ヘテロ二官能性 架橋試薬
ii.酸切断可能、光切断可能および熱感受性リンカー
iii.化学複合化のためのその他のリンカー
iv.ペプチド リンカー
3.例示的な白血球 集団モジュレーター (LPM) 複合体
G.改変RIP 毒素およびその複合体の調製
1.毒素 ポリペプチド、または毒素 ポリペプチドを含む複合体の作成およびクローニング方法
2. 融合タンパク質を含む複合体の生産および発現系
a. 発現のためのプラスミドおよび宿主細胞
i.細菌細胞 発現系
ii.昆虫細胞 発現系
iii.酵母細胞 発現系
iv.植物細胞 発現系
v.哺乳類細胞 発現系
b.精製
3.化学的複合体の生産
H. RIP ポリペプチド、またはその複合体の生産を上昇させる方法
タンパク質 生産を上昇させるさらなる方法
I.毒素またはその複合体の活性を測定するためのインビトロおよびインビボ アッセイ
1.インビトロ 活性 アッセイ
a.細胞に基づく 毒性 アッセイ
b.受容体 結合 アッセイおよびインターナリゼーション
c.走化性 アッセイ
2. 複合体の試験のためのインビボ 動物モデル
a.脊髄 傷害 (SCI)
b.外傷性脳傷害および脳卒中
c.アルツハイマー病
d.多発性硬化症
e.関節炎および自己免疫 疾患
f.炎症性 肺疾患
g. 遺伝子治療後の炎症
h.血管新生
i.腫瘍増殖
j.ヒト 免疫不全 ウイルス (HIV)
k.腎臓 疾患
l.過敏症
J.毒素およびその複合体を含む組成物の製剤および投与
K.毒素またはその複合体を用いる疾患および障害の治療方法
1.免疫宿主 防御系および炎症
a.恒常性 炎症
b.病理的 炎症
2.候補治療薬およびその限界
3.リガンド-毒素 複合体 (即ち、 LPM)
選択した疾患または障害の治療のためのリガンド-毒素 複合体の選択
白血球 集団モジュレーターの選択および設計
4.例示的な疾患
a.癌
b.腎臓 疾患
c.脊髄 傷害 (SCI)
d.過敏症
e.HIV 感染およびAIDSおよびその他の病原体による感染
f.炎症性関節 疾患および自己免疫 疾患
g.肺疾患
h. 二次組織 損傷に媒介されるその他の疾患
5.併用療法
L.実施例
格別に断りのない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書の全体の開示を通して参照される、特許、特許出願、公開された出願および出版物、遺伝子バンクの配列、データベース、ウェブサイトおよび公開された他の物は全て、格別に断りのない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書の用語について複数の定義がある場合は、この節における定義が優先する。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスが参照されている場合は、かかる識別子は変更され得、インターネット上の具体的な情報は現れたり消えたりし得るが、等価な情報はインターネットを探索することにより発見し得ると認識されたい。それらを参照していることはかかる情報の可用性および一般への流布を証明している。
(1)Fab、抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片、酵素パパインにより完全抗体を消化し、インタクトな軽鎖および1つの重鎖の部分を生じることにより、産生され得る;
(2)Fab’、完全抗体をペプシンにより処理し、次いで還元し、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じることにより得ることがきる抗体分子の断片;1抗体分子につき2つのFab’断片が得られる;
(3)F(ab’)2、完全抗体を酵素ペプシンにより処理し、その後還元を行わないで得ることができる抗体の断片;F(ab’)2は2つのFab’断片が2つのジスルフィド結合によりまとまった二量体である;
(4)Fv、2つの鎖として発現される、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に生産された断片と定義される;および
(5)単鎖抗体(「SCA」)、遺伝学的に融合された単鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に生産された分子。
減少した毒性を有するリボソーム不活性化タンパク質(RIP)毒素について、選択する、同定する、精製する、および/または単離する方法、それにより生じた改変RIP、ならびにRIPおよび改変RIPおよびそれらの複合体を発現する方法を提供する。毒性は、そのタンパク質の発現を増加させるのに十分な程度に減少しているが、RIPが(細胞を阻害するまたは殺す)治療効果を示すのに十分な毒性は保持されている。RIPは非常に毒性であるので、活性が10倍、100倍、1000倍またはそれ以上減少することは、細胞を阻害するまたは殺す、または細胞代謝に影響するための複合体における毒素としてのその毒素の用途には実質的に影響を与えない。
リボソーム不活性化タンパク質(RIP)は、保存されたメカニズムを介する真核および原核タンパク質合成の強力な阻害剤である、植物、真菌および細菌において発現されるタンパク質のクラスである。RIPは、N-グリコシダーゼまたはポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼであり、リボソームおよび非リボソーム核酸基質を不活性化することができる。RIPは、2つのグループに分類される。I型RIP(ホロ-RIPとも呼ばれる;すなわち、トリコサンチンおよびルフィン)は、リボソーム不活性化活性を有する約30kDaの単一のポリペプチド鎖を持つ。II型RIP(キメラ-RIPとも呼ばれる;すなわちリシン、アブリン、ならびに細菌毒素、例えば志賀毒素)は、ジスルフィド結合により連結されたA(通常単一サブユニット)およびB(単一または多サブユニット)と表される、2つのポリペプチド鎖または種を含有する。II型RIPのB鎖は、細胞への侵入に必要であるが、細胞侵入を達成するポリペプチドにより置換することができる。I型またはII型ファミリーのいずれにも当てはまらない他のRIPの例もある。これらは、A鎖のみを含有するが、タンパク質分解過程を必要とする2つの鎖のI型RIPと呼ばれるもの、およびオオムギRIPJIP60と構造的におよび機能的に関連するタンパク質であるIII型RIPタンパク質と呼ばれるものである(Peumans et al. (2001) The FASEB Journal, 15: 1493)。
例えば、毒素またはその複合体の生産の向上、またはリガンド-毒素 複合体の作成における、毒性が低減した改変毒素の選択のための本明細書において提供する方法において用いられる例示的な毒素は、rRNAの脱プリンを介するN-グリコシダーゼ 酵素活性に起因する細胞毒性を示すいずれの毒素であってもよい。かかる毒素は当業者に知られており、典型的にはRIP ファミリーの毒素を含む。例えば、400を超えるRIPが提案されており、そのなかでも50を超えるI型RIPおよび 15のII型RIPが配列決定および/またはクローニングされている(Peumans et al. (2001) The FASEB Journal、15: 1493)。例示的なI型RIPとしては、これらに限定されないが、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP、アスパリン-1、およびアスパリン 2が挙げられる。例示的な II型RIPとしては、これらに限定されないが、ボルケンシン、リシン、志賀毒素、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンが挙げられる。一般に、A-鎖、またはその活性の断片が、II型RIPの酵素活性に十分である。
志賀毒素(STX)は、細菌によって生産されるRIP タンパク質のファミリーである。志賀毒素は、3つの異なる群に分類される。志賀毒素 (Stx)は志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)によって生産され、5つの7.7 kDa B サブユニット (StxB)の環と非共有結合により結合している32-kDa 酵素 A サブユニット (StxA)を含むII型RIP タンパク質である。Stxは大腸菌によって生産される志賀様毒素 1(Stx1、ベロ毒素、SLT1またはVT1とも称される)とアミノ酸 配列において同一である。StxおよびStx1のA-鎖 前駆体は315 アミノ酸長であり (配列番号1に示す)、配列番号1のアミノ酸1-22に対応する22 アミノ酸の長さのシグナル 配列を含む。成熟 Stx/Stx1 A 鎖は 293 アミノ酸長であり、配列番号1 のアミノ酸23-315 に対応し、配列番号5に示す。第3のStxは志賀様毒素 2 (Stx2、ベロ毒素 2、SLT2またはVT2とも称される)であり、これは、StxおよびStx1と比較して異なる配列を示す。Stx2 のA-鎖 前駆体は 319 アミノ酸の長さであり(配列番号3に示す)、配列番号3のアミノ酸 1-22に対応する22 アミノ酸の長さのシグナル 配列を含む。成熟 Stx2 A 鎖は297 アミノ酸の長さであり、配列番号3のアミノ酸23-319に対応する。Stx/Stx1および Stx2のB サブユニットは 89 アミノ酸の長さである (それぞれ配列番号2および4に示す)。志賀様毒素は、Citrobacter freundii、Aeromononas hydrophila、Aeromononas caviae、およびEnterobacter cloacaeにおいても生産されることが報告されている (Sandvig et al. (2001) Toxicon、39: 1629-1635)。
毒性RIPを不活性化する阻害剤は知られているかまたは同定することができる。かかる阻害剤の研究により、毒素の活性部位の構造に関する洞察が提供された。さらに、様々な理由によりRIP 阻害剤を同定および開発することに興味がもたれており、例えば、これらに限定されないが、診断目的、毒物の解毒剤またはRIPを発現する細菌によって引き起こされる感染における予防および治療薬が挙げられる(Brigotti et al. (2000) Life Sciences、68: 331-336、米国特許出願第6,562,969号)。いくつかのRIP 阻害剤はRIP 毒素の保存された N-グリコシダーゼ 活性を標的とする。かかるRIP 毒素 阻害剤としては、 RIP-特異的オリゴヌクレオチド 阻害剤、例えば RNA アプタマー(例えば、Hesselberth et al. (2000) J. Biol. Chem.、275:4937-4942; Hirao et al. (2000) J. Biol. Chem.、275: 4943-4948を参照)、 RIP-特異的抗体、および/またはアデニン 異性体、例えば、アデニン、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)、およびその他の類似の異性体が挙げられる(Pallanca et al. (1998) Biochimica et Biophysica Acta、1384: 277-284; Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Research、28: 2383-2388; Brigotti et al. (2000) Life Sci.、68: 331-6; 米国特許出願第6,562,969号)。
アデニンはRIP 毒素の天然基質における塩基である(即ち、 GAGAのループ 配列における最初のアデニン 塩基)。したがって、アデニンおよびその類似体は、RNA N-グリコシダーゼ 活性の阻害剤として作用することによりRIP 毒性活性を阻害する (Pallanca et al. (1998) Biochimica et Biophysica Acta、1384: 277-284; Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Research、28: 2383-2388; Brigotti et al. (2000) Life Sci.、68: 331-6)。典型的には、アデニン 類似体には、一方の環が6-アミノピリミジンであって、他方の環が少なくとも 2つの隣接する 炭素原子を含む5-員複素環、例えばこれらに限定されないが、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フランおよびチオフェンであるあらゆる縮合二環式化合物が含まれる。典型的には、環の縮合は6-アミノピリミジンの4位と5 位における炭素原子および5員環のいずれかの2つの隣接する 炭素原子の間で、いずれかの結合様式で起こる。これには、例えば、5員環がイミダゾール 立体配置であるアデニン自体が含まれる。アデニンの構造は以下の通りである:
宿主である発現細胞に対して低下した細胞毒性を示す改変RIP 毒素を選択する方法が本明細書において提供される。本明細書における方法において、特定の宿主細胞に対するRIPの毒性によって、RIPはしばしばすべてのまたは実質的にすべての細胞に最終的に毒性である条件下においても、細胞培養物において低レベルにて発現されることが見いだされた。典型的には、RIPは細胞に対する毒性を示すために要求量が必要とされるために発現されるが、いくらかの細胞はRIPの毒性の影響に対して抵抗性となり、本明細書に示すように、RIPは突然変異する。その結果、RIPをコードする核酸を含む細胞の培養物において、RIPは比較的低レベルではあるが発現される。
一般に、多くのRIP タンパク質が原核 および/または真核細胞に対して毒性活性を示し、それらは細胞リボソームによるタンパク質 合成を阻害するため、 それらは宿主細胞系の一部または全部において高レベルにて発現され得ない。それらがより高いレベルで発現され得、かつ、RIPを用いる複合体において治療的に用いるために十分な毒性を示すように、RIPの毒性を低減する方法を本明細書において提供する。米国特許第7,166,702、7,157,418 および 7,192,736号における複合体ならびにサイトカイン、例えば 増殖因子、例えば、FGF、VEGF、EGF およびその他の複合体が含まれる。
所望の 出発RIP タンパク質、またはその複合体をコードする核酸は、所望の 宿主細胞に導入される。典型的には、選択 方法において選ばれる宿主細胞は、出発RIP タンパク質、またはその複合体の毒性効果に感受性であり、宿主細胞におけるRIPの発現によって宿主細胞のタンパク質 合成が消滅するかまたは顕著に阻害されるものである。本明細書における選択方法における使用のための宿主細胞としては、あらゆる原核細胞、例えば、これらに限定されないが、いずれかの細菌細胞、例えば、大腸菌が挙げられる。宿主細胞にはあらゆる真核細胞も含まれ、例えば、これらに限定されないが、酵母、例えば Pichia pastoris、Xenopus oocytes、および哺乳類細胞、例えば、Vero、Hep2、Chang、A549、COS-1、およびHeLa 細胞が挙げられる。本明細書における選択方法において使用する適当な 宿主細胞の決定において、RIP タンパク質、またはその複合体の宿主細胞における組換え タンパク質 発現に対する影響は本明細書に以下に記載するかまたは当業者に知られた様々な 方法によって判定することが出来る。タンパク質 合成に対する効果を評価するためのアッセイとしては、例えば、脱プリン アッセイ (即ち、アデニンの遊離)、無細胞タンパク質 合成 アッセイ、例えば、ウサギ網状赤血球ライセートまたはコムギ胚芽ライセート タンパク質 合成 アッセイ、あるいは細胞増殖/生存度 アッセイが挙げられる。例えば、かかるアッセイを用いることにより、真核および原核 リボソームに対してSA1が顕著な毒性活性を示すことが知られる(Suh et al. (1998) Biochemistry、37:9394)。したがって、1つの例において、改変形態のSA1、またはその活性の形態の選択は、真核細胞において行う。別の例において、改変形態のSA1、またはその活性の部分の選択は、細菌 細胞、例えば大腸菌において行う。様々な 大腸菌 宿主 株が入手可能であり、例えばこれらに限定されないが BL21(DE3)またはBL21(DE3)pLysS 細胞が含まれる。
トランスフェクションは、真核または原核細胞への核酸の導入に利用することが出来る。トランスフェクションは様々な 方法によって達成できるが、典型的には一過性の「孔」を細胞にあけて、宿主細胞において一過性に発現されるようになるDNAが入ることを可能にすることを含む。DNAをトランスフェクションによって導入する方法の例としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウム法、リポフェクション、および遺伝子銃アプローチが挙げられる。例えば、リポフェクション アプローチにおいては、DNAは リポソームに含まれるか、または、細胞膜と融合してDNAを細胞内に放出することが出来る脂質-カチオン試薬を用いることによって行われる。カチオン性脂質の例としては、これらに限定されないが、Lipofectin (Life Technologies、Inc.、Burlington、Ont.)(カチオン性脂質 N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム クロリド (DOTMA)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE)の1:1 (w/w) 製剤); LipofectAMINE (Life Technologies、Burlington、Ont.、米国特許第5,334,761号参照) (ポリカチオン性脂質 2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロアセテート (DOSPA)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE)の3:1 (w/w) 製剤)、LipofectAMINE PLUS (Life Technologies、Burlington、Ont.米国特許第5,334,761および5,736,392号参照;米国特許第6,051,429号も参照) (LipofectAmine and Plus reagent)、LipofectAMINE 2000 (Life Technologies、Burlington、Ont.; PCT国際出願WO 00/27795号も参照) (カチオン性脂質)、Effectene (Qiagen、Inc.、Mississauga、Ontario) (非リポソーム性脂質製剤)、Metafectene (Biontex、Munich、Germany) (ポリカチオン性脂質)、Eu-fectins (Promega Biosciences、Inc.、San Luis Obispo、CA) (エタノール性 カチオン性脂質第 1から12番: C52H106N6O4 .4CF3CO2H、C88H178N8O4S2.4CF3CO2H、C40H84NO3P.CF3CO2H、C50H103N7O3.4CF3CO2H、C55H116N8O2.6CF3CO2H、C49H102N6O3.4CF3CO2H、C44H89N5O3.2CF3CO2H、C100H206N12O4S2.8CF3CO2H、C162H330N22O9.13CF3CO2H、C43H88N4O2.2CF3CO2H、C43H88N4O3.2CF3CO2H、C41H78NO8P); Cytofectene (Bio-Rad、Hercules、CA ) (カチオン性脂質および中性脂質の混合物)、GenePORTER (Gene Therapy Systems Inc.、San Diego、CA) (中性脂質 (Dope) およびカチオン性脂質の製剤)およびFuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN) (多成分の脂質に基づく 非リポソーム試薬)が挙げられる。
形質転換は導入されたDNAが遺伝子材料の発現のために細胞のゲノムに組み込まれる点でトランスフェクションとは区別される。典型的には、安定な 形質転換に用いられる発現 ベクターは選択マーカー、例えば、形質転換細胞の選択および維持を可能とする抗生物質耐性を有する。形質転換は、DNAの細胞への移入を必要とし、それは天然に形質転換受容性であるか形質転換受容性とされた細胞が細胞膜または膜を横切ってDNAを取り込むことによって達成される。塩化カルシウムは、細胞、例えば 大腸菌細胞をより形質転換受容性にするのに用いられる1つの方法である。細菌細胞の熱ショックの後、それらはDNAを取り込むように誘導される。形質転換は細菌に限定されず、酵母、植物および哺乳類細胞、例えば胚性幹細胞においても行うことが出来る。形質転換の方法は周知である (例えば、Mello et al. (1995) Methods Cell Biol.、48:451-82参照)。
エレクトロポレーションは一時的に細胞の外膜にパルス回転 電場の使用により孔を開ける。インビトロおよびインビボでのエレクトロポレーションに用いられる方法および装置は周知である(例えば、米国特許第6,027,488、5,993,434、5,944,710、5,507,724、5,501,662、5,389,069、5,318,515号参照)。標準的 プロトコールを用いることが出来る。
DNA 分子での宿主細胞の導入は遺伝子産物の増幅をもたらし、それによって多コピーの遺伝子が発現するのを可能にする。本明細書の選択方法において用いられる出発 RIP 毒素またはその複合体は、選択される宿主細胞にとって通常有毒であるため、出発(starting)タンパク質の増幅および発現は、例えば細胞死のために、通常は起こらない。そのため、本明細書において提供される方法は、宿主細胞に対して示す毒性が少なくそれによって発現するタンパク質のそれらの改変形態を選択するための選択方法として、出発タンパク質の通常の毒性を用いる。典型的には、かかる発現タンパク質は、その一次配列においてタンパク質を低毒性にする1以上のアミノ酸突然変異によって改変される。いくつかの場合において、発現タンパク質は、出発タンパク質と比べてアミノ酸配列の切断を介して改変され、そのことが該タンパク質を低毒性にする。ほとんどの宿主細胞発現系において、改変 RIP 毒素をコードする遺伝子は、形質転換体を増殖させ、該形質転換体から組換え DNA 分子を単離し、必要な場合には、該単離された組換え DNA から挿入遺伝子を回収することによって、大量に得ることができる。
本明細書で提供される方法において選択される改変 RIP 毒素またはその複合体は、選択の後それらが宿主細胞リボソームに対する毒素活性を保持するかどうか決定するために、試験され得る。通常、かかる改変毒素は出発 RIP タンパク質またはその複合体と比べて減少した毒素活性を示すため、それらは選択される。しかし、一般的に、選択された改変毒素は、出発毒素タンパク質のいくらかの活性を保持する。本明細書において提供される改変 RIP 毒素またはその複合体は、基準または毒素の出発形態もしくはその複合体と比較して 0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 以上の毒素活性を保持する。代表的なアッセイは、RIP ポリペプチドの活性について試験するあらゆるアッセイであり得、例えば、N-グリコシダーゼ活性、DNAase 活性、RNAase 活性または他の活性を評価するアッセイを含む。当業者に公知のあらゆる方法が RIP タンパク質またはその複合体の毒素活性を評価するために用いられ得、それらは通常、RIP タンパク質の N-グリコシダーゼ活性の効果についてアッセイするあらゆるものを含む。かかる毒素の改変形態を含むあらゆる RIP 毒素またはその複合体の毒素活性を評価するための代表的なアッセイは、以下において説明される。
RIP 毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供される選択方法において同定されるあらゆる改変毒素を含むあらゆる改変 RIP の活性は、毒素の翻訳に対する効果を決定するため、タンパク質合成アッセイを用いて測定され得る。かかるアッセイは常套かつ当業者にとって公知のものである。かかるアッセイの典型例は、ウサギ網状赤血球ライセート アッセイである。通常、ウサギ網状赤血球ライセートは、効率的な転写および翻訳に必要な成分、例えばマグネシウムおよびカリウムイオンならびに NTP を含有するかまたはそれらが補われている。合成タンパク質の源である鋳型 RNA も添加される。かかるアッセイは、検出可能なウサギ リボソームによるインビトロでの共役したタンパク質の転写および翻訳を可能にする。一つの方法において、検出は、合成タンパク質に取込まれ、トリクロロ酢酸での沈殿の後に測定され得る放射活性、例えば [3H]Leu、[35S]Met または [35S]Met-Cys の取込みを介して達成され得る(TCA; Baas et al. (1992) The Plant Cell、4: 225-234; Zhao et al. (2005) Journal of Microbiology、54: 1023-1030)。別の方法においては、ルシフェラーゼ DNA が鋳型として用いられ得、その後にそれはルミノメーターを用いて検出される。代表的なウサギ網状赤血球ライセート系は、Promega によって販売されているものであり、例えば TNT(登録商標)共役網状赤血球ライセート系を含む。かかるアッセイは実施例 2 において説明される。アッセイは、コムギまたはトウモロコシの網状赤血球ライセートを含む他の翻訳系と共に用いられるよう適合させることができ、または、インタクトな細胞ライセートまたは様々な上清画分から再構築されたライセートおよび精製リボソームまたはポリリボソームを含む、翻訳反応において適合させることができる(Baas et al. (1992) The Plant Cell、4: 225-234)。いくつかの方法において、アッセイは全細胞においてタンパク質合成への影響を評価するために適合させることができ、ここで、タンパク質合成の検出はアデノウイルスに発現されるルシフェラーゼによって促進され得る (Zhao et al. (2005) Journal of Microbiology、54: 1023-1030)。加えて、毒素の相対活性を決定するため、最大反応の半分を与えるのに必要な毒素の濃度(RIC50)によって決定されるように、動態解析および用量反応曲線が実施され得る。
RIP 毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供される選択方法において同定されるあらゆる改変毒素を含むあらゆる改変 RIP の活性は、脱プリン アッセイにおいて決定され得る。RNA のリボソーム大サブユニットの RIP-媒介 脱プリン反応は、糖-リン酸骨格の脱プリン部位における加水分解に対する感受性を増大させる(Tumer et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.、94: 3866-3871)。アニリンでの処理の後、通常は小さな断片の放出によって加水分解が観察され得る。こうして、リボソームは増大する毒素濃度の存在下または非存在下で処理され得、RNA は抽出されてアニリンで処理され、そしてゲル電気泳動によって分析される。断片は、エチジウムブロマイドでの染色によって可視化され得る (Tumer et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.、94: 3866-3871; Hartley et al. (1991) FEBS、290: 1:65-68)。脱プリンのパーセントは、RNA ゲルの写真のネガをスキャンすることによって決定され得る(see e.g.、Taylor et al. (1994) The Plant Journal、5: 827-835)。
RIP 毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供される選択方法において同定されるあらゆる改変毒素を含むあらゆる改変 RIP の活性は、細胞増殖に対する効果を直接評価することによって決定され得る。かかるアッセイにおいて、あらゆる原核または真核細胞は、例えば適切な発現ベクターの形態で、毒素をコードする DNA を導入され得る。あるいは、あらゆる原核または真核細胞は、RIP ポリペプチドまたはその複合体、例えばリガンド-毒素複合体を直接に投与され得る。これらに限定されないが、例えば、対象から、すなわち血液、血清または他の組織源から直接に得られるあらゆる初代細胞を含む、あらゆる細胞を試験することができる。かかる細胞の中には、あらゆる白血球サブタイプまたはその活性化白血球が含まれる。細胞株もまた、RIP ポリペプチドまたはその複合体の毒性を評価するため、アッセイにおいて用いられ得る。代表的な細胞株は、THP-1、U251 または HT-29 細胞である。
本明細書において提供されるのは、野生型 RIP ポリペプチドに比べて減少した毒素活性を示す改変 RIP 毒素ポリペプチドまたはその複合体である。例えば、改変 RIP 毒素ポリペプチドまたはその複合体は、基準(reference)または毒素の出発形態もしくはその複合体と比較して 0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上の毒素活性を示す。減少した毒性のため、かかる改変 RIP 毒素ポリペプチドは宿主細胞によって発現され、そこから精製され、単離されおよび/または同定され得る。改変毒素またはその複合体は、真核または原核細胞に対して減少した毒性を示す。一般的に、改変 RIP 毒素またはその複合体は、細菌細胞、例えば大腸菌に対して減少した毒性を示し、それによって大腸菌は大腸菌での生産方法において用いられ得る毒素の源を許容する。
本明細書において提供される代表的な RIP 毒素は、そのあらゆる活性形態、例えば切断ポリペプチドが RIP 活性を示す限りそのあらゆる切断型における改変を含む SA1 の改変形態、および対立遺伝子またはその種変異体である。例えば、改変 SA1 ポリペプチドは、例えば配列番号22 または 配列番号24 に記載される SA1 の切断型変異体におけるあらゆる1以上の改変、またはあらゆる対立遺伝子またはその種変異体を含み得る。選択方法において用いられる出発 SA1 毒素と比較して、改変 SA1 毒素は切断され得、またはアミノ酸突然変異を現し得る。通常、かかる改変毒素は、出発 SA1 ポリペプチドと比較して1以上の活性を保持する。従って、かかる改変 SA1 ポリペプチドは、SA1 ポリペプチドの生産を改善するための方法において用いられ得、および/または改変 SA1 ポリペプチドを含有する複合体タンパク質を生成するための融合タンパク質において用いられ得る。
本明細書において提供されるのは、1以上の部分または物質(agent)、例えばあらゆる化学物質、ポリペプチド、またはペプチド部分、またはそれらの部分に対し直接的または間接的に結合した RIP ポリペプチド毒素またはその活性な断片を含有する複合体である。通常、本明細書で提供される複合体において使用するための毒素は、あらゆる 改変 RIP 毒素変異体を含むあらゆる RIP 毒素変異体を含有する毒素である。かかる改変毒素は、本明細書において提供されるかまたは本明細書で提供される選択方法を用いて同定されるあらゆる改変 RIP 毒素、例えば、改変 SA1 毒素もしくは対立遺伝子変異体またはそれらの断片を含む。かかる改変 SA1 の中には、本明細書の選択方法において同定される突然変異体 変異体 1 SA1 (すなわち、変異体 3) または突然変異体 変異体 2 SA1 (すなわち、変異体 4) が含まれる。
一般的に、本明細書において提供される改変 RIP 毒素複合体は、複合体を様々な疾患過程の病態に関与する細胞または細胞集団上の1または複数の受容体に標的化する標的化剤を含有する。疾患または障害に応じて、かかる細胞は、疾患および疾患過程の関数である活性化細胞、または疾患過程を支持するバイスタンダー(bystander)細胞である。結果的に、これらの受容体およびこれらの受容体を発現する細胞を標的化することは、治療を特定の疾患および疾患の進行に合わせることを可能にする。したがって、本明細書において提供される複合体は、様々な疾患の治療において治療法(therapeutics)として用いられ得る。
本明細書において提供されるものは、リガンド-毒素複合体において用いられる標的化剤がケモカインのファミリーから選択される複合体である。ケモカインの本明細書の複合体における標的化剤としての使用を理解するためには、ケモカイン リガンドとそれらの受容体の機能および相互作用を理解することが有益である。以下の考察は、かかる背景を提供する。
上記のケモカインは、主として白血球サブタイプに作用する、小さな(およそ、約 6 から 約 14 kDa)、誘導性の、分泌される、化学誘引物質であるサイトカインのスーパーファミリーである。ケモカイン リガンドは、その一次構造において 15 から 50% の間の同一性を有するが、受容体結合および活性化の原因となるのはそれらの共有される高度に保存された三次元構造である。スーパーファミリーは、一次配列における4つの保存されたシステイン残基の位置(または存在)に基づいて、4つのサブ-ファミリーに分けられる。3つのグループは4つのシステインを含有し、残りのグループは含有しない。該3つのグループは、最初の2つのシステインの配置によって定義される。もし最初の2つのシステインが単一のアミノ酸によって分離されている場合、それらは CXC ファミリー(アルファとも称される)のメンバーである; もし該システインが隣接している場合は、それらは CC ファミリー(ベータとも称される)に分類される; もし該システインが3つのアミノ酸 CX3C によって分離されている場合、それらは第3のグループ(デルタとも称される)のメンバーである。ケモカインの第4のグループである C またはガンマは、他のグループにおける第1と第3のシステインに対応する2つのシステインを含有する。
ケモカインは、G-タンパク質-共役 7回膜貫通型 ロドプシン様 細胞表面受容体を介して、その活性を媒介する。通常、CXC ケモカインは7つの CXC-受容体 (CXCR1、2、3A、3B、4、5、6)のうちの1以上に結合し、一方、CC ケモカインは11の CC-受容体(CCR1、2A、2B、3-10)のうちの1以上に結合する。他のケモカイン受容体は、XCR1、CX3CR、D6、CKX-CKR および(ケモカインに対する Duffy 抗原受容体または DARC としても知られる) Duffy を包含する。DARC、D6 および CKX-CKR は、4つ全てのグループからのケモカイン リガンドに結合することができるスカベンジャー ケモカイン受容体である (Hansell et al.、Biochem Soc Trans.、34: 1009-13、2006; Locati et al.、Cytokine Growth Factor Rev.、16: 679-86、2005)。代表的なケモカイン受容体は、これらに限定されないが、ケモカインに対する Duffy 抗原受容体(DARC)、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、CXCR-7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、XCR1、D6 および他のケモカイン受容体を含む。
様々なケモカイン受容体-白血球特異性はかなり重複し得るが、各々のケモカイン受容体は別個の白血球特異性を有する(例えば、表 6 を参照)。例えば、同じケモカインおよび同じ機能に対して特異的な別個の受容体サブタイプが、同じ細胞上に共発現し得る。さらに、同じ細胞上の別々の受容体において作用する別個のケモカイン リガンドが、同じ細胞応答を誘導し得る。さらに、異なるケモカイン リガンドが共通の受容体に結合し、標的細胞に異なる細胞応答を誘導し得る。いくつかのケモカイン受容体は、他の細胞タイプ、例えば様々な組織固有細胞、例えば赤血球、血小板、アストロサイト、内皮細胞、ニューロン、上皮細胞、脂肪細胞および脳の小膠細胞上に発現し得るが、ほとんどのケモカインは、白血球、特に活性化された白血球上に発現する受容体に結合する。表 6 は、ケモカイン受容体の非-網羅的で代表的なリストを含み、白血球サブタイプならびに様々な疾患および非-疾患環境下で各々のケモカイン受容体を発現することが知られている他の細胞タイプの代表的なセットを示す。
鍵: NK=ナチュラルキラー; Th1=タイプ 1 ヘルパー T 細胞; Th2=タイプ 2 ヘルパー T 細胞; IDC=未熟樹状細胞; MDC=成熟樹状細胞; MNP=単核食細胞 (単球、マクロファージおよび小膠細胞); GC=巨細胞 (多核の融合マクロファージ); TAM=腫瘍関連マクロファージ; PMN=多核(polymononuclear)好中球; MaC=肥満細胞。 注釈: 上の表は、特定のケモカイン受容体を発現する細胞タイプの代表的で非網羅的なリストを表す。
本明細書で提供されるリガンド-毒素複合体において用いられるケモカイン リガンドは通常、免疫調節性のまたは炎症性の過程、例えば二次的な組織損傷を促進する病的炎症に関与する白血球または他の寄与的(contributing)エフェクター細胞を含む1以上の免疫エフェクター細胞上に発現する少なくとも1つのケモカイン受容体に対して、しかし通常は1より多くのケモカイン受容体に対して、特異性を有するあらゆるケモカインである。かかる受容体は一般的に、G-タンパク質共役で7回膜貫通-ドメインのロドプシン-様受容体のスーパーファミリーのメンバーであり、これらに限定されないが、例えば、ケモカインについての Duffy 抗原受容体(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、CXCR-7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、XCR1 および他のケモカイン受容体として当該技術分野において知られる1以上の受容体を含む。いくつかの例において、本明細書で提供される複合体における標的化剤としての使用のために選択されるケモカインは、特定の受容体に結合することができる一方、他の例においては、選択されるケモカインは1より多くの受容体に結合することができる。加えて、複合体における標的化剤としての使用のために選択されるケモカインは、他のケモカインと重複するおよび異なる受容体特異性を示し得る(例えば、表 5 を参照)。
ケモカイン受容体をも発現するあらゆるものを含む二次組織損傷に関与する細胞タイプ上の特定のサイトカイン受容体に結合する非ケモカイン サイトカインである古典的なサイトカインを含む複合体もまた、本明細書で提供される複合体においておよび本明細書で提供される複合体を作成する方法において、用いることができる。かかる古典的サイトカインを含む複合体は、腫瘍細胞を標的化することによって、治療、例えば癌治療のために用いられてきた。本明細書において、サイトカインが、ケモカイン-受容体を有する細胞、例えば腫瘍を浸潤する白血球および望ましくない炎症反応に関連する他の細胞に結合するその能力について選択されることが意図される。
リガンド-毒素複合体中の標的化剤はまた、炎症反応に関与する細胞の表面上に発現する受容体、特にケモカイン受容体、サイトカイン受容体およびケモカイン受容体を発現する細胞上に発現する他の受容体に対して特異的な抗体、特にモノクローナル抗体またはその機能的な断片であり得る。モノクローナル抗体は、ケモカイン受容体、例えば、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR-10、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、DARC、XCR1、CX3CR-1 などの受容体に対して特異的であることが好ましい。
本明細書において提供される複合体は、該複合体を細胞表面受容体へ標的化するあらゆる標的化剤を含有し得る。ケモカイン、サイトカインおよび抗体を含む上記の標的化剤に加えて、かかる標的化剤は、該標的化剤がそれが結合する細胞表面受容体によってインターナライズされる限り、例えば、これらに限定されないが、増殖因子、ホルモン、および他のリガンドまたは対立遺伝子変異体、変異タンパク質、またはその断片をも含む。かかる標的化剤は、本明細書において提供される方法を用いてリガンド-毒素複合体を生成するために用いられ得る。さらに、かかる標的化剤は、本明細書で提供される改変 SA1 変異体を含む改変毒素または毒素変異体に対して直接的または間接的に結合した標的化剤を含有するリガンド-毒素複合体を構築するために、用いられ得る。
炎症および/または二次組織損傷に関与する細胞タイプ上のエンドサイトーシス細胞表面受容体に結合する増殖因子もまた、本明細書で提供される複合体のための標的化剤として用いることができ、かつ、本明細書で提供される方法において用いることができる。かかる増殖因子は、リガンド-毒素複合体を内皮細胞へ標的化することを介して、癌および他の疾患、例えば眼疾患または様々な慢性炎症性状態を含む血管新生疾患に関与する細胞を標的化するための標的化剤としても用いることができる。増殖因子、例えば血管内皮増殖因子 (VEGF) またはアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するものを含むそのあらゆる改変形(modified version)は、それらが受容体に結合する能力を保持し、インターナライズされる限り、毒素部分を特定の細胞タイプに標的化するために用いることができる(例えば、米国特許出願第2004/0166565号およびUS20010031485号を参照)。したがって、かかる増殖因子は、本明細書で提供される改変志賀毒素 A1 変異体を含む改変毒素または毒素変異体に直接的または間接的に結合した増殖因子を含有するリガンド-毒素複合体を構築するために用いることができる。標的とされる細胞タイプは、例えば、腫瘍増殖および慢性の炎症性状態としばしば関連する新たな血管を成長させる過程である血管新生に関与する内皮細胞を含み得る。
本明細書で提供される複合体を調製する際、RIP 毒素、例えば本明細書で提供される 改変 SA1 毒素は、標的化剤へ直接的または間接的に結合させられる。例えば、本明細書で提供される複合体は、以下の成分を含む: (標的化剤)n、(L)q および (標的化物質)m、ここで、結果として得られる複合体が標的化受容体に結合し、インターナライズされ、標的化物質を送達する限り、L は、標的化剤を毒素に結合させるためのリンカーであり; 標的化剤は、細胞表面上に発現する受容体に結合しそれによってインターナライズされるあらゆる部分であり; 独立に選択される m および n は、少なくとも 1 であり; そして q は 0 以上である。標的細胞に対する改変 RIP 毒素の毒性を低減するため、リンカー部分のタンパク質性リガンドへの付着が、標的細胞への、すなわち標的細胞上の受容体へのタンパク質性リガンドの結合を実質的に妨害しないか、またはリガンド-毒素のインターナリゼーションまたは代謝を実質的に妨害しない限り、複合体における成分の結合は、2つの部分を付着させるための、当該技術分野において現在知られるあらゆる方法によるものであり得る。結合は、これらに限定されないが、イオンおよび共有結合ならびにあらゆる他の十分に安定な結合(associate)を含むあらゆる型の結合であり得、これによって、標的化物質 (例えば、改変 RIP 毒素)が、複合体が標的化される細胞によってインターナライズされる。
当業者に公知のあらゆるリンカーが、本明細書において用いられ得る。一般的に、異なるセットのリンカーが、化学的に作成された複合体におけるリンカーからの融合タンパク質である複合体において用いられる。化学的に結合した複合体に適するリンカーおよび結合は、これらに限定されないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、立体障害のある(hindered)ジスルフィド結合および遊離の反応性の基、例えばアミンおよびチオール基の間の共有結合を含む。これらの結合は、ヘテロ二官能性の試薬を用いて1または両方のポリペプチド上に反応性のチオール基を生成し、次いで1つのポリペプチド上のチオール基を、他方で反応性のマレイミド(maleimido)基またはチオール基が付着していても良い反応性のチオール基またはアミン基と反応させて生成される。他のリンカーは、より酸性の細胞内区画において切断される酸開裂性リンカー、例えばビスマレイミドエトキシプロパン(bismaleimideothoxy propane)、酸不安定トランスフェリン複合体およびアジピン酸ジヒドラジド(diihydrazide); UV または可視光へ曝露されると切断される架橋剤、およびリンカー、例えば様々なドメイン、例えばヒト IgG1 の定常領域からの CH1、CH2 および CH3 を含む(Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386 を参照)。いくつかの態様において、各リンカーの所望の特性を利用するために、いくつかのリンカーが含まれ得る。化学的リンカーおよびペプチド リンカーは、リンカーをケモカイン受容体標的化剤および改変 RIP 毒素に共有結合させることによって挿入することができる。以下に記載されるヘテロ二官能性の物質は、かかる共有結合を生じさせるために用いることができる。ペプチド リンカーは、融合タンパク質としてリンカーおよび標的化剤、リンカーおよび改変 RIP 毒素、またはリンカー、改変 RIP 毒素および標的化剤をコードする DNA を発現させることによっても結合させることができる。可動性のリンカーおよび複合体の溶解度を増大させるリンカーが、使用について考慮される; 単独のまたは他のリンカーを伴うもののいずれかも本明細書において考慮される。
アミノ基およびチオール基の間に共有結合を形成するためにまたはチオール基をタンパク質内に導入するために用いられる多数のヘテロ二官能性の架橋試薬は、当業者に公知である(例えば、かかる試薬の調製および使用を記載し、かかる試薬についての商業的供給源を提供する PIERCE CATALOG、ImmunoTechnology Catalog & Handbook、1992-1993 を参照されたい; 例えば、Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:397-401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924-5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. 84:308-312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163-170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66:361-366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589 も参照されたい; 架橋のための試薬は以下から入手可能である: Pierce Chemical Company、Rockford、IL; Sigma Chemical Company、St. Louis、MO.; Molecular Probes、Inc.、Eugene、OR)。架橋のために用いられ得る官能基は、主要なアミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物およびカルボン酸を含む。ヘテロ二官能性の架橋試薬における使用のための代表的な基は、これらに限定されないが、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、N-ヒドロキシスクシニミド(NHS)-エステル、ヒドラジド、PFP-エステル、ヒドロキシメチル ホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジル ジスルフィド、イソシアネート、およびビニル スルホンを含む。ヘテロ二官能性の架橋試薬は、標的化剤、例えばケモカインと 改変 RIP 毒素の間に共有結合を形成するために用いられ得る。代表的なヘテロ二官能性の架橋剤は、2つの反応性の基を含有する: 1つは主要なアミン基と反応し(例えば、N-ヒドロキシスクシニミド)、もう一方はチオール基と反応する(例えば、ピリジル ジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど)。主要なアミン反応性基を介して、架橋剤は一方のポリペプチドの1または複数のリジン残基と反応することができ、チオール反応性基を介して、既に第1のタンパク質に結合している架橋剤は、他方のポリペプチドのシステイン残基(遊離のスルフヒドリル基)と反応する。代表的なヘテロ二官能性の架橋剤は、これらに限定されないが、以下を含む: N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP; ジスルフィド リンカー); スルホスクシンイミジル 6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート (スルホ-LC-SPDP); スクシンイミジルオキシカルボニル--メチルベンジルチオサルフェート (SMBT、妨害されたジサルフェートリンカー); スクシンイミジル 6-[3-(2-ピリジルジチオ) プロピオンアミド]ヘキサノエート (LC-SPDP); スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (スルホ-SMCC); スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート (SPDB; 妨害されたジスルフィド結合リンカー); スルホスクシンイミジル 2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド) エチル-1,3'-ジチオプロピオネート (SAED); スルホスクシンイミジル 7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセテート (SAMCA); スルホスクシンイミジル 6-[アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート (スルホ-LC-SMPT); 1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン (DPDPB); 4-スクシンイミジル-オキシカルボニル--メチル--(2-ピリジルチオ)トルエン (SMPT、妨害されたジサルフェートリンカー); 4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-a-(2-ピリジルジチオ)トルエン; スルホスクシンイミジル6[-メチル--(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート (スルホ-LC-SMPT); m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミド エステル (MBS); m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミド エステル (スルホ-MBS); N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート (SIAB; チオエーテル リンカー); スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノ ベンゾエート (スルホ-SIAB); スクシンイミジル4(p-マレイミドフェニル)ブチレート (SMPB); スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート (スルホ-SMPB); アジドベンゾイル ヒドラジド (ABH); 3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニル ヒドラジド; エルマン試薬; ジクロロトリアジン酸、S-(2-チオピリジル)-L-システイン。さらなる代表的な二官能性結合化合物は、例えば、米国特許第5,349,066号、第5,618,528号、第4,569,789号、第4,952,394号および第5,137,877号に開示されている。
酸開裂性リンカー、光開裂性および感熱性リンカーも、特に、より容易に反応に到達できるようにするため改変 RIP 毒素を切断することが必要な場合に、用いることができる。多くの開裂可能な基が当該技術分野において知られている (例えば、Jung et al. (1983) Biochem. Biophys. Acta 761: 152 162; Joshi et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14518 14525; Zarling et al. (1980) J. Immunol. 124: 913 920; Bouizar et al. (1986) Eur. J. Biochem. 155: 141 147; Park et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 205 210; Browning et al. (1989) J. Immunol. 143: 1859-1867 を参照)。さらに、広い範囲の開裂可能な二官能性リンカー基が、Pierce などの供給者から市販されている。
他のリンカーは、トリチルリンカー、特に、様々な程度の酸性度またはアルカリ度で治療剤の放出をもたらす複合体の属を作成するための誘導体化されたトリチル基を含む。そのため、治療剤が放出される pH 範囲を事前に選択する能力によってもたらされる可動性は、治療剤の送達を必要としている組織間における既知の生理学的差異に基づくリンカーの選択を可能にする(例えば、米国特許第5,612,474号を参照)。例えば、腫瘍組織の酸性度は、正常組織の酸性度よりも低いと思われる。
リンカー部分は、ペプチドであり得る。ペプチド リンカーは、融合タンパク質において採用され得、化学的に結合した複合体においても採用され得る。ペプチドは通常、約 2 から 約 60 のアミノ酸残基、例えば約 5 から 約 40、または約 10 から 約 30 のアミノ酸残基を有する。選択される長さは、因子、例えばリンカーが含まれる使用に依存する。
代表的なリガンド-毒素複合体は、志賀毒素 A1 (SA1) 変異体、例えば、本明細書に記載されるいずれかの SA1 変異体に直接的または間接的に結合したケモカインを含有する LPM 複合体を含む。通常、かかる複合体は、ケモカイン ポリペプチドの成熟部分または受容体に結合することができるポリペプチドの一部を含有する。所望により、結合が間接的である場合、複合体をコードする核酸分子は、ケモカイン標的化剤ポリペプチドと SA1 変異体標的化部分の間のリンカーポリペプチド、例えば Ala-Met リンカー(配列番号34; 技術的に、Met は細菌発現のための志賀毒素の開始コドンである)をコードする配列を含有し得る。いくつかの例において、精製、発現、クローニングまたは検出を促進するため、さらなる核酸分子が、リガンド-毒素複合体をコードする核酸に付加され得、または他の手段、例えば化学的リンカーによってリガンド-毒素複合体に結合され得る。例えば、制限酵素部位が、クローニングを促進するために核酸分子の 3' および 5' 末端の一方または両方において設計され得る。かかる一つの例において、配列番号37 および 39 に示される通り、位置 1-6 における NdeI 制限部位および位置 967-972 における BamHI 制限部位が、核酸分子中に設計された。
標的化物質に結合された標的化部分の複合体は、化学的結合、組換DNA技術または組換発現と化学的結合のコンビネーションのいずれにより製造され得る。本明細書の方法は、いずれの標的化物質、例えばRIP毒素、といずれの標的化剤の、本明細書で記載されているような、直接的な結合またはリンカーを介した結合のいずれかを調製及び使用するために使用され得る。標的化剤と標的化物質は、いずれかの向き(orientation)で、結合され得、複合体には、1以上の標的化剤及び/または標的化物質が存在し得る。本明細書の方法は、標的化剤、例えば、ケモカイン、及び標的化物質、例えば、改変志賀毒素 A1 ポリペプチドを含む複合体を特に参照して、例示される。
核酸s encoding a 改変毒素をまたはリガンド−毒素複合体を含む改変毒素を含む複合体コードする核酸は、核酸分子のクローニングおよび単離のための本分野で利用可能ないずれの方法を用いて、クローン化され、または単離され得る。例えば、標的化剤、またはリガンド、及び1以上の標的化物質の化学的融合タンパク質を含む複合体は、標的化剤または標的化物質の核酸配列が知られている場合はタンパク質合成、または、選択された標的化剤または標的化物質をコードするDNA分子の化学合成という、良く知られた技術によって製造され得る。あるいは、もし、標的化剤または標的化物質の核酸配列が不明であれば、限定はされないが、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニング及び活性ベースのスクリーニングを含むライブラリーのスクリーニング等の良く知られた方法を用いて、配列が最初に決定され得る。かかるスクリーニング方法は、また、アミノ酸配列の一部分のみが知られているときに、特定のタンパク質をコードする核酸配列を得るために使用され得る。
毒素またはその複合体、例えば、本明細書で与えられるいずれのリガンド−毒素複合体をコードする核酸分子は、核酸分子を含むベクターの形式で、提供され得る。かかるベクターの一例はプラスミドである。多くの発現ベクターが入手可能であり、当業者に知られており、毒素複合体を含む毒素ポリペプチドの発現のために使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択により影響され得る。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーター、及び場合によっては、エンハンサー、転写シグナル、及び、転写及び翻訳の終止シグナルを含むことができる。安定的な形質転換に用いられる発現ベクターは、典型的には、選択及び形質転換された細胞の維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。いくつかのケースでは、ベクターのコピー数を増幅させるために、複製起点(origin of replication)が使用され得る。加えて、多くの発現ベクターは、多重クローニングサイトの近傍に、N末端またはC末端エピトープタグのいずれかを提供し、その結果得られた、ベクターから発現されたいずれかのタンパク質は、ポリペプチド配列に、フレームを合わせて(in frame)挿入されたエピトープタグを有し得る。
本明細書で提供されるRIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む発現ベクターの構築、並びに、トランスフェクトされた細胞での核酸の発現は、本分野でよく知られたモレキュラークローニング技術の使用を必要とする。かかる方法は、適切な転写/翻訳コントロールシグナルに操作可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターの構築を含む。これらの方法は、また、インビトロ組換核酸(例えば、DNAまたはRNA)技術、合成技術及びインビボ組換/遺伝子組換を含む(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Sambrook et al.、eds.、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.、1989; Current Protocols in Molecular Biology、Vols. 1 and 2、Ausubel、et al. eds.、Current Protocols、1987-1994; John Wiley and Sons、Inc.、1994-1999; 及び Cloning Vectors: A Laboratory Manual、Vols I - IV、Pouwels、et al.、eds.、及びその追補版、Elsevier、N.Y.、1995-1998に記載された技術を参照)。
バクテリア系では、多数の発現ベクターが、系の所望の特性によって、有利に選択され得る。例えば、大量のRIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質が産生される必要があれば、容易に精製される、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質生産物の高いレベルの発現を指向するベクターが望まれうる。発現されるポリペプチドを回収することに役立つ切断部位を含むように設計されたものが好ましい。pET 11a、b、c、またはd(Novagen、Madison、WI)を含む、いくつかの商業的に入手可能なベクターを用いることにより、よい結果が得られ、そして得られてきている。
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体を発現させるために用いることができる別の発現系は、昆虫の系である。このような系の一つに、オートグラファ・カリフォルニア・核多角体病ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)が、外来遺伝子発現のためのベクターとして使用される。ウイルスは、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞で成育する。RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸を、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)にクローン化されることができ、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置する。RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸の上手く挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子を不活化し、非閉塞組換ウイルス(例えば、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質性コートを欠損するウイルス)を産生する。そして、これらの組換ウイルスは、挿入遺伝子が発現される、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞を感染させるために使用される(米国特許No. 4,215,051)。
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の発現のために使用されることができる別の発現系は、酵母である。酵母においては、数多くの、構成的または誘導プロモーターを含むベクターが、使用され得る。このようなベクターはよく知られている(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Sambrook et al.、eds.、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.、1989; Bitter、et al. (1987) Methods in Enzymol. 153: 516-544; Bitter et al. (1987) Methods in Enzymol.、152: 673-684; Rothstein、DNA Cloning、Vol. II、Glover、D.M.、ed.、IRL Press、Wash.、D.C.、Ch. 3、1986; および The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、Strathern et al.、eds.、Cold Spring Harbor Press、Vols. I and II、1982、に記載されている技術を参照)。ADHやLEU2にような構成的な酵母プロモーターまたはGALのような誘導プロモーターが使用され得る(例えば、Rothstein、DNA Cloning、Vol. II、Glover、D.M.、ed.、IRL Press、Wash.、D.C.、Ch. 3、1986参照)。あるいは、外来DNA配列の酵母染色体への組込みを促進するベクターが使用され得る。
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の発現のために使用されることができる別の発現系は、植物細胞系である。植物発現ベクターを使用する場合、複合体タンパク質をコードするDNA分子の発現が、多くのプロモーターのいずれかにより駆動されることができる。例えば、CaMVの35S RNA及び19S RNAプロモーター(例えば、Brisson et al.、(1984) Nature 310: 511-514参照)のようなウイルスプロモーター、またはTMVへのコートタンパク質プロモーター(例えば、Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311参照)が使用され得る;あるいは、RuBisCOの小サブユニット(例えば、Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 及び Broglie et al. (1984) Science 224: 838-843参照)のような植物プロモーター;または、例えば、ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B(たとえば、Gurley、et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565参照)が使用され得る。これらの構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、ダイレクトDNAトランスフォーメーション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、他の技術を用いて、植物細胞に導入され得る。このような技術の総説は、例えば、Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology、Academic Press、NY、Section VIII、pp. 421-463 及び Plant Molecular Biology、2d Ed.、Covet、S.N.、Ed.、Ch. 7-9、Blackie、London 1988である。
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の発現のために使用されることができる別の発現系は、哺乳類細胞系である。発現構築物は、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスのようなウイルス感染により、または、リポソーム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランのようなダイレクトDNAトランスファーにより、及び、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションのような物理的手段により、動物細胞にトランスファーされる。哺乳類細胞のための発現ベクターは、典型的には、mRNAキャップ部位、TATAボックス、転写開始配列(Kozak コンセンサス配列)及びポリアデニル化要素を含む。このようなベクターは、しばしば、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、SV40プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス(RSV)のロングターミナルリピートを含む。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞のタイプで活性である。組織及び細胞タイププロモーター及びエンハンサー領域は、また、発現に使用され得る。例示的なプロモーター−エンハンサー領域には、限定はされないが、例えば、エラスターゼ、インスリン、免疫グロブリン、マウス哺乳類腫瘍ウイルス(mouse mammary tumor virus)、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、アルファ−1−アンチトリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質(myelin basic protein)、ミオシン軽鎖−2及び性腺ホルモン放出ホルモン遺伝子コントロールが含まれる。選択可能なマーカー遺伝子には、限定はされないが、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hygromycin B phosphotransferase)、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、及びチミジンキナーゼが含まれる。細胞表面シグナリング分子、例えば、TCR-ζ及びFcεRI-γとの融合は、活性状態のタンパク質の発現を細胞表面に仕向ける。
発現された改変RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体を宿主細胞から単離し、そして精製する技術は、選んだ宿主細胞及び発現系に依存する。分泌された分子では、タンパク質は、一般的には、培養培地から細胞を除いた後に精製される。細胞内発現では、細胞は、可溶化され、そして、タンパク質が抽出物から精製され得る。トランスジェニック生物、例えば、トランスジェニック植物及び動物を発現のために用いるとき、組織または器官は、可溶化された細胞抽出物を作成するための出発物質として使用され得る。さらに、トランスジェニック動物製造は、集められ、そして、必要があれば、本分野で標準的な方法を用いてさらにタンパク質が抽出され、さらに精製される、ミルクや卵におけるポリペプチドの産生を含み得る。
本明細書における化学的複合体を達成するために、標的化剤は、標的化物質に、1以上の選択されたリンカーを介して、または直接的に結合される。化学的複合は、標的化物質及び標的化剤が別々のポリペプチドとして発現される場合に使用され得、そして、標的化物質が、ペプチドまたはタンパク質以外、例えば、核酸または非−ペプチド薬剤である場合に使用され得る。選択された部分を化学的に結合するために本分野で知られているいずれの手段も使用され得る。いくつかの方法が本明細書の他の場所に記載されており、限定はされないが、ホモ−及びヘテロ二官能性(bifunctional)の結合化合物のような架橋剤を含む。
本明細書で提供されているのは、宿主の毒性ポリペプチドの産生を増加させることを可能にするために、RIP毒素の毒性を減じることにより、組換え発現RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体またはその改変体の産生する方法である。このような方法において、RIP毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供されるいずれかのものは、例えば、上記セクションGで記載されたように製造され得、1またはそれ以上のRIP阻害剤の存在下で製造され得る。当業者に知られる、または後に見いだされる、RIP毒素を不活性化することができるいずれのRIP毒素阻害剤も、本明細書で提供される方法により使用され得る。本明細書の他の場所で記載されるように、例示的なRIP毒素阻害剤には、例えば、RIP-特異的オリゴヌクレオチド阻害剤、例えば、RNAアプタマー(RNA aptamer)、RIP-特異的抗体、及び/または、例えば、アデニン、4−アミノピラゾロ[3,4−d]ピリミジン(4−APP)、及び他の同様の異性体を含むアデニン異性体が含まれる。本明細書で提供される方法において、典型的には、このようなRIP毒素阻害剤は、RIP毒素の保存されたN-グリコシダーゼ活性を標的とすることにより毒素活性を阻害するいずれかのものである。本明細書における目的のために、いずれのRIP阻害剤、例えば、アデニンまたはそのいずれのアナログを、その阻害剤がRIP毒素またはその複合体に対する阻害活性を示す限り、本明細書の方法に使用され得る。したがって、RIP阻害剤、例えば4−APPは、限定はされないが、改変SA1、サポニン、モモルジン(momordin)またはブリオジン(bryodin)を含む、RIP毒素、リガンド−RIP毒素複合体、または、その変異体のタンパク質産生のための本明細書に記載された方法に使用することができる。
タンパク質の発現及び産生の間に、RIP阻害剤、例えば、4−APPを用いることによる、RIPポリペプチドまたはリガンド−毒素複合体の産生の増加に加えて、他の方法もまた使用され得る。ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるいずれのRIPポリペプチドまたはその複合体の発現及び産生を改善する方法は、本分野で知られるいずれの方法を含む。かかる方法の使用は、ポリペプチドを生成するために用いた発現系(例えば、細菌、酵母、哺乳類、昆虫、植物等)に依存し、発現ベクター(例えば、制御されたまたは構成的な発現)、宿主細胞の成育条件、またはタンパク質誘導パラメーターの選択などの因子の修飾を伴うことができる。宿主細胞からの発現されるポリペプチドの単離のための、上記した精製方法(例えば、宿主細胞溶解及びタンパク質分離)は、また、生成されるタンパク質の量を改善するために、本分野で知られる改変により最適化され得る。産生を改善するための更なる方法の例は、以下に記載する。
一般的に、本明細書で与えられるリガンド−毒素複合体は1以上の宿主細胞に対して毒性を示し、及び/または、例えば、細胞表面受容体を標的化し、結合する能力によって1以上の他の活性を示す。必要であれば、複合体は、インビトロ及びインビボアッセイを用いて、スクリーニングされ、毒素複合体の活性をモニターし、または同定し、そして、かかる活性を示す複合体を選択する。本明細書で提供されるいずれの複合体を試験するインビトロアッセイは、複合体が特定の宿主細胞標的化集団に対して活性を示すか否かを測定するいずれのアッセイを含む。かかる活性には、限定はされないが、細胞ベースの毒性アッセイ、受容体結合アッセイ、細胞インターナリゼーションアッセイ、及び走化性アッセイが含まれる。さらに、多様なインビボ動物モデルが知られ、または、特定の疾病モデルにおける特定の毒素の効果を評価するために設計され得る。
a. 細胞ベースの毒性アッセイ
本明細書で提供される複合体は、宿主細胞に対する毒性活性、例えば、N−グリコシダーゼ活性によるものについて試験され得る。毒性活性を試験するためのアッセイは、上記セクションDに詳細に記載され、限定はされないが、宿主細胞のタンパク質合成、リボソームの脱プリン化、及び細胞成長または生存を評価するためのアッセイを含む。例えば、毒性活性評価のために選択される宿主細胞は、標的化受容体を発現することが知られているものであり得る。かかる細胞には、対象、すなわち、血、血清または他の組織ソースから直接的に得られたもの、または細胞表面受容体を発現することが知られている細胞株が含まれる。かかる細胞は、活性化された細胞を含む。細胞は、あらゆる数の刺激によりインビトロで活性化され得るか、及び/または、病気または疾患、とりわけ、炎症疾患または活性化された白血球または他の細胞タイプにより特徴付けされる病気または疾患を有する患者より直接的に得ることができる。毒性活性アッセイにおいて試験され得る細胞タイプの例には、限定はされないが、免役細胞(限定はされないが、単球、マクロファージ(肺胞マクロファージ、ミクログリア、クッパー細胞を含む)、樹状細胞(未熟または成熟樹状細胞またはランゲルハンス細胞を含む)、T細胞(CD4陽性、例えば、限定はされないが、Th1および/またはTh2細胞またはCD8陽性)、B細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及び内皮細胞、またはそれらの活性化形態)が含まれる。リガンド−毒素複合体に対する毒性を試験することができる他の細胞には、例えば、癌細胞または癌細胞株、例えば、U251、HT-29またはTHP-1 細胞が含まれる。上記のように、細胞の生存(または細胞死)は、例えば、培養培地へのATP放出の能力、生存色素(vital dye)MTTを低減する細胞の能力により測定され得る。
リガンド−毒素複合体、例えば、いずれのケモカイン毒素複合体、例えば、いずれの本明細書で与えられる改変されたSA1部分を含むLPMは、1以上の標的化宿主細胞の細胞表面受容体を標的化するために設計される。このような細胞表面受容体に結合する毒素複合体は、細胞への毒素複合体の結合を評価することによって、直接的に評価され得る。ある例において、単球、マクロファージ(肺胞マクロファージ、ミクログリアを含む)、T細胞(Th1及びTh2細胞を含む)、B細胞、好酸球、好塩基球、樹状細胞、クッパー細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及び内皮細胞への毒素複合体の結合が、測定され得る。望まれるならば、細胞は、いずれの知られている活性化剤により、結合実験の前に、多様な病気及び疾患で見いだされる炎症及び病原性の状態でしばしば起きるような、受容体の発現を誘導するために、まず、いずれの知られている活性化剤により活性化され得る。試験される細胞は、ドナーから直接的に単離された、適切なドナー由来の、または、適切な細胞表現型を誘導する条件下で長期間培養された、細胞株または初代培養細胞であり得る。ある例において、競合アッセイが、関連する非結合リガンドと共に、リガンドに比較した毒素複合体の活性を評価するために採用され得る。例えば、毒素複合体LMP1dが試験されれば(修飾SA1に結合されたケモカインMCP-1を含む)、MCP-1単独は、競合アッセイにおいて試験され得る。
毒素複合体;特に、本明細書で提供される改変されたSA1部分を含むLPM複合体のような1以上のケモカイン毒素複合体は、従来の走化性アッセイを用いて、細胞の走化性を修飾する能力を試験することができる。かかる測定は、同種のケモカイン受容体に結合するケモカインの能力と関連する。かかるアッセイにおいて、活性化された白血球を含む白血球の移動は、ケモカインにより惹起され得、ルーチンなボイデンチャンバーセットアップ(Boyden chamber set up)を用いてフィルターを通して移動する細胞の数を数えることにより、測定される(例えば、McDonald et al. (2001) IDrugs、4: 427-442参照)。例えば、限定はされないが、単球、マクロファージ(肺胞マクロファージ、ミクログリアを含む)、T細胞(Th1及びTh2細胞を含む)、B細胞、好酸球、好塩基球、樹状細胞、クッパー細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及び内皮細胞を含むいずれの所望の細胞は、修飾されたボイデンチャンバーのトップのウェルに置くことができる。このような細胞は、細胞株であり得、または、ドナーから直接に単離された適切なドナー由来の、または適切な細胞表現型を誘導するための条件下で長期間培養された初代培養細胞であり得る。ボイデンチャンバーの低い方のチャンバーは、典型的には、リガンドケモカインの含む培養培地を含む。ある場合には、ある細胞は、構成的に活性であり、特異的な外因性の刺激なしで、移動することができる。このような細胞には、例えば、THP−1細胞が含まれる。したがって、THP−1細胞が走化性アッセイで使用されるなら、外因性のサイトカインは必要とされない、そして、ケモカイン複合体の効果は、移動を介したボトムのチャンバーに存在する活性細胞及びトップチャンバーに残る不活性細胞と比較され得る(McDonald et al. (2001) IDrugs、4: 427-442)。ボイデンチャンバーのトップ及びボトムウェルの1つまたは両方は、あらゆる濃度のケモカイン毒素複合体で処置され得る。30分、1時間、2時間、5時間、10時間、15時間、24時間、またはそれ以上のインキュベーションに続き、チャンバーのそれぞれのウェルの細胞数(またはフィルター上に存在する)が測定され得る。個々のチャンバーのそれぞれにおける細胞へのケモカイン毒素複合体の作用は、測定され、そして、毒素複合体を含まないコントロールウェルと比較することができる。チャンバーの1つまたは両方において細胞が存在しないこと、及び/または、ボトムチャンバーに移動活性細胞が存在しないことは、ケモカイン毒素複合体が標的細胞集団に対して活性であることを示す。
本明細書で提供される複合体、例えば、修飾されたSA1に結合するポリペプチドまたはその活性部分、例えば、本明細書で提供される改変されたSA1部分を含むいずれのLPM複合体を含む、は、ケモカイン及び/またはその受容体が関連または関係している疾患の処置に使用され得る。特定の疾患に対する特定の複合体は、本明細書に記載される。必要であれば、当業者は、よく知られたモデルにおいて、特定の適応疾患に対する使用のための複合体を確認し、または特定するために複合体を試験することができる。疾患の動物モデルはよく知られている。かかるモデルには、炎症疾患、とりわけ活性化された白血球、または、ある病気の状態においてケモカイン受容体を発現する活性化された白血球または細胞に関わる疾患のいずれの動物モデルが含まれ、リガンド−毒素複合体で処置されるために、本明細書に包含される。かかる動物モデルで毒素複合体の活性を評価することは、本明細書で包含される特定の疾患または状態の処置に適したそれら毒素複合体を確認及び/または特定することができる。
SCIの処置に対する本明細書で記載された複合体の活性を試験し、そして実証するためのモデルは、当業者に知られている。リガンド−毒素複合体、例えば、改変されたSA1部分を含むLPMを試験するために用いることができるSCIの動物モデルを提供し、使用している例示的な参考文献は、限定はされないが、本明細書に示された以下の参考文献を含む。
神経変性疾患、例えば、外傷性脳損傷及び脳卒中の処置のために、本明細書に記載されている複合体の活性を試験し、そして検証する方法は、当業者に知られている。神経変性疾患、例えば、外傷性脳損傷及び脳卒中の動物モデルを提供し、使用する例示的な参考文献は、本明細書で提供されている。かかる方法は、リガンド−毒素複合体、例えば、修飾されたSA1部分を含むLPM複合体を確認、または特定するために使用され得、限定はされないが、本明細書に示される以下の参考文献を含む。
神経変性疾患、例えば、(AD)の処置のために本明細書に記載された複合体の活性を試験し、そして検証するための方法は、当業者に知られている。これらのモデルは、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病の処置のために使用される複合体を確認し、または特定するために使用され得、リガンド−毒素複合体、例えば、修飾されたSA1部分を含むLPM複合体を試験するために使用され得るが、限定されることなく、本明細書に示された以下の参考文献を含む。
多発性硬化症(MS)は、限局された領域の脱髄により特徴づけられる中枢神経系(CNS)の炎症性疾患である。ミエリン抗体に反応する免疫がこの疾患プロセスに貢献する。MSは、顕著な炎症、オリゴデンドロサイトのミエリン鞘の喪失、神経変性、グリオーシス及び軸索喪失により特徴づけられる異種(heterogeneous)慢性自己免疫疾患である。(例えば、Bruck、W. & Stadelmann、C. Neurol Sci 24 Suppl 5、S265-7 (2003); Bruck、W. & Stadelmann、C.、Curr Opin Neurol 18、221-4 (2005); Fox、E.J.、Neurology 63、S3-7 (2004); Fox、R.J. & Ransohoff、R.M、Trends Immunol 25、632-6 (2004); Hendriks、J.J.、Teunissen、C.E.、de Vries、H.E. & Dijkstra、C.D. Brain Res Brain Res Rev 48、185-95 (2005); Prat、A. & Antel、J.、Curr Opin Neurol 18、225-30 (2005); Liu、L.、Callahan、M.K.、Huang、D. & Ransohoff、R.M.、Curr Top Dev Biol 68、149-81 (2005); Mahad、D. et al.、Ernst Schering Res Found Workshop、59-68 (2004)参照。)この病気は、北アメリカで約400,000人、全世界では250万人が罹患する(例えば、Cross、A.H. & Stark、J.L.、Immunol Res 32、85-98 (2005); Hafler、D.A.、J Clin Invest 113、788-94 (2004); Sindern、E.、Front Biosci 9、457-63 (2004); and Steinman、L.、Neuron 24、511-4 (1999)参照)。オンセットは通常20−40歳であるが、異なる予後及び診断の結果(challenge)を含む、早期(18歳未満)及び後期(50歳を過ぎる)オンセットのケースを含む非典型的なMSの形態がある(例えば、Krupp、L.B. & Macallister、W.S.、Curr Treat Options Neurol 7、191-199 (2005); Martinelli、V.、Rodegher、M.、Moiola、L. & Comi、G.、Neurol Sci 25 Suppl 4、S350-5 (2004); Stadelmann、C. & Bruck、W.、Neurol Sci 25 Suppl 4、S319-22 (2004); Stadelmann、C. et al.、Brain 128、979-87 (2005)参照)。
EAEモデルにおいては、脱髄疾患がマウスに惹起される。活性化された単球、マクロファージ、ミクログリア及びT細胞が、組織損傷の原因となる。このケースのモデルは急性(再発−寛解に反対の慢性進行性MSのような)であるが、悪化の前に必須なものには、CNS及び病気で浸潤する白血球グループ上でのCCR2(例えば、LPM1dに対する受容体;配列番号:44で示されたLPM1dポリペプチドのアミノ酸配列)のアップレギュレーションがある。したがって、そのモデルは、全てのタイプのMSに適用できる処置を確かにする。リガンド−毒素複合体、例えば、修飾されたSA1部分を含むLPM複合体を試験するために用いることができる多発性硬化症の動物モデルを提供し、使用している例示的な参考文献には、限定はされないが、Liu et al. (1998)、Nat Med 4:78-83があり、そこでは、MSを検討するための、実験的な自己免疫 脳脊髄炎 (EAE)齧歯類モデルの使用が記載されている。EAEモデルにおける、本明細書に提供される複合体の有効性を示すデータは、実施例10にて提供される。
多くの研究において、ヒトMSの病因論及びEAEモデルにおいてマクロファージ及びミクログリアが必須である。DC、MaC及びB細胞は、また、役割を果たす(Cross、A.H. & Stark、J.L.、Immunol Res 32、85-98 (2005); Zhang、Y. et al.、J Clin Immunol 25、254-64 (2005); Mouzaki、A.、Tselios、T.、Papathanassopoulos、P.、Matsoukas、I. & Chatzantoni、K.、Curr Neurovasc Res 1、325-40 (2004); Heppner、F.L. et al.、 Nat Med 11、146-52 (2005); Huitinga、I. et al.、Clin Exp Immunol 100、344-51 (1995); Polfliet、M.M. et al.、J Neuroimmunol 122、1-8 (2002); Behi、M.E. et al.、Immunol Lett 96、11-26 (2005); Theoharides、T.C. & Cochrane、D.E.、J Neuroimmunol 146、1-12 (2004); Chavarria、A. & Alcocer-Varela、J.、Autoimmun Rev 3、251-60 (2004); Kouwenhoven、M. et al.、J Neuroimmunol 126、161-71 (2002); Greter、M. et al.、 Nat Med 11、328-34 (2005))。ミクログリア細胞はEAEのオンセットの前に活性化され、増殖する(例えば、Ponomarev、E.D.、Shriver、L.P.、Maresz、K. & Dittel、B.N.、J Neurosci Res 81、374-89 (2005)参照)。ミクログリアとマクロファージの不活性化及びT及びMNP細胞の除去(depletion)は、EAEの重篤度を改善する(例えば、Heppner、F.L. et al.、Nat Med 11、146-52 (2005); Huitinga、I. et al.、Clin Exp Immunol 100、344-51 (1995); Polfliet、M.M. et al.、J Neuroimmunol 122、1-8 (2002); Rajan、A.J.、Asensio、V.C.、Campbell、I.L. & Brosnan、C.F.、J Immunol 164、2120-30 (2000); Rajan、A.J.、Klein、J.D. & Brosnan、C.F. J Immunol 160、5955-62 (1998); Bauer、J. et al.、Glia 15、437-46 (1995); Kotter、M.R.、Zhao、C.、van Rooijen、N. & Franklin、R.J.、Neurobiol Dis 18、166-75 (2005);及びTran、E.H.、Hoekstra、K.、van Rooijen、N.、Dijkstra、C.D. & Owens、T.、J Immunol 161、3767-75 (1998)参照)。研究は、末梢のマクロファージが、T細胞の活性化とEAEの進展に極めて重要であることを示してきた(例えば、Polfliet、M.M. et al.、J Neuroimmunol 122、1-8 (2002); Deloire、M.S. et al.、Mult Scler 10、540-8 (2004); Imrich、H. & Harzer、K.、J Neural Transm 108、379-95 (2001); Raivich、G. & Banati、R.、Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004)参照)。リツキサン(抗CD20mAb)を用いたMS患者におけるB細胞の除去(depletion)により、顕著な臨床的な改善がもたらされた(Stuve、O. et al.、Arch Neurol 62、1620-3 (2005)参照)。EAEにおけるPMNの除去は、病気のエフェクター相(effector phase)を阻害する。MS患者におけるPMNは、病気の増悪に繋がるいくつかの細胞表面抗原を高いレベルで発現させる(例えば、McColl、S.R. et al.、J Immunol 161、6421-6 (1998); Ziaber、J. et al.、Mediators Inflamm 7、335-8 (1998)参照)。マウスでの研究は、CNSのPMNが、ミエリン及びアジュバンド抗原に対するT細胞応答の強力な抑制剤であること、そして、自己免疫好中球減少症が、男性MS患者で報告されたことを示す(Kozuka、T. et al.、Intern Med 42、102-4 (2003); and Zehntner、S.P. et al.、J Immunol 174、5124-31 (2005))。
リガンド及び受容体のケモカインメッセージングシステム(chemokine-messaging system)は、EAE及びMSの病因に極めて重要な役割を果たす。このシステムは、これらの自己免疫疾患において、様々な白血球サブタイプのトラフィッキング(trafficking)、CNS浸潤および異常な炎症機能を組織化する。多数のケモカインおよびそれらの受容体が多発性硬化症において特定されてきており、CCL-1-8、CXCL8-13、CCR1-3,5およびCXCR1-3、4を含む(例えば、Banisor、I.、Leist、T.P. & Kalman、B.、J Neuroinflammation 2、7 (2005); Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005); Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004); Putheti、P. et al.、 Eur J Neurol 10、529-35 (2003); および Raivich、G. & Banati、R.、 Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004)参照)。例えば、MS損傷において、CCR1、2、5および6並びにCXCR3はCD3+ T 細胞上に現れ、そして、CCR1、2、3および5並びにCXCR3は、泡沫状マクロファージおよび活性化されたミクログリアに現れる(例えば、Banisor、I.、Leist、T.P. & Kalman、B.、J Neuroinflammation 2、7 (2005); Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005);Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004); Putheti、P. et al.、Eur J Neurol 10、529-35 (2003); Raivich、G. & Banati、R.、Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004); Malamud、V. et al.、J Neuroimmunol 138、115-22 (2003); Pedotti、R.、De Voss、J.J.、Steinman、L. & Galli、S.J.、Trends Immunol 24、479-84 (2003); Serafini、B.、Rosicarelli、B.、Magliozzi、R.、Stigliano、E. & Aloisi、F.、Brain Pathol 14、164-74 (2004); Corcione、A. et al.、Proc Natl Acad Sci U S A 101、11064-9 (2004); Gauld、S.B.、Benschop、R.J.、Merrell、K.T. & Cambier、J.C.、Nat Immunol 6、1160-7 (2005); Bartosik-Psujek、H. & Stelmasiak、Z.、Eur J Neurol 12、49-54 (2005)参照)。
メチルプレドニゾロン、インターフェロン類およびコパクソン(Copaxone)は、再発寛解疾患(relapsing remitting disease)の進展を遅くする。ノバトロン(novantrone)、アザチオプリン、メトトレキサートおよびシクロホスホミドを含む免疫抑制薬剤が、第1および第2の進展MS(primary and secondary progressive MS)(表5)に使用された。病気の進行を明らかに変える薬剤はない(不運なキャンパス(登録商標)(Campath)を除いて)(例えば、Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004);および Leary、S.M. & Thompson、A.J.、CNS Drugs 19、369-76 (2005)参照)。白血球除去する検討およびよい病因論およびキャンパス(登録商標)白血球除去により惹起される寛解(毒性にもかかわらず)は、ケモカイン媒介白血球減少のよい前兆となる(例えば、Coles、A.J. et al.、Ann Neurol 46、296-304 (1999); Moreau、T. et al.、Lancet 344、298-301 (1994)参照)。ケモカインメッセージングシステム(chemokine messaging system)は、MSに対するしっかりとした治療標的を提供することができる。MSにおいて活性である多くの白血球サブタイプはCCR2および/またはCXCR3を発現するので、かかる受容体を標的とする複合体、例えば、LPM7またはLPM1dおよび本明細書に例示される他のもの、は、MSの治療のため、または治療に使用され得る。CCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3,5、6およびCXCR1-3、4の1またはそれ以上のいずれか、またはその組み合わせを標的化する他の複合体が使用され得る。
本明細書の複合体の、自己免疫疾患、例えば、関節炎、狼瘡(lupus)および上述したMSの処置のための活性を試験し、検証する方法は、当業者に既知である。修飾されたSA1部分を含むLPM複合体のようなリガンド−毒素複合体を試験するために使用することができる、関節炎および自己免疫疾患の動物モデルを提供し、そして使用する例示的な参考文献には、限定はされないが、本明細書に示される以下の参考文献を含む。
である、アジュバンド惹起関節炎(AIA)がリウマチ関節炎の多くの動物モデルの1つであることが記載されている。Barnesらは、この疾患モデルをけもかいん発現の点で特徴づけ、2つのケモカイン(RANTES;Tリンパ球および単球化学誘引物質、、並びにKC(ヒトGRO-αのマウスホモログ);好中球の化学誘引物質)の増加されたレベルが全血および関節で見出されたことを示している。MIP-1α(他のT-リンパ球および単球化学誘引物質)のレベルは、全血において病気の過程を通して不変であり、関節でわずかに上昇した。RANTES発現は、RANTESに対するポリクローナル抗体がAIAにより惹起される動物の症状を大きく改善し、インドメタシン(非ステロイド抗炎症剤)を用いた処置と同様に有効であったことが見出されたので、その疾患に重要な役割を果たす。MIP-1αまたはKCのいずれかに対するポリクローナル抗体は、効果がない。
炎症性肺疾患の処置のための本明細書における複合体に関する活性を提示および試験するためのモデルは、当業者には既知である。リガンド-毒素複合体、例えば改変したSA1部分を含有するLPM複合体を試験するために用い得る炎症性肺疾患の動物モデルを提供および使用する文献の例示として、本明細書で説明する下記文献を含むが、これに限定するものではない。
遺伝子治療後の炎症を含む炎症の処置のために、本明細書中の複合体を確認および同定するためのモデルはよく知られている。例えば、Muruve ら(1999)のアデノウイルス遺伝子治療は、in vivoにおいて複数のケモカインの急速な誘導と急性好中球依存性肝臓傷害をもたらし、Hum Gene Ther 10:965-76は複製欠陥アデノウイルスに、感染組織の急性傷害および炎症を誘導する分子機構を研究し、ヒトの遺伝子治療への使用を制限している。この応答を特徴づけるため、種々のアデノウイルスベクターを静脈投与した後、DBA/2マウスにおけるケモカインの発現を評価した。adCMVbeta gal、adCMV-GFPおよびFG140を静脈投与すると、用量に依存してマウスの肝臓内に一貫したパターンのC-X-CおよびC-Cケモカインの発現が誘導された。10(10)PFUのadCMVbeta galを感染させた1時間後、肝臓のMIP-2 mRNAのレベルはベースラインの60倍を上回る増加を示した。MCP-1およびIP-10 mRNAのレベルもまた種々のアデノウイルスベクターを感染させた後直ちに増加し、6時間でピークとなり、それぞれ25倍および100倍を超える発現が見られた。アデノウイルスベクターによるRANTESおよびMIP-1beta mRNAの初期誘導も起こったが、より低い程度であった。投与から16時間以内にソラレン不活性化アデノウイルス粒子が同一パターンのケモカイン遺伝子転写物を産生したので、ケモカインの誘導は独立にウイルス遺伝子の発現をもたらした。ケモカインの発現は予期した通り、感染した動物の肝臓内への好中球およびCD11b+細胞の流入と相関していた。高力価では、DBA/2マウスに対する全身投与の後、全てのアデノウイルスベクターが有意な肝臓の壊死およびアポトーシスを引き起こした。このアデノウイルス誘導性の肝傷害における好中球の役割を調査するため、動物を中和抗MIP-2抗体で前処理するかまたは好中球を涸渇させた。MIP-2の拮抗作用および好中球枯渇各々また両方により血清ALT/ASTのレベルが減少し、アデノウイルス誘導性の肝傷害は組織学的に軽減され、初期の傷害は概ねケモカインの生産および好中球の補充によるものであると確認された。この結果は複製欠陥アデノウイルスベクターに対する初期の免疫応答を明らかにし、アデノウイルスを媒介とする炎症、およびケモカインまたは好中球の機能を干渉することによる組織の傷害を防御する戦略を示唆する。
本明細書で提供される複合体は、血管新生および血管新生に関与するプロセスにて上方調節される細胞を標的とすることができる。例として、リガンド-毒素複合体、例えば改変SA1部分を含有するLPM複合体を確認または同定するために、血管新生の動物モデルを提供かつ使用するような文献には、次のものを包含するが、これに限定するものではない。
本明細書で提供された複合体(例えば、増殖因子-毒素複合体、ErbB受容体複合体およびその他)は、腫瘍の治療のために、例えば血管新生などの腫瘍形成に関与する腫瘍受容体および/または細胞を標的化することにより使用できる。血管新生および炎症に関与する細胞の動員は、腫瘍成長および発症に関連がある。下記文献は、これらの関係性および腫瘍、血管新生および炎症反応の阻害剤についての治療法を同定するための動物モデルが当業者にはよく知られていることを述べている。これらの文献は、腫瘍成長および腫瘍成長に関連のある細胞を阻害するための治療法に関する研究のための動物モデルの可能性を明示する。改変された SA1 部分を含有するLPM複合体をふくめた、本明細書で提供されたリガンド-毒素複合体を、このようなモデルに使用して、腫瘍増殖に対する作用を評価することができる。
毒素部分をもつ複合体は、ウイルスに感染した細胞を標的とすることができ、ウイルスには、例えばHIV、肝炎A、Bおよび/またはC、ならびに慢性的に細胞を感染させる他のウイルスを包含するがこれらに限定しない。作用様式は、細胞代謝に対する毒素の作用によるものであり得る。加えて、毒素、例えば志賀毒素、および改変志賀毒素および本明細書で提供された活性断片は、ウイルス核酸を含めたRNAおよびDNAなどのポリヌクレオチドを脱プリン化するポリヌクレオチドアデノシングリコシダーゼである。このように、ウイルスのような感染細胞で発現した受容体を標的とする複合体は、ウイルス感染を処置できる。
本明細書で提供された複合体を腎臓疾患の治療のために使用できる。他腎臓疾患の動物モデルを、リガンド-毒素複合体、例えば改変SA1を含有するLPM複合体を試験するために使用できる。かかる動物モデルには、十分に特徴付けされた様々なヒト慢性腎臓疾患(CKD)に類似するモデルが包含される。抗GBM疾患およびヒト疾患に対するその関連性をふくめたいくつか十分特徴づけられたCKDモデルを参照する例示的文献は、Durvasula and Shankland (Methods Mol Med., 86: 47-66, 2003)である。
リガンド-毒素複合体、例えば改変SA1を含有するLPM複合体を試験するために使用され得る動物過敏性モデルを提供および使用するいくつかの例示的な文献は、本明細書に説明された下記文献を包含するが、これに限定しない。該マウス遅発性過敏症(MDTH)は、接触過敏症の試験を提供するために開発された初めてのものである。T-細胞調節性免疫応答の抑制をスクリーニングするのに適しており、また一般的には慢性炎症性疾患のモデルとして使用される(Staite et al.,(1996) Blood 88: 2973-2979)。
本明細書では、二次的組織損傷および関連病状を含めた病態生理学的炎症反応と関連する病気、ならびに他の疾患の治療に使用する組成物が提供される。かかる組成物は、本明細書に記載したような、標的化剤(例えば、ケモカインまたはその活性断片およびRIP毒素)を含んでなる治療上有効量のリガンド-毒素複合体を含む。当業者には既知の他の複合体もまた意図され、該毒素部分が本明細書で提供された該毒素に置換されるように改変でき、かかる複合体を含有する組成物もまた意図される。
本明細書で提供されるものは、疾患または障害の治療のために、改変SA1などの改変RIP部分を含有するものをはじめとする1以上の本明細書で提供されるリガンド-毒素複合体のいずれかを用いる方法であり、このためにリガンド-毒素複合体を設計して標的化する。標的化受容体発現細胞への複合体の受容体-特異的標的化により、本明細書で提供される組成物および方法は、外傷または疾患に対する応答を指揮する細胞に治療薬を選択的、計画的および非正規に(surreptitipus)送達する。免疫調節、炎症性疾患およびその他の外傷の病態生理学プロセスに関与する細胞に複合体を標的化することにより、受容体により媒介される該複合体の内在化が可能となり、これにより毒素媒介細胞毒性および病理学的細胞成分の排除を促進させることができる。
免疫系は、インタクトな免疫学的監視および宿主防御系を共に付与する先天性および後天性免疫に分けられる。該系には、いくつかの白血球の異種集団が包含され、これには単球またはマクロファージ[単核食細胞(MNP)、好中球(多形核球好中球、PMN)、T細胞、B細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー(NK)細胞、樹状細胞(DC)および肥満細胞(MaC)とまとめて呼ばれる]を含むが、これらに限定するものではない。先天的免疫系は、病原菌などの侵入成分に対して即時反応性の細胞に依存しており、MNP、樹状細胞、好中球およびNK細胞を包含する。後天的免疫は、宿主侵入物を特異的に標的化するように、抗原提示細胞、基本的には樹状細胞による活性化を獲得するTおよびB細胞が関与する。胚形成、血管新生、リンパ球トラフィキング、創傷治癒、組織修復、細胞破片の除去および他の望ましくない物質、例えば細菌、ウイルスまたは癌細胞クローンをはじめとする多くの臓器特異的プロセスにおける恒常性バランスを維持するために、先天的および後天的免疫応答細胞は、組織固有細胞(TRC;例えば、上皮細胞)と協同して働く(例えば、Esche et al., J. Invest. Dermatol., 125: 615-28, 2005; Chaturvedi et al., Indian J. Med. Res., 124: 23-40, 2006; Bunde, J. Exp. Med. 201: 1031-6, 2005; Krishnaswamy et al., Methods Mol. Biol. 315: 13-34, 2005; Martin and Leibovich, Trends Cell Biol., 15: 599-607, 2005; Kim, Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord., 4: 343-61, 2004; Moser and Willimann, Ann. Rheum. Dis. 63(suppl 2): 84-9, 2004; Hoebe et al., Nat. Immunol., 5: 971-4, 2004; Schaerli et al., J. Exp. Med., 199: 1265-75, 2004; Olson and Miller, J. Immunol. 173: 3916-24, 2004; Middleton et al., Blood, 100: 3853-60, 2002; Beyer et al., Glia 31: 262-66, 2000)。
恒常性炎症は、ケモカイン-メッセージング系の中心的役割により白血球系統の活性化されたTRCおよび活性化された細胞により、組織化され、伝搬される多因子の生化学的過程である。損傷細胞および死滅細胞から放出された可溶性ファクター、免疫性複合体またはバクテリアリポ多糖(LPS)様抗原を担持する複合体ならびに補体やトル様受容体系を介して働くウイルスエンベロープタンパク質は、白血球活性化および動員の一般的なトリガーである。応答において、白血球は、他の白血球群のトラフィッキングおよび情報伝達のために、細胞付着分子(CAM)および炎症性サイトカインおよびケモカインの上方調節をはじめとする広範囲の表現型の変更を受ける。一旦、浸潤部位で白血球は細胞毒性メディエーターという武器を生成する。例えば、反応性酸素および窒素種、タンパク質分解酵素およびエイコサノイドは、マクロファージおよびPMNにより主に貪食される細菌および真菌の侵入を全滅させる。創傷部位では、例えば血管内皮増殖因子(VEGF)および線維芽細胞GF(FGF)をはじめとする白血球(特に、マクロファージ)誘導性増殖因子(GF)等が血管新生を促進させる。繊維化誘導因子、例えば形質転換増殖因子-βであるTGF-βは、瘢痕化および創傷治癒を促進させる(Krishnaswamy et al. (2005) Methods Mol. Biol. 315: 13-34; Puneet et al. (2005) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288: L3-15; Taylor et al. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 901-44; Byrne et al. (2005) J. Cell Mol. Med. 9: 777-94; Carroll (2004) Nat. Immunol. 5: 981-6; Iwasaki and Medzhitov (2004) Nat. Immunol. 5: 987-95; Martin and Leibovich (2005) Trends Cell Biol. 15: 599-607; Liu and Pope (2004) Rheum. Dis. Clin. North. Am., 30: 19-39; Stark et al. (2005) Immunity, 22: 285-94; Gordon (2003) Nat. Rev. Immunol., 3: 23-5; Borish and Steinke (2003) J.Allergy Clin. Immunol., 111: S460-75; Cross and Claesson-Welsh (2001) Trends Pharmacol. Sci., 22, 201-7; Trautmann, et al. (2000) J. Pathol., 190: 100-6)。一般的に、活性化された白血球により生成したかかる免疫メディエーターは、保護的であるが、特定の病理学的状況では有害となり、疾患を長期化させる。
望ましくない外因性物質(例えば、細菌)または内因性物質(例えば、癌細胞クローン)の実体を取り除くために;細胞断片を除去し、組織および創傷治癒に参画するように、組織損傷または外傷部位で蓄積する免疫性防御細胞により炎症反応が媒介される。不幸にも、これらのレパレートリー(炎症性)プロセスに関わる分子メカニズムは、二次組織損傷を開始させ、病原および多くの炎症性疾患の根強い病理の一因となる。二次組織損傷に関与する分子メカニズムおよび細胞および化学伝達物質は、ヒトの大部分の炎症性疾患においては、同一でなければ類似している。例えば、これらに限定しないが、ウイルス、細菌、寄生生物、炎症性サイトカイン、ケモカイン、低酸素、虚血、タンパク尿(尿中のタンパク)、糖化最終産物(AGE)、自己抗体、体系的ヌクレオチド(systemic nucleotides)、補体、免疫性複合体、免疫グロブリンおよび環境汚染物質(例えば、タバコの煙)をはじめとする非常に多くの刺激因子の活性化により誘導される病理状態では、これらに限定しないがCNSのグリア細胞、腎臓のメサンギウム細胞(MC)、および多くの臓器の内皮細胞をはじめとする多様な白血球およびTRCを含めた細胞の活性化をもたらし得る。該刺激因子は、疾患の開始因子であるが、TRCおよび炎症性白血球は疾患病理の兵士である。活性化したTRCおよび常在白血球は、炎症部位で白血球活性化、浸潤および増殖を促進する特にサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子スーパーファミリーのメンバー等のものを発現および分泌する。任意の所定組織のTRCにより放出されたこの特定のケモカインおよび他の炎症性分子は、任意の所定疾患または外傷において特定の白血球浸潤物を規定する(Lindemans et al. (2006) Clin. Exp. Immunol., 144:409-17; Puneet et al. (2005) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288: L3-15; Boyle, J.J. (2005) Curr. Vasc. Pharmacol. 3: 63-8; Liu and Pope (2004) Rheum. Dis. Clin. North. Am., 30: 19-39; Tetley (2002) Chest 121: 156S-159S; de Leeuw et al. (2005) Ann. N. Y. Acad. Sci. 1051: 362-71; Drinda, et al. (2005) Rheumatol. Int. 25: 411-3; Raivich and Banati (2004) Brain Res. Brain Res. Rev., 46: 261-81; Tokarska-Rodak et al. (2004) Ann. Agric. Environ. Med. 11: 227-31; Hou et al. (2004) J. Am. Soc. Nephrol., 15: 1889-96; Hayashida et al. (2001) Arthritis Res. 3: 118-26; Garcia-Ramallo et al., (2002) J. Immunol. 169: 6467-73; Kim et al. (2002) Blood 100: 11-6; Perez de Lema (2001) J. Am. Soc. Nephrol., 12:1369-82; Barnes et al., Eur. Respir. J., 22: 672-88, 2003; Luster et al., Nat. Immunol., 6: 1182-90, 2005; Charo and Ransohoff, N. Eng. J. Med., 354: 610-21, 2006 )。
注:B=B細胞;T=T細胞;NK=ナチュラルキラー細胞;Th2=タイプ 2 ヘルパーT 細胞; DC=樹状細胞; MNP=単核(貪)食細胞(単球、マクロファージおよび小膠細胞); GC=巨細胞(多核化融合マクロファージ);TAM=腫瘍関連マクロファージ; PMN=多形核好中球;MaC=肥満細胞。
病理学的白血球および癌細胞活性などをはじめとする細胞活性の妨害を目的としたいくつかの方法があり、また調査されている。これらの多くの薬剤により生じるよくある問題は、特異性の欠如である。例えば、コルチコステロイド、シクロホスファミドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤は、炎症性疾患を処置するために使用されてきた。しかし、これら薬剤の非特異的免疫抑制効果にはいくつかの欠点がある。最初に、宿主防御に障害がおこり、生命を脅かす感染が生じ、免疫学的監視を欠くため悪性腫瘍の高い罹患率を引き起こす。第二に、直接的な器官毒性および代謝プロセスに関する崩壊が一般的におこる (例えば、Ingelfinger and Schwartz、N. Engl. J. Med. 353: 836-9、2005; Siegal and Sands、Ailment Pharmacol. Ther.、22: 1-16、2005; Duncan and Wilkes、Proc. Am. Thorac. Soc.、2: 449-55、2005; Perez-Simon et al.、Drugs 66:1041-57、2006)。他の方法も、特異性を増加させて、薬物の副作用を低下させるために用いられている。例えば、サイトカインおよびケモカイン受容体アンタゴニスト;サイトカインおよびケモカイン抗リガンド抗体;抗細胞付着分子(CAM)、抗GAG物質および細胞内シグナル伝達経路を干渉する分子をはじめとする、生物学的応答調節因子(BRM)が開発されてきた(例えば、Johnson et al. (2004) Biochem. Soc. Trans.、32: 366-77; Johnson et al. (2004) J. Immunol.,173: 5776-85; Eis et al. (2004) Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 52:164-72; McDonald et al. (2001) IDrugs.、4: 427-42; Ribeiro and Horuk (2005) Pharmacol. Ther. 107: 44-58; Wong (2005) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 264-71; de Boer (2005) Drug Discov. Today 10: 93 105; Haringman and Tak (2004) Arthritis Res. Ther.、6:93-7; Barber et al. (2005) Nat Med 11: 933-5; Camps et al. (2005) Nat Med 11: 936-43; Schon et al. (2003) J Invest Dermatol.、121: 951-962)。
リガンド-毒素複合体は生成されており、疾患の病理に関与する1以上のある細胞集団を特異的に標的とすることが知られている。これらのなかに含まれるものは、ケモカイン毒素複合体であり、例えば米国出願番号09/360,242;09/453,851;および09/792,793、現米国特許第7,166,702、7,157,418および7,192,736に記載されている。かかる複合体は、1つ、および通常は1以上の細胞タイプを、1以上のある特異的な細胞表面受容体による認識により標的とし、内在化して、この毒素部分によりその細胞を殺傷する。かかる毒素複合体を用いた場合に、病理学的白血球をはじめとする白血球および他の細胞の特異的かつ慎重な消滅が、疾患の処置に有効となり得ることが示されている(例えば、McCarron et al. (2005)、Mol. Interv.、5: 368-80; Pastan et al. (2006)、Nat. Rev. Cancer 6: 559-65; Frankel et al. (2003)、Semin. Oncol.、30: 545-57; Pastan (2003)、Immunol. Ther. 52: 338-41; Kreitman、(2006) AAPS. J.、8: E532-51; Carter (2006)、Nat. Rev. Immunol.、6: 343-57; Cohen (2005) MedGenMed.、7: 72; Edwards et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350: 2572-81; Zeisberger et al. (2006) Br. J Cancer、95: 272-81; Cross et al.、J. Neuroimmunol. Aug 10、2006、(published online); Cailhier et al. (2005)、J. Immunol.、174: 2336-42; van Roon et al. (2005) Ann. Rheum. Dis. 64: 865-70; Sfikakis et al. (2005) Arthritis Rheum.、52: 501-13; Nikolic-Patersonおよび Atkins (2001) Nephrol. Dial. Transplant.、16: Suppl 5、3-7; Rajan et al. (1998)、J. Immunol. 160: 5955-62; Hu et al. (1997) Cell Immunol.、177: 26-34; Schuh et al. (2003) Eur. J. Immunol.、33: 3080-90; Taoka et al. (1997)、Neuroscience 79: 1177-82; Wolff et al.、(2004) J. Vasc. Surg.、39: 878-88; Duffield et al.、Am. J. Pathol.、167: 1207-19、2005)。
上記に議論し、表8および9に例示したように、様々な細胞型は、多数の疾患、障害および他の症状の病変を悪化させるおよび/または一因となる。所定の疾患または障害において、関与する白血球サブタイプまたは他の細胞型のプロファイル、および発現したこの結合細胞表面受容体のタイプや分布をあつめることができる。従って、特異的な細胞表面受容体または複数の受容体を標的とするリガンド-毒素複合体を設計でき、これにより特定疾患を処置するために、影響する細胞およびメカニズムに参画する方法を提供できる。本明細書に記載したとおり、かかるリガンド-毒素複合体は、一般的に改変RIP毒素またはその活性部分(例えば、改変SA1)を含んでおり、標的宿主細胞に入ることにより、疾患を処置する手段として細胞を殺傷する。宿主細胞への標的に対して選択されたリガンド部分の選択は、リガンド-毒素複合体の設計のための主要ファクターである。疾患を処置するための特異的リガンド-毒素複合体の選択には、下記工程を必要とする:1)処置されるべき疾患を選択すること;2)細胞が存在過剰であり、かかる疾患に関与することを決定すること;3)選択された細胞型に対して細胞表面受容体の発現プロファイルを決定すること;4)該疾患にも関与し得る他の細胞型上の細胞表面受容体の発現を相関させること;5)選択された細胞表面受容体についてリガンドを選択すること;および6)リガンド-毒素複合体を構築すること。
特定疾患を処置することを目的とするLPMの設計は、好適な標的化剤、例えばケモカインリガンド等を選択することが必要である。複合体に使用するためのケモカインは、処理されるべき疾患または障害に従って選択される。第一の要件として、特定疾患または症状に関連のある白血球または他の細胞が同定される。本明細書で議論したように、疾患に対する多様な白血球集団の貢献は知られるか(例えば、表8および表9を参照されたい)または決定され得る。第二の工程は、1以上の標的とする細胞集団で発現した、1以上のあるケモカイン受容体を標的とする特定のケモカインリガンドを選択することである。かかるケモカインリガンドは、受容体についてケモカインの特異性ならびに多様な細胞上のケモカイン受容体の発現プロファイルを基にして選択される。白血球サブタイプでのケモカイン受容体発現およびケモカインリガンド-受容体相互作用は当分野で知られているか(例えば、表5および6を参照されたい)、あるいは経験的に決定され得る。
病理に関係がある細胞、異常な血管新生を有するような細胞、根本的な炎症性成分を有するような細胞、腫瘍細胞および他の異常なT細胞、ウイルス様感染細胞を標的とするリガンド-毒素複合体は、知られているかまたは製造され得る。処理されるべき特定疾患が、選択されるリガンド(標的化剤)またはその断片を決定する。このようなあらゆる複合体には、本明細書に提供および記載した改変毒素をふくみ得る(全てのかかる記載は、この章における文献ならびにその他全ての文献により組み込まれる)。
癌は、細胞が血液学的起源でなくても炎症性疾患と見なされうる。癌細胞は、白血球サブグループに属する多くの表現型を提示し、定義付けにより炎症細胞と見なされ得る。それらは、プロテアーゼおよび炎症性メディエーター(ケモカインをふくむ)を分泌し、食作用をおこなう能力を有する。加えて、癌細胞は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子(GF)受容体をはじめとする多様な受容体を発現する;転移を促進するCAM;および分化転換をうける。後者の例として、結腸癌細胞は、運動性および侵襲性を増強させるCXCR1およびCXCL8の発現の増加と付随して上皮−間葉転換をうける(Bates et al. (2004) Exp. Cell Res.、299:315-24)。白血球浸潤物の定量的試験は、例えば腫瘍関連マクロファージ(TAM)およびリンパ球が乳癌では細胞量の50%までを構成しており、間違いなく腫瘍とみなし得ることが明らかとなった(Elkak et al. (2005) J. Carcinog.、4:7; Leek et al. (1996) Cancer Res. 56:4625-9; Murdoch et al. (2004) Blood 104:2224-34; Queen et al. (2005) Cancer Res.、65:8896-904)。MNPおよび補充単球が増殖因子を提供し、血管新生および転移を助けるTAMに分化するという事実は、この概念を証明するものである[例えば、Ueno et al. (2000) Clin. Cancer Res.、6:3282-9; Valkovic et al. (2002) Virchows Arch.、440:583-8;および表8の文献を参照されたい]。
腎臓の疾患には多くのカテゴリーがあり、いくつかの疾患がサブグループに分類される。これらの疾患は、急性の腎炎症候群;抗糸球体基底膜疾患;常染色体-優性多嚢胞腎臓疾患;糸球体腎炎(GN)、抗好中球細胞質抗体GN;糖尿病腎症;糖尿病糸球体硬化症;巣状分節状糸球体硬化症;グッドパスチャー症候群;HIV腎症;特発性三日月状GN;特発性速進行性GN;IgA腎症IgAN;IgMメサンギウム増殖性GN;ループス腎炎;膜性増殖性GN(MPGN、I、II、III);微小変化疾患;膜性腎症;腎炎症候群;ポリオーマ・ウイルス属腎症;レンサ球菌感染後のGN;迅速三日月状GN;腎臓移植片拒絶反応;腎臓の血管炎(例えば、ヴェーゲナー肉芽腫症)および尿細管間質性腎炎を含むが、これらに限定するものではない。少数%の腎臓疾患は回復し得るが、大部分の一般的経路は、治療法がない慢性のその他腎臓疾患(CKD)へと急激またはゆっくりと進行する。CKD患者は、最終的には腎臓不全および末期の腎臓疾患(ESRD)へと低下する。ESRDは、患者は透析治療または移植に頼ることが必要である。
脊髄傷害(SCI)の結果は、小膠細胞(CNSの常在マクロファージ)、白血球炎症性メディエーターの生産および強固な炎症性カスケードをはじめとする活性化された白血球サブタイプの作用により引き起こされる二次的組織損傷を迅速にもたらす細胞性イオンホメオスタシスの崩壊を伴う最初の物理的および虚血外傷の結末である。これらのカスケードは、数分以内に見られ、数週間継続し、その後内生修復および再生を伴う部分的な回復期間が続く。二次的損傷は、ニューロンおよび乏突起膠細胞の壊死およびアポトーシス細胞死;細胞興奮毒性;血液-脳関門/血管脊髄バリアー崩壊;反応性神経膠症(神経膠瘢痕をもたらす);新血管形成;脱髄;感覚および運動機能の損失およびSCI後の慢性痛として検出できる[Jones et al. (2005) Curr. Pharm. Des.、11:1223-6; Klussman and Martin-Villalba (2005) J. Mol. Med.、83:657-71; Lee et al. (2000) Neurochem. Int.、36:417-25; McTigue et al. (1998) J. Neurosci. Res.、53: 368-76; Carlson et al. (1998) Exp. Neurol.、151: 77-88; Bartholdi and Schwab (1997) Eur. J. Neurosci.、9:1422-38; Hains and Waxman (2006) J. Neurosci.、26:4308-17; Abbadie、Trends Immunol.、26: 529-34、2005]。SCIおよびこの病理メカニズムにおいて二次的組織損傷をもたらす白血球および星状膠派生炎症性メディエーターにより開始された一次的物理的傷害およびアポトーシス事象により生じた一次的壊死の合併は、例えば外傷性脳傷害;脳卒中;多発性硬化症 (MS)、アルツハイマー病およびHIV-関連認知症(参考として表8を参照されたい)をはじめとする広い範囲のCNS外傷および疾患に類似している。
過敏性反応は、4つの(時に、重複する)主要タイプ(I-IV)に分類されており、これら全ては免疫媒介組織傷害と関連し得る。タイプI(即時)過敏症は、数分から数時間のアレルゲンへの暴露にておこり、肥満細胞および好塩基球脱顆粒を媒介するIgE抗体のB細胞生産を含む。好酸球もまたふくまれる。この反応は、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、結膜炎および鼻炎をはじめとするいくつかの症状に関与する。タイプII(細胞毒性)過敏症は、細胞表面上の自己または外因性抗原のいずれかを認識して補体依存性細胞毒性を媒介する抗体によるか、または活性化マクロファージおよびナチュラルキラーT細胞による抗体依存性細胞媒介性の細胞毒性による。この反応に関連のある症状には、グッドパスチャー症候群(肺および腎臓)および甲状腺炎が挙げられる。抗体が組織内に蓄積され得る自己または外来抗原を結合する場合にタイプIII免疫コンプレックス-媒介過敏症が発症し、補体活性化および炎症(様々な白血球サブタイプの活性化、増殖および浸潤)をもたらす。これは、疾患、例えば糸球体腎炎、血管炎、全身性エリテマトーデスおよび関節炎に関与する古典的な病理である。タイプIV(遅延型)細胞-媒介性過敏性は、通常、発症に数日かかり、抗体依存性ではない。この反応は、自己または外因性抗原と複合体を形成する自己標的細胞を異常破壊する様々なT細胞サブセット、細胞毒性T細胞およびマクロファージによる。好中球、好酸球および肥満細胞は、このタイプの反応に関与する。この反応は、皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症および関節リウマチのようなかかる症状で見られる。全ての上記免疫反応には、影響される組織および器官に対して白血球のトラフィッキング、活性化および増殖がふくまれる(参考として表8を参照されたい)。
CNA小膠細胞の活性化および感染ならびにマクロファージの浸潤は、HIVにより誘発される疾患の病原論の1つの証明である。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、特定の受容体を介して、古典的には特定のケモカイン共同受容体と関連するCD4受容体を介して細胞に入る。CXCR4、CCR2b、CCR3、CCR5、CCR6、CCR8、CX3CR1およびその他のものは、共同受容体としての能力にて作用し得る。例えば、マクロファージ-刺激HIV-1系統は一般にCCR5共同受容体を使用するが、一方でT-細胞刺激系統は一般にCXCR4を使用する。さらに、二重刺激ウイルスはCXCR4およびCCR5共同受容体を侵入に使用できるが、HIVウイルス系統の他のサブセットは種々の他のケモカイン共同受容体を使用する(Rubbert et al.、HIV Medicine 2006、Chapter 4、Hoffman et al.、eds、Flying Publisher、Parisを参照されたい)。
慢性関節リウマチ(RA)は、慢性結合組織損傷および骨侵食を特徴とする炎症性自己免疫疾患である。この疾患の病原論には、滑膜空間への白血球の浸潤、その活性化、および最終的に作用された関節を変形させて破壊する炎症メディエーターの放出が包含される。実際の関節炎応答は、おそらくMNPが前炎症性サイトカインおよびケモカインを放出する時に開始されるようである。RA患者の関節組織中にTNFα、IL-1、IL-6、GM-CSFおよびケモカインIL-8が豊富に存在することが認められており、それらの最も可能性のある供給源は、MNPに加えて滑膜繊維芽細胞である。MNP、好中球、およびT細胞の組み合わせに滑膜繊維芽細胞および滑膜細胞が加わることにより、炎症のカスケードが始まる。
肺の損傷の臨床症状は広い範囲にわたる。本明細書においては、それらを肺の炎症性疾患(ILD)と総称する。ILDは、典型的には特定の傷害の結果であり、例えば全身性細菌感染(例えば、敗血症)、外傷(例えば、虚血再還流傷害)、および抗原の吸入(例えば、タバコ煙のような毒素)が挙げられる。ILDはまた、アレルギー性肺胞炎、ARDS(急性または成人性呼吸困難症候群)、種々の型の喘息、気管支炎、コラーゲン血管疾患、肺類サルコイドーシス、好酸球性肺疾患、肺炎および肺線維症が含まれる。要するに、これらの疾患および症状の病理は、特に肺胞に存在するマクロファージの活性化に関与している。マクロファージの放出に引き続いて、好中球、好酸球およびT細胞が活性化され、損傷部位に動員されて、周辺の内皮および上皮細胞がサイトカインおよびケモカインを生成させた。関与する特異的サイトカインおよびケモカインには次のものが挙げられる;GM-CSF、TNF-α、IL-1、1L-3、IL-5、IL-8、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、RANTESおよびエオタキシン。
二次的組織損傷と関連する疾患の病状は、本明細書で提供される方法および本明細書で提供される複合体ならびに他の症状の治療のための当業者に公知のケモカインでないサイトカインを用いて治療できる。これらの病状には、限定されるものではないが、CNS傷害、CNS炎症性疾患、神経変性障害、心疾患、炎症性眼疾患、炎症性腸疾患、炎症性関節疾患、炎症性腎臓または腎疾患、炎症性肺疾患、炎症性鼻疾患、炎症性甲状腺疾患、サイトカインにより調節される癌、および二次的組織損傷に関連する他の病状が挙げられる。
本明細書で提供されたあらゆるLPMなどのリガンド-毒素複合体を、記載された疾患の治療のために併用することができる。併用療法は、特定疾患を処置するために、リガンド-毒素複合体をその他の治療剤と共に投与することにより達成することができる。かかる薬剤は当業者には公知である。また、併用治療は、2以上のケモカイン、例えば毒素部分のいずれか末端で結合した2つの異なるケモカインから構成される分子を用いても行い得る。この場合において、これらの二重ケモカイン融合物は、各々αおよびβケモカインファミリーからの1つのリガンドを包含できる。
以下の実施例は、説明を目的として含むもので、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
LPMの構築のための改変志賀毒素 A1 (SA1) 変異体の選択
A. SA1 変異体の選択のためのLPMのクローニングおよび発現
MCP-1/志賀毒素 融合タンパク質 (LMP1aと称する)をコードする核酸分子を、融合タンパク質がメチオニン (Met) 残基から開始し、次いで、成熟 MCP-1の公表された 配列 (配列番号69に示され、配列番号68に示すヌクレオチド配列によりコードされる)、Ala-Met リンカー (配列番号34)、およびリボソーム不活性化 (RIP) ドメインを含む志賀-A1 毒素 サブユニット(本明細書において変異体 1 SA1と称する;配列番号22に対応し、配列番号23に示す核酸 配列によってコードされる)の残基23-268を含むように設計した。遺伝子配列の様々な発現 ベクターへの取出および置換を促進するために、制限エンドヌクレアーゼ部位を遺伝子配列の3’および5’末端に組み込んだ。LPM1aの 配列は、 5’末端にメチオニン 開始コドン (配列番号31)を含むNdeI 制限部位を有するように設計し、かつ、3’末端に終止コドン、次いでBamHI 制限部位 (配列番号33)を有するように設計した。LPM1aをコードする核酸分子を、DNA 合成 サービス組織 (Blue Heron Biotechnology、Seattle WA)によるコドン使用頻度および二次構造 最適化の原理に従って合成し、マルチクローニングサイトを除いたpUC プラスミド(pUC minus M、配列番号86)において供給した。 LPM1a 核酸分子およびコードされる融合タンパク質の配列をそれぞれ配列番号37および38に示す。
LPM1aおよびLPM1bは、上記Aに記載のように、SA1 RIP 毒素 部分を含む融合タンパク質を生産する。SA1 部分の発現は宿主細胞に対して毒性であり、LPM 融合タンパク質の生産を妨害する。より低い毒性を示すSA1における突然変異体を選択するために、LPM1a またはLPM1bを含む pET9c プラスミド コンストラクトを、様々な濃度の 4APP (4-アミノピラゾロ [3,4-d]-ピリミジン)の存在下または不在下での突然変異 選択のために用いた。pET9c-含有LPM コンストラクトの適当な宿主株へのAに記載のようにした形質転換の後に、形質転換細菌を様々な濃度の 4APPの存在下または不在下で50 μg/mlのLB カナマイシン (km)上で選択した。以下に示す結果は、4APPの非存在下での50 μg/mlのLB カナマイシン (km)上でのLPM1a 形質転換細菌細胞の選択 および0.5 mM 4APPの存在下での50 μg/mlのLB カナマイシン (km)上でのLPM1b 形質転換細菌細胞の選択に基づく。
LPM1aを含むpET9c プラスミド コンストラクトでの4APPの非存在下でのHMS174(DE3) pLyS 宿主細胞の形質転換により、82の形質転換体が生じた。すべての82の選択したコロニーをLPM1a 発現およびプラスミド完全性についてスクリーニングした。 プラスミド DNA を標準的ミニプレップ手順を用いて細菌形質転換体から単離した。全長 タンパク質の発現をSDS-PAGEにより確認した。pET9c プラスミドからのLPM1aインサートをNdeI/ BamHIでの消化の後に精製し、インサートをT7 プライマーおよびT7t プライマーを用いて配列決定し、配列を確認した。T7: 5’ TAA,TAC,GAC,TCA,CTA,TAG,GG 3’ (配列番号35); T7t: 5’GCT,AGT,TAT,TGC,TCA,GCG 3’ (配列番号36)。
0.5 mM 4APPの存在下でのLPM1bを含むpET9c プラスミド コンストラクトによるHMS174(DE3) 宿主細胞の形質転換により、10の形質転換体が生じた。すべての10の形質転換体を選択し、プラスミド DNAを調製し、LPM1a 突然変異体について上記したようにして分析した。
変異体 LPM1の活性の比較
SA1における突然変異のLPM1 活性に対する重要性を、ウサギ網状赤血球可溶化液 (RIP) アッセイにおいてLPM1c (変異体 3 SA1 配列を含む) およびLPM1d (変異体 4 SA1 配列を含む)の活性を測定することにより評価した。LPM1cおよびLPM1d タンパク質を発現させ、部分的に精製した (実施例 4参照)。これらタンパク質の活性を、ルシフェラーゼ RNA (Promega、Madison、WI; 含まれるすべての試薬)の翻訳をアッセイするよう設計された市販の ウサギ網状赤血球可溶化液 系 (即ち、RIP アッセイ)を用いてタンパク質 合成の阻害を測定することにより評価した。簡単に説明すると、タンパク質 サンプルを1 μg/mlに希釈し、1 mg/ml BSAを含むPBS、pH 7.4に10倍工程(fold step)にて段階希釈した。希釈したタンパク質 (10 μl)を5 μl 反応混合物 (反応混合物: 2 μlのルシフェラーゼ RNAの1 mg/ml溶液; 1 μlの1:1 比の 0.1 mM アミノ酸混合物マイナスメチオニンおよびアミノ酸混合物マイナスリジン; 2 μlリボヌクレアーゼ 阻害剤)および35 μl ウサギ網状赤血球可溶化液に添加した。サンプルを30℃で1.5 時間インキュベートした後、反応をサンプルを氷上でインキュベートすることによって終止した。サンプルを上記の反応混合物を用いて1:25 に希釈した。反応混合物(100 μl)を96-ウェルホワイトポリスチレンプレート (Corning Corporation、NY)に移し、100 μlの発光色素 Bright-Glo (Promega)を各反応に添加した。プレートを予熱した (20-25℃) FLUOstar ルミノメーター (BMG Lab Technologies、Durham、NC)を用いて分析した。並行して、反応混合物のみまたは試薬ブランクをネガティブコントロールとして用い、RIP タンパク質 サポリン (Sigma、St. Louis、MO) をポジティブコントロールとして用いた。サポリン ポジティブコントロールは一貫して8-12 pMの範囲の相対活性 (RIC50) 値を有していた。志賀 ホロ毒素の報告されるRIC50 値は9 pMである (Skinner and Jackson (1997) J. Bacteriol. 179: 1368-174)。精製した変異体 4 SA1 サブユニット (配列番号28)のRIC50 値は50 pMであった。LPM1c (配列番号42) およびLPM1d (配列番号44)のRIC50 値はそれぞれ5 nMおよび80-100 pMであった。試験した突然変異体 変異体の観察されたRIP 活性に基づいて、LPM1dからのSA1 配列を含む新しいLPMである突然変異体 変異体 2 (即ち、変異体 4) SA1を、以下の実施例 3 に記載のように構築した。
SA1 変異体 4を含むLPM遺伝子の構築
LPM 2-13 (表12)を成熟 SA1 志賀毒素 サブユニットの突然変異体 変異体 2 (即ち、変異体 4) 切型型(配列番号28に示す)に対してアラニン-メチオニン ジペプチドによって結合したそれぞれのケモカイン 配列の融合タンパク質をコードするよう構築した。LPM2-13 をコードする配列を以下に説明する2種類の方法によってpET9c プラスミド (配列番号84)に挿入した。各方法は、SA1 志賀毒素 サブユニット 配列の5’ 配列内の内部EcoRI 制限部位の存在に依存し(例えば、配列番号23に示す変異体 1 配列、または配列番号29に示す変異体 4 配列のヌクレオチド4-9に対応)、その結果5’リジン 残基を欠くSA1 部分が生じ、それはEcoRI 制限部位に隣接してコードされるリジンを含むケモカイン リンカー 部分の設計によって再構成された。プラスミド 操作に用いたすべてのプロトコールは、 Maniatis et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York (1982)からのものであった。
LPM 4-10、LPM12およびLPM13 の成分(表13参照)をpUC19 プラスミド (配列番号85)中でアセンブリーさせ、 次いでpET9c ベクターにサブクローニングした。簡単に説明すると、SA1 変異体 4 成分を、LPM1d を含むpET9c ベクター(実施例 1参照)をEcoRIおよびBamHIにて消化することにより作成し、SA1 変異体 4遺伝子を含む750 bp EcoRI/BamHI DNA 断片を得た。消化した断片をゲルで精製し、対応する EcoRI/BamHI 部位にて切断しておいたpUC19 プラスミドに挿入して、pUC19BB プラスミドを得た。LPM 4-10、LPM12 およびLPM13のケモカイン 配列 成分をそれぞれのケモカイン含有pUC19 プラスミドの上記のようなNdeIおよびEcoRIでの消化により作成し、各ケモカインについての~ 250 bp NdeI/EcoRI DNA 断片を得た。完全なLPM 配列を作るために (表12参照)、消化したケモカイン 断片をゲルで精製し、対応するNdeI およびEcoRI 制限部位で消化しておいたSA1 変異体 4 配列を含むpUC19BB プラスミドに挿入した。完全なLPM 遺伝子配列を含むpUC19BBを 次いでNdeIおよびBamHIで消化して~ 1 kb 断片を得て、それをゲルで精製し、NdeIおよびBamHI で消化しておいたpET9c プラスミド (配列番号84)にサブクローニングした。プラスミドはそれぞれのLPMの発現について確認され、インサートの同一性を確認するために配列決定された。上記表12は、クローニングされたLPM 変異体である LPM4-10、LPM12およびLPM13についてのそれぞれの核酸およびコードされるアミノ酸についての配列 識別子(identifier)を示す。
LPM 2、3、および11を作成するために (表12参照)、それぞれのケモカイン遺伝子を本明細書において記載する方法を用いて、直接、pET9c 発現 プラスミド (配列番号84)に挿入した。まず、後のクローニング工程におけるベクターの消化を防止するために、EcoRI 部位をpET9c プラスミドから除いてベクター pET9DEを得た。簡単に説明すると、pET9c プラスミドを EcoRIで消化し、 末端をT4 DNA ポリメラーゼにより平滑にした。プラスミド DNAをライゲーションし、pET9DE ベクターを得、DH5α 大腸菌 細胞(Invitrogen、Carlsbad、CA)に形質転換した。プラスミド DNAを標準的ミニプレップ手順を用いて細菌形質転換体から単離し、 pET9DE ベクターにおけるEcoRI 部位の欠失を、制限 消化によって確認した。
LPM 変異体の発現および精製
A. LPM 変異体の発現
HMS174(DE3)のpET9c/LPM プラスミドによる形質転換の後、様々な LPMの発現に対するRIP 阻害剤 4APP の効果を、形質転換体を一晩37℃で 50 μg/ml カナマイシンおよび2 mM 4APP を含むMTB 培地 (24 g/L イーストエクストラクト、12 g/L トリプトン および0.4% グリセロールを含む1xM9 培地)中で培養することにより試験した。それぞれの LMPのIPTGによる誘導の前に、細胞を同じ培地に継代し(1:10 希釈)、さらに3 時間37℃で培養した。細胞を1mM IPTGの存在下または不在下および様々な濃度の 4APP (例えば、0、0.1、2、5、10、15および 20 mM 4APP) の存在下での誘導によりさらに同じ温度で3.5 時間誘導した。LPM 融合タンパク質を含むインクルージョンボディーを細胞から回収した (以下の方法参照)。IPTGの存在下での誘導により、所望の 発現 プロファイルを有する株は、~36 kD 発現 バンドを、4APP用量応答的に示した。タンパク質 同一性は抗-SA1 抗体を用いるウェスタンブロッティングにより確証した。SA1 サブユニットに対する抗体をSA1の合成ペプチド(配列番号30) (Covance Research Laboratories、Denver PA)に対してウサギにおいて作成し、血清を回収した。
表14: 4-APPの存在下での LPM 発現 レベル
バッチ発酵 方法をLPM 生産のために開発した。選択した SA1 変異体を有するpET9c/LPM プラスミドを担持する宿主細胞(HMS174(DE3))を液体濃縮培地 (発酵槽中5-100 Lまたは2.8 L 振盪フラスコ中400 ml)にて37℃で2 mM 4APPの存在下で培養した。産物発現を1 mM IPTGで3-6 時間 10 mM 4 APPの存在下で誘導し、細胞を遠心分離により回収した。細胞 ペレットをホモジナイズし (超音波処理により、またはホモジナイザーを3-4回通すことにより)、次いで細片を除き、遠心分離を用いてインクルージョンボディー (Ib)を回収した。Ibを 2-3 回数体積のdH2Oにより洗浄した。Ib を6M 塩酸グアニジンを含むバッファー中で可溶化し、 遠心分離し、上清を 8 M尿素に対して透析した。発酵槽または振盪フラスコからの典型的な出発LPM収量はそれぞれ~1g/L (OD600 nm ~ 50)および300 mg/L (OD600 nm~ 7)であると見積もられる。600 nmで記録された吸光度 (OD)は、Ultraspec Pro 分光光度計を用いた大腸菌 密度の尺度であった。核酸を0.1% (v/v) ポリエチレンイミンを有するIB 溶液から除去した。遠心分離の後、さらなる DNAを残余の DNAに結合し、等電点の高いタンパク質、例えば、 LPMの通過を可能とする陰イオン交換樹脂フィルターまたはカラム(Q-sepharose-FF)に通すことによって除いた。タンパク質産物を陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー (S-sepharose-FFまたはHP)で捕獲し、尿素 の存在下でのNaCl グラジエントにより溶出した。このカラムからのフロースルー画分は少量の遊離のSA1 毒素 部分を含む。タンパク質 画分をNaCl グラジエントにわたって回収し、SDS-PAGEにより分析した。LPMを含む画分をプールした。産物の再フォールディングを25 mM Tris-HCL、1 M 尿素、0.5 M L-アルギニン、1 mM 還元型グルタチオンおよび0.1 mM 酸化型グルタチオン、pH 8.0に対する16-24時間の透析によって行った。再フォールディングした物質を次いで製剤 バッファー (50 mM クエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、および20% スクロース)中で透析し、-80℃で保存した。この物質の純度はSDS-PAGEによって評価して80%を超え、製剤の前に精練 工程として陽イオン交換または疎水性相互作用 クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。別のプロセスでは同じ出発工程を用いたが最初の陰イオン交換からの産物は、25 mM リン酸ナトリウム、1 M尿素、200 mM L-アルギニン、20% (w/v) スクロース、1 mM 還元型グルタチオンおよび0.1 mM 酸化型グルタチオン、 pH 8.0への16-24時間の希釈によって直ちに再フォールディングされた。再フォールディングされた物質を次いで陽イオン交換、そして疎水性相互作用 クロマトグラフィーにかけた後、上記の製剤 バッファー中で透析した。
細胞に基づく 細胞毒性 アッセイ
LPM1dおよびLPM12の細胞 毒性を、細胞に基づく細胞毒性アッセイにおいて測定した。 このアッセイにおいて、細胞を、毒素 (即ち、SA1 部分を含むLPM タンパク質) の存在下または不在下で一定期間培養した。細胞溶解の際の培養中のATP量を、細胞 生存度の測定可能な指標として用いた。
THP-1 単球細胞を10% FBS (Invitrogen、Carlsbad、CA)を追加したRPMI 培地を含む完全培地中で製造業者の指示に従って (ATCC、Manassas、VA)培養し、週に2回継代して、細胞 密度を5 x 105 細胞/mL未満に維持した。細胞を遠心分離により収集し、新鮮な温かい培地で洗浄し、適当な 体積の培地に再懸濁して細胞に基づく 細胞毒性 アッセイのために密度 を3- 4 x 104 細胞/mlにした。細胞を100 μL アリコットの細胞 懸濁液を、96-ウェル 細胞 培養 プレートの内側の60 ウェルのそれぞれに移すことによって播種した(外側のウェルは完全培地のみで満たした)。20 μlの媒体 (バッファーのみ)およびLPM1d またはLPM12 タンパク質 サンプル (濃度範囲25 μg/ml〜100 μg/ml)を三連でウェルに添加し、穏やかに細胞と混合した。細胞を次いで、37℃ (5% C02)で24 時間インキュベートした。
CellTiter-Glo(商標) Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega、Madison WI)を(製造業者の指示に従って)、細胞に基づく 細胞毒性の尺度として細胞 生存度をアッセイするために用いた。細胞をATP 反応混合物 (製造業者によってCell Titer-Glo(登録商標) Reagentとして供給された)とともに溶解すると、ATP がルシフェリンの酸素負荷(oxygenation) を駆動する結果、ウェルにおけるATP 濃度に比例する発光 シグナルが生じる。これは、培養中の生細胞の数と直接比例する。上記AからのTHP-1 細胞 プレートからの100μLのアリコットを白色平底 培養 プレート(Corning Corporation、NY)に移して発光測定を可能とし、30 分間平衡化させた後、100 μLのATP 反応混合物を添加した。ATP 反応混合物の添加の後、プレートの内容物をボルテックスを用いて30 秒間穏やかに振盪して細胞 溶解を誘導し、室温で10 分間インキュベートして発光 シグナルを安定化させた。発光をFLUOstar ルミノメーター (BMG Lab Technologies、Durham、NC)を用いて測定した。媒体のみ(バッファーのみ)を含む一致対照(matched control)ウェルを各LMP タンパク質について調製した。三連の値を平均し、バックグラウンドの発光を試験したすべての条件について差し引いた。LMP 融合タンパク質の存在下でのATP含量を一致対照の存在下でのATP含量(100%として設定)のパーセンテージとして表した。LPM1dおよびLPM12を細胞に基づく 細胞毒性 アッセイにおいて試験し、結果をそれぞれ表15および表16に示す。結果は、ATP含量は様々な濃度の LPM1dの存在下で用量依存的に低下することを示し、LPM1dがTHP-1 細胞に対して毒性であることが示された。LPM12もTHP-1 細胞に対して毒性であったが、33 μg/ml以上の濃度のみにおいてであり、LPM12の用量依存的効果はこれら細胞に対して観察されなかった。LPM12 (エオタキシン ケモカインを含む融合タンパク質)の観察された効果は、エオタキシン 受容体、CCR3の、THP-1 細胞上での発現の欠如、および、エオタキシンが高濃度にて結合するTHP-1 細胞上のMCP-1 受容体、CCR2の存在 (Ogilvie et al.、(2001) Blood 97: 1920-1924)に起因する可能性がある。
ラットにおける抗-胸腺細胞 血清 (ATS)- 誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎におけるLPM1dの活性
以下の実施例は、ラットにおける抗-胸腺細胞 血清 (ATS)-誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎の進行に対するLPM 治療の効果を示す。
A. ATS 注射およびLPM1d 治療
ラットにおけるATS-誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎の進行に対するLPM1d 治療の効果を評価した。24匹のラットの体重を測定し、基底の 尿 収集のために24 時間メタボリックケージにおいて飼育した。尿 体積を記録し、尿を処理し、標準的手順を用いてクレアチニンおよびタンパク質を定量した。ラットを麻酔し、0.5-1.0 mlの血液を辺縁部尾静脈から採取した。血液は凝固し、血清を血液 尿素窒素 (BUN)、クレアチニン、およびコレステロールの標準的手順を用いる測定のために保持した。ラットに0日目に20 mg/ 100 g 体重の抗-胸腺細胞 (Thy1) IgG 画分 (Probotex、San Antonio、TX)を注射し、回復するとそれらのケージに戻した。ラットを毎日モニターし、体重および健康状態を記録した。ラットを 8匹ずつ3群に分けた: 2群には一日おき(2、4、6 および8日目)にLPM1dをそれぞれ50または100 μg/kgにて注射し、第3の群には、抗体 投与後2日目から開始して疾患 対照群として媒体のみ(0.05 mM EDTA を含有する50 mM クエン酸ナトリウム バッファー pH 6.2)を注射した。4日目にラットをメタボリックケージに戻して中間点の尿を収集した。翌日、血液を中間点 血清 収集のために尾静脈から得た。8日目にラットをメタボリックケージに最後の24時間の尿収集のために入れた。動物は実験にわたって健康であった。(尿 クレアチニン クリアランスにより測定した) LPM 処理群の糸球体ろ過量は一般に対照と変化無く、5および9日目に高用量与えられた動物においてわずかな上昇が観察されたのみであった。BUNおよびコレステロール レベルはすべて、 すべての動物について正常範囲内であった。尿 タンパク質を研究における中間点において判定した(24時間尿 収集、4-5日目)。低用量および高用量で処理された ラットは、それぞれ対照と比較して尿 タンパク質において34% および 39% の低下を有することが判明し、LPM1d が腎臓機能に対する保護効果を有することが示された。
9日目に、すべてのラットを屠殺し、血液を回収し、腎臓を組織学のために処理した。この実験からの腎臓皮質をスライスして2-3 mm 冠状切片とし、液体窒素で瞬間冷凍し、ホルマリンに入れるか、またはメタカーン(methacarn)に入れ、一晩4℃で固定した。
凍結切片をフィブロネクチンおよびアルファ 平滑筋アクチン (α-SMA)に対する抗体(それぞれ、クローン IST-9、Serotec、Harlan Bioproducts for Science、Indianapolis、IN およびクローン 1A4、Sigma、St.Louis MO)を用いて処理した。フィブロネクチンは、細胞外マトリックス (ECM) 沈着および合成のマーカーであり、アルファ 平滑筋アクチン (α-SMA)は、ECM 沈着の前兆である表現型変化を経ている細胞過多 メサンギウム細胞のマーカーである。フィブロネクチンおよびα-SMAの発現は、線維性プロセスを示す。α-SMA またはフィブロネクチンのいずれかについての染色について、結果は0-4のスケールで示し、それらはそれぞれ、染色無し、低度、中程度、高度および非常に高度の染色を示す。表17は、群における全部で4匹のラットの平均(AV) スコアとしてのα-SMAによる凍結切片の染色の結果を示す。結果は、より高い濃度の LPM1dの存在下ではα-SMAの発現が低下することを示す。したがって、LPM1d 処理された腎臓におけるメサンギウム細胞の活性化は低下する。
ホルマリン処理した サンプルを、腎病変のヘマトキシリン・エオシン染色 (H&E) 評価のために処理した。 凍結切片のH&E 染色は、腎病変ならびに腎糸球体の 完全性および構造の可視化および包括的評価を可能とし、それらは、正常な外観から重篤な損傷まで0-4のスケールにてスコア付けされる。結果 (表19)は、LPM1dの存在下でα-Thy1 処理したラット 腎臓における腎病変の存在の低下を示す。100 μg/Kg LPM1dで処理されたラットの群においては顕著な病巣は観察されなかった(即ち、1.44のスコアに匹敵)。したがって、LPM1dで処理した腎臓においては腎病変および構造的損傷が低減する。
メタカーン(Methacarn)処理したサンプルを、ED-1 抗体 (Chemicon Corporation、Temecula、CA)を用いるマクロファージの数の免疫組織化学 評価に用いた。このモデルにおいて、マクロファージの数は 約5日目に最大になる。ED-1 陽性 マクロファージの評価のために、マクロファージの総数(即ち、ED-1 陽性細胞)を9日目に25の糸球体から計数した。結果は表20に、群における4 匹のラットのそれぞれにおける計数したマクロファージの生の数値データとして示す。結果は、LPM1d処理した腎臓におけるマクロファージの存在の低下を示す。
マウス 遅発性過敏症 モデルにおけるLPM1cおよびLPM1dの活性
以下の実施例は、マウス耳におけるオキサゾロンに対する炎症反応の程度に対するLPM1cおよびLPM1d 処理の効果を示す。
脊髄 傷害 モデルにおけるLPM1dの活性
A.脊髄 傷害およびLPM 投与
脊髄 傷害 (SCI) モデル 実験を設計し、ここでマクロファージおよび好中球 集団の減少を定量するために、傷害の最初の1-3日後においてのみLPM1d を投与した。簡単に説明すると、脊髄 傷害を以下のようにして誘導した: 成体 6-8 週齡 CD-1 マウス (Charles River Laboratories、Montreal、Quebec、Canada)をケタミン-キシラジン混合物(85 mg/kg および15 mg/kg、腹腔内 (I.P.))でそれぞれ麻酔し、中程度の(60 kdyne) T9/10 挫傷 脊髄 傷害 (SCI)に供した (Infinite Horizons Impactor、Precision Systems Instrumentation、Kentucky、USA)。傷害はげっ歯類においてよく特徴づけられており、ヒト SCIの病態生理を模倣する中程度の病巣を再現可能な様式で作る(例えば、Wells et al. (2003) Brain、126: 1628-37参照)。傷害の後に、マウスを温かい毛布の上で回復させ、血液損失および脱水を補償するために0.5 ml 生理食塩水を与えた。膀胱を自発的な排尿が回復するまで毎日2-3 回手作業により強制的に動かした。すべての実験はCanadian Council on Animal Careのガイドラインに忠実にしたがってUniversity of Calgary Animal Care Ethics Committeeにしたがって行った。
1.新鮮な組織
新鮮な組織をマウスを麻酔した後SCI 傷害の24 および48 時間後に処理群のそれぞれから収集し、~1 mlの全血を100 μlのヘパリン溶液への心穿刺により収集した。血液 収集の直後に、動物を氷冷 PBSで灌流し、脊髄 (病巣部位を中心として2 cm)を迅速に単離し、氷冷 PBSに入れた。血液および脊髄 サンプルを次いでフローサイトメトリー用に調製した。
固定組織をSCI 傷害の後5日目に処理群のそれぞれから収集した。動物を 致死量の ケタミン-キシラジンで麻酔し、PBSで灌流し、次いで、PBS 中の4% パラホルムアルデヒド溶液により灌流固定した。脊髄 (T6〜T13)を取り出し、4% パラホルムアルデヒド中で一晩後固定し、次いで 30% スクロース中で凍結保護(cryoprotect)した。脊髄を次いでブロックに入れ、凍結し、切片にするまで -70℃で保存した。ブロックを横断面にて20 μmの厚さの切片にし、組織 切片を5つの隣接する切片の群に組織化したSuperfrost スライド (Fisher Scientific、Houston、TX)上に収集した。
統計分析はSigmaStat ソフトウェア (SPSS、Inc.)を用いて行った。処理群の間の差は分散分析 (ANOVA) および保証された場合Holm-Sidak 事後分析を用いて検定した。不等分散の場合、ランクに対するKruskal-Wallis 一元配置 ANOVA を用いた。P 値が0.05 未満である差を有意であるとみなした。
1.フローサイトメトリー
新鮮な組織からの脊髄 サンプルを小さいガラス製の加圧型細胞破砕装置により機械的に破壊し、単細胞 懸濁液を溶液 をワイヤーメッシュスクリーン (Sigma-Aldrich、Canada)を通過させることによって得た。サンプルを次いで4℃で1100 RPM (200 x g)、10 分間の低破壊の遠心分離に供した。ペレットをFBS 染色 バッファー (BD Biosciences)に再懸濁し、遠心分離 (3000 RPM、7 分間、4℃でゆっくりしたブレーキ)に供した。ペレットを次いでFBS 染色 バッファーに再懸濁した。
蛍光 免疫組織化学を損傷後5日目の脊髄からの固定された組織 切片を含むスライドに対して行った。スライドを解凍し、PBS中で3回すすぎ、10% 正常ヤギ 血清中で30 分間 室温でブロッキングした。小膠細胞/マクロファージを検出するために、スライドをウサギ 抗-Iba1 抗体 (1:1000; Wako Chemicals USA、Inc.)とともに2時間室温でインキュベートした。PBS中で3回洗浄した後、スライドを1時間 室温でAlexa488 ヤギ 抗-ウサギ 二次抗体 (1:1000、Molecular Probes Inc.、USA)とともにインキュベートして Iba-1を可視化した。スライドを次いでPBS中で3回洗浄し、 Hoechst 33258 (1 μg/ml、Sigma-Aldrich、Canada)に浸した。
異種移植モデルにおけるLPMの活性
乳癌におけるLPMの効果を確立された腫瘍 異種移植モデルを用いて評価した。雌性 胸腺欠損ヌード マウス (nu/nu) に 2500万の細胞 (0.2 mlのPBS/マトリゲル中)のエストロゲン依存性 乳癌 細胞株 MCF-7 (American Type Culture Collection (ATCC)、Manassas、VA)を注射し、2つの LPM 分子の腫瘍増殖に対する効果を評価した。
この研究において、SDF-1β-SA1Var1 LPM (配列番号216)を治療計画に用いた。この LPMは野生型 SA1 部分に結合した成熟 SDF-1β ケモカインを含む。100 μg/kg SDF-1β-SA1Var1 LPM または媒体 対照の腹腔内 投与をMCF-7 注射後7日目に開始し、21日目まで毎日継続した。腫瘍は31日目まで増殖を続けさせた。
このマウス 異種移植モデルにおけるMCF-7 乳癌 細胞の進行の遅延におけるSDF-1β-SA1Var1の効果を腫瘍重量および腫瘍 体積により測定した腫瘍増殖の評価により判定した。SDF-1β-SA1Var1の非存在下では、7日目から (約 100 mm3から開始) 31日目まで腫瘍増殖は安定して増加し、28日目までに最大腫瘍 体積約 980 mm3に達した。100 μg/kgの用量でのLPMによるマウスの処理もまた腫瘍増殖の安定した増加をもたらした; しかし、腫瘍増殖の規模はLPMの非存在下よりも有意に小さかった。例えば、LPMの存在下では最大腫瘍増殖は28日目に達したが、最大 腫瘍 体積は約 500 mm3に達するのみであった。結果はマウスのLPMによる処理により、MCF-7 腫瘍増殖速度における統計的に有意な低下がもたらされたことを示す。試験動物からの最終腫瘍重量は平均35%低下し、最終 腫瘍 体積は対照と比べて41.5%低下した (有意性はp < 0.05 両側 t-検定を使用)。
顕微鏡検査を用いて、このモデルにおける炎症性浸潤に対するSDF-1β-SA1Var1 LPMの効果を判定した。最後の用量のSDF-1β-SA1Var1 LPMをマウスに与えた後10日目に (即ち31日目) 腫瘍を切り出し、 切片とし、顕微鏡検査により腫瘍の周辺の白血球 浸潤を評価した。細胞をヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色により可視化した。結果は、媒体のみで処理された動物と比較してLPMで処理された 動物の組織において36%細胞が少ないことを示し、これは統計的に有意であった。
組織学的検査により腫瘍内壊死および空胞形成の程度の可視化を可能とした。抗-CD-31 (ヤギ ポリクローナル PECAM-1 (クローン M-20)、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)を用いて、単球、好中球、血小板およびT 細胞亜集団の細胞 表面に発現している細胞 接着 分子であり糖タンパク質であるPECAM-1を可視化した。PECAM-1はまた、成体および胚内皮細胞の表面にも発現している。最後の用量のSDF-1β-SA1Var1 LPM をマウス に与えた10日後に(即ち31日目)、腫瘍を切り出し、切片とし、抗-CD-31 抗体で染色した。 簡単に説明すると、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍標本切片を脱パラフィン処理し、水和させた。抗原賦活用緩衝液 (Target Retrieval Solution)(pH 9.0、DakoCytomation、Carpenteria、CA)中での熱誘導によるエピトープ修復の前処理を一次抗体 インキュベーションの前に用いた。内在性 ペルオキシダーゼ 活性は3% H2O2とのインキュベーションにより阻害され、非特異的 染色 をDAKO Protein Block Serum-Free (DakoCytomation、Carpenteria、CA)でブロックした。サンプルを1:800に希釈した一次(抗-CD-31) 抗体とともに30分間室温でインキュベートした。組織 切片を次いで1:400に希釈したビオチン化 ウサギ 抗-ヤギ 免疫グロブリン (Vector Laboratories、Burlington、CA)とともに30 分間 室温でインキュベートし、次いでDako Envision+ Rabbit System Labeled Polymer、HRP (DakoCytomation、Carpenteria、CA)を適用した。染色をLiquid DAB+ (DakoCytomation、Carpenteria、CA) で発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。いくらかの白血球 (組織学的 分析下での環状染色により可視化される)および内皮細胞 (細長い形状の細胞の染色により可視化される)はCD-31について陽性であると染色された。これらの結果は、増殖中の腫瘍における血管新生の存在を示した。逆に、SDF-1β-SA1Var1 LPM処理した腫瘍においてCD-31 染色が存在しなかったことは、マクロファージの非存在 (胸腺欠損 マウスは T 細胞を有さない)および腫瘍内内皮 細胞血管の非存在を示す。
組織学的検査を用いて、最後の用量のSDF-1β-SA1Var1 LPMをマウスに与えた10日後に (即ち31日目) ウサギ ポリクローナル 抗-Ki-67 抗体 (Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)による細胞の染色によりこのモデルにおいて細胞 増殖に対するSDF-1β-SA1Var1 LPMの効果を評価した。この抗原は細胞周期のすべての活動性の段階 (G1、S、G2 および M 期)において発現しているが、静止細胞 (G0-期)においては存在しない。Ki-67 抗原は細胞が非増殖状態に入ると迅速に分解し、DNA 修復工程の際にはKi-67の発現はみられない。簡単に説明すると、ホルマリン-固定パラフィン包埋 腫瘍 標本 切片を脱パラフィン処理し、水和させた。抗原賦活用緩衝液 (pH 9.0、DakoCytomation、Carpenteria、CA)中での熱に誘導されるエピトープ修復の前処理を一次抗体 インキュベーションの前に用いた。内在性 ペルオキシダーゼ 活性を3% H2O2とのインキュベーションにより阻害し、非特異的 染色をDAKO Protein Block Serum-Free (DakoCytomation、Carpenteria、CA)によりブロックした。サンプルを1:200に希釈した一次 (抗-Ki-67) 抗体とともに30分間室温でインキュベートした。組織 切片を次いで1:400に希釈したビオチン化 ヤギ 抗-ウサギ 免疫グロブリン (Vector Laboratories、Burlington、CA) とともに30 分間 室温でインキュベートし、次いで Dako Envision+ Rabbit System Labeled Polymer、HRP (DakoCytomation、Carpenteria、CA)を適用した。染色をLiquid DAB+ (DakoCytomation、Carpenteria、CA)により発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。Ki-67 染色によって示されるように多数の細胞が非処理腫瘍において増殖していた。対照的に、SDF-1β-SA1Var1 LPM 処理腫瘍では抗-Ki-67による染色はほとんど示されず、腫瘍 進行の低下を示した。さらに、視野における明らかな空胞によって示されるように多くの癌 細胞が壊死しているようであった。
この研究において、MCP-1-SA1Var4 (LPM1d) を治療計画に用いた。腹腔内投与を7日目に開始し、コホートには以下のいずれかを与えた:媒体; (1) 1回用量の 2 mg/Kg LPM1d、 7日目; (2) 2 mg/Kg LPM1d 、7、11、15および21日目または(3)100 μg/Kg LPM1d、7日目から 21日目まで毎日。腫瘍を32日目まで増殖させ続けた。 処理動物の体重における対照を含むコホート間のパーセント変化は0.5%を上回らなかった。
多発性硬化症の実験的自己免疫 脳脊髄炎 (EAE) 動物 モデルにおけるLPMdの活性
8-10-週齡のC57BL/6 雌性 マウス (Jackson Laboratory、Bar Harbor、Maine)を4 群 (Gr1-4)に分けた。EAEを誘導するために、群1および2 (n=9)に、0日目に尾の背側に、100 μlの完全フロイントアジュバント (Difco Laboratories、Detroit、MI)中に乳化した100 μgのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質 (MOG)33-55 ペプチド (Bernard et al. (1997) J Mol Med 75:77-88)を皮下注射した。これらのマウスには0日目および2日目に 腹腔内 (i.p.)用量の、200 μl のリン酸緩衝食塩水中の300 ngの再構成凍結乾燥 百日咳 毒素(Liu et al. (1998) Nat Med 4:78-83)も与えた。群1および2には、それぞれ、6日の毎日のバッファー (50 mM クエン酸ナトリウム バッファー、pH 6.2、0.05mM EDTAおよび10% v/v グリセロール)中のLPM1d (500 μg/kg)またはバッファーのみの注射(3-8日目)を与え、群3および4における対照 マウス (n=6)には、それぞれ、まったく注射を与えないか、または、6日の毎日の (3-8日目) 500 μg/kg LPM1dのみの注射を与えた。
OPL-CCL2-LPMを抗-胸腺細胞 血清 (ATS)-誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルにおいて試験した。雄性ラットにATSを0日目に注射し、媒体、50または100μg/kgの組換えタンパク質 Q2Dで、2日目から8日目まで静脈内処理した。尿 および血液 収集を、ATS 注射の前および5および9日目に行った。動物を9日目に屠殺した。体重または臨床毒性の兆候に対する処理に関連する効果は観察されなかった。尿 タンパク質 レベルは処理された動物において低下していた。腎臓 切片の組織病理的分析により、腎糸球体病変、M/M 数、フィブロネクチンおよびα-平滑筋アクチンについて、それぞれ40、36、38、および28%の最大の低減が明らかとなった。最後の2つのタンパク質はそれぞれ細胞外マトリックス 合成およびメサンギウム細胞 活性化についてのマーカーである。これらの結果は、腎炎のこのモデルにおける顕著な腎臓保護効果を示し、ケモカイン-リガンド 毒素が疾患の治療において利用できることを示す。
Claims (30)
- 改変志賀毒素ポリペプチドまたはその触媒的に活性の断片であって、アミノ酸改変を含み、非改変志賀毒素ポリペプチドと比較して、宿主細胞に対して減少した毒性を示すが、非改変志賀毒素ポリペプチドと比較して、少なくとも1%の毒素活性を保持する、改変志賀毒素ポリペプチドまたはその触媒的に活性の断片、
ここで該アミノ酸改変が、配列番号22に示すアミノ酸配列を含む志賀毒素A1サブユニット(SA1)におけるアミノ酸位置38および/または219に対応するアミノ酸位置の一方または両方の置換を含み、それにより改変志賀毒素ポリペプチドが非改変志賀毒素ポリペプチドより低い毒性を示し、
触媒的に活性の断片の触媒活性が、N-グリコシダーゼ活性もしくはポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性またはその両方であり;および
非改変志賀毒素ポリペプチドが、大腸菌の種の志賀毒素ポリペプチドであるかまたは赤痢菌の種の志賀毒素ポリペプチドである。 - 配列番号22に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、アミノ酸位置38および/または219に対応する部位にて改変を含む、請求項1の改変志賀毒素ポリペプチド。
- 改変がL38Rおよび/またはV219Aである請求項1または2の改変志賀毒素ポリペプチド。
- 志賀毒素がA サブユニットを含む請求項1-3のいずれかの改変志賀毒素ポリペプチド。
- 志賀毒素が志賀毒素A1鎖(SA1)またはその触媒的に活性の断片を含む請求項1-4のいずれかの改変志賀毒素ポリペプチド。
- SA1が切型のものである請求項5の改変志賀毒素ポリペプチド。
- SA1が配列番号26または28に示すアミノ酸配列を含む、請求項5または6の改変志賀毒素ポリペプチド。
- 以下を含む複合体:
請求項1-7のいずれかの改変志賀毒素ポリペプチドまたはその触媒的に活性の断片である標的化物質;および
細胞表面受容体に結合し、毒素をインターナライズさせ、それにより該複合体が細胞表面受容体に結合する結果、標的化物質の受容体を担持する細胞へのインターナリゼーションを起こす標的化剤、ここで、該標的化剤は、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β(SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ阻害タンパク質1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス(RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質α(GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質10(IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン(MDC)、顆粒球走化性タンパク質2(GCP-2)、上皮由来好中球活性化タンパク質78(ENA-78)、血小板塩基性タンパク質(PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン(MIG)、血小板因子4(PF-4)、ヘモフィルトレートCCケモカイン1(HCC-1)、胸腺および活性化制御ケモカイン(TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現ケモカイン(LEC)、エクソダス-2(SLC)、胸腺発現ケモカイン(TECK)、皮膚T-細胞誘引ケモカイン(CTACK)、粘膜関連上皮ケモカイン(MEC)、シングルCモチーフ1-β(SCM-1β)、インターフェロン誘導T-細胞アルファ化学誘引物質(I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン(BRAK)、フラクタルカイン、およびB細胞-誘引ケモカイン1(BCA-1)、ならびにその断片から選択され、免疫エフェクター細胞上のケモカイン受容体に特異的に結合し、結合した標的化物質の受容体を担持する免疫エフェクター細胞へのインターナリゼーションを起こし、免疫エフェクター細胞の遊走、活性化または増殖を阻害する、ケモカインまたはケモカインの断片である。 - 以下の成分:(標的化剤)n、(L)q、および(標的化物質)m、を含む請求項8の複合体、ここで:
Lは、標的化剤の標的化物質への結合のためのリンカー;
mおよびnは、独立に選択され、1から6の間の整数である;および、
qは、1から4の間の整数であり、
複合体が標的化受容体に結合し、インターナライズされ、標的化物質が送達される;
複合体は標的化剤と相互作用し標的化剤をインターナライズする受容体に結合し、それにより標的化物質が受容体を担持する細胞にインターナライズされる;および、
複合体が複数の標的化物質を含む場合、標的化物質は同一または異なっており、複合体が複数の標的化剤を含む場合、標的化剤は同一または異なっている、複合体。 - mおよびnの各々が1である請求項9の複合体。
- qが1、nが2およびmが1である請求項9の複合体。
- 免疫エフェクター細胞が、活性化された白血球である、請求項8-11のいずれかの複合体。
- 免疫エフェクター細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、B細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、および好中球から選択される、請求項8-12のいずれかの複合体。
- 免疫エフェクター細胞が、肺胞マクロファージ、小膠細胞、およびクッパー細胞から選択される組織マクロファージである;または
免疫エフェクター細胞が、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞、およびランゲルハンス細胞から選択される樹状細胞である、
請求項13の複合体。 - T細胞がCD4+およびCD8+T細胞から選択される請求項13の複合体。
- CD4+T細胞がTh1またはTh2細胞である請求項15の複合体。
- CD4+T細胞がTh17細胞である請求項15の複合体。
- I-309、MCP-1,MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8、MIG、IP-10、I-TAC、SDF-1α、SDF-1β、BCA-1、エオタキシン、MCP-4、MCP-5、C10、LECおよびMIP-1b2から選択されるケモカインまたはケモカイン受容体に結合する該ケモカインの断片を、請求項1-7のいずれかの改変志賀毒素ポリペプチドまたはそのSA1サブユニットまたはその触媒的に活性の断片と直接またはリンカーを介して結合して含む、複合体。
- 細胞が活性化されている請求項8-11および13-17のいずれかの複合体。
- 活性化が1以上の細胞表面受容体の発現を誘導する請求項12または19の複合体。
- 細胞表面受容体が、CXCR1、CXCR2、CXCR3A、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、XCR1およびCX3CR-1から選択されるケモカイン受容体であり、ここで:
ケモカインが受容体への結合を実行することにより、複合体が受容体を担持する細胞にインターナライズされる、請求項8-17および19-20のいずれかの複合体。 - 標的化剤および標的化物質が、共有結合またはイオン結合を介して直接結合している請求項8-17および19-21のいずれかの複合体。
- 標的化剤および標的化物質がリンカーを介して連結している請求項8-17および19-21のいずれかの複合体。
- リンカーがペプチド、アミノ酸、ポリペプチドまたは化学リンカーである請求項23の複合体。
- リンカーが、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル-6-(α-メチル-α-(ピリジルジチオール)トルアミド)ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート、スクシンイミジル-6-(3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド)ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル-6-(3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド)ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、およびS-(2-チオピリジル)-L-システインから選択される請求項24の複合体。
- リンカーがAla-Metリンカーである請求項24の複合体。
- 配列番号44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64または67のいずれかに示すアミノ酸配列を含む請求項8-26のいずれかの複合体。
- 請求項8-27のいずれかの複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- 請求項28の核酸分子を含むプラスミド。
- 請求項29のプラスミドを含む宿主細胞。
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