JP2011050388A - 改変毒素を選択および生産する方法、改変毒素を含む複合体、およびそれらの使用 - Google Patents

改変毒素を選択および生産する方法、改変毒素を含む複合体、およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】改変毒素およびその複合体を選択および同定する方法を提供する。
【解決手段】毒素が低下した改変リボゾーム蛋白質またはその活性の断片をコードする核酸分子を導入した宿主細胞を培養し、発現される宿主細胞に対して毒性の低下を示す毒素を選択する方法および阻害剤分子の存在による改変毒素またはその複合体の生産を上昇させる方法。前記複合体は、免疫または炎症応答に関与する細胞の増殖、遊走、および生理活性に関連する様々な疾患または障害の治療において利用できる。
【選択図】なし

Description

優先権および関連出願
優先権の利益を、 2007年8月22日出願のHongesheng Su、Philip J. Coggins、John R. McDonaldおよびLaura M. McIntosh の「METHODS OF SELECTING AND PRODUCING MODIFIED TOXINS, CONJUGATES CONTAINING MODIFIED TOXINS, AND USES THEREOF」と第する米国仮出願第60/965,977号および、2006年12月29日出願のHongesheng Su、Philip J. Coggins、John R. McDonald およびLaura M. McIntoshの「METHODS OF SELECTING AND PRODUCING MODIFIED TOXINS, CONJUGATES CONTAINING MODIFIED TOXINS, AND USES THEREOF」と題する米国仮出願第60/878,166号に対して主張する。
本出願はまた、現在米国特許第7,157,418号となっている、1999年7月22日出願の「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMA-TORY CONDITIONS AND DISORDERS」と題する米国特許出願第09/360,242号にも関連し、これは、35 U.S.C. §120のもとで、1999年7月21日出願のOsprey Pharmaceuticals Limited、McDONALD、John R. および COGGINS、Philip J による、「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS」と題するPCT国際出願PCT/CA99/00659号の一部継続出願 としての優先権の利益を主張する。さらに35 U.S.C. §119(e)のもとで1998年7月22日出願のJohn R. McDonald および Philip J. Cogginsの「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE」と題する米国仮出願第60/155,186号に対する優先権の利益を主張する。
本出願はまた、現在米国特許第7,166,702号となっている1999年12月2日出願のJohn R. McDonald および Philip J. Cogginsの「CYTOTOXIC CONJUGATES COMPRISING A CHEMOKINE RECEPTOR TARGETING AGENT」と題する米国特許出願第09/453,851号にも関連し、これは、現在は米国特許第7,157,418号となっている米国特許出願第09/360,242号の分割出願である。本出願はまた、現在は米国特許第7,192,736号となっている、2001年2月22日出願の「NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING CYTOTOXIC CONJUGATES THAT CONTAIN A CHEMOKINE RECEPTOR TARGETING AGENT」と題する米国特許出願第09/792,793号にも関連し、これは、米国特許出願第09/360,242号および米国特許出願第09/453,851号の分割出願である。
本出願はまた、2003年2月24日出願で現在は放棄されている「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS」と題する米国特許出願第10/375,209号にも関連し、これは米国特許出願第09/792,793号、米国特許出願第09/453,851号および米国特許出願第09/360,242号の継続出願である。
本出願はまた、2006年2月24日出願の「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS」と題する米国特許出願第11/361,977号にも関連し、これは、米国特許出願第10/375,209号、米国特許出願第09/792,793号、米国特許出願第09/453,851号および米国特許出願第09/360,242号の継続出願である。
上記出願および特許のそれぞれの主題をその内容全体を引用により本明細書に含める。
発明の分野
毒性が低下した改変毒素を選択および同定する方法が提供される。毒性が低減した改変毒素、およびかかる改変毒素を含む複合体も提供される。かかる改変毒素、またはその複合体を生産する方法が提供される。かかる複合体は、炎症反応に関与する細胞の増殖、遊走、および生理活性に関連する疾患の治療方法において有用である。
背景
炎症反応は、望ましくない 外因性物質(例えば、微生物)および内因性物質(例えば、癌細胞クローン)を体から排除するために; 細胞細片を排除し、組織および創傷治癒に参加するために組織 傷害または外傷の部位に蓄積する免疫防御細胞および関連する組織固有細胞(tissue residantial cells)によって媒介される。残念なことに、例えば、白血球の不適切な活性化に起因するこれらのレパラトリー(reparatory)(炎症性)プロセスに関与する分子機構は、二次組織損傷を惹起することがあり得、それは、いくつかの炎症性および免疫調節性疾患の病原および持続性症状に寄与する。
二次組織 損傷に関与する分子機構および細胞および化学メディエーターは同一ではないが、ヒトのほとんどの炎症性疾患において類似している。したがって、様々な治療薬が、これらの分子機構 および/またはその他の共通のメディエーターを標的化することによってかかる炎症性および免疫調節性 疾患を治療するために開発されている。例えば、かかる炎症性および免疫調節性 疾患の病態生理学プロセスに関与する細胞レベルで起こる単一の特定の生化学的事象(例えば、興奮性 アミノ酸または活性酸素種の細胞毒性作用)を標的とする治療薬が開発されている。かかる治療薬にはステロイドが含まれ、例えば、限定されないが、メチルプレドニゾロンおよびその合成21 アミノステロイド (lazaroid) 誘導体 (例えば、trisilazad)が挙げられ、これらは酸素フリーラジカルスカベンジャーとして作用する。ステロイドの有益な副作用は衰弱させる副作用によって隠されるため、長期間ステロイド治療は実行可能な臨床選択肢ではない。
病態生理学的プロセスにおいて誘導されるおよび/または関与する特定の炎症性 メディエーター(即ち、サイトカイン、増殖因子、またはそれらの受容体)を標的化することによって炎症性疾患を治療する治療薬も開発されてきた。かかる治療薬には、レミケード（登録商標） (インフリキシマブ、腫瘍壊死因子 (TNF)-αに対する中和抗体)、エンブレル（登録商標） (エタネルセプト、可溶性 TNFα 受容体)、および、様々な 増殖因子、例えば、塩基性線維芽細胞および血管内皮増殖因子に対する中和抗体 (McDonald et al. (2001) IDrugs、4:427-442)が含まれる。特異的ではあるが、かかる治療薬はすべて疾患の病理に関与するひとつの成分に焦点をあてている。したがって、かかる治療薬は、典型的には、炎症反応の代償性および病理プロセスに参加するために残っているその他の炎症性 サイトカインおよび増殖因子の存在により、部分的または一時的利益のみを提供する。
疾患の細胞性メディエーターを標的化することによる、炎症性疾患および免疫調節性 成分を有するその他の症状を治療するより包括的なアプローチを提供する治療薬が開発された。かかる細胞標的化治療薬には、毒素部分を含み、様々な機構によって１以上の 細胞に入ることが出来、その結果細胞が排除されるものが含まれる。かかる分子の例は、米国特許出願第09/360,242、09/453,851、および09/792,793号であって現在では、米国特許第7,166,702、7,157,418 および7,192,736号になっているものに示されるものである。かかる複合体は、疾患病理と関係する細胞タイプを特異的かつ予想通りに標的化するよう設計され得、したがって、疾患の治療に有用である。融合タンパク質複合体が宿主細胞において生産される。しかし複合体における毒素部分は、これら分子の効率的な生産を制限する。かかる分子は知られており入手可能であるが、広範な播種のために大量に効率的に生産する必要性およびその使用の必要性が存在する。したがって、本明細書における目的のなかで、毒素および毒素を含む複合体のより効率的な生産方法を提供することが１つの目的である。
概要
本明細書において、炎症性 または免疫調節性 疾患または症状の病理に関係する細胞性メディエーターを標的化する治療用分子の生産方法および改変毒素 複合体の使用を提供する。具体的には、改変毒素 ポリペプチド、改変毒素 ポリペプチドを含む複合体および改変毒素 ポリペプチドを作成および調製する方法が提供される。改変毒素 ポリペプチド(および/またはそれらを含む複合体)は、それらが発現する宿主細胞において低減された毒性を示し、そのように改変されていない毒素 ポリペプチドと比較してより高レベルの発現を可能とする。改変は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列において起こる。
宿主細胞または細胞における発現のために同定される改変リボゾーム不活性化タンパク質 (RIP)、またはその活性の部分または断片の選択または同定方法が提供される。具体的には、該方法は、本明細書における選択方法において用いる出発RIP タンパク質と比較して宿主細胞 に対する毒性が低減しているRIPを選択する。本明細書において提供する方法の実施において、RIP、またはその活性の部分をコードする核酸が、宿主細胞に導入され、細胞が培養され、生育した細胞が単離され、生育した細胞のなかから、RIPを発現する細胞が単離される。本明細書において提供する方法は、細胞が、選択的モジュレーター、例えば、アデニン 類似体、例えば、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)を含まない培地において培養されるように実行されうる。本明細書において提供する方法はさらに、RIPを発現する細胞を拡張させる工程を含みうる。一例において、単離された細胞において発現されたRIPが同定され、単離または精製される。RIPは、その配列またはその分子量によって同定されうる。場合によっては、RIPは配列決定によって同定されうる。該方法によって生産されたRIPも提供される。
該方法のいくつかの例において、RIPをコードする核酸を有する細胞が、選択的モジュレーターの存在下で培養される。選択的モジュレーターは、RIP 阻害剤、例えば、アデニン 類似体であり得る。アデニン 類似体は、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)でありうる。選択的モジュレーター、例えば、 RIP 阻害剤、例えば、アデニン 類似体、例えば、 4-APPの使用において、濃度を宿主細胞に対して毒性ではないように選択する。いくつかの側面において、濃度を、宿主細胞に対するRIPの毒性を阻害するように選択する。一例において、毒性の阻害は、RIP 阻害剤、アデニン 類似体、即ち4-APPの非存在下と比較して発現されるRIPの量を上昇させるのに十分である。例えば、RIPの毒性は、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%阻害される。RIP 阻害剤が4-APPである場合、本明細書における方法において使用される阻害剤の濃度 は（約）0.1 mMから（約）5.0 mMである。その他の阻害剤について、好適な濃度は、経験的にまたは 4-APPを参照して決定することが出来る。いくつかの例において、4-APPの濃度は（ 約）0.1 から 2、3、または4 mM、または0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9、または1 mMである。別の例において、4-APPの濃度は約0.5 mMまたは0.5 mMである。
したがって、毒性が低減した毒素の選択方法および毒性が低減した毒素の生産方法が提供される。該選択 方法は、毒性が低減した毒素を同定する。かかる毒素は、通常、発現のためにそれをコードする核酸が細菌に導入された場合発現されないが、一般的には低レベルで発現される。選択方法は発現した毒素を探索し、毒性が低減した毒素を発現する細胞を拡張して発現を可能とする。生産方法も提供され、それは阻害剤、例えば、 4-APP、典型的には低用量形態の4-APPの存在下で細胞を培養することにより突然変異体を選択するもう一つの方法であり、高レベルの毒性をさらに阻害し、野生型ほど多くはないが相当の毒性を保持する毒素および突然変異体の生産が導かれる。
したがって、選択方法は、毒性が低減した毒素の同定を可能とする。かかる改変毒素は、野生型よりも高レベルにて生産されうる。
生産方法において、野生型または改変された毒素は、毒素を低毒性にするために4-APP(一般に選択 方法において用いた濃度より高濃度)の存在下で発現されうる。選択 方法において同定された改変毒素が既に野生型より低毒性であれば、4-APPの存在はさらに毒性を制限し、それにより4-APP の非存在下における野生型または突然変異体と比較してより多量に生産され得、またはより低濃度の4-APPが使用されうる。すべての例において、方法における使用のためにそれらを細胞毒性にするために十分な毒性が保持される。毒素はその毒性が大幅に低減されており、例えば、1% 毒性にまで低減されているが、 本明細書の方法のために十分に毒性である程度に毒性である。
一つの側面において、本明細書において提供する方法では、宿主細胞が真核細胞である。 別の側面において、本明細書における方法に用いられる宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌である。
本明細書において提供する方法において、導入された核酸分子によってコードされるRIPは I型RIP、またはその活性の断片であり得る。例えば、本明細書における方法に用いられるRIPとしては、これらに限定されないが、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、ミラビリス属 抗ウイルスタンパク質 (MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP I、オオムギ RIP II、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP 3、トウモロコシ RIP 9、トウモロコシ RIP X、アスパリン-1、またはアスパリン 2が挙げられる。
本明細書において提供する方法の別の例において、導入された核酸分子によってコードされるRIP はII型RIP、その触媒サブユニットまたは その活性の断片である。 例えば本明細書における方法において用いられるRIPとしては、これらに限定されないが、志賀毒素 (Stx)、志賀様毒素 II (Stx2)、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、またはポルレクチンが挙げられる。一つの側面において、導入された核酸は、RIP サブユニット A、またはその活性の断片をコードする。別の側面において、導入された核酸は、RIP 志賀毒素のサブユニット A1 (SA1)をコードする。SA1は切型されたものでありうる。例えば、 SA1は、N- またはC-末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12の連続するアミノ酸の欠失により切型とされうる。別の例において、SA1は、Cysの別のアミノ酸、例えば、 Serとの置換によって改変されうる。本明細書において提供する方法において宿主細胞に導入される核酸の例は、配列番号22または配列番号24に示すアミノ酸配列を有するSA1をコードする核酸分子である。 例えば、SA1は、その配列を配列番号23または配列番号25に示す塩基を含む核酸分子によってコードされうる。
本明細書において提供する方法において、導入された核酸分子によってコードされるRIPはリガンドと複合体となってリガンド-毒素 複合体を形成しうる。複合体におけるRIPおよびリガンドは、共有結合またはイオン結合を介して直接結合されうる。例えば、RIPおよびリガンドは、リンカー、例えば、ペプチド、ポリペプチドまたは アミノ酸を介して連結されうる。リンカーの例はAla-Met リンカーである。典型的には、リガンド-毒素 複合体は融合タンパク質である。
リガンド-毒素 複合体におけるリガンドは、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリー リガンド、およびパターン認識 受容体 (PRR) リガンドであり得る。一例において、リガンドは、増殖因子、例えば、 VEGFである。別の例において、リガンドは、ケモカイン 受容体 標的化剤、例えば、ケモカインまたは、ケモカインの断片、またはケモカイン 受容体に特異的に結合する抗体、または抗体の断片であり、ここで、断片はケモカイン 受容体に結合する。リガンドが抗体である場合、それはモノクローナル抗体、またはその抗原特異的 断片であり得る。モノクローナル抗体の例は、 抗原、例えば限定されないが、 (DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR6、CXCR7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、および XCR1に対して特異的なものである。
さらなる例において、リガンドはケモカインである。本明細書における方法に用いられるリガンド-毒素 複合体におけるケモカインの例としては、これらに限定されないが、 単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連 上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種 変異体が挙げられる。一例において、ケモカインは、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、および BCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種 変異体のいずれかである。別の例において、ケモカインはMCP-1である。リガンド 毒素 複合体をコードする核酸の例は、配列番号38または 配列番号40に示すアミノ酸 残基の配列を有するリガンド-毒素 複合体をコードする核酸分子である。とりわけ、核酸分子は、配列番号37 または配列番号39に示す配列を有するものである。
本明細書における方法の一つの側面において、同定されたRIPは、導入された核酸分子によってコードされるRIPと比較して突然変異を含む。本明細書において提供する方法において、同定されたRIPはその毒性について評価される。毒性は、タンパク質 合成 アッセイ、脱プリン アッセイ、および細胞増殖/生存度 アッセイを含むがこれらに限定されないアッセイにより評価されうる。典型的には、同定されたRIPは導入された核酸分子によってコードされるRIPと比較して毒性を保持する。同定されたRIPは、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% またはそれを超える毒性を保持する。
本明細書における方法において、同定されたRIPを生産するさらなる工程も提供される。かかる方法は、同定されたRIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程、RIP 阻害剤の存在下で細胞をインキュベートする工程、ここで、RIP 阻害剤の量はRIP ポリペプチドの毒性を低減するよう選択される;およびRIP またはその活性の断片が生産される条件下で細胞を培養する工程を含む。RIPは、発現または精製またはその両方をされたRIP の量がRIP 阻害剤の非存在下よりも多くなるように一般に精製されうる。
本明細書において提供する方法はさらに、同定されたRIPを含む複合体を調製する工程も含みうる。本明細書において提供する方法において、方法はまた、同定されたRIP、または同定されたRIPを含む複合体を合成する工程も含む。
本明細書においてはまた、リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)、またはその活性の断片の生産を上昇させる 方法が提供される。かかる方法は、RIP、またはRIPを含む複合体の効率的な生産を可能とし、例えば、治療薬として使用するためのかかる複合体の生存可能なソースを提供する。本明細書における生産 方法において、RIP、またはその活性の断片をコードする核酸が、宿主細胞に導入される。細胞はRIP 阻害剤の存在下でインキュベートされ、RIP 阻害剤の量はRIPの毒性を低減するように選択される。本明細書における生産の上昇の方法において、細胞は、RIP またはその活性の断片が生産される条件下で培養される。一つの側面において、生産方法は、RIPが精製される工程を含む。典型的には、発現または精製またはその両方がなされるRIPの量は、RIP 阻害剤の非存在下よりも多い。
本明細書において提供する生産方法において、導入された核酸分子によってコードされるRIPは、I型RIP、またはその活性の断片でありうる。例えば、本明細書における方法において用いられるRIP としては、これらに限定されないが、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、ミラビリス属 抗ウイルスタンパク質 (MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP I、オオムギ RIP II、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP 3、トウモロコシ RIP 9、トウモロコシ RIP X、アスパリン-1、またはアスパリン 2が挙げられる。
本明細書において提供する生産方法の別の例において、導入された核酸分子によってコードされるRIPは、II型RIP、その触媒サブユニットまたはその活性の断片である。例えば、本明細書における方法において使用されるRIPとしては、これらに限定されないが、志賀毒素 (Stx)、志賀様毒素 II (Stx2)、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、またはポルレクチンが挙げられる。一つの側面において、導入された核酸はRIP サブユニット A、またはその活性の断片をコードする。 別の側面において、導入された核酸は、RIP 志賀毒素のサブユニット A1 (SA1)をコードする。SA1は切型型でありうる。例えば、SA1は、 N-または C-末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 または12の連続するアミノ酸の欠失により 切型型とされうる。
一つの側面において、導入された核酸によってコードされるRIP、例えば、SA1は、改変されている。一例において、SA1は、Cysの別のアミノ酸、例えば、 Serによる置換によって改変されうる。別の例において、SA1は、配列番号22に示すアミノ酸配列を有するSA1におけるアミノ酸 位置を参照して位置38または 位置 219の一方または両方の置換によって改変される。例えば、アミノ酸 置換は、 L38R および/またはV219Aに対応しうる。一例において、アミノ酸 置換は V219Aに対応する。本明細書において提供する方法において宿主細胞に導入される核酸の例は、配列番号26または配列番号28に示すアミノ酸配列を有するSA1をコードする核酸分子である。例えば、SA1は、その配列が配列番号27または配列番号29に示されるヌクレオチドを含む核酸分子によってコードされうる。
本明細書において提供する生産方法において、RIP 阻害剤はアデニン 類似体である。例えば、アデニン 類似体は4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)である。一般に、本明細書における生産方法において、RIP 阻害剤、アデニン 類似体または4-APPの濃度は、RIP の毒性が（約） 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%低減されるのに有効であるように選択される。RIP 阻害剤が 4-APPである場合、本明細書における方法において用いられる濃度は、（約）1 mM から（約）40.0 mMである。一例において、4-APPの濃度は、（約） 2.0 mM、3.0 mM、4.0 mM、5.0 mM、6.0 mM、7.0 mM、8.0 mM、9.0 mM、10.0 mM、15.0 mM、 または20.0 mMの間である。
一つの側面において、本明細書において提供する生産方法において、生産は真核宿主細胞におけるものである。別の側面において、生産は、原核宿主細胞、例えば、大腸菌におけるものである。
本明細書における生産方法において、誘導物質を生産方法に用いてもよく、それによって RIP ポリペプチドが誘導物質による誘導の後に発現される。誘導物質はIPTGでありうる。本明細書における生産方法において用いられるRIP 阻害剤は、誘導物質の添加の前、最中および/または後に添加されうる。
いくつかの側面において、本明細書における生産方法は、RIPを含む複合体の生産の上昇のために用いられる。 かかる方法において、RIPをコードする核酸分子は、リガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより分子がリガンド-毒素 複合体をコードする。複合体におけるRIPおよびリガンドは、共有結合またはイオン結合を介して直接結合していてもよい。例えば、RIP およびリガンドは、リンカー、例えば、 ペプチド、ポリペプチド またはアミノ酸を介して連結されうる。リンカーの例は、Ala-Met リンカーである; Metは結合したポリペプチドにおける開始コドンとして含めることが出来る。典型的には、リガンド-毒素 複合体は融合タンパク質である。
１以上の 受容体 標的化剤(targeting agent)を含む複合体、例えば、１以上の標的化物質(targeted agent)に直接またはリンカーを介して結合したケモカイン-受容体 標的化剤が提供される。具体的には、本明細書において提供する複合体は以下の成分を含む: (受容体 標的化剤)n、(L)q、および(標的化物質)m 、ここで少なくとも１つの受容体 標的化剤、例えば、受容体 リガンドまたは受容体-特異的抗体、またはリガンドまたは 抗体の有効な部分が、直接または１以上の リンカー (L)を介して少なくとも１つの標的化物質に結合している。Lはリンカーを意味する。複合体の要素のなかのあらゆる好適な結合が、その結果得られる複合体が標的化受容体と相互作用する結果、結合した標的化物質のインターナリゼーションが起こる限り、考慮される。本明細書において提供する複合体において、標的化物質は、改変毒素、例えば、改変RIP、またはその毒性の断片である。毒素または断片はその一次アミノ酸配列において改変されて、その非改変形態よりもその生産のためにそれが発現される宿主細胞に対して毒性が低くされる。毒素または複合体は本明細書において提供する方法によって改変される。
変数n および mは1以上の整数であり、qは0またはいずれかの整数である。変数n、qおよびmは、その結果得られる複合体が標的化受容体と相互作用し、標的化物質が、それが標的化された細胞によってインターナライズされるように選択される。典型的には n は1 から3; qは0以上であり、結合した標的化剤および標的化物質 および/または リンカーの官能基の数に依存し、q は一般的には1から 4; mは 1以上、一般的には1または2である。２以上の標的化物質が複合体に存在する場合、標的化物質は同一であっても異なっていてもよい。同様に、２以上の受容体 標的化剤が複合体に存在する場合、それらは同一であっても異なっていてもよい。
本明細書において提供する複合体は融合タンパク質として生産され得、化学的に結合してもよいし、融合タンパク質 部分および化学的に結合した部分またはそのいずれかの組合せを含んでいてもよい。本明細書における目的のために、受容体標的化剤は受容体、例えば、 活性化白血球上のケモカイン 受容体と特異的に相互作用するいずれかの物質、典型的には、ポリペプチドであり、受容体と相互作用すると、結合またそれ以外の方法で関連した標的化物質、例えば、標的化細胞によってインターナライズされることが意図されている毒素をインターナライズする。
リガンド-毒素 複合体におけるリガンドは、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、 ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリー リガンド、および パターン認識 受容体 (PRR) リガンドであり得る。一例において、リガンドは、増殖因子、例えば、 VEGFである。別の例において、リガンドは、ケモカイン 受容体 標的化剤、例えば、 ケモカイン、またはケモカインの断片またはケモカイン 受容体に特異的に結合する抗体、または抗体の断片であり、ここで断片はケモカイン 受容体に結合するものである。リガンドが抗体である場合、それはモノクローナル抗体、またはその抗原特異的 断片であり得る。モノクローナル抗体の例は、以下を含むがそれらに限定されない抗原に特異的なものである：(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、 CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、およびXCR1。
別の例において、リガンドはケモカインである。本明細書における方法に用いられるリガンド-毒素 複合体におけるケモカインの例としては、これらに限定されないが、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連 上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種 変異体が挙げられる。 一例において、ケモカインは、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、および BCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種 変異体のいずれかである。別の例において、ケモカインは MCP-1である。
リガンド-毒素 複合体における毒素 部分は、志賀毒素、その触媒的に活性の断片、またはその活性の断片であり得る。例えば、本明細書における方法において生産されるリガンド-毒素 複合体における毒素 部分は、SA1でありうる。リガンド-毒素 複合体における毒素 部分、例えば、 SA1は、改変毒素であり得る。本明細書における方法において生産されるリガンド-毒素 複合体をコードする核酸の例は、配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、または67のいずれかに示すアミノ酸 残基配列を有するリガンド-毒素 複合体をコードする核酸分子である。かかる核酸分子のなかでも特に、配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65 または66に示す配列を有するものである。
野生型および変異体 RIPを含むRIPである出発材料と比較して低減された毒性を示す改変毒素、特に、改変RIPが提供される。かかる改変RIP 毒素、またはその複合体のなかでは特に、本明細書における方法において同定されるものである。
本明細書において提供する改変毒素のなかでも特に、志賀毒素、その対立遺伝子または種 変異体、その触媒的に活性の部分またはその活性の断片において１以上の アミノ酸 改変を有し、かかる改変が毒性の低減を付与する、改変志賀毒素 ポリペプチド、またはその活性の断片である。一例において、１以上の アミノ酸 改変は、配列番号22に示すアミノ酸配列を有する志賀毒素 A1 サブユニット (SA1)におけるアミノ酸 位置を参照して位置38 および/または219に対応する位置の一方または両方の置換である。本明細書において提供する改変志賀毒素は、配列番号22に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも 約 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の配列 同一性を有し、アミノ酸 位置38 および/または219に対応する部位にて改変を含む。位置38 および/または219における改変のなかでも特に、L38R および/またはV219Aに対応するものである。改変志賀毒素はサブユニット Aを含む。例えば、改変志賀毒素は志賀毒素のSA1、またはその活性の断片のみを含みうる。SA1は切型でありうる。例えば、切型SA1は、N- または C-末端における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12の連続するアミノ酸の欠失によって切型であり得る。改変志賀毒素の例は、配列番号26または28に示すアミノ酸配列を有するもの、またはその対立遺伝子 または種変異体である。
改変リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)、例えば、本明細書における方法において同定されるいずれかの改変RIPである標的化物質を含む複合体も本明細書において提供する。改変志賀毒素、またはその活性の断片、例えば、上記のいずれかの改変志賀毒素である標的化物質を含む複合体も提供される。複合体はまた、受容体を担持する細胞における標的化物質のインターナリゼーションをもたらす細胞 表面 受容体への複合体の結合を助ける標的化剤、またはその部分も含む。
かかる複合体のなかでも特に以下の成分を有するものである: (標的化剤)n、(L)q、および (標的化物質)m、ここで、Lは、標的化剤の標的化物質への結合のためのリンカーであり、標的化剤は、細胞 表面 受容体に選択的に結合するいずれかの部分であり、m およびnは、独立に選択され少なくとも 1であり、qは0以上であり、ただし、その結果得られる複合体が標的化受容体に結合し、インターナライズされ、標的化物質を送達することを条件とする。典型的には、結果として得られる複合体は、標的化剤と相互作用しインターナライズする受容体に結合し、それにより標的化物質は受容体を担持する細胞にインターナライズされる。複合体が複数の 標的化物質を含むいくつかの場合においては、標的化物質は同一であるかまたは異なっている。典型的には、標的化物質はすべてRIP 毒素の改変形態である。また、複合体が複数の 標的化剤を含む場合、標的化剤は同一であるかまたは異なっている。一例において、独立に選択されるmおよび nは、1-6である。別の例において、qは1、nは2およびmは1である。
本明細書において提供する複合体において、標的化剤は、受容体 標的化剤、例えば、 限定されないが、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリー リガンド、および パターン認識 受容体 (PRR) リガンドを含む。一例において、リガンドは増殖因子、例えば、 VEGFである。別の例において、リガンドは、ケモカイン 受容体 標的化剤、例えば、ケモカイン、またはケモカインの断片、またはケモカイン 受容体に特異的に結合する抗体、または抗体の断片であり、ここで断片はケモカイン 受容体に結合するものである。リガンドが抗体である場合、それはモノクローナル抗体、またはその抗原特異的 断片でありうる。モノクローナル抗体の例は、抗原、例えば限定されないが、(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR6、CXCR7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、および XCR1に特異的なものである。
さらなる例において、リガンドはケモカインである。本明細書において提供するリガンド-毒素 複合体におけるケモカインの例としては、これらに限定されないが、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連 上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、および B 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、およびそれらの 対立遺伝子または種 変異体が挙げられる。一例において、ケモカインは、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種 変異体のいずれかである。別の例において、ケモカインはMCP-1である。
本明細書において提供する複合体における標的化剤は、１以上の 免疫エフェクター細胞、または免疫または炎症応答に関係するその他の細胞の上の１以上の 細胞 表面 受容体に特異的に結合する。一例において、１以上の免疫エフェクター細胞は白血球である。別の例において、免疫または炎症応答に関係するその他の細胞は組織固有細胞(TRC)である。本明細書において提供する複合体によって標的化される細胞としては、これらに限定されないが、単球、マクロファージ、樹状細胞、T 細胞、B 細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、および好中球が挙げられる。マクロファージのなかでも特に組織 マクロファージ、例えば、 肺胞マクロファージ、小膠細胞、およびクッパー細胞が挙げられる。樹状細胞のなかでも特に、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞およびランゲルハンス 細胞が挙げられる。T 細胞のなかでも特に、CD4+ (例えば、 Th1、Th2または Th17 細胞)およびCD8+ T 細胞が挙げられる。TRCのなかでも特に、メサンギウム細胞、グリア細胞、内皮 細胞、上皮 細胞、腫瘍 細胞、線維芽細胞、および滑膜細胞が挙げられる。複合体によって標的化される細胞は活性化されうる。例えば、細胞 活性化は、複合体によって標的化された１以上の 細胞 表面 受容体の発現を誘導しうる。
本明細書において提供する複合体のなかでも、特に１以上の ケモカインに結合する細胞 表面 受容体を標的化するものである。かかるケモカイン 受容体としては、これらに限定されないが、CXCR1、CXCR2、CXCR3A、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CXCR6、 CXCR7、CCR1、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、XCR1 およびCX3CR-1が挙げられる。複合体の ケモカイン 受容体への結合は、複合体の 受容体を担持する細胞へのインターナリゼーションを促進する。
本明細書において提供する複合体において、標的化剤(targeting agent)および標的化物質(targeted agent)、またはそれらの活性の断片は、共有結合またはイオン結合を介して結合している。例えば、複合体における改変RIPおよびリガンドは、共有結合またはイオン結合を介して直接結合されうる。 いくつかの例において、RIP およびリガンドは、リンカー、例えば、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸または化学的リンカーを介して連結されうる。リンカーの例は、Ala-Met リンカーである。リンカーの例としてはまた、これらに限定されないが、N-スクシンイミジル (4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル (4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α- (2-ピリジルジチオ)トルエン 、スルホスクシンイミジル-6-(α-メチル-α-(ピリジルジチオール)-トルアミド) ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ) - プロプリオネート、スクシンイミジル 6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロプリオンアミド) ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル 6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド) ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニル ヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、およびS-(2-チオピリジル)-L-システインが挙げられる。
配列番号44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 または67のいずれかに示すアミノ酸配列を有する複合体を本明細書において提供する。
本明細書において提供する改変毒素 複合体のいずれか、例えば、改変SA1を有するものを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は医薬上許容される賦形剤を含み、あらゆる好適な投与経路、例えば、これらに限定されないが、全身、経口、経鼻、肺、局所的および局所投与のために製剤されうる。医薬組成物のいずれか、組成物の投与のためのデバイスおよび所望により投与のための指示書を含むキットも提供する。
本明細書において提供する複合体のいずれかをコードする核酸分子も提供する。核酸分子を含むプラスミドおよび核酸分子またはプラスミドを含む細胞も提供する。
毒素を細胞に標的化する方法も本明細書において提供する。かかる方法は、例えば、対象のサンプルに複合体を投与することを含む。投与される複合体は、改変毒素、例えば、本明細書において提供するもののいずれか、および細胞 表面 受容体 標的化剤、例えば、リガンドを含む。標的化される細胞は、標的化剤のための細胞 表面 受容体を発現する。
免疫または炎症性疾患または障害を有する対象の治療方法を本明細書において提供する。治療方法において、本明細書において提供する複合体のいずれかを含む医薬組成物が対象に投与され、組成物が、二次組織 損傷促進性 炎症細胞の増殖、遊走 または生理活性を阻害する。
例えば、炎症反応に関係する免疫または炎症症状および/または１以上の 細胞の活性化、増殖および遊走に関係する二次組織 損傷である疾患または障害などの疾患または障害を有する動物 または対象における疾患または障害を阻害する方法またはかかる動物 または対象を治療する方法を本明細書において提供し、該方法は、複合体、例えば、 本明細書において提供するいずれかの複合体を投与することによる。該方法において、複合体 は１以上の 細胞に発現する１以上の 細胞 表面 受容体に結合し、その結果、受容体を担持する細胞中への標的化物質のインターナリゼーション が起こり、それにより、１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走が阻害される。一例において、治療は哺乳類のものである。別の例において、治療はヒトのものである。
該方法において、１以上の 細胞は免疫エフェクター細胞、または免疫または炎症症状に関係するその他の細胞でありうる。 一例において、免疫エフェクター細胞は白血球である。別の例において、免疫または炎症症状に関係するその他の細胞は組織固有細胞 (TRC)である。細胞としては、これらに限定されないが、単球、マクロファージ、樹状細胞、T 細胞、B 細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、および好中球が挙げられる。マクロファージのなかでも、特に、組織 マクロファージ、例えば、 肺胞マクロファージ、小膠細胞、またはクッパー 細胞が挙げられる。樹状細胞のなかでも特に、未熟 樹状細胞、成熟 樹状細胞、またはランゲルハンス 細胞が挙げられる。T 細胞のなかでも特に、CD4+ (例えば、 Th1、Th2またはTh17 細胞)およびCD8+ T 細胞が挙げられる。TRCのなかでも特に、メサンギウム細胞、グリア細胞、上皮 細胞、腫瘍 細胞、線維芽細胞、および滑膜細胞が挙げられる。いくつかの例において、１以上の 細胞は、例えば、細胞に発現する細胞 表面 受容体が上方制御されるように活性化される。
本明細書における疾患または障害の阻害方法の一つの側面において、複合体は、疾患または障害、例えば、限定されないが、CNS 傷害、CNS 炎症性疾患、神経変性障害、心疾患、炎症性眼 疾患、炎症性皮膚 疾患、炎症性腸 疾患、炎症性関節 疾患、炎症性腎臓または腎 疾患、炎症性 肺疾患、炎症性鼻 疾患、炎症性全身 疾患、肥満および関連疾患における炎症、炎症性甲状腺 疾患、細菌またはウイルス感染に関連する炎症反応、癌、および血管新生媒介疾患に関与する１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する。
一例において、CNS 炎症性疾患および/または 神経変性障害としては、これらに限定されないが、閉鎖性頭部外傷、白質脳症、脈絡髄膜炎、髄膜炎、副腎白質ジストロフィー、エイズによる認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、慢性疲労症候群、脳炎、脳脊髄炎、海綿状脳症、多発性硬化症、パーキンソン病および脊髄 傷害/外傷 (SCI)が挙げられる。別の例において、心疾患はアテローム性動脈硬化症である。炎症性眼疾患としては、これらに限定されないが、増殖性糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、網膜炎、強膜炎、強膜虹彩炎(scleroiritis)、脈絡膜炎およびブドウ膜炎が挙げられる。炎症性皮膚 疾患としては、これらに限定されないが、乾癬、湿疹および皮膚炎が挙げられる。炎症性腸 疾患としては、これらに限定されないが、慢性大腸炎、クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられる。炎症性関節 疾患としては、これらに限定されないが、若年性関節リウマチ、変形性関節症、関節リウマチおよび脊椎関節症、例えば、強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎炎、未分化性脊椎関節症およびベーチェット症候群が挙げられる。炎症性腎臓または腎 疾患としては、これらに限定されないが、糸球体腎炎、IgA 腎症およびループス腎炎が挙げられる。炎症性 肺疾患としては、これらに限定されないが、急性呼吸促迫症候群、好酸球性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、気管支収縮、気管支肺異形成症、気管支肺胞 好酸球増加症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺炎および線維性肺 疾患が挙げられる。炎症性鼻 疾患としては、これらに限定されないが、ポリープ症、副鼻腔炎および鼻炎が挙げられる。炎症性甲状腺 疾患としては、限定されないが、甲状腺炎が挙げられる。癌としては、これらに限定されないが、神経膠腫、アテローム癌、腺癌、肉芽腫、神経膠芽腫、肉芽腫症、リンパ腫、白血病、肺癌、 黒色腫、骨髄腫、肉腫、サルコイドーシス、小膠細胞腫、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、胃癌、例えば、消化器癌、膵臓 癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸 癌、直腸 癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺 癌、外陰癌、甲状腺 癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頚部癌が挙げられる。
一つの側面において、選択される疾患または障害は、腎臓 疾患、脊髄 傷害、または遅発性過敏症 疾患または障害である。
本明細書における疾患または障害の治療または阻害方法において、複合体の標的化剤としては、これらに限定されないが、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種変異体が挙げられ、標的化物質は改変志賀毒素である。一例において、標的化剤はMCP-1である。複合体の例としては、これらに限定されないが、LPM1c、LPM1d、LPM2、LPM3、LPM4、LPM5、LPM6、LPM7、LPM8、LPM9、LPM10、およびLPM11が挙げられる。かかる複合体は、配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 または 67のいずれかに示すアミノ酸配列をそれぞれ有する。
例えば、疾患は多発性硬化症 (MS)でありうる。かかる態様のために、標的化される細胞は、 MSにおいて上方制御される受容体を発現するものである。例えば、標的化される細胞としては、例えば、 １以上の、例えば、１または少なくとも２の、CCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3、5、6およびCXCR1-3、4から選択される受容体を発現するものが挙げられる。MSの治療のための複合体は、かかる受容体に結合してそれにインターナライズされる(直接的または間接的に)結合した物質の結合およびインターナリゼーションに十分な、標的化剤、例えば、ケモカインまたはその断片を含む。したがって、例えば、複合体は、その受容体との結合およびそれによるインターナリゼーションに十分なケモカインまたはその断片を含み得;そしてケモカインは、例えば、I-309、 MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8、MIG、IP-10、I-TAC、SDF-1α、SDF-1β、BCA-1、エオタキシン、MCP-4、MCP-5、C10、LEC およびMIP-1b2から選択される。かかる複合体の例はLPM1dである。
本明細書における方法の一例において、複合体の標的化剤は、 PF-4またはその対立遺伝子または種変異体を含み、疾患または症状は血管新生媒介 疾患である。別の例において、複合体の標的化剤は、VEGFまたはその対立遺伝子または種 変異体であり、疾患または症状は、血管新生媒介 疾患である。
詳細な説明
アウトライン
A.定義
B. リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)、その選択、発現および生産
C.リボソーム不活性化タンパク質(RIP) および作用の方法
1.例示的なRIP
志賀毒素
2.RIP 毒素 阻害剤
4-APP およびその他のアデニン類似体
D.改変毒素またはその複合体の選択方法
1. 候補RIP タンパク質またはその複合体
2. RIPまたはその複合体の宿主細胞への導入
a.トランスフェクション
b.形質転換
c.エレクトロポレーション
3.発現、選択および同定
4.活性評価
a.タンパク質 合成 アッセイ
b.脱プリン アッセイ
c.細胞増殖/生存/生存度 アッセイ
E. 例示的な改変毒素
改変 SA1 毒素
F.標的化剤およびその複合体
1.標的化剤
a.ケモカイン
i.リガンド
ii.ケモカイン受容体
iii.ケモカイン/ケモカイン 受容体細胞プロファイル
iv.例示的なケモカイン標的化剤
b.非ケモカイン サイトカイン
c.抗体 リガンド 部分
d.その他の標的化剤および受容体標的
増殖因子
2.リンカー 部分
a. 例示的なリンカー
i.ヘテロ二官能性 架橋試薬
ii.酸切断可能、光切断可能および熱感受性リンカー
iii.化学複合化のためのその他のリンカー
iv.ペプチド リンカー
3.例示的な白血球 集団モジュレーター (LPM) 複合体
G.改変RIP 毒素およびその複合体の調製
1.毒素 ポリペプチド、または毒素 ポリペプチドを含む複合体の作成およびクローニング方法
2. 融合タンパク質を含む複合体の生産および発現系
a. 発現のためのプラスミドおよび宿主細胞
i.細菌細胞 発現系
ii.昆虫細胞 発現系
iii.酵母細胞 発現系
iv.植物細胞 発現系
v.哺乳類細胞 発現系
b.精製
3.化学的複合体の生産
H. RIP ポリペプチド、またはその複合体の生産を上昇させる方法
タンパク質 生産を上昇させるさらなる方法
I.毒素またはその複合体の活性を測定するためのインビトロおよびインビボ アッセイ
1.インビトロ 活性 アッセイ
a.細胞に基づく 毒性 アッセイ
b.受容体 結合 アッセイおよびインターナリゼーション
c.走化性 アッセイ
2. 複合体の試験のためのインビボ 動物モデル
a.脊髄 傷害 (SCI)
b.外傷性脳傷害および脳卒中
c.アルツハイマー病
d.多発性硬化症
e.関節炎および自己免疫 疾患
f.炎症性 肺疾患
g. 遺伝子治療後の炎症
h.血管新生
i.腫瘍増殖
j.ヒト 免疫不全 ウイルス (HIV)
k.腎臓 疾患
l.過敏症
J.毒素およびその複合体を含む組成物の製剤および投与
K.毒素またはその複合体を用いる疾患および障害の治療方法
1.免疫宿主 防御系および炎症
a.恒常性 炎症
b.病理的 炎症
2.候補治療薬およびその限界
3.リガンド-毒素 複合体 (即ち、 LPM)
選択した疾患または障害の治療のためのリガンド-毒素 複合体の選択
白血球 集団モジュレーターの選択および設計
4.例示的な疾患
a.癌
b.腎臓 疾患
c.脊髄 傷害 (SCI)
d.過敏症
e.HIV 感染およびAIDSおよびその他の病原体による感染
f.炎症性関節 疾患および自己免疫 疾患
g.肺疾患
h. 二次組織 損傷に媒介されるその他の疾患
5.併用療法
L.実施例
A. 定義
格別に断りのない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書の全体の開示を通して参照される、特許、特許出願、公開された出願および出版物、遺伝子バンクの配列、データベース、ウェブサイトおよび公開された他の物は全て、格別に断りのない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書の用語について複数の定義がある場合は、この節における定義が優先する。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスが参照されている場合は、かかる識別子は変更され得、インターネット上の具体的な情報は現れたり消えたりし得るが、等価な情報はインターネットを探索することにより発見し得ると認識されたい。それらを参照していることはかかる情報の可用性および一般への流布を証明している。
本明細書において用いる場合、毒素（細胞毒素とも言及される）は、細胞内に取り込まれた場合、例えば細胞成長および／または増殖を阻害することにより、細胞の機能を阻害する分子、例えばポリペプチドまたは薬物を意味する。毒素は増殖を阻害することができる、または細胞に対して毒性である。細胞により内部に取り込まれると、細胞代謝を妨害するもしくは有害に変化させる、または何らかの様式にて細胞成長もしくは増殖を阻害するあらゆる分子が、この用語の範囲内に含まれ、細胞内へ輸送されるとその毒性効果が媒介される分子、また細胞表面にてその毒性効果が媒介される分子が含まれるが、これらに限定されない。多様な細胞毒素が知られており、タンパク質合成を阻害するもの、および細胞の生育または生存に不可欠な特定遺伝子の発現を阻害するものなどがある。毒素には、細胞死を引き起こすもの、および細胞成長、増殖および／または分化を阻害するもの、あるいは細胞代謝を有害に変化させるものなどがある。例えば、毒素は、これに限定しないが、リボソーム不活性化タンパク質（RIP）を含む。RIPは、細胞内に取り込まれると、細胞において代謝または遺伝子発現を変化させ、タンパク質合成を調節し、もしくは変化させ、増殖を阻害し、細胞を殺し、あるいは細胞に有害に影響する。本明細書の目的において、毒素、例えば、RIPタンパク質、例えば本明細書において提供する改変RIPタンパク質は、標的化物質（targeted agent）である。それらの毒素は、宿主細胞がかかる細胞にとって標準的なまたは正常な条件下において培養されると毒素が発現される、宿主細胞の何らかの様式において、生育および増殖を阻害し、または細胞代謝を妨害し、もしくは有害に変化させる。
本明細書において用いる場合、宿主細胞に関して標準的な条件下における生育とは、かかる細胞が正常に生育し、コードされたタンパク質または組換えタンパク質を発現する条件を意味する。
本明細書において用いる場合、リボソーム不活性化タンパク質（RIP）は、真核および原核タンパク質合成の強力な阻害剤である、植物および細菌において発現されるタンパク質のクラスを意味する。RIPはまた、核に輸送されると細胞DNAを分解する。RIPは、N-グリコシダーゼまたはポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼであり、リボソームおよび非リボソーム核酸基質を不活性化することができる。
本明細書において用いる場合、RIPポリペプチドとは、N-グリコシダーゼ活性を示し、リボソームを不活性化するいずれかのポリペプチドを意味する。これらは天然起源から単離されたポリペプチドならびに合成的に作製されたもの、例えば組換え方法、化学合成または何らかの方法により作製されたものを含む。それらはまた、変異体、野生型、種および対立遺伝子変異体を含む。典型的なRIPには、これに限定しないが、あらゆるIまたはII型RIPが含まれ、志賀毒素1（Stx1）、Stx2などの志賀毒素、サポリン6、オオムギRIP I、オオムギRIP II、ゲロニン、リシンA、モモルディンI、モモルディンII、ブリョジンI、ブリョジンII、Pap-S、ルフィン、トリコサンチン、クラビン、アブリン-a、トウモロコシRIP3、トウモロコシRIP9、トウモロコシRIP X、トリチン、MAP、ジアンチン30、ニグリンb、ニグリンI、エブリン（Ebulin）、これらの毒素の細胞毒性学的に活性な断片、および当業者に知られる他のRIPが含まれるが、これらに限定されない。RIPポリペプチドは、変異体および他の改変された形態、例えばRIPポリペプチドの突然変異タンパク質ムテインも包含する。典型的には、変異体および改変された形態は、N-グリコシダーゼ活性を有する。変異体には、例えば、対立遺伝子および種変異体、また、アミノ酸残基の挿入または欠失を有するものが含まれる。RIPタンパク質の典型的な配列は、配列番号1、5、89-111のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基、ならびにそれらの対立遺伝子および／または種変異体、および、少なくとも40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99またはそれ以上の配列同一性を有するそれらの相同体および改変型を含むいずれかの配列、特にN-グリコシダーゼ活性を保持するいずれかの配列である。典型的なRIP変異体には、当分野において知られるいずれかのもの、または本明細書において提供するもの、例えば１以上のいずれかのアミノ酸変異を有する、配列番号3、6-21、162-169に記載のようなRIPタンパク質が含まれる。
本明細書において用いる場合、RIPポリペプチドの「機能活性」または「活性」は、RIPポリペプチドにより示される評価することができるいずれかの活性を意味する。かかる活性は、インビトロおよび／またはインビボにおいて試験することができ、N-グリコシダーゼ活性および／またはポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性、RNAaseおよびDNAase活性などを含むが、これらに限定されない。他の活性には、スーパーオキシドジスムターゼ活性、ホスホリパーゼ活性、キチナーゼ活性および抗ウイルス活性などがあるが、これらに限定されない。RIPポリペプチド、それらの改変された形態またはそれらの複合体の活性を測定するアッセイは、当業者に知られている。例えば、タンパク質合成、脱プリン化および／または細胞成長／生存度についてアッセイすることにより活性を評価することができる。さらに、ポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性は、例えば、RIPポリペプチドにより処理した細胞からのDNAを精製し、臭化エチジウムによる染色によって可視化することにより、評価することができる。RIPポリペプチド、例えば改変されたSA1ポリペプチド、またはそれらの複合体の活性を評価するための典型的なアッセイは、本明細書に記載している、または実施例2および5に記載している。
本明細書において用いる場合、毒素の活性断片（活性部分と互換的に用いられる）は、活性、例えば毒性活性または触媒活性を有する断片を意味する。従って、毒素例えばRIPの触媒活性断片、および毒素活性を保持する断片を意味する。改変毒素、例えば改変志賀毒素を提供する場合、活性断片は改変を含む。
本明細書において用いる場合、変異体毒素ポリペプチド、例えば変異体RIPは、集合的に、本明細書において記載のように毒性を減じる改変を行う前のRIPを意味する。変異体毒素は、そのポリペプチドの野生型形態とは異なるいずれかの形態であり、対立遺伝子および／または種変異体、スプライス変異体によってコードされたポリペプチド、および／または改変された形態、特に一次構造に変化を有する変異体を含む。変異体は、タンパク質の野生型形態と比較してアミノ酸の欠失、置換または付加を含有するものを含む。例えば、SA1の変異体は、配列番号5に記載の成熟Aドメインのアミノ酸1-251に対応する野生型SA1、ならびにそれらの対立遺伝子または種変異体と比較して、アミノ酸突然変異を含有するもの、または切断されたものを含む。切型の典型例は、配列番号22および24にそれぞれ記載の変異体1および変異体2である。
本明細書において用いる場合、種変異体は、異なる細菌種、例えば大腸菌（Escherichia）および赤痢菌（Shigella）などの異なる種間のポリペプチドにおける変異体を意味する。
本明細書において用いる場合、対立遺伝子変異体は、同じ種のメンバー間のタンパク質における変異体を意味する。
本明細書において用いる場合、非改変RIPポリペプチドは、改変のために選択される出発タンパク質を意味する。その出発標的ポリペプチドは、天然の、ポリペプチドの野生型形態であり得る。さらに、出発標的ポリペプチドは、ネイティブの野生型アイソフォームとは異なるが、それにもかかわらず本明細書において産生される、後に改変されるタンパク質と比較して、本明細書において非改変出発標的タンパク質と呼べるように、あらかじめ変化させておくまたは突然変異させておくことができる。よって、非改変参照タンパク質と比較して具体的活性または特性が所望のように増加または減少するように改変されたことが知られるタンパク質は、非改変出発標的タンパク質として用いることができる。本明細書における目的において、非改変RIPポリペプチドは、RIPポリペプチド単独、またはその活性断片、またはRIPポリペプチドもしくはその活性断片を含有する複合体を含む。
本明細書において用いる場合、「改変された」または「突然変異」RIPポリペプチドは、参照出発タンパク質または非改変ポリペプチド、例えば野生型ポリペプチド、または、特定の種の対立遺伝子変異体および他の変異体を含む他の出発RIPポリペプチドと比較して一次配列に１以上の改変を有するポリペプチドを意味する。改変または突然変異は、毒性（すなわち、細胞において代謝または遺伝子発現を変化させる、タンパク質合成を調節するまたは変化させる、増殖を阻害する、細胞を殺す、あるいは細胞に有害に影響する能力）を変化させる。従って、改変されたまたは突然変異RIPは、いずれかのRIPにおけるアミノ酸残基の挿入および欠失を含み、出発RIPと比較して毒性が減少する突然変異を含有する。１以上の突然変異は、１以上のアミノ酸置換、挿入、欠失およびそれらのいずれかの組み合わせを含む。改変RIPポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の改変された位置を有し得る。一般に、これらの突然変異は、RIPポリペプチドの毒性および／または１以上の他の活性を変化させる。かかる改変には、本明細書の選択方法において同定されるものが含まれる。ポリペプチドの毒性を変化させる改変を含有することに加えて、改変RIPポリペプチドは、他の改変を含有することもできる。改変RIPポリペプチドは典型的には、野生型または非改変出発RIPポリペプチドのアミノ酸の対応する配列に対して60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有する。
本明細書において用いる場合、志賀毒素は、細菌、特に赤痢菌（Shigella）属および他の関連する属のメンバー、例えば志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）を元に単離されたRIPポリペプチドを意味する。志賀毒素は、Aサブユニットおよび5つのBサブユニットから構成される多サブユニットタンパク質であり、AサブユニットはA1およびA2に切断されて活性志賀毒素A1（SA1）部分を形成する。BサブユニットはA2部分に連結し、志賀毒素が細胞内に侵入するのに必要である（Sandvig and van Deurs, EMBO J., 19: 5943-50, 2000）。本明細書の複合体において、Bサブユニットは、細胞内に侵入するための標的化剤（targeting agent）と置換される。従って、複合体は、毒素サブユニット、具体的にはサブユニットA、最も具体的には触媒活性断片（SA1）またはその活性断片を含む。典型的な志賀毒素のAサブユニットの前駆体配列は、配列番号1に記載されており、成熟配列は配列番号5に記載されている。触媒活性A1断片（SA1）は、配列番号5に記載の配列のアミノ酸1-251に対応し、A2断片は、配列番号5に記載の配列のアミノ酸252-293に対応する。
志賀毒素はまた、対立遺伝子および種変異を示す。志賀毒素の例には、赤痢菌属の種およびその対立遺伝子および種変異体により産生されるもの、例えば、限定しないが、志賀赤痢菌、大腸菌（E.coli）、シトロバクター・フロインディイ（Citrobacter freundii）、エロモノナス・ヒドロフィラ（Aeromononas hydrophila）、エロモノナス・カビエ（Aeromononas caviae）およびエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）において産生されるものが含まれる。様々な志賀毒素のA鎖の前駆体または成熟型の典型的な配列は、配列番号1、3、5および7-21のいずれかに記載されている。志賀毒素A鎖の他の変異体は、配列番号6に記載している。
本明細書において用いる場合、RIPポリペプチドの「酵素学的サブユニット」または「触媒活性サブユニット」または「活性サブユニット」は、毒性活性を媒介するポリペプチドの部分を意味する。毒性活性は、そのポリペプチドのいずれかの特性または活性、例えば、N-グリコシダーゼ活性によるrRNAに対する阻害活性、またはDNA、mRNA、ウイルスDNAもしくはウイルスRNAの脱プリン化に起因するものであり得る。例えば、志賀毒素において、活性部分はA1サブユニット（SA1）であり、AサブユニットがA1およびA2断片へ切断されることによって活性化される。従って、志賀毒素のA鎖の活性部分は、SA1とも呼ばれるA1サブユニットである。
志賀毒素ならびにいずれかのRIPの活性部分は知られており、または活性を評価するインビトロまたはインビボ活性アッセイを用いて経験的に同定することができる（例えばStirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992；およびSandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996；Stirpe and Battelli, Cell Mol Life Sci., 63: 1850-66, 2006を参照のこと)。典型的なRIPのAサブユニットは、本明細書の表3に記載されている、および／または当業者に知られている、または当業者により同定され得る。
本明細書において用いる場合、RIP毒素の「それらの活性部分」または「それらの活性断片」は、毒性活性を表すための少なくとも最小のアミノ酸残基を含有するポリペプチドを意味する。典型的には、活性部分は、RIPポリペプチドからの連続するアミノ酸、例えば毒性活性を提供するのに必要なAサブユニットまたはA1サブユニットの最小部分を含有する。活性断片および最小アミノ酸残基は、RIPポリペプチドのAサブユニットまたはA1サブユニットのN-またはC-末端の片方または両方の切型を産生し、試験し、活性を示すものを決定することにより、経験的に決定することができる。活性は、本明細書において記載されているまたは当分野において知られる、タンパク質合成アッセイ、脱プリン化アッセイ、または細胞成長／生存度アッセイを含むが、これらに限定されない様々なアッセイによって評価することができる。活性は、完全長ポリペプチドのいずれかの割合の（上回るまたは下回る）活性であり得、完全ポリペプチドと比較して、活性の1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、またはそれ以上の活性が含まれるがこれらに限定されない。
典型的には、RIP毒素の活性断片は、ポリペプチドのA鎖のN-またはC-末端において約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸が欠損している切型断片である。触媒活性SA1サブユニットの典型的な活性断片、または志賀毒素のその活性断片は、配列番号22または配列番号24に記載している。
本明細書において用いる場合、毒性は、ペプチド、タンパク質、化学物質、または他の分子、を含む分子の、細胞において代謝または遺伝子発現を変化させる、タンパク質合成を調節するまたは変化させる、増殖を阻害する、細胞を殺す、あるいは細胞に有害に影響する能力を意味する。本明細書の目的において、RIPに関して、毒性は、RIPまたはそれらのサブユニットまたはそれらの断片の、細胞内へ取り込まれた際に、細胞において代謝または遺伝子発現を変化させる、タンパク質合成を調節するまたは変化させる、増殖を阻害する、細胞を殺す、あるいは細胞に有害に影響する能力を意味する。例えば、RIPポリペプチド、またはそれらの複合体は、それらのN-グリコシダーゼ活性および／またはポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性が含まれるが、これらに限定されない様々な活性によって、細胞毒性を示す。
本明細書において用いる場合、N-グリコシダーゼ活性は、ヌクレオチドN-グリコシド結合を切断するポリペプチド酵素を意味する。RIPポリペプチドは、リボソームのrRNAから特定のアデニン残基を除去することによりグリコシダーゼ活性を示す。かかる活性は、伸長因子のリボソームへの結合を妨げることによりタンパク質合成の阻害およびその後の細胞死を引き起こす。
本明細書において用いる場合、対応する残基は、整列化させた部位に存在する残基を意味する。関連または変異体ポリペプチドは、当業者に知られるいずれかの方法によって整列化される。かかる方法は、典型的にはマッチを最大化し、例えば手動の整列化を用いる方法、および多数の利用可能な整列化プログラム（例えばBLASTP）を用いる方法、および当業者に知られる他の方法を含む。ポリペプチドの配列を整列化することにより、当業者は、ガイドとして同一の保存アミノ酸残基を用いて対応する残基を同定することができる。例えば、当業者は、配列番号5に記載された成熟志賀毒素A鎖の参照位置は、シグナル配列の存在のために、配列番号1に記載の前駆体志賀毒素A鎖と比較すると、22アミノ酸残基分が異なることを認識している。従って、配列番号1の23位のアミノ酸は、配列番号5の1番目のアミノ酸残基に「対応する」。さらに、当業者はまた、ヒトおよび非ヒト配列間において対応するアミノ酸残基を発見するためのガイドとして保存アミノ酸残基を用いることができる。対応する位置はまた、例えば、コンピュータシミュレーションしたタンパク質構造の整列化を用いて、構造的整列化に基づくことができる。他の例において、対応する領域を同定することができる。当業者はまた、ヒトおよび非ヒト配列間における対応するアミノ酸残基を見付けるためのガイドとして保存アミノ酸残基を用いることができる。
本明細書において用いる場合、「一次配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の配列を意味する。
本明細書において用いる場合、「相同性」および「同一性」なる用語は互換的に用いられるが、タンパク質における相同性は、保存的アミノ酸変化を含み得る。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最高位のマッチが得られるように整列化する（例えば：Computational Molecular Biology、Lesk, A.M.編、Oxford University Press、New York、1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D.W.編、Academic Press、New York、1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I、Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、1987;およびSequence Analysis Primer、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照のこと）。
本明細書において用いる場合、「配列同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間において比較した、同一のアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）の数を意味する。相同性ポリペプチドは、先に決定された数の同一または相同アミノ酸残基を意味する。相同性は、保存的アミノ酸置換ならびに同一の残基を含む。配列同一性は、それぞれの供給者が確立したデフォルトのギャップペナルティーとともに用いる標準的な整列化アルゴリズムプログラムによって決定することができる。相同的核酸分子は、先に決定された数の同一または相同ヌクレオチドを意味する。相同性は、コードされたアミノ酸が変化しない置換（すなわち「サイレント置換」）ならびに同一の残基を含む。実質的に相同的な核酸分子は、典型的には、中程度のストリンジェンシーまたは高度のストリンジェンシーにて、目的の完全長核酸分子の全核酸長に沿ってまたは少なくとも約70％、80％または90％に沿ってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子中のコドン、または特定された配列同一性を有する分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子も考慮する。タンパク質の相同性を決定するために、同一アミノ酸と同様に保存的アミノ酸を整列化することができる；この場合において、同一性の割合と相同性の割合は異なるものになる。いずれか2つの核酸分子が（またはいずれか2つのポリペプチドが）少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％「同一の」ヌクレオチド配列（またはアミノ酸配列）を有するか否かは、既知のコンピュータアルゴリズム、例えば「FAST A」プログラムを用いて、例えばPearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)におけるようなデフォルトのパラメーターを用いて決定することができる（他のプログラムにはGCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)）、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego (1994）、およびCarillo et al, SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)）などがある）。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）データベースのBLAST機能は、同一性を測定するために用いることができる。他の市販のまたは一般に利用可能なプログラムには、DNAStar「MegAlign」プログラム（Madison、WI）およびウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（University of Wisconsin Genetics Computer Group）（UWG）の「Gap」プログラム（Madison WI）などがある。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性の割合は、例えば、GAPコンピュータプログラムを用いて（例えば、Needleman et al, J, Mol, Biol, 48: 443 (1970)）、SmithおよびWatermanにより修正されたように（Adv, Appl, Math, 2: 482 (1981)）配列情報を比較することにより決定することができる。簡単に説明すると、GAPプログラムは、類似する整列化されたシンボル（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、その2つの配列の短い方のシンボルの総数により除したものとして類似性を定義している。GAPプログラムにおけるデフォルトのパラメーターは以下を含み得る:（1）単項比較マトリックス（同一には1の値を、非同一には0の値を含有する）およびSchwartzおよびDayhoff編、Atlas of Protein Sequence and Structure、National Biomedical Research Foundation、pp. 353-358 (1979)に記載されているような、Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)の重み付け比較マトリックス（weighted comparison matrix）;（2）各ギャップについて3.0のペナルティーおよび各ギャップの各シンボルについてさらに0.10ペナルティー;および（3）末端ギャップについてペナルティーなし。
本明細書において用いる場合、「同一性」なる用語は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間における比較を表す。非限定的な一例において、「〜に対して少なくとも90％同一」は、参照ポリペプチドに対して90〜100％の同一性の割合を意味する。90％またはそれ以上のレベルの同一性は、例証目的のために100アミノ酸の試験および参照ポリヌクレオチド長を比較することを想定すると、試験ポリペプチドにおいて10％（すなわち100のうち10）より少ないアミノ酸が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示している。同様の比較を試験および参照ポリヌクレオチド間において行うことができる。かかる差異は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分布する点突然変異として表すことができ、またはそれらは許容される最大の長さまでの様々な長さの１以上の位置に、例えば、10／100アミノ酸の差異（おおよそ90％の同一性）に密集し得る。差異は核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義する。約85-90％を超えるレベルの相同性または同一性において、結果はプログラムおよびギャップパラメーターセットとは独立しているはずである;かかる高レベルの同一性は、しばしばソフトウェアに頼らなくとも容易に評価することができる。
本明細書において用いる場合、「実質的に同一の」または「同様の、類似の」なる用語は、文脈によって関連分野の当業者によって理解されるように変化するが、当業者はそのように評価することができるとも理解されたい。
本明細書において用いる場合、「選択方法」は、タンパク質が特定の性質、特性または活性に基づいて同定されるいずれかの方法を意味する。本明細書の目的において、本明細書における選択方法において同定されたRIPポリペプチドまたはそれらの活性断片は、非改変または出発タンパク質と比較して減少した毒性を示すものを含む。
本明細書において用いる場合、組換え方法による生産は、組換えポリペプチドを発現するために組換えDNA方法を用いることを意味する。かかる方法は当業者によく知られており、典型的にはクローニングしたDNAによりコードされるタンパク質を発現するための分子生物学的方法を含む。
本明細書において用いる場合、「増大した収率」は、RIP阻害剤の非存在下と比較したRIP阻害剤の存在下において産生されたRIPの量に関する、産生されたRIPの量、例えばmg／lまたは絶対量を意味する。
本明細書において用いる場合、細胞に関して「単離した」は、細胞、細胞のコロニー、または細胞の集団を、他の細胞コロニーまたは細胞の集団から離して分離することを意味する。単離は、細胞を分離するいずれかの方法、例えばプレーティング条件、精製技術、例えば電磁ビーズの使用、具体的な細胞の特徴、例えば粒度、または他の同様の技術によって行うことができる。例えば、単離は、細胞培養物、例えば細菌細胞培養物のサンプルをプレートから、それぞれの生細胞が生育し、細胞のコロニーを形成する条件下の栄養寒天表面上に、取り出す、または移すことにより行うことができる。プレーティング条件は、細胞の単一コロニーが分離したコロニーとして検出されるように、例えば細胞培養物を希釈することにより、最適化することができる。細胞または細胞のコロニーは、単一細胞として個別に採取するまたは選択することができる。
本明細書において用いる場合、核酸分子またはポリペプチドまたは他の生体分子に関して、「単離された」なる語は、核酸またはポリペプチドが、そのポリペプチドまたは核酸または細胞が得られた生成環境（genetic environment）から分離されたことを意味する。天然の状態から変化したことも意味し得る。例えば、この用語が本明細書において用いられる場合、生きている動物において天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ではないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」である。よって、組換え宿主細胞内に産生されるおよび／または含有されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離されたと考えられる。「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」としては、組換え宿主細胞もしくは天然起源から部分的にもしくは実質的に精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドも意図している。例えば、化合物のうち組換え技術により産生されたものは、Smith et al., Gene, 67:31-40 (1988)に記載の一工程方法（one-step method）により実質的に精製することができる。単離されたおよび精製されたなる用語は、互換的に用いることができる。
従って、「単離された」は、（もしあれば）生物の天然のゲノムにおいて、目的の核酸をコードする遺伝子に直接隣接する遺伝子のコード配列を、その核酸が含まないことを意味する。単離されたDNAは、一本鎖または二本鎖であり得、ゲノムDNA、cDNA、組換えハイブリッドDNAまたは合成DNAであり得る。それは出発DNA配列に対して同一であり得、または１以上のヌクレオチドの欠失、付加、または置換によりかかる配列と異なり得る。
本明細書において用いる場合、生体細胞または宿主から産生された「精製された」調製物は、少なくともその純度の、示されたDNAまたはタンパク質を含有する細胞抽出物（目的のDNAまたはタンパク質の粗製抽出物を含む）を意味する。例えば、タンパク質の場合、精製された調製物は、以下の個々の技術または一連の調製用のまたは生化学的技術に従って得ることができ、目的のDNAまたはタンパク質はこれらの調製物中に様々な程度の純度にて存在し得る。それらの方法には、硫安分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、および電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において用いる場合、「実質的に純粋な」または「単離された」DNAまたはタンパク質の調製物は、本来かかるDNAまたはタンパク質に通常付随している天然物質を実質的に含まない調製物を意味し、一般に5％以下の他の混入物を含有する。
本明細書において用いる場合、目的のDNAまたはタンパク質を含有する細胞抽出物は、目的のタンパク質を発現するまたは目的のDNAを含有する細胞から得られたホモジネート調製物または細胞不含調製物を意味する。「細胞抽出物」なる用語は、培養培地、特に細胞が過ごし、その細胞が除去された培養培地を含むことを意図する。
本明細書において用いる場合、「選択剤（selective agentまたはselection agent）」は、細胞または細胞集団がその剤に対して感受性（sensitiveまたはsusceptible）であり、その感受性により、その剤に対してまたはその剤の細胞に対する作用に対して耐性を示す細胞を同定するのに用いることができる、いずれかの因子を意味する。典型的には、選択剤は、特定の選択剤に対する耐性を宿主細胞に与える発現されたポリペプチドについて選択するための発現系と組み合わせて用いられる。選択剤の典型例は抗生物質である。
本明細書において用いる場合、「選択調節剤（selection modulating agentもしくはselection modulator）」または「選択を調節する剤」は、特定の性質、特性または活性、例えば組換えポリペプチドの性質、特性または活性を選択する能力を改善するまたは増大させる選択方法において用いられるいずれかの因子または剤を意味する。本明細書の目的において、選択を調節する剤は、変化した毒性を示すRIPポリペプチド、またはそれらの活性断片の選択を改善するための選択方法において用いることができる。選択調節剤の典型例はRIP阻害剤である。例えば、RIP阻害剤、例えばアデニン類似体は、宿主細胞に対するRIPポリペプチドの毒性を減少させまたは緩和させ、これにより宿主細胞におけるRIPの発現が可能となる。選択された選択調節剤、その濃度およびインキュベーション時間は、特定の性質、特性または活性について選択する能力を促進する選択調節剤の能力に影響し得る因子である。よって、選択調節剤は選択剤とは異なる。
本明細書において用いる場合、「誘導剤」は、宿主細胞において組換えタンパク質発現を開始するのに用いられるいずれかの因子を意味する。誘導剤として用いることができる因子には、温度変化または小分子、ペプチドまたはポリペプチドの投与が含まれるが、これらに限定されない。誘導物質の選択は、組換えタンパク質発現のために用いられる宿主細胞、およびタンパク質を発現するのに用いられる特定のプロモーターに依拠する。当業者は様々な誘導物質をよく知っている。例えば、pET発現系において、遺伝子発現に必要なT7 RNAポリメラーゼは、IPTG誘導性T7プロモーターの制御下にある。クローニングされた遺伝子を含有するpETベクターにより形質転換された宿主細胞、典型的には大腸菌BL21(DE3）細胞において、タンパク質発現は、IPTGにより誘導されるまで起こらない。
本明細書において用いる場合、RIP阻害剤は、RIPポリペプチドの活性を阻害するいずれかの化学物質、例えばペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の分子または条件である。典型的には、RIP阻害剤は、RIPポリペプチドのN-グリコシダーゼ活性を阻害するいずれかのものを含む。従って、RIP阻害剤は、RIPポリペプチド活性を減少させるいずれかの剤、ポリペプチド、または他の分子である。かかる剤は知られており、RIPポリペプチドの活性を減少させるいずれかのものを含む。RIP阻害剤の典型例は4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン（4-APP）である。
本明細書において用いる場合、RIP阻害剤を言及する際の「RIPポリペプチドの毒性を阻害するのに有効な」は、阻害剤の存在下においてRIPポリペプチドが全くもしくは少ししか活性を保持しない、またはRIP阻害剤の存在下においてインキュベートした際にその活性が減少することを意味する。例えば、毒性が阻害されているRIPポリペプチドは、RIP阻害剤の非存在下におけるRIPポリペプチドの毒性活性と比較して、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の毒性の低減を示す。
本明細書において用いる場合、「毒性活性を保持する」は、典型的にはRIPポリペプチドの野生型、出発形態または参照形態と比較して減少しているRIPポリペプチド活性を示すRIPポリペプチドまたはその活性部分を意味する。本明細書の目的において、活性は、リボソーム、DNA、mRNA、tRNAまたは標的宿主細胞に対して毒性活性を示すのに十分であるならば、その活性は保持されている。例えば、RIPポリペプチドまたはその活性部分は、野生型、出発または参照RIPポリペプチドと比較して少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％またはそれ以上の活性を示すならば、活性を保持している。RIPまたは他の毒素は、かかるRIPを含有する複合体が処置に有効である限り、実質的に減少した活性を、その元の活性の1％未満に至るまで示し得る。
本明細書において用いる場合、複合体は、改変RIP毒素である１以上の標的化物質に直接または間接的に連結した１以上の標的化部分を含む、本明細書において提供する分子を意味する。これらの複合体はまた、本明細書においてリガンド-毒素複合体とも呼び、例えば白血球集団調節剤（LPM）を含む。かかる複合体は、融合タンパク質、化学複合体によって産生されるもの、および、少なくとも１つの改変毒素が標的化剤に直接または間接的に連結し、これにより細胞表面受容体に結合すると毒素が標的細胞内に取り込まれるいずれかの他の方法により産生されるものを含む。
本明細書において用いる場合、白血球集団調節剤（LPM）は、リガンド-毒素複合体であり、ここで標的化剤は細胞上に発現された１以上のケモカイン受容体に複合体を標的化するのに十分なポリペプチド部分であり、これにより連結したあるいは会合した標的化物質の内部取り込みが達成される。一般に、LPMのポリペプチド部分は、複合体を１以上のケモカイン受容体に標的化するケモカインリガンド、それらの断片または対立遺伝子、種またはスプライス変異体である。典型的には、細胞表面に発現されたケモカイン受容体を介して、かかる複合体は１または１以上の白血球に標的化される。
本明細書において用いる場合、融合タンパク質は、少なくとも２つのポリペプチド成分、例えば標的化部分（すなわちケモカイン）および標的化物質、毒素および必要に応じてペプチドまたはポリペプチドリンカーを含有するポリペプチドを意味する。かかるタンパク質は、宿主細胞において複合体をコードする核酸の発現により産生することができる。
本明細書において用いる場合、標的化物質は、本明細書において規定されるように、標的化部分との連結により細胞内部に取り込まれることを意図し、なんらかの方法において取り込まれると、細胞代謝、生育、活性、生存度または細胞の他の特性または性質を変化させるまたはそれらに影響するいずれかの物質である。本明細書において標的化物質は改変毒素である。本明細書において提供する標的化物質の典型例は、SA1またはその活性断片であり、改変されたSA1ポリペプチドが含まれる。
本明細書において用いる場合、標的化物質を標的化することは、標的化物質を標的化部分に連結させることにより、標的化物質を選択された受容体を発現する細胞に方向付けることを意味する。受容体に結合すると、標的化物質または受容体結合部分に連結した標的化物質は、細胞により取り込まれる。
本明細書において用いる場合、「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」は、免疫系の一部として感染性疾患および外来物質に対して身体を防御するのを助けるいずれかの細胞を意味する。かかる細胞は、血中において、リンパ系において、および他の身体組織において見られるものを含む。これらは、白血球および他の組織常在細胞、例えばクッパー細胞、小膠細胞、肺胞マクロファージまたは他の組織に関連する免疫細胞を含むが、これらに限定されない。
本明細書において用いる場合、白血球は、身体の宿主免疫防御系に関与する白血球細胞を意味する。白血球は、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球（好塩基球、好酸球、好中球）、およびリンパ球（BおよびTリンパ球）を含むが、これらに限定されない。
本明細書において用いる場合、組織固有細胞（TRC）は、特定組織または器官に存在する、またはそれらに特異的な、特殊化細胞を意味する。多くの組織固有細胞は、特に特異的組織に関して、身体の免疫防御に関与する。かかるTRCには、肝臓のクッパー細胞、脳の小膠細胞および肺の肺胞マクロファージが含まれる
本明細書において用いる場合、免疫細胞または白血球に関して、活性化細胞は、刺激すると、刺激しない細胞と比較して変化した遺伝子発現特性を示す細胞を意味する。典型的には、かかる細胞は、可溶性または細胞表面結合ペプチドまたはポリペプチドメディエーター、例えば炎症性または他の免疫メディエーター、例えば、サイトカイン、ケモカインまたは他の化学伝達タンパク質またはそれらの受容体を分泌し、または産生し、またはそれらの発現を上方制御するものであり、それらの発現または産生は刺激前よりも増大する。
本明細書において用いる場合、標的化剤は、いずれかの細胞結合リガンドポリペプチド、またはその部分を意味し、細胞表面受容体に結合することにより標的細胞に結合し、次いで細胞に取り込まれる。標的化剤は、標的化される部分の取り込みを促進するいずれかの物質である。従って、それは、エンドサイトーシス細胞表面受容体に結合するいずれかの物質である。標的化部分は、いずれかの細胞受容体または細胞リガンドに結合するいずれかのポリペプチド、またはその部分を含み得るが、そのポリペプチドが細胞表面分子に結合した後に細胞に取り込まれることを条件とする。例えば、標的化部分は、抗体、増殖因子、サイトカイン、ケモカインその他を含むが、これらに限定されない。標的化剤の典型例は、ケモカイン受容体を標的とするものである。
本明細書において用いる場合、ケモカイン受容体は、タンパク質のケモカインファミリーの天然メンバーと特異的に相互作用し、かかる受容体を担持する細胞内にそのメンバーを輸送する受容体を意味する。これらは、CXCケモカインが結合する受容体（CXCR1-7、CXCR3AおよびCXCR3Bなど）、およびCCケモカインが結合する受容体（CCR1-10、CCR2AおよびCCR2Bなど）、および、いずれかのケモカインが特異的に結合し、連結した標的化物質の取り込みを促進する他のいずれかの受容体を含むが、これらに限定されない。
本明細書において用いる場合、ケモカイン受容体標的化剤は、細胞上のケモカイン受容体に特異的に結合し、連結したあるいは会合した標的化物質の内部取り込みを達成するいずれかの分子またはリガンドを意味する。ケモカイン受容体結合部分は、ケモカインが標的化され得る細胞表面タンパク質に結合することができ、リガンド含有融合タンパク質の細胞内への取り込みを促進することができる、いずれかのポリペプチドを含むが、これらに限定されない。かかるポリペプチドには、ケモカイン、抗体、またはそれらの断片が含まれるが、そのポリペプチドが１以上のケモカイン受容体に結合し、連結されたいずれかの標的化物質の取り込みを達成することを条件とする。１以上のケモカイン受容体に結合し、連結した標的化物質を細胞内に取り込むのに有効なポリペプチド、例えばケモカインまたは抗体の断片または部分の同定は、例えば、本明細書に記載の、または当業者に知られるいずれかのアッセイを用いて、細胞毒性物質に連結した断片を試験する、および細胞死を探すことにより、経験的に行うことができる。従って、ケモカイン受容体標的化剤は、ケモカインとして特徴付けられ、名付けられたあらゆるペプチドを含み、その完全長ケモカインが特異的に結合する細胞表面受容体またはタンパク質に、連結された標的化物質を方向付け、その受容体またはタンパク質が表面上に存在する細胞による取り込みを促進するまたは可能にするのに十分な本明細書に記載のクラス、およびそれらの切型および部分を含むが、これらに限定されない。
本明細書において用いる場合、「サイトカイン」なる用語は、インターロイキン、ケモカイン、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、増殖因子、アディポカインおよび受容体関連タンパク質、およびそれらの機能性断片を含むポリペプチドを意味する。本明細書の目的において、非ケモカインサイトカインは、あらゆるサイトカイン、最も典型的には古典的サイトカインを意味し、他の（古典的）サイトカインによっては一般に示されない化学誘引物質活性および他の活性を有するケモカインは含まない。しかし、当業者によって認識されている、および本明細書において下記に記載するように、ケモカインは、別個のクラスのポリペプチドである。
本明細書において用いる場合、ケモカインは、近くの細胞の移動または走化性を促進する細胞から分泌される小タンパク質のファミリーを意味する。いくつかのケモカインは、炎症促進性であると考えられ、免疫応答過程にて誘導され得、一方他のサイトカインは恒常性であると考えられている。典型的には、ケモカインは１以上のケモカイン受容体に結合することにより、それらの化学誘引物質機能および他の機能を発揮する。ケモカインは、天然起源から単離されたタンパク質、ならびに組換え方法または化学合成により合成的に作製されるものを含む。典型的なケモカイン（配列番号112-161に記載）には、MCP-1、エオタキシン、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、BCA-1、GCP-2、ENA-78、PBP、MIG、PF-4、PF-4var1、SDF-2、MCP-2、MCP-4、MIP-4、MIP-3β、MIP-2α、MIP-2β、MIP-5、HCC-1、RANTES、エオタキシン-2、TARC、I-309、リンホタクチン、ルングキン、C10、MIP-1γ、MCP-5、LEC、エクソダス-2、MIP-3、TECK、エオタキシン-3、CTACK、MEC、SCM-1β、I-TAC、BRAK、SR-PSOX、フラクタルカイン、LD78-β、MIP-1b2、および当業者に知られる他のケモカインが含まれるが、これらに限定されない。ケモカインを言及する場合、典型的にはかかるケモカインの単量体形態を含む。ケモカインはまた、二量体または他の多量体形態を含む。
ケモカインには、連結された標的化物質を、ケモカイン受容体を担持する細胞に標的化する能力を有するケモカインの変異体またはムテインが包含される。ケモカインのムテインはまた、複合体において用いるための標的化剤として考えられる。かかるムテインは、保存的アミノ酸変化、例えば以下の表1に記載のものを有し得る。かかるムテインをコードする核酸は、縮重コドンの置換により改変されない限り、少なくとも低ストリンジェンシーの条件下においてDNAに、一般に高ストリンジェンシーにて野生型タンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするであろう。タンパク質のムテインおよび改変型はまた、微量な対立遺伝子または種変異および残基の挿入または欠失を含むが、これらに限定されない。ケモカイン変異体の例は、配列番号170-191に記載している。アミノ酸の適切な保存的および非保存的置換は、当業者に知られており、一般に生じる分子の活性を変化させることなく作製することができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸の置換は、実質的に活性を変化させないと認識している（例えば、Watsonら、Molecular Biology of the Gene、第4版、1987、The Benjamin／Cummings Pub. co.、p.224を参照のこと）。かかる置換は以下に記載のものに従って作製することができる。
Figure 2011050388
他の置換も許容され、経験的に、または既知の保存的または非保存的置換に従って決定することができる。いずれかのかかるポリペプチドの改変は、当業者に知られるいずれかの方法によって達成することができる。
本明細書において用いる場合、ケモカインの部分は、単独にて、または別の断片もしくはケモカイン単量体との二量体として、連結された標的化物質の内部取り込みのためにケモカイン受容体に結合するのに十分なケモカインの断片または小片（piece）を意味する。ケモカインおよびケモカイン活性、特に走化活性の同定のための様々なインビトロアッセイが当業者に知られている（例えば、好中球の走化性の同定については、Walz et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:755; リンパ球の走化性のアッセイについては、Larsen et al. (1989) Science 243:1464およびCarr et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3652を参照のこと; 多数のアッセイが記載され、ケモカインを同定する方法を例証している、国際公開第99／33990号パンフレットも参照のこと）。かかるアッセイは、ケモカイン、改変されたケモカインおよびそれらの活性断片を同定するのに用いることができる。本明細書に記載の、および当業者に知られる結合アッセイは、ケモカイン受容体を特異的に認識する部分を同定するのに用いることができ、細胞毒性アッセイは、連結されたまたは会合した標的化物質の内部取り込みもするものを同定するのに用いることができる。
本明細書において用いる場合、ケモカインペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸は、かかるペプチドをコードすると本明細書において記載されているいずれかの核酸断片、当業者に知られるいずれかのかかる核酸断片、ケモカイン受容体に結合し、それにより内部に取り込まれるケモカインをコードするいずれかの核酸断片を意味し、プローブとして、前述のいずれかの核酸断片、または既知のケモカインペプチド（配列番号112-161、170-191に記載のものを含む）のいずれかをコードするいずれかの核酸断片、および前述のいずれかの核酸断片から縮重コドンの置換により産生することができるいずれかのDNA断片を用いて、ヒト細胞ライブラリーから単離することができる。ペプチド、例えばケモカインペプチドの完全アミノ酸配列、およびかかるペプチドをコードする一核酸断片を、ひとたび当業者が入手できれば、縮重コドンを置換すること、およびかかるペプチドをコードするいずれかの可能性ある核酸断片を産生することはルーチン的作業であると解される。アミノ酸配列に基づいてかかるペプチドをコードする核酸を合成することも一般に可能である。
本明細書において用いる場合、リンカーは、標的化剤（すなわちケモカインポリペプチド）を標的化物質に連結するペプチドまたは他の分子である。リンカーは、標的化物質がポリペプチドまたはペプチドであれば、標的化物質のN-またはC-末端またはいずれかの末端の近く、典型的には約20アミノ酸以内に存在する内部配列を介して結合することができる。典型的には、標的化物質がケモカインである場合、本明細書における連結はC-末端にある。本明細書において用いられるリンカーは、複合体の細胞内アベイラビリティー、血清安定性、特異性および溶解性を増大させる、または増大した可動性を提供する、または複合体内の立体障害を解放するために、複合体の成分を単に連結する働きをし得る。例えば、標的化物質の特異性または細胞内アベイラビリティーは、特定のプロテアーゼ、例えば正常細胞よりも腫瘍細胞に高レベルにて存在するプロテアーゼの基質であるリンカーを含むことにより得ることができる。
本明細書において用いる場合、ペプチドおよび／またはポリペプチドは、単量体がアミノ酸残基であり、それらがアミド結合を介して一緒に連結されている、ポリマーを意味し、あるいはポリペプチドと称する。アミノ酸がアルファ-アミノ酸である場合、L-光学異性体またはD-光学異性体のいずれかが用いられ得、L-異性体が好ましい。さらに、非天然アミノ酸、例えばベータ-アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンを含むことを意図する。好ましいアミノ酸はコード可能なものであるが、遺伝子にコードされていない一般に遭遇するアミノ酸も、本明細書において提供するリガンド-毒素キメラにおいて用いることができる。
本明細書において用いる場合、本明細書に表れる様々なアミノ酸配列に存在する「アミノ酸」は、それらの周知の３文字または１文字の略号に従って特定する（表1を参照のこと）。様々なDNA断片に存在するヌクレオチドは、当分野においてルーチン的に用いられている標準的な１文字命名法により命名する。
本明細書において用いる場合、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２またはそれ以上のアミノ酸を含有する。本明細書の目的において、アミノ酸は、20の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体（例えば、α-炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
本明細書において用いる場合、「アミノ酸残基」は、ポリペプチドの、そのペプチド結合における化学的消化（加水分解）によって形成されるアミノ酸を意味する。本明細書に記載のアミノ酸残基は、一般に「L」異性体型にある。「D」異性体型の残基は、所望の機能特性がそのポリペプチドに保持される限りは、いずれかのL-アミノ酸残基と置換することができる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を意味する。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシ基を意味する。J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) に記載され、37 C.F.R. SS1.821 - 1.822にて承認されている標準的なポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基の略号を表2に示す。
Figure 2011050388
本明細書において式によって表しているアミノ酸残基の配列は全て、アミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向において左から右への方向を有している。さらに、「アミノ酸残基」なる用語は、対応表（表2）に列挙したアミノ酸、および改変、非天然および異常アミノ酸、例えば37 C.F.R. SS1.821-1.822に記載のものを広く含むと定義し、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、アミノ酸残基配列のはじめの、または終わりのダッシュは、１以上のアミノ酸残基のさらなる配列、またはアミノ末端基、例えばNH2、またはカルボキシル末端基、例えばCOOHへのペプチド結合を示すことに留意されたい。
本明細書において用いる場合、「天然アミノ酸」は、ポリペプチドに表れる20のL-アミノ酸を意味する。
本明細書において用いる場合、「非天然アミノ酸」なる用語は、天然アミノ酸と同様の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に改変されたものである有機化合物を意味する。よって、非天然アミノ酸は、例えば、20の天然アミノ酸以外のアミノ酸または類似体を含み、アミノ酸のD-イソステレオマー（isostereomer）を含むが、これらに限定されない。典型的な非天然アミノ酸は当業者に知られている。
本明細書において用いる場合、ベクターまたはプラスミドは、異種性DNAの発現またはクローニングされた異種性DNAの複製のために異種性DNAを細胞へ導入するのに用いられる別個の要素を意味する。かかるベクターおよびプラスミドの選択および使用は十分に当業者のレベルの範囲内である。
本明細書において用いる場合、発現は、核酸がmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を意味する。核酸がゲノムDNAに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞または生物体が選択されるならば、mRNAのスプライシングを含み得る。
本明細書において用いる場合、発現ベクターは、DNA断片の発現を実行することができる調節配列、例えばプロモーター領域と作動可能に連結しているかかるDNA断片を発現することができるベクターを含む。よって、発現ベクターは、適切な宿主細胞へ導入すると、クローニングされたDNAの発現が起こる、組換えDNAまたはRNAコンストラクト、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターを意味する。適切な発現ベクターは、当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なもの、およびエピソーム性を保持するもの、または宿主細胞ゲノムに組み込むことができるものを含む。
本明細書において用いる場合、「ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列」なる用語は、転写およびその後の生じたmRNAの翻訳によりポリペプチドを産生する配列を意味する。
本明細書において用いる場合、「発現制御配列」なる用語は、ある核酸配列に作動可能に連結され、その核酸配列の発現を調節する、核酸配列を意味する。発現制御配列は、その発現制御配列が、ある核酸配列の転写、および必要に応じて翻訳を制御し、調節するならば、その核酸配列に作動可能に連結している。よって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわちATG）、イントロンおよびmRNAの適切な翻訳を可能にするためのタンパク質コード遺伝子の正しいリーディングフレームの整備のためのスプライシングシグナル、および終止コドンを含み得る。さらに、蛍光表示ポリペプチド、例えば緑色または青色蛍光タンパク質をコードするDNA配列を、陽性クローン（すなわち、所望のポリペプチドを発現するそれらの宿主細胞）を選択するために含めることができる。
本明細書において用いる場合、「宿主細胞」は、その中においてベクターが増殖し、その核酸が発現され得る細胞である。この用語はまた、対象宿主細胞のあらゆる子孫も含む。複製過程において突然変異が起こり得るので、全ての子孫が親細胞と同一ということはない可能性があると理解されたい。「宿主細胞」なる用語を用いる場合、かかる子孫も含まれる。
本明細書において用いる場合、分泌シグナルは、宿主の細胞質から周辺質空間へと、または細胞外培養培地へと前駆体タンパク質の分泌を方向付ける、その前駆体タンパク質内のペプチド領域を意味する。かかるシグナルは、前駆体タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに存在し得る。好ましい分泌シグナルは、アミノ末端に連結し、そのシグナルが連結したタンパク質に対して異種性であり得る。典型的には、シグナル配列は、細胞分泌経路を通る過程にて切断される。分泌されたタンパク質が所望の活性を保持する限りは、切断は必須ではない、または正確に位置する必要はない。
本明細書において用いる場合、トランスフェクションは、宿主細胞によるDNAまたはRNAの取り込みを意味する。形質転換は、そのDNAが染色体外要素として、または宿主の染色体DNAの一部として複製可能であるような様式にて行われるトランスフェクション過程を意味する。トランスフェクションおよび形質転換を達成するための方法および手段は、当業者によく知られている（例えば、Wigler et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-1376; Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110を参照のこと）。
本明細書において用いる場合、「機能性断片」なる用語は、規定の機能性アッセイによって同定することができ、細胞または細胞メカニズムまたは細胞活性における特定の生物学的、形態学的、または表現型の変化に関連する活性を有するポリペプチドを意味する。
本明細書において用いる場合、活性はインビトロおよび／またはインビボにおいて示されるポリペプチドのいずれかの活性を意味する。
本明細書において用いる場合、生物学的活性は、化合物のインビボ活性、または化合物、例えば本明細書において提供する複合体、組成物または他の混合物のインビボ投与によって生じる生理学的応答を意味する。よって、生物学的活性は、かかる化合物、組成物および混合物の治療効果および薬剤活性を包含する。しかし、かかる生物学的活性は、規定のアッセイにおいて測定される、特定のインビトロ活性に関して規定することができる。よって、例えば、本明細書において、ケモカイン単量体、二量体またはそれらの断片、またはケモカイン単量体および断片の他の組み合わせの生物学的活性を言及する際は、ケモカインの、ケモカイン受容体を担持する細胞への結合能および連結した物質を取り込ませる能力を意味する。かかる活性は、典型的には、インビトロにて、ケモカイン（二量体、単量体または断片）を細胞毒性物質、例えば改変された志賀A1サブユニットに連結させ、ケモカイン受容体を担持する細胞、例えば白血球を複合体に接触させ、細胞増殖または生育を評価することにより評価する。かかるインビトロ活性はインビボ活性に対して外挿的であるはずである。多数の動物モデルが参照され、本明細書に記載されている。
本明細書において用いる場合、生物学的に活性なる用語、または標的化剤から構成される複合体、例えばケモカインおよび標的化物質、例えば改変された志賀-A1サブユニットを含有する複合体の生物学的活性を言及する際は、その事例において、インビボまたはインビトロにてリボソームを不活性化することによりタンパク質合成を酵素学的に阻害する、または細胞による毒素含有ポリペプチドの取り込みにより細胞の生育を阻害するもしくは細胞を殺す、かかるポリペプチドの能力を意味する。かかる生物学的または細胞毒性活性は、当業者に知られるいずれかの方法によりアッセイすることができ、タンパク質合成を測定するインビトロアッセイ、および細胞増殖に対する、またはタンパク質合成に対する試験化合物の作用を測定することにより、細胞毒性を評価するインビボアッセイが含まれるが、これらに限定されない。しかし、特に好ましいのは、標的細胞において細胞毒性を評価するアッセイである。
本明細書において用いる場合、標的受容体に特異的に結合することは、受容体に対する、内部取り込みを達成するのに十分な親和性により結合することを意味する。典型的には、107 l／mol、108 l／molより高い親和性（Ka）により結合する。
本明細書において用いる場合、受容体に結合することは、かかる受容体を特異的に認識し、特異的に結合する、または標準的なインビトロアッセイによるアッセイにおいて検出可能な程度に結合する、リガンドの能力を意味する。例えば、結合により、ケモカイン複合体、ケモカイン単量体、または他のケモカイン受容体標的化剤の、かかるケモカイン受容体を発現することが知られる細胞上のケモカイン受容体を認識する能力が測られる。かかる細胞は、細胞株または様々な初代白血球細胞のサブタイプ、例えば、限定しないが、小膠細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、B細胞、肥満細胞、樹状細胞およびT細胞、または他の組織固有細胞、または十分に記載されているリガンド-受容体結合アッセイ、走化性アッセイ、病理組織学的分析、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡解析、および当業者に知られるおよび／または本明細書において例証されている他のアッセイを用いるかかる細胞の活性化型を含む。
本明細書において用いる場合、培養は、それらの生育、およびそれらのあらゆる継代培養を助ける培地における細胞の増殖を意味する。継代培養物なる用語は、別の培養物（起源培養物）の細胞から生育させた細胞の培養物、または起源培養物のいずれかの継代培養物を意味し、目的の継代培養物と起源培養物の間において行われた継代の数にかかわらない。「培養すること」なる用語は、かかる培養物を増殖させる過程を意味する。
本明細書において用いる場合、組成物は、２またはそれ以上の産物または化合物（例えば、剤、調節剤、レギュレーターなど）のいずれかの混合物を意味する。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性製剤またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。
本明細書において用いる場合、組み合わせは、２またはそれ以上の物質間におけるいずれかの集まりを意味する。
本明細書において用いる場合、特定の疾患を処置するための化合物の有効量は、疾患に関連する症状を寛解させる、または何らかの様式において減少させるのに十分な量である。かかる量は、単回用量として投与することができ、または投与計画に従って有効となるように投与することができる。その量は、疾患を治癒させることができるが、典型的には、疾患の症状を寛解させるために投与する。症状の所望の寛解を達成するには、繰り返し投与が必要であり得る。
本明細書において用いる場合、複合体の製薬的に許容される塩、エステルまたは他の誘導体は、かかる誘導体化のための既知の方法であって、実質的な毒性作用を伴わず動物またはヒトに投与できる、製薬的に活性である、またはプロドラッグである化合物を生産する方法を用いて、当業者により容易に調製することができるいずれかの塩、エステルまたは誘導体を含む。
本明細書において用いる場合、治療は、状態、障害または疾患の症状が寛解する、あるいは有利に変化するいずれかの様式を意味する。治療はまた、本明細書の組成物のいずれかの製薬学的使用を包含する。
本明細書において用いる場合、特定の医薬組成物の投与による特定障害の症状の寛解は、永続的であるか、または一時的であるか、持続性であるか、または一過性であるかによらず、組成物の投与が引き起こし得る、または投与が関係し得るいずれかの軽減を意味する。
本明細書において用いる場合、「対象」なる用語は動物を意味し、哺乳類、例えばヒトを含む。
本明細書において用いる場合、患者はヒト対象を意味する。
本明細書において用いる場合、「抗体」なる用語は、本明細書において用いる場合、エピトープの決定基と結合することができる、インタクトな分子ならびにそれらの機能性断片、例えばFab、F(ab’)2、およびFvを含む。これらの機能性抗体断片は、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合するいくらかの能力を保持し、以下のように規定される：
（1）Fab、抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片、酵素パパインにより完全抗体を消化し、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の部分を生じることにより、産生され得る；
（2）Fab’、完全抗体をペプシンにより処理し、次いで還元し、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じることにより得ることがきる抗体分子の断片;１抗体分子につき２つのFab’断片が得られる；
（3）F(ab’)2、完全抗体を酵素ペプシンにより処理し、その後還元を行わないで得ることができる抗体の断片;F(ab’)2は２つのFab’断片が２つのジスルフィド結合によりまとまった二量体である；
（4）Fv、２つの鎖として発現される、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に生産された断片と定義される;および
（5）単鎖抗体（「SCA」）、遺伝学的に融合された単鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に生産された分子。
これらの断片を作製する方法は、当分野において知られている（例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1988（参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
本明細書において用いる場合、「エピトープ」なる用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上のいずれかの抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、分子、例えばアミノ酸または炭水化物側鎖の化学的に活性な表面グループを含有し、通常、固有の３次元構造特性ならびに固有の電荷特性を有する。
本明細書において用いる場合、単数形の「a」「an」および「the」は、格別に断りのない限り、複数の対象も含む。従って、例えば、化合物を言及する際、「細胞外ドメインを含む」は、１つまたは複数の細胞外ドメインを有する化合物を含む。
本明細書において用いる場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲、と表し得る。約はまた、正確な量も含む。よって「約5塩基」は、「約5塩基」および「5塩基」を意味する。
本明細書において用いる場合、「任意の」または「必要に応じて」は、その後に記載された事象または状況が起こることまたは起こらないこと、およびその記載がその事象または状況が起こる事例、および起こらない事例を含むことを意味する。例えば、必要に応じて置換された基は、その基が置換されていない、または置換されていることを意味する。
本明細書において用いる場合、いずれかの保護基、アミノ酸および他の化合物についての略称は、格別に断りのない限り、一般的な用法に従い、認知された略称であり、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature（1972）Biochem., 11: 942-944にある。
B． リボソーム不活性化タンパク質（RIP）、それらの選択、発現および生産
減少した毒性を有するリボソーム不活性化タンパク質（RIP）毒素について、選択する、同定する、精製する、および／または単離する方法、それにより生じた改変RIP、ならびにRIPおよび改変RIPおよびそれらの複合体を発現する方法を提供する。毒性は、そのタンパク質の発現を増加させるのに十分な程度に減少しているが、RIPが（細胞を阻害するまたは殺す）治療効果を示すのに十分な毒性は保持されている。RIPは非常に毒性であるので、活性が10倍、100倍、1000倍またはそれ以上減少することは、細胞を阻害するまたは殺す、または細胞代謝に影響するための複合体における毒素としてのその毒素の用途には実質的に影響を与えない。
本明細書において提供する方法は、RIP毒素の選択を調節する、およびそれらの高収率生産を増加させるために、RIP阻害剤、例えば4-アミノピラゾロ[3, 4-d]-ピリミジン（4-APP）を用いる。また、毒性活性を発揮するのに十分な改変RIPの全部または一部を含有するリガンド-毒素複合体、例えば本明細書において提供するいずれかのものを提供する。選択された改変RIP、および改変RIPを含有する複合体は、宿主細胞に対し、より少ない毒性を示し、これによりそれらが発現した後に増大した収率のタンパク質産物が得られる。この増大した収率は、記述したように、および下記に詳述するように、より少ない固有の毒性および／または4-APPによる活性の阻害と関連している。
RIPは、真核および原核リボソームRNA（rRNA）を脱プリン化し、タンパク質合成阻害を生じることにより、細胞毒性および細胞死を促進する毒素である。一般に、リシンおよび志賀毒素を含むRIPは、真核リボソームに対する毒性活性を有する。しかし、いくつかのRIPは、真核および原核リボソームを攻撃することができる。これらは、例えば、志賀毒素を含み、大腸菌細胞に対して毒性を示す（Skinner and Jackson, Microb. Pathol., 24: 117-22, 1998; Suh et al. (1998) Biochemistry 37: 9394-8）。よって、RIPの発現、および従ってそれらの高収率のタンパク質生産は、それらの組換えタンパク質発現に用いた原核または真核宿主細胞の一方または両方に対するRIPの細胞毒性作用により、しばしば妨害される。
RIPの真核細胞に対する一般的な毒性のために、RIP、またはRIPを含有する複合体は、典型的には大腸菌において生産される。例えば、いくつかのRIP含有融合タンパク質は以前は大腸菌において発現されていた。これらには、例えば、毒素部分としてのサポリン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、または志賀毒素との融合体が含まれる。一般に、比較的低レベルの発現が得られる。いくつかの場合において、これは、細胞生存能を妨げるのに十分な量の毒素を放出する、漏出性プロモーター系に起因する。発現を最適化するための戦略が採用されてきた。
一般に、誘導系を用いて、宿主細胞が十分に生育するまで発現を抑制する。これは、毒素の誘導が宿主培養物を殺し始める前にその形質転換細胞の十分な生育が起こり得るようにするきつく制御された方法を可能にし、これによりRIP毒素の全体の生産が制限される。例えば、毒素またはそれらの複合体の生産のための標準的な方法は、形質転換された大腸菌BL21（DE3）細胞において、イソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）による誘導の後、T7後期プロモーターの制御下における発現を介する。この系において、RIPまたはそれらの複合体の発現は、BL21(DE3)pLysS 細菌細胞を用いてさらに最適化され、誘導なしにpETベクターからの発現が強力に阻止される（Joshi et al. (2005), Prot. Exp. Purif., 39:189-198）。両方の系において、生じたタンパク質は、封入体と関連して細胞内に留まり、精製の際に変性および再生工程が必要である（Barth et al. (2000) App Environ. Microbiol, 66:1572-1579）。他の誘導系も用いられてきた。例えば、ミラビリス属（Mirabilis）抗ウイルスタンパク質（MAP）の遺伝子を温度制御性プロモーターの制御下において発現させ、これにより88-10992の対数期において30から42℃へと培養温度を上昇させることによってMAP遺伝子の発現が誘導される。しばしば、そのような誘導性の系を用いても、RIPは宿主細胞に対して毒性であり得る。いくつかの場合、形質転換体を全く得ることができず、または形質転換体が非常に乏しく生育し、これは、その誘導性の系が漏出性である、および／または産物の毒素部分が宿主細胞を殺すことに関与できることを示している。
活性タンパク質の発現および／または収率を増加させるために他の戦略も用いられた。一例において、発現ベクターは、宿主細胞リボソームに対する毒性作用を減少させるために宿主のサイトゾルからのタンパク質産物の分泌を素早く達成するように設計することができる。例えば、大腸菌においてタンパク質を分泌するためには、シグナル配列が必要である。OmpAは、大腸菌における主要な外膜タンパク質であり、大腸菌により大量に産生され、分泌される（Habuka et al. (1990) J. Biol. Chem., 265:10988-10992）。よって、MAPタンパク質の分泌および生産は、大腸菌OmpAのシグナル配列をMAPをコードする配列に作動可能に連結させることにより達成された。他の場合において、RIP、またはRIPを含有する複合体は、他の細菌発現系、例えば毒素の周辺質発現を導く系などを用いて発現された。細菌の細胞質とは対照的に、細菌の周辺質は、いくつかのタンパク質の天然立体構造に必要なジスルフィド結合の形成が可能になる、非還元性の環境である。この戦略はジスルフィド結合形成が必要なそれらのタンパク質に有利であり得るが、周辺質環境におけるタンパク質の不溶性は、タンパク質収率に影響し得、これにより発現および精製過程において適合性の溶質を使用することが要求される（Barth et al. (2000) App Environ. Microbiol, 66:1572-1579）。RIP、またはRIPを含有する複合体は、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）においても発現されたが、これには酵母における異種性発現を最適化するために合成遺伝子の新規設計および構成が必要である（Gurkan et al. (2005) Microbial Cell Factories, 4:33）。
上記のそれぞれの戦略を組み合わせると、用いるRIPまたは宿主細胞によって時折またはいくらか効果的であるが、多くの場合、宿主細胞はRIPの毒性作用に対して感受性であり続ける。そのような場合、宿主細胞から毒素を発現させ、生産するために、他の戦略が用いられたが、それぞれが各々の限界を有している。例えば、Fabriniiら（FASEB J. 14:391-398 (2000)）は、宿主リボソームを不活性化から保護し、一方、合成されたポリペプチドの大部分が依然として生物学的に活性な形態にて分泌されることを可能とするために、真核細胞において中和剤として抗RIP抗体を使用することを提案した。サポリン（SAP）複合体の作製に中和するための抗SAP抗体が用いられたが、そのような戦略は宿主細胞において抗RIP抗体断片の恒常的かつ安定な発現を必要とする。
よって、本明細書において、RIPが原核および真核宿主細胞に対するそれらの毒性作用を媒介するN-グリコシダーゼメカニズムを利用して、これらの制限を克服するための、RIP、またはRIPを含有するリガンド-毒素複合体を生産する方法を提供する。インビトロリボソーム不活性化、例えば、4-アミノピラゾロ[3,4-d]-ピリミジン (4-APP)による阻害などにより測定にすると、アデニンおよびそれらのいくつかの類似体は、RIP活性を阻害することができる（Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Res., 28: 2383-8; Brigotti et al. (2000) Life Sci., 68: 331-6）。細胞発現クローン、例えば、細菌クローンの選択において、また毒素およびリガンド-毒素複合体分子、例えば、白血球集団調節剤（LPM）などの大規模発現においてアデニン類似体（例えば4-APP）の使用を採用できることが本明細書において認められる。
本明細書において提供する方法は、1）宿主細胞に対して減少した毒性を示すが、十分な毒性活性を維持する改変RIP毒素について選択するために設計され、その選択はアデニン類似体の存在下において調節され得、および2）宿主細胞において、１以上のアデニン類似体の存在下にて、選択された改変RIP毒素、または改変RIP毒素を含有する複合体を発現するように設計される。かかる方法は、選択改変RIP毒素の同定を可能にし、これを試験して、標的宿主細胞リボソームに対して十分な毒性活性を保持する改変RIP毒素を同定することができる。さらに、本明細書において、１以上のRIP阻害剤、例えば4-APPの存在下において、RIP毒素、およびRIP毒素を含有する複合体の大規模発現および生産を可能にする方法を提供する。
従って、本方法は、宿主である発現細菌株に対して減少した細胞毒性を示す改変RIP毒素を含有するリガンド-毒素複合体の設計に用いることができる改変RIP毒素の同定を可能にし、これにより、前臨床および臨床研究において用いるために、より多い量の産物を生産するための、生存可能な発現戦略を提供する。疾患および障害、例えば、二次組織損傷を含む炎症反応を促進する、細胞の増殖、遊走および／または生理活性と関連する炎症性疾患状態を処置することにおける改変されたリガンド-毒素複合体の適性は、活性または生物学的活性を評価するインビトロおよびインビボアッセイを用いて評価することができる。
C. リボソーム不活性化タンパク質（RIP）および作用方法
リボソーム不活性化タンパク質（RIP）は、保存されたメカニズムを介する真核および原核タンパク質合成の強力な阻害剤である、植物、真菌および細菌において発現されるタンパク質のクラスである。RIPは、N-グリコシダーゼまたはポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼであり、リボソームおよび非リボソーム核酸基質を不活性化することができる。RIPは、２つのグループに分類される。I型RIP（ホロ-RIPとも呼ばれる;すなわち、トリコサンチンおよびルフィン）は、リボソーム不活性化活性を有する約30kDaの単一のポリペプチド鎖を持つ。II型RIP（キメラ-RIPとも呼ばれる;すなわちリシン、アブリン、ならびに細菌毒素、例えば志賀毒素）は、ジスルフィド結合により連結されたA（通常単一サブユニット）およびB（単一または多サブユニット）と表される、２つのポリペプチド鎖または種を含有する。II型RIPのB鎖は、細胞への侵入に必要であるが、細胞侵入を達成するポリペプチドにより置換することができる。I型またはII型ファミリーのいずれにも当てはまらない他のRIPの例もある。これらは、A鎖のみを含有するが、タンパク質分解過程を必要とする２つの鎖のI型RIPと呼ばれるもの、およびオオムギRIPJIP60と構造的におよび機能的に関連するタンパク質であるIII型RIPタンパク質と呼ばれるものである（Peumans et al. (2001) The FASEB Journal, 15: 1493）。
II型RIPのB鎖は、細胞表面上のガラクトース含有受容体に結合し、A鎖を細胞質へ侵入させることができ、そこでそれらはリボソームを不活性化する。典型的には、II型RIPは、A鎖およびB鎖を含有するプレプロポリペプチドとして合成される。プレプロポリペプチドを小胞体（ER）へと標的化した後、シグナル配列は切断され、プロポリペプチドが生じる。ERにおいて、タンパク質の２つの鎖の間にジスルフィド結合形成が起こり、N-グリコシル化が起こる。プロポリペプチドはゴルジ体を通してプロテインボディー内へ輸送され、プロテインボディー内のエンドペプチダーゼによりタンパク質分解的に切断される。エンドペプチダーゼはプロポリペプチドをA鎖およびB鎖または依然として単一のジスルフィド結合により連結されている鎖へと開裂する。この様式にてRIPが加工されることで、毒素が合成および輸送過程において、例えばサイトゾルに漏出することにより、自身の宿主細胞リボソームを毒することは確実に回避される。
RIPの毒性活性には、触媒サブユニットが宿主細胞のサイトゾルへ取り込まれることが必要である。II型RIPの細胞への侵入は、Bサブユニットにより促進され、一方I型RIPは、血行性の、組織に存在する、固有の組織細胞により特異的に認識されず、II型RIPよりも毒性活性の効率が低い。毒素の内部取り込みについて、様々な細胞侵入メカニズムが存在し、クラスリン依存性およびクラスリン非依存性エンドサイトーシス、カベオラ非依存性エンドサイトーシス、およびマクロピノサイトーシスなどがあるが、これらに限定されない。さらに、細胞内に侵入する際に、毒素は多用なメカニズムを介してサイトゾルへと輸送される（Sandvig et al. (2005) Gene Therapy, 12: 865-872）。ひとたびサイトゾルの内部に入ると、RIPはリボソームの脱プリン化を触媒し、これによりタンパク質合成を崩壊させる。
I型RIP、およびII型RIPのA鎖は、真核および原核リボソームの28S rRNAから特定のアデニンを除去することによりタンパク質合成を阻害することによって、これらの毒素の酵素活性を生じさせている。一般に、II型RIPは、真核リボソームに対してのみ活性であると考えられ、一方、I型RIPは真核および原核リボソームに対して活性である。いくつかのII型RIP、例えば志賀毒素（STX）なども、原核リボソームを阻害する（Skinner et al. (1998), Microbial Pathogenesis, 24: 117-122）。
単一の鎖（I型）または２つの鎖（II型、A鎖により媒介される）のいずれかのRIPの毒性活性は、タンパク質のN-グリコシダーゼ活性により媒介される。この酵素活性により、主要rRNAの普遍的に保存されたGAGAテトラループ（アルファ-サルシン／リシンループとも呼ばれる）における正確な位置のアデノシン（ラットの肝臓28S rRNAの場合A4324、大腸菌rRNAのA2660）から１つのアデニンの除去が起こる（例えば、Endo et al. (1987) J. Biol. Chem., 262:8128; Barbieri et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta., 1154:237; Sandvig et al. (2001) Toxicon, 39: 1629-1635; Ippoliti et al. (2004) The Italian Journal of Biochemistry, 53: 92; Stirpe and Battelli, Cell Mol Life Sci., 63: 1850-66, 2006を参照）。アデニン塩基の除去により、リボソームは伸長因子2に結合できなくなり、よってRNA翻訳が打ち切られてしまう。GAGA配列は原核および真核リボソームに存在する。
RIP毒素の酵素活性は、触媒鎖とリボソームタンパク質との相互作用により媒介される。アデニンとの相互作用は、毒素タンパク質の活性部位クレフトにおいて起こる。基質結合における毒素間の差異は、活性部位クレフトにおけるアミノ酸の差異に起因し得る。例えば、X線の結晶学データは、StxとリシンのAサブユニットでは活性部位クレフトは類似することを示すが、これらのタンパク質の活性部位には少なくとも７つの不変残基が存在する（Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Research, 28:2383-2388）。さらに、毒素間における、真核と原核細胞との間の基質特異性の差異は、異なるリボソームタンパク質と相互作用するRIPの能力の違いに起因すると考えられる。例えば、ラットの肝臓タンパク質L9およびL10eはリシンA鎖の結合標的であるが、リボソームタンパク質L3はヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（PAP）の結合因子である。L3は高度に保存されたリボソームタンパク質であり、このことは異なる種のリボソームに対するPAPの広範な特異性を説明している（Peuman et al. (2001) The FASEB Journal, 15: 1493-1496）。アデニンの除去はrRNAの立体構造変化を引き起こし、伸長因子2の結合を妨げる。それ故に、脱プリン化されたリボソームは、新生ペプチド鎖を伸長させることができない。
リボソームを不活性化し、タンパク質合成を阻害することに加えて、RIPはまた、rRNA以外の他の基質と相互作用することによる他の機能を有する。RIPは、DNA、mRNA、およびウイルスのポリヌクレオチドを脱プリン化することができる（Ippoliti et al. (2004) The Italian Journal of Biochemistry, 53: 92; Parikh et al. (2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4:523-543）。それ故、N-グリコシダーゼ活性に加えて、RIPは、アデニン含有ポリヌクレオチド、一本鎖DNA、二本鎖DNA、およびmRNAを脱アデニル化する能力に起因する、ポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性を有することが実証されている。例えば、RIPは、スーパーコイルDNA（例えば、Li et al. (1991) Nucleic Acid Res., 22:6309; Ling et al. (1994) FEBS Lett., 345:143; Roncuzzi et al. (1996) FEBS Lett., 392:16）および断片ゲノムDNA（Bagga et al. (2003) J Biol. Chem., 278:4813-4820を参照）を分解することが報告されている。さらに、いくつかのRIPは、リボソームから１より多いアデニン残基を放出し（Barbieri et al. (1992) Biochem. J., 286:1）、ウイルスRNAを含む、リボソームRNA以外のRNA種に作用し、またはポリ(A)およびDNAにも作用する（Barbieri et al. (1994) Nature, 372:624; Stirpe et al. (1996) FEBS Lett., 382:309; Picard et al. (2005) J Biol. Chem., 280:20069-20075）。さらに、いくつかのRIPは、HIV-1インテグラーゼの3’末端プロセシングおよび鎖移転活性を阻害し、よって、ウイルスゲノムの宿主細胞ゲノムへの挿入を阻害することが示されている（Au et al., FEBS Lett, 471: 169-72, 2000）。それ故、ウイルスの増殖が阻害される。結果として、いくつかのRIPは、リボソームの不活性化によるタンパク質合成阻害に加えて、または代わりに、抗ウイルス活性を示す（Parikh et al. (2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4:523-543; Erice et al. (1993) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37: 835-838）。よって、全てではないかもしれないが、多くのRIPは、１以上のN-グリコシダーゼ活性、RNase活性、DNase活性、および他の活性、例えば、限定しないが、スーパーオキシドディスムターゼ、ホスホリパーゼ活性、キチナーゼ活性および抗ウイルス活性を有する（Park et al. (2004) Planta, 219:1093-1096; Bagga et al. (2003) J Biol. Chem., 278:4813-4820; Parikh et al. (2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4:523-543; Au et al., FEBS Lett, 471: 169-72, 2000）。
1.例示的な RIP
例えば、毒素またはその複合体の生産の向上、またはリガンド-毒素 複合体の作成における、毒性が低減した改変毒素の選択のための本明細書において提供する方法において用いられる例示的な毒素は、rRNAの脱プリンを介するN-グリコシダーゼ 酵素活性に起因する細胞毒性を示すいずれの毒素であってもよい。かかる毒素は当業者に知られており、典型的にはRIP ファミリーの毒素を含む。例えば、400を超えるRIPが提案されており、そのなかでも50を超えるI型RIPおよび 15のII型RIPが配列決定および/またはクローニングされている(Peumans et al. (2001) The FASEB Journal、15: 1493)。例示的なI型RIPとしては、これらに限定されないが、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP、アスパリン-1、およびアスパリン 2が挙げられる。例示的な II型RIPとしては、これらに限定されないが、ボルケンシン、リシン、志賀毒素、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンが挙げられる。一般に、A-鎖、またはその活性の断片が、II型RIPの酵素活性に十分である。
様々な RIP 毒素 ポリペプチドの議論は提供される態様の範囲を限定する意味ではない。当業者に知られたいずれのRIP ポリペプチド、またはここで次いで同定されるものが、本明細書において提供する方法に含まれることを理解されたい。当業者はRIP 毒素の同定および機能的特徴決定に精通している。例示的な RIP 毒素 ポリペプチドとその対応する配列番号のリストを表3に示す。
表 3: 例示的な RIP 毒素
Figure 2011050388
Figure 2011050388
志賀毒素
志賀毒素(STX)は、細菌によって生産されるRIP タンパク質のファミリーである。志賀毒素は、３つの異なる群に分類される。志賀毒素 (Stx)は志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)によって生産され、５つの7.7 kDa B サブユニット (StxB)の環と非共有結合により結合している32-kDa 酵素 A サブユニット (StxA)を含むII型RIP タンパク質である。Stxは大腸菌によって生産される志賀様毒素 1(Stx1、ベロ毒素、SLT1またはVT1とも称される)とアミノ酸 配列において同一である。StxおよびStx1のA-鎖 前駆体は315 アミノ酸長であり (配列番号1に示す)、配列番号1のアミノ酸1-22に対応する22 アミノ酸の長さのシグナル 配列を含む。成熟 Stx/Stx1 A 鎖は 293 アミノ酸長であり、配列番号1 のアミノ酸23-315 に対応し、配列番号5に示す。第３のStxは志賀様毒素 2 (Stx2、ベロ毒素 2、SLT2またはVT2とも称される)であり、これは、StxおよびStx1と比較して異なる配列を示す。Stx2 のA-鎖 前駆体は 319 アミノ酸の長さであり(配列番号3に示す)、配列番号3のアミノ酸 1-22に対応する22 アミノ酸の長さのシグナル 配列を含む。成熟 Stx2 A 鎖は297 アミノ酸の長さであり、配列番号3のアミノ酸23-319に対応する。Stx/Stx1および Stx2のB サブユニットは 89 アミノ酸の長さである (それぞれ配列番号2および4に示す)。志賀様毒素は、Citrobacter freundii、Aeromononas hydrophila、Aeromononas caviae、およびEnterobacter cloacaeにおいても生産されることが報告されている (Sandvig et al. (2001) Toxicon、39: 1629-1635)。
StxのA 鎖(StxA)は、配列番号5に示す配列のC242およびC261 (配列番号1に示す配列のC264および C283にそれぞれ対応する)の間に形成される内部ジスルフィド結合を含む酵素的に活性の A 断片を有する。配列番号5における、２つのシステインの間のループ内に位置する配列 248Arg-Val-Ala-Arg251 がトリプシンまたは細胞内プロテアーゼであるフリンによって認識される。フリン（Furin)はトランスゴルジ網 (TGN)およびエンドソームにおいてみられ、おそらくその翻訳後プロセシングの際にStxAを切断する。トリプシンまたはフリンは配列番号5 に示す配列におけるArg251のCOOH-末端側にてStxAを切断し、A-鎖をA1およびA2 断片に分離する(Sandvig et al. (2001) Toxicon、39: 1629-1635; Garred et al. (1995) J Biol. Chem.、270: 10817-10821)。したがって、Stxの切断されたA1 断片(SA1)は配列番号5に示すアミノ酸配列のアミノ酸 1から251に対応し、StxのA2 断片(SA2)はアミノ酸 252-293に対応する。
フリンによる切断はA1 断片 (SA1)を活性化する。A1 ドメインはERを通る輸送までC242およびC261の間のジスルフィド結合によってA2/B サブユニットに結合したままであり、ERを通る輸送においてジスルフィド結合が還元され、A1 断片がサイトゾルへと逆に移動することが可能となる(LaPointe et al. (2005) J Biol. Chem.、280:23310-8)。Stx のA1 断片はインタクトな Stx タンパク質と比較して6-から400-倍活性が高い(Suh et al. (1998) Biochemistry、37:9394-9398)。したがって、SA1はRIP 酵素活性を含み、 60S リボソーム サブユニットの28S RNAの脱プリンによるタンパク質 合成の阻害を担う。A1 鎖の最初の239 アミノ酸 はStxA1 RIP ドメインの最小の触媒活性領域を表す(LaPointe et al. (2005) J Biol. Chem.、280:23310-8)。触媒活性を保持するSA1 切断型としては、例えば、配列番号22に示し、配列番号23に示すヌクレオチド配列によってコードされる変異体 1 SA1 配列および、配列番号24に示し、配列番号25に示すヌクレオチド配列によってコードされる変異体 2 配列が挙げられる。
その他のRIPと同様に、Stx の活性のSA1 サブユニットは真核リボソームを攻撃する;しかし、それはまた、細菌 リボソームに対する活性も有する。例えば、様々なグループが大腸菌 細胞の生育がSA1の存在下で低下することを報告している (例えば、Skinner et al. (1998) Microbial Pathogenesis、24:117-122; Suh et al. (1998) Biochemistry、37:9394-9398参照)。SA1の原核細胞に対する毒性活性は、細胞質における毒素の発現を必要とし、それは例えばそのネイティブな シグナル 配列の非存在による; Stx-媒介毒性はそのシグナル 配列による周辺質へのSA1の排出の後には細胞において観察されない。原核細胞に対するSA1の毒性活性は、その真核細胞に対する毒性活性に匹敵する。その他のRIPもまた、原核細胞を標的とし、例えば、植物 RIPである PAP および MAPが挙げられ、ただしほとんどの場合にはかかる植物 RIPSの毒性活性は真核 リボソームに対して約 100 倍以上効率が高い(Suh et al. (1998) Biochemistry、37:9394-9398)。一方、その他のRIP、例えば RTA (リシンの酵素 サブユニット)は原核細胞に対する毒性を示さない。
2.RIP 毒素阻害剤
毒性RIPを不活性化する阻害剤は知られているかまたは同定することができる。かかる阻害剤の研究により、毒素の活性部位の構造に関する洞察が提供された。さらに、様々な理由によりRIP 阻害剤を同定および開発することに興味がもたれており、例えば、これらに限定されないが、診断目的、毒物の解毒剤またはRIPを発現する細菌によって引き起こされる感染における予防および治療薬が挙げられる(Brigotti et al. (2000) Life Sciences、68: 331-336、米国特許出願第6,562,969号)。いくつかのRIP 阻害剤はRIP 毒素の保存された N-グリコシダーゼ 活性を標的とする。かかるRIP 毒素 阻害剤としては、 RIP-特異的オリゴヌクレオチド 阻害剤、例えば RNA アプタマー(例えば、Hesselberth et al. (2000) J. Biol. Chem.、275:4937-4942; Hirao et al. (2000) J. Biol. Chem.、275: 4943-4948を参照)、 RIP-特異的抗体、および/またはアデニン 異性体、例えば、アデニン、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)、およびその他の類似の異性体が挙げられる(Pallanca et al. (1998) Biochimica et Biophysica Acta、1384: 277-284; Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Research、28: 2383-2388; Brigotti et al. (2000) Life Sci.、68: 331-6; 米国特許出願第6,562,969号)。
4-APP およびその他の アデニン 類似体
アデニンはRIP 毒素の天然基質における塩基である(即ち、 GAGAのループ 配列における最初のアデニン 塩基)。したがって、アデニンおよびその類似体は、RNA N-グリコシダーゼ 活性の阻害剤として作用することによりRIP 毒性活性を阻害する (Pallanca et al. (1998) Biochimica et Biophysica Acta、1384: 277-284; Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Research、28: 2383-2388; Brigotti et al. (2000) Life Sci.、68: 331-6)。典型的には、アデニン 類似体には、一方の環が6-アミノピリミジンであって、他方の環が少なくとも ２つの隣接する 炭素原子を含む5-員複素環、例えばこれらに限定されないが、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フランおよびチオフェンであるあらゆる縮合二環式化合物が含まれる。典型的には、環の縮合は6-アミノピリミジンの4位と5 位における炭素原子および5員環のいずれかの２つの隣接する 炭素原子の間で、いずれかの結合様式で起こる。これには、例えば、5員環がイミダゾール 立体配置であるアデニン自体が含まれる。アデニンの構造は以下の通りである:
Figure 2011050388
さらに、かかる類似体はまた、イミダゾール からピラゾール 立体配置までの5員環の窒素原子のあらゆる再編成を含み、例えば、4-APPおよびホルマイシン 塩基が挙げられ、これらは6-アミノピリミジンの5員 ピラゾール 環への結合様式においてのみ異なる (例えば、Brigotti et al. (2000) Life Sci.、68: 331-6参照)。さらに本明細書において提供する阻害剤には、ホルマイシン A 塩基のリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド 類似体が含まれ、例えばホルマイシン A 塩基のリボヌクレオチド5’モノ-、5’ジ-、5’トリおよび3’一リン酸 類似体ならびにホルマイシン Aのデオキシリボヌクレオチド5’モノ-、5’ ジ-、5’ トリおよび3’ 一リン酸 類似体またはその他の類似または既知の化合物、例えば本明細書で以後同定されるものが挙げられる (例えば、米国特許出願第6,562,969号参照)。4-APPおよびホルマイシン A 塩基の構造は以下の通りである:
Figure 2011050388
RIP 毒素の保存された N-グリコシダーゼ 活性にもかかわらず、アデニンおよびアデニンの類似体、例えば 4-APPは、リボソームをRIPによる不活性化から保護する様々な異なる能力を示す (Pallanca et al. (1998) Biochimica et Biophysica Acta、1384: 277-284; Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Research、28: 2383-2388; Brigotti et al. (2000) Life Sci.、68: 331-6)。例えば、4-APPはStx、モモルディン 、およびその他の 植物 RIPの強力な阻害剤であるが、リシンに対してはほとんど阻害を示さない。さらに、4-APPはアデニンよりもStxに対するより大きな阻害活性を示すが、4-APPおよびアデニンはRIP 毒素 モモルディン に対しては同等の阻害活性を示す。また、アデニンはリシンによる不活性化からリボソームを保護するが、4-APPはリシンの毒性活性に対してほとんど阻害作用を示さない。したがって、RIP 毒素は様々な アデニン 異性体によって阻害されるその能力において異なっており、RIP 毒素が共通の 活性部位 結合間隙を共有しないことが示される。アデニン 異性体のRIP 活性に対する阻害活性は知られているか(Pallanca et al. (1998) Biochimica et Biophysica Acta、1384: 277-284; Brigotti et al. (2000) Nucleic Acids Research、28: 2383-2388; Brigotti et al. (2000) Life Sci.、68: 331-6)または、当業者によって 例えば毒素のRNA N-グリコシダーゼ 活性 (即ち、RIP 活性)を阻害剤の存在下で判定することによって決定することが出来る。
以下に詳細に記載するように、RIP 阻害剤、例えば、アデニンおよびその類似体、例えば 4-APPは、RIPの改変形態を選択する方法において利用でき、また、RIP 毒素またはその複合体、例えば本明細書において提供する、あるいは本明細書において提供する選択 方法によって同定される改変RIP 毒素の生産を向上させる方法においても利用できる。
D.改変毒素またはその複合体を選択する方法
宿主である発現細胞に対して低下した細胞毒性を示す改変RIP 毒素を選択する方法が本明細書において提供される。本明細書における方法において、特定の宿主細胞に対するRIPの毒性によって、RIPはしばしばすべてのまたは実質的にすべての細胞に最終的に毒性である条件下においても、細胞培養物において低レベルにて発現されることが見いだされた。典型的には、RIPは細胞に対する毒性を示すために要求量が必要とされるために発現されるが、いくらかの細胞はRIPの毒性の影響に対して抵抗性となり、本明細書に示すように、RIPは突然変異する。その結果、RIPをコードする核酸を含む細胞の培養物において、RIPは比較的低レベルではあるが発現される。
したがって、出発RIP タンパク質 が発現されないかまたは低レベルでしか発現されない条件下で宿主細胞によって発現されるRIP 毒素を選択および同定する方法が設計される。本明細書において提供する方法を実施するためには、非改変または出発形態の RIP 毒素をコードする核酸が宿主細胞に導入され、宿主細胞が生育可能とされ、生育する細胞が単離され、細胞において発現される RIP 毒素が 同定され、活性、例えば 例えば、N-グリコシダーゼ 活性 および/またはその他のRIP 活性、例えば、これらに限定されないが、RNase 活性、DNase 活性、スーパーオキシドジスムターゼおよびホスホリパーゼ 活性について試験される。ある例において、選択はさらに選択 モジュレーター、例えばRIP 阻害剤の存在下で行われる。
一般に、かかる同定されたRIP 毒素は出発RIP タンパク質と比較して改変されており、改変によって、RIP 毒素は出発RIP 毒素と比較して変化した活性、例えば変化した毒性活性またはその他の活性を示す。一般に、改変RIP ポリペプチドの毒性は低減されている。ある例において、本明細書における選択 方法において同定された改変RIP ポリペプチドは毒性活性を示さない。しかし典型的には、改変RIP 毒素、またはその複合体は野生型形態の 毒素またはその複合体と比較して0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または 100% の毒性活性を保持する。保持された細胞毒性活性のために、かかる改変毒素を含む複合体を特定の細胞の標的化のために設計することが出来、それにより複合体がインターナリゼーションされると１または複数の標的化された細胞が殺傷される。例えば、以下に詳細に記載するように、改変RIP 毒素を含む複合体が、疾患プロセスに関与する１以上の 細胞または細胞集団を標的化することによって様々な 疾患または障害の治療方法において利用することが出来る。かかる改変毒素はまたRIP 毒素またはその複合体を発現および生産する方法に利用することも出来、それにより高収率のタンパク質 生産が可能となる。
1.候補 RIP タンパク質またはその複合体
一般に、多くのRIP タンパク質が原核 および/または真核細胞に対して毒性活性を示し、それらは細胞リボソームによるタンパク質 合成を阻害するため、 それらは宿主細胞系の一部または全部において高レベルにて発現され得ない。それらがより高いレベルで発現され得、かつ、RIPを用いる複合体において治療的に用いるために十分な毒性を示すように、RIPの毒性を低減する方法を本明細書において提供する。米国特許第7,166,702、7,157,418 および 7,192,736号における複合体ならびにサイトカイン、例えば 増殖因子、例えば、FGF、VEGF、EGF およびその他の複合体が含まれる。
本明細書において提供する方法において、宿主細胞において低減した毒性を示すRIP 毒素またはその複合体が生産される。かかる改変RIP 毒素またはその複合体は、したがって細胞に対する毒性が低い。毒性が低減するよう改変されたRIP タンパク質またはその複合体の選択により、宿主細胞によるかかる毒素の発現が可能となり収率が向上する。したがって、かかる方法は効率的かつ有効に生産することが出来るRIP 毒素またはその複合体の作成を可能とし、したがってそれが設計される疾患または障害の治療方法において利用できる。
本明細書において提供する選択 方法によって改変されるべきRIP タンパク質は、宿主細胞 リボソームに対する毒性活性のために宿主細胞において標準または通常の培養条件下で発現しないか低レベルにて発現するいずれのRIP タンパク質または、RIP タンパク質またはその活性の部分を含むいずれのポリペプチドであってもよい。タンパク質は改変されると、同じ条件下でより高レベルにて発現される。選択のための候補 RIP タンパク質としては、野生型または変異体形態の野生型 RIP タンパク質、または毒性活性を示すその活性の部分、例えば、本明細書における方法によって選択されていないRIP タンパク質の対立遺伝子または種 変異体およびアイソフォームが挙げられる。
かかるRIP タンパク質としては上記表3 に示すものが挙げられ、例えば配列番号5、89-111のいずれかに示すアミノ酸配列を有するもの、特にかかるRIP タンパク質のA-鎖の活性の部分、例えば志賀毒素のA1 鎖(即ち、SA1)、またはいずれかのその活性の断片が挙げられる。例えば、本明細書において提供する方法において用いられる出発タンパク質は、そのA-鎖またはA1 鎖において切型となっているが、依然として 触媒活性を示すものであってもよい。本明細書において提供する方法において出発タンパク質として挙げられるものとしては、変異体形態のRIP タンパク質、例えば その対立遺伝子または種 変異体を含むいずれかのポリペプチドである。例示的なRIP タンパク質の変異体は配列番号6、9-21、または162-169のいずれかに示される。標的化剤に結合したかかるタンパク質を含む複合体も提供される。
本明細書における方法において出発タンパク質として含まれるものとしては、かかる上記のRIP 毒素のいずれかまたはかかるRIP 毒素の活性の部分を、別のポリペプチド 部分と直接または間接的に結合して含む複合体がある。例えば、かかる複合体にはリガンド-毒素 複合体が含まれ、例えば、RIP 毒素が、ケモカイン、サイトカイン、抗体、増殖因子、またはその他の細胞 表面 受容体に結合することが出来るかかるリガンド タンパク質と直接または間接的に結合したものが挙げられる。典型的には、かかる複合体は融合タンパク質をコードする核酸分子によってコードされる。
本明細書において提供する方法において出発タンパク質として使用される例示的な RIP タンパク質としては、SA1、例えば配列番号5のアミノ酸 1-251に対応するアミノ酸配列を有するもの、またはその切断型形態、例えばそれぞれ配列番号22に示すアミノ酸 配列を有するSA1 (即ち、変異体 1 SA1)または配列番号24に示すアミノ酸 配列を有するSA1 (即ち、変異体 2 SA1)、またはそれらのいずれかの対立遺伝子または種 変異体が挙げられる。例示的なかかる複合体としては、上記の SA1 部分のいずれかを含むものであればいずれでもよく、ここでSA1 部分はリガンドまたはその他の細胞 受容体結合分子に直接または間接的に結合したものである。例えば、かかる複合体としては、ケモカイン 複合体 (即ち、白血球 集団 モジュレーター)、 例えば、米国特許第7,166,702、7,157,418および7,192,736号に示され記載されるものが挙げられる。これらには、例えば、SA1に結合したMCP-1 ケモカインを有するものが含まれる。変異体 1 SA1 RIP タンパク質に結合したMCP-1-SA1 複合体(即ち、LPM1a)の例示的な 配列を配列番号38に示し、配列番号37に示すヌクレオチド配列によってコードされる。変異体 2 SA1 RIP タンパク質に結合した MCP-1-SA1 複合体(即ち、LPM1b)のさらなる例示的な 配列を配列番号40に示し、配列番号39に示すヌクレオチド配列によってコードされる。
2. RIP またはその複合体の宿主細胞への導入
所望の 出発RIP タンパク質、またはその複合体をコードする核酸は、所望の 宿主細胞に導入される。典型的には、選択 方法において選ばれる宿主細胞は、出発RIP タンパク質、またはその複合体の毒性効果に感受性であり、宿主細胞におけるRIPの発現によって宿主細胞のタンパク質 合成が消滅するかまたは顕著に阻害されるものである。本明細書における選択方法における使用のための宿主細胞としては、あらゆる原核細胞、例えば、これらに限定されないが、いずれかの細菌細胞、例えば、大腸菌が挙げられる。宿主細胞にはあらゆる真核細胞も含まれ、例えば、これらに限定されないが、酵母、例えば Pichia pastoris、Xenopus oocytes、および哺乳類細胞、例えば、Vero、Hep2、Chang、A549、COS-1、およびHeLa 細胞が挙げられる。本明細書における選択方法において使用する適当な 宿主細胞の決定において、RIP タンパク質、またはその複合体の宿主細胞における組換え タンパク質 発現に対する影響は本明細書に以下に記載するかまたは当業者に知られた様々な 方法によって判定することが出来る。タンパク質 合成に対する効果を評価するためのアッセイとしては、例えば、脱プリン アッセイ (即ち、アデニンの遊離)、無細胞タンパク質 合成 アッセイ、例えば、ウサギ網状赤血球ライセートまたはコムギ胚芽ライセート タンパク質 合成 アッセイ、あるいは細胞増殖/生存度 アッセイが挙げられる。例えば、かかるアッセイを用いることにより、真核および原核 リボソームに対してSA1が顕著な毒性活性を示すことが知られる(Suh et al. (1998) Biochemistry、37:9394)。したがって、１つの例において、改変形態のSA1、またはその活性の形態の選択は、真核細胞において行う。別の例において、改変形態のSA1、またはその活性の部分の選択は、細菌 細胞、例えば大腸菌において行う。様々な 大腸菌 宿主 株が入手可能であり、例えばこれらに限定されないが BL21(DE3)またはBL21(DE3)pLysS 細胞が含まれる。
本明細書における方法に使用するための出発RIP タンパク質、またはその複合体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られているいずれかの方法、例えば、天然源からの単離、標準的 組換え DNA 技術、例えば 細胞、組織および生物からの標準的 クローニング手順による作成およびその他の組換え 方法およびインシリコ 工程、合成方法および当業者に知られたあらゆる方法を含む方法によって生産または単離することができる。かかる核酸分子はさらなる配列、例えば、制限酵素配列、リンカー、タグ、またはその他のかかる配列を含んでいてもよい。例示的な核酸分子としては、 RIP タンパク質、その活性の形態、またはその変異体をコードするあらゆるもの、例えば、配列番号1、3、5、7-22、24、89-111、または162-169のいずれかに示すポリペプチドをコードするあらゆるもの、またはいずれかのかかるRIP タンパク質を含む複合体をコードするあらゆるものが挙げられる。例示的な 核酸 配列としては、例えば、変異体 1または変異体 2 形態のSA1の配列、例えばそれぞれ配列番号23または配列番号25に示すものが挙げられる。その他の例示的な 核酸 配列としては、複合体、例えば、ケモカイン、例えば、MCP-1がSA1 変異体と結合した複合体をコードする配列が挙げられる。例えば、LPM1aまたはLPM1b 複合体をコードする核酸 配列が本明細書において提供する方法において利用でき、それぞれ 配列番号37および39に示す配列が含まれる。
典型的には、改変RIP タンパク質 またはその複合体の選択および発現のための配列を有する宿主細胞への導入に用いられる核酸分子は、発現 ベクターの形態であり、発現ベクターとしては、ポリペプチドの発現をコードする核酸 配列に作動可能に結合した発現 制御配列を有するものが含まれる。かかる発現 ベクターは本明細書中以下に詳細に記載する。適当なベクターは、宿主細胞 および/またはいずれかの所望の転写/翻訳要素、例えば、構成的および誘導可能プロモーター、転写 エンハンサー 要素、転写 ターミネーター等に応じて選択することが出来る。１つの例において、誘導可能な 発現系が本明細書における方法に用いられ、それは、毒素の発現の前の宿主細胞の最適な 生育を可能とする。例示的な大腸菌における誘導可能な 系はpET ベクター、例えば、PET9c プラスミドであり、これらはT7 後期プロモーターの制御下にあり、IPTGによる誘導を必要とする。別の例において、導入されるコードする核酸の発現に用いられる宿主細胞は、毒素 発現を最適にするさらなる成分をそれ自体が担持しているものが選択されうる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、漏出性でありうる親 宿主細胞BL21(DE3)と比較して誘導の非存在下でT7 プロモーター (例えば pET ベクターにおけるもの)からの発現を強く抑制する細胞株 BL21(DE3)pLysSを利用することが出来る。
RIP タンパク質、その活性の形態、またはその複合体をコードする核酸分子は、当業者に知られたいずれの方法によって宿主細胞に導入してもよい。かかる方法は、選ばれた宿主細胞に応じて選択され、例えば、これらに限定されないが、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション、およびあらゆるその他の好適な方法が挙げられる。場合によっては、DNAはウイルス ベクターを用いる形質導入によって細胞に導入されうる。典型的には、DNAを 細菌細胞に導入する場合は、形質転換またはエレクトロポレーション 方法が用いられる。
a.トランスフェクション
トランスフェクションは、真核または原核細胞への核酸の導入に利用することが出来る。トランスフェクションは様々な 方法によって達成できるが、典型的には一過性の「孔」を細胞にあけて、宿主細胞において一過性に発現されるようになるDNAが入ることを可能にすることを含む。DNAをトランスフェクションによって導入する方法の例としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウム法、リポフェクション、および遺伝子銃アプローチが挙げられる。例えば、リポフェクション アプローチにおいては、DNAは リポソームに含まれるか、または、細胞膜と融合してDNAを細胞内に放出することが出来る脂質-カチオン試薬を用いることによって行われる。カチオン性脂質の例としては、これらに限定されないが、Lipofectin (Life Technologies、Inc.、Burlington、Ont.)(カチオン性脂質 N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム クロリド (DOTMA)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE)の1:1 (w/w) 製剤); LipofectAMINE (Life Technologies、Burlington、Ont.、米国特許第5,334,761号参照) (ポリカチオン性脂質 2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロアセテート (DOSPA)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE)の3:1 (w/w) 製剤)、LipofectAMINE PLUS (Life Technologies、Burlington、Ont.米国特許第5,334,761および5,736,392号参照;米国特許第6,051,429号も参照) (LipofectAmine and Plus reagent)、LipofectAMINE 2000 (Life Technologies、Burlington、Ont.; PCT国際出願WO 00/27795号も参照) (カチオン性脂質)、Effectene (Qiagen、Inc.、Mississauga、Ontario) (非リポソーム性脂質製剤)、Metafectene (Biontex、Munich、Germany) (ポリカチオン性脂質)、Eu-fectins (Promega Biosciences、Inc.、San Luis Obispo、CA) (エタノール性 カチオン性脂質第 1から12番: C52H106N6O4 .4CF3CO2H、C88H178N8O4S2.4CF3CO2H、C40H84NO3P.CF3CO2H、C50H103N7O3.4CF3CO2H、C55H116N8O2.6CF3CO2H、C49H102N6O3.4CF3CO2H、C44H89N5O3.2CF3CO2H、C100H206N12O4S2.8CF3CO2H、C162H330N22O9.13CF3CO2H、C43H88N4O2.2CF3CO2H、C43H88N4O3.2CF3CO2H、C41H78NO8P); Cytofectene (Bio-Rad、Hercules、CA ) (カチオン性脂質および中性脂質の混合物)、GenePORTER (Gene Therapy Systems Inc.、San Diego、CA) (中性脂質 (Dope) およびカチオン性脂質の製剤)およびFuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN) (多成分の脂質に基づく 非リポソーム試薬)が挙げられる。
b.形質転換
形質転換は導入されたDNAが遺伝子材料の発現のために細胞のゲノムに組み込まれる点でトランスフェクションとは区別される。典型的には、安定な 形質転換に用いられる発現 ベクターは選択マーカー、例えば、形質転換細胞の選択および維持を可能とする抗生物質耐性を有する。形質転換は、DNAの細胞への移入を必要とし、それは天然に形質転換受容性であるか形質転換受容性とされた細胞が細胞膜または膜を横切ってDNAを取り込むことによって達成される。塩化カルシウムは、細胞、例えば 大腸菌細胞をより形質転換受容性にするのに用いられる１つの方法である。細菌細胞の熱ショックの後、それらはDNAを取り込むように誘導される。形質転換は細菌に限定されず、酵母、植物および哺乳類細胞、例えば胚性幹細胞においても行うことが出来る。形質転換の方法は周知である (例えば、Mello et al. (1995) Methods Cell Biol.、48:451-82参照)。
c.エレクトロポレーション
エレクトロポレーションは一時的に細胞の外膜にパルス回転 電場の使用により孔を開ける。インビトロおよびインビボでのエレクトロポレーションに用いられる方法および装置は周知である(例えば、米国特許第6,027,488、5,993,434、5,944,710、5,507,724、5,501,662、5,389,069、5,318,515号参照)。標準的 プロトコールを用いることが出来る。
3. 発現、選択および同定
DNA 分子での宿主細胞の導入は遺伝子産物の増幅をもたらし、それによって多コピーの遺伝子が発現するのを可能にする。本明細書の選択方法において用いられる出発 RIP 毒素またはその複合体は、選択される宿主細胞にとって通常有毒であるため、出発(starting)タンパク質の増幅および発現は、例えば細胞死のために、通常は起こらない。そのため、本明細書において提供される方法は、宿主細胞に対して示す毒性が少なくそれによって発現するタンパク質のそれらの改変形態を選択するための選択方法として、出発タンパク質の通常の毒性を用いる。典型的には、かかる発現タンパク質は、その一次配列においてタンパク質を低毒性にする１以上のアミノ酸突然変異によって改変される。いくつかの場合において、発現タンパク質は、出発タンパク質と比べてアミノ酸配列の切断を介して改変され、そのことが該タンパク質を低毒性にする。ほとんどの宿主細胞発現系において、改変 RIP 毒素をコードする遺伝子は、形質転換体を増殖させ、該形質転換体から組換え DNA 分子を単離し、必要な場合には、該単離された組換え DNA から挿入遺伝子を回収することによって、大量に得ることができる。
いくつかの例において、改変 RIP 毒素またはその複合体の回収にとって最適となるよう選択を調節するために、１または複数のさらなる物質が選択方法に追加される。かかる選択モジュレーター(selection modulator)は通常、RIP 毒素またはその複合体の毒素活性を減少させるあらゆるものである。例えば、あらゆる RIP 阻害剤を、選択を調節するために使用できる。RIP 毒素を不活化することができる、当業者に公知のまたはその後に本明細書において同定されたあらゆる RIP 毒素阻害剤が、本明細書において提供される方法において用いられ得る。通常、かかる RIP 毒素阻害剤は、例えば保存された RIP 毒素の N-グリコシダーゼ活性を標的にすることによって毒素活性を阻害するあらゆるものである。これらに限定されないが、RNase 活性、DNase 活性、ならびにスーパーオキシドジスムターゼおよびフォスフォリパーゼ活性を含むあらゆる他の１以上の RIP 活性を標的とする、他の RIP 毒素阻害剤が選択され得る。本明細書における目的のために、該阻害剤が RIP 毒素の出発形態、例えば、RIP 毒素の野生型形態(wildtype form)またはその活性の断片に対する阻害活性を示す限り、あらゆる RIP 阻害剤、例えばアデニンまたはそのあらゆる類似体が、本明細書の方法において用いられ得る。例えば、4-APP が、本明細書の方法において、これらに限定されないが、改変 SA1、サポリン、モモルディンまたはブリョジンを含む改変 RIP を選択するために用いられ得る (Brigotti et al. (2000) Life Sciences、68:331-336)。通常、4-APP は、本明細書の方法において改変 SA1 を選択するために用いられる。他の阻害剤が改変 SA1 を選択するために用いられ得ることも考慮される。
選択方法において用いられる RIP 阻害剤の量は、RIP タンパク質またはその複合体の毒素活性に対するその公知の作用に基づいて経験的に決定され得る。本明細書の方法において用いられる RIP 阻害剤それ自体は特定の宿主細胞に対し有毒でないということは重要であり、毒性は公知であるかまたは選択される宿主細胞に応じて当業者によって決定され得る。さらに、RIP 阻害剤が改変 RIP 毒素またはその複合体の選択を効率的に調節することを確実にするため、出発タンパク質の毒素活性を阻害するように RIP 阻害剤の濃度が選択される。通常は、出発 RIP タンパク質が RIP 阻害剤の存在下においていくらかの活性を保持するように RIP 阻害剤の濃度が選択され、それによって選択方法におけるある程度の選択圧または RIP 阻害剤の調節が可能になる。一般的に、RIP 毒素もしくはその複合体の毒素活性の少なくともまたは約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または 90% を阻害するが、該阻害が毒素活性の 100% には満たないような RIP 阻害剤の濃度が選択される。当業者に公知の様々なアッセイが、様々な濃度の RIP 阻害剤が宿主細胞または RIP タンパク質の活性に及ぼす影響を試験するために用いられ得る。
通常、本明細書の選択方法においては、阻害剤それ自体が選択される宿主細胞に対して有毒でない限り、選択を調節するために RIP 阻害剤、例えば 4-APP が(約)0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM. 0.5 mM. 0.6 mM、0.7 mM、0.8mM、0.9 mM、1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM、3.0 mM、4.0 mM、5.0 mM、6.0 mM. 7.0 mM、8.0 mM、9.0 mM、10.0 mM 以上で添加される。選択される RIP 阻害剤の濃度は、選択される宿主細胞または組換え発現のために用いられる条件によって変動し得ることが理解される。例えば、大腸菌細胞発現系において本明細書の選択方法で使用するための 4-APP の代表的な選択される濃度は、(約)0.2 から 0.8 mM、一般的には 0.5 mM の阻害剤である。
RIP 阻害剤は、出発タンパク質 RIP 毒素またはその複合体での宿主細胞の処理の前に、間に、または後に添加され得る。いくつかの例において、RIP 阻害剤は、液体培養または培地、例えば細胞培養の培地に添加される。他の例において、RIP 阻害剤は、固めることができる培地、例えば固形寒天に添加される。例えば、RIP 阻害剤、例えば 4-APP は RIP 阻害剤を含有する寒天プレートを生成するため、ルリア・ブロス(LB)寒天に添加され得る。RIP 阻害剤は、選択的モジュレーターとして単独で用いられ得、または他の選択的モジュレーターもしくは選択剤(selective agent)、例えば、これらに限定されないが、他の RIP 阻害剤または抗生物質耐性を与える抗生物質の存在下で用いられ得る。
宿主細胞の形質転換体から発現される選択された改変毒素は、選択された改変 RIP 毒素またはその複合体の同定を促進するために増幅され得る。かかる方法は一般的な組換え DNA 技術を含み、当業者にとって常套のものである。選択されたタンパク質の精製を可能にするため、改変毒素 DNA を含有する宿主細胞形質転換体からのベクターを単離することができる。例えば、上記の通りに RIP 出発タンパク質で大腸菌宿主細胞を形質転換した後、細胞形質転換体は、例えば当業者に公知のあらゆる方法を用い、コロニーを個別に拾い上げてプラスミド精製のために生育させることによって単離することができる個別のクローンとして生育し、必要があれば、例えば Midi プラスミド精製キット(Qiagen)を用いて大量に調整することができる。精製されたプラスミドは、改変毒素の配列を同定するために DNA 配列決定に用いられ得、または、そのさらなる発現および生産のためのあらゆる細胞に、例えば、これらに限定されないが、原核または真核の発現系にトランスフェクトするために用いられ得る。いくつかの例において、選択された配列を増幅するために１段階または２段階の PCR を実施することができ、その配列を選択された発現ベクターにサブクローン化することができる。PCR プライマーは、例えば制限酵素部位の追加を含めることによって、サブクローニングを促進するように設計することができる。
あらゆる所望の細胞発現系における選択された毒素のさらなる発現および生産の後、RIP 毒素ポリペプチドまたはその複合体を含有する馴化培地(conditioned medium)は、活性アッセイにおいて試験され得、またはさらなる精製のために用いられ得る。通常、選択された改変 RIP 毒素またはその複合体のあらゆるさらなる発現および生産は、RIP 阻害剤の存在下で行われる。RIP 毒素またはその複合体の生産の改善のため、かかる方法は以下のセクション G において詳細に記載される。
4. 活性評価
本明細書で提供される方法において選択される改変 RIP 毒素またはその複合体は、選択の後それらが宿主細胞リボソームに対する毒素活性を保持するかどうか決定するために、試験され得る。通常、かかる改変毒素は出発 RIP タンパク質またはその複合体と比べて減少した毒素活性を示すため、それらは選択される。しかし、一般的に、選択された改変毒素は、出発毒素タンパク質のいくらかの活性を保持する。本明細書において提供される改変 RIP 毒素またはその複合体は、基準または毒素の出発形態もしくはその複合体と比較して 0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 以上の毒素活性を保持する。代表的なアッセイは、RIP ポリペプチドの活性について試験するあらゆるアッセイであり得、例えば、N-グリコシダーゼ活性、DNAase 活性、RNAase 活性または他の活性を評価するアッセイを含む。当業者に公知のあらゆる方法が RIP タンパク質またはその複合体の毒素活性を評価するために用いられ得、それらは通常、RIP タンパク質の N-グリコシダーゼ活性の効果についてアッセイするあらゆるものを含む。かかる毒素の改変形態を含むあらゆる RIP 毒素またはその複合体の毒素活性を評価するための代表的なアッセイは、以下において説明される。
a. タンパク質合成アッセイ
RIP 毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供される選択方法において同定されるあらゆる改変毒素を含むあらゆる改変 RIP の活性は、毒素の翻訳に対する効果を決定するため、タンパク質合成アッセイを用いて測定され得る。かかるアッセイは常套かつ当業者にとって公知のものである。かかるアッセイの典型例は、ウサギ網状赤血球ライセート アッセイである。通常、ウサギ網状赤血球ライセートは、効率的な転写および翻訳に必要な成分、例えばマグネシウムおよびカリウムイオンならびに NTP を含有するかまたはそれらが補われている。合成タンパク質の源である鋳型 RNA も添加される。かかるアッセイは、検出可能なウサギ リボソームによるインビトロでの共役したタンパク質の転写および翻訳を可能にする。一つの方法において、検出は、合成タンパク質に取込まれ、トリクロロ酢酸での沈殿の後に測定され得る放射活性、例えば [3H]Leu、[35S]Met または [35S]Met-Cys の取込みを介して達成され得る(TCA; Baas et al. (1992) The Plant Cell、4: 225-234; Zhao et al. (2005) Journal of Microbiology、54: 1023-1030)。別の方法においては、ルシフェラーゼ DNA が鋳型として用いられ得、その後にそれはルミノメーターを用いて検出される。代表的なウサギ網状赤血球ライセート系は、Promega によって販売されているものであり、例えば TNT（登録商標）共役網状赤血球ライセート系を含む。かかるアッセイは実施例 2 において説明される。アッセイは、コムギまたはトウモロコシの網状赤血球ライセートを含む他の翻訳系と共に用いられるよう適合させることができ、または、インタクトな細胞ライセートまたは様々な上清画分から再構築されたライセートおよび精製リボソームまたはポリリボソームを含む、翻訳反応において適合させることができる(Baas et al. (1992) The Plant Cell、4: 225-234)。いくつかの方法において、アッセイは全細胞においてタンパク質合成への影響を評価するために適合させることができ、ここで、タンパク質合成の検出はアデノウイルスに発現されるルシフェラーゼによって促進され得る (Zhao et al. (2005) Journal of Microbiology、54: 1023-1030)。加えて、毒素の相対活性を決定するため、最大反応の半分を与えるのに必要な毒素の濃度(RIC50)によって決定されるように、動態解析および用量反応曲線が実施され得る。
b. 脱プリン アッセイ
RIP 毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供される選択方法において同定されるあらゆる改変毒素を含むあらゆる改変 RIP の活性は、脱プリン アッセイにおいて決定され得る。RNA のリボソーム大サブユニットの RIP-媒介 脱プリン反応は、糖-リン酸骨格の脱プリン部位における加水分解に対する感受性を増大させる(Tumer et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.、94: 3866-3871)。アニリンでの処理の後、通常は小さな断片の放出によって加水分解が観察され得る。こうして、リボソームは増大する毒素濃度の存在下または非存在下で処理され得、RNA は抽出されてアニリンで処理され、そしてゲル電気泳動によって分析される。断片は、エチジウムブロマイドでの染色によって可視化され得る (Tumer et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.、94: 3866-3871; Hartley et al. (1991) FEBS、290: 1:65-68)。脱プリンのパーセントは、RNA ゲルの写真のネガをスキャンすることによって決定され得る(see e.g.、Taylor et al. (1994) The Plant Journal、5: 827-835)。
c. 細胞増殖/生存/生存度アッセイ
RIP 毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供される選択方法において同定されるあらゆる改変毒素を含むあらゆる改変 RIP の活性は、細胞増殖に対する効果を直接評価することによって決定され得る。かかるアッセイにおいて、あらゆる原核または真核細胞は、例えば適切な発現ベクターの形態で、毒素をコードする DNA を導入され得る。あるいは、あらゆる原核または真核細胞は、RIP ポリペプチドまたはその複合体、例えばリガンド-毒素複合体を直接に投与され得る。これらに限定されないが、例えば、対象から、すなわち血液、血清または他の組織源から直接に得られるあらゆる初代細胞を含む、あらゆる細胞を試験することができる。かかる細胞の中には、あらゆる白血球サブタイプまたはその活性化白血球が含まれる。細胞株もまた、RIP ポリペプチドまたはその複合体の毒性を評価するため、アッセイにおいて用いられ得る。代表的な細胞株は、THP-1、U251 または HT-29 細胞である。
細胞増殖は、細胞増殖、細胞生存度または細胞生存(survival)についてアッセイすることによってモニターすることができる。増殖は、経時的に、かつ増大する毒素濃度の存在下または非存在下でモニターすることができる。例えば、細胞増殖は、コールターカウンター(Coulter Counter)において細胞を計数すること、細胞の光学密度を経時的に測定すること(Suh et al. (1998) Biochemistry、37: 9394-9398)、DNA 色素、例えば生細胞によって還元されて測定可能な不溶性の紫色のホルマザン結晶を形成する MTT を用いること(Arora et al. (1999) Cancer Research、59: 183-188; McDonald et al. (2001) IDrugs、4:427-442)、または色素、例えば生細胞からは排除されるが死細胞からは排除されないトリパンブルーを用いること(McDonald et al. (2001) IDrugs、4:427-442)によってモニターすることができる。別の例において、細胞生存度は、細胞培養培地中に放出される ATP の量を測定することによって評価することができる。かかるアッセイの典型例は、例えば実施例 5 において記載される CellTiter-Glo（商標）Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega、Madison WI)である。(製造者によって CellTiter-Glo（登録商標）試薬として供給される) ATP 反応混合物で細胞を溶解すると、ATP がルシフェリンの酸素化を駆動して発光シグナルをもたらし、それはウェル内における ATP 濃度に比例する。これは培養における生細胞の数に正比例する。
E. 代表的な改変毒素
本明細書において提供されるのは、野生型 RIP ポリペプチドに比べて減少した毒素活性を示す改変 RIP 毒素ポリペプチドまたはその複合体である。例えば、改変 RIP 毒素ポリペプチドまたはその複合体は、基準(reference)または毒素の出発形態もしくはその複合体と比較して 0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上の毒素活性を示す。減少した毒性のため、かかる改変 RIP 毒素ポリペプチドは宿主細胞によって発現され、そこから精製され、単離されおよび/または同定され得る。改変毒素またはその複合体は、真核または原核細胞に対して減少した毒性を示す。一般的に、改変 RIP 毒素またはその複合体は、細菌細胞、例えば大腸菌に対して減少した毒性を示し、それによって大腸菌は大腸菌での生産方法において用いられ得る毒素の源を許容する。
通常、かかる改変 RIP 毒素ポリペプチドまたはその複合体は、タンパク質の出発または野生型形態(すなわち、非改変ポリペプチド)の１以上の活性を保持する。例えば、改変 RIP 毒素ポリペプチドまたはその複合体は、非改変または野生型 RIP ポリペプチドまたはその複合体と比較して、１以上の RIP 活性の少なくともまたは約 0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上の活性を保持する。RIP ポリペプチドの活性は、これらに限定されないが、あらゆる１以上の N-グリコシダーゼ活性、RNAase活性およびDNAase活性を含むポリヌクレオチド:アデノシン グリコシダーゼ活性、スーパーオキシドジスムターゼ活性、フォスフォリパーゼ活性、キチナーゼ活性および抗ウイルス活性を含む。活性はインビトロまたはインビボで評価することができ、出発 RIP ポリペプチドの活性と比較することができる。
いくつかの例において、かかる改変 RIP ポリペプチドは、本明細書の選択方法において、例えば、宿主細胞によって発現されないかまたは低レベルで発現される出発 RIP ポリペプチドまたは RIP ポリペプチドを含有するポリペプチド複合体と比較して、宿主細胞によってそれが発現されることで同定される。上記の通り、かかる改変 RIP 毒素ポリペプチドは、出発または野生型 RIP ポリペプチドをコードする核酸、例えば、表 3 に記載される RIP ポリペプチドまたはその活性の断片をコードするあらゆる核酸の導入の後に同定され、その後、発現 RIP ポリペプチドの選択および同定がなされる。いくつかの例において、本明細書において提供される改変 RIP 毒素ポリペプチドは、出発 RIP 毒素またはその活性な部分をコードする核酸を導入された宿主細胞からの毒素の発現の後に同定される。他の例において、本明細書において提供される改変 RIP 毒素ポリペプチドは、RIP 毒素またはその活性な部分を含むポリペプチドをコードする出発複合体を導入された宿主細胞からの RIP 毒素複合体ポリペプチド(すなわち、リガンド-毒素複合体)の発現の後に同定される。通常、かかる複合体は融合タンパク質であり、その結果、融合タンパク質をコードする核酸分子の細胞内への導入が可能になる。
本明細書において記載される方法を用いて、発現 RIP ポリペプチド中の特定の改変が、例えば該ポリペプチドの配列決定によって同定され得る。通常、本明細書の方法において同定される改変は、非改変ポリペプチドの一次配列を変更するあらゆるものを含み、また、これらに限定されないが、あらゆる１以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および/またはアミノ酸切断を含む。例えば、改変は、一次配列におけるあらゆる１以上のアミノ酸突然変異または一次配列の切断、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。それ故、RIP ポリペプチドまたはその活性の断片におけるアミノ酸残基の改変は、ポリペプチドの一次配列の変化によって、減少した細胞毒性を与えることが同定され得る。
本明細書の選択方法において同定される発現 RIP ポリペプチド中の改変は、あらゆる標的タンパク質、例えば、あらゆる関連ポリペプチド、例えば、これらに限定されないが、発現 RIP ポリペプチドのあらゆる対立遺伝子、種、切断型(truncated)または他の変異体形態中の対応する位置において、作り出すことができる。かかる改変は、例えば当業者にとって常套のものである標準的な組換え DNA 技術によって、作り出すことができる。標的タンパク質中にあらゆる１以上のアミノ酸の突然変異をもたらすための、当該技術分野に公知のあらゆる方法が採用され得る。方法は、コードする核酸分子の(例えば Stratagene から入手可能な QuikChange などのキットを用いる)標準的な部位特異的突然変異誘発を含み、または固相ポリペプチド合成法による。
加えて、本明細書の方法において同定されるかまたは本明細書の方法において同定される改変に基づいて生成されるあらゆる改変 RIP ポリペプチドは、融合タンパク質または複合体を生成するために用いられ得る。例えば、そのインターナリゼーションのための細胞表面受容体を標的とするあらゆる部分へ直接または間接に結合した標的化された物質(以下のセクション F を参照)としての改変毒素部分を有するリガンド-毒素複合体が生成され得る。かかる複合体は、常套の組換え DNA 技術によって生成され得る。例えば、複合体は、制限酵素および所望の複合体成分の常套のサブクローニングのためのクローニング方法論を用いて生成され得る。あらゆる複合体を含む、本明細書の選択方法において同定される改変を有する、生成されるあらゆる改変ポリペプチドは、毒素活性を保持する。かかる改変ポリペプチドは一般的に、あらゆる１以上の RIP 活性を保持しまたは示す。複合体の毒素活性および他の活性は試験することができる。
ポリペプチドの一次配列中に存在するかまたは存在しない他の改変も、改変 RIP ポリペプチドまたはその複合体に含まれ得、それは例えば、これらに限定されないが、炭水化物部分の付加、ポリエチレングリコール(PEG)部分の付加、Fc ドメインの付加等である。例えば、かかる付加的な改変は、タンパク質の安定性または半減期を増大させるために作出され得る。
改変 SA1 毒素
本明細書において提供される代表的な RIP 毒素は、そのあらゆる活性形態、例えば切断ポリペプチドが RIP 活性を示す限りそのあらゆる切断型における改変を含む SA1 の改変形態、および対立遺伝子またはその種変異体である。例えば、改変 SA1 ポリペプチドは、例えば配列番号22 または 配列番号24 に記載される SA1 の切断型変異体におけるあらゆる１以上の改変、またはあらゆる対立遺伝子またはその種変異体を含み得る。選択方法において用いられる出発 SA1 毒素と比較して、改変 SA1 毒素は切断され得、またはアミノ酸突然変異を現し得る。通常、かかる改変毒素は、出発 SA1 ポリペプチドと比較して１以上の活性を保持する。従って、かかる改変 SA1 ポリペプチドは、SA1 ポリペプチドの生産を改善するための方法において用いられ得、および/または改変 SA1 ポリペプチドを含有する複合体タンパク質を生成するための融合タンパク質において用いられ得る。
改変 SA1 ポリペプチドは、本明細書の選択方法において同定され得る。一つの例において、改変 SA1 ポリペプチドは、SA1 ポリペプチドまたはその活性の断片をコードする核酸の導入の後に同定され得る。例えば、改変 SA1 ポリペプチドの選択は、配列番号22 に示される 変異体 1 SA1 ポリペプチドをコードする核酸の導入の後に達成され得る。別の例において、改変 SA1 ポリペプチドの選択は、変異体 2 SA1 ポリペプチドをコードする核酸の導入の後に達成され得る。変異体 2 SA1 は、システインに誘導される二量体化を回避するため、配列番号22 に示される変異体 1 SA1 と比較して５つの C-末端アミノ酸(CHHHA)を欠くように作出された SA1 の一形態である。変異体 2 SA1 のアミノ酸配列は配列番号24 に示され、配列番号25 に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの場合において、改変 SA1 ポリペプチドについての選択は、SA1 ポリペプチド部分を含有する複合体をコードする核酸の導入の後に達成され得る。複合体が SA1 ポリペプチドまたはその活性の断片を含有する限り、複合体はあらゆるリガンド-毒素複合体または他の複合体を含み得る。例えば、米国特許第7,166,702号、7,157,418号および 7,192,736号に記載されるケモカイン複合体が、(配列番号22 に示され、配列番号23 に示される核酸配列によってコードされる)変異体 1 SA1 ポリペプチドの改変形態を同定するため、出発タンパク質として用いられ得る。一つの例において、LPM1a ポリペプチドが出発タンパク質として用いられ、それは変異体 1 SA1 ポリペプチドに間接的に結合したケモカイン MCP-1 の複合体である。LPM1a 複合体は配列番号38 に示され、配列番号37 に示される核酸配列によってコードされる。別の例において、SA1 の変異体 2 形態と結合したケモカイン MCP-1 を含有する複合体が、出発非改変タンパク質として用いられ得、それは本明細書において LPM1b とも称する。LPM1b 複合体は配列番号40 に示され、配列番号39 に示される核酸配列によってコードされる。
本明細書において提供されるのは、配列番号22 に示される変異体 SA1 ポリペプチドの位置 38 に対応する位置 38 においてアミノ酸突然変異を含有する改変 SA1 毒素である。例えば、アミノ酸改変は、位置 L38 に対応し得る。本明細書で提供される方法において同定される、SA1 の代表的なアミノ酸突然変異は、例えば配列番号22 に示される変異体 SA1 ポリペプチドにおける改変 L38R に対応する。いくつかの例において、対応する L38R 突然変異は、対立遺伝子または種変異体を含む他の SA1 変異体形態において同定されまたは作出される。例えば、対応する L38R 突然変異は、配列番号24 に示される SA1 の変異体 2 配列において作出され得る。L38R のアミノ酸突然変異を有する代表的な SA1 毒素は配列番号26 に示され、配列番号27 に示されるアミノ酸配列によってコードされる。本明細書において、この改変 SA1 は、突然変異体 変異体 1 とも称される(変異体 3 とも称される)。突然変異体 変異体 1 SA1 ポリペプチドは、例えば、複合体がそのために設計されている疾患または障害を処置する方法において用いられ得るさらなる毒素複合体を生成するために、用いられ得る。さらに、突然変異体 変異体 1 SA1 ポリペプチドは、SA1 またはその複合体の生産を改善するための方法において用いられ得る。
別の例において、本明細書において提供されるのは、配列番号22 に示される変異体 SA1 ポリペプチドの位置 219 に対応する位置 219 においてアミノ酸突然変異を含有する、改変 SA1 毒素である。例えば、アミノ酸改変は、位置 V219 に対応し得る。本明細書で提供される方法において同定される、SA1 における代表的なアミノ酸突然変異は、配列番号22 に示される変異体 SA1 ポリペプチドにおける V219A の改変に対応する。いくつかの例において、対応する V219A 突然変異は、対立遺伝子または種変異体を含む他の SA1 変異体形態において同定または作出される。例えば、対応する V219A 突然変異は、配列番号24 に示される SA1 の変異体 2 の配列において作出され得る。V219A のアミノ酸突然変異を有する代表的な改変 SA1 ポリペプチドは、配列番号28 に示され、配列番号29 に示されるアミノ酸配列によってコードされる。この改変 SA1 は、本明細書において突然変異体 変異体 2 とも称される(変異体 4 とも称される)。該突然変異体 変異体 2 SA1 ポリペプチドは、例えば、複合体がそのために設計されている疾患または障害を処置する方法において用いられ得るさらなる毒素複合体を生成するために、用いられ得る。さらに、該突然変異体 変異体 2 SA1 ポリペプチドは、SA1 またはその複合体の生産を改善するための方法において用いられ得る。
加えて、本明細書の選択方法において改変 RIP ポリペプチド中に同定されるあらゆる突然変異は、組み合わせることができる。例えば、配列番号22 のいずれかに示される変異体 SA1 内の位置に対応する L38 および V219 の改変を有する、改変 SA1 ポリペプチドまたはその複合体が生成され得る。かかる改変は、あらゆる SA1 ポリペプチド、例えば、それぞれ配列番号22 または 24 に示される SA1 ポリペプチド、あらゆる対立遺伝子もしくはその種変異体、または当業者に公知のあらゆる他の SA1 変異体において、対応する位置に作出され得る。さらに、本明細書の選択方法において改変 RIP ポリペプチド中に同定されるあらゆる突然変異は、当業者に公知のまたはその後に本明細書で同定された RIP ポリペプチド中のあらゆる他の突然変異と組み合わせることができる。通常、RIP ポリペプチドまたはその複合体におけるあらゆるかかる組み合わせ突然変異体(combination mutant)は、RIP ポリペプチドの野生型または出発形態と比較して、宿主細胞に対して減少した毒性を示すが、基準(reference)または毒素の出発形態、またはその複合体と比較して、0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはそれより大きい毒素活性を保持する。
F. 標的化剤およびその複合体
本明細書において提供されるのは、１以上の部分または物質(agent)、例えばあらゆる化学物質、ポリペプチド、またはペプチド部分、またはそれらの部分に対し直接的または間接的に結合した RIP ポリペプチド毒素またはその活性な断片を含有する複合体である。通常、本明細書で提供される複合体において使用するための毒素は、あらゆる 改変 RIP 毒素変異体を含むあらゆる RIP 毒素変異体を含有する毒素である。かかる改変毒素は、本明細書において提供されるかまたは本明細書で提供される選択方法を用いて同定されるあらゆる改変 RIP 毒素、例えば、改変 SA1 毒素もしくは対立遺伝子変異体またはそれらの断片を含む。かかる改変 SA1 の中には、本明細書の選択方法において同定される突然変異体 変異体 1 SA1 (すなわち、変異体 3) または突然変異体 変異体 2 SA1 (すなわち、変異体 4) が含まれる。
通常、改変 RIP 毒素は、細胞表面受容体に選択的に結合することによって複合体を１以上の細胞タイプに標的化するあらゆる剤を含む標的化剤に、直接的または間接的に結合する(すなわち、本明細書においてリガンド-毒素複合体と称される)。したがって、あらゆるポリペプチドまたは細胞表面受容体に結合し、細胞によってインターナライズされるあらゆる分子が、本明細書における使用を意図される。かかる標的化剤は、標的化剤が細胞表面受容体によってインターナライズされる限り、これらに限定されないが、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体、およびホルモン、または対立遺伝子変異体、変異タンパク質もしくはその断片を含む。さらに、本明細書において提供される複合体は、所望により、さらなる成分、例えば、これらに限定されないが、クローニング、発現、翻訳後修飾、精製、検出および投与を促進するさらなる配列または部分を含み得る。これらは、例えば制限酵素配列、翻訳開始もしくは停止コドン配列、Hisタグ、またはそのような他の成分を含む。例えば、開始メチオニンのコドンまたは Kozak 配列が、成熟ポリペプチドまたは断片ポリペプチドの翻訳を可能にするかまたは増強するために、核酸コード配列に付加され得る。さらに、上記セクション D において記載される通り、標的物質、例えば SA1 サブユニットまたはその活性な部分に結合した標的化剤を含有するリガンド-毒素複合体をコードするあらゆる核酸分子が、標的化物質、例えば前記のおよび本明細書における実施例において記載される改変 SA1 の変異体についてスクリーニングするために用いられ得る。
1.標的化剤
一般的に、本明細書において提供される改変 RIP 毒素複合体は、複合体を様々な疾患過程の病態に関与する細胞または細胞集団上の１または複数の受容体に標的化する標的化剤を含有する。疾患または障害に応じて、かかる細胞は、疾患および疾患過程の関数である活性化細胞、または疾患過程を支持するバイスタンダー(bystander)細胞である。結果的に、これらの受容体およびこれらの受容体を発現する細胞を標的化することは、治療を特定の疾患および疾患の進行に合わせることを可能にする。したがって、本明細書において提供される複合体は、様々な疾患の治療において治療法(therapeutics)として用いられ得る。
例えば、本明細書において提供される複合体は、炎症性疾患に関与する様々な白血球サブタイプを含む免疫応答に関与する特定の細胞タイプ上の受容体に結合する標的化部分を含有する、リガンド-毒素を包含する。例えば、本明細書において提供される複合体の成分として、標的化部分は、疾患過程に関与する活性化細胞上を含む、免疫系の細胞、例えばあらゆる白血球系列の細胞または他の組織固有細胞上に発現する１以上の細胞表面受容体を標的とするリガンドを含み得る。本明細書において複合体によって標的化され得る細胞タイプの例は、これらに限定されないが、白血球を含み、これらに限定されないが、単球、組織マクロファージ例えば脳の小膠細胞、肝臓のクッパー細胞または肺の肺胞マクロファージを含むマクロファージ、B 細胞、Th1 および Th2 細胞を含む T 細胞、好塩基球、好酸球、未熟および成熟樹状細胞およびランゲルハンス細胞を含む樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、ならびに好中球を含む。本明細書において標的化され得る細胞タイプの他の例は、血小板、アストロサイト、内皮細胞、ニューロン、上皮細胞および脂肪細胞を含む。
a.ケモカイン
本明細書において提供されるものは、リガンド-毒素複合体において用いられる標的化剤がケモカインのファミリーから選択される複合体である。ケモカインの本明細書の複合体における標的化剤としての使用を理解するためには、ケモカイン リガンドとそれらの受容体の機能および相互作用を理解することが有益である。以下の考察は、かかる背景を提供する。
ケモカインは、通常は細胞によって分泌され、近くの応答細胞、通常は同族のケモカイン受容体を発現する白血球の活性化および/または遊走を刺激する(“走化性”)、４０以上の小さなタンパク質のファミリーである。同時に、ケモカインは、白血球サブタイプの全ての範囲(spectrum)を標的化する; 各々が個別に範囲の一部を標的化する。いくつかのケモカインは構成的であり、恒常的な免疫応答に関与するが、多くのケモカインは炎症性ケモカインと称され、細菌感染、ウイルスおよび他の刺激物質に対する応答において幅広い種類の細胞から誘導される。
ケモカインは、様々な生物学的活性を有する。それらは初め、白血球の遊走および活性化を刺激するその能力によって単離された。ケモカインは、接着分子との関連において、炎症および組織傷害の特定の部位へ白血球のサブセットを動員する。例えば、ケモカインは、様々な白血球上に発現するケモカイン受容体の刺激を介して、自然免疫におけるものを含む化学誘引物質として主に機能し、それによって単球、好中球および他のエフェクター細胞を血液から感染または損傷の部位へ動員し、および免疫反応の部位へのリンパ球の動員を含む獲得免疫における化学誘引物質としても機能する。一般的に、ケモカインおよびケモカイン受容体の発現は、ケモカインが自己分泌または傍分泌の様式で作用する状態で、疾患において上方制御される(Glabinski et al. (1995) Int. J. Dev. Neurosci.、13:153-65; Furie and Randolph (1995) Am. J. Pathol.、146:1287-301; Benveniste E.N. (1997) J. Mol. Med.、75:165-73; Schall et al. (1994) Current Biol.、6: 865-73; Taub et al. (1994) Ther. Immunol.、1:229-46; Baggliolini et al. (1994) Adv. Immunol.、55:97-179; and Haelens et al. (1996) Immunobiol.、195: 499-521; Taub、Cytokine Growth Factor Res.、7: 355-76、1996; Dong et al.、Eur. J. Dermatol.、13: 224-30、2003; Pastore et al.、Eur. J. Dermatol.、14: 203-8、2004: Charo and Ransohoff、N Eng J Med.、354: 610-21、2006)。
ケモカインはまた、これらに限定されないが、小膠細胞およびマクロファージを含む細胞の活性化をも誘導する。それ故、ケモカインは、様々な白血球集団からの活性酸素種、分解酵素、ならびに炎症性および毒性サイトカインの生産および放出を誘導すると考えられる。加えて、ケモカインがネガティブな造血前駆細胞の増殖を調節することが示され、いくつかの CXC ケモカインは血管新生を調節することができる。ケモカインはまた、炎症性の組織破壊、例えば成人呼吸窮迫症候群、心筋梗塞、関節リウマチ、およびアテローム性動脈硬化症を含む多くの疾患においても役割を果たす。
ケモカインは初め、例えば、その機能または起源に従って命名された。本明細書の文章においては、所与のリガンドについての最も一般的な名称が用いられる。後に数字が続くケモカインの群名を用いる最近の系統的な命名法を採用した。例えば、リガンドである単球走化性タンパク質(MCP)-1 およびインターロイキン(IL)-8 は、それぞれ系統的に CCL2 および CXCL8 と称される。それらの受容体は、それぞれ CCR2 および CXCR1/2 と称される(表 x および 7; Bacon、et al.、J. Interferon Cytokine Res.、22: 1067-8、2002; Murphy、Pharmacol. Rev、54: 227-9、2002; Murphy et al., Pharmacol. Rev.、52: 145-76、2000)。ケモカインおよびケモカイン受容体は、本明細書において、一般的および系統的な命名法を参照して互換的に称される。１つの名称が与えられた場合、当業者は対応する名称を知っているかまたは決定することができる。
i.リガンド
上記のケモカインは、主として白血球サブタイプに作用する、小さな(およそ、約 6 から 約 14 kDa)、誘導性の、分泌される、化学誘引物質であるサイトカインのスーパーファミリーである。ケモカイン リガンドは、その一次構造において 15 から 50% の間の同一性を有するが、受容体結合および活性化の原因となるのはそれらの共有される高度に保存された三次元構造である。スーパーファミリーは、一次配列における４つの保存されたシステイン残基の位置(または存在)に基づいて、４つのサブ-ファミリーに分けられる。３つのグループは４つのシステインを含有し、残りのグループは含有しない。該３つのグループは、最初の２つのシステインの配置によって定義される。もし最初の２つのシステインが単一のアミノ酸によって分離されている場合、それらは CXC ファミリー(アルファとも称される)のメンバーである; もし該システインが隣接している場合は、それらは CC ファミリー(ベータとも称される)に分類される; もし該システインが３つのアミノ酸 CX3C によって分離されている場合、それらは第３のグループ(デルタとも称される)のメンバーである。ケモカインの第４のグループである C またはガンマは、他のグループにおける第１と第３のシステインに対応する２つのシステインを含有する。
構造解析によって、ほとんどのケモカインがモノマーとして機能すること、および受容体結合に必要な２つの領域が成熟ポリペプチドの可動性 N-末端の最初の 35 アミノ酸の中に存在することが示される(Clark-Lewis et al. (1995) J Leukocyte Biol., 57:703-11; Beall et al. (1996) Biochem. J. 313:633-40; and Steitz et al. (1998) FEBS Lett 430: 158-64)。ケモカインのダイマーが生じ得、それはケモカイン間で形態が異なる。ダイマーの形成は通常、溶液中において高濃度で起こる(Baggiolini et al. (2001) J Int. Med.、250:91-104)。しかし、ダイマーは希釈されると解離し、モノマーが生物学的に活性な分子を構成する。
一般的に、アルファ ケモカインのメンバーは優先的に好中球および T-リンパ球に対して活性であり、ベータ ケモカインは単球、マクロファージ、好酸球および T-リンパ球に対して活性である。さらに、アルファおよびベータ ケモカイン サブ-ファミリーのいくつかのメンバーは、その活性化および未熟な食細胞からの成熟の後に強い抗原提示特性を示す遊走細胞である樹状細胞に対して活性であり、多くの炎症性疾患の病態生理に関与すると考えられている(例えば、Xu et al.、J. Leukoc. Biol.、60: 365-71、1996; および Sozzani et al.、J. Immunol.、159: 1993-2000、1997; Hashimoto et al.、J Dermatol Sci.、44: 93-9、2006; van Rijt et al.、J Exp Med、201: 981-91、2005)。フラクタルカインと称される第４のヒト CX3C-型 ケモカインが近年報告された(Bazan et al., Nature, 385:640-4, 1997; Imai et al., Cell, 91:521-30, 1997; Mackay, Curr. Biol. 7: R384-6, 1997)。他のケモカインとは違い、フラクタルカインは膜内におよび可溶型で存在する。該可溶型は、単球および T-細胞についての強い化学誘引物質である。このケモカインについての細胞表面受容体は、CX3CR1 と称される。異なる種に由来するケモカインの化学的性質および生理学的作用の間にはわずかな違いが存在し得ることに注意すべきである(Baggliolini et al.、Adv. Immunol.、55: 97-179、1994; and Haelens et al.、Immunobiol.、195: 499-521、1996)。
表 4 は、その異名を含む代表的なケモカインおよび代表的な配列番号を示す。さらに、表 4 は、それぞれの配列番号における位置を基準にして、シグナル配列および成熟ケモカインをコードするアミノ酸の位置を示す。アミノ酸の位置の記載は説明目的であり、提供される態様の範囲を制限する意図は無いことに注意する。ポリペプチドおよびその記載は、類似のポリペプチドとの相同性解析およびアラインメントに基づいて理論的に導き出されることが理解される。したがって、正確な座位は変動し得、各ポリペプチドについて必ずしも同一ではない。ケモカインの対立遺伝子変異体または種変異体も公知である。代表的なケモカインにおける対立遺伝子バリエーションの例は、配列番号:170-191 のいずれかに示される。


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ii. ケモカイン受容体
ケモカインは、G-タンパク質-共役 ７回膜貫通型 ロドプシン様 細胞表面受容体を介して、その活性を媒介する。通常、CXC ケモカインは７つの CXC-受容体 (CXCR1、2、3A、3B、4、5、6)のうちの１以上に結合し、一方、CC ケモカインは１１の CC-受容体(CCR1、2A、2B、3-10)のうちの１以上に結合する。他のケモカイン受容体は、XCR1、CX3CR、D6、CKX-CKR および(ケモカインに対する Duffy 抗原受容体または DARC としても知られる) Duffy を包含する。DARC、D6 および CKX-CKR は、４つ全てのグループからのケモカイン リガンドに結合することができるスカベンジャー ケモカイン受容体である (Hansell et al.、Biochem Soc Trans.、34: 1009-13、2006; Locati et al.、Cytokine Growth Factor Rev.、16: 679-86、2005)。代表的なケモカイン受容体は、これらに限定されないが、ケモカインに対する Duffy 抗原受容体(DARC)、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、CXCR-7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、XCR1、D6 および他のケモカイン受容体を含む。
ケモカインの、その標的細胞に対する受容体結合は、複雑かつ進化し続けている研究領域である。一般的に、受容体は、重複し且つ複雑な様式で、様々なリガンドに結合する。炎症細胞は通常、いくつかのケモカイン受容体を発現し、１つの受容体に対して１より多くのケモカインが結合し得る。例えば、ベータ ケモカイン 受容体 CCR3 は、MCP-3、MCP-4 および RANTES だけでなく他の３つの CC ケモカイン、エオタキシン、エオタキシン-2 および エオタキシン-3 にも結合する(He et al.、Nature、385: 645-49、1997; Jose et al.、J. Exp. Med.、179: 881-7、1994; Jose et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、205: 788-94、1994; Ponath et al.、J. Clin. Invest.、97: 604-12、1996; Daugherty et al.、J. Exp. Med. 183: 2349-54、1996; および Forssman et al.、J. Exp. Med.、185: 2171-6、1997)。エオタキシン、エオタキシン-2 および -3 は、CCR3-特異的である (Ponath et al.、J. Clin. Invest.、97: 604-12、1996; Daugherty et al.、J. Exp. Med. 183: 2349-54、1996; および Forssman et al.、J. Exp. Med.、185: 2171-6、1997; Kitaura et al.、J Biol Chem.、274: 27975-80、1999)。第２の例は、アルファ-ケモカイン CXCR4 (フーシン) HIV 共-受容体である。炎症細胞の様々なサブセット上に存在するこの受容体に特異的に結合し、かつ非常に強力な MNP 細胞 誘引物質である、SDF-1α、SDF-1β、および SDF-2 を含むケモカイン ストロマ細胞-由来因子(SDF)のいくつかのアイソフォームが同定されている(Ueda et al.、J. Biol. Chem.、272: 24966-70、1997; Yi et al.、J. Virol.、72: 772-7、1998; Shirozu et al.、Genomics、28: 495-500. 1995; Shirozu et al.、Genomics、37: 273-80、1996; Bleul et al.、J. Exp. Med.、184: 1101-9、1996; Tanabe et al.、J. Immunol. 159: 905-11、1997; および Hamada et al.、Gene、176: 211-4、1996; Yu et al.、Gene 374: 174-9、2006)。
いくつかの例において、ケモカインの特異的受容体への結合は、特定のアミノ酸モチーフ、例えばトリペプチド ELR モチーフ (Glu-Leu-Arg)の存在または非存在によって影響を受ける。CXC-受容体結合は、かかるモチーフによって影響を受ける。ELR陽性ケモカインは一般的に、CXCR2 受容体に結合し、血管新生性であり、かつ好中球を優先的に標的とする。対照的に、ELR陰性ケモカインは、CXCR3 および 5 に結合し、抗-血管新生性であり、かつ T-リンパ球、NK 細胞、未熟樹状細胞(IDC)および活性化内皮細胞を優先的に標的とする。ELR陰性ケモカイン SDF-1β(CXCR4) および MCP-1 (CCR2) を含むいくつかの CC ケモカインもまた、血管新生性である(Strieter et al. (2005) Cytokine Growth Factor Res.、16:593-609; Salcedo et al. (2000) Blood 96: 34-40)。ケモカインはまた、白血球の活性化および循環から炎症組織への輸送(血管外遊走)に必要な勾配の維持を促進すると考えられる方法で、細胞表面のヘパリンおよびグリコサミノグリカンにも結合する (Schall et al.、Current Biol.、6: 865-73、1994; および Tanaka et al.、Immunology Today、14: 111-15、1993; Neel et al.、Cytokine Growth Factor Rev.、16: 637-58、2005; Johnson et al.、Biochem. Soc. Trans.、32: 366-77、2004)。
表 5 は、代表的なケモカインおよびその受容体についてのケモカイン/ケモカイン アゴニスト特異性を示す。特定のケモカインが異なるケモカイン受容体に拮抗的様式で結合することが示されたことには注意する必要がある。表 5 のデータはヒトに関する。ケモカイン受容体特異性の間には種差が存在し得、ケモカインは異なる受容体について異なる親和性を有し得る。したがって、種-特異的なおよび受容体-特異的な複合体を調製することができる。種のメンバー間には受容体における対立遺伝子の差も存在し得、必要な場合には、対立遺伝子-特異的な複合体を調製することができる。さらに、様々な種がヒト ケモカインのホモログを発現する。例えば、TCA-3 は、ヒト I-309 のマウス ホモログである(I. Goya et al. (1998) J. Immunol.、160:1975-81)。

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iii. ケモカイン/ケモカイン受容体 細胞特性
様々なケモカイン受容体-白血球特異性はかなり重複し得るが、各々のケモカイン受容体は別個の白血球特異性を有する(例えば、表 6 を参照)。例えば、同じケモカインおよび同じ機能に対して特異的な別個の受容体サブタイプが、同じ細胞上に共発現し得る。さらに、同じ細胞上の別々の受容体において作用する別個のケモカイン リガンドが、同じ細胞応答を誘導し得る。さらに、異なるケモカイン リガンドが共通の受容体に結合し、標的細胞に異なる細胞応答を誘導し得る。いくつかのケモカイン受容体は、他の細胞タイプ、例えば様々な組織固有細胞、例えば赤血球、血小板、アストロサイト、内皮細胞、ニューロン、上皮細胞、脂肪細胞および脳の小膠細胞上に発現し得るが、ほとんどのケモカインは、白血球、特に活性化された白血球上に発現する受容体に結合する。表 6 は、ケモカイン受容体の非-網羅的で代表的なリストを含み、白血球サブタイプならびに様々な疾患および非-疾患環境下で各々のケモカイン受容体を発現することが知られている他の細胞タイプの代表的なセットを示す。


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鍵: NK=ナチュラルキラー; Th1=タイプ 1 ヘルパー T 細胞; Th2=タイプ 2 ヘルパー T 細胞; IDC=未熟樹状細胞; MDC=成熟樹状細胞; MNP=単核食細胞 (単球、マクロファージおよび小膠細胞); GC=巨細胞 (多核の融合マクロファージ); TAM=腫瘍関連マクロファージ; PMN=多核(polymononuclear)好中球; MaC=肥満細胞。 注釈: 上の表は、特定のケモカイン受容体を発現する細胞タイプの代表的で非網羅的なリストを表す。
各々の細胞タイプは、特定の細胞タイプ、機能タイプ、組織タイプ、疾患状態および疾患のタイプ、細胞タイプの発達状態、細胞受容体の活性化状態、ならびに周囲の細胞タイプおよび分子を含む細胞外環境に依存するフィンガープリントまたは“ケモプリント(chemoprint)”に類似するケモカイン受容体特性を有する。例えば、単球系列の細胞は CXCR4 ならびに CCR1-3 および 5 受容体と結合する傾向があり; 好酸球および好塩基球は CCR1-3 ならびに CXCR3 および 4 と; PMN は CXCR1、2 および CCR1 と; B-細胞は CCR1-7 および CXCR3-5 と; Th1 細胞は CXCR3 および CCR5 と; そして最後に、Th2 細胞は CCR2、3、4 および 8 と結合する傾向がある(例えば、Baggiolini、J. Intern. Med.、250: 91-104、2001)。
一般的に、標的細胞を横断する結合親和性、特異性および受容体サブタイプの差異的分布は、所与のケモカインが炎症性過程を引き起こす寄与を決定する。１つの設定において決定される所与のケモカインの生物学的特性は、別の設定においては、特に標的細胞の割合および活性化状態が外傷または疾患の間に変化する場合には、当てはまらないことがある。したがって、所与のケモカインの生物学的特性は、必要な場合には、ケースバイケースで確立することができる。例えば、単球走化性タンパク質-3 (MCP-3)の作用は MCP-1 の作用と類似するが、前者はより広い範囲の細胞および受容体に結合する。異なる細胞上の異なる受容体発現に加えて、細胞表面上に発現する受容体の数が異なり得る。例えば、CCR1 および CCR2 は、単球およびリンパ球あたり 3,000 受容体の割合で発現するが、一方、好酸球上には 約 50,000 の CCR3 受容体が存在する(Borish and Steinke、J Allergy Clin Immunol.、111: S460-75、2003)。かかる違いは、遊走方向および応答時間についての暗示となり得る。例えば、T 細胞上の高密度の CXCR4 は、HIV によって誘導されるより速い死と相関し、CCR2 および CCR4 を含むより高密度の受容体は、アレルギー性喘息の患者における肺胞 T 細胞の動員に関連する (Kallinich et al. (2005) Clin. Exp. Allergy 35、26-33; Lelievre et al. (2004) AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 1230-43)。
同様に、ケモカイン受容体の特性はしばしば、外傷または疾患の間に変化する。ケモカイン リガンド/受容体の軸(axes)は、構成的/恒常的、誘導性/炎症性または両方に分類される (例えば、表 7 を参照)。そのため、炎症性ケモカイン リガンドおよびその受容体は、疾患または外傷が起こるまでは必ずしも発現しない。例えば、静止状態の細胞は、一旦活性化されると、受容体発現を迅速に変化させおよび上方制御する (例えば、Ghirnikar、et al. (2000) Neurosci. Res. 59:63-73: Henneken et al. (2005) Arthritis Res. Ther. 7: R1001-13; Klitgaard et al. (2004) Acta. Ophthalmol. Scand. 82: 179-83; McDonald et al. (2001) IDrugs 4: 427-42)。ケモプリントの同一性は、環境中における炎症性および非炎症性のメディエーターのタイプおよび存在量にも依存する (例えば、Porcheray et al. (2006) Virology 349: 112-20; Stout and Suttles (2004) J. Leukoc. Biol. 76: 509-13; Sozzani (2005) Cytokine Growth Factor Res. 16: 581-92; Mantovanni et al.、Trends Immunol.、25: 677-86、2004; 発行の前に公開された Ben-Baruch、Cancer Metastasis Rev.、2006)。表 7 は、恒常的なまたは炎症性の条件下における機能の結果としての、ケモカイン/受容体の軸(axes)の代表的な発現プロファイルを示す。

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表 7 は代表的なもののみであり、異なるケモカイン/受容体ペアの発現は、多くの因子、例えば、これらに限定されないが、疾患の段階または重症度に依存することが理解される。例えば、特定の白血球サブタイプは、臨床状態が特定の段階に達するまでは存在しない。受容体発現もまた、変化し得る。例えば、ケモカイン受容体は、ラットにおいては脊髄挫傷傷害より前には検出されない。CCR2、CCR3、CCR5、CCR10 および CXCR4 の発現は、傷害後１日から傷害後 14 日まで、経時的に、異なって上方制御された(Ghirnikar、et al. (2000) Neurosci. Res.、59:63-73)。
特定のリガンド/受容体の軸(axes)は、特定の疾患において卓越した役割を果たす。例えば、MCP-1/CCR2 の軸(axis)は、これらに限定されないが、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、多発性硬化症、脊髄傷害(SCI)、癌およびいくつかのクラスの慢性腎臓疾患(CKD)を含む広範囲の疾患において重要である。別の例において、SDF-1β/CXCR4 は、関節炎ならびに卵巣、前立腺、乳房および脳の癌を含む多くの癌に関連する。別の例において、MIG、IP-10、I-TAC/CXCR3A 軸(axes)は、臓器移植拒絶、１型糖尿病、増殖性糸球体腎炎(GN)および多発性硬化症に関連する。別の例において、エオタキシン、エオタキシン-2 および エオタキシン-3/CCR3 は、喘息、好酸球性肺炎、食道炎および炎症性皮膚疾患において重要な軸(axes)である。
ほとんどの場合、特定の疾患状態において、複数のケモカインリガンドおよびケモカイン受容体が発現する(例えば、Mantovani (1999) Immunol. Today 20: 254-7; Borish and Steinke (2003) J. Allergy Clin. Immunol.、111: S460-75; Charo and Ransohoff、N Engl J Med.、354: 610-21、2006)。例えば、多発性硬化症(MS)の実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおいて、T 細胞は CCR5、CCR2 および CXCR3 を発現し得る(Matsui et al. (2002) J. Neuroimmunol.、128: 16-22)。別の例では、インビトロの血液脳関門(BBB)血管外移動の研究において、T 細胞は CCR2、CCR5 および CXCR3 を発現し得るが、CCR2 を発現する MNP および T 細胞の CNS 血管外遊走には、MCP-1/CCR2 軸(axes)が重要である(Mahad et al. (2006) Brain 129: 212-23; Callahan et al. (2004) J. Neuroimmunol.、153: 150-7)。このように、特定の疾患または外傷を研究すれば、毒素複合体のための１または複数の標的化剤を選択するに際してあらゆる所与の１または複数のリガンド/受容体軸の空間的、時間的、生物学的および臨床的な特性を確立することができる。
この複雑性に加えて、病的状態においては、免疫細胞および寄与的(contributing)組織耐性細胞(TRC)は、表現型の著しい変化を受け得、特定の細胞タイプには通常は関連しないケモカイン受容体を発現し得る。例えば、CXC ケモカインの PMN に対する優先性に関わらず、血管炎 敗血症のラットモデルおよび敗血症のマウスモデルにおいて、CC ケモカイン MCP-1 および MIP-1α による著しい PMN の化学誘引が起こった(Johnston et al. (1999) J. Clin. Invest. 103:1269-76; Speyer et al. (2004) Am. J. Pathol. 165: 2187-96)。受容体の変化は、MNP、T リンパ球および MaC についての疾患においても起こり得る。それらは、特定の炎症性の微小環境において CXCR1 および CXCR2 を発現するよう誘導され得る (Smith et al. (2005) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289: H1976-84; Lippert et al. (2004) Exp. Dermatol. 13: 520-5)。好酸球は、MCP-1 についての同族受容体である機能的 CCR2 をしばしば発現する(Dunzendorfer (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108: 581-7)。
iv. 代表的なケモカイン標的化剤
本明細書で提供されるリガンド-毒素複合体において用いられるケモカイン リガンドは通常、免疫調節性のまたは炎症性の過程、例えば二次的な組織損傷を促進する病的炎症に関与する白血球または他の寄与的(contributing)エフェクター細胞を含む１以上の免疫エフェクター細胞上に発現する少なくとも１つのケモカイン受容体に対して、しかし通常は１より多くのケモカイン受容体に対して、特異性を有するあらゆるケモカインである。かかる受容体は一般的に、G-タンパク質共役で７回膜貫通-ドメインのロドプシン-様受容体のスーパーファミリーのメンバーであり、これらに限定されないが、例えば、ケモカインについての Duffy 抗原受容体(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、CXCR-7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、XCR1 および他のケモカイン受容体として当該技術分野において知られる１以上の受容体を含む。いくつかの例において、本明細書で提供される複合体における標的化剤としての使用のために選択されるケモカインは、特定の受容体に結合することができる一方、他の例においては、選択されるケモカインは１より多くの受容体に結合することができる。加えて、複合体における標的化剤としての使用のために選択されるケモカインは、他のケモカインと重複するおよび異なる受容体特異性を示し得る(例えば、表 5 を参照)。
かかるケモカイン リガンドの中には、アルファおよびベータ ケモカインならびに他の類似のケモカインのサブグループのあらゆるものを含む上記の表 4 に示されるあらゆるものが包含される。特に、リガンド-毒素複合体中のタンパク質性リガンド部分としての使用にとって現在好ましいケモカインは、これらに限定されないが、当該技術分野において IL-8 として知られるアルファ-ケモカイン; 顆粒球走化性タンパク質-2 (GCP-2); 増殖関連癌遺伝子-α(GRO-α)、GRO-β および GRO-γ; 上皮細胞由来 好中球活性化ペプチド-78 (ENA-78); 結合組織活性化ペプチド III (CTAP III); 好中球活性化 ペプチド-2 (NAP-2); インターフェロン-γに誘導されるモノカイン (MIG); インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10、それは主に好中球および T 細胞に対してしかしそれらには限らず強い化学誘引作用を有する); ストロマ細胞由来因子 SDF-1α、SDF-1β および SDF-2; 当該技術分野において単球走化性タンパク質 MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4 および MCP-5 として知られるベータ-ケモカイン; マクロファージ炎症性タンパク質 MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4 および MIP-5; マクロファージ由来ケモカイン(MDC); ヒト ケモカイン 1 (HCC-1); RANTES; エオタキシン 1; エオタキシン 2; エオタキシン-3; TARC; SCYA17 および I-309; 樹状細胞ケモカイン-1 (DC-CK-1); γ-ケモカイン、リンホタクチン; CX3C ケモカインであるフラクタルカインの可溶性型(それは主に単球、マクロファージ、好酸球および T 細胞に対してのしかしこれらに限らない化学誘引物質である); 当業者に公知のあらゆる他のもの; およびケモカイン受容体に結合するよう設計されたあらゆる合成のまたは改変されたタンパク質を含む。ケモカインは、常套の方法を用いて天然の源(natural source)から単離することができ、またはケモカインをコードする核酸を用いて発現させることができる。生物学的に活性なケモカインは、大腸菌において組換えにより発現されている(例えば、R&D Systems、Minneapolis、MN から市販されているもの)。
他のケモカイン標的化剤の例は、１以上の免疫細胞、例えばあらゆる二次組織損傷促進性細胞、例えば、アシル化 LDL スカベンジャー受容体 1 および 2、ならびに LDL についての受容体である非常に低密度なリポタンパク質-1 (VLDL-1)、VLDL-2、糖タンパク質 330/メガリン、リポタンパク質受容体-関連タンパク質 (LRP)、アルファ-2-マクログロブリン、sorLA-1 に結合するおよび/またはそれを活性化するあらゆるものを含む。未だ命名されていない、特に有用な受容体結合タンパク質は、約 39,000 ダルトンの分子量を有し、タンパク質、例えば低密度リポタンパク質(LDL)-受容体ファミリーのメンバーに結合し、その活性を調節する。
他のケモカインが公知であること、および、かかるケモカインおよびそれに特異的な受容体が、本明細書に記載される通り、同定され得、必要に応じて生産され得、複合体を作成するために用いられ得ることが理解される。以下で詳細に説明される通り、得られる複合体を用いることができる疾患は、特異性およびそれについての受容体が発現する細胞集団によって決定することができ、本明細書において例証され、説明されおよび/または引用されたものを含む当業者に公知のインビトロおよびインビボのモデルを用いて経験的に決定することもできる。
b. 非ケモカイン サイトカイン
ケモカイン受容体をも発現するあらゆるものを含む二次組織損傷に関与する細胞タイプ上の特定のサイトカイン受容体に結合する非ケモカイン サイトカインである古典的なサイトカインを含む複合体もまた、本明細書で提供される複合体においておよび本明細書で提供される複合体を作成する方法において、用いることができる。かかる古典的サイトカインを含む複合体は、腫瘍細胞を標的化することによって、治療、例えば癌治療のために用いられてきた。本明細書において、サイトカインが、ケモカイン-受容体を有する細胞、例えば腫瘍を浸潤する白血球および望ましくない炎症反応に関連する他の細胞に結合するその能力について選択されることが意図される。
ケモカインは、表面上はサイトカインに分類されるが、それらは別々のクラスのタンパク質である。それらがサイトカインとしての分類されるのは、正確というよりむしろ歴史的なものである。新規なタンパク質が発見されると、それらは例えばその明白な活性またはその細胞源(cellular source)にちなんで命名される。そのため、初期のサイトカインは、ホルモンであると考えられたかまたは増殖因子と呼ばれた。サイトカインは、ホルモンおよび増殖因子と多くの特性を共有するため、区別はこれまでもそして現在も未だ曖昧である。例えば、総説において(例えば、Wells et al. (1996) Ann Rev Biochem 65:609-34 を参照)、サイトカインを説明するために“造血性ホルモン/サイトカイン”という語句が用いられている(様々なコロニー刺激因子との生物学的活性の類似性についての言及)。いくつかのサイトカイン活性は、最初にリンパ球および単核球細胞から単離され、それぞれリンホカインおよびモノカインと名付けられた。これらの分子が広い活性スペクトルを示しかつ多数の細胞タイプに由来することが理解された時、“サイトカイン”の用語が作られた。
古典的サイトカイン(12-40 kDa タンパク質)は、インターフェロン(IFN)、腫瘍壊死因子(TNF)およびインターロイキン(その活性が白血球間の情報交換を含むことからこう呼ばれる)、造血性増殖因子、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子などを含む。これらのサイトカインは、構造的に相同なクラス I サイトカイン受容体を介して多くの異なる細胞タイプの増殖および分化を調節する。クラス I 受容体は通常、２つのポリペプチド鎖、“リガンド-特異的サブユニット および βシグナル伝達サブユニットで構成される。このクラスの受容体は、同一のサブユニットおよび第３のサブユニットの有用性に基づいて細分され得る。インターフェロンは、構造的に異なるセットの(α、βおよびγ)クラス II 受容体を介して作用する。現在、異なる TNF 受容体の新たなファミリーが出現しつつある。
サイトカイン受容体は普通、JAK/STAT 細胞内シグナル経路を介してシグナルを伝えるが、他のシグナル伝達カスケードを通してシグナルを伝えることもできる。有意に、これらの受容体に結合するインターロイキンなどのサイトカインのいずれもが、(上記の)構造的に異なるケモカイン受容体のいずれにも結合せず、いずれのケモカイン リガンドも、上記のサイトカイン受容体のいずれにも結合しない。
従って、非ケモカイン サイトカインへの言及は、古典的サイトカインを包含することを意図される。細胞、例えばケモカイン受容体をも有する細胞上の受容体に対して複合体を標的化するためのリガンド部分として有用な非ケモカイン サイトカインは、これらに限定されないが、内皮単球活性化ポリペプチド II (EMAP-II)、コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球-マクロファージ-CSF (GM-CSF)、顆粒球-CSF (G-CSF)、マクロファージ-CSF (M-CSF)、インターロイキン 1 (IL-1)、IL-1a、IL-1b、インターロイキン 2 (IL-2)、インターロイキン-3 (IL-3)、インターロイキン 4 (IL-4)、インターロイキン 5 (IL-5)、インターロイキン 6 (IL-6)、インターロイキン 7 (IL-7)、インターロイキン 8 (IL-8)、インターロイキン 10 (IL-10)、インターロイキン 12 (IL-12)、インターロイキン-13 (IL-13)、インターロイキン 15 (IL-15)、インターロイキン 18 (IL-18)、インターフェロン アルファ (IFNα)、インターフェロン ベータ (IFNβ)、インターフェロン ガンマ (IFNγ)、インターフェロン オメガ (IFNω)、インターフェロン タウ (IFNτ)、インターフェロン ガンマ 誘導因子 I (IGIF)、Flt-3 リガンド、エリスロポエチン (EPO)、腫瘍壊死因子 (TNF)、増殖-誘導リガンド (APRIL)、CD40 リガンド、CD30 リガンド、CD27 リガンド、fas リガンド、4-1BB リガンド、LIGHT、HVEM、TWEAK、GITRL、TNF-関連 アポトーシス-誘導リガンド (TRAIL)、TNF-関連 活性化-誘導 サイトカイン (TRANCE)、TNF およびアポトーシス リガンド-関連 白血球-発現 リガンド 1 (TALL-1)を含み、それらは炎症反応に関与する細胞上、例えば二次組織損傷促進性細胞上のサイトカイン受容体のファミリーに結合する。
本明細書において提供される、あらゆる非ケモカイン サイトカインによる標的化のための代表的なサイトカイン受容体は、これらに限定されないが、ヘマトポエチン ファミリー受容体 (例えば、IL-2 から IL-7 および GM-CSF についての受容体)、インターフェロン ファミリー受容体 (例えば、IFNα、IFNβ および IFNγ についての受容体)、および 腫瘍壊死因子ファミリー受容体 (例えば、これらに限定されないが、あらゆる TNF 受容体 (TNFR)、例えば、これらに限定されないが、TNFR1、TNFR2、LtβR、Fas、CD40、CD27、D30、4-1BB、OX40、DR3、DR5 および HVEM を含む TNFα、リンホトキシン、Fas リガンド、LIGHT、BTLA、CD40 リガンド、4-1BB リガンド、OX-40 リガンドなどについての受容体)を含む。
c. 抗体リガンド部分
リガンド-毒素複合体中の標的化剤はまた、炎症反応に関与する細胞の表面上に発現する受容体、特にケモカイン受容体、サイトカイン受容体およびケモカイン受容体を発現する細胞上に発現する他の受容体に対して特異的な抗体、特にモノクローナル抗体またはその機能的な断片であり得る。モノクローナル抗体は、ケモカイン受容体、例えば、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR-10、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、DARC、XCR1、CX3CR-1 などの受容体に対して特異的であることが好ましい。
いくつかの場合において、抗体は、非ケモカイン サイトカイン受容体、例えば、サイトカイン EMAPII、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13 のあらゆる１以上のものについての受容体に対して特異的であり得る。これらの抗体を含有する複合体は、標的化されたサイトカイン受容体を発現する細胞への標的化のために用いることができる。かかる細胞は、二次組織損傷に関与する細胞を含む。標的化された細胞は、１以上のケモカイン受容体をも発現し得る。
複合体において用い得るモノクローナル抗体の非限定的な例は、これらに限定されないが、MAC-1、MAC-3、ED-1、ED-2、ED-3 ならびに以下の抗原 CD5、14、15、19、22、34、35、54 および 68; OX4、6、7、19 および 42; Ber-H2、BR96、Fib75、EMB-11、HLA-DR、LN-1 およびトウゴマ(Ricinus communis)のアグルチニン-1 に対するモノクローナル抗体を含む。
抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解によって、または該断片をコードする DNA の大腸菌における発現によって、調製することができる。抗体断片は、常套の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、F(ab')2 と表わされる 5S 断片を提供するために、ペプシンでの抗体の酵素的切断によって作成することができる。この断片は、一価の断片 3.5S Fab' を作成するため、チオール還元剤および所望によりジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基のための保護基を用いてさらに切断することができる。代わりに、ペプシンを用いる酵素的切断は、２つの一価の Fab' 断片および１つの Fc 断片を直接に生成する(例えば、参考文献も引用によって本明細書に全体が包含される米国特許第4,036,945号および第4,331,647号ならびにそこに含まれる参考文献を参照されたい; Porter、R.R.、(1959) Biochem. J.、73: 119-126 も参照されたい)。抗体を切断する他の方法、例えば一価の軽-重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術も、インタクトな抗体によって認識される抗原に対して該断片が結合する限り、用いることができる。
Fv 断片は、VH および VL 鎖の結合を含む。この結合は、Inbar et al. (1972) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 69:2659-62 に記載される通り、非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって結合され得、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋-結合され得る。通常、Fv 断片は、ペプチド リンカーによって連結された VH および VL 鎖を含む。これら一本鎖の抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドによって連結された VH および VL ドメインをコードする核酸分子を構築することによって調製される。結果として得られるコンストラクトは発現ベクターに挿入され、該ベクターが宿主細胞、例えば大腸菌に導入される。組換え宿主細胞は、２つの V ドメインを架橋するリンカー ペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。sFv を生産する方法は、例えば、Whitlow and Filpula (1991) Methods、2: 97-105; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77; および Ladner et al.、米国特許第4,946,778号)によって記載されている。
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDR ペプチド(“最小の認識単位”)は、興味の対象である抗体の CDR をコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。かかる遺伝子は、例えば、抗体産生細胞の RNA から可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される(例えば、Larrick et al. (1991) Methods、2: 106-10; および/または landi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837 を参照)。
二次組織損傷促進性の細胞上のケモカイン受容体または非ケモカイン サイトカイン受容体に結合する抗体は、免疫する抗原としての興味のある小さなペプチドを含有するインタクトなポリペプチドまたは生物学的に機能的な断片を用いて調製することができる。動物を免疫するために用いられるポリペプチドまたはペプチド(例えば、翻訳された cDNA または化学合成由来の)は、所望により、担体タンパク質に結合させることができる。一般的に用いられる、ペプチドに化学的に結合する担体は、これらに限定されないが、キーホールリンペット ヘモシアニン (KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン (BSA) および破傷風トキソイドを含む。次いで、結合したペプチドは、動物(例えば、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫するために用いられる。
モノクローナル抗体の調製は、当該技術分野において周知である (例えば、Kohler et al. (1975) Nature 256:495-7; および Harlow et al.、in: Antibodies: a Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Pub.、1988) を参照)。手短に言えば、モノクローナル抗体は、抗原を含有する組成物をマウスに注入し、血清サンプルを除去することで抗体生産の存在を確認し、脾臓を取り除いて B リンパ球を得、該 B リンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作出し、該ハイブリドーマをクローン化し、前記抗原に対する抗体を生産する陽性クローンを選択し、そして該ハイブリドーマの培養から抗体を単離することによって得ることができる。モノクローナル抗体は、様々な十分に確立された技術によって、ハイブリドーマの培養から単離および精製することができる。かかる単離技術は、プロテイン-A セファロースでの親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含み、かつ当業者に周知である(例えば、Pharmacia Monoclonal Antibody Purification Handbook (例えば、Cat. # 18-1037-46) を参照)。
抗体は、類人猿の抗体から得ることもできる。ヒヒにおいて治療上有用な抗体を産生させるかかる方法は、当業者に公知である(例えば、Goldenberg et al. (1991) 公開された国際PCT出願第WO91/11465号 および Losman et al. (1990) Int. J. Cancer、46:310-314 を参照)。治療上有用な抗体は、“ヒト化”モノクローナル抗体から得ることができる。かかる方法および抗体は公知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変鎖からのマウスの相補性決定領域をヒトの可変ドメインへ移し、次いでフレームワーク領域中のヒト残基をマウスの対応物で置換することによって作成される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、マウス定常領域の免疫原性に付随する潜在的な問題を除去する。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技術は、例えば、引用によって本明細書に全体が包含される Orlandi et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833-7 によって記載される。ヒト化モノクローナル抗体を生産するための技術は、例えば、Jones et al. (1986) Nature 321:522-5; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-7; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-6; Carter et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285-9; Sandhu (1992) Crit. Rev. Biotech. 12:437-62; および Singer et al. (1993) J. Immunol. 150:2844-67 によって記載される。
抗イディオタイプ技術は、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を作成するために用いることができる。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して作られる抗イディオタイプ モノクローナル抗体は、第１のモノクローナル抗体によって結合されるエピトープの“イメージ”である結合ドメインを超可変領域中に有する。
d. 他の標的化剤および受容体標的
本明細書において提供される複合体は、該複合体を細胞表面受容体へ標的化するあらゆる標的化剤を含有し得る。ケモカイン、サイトカインおよび抗体を含む上記の標的化剤に加えて、かかる標的化剤は、該標的化剤がそれが結合する細胞表面受容体によってインターナライズされる限り、例えば、これらに限定されないが、増殖因子、ホルモン、および他のリガンドまたは対立遺伝子変異体、変異タンパク質、またはその断片をも含む。かかる標的化剤は、本明細書において提供される方法を用いてリガンド-毒素複合体を生成するために用いられ得る。さらに、かかる標的化剤は、本明細書で提供される改変 SA1 変異体を含む改変毒素または毒素変異体に対して直接的または間接的に結合した標的化剤を含有するリガンド-毒素複合体を構築するために、用いられ得る。
代表的な標的化剤は、これらに限定されないが、形質転換増殖因子ベータ(TGF-β)、リーシュマニア伸長開始因子(LEIF)、血小板-由来 増殖因子(PDGF)、表皮増殖因子(EGF)、アンフィレギュリン、ニューレグリン-1、ニューレグリン-2、ニューレグリン-3 もしくは ニューレグリン-4、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、神経増殖因子(NGF)、胎盤増殖因子(P1GF)、脳-由来 神経栄養因子 (BDNF)、ベータセルリン (BTC)、ミッドカイン、インヒビン、内皮増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子 (IGF)、ニューロトロフィン-2 (NT-2)、ニューロトロフィン-3 (NT-3)、ニューロトロフィン-4 (NT-4)、ニューロトロフィン-5 (NT-5)、グリア細胞株由来 神経栄養因子 (GDNF)、毛様体神経栄養因子 (CNTF)、プレイオトロフィン、幹細胞因子 (SCF)、オンコスタチン M、感覚および運動ニューロン由来因子 (SMDF)、白血病阻害因子 (LIF)、ミュラー管抑制因子 (MIS)、カルディオトロフィン-1(cardiotrophin-1)、トロンボポエチン、アンジオポエチン、アクチビン、骨形成タンパク質 (BMP)、APM1、成長ホルモン (GH)、レプチンおよびプロラクチンを含む増殖因子、または対立遺伝子変異体、変異タンパク質もしくはその断片を含む。病原体の食作用またはエンドサイトーシスに関与する病原体認識受容体 (PRR)もまた、標的化剤として包含される。例えば、他の代表的な標的化物質は、マンノース受容体 (MR)、デクチン-1、およびこれらに限定されないが、サーファクタント タンパク質 A (SP-A)、サーファクタント タンパク質 D、マンノース結合レクチン (MBL)もしくは補体タンパク質 1q (C1q)に対する受容体を含むコレクチンもしくはコレクチン様タンパク質についての受容体を標的とする分子を含む。好ましい標的化剤は、受容体に結合すると細胞内へインターナライズされるポリペプチドである。
かかる標的化剤を用いて作成されるリガンド-毒素複合体は、その病態に関与する細胞成分を有するあらゆる疾患または障害を処置するために用いることができる。かかる疾患または障害のうちで好ましいのは、病理学的細胞成分を有するあらゆる疾患または障害であり、ここで、細胞成分は標的化され得る１以上の細胞表面受容体を発現する。他の疾患および障害、特に、これらに限定されないが、癌および網膜症、例えば眼球性のまたは糖尿病性の網膜症を含む血管新生疾患も、例えば血管新生に関与する内皮細胞の標的化を介して、考慮される。
増殖因子
炎症および/または二次組織損傷に関与する細胞タイプ上のエンドサイトーシス細胞表面受容体に結合する増殖因子もまた、本明細書で提供される複合体のための標的化剤として用いることができ、かつ、本明細書で提供される方法において用いることができる。かかる増殖因子は、リガンド-毒素複合体を内皮細胞へ標的化することを介して、癌および他の疾患、例えば眼疾患または様々な慢性炎症性状態を含む血管新生疾患に関与する細胞を標的化するための標的化剤としても用いることができる。増殖因子、例えば血管内皮増殖因子 (VEGF) またはアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するものを含むそのあらゆる改変形(modified version)は、それらが受容体に結合する能力を保持し、インターナライズされる限り、毒素部分を特定の細胞タイプに標的化するために用いることができる(例えば、米国特許出願第2004/0166565号およびUS20010031485号を参照)。したがって、かかる増殖因子は、本明細書で提供される改変志賀毒素 A1 変異体を含む改変毒素または毒素変異体に直接的または間接的に結合した増殖因子を含有するリガンド-毒素複合体を構築するために用いることができる。標的とされる細胞タイプは、例えば、腫瘍増殖および慢性の炎症性状態としばしば関連する新たな血管を成長させる過程である血管新生に関与する内皮細胞を含み得る。
血管新生は、新たな血管を成長させる厳密に制御された過程である(例えば、総説として、Folkman & Shing (1992) J Biol. Chem.、267: 10931-4; Hanahan (1997) Science、277:48-50 を参照されたい)。通常の環境下では、血管新生は、胚発生、創傷治癒および黄体発生の間にのみ起こる。血管新生は、多くの病態、例えば固形腫瘍および転移の増殖、様々な眼疾患、慢性の炎症性状態ならびに虚血傷害において起こる(総説として Folkman (1995) Nat. Med.、1:27-31 を参照されたい)。そのため、増殖する内皮細胞は、いくつかの主要な病態の治療のためのユニークな標的を提示する。
VEGF タンパク質は、血管新生の正の制御因子である分泌される二量体糖タンパク質のファミリーである (例えば、Cross and Claesson-Welsh、Trends Pharmacol Sci.、22: 201-7、2001)。代表的な VEGF タンパク質は、これらに限定されないが、VEGF-A (UniProt 番号 P15692)、VEGF-B (UniProt 番号 P49765)、VEGF-C (UniProt 番号 P49767)、VEGF-D (UniProt 番号 O43915) および PGF (胎盤増殖因子、VEGF-関連タンパク質; UniProt 番号 Q53XY6)、ならびにスプライスバリアント、対立遺伝子変異体またはその種変異体を含む。代表的な VEGF-A 前駆体ポリペプチドは、配列番号204-210 に示され、配列番号204-206 のアミノ酸 1-26 に対応する 26アミノ酸のシグナルペプチドおよび選択的スプライシングの結果としての様々な長さの成熟ポリペプチドを含む。例えば、成熟 VEGF-A ポリペプチドは、長さが 206、189、183、165、148、145 または 121 アミノ酸であり得る。VEGF-B 前駆体ポリペプチドは、配列番号 211 および 212 に示され、配列番号 211 および 212 のアミノ酸 1-21 に対応する 21アミノ酸のシグナルペプチドならびに長さが 186 および 167 アミノ酸でありそれぞれ配列番号 211 のアミノ酸 22-207 および配列番号 212 の 22-188 に対応する成熟ポリペプチドを含む。VEGF-C についての前駆体ポリペプチドは、配列番号213 に示され、配列番号213 のアミノ酸 1-31 に対応する 31アミノ酸のシグナルペプチド、配列番号213 のアミノ酸 32-111 および 228-419 に対応する２つのプロペプチド配列ならびに配列番号213 のアミノ酸 112-227 に対応する 116 アミノ酸の成熟ポリペプチドを含む。VEGF-D についての前駆体ポリペプチドは、配列番号214 に示され、配列番号214 のアミノ酸 1-21 に対応する 21アミノ酸のシグナルペプチド、配列番号214 のアミノ酸 22-88 および 206-354 に対応する２つのプロペプチド配列ならびに配列番号214 のアミノ酸 89-205 に対応する 117 アミノ酸の成熟ポリペプチドを含む。PGF についての前駆体ポリペプチドは、配列番号215 に示される。
内皮細胞に対する VEGF の作用は、チロシンキナーゼ受容体、VEGFR-1 (flt-1)、VEGFR-2 (KDR/flk-1) および VEGFR-1-関連 によって媒介される。これらの受容体は、内皮細胞上に優先的に発現する。該受容体は、免疫グロブリン スーパーファミリーに属し、細胞外ドメイン中に７つの Ig様ループを含有し、血小板由来 増殖因子についての受容体と相同性を有する、１回(single span)膜貫通型タンパク質 チロシンキナーゼである。これらの受容体への VEGF の結合は、受容体の二量体化を誘導し、該二量体における SH2 および SH3 ドメインのチロシン リン酸化がこれに続く。次いで KDR/flk-1-VEGF 複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスを介してインターナライズされる。このように、それはその１または複数の受容体を発現する細胞によってインターナライズされ得るため、あらゆる VEGF タンパク質、例えば本明細書に記載されるあらゆるものが、改変 RIP ポリペプチド、例えば 改変 SA1 ポリペプチドまたはその活性の断片を含む複合体において、標的化剤としての機能を果たし得る。
2. リンカー部分
本明細書で提供される複合体を調製する際、RIP 毒素、例えば本明細書で提供される 改変 SA1 毒素は、標的化剤へ直接的または間接的に結合させられる。例えば、本明細書で提供される複合体は、以下の成分を含む: (標的化剤)n、(L)q および (標的化物質)m、ここで、結果として得られる複合体が標的化受容体に結合し、インターナライズされ、標的化物質を送達する限り、L は、標的化剤を毒素に結合させるためのリンカーであり; 標的化剤は、細胞表面上に発現する受容体に結合しそれによってインターナライズされるあらゆる部分であり; 独立に選択される m および n は、少なくとも 1 であり; そして q は 0 以上である。標的細胞に対する改変 RIP 毒素の毒性を低減するため、リンカー部分のタンパク質性リガンドへの付着が、標的細胞への、すなわち標的細胞上の受容体へのタンパク質性リガンドの結合を実質的に妨害しないか、またはリガンド-毒素のインターナリゼーションまたは代謝を実質的に妨害しない限り、複合体における成分の結合は、２つの部分を付着させるための、当該技術分野において現在知られるあらゆる方法によるものであり得る。結合は、これらに限定されないが、イオンおよび共有結合ならびにあらゆる他の十分に安定な結合(associate)を含むあらゆる型の結合であり得、これによって、標的化物質 (例えば、改変 RIP 毒素)が、複合体が標的化される細胞によってインターナライズされる。
標的化剤、例えばケモカインは、所望により１以上のリンカーを介して 改変 RIP 毒素またはその活性の断片に結合させられる。リンカー部分は、所望の特性に応じて選択される。例えば、リンカー部分の長さは、リガンド結合の速度論(kinetics)および特異性を最適化するために選択され得、それはリガンドの標的受容体への結合によって誘導されるあらゆる立体構造変化を含む。リンカー部分は、タンパク質性リガンド部分と標的細胞受容体が自由に相互作用することを可能にするのに十分な長さで、かつ十分に柔軟であるべきである。リンカーが短すぎるかまたは硬すぎる場合には、タンパク質性リガンド部分と細胞毒素の間に立体障害が存在し得る。リンカー部分が長すぎる場合には、細胞毒素は、生産の過程でタンパク質分解され得るか、またはその毒性作用を効果的に標的細胞へ送達することができない。リンカー、例えば化学的リンカーは、当該技術分野において公知の多数のプロトコールを用いて、精製リガンドへ付着させることができる (Pierce Chemicals “Solutions, Cross-linking of Proteins: Basic Concepts and Strategies,”Seminar #12, Rockford, IL を参照)。
a. 代表的なリンカー
当業者に公知のあらゆるリンカーが、本明細書において用いられ得る。一般的に、異なるセットのリンカーが、化学的に作成された複合体におけるリンカーからの融合タンパク質である複合体において用いられる。化学的に結合した複合体に適するリンカーおよび結合は、これらに限定されないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、立体障害のある(hindered)ジスルフィド結合および遊離の反応性の基、例えばアミンおよびチオール基の間の共有結合を含む。これらの結合は、ヘテロ二官能性の試薬を用いて１または両方のポリペプチド上に反応性のチオール基を生成し、次いで１つのポリペプチド上のチオール基を、他方で反応性のマレイミド(maleimido)基またはチオール基が付着していても良い反応性のチオール基またはアミン基と反応させて生成される。他のリンカーは、より酸性の細胞内区画において切断される酸開裂性リンカー、例えばビスマレイミドエトキシプロパン(bismaleimideothoxy propane)、酸不安定トランスフェリン複合体およびアジピン酸ジヒドラジド(diihydrazide); UV または可視光へ曝露されると切断される架橋剤、およびリンカー、例えば様々なドメイン、例えばヒト IgG1 の定常領域からの CH1、CH2 および CH3 を含む(Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386 を参照)。いくつかの態様において、各リンカーの所望の特性を利用するために、いくつかのリンカーが含まれ得る。化学的リンカーおよびペプチド リンカーは、リンカーをケモカイン受容体標的化剤および改変 RIP 毒素に共有結合させることによって挿入することができる。以下に記載されるヘテロ二官能性の物質は、かかる共有結合を生じさせるために用いることができる。ペプチド リンカーは、融合タンパク質としてリンカーおよび標的化剤、リンカーおよび改変 RIP 毒素、またはリンカー、改変 RIP 毒素および標的化剤をコードする DNA を発現させることによっても結合させることができる。可動性のリンカーおよび複合体の溶解度を増大させるリンカーが、使用について考慮される; 単独のまたは他のリンカーを伴うもののいずれかも本明細書において考慮される。
リンカーは、改変 RIP 毒素と標的化剤を結合させるのに適したあらゆる部分であり得る。かかる部分は、これらに限定されないが、ペプチド結合; 通常は１から 約 60 の間のアミノ酸を含有するアミノ酸およびペプチドの結合; 化学的リンカー、例えばヘテロ二官能性の開裂性架橋を含む。他のリンカーは、これらに限定されないが、改変 RIP 毒素と標的化剤の間の立体障害を減少させるペプチドおよび他の部分、細胞内酵素基質、複合体の可動性を増大させるリンカー、複合体の溶解度を増大させるリンカー、複合体の血清安定性を増大させるリンカー、光開裂性リンカーならびに酸開裂性リンカーを含む。
i. ヘテロ二官能性の架橋試薬
アミノ基およびチオール基の間に共有結合を形成するためにまたはチオール基をタンパク質内に導入するために用いられる多数のヘテロ二官能性の架橋試薬は、当業者に公知である(例えば、かかる試薬の調製および使用を記載し、かかる試薬についての商業的供給源を提供する PIERCE CATALOG、ImmunoTechnology Catalog & Handbook、1992-1993 を参照されたい; 例えば、Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:397-401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924-5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. 84:308-312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163-170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66:361-366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589 も参照されたい; 架橋のための試薬は以下から入手可能である: Pierce Chemical Company、Rockford、IL; Sigma Chemical Company、St. Louis、MO.; Molecular Probes、Inc.、Eugene、OR)。架橋のために用いられ得る官能基は、主要なアミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物およびカルボン酸を含む。ヘテロ二官能性の架橋試薬における使用のための代表的な基は、これらに限定されないが、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、N-ヒドロキシスクシニミド(NHS)-エステル、ヒドラジド、PFP-エステル、ヒドロキシメチル ホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジル ジスルフィド、イソシアネート、およびビニル スルホンを含む。ヘテロ二官能性の架橋試薬は、標的化剤、例えばケモカインと 改変 RIP 毒素の間に共有結合を形成するために用いられ得る。代表的なヘテロ二官能性の架橋剤は、２つの反応性の基を含有する: １つは主要なアミン基と反応し(例えば、N-ヒドロキシスクシニミド)、もう一方はチオール基と反応する(例えば、ピリジル ジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど)。主要なアミン反応性基を介して、架橋剤は一方のポリペプチドの１または複数のリジン残基と反応することができ、チオール反応性基を介して、既に第１のタンパク質に結合している架橋剤は、他方のポリペプチドのシステイン残基(遊離のスルフヒドリル基)と反応する。代表的なヘテロ二官能性の架橋剤は、これらに限定されないが、以下を含む: N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP; ジスルフィド リンカー); スルホスクシンイミジル 6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート (スルホ-LC-SPDP); スクシンイミジルオキシカルボニル--メチルベンジルチオサルフェート (SMBT、妨害されたジサルフェートリンカー); スクシンイミジル 6-[3-(2-ピリジルジチオ) プロピオンアミド]ヘキサノエート (LC-SPDP); スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (スルホ-SMCC); スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート (SPDB; 妨害されたジスルフィド結合リンカー); スルホスクシンイミジル 2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド) エチル-1,3'-ジチオプロピオネート (SAED); スルホスクシンイミジル 7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセテート (SAMCA); スルホスクシンイミジル 6-[アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート (スルホ-LC-SMPT); 1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン (DPDPB); 4-スクシンイミジル-オキシカルボニル--メチル--(2-ピリジルチオ)トルエン (SMPT、妨害されたジサルフェートリンカー); 4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-a-(2-ピリジルジチオ)トルエン; スルホスクシンイミジル6[-メチル--(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート (スルホ-LC-SMPT); m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミド エステル (MBS); m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミド エステル (スルホ-MBS); N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート (SIAB; チオエーテル リンカー); スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノ ベンゾエート (スルホ-SIAB); スクシンイミジル4(p-マレイミドフェニル)ブチレート (SMPB); スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート (スルホ-SMPB); アジドベンゾイル ヒドラジド (ABH); 3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニル ヒドラジド; エルマン試薬; ジクロロトリアジン酸、S-(2-チオピリジル)-L-システイン。さらなる代表的な二官能性結合化合物は、例えば、米国特許第5,349,066号、第5,618,528号、第4,569,789号、第4,952,394号および第5,137,877号に開示されている。
ii. 酸開裂性、光開裂性および感熱性のリンカー
酸開裂性リンカー、光開裂性および感熱性リンカーも、特に、より容易に反応に到達できるようにするため改変 RIP 毒素を切断することが必要な場合に、用いることができる。多くの開裂可能な基が当該技術分野において知られている (例えば、Jung et al. (1983) Biochem. Biophys. Acta 761: 152 162; Joshi et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14518 14525; Zarling et al. (1980) J. Immunol. 124: 913 920; Bouizar et al. (1986) Eur. J. Biochem. 155: 141 147; Park et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 205 210; Browning et al. (1989) J. Immunol. 143: 1859-1867 を参照)。さらに、広い範囲の開裂可能な二官能性リンカー基が、Pierce などの供給者から市販されている。
酸開裂性リンカーは、これらに限定されないが、ビスマレイミドエトキシプロパン(bismaleimideothoxy propane); およびアジピン酸ジヒドラジド リンカー(例えば、Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589 を参照) および細胞内トランスフェリン循環経路へ入ることを可能にするのに十分なトランスフェリンの部分を含有する酸不安定トランスフェリン複合体(例えば、Welhoner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314 を参照)を含む。
光開裂性リンカーは、光に曝露されると開裂し(例えば、Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107 を参照)、光に曝露されるとそれによって標的化物質を放出するリンカーである。光に曝露されると開裂する光開裂性リンカーは周知である(例えば、システインについての光開裂性保護基としてのニトロベンジル基の使用を記載する Hazum et al. (1981) in Pept.、Proc. Eur. Pept. Symp.、16th、Brunfeldt、K (Ed)、pp. 105-110; ヒドロキシプロピルメタクリルアミド コポリマー、グリシン コポリマー、フルオレセイン コポリマーおよびメチルローダミン コポリマーを含む水溶性の光開裂性コポリマーを記載する Yen et al. (1989) Makromol. Chem 190:69-82; 近UV光(350nm)へ曝露されると光分解を受ける架橋剤および試薬を記載する Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107; および光開裂性の結合を生成するニトロベンジルオキシカルボニルクロライド架橋剤を記載する Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42:231-237 を参照されたい)。かかるリンカーは、光ファイバーを用いて光に曝露することができる皮膚科学的または眼の症状の処置における特定の使用を有する。複合体の投与後、眼または皮膚または他の体の部分を光に曝露することができ、その結果、複合体からの改変 RIP 毒素の放出がもたらされる。かかる光開裂性リンカーは、動物の体からの迅速なクリアランスを可能にするために標的化剤を除去することが望ましい診断プロトコールに関して、有用である。
iii. 化学的結合に関する他のリンカー
他のリンカーは、トリチルリンカー、特に、様々な程度の酸性度またはアルカリ度で治療剤の放出をもたらす複合体の属を作成するための誘導体化されたトリチル基を含む。そのため、治療剤が放出される pH 範囲を事前に選択する能力によってもたらされる可動性は、治療剤の送達を必要としている組織間における既知の生理学的差異に基づくリンカーの選択を可能にする(例えば、米国特許第5,612,474号を参照)。例えば、腫瘍組織の酸性度は、正常組織の酸性度よりも低いと思われる。
iv. ペプチド リンカー
リンカー部分は、ペプチドであり得る。ペプチド リンカーは、融合タンパク質において採用され得、化学的に結合した複合体においても採用され得る。ペプチドは通常、約 2 から 約 60 のアミノ酸残基、例えば約 5 から 約 40、または約 10 から 約 30 のアミノ酸残基を有する。選択される長さは、因子、例えばリンカーが含まれる使用に依存する。
タンパク質性リガンドは、１以上の標的細胞上の１または複数の受容体に特異性をもって結合し、１または複数の標的細胞によって取り込まれる(taken up)。リガンド-毒素複合体の標的細胞への通過を促進するため、リガンド-毒素複合体のサイズは、興味の対象である標的細胞によって取り込まれ得るよりも大きくないことが現在好ましい。一般的に、リガンド-毒素複合体のサイズは、その組成に依存する。リガンド毒素複合体が化学的リンカーおよび化学的毒素(すなわち、タンパク質性のリンカーではない)を含有する場合には、リガンド-毒素のサイズは一般的に、リガンド-毒素複合体が融合タンパク質である場合よりも小さい。ペプチド性リンカーは、核酸によって便利にコードされ得、宿主細胞、例えば大腸菌において発現されることで融合タンパク質に組み込まれ得る。
ペプチド リンカーは、標的化剤がタンパク質性である場合に有利である。例えば、リンカー部分は、可動性のスペーサーアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体の研究において公知のものであり得る。かかる公知のリンカー部分の例は、これらに限定されないが、GGGGS (配列番号192)、(GGGGS)n (配列番号193)、GKSSGSGSESKS (配列番号194)、GSTSGSGKSSEGKG (配列番号195)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG (配列番号196)、GSTSGSGKSSEGKG (配列番号197)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG (配列番号198)、EGKSSGSGSESKEF (配列番号199)、SRSSG (配列番号200)、SGSSC (配列番号201)を含む。配列 AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM (配列番号202) を有するジフテリア毒素トリプシン感受性リンカーも有用である。
あるいは、ペプチドリンカー部分は、VM もしくは AM (配列番号34)であり得、または以下の式によって記載される構造を有し得る: AM(G2 to 4S)xAM ここで X は 1 から 11 の整数である(配列番号203)。さらなる結合部分は、例えば、Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883; Whitlow、M.、et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995; Newton et al. (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:397-401; Ladurner et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:330-337; および米国特許第4,894,443号に記載されている。
他のリンカーは、これらに限定されないが、以下を含む: 酵素基質、例えば カテプシン B 基質、カテプシン D 基質、トリプシン基質、トロンビン基質、サブチリシン基質、第Xa因子基質およびエンテロキナーゼ基質; リンカー、例えば (glymser)n および (sermgly)n を含む、溶解度、可動性および/または細胞内開裂性を増大させるリンカー、ここで、m は 1 から 6、一般的には 1 から 4、そして通常は 2 から 4 であり、n は 1 から 30、または 1 から 10、そして通常は 1 から 4 である(例えば、複合体における使用に関する代表的なリンカーを提供する国際PCT出願第WO96/06641号を参照されたい)。いくつかの態様において、各々のリンカーの所望の特性を利用するために、いくつかのリンカーが含まれ得る。
3. 代表的な白血球集団モジュレーター(LPM)複合体
代表的なリガンド-毒素複合体は、志賀毒素 A1 (SA1) 変異体、例えば、本明細書に記載されるいずれかの SA1 変異体に直接的または間接的に結合したケモカインを含有する LPM 複合体を含む。通常、かかる複合体は、ケモカイン ポリペプチドの成熟部分または受容体に結合することができるポリペプチドの一部を含有する。所望により、結合が間接的である場合、複合体をコードする核酸分子は、ケモカイン標的化剤ポリペプチドと SA1 変異体標的化部分の間のリンカーポリペプチド、例えば Ala-Met リンカー(配列番号34; 技術的に、Met は細菌発現のための志賀毒素の開始コドンである)をコードする配列を含有し得る。いくつかの例において、精製、発現、クローニングまたは検出を促進するため、さらなる核酸分子が、リガンド-毒素複合体をコードする核酸に付加され得、または他の手段、例えば化学的リンカーによってリガンド-毒素複合体に結合され得る。例えば、制限酵素部位が、クローニングを促進するために核酸分子の 3' および 5' 末端の一方または両方において設計され得る。かかる一つの例において、配列番号37 および 39 に示される通り、位置 1-6 における NdeI 制限部位および位置 967-972 における BamHI 制限部位が、核酸分子中に設計された。
本明細書で提供される LPM 複合体の中には、標的化物質としての変異体 1 志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合した成熟 MCP-1 ケモカイン ポリペプチドの複合体が存在する。例えば、提供される実施例において記載される通り、LPM1a 複合体は、リボソーム不活性化(RIP)ドメイン(本明細書において SA1 変異体 1 と称される; 配列番号22 に示されるアミノ酸の配列に対応する)を含有する、SA1 サブユニット ポリペプチドの残基 23-268 に結合した成熟 MCP-1 ポリペプチド(配列番号69 に示される)を含有する。MCP-1 ポリペプチドおよび SA1 ポリペプチドは、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して間接的に結合し、リガンド:リンカー:毒素 融合ポリペプチドを生成する。LPM1a ポリペプチドをコードする代表的な核酸は、配列番号37 に示される。コードされる LPM1a ポリペプチドは、配列番号38 に示される。
本明細書で提供される LPM 複合体の中には、標的化物質としての変異体 2 志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合した成熟 MCP-1 ケモカイン ポリペプチドの複合体も存在する。例えば、提供される実施例において記載される通り、LPM1b 複合体は、切断型志賀毒素 A1 サブユニット ポリペプチド(本明細書において SA1 変異体 2 と称され、配列番号24 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MCP-1 ポリペプチド(配列番号69 に示される)を含有する。MCP-1 ポリペプチドおよび変異体 2 SA1 ポリペプチドは、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して間接的に結合し、リガンド:リンカー:毒素 融合ポリペプチドを生成する。LPM1b ポリペプチドをコードする代表的な核酸は配列番号39 に示され、ここで、ヌクレオチド 7-966 はリガンド-毒素複合体ポリペプチドをコードし、ヌクレオチド 964-966 は操作された停止コドンをコードする。配列番号40 に示されるコードされる LPM1b ポリペプチドは、長さが 320 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 MCP-1 (アミノ酸 2-77)、Ala-Met リンカー (アミノ酸 78-79) および SA1 変異体 2 サブユニット (アミノ酸 80-320)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、本明細書の選択方法において同定される改変 SA1 ポリペプチドである、標的化物質としての(変異体 3 とも称される)突然変異体 変異体 1 志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合した成熟 MCP-1 ケモカイン ポリペプチドの複合体である。例えば、LPM1c 複合体は、突然変異体 志賀毒素 A1 サブユニット ポリペプチド (本明細書において SA1 変異体 3 と称され、配列番号26 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MCP-1 ポリペプチド(配列番号69 に示される)を含有する。MCP-1 ポリペプチドおよび SA1 ポリペプチド 変異体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して間接的に結合し、リガンド:リンカー:毒素 融合ポリペプチドを生成する。SA1 変異体 3 は、配列番号22 に示される成熟野生型 SA1 ポリペプチドについて、位置 38 における L から R への突然変異を有する。実施例において記載される通り、LPM1c は、LPM1a 複合体(配列番号38)の SA1 部分の改変形態についてのスクリーニングにおいて生成された。LPM1c ポリペプチドをコードする代表的な核酸は、配列番号41 に示される。コードされる LPM1c ポリペプチドは、配列番号42 に示される。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、本明細書の選択方法において同定される改変 SA1 ポリペプチドである、標的化物質としての(変異体 4 とも称される) 突然変異体 変異体 2 志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合した成熟 MCP-1 ケモカイン ポリペプチドの複合体である。例えば、LPM1d 複合体は、突然変異体 志賀毒素 A1 サブユニット ポリペプチド(本明細書において SA1 変異体 4 と称され、配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MCP-1 ケモカイン ポリペプチド(配列番号69 に示される)を含有する。MCP-1 ポリペプチドおよび SA1 ポリペプチド 変異体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して間接的に結合し、リガンド:リンカー:毒素 融合ポリペプチドを生成する。SA1 変異体 4 は、配列番号24 に示される成熟切断型 SA1 変異体 2 ポリペプチドについて、位置 219 における V から A への突然変異を有する。実施例において記載される通り、LPM1d は、LPM1b 複合体 (配列番号40)の SA1 部分の変異体についてのスクリーニングにおいて生成された。LPM1d ポリペプチドをコードする代表的な核酸は、配列番号43 に示される。コードされる LPM1d ポリペプチドは、配列番号44 に示される。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン エオタキシンの複合体である。例えば、LPM2 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟エオタキシン ポリペプチド (配列番号113 に示される配列のアミノ酸 24-97 に対応する)を含有する。LPM2 をコードする代表的な核酸分子は、配列番号45 のヌクレオチド 7-960 に示され、ヌクレオチド 958-960 において操作された停止コドンを含む。配列番号46 に示される、コードされる LPM2 ポリペプチドは、長さが 318 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟エオタキシン(アミノ酸 2-75)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 76-77)および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 78-318)がこれに続く。
標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに結合したケモカイン エオタキシンの複合体である、本明細書で提供される別の代表的な LPM は、LPM12 である。LPM12 において用いられるエオタキシン ポリペプチドは、LPM2 におけるエオタキシンと同じアミノ酸配列を有するが、合成方法の違いに起因して(実施例 3 を参照)、それらの核酸配列は異なる。LPM12 をコードする代表的な核酸分子は、配列番号65 のヌクレオチド 7-960 に示され、ヌクレオチド 958-960 において操作された停止コドンを含む。配列番号46 に示される、コードされる LPM12 ポリペプチドは、長さが 318 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟エオタキシン(アミノ酸 2-75)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 76-77)および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 78-318)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン SDF-1βの複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM3 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 SDF-1β ポリペプチド(配列番号114 に示される配列のアミノ酸 22-93 に対応する)を含有する。LPM3 をコードする代表的な核酸分子は、配列番号47 のヌクレオチド 7-954 に示され、ヌクレオチド 952-954 において操作された停止コドンを含む。配列番号48 に示される、コードされる LPM3 ポリペプチドは、長さが 316 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 SDF-1β(アミノ酸 2-73)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 74-75)および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 76-316)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン GRO-αの複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM4 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 GRO-α ポリペプチド(配列番号115 に示されるポリペプチドのアミノ酸 35-107 に対応する)を含有する。LPM4 をコードする代表的な核酸分子は、配列番号49 のヌクレオチド 7-957 に示され、ヌクレオチド 955-957 において操作された停止コドンを含む。配列番号50 に示される、コードされる LPM4 ポリペプチドは、長さが 317 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 GRO-α(アミノ酸 2-74)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 75-76)および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 77-317)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン MIP-1βの複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM5 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MIP-1β ポリペプチド(配列番号116 に示されるポリペプチドのアミノ酸 24-92 に対応する)を含有する。かかる LPM5 配列の代表的なものは、ヌクレオチド 943-945 において操作された停止コドンを含む、配列番号51 に示される核酸配列のヌクレオチド 7-945 である。配列番号52 に示される、コードされる LPM5 ポリペプチドは、長さが 313 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 MIP-1β(アミノ酸 2-70)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 71-72) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 73-313)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン IL-8 の複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM6 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 配列(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 IL-8 ポリペプチド(配列番号117 に示されるポリペプチドのアミノ酸 21-99 に対応する)を含有する。LPM6 をコードする代表的な核酸分子は、ヌクレオチド 967-969 において操作された停止コドンを含む配列番号53 のヌクレオチド 7-969 に示される。配列番号54 に示される、コードされる LPM6 ポリペプチドは、長さが 321 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 IL-8 (アミノ酸 2-78)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 79-80) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 81-321)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン IP-10 の複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM7 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 IP-10 ポリペプチド(配列番号118 に示されるポリペプチドのアミノ酸 22-98 に対応する)を含有する。LPM7 をコードする代表的な核酸分子は、ヌクレオチド 967-969 において操作された停止コドンを含む配列番号55 のヌクレオチド 7-969 に示される。配列番号56 に示される、コードされる LPM7 ポリペプチドは、長さが 321 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 IP-10 (アミノ酸 2-78)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 79-80) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 81-321)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン MCP-3 の複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM8 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MCP-3 ポリペプチド(配列番号119 に示されるポリペプチドのアミノ酸 24-99 に対応する)を含有する。LPM8 をコードする代表的な核酸分子は、ヌクレオチド 964-966 において操作された停止コドンを含む配列番号57 のヌクレオチド 7-966 に示される。配列番号58 に示される、コードされる LPM8 ポリペプチドは、長さが 320 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 MCP-3 (アミノ酸 2-77)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 78-79) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 80-320)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン MIP-3αの複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM9 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MIP-3α ポリペプチド(配列番号120 に示されるポリペプチドのアミノ酸 27-96 に対応する)を含有する。LPM9 をコードする代表的な核酸分子は、ヌクレオチド 946-948 において操作された停止コドンを含む配列番号59 のヌクレオチド 7-948 に示される。配列番号60 に示される、コードされる LPM9 ポリペプチドは、長さが 314 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 MIP-3α (アミノ酸 2-71)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 72-73) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 74-314)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン MDC の複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM10 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MDC ポリペプチド(配列番号121 に示されるポリペプチドのアミノ酸 25-93 に対応する)を含有する。LPM10 をコードする代表的な核酸分子は、アミノ ヌクレオチド 943-945 において操作された停止コドンを含む配列番号61 のヌクレオチド 7-945 に示される。配列番号62 に示される、コードされる LPM10 ポリペプチドは、長さが 313 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 MDC (アミノ酸 2-70)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 71-72) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 73-313)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン MIP-1αの複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM11 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 MIP-1α ポリペプチド(配列番号122 に示されるポリペプチドのアミノ酸 24-92 に対応する)を含有する。LPM11 をコードする代表的な核酸分子は、ヌクレオチド 943-945 において操作された停止コドンを含む配列番号63 のヌクレオチド 7-945 に示される。配列番号64 に示される、コードされる LPM11 ポリペプチドは、長さが 313 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 MIP-1α(アミノ酸 2-70)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 71-72) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 73-313)がこれに続く。
本明細書で提供される別の代表的な LPM は、標的化物質としての改変志賀毒素 A1 (SA1) サブユニットに直接的または間接的に結合したケモカイン BCA-1 の複合体である。一つの例において、改変 SA1 サブユニットは、本明細書の選択方法において同定される変異体 4 SA1 ポリペプチドである。例えば、LPM13 複合体は、Ala-Met リンカー(配列番号34)を介して SA1 変異体 4 ポリペプチド(配列番号28 に示されるアミノ酸の配列に対応する)に結合した成熟 BCA-1 ポリペプチド(配列番号123 に示されるポリペプチドのアミノ酸 23-109 に対応する)を含有する。LPM13 をコードする代表的な核酸分子は、ヌクレオチド 997-999 において操作された停止コドンを含む配列番号66 のヌクレオチド 7-999 に示される。配列番号67 に示される、コードされる LPM13 ポリペプチドは、長さが 331 アミノ酸であり、(アミノ酸 位置 1 において) 5' 開始メチオニン残基を含有し、成熟 BCA-1 (アミノ酸 2-88)、Ala-Met リンカー(アミノ酸 89-90) および SA1 変異体 4 サブユニット(アミノ酸 91-331)がこれに続く。
G. 改変RIP毒素及びその複合体の調製
標的化物質に結合された標的化部分の複合体は、化学的結合、組換DNA技術または組換発現と化学的結合のコンビネーションのいずれにより製造され得る。本明細書の方法は、いずれの標的化物質、例えばRIP毒素、といずれの標的化剤の、本明細書で記載されているような、直接的な結合またはリンカーを介した結合のいずれかを調製及び使用するために使用され得る。標的化剤と標的化物質は、いずれかの向き（orientation）で、結合され得、複合体には、１以上の標的化剤及び／または標的化物質が存在し得る。本明細書の方法は、標的化剤、例えば、ケモカイン、及び標的化物質、例えば、改変志賀毒素 A1 ポリペプチドを含む複合体を特に参照して、例示される。
さらに、本明細書において、組換ポリペプチドの発現及び製造方法が提供される。かかる方法は、本明細書において、単独で、または、ケモカインなどの選択された標的化物質との融合タンパク質複合体(例えば、リガンド-RIP 毒素 複合体)として与えられる、改変毒素または毒素変異体を発現させるために用いられ得る。標的化物質。例えば本明細書で与えられる改変毒素、及び標的化剤が個々のペプチドとして発現される例では、改変標的化物質の標的化剤との複合体は、本明細書の他のところで議論される化学的手段を介して製造され得る。
1. 毒素ポリペプチドまたは毒素ポリペプチドを含む複合体の作成及びクローニング方法
核酸s encoding a 改変毒素をまたはリガンド−毒素複合体を含む改変毒素を含む複合体コードする核酸は、核酸分子のクローニングおよび単離のための本分野で利用可能ないずれの方法を用いて、クローン化され、または単離され得る。例えば、標的化剤、またはリガンド、及び１以上の標的化物質の化学的融合タンパク質を含む複合体は、標的化剤または標的化物質の核酸配列が知られている場合はタンパク質合成、または、選択された標的化剤または標的化物質をコードするＤＮＡ分子の化学合成という、良く知られた技術によって製造され得る。あるいは、もし、標的化剤または標的化物質の核酸配列が不明であれば、限定はされないが、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニング及び活性ベースのスクリーニングを含むライブラリーのスクリーニング等の良く知られた方法を用いて、配列が最初に決定され得る。かかるスクリーニング方法は、また、アミノ酸配列の一部分のみが知られているときに、特定のタンパク質をコードする核酸配列を得るために使用され得る。
核酸の増幅方法は、標的化剤および/または標的化物質をコードする核酸分子を単離するために用いられ得、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含む。物質を含む核酸は、そこから標的化剤または標的化物質をコードする核酸分子が単離され得る出発材料として使用され得る。例えば、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの調製、細胞抽出物、組織抽出物、液体サンプル（fluid sample）（例えば、血液、血清、唾液）、健康な被検体および/または疾患を有する被検体由来のサンプルは、増幅方法において使用され得る。核酸ライブラリーもまた、出発材料のソースとして使用され得る。プライマーは、所望の分子を増幅するために設計されうる。例えば、プライマーは、そこから毒素またはリガンド分子（すなわち、ケモカイン）が生産される、発現される核酸に基づいて設計され得る。プライマーは、特定の知られたアミノ酸配列のバックトランスレーションに基づいて設計され得る。作成された核酸分子は、増幅され、配列決定され、その分子をコードすることが確認され得る（Nucleic acid molecules generated be amplification can be sequenced and confirmed to encode the molecule.）。
標的化剤または標的化物質をコードする遺伝子のいくつかは、商業的に入手可能である。例えば、ケモカインまたは細胞毒素をコードする核酸分子は入手可能である。商業的に入手可能な遺伝子を得る利点は、その配列が、宿主、例えば、大腸菌で発現するのに適切かされていることである。タンパク質、ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または興味のあるポリヌクレオチドは、核酸合成技術を用いて製造され得る。限定されないが、ベクターへのクローニング、核酸残基の変異導入、及び、核酸残基の追加または欠失を含むＤＮＡ分子の操作方法は、当分野で良く知られており、本明細書で与えられる改変RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体の製造に使用され得る。
一つの実施態様として、キメラリガンド−RIP毒素は複合体として製造される。融合タンパク質は、組換核酸技術により製造され得、そこにおいて、単一ポリペプチドが、標的化部分、例えばケモカインを含み、タンパク性の標的化物質、例えば、細胞毒素に直接的に結合される。あるいは、タンパク質は、適切な二次及び三次構造を形成することを確かにするための距離を隔てることができる。適切なリンカー配列は、（１）適切な延ばされた配置を採用し得、（２）融合ポリペプチドの機能ドメインと相互作用しうる整えられた二次構造をとる性質を示さない、そして、（３）機能的なタンパク質ドメインとの相互作用を促進することができる、最小限の疎水性または荷電された（charged）性質を有し得る。標的化部分は、ポリペプチドにおいて、細胞毒素部分に対してアミノ末端に位置し得る。かかる融合タンパク質の例は、一般化された構造：（アミノ末端）標的化剤：ペプチドリンカー：毒素（カルボキシ末端）を有する。あるいは、標的化部分は、融合タンパク質内で、細胞毒素部分に対してカルボキシ末端に位置し得、例えば、一般化された構造：（アミノ末端）毒素：ペプチドリンカー：標的化剤（カルボキシ末端）を有する。
本明細書でまた包含されるものには、タンパク質精製を促進させるエピトープタグや他の分子の配列のような、アミノ及び／またはカルボキシ末端での付加的なアミノ酸配列を含む融合タンパク質がある。例えば、クローニング、発現、翻訳後修飾、精製、検出及び投与等のプロセスを促進することができるポリヒスチジンタグを採用することができる。１以上のRIP毒素、１以上のリンカー、または１以上のリガンドが存在するいくつかの例では、遺伝子は、標的化剤または標的化物質の所望の活性が排除されないならば、いずれの順序で配置され得る。
融合タンパク質は、所望の配列から酵素切断及びフラグメントのライゲーションという従来技術を用いて調製され得る。例えば、所望の配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いて合成され得、適切な制限酵素消化によりタンパク質を産生する親細胞のDNAから単離され得、または、細胞、組織、ベクター等の標的ソースまたは他の標的ソースから、適切なプライマーを用いたゲノムDNAのPCRによって得ることができる。一つの例では、毒素複合体、例えば本明細書で提供される改変毒素部分を含むいずれのリガンド−毒素複合体は、ベクターの設計された組換え部位に、DNA標的配列を連続的に連結することにより作成され得る。消化された産物は、さらに配列を組換え操作するために、例えば、ベクターに既に含まれているもう１つの核酸配列と融合させる、または、標的分子を発現させるために、ベクターにサブクローニングされ得る。
ある例では、PCR増幅が、十分量の消化産物を得る手段として採用され得る。PCR増幅に使用されるPCRプライマーも、また、核酸配列の操作的な結合を促進するために設計され得る。例えば、鋳型に相補的でない５’延長をプライマーに付加し、PCR産物のあらゆる増幅後操作を、増幅に重大な影響を与えずに可能にすることができる。例えば、これらの５’延長は、制限部位、プロモーター配列、制限酵素リンカー配列、プロテアーゼ切断部位配列またはエピトープタグの配列を含むことができる。一つの例としては、融合配列を製造する目的で、プライマーに組み込まれることができる配列は、例えば、mycタグ、hisタグ、または他の小さいエピトープタグを含む配列を含み、その結果、増幅されたPCR産物は、有効に、興味のある核酸配列とエピトープタグとの融合を含む。
他の例では、制限酵素部位をプライマーに組み込むことにより、対応する制限部位、例えば、核酸配列のライゲーションのための粘着末端を与えることにより、増幅産物をベクターにサブクローニングすることを促進することができる。多数のPCR増幅産物を単一のベクターにサブクローニングすることは、異なる核酸配列を操作可能に連結させ、融合させるストラテジーとして使用され得る。PCR産物をベクターにサブクローニングする他のストラテジーには、ブラントエンドクローニング、TAクローニング、ライゲーション独立クローニング及びインビボクローニングが含まれる。
例えば、暴露された制限酵素部位を含むPCR産物をベクターにサブクローニングする前に、興味のある配列との融合を作成するために、カットされていないものから消化されたPCR産物を分離する（resolve）ことが時々必要である。かかる例では、プライマーの５’端に蛍光タグを付加することが、PCRの前にされ得る。これにより、消化が十分になされれば、消化により蛍光ラベルが消失するので、消化産物を同定することができる。いくつかの例では、引き続くベクターへのサブクローニングのための制限部位を含む増幅されたPCR産物を、融合配列を作成するために使用することにより、融合タンパク質産物に制限酵素リンカー配列を組み込むことが可能になる。一般的に、このようなリンカー配列は短く、配列は操作可能に連結される限りポリペプチドの機能を損なわない。
2. 融合タンパク質を含む複合体の製造及び発現系
毒素またはその複合体、例えば、本明細書で与えられるいずれのリガンド−毒素複合体をコードする核酸分子は、核酸分子を含むベクターの形式で、提供され得る。かかるベクターの一例はプラスミドである。多くの発現ベクターが入手可能であり、当業者に知られており、毒素複合体を含む毒素ポリペプチドの発現のために使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択により影響され得る。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーター、及び場合によっては、エンハンサー、転写シグナル、及び、転写及び翻訳の終止シグナルを含むことができる。安定的な形質転換に用いられる発現ベクターは、典型的には、選択及び形質転換された細胞の維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。いくつかのケースでは、ベクターのコピー数を増幅させるために、複製起点（origin of replication）が使用され得る。加えて、多くの発現ベクターは、多重クローニングサイトの近傍に、N末端またはC末端エピトープタグのいずれかを提供し、その結果得られた、ベクターから発現されたいずれかのタンパク質は、ポリペプチド配列に、フレームを合わせて（in frame）挿入されたエピトープタグを有し得る。
融合タンパク質は、良く知られた技術を用いて製造され得、ここで、宿主細胞は、発現される融合タンパク質をコードする核酸分子に操作可能に連結された発現コントロール配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされる（Molecular Cloning A Laboratory Manual、Sambrook et al.、eds.、2nd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.、1989）。毒素をコードするDNAは、一般的には、本明細書で提供されるようなリガンド−毒素複合体のいずれかのような、修飾毒素に直接的にか間接的に連結されるリガンドを含む融合タンパク質の形態で、発現のために宿主細胞にトランスフェクトされる。リガンド−毒素複合体を含む毒素ポリペプチドは、要求される量、及び、投与及び処置に必要なポリペプチドの形態で産生されるのに適切ないずれの生命体で発現され得る。一般的に、異種DNAを発現するために設計され得、分泌経路を有するタイプの細胞は、適している。発現宿主には、原核及び真核生物、例えば、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株を含む哺乳類細胞、及びトランスジェニック動物が含まれる。発現宿主は、タンパク産生レベル及び発現されるタンパク質に存在する翻訳後修飾のタイプにおいて、相違する。発現宿主の選択は、これらの要素、及び、制御及び安全の観点、生産コスト及び精製の必要性及び方法などの他の要素に基づいてなされ得る。
a. 発現のためのプラスミド及び宿主細胞
本明細書で提供されるRIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む発現ベクターの構築、並びに、トランスフェクトされた細胞での核酸の発現は、本分野でよく知られたモレキュラークローニング技術の使用を必要とする。かかる方法は、適切な転写／翻訳コントロールシグナルに操作可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターの構築を含む。これらの方法は、また、インビトロ組換核酸（例えば、DNAまたはRNA）技術、合成技術及びインビボ組換／遺伝子組換を含む（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Sambrook et al.、eds.、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.、1989; Current Protocols in Molecular Biology、Vols. 1 and 2、Ausubel、et al. eds.、Current Protocols、1987-1994; John Wiley and Sons、Inc.、1994-1999; 及び Cloning Vectors: A Laboratory Manual、Vols I - IV、Pouwels、et al.、eds.、及びその追補版、Elsevier、N.Y.、1995-1998に記載された技術を参照）。
宿主細胞で興味のあるポリペプチドを発現させるための組換核酸分子は、一般的に、発現ベクターの形態であり得、ポリペプチドをコードする核酸分子に操作可能に連結された発現コントロール配列（expression control sequence）を含む。外来核酸が宿主において継続して維持されるように安定した運搬（transfer）を得る方法は、本分野によく知られている。宿主細胞を組換核酸により形質転換することは、当業者によく知られた従来技術によりなされ得る。
多様な宿主発現ベクター系が、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の発現のために使用され得る。これらには、限定はされないが、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む、組換プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、または、コスミド発現ベクターでトランスフェクトされた微生物、例えば細菌；RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む、組換酵母発現ベクターで形質転換された酵母；RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む、組換ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）で感染させた、または、プラスミド発現ベクター（例えば、Ti プラスミド）で形質転換させた植物細胞システム；RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む、組換ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；または、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む、組換プラスミド発現ベクターで形質転換されるか、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子を含む、組換ウイルス発現ベクター（例えば、DNAまたはRNAウイルス、例えば、限定はされないが、レトロウイルス、アデノウイルス、及びワクシニアウイルス）で感染させた、哺乳類細胞系、または、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体を安定的に発現するように操作された形質転換動物細胞系、が含まれる。
使用される宿主／ベクター系によって、構成的及び誘導プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含む、多くの適切な転写及び翻訳要素のいずれかを、発現ベクターにおいて、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子に操作可能に連結され得る（例えば、Bitter et al.、Methods in Enzymology 153: 516-544、1987参照）。例えば、細菌の系を使用するとき、例えば、限定はされないが、バクテリオファージS、PLAC、PTRP、PTAC (PTRP-LAC ハイブリッドプロモーター)、またはT7のPL等の、誘導プロモーターが使用され得る。もう１つの例では、哺乳類細胞系を使用するとき、哺乳類細胞のゲノム由来（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス由来（例えば、レトロウイルスLTR（long terminal repeat）、アデノウイルス後期プロモーター（adenovirus late promoter）、またはワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）のプロモーターが使用され得る。組換核酸または合成技術により製造されるプロモーターは、また、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする挿入される核酸分子の転写のために与えられることができる。
宿主が原核生物、例えば大腸菌のとき、DNA取り込み（すなわち、形質転換）が可能なコンピテントセルは、本分野でよく知られる手順で細胞から調製され得る。例えば、細胞は、対数増殖期の後で回収され、続いて、CaCl2方法により処置され得る。あるいは、MgCl2またはRbClが使用され得る。形質転換は、また、宿主細胞のプロトプラスト形成の後で、またはエレクトロポレーションにより実施され得る。一般的に、原核生物宿主は、宿主細胞として使用される。
宿主が真核生物のとき、組換核酸分子のトランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈殿の形成、及び、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及びリポソームに入れられたプラスミド挿入等の従来よりの機械的手段が含まれる。核酸運搬のもう１つの方法には、シミアンウイルス４０（SV40）、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、または組換自律的増殖パルボウイルス（recombinant autonomous parvovirus vector）（例えば、米国特許第5,585,254に記載されている）真核生物ウイルスベクターの使用が含まれ、一過性に真核細胞に感染し、または真核細胞を形質転換させ、そしてタンパク質を発現する（Eukaryotic Viral Vectors、Cold Spring Harbor Laboratory、Gluzman ed.、1982）。真核細胞は、また、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子および選択可能な表現型をコードする第２の核酸分子、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子で、コトランスフェクト（cotransfect）され得る。あるいは、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸分子および選択可能な表現型をコードする核酸分子は、同じベクターまたはプラスミドに存在する。
真核生物発現系は、発現される哺乳類タンパク質の更なる翻訳後修飾が起きることを可能にする。かかる細胞は、もし所望されるなら、主な転写物（machinery）の翻訳後プロセッシングのための細胞内機関を有する。かかる修飾には、限定はされないが、グリコシレーション、ホスホリレーション、及びファルネシレーション（farnesylation）が含まれる。かかる細胞株には、限定はされないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293、及びWI38が含まれる。
i. 細菌細胞（bacterial cell）発現系
バクテリア系では、多数の発現ベクターが、系の所望の特性によって、有利に選択され得る。例えば、大量のRIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質が産生される必要があれば、容易に精製される、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質生産物の高いレベルの発現を指向するベクターが望まれうる。発現されるポリペプチドを回収することに役立つ切断部位を含むように設計されたものが好ましい。pET 11a、b、c、またはd(Novagen、Madison、WI)を含む、いくつかの商業的に入手可能なベクターを用いることにより、よい結果が得られ、そして得られてきている。
大腸菌の形質転換のための特に好ましいプラスミドには、pET発現ベクター（例えば、米国特許第4,952,496を参照; NOVAGEN、Madison、WIから入手可能;また、Novagenにより出版されている、このシステムを記載した文献を参照）。かかるプラスミドは、pET 11c および/または pET 11aを含み、それは、T7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導性大腸菌lacオペレーター（inducible E. coli lac operator）、及びlacリプレッサー遺伝子を含む;pET 12a-c、それは、T7プロモーター、T7ターミネーター、及び大腸菌ompT分泌シグナルを含む;及び、pET 15b (Novagen、Madison、WI)、それは、Hisカラムを用いた精製に使用するためにHis-Tag（登録商標）リーダー配列 (配列番号：40)を、カラムでの精製に続く切断を可能にするトロンビン切断部位;T7-lacプロモーター領域及びT7ターミネーターを含む、が含まれる。
リンカー有りおよび無しで標的化物質に連結された、例えば、ケモカインなどの標的化剤をコードする核酸分子、及び他のそのような構築物は、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の細胞内またはペリプラスム発現のために、pETベクター、例えば、pET11c、pET-11a、及びpET-15b発現ベクター(NOVAGEN、Madison、WI)に挿入され得る。あるいは、標的化物質または標的化剤は、pETベクターに挿入され得、個々に発現される。
他のプラスミドには、pKKプラスミド、特にtacプロモーターを含むpKK223-3（Pharmaciaより入手可能；また、Brosius et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6929; Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology;及び米国特許第5,122,463、5,173,403、5,187,153、5,204,254、5,212,058、5,212,286、5,215,907、5,220,013、5,223,483、及び5,229,279参照）が含まれ、これは、tacプロモーターを含む。プラスミドpKKは、アンピシリン耐性マーカー遺伝子に、EcoRI粘着末端（Pharmaciaより入手可能；pUC4K（例えば、Vieira et al. (1982) Gene 19:259-268;及び米国特許第4,719,179参照）から得られる）でカナマイシン耐性カセットを挿入することにより修飾されている。
他の好ましいベクターには、限定はされないが、pPL-ラムダ誘導発現ベクター（pPL-lambda inducible expression vector）およびtacプロモーターベクターpDR450（例えば、米国特許第5,281,525、5,262,309、5,240,831、5,231,008、5,227,469、5,227,293参照；Pharmacia P.L. Biochemicalsより入手可能；また、Mott、et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:88;及びDe Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21参照）；および、pBlueBac IIIを含むpBlueBacベクター（また、pJVETL及びその誘導体とも呼ばれる；他例えば、米国特許第5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051、及び5,169,784参照）等のバキュロウイルスベクター、が含まれる。
他のベクターには、限定はされないが、pIN-IIIompA2（例えば、米国特許第4,575,013 及びDuffaud et al. (1987) Meth. Enzymology153: 492-507を参照）等のpIN-IIIompA プラスミドが含まれる。pIN-IIIompA プラスミドは、大腸菌のリポプロテイン遺伝子由来の機能フラグメントと転写読み込み枠で連結した、異種DNAのための挿入部位を含む。プラスミドは、また、大腸菌のompA タンパク質のシグナルペプチドをコードするDNA断片を含み、それは、所望のポリペプチドがそのN末端でompA シグナルペプチドと一緒に発現され、それにより、細胞質膜を通って効率的な分泌が可能になるように位置されている。プラスミドは、さらに、大腸菌lacプロモーター−オペレーターに特異的な部分をコードするDNAを含み、それは、所望のポリペプチドの転写発現のため、及び、lacオペレーターインデュサーの非存在下でlacプロモーター−オペレーターに相互作用しその転写を抑制する関連リプレッサー分子をコードする分離された機能的な大腸菌lacI遺伝子の転写発現のために適切な方向で位置する。所望のポリぺちどの発現は、リポタンパク質（lpp）プロモーター及びlacプロモーター−オペレーターの制御下にあるが、いずれかのプロモーターからの転写はリプレッサー分子により通常ブロックされる。リプレッサーは、インデュサー分子によって選択的に不活性化され、それにより、両方のプロモーターからの所望のポリペプチドの転写発現が誘導される。
リプレッサータンパク質は、構築物を含むプラスミドまたはリプレッサー−タンパク質をコードする遺伝子を含む第二のプラスミドによりコードされ得る。リプレッサー−タンパク質は、リプレッサー−タンパク質が結合する核酸配列を含むプロモーターの転写を抑制する能力がある。プロモーターは、細胞の生理的状態を変化させることにより脱抑制され得る。その変化は、例えば、オペレーターまたは調節タンパク質もしくはＤＮＡの他の領域と相互作用する能力を阻害する分子を成長培地（growth medium）に添加することにより、または、成長培地の温度を変えることにより達成され得る。好ましいリプレッサー−タンパク質には、限定はされないが、ＩＰＴＧ誘導に反応する大腸菌lacIリプレッサー、温度感受性cI857リプレッサーが含まれる。大腸菌lacIリプレッサーが好ましい。
ある実施態様において、構築物は、また、転写ターミネーター配列を含む。プロモーター領域及び転写ターミネーターは、それぞれ独立して同じまたは相違する遺伝子から選択される。ある実施態様では、ＤＮＡ断片は大腸菌などの細菌細胞内で複製される。ＤＮＡ断片は、また、典型的には細菌の複製起点を含み、細菌の世代から世代へＤＮＡ断片が維持されるのを確かにしている。このようにして、大量のＤＮＡ断片が細菌における複製により製造され得る。好ましい細菌の複製起点（origin of replication）には、限定はされないが、複製のf1-ori及びcolE1起点が含まれる。
例示的な細菌の宿主は、lacUVプロモーター（米国特許第4,952,496参照）等の誘導プロモーターに操作可能に連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの染色体コピーを含む。このような宿主には、限定はされないが、溶原性（lysogens）大腸菌株 HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)及びBL21(DE3)が含まれる。BL21(DE3)株が好ましい。pLys株は低レベルのT7リゾチーム、天然のT7RNAポリメラーゼ阻害剤を提供する。好ましい細菌の宿主は昆虫細胞スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（sf9細胞；例えば、Luckow et al. (1988) Biotechnology 6:47-55及び米国特許第4,745,051参照）。
細菌宿主を用いる発現系は、小スケールまたは大スケールのタンパク質生産のために容易にスケールを調節できる。大スケールのタンパク質製造のために、バッチ発酵（batch fermentation）のような方法が、本明細書で提供されている改変RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体のような、組換えタンパク質を発現させるために使用され得る。バッチ発酵の例示的な方法は本分野で知られており、例えば、本明細書で提供される実施例においても見いだすことができる。たとえば、本明細書で提供されているRIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体をコードする核酸分子を担持するpETベクター等の発現ベクターを含む細菌宿主細胞は、バッチ発酵のために、発酵槽（fermentor）等の容器内で成育させることができる。典型的には、このような発酵槽は、５から１００リットルまたはそれ以上の液体培養における細菌の成育のために使用される。成育に用いられる液体培養は、典型的には、標準的な富化培地培養であり、それは、場合により、細菌の成育および／または発現されるタンパク質の産生を促進する付加的な成分を含むことができる。例えば、4-APP等のRIP毒素阻害剤は、RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体タンパク質を発現する細菌の成長を促進させるために培養に添加され得る。本明細書の他のところで記載されているように、4-APPの添加は宿主細菌細胞において発現されるRIP毒素の毒素活性を阻害し、それによって、高いレベルのタンパク質生産が可能となる。タンパク質発現のために、誘導性ベクター、例えば、pETベクターを用いるとき、誘導剤（inducing agent）（例えば、IPTG）を、一旦培養が特定の密度に達すれば、典型的には、ある期間培養に添加する。誘導剤の濃度及び誘導時間の長さは、経験的に決めることができるか、または、タンパク質発現のために好適な成育条件を決定する本分野で知られる方法を用いて実験的に決めることができる。細菌の宿主細胞からの発現タンパク質の精製方法は、本分野でよく知られており、例えば、適切な可溶化緩衝液中、例えば、場合により界面活性剤（detergent）を含む強い変性溶液（例えば、塩酸グアニジン／尿素（guanidine hydrochloride/urea）溶液）中で、ホモジナイザーを用いて可溶化し、その後カラム精製を行うことを含むことができる。RIP毒素及びリガンド−RIP毒素複合体の精製方法の例は、本明細書にて与えられる。
ii. 昆虫細胞（Insect cell）発現系
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体を発現させるために用いることができる別の発現系は、昆虫の系である。このような系の一つに、オートグラファ・カリフォルニア・核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）（AcNPV）が、外来遺伝子発現のためのベクターとして使用される。ウイルスは、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞で成育する。RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸を、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化されることができ、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置する。RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸の上手く挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子を不活化し、非閉塞組換ウイルス（例えば、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質性コートを欠損するウイルス）を産生する。そして、これらの組換ウイルスは、挿入遺伝子が発現される、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞を感染させるために使用される（米国特許No. 4,215,051）。
昆虫宿主、バキュロウイルス、例えば、pBlueBac（pJVETLとも呼ばれる、及びその誘導体)、特にpBlueBac III（例えば、米国特許番号：4,745,051、5,242,687、5,243,041、5,244,805、5,266,317、5,270,458、5,278,050、及び5,169,784;及び発行された国際PCT出願WO 93/10139; Invitrogen、San Diegoより入手可能）も、ポリペプチドの発現のために使用され得る。pBlueBacIIIベクターは、デュアルプロモーターベクターであり、このプラスミドが、昆虫が認識できる（insect recognizable）ETLプロモーターの制御下にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）を含み、IPTGにより誘導可能であるので、青／白スクリーニングにより組換え体の選別を与える。pBlueBac IIIバキュロウイルスベクターに導入されるDNA構築物は、ポリヘドリンプロモーターに操作可能に連結され、発現プラスミドを生成し、野生型と共に、昆虫細胞スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）にコトランスフェクト（co-transfect）される（sf9 細胞;例えば、Luckow et al. (1988) Biotechnology 6: 47-55及び米国特許番号：4,745,051参照）。青い閉塞マイナスウイルスプラークを選択し、プラークを精製し、複合体タンパク質をコードするDNA分子の存在を、例えば、適切な抗血清を用いたウェスタンブロットまたは適切なプローブを用いたサザンブロット等のいずれかの標準的な方法により、スクリーニングする。選択された精製組換ウイルスは、そして、例えば、CaPO4トランスフェクションまたはリポソームにより、野生型バキュロウイルスと共に、昆虫細胞スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）にコトランスフェクト（co-transfect）され、組織培養フラスコまたは懸濁培養で成育される。
iii. 酵母細胞（Yeast cell）発現系
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の発現のために使用されることができる別の発現系は、酵母である。酵母においては、数多くの、構成的または誘導プロモーターを含むベクターが、使用され得る。このようなベクターはよく知られている（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Sambrook et al.、eds.、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.、1989; Bitter、et al. (1987) Methods in Enzymol. 153: 516-544; Bitter et al. (1987) Methods in Enzymol.、152: 673-684; Rothstein、DNA Cloning、Vol. II、Glover、D.M.、ed.、IRL Press、Wash.、D.C.、Ch. 3、1986; および The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、Strathern et al.、eds.、Cold Spring Harbor Press、Vols. I and II、1982、に記載されている技術を参照）。ADHやLEU2にような構成的な酵母プロモーターまたはGALのような誘導プロモーターが使用され得る（例えば、Rothstein、DNA Cloning、Vol. II、Glover、D.M.、ed.、IRL Press、Wash.、D.C.、Ch. 3、1986参照）。あるいは、外来DNA配列の酵母染色体への組込みを促進するベクターが使用され得る。
iv. 植物細胞発現系
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の発現のために使用されることができる別の発現系は、植物細胞系である。植物発現ベクターを使用する場合、複合体タンパク質をコードするDNA分子の発現が、多くのプロモーターのいずれかにより駆動されることができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（例えば、Brisson et al.、(1984) Nature 310: 511-514参照）のようなウイルスプロモーター、またはＴＭＶへのコートタンパク質プロモーター（例えば、Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311参照）が使用され得る；あるいは、RuBisCOの小サブユニット（例えば、Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 及び Broglie et al. (1984) Science 224: 838-843参照）のような植物プロモーター；または、例えば、ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B（たとえば、Gurley、et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565参照）が使用され得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、ダイレクトＤＮＡトランスフォーメーション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、他の技術を用いて、植物細胞に導入され得る。このような技術の総説は、例えば、Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology、Academic Press、NY、Section VIII、pp. 421-463 及び Plant Molecular Biology、2d Ed.、Covet、S.N.、Ed.、Ch. 7-9、Blackie、London 1988である。
v. 哺乳類細胞発現系
RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質の発現のために使用されることができる別の発現系は、哺乳類細胞系である。発現構築物は、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスのようなウイルス感染により、または、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランのようなダイレクトＤＮＡトランスファーにより、及び、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションのような物理的手段により、動物細胞にトランスファーされる。哺乳類細胞のための発現ベクターは、典型的には、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、転写開始配列（Kozak コンセンサス配列）及びポリアデニル化要素を含む。このようなベクターは、しばしば、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のロングターミナルリピートを含む。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞のタイプで活性である。組織及び細胞タイププロモーター及びエンハンサー領域は、また、発現に使用され得る。例示的なプロモーター−エンハンサー領域には、限定はされないが、例えば、エラスターゼ、インスリン、免疫グロブリン、マウス哺乳類腫瘍ウイルス（mouse mammary tumor virus）、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、アルファ−１−アンチトリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質（myelin basic protein）、ミオシン軽鎖−２及び性腺ホルモン放出ホルモン遺伝子コントロールが含まれる。選択可能なマーカー遺伝子には、限定はされないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（hygromycin B phosphotransferase）、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、及びチミジンキナーゼが含まれる。細胞表面シグナリング分子、例えば、TCR-ζ及びFcεRI-γとの融合は、活性状態のタンパク質の発現を細胞表面に仕向ける。
多くの細胞株がマウス、ラット、ヒト、サル、及びトリ及びハムスター細胞を含む哺乳類発現に利用可能である。例示的な細胞株には、限定はされないが、CHO、VERO、BHK、HT1080、MDCK、W138、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0 (非分泌)及び他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ及びヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、RPMI 1788細胞、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8、EBNA-1、及びHKB細胞 (例えば、米国特許第5,618,698及び6,777,205参照)が含まれる。細胞株は、また、細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を促進する無血清培地に適したものが利用可能である（例えば、EBNA-1、Pham et al.、(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42）。
発現を指向する組換ウイルスまたはウイルス要素を用いる哺乳類細胞系を操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いるとき、RIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸を、アデノウイルス転写／翻訳コントロールコンプレックス、例えば、レイトプロモーター（late promoter）及び三部からなる（tripartite）リーダー配列に連結することができる。そして、このキメラ遺伝子は、インビトロおよびインビボ組換によりアデノウイルスげのむに挿入されることができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE3）への挿入により、生存可能であり、感染された宿主におけるRIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体をコードする核酸の発現を可能にする組換ウイルスとなる（例えば、Logan and Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81: 3655-3659参照）。あるいは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターが使用され得る（例えば、Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79: 7415-7419; Mackett et al. (1984) J. Virol. 49: 857-864、1984; 及び Panicali et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79: 4927-4931参照）。特に興味深いのは、染色体外要素として複製可能であるウシパピローマウイルスに基づくベクターである（Sarver、et al.、Mol. Cell. Biol. 1: 486-96、1981）。マウス細胞内にこのＤＮＡが入るとほどなく、プラスミドは、細胞当たり約１００から２００コピーに複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写は、プラスミドの宿主染色体への組込を必要とせず、それにより高レベルの発現を産む。これらのベクターは、プラスド中に選択可能なマーカー、例えば、neo遺伝子を含むことにより、定常的な発現のために使用され得る。あるいは、レトロウイルスゲノムは、宿主細胞でのRIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体の発現を促すまたは指向する能力があるベクターとして使用するために改変され得る（Cone and Mulligan、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6349-6353、1984）。高レベルの発現は、また、限定はされないが、メタロチオネインＩＩＡプロモーター及び熱ショックプロモーターを含む、誘導プロモーターを用いることにより達成され得る。
組換タンパク質の長期間の、高収率の産生のためには、安定発現が好ましい。複製のウイルス起点を含む発現ベクターを用いる以外に、宿主細胞は、好適な発現コントロールエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）により制御されるRIP毒素変異体またはリガンド−RIP毒素変異体複合体タンパク質、及び選択可能なマーカーをコードするｃＤＮＡで形質転換され得る。組換プラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択への抵抗性を与え、細胞が、安定的にその染色体にプラスミドが組み込まれ、成育し、順に、細胞株にクローン化され、拡大されることができる、fociを形成することを可能にする。たとえば、外来DNAの導入に続いて、操作された細胞は、富化培地で１−２日成育され得、そして、選択培地に切り替えられる。多くの選択系が使用され得、限定はされないが、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞に用いられ得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al.、細胞、11: 223-32、1977）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトトランスフェラーゼ（Szybalska and Szybalski (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、48: 2026-30）、及びアデニンホスホ−リボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al. (1980) 細胞 22: 817-31）遺伝子を含む。抗代謝耐性もまた、メトトレキサートへの耐性を付与するdhfr（Wigler et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3567-70; O'Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、8: 1527-31、1981）；ミコフェノール酸への耐性を付与するgpt（Mulligan and Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-6）；アミノグリコシドG-418への耐性を扶養する、neo（Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14）；及び、ハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロ（Santerre et al. (1984) Gene 30: 147-56）遺伝子のための選択の基礎として用いられ得る。最近、更なる選択可能な遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンに代わりインドールを使用することっを可能にする、trpB；細胞が、ヒスチジンに代わりヒスチノール（histinol）を使用することを可能にする、hisD（Hartman and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047-51）；及び、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−DL−オルニチン、DFMOに対する抵抗性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue and Coffino (1983) J. Biol. Chem. 258: 8384-8388）が記載されている。
b. 精製
発現された改変RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体を宿主細胞から単離し、そして精製する技術は、選んだ宿主細胞及び発現系に依存する。分泌された分子では、タンパク質は、一般的には、培養培地から細胞を除いた後に精製される。細胞内発現では、細胞は、可溶化され、そして、タンパク質が抽出物から精製され得る。トランスジェニック生物、例えば、トランスジェニック植物及び動物を発現のために用いるとき、組織または器官は、可溶化された細胞抽出物を作成するための出発物質として使用され得る。さらに、トランスジェニック動物製造は、集められ、そして、必要があれば、本分野で標準的な方法を用いてさらにタンパク質が抽出され、さらに精製される、ミルクや卵におけるポリペプチドの産生を含み得る。
ある場合には、精製の前に、リガンド−毒素複合体を含む分泌された融合ポリペプチドを含む馴化培地（conditioned media）を得ることができる。馴化培地は、そのまま試験され得る。他の例では、馴化培地は浄化され（clarified）、及び／または濃縮化され得る。浄化は遠心、それに続くろ過によりなされ得る。濃縮は、当業者に知られるいずれかの方法、例えば、接線流（tangential flow）膜を用いて、または、攪拌細胞系フィルターを用いて、なされ得る。多様な分子量（ＭＷ）分離カットオフが、濃縮プロセスのために使用され得る。例えば、１０，０００ＭＷ分離カットオフが使用され得る。
原核生物または真核生物のいずれかにより産生された改変RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体は、限定はされないが、SDS-PAGE、ディファレンシャル沈殿（differential precipitation）、ダイアフィルトレーション（diafiltration）、ウルトラフィルトレーション、カラムエレクトロフォーカシング（column electrofocusing）、フラット−ベッドエレクトロフォーカシング、ゲルろ過、等速電気泳動、サイズ分画、硫酸アンモニウム沈殿、高性能液体クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン、陰イオン）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography）、及び分子排除クロマトグラフィー（molecular exclusion chromatography）を含む本分野で知られる標準的なタンパク精製技術により達成され得る。アフィニティー精製技術も、また、調製の効率及び純度を改善するために使用され得る。例えば、改変RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、レセプター及び他の分子の使用が、アフィニティー精製において使用され得る。構築物の発現は、また、アフィニティータグ、例えば、mycエピトープ、GST融合またはHis6を付加するために操作され得、そして、myc抗体、グルタチオンレジン、及びNi-レジンで、それぞれ、タンパク質にアフィニティー精製される。精製は、ゲル電気泳動および染色および分光学的（spectrophotometric）技術を含む本分野で知られるいずれの方法により評価され得る。
形質転換に続き、大量のタンパク質が、常法にしたがって、単離され、精製され得る。例えば、溶解物は、発現宿主にから調製され得、そして、所望のタンパク質（例えば、リガンド−RIP毒素変異体）が、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製され得る。精製されたタンパク質は、一般的には、約８０％から約９０％純粋（pure）であり得、１００％純粋を含む、高純度になり得る。純粋とは、他のタンパク質及び細胞残渣（debris）が無いことを意味する。
ある例では、選択された精製方法は、タンパク質の構造に影響を与え得、そして、それにより、精製後に更なる調製工程が、所望の組換タンパク質を製造するために、必要とされる。例えば、ある発現されたタンパク質は、強い変性条件を用いる精製技術の後に、リフォールディングを必要とする。タンパク質をリフォールディングする方法は、本分野で知られており、例えば、低レベルの還元剤の存在下の透析を含み得る（例えば、実施例４参照）。
3. 化学的複合体（chemical conjugate）の生産
本明細書における化学的複合体を達成するために、標的化剤は、標的化物質に、１以上の選択されたリンカーを介して、または直接的に結合される。化学的複合は、標的化物質及び標的化剤が別々のポリペプチドとして発現される場合に使用され得、そして、標的化物質が、ペプチドまたはタンパク質以外、例えば、核酸または非−ペプチド薬剤である場合に使用され得る。選択された部分を化学的に結合するために本分野で知られているいずれの手段も使用され得る。いくつかの方法が本明細書の他の場所に記載されており、限定はされないが、ホモ−及びヘテロ二官能性（bifunctional）の結合化合物のような架橋剤を含む。
RIP毒素変異体または標的化剤をコードする核酸分子は、また、標的化物質、たとえば、本明細書で与えられている改変されたRIP毒素変異体を、標的化剤に転写後に化学的に結合することを促進させるために改変され得る。例えば、RIP毒素変異体または標的化剤をコードする核酸分子は、発現後、そして、場合によってはRIP毒素及び標的化剤の精製後にRIP毒素を標的化剤に結合することができるリンカーペプチドをコードする核酸分子に融合され得る。他の例では、RIP毒素変異体または標的化剤をコードする核酸分子は、特定のコドンを変異させるために修飾され、化学修飾及び複合のためのポリペプチド、例えばリンカーの付加のための部位として使用され得る、ポリペプチドにおけるアミノ酸を生成させることができる。より特異的には、リンカー部分への結合基（attachment group）を含むアミノ酸残基を除去及び／または導入することによって、ポリペプチドを特異的に適合させて、分子を選択するリンカー部分により結合させやすくすることが可能となる（例えば、米国特許第20060252690参照）。
H. RIPポリペプチドまたはその複合体の生産を増加させる方法
本明細書で提供されているのは、宿主の毒性ポリペプチドの産生を増加させることを可能にするために、RIP毒素の毒性を減じることにより、組換え発現RIP毒素またはリガンド−RIP毒素複合体またはその改変体の産生する方法である。このような方法において、RIP毒素またはその複合体、例えば、本明細書で提供されるいずれかのものは、例えば、上記セクションＧで記載されたように製造され得、１またはそれ以上のRIP阻害剤の存在下で製造され得る。当業者に知られる、または後に見いだされる、RIP毒素を不活性化することができるいずれのRIP毒素阻害剤も、本明細書で提供される方法により使用され得る。本明細書の他の場所で記載されるように、例示的なRIP毒素阻害剤には、例えば、RIP-特異的オリゴヌクレオチド阻害剤、例えば、RNAアプタマー（RNA aptamer）、RIP-特異的抗体、及び／または、例えば、アデニン、４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４−ＡＰＰ）、及び他の同様の異性体を含むアデニン異性体が含まれる。本明細書で提供される方法において、典型的には、このようなRIP毒素阻害剤は、RIP毒素の保存されたN-グリコシダーゼ活性を標的とすることにより毒素活性を阻害するいずれかのものである。本明細書における目的のために、いずれのRIP阻害剤、例えば、アデニンまたはそのいずれのアナログを、その阻害剤がRIP毒素またはその複合体に対する阻害活性を示す限り、本明細書の方法に使用され得る。したがって、RIP阻害剤、例えば４−ＡＰＰは、限定はされないが、改変ＳＡ１、サポニン、モモルジン（momordin）またはブリオジン（bryodin）を含む、RIP毒素、リガンド−RIP毒素複合体、または、その変異体のタンパク質産生のための本明細書に記載された方法に使用することができる。
本明細書で提供される産生の改善方法に使用されるRIP阻害剤の選択は、限定はされないが、組換タンパク質発現のために使用される宿主細胞の選択、及び発現される特定のRIPポリペプチドを含む多くの因子に依存する。与えられるRIPポリペプチドに対するRIP阻害剤の特異性は、知られているか、または、RIPポリペプチドの毒性を評価する通常の方法に基づいて決定され得る。RIP阻害剤特異性の議論は、本明細書の他のところに記載する。例えば、知られた、そして試験されたアデニンアナログの特異性に基づいて、４−ＡＰＰは、本明細書に記載されている、ＳＡ１部分、その活性断片、およびその複合体を含む志賀毒素の発現および改善された産生方法に使用される候補である。特に、４−ＡＰＰは、本明細書で提供される改変されたＳＡ１ポリペプチド、またはその複合体のいずれか、例えば、本明細書で提供されるＬＰＭ複合体のいずれか、の産生を増加させるために本明細書に記載された改善された産生方法に使用され得る。
ポリペプチド発現の方法に使用されるRIP阻害剤の量は、RIP毒素、リガンド−RIP毒素複合体、またはその改変体の毒性に対するその既知の効果に基づいて、実験的に決定され得る。本明細書の方法で使用されるRIP阻害剤は、それ自体特定の宿主細胞に毒性でなく、その毒性は既知であり、選択された宿主細胞に依存して当業者によって決定され得る。したがって、本明細書の発現方法では、典型的には、RIP阻害剤、例えば、４−ＡＰＰは、約0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM、3.0 mM、4.0 mM、5.0 mM、10 mM、15 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mMまたはそれ以上、または、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM、3.0 mM、4.0 mM、5.0 mM、10 mM、15 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mMまたはそれ以上で、阻害剤それ自体が宿主細胞に毒性でない限り、添加される。選択されるRIP阻害剤の濃度は、選択される宿主細胞、組換え体発現のために使用される条件、阻害剤のインキュベーション期間、選択された特定のRIP阻害剤、及び／または産生される特定のRIP毒素またはリガンド−毒素複合体二依存して変化し得ることが理解される。
ある実施例において、RIP阻害剤の濃度は、濃度依存性実験の実施及び阻害剤それぞれの濃度での発現されたタンパク量を試験することによって、実験的に決定され得る。例えば、本明細書の実施例４では、増加した濃度の４−ＡＰＰの存在下での発現の後で、クーマシー染色により種々のＬＰＭの発現プロファイルを評価することにより、種々のＬＰＭの産生に用いる４−ＡＰＰの最適な濃度の決定する、例示的な実験を記載している。実施例４に例示されているように、結果は、増加された４−ＡＰＰの濃度の存在下で、異なるＬＰＭ複合体間で、発現されたポリペプチドのレベルに相違があることが示されている。生産方法に使用するRIP阻害剤の濃度を決定するために、当業者は、最大のタンパク質発現を提供するRIP阻害剤の濃度を決定するために、いずれかのRIPポリペプチド、またはその複合体、及びRIP阻害剤、例えば、４−ＡＰＰを用いて同様の実験をすることができる。例えば、LPM1dは、約10mM以上または10mM以上の４−ＡＰＰで最大レベルで発現され、一方、ＬＭＰ７は、約2.0mM以上または2.0mM以上の４−ＡＰＰの存在下で、最大レベルで発現する。一般的に、ＬＰＭ複合体、例えば、改変４修飾ＳＡ１部分に直接的に、または間接的に結合するケモカインリガンドを含むものは、約2.0 mM、3.0 mM、4.0 mM、5.0 mM、10.0 mMまたは20 mMの４−ＡＰＰ、または2.0 mM、3.0 mM、4.0 mM、5.0 mM、10.0 mM または20 mMの４−ＡＰＰの存在下で、本明細書の方法で産生される。
RIP阻害剤は、RIP毒素、リガンド−毒素複合体、またはその変異体をコードする核酸で宿主細胞を形質転換する前、その間、またはその後で、添加され得る。誘導剤がタンパク質発現を誘導する場合、RIP阻害剤は、誘導剤を宿主細胞に導入する前、その間、及び／またはその後に、添加され得る。例えば、RIP阻害剤は、誘導剤を添加する前に、単一濃度で添加され得る。他の例では、RIP阻害剤は、誘導剤が添加される前に、単一濃度で添加され得、そして、誘導剤とインキュベーションする間、またはその後に、培地は、更なるRIP阻害剤で補完され得る。ある場合、発現系に添加されるRIP阻害剤の濃度は、使用される特定の発現系にしたがって、異なるステージで変化し得る。例えば、実施例４で例示されるように、RIP阻害剤４−ＡＰＰは、ＬＰＭをコードする核酸で形質転換された大腸菌に2.0mMの濃度で、最初の一晩及びリガンド−毒素複合体の成育の間添加されたが、誘導剤とのインキュベーションの間は、１０倍高濃度まで更なる４−ＡＰＰが添加された。実施例４で例示されているように、使用されるRIP毒素阻害剤の濃度、及びRIP阻害剤の投与タイミングは、使用される特定の発現系に依存して最適化され得る。
１以上のRIP阻害剤が、RIP毒素またはその複合体の改善された産生のための本明細書に記載されている方法に使用され得る。さらに、上記で記載されているいずれかのような、組換タンパク質の発現及び産生を改善する他の方法もまた。本明細書の方法で使用され得る。例えば、本分野で知られている、RIPポリペプチドまたはその複合体の発現および産生を増加させるために使用される方法は、RIP阻害剤、例えば、４−ＡＰＰの存在下または非存在下で実施され得る。
タンパク質産生を増加させるための更なる方法
タンパク質の発現及び産生の間に、RIP阻害剤、例えば、４−ＡＰＰを用いることによる、RIPポリペプチドまたはリガンド−毒素複合体の産生の増加に加えて、他の方法もまた使用され得る。ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるいずれのRIPポリペプチドまたはその複合体の発現及び産生を改善する方法は、本分野で知られるいずれの方法を含む。かかる方法の使用は、ポリペプチドを生成するために用いた発現系（例えば、細菌、酵母、哺乳類、昆虫、植物等）に依存し、発現ベクター（例えば、制御されたまたは構成的な発現）、宿主細胞の成育条件、またはタンパク質誘導パラメーターの選択などの因子の修飾を伴うことができる。宿主細胞からの発現されるポリペプチドの単離のための、上記した精製方法（例えば、宿主細胞溶解及びタンパク質分離）は、また、生成されるタンパク質の量を改善するために、本分野で知られる改変により最適化され得る。産生を改善するための更なる方法の例は、以下に記載する。
宿主細胞の生育条件は、例えば、限定はされないが、ｐＨ、温度、大気組成（例えば、酸素または二酸化炭素濃度）、オスモル濃度を含む培地組成、栄養素濃度（例えば、グルコース及び他の糖、ミネラル、及びリン酸塩または他のイオン）、または宿主成育に影響を与える他の分子の存在（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤または抗菌化合物、タンパク質阻害剤糖）を含む多様な方法により変化され得る。生育条件の修飾は、また、硫酸塩などの、タンパク質発現に影響し得る阻害物質の酸性を低下させるために使用することができる（例えば、米国特許第6,686,180参照）。
誘導パラメーターは、例えば、誘導剤（例えば、ＩＰＴＧまたは他の誘導分子、温度、酸素組成等）の濃度、誘導時間の長さ、誘導温度、誘導時の宿主の濃度、および発現レベルにおける宿主バックグランドの影響の変化により、変化させることができる。
宿主細胞の選択も、また、タンパク質産生レベルに影響を与えることができる。例えば、タンパク質産生に影響を与えることができる遺伝バックグランドの違う細菌株を利用できる。かかる違いには、限定はされないが、プロテアーゼ（例えば、lon及びompT）、リコンビナーゼ（例えば、recA）、またはエンドヌクレアーゼ（例えば、endA）の変異、ジスルフィド結合形成及びタンパク質のフォールディングを改善する変異（例えば、trxB/gor）、Ｔ７プロモーター駆動発現のためのＤＥ３溶原菌（例えば、LysEまたはLysS）の存在、宿主細胞のタンパク質誘導（例えば、lacZYまたはlacIq）または糖利用の制御に影響を与える変異が含まれる。宿主細胞は、また、ポリペプチドをコードする核酸配列における希なコドンの認識の改善のために、希なｔＲＮＡ遺伝子のコピーを含むことができる。
本明細書のポリペプチドの発現レベルを変える他の方法は、ポリペプチドをコードする核酸を修飾すること、または、ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを変えることである。本明細書の他のところで記載され、本分野で知られているように、本明細書で提供されるRIP毒素修飾体及びリガンド−RIP毒素修飾体を含む、本明細書で提供されるポリペプチドの発現のために、多くのベクターが利用可能である。本明細書で提供されるポリペプチドの産生を改善する方法には、例えば、限定はされないが、高レベル発現のための強いプロモーター、発現のタイミングをコントロールする制御可能なプロモーター、連続的な発現のための構成的プロモーター、または、長期間発現のための安定的プロモーターのような、性質を有するベクターの選択を含む。高レベルのタンパク質発現及び厳密な制御を可能にするベクターの使用は、本明細書で提供されるRIP毒素変異体及びリガンド−RIP毒素変異体のような毒性タンパク質の発現のために好ましい。このようなベクターの例は、本分野で知られており、例えば、本明細書の他のところ及び実施例で記載されているようなpETベクター類、嫌気的に制御されたプロモーターを有するベクター類（例えば、nirB）、及びD-グルコースで抑制されるL-ラムノース誘導ベクター類を含む（pETベクターは、Novagenより商業的に入手可能である；Debinski et al.、(1991) Mol. Cell. Biol. 11:3:1751-1753; Debinski and Pastan (1992) Cancer Res. 52: 5379 5385; Debinski et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:405-411; Oxer et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19(11) 2889-2892; Giacalone et al. (2006) Biotechniques 40 (3): 355-363）。
ポリペプチドをコードする核酸は、また、ポリペプチドのアミノ酸をコードするコドンに変異を含むために修飾することができ、その結果、ポリペプチドが発現される宿主内でまれであるコドンが、宿主内でより一般的であるコドンに、コードされるアミノ酸を変えることなく、変えられる。特定の宿主においてよく使用されているコドンの使用は、ポリペプチドの翻訳の効率を改善することにより、ポリペプチドの産生を改善することができる。特定の宿主、例えば、細菌宿主のコドン使用頻度は、本分野で知られており、本明細書で与えられるポリペプチドをコードする最適化された核酸を作製するために用いられ得る。
I. 毒素複合体の活性を測定するインビトロ及びインビボアッセイ
一般的に、本明細書で与えられるリガンド−毒素複合体は１以上の宿主細胞に対して毒性を示し、及び／または、例えば、細胞表面受容体を標的化し、結合する能力によって１以上の他の活性を示す。必要であれば、複合体は、インビトロ及びインビボアッセイを用いて、スクリーニングされ、毒素複合体の活性をモニターし、または同定し、そして、かかる活性を示す複合体を選択する。本明細書で提供されるいずれの複合体を試験するインビトロアッセイは、複合体が特定の宿主細胞標的化集団に対して活性を示すか否かを測定するいずれのアッセイを含む。かかる活性には、限定はされないが、細胞ベースの毒性アッセイ、受容体結合アッセイ、細胞インターナリゼーションアッセイ、及び走化性アッセイが含まれる。さらに、多様なインビボ動物モデルが知られ、または、特定の疾病モデルにおける特定の毒素の効果を評価するために設計され得る。
1. インビトロ活性測定
a. 細胞ベースの毒性アッセイ
本明細書で提供される複合体は、宿主細胞に対する毒性活性、例えば、Ｎ−グリコシダーゼ活性によるものについて試験され得る。毒性活性を試験するためのアッセイは、上記セクションＤに詳細に記載され、限定はされないが、宿主細胞のタンパク質合成、リボソームの脱プリン化、及び細胞成長または生存を評価するためのアッセイを含む。例えば、毒性活性評価のために選択される宿主細胞は、標的化受容体を発現することが知られているものであり得る。かかる細胞には、対象、すなわち、血、血清または他の組織ソースから直接的に得られたもの、または細胞表面受容体を発現することが知られている細胞株が含まれる。かかる細胞は、活性化された細胞を含む。細胞は、あらゆる数の刺激によりインビトロで活性化され得るか、及び／または、病気または疾患、とりわけ、炎症疾患または活性化された白血球または他の細胞タイプにより特徴付けされる病気または疾患を有する患者より直接的に得ることができる。毒性活性アッセイにおいて試験され得る細胞タイプの例には、限定はされないが、免役細胞（限定はされないが、単球、マクロファージ（肺胞マクロファージ、ミクログリア、クッパー細胞を含む）、樹状細胞（未熟または成熟樹状細胞またはランゲルハンス細胞を含む)、T細胞（CD4陽性、例えば、限定はされないが、Th1および/またはTh2細胞またはCD8陽性）、B細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、及び内皮細胞、またはそれらの活性化形態）が含まれる。リガンド−毒素複合体に対する毒性を試験することができる他の細胞には、例えば、癌細胞または癌細胞株、例えば、U251、HT-29またはTHP-1 細胞が含まれる。上記のように、細胞の生存（または細胞死）は、例えば、培養培地へのＡＴＰ放出の能力、生存色素（vital dye）ＭＴＴを低減する細胞の能力により測定され得る。
b. 受容体結合アッセイ及びインターナリゼーション
リガンド−毒素複合体、例えば、いずれのケモカイン毒素複合体、例えば、いずれの本明細書で与えられる改変されたＳＡ１部分を含むＬＰＭは、１以上の標的化宿主細胞の細胞表面受容体を標的化するために設計される。このような細胞表面受容体に結合する毒素複合体は、細胞への毒素複合体の結合を評価することによって、直接的に評価され得る。ある例において、単球、マクロファージ（肺胞マクロファージ、ミクログリアを含む）、T細胞（Th1及びTh2細胞を含む）、B細胞、好酸球、好塩基球、樹状細胞、クッパー細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、及び内皮細胞への毒素複合体の結合が、測定され得る。望まれるならば、細胞は、いずれの知られている活性化剤により、結合実験の前に、多様な病気及び疾患で見いだされる炎症及び病原性の状態でしばしば起きるような、受容体の発現を誘導するために、まず、いずれの知られている活性化剤により活性化され得る。試験される細胞は、ドナーから直接的に単離された、適切なドナー由来の、または、適切な細胞表現型を誘導する条件下で長期間培養された、細胞株または初代培養細胞であり得る。ある例において、競合アッセイが、関連する非結合リガンドと共に、リガンドに比較した毒素複合体の活性を評価するために採用され得る。例えば、毒素複合体ＬＭＰ1dが試験されれば（修飾SA1に結合されたケモカインMCP-1を含む）、MCP-1単独は、競合アッセイにおいて試験され得る。
一つの例において、毒素複合体が、特定の細胞表面受容体を発現することが知られている宿主細胞に結合する能力は、複合体をいずれかの既知の検出可能な試薬、例えば、限定はされないが、蛍光部分、放射活性部分、またはタグポリペプチド（つまり、Flag、Hisタグ、mycタグ）でラベルすることにより評価され得る。例えば、毒素複合体は、蛍光部分、例えば、フルオロセイン イソチオシアネート（FITC）でラベルされ得る。FITCでラベルされた毒素複合体の濃度を増加させて所望の細胞タイプに添加すること、及び４℃で指定時間、例えば、３０分または１時間インキュベートすることができる。結合していない毒素複合体を除去するために細胞を洗浄し、細胞に結合した蛍光をフローサイトメトリーによって測定することができる。ある場合には、毒素複合体の結合アフィニティーが、フローサイトメトリー測定において、毒素複合体の濃度を同じ程度の（equal mean）蛍光値を与える濃度で割ることにより、リガンドのリガンド毒素複合体に対する結合アフィニティーを比較することにより、測定され得る（例えば、Thompson et al. (2001) Protein Engineering、14: 1035-1041参照）。さらに、望まれるならば、毒素複合体の細胞によりインターナライズされる能力は、４℃対３７℃で蛍光を比較することによって評価され得る。インキュベーション時間は、毒素複合体が３７℃インキュベーションの間、毒性がないことを確かにするために、調節され得る。結合及びインターナリゼーション（internalization）を評価する他の方法には、限定はされないが、放射活性、細胞ベースのELISA、及び他のこのようなアッセイが含まれる。
c. 走化性アッセイ
毒素複合体；特に、本明細書で提供される改変されたＳＡ１部分を含むＬＰＭ複合体のような１以上のケモカイン毒素複合体は、従来の走化性アッセイを用いて、細胞の走化性を修飾する能力を試験することができる。かかる測定は、同種のケモカイン受容体に結合するケモカインの能力と関連する。かかるアッセイにおいて、活性化された白血球を含む白血球の移動は、ケモカインにより惹起され得、ルーチンなボイデンチャンバーセットアップ（Boyden chamber set up）を用いてフィルターを通して移動する細胞の数を数えることにより、測定される（例えば、McDonald et al. (2001) IDrugs、4: 427-442参照）。例えば、限定はされないが、単球、マクロファージ（肺胞マクロファージ、ミクログリアを含む)、T細胞（Th1及びTh2細胞を含む)、B細胞、好酸球、好塩基球、樹状細胞、クッパー細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、及び内皮細胞を含むいずれの所望の細胞は、修飾されたボイデンチャンバーのトップのウェルに置くことができる。このような細胞は、細胞株であり得、または、ドナーから直接に単離された適切なドナー由来の、または適切な細胞表現型を誘導するための条件下で長期間培養された初代培養細胞であり得る。ボイデンチャンバーの低い方のチャンバーは、典型的には、リガンドケモカインの含む培養培地を含む。ある場合には、ある細胞は、構成的に活性であり、特異的な外因性の刺激なしで、移動することができる。このような細胞には、例えば、ＴＨＰ−１細胞が含まれる。したがって、ＴＨＰ−１細胞が走化性アッセイで使用されるなら、外因性のサイトカインは必要とされない、そして、ケモカイン複合体の効果は、移動を介したボトムのチャンバーに存在する活性細胞及びトップチャンバーに残る不活性細胞と比較され得る（McDonald et al. (2001) IDrugs、4: 427-442）。ボイデンチャンバーのトップ及びボトムウェルの１つまたは両方は、あらゆる濃度のケモカイン毒素複合体で処置され得る。３０分、１時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、またはそれ以上のインキュベーションに続き、チャンバーのそれぞれのウェルの細胞数（またはフィルター上に存在する）が測定され得る。個々のチャンバーのそれぞれにおける細胞へのケモカイン毒素複合体の作用は、測定され、そして、毒素複合体を含まないコントロールウェルと比較することができる。チャンバーの１つまたは両方において細胞が存在しないこと、及び／または、ボトムチャンバーに移動活性細胞が存在しないことは、ケモカイン毒素複合体が標的細胞集団に対して活性であることを示す。
2. 複合体を試験するためのインビボ動物モデル
本明細書で提供される複合体、例えば、修飾されたＳＡ１に結合するポリペプチドまたはその活性部分、例えば、本明細書で提供される改変されたＳＡ１部分を含むいずれのＬＰＭ複合体を含む、は、ケモカイン及び／またはその受容体が関連または関係している疾患の処置に使用され得る。特定の疾患に対する特定の複合体は、本明細書に記載される。必要であれば、当業者は、よく知られたモデルにおいて、特定の適応疾患に対する使用のための複合体を確認し、または特定するために複合体を試験することができる。疾患の動物モデルはよく知られている。かかるモデルには、炎症疾患、とりわけ活性化された白血球、または、ある病気の状態においてケモカイン受容体を発現する活性化された白血球または細胞に関わる疾患のいずれの動物モデルが含まれ、リガンド−毒素複合体で処置されるために、本明細書に包含される。かかる動物モデルで毒素複合体の活性を評価することは、本明細書で包含される特定の疾患または状態の処置に適したそれら毒素複合体を確認及び／または特定することができる。
改変されたＳＡ１部分を含むいずれのＬＰＭ複合体を含む、本明細書で提供されるリガンド−毒素複合体は、また、他の複合体が用いられる疾患のモデル、例えば、抗腫瘍活性を確認するためのマウス異種移植片（xenograft）モデルで試験され得る（Beitz et al. (1992) Cancer Research 52:227-230; Houghton et al. (1982) Cancer Res. 42:535-539; Bogden et al. (1981) Cancer (Philadelphia) 48:10-20; Hoogenhout et al. (1983) Int. J. Radiat. Oncol.、Biol. Phys. 9:871-879; Stastny et al. (1993) Cancer Res. 53:5740-5744）。
哺乳類を処置するための候補を選択する動物モデルはよく知られており、数多くの認知されたモデルがある。さらに、これらの疾患状態において、活性化された免役細胞の役割が示されてきた。かかる疾患及び状態の例示的なモデルには、限定はされないが、如何に議論するものが含まれる。
a. 脊髄損傷(SCI)
SCIの処置に対する本明細書で記載された複合体の活性を試験し、そして実証するためのモデルは、当業者に知られている。リガンド−毒素複合体、例えば、改変されたＳＡ１部分を含むＬＰＭを試験するために用いることができるＳＣＩの動物モデルを提供し、使用している例示的な参考文献は、限定はされないが、本明細書に示された以下の参考文献を含む。
Bennett et al. (1999) Spasticity in rats with sacral spinal cord injury、J. Neurotrauma 16:69-84は、最小限に破壊的であり、膀胱、腸、または後肢の運動機能を阻害しない筋肉の痙性のラットモデルを提供する。脊髄切断をＳ２仙骨レベルで行い、そして、それにより、尾の筋肉組織が影響を受けるのみである。脊髄切断後、尾の筋肉は２週間不活性である。この最初の期間に続き、筋緊張高進、反射高進及びクローヌスが尾で発現し、時間と共に、より明らかになる。尾が容易に近づきやすく、簡単に操作できるので、これらの変化は、警戒したラット（alert rat）で評価された。尾の筋肉伸長または皮膚刺激は、力と筋電図記録により測定すると、筋肉けいれん及び筋緊張の顕著な増加となった。尾が拘束されたとき、自発的な、また反射で惹起された屈筋及び伸筋が尾を巻いた。けいれんの間の動きは、しばしば、尾の末端でクローヌスを惹起する。尾の毛及び皮膚は、軽い接触に極度に反射し、接触すると直ぐに引っ込め、時には、表面上で尾の繰り返された接触によりクローヌスを伴うことができた。部分的な尾筋肉反射、例えば、ホフマン反射（Ｈ−反射）は、スパイナリゼーション（spinalization）の前後で測定され、そして、切断後２週間で顕著に増加した。これらの結果は、仙骨（sacral spinal）ラットが、脊髄損傷を有する人の足の筋肉で見られるのと同様な特徴を有する尾筋肉でけいれんの症状を発症し、よってこの症状を検討するための便利な調製を与えることを示す。
Taoka et al. (1998), Spinal cord injury in the rat、Prog Neurobiol 56:341-58は、更なる新しい治療戦略の発展に向けた、ラットにおける外傷−惹起脊髄損傷の病気のメカニズムの総説を提供する。外傷により惹起される脊髄損傷は、最初の物理的損傷及び組織破壊を導く多様な病理化学的（pathochemical）イベントを伴うそれに続く進行性の損傷過程の結果であり：よって、後者は、医薬処置の標的となるであろう。最近、活性化された好中球が、ラットにおいて脊髄損傷の後者の過程に関与することが示されてきた。活性化された好中球は、好中球エラスターゼ及び酸素フリーラジカルのような炎症性メディエーターを放出することにより内皮細胞にダメージを与える。内皮細胞への活性化された好中球の接着は、また、内皮細胞損傷に役割を果たし得る。この内皮細胞傷害は、順に、微小循環障害を惹起し、脊髄虚血を導き得る。好中球の活性化を阻害するいくつかの治療剤は、脊髄損傷のラットモデルにおいて観察される運動障害を緩和する。メチルプレドニゾロン（ＭＰＳ）及びＧＭ１ガングリオシド、それらは、急性脊髄障害の処置において現在臨床的に使用できる２つしかない薬剤であるが、ラットモデルでは、好中球活性化を阻害しない。これらを一緒に考えると、これらの観察は、好中球活性化を阻害する他の薬剤が、ＭＰＳまたはＧＭ１ガングリオシドと併用されて、ヒトにおける外傷性脊髄損傷の処置において相乗効果を奏することができる可能性を提起する。
Carlson et al. (1998), Acute inflammatory response in spinal cord following impact injury、Exp Neurol 151:77-88は、ラットのＴ１０脊髄（１０ｇ重量、５０ｍｍドロップ）への挫傷後４、６、２４及び４８時間での、好中球とマクロファージ／ミクログリアの頭側−尾側（rostral-caudal）の分布を検討している。好中球は、ネクローシス領域で、多く存在し、ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）アッセイで測定すると２４時間でピークとなるタイムコースであった。ＭＰＯ活性の最も鋭いピークは、損傷の4mm頭側及び尾側の間に位置した。マクロファージ／ミクログリアは、ＥＤ１及びＯＸ−４２に対する抗体で可視化された。食細胞の形態を有する多くの細胞は２４ｈまでに存在し、４８ｈまでにより増加した。これらの細胞は、灰白質（gray matter）及び後索白質（dorsal funiculus white matter）に多く存在した。細胞の数は、損傷の６ｍｍ頭側及び尾側の間で、徐々に減少した。ＯＸ−４２染色は、また、ブラントプロセス（blunt process）での活性化ミクログリアを、とりわけ、損傷から遠いレベルで、明らかにした。マクロファージ／ミクログリアの数は、どのレベルでも、組織損傷の量に関連した。
実験的なマウスの脊髄損傷での前炎症性（pro-inflammatory）サイトカイン及びケモカインｍＲＮＡの発現：インサイツハイブリダイゼーション（in situ hybridization）検討、Bartholdi et al. (1997) Eur J Neurosci 9:1422-38は、実験的なマウスの脊髄損傷での前炎症性（pro-inflammatory）サイトカイン及びケモカインｍＲＮＡの発現パターンを検討している。インサイツハイブリダイゼーションは、前炎症性サイトカイン、ＴＮＦα及びＩＬ−１並びにケモカインＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの転写物が、損傷後最初の１時間でアップレギュレートされることを示す。この初期のフェーズにおいて、前炎症性サイトカインの発現は、損傷エリアの周辺の細胞、おそらく内在するＣＮＳ細胞に限定されている。ＴＮＦαが大変狭い時間ウィンドウで発現する一方、ＩＬ−１は、約６ｈで脊髄に浸入する多形核顆粒球（polymorphonuclear granulocyte）のサブセットにおいて、第２フェーズで検出され得る。ケモカインＭＩＰ−１α及び−βのメッセージは、全般的に全脊髄の灰白質で、約２４ｈで発現し、損傷後４日で、損傷部位の細胞浸潤物にまた限局される。データは、内在するＣＮＳ細胞、最もおそらくは、ミクログリア細胞、末梢の炎症細胞でないものが、サイトカインとケモカインのｍＲＮＡの主な源であることを示す。観察された決定されたサイトカインパターンは、ＣＮＳ損傷時の炎症性イベントがしっかりと制御されていることを示している。前炎症性サイトカイン及びケモカインのメッセージの非常に初期の発現は、炎症性細胞の動員の重要な要素を示し得る。
慢性の実験的脊髄損傷における血管の形態学的解析：血管過剰増生及び機能の回復、Blight et al. (1991)、J Neurol Sci 106:158-74は、以前に記載された、設定した厚みへの圧迫（compression to a set thickness）に基づいた、モルモットにおける脊髄外傷モデルを提供する。低い胸髄（lower thoracic cord）の圧迫損傷は、１１の麻酔された、おとなのモルモットで作製され、連続的な行動薬理学試験及び２−３月での損傷の形態を用いて、結果がモニターされた。この報告は、損傷の真ん中を通した１ミクロンの形成横セクション（plastic transverse sections through the center of the lesion）の光学顕微鏡解析に基づいて、脊髄の血管（vascularity）における変化を記載する。これらの損傷の平均的な血管密度は、通常の損傷を受けていない脊髄の同等の領域で見られるものの約２倍であり、白質の過剰血管形成は、損傷中央から、頭側及び尾側に少なくとも４脊髄セグメント拡大した。毛細血管の半径の分布は、大きな値にシフトし、血管周囲腔は、ほとんどの毛細血管及びプレ及びポストの毛細血管（pre- and post-capillary vessel）に囲まれた。過剰血管形成の程度は、損傷の全体的な重症度には相関せず、損傷後の１日と８週の間に見られる、白質の外側４００μにおける血管の密度と損傷に続く神経学的機能の２次的喪失の間に顕著な正相関があった。これらのデータは、損傷の血管過剰形成が脊髄損傷における二次的な病的メカニズム、おそらく炎症反応に関連し、それは、最初の物理的損傷に比較的独立しいるが、機能のロスと回復により密接に関連していることを示す。
打撲損傷に続く脊髄における興奮性毒素（excitotxin）キノリン酸のレベルの増加、Blight et al. (1993)、Brain Res 632:314-6は、炎症性食細胞の生産物が、脊髄外傷に続く二次的病変に寄与する能力があることを示し、短い圧縮損傷の５日後における、おとなのモルモットの低い胸髄（lower thoracic spinal cord）での、ニューロトキシン及び活性化されたマクロファージの産物、キノリン酸（ＱＵＩＮ）のレベルを定量する試験を提供する。損傷部位（Ｔ１３）で、組織ＱＵＩＮレベル（＞１０倍）の上昇は、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（＞２倍）の活性とＬ−キヌレニン（＞２．５倍）の濃度の正の増加を伴った。これに対し、顕著な変化は、コントロールに比較して、検討した２つの損傷されていない領域、つまり、頸髄（Ｃ２）及び体性感覚皮質において、起きなかった。
Forbes et al. (1994)、Inhibition of neutrophil adhesion does not prevent ischemic spinal cord injury、Ann Thorac Surg 58:1064-8は、動物モデルにより、パラプレジアが、脊髄の最初の虚血または再還流期の損傷の結果として、一過性の大動脈結紮の後に起き得ることを示す。虚血／再還流の動物モデルにおいて、再還流障害は、部分的に好中球により修飾され得ることが明らかである。好中球接着ブロックマウスモノクローナル抗体（MAb 60.3）の効果を、ウサギ脊髄虚血／還流において評価した。脊髄虚血は、腎臓下の動脈のバルーンカテーテル結紮により成し遂げた。神経学的評価は、普通、部分的神経学的損傷、完全な麻痺としてランク付けした。電気生理学的な体性感覚惹起ポテンシャルのモニターリングを、結紮時間の最適な長さを決定するために用いた。実験者が処置を知らない状況で、動物をランダムに、2 mg/kg のMab 60.3(n = 8)または生理食塩水溶液 (n = 9)を静注で処置した。平均的な結紮時間は群間で相違なかった（コントロール、32.7 +/- 3.6分 対 ＭＡｂ、32.4 +/- 6.0分）。５匹の（５５％）食塩水処置及び４匹（５０％）のMAb60.3処置動物が麻痺した。最初の不全対麻痺を有する動物は全て弛緩性麻痺に２４時間の間に進んだ。この検討は、一過性動脈結紮の後の脊髄損傷が好中球のＣＤ１１／ＣＤ１８グリコプロテイン複合体に独立していることを結論づける。このセッティングにおける損傷は、虚血の間に起こり得、よって、好中球または再還流に依存しないであろう。
Liu et al. (1997)、Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury、J Neurosci 17:5395-406は、軽度から中程度の重症度の外傷にかけられたラットの脊髄を検討する。軽い重量の落下インパクト（10g重量6.25mm落下）の後数分内で、インパクトエリアの直近のニューロンは、細胞質Nissl物質のロスを示した。次の７日に渡り、損傷領域は拡大し、空洞が作られた。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）−媒介デオキシウリジントリホスフェート−ビオチンニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）−陽性ニューロンが、損傷４−２４ｈｒ後、全般的な損傷領域に制限されて見いだされ、損傷８ｈｒ後で最大になった。ＴＵＮＥＬ陽性グリアは、４ｈｒ及び１４ｄの間、試験された全てのステージで存在し、損傷２４ｈｒ後、損傷領域内で最大に存在した。損傷７日後、損傷の周辺の白質でＴＵＮＥＬ陽性グリア細胞の第二の波が見いだされ、損傷中央から少なくとも数ミリメートル離れたところまで拡大した。メカニズムとしてのアポトーシスは、電子顕微鏡により、そして、Hoechst33342色素を用いた核染色により、そして、損傷部位から調製されたDNAの試験により、検証された。さらに、12.5mm重量落下衝撃の直後から始めた、シクロヘキシミドの反復腹腔内投与は、脊髄ダメージの組織学的証拠及び４週間後に評価された運動障害の実質的に低減した。このデータは、アポトーシスが活動的なタンパク質合成に依存し、神経及びグリア細胞死、さらに、ラット脊髄への軽度から中程度の外傷により惹起される神経学的損傷に寄与するという仮説を支持する。
脊髄損傷モデルにおけるＬＭＰ複合体の実験的な結果は、実施例８に示され、そこには、脊髄損傷モデルにおけるLPM1dの実験的結果が示される。他のLPM、例えば、本明細書で提供されるような、修飾されたSA1に結合したケモカインを含むものは、また、同様に試験され得る。かかる結果は、LPMが脊髄損傷の治療のための治療薬の候補として使用できることを示す。
b. 外傷性脳傷害及び脳卒中を含む神経変性疾患
神経変性疾患、例えば、外傷性脳損傷及び脳卒中の処置のために、本明細書に記載されている複合体の活性を試験し、そして検証する方法は、当業者に知られている。神経変性疾患、例えば、外傷性脳損傷及び脳卒中の動物モデルを提供し、使用する例示的な参考文献は、本明細書で提供されている。かかる方法は、リガンド−毒素複合体、例えば、修飾されたＳＡ１部分を含むＬＰＭ複合体を確認、または特定するために使用され得、限定はされないが、本明細書に示される以下の参考文献を含む。
Ghirnikar et al. (1996)、Chemokine expression in rat stab wound brain injury、J Neurosci Res 46:727-33は、おとなの哺乳類中枢神経系（CNS）に対する外傷は、活性型アストログリア及び造血性の細胞の損傷された神経組織への浸潤を導くことが記載されている。ケモカインは損傷に続いて起こる炎症変化のメディエーターとして認識されている。MCP-1の発現は、ラット脳での外傷において示されてきた（Berman et al. (1996) J Immunol 156:3017-3023）。メカニカル損傷のための刺創モデル（stab wound model）を用いて、ラット脳における２つの他のケモカイン：RANTES及びＭＩＰ−１βの発現が検討された。刺創モデルは、広範なグリオーシスと造血性細胞の浸潤によって特徴づけられる。免疫組織染色は、損傷された脳におけるRANTES及びＭＩＰ−１βの存在を明らかにした。RANTES及びＭＩＰ−１βは、両者とも、ネクローシス組織に分散して発現し、損傷１日後（dpi）と同じくらいに早期に検出された。二重染色試験は、RANTESではなくＭＩＰ−１βが、損傷部位の近くの活性化アストロサイトにより発現されることを示した。さらに、ＭＩＰ−１β染色は、また、損傷部位マクロファージで検出された。ケモカインの最初の発現は、損傷されたＣＮＳにおける炎症性細胞の出現に密接に関連し、RANTES及びＭＩＰ−１βが、外傷性脳損傷の炎症イベントに役割を果たし得ることが示された。この検討は、また、ラットＣＮＳへの外傷に続く反応性アストロサイトにおけるＭＩＰ−１βの発現を示した。
Wang et al. (1998)、Prolonged expression of interferon-inducible protein-10 in ischemic cortex after permanent occlusion of the middle cerebral artery in rat、J Neurochem 71:1194-204は、焦点（focal）脳卒中におけるIP-10の役割を調査し、ラット中大脳動脈結紮後の一時的なIP-10ｍRNAの発現を、ノーザン解析により試験している。焦点脳卒中の後のIP-10ｍRNAの発現は、中大脳動脈結後３ｈでの顕著な早期の増加（コントロールの４．９倍；p0.01）、６ｈでのピーク（１４．５倍；p0.01）、及び、虚血損傷後１０−１５日の第２の惹起（１０及び１５日の間、それぞれ７．２及び９．３倍増加；p0.01）を伴う、独特の２相性プロファイルを示した。インサイツハイブリダイゼーションは、IP-10ｍRNAの惹起された発現を確認し、そして、焦点脳卒中の後のその空間的分布を明らかにした。免疫組織学的検討は、虚血ゾーンのニューロン（３−１２ｈ）及びアストログリア（６ｈから１５日）において、IP-10の発現を示した。濃度依存的なC6グリア細胞上のIP-10の走化活性及びラット大脳顆粒神経細胞の増強された接着性が示された。データは、虚血がIP-10を惹起し、焦点脳卒中の後の長期に渡る白血球の動員、アストロサイト浸潤／活性化、神経細胞接着／発芽（sprouting）に多面的な役割を果たすことを示した。
Galasso et al. (1998)、Excitotoxic brain injury stimulates expression of the chemokine receptor CCR5 in neonatal rats、Am J Pathol 153:1631-40は、死後７日ラットにおける、CCR5発現についてのNMDAの海馬内注入の影響を評価している。逆転写ポリメラーゼチェインリアクション（reverse transcription polymerase chain reaction）は、損傷２４時間後の海馬CCR5mRNAの増加を明らかにし、そして、インサイツハイブリダイゼーション解析は、CCR5ｍRNAが損傷された海馬及びその近傍の領域に発現されることを示した。ウェスタンブロッティング解析は、海馬組織のCCR5タンパク質の増加が、損傷後３２時間に及ぶ（extract）ことを示した。補足的な免役細胞化学の検討により、浸潤するミクログリア／単球及び損傷されたニューロンが、主なCCR5-免疫反応性細胞として特定された。これらの結果は、急性の興奮毒性損傷がCCR5発現を制御するという証拠を提供する。
Vannucci et al. (1999)、Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage、J Neurosci Res 55:158-63は、周産期の低酸素虚血脳損傷の病因と管理について知見を得るために成熟していないラットのモデルを使用する。そのモデルは、全身低酸素がその後に続く、１つの総頸動脈の結紮を伴う。その傷害は、頸動脈結紮の同側の大脳半球に限定された永久的な低酸素虚血脳損傷をもたらす。このモデルは、低酸素−虚血脳損傷を予防しまたは最小限にする治療戦略の特定のための検討に使用される。
c. 神経変性疾患-アルツハイマー病(AD)
神経変性疾患、例えば、（ＡＤ）の処置のために本明細書に記載された複合体の活性を試験し、そして検証するための方法は、当業者に知られている。これらのモデルは、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病の処置のために使用される複合体を確認し、または特定するために使用され得、リガンド−毒素複合体、例えば、修飾されたＳＡ１部分を含むＬＰＭ複合体を試験するために使用され得るが、限定されることなく、本明細書に示された以下の参考文献を含む。
Hauss-Wegrzyniak et al. (1998)、Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease、Brain Res 780:294-303は、炎症プロセスが、アルツハイマー病に関連する変性変化及び認知障害の病因論に役割を果たすことが記載され、そして、グラム陰性細菌の細胞壁由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を使用して、若年のラットの脳内に慢性の、全般的な炎症を起こすことを記載している。４週間、第４脳室へＬＰＳ（0.25μg/h）を慢性的に注入することにより、（１）グリア細胞繊維性酸性タンパク質陽性の活性化されたアストロサイト及びOX-6陽性反応性ミクログリアの数が増加し、脳全般に分布し、側頭葉、特に海馬内で最も増加する、（２）前脳基底領域（basal forebrain region）及び海馬内で、インターロイキン−１ベータ、腫瘍壊死因子−アルファ、及びベータアミロイド前駆体タンパク質のmRNAレベルが、増加する、（３）海馬CA3錐体神経細胞が変性する、そして、（４）空間記憶の顕著な障害が、Ｔ迷路での自発的交替行動（spontaneous alternation behavior）の減少により測定される。
オンセットの早いアルツハイマー病を有する家族のＡβ産生に関与するヒト遺伝子の変異型を発現するように遺伝子操作された齧歯類を含む、数多い他のアルツハイマー病モデルは、当業者に知られ、そして、利用可能である。
d. 多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、限局された領域の脱髄により特徴づけられる中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患である。ミエリン抗体に反応する免疫がこの疾患プロセスに貢献する。ＭＳは、顕著な炎症、オリゴデンドロサイトのミエリン鞘の喪失、神経変性、グリオーシス及び軸索喪失により特徴づけられる異種（heterogeneous）慢性自己免疫疾患である。（例えば、Bruck、W. & Stadelmann、C. Neurol Sci 24 Suppl 5、S265-7 (2003); Bruck、W. & Stadelmann、C.、Curr Opin Neurol 18、221-4 (2005); Fox、E.J.、Neurology 63、S3-7 (2004); Fox、R.J. & Ransohoff、R.M、Trends Immunol 25、632-6 (2004); Hendriks、J.J.、Teunissen、C.E.、de Vries、H.E. & Dijkstra、C.D. Brain Res Brain Res Rev 48、185-95 (2005); Prat、A. & Antel、J.、Curr Opin Neurol 18、225-30 (2005); Liu、L.、Callahan、M.K.、Huang、D. & Ransohoff、R.M.、Curr Top Dev Biol 68、149-81 (2005); Mahad、D. et al.、Ernst Schering Res Found Workshop、59-68 (2004)参照。）この病気は、北アメリカで約４００，０００人、全世界では２５０万人が罹患する（例えば、Cross、A.H. & Stark、J.L.、Immunol Res 32、85-98 (2005); Hafler、D.A.、J Clin Invest 113、788-94 (2004); Sindern、E.、Front Biosci 9、457-63 (2004); and Steinman、L.、Neuron 24、511-4 (1999)参照）。オンセットは通常２０−４０歳であるが、異なる予後及び診断の結果（challenge）を含む、早期（１８歳未満）及び後期（５０歳を過ぎる）オンセットのケースを含む非典型的なＭＳの形態がある（例えば、Krupp、L.B. & Macallister、W.S.、Curr Treat Options Neurol 7、191-199 (2005); Martinelli、V.、Rodegher、M.、Moiola、L. & Comi、G.、Neurol Sci 25 Suppl 4、S350-5 (2004); Stadelmann、C. & Bruck、W.、Neurol Sci 25 Suppl 4、S319-22 (2004); Stadelmann、C. et al.、Brain 128、979-87 (2005)参照）。
通常のケースの約８５％が、視覚障害、一過性の盲目及びモーターコオーディネーション（motor co-ordination）を含む損傷された感覚モダリティー（modality）のエピソードを再発−寛解し、始まる。これは、第二の進行性疾患への未知を与える。ＭＳのもう１つの形態は、所謂第一の進行性ＭＳである。再発は、神経変性のフェーズに移行するまで起きる（例えば、Bruck、W. & Stadelmann、C.、Neurol Sci 24 Suppl 5、S265-7 (2003); Bruck、W. & Stadelmann、C.、Curr Opin Neurol 18、221-4 (2005); Fox、E.J.、Neurology 63、S3-7 (2004); Fox、R.J. & Ransohoff、R.M.、Trends Immunol 25、632-6 (2004); Steinman、L.、Curr Opin Immunol 13、597-600 (2001);及びZaffaroni、M.、Neurol Sci 24 Suppl 5、S279-82 (2003)参照）。免疫、遺伝、及び環境（例えば、ウイルス、細菌）要素が、ＭＳの病因に関係する（例えば、Zaffaroni、M.、 Neurol Sci 24 Suppl 5、S279-82 (2003)参照）。
ＭＳ病因の特徴は、脊髄を含むＣＮＳ全体の白質プラークまたは損傷である（例えば、Bruck、W. & Stadelmann、C.、Neurol Sci 24 Suppl 5、S265-7 (2003); Mahad、D. et al.、Ernst Schering Res Found Workshop、59-68 (2004); Fawcett、J.W. & Asher、R.A.、Brain Res Bull 49、377-91 (1999); 及びZhang、Y. et al.、J Clin Immunol 25、254-64 (2005)参照）。慢性活性損傷（chronic active lesion）における最も多い白血球グループは、活性化されたCCR2+/CCR3+/CCR5+/CXCR3+マクロファージである。他の細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びミクログリアを、同様の受容体発現パターンで含む。これらの受容体に関連したリガンドは、アストロサイト及び参加している白血球グループを囲む損傷において生産される（例えば、Banisor、I.、Leist、T.P. & Kalman、B.、J Neuro-inflammantion 2、7 (2005); Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005); Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004);及びPutheti、P. et al.、Eur J Neurol 10、529-35 (2003)参照）。ＣＮＳ白血球グループは、武器：反応性酸素及び窒素種を含む有害物質；ＭＭＰ；ロイコトリエン類：自己抗体の産生及び前炎症性（proinflammatory）サイトカイン及びケモカインの放出、により免疫的損傷を惹起する。これは、同様に、軸索ダメージ、損傷形成、及びオリゴデンドロサイト及びニューロンの細胞死を惹起する。
１） EAEモデル
ＥＡＥモデルにおいては、脱髄疾患がマウスに惹起される。活性化された単球、マクロファージ、ミクログリア及びＴ細胞が、組織損傷の原因となる。このケースのモデルは急性（再発−寛解に反対の慢性進行性ＭＳのような）であるが、悪化の前に必須なものには、ＣＮＳ及び病気で浸潤する白血球グループ上でのＣＣＲ２（例えば、ＬＰＭ１ｄに対する受容体；配列番号：４４で示されたＬＰＭ１ｄポリペプチドのアミノ酸配列）のアップレギュレーションがある。したがって、そのモデルは、全てのタイプのＭＳに適用できる処置を確かにする。リガンド−毒素複合体、例えば、修飾されたSA1部分を含むLPM複合体を試験するために用いることができる多発性硬化症の動物モデルを提供し、使用している例示的な参考文献には、限定はされないが、Liu et al. (1998)、Nat Med 4:78-83があり、そこでは、MSを検討するための、実験的な自己免疫 脳脊髄炎 (EAE)齧歯類モデルの使用が記載されている。ＥＡＥモデルにおける、本明細書に提供される複合体の有効性を示すデータは、実施例１０にて提供される。
2) MSに関与する白血球
多くの研究において、ヒトＭＳの病因論及びＥＡＥモデルにおいてマクロファージ及びミクログリアが必須である。ＤＣ、ＭａＣ及びＢ細胞は、また、役割を果たす（Cross、A.H. & Stark、J.L.、Immunol Res 32、85-98 (2005); Zhang、Y. et al.、J Clin Immunol 25、254-64 (2005); Mouzaki、A.、Tselios、T.、Papathanassopoulos、P.、Matsoukas、I. & Chatzantoni、K.、Curr Neurovasc Res 1、325-40 (2004); Heppner、F.L. et al.、 Nat Med 11、146-52 (2005); Huitinga、I. et al.、Clin Exp Immunol 100、344-51 (1995); Polfliet、M.M. et al.、J Neuroimmunol 122、1-8 (2002); Behi、M.E. et al.、Immunol Lett 96、11-26 (2005); Theoharides、T.C. & Cochrane、D.E.、J Neuroimmunol 146、1-12 (2004); Chavarria、A. & Alcocer-Varela、J.、Autoimmun Rev 3、251-60 (2004); Kouwenhoven、M. et al.、J Neuroimmunol 126、161-71 (2002); Greter、M. et al.、 Nat Med 11、328-34 (2005)）。ミクログリア細胞はＥＡＥのオンセットの前に活性化され、増殖する（例えば、Ponomarev、E.D.、Shriver、L.P.、Maresz、K. & Dittel、B.N.、J Neurosci Res 81、374-89 (2005)参照）。ミクログリアとマクロファージの不活性化及びＴ及びＭＮＰ細胞の除去（depletion）は、ＥＡＥの重篤度を改善する（例えば、Heppner、F.L. et al.、Nat Med 11、146-52 (2005); Huitinga、I. et al.、Clin Exp Immunol 100、344-51 (1995); Polfliet、M.M. et al.、J Neuroimmunol 122、1-8 (2002); Rajan、A.J.、Asensio、V.C.、Campbell、I.L. & Brosnan、C.F.、J Immunol 164、2120-30 (2000); Rajan、A.J.、Klein、J.D. & Brosnan、C.F. J Immunol 160、5955-62 (1998); Bauer、J. et al.、Glia 15、437-46 (1995); Kotter、M.R.、Zhao、C.、van Rooijen、N. & Franklin、R.J.、Neurobiol Dis 18、166-75 (2005);及びTran、E.H.、Hoekstra、K.、van Rooijen、N.、Dijkstra、C.D. & Owens、T.、J Immunol 161、3767-75 (1998)参照）。研究は、末梢のマクロファージが、Ｔ細胞の活性化とＥＡＥの進展に極めて重要であることを示してきた（例えば、Polfliet、M.M. et al.、J Neuroimmunol 122、1-8 (2002); Deloire、M.S. et al.、Mult Scler 10、540-8 (2004); Imrich、H. & Harzer、K.、J Neural Transm 108、379-95 (2001); Raivich、G. & Banati、R.、Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004)参照）。リツキサン（抗ＣＤ２０ｍＡｂ）を用いたＭＳ患者におけるＢ細胞の除去（depletion）により、顕著な臨床的な改善がもたらされた（Stuve、O. et al.、Arch Neurol 62、1620-3 (2005)参照）。ＥＡＥにおけるＰＭＮの除去は、病気のエフェクター相（effector phase）を阻害する。ＭＳ患者におけるＰＭＮは、病気の増悪に繋がるいくつかの細胞表面抗原を高いレベルで発現させる（例えば、McColl、S.R. et al.、J Immunol 161、6421-6 (1998); Ziaber、J. et al.、Mediators Inflamm 7、335-8 (1998)参照）。マウスでの研究は、ＣＮＳのＰＭＮが、ミエリン及びアジュバンド抗原に対するＴ細胞応答の強力な抑制剤であること、そして、自己免疫好中球減少症が、男性ＭＳ患者で報告されたことを示す（Kozuka、T. et al.、Intern Med 42、102-4 (2003); and Zehntner、S.P. et al.、J Immunol 174、5124-31 (2005)）。
高度に活性化されたミクログリア、血管周囲のＭＮＰ及び浸潤するＭＮＰは、ＭＳにおいていくつかの役割を果たす。有害物質の放出によるそれらの炎症性の破壊的な役割とは離れて、それらは、浸潤するＴ細胞に対する抗原を提示し、ミエリン特異的なＴ細胞応答及びケモカインを介したＴ細胞及びマクロファージの更なる動員を促進する（例えば、Deng、X. & Sriram、S.、Curr Neurol Neurosci Rep 5、239-44 (2005); Behi、M.E. et al.、Immunol Lett 96、11-26 (2005); Raivich、G. & Banati、R.、Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004); Nelson、P.T.、Soma、L.A. & Lavi、E.、Ann Med 34、491-500 (2002); Zhang、S.C.、Goetz、B.D.、Carre、J.L. & Duncan、I.D.、Glia 34、101-9 (2001); Izikson、L.、Klein、R.S.、Luster、A.D. & Weiner、H.L.、Clin Immunol 103、125-31 (2002)参照）。
マクロファージは、また、ＭＳにおける変性の病因に関係する。細胞浸潤物（Cellular infiltrate）は、ＭＳ損傷における軸索欠失に関連する（例えば、Hendriks、J.J.、Teunissen、C.E.、de Vries、H.E. & Dijkstra、C.D.、Brain Res Brain Res Rev 48、185-95 (2005)参照）。食細胞ＭＮＰ及びミクログリアは軸索ミエリン鞘を破壊し、それにより、患者の機能喪失が導かれる（例えば、Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005); Raivich、G. & Banati、R.、Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004);及びSmith、M.E.、van der Maesen、K. & Somera、F.P.、 J Neurosci Res 54、68-78 (1998)参照）。ミクログリアは、神経細胞のアポトーシス小体を貪食するのと同様に、神経細胞死を誘導し、そして、神経突起の伸展を阻害することができる（例えば、Munch、G. et al.、Exp Brain Res 150、1-8 (2003);及びStolzing、A. & Grune、T.、Faseb J 18、743-5 (2004)参照）。
単球由来ＤＣ、Ｂ細胞、ＭａＣ及び活性化されたアストロサイトもまた、ＭＳの病因に関与する（例えば、Zhang、Y. et al.、J Clin Immunol 25、254-64 (2005); Behi、M.E. et al.、Immunol Lett 96、11-26 (2005); Chavarria、A. & Alcocer-Varela、J.、Autoimmun Rev 3、251-60 (2004); Corcione、A. et al.、Autoimmun Rev 4、549-54 (2005);及びZang、Y.C. et al.、Mult Scler 10、499-506 (2004)参照）。活性化ストロサイトは、いくつかのケモカイン及び他のメディエーターを放出し、炎症部位へ白血球を引きつける（例えば、Ambrosini、E. et al.、J Neuropathol Exp Neurol 64、706-15 (2005); Andjelkovic、A.V.、Kerkovich、D. & Pachter、J.S.、J Leukoc Biol 68、545-52 (2000); Krumbholz、M. et al.、J Exp Med 201、195-200 (2005)参照）。Macは、血管透過性の原因となり、損傷におけるフィブリン沈着を促進するプロテアーゼを放出する（例えば、Theoharides、T.C. & Cochrane、D.E.、J Neuroimmunol 146、1-12 (2004); Pedotti、R.、De Voss、J.J.、Steinman、L. & Galli、S.J.、Trends Immunol 24、479-84 (2003)参照）。ＤＣは、Ｔ細胞の活性化を促進する抗原及び病気の進展を与える（例えば、Greter、M. et al.、Nat Med 11、328-34 (2005)参照）。異所性のリンパ組織は、ＭＳ患者の髄膜における炎症部位で明らかである。かかる患者の髄膜は、Ｂ、Ｔ、血漿、及びＤＣ細胞を含み、体液性の自己免疫及び病気の増悪を維持する段階で現れる（例えば、Serafini、B.、Rosicarelli、B.、Magliozzi、R.、Stigliano、E. & Aloisi、F.、Brain Pathol 14、164-74 (2004)参照）。
ＭＮＰ、Ｔ細胞、Ｉｇ及び免疫複合体に加えて、Ｂ細胞も、また、ＭＳ損傷において現れる。７０％を越える活動性病変は、補体と抗体を含む（例えば、Cross、A.H. & Stark、J.L. Immunol Res 32、85-98 (2005)参照）。クローン化され拡大された抗体分泌Ｂ細胞及び胚中心細胞は、ＭＳ患者のＣＳＦに見いだされる（例えば、Zhang、Y. et al.、J Clin Immunol 25、254-64 (2005); Ziemssen、T. & Ziemssen、F.、Autoimmun Rev 4、460-7 (2005); Corcione、A. et al.、Autoimmun Rev 4、549-54 (2005); 及び Corcione、A. et al.、Proc Natl Acad Sci U S A 101、11064-9 (2004)参照）。９０％を越えるＭＳ患者は、ＣＳＦ中に、髄腔内のオリゴクローナルＩｇ及び増加された量の抗体を有し、それらは、ＭＳ悪化のエピソードに関連している（例えば、Cross、A.H. & Stark、J.L.、Immunol Res 32、85-98 (2005)参照）。Ｂ細胞は、ＣＮＳ胚中心に由来すると考えられ；脳は、長期間生存、増殖および異所性リンパ構造の形成のために好適な微少環境を提供する。Ｂ細胞は、ミエリンタンパク質に対する抗体を作り（ミエリンオプソニン作用を増加する）、Ｔ細胞へ抗原及び補体分子を提供し、そして白血球を動員する。研究は、循環するＢ細胞の集団は永久的に不活化されないが、持続的に活性化され、自己免疫攻撃の原因となることを見いだしている（例えば、Gauld、S.B.、Benschop、R.J.、Merrell、K.T. & Cambier、J.C.、Nat Immunol 6、1160-7 (2005)参照）。ＭＳにおけるＢ細胞は、ＣＮＳ内で分化されるとき活性化され得る。
3) ＭＳにおけるケモカイン類
リガンド及び受容体のケモカインメッセージングシステム（chemokine-messaging system）は、ＥＡＥ及びＭＳの病因に極めて重要な役割を果たす。このシステムは、これらの自己免疫疾患において、様々な白血球サブタイプのトラフィッキング（trafficking）、CNS浸潤および異常な炎症機能を組織化する。多数のケモカインおよびそれらの受容体が多発性硬化症において特定されてきており、CCL-1-8、CXCL8-13、CCR1-3,5およびCXCR1-3、4を含む（例えば、Banisor、I.、Leist、T.P. & Kalman、B.、J Neuroinflammation 2、7 (2005); Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005); Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004); Putheti、P. et al.、 Eur J Neurol 10、529-35 (2003); および Raivich、G. & Banati、R.、 Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004)参照）。例えば、MS損傷において、CCR1、2、5および6並びにCXCR3はCD3+ T 細胞上に現れ、そして、CCR1、2、3および5並びにCXCR3は、泡沫状マクロファージおよび活性化されたミクログリアに現れる（例えば、Banisor、I.、Leist、T.P. & Kalman、B.、J Neuroinflammation 2、7 (2005); Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005);Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004); Putheti、P. et al.、Eur J Neurol 10、529-35 (2003); Raivich、G. & Banati、R.、Brain Res Brain Res Rev 46、261-81 (2004); Malamud、V. et al.、J Neuroimmunol 138、115-22 (2003); Pedotti、R.、De Voss、J.J.、Steinman、L. & Galli、S.J.、Trends Immunol 24、479-84 (2003); Serafini、B.、Rosicarelli、B.、Magliozzi、R.、Stigliano、E. & Aloisi、F.、Brain Pathol 14、164-74 (2004); Corcione、A. et al.、Proc Natl Acad Sci U S A 101、11064-9 (2004); Gauld、S.B.、Benschop、R.J.、Merrell、K.T. & Cambier、J.C.、Nat Immunol 6、1160-7 (2005); Bartosik-Psujek、H. & Stelmasiak、Z.、Eur J Neurol 12、49-54 (2005)参照）。
アストロサイト由来CCL2およびCXCL10は、EAEの研究において明らかにされた。これらのケモカインは、更なる神経免疫反応を惹起し、抹消からの白血球の動員に貢献する（例えば、Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004); Huang、D. et al.、Immunol Rev 177、52-67 (2000); Jee、Y.、Yoon、W.K.、Okura、Y.、Tanuma、N. & Matsumoto、Y.、J Neuroimmunol 128、49-57 (2002)参照）。CCL2/CCR2およびCXCL9/10/11 /CXCR3は、それらの分布がいくつかの特異的な病因白血球細胞タイプ上にあり、そしてそれらがMSおよびEAE研究においてしばしば検出されたことから、治療的介在（therapeutic intervention）の標的の中にある。ケモカイン軸（axis）CCL2/CCR2は、MNPおよびT細胞の内皮細胞を通り（transendothelial）、CNSへの遊走に役割を果たし、血液脳関門（BBB）損傷および破壊に関与する（例えば、Chavarria、A. & Alcocer-Varela、J Autoimmun Rev 3、251-60 (2004); Mahad、D. et al.、Brain (2005); Dzenko、K.A.、Andjelkovic、A.V.、Kuziel、W.A. & Pachter、J.S.,. J Neurosci 21、9214-23 (2001); Dzenko、K.A.、Song、L.、Ge、S.、Kuziel、W.A. & Pachter、J.S.、Microvasc Res (2005); Stamatovic、S.M. et al.、J Cereb Blood Flow Metab 25、593-606 (2005); Minagar、A. & Alexander、J.S.、Mult Scler 9、540-9 (2003)参照）。CCL2は、内皮細胞間のタイトジャンクションをCCR2を介して変化させることにより、BBB透過性を増加させる（Stamatovic、S.M. et al.、J Cereb Blood Flow Metab 25、593-606 (2005)）。入ってくるMNPは、また、CCL2を分泌することにより、その透過性を変化させ、そして、CNSへ遊走する。MNP-およびT細胞-由来のMMPは、また、BBBの分解および破壊、および酸の細胞を通る移行（cellular transmigration）に関与する（例えば、Abraham、M.、Shapiro、S.、Karni、A.、Weiner、H.L. & Miller、A.、J Neuroimmunol 163、157-64 (2005); Avolio、C. et al.、J Neuroimmunol 136、46-53 (2003); Karabudak、R. et al.、J Neurol 251、279-83 (2004); Uccelli、A.、Pedemonte、E.、Narciso、E. & Mancardi、G.、Neurol Sci 24 Suppl 5、S271-4 (2003); Brundula、V.、Rewcastle、N.B.、Metz、L.M.、Bernard、C.C. & Yong、V.W.、Brain 125、1297-308 (2002); Sellebjerg、F. & Sorensen、T.L.、Brain Res Bull 61、347-55 (2003); Vos、C.M.、van Haastert、E.S.、de Groot、C.J.、van der Valk、P. & de Vries、H.E.、J Neuroimmunol 138、106-14 (2003)参照）。CXCR3+は、T細胞をBBBへトラフィッキングさせるが、これらの細胞におけるCCR2の発現は、漏出を可能にする（Mahad、D. et al.、Brain (2005); Callahan、M.K. et al.、J Neuroimmunol 153、150-7 (2004)参照、それは、BBBを通過した後、T 細胞および単球上のCCR2のダウンレギュレーションを記載する）。CCL2/CCR2 ケモカインペアは、BBB透過性に関与し、いくつかの白血球タイプにおいて、CNS実質および損傷内で、CCL2/CCR2軸の顕著な増加が観察される（Mahad、D.J. & Ransohoff、R.M.、Semin Immunol 15、23-32 (2003)）。さらに、CCL2/CCR2軸は、MS脳での損傷、患者の血液およびCSFにおいて顕著である（Banisor、I.、Leist、T.P. & Kalman、B.,. J Neuroinflammation 2、7 (2005); Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005); Putheti、P. et al.、Eur J Neurol 10、529-35 (2003); and Mahad、D.J. & Ransohoff、R.M.、Semin Immunol 15、23-32 (2003))参照）。授与体の発現は、ケモプリント（chemoprint）が一時的であり、空間的であり、優勢な微小環境に従って変化するので、時間に渡り変化する（Karpus、W.J. & Ransohoff、R.M. J Immunol 161、2667-71 (1998)）。単球がBBBを通過するので、それらはCCR2をダウンレギュレートし、その後再発現し、成熟してマクロファージとなる。このことは、死後のＭＳ剖検を用いた研究で、コントロールＣＮＳ組織に対し、ミクログリア細胞により発現されるCCR2、CCR3およびCCR5のレベルが低いことが示され、検証されている。慢性活性ＭＳ損傷では、CCR2、CCR3およびCCR5が、泡沫化マクロファージおよび活性化されたミクログリアで出現する。CCR2およびCCR5は、また、大部分の浸潤白血球上にも存在し、少数のCCR-3陽性白血球が存在する（例えば、Simpson、J. et al.、J Neuroimmunol 108、192-200 (2000)参照）。同様に、CXCR3およびCCR5は、好ましくはTh1 細胞（前炎症性サイトカイン産生者）上で発現され、MS再発の間、抹消血中で著しくアップレギュレートされる。受容体のレベルは、患者が寛解へ向かうと低下する（Mahad、D.J.、Lawry、J.、Howell、S.J. & Woodroofe、M.N.、Mult Scler 9、189-98 (2003)）。CXCL10の発現は、MS患者由来のCSFでアップレギュレートされ、その受容体、CXCR3の発現と密接に関連したCNS組織部分において空間的に脱髄と関係する（例えば、Sorensen、T.L. et al.、J Neuroimmunol 127、59-68 (2002)参照）。自己免疫性脱髄（autoimmune demyelination）におけるCCL2/CCR2の参加の更なる証拠は、EAE研究からもたらされる。CCL2がCNSにおいて高度に発現され、抗CCL2処置がマウスにおける病気の再発を阻害することが見出された。CCR2-/-マウスを用いた研究が、CCL2/CCR2がEAEの進展に重要であることを示す（Fife、B.T.、Huffnagle、G.B.、Kuziel、W.A. & Karpus、W.J.、J Exp Med 192、899-905 (2000); Izikson、L.、Klein、R.S.、Charo、I.F.、Weiner、H.L. & Luster、A.D.、J Exp Med 192、1075-80 (2000)）。CCL2 DNAワクチンは、動物をEAEの進展から保護し、そして、CCL2およびCCR2のアップレギュレーションは、病気の再発フェーズと密接に関連した（Jee、Y.、Yoon、W.K.、Okura、Y.、Tanuma、N. & Matsumoto、Y.、J Neuroimmunol 128、49-57 (2002); Youssef、S. et al.、J Immunol 161、3870-9 (1998)）。CCL2は、ケモカインが損傷形成を惹起することができることを示すマウスにおいて、慢性的に発現されるとき、脳症の原因となることが示された（Huang、D. et al.、Faseb J 19、761-72 (2005)）。
CXCL9/10/11 ケモカインおよびそれらの対応するCXCR3 受容体は、また、EAEおよびMSにおいて役割を果たす（例えば、Liu、L.、Callahan、M.K.、Huang、D. & Ransohoff、R.M.、Curr Top Dev Biol 68、149-81 (2005); Cartier、L.、Hartley、O.、Dubois-Dauphin、M. & Krause、K.H.、Brain Res Brain Res Rev 48、16-42 (2005); Sorensen、T.L. et al.、J Neuroimmunol 127、59-68 (2002); Mahad、D.J.、Lawry、J.、Howell、S.J. & Woodroofe、M.N.、Mult Scler 9、189-98 (2003);および Lazzeri、E. & Romagnani、P.、Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 5、109-118 (2005)参照）。MSにおいて、炎症バランス（inflammatory balance）は、Th１細胞（前炎症性サイトカイン生産者）優勢であり、それは、Th2細胞環境（抗炎症性サイトカイン生産者）と反対に、CXC3およびCCR5の発現に関係し、特徴的にCCR3、4 および 8を発現する（例えば、Mouzaki、A.、Tselios、T.、Papathanassopoulos、P.、Matsoukas、I. & Chatzantoni、K.、Curr Neurovasc Res 1、325-40 (2004); Teleshova、N. et al.、J Neurol 249、723-9 (2002); および Misu、T. et al.、J Neuroimmunol 114、207-12 (2001)参照）。CXCR3およびCCR5を発現するT細胞は、血液と比較してMS CSF中に顕著に多い。CCR5+/CCR3-細胞はCSFには存在せず、このことは、CCR5が、単独の原因で、T細胞のCSFへのトラフィッキングをしないことを示す（例えば、Kivisakk、P. et al.、Clin Exp Immunol 129、510-8 (2002); および Sorensen、T.L. et al.,. J Clin Invest 103、807-15 (1999)参照）。炎症のモデルにおいて、抗CXCR3治療は、炎症組織へのTh1細胞の浸潤を改善し、このことは、CXCR3がトラフィッキングに必要な受容体であることを示す（例えば、Xie、J.H. et al.、J Leukoc Biol 73、771-80 (2003); および Sindern、E.、Patzold、T.、Ossege、L.M.、Gisevius、A. & Malin、J.P.、J Neuroimmunol 131、186-90 (2002)参照）。活性でないMS損傷は、損傷を囲むマクロファージおよびアストロサイトにより、CXCL9およびCXCL10が発現されている。CXCR3は、損傷内のT細胞およびアストロサイトに発現されている。Th1細胞由来IFN-γは、細胞を刺激して、化学誘引物質を発現させ、CNSにT細胞を動員させる（Simpson、J. et al.、J Neuroimmunol 108、192-200 (2000)）。CXCR3およびその対応するリガンドいくつかは、いくつかのEAEモデルで検討した。この軸は、特異的なEAEモデルや、げっ歯類の種に役割を果たす。ある研究において、CXCL10欠損マウスは、コントロールグループに比較して、その発現、重症度および組織病理を示した。研究は、CXCL10はトラフィッキングに必要でないが、コントロールに比較して末梢で病気感受性の閾値を下げることを決定した（Klein、R.S. et al.、J Immunol 172、550-9 (2004); Oppenheim、J.J. et al.、J Leukoc Biol 77、854-61 (2005)）。CXCR3は、また、上述した白血球集団の少なくとも１％（at least a percentage）で発現する（Sorensen、T.L. et al.、J Clin Invest 103、807-15 (1999); Oppenheim、J.J. et al.、J Leukoc Biol 77、854-61 (2005); Kuipers、H.F. et al. Glia (2005); Foley、J.F. et al.、J Immunol 174、4892-900 (2005)）。例えば、患者はCSFおよび血中のB細胞で、それぞれコントロールに比較して活性MSで高いCXCR3およびCCR5の発現を有した（Sorensen、T.L.、Roed、H. & Sellebjerg、F.、J Neuroimmunol 122、125-31 (2002)）。マウスおよびヒトアストロサイトおよびミクログリアは受容体を発現し、インビトロで対応するリガンドに反応して走化性とされる（例えば、Biber、K. et al.、Neuroscience 112、487-97 (2002)参照）。したがって、他のなかで、これらの受容体は、１以上のこれらの受容体を標的とする１つを選択し、本明細書で与えられた複合体を適切に選ぶことにより、標的化されることができる（表、実施例および本明細書の記載を参照）。
4) MSにおける治療
メチルプレドニゾロン、インターフェロン類およびコパクソン（Copaxone）は、再発寛解疾患（relapsing remitting disease）の進展を遅くする。ノバトロン（novantrone）、アザチオプリン、メトトレキサートおよびシクロホスホミドを含む免疫抑制薬剤が、第１および第２の進展MS（primary and secondary progressive MS）（表５）に使用された。病気の進行を明らかに変える薬剤はない（不運なキャンパス（登録商標）（Campath）を除いて）（例えば、Galimberti、D.、Bresolin、N. & Scarpini、E.、Expert Rev Neurother 4、439-53 (2004);および Leary、S.M. & Thompson、A.J.、CNS Drugs 19、369-76 (2005)参照）。白血球除去する検討およびよい病因論およびキャンパス（登録商標）白血球除去により惹起される寛解（毒性にもかかわらず）は、ケモカイン媒介白血球減少のよい前兆となる（例えば、Coles、A.J. et al.、Ann Neurol 46、296-304 (1999); Moreau、T. et al.、Lancet 344、298-301 (1994)参照）。ケモカインメッセージングシステム（chemokine messaging system）は、MSに対するしっかりとした治療標的を提供することができる。MSにおいて活性である多くの白血球サブタイプはCCR2および／またはCXCR3を発現するので、かかる受容体を標的とする複合体、例えば、LPM7またはLPM1ｄおよび本明細書に例示される他のもの、は、MSの治療のため、または治療に使用され得る。CCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3,5、6およびCXCR1-3、4の１またはそれ以上のいずれか、またはその組み合わせを標的化する他の複合体が使用され得る。
e. 関節炎および自己免疫 疾患
本明細書の複合体の、自己免疫疾患、例えば、関節炎、狼瘡（lupus）および上述したMSの処置のための活性を試験し、検証する方法は、当業者に既知である。修飾されたSA1部分を含むLPM複合体のようなリガンド−毒素複合体を試験するために使用することができる、関節炎および自己免疫疾患の動物モデルを提供し、そして使用する例示的な参考文献には、限定はされないが、本明細書に示される以下の参考文献を含む。
Barnes et al. (1998)、Polyclonal antibody directed against human RANTES ameliorates disease in the Lewis rat adjuvant-induced arthritis model、J Clin Invest 101:2910-9は、Tリンパ球およびマクロファージ細胞浸潤により特徴付けられる疾患
である、アジュバンド惹起関節炎（AIA）がリウマチ関節炎の多くの動物モデルの１つであることが記載されている。Barnesらは、この疾患モデルをけもかいん発現の点で特徴づけ、2つのケモカイン（RANTES；Tリンパ球および単球化学誘引物質、、並びにKC（ヒトGRO-αのマウスホモログ）；好中球の化学誘引物質）の増加されたレベルが全血および関節で見出されたことを示している。MIP-1α（他のT-リンパ球および単球化学誘引物質）のレベルは、全血において病気の過程を通して不変であり、関節でわずかに上昇した。RANTES発現は、RANTESに対するポリクローナル抗体がAIAにより惹起される動物の症状を大きく改善し、インドメタシン（非ステロイド抗炎症剤）を用いた処置と同様に有効であったことが見出されたので、その疾患に重要な役割を果たす。MIP-1αまたはKCのいずれかに対するポリクローナル抗体は、効果がない。
Weinberg、A. D. (1998)、Antibodies to OX-40 (CD134) can identify and eliminate autoreactive T cells: implications for human autoimmune disease、Mol Med Today 4:76-83は、自己抗原特異的 CD4+ T 細胞が、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫 ブドウ膜炎、糖尿病、炎症性腸 疾患および移植片対宿主病（graft-versus-host disease）において、原因となる細胞タイプとして関与していることを記載している。Weinbergは、また、自己免疫組織破壊部位で自己反応性T細胞を除去する有効な治療の開発のために実験滝に惹起された自己免疫疾患を用いることを記載する。
Schrier et al. (1998)、Role of chemikenes and cytokines in a reactivation model of arthritis in rats induced by injection with streptococcal cell walls、J Leukoc Biol 63:359-63は、関節炎の動物モデルにおけるケモカインの役割を検討している。連鎖球菌（streptococcal）細胞壁（SCW）抗原の関節内注入およびその後の静脈内チャレンジ（intravenous challenge）により、雌性ルイスラット（Lewis rat）におけるT細胞媒介単関節炎（monoarticular arthritis）を導く。第１の研究では、静脈内SCW高原に対するこの再活性化反応(reactivation response)は、インターロイキン１（IL-1）および腫瘍壊死因子アルファ（TNF-アルファ）に依存し、そして、膨潤の初期相が好中球依存性であることを示した。好中球除去またはPセレクチンまたはMIP-2抗体を用いた受動免疫が足首の浮腫の強度および好中球の流入を低下させた。しかしながら、最初の数日後、関節炎反応は、主に単核細胞により媒介される。関節組織は、MCP-1のmRNAをアップレギュレートし、それは、部分的に抗IL-4により阻害され得る；ラットをIL-4またはMCP-1に対する抗体で処置すると、足首の浮腫の進展および炎症の病理組織証拠（histopathological evidence）を顕著に抑制する。インターフェロンガンマまたはIL-10に対する抗体は、効果がなかった。抗MCP-1による処置は、またラベルされたT細胞の足首関節への流入を抑制した。これらのでーたは、雌性ルイスラットにおけるSCW惹起関節炎の後期の単核依存的な（mononuclear-dependent）フェーズが、MCP-1をアップレギュレートさせるサイトカインを必要とし、それは、次に、関節への単核細胞の動員と溢出を促進させることができる。
Oppenheimer-Marks et al. (1998)、Interleukin 15 is produced by endothelial cells and increases the transendothelial migration of T cells in vitro and in the SCID mouse- human rheumatoid arthritis model in vivo、J Clin Invest 101:1261-72は、内皮細胞（EC）のIL-15を産生する能力およびIL-15のT細胞の経内皮移動（transendothelial migration）へ影響を与える能力を検討している。ヒト臍静脈内皮細胞は、IL-15ｍRNAおよびタンパク質を発現する。内皮細胞由来IL-15は、IL-15に対するモノクローナル抗体でブロックすることによりこの過程が阻害されることから明らかにされるように、T細胞の経内皮移動を増強する。IL-15は、インテグリン接着分子LFA-1(CD11a/CD18)の結合能力を活性化すること、そして、また、増加されたT細胞の運動性により、T細胞の経内皮移動を増強する。さらに、IL-15は、初期活性化分子CD69の発現を誘導した。インビボT細胞の遊走の調節におけるIL-15の重要性は、免疫欠損SCIDマウスへ移植されたリウマチ関節炎の滑液組織内の適合移植されたヒトT細胞の蓄積を促進する能力により確認された。これらの結果は、ECが、T細胞が炎症組織に浸出する役割を果たすIL-15を産生することを示す。
Kasama et al. (1995)、Interleukin-10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type II collagen-induced arthritis J Clin Invest 95:2868-76は、タイプIIコラーゲン惹起関節炎（CIA）の進展の間の、特異的なサイトカイン、MIP-1αおよびMIP-2、およびインターロイキン 10 (IL-10)の発現および寄与を試験している。MIP-1αおよびMIP-2の走化性サイトカインタンパク質の検出可能なレベルは、最初、最初のタイプIIコラーゲンチャレンジから、第３２日と第３６日の間観察されるが、増加されたIL-10は、第３６日および第４４日の間見出される。MIP-1αまたはMIP-2のいずれかに対する抗体を用いて受動免疫されたCIAマウスは、関節炎のオンセットの遅れ、そして、関節炎の重症度の低減を示した。抗IL-10抗体で中和されたCIAマウスは、オンセットおよび関節炎の重症度の増加を示した。抗IL-10処置は、MIP-1αおよびMIP-2の発現を増加させ、同様に、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性および炎症関節への白血球浸潤を増加させた。これらのデータは、MIP-1αおよびMIP-2が、開始および維持に役割を果たす一方、IL-10は、実験関節炎の進展の間調節的役割を果たすようであることを示している。
Keffer et al. (1991)、Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis、Embo J 10:4025-31は、野生型および３'修飾ヒト腫瘍壊死因子（hTNF-アルファ、カケクチン（cachectin））トランスジーンを有し、そして、発現するトランスジェニックマウスを提供し、それは、正しいエンドトキシン反応性およびマクロファージ特異的hTNF遺伝子発現がトランスジェニックマウスで確立され得たこと、そして、hTNF遺伝子の３'領域がマクロファージ特異的転写に関係することができることを示している。３'修飾hTNFトランスジーンを有するトランスジェニックマウスは、発現パターンの脱調節化および慢性炎症性多発関節炎の進展を示す。Kefferらは、関節炎を予想通り進展するトランスジェニクマウスが、それにより、ヒトにおいて、この病気の病因論と処置をさらに調査できる遺伝子モデルであることを示している。
Sakai et al. (1998)、Potential withdrawal of rheumatoid synovium by the induction of apoptosis using a novel in vivo model of rheumatoid、Arthritis Rheum 41:1251-7は、FAS媒介アポトーシスがリウマチ関節炎（RA）の治療方針としてポテンシャルがあるか否か、ヒトRA組織をSCIDマウスに移植したRAモデルを用いて検討している。関節軟骨を含む新しいリウマチ滑膜組織が、SCIDマウスの背中の皮下に移植された。移植６週間後、抗FASモノクローナル抗体を腹腔内に注射した。移植した滑膜における抗FASモノクローナル抗体によって惹起される時間に関連したアポトーシス変化を、ニックエンドラベリング組織化学により評価した。注入３６時間後、分散されたアポトーシス変化が移植された滑膜で観察された。注射４週後、リウマチ滑膜組織は縮小した。
Smith et al. (1999)、Diacerhein treatment reduces the severity of osteoarthritis in the canine cruciate-deficiency model of osteoarthritis、Arthritis Rheum 42:545-54は、イヌの変形性関節症 (OA)モデルを記載する。OAを、左ひざの前部十文字靭帯の切断により２０匹のおとなの雑種犬に惹起した。このモデルは、OAの処置を試験するために使用された。
f. 炎症性肺疾患
炎症性肺疾患の処置のための本明細書における複合体に関する活性を提示および試験するためのモデルは、当業者には既知である。リガンド-毒素複合体、例えば改変したSA1部分を含有するLPM複合体を試験するために用い得る炎症性肺疾患の動物モデルを提供および使用する文献の例示として、本明細書で説明する下記文献を含むが、これに限定するものではない。
Kumagai et al. (1999)、Inhibition of Matrix Metalloproteinases Prevents Allergen-Induced Airway Inflammation in a Murine Model of Asthma, J Immunol 162:4212-4219により、アレルギー性喘息のマウスモデルを用いて、気管支喘息の病原におけるMMPの役割が研究された。このモデルを用いて、リンパ球および好酸球の浸潤をともなうOVA感作マウスにおけるAg吸入後の気管支肺胞洗浄液中のMMP-2およびMMP-9の放出の増加が報告されている。気管へのメタロプロテイナーゼ-2という組織阻害剤の投与により、気管壁および内腔へのリンパ球および好酸球のAg誘導性浸潤が阻害され、Ag誘導性気管過敏反応性が低下し、末梢血中の好酸球およびリンパ球が増加した。気管内腔への細胞性浸潤の阻害はまた、メタロプトテイナーゼ-1という組織阻害剤および合成基質メタロプロテイナーゼ阻害剤を用いても認められた。このデータはMMP、特にMMP-2およびMMP-9は、気管支喘息の病原的特徴である炎症性細胞の浸潤および気管過敏反応性の誘導に関して決定的なものであるということを示すものである。
Griffiths-Johnson et al. (1997) Animal models of asthma: role of chemokines, Methods Enzymol 288:241-66により、多数のケモカインが、(1)炎症動物モデルに由来するin vitro細胞培養上清およびin vivo滲出物のバイオアッセイおよび(2)分子生物学技術の使用によって見出されているということが記載されている。喘息においては好酸球が重要なエフェクター細胞であるという、動物および臨床研究からの強力な証拠がある。Griffiths-Johnsonらは、肺への好酸球補充を阻害するための２種の標的、すなわち、好酸球生物学のいくつかの態様において重要であるIL-5およびその受容体、ならびにエオタキシンおよびその受容体であるCCR3を同定している。エオタキシン受容体は好酸球で多数発現されるがその他の白血球では発現されず、エオタキシンおよびMCP-4などのその他のケモカインに対する好酸球の主要な検出物であると考えられている。エオタキシンおよびCCR3ノックアウトマウスは、喘息と関連のあるメディエーターの評価、ならびに特異的治療的様相を試験することができるであろう。
Campbell et al. (1998) Temporal role of chemokines in a murine model of cockroach allergen-induced airway hyperreactivity and eosinophilia,J Immunol 161:7047-53により、ゴキブリアレルゲン誘導性気管疾患のネズミモデルが提供され、ヒトアトピー性喘息と類似の特異的な反応機構が評価されている。このモデルにおけるアレルギー性反応としてはアレルゲン特異的気管好酸球増加、および炎症と直接関連する相当に変化した気管生理機能が挙げられる。第一段階の間の重要な好酸球誘引物質であるMIP-1αおよび第二の再負荷段階の間のエオタキシンを用いて、これらの段階の間のCCケモカインの特異的な役割が同定されている。これらのモデルによりゴキブリアレルゲン負荷の両段階に関与するメディエーターの評価、ならびに特定の治療様相を試験することが可能となる。
Piguet et al. (1989) Tumor necrosis factor/cachectin plays a role in bleomycin-induced pneumopathy and fibrosis,J Exp Med 170:655-63 and Schrier et al. (1983) The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation, Am Rev Respir Dis 127:614-617により、肺繊維症のマウスモデルが記載されている。
Steinhauser et al. (1999) IL-10 is a major mediator of sepsis-induced impairment in lung antibactirial host defense, J Immunol 162:392-399により、敗血症と関連する免疫抑制機構を調べるための敗血症誘導性緑膿菌肺炎のマウスモデルが記載されている。CD-1マウスに盲腸の結紮および26規格針での穿刺(CLP)または擬似手術のいずれかとそれに続く緑膿菌（P. aeruginosa）または生理食塩水の気管内(i.t.)投与を施した。CLPとその24時間後の生理食塩水または緑膿菌のi.t.投与を施されたマウスの生存率はそれぞれ58%および10%であり、他方、擬似手術とそれに続く緑膿菌投与を施された動物は95%が生存した。CLP/緑膿菌群における死亡率の増加は、肺の細菌クリアランスが著しく損なわれこと、さらに緑膿菌菌血症の早期発症に起因する。擬似ではなくCLPを施したマウスへの細菌のi.t.投与により好酸球の強い肺内蓄積がもたらされた。さらに、敗血症マウスにおける緑膿菌抗原投与により、IL-12の減少傾向をともなう肺IL-10産生の増強への関連する変化がもたらされた。敗血症マウスにおいて、緑膿菌抗原投与の直前に与えられた、IL-10Absのi.t.ではないi.p.投与により、緑膿菌を投与された敗血症動物の生存率および肺からの細菌の排除の双方が相当改善された。最後に、CLPを施された動物から単離された肺胞マクロファージはex vivoで緑膿菌を取り込み死滅させる能力において著しい欠陥を示したが、この欠陥はin vivoでのIL-10の中和によって部分的に回復した。考え合わせると、これらの観察結果から、敗血症反応は緑膿菌に対する肺の内在的な免疫を実質的に損ない、この作用は内生的に産生されたIL-10によって媒介されているということが示された。
g.遺伝子治療後の炎症
遺伝子治療後の炎症を含む炎症の処置のために、本明細書中の複合体を確認および同定するためのモデルはよく知られている。例えば、Muruve ら(1999)のアデノウイルス遺伝子治療は、in vivoにおいて複数のケモカインの急速な誘導と急性好中球依存性肝臓傷害をもたらし、Hum Gene Ther 10:965-76は複製欠陥アデノウイルスに、感染組織の急性傷害および炎症を誘導する分子機構を研究し、ヒトの遺伝子治療への使用を制限している。この応答を特徴づけるため、種々のアデノウイルスベクターを静脈投与した後、DBA/2マウスにおけるケモカインの発現を評価した。adCMVbeta gal、adCMV-GFPおよびFG140を静脈投与すると、用量に依存してマウスの肝臓内に一貫したパターンのC-X-CおよびC-Cケモカインの発現が誘導された。10(10)PFUのadCMVbeta galを感染させた１時間後、肝臓のMIP-2 mRNAのレベルはベースラインの60倍を上回る増加を示した。MCP-1およびIP-10 mRNAのレベルもまた種々のアデノウイルスベクターを感染させた後直ちに増加し、6時間でピークとなり、それぞれ25倍および100倍を超える発現が見られた。アデノウイルスベクターによるRANTESおよびMIP-1beta mRNAの初期誘導も起こったが、より低い程度であった。投与から16時間以内にソラレン不活性化アデノウイルス粒子が同一パターンのケモカイン遺伝子転写物を産生したので、ケモカインの誘導は独立にウイルス遺伝子の発現をもたらした。ケモカインの発現は予期した通り、感染した動物の肝臓内への好中球およびCD11b+細胞の流入と相関していた。高力価では、DBA/2マウスに対する全身投与の後、全てのアデノウイルスベクターが有意な肝臓の壊死およびアポトーシスを引き起こした。このアデノウイルス誘導性の肝傷害における好中球の役割を調査するため、動物を中和抗MIP-2抗体で前処理するかまたは好中球を涸渇させた。MIP-2の拮抗作用および好中球枯渇各々また両方により血清ALT/ASTのレベルが減少し、アデノウイルス誘導性の肝傷害は組織学的に軽減され、初期の傷害は概ねケモカインの生産および好中球の補充によるものであると確認された。この結果は複製欠陥アデノウイルスベクターに対する初期の免疫応答を明らかにし、アデノウイルスを媒介とする炎症、およびケモカインまたは好中球の機能を干渉することによる組織の傷害を防御する戦略を示唆する。
h. 血管新生
本明細書で提供される複合体は、血管新生および血管新生に関与するプロセスにて上方調節される細胞を標的とすることができる。例として、リガンド-毒素複合体、例えば改変SA1部分を含有するLPM複合体を確認または同定するために、血管新生の動物モデルを提供かつ使用するような文献には、次のものを包含するが、これに限定するものではない。
Folkman et al. (1987), Angiogenic factors、Science 235:442-7は、血管新生、ならびに、例えば酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子など、アンジオゲニン、および形質転換増殖因子αおよびβなどの因子の役割と、脈管系の増殖調節を理解する際のそれらの重要性を確立するものである。推定される標的に従って評価すると、因子は、血管内皮細胞に直接はたらいて移動または有糸分裂を刺激するグループ、ならびに間接的にはたらいて宿主細胞(例えばマクロファージ)を動員して内皮増殖因子を放出するグループに分けられる。新血管新生が起こっている腫瘍にその因子が存在することに加えて、新血管新生が起こっていない多くの正常組織にも同じ血管新生のペプチドが見られる。これは血管新生因子の生理学的発現が厳格に調節されていることを示唆する。腫瘍により誘導される持続性血管新生のほかに、これまでには関係がないと思われていた種々の非腫瘍性疾患は毛細血管の病理学的成長に左右されるため、今では「血管新生疾患」とみなされ得る。
Leibovich et al.(1987)、Macrophage-induced angiogenesis is mediated by tumor necrosis factor-alpha, Nature 329:630-632は、創傷修復、炎症および腫瘍増殖中の新しい血管成長の誘導においてマクロファージが重要であることを記載し、ラットの角膜における毛細血管新生およびヒナの漿尿膜の発生を研究することによりこれを調べた。
Koch et al. (1992)、Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis、Science 258:1798-1801は、単球/マクロファージにより産生された血管新生因子が、持続性血管新生を特徴とする慢性炎症性疾患の病因に関与することを記載している。リンパ球および好中球に対して走化性のあるインターロイキン8（IL-8）の役割は、ラットの角膜に移植された時に潜在的に血管新生を示し、ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖および走化性を誘導する。このデータは、関節リウマチ、腫瘍増殖、および創傷修復などの血管新生依存性疾患におけるマクロファージ由来のIL-8の役割を示す。
i. 腫瘍増殖
本明細書で提供された複合体（例えば、増殖因子-毒素複合体、ErbB受容体複合体およびその他)は、腫瘍の治療のために、例えば血管新生などの腫瘍形成に関与する腫瘍受容体および/または細胞を標的化することにより使用できる。血管新生および炎症に関与する細胞の動員は、腫瘍成長および発症に関連がある。下記文献は、これらの関係性および腫瘍、血管新生および炎症反応の阻害剤についての治療法を同定するための動物モデルが当業者にはよく知られていることを述べている。これらの文献は、腫瘍成長および腫瘍成長に関連のある細胞を阻害するための治療法に関する研究のための動物モデルの可能性を明示する。改変された SA1 部分を含有するLPM複合体をふくめた、本明細書で提供されたリガンド-毒素複合体を、このようなモデルに使用して、腫瘍増殖に対する作用を評価することができる。
Phillips et al.(1994)、Transforming growth factor-alpha -Pseudomonas exotozin fusion protein (TGF-alphfa-PE38) treatment of subcutaneous and intracranial human glioma and medulloblastoma xenografts in athymic mice、Cancer Res 54:1008-15は、神経膠芽腫または髄芽腫の皮下異種移植片を担持するヌードマウスを用いて、TGF-α-シュードモナス菌外毒素組換え毒素であるTGF-α-PE38を用いる標的化脳腫瘍治療のために、正常な脳では低いか検出不可能であるが、多種の悪性神経膠腫や他の原発性脳腫瘍にでは増幅されるかまたは過剰発現される表皮増殖因子受容体(EGFR)の示差発現を行っている。異種移植モデルは、炎症反応の処置のためのケモカイン受容体-標的化複合体の試験および腫瘍発症に関与する細胞の標的化に有用であり得る。
Debinski et al.(1994)[Interleukin-4 receptorrs expressed on tumor cells can serve as a target for anticancer therapy using chimeric Pseudomonas exotoxin、Int J Cancer 58:744-748]は、ヒト固形腫瘍異種移植モデルにおけるヒトIL4(hIL4)および強力なバクテリア毒素であるPseudomonas exotoxin A (PE)の2つの異なる変異体形態から構成されたキメラタンパク質の使用を報告している。hIL4-PE4EおよびhIL4-PE38QQRと言われる2つのキメラ毒素は、特異的なhIL4R依存性および用量依存性の抗腫瘍活性を示した。
Husainら [Complete regression of established human glioblastoma tumor xenograft by interleukin-4 toxin therapy、Cancer Res 58:3649-53(1998)]は、ヌードマウスにおいて神経膠芽腫フランク腫瘍の標的化処置のためのIL-4 毒素複合体の使用を示す。Kreitman et al. (1998), Accumulation of a recombinant immunotoxin in a tumor in vivo: fewer than 1000 molecules per cell are sufficient for complete responses, Cancer Res 58:968-975もこのモデルの使用を示す。
McDonald ら [The therapeutic potential of chemokine-tozin fusion proteins、I Drugs 4:427-442(2001)]は、SDF-1β-SA1 (野生型SA1)が、2つの別々のマウス異種移植モデルにおいてHT-29 結腸癌腫瘍の増殖を妨害することを報告している。SDF-1β-SA1は、コントロール腫瘍に対して処置した腫瘍において血管横断切片（cross sectioned vessels）がないことから明らかなように、腫瘍内で新規に形成する血管を完全に根絶した。
腫瘍増殖のモデルにおいてLPM複合体の例示的な結果は、実施例9に説明され、これは腫瘍増殖の異種移植モデルにおいてLPM1dを試験する実験の結果を示すものである。その他のLPM、例えば改変SA1に結合したケモカインを含有するあらゆる本明細書で提供されたものも、同様のアッセイにおいて試験することができる。かかる結果は、LPMが癌および血管新生の処置のための候補治療物質として使用できることを示すものである。
j. ヒト免疫不全ウイルス(HIV)および他のウイルス
毒素部分をもつ複合体は、ウイルスに感染した細胞を標的とすることができ、ウイルスには、例えばHIV、肝炎A、Bおよび/またはC、ならびに慢性的に細胞を感染させる他のウイルスを包含するがこれらに限定しない。作用様式は、細胞代謝に対する毒素の作用によるものであり得る。加えて、毒素、例えば志賀毒素、および改変志賀毒素および本明細書で提供された活性断片は、ウイルス核酸を含めたRNAおよびDNAなどのポリヌクレオチドを脱プリン化するポリヌクレオチドアデノシングリコシダーゼである。このように、ウイルスのような感染細胞で発現した受容体を標的とする複合体は、ウイルス感染を処置できる。
例えば、本明細書で提供された複合体を使用して、IV感染細胞を標的とし、ウイルス核酸を破壊および/または該細胞を阻害または殺傷することが出来る。リガンド-毒素複合体、例えば改変SA1を含有するLPM複合体を試験するために使用され得るHIVの動物モデルを提供および使用するいくつかの例示的な文献には、下記文献がふくまれるが、これらに限定するものではない。Westmoreland ら(1998)；サル免疫不全ウイルス脳炎のマカークの脳内常在細胞および炎症細胞でのケモカイン受容体の発現、Am J Pathol 152:659-665は、脳内で浸潤する単球／マクロファージと脳および神経性疾患の間に相関関係があることと、ケモカインおよびケモカイン受容体がHIV脳炎の病因において役割を担っていることを記載し、SIV感染させたHIV脳炎のアカゲザルモデルにおけるその発現パターンを記載している。SIV脳炎を有するマカークザルの脳内における、ケモカインMIP-1α、MIP-1β、RANTES、およびIP-10の発現上昇は証明されており、この研究において対応するケモカイン受容体CCR3、CCR5、CXCR3、およびCXCR4は、これら同じ組織の血管周囲の浸潤物中に発現されることが分かった。さらにCCR3、CCR5およびCXCR4は海馬状隆起神経および新皮質錐体神経の広範な副次集団に検出され、正常および脳炎のどちらの脳内グリア細胞にも検出された。このデータおよび結果は複数ケモカインおよびその受容体が、SIV脳炎において脳へ単球およびリンパ球を補充するのに寄与していることを示す。さらに、公知のHIV/SIV共同受容体のニューロンでの発現は、メカニズムによりHIVまたはSIVが直接これらの細胞に働きかけ、その正常な生理機能を妨害し、AIDSによる認知症の病因に関与しているというメカニズムの可能性を示唆する。
Tyorらの重症複合免疫不全マウスのヒト免疫不全ウイルス脳炎モデル、Proc Natl Acad Sci USA 90:8658-62(1993)は、その治療の開発の一助にHIV関連認知症候群の動物モデルを提供している。異種移植を受け拒絶反応を示さなかった重症複合免疫不全マウス(SCID マウス)に、ヒト末梢血単核細胞およびHIVを大脳接種した。接種から１〜４週間後、これらマウスの脳はヒトマクロファージ（HIV ｐ24抗原陽性のものもある）、偶発的な多核細胞、および免疫細胞化学染色による著しい神経膠症を有していた。ヒトマクロファージはまた、腫瘍壊死因子型αに対してしばしば陽性であり、時にはインターロイキン１およびVLA-4に対しても陽性である。HIVに対するこれらの脳培養物は陽性であった。一般に、ヒトマクロファージは対照マウスの脳内にも顕著な神経膠症にも存在しなかった。HIVは、大脳内にのみHIVを受けたマウスから回収されなかった。病理学的に、SCIDマウスでのこのHIV脳炎モデルは、ヒトのHIV脳炎に類似し、このデータはHIV接種によるマクロファージの活性化により、脳内で蓄積および持続されて神経膠症を発症することを示唆する。このHIV脳炎モデルは、この疾患の病因および処置への洞察を提供するものである。
Toggas ら(1994)、トランスジェニックマウスにおけるHIV-1コートタンパク質gp120の発現による中枢神経系の損傷、Nature 367:188-193は、その脳内にgp120を発現するトランスジェニックマウスを提供し、これらのマウスをヒトに認められるニューロンおよびグリア細胞におけるgp120の役割の研究に用いた。トランスジェニックマウスの脳内に認められた変化はHIV-1感染したヒトの脳内の異常性と類似する。損傷の重篤度はgp120発現の脳レベルと、相互関係を明確に示した。これらの結果は、in vivoにおいて gp120がHIV-1関連神経系の障害において主要な役割を担っているという証明となる。これはHIV脳相互作用にねらいを定めた治療戦略の評価および開発を容易にする。
Wykrzykowskaら(1998)；サル免疫不全ウイルスに感染したアカゲザル胸腺前駆体の初期再生、J Exp Med 187:1767-1778は、AIDSのSIV／マカークモデルを用いて胸腺に対するSIVの初期効果を調査している。
Krucker ら(1998)；ヒト免疫不全ウイルス１型コートタンパク質gp120を大脳に発現しているトランスジェニックマウスはCA1海馬状隆起における短期および長期の増強において分散型の変化を示す, Neuroscience 83:691-700は、ヒト免疫不全ウイルス1型に感染したヒト脳内と異常性が類似する、ニューロンおよびグリア細胞の変化を示す脳の星状細胞から、グリア原繊維酸性タンパク質により駆動されるgp120を構成的に発現するトランスジェニックマウスを研究している。
Power ら(1998);ネコ免疫不全ウイルスに感染した新生のネコにおける神経毒性はウイルス株特異的かつ全身免疫抑制に依存性である、J Virol 72:9109-15は、HIVの動物モデルおよび免疫抑制におけるその役割を示している。ネコ免疫不全ウイルス(FIV)はネコの免疫抑制および神経性疾病の原因となるレンチウイルスである。種々のFIV株が神経性疾患を引き起こす程度を決定するため、FIV V1CSFおよびPetalumaをex vivoおよびin vivoにおいて比較した。両ウイルスをマクロファージに感染させ、そこで複製させ、同等レベルでグリア細胞培養を混合したが、V1CSFは神経毒性アッセイにおいてペタルーマ(Petaluma)よりも著しく多数のニューロン死を誘導した。V1CSF感染動物は、ペタルーマ感染動物および非感染動物と比べて有意な神経発達の遅延を示した。前頭皮質に関する磁器共鳴分光測定研究は、他の群と比較して、V1CSF群中でアスパラギン酸N-アセチル／クレアチンの割合が有意に減少したことを明らかにした。ペタルーマ感染動物へのシクロスポリンA処置は、神経発達の遅延および脳内のアスパラギン酸N-アセチル／クレアチンの割合の減少を引き起こした。非感染群およびペタルーマ感染群と比較して、V1CSF感染群でCD4(+)およびCD8(+)細胞数の減少が認められた。これらの発見は神経発達の遅延およびニューロン傷害はFIV株特異的なものであるが、全身の免疫抑制もまたFIVに誘導される神経毒性の重要な決定要因であることを示す。
他のウイルス感染についてのモデルはよく知られており、他のウイルスについての抗ウイルス活性を確認するために使用できる。
k. 腎臓疾患
本明細書で提供された複合体を腎臓疾患の治療のために使用できる。他腎臓疾患の動物モデルを、リガンド-毒素複合体、例えば改変SA1を含有するLPM複合体を試験するために使用できる。かかる動物モデルには、十分に特徴付けされた様々なヒト慢性腎臓疾患(CKD)に類似するモデルが包含される。抗GBM疾患およびヒト疾患に対するその関連性をふくめたいくつか十分特徴づけられたCKDモデルを参照する例示的文献は、Durvasula and Shankland (Methods Mol Med., 86: 47-66, 2003)である。
例えば、ヒトメサンギウム増殖性糸球体腎炎のモデルとして、ラットにおける抗Thy-1誘導性糸球体腎炎は、十分に説明されてきた(Jefferson and Johnson (1999) J. Nephrol. 12:297-307; Westerhuis et al. (2000) Am. J. Pathol.、156: 303-10参照されたい)。簡潔には、ラットは、糸球体メサンギウム細胞(MGC)と結合し、補体依存性のメサンギウム溶解（mesangiolysis）をもたらす抗胸腺抗体を注射される。メサンギウム溶解は、2日までに終結し、その後MGC増殖および5-7日でピークとなる過形成が続く。従って、MGCは、このモデル自身が溶解するまでアポトーシスをうける。増殖期中に、線維症の早期インジケーターである細胞外のマトリクスタンパク質(ECM)の堆積と関連のあるMGC表現型において変化がある。最初の数分では、白血球の薬剤取り込みと関連のあるケモカインMCP-1を包含する可溶性炎症性メディエーター、最も重要なものとしてはマクロファージの上方調節がある。マクロファージは、反応性窒素および酸素種を産生することにより、初期段階にてメサンギウム溶解に関与すると考えられる。後期段階には、増殖性TGF-β等のサイトカインおよび増殖因子の産生によりMGC増殖およびECM生産に関与すると考えられる。マクロファージの数は、ほぼ2〜4の間でピークとなり、その後徐々に低下する。このモデルにおいてMCP-1の中和は、マクロファージ浸潤、TGF-β生産、およびECMタンパク質の合成を改善することが示された。他の試験において、クロドロネート・リポソームを用いるマクロファージの枯渇により、メサンギウムマトリクス拡張が著しく低減する。
他の腎臓疾患のモデルにおいてのLPM複合体の例示的な結果は、実施例6にて説明されており、ここで抗Thy-1誘導性糸球体腎炎モデルにおいてLPM1dを試験する実験結果を示している。この結果から、LPM1dは、数多くの試験した生理学的パタメーターのなかで腎臓の保護を提供することがわかる。他のLPM、例えば改変SA1に結合したケモカインを含有する本明細書で提供されたあらゆるものもまた、同様のアッセイにおいて試験することが出来る。かかる結果は、LPMを腎臓疾患の治療のための候補治療物として使用できることを示す。
l. 過敏症
リガンド-毒素複合体、例えば改変SA1を含有するLPM複合体を試験するために使用され得る動物過敏性モデルを提供および使用するいくつかの例示的な文献は、本明細書に説明された下記文献を包含するが、これに限定しない。該マウス遅発性過敏症(MDTH)は、接触過敏症の試験を提供するために開発された初めてのものである。T-細胞調節性免疫応答の抑制をスクリーニングするのに適しており、また一般的には慢性炎症性疾患のモデルとして使用される(Staite et al.,(1996) Blood 88: 2973-2979)。
例えば、いくつかのモデルおよび特にオキサザロン(oxazalone)(OXA)誘導性アレルギー性接触皮膚炎マウスモデルにおいては、潜在的抗炎症剤および免疫調節剤(Chapman et al.,(1986) Am. J. Dermatopathol. 130-8)を同定するために使用されてきた。オキサゾランの溶液を直接耳に塗布した場合にオキサゾラン感作マウスは、再現性があり、測定可能な炎症反応を経験する。ハプテン-特異的真皮Tリンパ球(Th1およびTh2 細胞の混合物)およびマクロファージは誘発され、炎症性サイトカインおよびケモカインを放出する。また、その数は少数であるが、好中球活性化および浸潤がある。他のDTHモデル試験は、サイトカインおよびケモカインを放出することによって、好中球が間接的または直接的にT細胞の動員を調節することができることを示した。数時間内に、耳の膨張および白血球は、血管外組織を浸潤させ始める。耳の厚さおよび細胞性浸潤は、24時間でピークとなり、数日にわたりベースラインレベルまで徐々に低下する。該マウスの耳の重量は、白血球の薬剤取り込みおよび滲出液の生産に従い増加する。
過敏性モデルにおいてLPM複合体の例示的結果は実施例7にて説明されており、これは過敏性モデルでLPM1cおよびLPM1dを試験する実験結果を示す。MDTHモデルにおいて耳膨張に関与した大部分の白血球サブタイプは、他のケモカイン受容体の中では、MCP-1を標的とする受容体であるCCR2を発現する。このように、改変dSA1を含有するMCP-1-SA1(LPM1)複合体を選択して、排除のためにこれらの細胞を標的とする。この結果は、MCP-1-SA1(LPM1)変異体LPM1cおよびLPM1dが過敏症の治療に有効であって、LPM1cおよびLPM1dは後記に示したようにその毒性活性に従い異なる有効性をもつことを実証する(例えば、実施例3を参照されたい)。他のLPM、例えば改変SA1に結合したケモカインを含有する本明細書で提供されるあらゆるものもまた、同様のアッセイにて試験され得る。あらゆるLPM複合体を、試験することができ、特に細胞表面受容体、例えば過敏性に関与する１以上の白血球上で発現したあらゆる細胞表面受容体を標的とすることが知られるあらゆるLPM複合体を試験できる。このように、かかる結果は、LPMを過敏症の治療のための候補治療物質として使用できることを示している。
J.毒素およびその複合体を含有する組成物の処方および投与
本明細書では、二次的組織損傷および関連病状を含めた病態生理学的炎症反応と関連する病気、ならびに他の疾患の治療に使用する組成物が提供される。かかる組成物は、本明細書に記載したような、標的化剤（例えば、ケモカインまたはその活性断片およびRIP毒素）を含んでなる治療上有効量のリガンド-毒素複合体を含む。当業者には既知の他の複合体もまた意図され、該毒素部分が本明細書で提供された該毒素に置換されるように改変でき、かかる複合体を含有する組成物もまた意図される。
症状または疾患を治療するための有効な濃度の、本明細書で提供された１以上のリガンド-毒素複合体、例えばLPM等、またはその医薬上許容される誘導体を、全身性、局所または特定の投与のために好適な医薬的用担体またはビヒクルと混合する。化合物には選択された疾患の処置に有効な量が含まれる。組成中の有効化合物の濃度は、有効化合物の吸収、不活化、排出速度、投与計画および投与量ならびに当業者に公知の他の因子による。
複合体の投与および本明細書で提供された方法に好適な医薬用担体またはビヒクルは、特定の投与様式に好適である当業者には既知のかかる担体のいずれもが含まれる。さらに、該化合物は組成中、唯一の医薬上有効な成分として処方してもよいし、あるいは他の有効成分と組み合わせてもよい。
投与される治療剤の正確な量または用量は、特定の複合体、投与経路、およびその他配慮事項に依存する。治療剤は、限定されるものではないが、マイクロスフェア、リポソーム、微粒子、ナノ粒子、およびコロイド状炭素などの徐放性ビヒクルにて投与可能である。典型的には、医薬上有効量は、約0.1ng/mlないし約50-100μg/mlの有効成分の血清濃度となるべきである。該医薬組成物は、選択される複合体にもよるが、典型的には1日につき体重1kgあたり約0.01mgないし約100-2000mgの複合体を1回の投与量とすべきである。典型的には、静脈内または全身処置には約0.05ないし0.5mg/kgの１日用量で十分であろう。局所適用では、1回の投与につき約1ngないし100μg、好ましくは約1μgないし約10μgとすべきである。投与量は、選択される複合体、治療される適応症、および場合により許容できる副作用に相関するものと理解される。用量は各疾患について認められているモデルを用い経験的に決定できる。
有効成分は一度に投与してもよいし、あるいは一定の時間間隔投与される数回のより少量の用量に分割してもよい。正確な用量および治療期間は治療される組織に相関し、公知の試験プロトコールを用いるかまたはin vivoもしくはin vitroの試験データから推定して経験的に決定してもよいことが理解されよう。濃度および用量の数値は治療される個体の年齢に応じても変わることに注意すべきである。さらに、あらゆる特定の患者に対する特定の投与計画は、個々の必要性および投与する者または組成の投与を管理する者の専門的な判断に従って経時的に調節されるべきであり、また本明細書で示される濃度範囲は単に例示的なものであると理解される。
化合物は微粉または他の好適な形態で懸濁させてもよいし、あるいはより可溶性の高い有効生成物を製造するため、またはプロドラッグを製造するために誘導体化してもよい。得られた混合物の形態は、意図する投与様式および選択した担体またはビヒクル中の化合物の溶解度をはじめとする多くの因子に依存する。有効な濃度は標的とされる症状の緩和に十分なものであり、経験的に決定できる。組成物を処方するには、標的とされる症状が軽減または緩和するような有効な濃度で、その重量分率の化合物を、選択されたビヒクルに溶解、懸濁、分散させるか、あるいは混合する。
筋肉内、非経口的または関節内投与などの局所内部への投与には、該化合物は、一般的に等張緩衝生理食塩水などの水性媒質中の溶液または懸濁溶液として処方するか、あるいは生体適合性支持体または、内部投与を意図した生体接着剤を組合せる。
得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルションなど、または他のかかる混合物であってもよく、また水性混合物、クリーム、ゲル、軟膏、エマルション、水溶液、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、泡沫、エアロゾル、灌注、噴霧、坐剤、包帯、または全身、局所または特定部位投与に好適な他の剤型として処方することもできる。
本明細書で提供される化合物の投与に好適な医薬および美容用担体またはビヒクルは、特定の投与様式に適した当業者に公知のいずれの担体も含む。さらに、該化合物は組成中唯一の医薬上有効な成分として処方されてもよいし、あるいは他の有効成分と組み合わせてもよい。有効化合物は、治療する個体に重大な有毒作用を起こさずに治療上有用な効果を発揮するに十分な量で担体中に含まれる。有効な濃度は、本明細書に記載した動物モデルをはじめ、in vitroおよびin vivo系を用いて化合物を試験することにより経験的に決定すればよい。
局部適用に使用する水溶液または懸濁液には以下の成分：注射水、生理食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールおよびメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物；エチレンヂアミン四酢酸[EDTA]などのキレート剤; アセテート、クエン酸およびリン酸などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調節剤のいずれかが含まれてよい。液体製剤はアンプル、使い捨てのシリンジ、または、ガラス、プラスチックもしくは他の好適な材料でできている複数用量のバイアルに封入してもよい。好適な担体としては生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水[PBS]を含んでよく、懸濁液および水溶液としてはグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールおよびその混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有してよい。リポソーム懸濁液も医薬上許容される担体として好適であり得る。これらは当業者に公知の方法に従って製造すればよい。
この方法を用いる治療薬は、限定されるものではないが、例えばこれに限定されるものではないが、局所、関節内、大槽内（intracisternally）、眼球内、脳室内、髄腔内、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮内、気管内、ならびにその２以上の組み合わせによるなど当業者に公知の経路のいずれかで投与できる。
投与に最も適した経路は治療される疾患、例えば炎症症状の場所によって変わる。投与様式としては、限定されるものではないが、局所、特定部位、関節内、大槽内、眼球内、脳室内、髄腔内、静脈内、筋肉内、気管内、腹膜内、皮内、定位的（sterotactically）およびその２以上の組み合わせによるものが挙げられる。例えば、SCIおよび他のCNS炎症状態の治療には、CNS液または脳内への投与（例えば髄腔内、静脈内、または大槽内）をはじめとする局所投与は、治療薬の全身投与に伴う合併症の危険もなく治療薬を高濃度で投与し得るという利点がある。あるいは、投与は、脳内への（例えば、腫瘍の治療の際に）定位接種によってもよい。同様に、炎症性関節疾患の治療には、炎症を起こした関節へ治療薬を注射（即ち、関節内、静脈内または皮下手段により）することによる局所投与を用いることが出来る。別の例として、炎症性の皮膚症状に関連する病状には、例えば、クリーム、ゲル、または軟膏として処方された治療薬の局所投与による治療が有利であり得る。炎症性肺症状に関連する疾患の治療には、治療薬をエアロゾルで吸入する、または気管内投与する経路が好ましい。
従って、該複合体は、液体、半液体または固形形態で、例えば経口、非経口(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内に、皮下注射または点滴またはインプラントを介して)、経鼻、または経肺、経膣、直腸、舌下または局所経路のいずれの適当な経路によっても投与可能で、また各投与経路に好適な方法で処方される。好ましい投与方法は、処置される適応症に依存する。皮膚科学的または眼科学的適応症は、典型的には局所的に治療されるが、腫瘍およびSCIおよび他のかかる疾患の典型的な投与様式は全身的、皮内、筋肉内、定位、または他の投与様式となろう。注射による投与(例えば、静脈内または皮膚下手段を用いて)でもよく、除放または指定時間投与(例えば、徐放装置またはミニポンプ、例えば浸透圧ポンプまたは皮膚パッチを用いる)のための持続注入でもよい。
治療薬は有効な量が投与される。治療に用いる有効量は当然、投与経路と同じく疾患の重篤度および患者の体重や全身状態による。治療薬の局所濃度では、ある場合には、全身投与において安全性をもって達し得るよりも次の局所投与の方が高濃度であるとはいえ、通常、治療薬の局所投与は典型的にはいずれの全身投与様式よりも少ない用量を要する。
個々の患者は症状の重篤度において広範な変動を呈し、各治療薬は独特の治療特性をもつため、治療に対する患者の応答を決定し、それに従って用量を変えるのは施術者の役割である。In vitroで用いる用量は医薬組成のin situでの投与に有用な量への有効な指標を示すことができるであろうし、動物モデルはいくつかの場合において特定の疾患の治療に有効な用量を決定するのに用いられる。しかし一般に、局所投与に関しては治療薬の有効量は体重1kgあたり約0.1ピコグラム(pg)ないし約1ngの範囲内であろうと考えられている。有効な量に到達させる際の様々な考察が、例えば、GoodmanおよびGilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics、8th ed.、Pergamon Press、1990;およびRemington's Pharmaceutical Sciences、17th ed.、Mack Publishing Co.、Easton、Pa., 1990;およびニューロン特異的リガンド-毒素の髄腔内注射を含むManthy et al., (Science, 278:275-79, 1997)の研究などに記載されている。
本明細書で提供される該組成物および方法の１つの具体例では、徐放性送達ビヒクル中の該治療薬は、例えばコロイド分散系中またはポリマー安定化結晶中に封入され、局所投与される。有用なコロイド分散系としては、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質基剤系が挙げられる。コロイド系で現在好ましいのは、リポソームまたはマイクロスフェアである。リポソームは人工膜小胞であり、注射または移植の際に徐放性送達ビヒクルとして有用である。脂質−ポリマー複合体およびリポソームのいくつかの実施例が、米国特許第5,631,018号に開示されており、出典明示して本明細書の一部とする。徐放性送達ビヒクルの他の例としては、生分解性のヒドロゲルマトリックス(米国特許第5,041,292号)、樹状ポリマー複合体(米国特許第5,714,166号)および多小胞体リポソーム(Depofoam（登録商標）、Depotech、San Diego、CA) (米国特許第5,723,147号および第5,766,627号) が挙げられる。局所注射(例えば、皮下組織)のための治療用薬剤の封入に好適なマイクロスフェアの１つとして、D. Fletcher (1997) Anesth. Analg. 84:90-94に記載の、ポリ(D,L)ラクチドマイクロスフェアがある。
外傷部位に効果的な治療用量を送達し、全身性毒性の頻度を低下させる他、局所投与はまたタンパク質分解ならびに抗原性および免疫原性応答を介する免疫学的介入のような分解過程に対する治療薬の曝露を少なくする。例えば、モノメトキシポリ(エチレングリコール)を用いる薬剤誘導体化も前記の欠点の可能性を小さくさせ得る。治療薬のペグ化は、タンパク質分解耐性を増大させ；血漿中での半減期を延長させ、抗原性および免疫原性を低下させることが報告されている。ペグ化方法の例示は、LuおよびFelix (1994) Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138; LuおよびFelix (1993) Peptide Res.、6:142-6; Felix et al.(1995) Int. J. Peptide Res., 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem.、269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol.、154:3088-95 に記載されている。
本明細書で提供される組成物は、限定されるものではないが、不活性担体またはコロイド分散系のような送達を促進する１以上のアジュバントをさらに含む。水、イソプロピルアルコール、ガス状フルオロカーボン、エチルアルコール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ゲル生成材料、ステアリルアルコール、ステアリン酸、鯨ろう、モノオレイン酸ソルビタン、メチルセルロース、ならびにこれらのうち２以上の好適な組み合わせから選択できる。
本明細書で提供される組成物はまた、好適な分散剤、湿潤剤または懸濁剤を用いて公知の方法に従って無菌注射懸濁液として処方できる。この無菌注射製剤はまた、例えば1-4,ブタンジオール溶液のような無毒の非経口投与が許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液または懸濁液であってよい。無菌の不揮発性油は、通常、溶媒または懸濁媒質として使用される。この目的のためにいずれの無菌不揮発性油を用いてもよく、限定されるものではないが、合成モノ−もしくはジグリセリド、脂肪酸(オレイン酸を含む)、ゴマ油、ココナツ油、ピーナッツ油、綿実油などの天然植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂質ビヒクルが挙げられる。バッファー、保存剤、抗酸化剤、および好適な成分を、必要であれは含むことができ、あるいは組成物としても処方できる。
一般的に、経口投与用組成物には一般に、不活性希釈剤または可食担体が含まれ、また打錠してもよいし、またはゼラチンカプセルに封入してもよい。治療用経口投与のために、有効化合物または化合物群は賦形剤を配合し、錠剤、カプセル剤またはトローチ剤の形態で使用してよい。治療用経口投与のために、有効化合物または化合物群は賦形剤を配合し、錠剤、カプセル剤またはトローチ剤の形態で使用してよい。医薬上許容される結合剤およびアジュバント物質を組成物の一部として含んでもよい。
錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは以下のいずれの成分、または類似の特性を有する化合物を含んでよい：微晶質セルロース、トラガントゴムおよびゼラチンなどの結合剤; デンプンおよびラクトースなどの賦形剤、限定されるものではないが、アルギニン酸およびトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；限定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；限定されるものではないが、コロイド状二酸化シリコンなどのグリダント(glidant)；ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、および果実フレーバーなどの香味剤。
投与単位形がカプセルである場合、前記の種類の物質に加えて脂肪油などの液性担体を含んでもよい。さらに、投与単位形は例えば、糖および他の腸溶剤被覆など該投薬用量の物理形態を改変する種々の他の物質を含むことができる。該複合体はまた、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ、チューインガムなどの成分として投与できる。シロップ剤は、有効化合物に加えてショ糖などの甘味剤、およびある種の保存剤、色素、着色剤および香味剤を含有してもよい。
該有効物質はまた、所望の作用を損なうことのない他の有効物質、または腫瘍治療のためのシスプラチンなどの所望の作用を補う物質と混合することができる。
最後に、該化合物は包装材料、包装材料中の、本明細書で提供される１以上の複合体または組成物、該複合体が適用される適応症を指示するラベルを含む製品として包装してもよい。
K. 毒素またはその複合体を用いる疾患および障害の治療方法
本明細書で提供されるものは、疾患または障害の治療のために、改変SA1などの改変RIP部分を含有するものをはじめとする１以上の本明細書で提供されるリガンド-毒素複合体のいずれかを用いる方法であり、このためにリガンド-毒素複合体を設計して標的化する。標的化受容体発現細胞への複合体の受容体-特異的標的化により、本明細書で提供される組成物および方法は、外傷または疾患に対する応答を指揮する細胞に治療薬を選択的、計画的および非正規に(surreptitipus)送達する。免疫調節、炎症性疾患およびその他の外傷の病態生理学プロセスに関与する細胞に複合体を標的化することにより、受容体により媒介される該複合体の内在化が可能となり、これにより毒素媒介細胞毒性および病理学的細胞成分の排除を促進させることができる。
このように、本明細書で提供されるものは、炎症性または免疫性疾患および症状を処置するために複合体を使用する方法である。かかる疾患または症状を処置するためにかかる複合体の使用を評価するためには、かかる疾患の悪化への、免疫系および病理学的細胞の感応についての理解が、現行の候補治療物質の制限についての議論する場合に必要とされる。下記の議論は、例に挙げた疾患の処置において、リガンド-毒素複合体、例えば改変毒素を含有する複合体の選択および使用に関する議論について、序文のような背景知識を提供する。
1.免疫性宿主防御系および炎症
免疫系は、インタクトな免疫学的監視および宿主防御系を共に付与する先天性および後天性免疫に分けられる。該系には、いくつかの白血球の異種集団が包含され、これには単球またはマクロファージ[単核食細胞(MNP)、好中球(多形核球好中球、PMN)、T細胞、B細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー(NK)細胞、樹状細胞(DC)および肥満細胞(MaC)とまとめて呼ばれる]を含むが、これらに限定するものではない。先天的免疫系は、病原菌などの侵入成分に対して即時反応性の細胞に依存しており、MNP、樹状細胞、好中球およびNK細胞を包含する。後天的免疫は、宿主侵入物を特異的に標的化するように、抗原提示細胞、基本的には樹状細胞による活性化を獲得するTおよびB細胞が関与する。胚形成、血管新生、リンパ球トラフィキング、創傷治癒、組織修復、細胞破片の除去および他の望ましくない物質、例えば細菌、ウイルスまたは癌細胞クローンをはじめとする多くの臓器特異的プロセスにおける恒常性バランスを維持するために、先天的および後天的免疫応答細胞は、組織固有細胞(TRC;例えば、上皮細胞)と協同して働く(例えば、Esche et al., J. Invest. Dermatol., 125: 615-28, 2005; Chaturvedi et al., Indian J. Med. Res., 124: 23-40, 2006; Bunde, J. Exp. Med. 201: 1031-6, 2005; Krishnaswamy et al., Methods Mol. Biol. 315: 13-34, 2005; Martin and Leibovich, Trends Cell Biol., 15: 599-607, 2005; Kim, Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord., 4: 343-61, 2004; Moser and Willimann, Ann. Rheum. Dis. 63(suppl 2): 84-9, 2004; Hoebe et al., Nat. Immunol., 5: 971-4, 2004; Schaerli et al., J. Exp. Med., 199: 1265-75, 2004; Olson and Miller, J. Immunol. 173: 3916-24, 2004; Middleton et al., Blood, 100: 3853-60, 2002; Beyer et al., Glia 31: 262-66, 2000)。
a. 恒常性炎症
恒常性炎症は、ケモカイン-メッセージング系の中心的役割により白血球系統の活性化されたTRCおよび活性化された細胞により、組織化され、伝搬される多因子の生化学的過程である。損傷細胞および死滅細胞から放出された可溶性ファクター、免疫性複合体またはバクテリアリポ多糖(LPS)様抗原を担持する複合体ならびに補体やトル様受容体系を介して働くウイルスエンベロープタンパク質は、白血球活性化および動員の一般的なトリガーである。応答において、白血球は、他の白血球群のトラフィッキングおよび情報伝達のために、細胞付着分子(CAM)および炎症性サイトカインおよびケモカインの上方調節をはじめとする広範囲の表現型の変更を受ける。一旦、浸潤部位で白血球は細胞毒性メディエーターという武器を生成する。例えば、反応性酸素および窒素種、タンパク質分解酵素およびエイコサノイドは、マクロファージおよびPMNにより主に貪食される細菌および真菌の侵入を全滅させる。創傷部位では、例えば血管内皮増殖因子(VEGF)および線維芽細胞GF(FGF)をはじめとする白血球(特に、マクロファージ)誘導性増殖因子(GF)等が血管新生を促進させる。繊維化誘導因子、例えば形質転換増殖因子-βであるTGF-βは、瘢痕化および創傷治癒を促進させる(Krishnaswamy et al. (2005) Methods Mol. Biol. 315: 13-34; Puneet et al. (2005) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288: L3-15; Taylor et al. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 901-44; Byrne et al. (2005) J. Cell Mol. Med. 9: 777-94; Carroll (2004) Nat. Immunol. 5: 981-6; Iwasaki and Medzhitov (2004) Nat. Immunol. 5: 987-95; Martin and Leibovich (2005) Trends Cell Biol. 15: 599-607; Liu and Pope (2004) Rheum. Dis. Clin. North. Am., 30: 19-39; Stark et al. (2005) Immunity, 22: 285-94; Gordon (2003) Nat. Rev. Immunol., 3: 23-5; Borish and Steinke (2003) J.Allergy Clin. Immunol., 111: S460-75; Cross and Claesson-Welsh (2001) Trends Pharmacol. Sci., 22, 201-7; Trautmann, et al. (2000) J. Pathol., 190: 100-6)。一般的に、活性化された白血球により生成したかかる免疫メディエーターは、保護的であるが、特定の病理学的状況では有害となり、疾患を長期化させる。
b. 病理学的炎症
望ましくない外因性物質(例えば、細菌)または内因性物質(例えば、癌細胞クローン)の実体を取り除くために；細胞断片を除去し、組織および創傷治癒に参画するように、組織損傷または外傷部位で蓄積する免疫性防御細胞により炎症反応が媒介される。不幸にも、これらのレパレートリー(炎症性)プロセスに関わる分子メカニズムは、二次組織損傷を開始させ、病原および多くの炎症性疾患の根強い病理の一因となる。二次組織損傷に関与する分子メカニズムおよび細胞および化学伝達物質は、ヒトの大部分の炎症性疾患においては、同一でなければ類似している。例えば、これらに限定しないが、ウイルス、細菌、寄生生物、炎症性サイトカイン、ケモカイン、低酸素、虚血、タンパク尿(尿中のタンパク)、糖化最終産物(AGE)、自己抗体、体系的ヌクレオチド（systemic nucleotides）、補体、免疫性複合体、免疫グロブリンおよび環境汚染物質（例えば、タバコの煙）をはじめとする非常に多くの刺激因子の活性化により誘導される病理状態では、これらに限定しないがCNSのグリア細胞、腎臓のメサンギウム細胞(MC)、および多くの臓器の内皮細胞をはじめとする多様な白血球およびTRCを含めた細胞の活性化をもたらし得る。該刺激因子は、疾患の開始因子であるが、TRCおよび炎症性白血球は疾患病理の兵士である。活性化したTRCおよび常在白血球は、炎症部位で白血球活性化、浸潤および増殖を促進する特にサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子スーパーファミリーのメンバー等のものを発現および分泌する。任意の所定組織のTRCにより放出されたこの特定のケモカインおよび他の炎症性分子は、任意の所定疾患または外傷において特定の白血球浸潤物を規定する(Lindemans et al. (2006) Clin. Exp. Immunol., 144:409-17; Puneet et al. (2005) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288: L3-15; Boyle, J.J. (2005) Curr. Vasc. Pharmacol. 3: 63-8; Liu and Pope (2004) Rheum. Dis. Clin. North. Am., 30: 19-39; Tetley (2002) Chest 121: 156S-159S; de Leeuw et al. (2005) Ann. N. Y. Acad. Sci. 1051: 362-71; Drinda, et al. (2005) Rheumatol. Int. 25: 411-3; Raivich and Banati (2004) Brain Res. Brain Res. Rev., 46: 261-81; Tokarska-Rodak et al. (2004) Ann. Agric. Environ. Med. 11: 227-31; Hou et al. (2004) J. Am. Soc. Nephrol., 15: 1889-96; Hayashida et al. (2001) Arthritis Res. 3: 118-26; Garcia-Ramallo et al., (2002) J. Immunol. 169: 6467-73; Kim et al. (2002) Blood 100: 11-6; Perez de Lema (2001) J. Am. Soc. Nephrol., 12:1369-82; Barnes et al., Eur. Respir. J., 22: 672-88, 2003; Luster et al., Nat. Immunol., 6: 1182-90, 2005; Charo and Ransohoff, N. Eng. J. Med., 354: 610-21, 2006 )。
まさに、病理学的炎症に用いた炎症性メディエーター、例えばサイトカイン、ケモカインおよび関連受容体は、目的とする組織または器官や傷害または疾患段階に関与した的確な白血球サブタイプに依存する。さらに、炎症性メディエーターの放出は、長期化する病理学的サイクルをもたらしうる。例えば、サイトカインおよびケモカインは、それ自身の産生を存続させて、白血球からオートクリンやパラクリンメカニズムにより放出される。また、それらは、それらが標的とする細胞から、細胞毒性化合物の合成および放出を誘導する。神経毒素、常在白血球および浸潤白血球放出に加えて、同分子を、組織損傷を媒介するために恒常性の目的のために使用した。サイトカインおよびケモカインは、白血球、内皮、グリアおよび癌細胞をはじめとする様々な細胞型上で細胞付着分子(CAM)および細胞表面抗原(サイトカインおよびケモカイン受容体を包含する)の発現を誘導する。CAMおよびグリコサミノグリカン(GAG)は、恒常的環境においてだけでなく、癌転移をはじめとする病理学的炎症状態においても、細胞のトラフィキング(または遊走)のために重要である。細胞表面抗原の上方調節は、炎症性メディエーターのさらなる産生に寄与する細胞活性化に関与する。加えて、炎症因子の微小環境の組成物は、様々なT細胞の表現型に影響する。例えば、好中球は、CXC受容体を発現することが知られるが、感染性急性肺傷害および再灌流傷害のような特定の場合には、好中球はCCR2をはじめとするCC受容体を発現する。
白血球の相対的な疾患-特異的サブタイプに関する過度の浸潤、(慢性)活性化および増殖(増加数)は、様々な異なる慢性症状、疾患および外傷(例えば、表6；表7を参照されたい)に関する広範な免疫病理の基礎となることが断定的に示されてきた。組織-特異的変動は、基本的には主役を占める異なる白血球サブグループの問題であり、例えばCNS炎症の初期段階での小膠細胞；肺のアレルギー性炎症における好酸球、Th2細胞および肥満細胞(MaC)；および慢性腎臓疾患(CKD)でのマクロファージ、Th1細胞およびMaCsである。加えて、白血球誘導性可溶性メディエーター、例えば血小板から得られる増殖因子(PDGF)および形質転換増殖因子-β(TGF-β)は、他の病理学プロセス、例えば血管新生および線維症の各々のレギュレーターである。高い白血球細胞数を有する閉経後の女性が、低い白血球細胞数を持つ閉経後の女性よりも心臓発作、脳卒中および死亡のリスクが40-50%高いことを示す最近の試験から、疾患/慢性炎症過程において白血球の絶対数の重要性が強調されている(Cushman、Arch. Intern. Med. 165: 487-8、2005; Margolis、et al.、Arch. Intern. Med. 165: 500-8、2005)。肺胞マクロファージは、慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者の病原論における役割をになう。COPD患者は、コントロールと比較して、気道、肺柔細胞、気管支肺胞洗浄液および唾液中のMNP数が10倍まで増加する。同様に、気腫患者は、組織および肺胞空間中のMNP数において25倍の増加を示した(Tetley、Chest 121:156S-159S、2002)。養子免疫伝達試験では、糸球体マクロファージの増加数が、マクロファージ誘導性タンパク質尿(腎臓傷害のマーカー)、糸球体細胞増殖および過形成と相関性したことを示した。さらに、白血球サブタイプ数と多数の疾患の重症度および進行との間に相関関係がある(例えば、Ikezumi、et al.、Kidney Int.、63: 83-95、2003; Brightling et al.、N. Engl. J. Med. 346: 1699-705、2002; Panzer et al.、Transplantation 78: 1341-50、2004)。表8は、多様な疾患および障害病理において様々な白血球の役割をサポートする文献を下記に示すものである。表9は、多数の疾患病理に関与する例示的な白血球集団および他の免疫細胞または組織常在T細胞を記載する。
表 8: 疾患の病理学における白血球
Figure 2011050388
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表9: ヒト疾患における例示的白血球細胞タイプ
Figure 2011050388
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注：B=B細胞；T=T細胞;NK=ナチュラルキラー細胞；Th2=タイプ 2 ヘルパーT 細胞； DC=樹状細胞; MNP=単核（貪）食細胞(単球、マクロファージおよび小膠細胞); GC=巨細胞(多核化融合マクロファージ)；TAM=腫瘍関連マクロファージ; PMN=多形核好中球;MaC=肥満細胞。
2. 候補治療物質
病理学的白血球および癌細胞活性などをはじめとする細胞活性の妨害を目的としたいくつかの方法があり、また調査されている。これらの多くの薬剤により生じるよくある問題は、特異性の欠如である。例えば、コルチコステロイド、シクロホスファミドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤は、炎症性疾患を処置するために使用されてきた。しかし、これら薬剤の非特異的免疫抑制効果にはいくつかの欠点がある。最初に、宿主防御に障害がおこり、生命を脅かす感染が生じ、免疫学的監視を欠くため悪性腫瘍の高い罹患率を引き起こす。第二に、直接的な器官毒性および代謝プロセスに関する崩壊が一般的におこる (例えば、Ingelfinger and Schwartz、N. Engl. J. Med. 353: 836-9、2005; Siegal and Sands、Ailment Pharmacol. Ther.、22: 1-16、2005; Duncan and Wilkes、Proc. Am. Thorac. Soc.、2: 449-55、2005; Perez-Simon et al.、Drugs 66:1041-57、2006)。他の方法も、特異性を増加させて、薬物の副作用を低下させるために用いられている。例えば、サイトカインおよびケモカイン受容体アンタゴニスト;サイトカインおよびケモカイン抗リガンド抗体;抗細胞付着分子(CAM)、抗GAG物質および細胞内シグナル伝達経路を干渉する分子をはじめとする、生物学的応答調節因子(BRM)が開発されてきた(例えば、Johnson et al. (2004) Biochem. Soc. Trans.、32: 366-77; Johnson et al. (2004) J. Immunol.,173: 5776-85; Eis et al. (2004) Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 52:164-72; McDonald et al. (2001) IDrugs.、4: 427-42; Ribeiro and Horuk (2005) Pharmacol. Ther. 107: 44-58; Wong (2005) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 264-71; de Boer (2005) Drug Discov. Today 10: 93 105; Haringman and Tak (2004) Arthritis Res. Ther.、6:93-7; Barber et al. (2005) Nat Med 11: 933-5; Camps et al. (2005) Nat Med 11: 936-43; Schon et al. (2003) J Invest Dermatol.、121: 951-962)。
しかし、BRMは、恒常性および炎症性免疫応答において用いた様々なネットワークおよびカスケードについて代償性、多面的および不均質な性質のために疾患治療において制限をもつ。このように、疾患の処置におけるBRMの使用を制限する理由の一つは、疾患に関与する細胞性受容体および可溶性メディエーター内での機能重複性（redundancy）をはじめとする細胞のシグナル伝達機構に関する機能重複性およびクロストークである。例えば、炎症に関与するメディエーターにおいて、例えばサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子系のメンバーにおいて非常に多くの機能重複性がある。
典型的には、免疫細胞は、可溶性リガンドメディエーターに対していくつかの受容体を発現でき、各受容体は1以上の可溶性リガンドに応答できる。例えば、ケモカインMIP-1α、RANTESおよびLECは、CCR5だけでなく、CCR1;CCR1およびCCR3;およびCCR1およびCCR2各々にも結合する(表5を参照されたい)。こうして、CCR5に対するアンタゴニストは、MIP-1α、RANTESおよびLECが、CCR1、CCR2、および/またはCCR3への結合を妨害せずに、炎症効果を発揮し続ける(例えば、Matsui et al.、(2002) J. Neuroimmunol. 128: 16-22を参照されたい)。別の例においては、その他のケモカインもまたMCP-3、MCP-2、MCP-5、MCP-4およびLECなどをはじめとするCCR2を使用し、そしてマクロファージがCCR2以外のその他のケモカイン受容体を発現するので(例えば、表5を参照されたい)、疾患においてCCR2を介してマクロファージ浸潤を減少させるためのケモカインMCP-1の阻害は最適な治療ではない。例えば、Fujinaka ら(J. Am. Soc. Nephrol.、8: 1174-8 (1997))は、MCP-1に対する中和化抗体が、4日目に患者を処置した場合に単球およびマクロファージの数および糸球体中のタンパク質尿を低下させたことを示した。しかし、8日後の抗MCP-1治療は、細胞浸潤、尿タンパク質排泄またはクレセント形成を低下させなかった。即ち、この系において、マクロファージは、MCP-1によるだけでなく、糸球体傷害に関与した他の因子によっても活性化された。例えば、他のCCR2リガンドとは別に、マクロファージはCCR1、CCR3、CCR5およびCCR8も発現し、またある場合においてはCXCR1および2をも発現しており、これらのうちの幾つかまたは全ては該病理に関連する因子である可能性がある。また、抗MCP-1治療は、関節炎試験中の臨床または免疫組織学的改善に対して効果を示さないことがわかった(例えば、Haringman et al.、(2006) Arthritis Rheum.、54:2387-92)。
このため、大部分の候補治療物質は、全てというわけではないが白血球により放出または活性化された生化学的伝達物質の一つを標的とするか、または一つの細胞タイプが所定の疾患にのみ関与し得るという間違った前提により特定の白血球サブタイプを死滅させる、これはもしそのケースがあったとして稀である。疾患、障害または外傷を処置するためのより包括的方法は、該疾患の病理と関連のある細胞成分、例えば病理学的白血球を含む白血球および/またはTRCを排除することである。白血球の数や活性増加および疾患の重症度および測定した病理学的パタメーターの間に相関関係がある[例えば、Wada et al. (1996); Zoja et al.(1996);およびChiang et al. (1996; Nikolic-Paterson and Atkins、Nephrol Dial Transplant.、16 (Suppl 5): 3-7、2001を参照されたい]。病理学的白血球、例えば活性化された白血球の排除は、炎症性メディエーターおよび毒性分子の産生を消滅させて、多くの疾患の悪化に関与し得る白血球のトラフィッキングを低下させる。かかる候補治療物質の例としては、リガンド-毒素複合体、特に活性化された白血球を標的とするケモカイン-受容体標的化複合体である。よって、かかる複合体は、炎症成分または根本的な炎症性病理を共有している成分による疾患についての候補治療物質である。
3.リガンド-毒素複合体
リガンド-毒素複合体は生成されており、疾患の病理に関与する１以上のある細胞集団を特異的に標的とすることが知られている。これらのなかに含まれるものは、ケモカイン毒素複合体であり、例えば米国出願番号09/360,242；09/453,851;および09/792,793、現米国特許第7,166,702、7,157,418および7,192,736に記載されている。かかる複合体は、1つ、および通常は1以上の細胞タイプを、1以上のある特異的な細胞表面受容体による認識により標的とし、内在化して、この毒素部分によりその細胞を殺傷する。かかる毒素複合体を用いた場合に、病理学的白血球をはじめとする白血球および他の細胞の特異的かつ慎重な消滅が、疾患の処置に有効となり得ることが示されている(例えば、McCarron et al. (2005)、Mol. Interv.、5: 368-80; Pastan et al. (2006)、Nat. Rev. Cancer 6: 559-65; Frankel et al. (2003)、Semin. Oncol.、30: 545-57; Pastan (2003)、Immunol. Ther. 52: 338-41; Kreitman、(2006) AAPS. J.、8: E532-51; Carter (2006)、Nat. Rev. Immunol.、6: 343-57; Cohen (2005) MedGenMed.、7: 72; Edwards et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350: 2572-81; Zeisberger et al. (2006) Br. J Cancer、95: 272-81; Cross et al.、J. Neuroimmunol. Aug 10、2006、(published online); Cailhier et al. (2005)、J. Immunol.、174: 2336-42; van Roon et al. (2005) Ann. Rheum. Dis. 64: 865-70; Sfikakis et al. (2005) Arthritis Rheum.、52: 501-13; Nikolic-Patersonおよび Atkins (2001) Nephrol. Dial. Transplant.、16: Suppl 5、3-7; Rajan et al. (1998)、J. Immunol. 160: 5955-62; Hu et al. (1997) Cell Immunol.、177: 26-34; Schuh et al. (2003) Eur. J. Immunol.、33: 3080-90; Taoka et al. (1997)、Neuroscience 79: 1177-82; Wolff et al.、(2004) J. Vasc. Surg.、39: 878-88; Duffield et al.、Am. J. Pathol.、167: 1207-19、2005)。
本明細書で提供されるものは、改変RIP毒素ポリペプチドを含有するリガンド-毒素複合体である。複合体は、多様な疾患および障害を処置するために使用でき、このために非改変RIP毒素を含有する複合体が設計される。上記議論したように、これら改変リガンド-毒素複合体は、宿主細胞に対して弱毒性を示し、これにより該毒素の高収率の産生を可能とする。かかる改変リガンド-毒素複合体の高い産生は、候補治療物質として、また標的とする疾患および障害の処置のための治療物質としてのその使用に有利である。改変SA1を含有する複合体をふくめた改変リガンド-毒素複合体は、細胞を排除するために使用されてもよく、またその増殖を阻害するために使用されてもよく、またはその代謝を変化させるために使用されてもよい。標的とする細胞は、疾患または障害の病理に関与するものであって、例えば炎症、血管新生または癌に関与する細胞である。
改変毒素を含有する複合体のなかには、ケモカインリガンド-毒素複合体があり、白血球集団モジュレーター(LPM)とよばれる。下記に記載したとおり、LPMは、これらの細胞上で発現した高度に調節されるケモカイン受容体の活用を通じて、活性化された病理学的(炎症性)白血球およびその他の細胞を排除またはその代謝を変更させることを意図している。LPMのリガンド部分は、関連したケモカイン受容体の発現により細胞中への侵入を可能にする役割がある。適切なケモカイン受容体を発現する細胞は、例えばウイルス核酸を分解するかまたはタンパク質合成を妨害すること等により、細胞の増殖を阻害し、細胞を殺傷するか、またはその代謝を変更させる毒素を含んでいるLPM分子を取り込む。病理学的細胞が、除去、阻害または殺傷されると、疾患プロセスおよび炎症性メディエーターに関与するような細胞間のコミュニケーションが徐々に少なくなり、もはや合成されなくなる。こうして、炎症の様々なプロセスまたは他の疾患プロセス(標的化細胞が内皮細胞、例えばVEGFRを発現する細胞である場合には血管新生)に関与する複数の刺激がこれに随伴して活動が終了する。
本明細書で提供された方法により、複合体中で使用するために製造されるかまたは複合体として製造される宿主細胞に対して毒性が少ない改変毒素（例えば、RIP）またはかかる毒素を含有する複合体の生成および単離が可能である。このため、より高い量を製造できる。該毒素が非常に強力であるため、10倍、100倍、さらに1000倍以上低い毒性は、治療用複合体中でのその使用に対して影響を与えない。当業者には既知のまたは当業者により製造される毒素（特に、RIP毒素）を含有するあらゆる複合体は、本明細書の方法によるか、または本明細書で提供された改変毒素により毒素を置換することにより改変され得る。多くのかかる複合体が知られる。これらのものには、米国特許第7,166,702、7,157,418および7,192,736に記載したもの、ならびにサイトカイン複合体、例えば増殖因子および抗体および他のポリペプチド標的化剤の複合体を包含する。
リガンド-毒素複合体のなかには、直接的または間接的に、本明細書に記載したようなSA1の切断型形態、例えば変異体1または変異体2SA1に結合されるリガンド、例えばケモカインまたはその活性断片を有するものが含まれる。かかる複合体の例示は、LPM1aおよびLPM1bであって、各々配列番号：38および40に示す。特に、ケモカインリガンドの改変SA1への結合を含有する複合体は、本明細書の方法で同定したあらゆる改変SA1、例えば突然変異体1 SA1 (即ち、変異体3)または突然変異体2 (即ち、変異体4)SA1部分、または低い毒性を提示することが知られるかまたは見出されたその他の改変d SA1等を包含するが、これらに限定するものではない。本明細書中の処置方法において使用のためのこのようなLPMの例示は、配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64または66のいずれかに示すLPM複合体のいずれかのものである。
任意の細胞または複数細胞は、複数細胞がリガンド-毒素複合体と相互作用する１以上の細胞表面受容体を発現する限り、本明細書で提供されたリガンド-複合体により標的化され得、これにより該複合体の内在化をもたらし得る。例えば、1つまたは複数のケモカイン受容体を発現する任意のかかる細胞は、改変毒素にケモカイン受容体標的化剤を結合することにより標的化され得る。例示的な複合体は本明細書で提供され、また本明細書で提供された１以上のLPM分子のいずれかを包含する。標的化細胞に包含されるものは、白血球または他の免疫細胞であって、特に活性化された白血球および免疫細胞、例えば単球、マクロファージ(肺胞マクロファージ、小膠細胞、クッパー細胞を包含する)、樹状細胞(未熟または成熟樹状細胞およびランゲルハンス細胞を包含する)、T細胞(例えば、これに限定しないがTh1および/またはTh2細胞等をふくめたCD4陽性またはCD8陽性細胞)、B細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞および好中球が挙げられるが、これらに限定するものではない。また、あらゆる組織固有細胞(TRC)、例えばメサンギウム細胞、グリア細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、星状細胞、および/または滑膜細胞を包含する。細胞上でケモカイン受容体の発現は、構成的または誘導性であってもよく、例えば細胞の活性化を理由としてもよい。通常、休止白血球または他の機能に関わる白血球は、LPMの標的、例えば本明細書で提供されたものではない(McDonald et al、IDrugs、4: 427-42、2001)。一般的には、該LPMは、誘導可能なケモカイン、例えば病気となり、様々な疾患または障害の徴候を悪化させ得る炎症または他の症状を理由とする活性化細胞で上方調節されるそのようなケモカインに特異的である。こうして、活性化された白血球または標的ケモカイン受容体を担持する他の活性化TRCのみを枯渇させる。
例えば、多くの症例においては、疾患プロセス(例えば、癌)または炎症反応を開始および維持するために、関与する細胞が活性化され、多様なリガンドに対する細胞表面受容体のその発現を上方調節する。外傷および疾患に関与する受容体が上方調節されることが多いため、正しい細胞により内在化される治療剤の可能性は高くなる。こうして、疾患プロセスにおいて上方調節された細胞性受容体の標的化は、特定の疾患または障害を標的化するための所定の毒素複合体の特異性を増加させる。
本明細書中で処置される疾患または障害の例示は、例えば上記表8および9にて議論された疾患病理に関連する免疫または炎症細胞成分を有するものである。これらには、例えば外傷ならびにアレルギー性、血管形成、自己免疫、炎症性または腫瘍性成分を有するあらゆる疾患などの症状がふくまれる。故に、活性化細胞の標的化、例えばこれに限定しないが、あらゆる活性化された白血球、例えば１以上のあるケモカイン受容体を発現する疾患または障害に関与するあらゆる活性化された免疫エフェクター細胞および/またはあらゆる活性化された組織固有細胞または他の細胞などの標的化は、本明細書で提供されるあらゆるLPM複合体などのリガンド-毒素複合体を用いる疾患または障害の処置として本明細書に包含される。
しかし、標的細胞が血管新生および癌および他の疾患に関与するものをはじめとする毒素複合体により処置されるあらゆる疾患または障害は、毒素ポリペプチド部分を本明細書で提供された改変毒素により置換することにより改変され得るか、または本明細書で提供された方法により改変され得る。例となる改変され得るFDAに認可された治療剤には次のものが挙げられる。例えばCD33に対するヒト化モノクローナル抗体から構成したリガンド-毒素融合タンパク質であるゲムツズマブオゾガマイシン（Gemtuzumab-ozogamicin）；ヒトIL-2リガンドから構成したリガンド-毒素融合タンパク質であるデニロイキンジフチトクス（Denileukin diftitox）である。
選択された疾患または障害の治療のためのリガンド-毒素複合体の選択
上記に議論し、表8および9に例示したように、様々な細胞型は、多数の疾患、障害および他の症状の病変を悪化させるおよび/または一因となる。所定の疾患または障害において、関与する白血球サブタイプまたは他の細胞型のプロファイル、および発現したこの結合細胞表面受容体のタイプや分布をあつめることができる。従って、特異的な細胞表面受容体または複数の受容体を標的とするリガンド-毒素複合体を設計でき、これにより特定疾患を処置するために、影響する細胞およびメカニズムに参画する方法を提供できる。本明細書に記載したとおり、かかるリガンド-毒素複合体は、一般的に改変RIP毒素またはその活性部分（例えば、改変SA1）を含んでおり、標的宿主細胞に入ることにより、疾患を処置する手段として細胞を殺傷する。宿主細胞への標的に対して選択されたリガンド部分の選択は、リガンド-毒素複合体の設計のための主要ファクターである。疾患を処置するための特異的リガンド-毒素複合体の選択には、下記工程を必要とする：1)処置されるべき疾患を選択すること；2)細胞が存在過剰であり、かかる疾患に関与することを決定すること；3)選択された細胞型に対して細胞表面受容体の発現プロファイルを決定すること；4)該疾患にも関与し得る他の細胞型上の細胞表面受容体の発現を相関させること；5)選択された細胞表面受容体についてリガンドを選択すること；および6)リガンド-毒素複合体を構築すること。
正確に標的化するサイトカイン、ケモカイン、増殖因子および/またはその関連受容体は、目的とする特定疾患または障害、組織および/または傷害または疾患段階に関与するまさにその細胞集団に依存する。例えば、特定の炎症性ケモカインリガンド/受容体軸（axes）は、特定疾患において発現され、優勢であることを示している。それ故に、特異的疾患および外傷において顕著な白血球サブタイプ上のその関連受容体を標的とする関連リガンド(即ち、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子)を選択することにより特異的疾患のための薬剤を設計することが出来る。
表9は、疾患の例示、およびかかる疾患の病理または悪化に関与し得る該白血球および他の細胞集団を説明するものである。当業者は、疾患進行に関与する表9に記載した1以上の細胞等の細胞集団を知るか、または同定することが可能である。リガンド-毒素複合体（例えば、本明細書で提供されたあらゆるもの）による疾患または障害に関与するいずれか1以上の細胞の標的化を、疾患または障害を処置するために使用できる。かかる処置において使用されるべきリガンド-毒素複合体の選択は、細胞または細胞集団上での細胞表面受容体の発現およびかかる受容体についてリガンドの特異性に依存する。当業者は、目的とする組織の検討や傷害および/または疾患状態をはじめとする特定の細胞型で発現される受容体を、知っているかまたは同定することができる。例えば、受容体発現は、一般的な発現試験（例えば、これに限定しないがフローサイトメーターまたはリアルタイムPCR方法）を用いて、細胞または細胞集団に対して決定され得る。試験される細胞は、細胞株、培養一次細胞、または疾患または障害を有する患者から直接得た細胞(即ち、患者組織、血液または他の起源から得た細胞)であってよい。同様に、リガンド-受容体特異性は、当業者には既知の通常の結合アッセイを用いて、例えば本明細書に記載したように評価され得る。リガンド結合は、例えば蛍光または放射性活性物質によりリガンドを直接標識することにより検出できる。通常、かかる結合アッセイは4℃で為されるが、標的とする細胞表面受容体がエンドサイトーシスおよび特異的リガンドの内在化を媒介する場合には37℃で行い決定できる。リガンド-複合体の目的のために、その毒性効果を発揮するためにはその細胞の細胞質への侵入を獲得しなければならないため、内在化は避けられない検討材料である。
下記記載は、ケモカインおよびその関連受容体の既知の発現プロファイルを基にして、白血球集団モジュレーターを選択することにより、例示したようなリガンド-毒素複合体の設計および選択を説明するものである。同様の方法が知られるか、または他のリガンド-毒素複合体を設計するように使用され得る。この記載は単なる例示であることを意味する。リガンド-毒素複合体の設計には、疾患の特定の考察（例えば、疾患の段階および重症度）を必要とする。当業者は、多様な毒性活性のイン・ビトロアッセイ（例えば、特異的な細胞または細胞集団に対する毒性活性において）および疾患（限定するものではないが、本明細書に記載のあらゆるもの）のイン・ビボアッセイにてリガンド-毒素複合体を設計および試験できる。
白血球集団モジュレーターの選択および設計
特定疾患を処置することを目的とするLPMの設計は、好適な標的化剤、例えばケモカインリガンド等を選択することが必要である。複合体に使用するためのケモカインは、処理されるべき疾患または障害に従って選択される。第一の要件として、特定疾患または症状に関連のある白血球または他の細胞が同定される。本明細書で議論したように、疾患に対する多様な白血球集団の貢献は知られるか(例えば、表8および表9を参照されたい)または決定され得る。第二の工程は、1以上の標的とする細胞集団で発現した、1以上のあるケモカイン受容体を標的とする特定のケモカインリガンドを選択することである。かかるケモカインリガンドは、受容体についてケモカインの特異性ならびに多様な細胞上のケモカイン受容体の発現プロファイルを基にして選択される。白血球サブタイプでのケモカイン受容体発現およびケモカインリガンド-受容体相互作用は当分野で知られているか(例えば、表5および6を参照されたい)、あるいは経験的に決定され得る。
特に、リガンド-毒素複合体において使用するための好ましいケモカインの選択は、免疫恒常性中に細胞で発現しないが、炎症性および病理学的症状下に誘導されるケモカイン受容体を標的とするものである。例えば、表7は、炎症(即ち、病理)および恒常性条件下で、ケモカイン受容体プロファイルを説明するものである。かかる表は、単なる例示であって、ケモカイン受容体の誘導性発現は、刺激因子、疾患、疾患の状態または重症度などの多様なファクターおよび試験される特定の細胞集団に依存および影響される文脈であると理解される。当業者は、知っているか、または多様な症状または疾患状態の間の細胞または細胞集団でケモカインプロファイル発現、即ちケモプリント（chemoprint）を経験的に決定することができる。他のバイスタンダー白血球または不活発な白血球ではなく、病理学的細胞に対して活性を持つ標的化剤を選択することにより、疾患進行の原因となる活性化細胞が確実に殺傷の標的となる。
特定のケモカインは、他のものを行うよりも、特異的疾患状態でさらに影響をもたらすことが明らかである。例えば、MCP-1発現が急性実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)を調節することがわかっているが、MIP-1α発現はEAEを再発する重症度と相関している。別の例において、アルツハイマー病(AD)脳試験片を免疫組織学的に染色することにより、他のいくつかのケモカインよりもMIP-1β発現が優性であることを示している。即ち、例えばMIP-1αおよびMIP-1βは、MSおよびアルツハイマー病の各々を処置するために、LPM複合体について選択するリガンドである。リガンド、例えばMCP-1、IP-10およびRANTESは、その関連受容体CCR2、CXCR3およびCCR5として、ヒトMSの治療に使用され、各々該疾患において上方調節される。エオタキシン1、2および3は、好酸球により選択的に発現されるCCR3に対して高い特異性を示す。それ故に、エオタキシンLPMを、喘息、好酸球増多筋痛症候群、鼻アレルギー、アトピー性皮膚炎およびポリープ症をはじめとする様々な肺疾患および皮膚疾患をふくめた好酸球(アレルギー性)疾患に使用できる。さらなる例示において、PF-4は、内皮細胞を標的とするよう使用したケモカインであり、血管新生または他の関連のある血管新生疾患、例えば眼障害または糖尿病(例えば、WO 95/12414を参照されたい)の処置に使用できる。
このため、例えば疾患の段階、疾患の重症度ならびに処置の時期および継続時間などの他のファクターの検討もまた、ケモカインリガンドの選択に影響する。例えば、受容体特異性の程度がさらに高い特定のケモカインLPMは、二次的組織損傷の初期段階、例えば小膠細胞および/またはマクロファージが炎症を開始する段階では好適な可能性がある。非常に特異的な薬剤によるこれらの細胞を除去することにより、周辺細胞およびさらには良性細胞が活性化する可能性を減少させることができる。他の白血球サブグループが、疾患の中期または後期段階で補充される場合、広い範囲の細胞特異性が望まれ得る。加えて、好適に広い範囲のケモカインLPMは、複数のケモカイン受容体型を発現するそれらに限定された白血球集団に強力なダメージを与えるであろう。
例えば、MCP-1、エオタキシンおよびSDF-1βは、制限され非常に特異的な受容体結合プロファイルを示すケモカインリガンドの例示である。かかるリガンドは、利用可能な受容体の制限されたサブセットにより特異的な細胞型を標的とする。MCP-3およびRANTESは、広い細胞および受容体の結合プロファイルを持つリガンドの例である。このようなケモカインリガンドは、一つまたは広範囲の臨床症状に関連し得る。受容体サブタイプを用いる広範囲の細胞型を標的とするリガンドは、全ての細胞または特定細胞のみにて発現され得る。これは、主に、所定の症状に特異的であるかまたは症状の範囲に共通する細胞型の機能である。
上記考察に基づいてLPMを設計することができる。例えば急性肺傷害(ALI)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)または慢性閉塞性肺疾患(COPD)等の肺疾患を処置のために考慮されるならば、当業者は、PMN、MNP、T細胞、肥満細胞、未熟または成熟DC、および/または好酸球をはじめとするかかる疾患にて発現した任意の１以上の細胞型が１以上のCCR1、CCR2およびCCR3等を発現することを知るか(即ち、例えば上記表9に記載する)または決定できる。従って、1以上のかかるケモカイン受容体(例えば、MCP1、MCP-3またはエオタキシン)に特異的であるリガンドを選択することは、ALI、ARDSまたはCOPDのいずれか1以上の治療のためにリガンド-毒素複合体を設計する際の第一の工程である。第二の程は、疾患に関わる様々な病理学的白血球サブタイプに対する特異的ケモカイン受容体の発現を理解することである。改変RIPに直接的または間接的に結合したリガンド部分としてのMCP-1、MCP-3またはエオタキシンを有するリガンド-毒素複合体、例えば本明細書の方法および/または本明細書に記載した方法により見出されたあらゆるものを、肺疾患の処置における使用のために考慮され得る。かかるリガンド-毒素複合体の中に含まれるものは、LPM1dである。
下記表は、選択された疾患および症状の処置のための、LPMの設計における使用のいくるかの例としてのリガンドをまとめたものである。
Figure 2011050388
 そのために、多くのケモカイン-リガンド毒素融合タンパク質(即ち、LPM)を、疾患の病理または重大性に関与する優勢な細胞型に関する疾患を処置するために設計した。特定疾患の治療のための例示的なLPMを表11に説明する。
表11: 白血球集団のモジュレーターについての例示的な疾患の適用
Figure 2011050388
4. 例示的疾患
病理に関係がある細胞、異常な血管新生を有するような細胞、根本的な炎症性成分を有するような細胞、腫瘍細胞および他の異常なT細胞、ウイルス様感染細胞を標的とするリガンド-毒素複合体は、知られているかまたは製造され得る。処理されるべき特定疾患が、選択されるリガンド(標的化剤)またはその断片を決定する。このようなあらゆる複合体には、本明細書に提供および記載した改変毒素をふくみ得る(全てのかかる記載は、この章における文献ならびにその他全ての文献により組み込まれる)。
疾患および疾患状態の例示は、白血球および上皮または内皮起源の他の寄与細胞をはじめとする様々な炎症性免疫細胞型の増殖、活性化および遊走に関連があるものである。これらの事象は、傷害または疾患の部位にて非常に攻撃的かつ存在しにくい環境を生み出す。大部分の器官系統が関わる多数の疾患および症状の細胞生態学には、病態生理学的炎症反応がふくまれる。多くのこれら病態生理学疾患の細胞成分を上記表9に挙げる。かかる疾患および障害は、本明細書で提供したおよび/または本明細書に記載したとおりに製造された改変RIP、例えば改変SA1部分を含有するあらゆるものをふくめた、リガンド-毒素複合体のいずれかにより処置され得る。本明細書の方法にて使用したかかるリガンド-毒素複合体の例は、LPMであり、特に特定疾患を処置するために設計および選択される本明細書で提供したあらゆるLPMである。故に、本明細書で提供した方法および組成物は、白血球サブタイプ(および/または他の細胞、例えば脂肪細胞、星状細胞およびその他の細胞)の活性を一時的に阻害または抑制し、炎症性メカニズムおよび二次的損傷を刺激する起源物を排除するように作成されている。
例示的な障害および症状には、上記表9に記載したあらゆるものが挙げられるがこれに限定するものではない；例えば脳卒中、アテローム性動脈硬化症および高血圧をはじめとする心臓脈管疾患；肝臓疾患；肺疾患、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性肺傷害および急性呼吸促迫症候群(ARDS)；炎症性関節疾患、例えば関節リウマチおよび変形性関節症；急性過敏性、糖尿病、神経疾病および糸球体腎炎をはじめとする慢性腎臓疾患;全身性疾患、例えば全身性エリテマトーデスおよび肥満;HIV感染ならびに認知症、脳炎および腎症等のHIV関連疾患；脳、乳癌、肺癌および卵巣癌などのあらゆる器官の癌をはじめとするいくつかの癌の形態に関する、増殖、新血管形成(血管新生)および転移；アルツハイマー病などの中枢神経系疾患；ダウン症候群；多発性硬化症；脊髄傷害；海綿状脳症；炎症性腸疾患、例えば敗血症；潰瘍性大腸炎およびクローン病；皮膚疾患、例えば湿疹および乾癬；ブドウ膜炎および網膜炎および虹彩炎はじめとする眼疾患ならびに増殖性硝子体網膜症;ならびに移植、例えば移植片対宿主病(GVHD)および移植/臓器拒絶反応。
いくつかのこれら疾患病理における白血球および他の細胞型の関与に関する説明を次に記載する。かかる説明は、単に例示することを意味しており、特定のLPM複合体毒素または特定のリガンド-毒素複合体に限定することを意味するものではない。当業者は、既知の細胞成分に基づいて、リガンド-毒素複合体を作成および選択して、任意の所望の疾患の治療に使用されるべきである。特定処置および用量は、当業者により決定できる。処置を評価する検討項目には、次のものが挙げられる；処理されるべき疾患、該疾患に関与する細胞成分、該疾患の重症度および経過、該分子が予防目的または治療目的のために投与されるかどうか、治療前歴、該患者の病歴および治療に対する応答ならびに主治医の判断。
a. 癌
癌は、細胞が血液学的起源でなくても炎症性疾患と見なされうる。癌細胞は、白血球サブグループに属する多くの表現型を提示し、定義付けにより炎症細胞と見なされ得る。それらは、プロテアーゼおよび炎症性メディエーター(ケモカインをふくむ)を分泌し、食作用をおこなう能力を有する。加えて、癌細胞は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子(GF)受容体をはじめとする多様な受容体を発現する；転移を促進するCAM；および分化転換をうける。後者の例として、結腸癌細胞は、運動性および侵襲性を増強させるCXCR1およびCXCL8の発現の増加と付随して上皮−間葉転換をうける(Bates et al. (2004) Exp. Cell Res.、299:315-24)。白血球浸潤物の定量的試験は、例えば腫瘍関連マクロファージ(TAM)およびリンパ球が乳癌では細胞量の50%までを構成しており、間違いなく腫瘍とみなし得ることが明らかとなった(Elkak et al. (2005) J. Carcinog.、4:7; Leek et al. (1996) Cancer Res. 56:4625-9; Murdoch et al. (2004) Blood 104:2224-34; Queen et al. (2005) Cancer Res.、65:8896-904)。MNPおよび補充単球が増殖因子を提供し、血管新生および転移を助けるTAMに分化するという事実は、この概念を証明するものである[例えば、Ueno et al. (2000) Clin. Cancer Res.、6:3282-9; Valkovic et al. (2002) Virchows Arch.、440:583-8;および表8の文献を参照されたい]。
b. 腎臓疾患
腎臓の疾患には多くのカテゴリーがあり、いくつかの疾患がサブグループに分類される。これらの疾患は、急性の腎炎症候群；抗糸球体基底膜疾患；常染色体-優性多嚢胞腎臓疾患；糸球体腎炎(GN)、抗好中球細胞質抗体GN；糖尿病腎症；糖尿病糸球体硬化症；巣状分節状糸球体硬化症；グッドパスチャー症候群；HIV腎症；特発性三日月状GN；特発性速進行性GN；IgA腎症IgAN；IgMメサンギウム増殖性GN；ループス腎炎；膜性増殖性GN(MPGN、I、II、III)；微小変化疾患；膜性腎症；腎炎症候群；ポリオーマ・ウイルス属腎症；レンサ球菌感染後のGN；迅速三日月状GN；腎臓移植片拒絶反応；腎臓の血管炎(例えば、ヴェーゲナー肉芽腫症)および尿細管間質性腎炎を含むが、これらに限定するものではない。少数％の腎臓疾患は回復し得るが、大部分の一般的経路は、治療法がない慢性のその他腎臓疾患(CKD)へと急激またはゆっくりと進行する。CKD患者は、最終的には腎臓不全および末期の腎臓疾患(ESRD)へと低下する。ESRDは、患者は透析治療または移植に頼ることが必要である。
白血球およびケモカインは、腎臓疾患および腎臓同種移植片拒絶反応において極めて重要な役割をになう。CKDにおける炎症反応は、活性化された白血球、自己抗体、免疫複合体免疫グロブリン、DNA種、ヌクレオソーム、AGE、補体またはこれら薬剤の組合せによって開始され得る。重要な開始メカニズムは、管状および糸球体傷害を媒介する抗体である。抗体は、最終的に糸球体のメサンギウム中に沈着される、不溶性糸球体抗原との複合体および/または循環抗原との免疫複合体のいずれかを形成する。腎臓および非腎臓のある細胞は、活性化されて、サイトカイン、ケモカインおよび前繊維化増殖因子をはじめとする可溶性メディエーターの様々な種類がその環境中へ放出される。線維芽細胞; メサンギウム細胞(MGC)；管状上皮細胞(TEC)；有足細胞；および糸球体頭頂上皮細胞(PEC)をはじめとする活性化された浸潤性白血球および全ての内因性腎臓細胞は、これら同様の炎症性メディエーターを発現できる。CKDの一般的な病理には、腎盂腎炎(PN)または腎臓の感染；糸球体基底膜(GBM)および頭頂基底膜(PBM)の分解；白血球浸潤；三日月形成；線維症；尿細管およびネフロンの破壊；および糸球体構造の崩壊が挙げられる。解像解析または外科的介入があるにもかかわらず、該疾患は、継続的炎症、繰り返される腎臓傷害、線維症およびESRDへの進行と共に進行する。マクロファージ/単球、T細胞およびMaCは、CKDに関与するよく知られた白血球である。CKDにおけるこれら白血球サブタイプの活性化、遊走および増殖を調節するいくつかのケモカインおよびその関連受容体には、MIP-1α/CCR1、ENA-78/CCR5、フラクタルカイン/CX3CR1、MIG/IP-10/I-TAC/CXCR3およびIL-8/CXCR1/2が挙げられる。動物モデルやヒトの試験により提示したように、CKDのいくつか異なるタイプにおけるマクロファージ/単球およびMCP-1/CCR2の役割は、極めて重要であり、このケモカイン/受容体軸が治療的介入のための強力な物質となる(文献として表8を参照されたい)。CKDの全ての症候を成功裏に処置する治療法はなく、また副作用なしに行う治療法はほとんどない(例えば、Busauschina et al.、Transplant Proc.、36: 229S-233S、2004; Slattery et al.、Am. J. Pathol.、167: 395-407、2005; Bir et al.、J. Rheumatol.、33: 185-7、2006)。したがって、CKDとは異なる治療方法、例えば本明細書で提供される方法が必要である。
c. 脊髄傷害 (SCI)
脊髄傷害(SCI)の結果は、小膠細胞(CNSの常在マクロファージ)、白血球炎症性メディエーターの生産および強固な炎症性カスケードをはじめとする活性化された白血球サブタイプの作用により引き起こされる二次的組織損傷を迅速にもたらす細胞性イオンホメオスタシスの崩壊を伴う最初の物理的および虚血外傷の結末である。これらのカスケードは、数分以内に見られ、数週間継続し、その後内生修復および再生を伴う部分的な回復期間が続く。二次的損傷は、ニューロンおよび乏突起膠細胞の壊死およびアポトーシス細胞死；細胞興奮毒性；血液-脳関門/血管脊髄バリアー崩壊；反応性神経膠症(神経膠瘢痕をもたらす)；新血管形成；脱髄；感覚および運動機能の損失およびSCI後の慢性痛として検出できる[Jones et al. (2005) Curr. Pharm. Des.、11:1223-6; Klussman and Martin-Villalba (2005) J. Mol. Med.、83:657-71; Lee et al. (2000) Neurochem. Int.、36:417-25; McTigue et al. (1998) J. Neurosci. Res.、53: 368-76; Carlson et al. (1998) Exp. Neurol.、151: 77-88; Bartholdi and Schwab (1997) Eur. J. Neurosci.、9:1422-38; Hains and Waxman (2006) J. Neurosci.、26:4308-17; Abbadie、Trends Immunol.、26: 529-34、2005]。SCIおよびこの病理メカニズムにおいて二次的組織損傷をもたらす白血球および星状膠派生炎症性メディエーターにより開始された一次的物理的傷害およびアポトーシス事象により生じた一次的壊死の合併は、例えば外傷性脳傷害；脳卒中；多発性硬化症 (MS)、アルツハイマー病およびHIV-関連認知症(参考として表8を参照されたい)をはじめとする広い範囲のCNS外傷および疾患に類似している。
SCIにおける急性炎症傷害は、数日間続くが、部分的に前駆体乏突起膠細胞を分化することにより、軸シナプス発芽および制限された再ミエリン化等のCNS回復メカニズムと重なる。現在、MNP(小膠細胞およびマクロファージ)は、修復の促進剤として同定されている。これらの細胞は、死細胞および分解物を貪食して、マトリクスタンパク質増殖因子、好中球（Neutrophins)およびCNS修復を助けるサイトカインを提供する。傷害および修復においてMNPに対する二元的役割は、実験的糸球体腎炎、肝臓傷害；頸動脈傷害およびMSをはじめとする他の白血球媒介疾患における証拠である(Duffield et al. (2005) J. Clin. Invest 115:56-65; Duffield (2003) Clin. Sci. 104:27-38; Danenberg et al. (2002) Circulation 106: 599-605; Raivich and Banati (2004) Brain Res. Brain Res. Rev. 46:261-81)。実験的SCI試験は、MNP活性または溢出物の一過的抑制および処置後の使用中止により、組織節約を高め、行動的治療結果を改善できることを示した。これは、MNPおよびおそらくT細胞の回復活性を一部理由とする(Jones et al. (2005) Curr. Pharm. Des.、11:1223-36; Gris et al. (2004) J. Neurosci. 24:4043-51; Wells et al. (2003) Brain 126:1628-37)。実験的SCIの初期段階におけるPMNまたはマクロファージの枯渇は、陽性の結果を同様に示した(Taoka and Okajima、Prog. Neurobiol.、56: 341-58、1998; Popovich et al. (1999) Exp. Neurol.、158: 351-365)。LPMを用いる標的受容体の同定を可能とするSCIにおける二次的組織損傷の病理に関わるケモカインリガンドおよび受容体の示差発現がある(Glaser et al. (2004) J. Neurosci. Res.、77:701-8; Glaser et al.、(2006) J. Neurosci. Res. 84: 724-34; Ghirnikar et al. (2000) J. Neurosci. Res. 59:63-73; McTigue et al. (1998) J. Neurosci. Res.、53: 368-76; Lee et al.、Neurochem. Int. 36:417-25、2000)。いくつかの残存軸(10-15%)が、SCI後の有意な機能回復を為すために必要であると知られている（Jones et al. (2005) Curr. Pharm. Des.、11: 1223-36)。したがって、急性期に炎症を抑制することは、治療への有望な方法である。活性化された病理学的白血球の撲滅は一つの手段である。
d. 過敏症
過敏性反応は、４つの(時に、重複する)主要タイプ(I-IV)に分類されており、これら全ては免疫媒介組織傷害と関連し得る。タイプI(即時)過敏症は、数分から数時間のアレルゲンへの暴露にておこり、肥満細胞および好塩基球脱顆粒を媒介するIgE抗体のB細胞生産を含む。好酸球もまたふくまれる。この反応は、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、結膜炎および鼻炎をはじめとするいくつかの症状に関与する。タイプII(細胞毒性)過敏症は、細胞表面上の自己または外因性抗原のいずれかを認識して補体依存性細胞毒性を媒介する抗体によるか、または活性化マクロファージおよびナチュラルキラーT細胞による抗体依存性細胞媒介性の細胞毒性による。この反応に関連のある症状には、グッドパスチャー症候群(肺および腎臓)および甲状腺炎が挙げられる。抗体が組織内に蓄積され得る自己または外来抗原を結合する場合にタイプIII免疫コンプレックス-媒介過敏症が発症し、補体活性化および炎症(様々な白血球サブタイプの活性化、増殖および浸潤)をもたらす。これは、疾患、例えば糸球体腎炎、血管炎、全身性エリテマトーデスおよび関節炎に関与する古典的な病理である。タイプIV（遅延型)細胞-媒介性過敏性は、通常、発症に数日かかり、抗体依存性ではない。この反応は、自己または外因性抗原と複合体を形成する自己標的細胞を異常破壊する様々なT細胞サブセット、細胞毒性T細胞およびマクロファージによる。好中球、好酸球および肥満細胞は、このタイプの反応に関与する。この反応は、皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症および関節リウマチのようなかかる症状で見られる。全ての上記免疫反応には、影響される組織および器官に対して白血球のトラフィッキング、活性化および増殖がふくまれる(参考として表8を参照されたい)。
接触皮膚炎試験により、活性化された白血球の動員に関与するいくつかのケモカイン軸が同定されており、これに限定しないが、IP-10/CXCR3、IL-8/CXCR2、RANTES/CCR5、MCP-1/CCR2、MIP-1α/CCR1および5が挙げられる。様々なケモプリントが、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、アトピー性湿疹およびアトピー性皮膚炎について同定されてきた。皮膚T細胞リンパ腫、黒色腫、強皮症および全身性硬化症のある形態に関与する同様の有力なケモカイン軸が同定された。このことは、注意深く選択されたLPM含有関連ケモカイン受容体標的化剤は、炎症性皮膚疾患および癌の処置に有用であることを示している（表6にある文献を参照されたい)。
e. HIV感染およびAIDSおよび他の病原体による感染症
CNA小膠細胞の活性化および感染ならびにマクロファージの浸潤は、HIVにより誘発される疾患の病原論の１つの証明である。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、特定の受容体を介して、古典的には特定のケモカイン共同受容体と関連するCD4受容体を介して細胞に入る。CXCR4、CCR2b、CCR3、CCR5、CCR6、CCR8、CX3CR1およびその他のものは、共同受容体としての能力にて作用し得る。例えば、マクロファージ-刺激HIV-1系統は一般にCCR5共同受容体を使用するが、一方でT-細胞刺激系統は一般にCXCR4を使用する。さらに、二重刺激ウイルスはCXCR4およびCCR5共同受容体を侵入に使用できるが、HIVウイルス系統の他のサブセットは種々の他のケモカイン共同受容体を使用する(Rubbert et al.、HIV Medicine 2006、Chapter 4、Hoffman et al.、eds、Flying Publisher、Parisを参照されたい)。
HIV脳炎(HIVE)の患者において、CXCR-4は、MNP、星状細胞およびコリン作動性ニューロンの部分集団で発現するが、CCR5は主としてMNPで発現する。 HIVE患者(子供および成人)の感染細胞の大多数はMNPであると思われ、CCR5の発現増加は疾患の重篤度と相関していると考えられる点に注目すべきである。このことは、少なくともHIVEの後期の重篤な段階においてMNPに媒介される事象がより重要であることを示している。このCCR5受容体はまた、CNSのバクテリア感染後および虚血性脳損傷のラットモデルにおいて上方調節される。
サイトカイン(例えば、TNF-α)およびケモカイン(例えば、RANTES、MCP-1、MIP-1α、およびMIP-1β)の産生の増大は、HIV感染と関連している。HIV感染において増大したCNSケモカインは、末梢白血球の動員とニューロンおよび乏突起神経膠細胞に直接的な細胞傷害作用を持つサイトカイン放出(少なくともTNF-αの場合)を説明し、かつCNS外傷経験を正確に反映する。GM-CSF、マクロファージ−CSF、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、TNF-α、およびTNF-βを含むいくつかのサイトカインも、HIV複製を活性化および／または増大させることによりHIV疾患の病原論に関与することができる。
二次的損傷は、HIV-1陽性、無症状の前-AIDS患者において起こる(An et al.(1997) Arch Anat Cytol Pathol 45, 94-105)。これらの研究者らは無症状性の患者のうち50%の脳においてHIV-1のDNAを検出し、ほぼ90％が星膠症を起こしていることを認めた。これらの患者はまた、免疫分子ならびにTNF-α、IL-1、IL-4およびIL-6を含むサイトカインのレベルが上昇している。ニューロンの損傷はアポトーシスを起こしたニューロンにより確認された。
MNP由来の興奮性アミノ酸による直接的な神経毒性およびCCR5補受容体の上方調節もHIV感染の病理学に深く結びついている。誘導性酸化窒素シンターゼ活性の増大が、AIDS患者のHIVに感染した小膠細胞で検出されている。これは、酸化窒素の生成が、神経系のHVI感染領域における病変形成に関与し得ることを示唆する。さらに、HIV脳症の病理学、ならびに発症前および発症後のAIDSのCNSに及ぼす影響は、SCIおよび他の炎症性疾患で認められる二次的組織損傷を模倣しているものと思われる。
いくつかのケモカインおよびケモカイン受容体はまた、前微生物因子であり、感染性疾患を促進することが見出されている(Pease et al. (1998) Semin Immunol 10:169-178を参照されたい）。病原体はケモカイン系を利用する。例えば、細胞のケモカイン受容体は、HIVをはじめとする細胞内病原体の細胞侵入のために利用される。さらにウイルスは、ウイルスによりコードされたケモカイン受容体を利用して宿主細胞の増殖を促進する。病原体はまた、ケモカイン系を壊滅させる。ウイルスによりコードされたケモカインアンタゴニスト、およびウイルスによりコードされたケモカインスカベンジャーが知られている(例えば、Murphy、Nat Immunol.、2: 116-22、2001: Kotwal、Immunol Today、21: 242-8、2000)。
f. 炎症性関節疾患および自己免疫疾患
慢性関節リウマチ(RA)は、慢性結合組織損傷および骨侵食を特徴とする炎症性自己免疫疾患である。この疾患の病原論には、滑膜空間への白血球の浸潤、その活性化、および最終的に作用された関節を変形させて破壊する炎症メディエーターの放出が包含される。実際の関節炎応答は、おそらくMNPが前炎症性サイトカインおよびケモカインを放出する時に開始されるようである。RA患者の関節組織中にTNFα、IL-1、IL-6、GM-CSFおよびケモカインIL-8が豊富に存在することが認められており、それらの最も可能性のある供給源は、MNPに加えて滑膜繊維芽細胞である。MNP、好中球、およびＴ細胞の組み合わせに滑膜繊維芽細胞および滑膜細胞が加わることにより、炎症のカスケードが始まる。
IL-1およびTNFαは関節炎の関節中でのケモカインの産生に関与すると考えられている。ある研究においては、RA患者から単離したヒト滑膜繊維芽細胞において、これら２つのサイトカイン濃度の上昇がIL-8(T細胞の強力な化学誘引物質)およびRANTES(好中球の強力な化学誘引物質)の発現を誘導した(Rathanaswami et al. (1993) J Biol Chem 268、5834-9)。他の研究者らは、RAおよび骨関節炎の患者由来の炎症を起こした滑膜組織は高濃度のMCP-1を含有し、かつこれらの試験片由来の培養滑膜細胞中において、TNFαおよびIL-1はこのケモカインのmRNA発現を著しく増大させた。MNP由来のケモカインおよび滑膜繊維芽細胞と滑膜細胞を刺激したサイトカインは、末梢の単球、好中球およびＴ細胞の補充および溢出を促進することにより、RAの病原論において重要な役割を担っていることがわかる。他の疾患および症状に共通して、活性化された白血球は他の組織を損傷させる一連のメディエーターを放出する。より具体的には、白血球由来の反応性酸素種およびタンパク質分解酵素(例えば、マトリクスメタロプロテアーゼ、カテプシンおよび好中球由来エラスターゼ)が炎症性関節疾患において組織損傷の開始および維持に関与する(文献については表8を参照されたい)。
g.肺疾患
肺の損傷の臨床症状は広い範囲にわたる。本明細書においては、それらを肺の炎症性疾患(ILD)と総称する。ILDは、典型的には特定の傷害の結果であり、例えば全身性細菌感染(例えば、敗血症)、外傷(例えば、虚血再還流傷害)、および抗原の吸入(例えば、タバコ煙のような毒素)が挙げられる。ILDはまた、アレルギー性肺胞炎、ARDS(急性または成人性呼吸困難症候群)、種々の型の喘息、気管支炎、コラーゲン血管疾患、肺類サルコイドーシス、好酸球性肺疾患、肺炎および肺線維症が含まれる。要するに、これらの疾患および症状の病理は、特に肺胞に存在するマクロファージの活性化に関与している。マクロファージの放出に引き続いて、好中球、好酸球およびＴ細胞が活性化され、損傷部位に動員されて、周辺の内皮および上皮細胞がサイトカインおよびケモカインを生成させた。関与する特異的サイトカインおよびケモカインには次のものが挙げられる；GM-CSF、TNF-α、IL-1、1L-3、IL-5、IL-8、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、RANTESおよびエオタキシン。
白血球は、プロテアーゼ、反応性酸素種、および生物学的活性脂質を含む二次的組織損傷の多くのメディエーターを放出して、また細胞表面抗原および細胞接着分子を発現することにより、前炎症性サイトカインおよびケモカインに応答する。さらに、特定の白血球集団はある種のILDにおいて、他のILDに対するよりもより重要な役割を果たすものと考えられる。好中球およびMNPは、ARDSなどの急性肺損傷および種々の肺繊維症における二次的損傷に対して、より顕著な寄与因子であるが、一方でＴ細胞と好酸球はアレルギー性喘息、繊維性肺胞炎、およびサルコイドーシスなどを含む好酸球性肺疾患の主犯である。
h. 二次組織損傷により媒介される他の疾患
二次的組織損傷と関連する疾患の病状は、本明細書で提供される方法および本明細書で提供される複合体ならびに他の症状の治療のための当業者に公知のケモカインでないサイトカインを用いて治療できる。これらの病状には、限定されるものではないが、CNS傷害、CNS炎症性疾患、神経変性障害、心疾患、炎症性眼疾患、炎症性腸疾患、炎症性関節疾患、炎症性腎臓または腎疾患、炎症性肺疾患、炎症性鼻疾患、炎症性甲状腺疾患、サイトカインにより調節される癌、および二次的組織損傷に関連する他の病状が挙げられる。
本明細書記載の方法および本明細書で提供される複合体を使用して治療できるCNS炎症性疾患および／または神経変性障害の例としては、限定されるものではないが、脳卒中、閉鎖性頭部外傷、白質脳症、脈絡髄膜炎、髄膜炎、副腎白質ジストロフィー、エイズによる認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、慢性疲労症候群、脳炎、脳脊髄炎、海綿状脳症、多発性硬化症、パーキンソン疾患、脊髄傷害/外傷(SCI)、および外傷性脳傷害が挙げられる；本明細書で提供される方法を用いて処置できる心疾患には、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、新生内膜過形成および再狭窄が含まれる；本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性眼疾患には、限定されるものではないが、増殖性糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、網膜炎、強膜炎、強膜虹彩炎、脈絡膜炎およびブドウ膜炎が挙げられる。本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性皮膚疾患の例には、限定されるものではないが、乾癬、湿疹および皮膚炎が挙げられる。
本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性腸疾患の例には、限定されるものではないが、慢性大腸炎、クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられる。本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性関節疾患の例には、限定されるものではないが、若年性関節リウマチ、変形性関節症、関節リウマチ、脊椎関節症、例えば強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎炎、未分化性脊椎関節症およびベーチェット症候群等が挙げられる；本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性腎臓または腎疾患の例としては、限定されるものではないが、糸球体腎炎、ループス腎炎およびIgA 腎症が挙げられる。本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性肺疾患の例としては、限定されるものではないが、好酸球性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、繊維性肺疾患、急性好酸球性肺炎、および喘息、気管支肺異形成症、気管支肺胞好酸球増加症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺炎、急性呼吸困難症候群を含む気管支収縮、ならびに慢性閉塞性肺疾患(COPD)が挙げられる；本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性鼻疾患の例としては、限定されるものではないが、ポリープ症、鼻炎、副鼻腔炎が挙げられる；本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できる炎症性甲状腺疾患の例としては、限定されるものではないが、甲状腺炎が挙げられる；本明細書で提供される方法および複合体を用いて処置できるサイトカインにより制御される癌の例としては、限定されるものではないが、神経膠腫、アテローム癌、腺癌、肉芽腫、神経膠芽腫、肉芽腫症、リンパ腫、白血病、黒色腫、肺癌、骨髄腫、肉腫、サルコイドーシス、小膠細胞腫、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、ホジキン病、および乳房および前立腺癌が挙げられる。本明細書で提供される方法および複合体を用いる処置に感受性がある他の炎症性疾患としては、限定されるものではないが、脈管炎、自己免疫糖尿病、インスリン依存性真性糖尿病、移植片対宿主病(GVHD)、乾癬、全身性エリテマトーデス、敗血症、全身性炎症応答症候群(SIRS)、および火傷による外傷性炎症が挙げられる。
前記のように、これらの疾患は多様ではあるが炎症応答に関して共通する特性を有する。処置の必要な患者に本明細書に記載の有効量の治療薬剤を投与することにより治療できる脊髄損傷または外傷は考慮される疾患の例である。本明細書に記載の治療法は、白血球の増殖および遊走に関与に関わる応答の有害な結果に対抗するよう設計されている。この治療法は白血球の増殖および遊走をなくすか、または低下させ、それにより症状の改善、有害な事象の低減をはかり、また他の治療法の有効性を増強するといったその他の有益な結果を導く。
5. 併用療法
本明細書で提供されたあらゆるLPMなどのリガンド-毒素複合体を、記載された疾患の治療のために併用することができる。併用療法は、特定疾患を処置するために、リガンド-毒素複合体をその他の治療剤と共に投与することにより達成することができる。かかる薬剤は当業者には公知である。また、併用治療は、2以上のケモカイン、例えば毒素部分のいずれか末端で結合した2つの異なるケモカインから構成される分子を用いても行い得る。この場合において、これらの二重ケモカイン融合物は、各々αおよびβケモカインファミリーからの1つのリガンドを包含できる。
L. 実施例
以下の実施例は、説明を目的として含むもので、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例 1
LPMの構築のための改変志賀毒素 A1 (SA1) 変異体の選択
A. SA1 変異体の選択のためのLPMのクローニングおよび発現
MCP-1/志賀毒素 融合タンパク質 (LMP1aと称する)をコードする核酸分子を、融合タンパク質がメチオニン (Met) 残基から開始し、次いで、成熟 MCP-1の公表された 配列 (配列番号69に示され、配列番号68に示すヌクレオチド配列によりコードされる)、Ala-Met リンカー (配列番号34)、およびリボソーム不活性化 (RIP) ドメインを含む志賀-A1 毒素 サブユニット(本明細書において変異体 1 SA1と称する;配列番号22に対応し、配列番号23に示す核酸 配列によってコードされる)の残基23-268を含むように設計した。遺伝子配列の様々な発現 ベクターへの取出および置換を促進するために、制限エンドヌクレアーゼ部位を遺伝子配列の3’および5’末端に組み込んだ。LPM1aの 配列は、 5’末端にメチオニン 開始コドン (配列番号31)を含むNdeI 制限部位を有するように設計し、かつ、3’末端に終止コドン、次いでBamHI 制限部位 (配列番号33)を有するように設計した。LPM1aをコードする核酸分子を、DNA 合成 サービス組織 (Blue Heron Biotechnology、Seattle WA)によるコドン使用頻度および二次構造 最適化の原理に従って合成し、マルチクローニングサイトを除いたpUC プラスミド(pUC minus M、配列番号86)において供給した。 LPM1a 核酸分子およびコードされる融合タンパク質の配列をそれぞれ配列番号37および38に示す。
LMP1a 融合タンパク質に含まれるSA1の変異体 1 配列は、配列番号22のアミノ酸 242に対応するシステイン 残基を含むため、さらなる切型 SA1 部分を、高度に精製された LMP 融合タンパク質の間でのシステイン誘導性二量体化を避けるために作成した。このSA1 部分 (本明細書において変異体 2と称する)は、配列番号22に示すポリペプチド 配列のアミノ酸 242-246に対応する５つのC-末端 アミノ酸(CHHHA)を欠く。変異体 2 SA1のアミノ酸 配列を配列番号24に示し、配列番号25に示す核酸 配列によりコードされる。LPM1bと称される変異体 2 SA1 部分を含むMCP-1 融合タンパク質を作成した。変異体 2 SA1 配列を含むLPM1b 融合タンパク質 (MCP-1-AM-SA1 (変異体 2))をコードする核酸 配列を、LPM1a 融合タンパク質について記載したように合成し、供給した。LPM1b 核酸分子およびコードされる融合タンパク質の配列 をそれぞれ配列番号39 および40に示す。
結果として得られたpUC minus M ベクターにおけるLMP1aおよびLMP1b コンストラクトをNdeIおよびBamHIで消化して、 ~ 1 Kb NdeI/ BamHI 断片を得て、それを T7 発現 ベクター、pET9c (Novagen、配列番号84)の、対応するNdeI/ BamHI部位にクローニングした。LPM1aを含むpET9c プラスミド を、発現 宿主株 HMS174 (DE3) pLyS (F- recA1 hsdR(rK12 -mK12 +) (DE3) pLysS (CamR、RifR)に製造業者 (Novagen) の指示に従って形質転換した。LPM1bを含むpET9c プラスミドを発現 宿主株 HMS174 (DE3) (F- recA1 hsdR(rK12 -mK12 +) (DE3) (RifR)に製造業者(Novagen) の指示に従って形質転換した。
B.突然変異体の選択
LPM1aおよびLPM1bは、上記Aに記載のように、SA1 RIP 毒素 部分を含む融合タンパク質を生産する。SA1 部分の発現は宿主細胞に対して毒性であり、LPM 融合タンパク質の生産を妨害する。より低い毒性を示すSA1における突然変異体を選択するために、LPM1a またはLPM1bを含む pET9c プラスミド コンストラクトを、様々な濃度の 4APP (4-アミノピラゾロ [3,4-d]-ピリミジン)の存在下または不在下での突然変異 選択のために用いた。pET9c-含有LPM コンストラクトの適当な宿主株へのAに記載のようにした形質転換の後に、形質転換細菌を様々な濃度の 4APPの存在下または不在下で50 μg/mlのLB カナマイシン (km)上で選択した。以下に示す結果は、4APPの非存在下での50 μg/mlのLB カナマイシン (km)上でのLPM1a 形質転換細菌細胞の選択 および0.5 mM 4APPの存在下での50 μg/mlのLB カナマイシン (km)上でのLPM1b 形質転換細菌細胞の選択に基づく。
1.LPM1a 突然変異体
LPM1aを含むpET9c プラスミド コンストラクトでの4APPの非存在下でのHMS174(DE3) pLyS 宿主細胞の形質転換により、82の形質転換体が生じた。すべての82の選択したコロニーをLPM1a 発現およびプラスミド完全性についてスクリーニングした。 プラスミド DNA を標準的ミニプレップ手順を用いて細菌形質転換体から単離した。全長 タンパク質の発現をSDS-PAGEにより確認した。pET9c プラスミドからのLPM1aインサートをNdeI/ BamHIでの消化の後に精製し、インサートをT7 プライマーおよびT7t プライマーを用いて配列決定し、配列を確認した。T7: 5’ TAA,TAC,GAC,TCA,CTA,TAG,GG 3’ (配列番号35); T7t: 5’GCT,AGT,TAT,TGC,TCA,GCG 3’ (配列番号36)。
わずかなコロニーのみがLPM1を発現した。選択したコロニーのいくつかは切型形態の LPM1を発現した。１つのコロニーは、配列番号38に示すLPM1a 配列と比較して融合タンパク質のSA1 部分における位置 117 においてLからRへの突然変異を含むLPM1 を発現した(配列番号22に示す変異体 1 SA1 部分についてのアミノ酸 配列におけるL38Rに対応する)。この突然変異体 LPM1を本明細書においてLPM1cと称する。LPM1cについてのヌクレオチドおよびアミノ酸 配列をそれぞれ配列番号41および42に示し、これらは配列番号37および 38に示す親 LPM1a 分子と比較することが出来る。SA1におけるL38R 突然変異を本明細書において、突然変異体 変異体(mutant variant) 1 (本明細書において変異体(variant)3とも称する)と称し、配列番号26に示し、配列番号27に示す配列を有する核酸によってコードされる。
2.LPM1b 突然変異体
0.5 mM 4APPの存在下でのLPM1bを含むpET9c プラスミド コンストラクトによるHMS174(DE3) 宿主細胞の形質転換により、10の形質転換体が生じた。すべての10の形質転換体を選択し、プラスミド DNAを調製し、LPM1a 突然変異体について上記したようにして分析した。
２つの選択したコロニーが、配列番号40 に示す親 LPM1b 配列と比較して位置 298 においてSA1 部分におけるVからAへの 突然変異を含むLPM1 を発現した(配列番号22および 配列番号24にそれぞれ示す、変異体 1および変異体 2 SA1 部分についてのアミノ酸 配列におけるV219Aに対応する)。この突然変異体 LPM1を本明細書においてLPM1dと称する。LPM1d についてのヌクレオチドおよびアミノ酸 配列をそれぞれ配列番号43および44に示し、配列番号39および40に示す親 LPM1b 配列と比較することが出来る。SA1におけるV219A 突然変異 を本明細書において突然変異体 変異体 (mutant variant) 2 と称し(本明細書において変異体(variant) 4とも称する)、配列番号28に示し、配列番号29に示す配列を有する核酸によってコードされる。
実施例 2
変異体 LPM1の活性の比較
SA1における突然変異のLPM1 活性に対する重要性を、ウサギ網状赤血球可溶化液 (RIP) アッセイにおいてLPM1c (変異体 3 SA1 配列を含む) およびLPM1d (変異体 4 SA1 配列を含む)の活性を測定することにより評価した。LPM1cおよびLPM1d タンパク質を発現させ、部分的に精製した (実施例 4参照)。これらタンパク質の活性を、ルシフェラーゼ RNA (Promega、Madison、WI; 含まれるすべての試薬)の翻訳をアッセイするよう設計された市販の ウサギ網状赤血球可溶化液 系 (即ち、RIP アッセイ)を用いてタンパク質 合成の阻害を測定することにより評価した。簡単に説明すると、タンパク質 サンプルを1 μg/mlに希釈し、1 mg/ml BSAを含むPBS、pH 7.4に10倍工程(fold step)にて段階希釈した。希釈したタンパク質 (10 μl)を5 μl 反応混合物 (反応混合物: 2 μlのルシフェラーゼ RNAの1 mg/ml溶液; 1 μlの1:1 比の 0.1 mM アミノ酸混合物マイナスメチオニンおよびアミノ酸混合物マイナスリジン; 2 μlリボヌクレアーゼ 阻害剤)および35 μl ウサギ網状赤血球可溶化液に添加した。サンプルを30℃で1.5 時間インキュベートした後、反応をサンプルを氷上でインキュベートすることによって終止した。サンプルを上記の反応混合物を用いて1:25 に希釈した。反応混合物(100 μl)を96-ウェルホワイトポリスチレンプレート (Corning Corporation、NY)に移し、100 μlの発光色素 Bright-Glo (Promega)を各反応に添加した。プレートを予熱した (20-25℃) FLUOstar ルミノメーター (BMG Lab Technologies、Durham、NC)を用いて分析した。並行して、反応混合物のみまたは試薬ブランクをネガティブコントロールとして用い、RIP タンパク質 サポリン (Sigma、St. Louis、MO) をポジティブコントロールとして用いた。サポリン ポジティブコントロールは一貫して8-12 pMの範囲の相対活性 (RIC50) 値を有していた。志賀 ホロ毒素の報告されるRIC50 値は9 pMである (Skinner and Jackson (1997) J. Bacteriol. 179: 1368-174)。精製した変異体 4 SA1 サブユニット (配列番号28)のRIC50 値は50 pMであった。LPM1c (配列番号42) およびLPM1d (配列番号44)のRIC50 値はそれぞれ5 nMおよび80-100 pMであった。試験した突然変異体 変異体の観察されたRIP 活性に基づいて、LPM1dからのSA1 配列を含む新しいLPMである突然変異体 変異体 2 (即ち、変異体 4) SA1を、以下の実施例 3 に記載のように構築した。
実施例 3
SA1 変異体 4を含むLPM遺伝子の構築
LPM 2-13 (表12)を成熟 SA1 志賀毒素 サブユニットの突然変異体 変異体 2 (即ち、変異体 4) 切型型(配列番号28に示す)に対してアラニン-メチオニン ジペプチドによって結合したそれぞれのケモカイン 配列の融合タンパク質をコードするよう構築した。LPM2-13 をコードする配列を以下に説明する２種類の方法によってpET9c プラスミド (配列番号84)に挿入した。各方法は、SA1 志賀毒素 サブユニット 配列の5’ 配列内の内部EcoRI 制限部位の存在に依存し(例えば、配列番号23に示す変異体 1 配列、または配列番号29に示す変異体 4 配列のヌクレオチド4-9に対応)、その結果5’リジン 残基を欠くSA1 部分が生じ、それはEcoRI 制限部位に隣接してコードされるリジンを含むケモカイン リンカー 部分の設計によって再構成された。プラスミド 操作に用いたすべてのプロトコールは、 Maniatis et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York (1982)からのものであった。
表12: LPM 変異体
Figure 2011050388
簡単に説明すると、LPM 2-13 の構築に用いたケモカインをコードする核酸分子の配列(表12) を、DNA 合成 サービス組織 (Bio S&T、Montreal)によるコドン使用頻度および二次構造 最適化の原理にしたがって合成し、pUC プラスミド (pUC19、配列番号85)中に供給した。それぞれのケモカイン遺伝子について、メチオニン 開始コドンを含むNdeI 制限部位(配列番号31) を5’末端に付加し、アミノ酸Ala-Met-Lysをコードするリンカー 配列、次いでEcoRI 部位 (配列番号32)を3’末端に付加した。それぞれのケモカイン コンストラクトについてのヌクレオチド 配列を表13に記載し、配列番号72-83に示す。第二のエオタキシン 配列は最適化され、Blue Heron Biotechnologyによって供給され、配列番号82に示す。ケモカインをコードするそれぞれの核酸分子のそれぞれを用いて、以下に示す２つのクローニング 方法の１つによってLPM 融合タンパク質を作成した。
表13: LPM 2-13についてのケモカイン コンストラクトの配列 成分についてのヌクレオチド 位置
Figure 2011050388
A.クローニング 方法 1
LPM 4-10、LPM12およびLPM13 の成分(表13参照)をpUC19 プラスミド (配列番号85)中でアセンブリーさせ、 次いでpET9c ベクターにサブクローニングした。簡単に説明すると、SA1 変異体 4 成分を、LPM1d を含むpET9c ベクター(実施例 1参照)をEcoRIおよびBamHIにて消化することにより作成し、SA1 変異体 4遺伝子を含む750 bp EcoRI/BamHI DNA 断片を得た。消化した断片をゲルで精製し、対応する EcoRI/BamHI 部位にて切断しておいたpUC19 プラスミドに挿入して、pUC19BB プラスミドを得た。LPM 4-10、LPM12 およびLPM13のケモカイン 配列 成分をそれぞれのケモカイン含有pUC19 プラスミドの上記のようなNdeIおよびEcoRIでの消化により作成し、各ケモカインについての~ 250 bp NdeI/EcoRI DNA 断片を得た。完全なLPM 配列を作るために (表12参照)、消化したケモカイン 断片をゲルで精製し、対応するNdeI およびEcoRI 制限部位で消化しておいたSA1 変異体 4 配列を含むpUC19BB プラスミドに挿入した。完全なLPM 遺伝子配列を含むpUC19BBを 次いでNdeIおよびBamHIで消化して~ 1 kb 断片を得て、それをゲルで精製し、NdeIおよびBamHI で消化しておいたpET9c プラスミド (配列番号84)にサブクローニングした。プラスミドはそれぞれのLPMの発現について確認され、インサートの同一性を確認するために配列決定された。上記表12は、クローニングされたLPM 変異体である LPM4-10、LPM12およびLPM13についてのそれぞれの核酸およびコードされるアミノ酸についての配列 識別子(identifier)を示す。
B.クローニング 方法 2
LPM 2、3、および11を作成するために (表12参照)、それぞれのケモカイン遺伝子を本明細書において記載する方法を用いて、直接、pET9c 発現 プラスミド (配列番号84)に挿入した。まず、後のクローニング工程におけるベクターの消化を防止するために、EcoRI 部位をpET9c プラスミドから除いてベクター pET9DEを得た。簡単に説明すると、pET9c プラスミドを EcoRIで消化し、 末端をT4 DNA ポリメラーゼにより平滑にした。プラスミド DNAをライゲーションし、pET9DE ベクターを得、DH5α 大腸菌 細胞(Invitrogen、Carlsbad、CA)に形質転換した。プラスミド DNAを標準的ミニプレップ手順を用いて細菌形質転換体から単離し、 pET9DE ベクターにおけるEcoRI 部位の欠失を、制限 消化によって確認した。
LPM 2、3、および11をコードする遺伝子をクローニングするために、上記クローニング 方法 1 からの完全な LPM1d遺伝子のための配列を含むpUC19BB プラスミドをNdeIおよびBamHIで消化して1 kb 断片を得た。断片をゲルで精製し、NdeIおよびBamHIで消化しておいたpET9DE ベクターにサブクローニングして、pET9DE-BB プラスミドを作成した。LPM 2、3、および11のケモカイン 配列 成分をNdeIおよびEcoRIでの消化により上記のようにそれぞれのケモカイン含有pUC19 プラスミドの消化により作成し、各ケモカインについての ~250 bp NdeI/EcoRI DNA 断片を得た。完全な LPM 配列を作成するため (表12参照)、消化した断片をゲルで精製し、対応する NdeI/EcoRI 部位で消化しておいたpET9DE-BB プラスミドに挿入した。 上記表12は、クローニングされたLPM 変異体 LPM2、3、および11についてのそれぞれの核酸 およびコードされるアミノ酸についての配列 識別子を示す。
実施例 4
LPM 変異体の発現および精製
A. LPM 変異体の発現
HMS174(DE3)のpET9c/LPM プラスミドによる形質転換の後、様々な LPMの発現に対するRIP 阻害剤 4APP の効果を、形質転換体を一晩37℃で 50 μg/ml カナマイシンおよび2 mM 4APP を含むMTB 培地 (24 g/L イーストエクストラクト、12 g/L トリプトン および0.4% グリセロールを含む1xM9 培地)中で培養することにより試験した。それぞれの LMPのIPTGによる誘導の前に、細胞を同じ培地に継代し(1:10 希釈)、さらに3 時間37℃で培養した。細胞を1mM IPTGの存在下または不在下および様々な濃度の 4APP (例えば、0、0.1、2、5、10、15および 20 mM 4APP) の存在下での誘導によりさらに同じ温度で3.5 時間誘導した。LPM 融合タンパク質を含むインクルージョンボディーを細胞から回収した (以下の方法参照)。IPTGの存在下での誘導により、所望の 発現 プロファイルを有する株は、~36 kD 発現 バンドを、4APP用量応答的に示した。タンパク質 同一性は抗-SA1 抗体を用いるウェスタンブロッティングにより確証した。SA1 サブユニットに対する抗体をSA1の合成ペプチド(配列番号30) (Covance Research Laboratories、Denver PA)に対してウサギにおいて作成し、血清を回収した。
表14は、 LPM 複合体である、LPM1d、LPM8、LPM3、LPM6 またはLPM7の相対的発現を示す。細胞からのLPM 融合タンパク質の発現および回収の後、タンパク質をSDS-PAGEゲルで分離し、全タンパク質をクーマシーブルーでの染色により可視化した。4-APP 用量曲線に沿ったパーセント 発現を同じ振盪フラスコ発酵 (0.1〜20 mM 4-APP)のそれぞれからの同一であるように調製したサンプルをローディングすることによって評価した。 所与のLPMの100% 発現は、所与の濃度の 4-APPにおいてゲル上でタンパク質レベルが上昇しなくなることの観察に基づいた。パーセント 発現を示された100% 発現と発酵ブロスにおいて発現および4-APPがより低いサンプルのレーンとを目視で比較することによって評価した。実験は少なくとも２回行った。一般に、発現 レベルは0.1 mM 4APPにおける所望の タンパク質のわずかなまたは検出不可能な量 から10-20 mM 4APPにおける高レベルへと上昇した。
表14: 4-APPの存在下での LPM 発現 レベル
Figure 2011050388
B.タンパク質生産
バッチ発酵 方法をLPM 生産のために開発した。選択した SA1 変異体を有するpET9c/LPM プラスミドを担持する宿主細胞(HMS174(DE3))を液体濃縮培地 (発酵槽中5-100 Lまたは2.8 L 振盪フラスコ中400 ml)にて37℃で2 mM 4APPの存在下で培養した。産物発現を1 mM IPTGで3-6 時間 10 mM 4 APPの存在下で誘導し、細胞を遠心分離により回収した。細胞 ペレットをホモジナイズし (超音波処理により、またはホモジナイザーを3-4回通すことにより)、次いで細片を除き、遠心分離を用いてインクルージョンボディー (Ib)を回収した。Ibを 2-3 回数体積のdH2Oにより洗浄した。Ib を6M 塩酸グアニジンを含むバッファー中で可溶化し、 遠心分離し、上清を 8 M尿素に対して透析した。発酵槽または振盪フラスコからの典型的な出発LPM収量はそれぞれ~1g/L (OD600 nm ~ 50)および300 mg/L (OD600 nm~ 7)であると見積もられる。600 nmで記録された吸光度 (OD)は、Ultraspec Pro 分光光度計を用いた大腸菌 密度の尺度であった。核酸を0.1% (v/v) ポリエチレンイミンを有するIB 溶液から除去した。遠心分離の後、さらなる DNAを残余の DNAに結合し、等電点の高いタンパク質、例えば、 LPMの通過を可能とする陰イオン交換樹脂フィルターまたはカラム(Q-sepharose-FF)に通すことによって除いた。タンパク質産物を陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー (S-sepharose-FFまたはHP)で捕獲し、尿素 の存在下でのNaCl グラジエントにより溶出した。このカラムからのフロースルー画分は少量の遊離のSA1 毒素 部分を含む。タンパク質 画分をNaCl グラジエントにわたって回収し、SDS-PAGEにより分析した。LPMを含む画分をプールした。産物の再フォールディングを25 mM Tris-HCL、1 M 尿素、0.5 M L-アルギニン、1 mM 還元型グルタチオンおよび0.1 mM 酸化型グルタチオン、pH 8.0に対する16-24時間の透析によって行った。再フォールディングした物質を次いで製剤 バッファー (50 mM クエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、および20% スクロース)中で透析し、-80℃で保存した。この物質の純度はSDS-PAGEによって評価して80%を超え、製剤の前に精練 工程として陽イオン交換または疎水性相互作用 クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。別のプロセスでは同じ出発工程を用いたが最初の陰イオン交換からの産物は、25 mM リン酸ナトリウム、1 M尿素、200 mM L-アルギニン、20% (w/v) スクロース、1 mM 還元型グルタチオンおよび0.1 mM 酸化型グルタチオン、 pH 8.0への16-24時間の希釈によって直ちに再フォールディングされた。再フォールディングされた物質を次いで陽イオン交換、そして疎水性相互作用 クロマトグラフィーにかけた後、上記の製剤 バッファー中で透析した。
実施例 5
細胞に基づく 細胞毒性 アッセイ
LPM1dおよびLPM12の細胞 毒性を、細胞に基づく細胞毒性アッセイにおいて測定した。 このアッセイにおいて、細胞を、毒素 (即ち、SA1 部分を含むLPM タンパク質) の存在下または不在下で一定期間培養した。細胞溶解の際の培養中のATP量を、細胞 生存度の測定可能な指標として用いた。
A.細胞培養およびサンプル添加
THP-1 単球細胞を10% FBS (Invitrogen、Carlsbad、CA)を追加したRPMI 培地を含む完全培地中で製造業者の指示に従って (ATCC、Manassas、VA)培養し、週に２回継代して、細胞 密度を5 x 105 細胞/mL未満に維持した。細胞を遠心分離により収集し、新鮮な温かい培地で洗浄し、適当な 体積の培地に再懸濁して細胞に基づく 細胞毒性 アッセイのために密度 を3- 4 x 104 細胞/mlにした。細胞を100 μL アリコットの細胞 懸濁液を、96-ウェル 細胞 培養 プレートの内側の60 ウェルのそれぞれに移すことによって播種した(外側のウェルは完全培地のみで満たした)。20 μlの媒体 (バッファーのみ)およびLPM1d またはLPM12 タンパク質 サンプル (濃度範囲25 μg/ml〜100 μg/ml)を三連でウェルに添加し、穏やかに細胞と混合した。細胞を次いで、37℃ (5% C02)で24 時間インキュベートした。
B.細胞に基づく細胞毒性の評価
CellTiter-Glo（商標） Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega、Madison WI)を(製造業者の指示に従って)、細胞に基づく 細胞毒性の尺度として細胞 生存度をアッセイするために用いた。細胞をATP 反応混合物 (製造業者によってCell Titer-Glo（登録商標） Reagentとして供給された)とともに溶解すると、ATP がルシフェリンの酸素負荷(oxygenation) を駆動する結果、ウェルにおけるATP 濃度に比例する発光 シグナルが生じる。これは、培養中の生細胞の数と直接比例する。上記AからのTHP-1 細胞 プレートからの100μLのアリコットを白色平底 培養 プレート(Corning Corporation、NY)に移して発光測定を可能とし、30 分間平衡化させた後、100 μLのATP 反応混合物を添加した。ATP 反応混合物の添加の後、プレートの内容物をボルテックスを用いて30 秒間穏やかに振盪して細胞 溶解を誘導し、室温で10 分間インキュベートして発光 シグナルを安定化させた。発光をFLUOstar ルミノメーター (BMG Lab Technologies、Durham、NC)を用いて測定した。媒体のみ(バッファーのみ)を含む一致対照(matched control)ウェルを各LMP タンパク質について調製した。三連の値を平均し、バックグラウンドの発光を試験したすべての条件について差し引いた。LMP 融合タンパク質の存在下でのATP含量を一致対照の存在下でのATP含量(100%として設定)のパーセンテージとして表した。LPM1dおよびLPM12を細胞に基づく 細胞毒性 アッセイにおいて試験し、結果をそれぞれ表15および表16に示す。結果は、ATP含量は様々な濃度の LPM1dの存在下で用量依存的に低下することを示し、LPM1dがTHP-1 細胞に対して毒性であることが示された。LPM12もTHP-1 細胞に対して毒性であったが、33 μg/ml以上の濃度のみにおいてであり、LPM12の用量依存的効果はこれら細胞に対して観察されなかった。LPM12 (エオタキシン ケモカインを含む融合タンパク質)の観察された効果は、エオタキシン 受容体、CCR3の、THP-1 細胞上での発現の欠如、および、エオタキシンが高濃度にて結合するTHP-1 細胞上のMCP-1 受容体、CCR2の存在 (Ogilvie et al.、(2001) Blood 97: 1920-1924)に起因する可能性がある。
表15: THP-1 細胞に対するLPM1dの細胞 毒性
Figure 2011050388
表16: THP-1 細胞に対するLPM12の細胞 毒性
Figure 2011050388
実施例 6
ラットにおける抗-胸腺細胞 血清 (ATS)- 誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎におけるLPM1dの活性
以下の実施例は、ラットにおける抗-胸腺細胞 血清 (ATS)-誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎の進行に対するLPM 治療の効果を示す。
A. ATS 注射およびLPM1d 治療
ラットにおけるATS-誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎の進行に対するLPM1d 治療の効果を評価した。24匹のラットの体重を測定し、基底の 尿 収集のために24 時間メタボリックケージにおいて飼育した。尿 体積を記録し、尿を処理し、標準的手順を用いてクレアチニンおよびタンパク質を定量した。ラットを麻酔し、0.5-1.0 mlの血液を辺縁部尾静脈から採取した。血液は凝固し、血清を血液 尿素窒素 (BUN)、クレアチニン、およびコレステロールの標準的手順を用いる測定のために保持した。ラットに0日目に20 mg/ 100 g 体重の抗-胸腺細胞 (Thy1) IgG 画分 (Probotex、San Antonio、TX)を注射し、回復するとそれらのケージに戻した。ラットを毎日モニターし、体重および健康状態を記録した。ラットを 8匹ずつ３群に分けた: ２群には一日おき(2、4、6 および8日目)にLPM1dをそれぞれ50または100 μg/kgにて注射し、第３の群には、抗体 投与後２日目から開始して疾患 対照群として媒体のみ(0.05 mM EDTA を含有する50 mM クエン酸ナトリウム バッファー pH 6.2)を注射した。4日目にラットをメタボリックケージに戻して中間点の尿を収集した。翌日、血液を中間点 血清 収集のために尾静脈から得た。8日目にラットをメタボリックケージに最後の24時間の尿収集のために入れた。動物は実験にわたって健康であった。(尿 クレアチニン クリアランスにより測定した) LPM 処理群の糸球体ろ過量は一般に対照と変化無く、5および9日目に高用量与えられた動物においてわずかな上昇が観察されたのみであった。BUNおよびコレステロール レベルはすべて、 すべての動物について正常範囲内であった。尿 タンパク質を研究における中間点において判定した(24時間尿 収集、4-5日目)。低用量および高用量で処理された ラットは、それぞれ対照と比較して尿 タンパク質において34% および 39% の低下を有することが判明し、LPM1d が腎臓機能に対する保護効果を有することが示された。
B.組織学的分析
9日目に、すべてのラットを屠殺し、血液を回収し、腎臓を組織学のために処理した。この実験からの腎臓皮質をスライスして2-3 mm 冠状切片とし、液体窒素で瞬間冷凍し、ホルマリンに入れるか、またはメタカーン(methacarn)に入れ、一晩4℃で固定した。
1.線維性プロセスマーカーのための免疫組織化学的染色
凍結切片をフィブロネクチンおよびアルファ 平滑筋アクチン (α-SMA)に対する抗体(それぞれ、クローン IST-9、Serotec、Harlan Bioproducts for Science、Indianapolis、IN およびクローン 1A4、Sigma、St.Louis MO)を用いて処理した。フィブロネクチンは、細胞外マトリックス (ECM) 沈着および合成のマーカーであり、アルファ 平滑筋アクチン (α-SMA)は、ECM 沈着の前兆である表現型変化を経ている細胞過多 メサンギウム細胞のマーカーである。フィブロネクチンおよびα-SMAの発現は、線維性プロセスを示す。α-SMA またはフィブロネクチンのいずれかについての染色について、結果は0-4のスケールで示し、それらはそれぞれ、染色無し、低度、中程度、高度および非常に高度の染色を示す。表17は、群における全部で4匹のラットの平均(AV) スコアとしてのα-SMAによる凍結切片の染色の結果を示す。結果は、より高い濃度の LPM1dの存在下ではα-SMAの発現が低下することを示す。したがって、LPM1d 処理された腎臓におけるメサンギウム細胞の活性化は低下する。
表17:凍結腎臓切片におけるα-SMA レベル
Figure 2011050388
表18は、LPM1dでのラットの治療の際のフィブロネクチンについての凍結腎臓切片の染色の結果を示す。結果は、特に高濃度の LPM1d (100 μg/kg)での、免疫組織化学的染色によるフィブロネクチンの発現の低下を示す。したがって、LPM1dで治療した腎臓におけるECM 沈着は低下する。
表18:凍結腎臓切片におけるフィブロネクチン レベル
Figure 2011050388
2. 腎病変のヘマトキシリン・エオシン染色 (H&E)
ホルマリン処理した サンプルを、腎病変のヘマトキシリン・エオシン染色 (H&E) 評価のために処理した。 凍結切片のH&E 染色は、腎病変ならびに腎糸球体の 完全性および構造の可視化および包括的評価を可能とし、それらは、正常な外観から重篤な損傷まで0-4のスケールにてスコア付けされる。結果 (表19)は、LPM1dの存在下でα-Thy1 処理したラット 腎臓における腎病変の存在の低下を示す。100 μg/Kg LPM1dで処理されたラットの群においては顕著な病巣は観察されなかった(即ち、1.44のスコアに匹敵)。したがって、LPM1dで処理した腎臓においては腎病変および構造的損傷が低減する。
表19:凍結腎臓切片における腎病変のH&E 染色
Figure 2011050388
3.増殖する細胞についての免疫組織化学的染色
メタカーン(Methacarn)処理したサンプルを、ED-1 抗体 (Chemicon Corporation、Temecula、CA)を用いるマクロファージの数の免疫組織化学 評価に用いた。このモデルにおいて、マクロファージの数は 約5日目に最大になる。ED-1 陽性 マクロファージの評価のために、マクロファージの総数(即ち、ED-1 陽性細胞)を9日目に25の糸球体から計数した。結果は表20に、群における4 匹のラットのそれぞれにおける計数したマクロファージの生の数値データとして示す。結果は、LPM1d処理した腎臓におけるマクロファージの存在の低下を示す。
表20: 9日目における糸球体中のマクロファージ数
Figure 2011050388
実施例 7
マウス 遅発性過敏症 モデルにおけるLPM1cおよびLPM1dの活性
以下の実施例は、マウス耳におけるオキサゾロンに対する炎症反応の程度に対するLPM1cおよびLPM1d 処理の効果を示す。
細胞に基づく 免疫応答に対するLPM タンパク質の効果を、抗原 オキサゾロンの投与によって誘導される遅発性過敏症のマウス モデル(MDTH)において評価した。LPM1cおよびLPM1d 処理の、マウス耳におけるオキサゾロンに対する炎症反応の程度に対する効果を評価した。56匹の体重~ 20-25グラムの雌性 Balb/c マウスを表21に示すように７つの処理群に分けた。マウスを2 % オキサゾロン (Sigma、St. Louis、MO)に対して -7および -6日目に抗原 溶液の体の剪毛領域に対する投与によって感作した。0日目に、マウスを両耳に直接塗布した2% オキサゾロン 溶液により攻撃した。0日目および1日目に、マウスを LPM1c (100 μg/kg)、LPM1d (10 μg/kgまたは25 μg/kg)、デキサメタゾン (抗炎症性 副腎皮質ステロイド、0.2 mg/kg (Vedco Inc、St. Joseph、MO))、または媒体対照で処理した。
表21: MDTH 処理群
Figure 2011050388
オキサゾロンに対する炎症反応の程度を評価し、表21に示す処理の効果を比較するために、耳の厚さおよび総重量を測定した。マウスの両耳を、攻撃前、攻撃後24 時間目および研究の最後(攻撃後48 時間目)にノギスで測定した。さらに、研究の最後に耳を除去し、重さを測定した。
最後の耳の重量の平均 +/- 標準誤差をグラムにて判定した。両側t検定を結果の統計的有意性の分析に用い、すべての LPM 処理が、ポジティブコントロール デキサメタゾン処理群と同様に、媒体-処理/感作/攻撃群 (表18における群 2)と比較して統計的に有意な (* p < 0.05)、耳の幅の相対的低下を与えた。媒体-処理/ 感作/ 攻撃群と比較しての耳の幅におけるパーセント低下を各群について計算した。パーセント低下は、次式によって計算した: 1 - [(処理 - ネガティブコントロール) / (ポジティブコントロール - ネガティブコントロール)] x 100%。結果は表22に示す。LPM1c (群 3) およびLPM1d (群 4 および 群 5) 処理群における耳の厚さの測定はデキサメタゾン (群 6) 処理群 (29 %)とほぼ同程度に低下していた。
表22: MDTHにおける耳の重量に対するLPM 処理の効果
Figure 2011050388
実施例 8
脊髄 傷害 モデルにおけるLPM1dの活性
A.脊髄 傷害およびLPM 投与
脊髄 傷害 (SCI) モデル 実験を設計し、ここでマクロファージおよび好中球 集団の減少を定量するために、傷害の最初の1-3日後においてのみLPM1d を投与した。簡単に説明すると、脊髄 傷害を以下のようにして誘導した: 成体 6-8 週齡 CD-1 マウス (Charles River Laboratories、Montreal、Quebec、Canada)をケタミン-キシラジン混合物(85 mg/kg および15 mg/kg、腹腔内 (I.P.))でそれぞれ麻酔し、中程度の(60 kdyne) T9/10 挫傷 脊髄 傷害 (SCI)に供した (Infinite Horizons Impactor、Precision Systems Instrumentation、Kentucky、USA)。傷害はげっ歯類においてよく特徴づけられており、ヒト SCIの病態生理を模倣する中程度の病巣を再現可能な様式で作る(例えば、Wells et al. (2003) Brain、126: 1628-37参照)。傷害の後に、マウスを温かい毛布の上で回復させ、血液損失および脱水を補償するために0.5 ml 生理食塩水を与えた。膀胱を自発的な排尿が回復するまで毎日2-3 回手作業により強制的に動かした。すべての実験はCanadian Council on Animal Careのガイドラインに忠実にしたがってUniversity of Calgary Animal Care Ethics Committeeにしたがって行った。
傷害の後、LPM1d または媒体 対照をマウスに投与した。マウスを無作為に以下の表23に示す４つの処理群に分けた。
表23: SCI モデルにおけるLPM1dによる処理
Figure 2011050388
B.データ分析のための組織および血液の回収
1.新鮮な組織
新鮮な組織をマウスを麻酔した後SCI 傷害の24 および48 時間後に処理群のそれぞれから収集し、~1 mlの全血を100 μlのヘパリン溶液への心穿刺により収集した。血液 収集の直後に、動物を氷冷 PBSで灌流し、脊髄 (病巣部位を中心として2 cm)を迅速に単離し、氷冷 PBSに入れた。血液および脊髄 サンプルを次いでフローサイトメトリー用に調製した。
2.固定組織
固定組織をSCI 傷害の後5日目に処理群のそれぞれから収集した。動物を 致死量の ケタミン-キシラジンで麻酔し、PBSで灌流し、次いで、PBS 中の4% パラホルムアルデヒド溶液により灌流固定した。脊髄 (T6〜T13)を取り出し、4% パラホルムアルデヒド中で一晩後固定し、次いで 30% スクロース中で凍結保護(cryoprotect)した。脊髄を次いでブロックに入れ、凍結し、切片にするまで -70℃で保存した。ブロックを横断面にて20 μmの厚さの切片にし、組織 切片を５つの隣接する切片の群に組織化したSuperfrost スライド (Fisher Scientific、Houston、TX)上に収集した。
3.統計分析
統計分析はSigmaStat ソフトウェア (SPSS、Inc.)を用いて行った。処理群の間の差は分散分析 (ANOVA) および保証された場合Holm-Sidak 事後分析を用いて検定した。不等分散の場合、ランクに対するKruskal-Wallis 一元配置 ANOVA を用いた。P 値が0.05 未満である差を有意であるとみなした。
C.データ分析
1.フローサイトメトリー
新鮮な組織からの脊髄 サンプルを小さいガラス製の加圧型細胞破砕装置により機械的に破壊し、単細胞 懸濁液を溶液 をワイヤーメッシュスクリーン (Sigma-Aldrich、Canada)を通過させることによって得た。サンプルを次いで4℃で1100 RPM (200 x g)、10 分間の低破壊の遠心分離に供した。ペレットをFBS 染色 バッファー (BD Biosciences)に再懸濁し、遠心分離 (3000 RPM、7 分間、4℃でゆっくりしたブレーキ）に供した。ペレットを次いでFBS 染色 バッファーに再懸濁した。
脊髄 細胞を常在性 小膠細胞 (CD45dim:CD11b)および血液由来白血球(顆粒球および単球; CD45high:CD11b)の集団の判定に用いるマーカーに対する抗体で染色した。抗体希釈度を最適にするために、細胞数を 細胞を 1:1にトリパンブルーに希釈し (10 μl トリパンブルーに対して10 μl の各サンプル)、血球計数器を用いて細胞数を計数することによって、まずトリパンブルー 染色 を用いて計数した。サンプルをまず Fc 受容体に対する抗体 結合による非特異的 結合を低減させるためにFc Block（商標） (精製ラット 抗-マウス CD16/CD32 (FcγIII/II 受容体; BD Biosciences; 0.5 mg/ml))とともにインキュベートした。Fc block との 約 5 分間のインキュベーションの後、以下のモノクローナル抗体 (BD Biosciences)を細胞 サンプルに添加して、常在性 小膠細胞および血液 由来白血球の存在を評価した: R-フィコエリトリン (R-PE)-結合ラット抗-マウス CD11b (0.2 mg/ml)、FITC 抗-マウス Ly-6G およびLy-6C (Gr-1; 0.5 mg/ml)、FITC 抗-マウス CD3 分子複合体 (0.5 mg/ml)、およびペリジニン クロロフィル-a タンパク質 (PerCP)-結合ラット抗-マウス CD45 (白血球共有抗原、Ly-5; 0.2 mg/ml)。非特異的 結合 および自己蛍光を制御するために、適当な アイソタイプ 対照 抗体を用いる染色も行った(即ち、PE 標識ラットIgG2a、k アイソタイプ 対照 (0.2mg/ml); FITC標識ラットIgG2b、k アイソタイプ 対照 (0.5 mg/ml);および PerCP-結合ラット IgG2b アイソタイプ 対照 (0.2 mg/ml))。細胞のみのサンプルも染色 インキュベーションに含めた。細胞を30 分間4℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞 サンプルをFBS 染色 バッファーで２回洗浄し、1% 緩衝ホルマリンに再懸濁した。細胞 サンプルを4℃で保存し、BD FACScan (BD Biosciences)を用いて分析した。
フローサイトメトリーの結果を、WinMD1 バージョン 2.8 ソフトウェア (Scripps Research Institute、California、USA)を用いて密度 プロット (CD45、y-軸; CD11b、x-軸)から判定し、異なる処理群の間で比較した。WinMD1 バージョン 2.8 ソフトウェアを用いて、CD45 および CD11b 染色の平均 蛍光を各処理群について判定した。血液由来白血球の常在性 小膠細胞に対する比を、CD45:CD11bの平均 蛍光 値の比として判定した。平均の標準誤差も処理群のそれぞれについて判定した。結果を表24に示す。結果は、SCIの24 時間後、LPM1d でSCIの2 時間後に処理された群 I におけるマウスは、媒体のみで処理されたマウス と比較して脊髄における血液由来白血球の比の低下を示した。分析は、SCIの２時間後にLPM1dの１回用量を受け取ったマウスは、24 時間における血液由来白血球:小膠細胞の比が、対照と比較して有意に(P< 0.05)低下していたことを示す。これは、小膠細胞数が群の間で変化しなかったので血液由来白血球の30% 低減を表す。SCIの48 時間後において、感染後2 および24 時間に２回用量のLPM1d で処理されたマウス(即ち、 群 II)からの脊髄 細胞の比は、試験および対照比の間で有意差を示さなかった。
表24: SCIの24および48 時間後における血液由来白血球対常在性 小膠細胞の比
Figure 2011050388
2.小膠細胞/マクロファージの検出のための免疫組織化学
蛍光 免疫組織化学を損傷後５日目の脊髄からの固定された組織 切片を含むスライドに対して行った。スライドを解凍し、PBS中で３回すすぎ、10% 正常ヤギ 血清中で30 分間 室温でブロッキングした。小膠細胞/マクロファージを検出するために、スライドをウサギ 抗-Iba1 抗体 (1:1000; Wako Chemicals USA、Inc.)とともに２時間室温でインキュベートした。PBS中で３回洗浄した後、スライドを１時間 室温でAlexa488 ヤギ 抗-ウサギ 二次抗体 (1:1000、Molecular Probes Inc.、USA)とともにインキュベートして Iba-1を可視化した。スライドを次いでPBS中で３回洗浄し、 Hoechst 33258 (1 μg/ml、Sigma-Aldrich、Canada)に浸した。
損傷 脊髄内での小膠細胞/マクロファージ 活性化/動員を定量するために、オーバーレイボックス (1024 × 1024 ピクセル)をIba-1 シグナルを含む横断 脊髄 切片のデジタル捕捉 共焦点 閾値画像上にSigmaScan Pro ソフトウェア (SPSS、Chicago、IL)を用いて配置させた。 Iba-1 シグナルによって占有される領域のパーセンテージをSCIの５日後にIba-1 組織 染色を用いて脊髄 小膠細胞/マクロファージの密度を判定するために計算した。それぞれの動物の病巣部位の中心からの少なくとも２つの切片を評価した (群あたりn =2-3 動物)。平均および平均の標準誤差(SEM)のIba-1 シグナルを判定し、結果を表25に示す。結果は、単回用量の LPM1dを2 時間において受け取った 動物(群 I) および３回用量のLPM1dをSCIの2、24、および48 時間後に受け取ったマウス (群 III) は媒体のみの対照と比較してそれぞれ細胞数における40% および 60% の低減を示した。これは統計的に有意であった(処理群の間のP<0.05の差、ランクに対する Kruskal-Wallis一元配置 ANOVA)。この実験において、2 時間および24 時間において２回用量のLPM1d を受け取った群 II のマウスはIba-1 陽性である細胞のパーセンテージにおいて対照 細胞と比較して有意差を示さなかった。
表25: SCIの５日後のIba-1 (%領域) 陽性 小膠細胞/マクロファージの密度
Figure 2011050388
実施例 9
異種移植モデルにおけるLPMの活性
乳癌におけるLPMの効果を確立された腫瘍 異種移植モデルを用いて評価した。雌性 胸腺欠損ヌード マウス (nu/nu) に 2500万の細胞 (0.2 mlのPBS/マトリゲル中)のエストロゲン依存性 乳癌 細胞株 MCF-7 (American Type Culture Collection (ATCC)、Manassas、VA)を注射し、２つの LPM 分子の腫瘍増殖に対する効果を評価した。
A.SDF-1β-SA1Var1 LPM
この研究において、SDF-1β-SA1Var1 LPM (配列番号216)を治療計画に用いた。この LPMは野生型 SA1 部分に結合した成熟 SDF-1β ケモカインを含む。100 μg/kg SDF-1β-SA1Var1 LPM または媒体 対照の腹腔内 投与をMCF-7 注射後7日目に開始し、21日目まで毎日継続した。腫瘍は31日目まで増殖を続けさせた。
1.腫瘍増殖
このマウス 異種移植モデルにおけるMCF-7 乳癌 細胞の進行の遅延におけるSDF-1β-SA1Var1の効果を腫瘍重量および腫瘍 体積により測定した腫瘍増殖の評価により判定した。SDF-1β-SA1Var1の非存在下では、7日目から (約 100 mm3から開始) 31日目まで腫瘍増殖は安定して増加し、28日目までに最大腫瘍 体積約 980 mm3に達した。100 μg/kgの用量でのLPMによるマウスの処理もまた腫瘍増殖の安定した増加をもたらした; しかし、腫瘍増殖の規模はLPMの非存在下よりも有意に小さかった。例えば、LPMの存在下では最大腫瘍増殖は28日目に達したが、最大 腫瘍 体積は約 500 mm3に達するのみであった。結果はマウスのLPMによる処理により、MCF-7 腫瘍増殖速度における統計的に有意な低下がもたらされたことを示す。試験動物からの最終腫瘍重量は平均35%低下し、最終 腫瘍 体積は対照と比べて41.5%低下した (有意性はp < 0.05 両側 t-検定を使用)。
2.炎症性浸潤
顕微鏡検査を用いて、このモデルにおける炎症性浸潤に対するSDF-1β-SA1Var1 LPMの効果を判定した。最後の用量のSDF-1β-SA1Var1 LPMをマウスに与えた後１０日目に (即ち31日目) 腫瘍を切り出し、 切片とし、顕微鏡検査により腫瘍の周辺の白血球 浸潤を評価した。細胞をヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色により可視化した。結果は、媒体のみで処理された動物と比較してLPMで処理された 動物の組織において36%細胞が少ないことを示し、これは統計的に有意であった。
3.CD-31 染色
組織学的検査により腫瘍内壊死および空胞形成の程度の可視化を可能とした。抗-CD-31 (ヤギ ポリクローナル PECAM-1 (クローン M-20)、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)を用いて、単球、好中球、血小板およびT 細胞亜集団の細胞 表面に発現している細胞 接着 分子であり糖タンパク質であるPECAM-1を可視化した。PECAM-1はまた、成体および胚内皮細胞の表面にも発現している。最後の用量のSDF-1β-SA1Var1 LPM をマウス に与えた１０日後に(即ち31日目)、腫瘍を切り出し、切片とし、抗-CD-31 抗体で染色した。 簡単に説明すると、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍標本切片を脱パラフィン処理し、水和させた。抗原賦活用緩衝液 (Target Retrieval Solution)(pH 9.0、DakoCytomation、Carpenteria、CA)中での熱誘導によるエピトープ修復の前処理を一次抗体 インキュベーションの前に用いた。内在性 ペルオキシダーゼ 活性は3% H2O2とのインキュベーションにより阻害され、非特異的 染色 をDAKO Protein Block Serum-Free (DakoCytomation、Carpenteria、CA)でブロックした。サンプルを1:800に希釈した一次(抗-CD-31) 抗体とともに30分間室温でインキュベートした。組織 切片を次いで1:400に希釈したビオチン化 ウサギ 抗-ヤギ 免疫グロブリン (Vector Laboratories、Burlington、CA)とともに30 分間 室温でインキュベートし、次いでDako Envision+ Rabbit System Labeled Polymer、HRP (DakoCytomation、Carpenteria、CA)を適用した。染色をLiquid DAB+ (DakoCytomation、Carpenteria、CA) で発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。いくらかの白血球 (組織学的 分析下での環状染色により可視化される)および内皮細胞 (細長い形状の細胞の染色により可視化される)はCD-31について陽性であると染色された。これらの結果は、増殖中の腫瘍における血管新生の存在を示した。逆に、SDF-1β-SA1Var1 LPM処理した腫瘍においてCD-31 染色が存在しなかったことは、マクロファージの非存在 (胸腺欠損 マウスは T 細胞を有さない)および腫瘍内内皮 細胞血管の非存在を示す。
4.Ki-67 染色
組織学的検査を用いて、最後の用量のSDF-1β-SA1Var1 LPMをマウスに与えた１０日後に (即ち31日目) ウサギ ポリクローナル 抗-Ki-67 抗体 (Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)による細胞の染色によりこのモデルにおいて細胞 増殖に対するSDF-1β-SA1Var1 LPMの効果を評価した。この抗原は細胞周期のすべての活動性の段階 (G1、S、G2 および M 期)において発現しているが、静止細胞 (G0-期)においては存在しない。Ki-67 抗原は細胞が非増殖状態に入ると迅速に分解し、DNA 修復工程の際にはKi-67の発現はみられない。簡単に説明すると、ホルマリン-固定パラフィン包埋 腫瘍 標本 切片を脱パラフィン処理し、水和させた。抗原賦活用緩衝液 (pH 9.0、DakoCytomation、Carpenteria、CA)中での熱に誘導されるエピトープ修復の前処理を一次抗体 インキュベーションの前に用いた。内在性 ペルオキシダーゼ 活性を3% H2O2とのインキュベーションにより阻害し、非特異的 染色をDAKO Protein Block Serum-Free (DakoCytomation、Carpenteria、CA)によりブロックした。サンプルを1:200に希釈した一次 (抗-Ki-67) 抗体とともに30分間室温でインキュベートした。組織 切片を次いで1:400に希釈したビオチン化 ヤギ 抗-ウサギ 免疫グロブリン (Vector Laboratories、Burlington、CA) とともに30 分間 室温でインキュベートし、次いで Dako Envision+ Rabbit System Labeled Polymer、HRP (DakoCytomation、Carpenteria、CA)を適用した。染色をLiquid DAB+ (DakoCytomation、Carpenteria、CA)により発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。Ki-67 染色によって示されるように多数の細胞が非処理腫瘍において増殖していた。対照的に、SDF-1β-SA1Var1 LPM 処理腫瘍では抗-Ki-67による染色はほとんど示されず、腫瘍 進行の低下を示した。さらに、視野における明らかな空胞によって示されるように多くの癌 細胞が壊死しているようであった。
B. MCP-1-SA1Var4 (LPM1d)
この研究において、MCP-1-SA1Var4 (LPM1d) を治療計画に用いた。腹腔内投与を7日目に開始し、コホートには以下のいずれかを与えた：媒体; (1) １回用量の 2 mg/Kg LPM1d、 7日目; (2) 2 mg/Kg LPM1d 、7、11、15および21日目または(3)100 μg/Kg LPM1d、7日目から 21日目まで毎日。腫瘍を32日目まで増殖させ続けた。 処理動物の体重における対照を含むコホート間のパーセント変化は0.5%を上回らなかった。
LPM1dの非存在下において、腫瘍増殖は7日目から32日目まで安定に上昇し、32日目には最大腫瘍 体積約 1500 mm3に達した。すべての投与計画でのマウスのLPMによる処理の結果、腫瘍増殖が安定に上昇した;しかし、腫瘍増殖の規模はLPM1dの非存在下と比較して有意に小さかった。MCP-1-SA1Var4 (LPM1d)による処理は、腫瘍 体積および重量により測定してMCF-7 腫瘍増殖における統計的に有意な低下を誘導した。すべてのLPM1d 処理群についての腫瘍増殖における低下は7日目から29日目まで同程度であったが、32日目には異なる LPM1d 処理群の腫瘍増殖に対する効果においていくらかの差がみられた。群1-3からの最終的な腫瘍重量は対照の41、58.6 および36% 低下した( p < 0.05 両側 t-検定により有意)。群1-3からの最終的な腫瘍 体積は対照の47、63 および40.4%低下した(p < 0.05 両側 t-検定により有意)。この研究は、単回または最小回の反復投与が腫瘍増殖の速度を有意に低下させるために十分であることを示す。
第２の MCF-7 異種移植 実験をLPM1dを用いて行った。最初の実験からの投与計画は同様の結果を与えた。さらなる投与計画は 処理が大きな増殖中の腫瘍 (より顕著な脈管構造を有する)に影響を与えるかどうか試験するために、LPM1dによる処理の前に腫瘍をまず~ 700 mm3 腫瘍 体積 ( ~ 100 mm3ではなく）まで増殖させるということを追加した。したがって腫瘍はLPM1dまたは媒体 対照の投与前、約27日まで増殖させた。動物は27日目から43日目まで４日に１回腹腔内 注射により100 μg/kg LPM1dによって処理した。LPM1dによる処理は、対照と比較して最初の注射の直後に腫瘍 体積を有意に低下させた(p < 0.05) 。この傾向は43日目まで続いた。
実施例 10
多発性硬化症の実験的自己免疫 脳脊髄炎 (EAE) 動物 モデルにおけるLPMdの活性
8-10-週齡のC57BL/6 雌性 マウス (Jackson Laboratory、Bar Harbor、Maine)を4 群 (Gr1-4)に分けた。EAEを誘導するために、群1および2 (n=9)に、0日目に尾の背側に、100 μlの完全フロイントアジュバント (Difco Laboratories、Detroit、MI)中に乳化した100 μgのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質 (MOG)33-55 ペプチド (Bernard et al. (1997) J Mol Med 75:77-88)を皮下注射した。これらのマウスには0日目および2日目に 腹腔内 (i.p.)用量の、200 μl のリン酸緩衝食塩水中の300 ngの再構成凍結乾燥 百日咳 毒素(Liu et al. (1998) Nat Med 4:78-83)も与えた。群1および2には、それぞれ、6日の毎日のバッファー (50 mM クエン酸ナトリウム バッファー、pH 6.2、0.05mM EDTAおよび10% v/v グリセロール)中のLPM1d (500 μg/kg)またはバッファーのみの注射(3-8日目)を与え、群3および4における対照 マウス (n=6)には、それぞれ、まったく注射を与えないか、または、6日の毎日の (3-8日目) 500 μg/kg LPM1dのみの注射を与えた。
動物を0から15の範囲のスケールにて疾患の評価を行うスコア付けシステムを用いて毎日評価した(Weaver et al.、2005)。 疾患 スコアは、尾およびすべての４本の四肢の状態の和である。尾については、スコア0は症候無し、1は半分麻痺した尾を表し、スコア 2は尾が完全に麻痺したマウスに与えられる。後足および前足のすべてについて、それぞれ別々に評価し、0 は症候無しを表し、スコア1 は弱いまたは変化した歩調を表し、2は運動麻痺を表し、スコア3は完全に麻痺した足を表す。したがって完全に麻痺した 四肢麻痺の 動物の スコアは14となる。死亡はスコア15で表される。結果は、対照 マウス (群3および 4)は麻痺を示さないことを示す。群 2のバッファーで処理されたEAE モデルは、注射後約 9日に開始する麻痺を示し、14日目までに平均 臨床スコアが6を超えるまで直線的に上昇した。処理した EAE 動物は麻痺を生じ始めたが、10日目において平均 スコアは約 4を下回り、12日目には対照 レベルまで低下し (0付近)そして、13日目にはそのままであった。
多発性硬化症の急性 実験的 自己免疫 脳脊髄炎 (EAE) モデルにおいて、OPL-CCL2-LPMは疾患過程に対して劇的な効果を有していた。疾患の発症および重篤度はそれぞれ顕著に遅延および低減された。この研究において、動物を毎日媒体またはLPMで3-8日目に処理した。 対照および被験動物は10日目に予測されたように疾患の最初の発症を示した。 その後、疾患の臨床重篤度スコアは処理動物において０に回復し (疾患の挙動的兆候なし)、一方、対照動物 (臨床重篤度 スコア6-10を示す) では続く４日間続いた。
平均臨床重篤度 スコア(スケール上もっとも近い0.5に含めた)
Figure 2011050388
 注射を受けなかったまたは媒体のみを与えられた動物(疾患無し)は一貫してスコア０とした。
実施例 11
OPL-CCL2-LPMを抗-胸腺細胞 血清 (ATS)-誘導性メサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルにおいて試験した。雄性ラットにATSを0日目に注射し、媒体、50または100μg/kgの組換えタンパク質 Q2Dで、2日目から8日目まで静脈内処理した。尿 および血液 収集を、ATS 注射の前および5および9日目に行った。動物を9日目に屠殺した。体重または臨床毒性の兆候に対する処理に関連する効果は観察されなかった。尿 タンパク質 レベルは処理された動物において低下していた。腎臓 切片の組織病理的分析により、腎糸球体病変、M/M 数、フィブロネクチンおよびα-平滑筋アクチンについて、それぞれ40、36、38、および28%の最大の低減が明らかとなった。最後の２つのタンパク質はそれぞれ細胞外マトリックス 合成およびメサンギウム細胞 活性化についてのマーカーである。これらの結果は、腎炎のこのモデルにおける顕著な腎臓保護効果を示し、ケモカイン-リガンド 毒素が疾患の治療において利用できることを示す。
改変は当業者に明らかであろうから、添付の請求の範囲によってのみ本発明は制限されることが意図される。

Claims (25)

  1. 以下の工程を含む、毒性が低下した改変リボゾーム不活性化タンパク質(RIP)またはその活性の断片を選択する方法:
    a)RIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
    b)細胞を培養する工程;
    c)生育した細胞を単離する工程;
    d)生育した細胞のなかから、生育し、RIP、またはその活性の断片を発現する細胞を単離する工程、ここで、RIPまたは断片は、工程a)において導入された核酸分子によってコードされるものと比較して改変を含む；および
    e)単離された細胞において発現された改変RIP、またはその活性の断片を同定または単離または精製する工程。
  2. 工程b)において、細胞がRIP阻害剤を含まない培地で培養される請求項１の方法。
  3. 工程c)またはd)の後に、さらに以下の工程を含む請求項１または２の方法:
    RIPを発現する単離された細胞を拡張させる工程。
  4. 工程b)においてRIP阻害剤である選択的モジュレーターの存在下で細胞を培養することをさらに含む請求項１の方法。
  5. RIP阻害剤がアデニン類似体である請求項４の方法。
  6. RIPが志賀毒素であり、アデニン類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4-APP)である請求項５の方法。
  7. 細胞が原核細胞である請求項１〜６のいずれかの方法。
  8. 導入された核酸分子によってコードされるRIPが、I型RIP、またはその活性の断片であるか、または、II型RIP、その触媒サブユニット、またはその活性の断片である請求項１〜７のいずれかの方法。
  9. RIPが、ジアンチン30、ジアンチン32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAPII、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジンII、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン、モモルディン-II、モモルディン-Ic、ミラビリス属抗ウイルスタンパク質(MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIPI、オオムギRIPII、トリチン、アマRIP、トウモロコシRIP 3、トウモロコシRIP 9、トウモロコシRIPX、アスパリン-1、およびアスパリン2から選択されるI型RIPであるか、または、
    RIPが、志賀毒素(Stx)、志賀様毒素II(Stx2)、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択されるII型RIPである、
    請求項８の方法。
  10. さらに以下の工程を含む、請求項１〜９のいずれかの方法:
    a)同定されたRIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
    b)RIP阻害剤の存在下で細胞をインキュベートする工程、ここでRIP阻害剤の量が、RIPポリペプチドの毒性を低減するように選択される;および、
    c)RIPまたはその活性の断片が生産される条件下で細胞を培養する工程;および、
    d)工程c)のRIPを精製する工程。
  11. 以下の工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質(RIP)、またはその活性の断片の宿主細胞における生産を上昇させる方法:
    a)RIP、またはその活性の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入する工程、ここで、RIPをコードする核酸分子が、リガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより該分子がリガンド-毒素複合体をコードする;
    b)RIP阻害剤の存在下で細胞をインキュベートする工程、ここでRIP阻害剤の量がRIPの毒性を低減するように選択される;および、
    c)RIP阻害剤の非存在下で培養された場合と比べて、RIP、またはその活性の断片がより多い量にて生産される条件下で細胞を培養する工程。
  12. 工程c)のRIPを精製する工程をさらに含むことにより、発現または精製またはその両方をされたRIPの量が、RIP阻害剤の非存在下での量よりも多くなる請求項１１の方法。
  13. 導入された核酸によってコードされるRIPが、I型RIP、またはその活性の断片であるか、または、II型RIP、その触媒サブユニットまたはその活性の断片である、請求項１１または１２の方法。
  14. RIPが、ジアンチン30、ジアンチン32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAPII、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン、モモルディン-II、モモルディン-Ic、ミラビリス属抗ウイルスタンパク質(MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギRIPI、オオムギRIPII、トリチン、アマRIP、トウモロコシRIP3、トウモロコシRIP9、トウモロコシRIPX、アスパリン-1、およびアスパリン2から選択されるI型RIPであるか、または、
    RIPが、志賀毒素(Stx)、志賀様毒素II(Stx2)、志賀様毒素I、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択されるII型RIPである、
    請求項１３の方法。
  15. RIP阻害剤がアデニン類似体である請求項１４の方法。
  16. アデニン類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4-APP)である請求項１５の方法。
  17. 宿主細胞が大腸菌である請求項１〜１６のいずれかの方法。
  18. リガンド-毒素複合体が融合タンパク質である請求項１１〜１７のいずれかの方法。
  19. リガンド-毒素複合体におけるリガンドが、ケモカイン受容体標的化剤、非ケモカインサイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNFスーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体(PRR)リガンドから選択される；および/または
    ケモカイン受容体標的化剤が、ケモカイン、またはケモカイン受容体に結合するケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、または該受容体に結合する抗体の断片である請求項１１〜１８のいずれかの方法。
  20. ケモカイン受容体標的化剤が、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β(SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ阻害タンパク質1α(MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES)タンパク質、インターロイキン-8(IL-8)、増殖制御タンパク質α(GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質10(IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン(MDC)、顆粒球走化性タンパク質2(GCP-2)、上皮由来好中球活性化タンパク質78(ENA-78)、血小板塩基性タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン(MIG)、血小板因子4(PF-4)、ヘモフィルトレートCCケモカイン1(HCC-1)、胸腺および活性化制御ケモカイン(TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現ケモカイン(LEC)、エクソダス-2(SLC)、胸腺発現ケモカイン(TECK)、皮膚T-細胞誘引ケモカイン(CTACK)、粘膜関連上皮ケモカイン(MEC)、シングルCモチーフ1-β(SCM-1β)、インターフェロン誘導T-細胞アルファ化学誘引物質(I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン(BRAK)、フラクタルカイン、およびB細胞-誘引ケモカイン1(BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択されるケモカインである、請求項１９の方法。
  21. RIP が、改変志賀毒素または改変を含むその活性の断片である請求項１１〜２０のいずれかの方法。
  22. リガンド-毒素複合体が配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、または67のいずれかに示すアミノ酸 残基の配列を含む請求項１１〜２１のいずれかの方法。
  23. 同定されたRIPを含む複合体を調製することをさらに含む請求項１１〜２２のいずれかの方法。
  24. 毒素が志賀毒素サブユニットA1(SA1)である請求項１〜２３のいずれかの方法。
  25. SA1が、配列番号22または24に示すアミノ酸残基の配列を含む、請求項２４の方法。
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