MX2008013363A - Metodos y composiciones basados en la proteina tipo 1 de la toxina shiga. - Google Patents

Abstract

La invención se basa en el descubrimiento del epítopo en la proteína Stxl para el anticuerpo 13C4. La invención presenta polipéptidos Stxl que no son de longitud completa que incluyen el epítopo para el epítopo de anticuerpo monoclonal 13C4. La invención también presenta métodos para producir anticuerpos anti-Stxl específicos para el epítopo 13C4 de la proteína Stxl. Adicionalmente, la invención presenta métodos para tratar un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, una enfermedad asociada con toxina Shiga (v.gr., síndrome de uremia hemolítica y enfermedades asociadas con infección por E. coli y S. dysenteriae) con un polipéptido que incluye el epítopo 13C4 o con un anticuerpo anti- Stxl desarrollado usando los métodos de la invención. Adicionalmente, la invención presenta la detección de Stxl en una muestra usando los anticuerpos desarrollados usando los métodos de la invención.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES BASADOS EN LA PROTEINA TIPO 1 DE LA TOXINA SHIGA Antecedentes de la Invención En general, esta invención se refiere al campo de tratamiento y prevención de enfermedades asociadas con la toxina Shiga . En los Estados Unidos de América, la Escherichia coli que produce la toxina Shiga (Stx) (STEC, por sus siglas en inglés) cuenta para alrededor de 110,000 infecciones por año. La E. coli enterohemorrágica (EHEC, por sus siglas en inglés) , más notablemente el serotipo 0157 :H7, es un subconjunto de STEC que se nota para producir enfermedad mediada por Stx. Una posible complicación a partir de una infección con un organismo que produce Stx es el síndrome hemolítico urémico (HUS, por sus siglas en inglés) , que se caracteriza por anemia hemolítica, trombocitopenia trómbica, e insuficiencia renal. Hay aproximadamente una relación de fatalidad del 5-10% para aquellos con HUS y los supervivientes pueden tener daño renal duradero. Actualmente no hay terapia o vacunas aprobadas por la FDA para combatir o prevenir el malestar de una enfermedad mediada por Stx, pero varias opcionales prometedoras para el futuro incluyen: un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a y neutraliza Stx2 y un toxoide StxA2/StxBl quimérico que produce una respuesta neutral izante y proporciona protección contra una prueba de exposición letal de Stxl o Stx2 o Stxl y Stx2. Hay esencialmente dos tipos principales de Stxs : Stx/Stxl y Stx2. La Stx se produce a partir de Shigella dysente-ríae tipo 1, mientras que Stxl y Stx2 se producen de Escherichia coli. La Stx y Stxl son virtualmente idénticas, sólo con un aminoácido de diferencia en la subunidad A. Las subunidades A y B maduras de Stxl y Stx2 tienen una similitud del 68 y 73%, respectivamente. A pesar de las diferencia de la secuencia de aminoácidos, las estructuras de cristal de Stx y Stx2 son remarcablemente similares (Figura 1) . Estas toxinas pueden diferenciarse por antisuero policlonal: el anticuerpo policlonal producido contra Stxl no neutraliza Stx2 y viceversa. Las variantes .de Stxl y Stx2 existen e incluyen Stxlc, Stxld3 Stx2c, Stx2d, Stx2d-activable (Stx2-act.), Stx2e, y Stx2f. Las toxinas Shiga son holotoxinas en complejo con una estructura AB5. El dominio activo (A) , contiene una N-glicosidasa que despuriniza el 28S ARNr de la subunidad ribosomal 60S, lo que detiene la síntesis de la proteína y eventualmente lleva a la muerte celular. La subunidad A es de -32 kDa y se desdobla proteolíticamente por tripsina o furina en una subunidad de -28 kDa A-L y un péptido de -5 kDa A2 que se conectan a través de un solo enlace de disulfuro. La subunidad Ax contiene el dominio •activo, y el péptido A2 hace en extensiones laterales no covalen-temente el dominio activo al dominio de enlace. El dominio de enlace (B) consiste de cinco monómeros idénticos de -7.7 kDa que forman un pentámero a través del cual atraviesa la terminal C del péptido A2. Cada uno de los monómeros de subunidad B tiene dos residuos de cisteína que forman un enlace de disulfuro dentro de cada monómero (Figura 2) . El pentámero B enlaza la ceramida de globotriaosilo del receptor eucariótico (Gb3) (o Gb4 como sea el caso para Stx2e) . A pesar de este conocimiento acerca de los resultados de la exposición a estas toxinas, actualmente no hay una cura o vacuna conocida para HUS . El uso de antibióticos puede exacerbar la situación al incrementar la liberación de toxina de la bacteria. De esta manera, hay una necesidad para un compuesto que prevenga o trate las complicaciones de EHEC producida por la toxina Shiga . Tal compuesto podría usarse para tratar sujetos infectados y reducir los efectos sistémicos de la toxina en el SNC, sangre, y ríñones. Además, si la toxina pudiera neutralizarse, los antibióticos se darían seguramente para eliminar la bacteria en el tracto GI . Tal compuesto podría también usarse para prevenir complicaciones infecciosas, al tratar individuos expuesto o de alto riesgo antes de adquirir la infección por EHEC. Tales individuos incluirán niños en guarderías o adultos mayores en asilos, donde se ha identificado un caso de diarrea por EHEC. Estos individuos están en riesgo incrementado de desarrollar EHEC, frecuentemente con varias complicaciones, y la expansión de EHEC en estos ambientes no es inusual .

Compendio de la Invención El anticuerpo monoclonal (MAb) 13C4 reconoce la subunidad B de Stxl y neutraliza su citotoxicidad . A pesar de la similitud de la secuencia de aminoácidos del 73% (aa) entre StxBl y StxB2, el MAb 13C4 MAb no enlaza a StxB2. Se ha descubierto que el epítopo 13C4 abarca regiones de disimilitud entre StxBl y StxB2. El MAb 13C4 reconoce un epítopo discontinuo o conformacio-nal que se extiende por tres regiones en el monómero StxBl y requiere residuo 55. Las tres regiones de disimilitud, (aa 1-6 (SEQ ID No: 1), 25-32 (SEQ ID NO : 2 ) y 54-61 (SEQ ID NO: 3)), se encuentran para localizarse cerca cada una de otra en la estructura de cristal de StxB (StxB es idéntica a StxBl) . Cada una de las dos regiones de flanqueo (1-6, 54-61) contienen un residuo de cisteína. El epítopo 13C4 por lo tanto incluye al menos uno, dos, o las tres de las secuencias establecidas en la SEQ ID NOs : 1, 2, y 3. De conformidad, la invención muestra un método para producir anticuerpos anti-Stxl (v.gr. , anticuerpos monoclonales y policlonales) y fragmentos de anticuerpo que enlazan específi-camente al epítopo 13C4 de Stxl. Tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se enlazan específicamente a Stxl y no a Stx2. Este método incluye la inmunización de un mamífero con un polipéptido que incluye un fragmento de Stxl (es decir, no toda la longitud Stxl) que incluye al menos uno, dos o tres de las tres secuencias establecidas en las SEQ ID NOs : 1, 2, y 3, donde este polipéptido no incluye Stxl de longitud completa. Preferentemente el método incluye el uso de Stxl que incluye las SEQ ID NOs : 1 y 3. En una forma de realización, el método incluye inmunización del mamífero con un polipéptido substancialmente idéntico a la secuencia del aminoácido establecido en la SEQ ID NO: 4, que incluye las SEQ ID NOs : 1 , 2 y 3. Los anticuerpos anti-Stxl pueden seleccionarse usando métodos estándar conocidos en la materia o descritos en la presente incluyendo, por ejemplo, el ensayo de neutralización in vitro descrito en la presente, para identificar anticuerpos que enlazan específicamente a Stxl y no Stx2. El polipéptido inmunógeno, y métodos para preparar este polipéptido, junto con la molécula del ácido nucleico que codifica este polipéptido (incluyendo donde este ácido nucleico se liga a una construcción de expresión en un vector, y donde este vector se inserta en una célula hospedera) , también se incluyen como aspectos relacionados de la invención. Esta invención muestra también anticuerpos anti-Stxl que enlazan específicamente al epítopo 13C4 de Stxl, donde los anticuerpos enlazan específicamente a Stxl y no Stx2. Los anticuerpos preferidos de la invención se enlazan a un epítopo que incluye al menos uno, dos o todos los tres de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 1, 2 y 3, preferentemente para un sitio de enlace formado por las SEQ ID NOs: 1 y 3, y más preferentemente que contienen las tres. El epítopo puede ser un epítopo conformacional donde las secuencias del aminoácido se basan en la proximidad en la conformación del polipéptido Stxl que incluye el epítopo o una proteína quimérica Stx 2 que contiene las 3 regiones del epítopo (SEQ ID NOs : 1 , 2 y 3) presente en la proteína Stxl. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos IgG, IgM, IgE, IgD, IgA, Fab, Fv, monoclonales y policlonales , o fragmentos de anticuerpo y pueden desarrollarse por los métodos descritos en la presente. Los anticuerpos preferentemente enlazan Stxl con una Kd de menos de 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, o 1 pM o menos. En un ejemplo, el anticuerpo de la invención inhibe enlaces del anticuerpo 13C4 a Stxl o una proteína quimérica que contiene el epítopo 13C4, incluyendo una inhibición con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. También, son deseables, los anticuerpos inhibidores Stxl que enlazan al receptor eucariotico globotriaosil ceramida (Gb3 ) . Los anticuerpos anti-Stxl de la invención no pretenden incluir formas de ratón, humanizadas o quiméricas de los anticuerpos 13C4, 5-5B monoclonal, o 2H3. La invención incluye además una línea celular de hibridoma que produce cualquiera de los anticuerpos de la invención. Otro aspecto de la invención es una composición para estimular una respuesta inmune contra Stxl usando al menos un péptido, donde el péptido incluye, al menos uno, dos o tres de las secuencias establecidas en la SEQ ID NOs : 1, 2, y 3 y donde el péptido no es Stxl de longitud completa. La composición además puede incluir un adyuvante. Deseablemente, el péptido incluye una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos señalada en la SEQ ID NO : 4 , o un fragmento de la misma. La invención también muestra el uso de un péptido quimérico incluyendo un epítopo 13C4 (v.gr. , un péptido quimérico que contiene al menos uno, dos o todos los tres de las SEQ ID NOs : 1 , 2, o 3 insertadas en una proteína de andamiaje tal como StxB2) . Este péptido puede usarse para inmunizar contra o para tratar cualquier toxina asociada con enfermedad incluyendo síndrome de uremia hemolítica y enfermedades asociadas con infección por E. coli y S. dysenteriae . Aún otro aspecto de la invención muestra un método para detectar Stxl en una muestra biológica (v.gr., tejido, célula, extracto de célula, fluidos corporales y biopsia) usando cualquiera de los anticuerpos de la invención. La detección de métodos de la invención incluyen ELISA, RIA, western blot, inmunoprecipitación, y citometría de flujo. La invención incluye el diagnóstico de una enfermedad asociada con toxina Shiga basada en la identificación de Stxl en una muestra. La invención incluye también una kit de prueba inmunológica para detectar una enfermedad asociada con toxina Shiga, el kit incluyendo un anticuerpo de la invención y un medio para detectar el anticuerpo. Aún otro aspecto de la invención muestra un método para tratar una enfermedad asociada con toxina Shiga usando un anticuerpo producido por cualquiera de los métodos anteriores. Ejemplos de enfermedad asociada con toxina Shiga incluyen síndrome de uremia hemolítica (HUS) y enfermedades asociadas con infección por E. coli y S. dysenteriae . Estos anticuerpos pueden administrarse en combinación con otras terapias, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos que enlazan específicamente otra toxina Shiga asociada con proteínas (v.gr., Stx2) . Por "epítopo 13C4" se entiende una secuencia de aminoácidos que, ya sea como un resultado de estructura lineal o conformación de tres dimensiones, forman el sitio de enlace para el anticuerpo 13C4. Este término significa incluir cualquier proteína Stxl sin longitud completa que incluye secuencias substancialmente idénticas a uno, dos o tres de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs : 1 , 2 y 3 (v.gr., SEQ ID NOs : 1 y 2, SEQ ID NOs: 2 y 3, SEQ ID NOs : 1 y 3, y SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3) . Un ejemplo de una proteína que incluye un epítopo 13C4 es una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO : 4. Por los términos "anticuerpo que enlaza específicamente al epítopo 13C4 de Stxl" o "anticuerpo específico del epítopo 13C4" se entiende un anticuerpo que enlaza a una proteína Stxl que incluye el epítopo 13C4 con un valor Kd de entre 100 nM-1 p . Tales anticuerpos también se caracterizan por enlaces pequeños o no detectables para la proteína Stx2 (v.gr., que tiene un valor Kd de más de 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1 µ?, ?? µ?, 100 µ?, l mM o mayor para Stx2) . Las afinidades del anticuerpo pueden determinarse usando cualquiera de los ensayos conocidos en la materia incluyendo, pero no limitado a, ensayos basado en resonancia de plasmón de superficie, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) , y ensayos de competencia (por ejemplo RIA) . También, el anticuerpo puede someterse a un ensayo de neutralización in vitro como se describe en la presente. Un anticuerpo que específicamente enlaza a el epítopo 13C4 neutralizará el efecto citotóxico de Stxl por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, o mas, usando los ensayos descritos en la presente o conocidos en la materia. Por "inhibir el enlace" se entiende para ocasionar una disminución de una proteína enlazada a otra por al menos 50%, preferentemente 60%, 70%, 80%, 90%, o más, según se mide, por ejemplo, por ELISA o el ensayo de enlace del receptor Gb3 descrito en la presente. El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (v.gr. , anticuerpos biespecífieos) , o fragmentos de anticuerpo, provisto que tales moléculas posean una actividad biológica deseada (v.gr., neutralización de la toxina Stxl como se describe en la presente) . Por "aislado" se entiende una proteína que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interferirían con diagnósticos o usos terapéuticos para la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos . Por "Stxl sin longitud completa" se entiende una proteína que contiene menos de 90%, 80%, 70%, 60%, o menos aminoácidos del polipéptido Stxl de longitud completa. Por "substancialmente idénticas" se entiende un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos que, cuando se alinean de manera óptima, por ejemplo usando los métodos descritos a continuación, comparte al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con un segundo ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, por ejemplo, a Stxl, Stx2 , o proteína quimérica tal como una de la establecida en la SEQ ID NO:4. "Identidad substancial" puede usarse para referirse a varios tipos y longitudes de la secuencia, tal como secuencia de longitud completa, epítopos o péptidos inmunógenos, dominios funcionales, secuencias de codificación y/o regulatorias , exones, intrones, promotores, y secuencias genómicas. El porcentaje de identidad entre dos polipéptidos o secuencias de ácido nucleico se determina en varios medios que están dentro del estado de la técnica, por momentos, usando software de computadora disponible al publico tal como Alineación Smith Waterman (Smith, T. F. y . S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-7); "Best Fit" (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics , 482-489 (1981)) como se incorpora en GeneMatcher Plu, Schwarz y Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., editor, pp 353-358; programa BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica; (Altschul, S. F., W. Gish, y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10), BLAST- 2 , BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, o software Megalign (DNASTAR) . Además, .los técnicos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquiera de los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud de las secuencias siendo comparadas. En general, para proteínas, la longitud de comparación de secuencias puede ser al menos de 6 aminoácidos, preferentemente 10, 20, 30, 40, 50, 60, o 70 aminoácidos o más hasta la longitud entera de la proteína. Para ácidos nucleicos, la longitud de comparación de secuencias generalmente puede ser al menos de 18, 25, 50, 100, 150, o 200 nucleótidos o más hasta la longitud entera de la molécula del ácido nucleico. Se entiende que para los propósitos para determinar la identidad de secuencia cuando se compara una secuencia de ADN a una secuencia de ARN, un nucleótido timina es equivalente a un nucleótido uracilo. Las substituciones conservadoras incluyen típicamente substituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina , tirosina.

Por "fragmento" se entiende una porción de un polipép-tido o molécula de ácido nucleico que contiene, preferentemente, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más de la longitud entera de la molécula o polipéptido de ácido nucleico referente. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, o más nucleótidos o 10, 20, 30, 40, 50, 60, o 70 aminoácidos o más. Los. fragmentos de proteína de toxina Shiga tipo 1 o toxina Shiga tipo 2 pueden incluir cualquier porción que sea menor de la proteína de longitud completa (poner en el tamaño de longitud completa como un punto de referencia y luego longitudes ejemplares específicas) . Los fragmentos también pueden incluir subunidades Stxl o 2 tales como Stx Bl y B2. Por "enfermedad asociada con toxina Shiga" se entiende cualquier enfermedad resulta-nte de un patógeno que expresa una toxina Shiga. El término "enfermedad asociada con toxina Shiga" se entiende para incluir síndrome de uremia hemolítica, shigelo-sis, y enfermedades resultantes de infección Escherichia coli y S. dysenteriae produciendo toxina Shiga. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra la estructura de cristal de Stx y Stx2. La figura 2 muestra la estructura de toxina Shiga general . La figura 3 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las proteínas Stx indicadas. La figura 4 muestra un western blot mostrando un reconocimiento Mab 13C4 de la subunidad B. La subunidad B carboxamidometilada (carriles 1) , la subunidad B desnaturalizada en solución amortiguadora de muestra no reducida (carriles 2) , y subunidad B desnaturalizada en la presencia de ß-mercaptoetanol (carriles 3) se analizaron por SDS-Page, seguido por tinción con azul de Coomassie (A) o Western blot con Mab 13C4 (B) o con antisuero para péptido 1-25 (C) (Boyd y colaboradores (1991) Infect. Immun. 59:750-757)). La figura 5A muestra la alineación del aminoácido de StxB2 y StxBl . Los aminoácidos subrayados representan aminoácidos no conservados. Los aminoácidos StxBl indicados restantes se conservan y los puntos indican identidad. Las regiones de secuencia etiquetadas 1, 2, y 3 corresponden a la SEQ ID NO : 1 (TPDCVT) , SEQ ID NO : 2 (GDKELFTN) , y SEQ ID NO : 3 (TNACHNGG) respectivamente. Los tres segmentos de la 13C4 MAb están en cajas en el panel A e indicados por el número en la figura 5B. Estos segmentos, cuando se insertan en la proteína StxB2 forma la secuencia de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO : 4 (TPDCVTGKIEFSKYNEDDTFTVKVGDKELFTNRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIKTNACHNGGG FAEVQFNND) . Las tres diferencias de aminoácidos entre StxBl y StxBld están debajo de la secuencia StxBl; la última estrella indica el residuo de asparagina critico. La figura 5B muestra la vista inferior y de lado de la estructura de cristal de pentámero StxB. Las flechas indican los dos residuos de cisteína que generan el enlace de bisulfuro. La figura 6 muestra una ilustración de proteínas StxBl /StxB2 quiméricas. El StxBl se muestra en negro, Stx2 se muestra en blanco, mientras las seis etiquetas de histidina se manchan. Las regiones de StxBl se enlistan bajo las subunidades B quiméricas. Los dos residuos de cisteína en cada subunidad B se caracterizan por barras anteriores de las subunidades B. La figura 7 muestra una análisis western blot de proteínas StxBl/StxB2 quiméricas (panel superior), y StxBl con mutaciones de aminoácido sencillo (panel inferior) probado con a-6 His MAb o a-13C4 MAb (panel inferior) . Panel superior: carril 1, 100 ng Stxl ; carril 2, solamente vector; carril 3, StxBl; carril 4, StxB2 ; carril 5, StxBl = 1-6; carril 6, StxBl = 25-32; carril 7, StxBl = 54-61 ; carril 8, StxBl = 25-32, 54-61, carril 9, StxBl = 1-6, 25-32; carril 10, StxBl = 1-6, 54-61, carril 11, StxBl = 1-6, 25-32, 54-61. Panel inferior: carril 1, 100 ng Stxl; carril 2, solamente vector; carril 3, StxBl; carril 4, StxBl TIA; carril 5, StxBl G25A; carril 6, StxBl N55T. La figura 8 muestra una alineación del aminoácido de las subunidades B de Stxl, Stxlc y Stxld (SEQ ID NO:9). Los 20 aminoácidos lideran la secuencia que se remueve para generar la proteína madura se subraya en Stxl.' Las tres diferencias del aminoácido entre StxBl y StxBdl están en cajas. Las flechas indican un residuo de aminoácido conservado y los residuos de aminoácido Stxlc y Stxld indicados restantes están aminoácidos no conservados. Los puntos indican aminoácidos idénticos. La figura 9 es una gráfica que muestra que 13C4 MAb inhibe el enlace de Stxl a Gb3 de una manera dependiente de la dosis. Los círculos individuales representan promedios de dos experimentos realizados en triplicado, y las barras de error indican desviaciones estándar ( +/- 1) . La línea sólida representa la estructura (1 µg de Gb3 más 1,000 pg de Stxl y anticuerpo secundario sin anticuerpo primario) , mientras la línea discontinua representa Stxl enlazado sin adición del 13C4 MAb. O.D. 600, densidad óptica a 600 mn. Descripción Detallada de la Invención En general, la invención muestra la producción de anticuerpos que enlazan específicamente al epítopo 13C4 de la proteína Stxl. Se ha descubierto el epítopo 13C4 y ha encontrado que este epítopo incluye al menos uno, dos o tres de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs : 1 , 2 y 3. También se ha descubierto que un sujeto que tiene, o en riesgo de desarrollar, una enfermedad asociada con toxina Shiga (v.gr., síndrome de uremia hemolítica y enfermedades asociadas con infección de E. coli y S. dysenteriae) pueden tratarse con un péptido que contiene el epítopo 13C4 o con anticuerpos que enlazan específicamente a el epítopo 13C4 de la proteína Stxl. I . Indicaciones Los compuestos y métodos de la invención son útiles para tratar sujetos que tienen, o están en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con la toxina Shiga . Tales sujetos incluirían niños en guarderías o adultos mayores en residencias geriátricas . En un ejemplo, el sujeto en guarderías o residencias geriátricas donde un caso de diarrea EHEC se ha detectado. En este ejemplo, el sujeto puede o no puede tener desarrollo de la enfermedad. Las enfermedades asociadas con toxina Shiga incluyen aquellos que resultan de la infección con toxina que producen S. dysenteriae o E. coli enterohemorrágica (EHEC) , más notablemente el serotipo 0157 :H7. Estas infecciones a menudo resultan en síndrome de uremia hemolítico (HUS) , las cuales se caracterizan por anemia hemolítica, trombocitopenia trombótica, e insuficiencia renal . II . Anticuerpos La invención incluye la producción de anticuerpos que se unen específicamente al epítopo 13C4 de la proteína tipo I de toxina Shiga (Stxl) . De forma deseable, tal anticuerpo no se une de forma detectable a Stx2. La capacidad única de los anticuerpos para reconocer y unirse específicamente a las proteínas objetivo proporciona enfoques para tanto diagnóstico como tratamiento de enfermedades relacionadas a Escherichia coli que produce la toxina Shiga (STEC) . La invención se proporciona para la producción de anticuerpos, incluyendo, pero no limitados a, anticuerpos policlonales y monoclonales , anticuerpos anti-idiopáticos, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecífieos , dímeros o tetrámeros de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla (v.gr., fragmentos de anticuerpo unidos al scFv y antígeno tales como Fabs, diacuerpos, y fragmentos Fab' ) , regiones unidas recombinantes basadas en regiones unidas de anticuerpo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos primatizados , anticuerpos humanizados y completamente humanos, anticuerpos de dominio eliminado, y anticuerpos etiquetados con un marcador detectable, o acoplados con una toxina o radionucleótido . Tales anticuerpos se producen por métodos convencionales conocidos en la materia. En un aspecto, la invención incluye la preparación de anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo que se une específicamente al epítopo 13C4 de Stxl donde la preparación incluye el uso de un fragmento de longitud no completa de Stxl que contiene al menos una, dos, o tres secuencias seleccionadas de las secuencias establecidas en las SEQ ID. Nos:l, 2, o 3. Un ejemplo de tal fragmento es la proteína de SEQ ID NO : 4. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales pueden prepararse al inmunizar conejos u otros animales al inyectar antígeno seguido por estimulaciones posteriores a intervalos apropiados. Los animales se hacen sangrar y los sueros se ensayan contra proteína purificada usualmente por ELISA. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente al epítopo 13C4 pueden producirse en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (SC) o intraperitoneales (IP) del antígeno y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeho o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos objetivo a una proteína que es inmunógena en las especies para inmunizarse (v.gr., hemocianina de una variedad de lapa, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de frijol de soya) usando un agente bifuncional o de derivación (v.gr. , éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído , o anhídrido succínico) . Por ejemplo, los animales pueden inmunizarse contra el epítopo 13C4, conjugados inmunogénicós , o derivados al combinar 1 de 1 mg del péptido o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde los animales se estimulan con 1/5 hasta 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en sitios múltiples. Siete hasta 14 días más tarde, los animales se hacen sangrar y el suero se evalúa para concentración de anticuerpo al antígeno o un fragmento del mismo. Los animales se estimulan hasta estabilizar la concentración. Preferentemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo polipéptido, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, los agentes de agregación tales como alumbre se usan apropiadamente para aumentar la respuesta inmune . Los policlonales quiméricos, humanizados, o completamente humanos pueden producirse en animales transgénicos para genes de inmunoglobulina humana, o al aislar dos o más B-linfocitos reactivos Stxl de un sujeto para materia prima. Los policlonales también pueden purificarse y seleccionarse para (tal como a través de afinidad para un péptido de antígeno conformacionalmente contraído) , iterativamente si es necesario, para proporcionar un anticuerpo monoclonal . Alternativamente o adicionalmente , puede emplearse la codificación del ácido nucleico que codifica un solo anticuerpo de un linfocito. Anticuerpos Monoclonales En otra forma de realización de la invención, se obtienen anticuerpos monoclonales de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos (esto es, los anticuerpos individuales incluyendo las poblaciones son idénticas excepto por las posibles mutaciones que se presentan naturalmente que pueden presentarse en cantidades menores) . De esta manera, el término monoclonal indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse por métodos conocidos en la materia, tales como el método de hibridoma de Kohler y Milstein al fusionar bazocitos de ratones inmunizados con células de tumor continuamente replicadas tales como células de mieloma o linfoma. (Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497; Gulfre y Milstein (1981) Methods in Enzymo-logy: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone y Banatis eds . , Academic Press) . Las células de hibridoma se clonan entonces al limitar los métodos de dilución y sobrenadantes evaluados para producción de anticuerpo por ELISA, RIA, o bioensayos . En otra forma de realización, los monoclonales pueden hacerse por métodos de ADN recombinante . Para la preparación de anticuerpos monoclonales (Mabs) que unen específicamente el epítopo 13C4, cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo puede usar. Por ejemplo, la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein ((1975) supra, así como en Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol . 6:511-519; Kohler y colaboradores (1976) Eur. J. Immunol . 6:292-295; Hammerling y colaboradores (1981) en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., pp . 563-681), y la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor y colaboradores (1983) Immunol. Today 4:72-79), y la técnica EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores (1985) en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp . 77-96). Tales anticuerpos puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. El hibridoma que produce los abs en la invención puede cultivarse in vitro o in vivo. En una forma de realización adicional de la invención, los anticuerpos monoclonales pueden producirse en animales libres de gérmenes utilizando tecnología conocida en la materia. En general, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster, se inmuniza con el polipéptido que incluye el epítopo 13C4 para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que pueden unirse específicamente al antígeno o fragmento del mismo usado para inmunización. Alternativamente, los linfocitos se inmunizan in vitro. Los bazocitos del animal hospedero inmunizado (v.gr., un ratón) se extraen y fusionan con una línea celular de mieloma apropiada usando un agente de fusión apropiado, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, p . 59-103, Academic Press) . Cualquier línea celular de mieloma apropiada puede emplearse de acuerdo con la presente invención; sin embargo, las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción a alto nivel estable de anticuerpo por las células que producen el anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center (Centro de Distribución de Células del Instituto Salk) , San Diego, California, Estados Unidos, y células SP-2 disponibles del American Type Culture Collection (Colección de Cultivos de Tipo Americano) , Rockville, Maryland, Estados Unidos . Las células de hibridomas de esta manera preparadas pueden sembrarse y hacerse crecer en un medio de cultivo apropiado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras, no fusionadas. Las células de hibridoma obtenidas a través de tal medio de selección y/o cultivo en el cual las células de hibridoma que se mantienen pueden entonces evaluarse para identificar la producción de anticuerpo monoclonales que unen específicamente el epítopo 13C4. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por la inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vi tro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a la enzima (ELISA) o usando un Biacore. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard de Munson y Rodbard (1980) Anal. Biochem. 107:220-239. Después de que las células de hibridoma se identifican que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución ' limitada y crecimiento por métodos estándar (Goding, supra) . Adicionalmente , las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan apropiadamente del medio de cultivo, fluido de ascitos, o suero por procedimiento de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxiapatita , electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aisla fácilmente y se procesa en secuencia usando procedimientos convencionales (v.gr. , usando sondas de oligonu-cleótido que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que se transfectan entonces en células hospederas tales como células de E. coli, células COS, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes (ver, v.gr., Skerra y colaboradores (1993) Curr. Opin. Immunol . 5 : 256-262 y Pluckthun (1992) Immunol . Rev. 130 : 151-188) . El ADN también puede modificarse, por ejemplo, al substituir toda o parte de la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias de murino homogéneas (Morrison y colaboradores (1984) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A. 81:6851-6855), o al juntar covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no de inmunoglobulina. De tal manera, se preparan anticuerpos quiméricos o híbridos que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal de epítopo anti-13C4. Típicamente, tales polipéptidos no de inmunoglobulina se substituyen para los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se substituyen para los dominios variables de un sitio que combina el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo divalente quimérico que incluye un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para el epítopo 13C4 de acuerdo con la invención y otro sitio que combina el antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. Anticuerpos Modificados Los anticuerpos modificados de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras humano-ratón) , anticuerpos monoclonales humanos, y anticuerpos monoclonales primatizados . Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones se derivan de especies de animales diferentes, tales como aquellos que tienen una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de una mAb de murino (ver, v.gr., las patentes US 4,816,567 y 4,816,397). Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (v.gr., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab' , F(ab')2 u otras subsecuencias que enlazan el antígeno de anticuerpos) los cuales contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana, tal como una o más regiones que determinan complementariedad (CDRs) de las especies no humanas y una estructura de región de una molécula de inmunoglobulina humana (ver, v.gr., la patente US 5,585,089). Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región que determina complementariedad (CDR) de los receptores se reemplazan por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificación, afinidad, y capacidad deseadas. En algunas instancias, la estructura de residuos Fv de la inmunoglobulina humana se reemplaza por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden incluir residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en los CDR importados o estructuras de secuencias. En general, el anticuerpo humanizado incluirá substancialmente 'todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, los cuales todos o substancialmente todos de las regiones CDR corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todos o substancialmente todos de las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también opcionalmente incluirá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la materia, por ejemplo usando métodos descritos en WO 87/02671; EP 184,187; EP 171,496; EP 173,494; WO 86/01533; US 4,816,567; EP 125,023; Better y colaboradores (1988) Science 240 : 1041-1043 ; Liu y colaboradores (1987) Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. 84:3439-3443; Liu y colaboradores (1987) J. Immunol . 139:3521-3526; Sun y colaboradores (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:214-218; Nishimura y colaboradores (1987) Cáncer Res. 47:999-1005; Wood y colaboradores (1985) Nature 314:446-449; Shaw y colaboradores (1988) J. Nati. Cáncer Inst . 80:1553-1559; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi y colaboradores (1986) Biotechniques 4:214; US 5,225,539; Jones y colaboradores (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan y colaboradores (1988) Science 239:1534; y Beidler y colaboradores (1988) J. Immunol. 141:4053-4060. Ver, a continuación para una discusión adicional de anticuerpos humanizados y métodos relacionados de ello. Otro medio altamente eficiente para generar anticuerpos recombinantes se describe por Newman ((1992) Biotechnology 10:1455-1460); ver también las patentes US 5,756,096; 5,750,105; 5,693,780; 5,681,722; y 5,658,570.

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la materia. La humanización puede esencialmente realizarse siguiendo el método de Winter y compañeros de trabajo como se describe anteriormente (incluyendo Jones y colaboradores (1986) Nature 321:522-525; Riechmann y colaboradores (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen y colaboradores (1988) Science 239:1534-1536), por substituir secuencias CDRs o CDR de roedores para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De conformidad, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patentes US 4,816,567 y 6,331,415) . En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son substituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usarse en la elaboración de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir antigeni-cidad. De conformidad al llamado método de ajuste óptimo, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se muestra contra la colección entera de secuencias de dominio variable humano. La secuencia humana la cual que esta más cerca de las de los roedores luego se acepta como la estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y colaboradores (1993) J. Immunol. 151:2296-2308; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol . 196:901-917) : Otro método usa una estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede usarse por varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter y colaboradores (1992) Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. 89:4285-4289; Presta y colaboradores (1993) J. Immunol . 151 :2623-2632. También se desea que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno (es decir, el epítopo 13C4 de Stxl) y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos humanizados se prepararon a través de un análisis de las secuencias precursoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos de tres dimensiones de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina de tres dimensiones están comúnmente disponibles y son familiares para los técnicos en la materia. Programas de computadora están disponibles los cuales ilustran y muestran estructuras de conformación de tres dimensiones probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas muestras permite análisis del papel similar de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influye en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para enlazar su antígeno. Por este medio, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados de secuencias de consenso e importantes así como las características del anticuerpo deseado, tal como incremento de afinidad para los antígenos objetivos, se logra. En general, los residuos CDR son directamente y más substancialmente involucra una influencia del enlace de antígeno. Los anticuerpos completamente humanos son útiles para tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Tales anticuerpos pueden producirse, por ejemplo, usando ratones transgénicos los cuales son incapaces de expresar genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina endógenos, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humanos. Los ratones transgénicos pueden inmunizarse en la manera normal con un antígeno seleccionado, v.gr. , un polipéptido que incluye el epítopo 13C4. Ver para ejemplos, las publicaciones PCT WO 94/02602, WO 00/76310; las patentes US 5,545,806; 5,545,807; 5,569,825; 6,150,584; 6,512,097; y 6,657,103; Jakobovits y colaboradores (1993) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:2551; Jakobovits y colaboradores (1993) Nature 362:255-258; Bruggeniann y colaboradores (1993) Year in Immunol . 7:33-40; Méndez y colaboradores (1997) Nat . Gene. 15:146-156, y Green y Jakobovits (1998) J. Exp . Med. 188 :483-495. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden hacerse también por el método de hibridoma. Las líneas de célula de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, por Kozbor (1984) J. Immunol. 133:3001-3005; Brodeur y colaboradores (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , pp . 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York; y Boerner y colaboradores (1991) J. Immunol . 147:86-95. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado también pueden generarse usando una técnica referida como selección guiada. En este enfoque, el anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers y colaboradores (1994) Biotechnology . 12:899-903) . Ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv y anticuerpos de una sola cadena incluyen aquellas descritas en las patentes US 4,946,778 y 5,258, 498; Huston y colaboradores (1991) Meth. Enzymol . 203:46-88; Shu y colaboradores (1993) Proc . Nati. Acad. Sci . U.S. A. 90:7995-7999; y Skerra y colaboradores (1988) Science 240:1038-1040. Alternativamente, la tecnología de despliegue de fagos (McCafferty y colaboradores (1990) Nature 348:552-553) puede usarse para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanos in vi tro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. El despliegue de fagos puede realizarse en una variedad de formatos; ver, por ejemplo, Johnson y Chiswell (1993) Curr . Opin. Struct . Biol . 3:564-571. Varias fuentes de segmentos de genes en V pueden usarse para despliegue de fagos. Clackson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628 aisla una configuración diversa de anticuerpos anti -oxazolona de una colección de combinación aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes en V de donadores humanos no inmunizados puede hacerse en constructor y pueden aislarse anticuerpos para una configuración diversa de antígenos (incluyendo auto-antíge-nos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por arks y colaboradores (1991) J. Mol. Biol . 222:581-597, o Griffith y colaboradores (1993) EMBO. J. 12:725-734. La invención proporciona fragmentos, derivados o análogos funcionalmente activos de las moléculas de inmunoglobu-linas que se unen específicamente a una proteína que incluyen el epítopo 13C4. Funcionalmente activo en este contexto significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de inducir anticuerpos anti -anti - idiotipo (esto es, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que se reconoce por el anticuerpo del cual el fragmento, derivado o análogo se deriva. Específicamente, en una forma de realización preferida, la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede aumentarse por la eliminación de la estructura y secuencias CDR que son de terminal C para la secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar que secuencias CDR unen el antígeno, los péptidos sintéticos que contienen las secuencias CDR pueden usarse en ensayos de enlace con el antígeno por cualquier método de ensayo de enlace conocido en la materia. La presente invención proporciona fragmentos de anticuerpo tales como, pero no limitado a, F(ab')2, F(ab)2, Fab' , Fab, y scFvs . Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos pueden generarse por técnicas conocidas, v.gr. , por desdoblamiento mediado por pepsina o papaína. La invención también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la invención, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como FV o anticuerpos de cadena sencilla (SCAs) (v.gr. i como se describe en la patente US 4,946,778; Bird (1988) Science 242:423-42; Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 85:5879-5883; y Ward y colaboradores (1989) Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad como el anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de una sola cadena se forman al ligar los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácido, lo que resulta en un polipépti-do de una sola cadena. Pueden usarse técnicas para el ensamble de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra y colaboradores (1988) Science 242:1038-1041). Alternativamente, un clon que codifica al menos la porción Fab del anticuerpo puede obtenerse al separar por exclusión colecciones de expresión Fab (v.gr., como se describe en Huse y colaboradores (1989) Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que unen el antígeno específico o por separación por exclusión de colecciones de anticuerpo (ver, v.gr., Clackson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628; Hanes y Pluckthun (1997) Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. 94:4937-4942) . En otras formas de realización, la invención proporciona proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la invención, o fragmentos funcionalmente activos de los mismos. En un ejemplo, la inmunoglobulina se fusiona por medio de un enlace covalente (v.gr., un enlace de péptido) , en ya sea la terminal N o la terminal C a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o porción de la misma, preferentemente una porción de al menos 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína) que no es la inmunoglobulina. Preferentemente la inmunoglobulina, o fragmento de la misma, se liga covalentemente a otra proteína en la terminal N del dominio constante. Como se establece arriba, tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, incrementando la vida media in vivo, y aumentando la liberación de un antígeno a través de una barrera epitelial para el sistema inmune. En otra forma de realización, la invención proporciona composiciones y uso de anticuerpos agrupados, fragmentos de anticuerpo, y las otras variantes de anticuerpo descritas en la presente. Por ejemplo, dos o más monoclonales pueden agruparse para uso . Administración Terapéutica La invención también presenta la administración de anticuerpos desarrollados usando los métodos anteriores (v.gr., anticuerpos que se unen específicamente al epítopo 13C4 de Stxl) a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con toxina Shiga . Los anticuerpos de la invención se formularán, se dosificarán, y se administrarán en una forma consistente con la práctica médica buena. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular a tratarse, el sujeto particular a ser tratado, la condición clínica del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación del agente, el método de administración, el programa de administración, y otros factores conocidos para practicantes médicos. La cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo que se une específicamente al epítopo 13C4 de Stxl a administrarse se gobernará por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, aliviar, o tratar, o estabilizar, una enfermedad asociada con la toxina Shiga, o síntomas asociados con esta. El anticuerpo específico para el epítopo 13C4 no necesita ser, pero es opcionalmente , formulado con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar las enfermedades asociadas con la toxina Shiga (v.gr., anticuerpos específicos para Stx2, incluyendo 11E10 y TMA-15, o derivados humanizados o quiméricos de los mismos) . La cantidad específica de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo específico para el epítopo 13C4 de Stxl presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos arriba. El anticuerpo se administra por cualquier medio apropiado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal , intrapulmonar , e intranasal . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra apropiadamente por infusión a pulso, particularmente con dosis reducidas de anticuerpo, preferentemente la dosificación se da por inyecciones, aún más preferentemente inyecciones intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte si la administración es breve o crónica. III. Vacunas La invención presenta composiciones para estimular una respuesta inmune contra la proteína Stxl . Los individuos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con la toxina Shiga pueden tratarse por la administración de una composición (v.gr., una vacuna) que contiene el epítopo 13C4 de la invención, donde el polipéptido no incluye polipéptido Stxl de longitud completa, preferentemente en una cantidad inmunogénicamente efectiva. El péptido puede administrarse profilácticamente y/o terapéuticamente . Los diferentes tipos de vacunas se pueden desarrollar de acuerdo a los procedimientos estándar conocidos en la materia. Por ejemplo, una vacuna puede ser una vacuna basada en péptido, basada en ácido nucleico, basada en bacterias o vírica. Una formulación de vacuna contiene un polipéptido o ácido nucleico que codifica el polipéptido que incluye el epítopo 13C4 puede contener una variedad de otros componentes, incluyendo estabilizadores. La vacuna también puede incluir o co-administrarse con, uno o más adyuvantes adecuados. La relación de adyuvante al polipéptido que incluye el epítopo 13C4 en la vacuna puede determinarse por métodos estándar por un técnico en la materia. En otra forma de realización, las vacunas de péptido pueden utilizar peptidos incluyendo el epítopo 13C4 o derivados funcionales de los mismos como una vacuna profiláctica o terapéutica en un número de formas, incluyendo: 1) como monómeros o multímeros de la misma secuencia, 2) combinadas contiguamente o no contiguamente con secuencias adicionales que pueden facilitar la agregación, promover la presentación o procesamiento del epítopo (v.gr., secuencias dirigidas clase I/II) y/o un anticuerpo adicional, epítopos CTL o auxiliares T para incrementar la inmunogenicidad del epítopo 13C4, 3) modificadas químicamente o conjugadas para agentes que deberán incrementar la inmunogenicidad o administración de la vacuna (v.gr., cadenas de ácido graso o acilo, KLH, toxoide de tétanos, o toxina del cólera), 4) cualquier combinación de los anteriores, 5) cualquiera de los anteriores en combinación con adyuvantes, incluyendo pero no limitado a geles inorgánicos tales como hidróxido de aluminio, y emulsiones agua en aceite tales como adyuvante Freund incompleto, sales de aluminio, saponinas o triterpenos, MPL, toxina del cólera, ISCOM, PRO VAX, DETOX, SAF, adyuvante Freund, Alum, Saponin, entre otros, y particularmente aquellos descritos en las patentes US 5,709,860; 5,695,770; y 5,585,103; y/o vehículos administrados, incluyendo pero no limitado a liposomas, partículas tipo virus o VPLs, microemulsiones , vectores víricos o bacterianos atenuados o muertos, y microesferas degradables (ver, v.gr., ersten y Hirschberg (2004) Expert Rev. of Vaccines 3:453-462; Sheikh y colaboradores (2000) Curr . Opin. Mol. Ther. 2:37-54), y 6) administradas por cualquier ruta o como un medio para células cargadas con antígeno ex vivo. Las dosificaciones de un polipéptido que incluyen un epítopo 13C4, donde el polipéptido no es Stxl de longitud completa, administradas al individuo como ya sea una terapia profiláctica o terapia contra una enfermedad asociada con la toxina Shiga se puede determinar por un técnico en la materia. Generalmente, las dosificaciones contendrán entre alrededor de 10 µg hasta 1,000 mg, preferentemente entre alrededor de 10 mg y 500 mg, más preferentemente entre alrededor de 30 mg y 120 mg, más preferentemente entre alrededor de 40 mg y 70 mg, más preferentemente alrededor de 60 mg del polipéptido que incluye el epítopo 13C4. Por lo menos una dosis del polipéptido que incluye el epítopo 13C4 se administrará al sujeto, preferentemente al menos dos dosis, más preferentemente cuatro dosis, con hasta seis o más dosis totales administradas. Puede ser deseable administrar las dosis estimuladoras del polipéptido que incluyen el epítopo 13C4 en intervalos de una o dos semanas después de la última inmunización, generalmente una dosis estimuladora contiene menos de, o la misma cantidad de, el epítopo 13C4 como la dosis inicial administrada. En un ejemplo, el régimen de inmunización se administrará en cuatro dosis- en intervalos de una semana. Ya que un polipeptido o un ácido nucleico pueden romperse completamente en el estómago, la inmunización se administra preferentemente parenteralmente (v.gr., inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica) . El progreso de los sujetos inmunizados puede seguirse por evaluación médica general, separación por exclusión por infección por examen de serología y/o gastroscópico . IV. Ejemplos El anticuerpo monoclonal 13C4 murino (MAb) se enlaza a StxBl y neutraliza a Stxl, pero no se enlaza a StxB2 o neutraliza a Stx2 a pesar de -73% de similitud de aminoácidos (secuencias señaladas en la Figura 3) . Se mostró previamente que el epítopo 13C4 MAb fue un epítopo no lineal que no extiende ninguno de los seis aminoácidos contiguos en StxBl . Boyd y colaboradores ((1991) Infect . Immun. 59:750-757) concluyen que el epítopo 13C4 MAb fue un epítopo conformacional y que el enlace de disulfuro que se forma dentro de cada monómero StxlB es esencial para generar la conformación propia que permite que el 13C4 MAb se enlace a Stxl (Figura 4) . Recientemente, se reportó que el 13C4 MAb no detecta a Stxld, el cual difiere de Stxl por solamente tres aminoácidos en la subunidad B madura. Aquí, se describe el mapeo del epítopo del 13C4 MAb que se enlaza a y neutraliza a Stxl. El 13C4 MAb se hace reaccionar fuertemente con Stxl, StxBl y la subunidad B quimérica triple que contiene las tres regiones únicas de StxBl, pero solamente de manera débil con la subunidad B quimérica doble que contiene las dos regiones flanqueadas de StxBl; no se detectó señal con las otras quimeras. Los ratones se inmunizaron con la subunidad B quimérica triple se protegieron contra una prueba de exposición letal de Stxl, pero sin Stx2, un hallazgo que prueba los aminoácidos identificados como el epítopo 13C4 e indica que la incorporación de este epítopo StxBl en el pentámero Stx2 B puede enmascarar o reemplazar cualesquiera sitios en StxB2 necesarios para producir anticuerpos neutralizantes anti-Stx2. Debido a que el 13C4 MAb es incapaz de detectar Stxld, una variante Stxl que difiere por tres aminoácidos en la subunidad B madura de Stxl, substituciones de aminoácido sencillas se hicieron en StxBl para imitar a Stxld (TIA, G25A y N55T) . El 13C4 MAb reconoce que StxBl con cualesquiera mutaciones TIA o G25A, pero sin la mutación N55T, un resultado que indica que el residuo 55 es crítico para el epítopo 13C4 MAb. El 13C4 MAb también falla para neutralizar una holotoxina Stxl con una mutación N55T pero neutraliza Stxl y holotoxinas Stxl con cualesquiera mutaciones TIA o G25A. En conclusión, el 13C4 MAb reconoce un epítopo discontinuo o conformacional que extiende tres regiones en el monómero StxBl y requiere del residuo 55. Materiales y Métodos Cepas bacterianas , plásmidos y medios Las bacterias se hicieron crecer en caldo Luria-Bertani (LB) o un complemento agar LB (Becton Dickinson and Company, Sparks, assachusetts , Estados Unidos) con 100 µg/ml de ampicili-na como sea necesario para selección de plásmidos recombinantes Construcción de plásmidos que codifican stxB1/stxB2 quiméricos Un conjunto de siete stxB1/stxB2 quiméricos con ya sea una, dos o tres regiones StxBl supuestas que incluyen el epítopo 13C4 Ab se generaron por una serie de reacciones de cadena de polimerasa (PCR) seguido por empalme por etapas de extensión de traslape (SOE, por sus siglas en inglés) . Inicialmente , stxB-L y stxB2 se amplificaron de clones que contienen stxx o stX2 por PCR, los genes st ^ y stxA2 se removieron y las regiones promotoras nativas stxx y stx2 y stxB-L y stxB2 respectivamente se empalman juntos por SOE. Estas construcciones luego se ligaron en pBluescript II KS~ (Stratagene, La Jolla, California, Estados Unidos) . Después, los genes quiméricos se amplificaron por PCR y se ligaron en un vector de expresión pTrcHis2 C (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) y se transformaron en cepa BL21 de E. coli (DE3) . Durante esta corrida de PCR, los promotores stXi o stx2 nativos se removieron y una secuencia Shine-Dalgarno optimizada (TAAGGAGGACAGCTATG (SEQ ID NO: 15)) se agregó en dirección 5' de los codones de inicio traduccionales .

Adicionalmente , 18 pares base correspondientes a seis codones de histidina se agregaron inmediatamente en dirección descendente de los genes B para incorporar seis epítopos de histidina comunes en todas las subunidades B. La clonación de los genes para las subunidades B de esta manera se permite para la expresión de los genes quiméricos para estar bajo control del promotor pTrc y agregar un epítopo común a todos las construcciones. Este epítopo común se permite para la normalización de las subunidades B al realizar Western blot preliminares en los mismos lisados y por detección con un MAb que reconoce los seis epítopos de histidina. Tres mutaciones individuales adicionales se generaron por SOE PCR en stxB-L para imitar las tres diferencias de aminoácidos entre el StxBld y StxBl maduro (TIA o G25A o N55T) . Las construcciones se procesaron por secuencia en el Centro de Instrumentación Biomédica de los Servicios Uniformados de la Universidad de Ciencias de la Salud para verificar que las mutaciones correctas se generaron. Técnica Western blot El Stxl purificado, o lisados bacterianos de célula completa que expresan StxBl, StxB2 o proteínas etiquetadas his StxBl/StxB2 se sometieron a electroforesis en gel de poliacrila-mida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y análisis Western blot como previamente se describe (Smith y colaboradores (2006) Vaccine 24:4122-42129) . En breve, los cultivos durante la noche de E. coli BL21 (DE3) que contienen el pTrcHis2 C- ????? o stxB2 y los siete clones quiméricos se diluyeron 1:50 en 5 mL de caldo LB . Después de 3 horas, los cultivos se indujeron con ß-D-tiogalactopiranosido de isopropilo 1 m (IPTG) y se incubaron durante unas 5 horas adicionales. Los cultivos inducidos luego se hicieron en alícuotas en tubos de microfuga y la solución reguladora de muestra SDS-PAGE (contienen Ditiotreitol 0.6 M, sulfato dodecil de sodio al 10%) se agregó y las muestras se almacenaron a -80°C. Previo a cargar en geles de poliacrilamida al 15%, las muestras se calentaron a 95°C durante 5 minutos. La concentración de las subunidades B quiméricas o de tipo silvestre cargada se normalizó en Western-blot preliminarmente por detección con el anticuerpo monoclonal anti-seis histidinas (Novagen) y cuantificó usando el programa J de imagen (NIH) . Un segundo Western-blot se realizó usando sobrenadantes de cultivo del tejido de hibridoma 13C4 MAb como el anticuerpo primario en muestras normalizadas. El segundo anticuerpo para ambos Western-blot fue inmunoglobul ina anti-ratón de cabra G (IgG) conjugada en peroxidasa de raíz de rábano (HRP) (Bio-Rad) a una dilución de 1:3,000. El segundo anticuerpo se detectó por quimioluminiscencias con el kit ECL-Plus Western Blotting Detection (Amersham Bioscience, Little Chalfont Buckhamshire , Inglaterra) . Purificación de la subunidad B quimérica triple StxB1/StxB2 Un cultivo durante la noche de E. coli BL21 (DE3) que contiene el clon p JS36ABC de la subunidad B quimérica triple pTrcHis2 C-stxB1/stxB2 se diluyó 1:50 en 3 L de caldo LB . Después de 3 h de crecimiento, los cultivos se indujeron con IPTG 1 m y se incubaron durante unas 5 horas adicionales. Las bacterias se sedimentaron por centrifugación y concentraron 75 veces por resuspensión en 40 mi de solución amortiguadora de fosfato 50 mM que contiene NaCl 300 mM pH 7.6 (solución reguladora de tratamiento sónico) . Las suspensiones bacterianas concentradas luego se rompieron por tratamiento sónico, y se clarificaron por centrifugación. El lisado clarificado con la subunidad B quimérica triple StxB1/StxB2 etiquetado his luego se aplicó a una columna de afinidad de Níquel (Qiagen Inc., Valencia, California, Estados Unidos) , se lavó con solución reguladora de tratamiento sónico que contiene imidazol 20 mM y se eluyó con solución amortiguadora de tratamiento sónico que contiene imidazol 250 mM. Las proteínas eluidas se dializaron contra solución amortiguadora salina de fosfato, pH 7.4 (PBS) y se concentraron con un Centricon 3,000 de filtro completamente cortado de peso molecular (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts , Estados Unidos) y se filtraron a través de un filtro 0.2 µtt?. Después de la purificación, la concentración de proteína total de la preparación de la subunidad B quimérica triple StxB1/StxB2 fue 288 ng/µ?, como se determina por un ensayo BCA (Pierce) . Un Western blot usando el 13C4 MAb y geles teñidos de plata muestran que la proteína purificada principal fue la subunidad B quimérica triple StxB1/StxB2, aunque diversas otras proteínas menores se co-purificaron . Inmunización y prueba de exposición de ratones El suero pre-inmune se colectó de 13 ratones macho CD-1 que pesan 14-16 g (Charles River, Boston, assachusetts , Estados Unidos) . Los ratones luego se inmunizaron intraperitonealmente (i.p.) con -14.4 g de la subunidad B quimérica triple purificada en PBS mezclada 1:1 con TiterMax Gold, un adyuvante de agua en aceite (TiterMax USA Inc., Norcross, Georgia, Estados Unidos) (volumen total 100 µ?) . Los ratones se estimularon con la misma cantidad de la subunidad B quimérica purificada en intervalos de tres semanas, para un total de cuatro estimulaciones. Dos semanas después de la última estimulación, los 13 ratones inmunizados se dividieron en dos grupos que contienen siete (grupo B) y seis (grupo D) ratones cada uno y se les aplicó la prueba de exposición con 10 veces la dosis letal al 50% (LD50) de cualquiera de Stxl (1, 250 ng) o Stx2 (10 ng) respectivamente. 14 ratones macho CD-1 no inmunizados se dividieron en dos grupos que contienen siete ratones cada uno y se les aplicó la prueba de exposición con 10 LD50 de cualquiera de Stxl o Stx2 , (grupos de prueba de exposición A y C respectivamente) . Ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) Diez días después en la cuarta y final estimulación, el suero se colectó de los ratones inmunizados y el suero antes y después de la inmunización de los ratones inmunizados y el suero de los 14 ratones nativos se usaron en ensayos inmunosor- bentes ligados a la Enzima (ELISA) para determinar los niveles de inmunoglobulina G en el suero (IgG) contra StxBl o StxB2 como se reporta previamente (Smith y colaboradores (2006) Vaccine 24:4122-42129) . Brevemente, 100 ng de Stxl o Stx2 purificado en PBS se usó como el antígeno y el suero del ratón se usó como el anticuerpo primario después de diluir en PBS que contiene Tween-20 al 0.05% (PBST) . El anticuerpo secundario, el IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP se agregó a una dilución de 1:3,000 en PBST. Las concentraciones ELISA se definieron como la dilución del suero después de la inmunización que fue +0.1 O.D.405 unidades arriba de los valores de pre-sangrado después la estructura se sustrajo. Ensayos de neutralización in vitro El suero antes y después de la inmunización de los 13 ratones inmunizados y el suero de los 14 ratones nativos se usaron en ensayos de neutralización in vitro contra Stxl y Stx2 como se reporta previamente. Aproximadamente se usaron 10 CD50 y 25 CD50 de Stxl y Stx2 purificados respectivamente. Los valores CDS0 actuales se calcularon retrospectivamente después de que el experimento se realizó. Debido a que el 13C4 MAb no detecta Stxld, el anticuerpo se usó en los ensayos de neutralización en lisados sónicos clarificados de bacterias que expresan cualquier Stxl o Stxl de tipo silvestre que contiene una de tres mutaciones de aminoácidos sencillos en la subuni-dad B (TIA o G25A o N55T) . Aproximadamente 10 CD50 de Stxl o Stxl que contienen una de las mutaciones de subunidad B se usó para estos experimentos de neutralización. La concentración de neutralización se definió como la dilución del suero de los ratones o 13C4 Ab que neutraliza 50% del efecto citotóxico de Stxl o Stx2 en células Vero. Estos ensayos se realizaron una vez en duplicado. Ensayo de inhibición de enlace de globotriaosil ceramida del receptor eucariótico (Gb3) . Un ensayo Gb3 se usó para determinar si el 13C4 MAb puede inhibir Stxl de interactuar con su receptor. En breve, 1,200 pg de Stxl purificado se diluyó en PBS que contiene Tween 80 al 0.05% (PBST-80) y albúmina de suero de bovino al 0.1% (posteriormente nombrado solución de enlace) , y volúmenes iguales de Stxl se mezclan con cualquier solución de enlace, 13C4 MAb no diluido (Hycult Biotechnology, Uden, Países Bajos) , o 13C4 MAb diluido seriamente (1:4) en solución de enlace. La mezcla toxina-anticuerpo (volumen total, 120 µ?) se incubó durante 2 h a 37°C en C02 al 5%, y 100 µ? luego se aplicó a placas de microtitula-ción recubiertas Gb3 (Matreya, Inc., State College, Pennsylvania , Estados Unidos) (1 µg/pozo) que se han lavado con PBST-80. Las muestras se incubaron durante 2 h a 37°C con el anticuerpo primario, anticuerpo policlonal anti-Stxl de conejo diluido 1:5,000 en solución de enlace. Después de lavar el anticuerpo primario no enlazado de los pozos con PBST-80 y PBS, el anticuerpo ¦ secundario, IgG anti-conejo de cabra conjugado a HRP (Bio- Rad) , se agregó a una dilución de 1:1,000 y se incubó durante 1 h a 37°C. Después de otro lavado con PBST-80, seguido por un lavado con PBS , el anticuerpo- secundario se detectó con kit de substrato de inmunoensayo de enzima de peroxidasa de tetrametil-benzidina (Bio-Rad) , y las placas de microtitulación se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min para permitir un cambio de color en el desarrollo. Las mezclas de reacción luego se transfirieron a una placa de microtitulación fresca y se leyeron a 600 nm. Estos ensayos se hicieron dos veces en triplicado. Los controles para este experimento incluyen Stxl incubado con un MAb irrelevante que ajusta el isotipo (11E10; Hycult Biotechnology) o sin anticuerpo. Resultados Análisis de alineación de aminoácidos StxBl y StxB2 y comparación de las estructuras de cristal Stx y Stx2 Cuando los aminoácidos de las proteínas StxBl y StxB2 maduras se alinean, tres regiones de disimilitud más altas entre las dos proteínas son evidentes (Figura 5) . Dos de estas regiones se centran alrededor de los residuos de cisteína en la terminación N y C de la proteína e incluye aminoácidos 1-6 y 54-61 respectivamente. La tercera región está a la mitad de StxBl, que abarca los aminoácidos 25-32. Estas tres regiones de disimilitud se encontraron para ubicarse uno del otro en las estructuras de cristal de StxB (StxB es idéntico a StxBl) , ilustrado en la estructura de cristal del pentámero StxB en la Figura 5.

Construcción de proteínas StxBl/StxB2 quiméricas El StxBl y StxB2 de tipo silvestre y siete subunidades B Stxl/Stx2 quiméricas consisten de una, dos o tres de las regiones StxBl únicas se generaron por una serie de PCR y empalme por reacciones de extensión de traslape (Figura 6) . Adicionalmen-te, estas subunidades B se etiquetaron con his en la terminación C para permitir la normalización de las subunidades B. Análisis Western hlot de proteínas StxBl/StxB2 quiméricas con el anticuerpo monoclonal 13C4 Los Western blot preliminares se realizaron usando el Novagen MAb a-seis histidinas en muestras idénticas de Usados bacterianos de célula completa que contienen proteínas StxBl, StxB2 o StxBl/StxB2 quiméricas tipo silvestre etiquetadas his. La cantidad de las subunidades B en estas muestras se normalizó usando el programa J de imagen, luego un segundo Western blot se realizó usando el 13C4 MAb como el anticuerpo primario. El 13C4 MAb se hace reaccionar fuertemente con Stxl , StxBl y la subunidad B quimérica triple que contiene tres regiones únicas de StxBl, pero solamente de manera débil con la subunidad B quimérica doble que contiene las dos regiones flanqueadas de StxBl; se detectó sin señal con las otras quimeras (Figura 7) . Indicando un sitio enlazado al anticuerpo formado por regiones 1-6 y 54-61 y un efecto conformacional en el sitio de enlace por medio de la región 25-32. Análisis de StxBl que contiene mutaciones de aminoácido sencillo por Western blot y neutralización in vitro con el 13C4 MAb. El 13C4 MAb no reconoce a Stxld, que tiene solamente diferencias de tres aminoácidos en la subunidad B madura de Stxl (Figura 8 y Bürk y colaboradores (2003) J. Clin. Micro-biol . 41:2106—2112) . Debido a esto, se generan tres mutaciones StxBl sencillas que imitan tres diferencias (TIA, G25A y N5T) y se hacen por sonda en ellas con el 13C4 MAb por análisis Western blot. El 13C4 MAb detectó Stxl, StxBl y StxBl con las mutaciones TIA y G25A, pero sin la mutación N55T (Figura 7) . Para investigar además la capacidad del 13C4 MAb para enlazar funcionalmente a las mutaciones de aminoácido sencillo en StxBl, se realizaron ensayos de neutralizaciones in vitro. Un segundo plásmido que codifica stxAx se co- transformó en las bacterias que expresan StxBl o StxBl con las mutaciones TIA o G25A o N55T de manera que las bacterias se co- transforman con estos plásmidos producidos de holotoxinas. Los lisados sónicos clarificados de las bacterias que forman holotoxinas Stxl se sometieron a ensayos de neutralización in vitro con el 13C4 MAb (aproximadamente 10 CD50 por toxina) . El 13C4 MAb neutraliza él Stxl de tipo silvestre y el Stxl con las mutaciones SxtBl TIA y G25A, pero no con la mutación N55T. El hecho de que 13C4 no reconoce la subunidad B con la mutación N55T sencilla ni neutraliza Stxl con la mutación N55T fuertemente sugiere que el residuo 55 es un residuo crítico para enlace 13C4 funcional. Respuesta inmune para inmunización de subunidad B quimérica triple StxBl/StxB2 Los 13 ratones CD-1 se inmunizaron con la proteína StxBl/StxB2 quimérica triple purificada y se estimulan en intervalos de tres semanas para un total de cuatro estimulaciones. Diez días después la estimulación final, después de la inmunización el suero se colectó y evaluó en ensayos de neutralización in vitro y ELISA y se comparó con el suero pre-inmune apropiado y con el suero que se colectó de los 14 ratones no inmunizados. Los ratones inmunizados muestran concentraciones ELISA altas para Stxl y Stx2 , 5.12 y 3.77 logaritmos arriba de la estructura respectivamente (Tabla 1) . Ninguno del suero pre-inmune de los 13 ratones inmunizados o el suero de los 14 ratones no inmunizados muestra ningunas concentraciones ELISA apreciables para Stxl o Stx2. Tabla 1 a La media geométrica de las concentraciones de suero IgG log para Stxl o Stx2 , las barras de error indican ± 1 S.D. b La media geométrica de las concentraciones de neutralización al 50% log hasta aproximadamente 10 o 25 CD50 de Stxl o Stx2 respectivamente, las barras de error indican + 1 S.D. c El suero de 12 o 2 ratones de los 13 Stxl o Stx2 neutralizados respectivamente. Las muestras que no neutralizan Stxl o Stx2 se asignaron un valor de 0.3.

Debido a que las concentraciones de neutralización in vitro son un indicador mejor de una respuesta inmune protegida que son concentraciones ELISA, los ensayos de neutralización in vitro se realizaron en las muestras de suero contra Stxl o Stx2 purificados (10 o 25 CD50 respectivamente) . Los 12 de 13 ratones inmunizados muestran concentraciones de neutralización altas para Stxl, mientras que solamente dos ratones muestran concentraciones de neutralización para Stx2 (Tabla 2) . El suero pre- inmune de los 13 ratones inmunizados y el suero de los 14 ratones no inmunizados no muestran concentraciones neutralizantes para Stxl o Stx2. Estos datos sugieren que las regiones de la subunidad B quimérica que son Stxl representan un epítopo neutralizante. Tabla 2 a El LD50 se determinó previamente para ser 125 y 1 ng/ratones para Stxl y Stx2 , respectivamente . b El peso promedio de los ratones cuando se probaron inmunogénicamente fue 44.9 g.

Protección de ratones inmunizados contra prueba de exposición de toxina letal Dos semanas después de la estimulación final, los 13 ratones inmunizados y los 14 ratones de control se les aplicó la prueba de exposición con ya sea 10 LD50 de Stxl o Stx2. Los 13 ratones inmunizados se dividieron en dos grupos de prueba de exposición, el grupo de prueba de exposición Stxl (grupo B) contiene siete ratones, mientras que el grupo de prueba de exposición Stx2 (grupo D) contiene de seis ratones. Los 14 ratones no inmunizados se dividieron en dos grupos de siete y se les aplicó la prueba de exposición con cualquiera de Stxl (grupo A) o Stx2 (grupo C) . Seis de los siete ratones inmunizados sobreviven a la prueba de exposición Stxl, mientras que solamente uno de seis ratones inmunizados sobrevive a la prueba de exposición Stx2 (Tabla 2) . Ninguno de los 14 ratones no inmunizados sobrevivió a la prueba de^ exposición Stxl o Stx2 y todos murieron al cuarto día. Ensayo de inhibición de enlace Gb3. Un ensayo de inhibición de enlace in vitro se usó para determinar si el 13C4 MAb puede prevenir el enlace de Stxl a Gb3. El Stxl y 13C4 MAb se incubaron juntos y luego se sobreponen en placas de microtitulación recubiertas con Gb3. El Stxl enlazado a Gb3 no se detectó hasta que el 13C4 MAb se diluyó la pasta 1:512 de una reserva 0.1 mg/ml (Figura 9) . El enlace Stxl máximo ocurre después el 13C4 se diluyó a 1:8,000 o mayor. Estos resultados muestran que el 13C4 Mab inhibe completamente el enlace de 1,000 pg de Stxl hasta Gb3 en una manera dependiente de dosis . Discusión Después de comparar las secuencias de aminoácido de StxBl y StxB2 , y examinar la estructura de cristal del pentámero StxB, se identificaron tres regiones no lineales en StxBl para el epítopo 13C4 MAb. El análisis Western blot de una serie de proteínas quiméricas StxBl/StxB2 muestra que el 13C4 MAb reaccionar fuertemente con Stxl, StxBl y la subunidad B quimérica triple que contiene tres regiones únicas de StxBl, pero solamente de manera débil con la subunidad B quimérica doble que contiene la primera y tercera regiones de StxBl; sin señal se detectó con las otras quimeras. Un conjunto de mutantes específicos del sitio muestran que el 13C4 MAb específicamente enlaza mutaciones TIA y G25A que contienen Stxl, StxBl y StxBl de tipo silvestre, pero sin StxBl que contienen la mutación N55T. Además, el 13C4 MAb neutraliza Stxl y Stxl de tipo silvestre con las mutaciones TIA y G25A, pero sin la mutación N55T. Tomados juntos, estos datos indican que la asparagina en el residuo 55 de StxBl es un aminoácido crítico del epítopo 13C4 MAb. La asparagina en el residuo 55 de StxBl también es un aminoácido crítico para el enlace de 5-5B monoclonal, otro anticuerpo Stxl que enlaza la subunidad B Stxl, pero falla para reconocer a Stxld (Nakao y colaboradores (2002) Microbiol . Immunol . 46: 777-780). Adicionalmente , un tercer MAb (2H3) se ha producido que reconoce a StxBl, pero sin StxBld, y el residuo 55 puede jugar un papel en tal diferencia como buena (Bürk y colaboradores (2003) J. Clin. Microbiol. 41:2106-2112). Finalmente, otro MAb, VTml .1 (último humanizado y nombrado TMA-15) se enlaza a StxB2 y neutraliza a Stx2 (Nakao y colaboradores (1999) Infect. Immun. 67:5717-5722, Kimura y colaboradores (2002) Hybrid. Hybridomics. 21:161-168), no puede enlazarse a StxB2 cuando el aminoácido 56 es mutado (E56H) . El residuo 55 de StxBl y el residuo 56 de StxB2 ambos se localizan en el exterior de los monómeros B en aproximadamente la misma ubicación. Los resultados y los resumidos arriba, soportan la idea de que los aminoácido 55 y 56 de StxBl y StxB2 , respectivamente, son residuos críticos para neutralizar Mabs que se dirigen contra Stxl y Stx2. Aunque la subunidad B quimérica triple StxBl/StxB2 contiene mayormente StxB2 (solamente 22 fuera de los 71 aminoácidos son StxBl) , las concentraciones de neutralizaciones y ELISA Stxl más altas se realizaron después de inmunizarse con la subunidad B quimérica triple-. Esto puede ser debido a los 22 aminoácidos que incluyen el epítopo 13C4, que están fuera del pentámero B, son inmunodominantes y son buenos objetivos para anticuerpos neutralizantes. Esto puede explicar por que cuando los 22 aminoácidos incluyendo el epítopo 13C4 MAb se insertan en StxB2 , seis de los siete ratones sobreviven a la prueba de exposición letal de 10 LD50 de Stxl, pero solamente uno de los seis ratones sobrevive a una prueba de exposición letal de 10 LD50 de Stx2. Otras Formas de Realización Varias modificaciones y variaciones de los métodos y composiciones descritas de la invención serán aparentes páralos técnicos en la materia sin alejarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con formas de realización deseadas específicas, deberá entenderse que la invención como se reivindica no deberá limitarse excesivamente para tales formas de realización específicas. Las varias modificaciones innecesarias de los modos descritos para portar la invención que son obvios para aquellos experimentados en los campos de la medicina, inmunología, farmacología, endocrinología, o campos relacionados se pretenden para estar dentro del alcance de la invención. Todas las patentes, solicitudes de patentes, y publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia a la misma extensión como si cada publicación independiente se incorporó específicamente e individualmente por referencia .

Claims (61)

1. REIVI DICACIONES 1. Un método para producir un anticuerpo anti-Stxl que se enlaza específicamente al epítopo 13C4 de la proteína tipo 1 de toxina Shiga (Stxl) , el método caracterizado porque comprende las etapas de: a) inmunizar un mamífero con un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias establecidas en SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3, en donde el polipéptido no comprende Stxl de longitud completa; y b) purificar el anticuerpo anti-Stxl que se enlaza específicamente al epítopo 13C4 de la proteína Stxl de un tejido del mamífero o de un hibridoma hecho usando el tejido.
2. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo anti-Stxl que se enlaza específicamente al epítopo 13C4 de la proteína Stxl no enlaza Stx2.
3. 3. El método de la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende la etapa de : (c) separar por exclusión el anticuerpo contra Stxl y Stx2 en un ensayo de neutralización in vitro, en donde un anticuerpo que neutraliza al menos 50 % del efecto citotóxico de Stxl es un anticuerpo anti-Stxl que se enlaza específicamente al epítopo 13C4 de la proteína Stxl.
4. 4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende al menos dos de las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3.
5. 5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 4.
6. 6. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
7. 7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (a) comprende además usar un adyuvante.
8. 8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o fragmento del mismo .
9. 9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo .
10. 10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo modificado.
11. 11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
12. 12. Una composición para estimular una respuesta inmune contra Stxl, caracterizada porque comprende al menos un polipéptido, en donde el polipéptido comprende al menos una de las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3, y en donde el polipéptido tiene la antigenicidad de Stxl, junto con un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el polipéptido no comprende Stxl de longitud completa.
13. 13. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque el polipeptido es una proteína quimérica.
14. 14. La composición de la reivindicación. 13, caracterizada porque la proteína quimérica comprende las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3, y una proteína no Stxl.
15. 15. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína no Stxl es un andamiaje y las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOs : 1 , 2, o 3 se insertan en el andamiaje.
16. 16. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína no Stxl comprende proteína StxB2 , o un fragmento de la misma.
17. 17. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque la composición no estimula una respuesta inmune a Stx2.
18. 18. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína quimérica comprende una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4.
19. 19. La composición de la reivindicación 18, caracterizado porque la proteína quimérica comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4.
20. 20. La composición de la reivindicación 12, caracteri- zada porque la composición comprende además un adyuvante.
21. 21. Un método para inducir una respuesta inmune a Stxl en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar la composición de la reivindicación 12 o 18 al sujeto.
22. 22. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la toxina Shiga en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar la composición de la reivindicación 12 o 18 al sujeto.
23. 23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la enfermedad asociada con la toxina Shiga es síndrome de uremia hemolítico.
24. 24. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la enfermedad asociada con la toxina Shiga se asocia con infección por E. coli o S. dysenteriae .
25. 25. Un anticuerpo anti-Stxl, o fragmento del mismo, que se enlaza específicamente al epítopo 13C4 de la proteína tipo 1 de toxina Shiga (Stxl) caracterizado porque comprende al menos una de las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3, en donde el anticuerpo inhibe el enlace de un anticuerpo 13C4 (ATCC CRL-1794) , anticuerpo 13C4 quimérico, o anticuerpo 13C4 humanizado a la proteína Stxl.
26. 26. El anticuerpo de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza específicamente a un epítopo en el polipéptido que comprende las secuencias establecidas en SEQ ID NOs : 1, 2 , y 3.
27. 27. El anticuerpo de la reivindicación 26, caracterizado porque el epítopo comprende las secuencias establecidas en SEQ ID NOS : 1, 2, y 3.
28. 28. El anticuerpo de la reivindicación 26, caracterizado porque el epítopo es un epítopo conformacional .
29. 29. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
30. 30. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es humanizado .
31. 31. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
32. 32. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo inhibe el enlace entre Stxl y un anticuerpo 13C4, en donde el anticuerpo 13C4 tiene un Kd de 0.50 n o menor.
33. 33. El anticuerpo, o fragmento del mismo de la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo 13C4 es un anticuerpo 13C4 de ratón, humanizado, o quimérico.
34. 34. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es IgG, Ig , IgE, IgD, o IgA.
35. 35. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindi- cación 25, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento Fab o Fv.
36. 36. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 25, y un portador farmacéuticamente aceptable.
37. 37. Una línea celular de hibridoma, caracterizada porque produce el anticuerpo de la reivindicación 25.
38. 38. El anticuerpo de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo inhibe el enlace de Stxl a la ceramida de globotriaosilo del receptor Eucariótico.
39. 39. Un método para detectar Stxl en una muestra biológica, el método caracterizado porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 25 bajo condiciones que permiten la formación de complejo entre el anticuerpo y Stxl; y (b) detectar el complejo en la muestra biológica.
40. 40. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque la muestra biológica es de un tejido, célula, extracto celular, fluido corporal o una biopsia.
41. 41. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque el complejo se detecta usando ELISA, RIA, técnica Western blot, immunoprecipitación, o citometría de flujo.
42. 42. Un método para diagnosticar una enfermedad asociada con la toxina Shiga en un sujeto, el método caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra biológica del sujeto; (b) poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 25 bajo condiciones que permiten la formación de complejo entre el anticuerpo y Stxl; y (c) detectar el complejo en la muestra biológica; en donde la presencia de Stxl en la muestra diagnostica al sujeto con una enfermedad asociada a la toxina Shiga.
43. 43. El método de la reivindicación 42, caracterizado porque la enfermedad asociada con la toxina Shiga es síndrome urémico hemolítico.
44. 44. El método de la reivindicación 42, caracterizado porque la enfermedad asociada con la toxina Shiga es infección por E. coli o S. dysenteriae .
45. 45. Un kit de prueba inmunológico para detectar una enfermedad asociada con la toxina Shiga, el kit caracterizado porque comprende el anticuerpo o porción enlazada al mismo de la reivindicación 25 y un medio para detectar el anticuerpo.
46. 46. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la toxina Shiga en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar al sujeto una dosis farmacéuticamente efectiva del anticuerpo, o fragmento del mismo, de las reivindicaciones 25-36.
47. 47. El método de la reivindicación 46, caracterizado porque la enfermedad asociada con la toxina Shiga es síndrome urémico hemolítico.
48. 48. El método de la reivindicación 46, caracterizado porque la enfermedad asociada con la toxina Shiga se asocia con infección por E. coli o S. dysenteriae .
49. 49. Un polipéptido caracterizado porque comprende al menos una de las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOs:l, 2, y 3, en donde el polipéptido no comprende Stxl de longitud completa.
50. 50. El polipéptido de la reivindicación 49, caracterizado porque el polipéptido comprende las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3.
51. 51. El polipéptido de la reivindicación 49 o 50, caracterizado porque el polipéptido es una proteína quimérica que comprende además un polipéptido no Stxl.
52. 52. El polipéptido de la reivindicación 51, caracterizado porque la proteína no Stxl comprende la proteína StxB2 , o un fragmento de la misma.
53. 53. El polipéptido de la reivindicación.51, caracterizado porque la proteína no Stxl es un andamiaje y las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID N0s:l, 2, y 3 se insertan en el andamiaje.
54. 54. Un polipéptido caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO : 4.
55. 55. Un polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO : 4.
56. 56. El polipéptido de la reivindicación 55 caracterizado porque consiste del aminoácido establecido en la SEQ ID NO : 4.
57. 57. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica el polipéptido de las reivindicaciones 49, 54, o 55.
58. 58. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 57, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se liga operativamente a una secuencia de control de expresión .
59. 59. Un vector capaz de expresar un polipéptido, el vector caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 58.
60. 60. Una célula hospedera, caracterizada porque contiene el vector de la reivindicación 59.
61. 61. Un método para preparar un polipéptido, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOsrl, 2, y 3, en donde el polipéptido no comprende Stxl de longitud completa, el método incluye las etapas de: (a) introducir el ácido nucleico de la reivindicación 52 en una célula hospedera, (b) purificar el polipéptido de la célula hospedera.