TW201235469A - Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins, and uses thereof - Google Patents

Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins, and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
TW201235469A
TW201235469A TW101109621A TW101109621A TW201235469A TW 201235469 A TW201235469 A TW 201235469A TW 101109621 A TW101109621 A TW 101109621A TW 101109621 A TW101109621 A TW 101109621A TW 201235469 A TW201235469 A TW 201235469A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
rip
protein
chemokine
cell
cells
Prior art date
Application number
TW101109621A
Other languages
English (en)
Inventor
Hongsheng Su
Philip J Coggins
John R Mcdonald
Laura M Mcintosh
Original Assignee
Osprey Pharmaceuticals Usa Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osprey Pharmaceuticals Usa Ltd filed Critical Osprey Pharmaceuticals Usa Ltd
Publication of TW201235469A publication Critical patent/TW201235469A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/25—Shigella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

201235469 六、發明說明： 【相關申請案之交互參照】 本發明係主張 Hongesheng Su，Philip J. Coggins，John R. McDonald 和 Laura M. McIntosh 於 2007 年 8 月 22 日申請之 美國臨時申請案第60/965，977號，標題為”挑選和生產經修 改毒素的方法、含有該經修改毒素之共軛物，及其用途 (METHODS OF SELECTING AND PRODUCING MODIFIED TOXINS, CONJUGATES CONTAINING MODIFIED TOXINS, AND USES THEREOF)，’，和 HongeshengSu，PhilipJ. Coggins，John R. McDonald 和 Laura M. McIntosh 於 2006 年 12月29曰申請之美國臨時申請案第60/878,166號，標題為” 挑選和生產經修改毒素的方法、含有該經修改毒素之共軛 物，及其用途（METHODS OF SELECTING AND PRODUCING MODIFIED TOXINS, CONJUGATES CONTAINING MODIFIED TOXINS，AND USES THEREOF)’’的優先權益。 本申請案亦關於1999年7月22曰申請之美國申請案 第09/3 60,242號，現為美國專利第7，157,418號，標題為” 治療二次組織傷害及其他炎性症狀和病症的方法和組合物 (METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS)”，其以 部分接續申請案根據 35U.S.C.§120 主張由 Osprey Pharmaceuticals Limited，McDONALD，John R.和 COGGINS， Philip J·於1999年7月21曰申請之國際PCT申請案第 201235469 PCT/CA99/00659號，標題為，，治療二次組織傷害及其他炎性 - 症狀和病症的方法和組合物（METHODS AND . COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS)的優先權益，並根據 35U.S.C.119§(e)主 張 John R. McDonald 和 Philip J. Coggins 於 1998 年 7 月 22 曰申請之美國臨時申請案第66/155,186號，標題為”治療二 次組織.傷害之方法和組合物（METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE)”的優先權益。 本申請案亦關於1999年12月2曰申請之John R. McDonald 與 Philip J. Coggins 的美國申請案第 09/453,85 1 號，現為美國專利第7,166,702號，標題為”包括趨化因子 受體靶定劑的胞毒性共軛物（CYTOTOXIC CONJUGATES COMPRISING A CHEMOKINE RECEPTOR TARGETING AGENT)”的優先權益，其為美國申請案第09/360,242號的 分割案，現為美國專利第7,1 57,4 1 8號。該申請案亦關於 2001年2月22曰申請之美國申請案第09/792,793號，現為 美國專利第7,192,736號，標題為”編碼含有趨化因子受體 靶定劑之胞毒性共軛物的核酸分子（NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING CYTOTOXIC CONJUGATES THAT CONTAIN A CHEMOKINE RECEPTOR TARGETING AGENT)’’，其為美國申請案第09/360,242號和美國申請案 第09/453,85 1號的分割案。 201235469 本申請案亦關於2003年2月24曰申請之美國申請案 第10/3 75,209號，現在已經放棄，標題為”治療二次組織傷 害及其他炎性症狀和病症的方法和組合物（METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS)’’，其為美國申請案第09/792,793號、美 國申請案第09/453,85 1號和美國申請案第09/360,242號的 接續案。 本申請案亦關於2006年2月24曰申請之美國申請案 第1 1/361,977號，標題為”治療二次組織傷害及其他炎性症 狀和病症的方法和組合物（METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS)’’，其為美國申請案第10/375,209號、美 國申請案第09/792,793號、美國申請案第09/453，851號和 美國申請案第09/360,242號的接續案。 在允許的情況下將每個上文提及之申請案和專利案的 主題全部以引用方式納入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本發明係提供挑選並鑑認具有降低的毒性之經修改毒 素的方法。亦提供具有降低的毒性之經修改毒素，以及含 有這類經修改毒素的共軛物。提供生產這類經修改毒素或 其共軛物的方法。在治療與涉及炎性反應之細胞的增殖、
S 6 201235469 使用該共軛物 移行和生理學活性有關之疾病的方法中， 【先前技術】 k性反應是由务游ρ大袍3 & ^ 兇及防示細胞和相關之組織居留細胞介 ’ k些細胞堆積在組織受傷或受創的地方，以除去身體 =要的外源物（例如微生物）和内源物（例如癌細胞殖系）； 以:除細胞碎4，纟參與組織和傷口癒合。不幸地是，涉 及k些修補(炎性)過程的分子機制因為（例如）自血球的不 適田活2，可發動二次組織傷害，其轉而促成數個炎性和 免疫調節疾病的發病機制和持續的病理學。 涉及二次組織傷害之分子機制及細胞和化學介體，在 大夕數的人類炎性疾病+，若不相同也是類似的。因此， 已I發展出各種療法’藉著靶定這些分子機制及/或其他的 八同"體纟療這類炎性和免疫調節疾病。例如，已經 &展出定特定之單—生化事件的療法’該事件發生在細 I層面（例如興奮性胺基gt或反應性氧物冑的胞毒作用），其 /y及這類炎性和免疫調節疾病的病理生理學過程。在這類 療法中包括類固醇，像是（但不限於）甲潑尼龍 (methylprednisolone)及其合成的 21 胺基 類固醇（拉扎類固 醇（lazaroid))衍生物（例如曲西拉扎（trisilazad))，其作用為氧 自由基清除劑。類固醇的有益副作用受到使人衰弱之副作 用阻礙，使知長期的類固醇治療不是可行的臨床選擇。 亦已經發展出藉著耙定引起及/或涉及病理生理學過程 的特定炎性介體（即細胞介素、生長因子或其等之受體），治 201235469 療炎性疾病的療法。在這類療法中包括瑞米凱德 (RemiCade)®(英利昔單抗（infliximab)，一種對腫瘤壞死因子 (tumor necrosis fact〇r，TNF)_a 的中和抗體）、恩博 (Enbrel)®(依那西普（etanercept),可溶性τΝρα受體），以及 對各種生長因子（包括基本的纖維母細胞和血管内皮生長 因子）的中和抗體（McDonald等人（2〇〇1) IDrugs， 4.427-442)。雖然是專—的，但這類療法全都聚焦在涉及疾 病之病理學的單-組份。因&，這類療法典型地僅提供部 分或暫時的益處，因為炎性反應的補償性質與其他留下來 參與該病理學過程的炎性細胞介素與生長因子的存在。 已經發展出提供更廣泛之方法，藉著乾定疾病之細胞 介體，治療具有免疫調節組份之炎性疾病及其他症狀的療 法。在這類#定細胞的療法中，包括含有#素部分的那些， 以及能夠藉著各種機制進入一或多個細胞内，結果除去該 細胞者。這類分子的範例係在㈣申請㈣〇9/36〇,242 號、〇9/453,851號和09/792,793號，現為美國專利第 7，166,702號、7，157,418號和7，192,736號中所陳述之任一 者。可設計這類共軛物，以專一且可預料地之方式靶定與 疾病病理學有關的細胞類型，並因此可用於疾病治療。融 合蛋白共軛物係在宿主細胞中生產。然而，在該共軛物中 的毒素部分，限制了這些分子的有效生產 雖然這類分子 疋，知可制的，但為了廣泛散播及使用仍需要有效的 大量生產。因A，在本文之目標中，目的之—是提供更有 效生產毋素及含有该毒素之共輕物的方法。 201235469 【發明内容】 發明概要 在本文中提供生產治療分子之方法，以及經修改毒素 共軛物於靶定與炎性或免疫調節疾病或症狀之病理學有關 的細胞介體之用途。特定而言，所提供者係經修改毒素多 肽、含有該經修改毒素多肽之共軛物，以及產製和製備該 經修改毒素多肽的方法。該經修改毒素多肽（及/或含有其等 之共車厄物）在表現其等之宿主細胞中顯示出降低毒性，與未 經如此修改之毒素多肽相比較，允許更高水平的表現。該 修改出現在該多肽的原始胺基酸序列中。 所提供者係挑選或鑑認經修改之核糖體失活蛋白質 (ribosome inactivation protein，RIP)或其活性部分或片段的 方法藉著在宿主細胞或細胞群中表現來鑑認之。特定而 言’與用在本文之挑選方法中的起始RIP蛋白質相比較， 該方法挑選具有降低的對宿主細胞的毒性的RIp ^在實行本 文提供之方法時，將編碼RIP或其活性部分的核酸導入宿 主細胞内，讓該細胞生長，分離生長的細胞，並從生長的 細胞中分離表現Rip的細胞。可進行本文提供之方法，使 得細胞生長在不含挑選調節子，例如腺嘌呤類似物，如4_ 胺基吼唾并[3,4-d]嘧啶（4-APP)的培養基中。本文提供之方 法更可含有擴展該表現RIP之細胞的步驟。在一實例中， 鑑3忍、分離或純化在該經分離之細胞中表現的RIP。可藉著 其序列或其分子量鑑認RIP。在某些情況下，可藉著定序鐘 201235469 RIP亦提供由該方法產生的RIP。 去的某些貫例中，使帶有編碼RIp之核酸的細胞 在挑選凋卽子的存在下生長。挑選調節子可以{ RIP抑制 劑，例如腺嘌呤類似物。腺嘌呤類似物可以是4-胺基吼唑 并[3’4-d>密唆（4_App)。在使用挑選調節子如⑽抑制劑（例 如腺^令類似物’如4_APP)時，選擇濃度使得它對宿主細 疋有母〖生的。在某些觀點中，選擇濃度以抑制rip對 宿主細胞的毒性。在-實例中，與缺少RH>抑制劑♦票呤 類似物或4-APP相比較’毒性的抑制足以增加Rip表現的 量。例如，抑制RIP的毒性〇.1%、〇 5%、1%、5%、1〇%、 15〇/〇、20%、30%、4〇%、5〇%、6〇%、7〇%、8〇%、9〇%、95% 或100%。在rIP抑制劑為4_App的情形，在本文提供之方 法中使用的抑制劑濃度是大約或為〇 lmM到大約或 5.0mM。至於其他的抑制劑，可憑經驗或藉著參考4_App 來判定適合的濃度。在某些實例中，4_App的濃度是在大約 或為0.1到2、3或4mM之間，或為0 2、〇 3、〇 4、〇 5、 0.6、〇_7、0.9或ImM。在其他的實例中，4_App的濃度是 大約或為0.5mM。 因此，所提供者係挑選具有降低毒性之毒素的方法， 還有生產該具降低毒性之毒素的方法。挑選方法鑑認出具 降低毒性之毒素。這類毒素，當將編碼其等之核酸導入細 菌内以進行表現時，正常不被表現，但通常以低水平表現。 挑選方法尋找被表現的毒素，然後擴展表現具降低毒性之 毒素的細胞，以允許表現。亦提供者為生產方法，其為另 10 201235469 一種藉著使細胞在抑制劑（如4-APP，典型地是低劑量的 ‘ 4-APP)的存在下生長來挑選突變種之方式，該抑制劑進一 -步抑制了高水平的毒性，結果產生了毒素，還有保留彳艮多 毒性，但不像野外型那麼多的突變種。 因此’挑選方法允許鑑認具降低毒性的毒素。可以比 野外型更咼的水平’生產這類經修改毒素。在生產方法中， 可在4-APP(通常是比在挑選方法中所使用的更高的濃度） 的存在下表現野外型或經修改毒素，以使該毒素的毒性較 低。若在挑選方法中鑑認的經修改毒素之毒性已經比野外 型更低，則4-APP的存在會進一步限制毒性，而得以產生 比野外型或在缺少4_APP時之突變種更多的毒素，或使用 較低濃度4-APP。在所有的情況下，保留足夠的毒性，使其 =成為適合用於本文方法的胞毒性毒素。言亥毒素是如此地 毒，即使大量降低其等的毒性，如降低至1%毒性其等對 於本文之方法仍是足夠毒的。 方面，在本文提供之方法中的宿主細胞為真核生物 月已另方面，在本文之方法中使用的宿主細胞為原核 生物細胞，例如大腸桿菌。 在本文提供之方法中’由經導人之核酸分子編碼的咖 可以是第I型RIP或其活性片段。例如在本文之方法中使用 ip ^括，但不限於康乃馨蛋白（dianthin)3〇、康乃馨蛋 白32、萊屈寧（lychnin)、4草毒蛋白（〒叫]、息草毒蛋 皂草毒蛋白_3、4草毒蛋白_4、皂草毒蛋白_5、息草 母蛋白-6、皂草毒蛋白_7、皂草毒蛋白_8、皂草毒蛋㈣、 201235469 PAP、ΡΑΡΠ、PAP-R、PAP-S、PAP-C、馬帕明（mapalmin)、 多迪肯郡（dodecandrin)、拜歐丁（bryodin)-L、拜歐丁、拜歐 丁 - Π、克雷芬（clavin)、大腸桿菌素（c〇ucin)_i、大腸桿菌 素-2、絲瓜籽蛋白（luffin)-A、絲瓜籽蛋白-B、絲瓜籽蛋白、 19K-PSI ' 15K-PSI、9K-PSI、α-克里洛文（kiril〇win)、（3_ 克 里洛文、截短型細胞毒素（gel〇nin)、地膚子皂苷 (momordin)、地膚子皂苷 Π、地膚子皂苷-I 〇、紫茉莉抗病 毒蛋白Antiviral Protein，MAP)、ΜΑΡ-30、α-苦 瓜籽毒蛋白（momorcharin)、β-苦瓜籽毒蛋白、天花粉蛋白 (trichosanthin)、ΤΑΡ-29、栝樓籽毒蛋白（trichokirin)、大麥 RIP I、大麥 RIP Π、曲亭（tritin)、亞麻 rip、玉蜀黍 RIP3、 玉蜀黍RIP9、玉蜀黍RIPX、阿司帕林或阿司帕 林-2 〇 在本文提供之方法的其他實例中，由經導入之核酸分 子編碼的RIP為第Π型RIP，其催化次單元或其活性片段。 例如，在本文之方法中使用的RIp包括，但不限於志賀毒 素（Stx)類心貞·^素Π (Stx2)、蒴蓮素（v〇ikensin)、蓖麻毒 素、尼格林（nigrin)_CIP-29、相思豆毒素、維古明（vircumin)、 藥蓮毒素（modeccin)、依布利亭（ebuUtin)_a、依布利亭、 依布利亭-γ或黃樟毒蛋白（p〇rrectin)。一方面，經導入之核 酸編碼RIP次單元A或其活性片段。另一方面，經導入: 核駄編碼rip志贺毒素的次單元ai(sai)。該sAi可以是 經截短的Μ列如，可藉著刪除在冰或c_端的丨、2、3、4、 5 6、7 ' 8、9、1〇、11或12個相鄰胺基酸，截短⑷。 12 201235469 在另一實例中，可藉著以另一個胺基酸-如Ser置換Cys， 來修改S A1。在本文提供之方法中，被導入宿主細胞内之核 酸的範例，為編碼具有在SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24 中陳述之胺基酸序列的S A 1之核酸分子。例如，可由含有 在SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23中陳述其序列之鹼基的 核酸分子編碼SA1。 在本文提供之方法中，可將由經導入之核酸分子編碼 的RIP與配體共輕，形成配體-毒素共輛物。在該共輕物中 的RIP和配體，可經由共價或離子鍵直接連接。例如，可 經由連接子，如肽、多肽或胺基酸接合RIP和配體。連接 子之範例為Ala-Met連接子。典型地，該配體-毒素共輛物 為融合蛋白。 在該配體-毒素共軛物中的配體可以是趨化因子受體靶 定劑、非-趨化因子之細胞介素、激素、生長因子、對細胞 表面受體專一的抗體、TNF超家族配體和特徵辨認受體 (pattern recognition receptor，PRR)配體。在一實例中，該 配體為生長因子，如VEGF。在另一實例中，該配體為趨化 因子受體靶定劑，如趨化因子或趨化因子之片段，或與趨 化因子受體專一結合的抗體，或抗體之片段，其中該片段 與趨化因子受體結合。在配體為抗體之情況，其可以是單 株抗體或其抗原-專一性片段。單株抗體的範例是對抗原專 一的那些，抗原包括但不限於（DARC)、D6、CXCR-1、 CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR6、 CXCR7、CCR小 CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、 13 201235469 CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1 和 XCRJ。 在額外的實例中，該配體為趨化因子。在本文之方法 中使用的配體-毒素共軛物中之趨化因子的範例包括，但不 限於單核細胞趨化蛋白-l(monocytes chemotactic protein， MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、嗜酸性白血球 趨化蛋白1(嗜酸球趨化蛋白（Eotaxin)-l)、嗜酸球趨化蛋白 -2、嗜酸球趨化蛋白-3、基質衍生因子-1 yS ( stromal derived factor-1 β，SDF-1 β ) 、SDF-1 α、SDF-2、巨嗟細胞抑制蛋 白質 1 a (macrophage inhibitory protein 1 a ，MIP-1 a.)、 MIP-1 yS 、ΜΙΡ-1γ、MIP-2、MIP-2a 、MIP-2y8 、MIP-3、 MIP-3 /3、MIP-3 a、MIP-4、MIP-5、活化後立即調節的， 正常T細胞表現和分泌的（Regulated on Activition，Normal T cell Expressed and Secreted，RANTES)蛋白質、介白素 -8(IL-8)、生長調節蛋白 a (grow regulated protein α，GRO-a)、干擾素-可誘導之蛋白質 10(interferon-inducible protein 10 ’ IP-10)、巨嗤細胞-衍生之趨化因子（macrophage-derived chemokine ’ MDC)、顆粒球趨化蛋白 2(granulocyte chemotactic protein 2，GCP-2)、上皮-衍生之嗜中性白血球 -活化性蛋白質 78(epithelial-derived neutrophil-activating protein 78 ’ ENA-78)、血小板鹼性蛋白質（platelet basic protein ’ PBP)、r干擾素-誘導之單核細胞活素（gamma
interferon-induced monokine，MIG)、血小板因子 4(platelet factor 4，PF-4)、血液濾液 CC 趨化因子 l(hemofiltrate CC chemokine 1，HCC-1)、胸腺和活化-調節之趨化因子（thymus 201235469 and activation-ragulated chemokine，TARC)、淋巴細胞趨化 - 因子（lymphotactin)、肺活素（lungkine)、CIO、肝-表現之 • 趨化因子（liver-expressed chemokine，LEC)、艾索朵斯 (exodus)-2(SLC)、胸腺表現之趨化因子（thymus expressed chemokine，TECK)、皮膚的T-細胞吸引性趨化因子 (cutaneous T-cell attracting chemokine，CTACK)、黏膜-結 合之上皮趨化因子（mucosae-associated epithelial chemokine，MEC)、單一 C 基序 1-厶（single C motif 1-β， SCM-1 /3 )、干擾素-可誘導之T-細胞α化學吸引劑 (interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant，I-TAC)、 乳房和腎臟-表現的趨化因子（breast and kidney-expressed chemokine ’ BRAK)、人神經趨化蛋白（fractalkinee〇 B_細胞 吸引性趨化因子 1(B cell-attracting chemokine 1，BCA-1)， 及其對偶基因或物種變體。在一實例中，該趨化因子為 MCP-卜嗜酸球趨化蛋白」、SDF-Ιβ、GRO-a、MIP-Ιβ、IL-8、 IP-10、MCP-3、ΜΙΡ-3α、MDC、MIP-Ια 和 BCA-1，及其對 偶基因或物種變體的任一者。在其他實例中，該趨化因子 為MCP-1。編碼配體毒素共軛物之核酸的範例為編碼具有 在SEQ ID NO:3 8或SEQ ID NO:40中陳述之胺基酸殘基的 序列之配體-毒素共輛物的核酸分子。在這類核酸分子中 者，是具有在SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39中陳述之序 列的那些。 在本文方法的一項觀點中，與由經導入之核酸分子編 碼的RIP相比較，該經鑑認之RIP含有突變。在本文提供 15 201235469 之方法中，就其毒性評估該經鑑認之。可藉著包括彳曰不 限於蛋白質合成測定、脫嘌呤測定和細胞生長/活力測定的 測定來評估毒性。典型地’肖由經導人之核酸分子編碼的 RIP相比較，經鑑認之RIP仍保留毒性。該經鑑認之Rip 保留了 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%、20%、30%、40〇/〇、50%、60%、7〇%、8〇%、9〇% 或更 多毒性。 在本文之方法中亦提供生產經鑑認之RIp的額外步 驟。這類方法包括將編碼該經鑑認之RIp或其活性片段的 核酸分子導入宿主細胞内，在RIP抑制劑的存在下培養該 細胞，其中選擇該RIP抑制劑的量以減少RIp多肽的毒性； 並使該細胞在條件下生長，藉此產生RIp或其活性片段。 可純化5亥RIP，通常使得所表現或純化或兩者的量比在 缺少RIP抑制劑之下更多。 在本文中提供之方法亦包括製備含有經鐘認RIp之共 軛物的更多步驟。在本文提供之方法中，該方法亦包括合 成經鑑認之RIP，或含有該經鑑認之RIp的共扼物。 在本文中亦提供者係增加核糖體失活蛋白質（RIp)或其 活性片段生產的方法。這類方法允許有效產生RIp，或含有 RIP之共軛物，例如，以提供用以作為治療劑之這類共軛物 的可實行來源。在本文之生產方法中，將編碼RIp或其活 性片段的核酸導入宿主細胞内。在RIp抑制劑的存在下培 養S亥細胞’使所選擇之RIP抑制劑的量得以減少RIP之毒 性。在本文之增加生產的方法中，使細胞生長在RIp或其
16 S 201235469 活性片段被生產的條件下。一方面，該生產方法包括純化 MP的步驟。典型地，所表現或純化或兩者之RIP的量比在 缺少RIP抑制劑之下更多。 在本文提供之生產方法中，由經導入之核酸分子編碼 的RIP可以是第！型RIP，或其活性片段。例如，在本文之 方法中使用的RIP包括，但不限於康乃馨蛋白％、康乃馨 蛋白32、萊屈寧、皂草毒蛋白_卜4草毒蛋白_2、息草毒 蛋白小4草毒蛋白―4、皂草毒蛋白-5、4草毒蛋白_6、息 草毒蛋白_7、4草毒蛋白·8、4草毒蛋白·9、ΡΑΡ、ΡΑΡΠ、 PAP-R、PAP-S、ΡΑΡ-Ρ、巨 αα η〇 办 c馬帕明、多迪肯郡、拜歐丁 _L、 早。"丁 #歐丁 π、克雷芬、大腸桿菌素」、大腸桿菌素 _2、絲瓜軒蛋白-A、絲瓜籽蛋白、絲瓜籽蛋白·S、i 9K-PSI、 15K-PSI、9K-PSI、α·身里、'么夺 β 土 , 、卜克里洛文、截短型細胞 地膚子皂苦、地膚子息*-π、地膚子皂普_Ic、紫 末利抗病毒蛋白（ΜΑΡ)、ΜΑΡ_30、α苦瓜軒毒蛋白、卜苦瓜 籽毒蛋白、天花粉蛋白、ΤΑΡ_29、栝樓籽毒蛋白、大麥 RIP I、大麥 RIP ΤΤ、a 古 . T、亞麻RIP、玉蜀黍RIp3、玉蜀 泰贈、玉蜀黍RIPX、阿司帕林]或阿司帕林小 在本文提供之生產方法的其他實例中，由經導入之核 /子編碼的RIP為第2型RIP’其催化次單元或其活性片 丰又。例如，在本文之方法中 力α主本〜、 中使用的RIP包括’但不限於志 = 志賀毒素n(stx2)、賴蓮素、萬麻毒素、尼 才口林- CIP-29、相田、s主主 心|素、維古明、藥蓮毒素、依布利亭_ «、依布利亭-召、依右丄 布利苧-r或黄樟毒蛋白。一方面，經 17 201235469 導入之核酸編碼RIP次單元A或其活性片段。另一方面， 經導入之核酸編碼RIP志贺毒素的次單元A1(SA1)。該 可以是經截短的。例如’可藉著刪除在N_或c_端的1、2、 3、4 ' 5、6、7、8、9、1〇、n或12個相鄰胺基酸，截短 SA1。 一方面，修改由經導入之核酸編碼的RIp(例如SA1)。 在貫例中，可藉著以另一個胺基酸-如Ser置換Cys ,來 修改SA1。在另一實例中’關於在具有在SEq IDn〇:22中 陳述之胺基酸序列的S A1中之胺基酸位置，藉著置換位置 3 8或位置219之一或兩者，來修改s A1。例如，該胺基酸 置換可對應L3 8R及/或V219 A。在一實例中，該胺基酸置 換相當於V219A。在本文提供之方法中，被導入宿主細胞 内之核酸的範例是編碼具有在SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28中陳述之胺基酸序列之sA1的核酸分子。例如該s A1 可由含有在SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29中陳述其序列 之核苷酸的核酸分子編碼。 在本文提供之生產方法中，該RIP抑制劑為腺嘌呤類 似物。例如’該腺嘌呤類似物為4-胺基吡唑并[3,4-d]嘧啶 (4-APP) ^通常，在本文之生產方法中，選擇該RIp抑制劑_ 腺嘌呤類似物或4-APP的濃度，使得其有效降低RIP之毒 性至或大約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90% ' 91% ' 92% ' 93% ' 94% ' 95% > 96% ' 97% ' 98% ' 99% 或1 00%。在該RIP抑制劑為4-APP之情況，在本文之方法 中所使用之濃度為大約或是ImM到大約或40.0mM。在一 18 201235469 實例中’該4-APP之濃度是在大約或為2 〇mM、3 〇mM、 • 4.〇mM、5.0mM、6.〇mM、7.0mM、8.0mM、9.0mM、l〇.〇mM、 . 1 5.0mM 或 20.0mM 之間。 一方面’在本文提供之生產方法中者，是在真核生物 宿主細胞中生產。另一方面，是在原核生物宿主細胞中生 產，例如大腸桿菌。 在本文之生產方法中，可在生產方法中使用誘導劑， 而得以在利用該誘導劑誘導之後，表現RIp多肽。該誘導 劑可以是IPTG。在本文之生產方法中所使用的RIp抑制 劑，可在加入誘導劑之前、期間及/或之後加入。 在某些方面，使用本文之生產方法以增加含有RIp之 共軛物的生產。在這類方法中，編碼RIP之核酸分子包括 編碼配體的核苷酸序列，藉此使該分子編碼配體-毒素共軛 物。在該共軛物中的RIp和配體可經由共價或離子鍵直接
連接。例如，可經由連接子-如肽、多肽或胺基酸，接合RIP 和配體。連接子的範例為Ala_Met連接子；該Met可被納 =成為在所連接之多肽中的起始密碼子。典型地，該配體-毒素共輛物為融合蛋白。 提供含有一或多個受體 靶定劑，如趨化因子-受 體靶 定 ’其直接或經由連接子與 一或多個被把 定 劑 連接的 共軛 物 。特疋而言，在本文中提供 之共耗物含有 下 列 的組份 :(受 體 乾定劑）n、（L)q和（被靶定 劑）m，其中至 少 個受體 靶定 劑 ，如受體配體或受體_專一 性抗體，或該 配 體 或抗體 之有 效 刀，直接或經由一或多個連接子（L)與 至 少 一個被靶定 19 201235469 劑連接。L意指連接子。考慮到在共軛物之元件中任何適當 的結合，只要所得的共軛物與經靶定受體產生交互作用， 而得以70成經結合之被靶定劑的内化即可。在本文提供之 共軛物中，被靶定劑是經修改毒素，如經修改RIP或其毒 性片段。在其原始胺基酸序列中修改該毒素或片段，使得 其對在其中表現以產生其之宿主細胞的毒性比其未經修改 形式更低。藉著在本文中提供之方法修改該毒素或共軛物。 變數η和m是1或更大的整數，而q為〇或任何整數。 選擇變數η、q和m，使得所得的共軛物與經靶定受體產生 父互作用，並由已經被靶定之細胞内化該被靶定劑。典型 地，η是在丨到3之間；q是〇或更多，視所連接之靶定和 被靶定劑的數目及/或連接子的功能而定，q通常是丨到4; m為1或更多，通常是丨或2。當在共軛物中出現一個以上 的被靶定劑時，該被靶定劑可以是相同或不同的。同樣的， 當在共軛物中出現一個以上的受體靶定劑時，其等可以是 相同或不同的。 可以融合蛋白之形式-其可以是經化學偶聯的或包含融 合蛋白部分和經化學連接部分或其任何組合，生產本文提 供之共軛物。為了本文之目的，受體靶定劑為任何劑，典 型地是多肽，其專一地與受體交互作用，如在經活化白血 球上的趨化因子受體，並在與受體交互作用後，將所連接 或另行結合之被靶定劑-如打算由被靶定細胞内化的毒素内 化。 在配體-毒素共軛物中的配體可以是趨化因子受體靶定 20 201235469 劑、非-趨化因子之細胞介素、激素、生長因子、對細胞表 . 面受體專一的抗體、TNF超家族配體和特徵辨認受體（PRR) . 配體。在一實例中，該配體為生長因子，如VEGF。在另一 實例中，該配體為趨化因子受體靶定劑，如趨化因子或趨 化因子之片段，或與趨化因子受體專一結合的抗體，或抗 體之片段，其中該片段與趨化因子受體結合。在配體為抗 體之情況，其可以是單株抗體或其抗原-專一性片段。單株 抗體的範例是對選自包括，但不限於（DARC)、D6、CXCR-：l、 CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CCR-1、 CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、 CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1 和 XCR1 之抗原專一的 那些。 在額外的實例中，該配體為趨化因子。在本文之方法 中所使用的配體-毒素共軛物中之趨化因子的範例包括但不 限於單核細胞趨化蛋白-l(MCP-l)、MCP-2、MCP-3、 MCP-4、MCP-5、嗜酸性白血球趨化性蛋白質1(嗜酸球趨化 蛋白-1 )、嗜酸球趨化蛋白-2、嗜酸球趨化蛋白-3、基質衍生 因子-1泠、SDF-1 a、SDF-2、巨噬細胞抑制蛋白質1 ο; (MIP-1 a )' ΜΙΡ-1 β ' ΜΙΡ-1γ ' ΜΙΡ-2 ' ΜΙΡ-2 a > ΜΙΡ-2 β > ΜΙΡ-3 ' ΜΙΡ-3 /3、ΜΙΡ-3 α、ΜΙΡ-4、ΜΙΡ-5、活化後立即調節的， 正常Τ細胞表現和分泌的（RANTES)蛋白質、介白素 -8(IL-8)、生長調節蛋白^ (GRO-α )、干擾素-可誘導之蛋 白質ΙΟ(ΙΡ-ΙΟ)、巨噬細胞-衍生之趨化因子（MDC)、顆粒球 趨化性蛋白質2(GCP-2)、上皮-衍生之嗜中性白血球-活化性 21 201235469 蛋白質78(ENA-78)、血小板驗性蛋白質（pBp)、了干擾素 誘導之單核細胞活素（MIG)、灰小极因子4(pE_4)、血液據 液CC趨化因？ KHCCM)、月匈腺和活化_調節的趨化因= (TARC)、淋巴細胞趨化因子、肺活素、ci〇、肝表現之趨 化因子（LEC)、艾索朵斯ASLC)、胸腺表現之趨化因子 (TECK)、皮膚的T-細胞吸引性趨化因子（ctack)、黏膜 結合之上皮趨化因子(MEC)、單_ c基序】邻cm_…、 干擾素-可誘導之τ-細胞α化學吸引劑（I_TAC)、乳房和腎臟 -表現的趨化因子（BRAK)、人神經趨化蛋白和B細胞吸引性 趨化因子l(BCA-l)，及其對偶基因或物種變體。在一實例 中，該趨化因子為MCP-1、嗜酸球趨化蛋白]、SDF ip、 GRO-α、ΜΙΡ-Ιβ、IL-8 ' IP-lo、Mcp_3、ΜΙρ_3α、MDc、 ΜΙΡ-1α和BCA-1 ’及其對偶基因或物種變體的任一者。在 其他實例中’該趨化因子為Mcp_i。 在配體-毒素共軛物中的毒素部分可以是志贺毒素 '其 催化活性片段，或其活性片&。例如，在本文之方法中產 生的配體-毒素共軛物中之毒素部分可以是SA1。在配體_ 毒素共軛物中的毒素部分，％ SA1可以是經修改毒素。編 碼在本文之方法中產生的配體毒素共軛物之核酸的範例為 編碼具有任何 SEqIDn〇:42、44、46、48、5〇、52、54、 58 60 62、64或67陳述之胺基酸殘基之序列的配體 毒素共輕物之核酸分子。在這類核酸分子中者，是具有在 任何 SEQ ID NO:41、43、45、47、49、50、53、55、57、 59、61、63、65或66中陳述之序列的那些。 22 201235469 所提供者係經修改毒素，特別是經修改RIp，與起始材 料相比較’（其為RIP，包含野外型和變體rip )顯示出降 低的毒性。在這類經修改RIP毒素或其共軛物中，包括任 何在本文之方法中經過鑑認的。 在本文中提供之經修改毒素中者，是經修改志贺毒素 多肽或其活性片段，其在志贺毒素、其對偶基因或物種變 體、其具催化活性的部分或其活性片段中具有一或多個胺 基酸修改，使得該修改賦予降低的毒性。在一實例中，該 一或多個胺基酸修改是置換一或兩個位置對應於關於具有 SEQ ID NO:22中陳述之胺基酸序列的志贺毒素Ai次單元 (SA1)中之胺基酸位置的位置38及/或219。在本文中提供 之經修改志賀毒素’對具有在SEQ ID NO:22中陳述之胺基 酸序列的多肽，具有至少大約40〇/〇、50%、60%、70%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，且其包 含在相當於胺基酸位置38及/或219之位點處的修改。在位 置38及/或219處的修改中者’是相當於L38r及/或V219A 的那些。經修改志贺毒素包含次單元A。例如，經修改志贺 毒素可僅包含志贺毒素的SA1，或其活性片段。該sa 1可 以是經截短的。例如’可藉著在冰或C —端刪除卜2、3、4、 5、6、7、8、9、10、η或12個相鄰胺基酸，截短該經截 短之SA1。經修改志贺毒素的範例為具有在SEq id 或28中陳述之胺基酸序列的那些，或其對偶基因或物種變 體。 在本文中亦提供含有被靶定劑的共軛物，該被靶定劑 23 201235469 為經修改之核糖體失活蛋白質（RIP)，如任何在本文之 中鑑認的經修改RIP。亦提供者係含有被靶定劑的共軛物\ 該被靶定劑為經修改志賀毒素，或其活性片段，如任何如 上文提及的經修改志賀毒素。該共軛物亦包含靶定劑，或 其一部分，其有助於該共軛物與細胞表面受體的結合，結 果將該被靶定劑内化至攜帶該受體的細胞中。 在這類共輛物中者，是具有下列組份的那些：（靶定 劑）n、（L)q和（被靶定劑h，其中為連接子，連接該靶定劑 與被靶定劑，該靶定劑是任何選擇性地與細胞表面受體2 合的部分，分別選擇 使其為至少1，且q為0或更 彳口 ，——〆 - 一 η ^5/ ν > 多’只要所得的共軛物與該經靶定受體結合，被内化並站 所得的共軛物與受體結合， 送該被乾定劑即可。典型地 藉此將該被把定劑 該受體與靶定劑交互作用並將其内化 内化至攜帶該受體的細胞中。在某些情況下，在該共軛物 含有多個㈣定劑之情況’該㈣定劑可以是相同或不同 的八聖地，5亥被靶定劑全都是Rip毒素的經修改形式。 再者，當該共輛物含有多㈣定劑時，㈣定劑是相同或 不同的在貫例中，分別選擇m和n，使其為卜6。在另 一實例中，q為l’n為2且瓜為卜 在本文中提供之共軛物中 TNF超家族配體和特徵辨認受 δ玄配體為生長因子，如vegf 劑’像是但不限於趨化因子 胞介素、激素、生長因子、 該靶定劑包括受體粑定 受體靶定劑、非-趨化因子之細 對細胞表面受體專一的抗體、 體（PRR)配體。在一實例中’ ，在另一實例中，該配體為趨 24 201235469 化因子受體靶定劑，如趨化因子，或趨化因子之片段，或 與趨化因子受體專一結合的抗體，或抗體之片段，其中該 片段與趨化因子受體結合。在配體為抗體之情況，其可以 是單株抗體或其抗原-專一性片段。單株抗體的範例是對下 列抗原專一的那些，抗原包括但不限於（DARC)、D6、 CXCR小 CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、 CXCR6、CXCR7、CCR小 CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、 CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1 和 XCR1。 在額外的實例中，該配體為趨化因子。在本文提供之 配體-毒素共軛物中的趨化因子之範例包括，但不限於單核 細胞趨化蛋白- l(MCP-l)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、 嗜酸性白血球趨化蛋白1(嗜酸球趨化蛋白-1)、嗜酸球趨化 蛋白-2、嗜酸球趨化蛋白-3、基質衍生因子-1 /3、SDF-1 α、 SDF-2、巨噬細胞抑制蛋白質 1 α (ΜΙΡ-1 a )、ΜΙΡ-1冷、 ΜΙΡ-1γ > ΜΙΡ-2 ' ΜΙΡ-2 α ' ΜΙΡ-2 ^ > ΜΙΡ-3 ' ΜΙΡ-3 β > ΜΙΡ-3 α、ΜΙΡ-4、ΜΙΡ-5、活化後立即調節的，正常Τ細胞 表現和分泌的（RANTES)蛋白質、介白素-8(IL-8)、生長調節 蛋白α (GRO-α )、干擾素-可誘導之蛋白質l〇(IP-l〇)、巨噬 細胞-衍生之趨化因子（MDC)、顆粒球趨化蛋白2(GCP-2)、 上皮-衍生之嗜中性白血球-活化性蛋白質78(ENA-78)、血 小板驗性蛋白質（PBP)、γ干擾素-誘導之單核細胞活素 (MIG)、血小板因子4(PF_4)、血液濾液CC趨化因子 1 (HCC-1)、胸腺和活化-調節的趨化因子（TARC)、淋巴細胞 25 201235469 趨化因子、肺活素、C10、肝-表現之趨化因子（LEC)、艾索 木斯'2(SLC)、胸腺表現之趨化因子（TECK)、皮膚的T-細胞 吸引性趨化因子（CTACK)、黏膜結合之上皮趨化因子 (MEC) '單一 C基序1-卢（SCM-1万）、干擾素-可誘導之T-細胞α化學吸引劑（I_TAC)、乳房和腎臟表現的趨化因子 (BRAK)、人神經趨化蛋白和B-細胞吸引性趨化因子 1 (BCA-1) ’及其對偶基因或物種變體。在一實例中，該趨 化因子為MCP-1、嗜酸球趨化蛋白·i、SDF-Ιβ、GRO-α、 ΜΙΡ-1β、IL-8、IP-io、MCP-3、MIP-3a、MDC、MIP-la 和 BCA-1，及其對偶基因或物種變體的任一者。在其他實例 中，該趨化因子為MCP-1。 在本文提供之共軛物中的靶定劑，專一地與在一或多 個免疫效應細胞，或其他與免疫或炎性反應有關之細胞上 的一或多個細胞表面受體結合。在一實例中，該免疫效應 細胞或細胞群是白血球。在另一實例中，其他與免疫或炎 性反應有關的細胞是組織居留細胞（tissue residential cell， TRC)。藉著本文提供之共軛物靶定的細胞包括，但不限於 單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、T細胞、B細胞、嗜酸性 白血球、嗜鹼性白血球、肥大細胞、自然殺手（NK)細胞和 嗜中性白血球。在巨噬細胞中包括組織巨噬細胞，如肺泡 巨嗤細胞、小神經膠質細胞和庫弗細胞（kupfer cell )。在 樹突細胞中包括未成熟的樹突細胞、成熟樹突細胞和朗格 漢斯細胞（lnagerhans cell)。在τ細胞中包括CD4 + (如T1U、 Th2或Thl7細胞）和CD8+ T細胞。在TRC中包括腎小球膜 26 (0 201235469 細胞、神經膠質細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘤細胞、 纖維母細胞和滑膜細胞。可活化被該共軛物靶定的細胞。 例如，細胞活化可誘導被該共輛物靶定之一或多個細胞表 面受體的表現。 在本文提供之共軛物中者，是靶定與一或多個趨化因 子結合之細胞表面受體的那些。這類趨化因子受體包括， 但不限於 CXCR1、CXCR2、CXCR3A、CXCR3B、CXCR4、 CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCiU、CCR2A、CCR2B、CCR3、 CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、XCR1 和 CX3CR-卜該共軛物與趨化因子受體的結合，促進了將該共 軛物内化至攜帶該受體之細胞内的作用。 在本文提供之共輛物中，經由共價或離子鍵來連接乾 定劑和被靶定劑或其活性片段。例如，在共軛物中的經修 改RIP和配體，可直接經由共價或離子鍵來連接。在某些 情況下，可經由連接子（如肽、多肽、胺基酸或化學連接子） 接合RIP和配體◊連接子的範例為Ala_Met連接子。連接子 的範例亦包括，但不限於N_琥珀醯亞胺基（4_碘乙醯基）_胺 基苯曱酸酯、硫代琥珀酿亞胺基（4_碘乙醯基胺基苯甲酸 酯、4-琥珀醯亞胺基_氧羰基_α_(2_吡啶二硫代）曱苯、硫代 琥珀醯亞胺基-6-(α-甲基-α_(吡啶二硫代甲苯醯胺基 (toluamido))己酸酯、Ν-琥珀醯亞胺基_3_(2_吡啶二硫代）_ 丙酸酯、琥珀醯亞胺基6-(3-(2-吡啶二硫代）_丙醯胺基）己酸 酯、硫代琥珀醯亞胺基6-(3 -(2-吡啶二硫代）_丙醯胺基）己酸 酯、3-(2-吡啶二硫代）-丙醯肼、艾爾曼氏（EUman，s)試劑、 27 201235469 二氣三畊酸和S-(2_硫代吡嗦其 1乂比定基）-L-半胱胺酸。 在本文中提供的是見右名紅"〇τ_ '、有在任何 SEQ ID ΝΟ:44、46、48 5 0、5 2、5 4、5 6、S s、< λ 广 ^ 、62、64或67中陳述之胺基酸片 列的共軛物。 亦徒供者係含有任何在本文中提供之經修改毒素共輕 物，如任何具有經修改SA1的醫藥組合物。該醫藥組合物 含有在藥學上可接受的賦形劑，並可為了任何適當的投藥 路徑來調配’路徑包括但不限於全身、口服、經鼻、肺臟、 局部和區域投藥。亦提供含有任何醫藥組合物、投與該組 口物之裝置，可視需要還有投藥說明的套組。 亦提供編碼任何在本文中提供之共輛物的核酸分子。 亦提供者係含有該核酸分子的質體，以及含有該核酸分子 或質體的細胞》 在本文中亦提供使毒素乾定細胞的方法。這類方法包 括將該共輒物投與，像是個體之試樣。所投與之共桃物含 有經修改毒素_像是任何在本文中提供的，以及細胞表面受 體乾定劑·像是配體。絲定之細胞表現適合該Μ劑的細 胞表面受體。 在本文中提供治療患有免疫或炎性疾病或病症之個體 的方法。在治療方法中，將含有任何在本文中提供之共軛 物的醫藥組合物投與個體，並使該組合物得以抑制提升二 次組織傷害之炎性細胞的增殖、移行或生理學活性。 在本文中亦提供藉著投與共扼物，如任何在本文中提 供之共概物，在動物或個體中抑制疾病或病症，或治療罹 28 201235469 患疾病或病症之動物或個體的方法，該疾病或病症是諸如 與炎性反應有關之免疫或炎性症狀及/或與一或多個細胞之 -活化、增殖和移行有關之二次組織傷害。在該方法中，該 共軛物與在一或多個細胞上表現的一或多個細胞表面受體 結合，結果將該被靶定劑内化至攜帶該受體的細胞中，藉 此抑制一或多個細胞的活化、增殖或移行。在一實例中， 該治療是哺乳動物的。在另一實例中，該治療為人類的。 在δ亥方法中’該一或多個細胞可以是免疫效應細胞或 其他與免疫或炎性症狀有關的細胞。在一實例中，該免疫 效應細胞是白血球。在另一實例中，該其他與免疫或炎性 症狀有關的細胞是組織居留細胞。該細胞包括，但不 限於單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、T細胞、B細胞、嗜 酸性白血球、嗜鹼性白血球、肥大細胞、自然殺手（NK)細 胞和嗜中性白血球。在巨嗟細胞中包括組織巨嗟細胞，如 肺泡巨噬細胞、小神經膠質細胞或庫弗細胞。在樹突細胞 中包括未成熟的樹突細胞、成熟樹突細胞或朗格漢斯細 胞。在T細胞中包括CD4 + (如Thl、Th2或Thl7細胞）和 CD8+ T細胞。在trc中包括腎小球膜細胞、神經膠質細胞、 上皮細胞、腫瘤細胞、纖維母細胞和滑膜細胞。在某些情 況下’活化一或多個細胞，而得以，例如向上調節在細胞 上表現的細胞表面受體。 在本文抑制疾病或病症之方法的觀點中，該共辆物抑 制了一或多個涉及下列疾病或病症之細胞的活化、增殖或 移行：像是，但不限於CNS傷害、CNS炎性疾病、神經變 29 201235469 性病症、心臟病、炎性眼睛 、在 ^ ,, ^ 人Γ生皮膚疾病、炎性腸 病、炎性腎臟或腎病、炎性肺病、炎性鼻 :性甲^ 疾病、在肥胖和相關疾病中的炎性反應、 人I·生曱狀腺疾病、與細菌或病毒 毋4朵有關的炎性反應、癌 症和血管生成-介導之疾病。 在一實例中，該CNS炎性疾病及/或神經變性病症包 括’但不限於閉鎖型頭部外傷、腦&衍十 腦膜炎、腎上腺腦白…脈絡叢腦膜炎、 賞上料白質退化症、AIDS癡呆複合症阿兹海 ;唐氏症，陵性疲勞徵候群、腦炎、腦脊趙炎海 綿狀腦病、多發神石击命 ,Λ . 更化症 '帕金森氏症和脊髓傷害/創傷 ()在另實例中，該心臟疾病為動脈粥樣硬化◊炎性 眼睛疾病包括，但不限於增殖性糖尿病性視網膜病、增殖 性玻璃體視網膜病變、視網膜炎、鞏膜炎、鞏膜虹膜炎、 脈絡膜炎和葡萄膜炎。炎性皮膚病包括，但不限於牛皮癬、 濕疹和皮膚炎。炎性腸病可包括，但不限於慢性結腸炎、 克隆氏症和潰㈣結腸炎。炎性關節疾病包括，但不限於 幼年型風濕性關節炎、冑關節炎、風濕性關節炎和脊椎關 卽病，像是僵直性脊椎炎、瑞特氏徵候群（Reitzs syndrome )、反應性關節炎、牛皮癬性關節炎、脊椎炎、未 刀類的脊椎關節病和貝塞特氏徵候群（Behcet’s syndrome )。炎性腎臟或腎病包括，但不限於腎小球腎炎、
IgA腎病和狼瘡性腎炎。炎性肺臟疾病包括，但不限於急性 呼吸窘迫彳政候群、嗜酸性白血球性肺病、慢性嗜酸性白血 球性肺炎、急性嗜酸性白企球性肺炎、支氣管收縮、支氣 6 30 201235469 管肺發育不良、支氣管肺泡唾龄w a丄1 欣 θ酉夂性白血球增多症、過敏性 支氣官肺麴菌病、肺炎和纖維 *化肺病。炎性鼻病包括，但 不限於息肉病、鼻竇炎和鼻炎。 灸丨生甲狀腺疾病包括，但 不限於甲狀腺炎。癌症包括但赚 个丨r 7、狎經耀質瘤、動脈粥 瘤、腺癌、肉芽腫、神經膠質 貝母細胞瘤、肉芽腫病、淋巴 瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、晋晋*,庙 .. 月如瘤'肉瘤、肉狀瘤病、 小神經膠質瘤、腦膜瘤、涅灿a + 媚星狀細胞瘤、寡樹突膠質瘤、胃 或胃癌，包括胃腸癌、胰臟癌、子宮頸癌1巢癌、肝癌、 膀胱癌 '肝腫瘤 '乳癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、子 宮内膜或子宮^、唾液腺癌、腎臟或腎癌、前列腺癌、陰 唇癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌和頭與頸癌。 方面，所選擇的疾病或病症是腎臟疾病、脊髓傷害 或延遲型過敏疾病或病症。 在本文之治療或抑制疾病或病症的方法中，該共軛物 之靶定劑包括但不限於MCP-1、嗜酸球趨化蛋白_丨、sdh 沒、GRO-α、MIP-1 万、il_8、IP_1〇、Mcp_3、ΜΙρ 3α、 MDC、ΜΙΡ-1α* BCA_卜及其對偶基因或物種變體，而被 靶定劑為經修改志贺毒素。在一實例中，該靶定劑為 MCP-1。共軛物的範例包括，但不限於LpMlc、LpMid、 LPM2、LPM3、LPM4、LPM5、LPM6、LPM7、LPM8、LPM9、 LPM10和LPM11。這類共輕物分別具有在任何seq id NO:42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 或67中陳述之胺基酸的序列。 例如，該疾病可以是多發性硬化症（MS)。關於這類具 31 201235469 體事實’該被靶定細胞為表現在MS時被向上調節之受體的 那些°例如，該被靶定細胞包括表現選自，例如一或多個， 如一或至少兩個 CCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3、5、6 和 CXCR1-3、4中之受體的那些。治療MS的共軛物含有靶定 劑’如足以使所連接（直接或間接）之劑結合並將其内化的趨 化因子或其片段，其結合並被這類受體内化。因此，例如 該共輕物可含有足以與其受體結合並被内化的趨化因子或 其片段’且該趨化因子，例如係選自例如I_3〇9、MCp]、 ΜΙΡ-1 ο:、MIP-1 /3、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8 ' MIG、 10 I-TAC、SDF-1 〇:、SDF-1 0、BCA-1、嗜酸球趨化 蛋白、MCP-4、MCP-5、CIO、LEC 和 MIP_lb2 之中。這類 共軛物的範例為LPMld。 在本文之方法的實例中，該共軛物之靶定劑含有pF-4 或其對偶基因或物種變體，且該疾病或症狀為血管生成-介 導之疾病。在另—實例中，該共㈣之㈣料VEGF或 其對偶基因或物種變體，且該疾病或症狀為血管生成-介導 【實施方式】 發明之詳細說明 概述 A·定義 核糖體失活蛋白質（RIP)，其挑選、表現和生產 C.核糖體失活蛋白質（RIP)和作用方法 32 201235469
1. 例示性RIP 志贺毒素 2. RIP毒素抑制劑 4-APP及其他腺嘌呤類似物 D. 挑選經修改毒素或其共軛物的方法 1.候選的RIP蛋白質或其共軛物 2·將RIP或其共軛物導入宿主細胞内 a. 轉染 b. 轉型 c. 電穿透 3. 表現、挑選和鑑認 4. 活性評估 a. 蛋白質合成測定 b. 脫嗓呤測定 c ·細胞生長/存活/活力測定 E. 例示性經修改毒素 經修改SA1毒素 F. 靶定劑及其共軛物 1.靶定劑 a.趨化因子 i. 配體 ii. 趨化因子受體 iii. 趨化因子/趨化因子受體細胞特徵 iv. 例示性趨化因子靶定劑 33 201235469 b.非-趨化因子之細胞介素 c ·抗體配體部分 d·其他的靶定劑和受體目標 生長因子 2. 連接子部分 a.例示性連接子 i. 異雙功能的交聯試劑 U. 酸可切開的、光可切開的和熱敏感性連接 子 iii·適合化學共軛的其他連接子 iv.肽連接子 3. 例示性白血球族群調節子（lpm)共軛物 G.經修改RIP毒素及其共軛物的製備 1. 產製和選殖毒素多肽或含有毒素多肽之共 輛物的方法 2. 含有融合蛋白之共軛物的生產及表現系統 a. 用於表現的質體和宿主細胞 i·細菌細胞表現系統 ii. 昆蟲細胞表現系統 iii. 酵母菌細胞表現系統 iv. 植物細胞表現系統 V. 哺乳動物細胞表現系統 b. 純化 3.化學共輛物的生產 34 201235469 Η·增加RIP多肽或其共軛物生產的方法 增加蛋白質生產的額外方法 h測量毒素或其共輛物之活性的試管内和活體内測定 1.在試管内的活性測定 a ·基於細胞的毒性測定 b. 受體結合測定和内化 c. 趨化性測定 2·測試共軛物的活體内動物模式 a.脊趙傷害（SCI) b·創傷性腦外傷和猝發 e·阿茲海默氏症 d. 多發性硬化症 e. 關節炎和自體免疫疾病 f. 炎性肺臟疾病 g·在基因治療之後的炎性反應 h. jk管生成 i. 腫瘤生長 j. 人類免疫不全病毒（HIV) k·腎臟疾病 1.過敏 J.含有毒素及其共軛物之組合物的調配和投藥 K·使用毒素或其共概物治療疾病和病症的方法 1.免疫宿主防禦系統和炎性反應 a.體内平衡的炎性反應 35 201235469 b.病理學的炎性反應 2.候選治療劑及其限制 3·配體-毒素共軛物（即LPM) 挑選配體-毒素共輛物來治療所選擇之疾病 或病症 白jk球族群調節子的挑選和設計 4.例示性疾病 a. 癌症 b. 腎臟疾病 c. 脊髓傷害（SCI) d. 過敏 e. HIV感染和AIDS及以其他病原體感染 f·炎性關節疾病和自體免疫疾病 g. 肺臟疾病 h. 其他由二次組織傷害介導的疾病 5 ·混合治療 L.實施例 A.定義 除非另仃定義’否則所有在本文中使用的技術和科學
，除非另行陳述’全部以引用方式 有眾多對於本文名詞之定義在該章節 36 201235469 p占優勢。在提到狐或其他這類識別碼或稱呼
瞭解廷類識別碼可改變且在網際 ‘I 來麥本v u、.’罔路上可能有特殊資料來 來去去，但可藉著搜尋網際網路找到相等 裡證明這類資訊的利用性和公開傳播。 ° 那 肽it本文中使用時’毒素(亦稱為細胞毒素)意指諸如多 二Λ 類的分子，#將其内化至細胞内時，抑制該細 胞功此，如藉著抑制細胞生長及/或增殖◊毒辛可 或是對細胞有毒性。將任何在被細胞内化時，干擾或0有宝 Γ文變細Γ之代謝’或以㈣方式抑制細胞生長或增㈣ 刀子’均納入該名詞的範圍内，包括但不限於當運送至知 胞内時介導其毒性影響的分子，還有在細胞表面介㈣毒 性影響的那些。已知各種細胞毒素，並包括抑制蛋白質a 成的那些和抑制細胞生長或存活不可或缺之某些基因純 的那些。毒素包括結果導致細胞死亡的那些和抑制細胞生 長、增殖及/或分化，或另行有害地改變細胞代謝的那些。 例如，毒素包括，但不限於核糖體_失活蛋白質（rip)。， 在内化至細胞内後，改變細胞中的代謝或基因表現、調節 或改變蛋白質合成、抑制增殖、殺死細胞或另行有宝地费 響細胞。為了本文之目的’毒素，例如RIP蛋白質：如： 本文中提供之經修改RIP蛋白質，是被靶定劑。當在這類 細胞之標準或正常條件下培養在其中表現毒素的任何類型 宿主細胞時，該毒素抑制生長和增殖’或干擾或有害地改 變該細胞之代謝。 當在本文中使用時，關於宿主細胞提到在標準條件下 37 201235469 生長’意指這類細胞在其下正常生長以表現所編碼之蛋白 質或重組蛋白的條件。 當在本文十使用時，核糖體失活蛋白質(RIP)意指一種 在植物和細菌中表現的蛋白冑，其為真核生物和原核生物 蛋白質合成的有效抑制劑。RIP亦在輸入核内之後使细胞 麵退化。RIP是N_糖芽酶或多核芽酸：料糖㈣，並 能夠使核糖體和非核糖體之核酸受質失活。 當在本文中使用時，提到RIP多肽意指任何顯示出N_ 糖芽酶活性並使核糖體失活的多[這些包括分離自天狄 來源的多a ’以及以合成方式’如藉著重組方法、藉著化 學合成或任何方法製造的那些。其等亦包括變體、野外型、 物種和對偶基因變體。例示性RIP &括，但不限於任何第 I型或“型RIP，包括但不限於志贺毒素，包括志贺毒素 UStxl)、Stx2、4草毒蛋白6、大麥Rlpi、大麥驗立、 截短型細胞毒素、ϋ麻蛋白A、地膚子㈣：、地膚子息芽 η、拜歐丁 I、拜歐丁 π、Pap_s'絲瓜籽蛋白、天花粉蛋 白、克雷芬、相思豆毒素_a、玉黍蜀RIP3、玉黍蜀Rip9、 玉黍蜀RIPX、曲亭、MAp、康乃馨蛋白3〇、尼格林b、尼 格林I、依布林（ebulin)、這些毒素的胞毒活性片段，以及 其他熟諳此藝者已知的RIp。RIP多肽亦包括變體和其他的 經修改形式’ # RIP多肽之突變蛋白。典型地，變體和經 修改形式具有N_糖苷酶活性。變體包括，例如對偶基因和 物種變體，還有具有插入或刪除胺基酸殘基的那些。Rip蛋 白質之例示性序列為任何包括具有在任何SEQ id n〇:i、 38 201235469 5、89-1 1 1中陳述之胺基酸序列的胺基酸殘基，以及其對偶 基因及/或物種變體，及其同系物和經修改之版本，其具有 至少 40、50、60、65、70、75、8〇、85、9〇 95 96、/97' 98、99或更多的序列同—性’特別是保留㈣芽酶活性的 任一者。例示性RIP變體包括任何在技術領域中已知的， 或在本文中提供的那些，如具有像在seqidn〇:3、6_2i、 1 62 1 69中陳述之任一或更多胺基酸變化的蛋白質。 當在本文中使用時，RIP多肽的，，功能活性，，或，，活性，，意 指任何可評估之由RIP多肽顯示出的活性。可在試管内及^ 或在活體内測試這類活性，並包括但不限於N_糖苦酶活性 及/或多核皆酸：腺苦糖苦酶活性，包括尺^^酶和dna_ 活性。其他的活性包括但不限於超氧物歧化酶活性、鱗脂 酶活性、幾丁質酶活性和抗_病毒活性。決定Rlp多狀、其 經修改形式或其共軛物活性的測定，為熟諳此藝者已： 的。例如，可藉著測定蛋白質合成、脫嗓吟及/或細胞生長/ 活力來評估活性。此外，可藉著例如從以Rlp多肽處理之 細胞中純〖DNA’ ϋ藉著以漠化乙旋染色使其顯影，評估 多核苦酸：腺苦糖*酶活性。在本文中陳述或在實施例2 和5中描述了評估RIP多肽·如經修改㈤多狀或其共輕物 之活性的例示性測定。 當在本文中使用時’毒素的活性片段(可與活性部分交 替使用）意指具有活性（如毒性或催化活性）的片段。因此， 意指毒素之具有催化活性的片段，如Rip和保留毒素活性 的片段。在提供經修改毒素之處，如經修改志賀毒素’，該 39 201235469 活性片段包括修改。 =在本文中使用時，變體毒素多肽，如變體Rip，集體 也心4曰在如本文中之描述修改以降低毒性之前的Μ卜變體 毒素是任何形式的多肽，其與野外型形式不同並包括對 偶基因及/或物種變體、由接合變體編碼之多肽，及/或經修 文之形式特別疋在原始結構中有變化的變體。變體包括 ’、蛋白質之野外型形式相比較，含有刪除、取代或添加胺 土 I的那二。例如’ s A i的變體包括與野外型S A i (相當於 在Q ID Ν〇·5中陳述之成熟A功能部位的胺基酸卜25i) 相比較’含有胺基酸突變或是截短的那些，及其對偶基因 或物種變體。截短的範例分別為在SEQ ID NO:22和24中 陳述的變體1和變體2 ^ 田在本文中使用時，物種變體意指在不同物種之多肽 中的變體，包括不同的細菌物種，如埃希氏和 菌屬。 、在本文中使用時’對偶基因變體意指在相同物種之 成員中之蛋白質中的變化。 當在本文中使用時，未經修改之RIp多肽意指為了修 改而挑選的起始蛋白質。起始目標多肽可以是多肽的天缺 存在之野外型形式。此外，起始目標多肽先前可能已經= 變或突變，使得它與天然的野外型同功型有所不同，作儘 管如此’相對於在本文中產生之實質上經修改蛋白質，在 本文中仍意指起始的未經修改之目標蛋白f。因此， 用已知經料改且與未經修改之參考蛋自f㈣較在特殊 201235469 活性或特性上具有想要之增加或減少的蛋白質，作為起始 之未經修改的目標蛋白質。為了本文之目的，未經修改= Rip多肽包括單獨的RIP多肽，或其活性片段，或含有 多肽或其活性片段的共軛物。 當在本文中使用時，”經修改”或”突變的”RIp多肽意指 與參考起始蛋白質或未經修改之多肽_如野外型多肽或其他 的起始RIP多肽（包括特殊物種的對偶基因變體及其他變體） 相比較，在一級序列中具有一或多個修改的多肽。該修改 或突變改變了毒性（即在細胞中改變代謝或基因表現、調節 或改變蛋白質合成、抑制增殖、殺死細胞或另行以有害方 式影響細胞的能力）。因此，經修改或突變的RIp含有突變， 包括在任何RIP中插入和删除胺基酸殘基，藉此與起始Rip 相比較降低了毒性。一或多個突變包括一或多個胺基酸置 換（取代）、插入、刪除及其任何組合。經修改之Rip多肽可 具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20或更多個經修改的位置。通常， 這些突變改變了 RIP多肽之毒性及/或一或多個其他的活 性。這類修改包括在本文之挑選方法中鑑認的那些。除了 3有改變該多肽之毒性的修改之外’經修改之RIP多肽亦 可含有其他的修改。經修改之RIP多肽典型地對野外型或 起始之未經修改RIP多肽的胺基酸之相對應序列，具有 60〇/〇、70%、80%、8 5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性。 當在本文中使用時’志贺毒素意指最初從細菌，特別 41 201235469 是志贺桿菌屬和其他相關屬，如痢病志贺桿菌 办πηία/αβ)之成員中分離的RIP多肽。志貝毒素疋由Α次 單元和5個B次單元構成的多次單元蛋白質’ A次單元被 切開成A1和A2，形成有活性的志贺毒素Al(SAl)部分。B 次單元與A2部分連接，並為使志贺毒素進入細胞内所必須 的（Sandvig 和 van Deurs, ·/.，19:5943-50, 2000)。在本 文之共軛物中，為了進入細胞内以靶定劑置換Β次單元。 因此，該共軛物包含毒素次單元，特別是次單元Α ’而最特 別的是，具有催化活性的片段（SA1)或其活性片段。在SEQ ID NO: 1中陳述了志賀毒素Α次單元的例示性前驅物序 列，並在SEQ ID NO:5中陳述了成熟序列。具有催化活性 之A1片段（SA1)相當於在SEQ ID NO:5中陳述之序列的胺 基酸1-251，且A2片段相當於在SEQ IDNO:5中陳述之序 列的胺基酸252-293。 志贺毒素亦顯示對偶基因和物種變體。志贺毒素之實 例包括由志贺桿菌物種產生的那些，及其對偶基因和物種 變體’像是但不限於在痢疾志賀桿菌、大腸桿菌、弗氏檸 樣酸才干菌、嗜水氣單胞菌 (心、豚鼠氣單胞菌⑽如$ cavzae)和陰溝腸桿菌（五中產生的那 些。在任何SEQ ID ΝΟ:1 ' 3、5和7-21中陳述了各種志贺 毒素A键之前驅物或成熟形式的例示性序列。在seq iD NO:6中陳述了志贺毒素α鏈中的其他變體。 當在本文中使用時，RIP多肽的，，酵素次單元”或，，具有 42 201235469 催化活性之次單元”或”活性次單元”意指多肽介導毒性活性 的部分。該毒性活性可以是多肽的任何特性或活性，如起 因於藉由N-糖苷酶活性對抗rRNA的抑制活性，或dnA、 mRNA或病毒DNA或病毒RNA的脫α票呤。例如，對於志贺 毒素，活性部分是A1次單元（SA1)’其藉著將a次單元切 成A1和A 2片段而被活化。因此，志賀毒素a _鏈的活性部 分是A1次單元’也稱為SA1。 志賀毒素的活性部分’以及任何RIP均為已知的，或 可憑經驗使用評估活性的試管内或活體内之活性測定來鑑 認（參見，例如 Stirpe 等人，i〇:4〇5-12, 1992 ;以及 Sandvig 和 Van Deurs，尸六少们’〇/. /Jev. 76.949-66 1996，Stirpe 和 Battelli，Ce// Λ/ο/ iSc/·，63. 1850-66 2006)。在本文之表3中陳述，及/或為已知的或可由熟諳此 藝者鑑認的例示性RIP之A次單元。 當在本文中使用時，RIP毒素之”其活性部分，，或，，其活 性片段”意指含有至少顯示出毒性活性之最少胺基酸殘基的 多肽。活性部分典型地含有得自RIP多肽的相鄰胺基酸， 如提供毒性活性所需之最少部分的A次單元或Ai次單元。 可藉著產生並測試RIP多肽、A次單元或A1次單元之^或 C-端的一或兩者截短，決定展現出活性的那些，憑經驗判 定活性片段和最少的胺基酸殘基。可藉著在本文中描述或 在技術領域中已知的各種測定，包括但不限於蛋白質合成 測定、脫°票呤測定或細胞生長/活力測定，來評估活性。活 性可以是全長多肽之活性的任何百分比（更多或更少），與完
43 201235469 整多肽相比較，包括但不限於活性的1 %，2%、3%、4°/〇、 5% ' 10%、20%、30% ' 40%、50%、60%、70%、80%、90%、 95% ' 96% > 97% ' 98% > 99% > 100% ' 200% ' 300% ' 400% ' 5 00%或更多活性。 典型地，RIP毒素的活性片段是經截短之片段，其中在 多肽A-鏈之N-或C，端漏失大約1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14 或 15 個胺基酸。在 SEQ ID NO:22 或SEQIDNO:24中陳述了志賀毒素具有催化活性之SA1次 單元的例示性活性片段，或其活性片段。 當在本文中使用時，毒性意指一分子，包括肽、蛋白 質、化學物質或其他分子，改變細胞中之代謝或基因表現、 調節或改變蛋白質合成、抑制增殖、殺死細胞或另行以有 害方式影響細胞的能力。為了本文之目的，關於RIP，毒性 思才曰RIP或其次單元或其片段’在内化至細胞内後，改變 細胞之代謝或基因表現、調節或改變蛋白質合成、抑制增 殖、殺死細胞或另行以有害方式影響細胞的能力。例如，
Rip多肽或其共軛物，經由各種活性，包括但不限於其等之 N-糖苷酶活性及/或多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，顯示出細 胞毒性。 當在本文中使用時，N-糖苷酶活性意指多肽酵素，其 切開核苷酸N-糖苷鍵結。rIP多肽藉著從核糖體rRNA中移 除特定的腺嘌呤殘基，顯示出糖苷酶活性。這類活性藉著 阻止延伸因子與核糖體結合，結果導致蛋白質合成的抑 制，以及後續的細胞死亡。 44 201235469 曰在本文中使用時’相對應之殘基意指出現在經過排 列之位點處的殘基。藉著熟諳此藝者已知的任何方法，將 相關或變體多壯由t + $ π 排成—直線。這類方法典型地使相配達到 最大，並包括如使用手工排列的方法，並藉著使用許多可 利用的排列程式（例如BLASTP)，以及其他熟諸此藝者已知 / 藉著將夕肽的序列排成—直線，熟諳此藝者可鑑 〜相對應之殘& ’使用經保留和相同的胺基酸殘基作為指 如’熟請此藝者認出在SEQIDN〇:5中陳述之成熟 心賀母素A•鏈的參考位置’與在SEQ ID ΝΟ:1中陳述的前 驅物志貿毒素A -鏈相比較時，有2 2個胺基酸殘基不同，歸 因於信號序列的存在。因此，卿⑴咖的位置Μ處之 胺基酸”相當於” S p 〇 τ η μ 〇 c αα μ 、Q ID Ν0:5的弟一個胺基酸殘基。此外， 熟諳此藝者亦可使用經保留的胺基酸殘基作為指引，找出 在人類和非·人類序列之間及其中的相對應胺基酸殘基。相 對應位置亦可基於結構排列，例如，藉 的編擬排列。在其他的情況下，可鐘認相對丄構 热請此藝者亦可使用經保留的胺基酸殘基作為指引，找出 在人類和非-人|貞序狀間及其中的相對應胺基酸殘基。 當在本文中使用時，”―級序列”意指在多肽中之胺基酸 殘基的序列。 當在本文中使用時，可交替使用名詞，，同種性，，和，，同一 性’’，但蛋白質的同種性可包括保留性胺基酸改變。通常欲 鑑認相對應之位置，將胺基酸的序列排成—直線，以便獲 得最高級的相配（參見，例如··計算的分子生物^ 45 201235469 (Computational Molecular Biology), Lesk，A.M.，編輯， Oxford University Press，New York, 1988 ;生物計算：資訊 和基因組計劃（Biocomputing: Informatics and Genome Projects)，Smith, D.W·，編輯，Academic Press，New York, 1993;序列資料的電腦分析，第I部（ComputerAnalysisof Sequence Data, Part I), Griffin, A.M.，和 Griffin, H.G·，編 輯，Humana Press，New Jersey, 1994 ;在分子生物學上的序 歹丨J 分析（Sequence Analysis in Molecular Biology), von Heinje，G·，Academic Press, 1987 ;以及序列分析入門 (Sequence Analysis Primer), Gribskov，M.和 Devereux，J_，編 輯，M Stockton Press, New York，1991; Carillo 等人（1 988) 57/4M ·/ Μαί/ζ 48:1 073)。 當在本文中使用時’ ”序列同一性”意指在受試和參考多 肽或多核苷酸之間比較時，相同胺基酸（或核苷酸鹼基）的數 目。同種的多肽意指預定數目之相同或同種的胺基酸殘 基。同種性包括保留性胺基酸取代，以及相同的殘基。可 藉著標準排列演算法程式，使用由每個供應者確立的預設 間隙罰點’判定序列同一性。同種的核酸分子意指預定數 目的相同或同種核苷酸。同種性包括不改變所編碼之胺基 酸的取代（即”無聲取代”）以及相同的殘基。實質上同種的核 西欠分子典型地在中荨嚴格或高嚴格下與整個核酸長度或至 少大約70%、80%或90°/。的感興趣之全長核酸分子雜交。亦 考慮含有簡併密碼子代替在雜交核酸分子中，或在具有特 定序列同一性的分子中之密碼子的核酸分子。為了決定蛋 46 201235469 白質的同種性，可將保留性胺基酸與相同的胺基酸排成一 直線；在該情況下’同一性的百分比和同種性的百分比有 所不同。可使用已知的電腦演算法，如”FASTA”程式，使用 例如像是在 Pearson 等人 iV〇c. jVai/· Scz·. 85: 2444(1988)中的預設參數（其他的程式包括GCG套裝程式 (Devereux, ί專尺，Nucleic Acids Research \2、V): 3 名Ί (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，等人，J. Mo/ec.以〇/· 215:403(1990);引導至大電腦（Guide to Huge Computers), Martin J. Bishop,編輯，Academic Press，San Diego(1994)’ 和 CariUo 等人 ( 1 988))。例如’可使用國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information)資料庫的 BLAST 功能 來決定同一性。其他市售的或可公開獲得的程式包括 PNAStar ”MegAlign” 程式（Madison，WI)和 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) ”Gap” 程式 (MadisQn，WI)) ’判定任兩個核酸分子（或任兩個多肽）是否 具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%，， 相同的’’核苷酸序列（或胺基酸序列）。例如，可藉著使用GAP 電腦程式（例如 Needleman 等人 Μσ/.仏〇/. 48: 443 (1970), 按照由Smith和 Waterman修訂的（Wv.却〆Μαί/2. 2:482(1 98 1))比較序列資訊，決定蛋白質及/或核酸分子的同 種性或同一性百分比。簡言之，GAP程式定義類似性為排 成一直線之符號（即核苷酸或胺基酸）為類似的數目，除以在 兩個序列之較短者中符號的總數。GAP程式的預設參數可 47 201235469 包含：（1) 一元比較矩陣（含有1(同一）和〇(非同一）之值）和
Gribskov 等人 14·· 6745 (1986)的權重比較 矩陣’根據由Schwartz和Dayhoff，編輯，蛋白質序列和於 構的圖譜（Atlas of Protein Sequence and Structure) National
Biomedical Research Foundation，第 353-358 頁（1979)描述 的；（2)對每個間隙3·0之罰點，並對在每個間隙中每個符 號有額外的0.10罰點；以及（3)對末端間隙沒有罰點。 當在本文中使用時’”同一性，，一詞代表在受試和參考多 肽或多核苷酸之間的比較。在一非限制性實例中，，至少 相同的”意指相對於參考多肽，同一性百分比是從到° 1〇〇%。在90%或更高水平的同一性，代表為了舉例說明， 假設比較長度為1 〇〇個胺基酸的受試和參考多肽，在唁受 試多肽中有不超過10%(即100中的10個）胺基酸與參 肽不同的事實。可在受試和參考多料酸之間進行類似的 比較。這類差異可代表隨機分布在整個長度之胺基酸序列 中的點突變’或其等可群集於一或多 凡夕個具有不同長度的場 所’最高可容許例如10/100個胺基酸差異（約90%同一性）。 將差異限定為核酸或胺基酸取代、插人或刪除。在大於大 約85-90%同種性或同一性的水平 十上、吉果應忒與程式和間 隙參數設定無關；可迅速評估迮掸古 乂樣呵水平的同一性，通常 不必依賴軟體。 - w Κ貝工相「5J的 類似的:隨著前後文而改變’如同熟請相關技術者所 的’但热諳此藝者可這樣評估。
48 S 201235469 當在本文中使用時，，，挑選方法，，意指任何在那裡基於特 性質、特性或活性鑑認蛋白質的方法。為了本文之目的， 在本文之挑選方法中鑑認的RIP多肽或其活性片段包括盘 未經修改或起始蛋白質相比較，顯示出降低毒性的^b。 當在本文中使用時，藉著重組方法生產意指使用重組 的DNA方法來表現重組多肽。這類方法為熟諳此藝者已孰 知的’並典型地包括用以表現由經選瘦職編碼之蛋白質 的分子生物學方法。 當在本文中使用時，”增加產量，，意指與缺少Rip抑制劑 相比較’關於在RIP抑制劑的存在下所產生之⑽的量， 如毫克/公升或絕對量。 當在本文中使用時，關於細胞之，，經分離的，，意指細胞、 細胞集落或細胞族群的分離，遠離其他細胞集落或細胞族 群可藉著任何分離細胞办程序完成分離，如平舖的條件、 純化技術，如使用磁珠、特殊的細胞特徵，如粒性，或其 他類似的技術。例如，可藉著在使每個可存活細胞生長並 形成細菌之集落的條件下，將細胞培養物_如細菌細胞培養 物的試樣，平舖或散佈在營養的瓊脂表面來完成分離。可 針對平舖條件最適化，如藉著稀释細胞培養物，而得以偵 貝’J到呈個別集落的細胞之單一集落。可分別挑選細胞或細 胞之集落，或選擇呈單_細胞的細胞。 八當在本文中使用時，關於核酸分子或多肽或其他生物 分子之”經分離的”，意指從已經從其中獲得該多肽或核酸或 肊之遺傳ί衣i兄中分離的核酸或多肽。其亦可意指與天然 49 201235469 狀態有所改變。例如，天然存在於活動物中的多核皆酸或 多肽不是，’經分離的，，，但從其天,然狀態之共存物質中分離的 相同多核苷酸或多肽是”經分離的，，，如同在本文中使用之名 詞。因此，將重組宿主細胞所產生及/或其中所含有之多狀 或多核苷酸視為是經分離的。亦打算將，，經分離之多肽，，或” 經分離之多核苦酸，，當作已經部分或實質上從重組宿主細胞 中或從天然來源中純化的多狀或多核苦酸。例如，可藉著 在s:hh等人，Ge⑽，67:31_4〇(1988)中描述的單一步驟方 法’實質上純化化合物以重組方式產生的版本。可交替使 用名詞經分離的和經純化的。 因此，，，經分離的”意指不含那些基因（（若有的話）其在 生物之天然存在的基因組中，緊接在編碼感興趣核酸的基 ^側面）之編碼序列的核酸。經分離的DNA可以是單股或雙 股的，且可以是基因組DNA、cDNA、重組的雜種DNA或 合成的DNA。其可以是與起始DNA序列相同的或因—或 多個核苷酸的刪除、添加或取代而與這類序列不同。 ，田在本文中使用時，從生物學細胞或宿主製造之”經純 化”製劑意指細胞萃取物之純度至少含有所指示之或 蛋白質，其包括感興趣之DNA或蛋白質的未加工萃取物。 例如’在蛋白質的情況下，可在個別的技術或—系列製備 或生化技術之後獲得經純化製劑，且在這些製劑中感興趣 的να或蛋白質可以各種程度的純度存在。該程序可包 括，但不限於硫酸銨分級分離、凝膠過濾、離子交換層析 法、親和力層析法、密度梯度離心和電泳。 50 201235469 當在本文中使用時，’，實質上純的，，或，，經分離的”dna 和蛋白質之製劑意指該製劑實質上不含在自然界中正常與 這類DNA或蛋白質結合的天然存在之物質，且通常含有5% 或更少的其他污染物。 當在本文中使用時，含有感興趣之dna或蛋白質的细 胞萃取物意指獲自表現該蛋白質或含有感興趣DNA之細胞 的勻漿製劑或不含細胞之製劑。名詞，’細胞萃取物”打算包含 培養基’尤其疋已經從其中移出細胞之用過了的培養基。 s在本文中使用時，”選擇劑”或”挑選劑”意指任何因 子，細胞或細胞族群對其是敏感或易感受的，纟可藉著敏 感性而使用其以鑑認對該劑或該劑對細胞之影響展現出抵 抗力的細胞。典㈣’與表現系統併用挑選劑，以便選擇 所表現之多肽，其賦予宿主細胞對特定選擇劑的抵抗力。 選擇劑的範例為抗生素。 當在本文中使用時，，，挑選調節劑，，或，，挑選調節子”或” 調節挑選之製劑”意指用在挑選方法中的任何因子或製劑， 其改善或增加了挑選特殊性質、特性或活性的能力，如重 組多肽的性質、特性或活性。為了本文之目的，可在挑選 方法中使用調節挑選的製劑，以改善展現出經改變之毒性 的RIP多肽或其活性片段的挑選。挑選調節子之範例為⑽ 抑制劑。例如，RIP抑制齊卜如腺嗓呤類似物，降低或減輕 胞之毒性’||此容許Rip在宿主細胞中的 表現。選擇挑選調節子’其濃度和培養時間為可以影塑咳 挑選調節子之能力的时，以提高挑選特殊性質、特^或 201235469 活性的能力。因此，挑選調節子與挑選劑不同。 當在本文中使用時，”誘導劑，，意指任何用來在宿主細胞. 中發動重組蛋白質表現的因子。可用來作為誘導劑的因子 包括，但不限於溫度的改變，或小分子、肽或多肽的投與。 依據用於重組蛋白質表現的宿主細胞和用以表現該蛋白質 之特定啟動基因來選擇誘導劑。熟諳此藝者熟悉各種誘導 例如，在PET表現系統中，基因表現所必需的I? rna 聚合酶是在IPTG_可誘導之Τ7啟動基因的控制之下。在以 含有選殖基因tpET載體轉型的帛主細胞（典型地是大腸桿 菌BL21(DE3)細胞）中不發生蛋白質表現，直到藉著ιρτ〇 誘導為止。 當在本文中使用時，RIP抑制劑是任何化學物質如 肽、多肽 '寡核苷酸或其他分子或條件，其抑制Rip多肽 的活性。典型地，RIP抑制劑包括任何抑制Rip多肽之N-糖苦酶活性者。因此，RIP抑制劑為任何降低Rip多肤之活 性的製劑、多肽或其他分子。這類製劑為已知的，並包括 任何降低R ϊ P多肽之活性者。R! P抑制劑的範例為4胺基t °坐并[3,4-d]嘧啶（4-APP)。 當在本文中使用時’在提及RIP抑制劑時，，，有效抑制 Rip多肽之毒性”意指當在RIP抑制劑的存在下培養時，在 抑制劑的存在下，RIP多肽保留沒㈣报少的料，或降低 其活性。例如，抑制RIP多肽之#性，與在缺少Rip抑制 劑之下RIP多肽的毒性活性相比較’在毒 f生上顯不出50%、 /»、70%、80%、90%、9 1%、92%、93%、94%、、％%、 52 201235469 97°/。、98%、99% 或 100%的降低。 當在本文中使用時，，’保留毒性活性’’意指Rjp多肽或其 - 活性部分展現出的RIP多肽活性，與RIP多肽之野外型、 起始或參考形式相比較，典型地降低該活性。為了本文之 目的，保留該活性，只要其足以顯示出對抗核糖體、DNA、 mRNA、tRNA或目標宿主細胞的毒性活性即可。例如，Rip 多肽或其活性部分保留活性，只要其展現出與野外型、起 始或參考RIP多肽相比較，至少1〇/〇、2%、3〇/。、4%、5〇/。、 6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90。/。、95。/。或更多的活性。RIP或其他毒素可顯 示出活性的實質上降低，即使低於其原始活性1%，只要含 有這類RIP的共輛物對治療是有效的即可。 當在本文中使用時，共軛物意指本文提供之分子’其
地内化所連接或另行結合之被靶定劑。 分，其足以使該共軛 因子受體，藉此有效 。通常，LPM的多肽 53 201235469 :分：趨化因子配體、其片段或對偶基因、物種或接合· ;’f使該共輥物1巴定-或多個趨化因子受體。典型地？ :表©表現的趨化因子受體，使該共㈣被 一或一種以上的白血球。 王 當在本文中使用時，融合蛋白意指含有至少兩個多狀 組份的多肽’如乾定部分（即趨化因子）和㈣定劑、毒素， 並可視需要還有肽或多肽連接子q藉著在宿主細胞中表 現編碼§亥共輕物的核酸，產生這類蛋白質 曰在本文中使用時’破靶定劑為任何打算藉著與靶定 部分連接而内化的製劑’如同在本文中的定義，並在内化 後以某種方式改變或影響細胞之代謝、生&、活性、活力 或細胞的其他特性或特徵。在本文中被無定劑是經修改毒 素。在本文中提供之被衫劑的範例為sai或其活性片段， 包括經修改之SA1多肽。 $在本文中使用時，靶定被靶定劑意指藉著連接該劑 與把疋。P刀’ |其指向表現所挑選之受體的細胞。在與受 體結合後’被靶定劑或與受體結合部分連接之被靶定劑被 細胞内化。 田在本文中使用時，”免疫細胞，，或，，免疫效應細胞，，意指 4何協助防禦身體對抗傳染病和外來物質，成為免疫系統 -部分的細胞。這類細胞包括在血液中、在淋巴系統中和 在其他身體組織中發現的那些。這些包括，但不限於白血 球及其他組織居留細胞，如庫弗細胞、小神經膠質細胞、 肺泡巨噬細胞或其他與組織有關的免疫細胞。 54 201235469 當在本文中使用時，白血球意指在身體之宿主免疫防 禦系統中扮演一角色的白血球。白血球包括’但不限於單 核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、肥大細胞、自然殺手細胞、 顆粒球（嗜鹼性白血球、嗜酸性白血球、嗜中性白血球）和淋 巴細胞（B和τ淋巴細胞）。 當在本文中使用時，組織居留細胞（TRC)意指特化的細 胞，其居住在特殊的組織或器官中或是對其專一的。許多 組織居留細胞在身體的免疫防禦上扮演一角色，特別是與 特定的組織有關。在這類TRC中包括肝臟的庫弗細胞、腦 的小神經膠質細胞，和肺的肺泡巨噬細胞。 當在本文中使用時，關於免疫細胞或白血球的經活化 細胞意指在刺激後，與未經刺激之細胞相比較，顯示出改 變之基因表現特徵的細胞。典型地，這類細胞分泌或產生 或向上調節可溶性或細胞表面-結合之肽或多肽介體的表 現’如炎性或其他免疫介體，例如細胞介素、趨化因子或 其他化學信使蛋白質或其受體，其表現或產生比在刺激之 月1】更多。 δ在本文中使用時，靶定劑意指任何細胞結合配體多 肽或其一部分，其藉著與細胞表面受體結合而與被靶定細 胞結合，接著是其等的内化。靶定劑為任何有助於經靶定 邓刀内化的製劑。因此’它是任何與細胞攝粒之細胞表面 受體結合的㈣。⑱定部分可包括任何纽或其—部分， 其與任何細胞受體或細胞配體結合，只要該多肽在與細胞 表面分子結合後被該細胞内化即可。例如，靶定部分包括， 55 201235469 但不限於抗體、生長因子、細胞介素、趨化因子及其他。 乾疋劑之範例為乾定趨化因子受體的那些製劑。 當在本文中使用時，趨化因子受體意指專一地與蛋白 夤的趨化因子家族之天然存在成員交互作用，並將其運送 至攜帶這類受體之細胞内的受體。這些包括，但不限於受 體（CXCIU-7,包括CXCR3A和CXCR3B) cxc趨化因子與 其結合，和受體（CCR1-1〇,包括ccr2a* ccr2b)cc趨 化因子與其結合，以及任何其他的受體-任何趨化因子與其 專一地結合，並有助於所連接之被靶定劑的内化。 當在本文令使用時，趨化因子受體靶定劑意指任何分 :或配體’其專一地與在細胞上的趨化因子受體結合並 凡成所連接或另行結合之被乾定劑的内化。趨化因子受體 結合部分，包括但不限於任何能夠與細胞_表面蛋白質（趨化 因子會被它乾定）結合，並能夠促使將含有配體之融合蛋白 ^至細胞内的多肽。這類多肽包括趨化因子、抗體或其 又，只要該多肽與一或多個趨化因子受體結合並 任何所連接之被乾定劑的内化即可。可憑經驗，藉著:如 使用在本文t描述或熟諳此藝者已知的任何測定，測 胞毋劑連接之片段並尋找細胞死亡’進行有效與一或多個 趨^因子受體結合，並將所連接之被衫劑内化的多 =部分（如趨化因子或抗體）的鑑認。因此，趨化因子 :疋劑包括所有特徵和稱呼就像趨化因子一樣的肽，^ 盆但不限於在本文中描述的種類，及其截短版本和部广 ”足以使所連接之㈣定劑指向細胞表面受體或蛋白質^ 56 201235469 長的趨化因子專—地與其結合）， Λ 男助於或能夠使其被在 其上出現该爻體或蛋白質的細胞内化。 當在本文中使用時’，，細胞介一 八人主地 s°]意指多肽，其包括 :因子、淋巴細胞活素、單核細胞活素、集菌 ’丨激性因子、生長因子、脂肪動用激素和受體結合蛋白質， 及其功能片段。為了本文之目的，非-趨化因子之細胞介幸 意指所有的細胞介素…數典型地為傳統的細胞介素， 且不包括趨化因子·其具有化學吸引力，及其他通常不是由 其他（傳統的）細胞介素展現的活性。然而，由熟諳此藝者所 認可並在後文中討論的趨化因？是不同_的多肽。 田在本文中使用時，趨化因子意指從促進細胞附近之 移動或趨化性的細胞中分泌的小型蛋白質家族。將—些趨 化因子視為前-炎性的，並可在免疫反應期間被誘導，而其 他的則被視為是體内平衡的。典型地，趨化因子藉著與— 或多個趨化因子受體結合而發揮其等之化學吸引功能及其 他功能。趨化因子包括分離自天然來源的蛋白質，以及以 合成方式、藉著重組方式或藉著化學合成製造的那些。例 示性趨化因子（在SEQ ID NO: 11 2-161中陳述）包括，但不限 於 MCP-1、嗜酸球趨化蛋白、soF-Ιβ、GRO-α、MIP-1 /5、 IL-8 ' ip-io . MCP-3 > MIP-3 a ' MDC ' MIP-1 a ' BCA-1 > GCP-2、ENT-78、PBP、MIG、PF-4、PF-4 變體 1、SDF-2、 MCP-2 ' MCP-4 ' MIP-4 ' MIP-3 β ' MIP-2 a ' MIP-2 β ' MIP-5、HCC-卜 RANTES、嗜酸球趨化蛋白-2、TARC、1-309、 淋巴細胞趨化因子、肺活素、CIO、ΜΙΡ-1γ、MCP-5、LEC、 57 201235469 艾索朵斯-2、MIP-3、TECK、嗜酸球趨化蛋白_3、ctack、 MEC ' SCM]万、me、BRAK、SR_ps〇x、人神經趨化 蛋白、LC78J、MIP-lb2，以及其他熟諸此藝者已知的。 提到趨化因子日夺’典型地包含這類趨化因子的單體形式。 趨化因子亦包括二聚體或其他的多聚體形式。 趨化因子包括趨化因子的變體或突變蛋白，其具有使 所連接之被靶定劑靶定攜帶趨化因子_受體之細胞的能力。 亦考慮到趨化因子的突變蛋白可作為用在共軛物中的靶定 劑。這類突變蛋白可具有保留性胺基酸改變，如在下文表丄 中陳述的那些。編碼這類突變蛋白的核酸，除非藉著簡倂 密碼子之置換來修改，否則會在至少低嚴格度的條件下與 DNA雜交，通常是在高嚴格度下與編碼野外型蛋白質的 DNA雜交。突變蛋白和蛋白質之修改亦包括，但不限於最 少的對偶基因或物種改變，以及殘基的插入或刪除。在Seq ID NO: 170-191中陳述了趨化因子變體的實例。適當的胺基 酸之保留性和非-保留性取代為熟諳此藝者已知的，且通常 可進行.，不會改變所得之分子的活性。熟諳此藝者承認通 常在多肽之非-必需區域中的單一胺基酸取代實質上不會改 變活性（參見，例如Watson等人基因的分子生物學 (Molecular Biology 〇f the Gene),第 4 版，i987，The Benjamin/Cummings Pub. Co.,第 224 頁）。可根據如下陳述 的那些進行這類取代：
58 S 201235469 表1 原始的殘基 保留性置換 Ala (A) Gly ; Ser Arg(R) Lys Asn (N) Gin ； His Cys (C) Ser;中性胺基酸 Gln(Q) Asn Glu (E) Asp Gly(G) Ala ； Pro His (H) Asn ; Gin lie (I) Leu ； Val Leu (L) lie ； Val Lys(K) Arg ; Gin ; Glu Met (M) Leu ; Tyr ; He Phe (F) Met ; Leu ; Tyr Ser(S) Thr Thr(T) Ser Trp (W) Tyr Tyr⑺ Trp ； Phe Val (V) lie ； Leu 亦允許其他的取代，並可憑經驗判定或根據已知的保 留性或非-保留性取代。可藉著熟諳此藝者已知的任何方法 完成多肽的任何這類修改。 當在本文中使用時，趨化因子的一部分意指趨化因子 的片段或一片，其（單獨或為帶有其他片段或趨化因子單體 的二聚體）足以與趨化因子受體結合，以便將所連接之被靶 定劑内化。熟諳此藝者已知各種用以鑑認趨化因子和趨化 因子活性，特別是趨化活性的試管内測定（參見，例如Walz 專 Biochem. Biophys. Res. Commun. ΥΑ9..Ί，认龜 認嗜中性白血球的趨化性；Larsen等人 （1989) Science 243:1464 和 Carr 等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci· U.S.A. 59 201235469 652以測疋淋巴細胞的趨化性；亦參見國際ρ^τ申請 案第WO 99/3 3990號，其描述許多意圖鑑認趨化因子的測 範例）可使用這類測定鑑認趨化因子、經修改的趨化 因子及其活性片段。可使用在本文中描述和熟諳此藝者已 头的、、’α 口測定，鑑認會專一地認出趨化因子受體的部分， 並可使用胞母測定鑑認亦内化所連接或結合之被靶定劑的 男[5些。 田在本文中使用時，編碼趨化因子肽或多肽的核酸意 才θ任何在本文中陳述編碼這類肽的核酸片段、熟諳此藝者 已知的任何這類核酸片段、任何核酸片段（其編碼與趨化因 子又體、”。σ之趨化因子’並藉此將其内化而可從人類細 胞庫中使用任何先前的核酸片段作為探針來分離），或編碼 任何已知之趨化因子肽的任何核酸片段，包括在seq出 〇’ 1 12-1 6 1、170-19 1中陳述的那些，以及任何DNA片段（其 藉著簡倂密碼子之取代，從任何先前的核酸片段中產幻。 應瞭解旦熟諳此藝者可獲得肽（如趨化因子肽）的完整胺 基S欠序列，以及編碼這類肽的核酸片段，便例行地取代簡 拜饴碼子，並產生任何可能編碼這類肽的核酸片段。通常 亦可能基於胺基酸序列，合成編碼這類肽的核酸。 當在本文中使用時，連接子為連接靶定劑（即趨化因子 肽）與被#定劑的肽或其他分子。若該劑為多肽或肽，該連 子可、盈由N-或C-柒或接近被靶定劑任一端的内部殘基 (，型地是在大約20個胺基酸之内)結合。典型地，在被靶 定劑為趨化因子之處，在本文中的鍵結是在c_端。在本文 60 201235469 中使用的連接子可僅用以連接共轆物之組份，增加共概物 的細胞内利用清料性、專—性和溶解度，或在此 軛物中提供增加的彈性或解除位阻。例如，可藉著納入連 接子(其為某些蛋白酶之受質，如以比在正常細胞中更高的 水平出現在腫瘤細胞中的蛋白酶），賦予被乾定劑的專_性 或細胞内利用性。 當在本文中使用時’肽及/或多肽意指其中單體為胺基 酸殘基的聚合物，其經由醯胺鍵結連接在一起，或者稱為 多肽。當胺基酸為胺基酸時，可❹L_旋光異構體或 D-旋光異構體，L-異構體是較佳的。此外，亦打算包含非 天然的胺基酸，如万_丙胺酸、苯基甘胺酸和高精胺酸。在 本文中提供之配體-毒素嵌合體亦可使用不是經基因-編碼 的常見胺基酸，雖然較佳的胺基酸是可編碼的那些。 當在本文中使用時，根據其等已熟知的三-字母或單_ 子母鈿寫，鑑認出現在本文中出現之各種胺基酸序列中的” 細基fee (參見表1) ^以在技術領域中例行使用的標準單_字 母名稱，稱呼出現在各種DNA片段中的核苷酸。 當在本文中使用時，”胺基酸”是含有胺基基團和羧酸基 團的有機化合物。多肽含有二或多個胺基酸。為了本文之 目的，胺基酸包括20個天然存在的胺基酸、非_天然的胺基 酸和胺基酸類似物（例如其中α_碳具有側鏈的胺基酸）。 當在本文中使用時，，，胺基酸殘基，，意指在多肽之肽鍵結 處的化冬’肖化（水解）後形成的胺基酸。在本文中描述的胺基 酸殘基通常為，，L”異構形式。為”D”異構形式的殘基可被任 61 201235469 何L-胺基酸殘基取代，只要該多肽仍保留想要的功能特性 即可。NH2意指出現在多肽之胺基端的自由胺基基團。 COOH意指出現在多肽之羧基端的自由羧基基團。在表2 中出示 了與在 J. Biol. Chem·，243:3552-59(1969)中描述之 標準多肽命名一致，並在37 C.F_R.§§ 1.82 1-1.822處採納的 胺基酸殘基之縮寫。 62 201235469 表2 :對應的表 1-字母 3-字母 胺基酸 Y Tyr 酪胺酸 G Gly 甘胺酸 F Phe 苯丙胺酸 Μ Met 曱硫胺酸 A Ala 丙胺酸 S Ser 絲胺酸 I lie 異亮胺酸 L Leu 亮胺酸 T Thr 蘇胺酸 V Val 纈胺酸 P Pro 脯胺酸 K Lys 離胺酸 H His 組胺酸 Q Gin 榖胺醯胺 E Glu 榖胺酸 z Glx Glu 及/或 Gin w Trp 色胺酸 R Arg 精胺酸 D Asp 天冬胺酸 N Asn 天冬醯胺 B Asx Asn 及/或 Asp C Cys 半胱胺酸 X Xaa 未知的或其他 在本文中，藉著在胺基-端至羧基-端之傳統方向中具有 左至右之方位的化學式，代表所有胺基酸殘基之序列。此 外，將片語”胺基酸殘基”廣泛地定義為包含在對應表（表2) 中列舉的胺基酸，以及經修改、非-天然和罕見的胺基酸， 如在37C.F.R. §§1.821-1.822中提及的那些，並以引用方式 納入本文中。此外，應注意到在胺基酸殘基序列開始或結 63 201235469 束處的虛線，表示肽與一或多個胺基酸殘基的更多序列， 或與胺基-端基團，如NH2，或與羧基-端基團，如c〇〇H形 成鍵結。 當在本文中使用時’ ”天然存在的胺基酸，，意指出現在多 肽中的20個L-胺基酸。 當在本文中使用時’ ”非-天然胺基酸，，一詞意指具有類 似天然胺基酸結構的有機化合物，但在結構上經過修改以 模仿天然胺基酸的結構和反應性。因此，非_天然存在 a 基酸包含，例如20個天然存在的胺基酸以外的胺基酸或胺 基酸類似物’並包括但不限於胺基酸的D_等排體 (is〇stereomers)。例示性非-天然胺基酸為熟諳此藝者已知 的。 當在本文中使用時’載體或質體意指不同的元件，其 係用以將異種DNA導入細胞内，以供異種DNA的表現戋 經選殖之異種DNA的複製。這類載體和質體的選擇和使用 完全在熟諳此藝者的程度範圍内。 當在本文中使用時，表現意指核酸被轉錄成mRNA並 被轉譯成肽、多肽或蛋白質的過程。若核酸衍生自基因組 DNA，若選擇適當的真核生物宿主細胞或生物，則表現可 包含mRNA的接合。 當在本文中使用時，表現載體包含能夠表現以可操作 之方式與調節序列-如啟動基因區（其能夠完成這類dna片 段的表現）連接之DNA片段的載體。因此，表現載體意指重 組的DNA或rNA構築體，如質體、噬菌體、重組病毒或 64 201235469 其他載體’其在導入適當的宿主細胞内後，結果表現選殖 之DNA。適當的表現載體為熟諳此藝者已熟知的，並包括 可在真核生物細胞及/或原核生物細胞中複製 依然是附加體或可整合至宿主細胞基因組内：:：/及 田在本文中使用日守’為了多肽的”表現而編碼之核苷酸 序列”意指一序列在轉錄和所得之mRNA的後續轉譯後，產 生多狀。 當在本文中使用時，，，表現控制序列，’意指調節與其以可 钿作之方式連接之核酸序列表現的核酸序列。當表現控制 序列控制並調節核酸序列之轉錄和適當地轉譯時，該表現 控制序列是以可操作之方式與該核酸序列連才矣。因此，表 現控制序列可包含適當的啟動基因、促進子、轉錄終止序 列、起始密碼子（即ATG)(在編碼蛋白質的基因之前）、插入 序列的接合信號，和維持編碼蛋白質之基因的正確讀框以 允許mRNA的適當轉譯，以及終止密碼子。此外，亦可包 3、扁碼螢光指示劑多肽，如綠或藍螢光蛋白的DNA序列， 以便挑選陽性的殖系（即表現想要多肽的那些宿主細胞）。 當在本文中使用時，”宿主細胞，，為可在其中繁殖載體並 /'核I的細胞。該名詞亦包含主題宿主細胞的任何後 〇。應瞭解所有後代可以是與親代細胞不同的，因為在複 衣期間可能發生突變。當使用”宿主細胞，，一詞時，包括這類 後代。 當在本文中使用時，分泌信號意指在前驅物蛋白質内 、區域，其私揮前驅物蛋白質從宿主的細胞質中分泌至 65 201235469 近膜間隙内或細胞外的生長培養基内。這類信號可在前驅 物蛋白質的胺基端或緩基端。較佳的分泌信號與胺基端連 接’並對其所連接之蛋白質而言可能是異種的。典型地在 通過細胞分泌路徑的期間，切開該信號序列。切開並不是 必要的或正確安置所必須的’只要該經分泌蛋白質仍維持 其想要活性即可。 當在本文中使用時，轉染意指由宿主細胞吸收DNa或 RNA。轉型意指以使得該〇ΝΑ為可複製的，以染色體外元 件或成為宿主之染色體DNA 一部分的方式進行該過程。完 成轉染和轉型的方法和手段為熟諳此藝者已熟知的（參見， 例如 Wigler 等人（1979) ^
76:1373-1376 ; Cohen 等人（1972) ito/· USA 69:2110)。 當在本文中使用時，”功能片段”一詞意指具有可經由經 疋義之功能測定鑑認之活性的多肽，且其在細胞或細胞機 制或細胞活性上’與特殊的生物學、形態學或表現型改變 有關。 當在本文中使用時，活性意指多肽在試管内及/或在活 體内展現的任何活性。 當在本文中使用時，生物活性意指一化合物在活體内 的活性，或在活體内投與一化合物（如本文提供之共軛物、 組合物或其他混合物）後所產生的生理反應。因此，生物活 性包括這類化合物、組合物和混合物的治療效果及藥學活 性。然而’可參考特殊的試管内活性，如在經定義之測定 66 201235469 中測量到#，來定義這類生物活性。因此，例如在本文令 提到趨化因子單體、二聚體或其片段，或趨化因子單體和 片段之其他組合的生物活性，意指該趨化因子與攜帶趨化 因子受體之細胞結合並内化所連接之製劑的能力。典型地 藉著使趨化因子(二聚體、單體或月段)與胞毒劑-如經修改 之志贺毒素·Α1次單元連接，使攜帶趨化因子受體之細胞_ 如白血球與該共軛物接觸，並評估細胞增殖或生長，在試 管内評估這類活性。這類在試管内的活性應該可推測在活 體内的活性。在本文中提及並描述許多動物模式。 —當在本文中使用時’具有生物活性-詞，或提到由乾 疋!之共㈣（如含有趨化因子和餘定劑，如經修改 ::貝毋素-Α1次單元的共軛物)的生物活性，在那情況下 =旨：類多肽在含有毒素之多肽被細胞内化後，藉著在活 體内或在試管内使核糖體失活，以酵素方式抑制蛋白質人 戈抑制生長或殺死細胞的能力。可藉著任何熟諸此； 旦二方法評估！類生物或胞毒活性’包括但不限於測 *合成的試管内測定，和藉著測4受試化合物對細 :。曰然：對蛋白質广成之影響來評估胞毒性的活體内測 ^特佳的是在被乾定細胞中評估胞毒性的測定。 •在本文中使用時，對經定受體專一地結合意指以 足夠之親和力斑受體έ士人品— 心升/草：成内化。典型地，結合具有 1 升莫耳、10公升/莫耳以上的親和力（Ka)。 音在本文中使用時，盥 並專-地結合或以可偵測…厂'“配體專-地認出 *之方式（如藉著標準的試管内測定 67 201235469 來測定）與這類受體結合的能力。例如，結合測量趨化因子 共輛物、趨化因子單體或其他的趨化因子受體靶定劑認出 在已知表現這類趨化因子受體之細胞上的趨化因子受體的 能力》這類細胞包括細胞株或各種原始的白企球細胞亞 型，像是但不限於小神經膠質細胞、單核細胞、巨噬細胞、 嗜中性白血球、嗜酸性白血球、嗜鹼性白血球、自然殺手 細胞、B細胞、肥大細胞、樹突細胞和τ_細胞，或其他組 織居留細胞’ < 這類細胞的經活化形式，使料盡描述的 配體-受體結合測定、趨化性測定、組織病理學分析 '流式 細胞分析和共焦顯微鏡分析，以及熟諳此藝者已知的及/或 在本文中舉例說明的其他測定。 當在本文中使用時，培養意指細胞在有助於其等生長 之培養基中的繁殖’以及其所有的繼代培養物。繼代培養 物-詞意指從其他培養物（來源培養物）之細胞中生長的細 胞培養物’或該來源培養物的任何繼代培養物，不考慮在 感興趣之繼代培養物和來源培養物之間已經進行繼代培 的久數。培養-詞意指這類培養物藉以繁殖的過程。 當在本文中使用時，組合物意指二或多個產物或化合 物(例如製劑、調節子、調節子等等)的任何混合物。盆可二 料液、液體、散劑、軟膏、水性、非·水性調配 物或其任何組合β 當在本文令使用時，組合意指在二或多 任何聯合。 s <_间的 g在本文中使用時，治疼 縻特疋疾病之化合物的有效量 68 201235469 是足以改善’或以某種方式降低與該疾病有關之症狀的 量。可以單一劑量投與這類含量’或可根據攝生法投與， 藉此使其為有效的。該量可治癒疾病’但典型地投與該量 以便改善疾病的症狀。可能需要重複投藥以達到症狀的想 要改善。 當在本文中使用時，共軛物在藥學上可接受之鹽類、 酉曰類或其他衍生物包括任何可由熟諳此藝者使用適合這類 衍生之已知方法迅速製備的鹽類、酯類或衍生物，且其產 生的化合物可投與動物或人類’沒有實際的毒性影響，並 為具有藥學活性的或是前藥。 當在本文中使用時，治療意指其中改善或以有利之方 式改變疾病之症狀、病症或疾病的任何做法。治療亦包括 本文之組合物的任何藥學用途。 當在本文中使用時，藉著投與特殊的醫藥組合物而改 善特定病症之症狀意指任何可歸因於投與該組合物或與其 有關的減輕’無論是永久或暫時的、持續或短暫的。 當在本文中使用時，，，個體”一詞意指動物，包括哺乳動 物，如人類。 當在本文中使用時’患者意指人類個體。 當在本文中使用時，，，抗體，，-詞在本文中包括完整的分 子’以及其功能片段’如Fab、F(ab，）4 Fv，其能夠與抗 原決定位結合。這些有功能的抗體片段保留了一些與其個 別之抗原或受體選擇性結合的能力，並如下定義：” (料，含有抗體分子之單價抗原'结合片段的片段， 69 201235469 可藉著以酵素木瓜蛋白酶消化整個抗體而產生，產生完整 輕鏈和一個重鏈的一部分； / /Λ \ TJ* V ) _ a 可藉著以胃蛋白酶處理整個抗體，接著還原， 產生完整輕鏈和—部分重鏈，而獲得的抗體分子之片段； 每個抗體分子獲得兩個Fab，片段； (3)F(ab )2，可藉著以酵素胃蛋白酶處理整個抗體沒 有後’的還原，而獲得抗體的片段；F(ab，）2是兩個Fab，片 &藉著兩個二硫鍵結合在一起的二聚體； ()Fv被疋義為經遺傳設計的片段，其含有呈兩鏈形 式的輕鏈可變區和重鏈可變區；以及 (5)單鏈抗體（”％八，，），經遺傳設計的分子，其含有輕鏈 可變區和重鏈可變區，藉著適當的多肽連接子連接，為經 遺傳融合的單鍵分子。 製造這些片段的方法為在技術領域中已知的（參見，例 如Had〇w和Lane，抗體：實驗室手冊a
Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, New York，1988，以引用方式納入本文中）。 當在本文中使用時，，，抗原決定位”一詞意指任何在抗原 上的抗原决疋位，抗體之抗體結合部位與其結 合。抗原決定位含有分子之具化學活性的表面基團，如胺 基酸或碳水化合物側鏈，且經常有特定的三維結構特徵， 以及特定的電荷特徵。 當在本文辛使用時，單數形式，，一個，，和，，這個，，包括複數 的對象，除非前後文另行明確地指示。因此，例如提到，，包 201235469 括一細胞外功能部位之，，化合物時，包含具有一或多個細胞 外功能部位的化合物。 當在本文中使用時，可以，，大約，，特定值或範圍來表達範 圍和量。大約亦包含精確的量。因此，”大約5個鹼基，，意指” 大約5個鹼基，，還有，，5個鹼基，，。 當在本文中使用時，”任意的，，或，，可視需要，，意指隨後描 述的事件或狀況有或沒有發生，且該描述包括發生該事件 或狀況的情況和沒有發生的情况。例如，可視需要經取代 的基團意指該基團未經取代或經取代。 當在本文中使用時，除非另行指定，否則任何保護基、 胺基酸和其他化合物的縮寫，均根據其等普遍使用、認可 的縮寫，或IUPAC-IUB仏匕命名法委員會（c〇mmissi〇n 〇n
Biochemical Nomenclature)(1972) ㈣，u : 。 B.核糖體失活蛋白質（RIP)，其挑選、表現和生產 提供挑選、鑑認、純化及/或分離具有降低毒性之核糖 體失活蛋白質（Rip)毒素的方法、所得的經修改Rip，以及 表現RIP和經修改RIP及其共扼物的方法。降低毒素足以 增加該蛋白質之表現，但替RIp保留足夠的毒性以顯示治 療效果（抑制或殺死細胞）。因為RIP是如此之毒，故降低 10- ' 100-、1000_倍或更多的活性，實質上不影響該毒素在 抑制或殺死細胞或影響細胞代謝之共軛物中作為毒素的用 途〇 在本文中提供之方法使用RIP抑制劑，如4_胺基吡唑 并[3,4-d]-嘧啶（4_APP)，以調節RIP毒素的挑選，並增加其 71 201235469 Γ7產量生產亦提供含有全部或一部分經修改Rip的配體_ 毒素共軛物，其足以發揮毒性活性，例如任何在本文中提 供的。所挑選的經修改RIp及含有該經修改Rip之共軛物， 對宿主細胞顯示出較少的毒性’結果在其表現之後增加了 蛋白質產物的產量。增加產量與較低的固有毒性及/或以 4-APP抑制活性有關，如同在下文中注意到並詳細說明的。 RIP疋^素，其藉著使真核生物和原核生物核糖體 RNA(rRNA)脫嘴吟而增進細胞毒性和死亡，結果導致蛋白 質合成的抑制。通常，RIP(包含藥麻毒素和志贺毒素）具有 對抗真核生物核糖體的毒性活性。然而，有些Rip可攻擊 真核生物和原核生物核糖體。這些包括，例如志贺毒素， 其對大腸桿菌細胞顯示出毒性（Skinner和Jacks〇n，版从 ~W.，24:1 17-22，1998; Suh 等人（1998) Βί〇 — ^ 37:9394-8)。因此，RIP的表現，並因此還有其高產量之蛋 白質生產，經常在用於其重組蛋白質表現的原核生物或真 核生物宿主細胞之任一或兩者中，受到RIp之胞毒影響的 妨礙。 既然RIP對真核生物細胞普遍都有毒性，典型地在大 腸#菌中生產RIP或含有Rip的共輛物。例如，先前已經 在大腸桿菌中表現數個含有RIP的融合蛋白。這此包括， 例如與作為毒性部分之皂草毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白 質或志贺毒素的融合。通常獲得相對較低水平的表現。在 某些情況下，這是因為有漏洞的啟動基因系統，其釋放足 量的毒素而干擾了細胞存活。已經使用最適化表現的策略。 72 201235469 通常，使用誘導系統以壓抑表現，直到宿主細胞已經 充分地生長為止。這容許嚴格地控制，意指允許在誘導毒 素開始殺死宿主培養物之前，發生經轉型細胞的充分生 長’藉此限制RIP毒素的整體生產。例如，產生毒素或其 共輛物的標準方法，是在藉著異丙基冷硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導之後，經由在經轉型之大腸桿菌bL21(dE3)細胞 中的T7晚期啟動基因的控制之下表現。在該系統下，已經 使用BL2 1 (DE3)pLysS細菌細胞，進一步針對Rip或其共軛 物的表現最適化，該細胞在缺少誘導時強烈地壓抑來自pET 載體的表現（Joshi等人（2005)，尸⑽· £印_尸紹/·，39: 89-198)。在兩個系統中，所得的蛋白質保留在細胞内，與 包涵體結合，並在純化後需要變性和復性程序（Barth等人 (2000)却;？ 紹以以⑻，66:丄579) »亦已經使用 其他的誘導系統。例如，已經在溫度_調節之啟動基因的控 制之下表現备、茉莉抗病毒蛋白（MAP)的基因，藉此在 /88-10992的對數-期，藉著將培養基溫度從3〇。〇升高到42 C，誘導MAP基因的表現。即使使用這類可誘導系統，Rip 仍經常可能是對宿主細胞有毒性的。在某些情況下，無法 獲得轉型物或轉型物生長極差，其表示該可誘導系統有漏 洞，及/或產物的毒素部分可能是殺死宿主細胞的原因。 亦已經使用其他策略以增加活性蛋白質的表現及/或產 里。在貫例中，可設計表現載體，以達到蛋白質產物迅 速地從宿主之胞液中分泌，降低對宿主細胞核糖體的毒性 衫響。例如，為了使大腸桿菌分泌蛋白質，需要一信號序 73 201235469 歹卜〇mPA是大腸桿菌中重要的外膜蛋白質，其由大腸桿菌 大里產生並分泌（Habuka等人（199〇) y別〇/ c/zew.， 265:1G988- 1G992)。因此，已經藉著以可操作之方式將大腸 桿菌之信號序列OmpA與編碼MAP之序列連接，達成MAp 蛋白質的分泌和生產。在其他情況下，已經使用其他的細 菌表現系統，像是例如指揮毒素之漿周間隙表現的表現系 統，表現RIP或含有RIP之共軛物。與細菌細胞質相反， 細菌的漿周間隙是非還原環境，其允許某些蛋白質之天然 構象所需的二硫鍵形成。雖然該策略對那些需要二硫鍵形 成之蛋白質可能是有利的，但蛋白質在漿周間隙環境中的 不溶性可能影響蛋白質產量，並因此在表現和純化期間需 要使用可相容的溶質（Barth等人（2〇〇〇)却厂五_>〇义 Microho/，66:1572-15 79)。亦已經在酵母菌巴斯德畢赤酵母 申表現RIP或含有Rip之共轆物，雖然這 可能需要重新設計並建構合成的基因，以便針對在酵母菌 中的異種表現最適化（Gurkan等人（2005) Micros/ Ce// Factories, 4:33) ° 雖然上述每種策略的組合有時或多少是有效的，視所 使用的RIP或宿主細胞而定，但在許多情況下宿主細胞仍 持續易感受RIP的毒性影響。在這種情況下，已經使用其 他的策略企圖從宿主細胞中表現產物毒素，雖然每種都有 其限制。例如，Fabrini 等人（FASEB J. 14:391-3 98(2000)) 曾提出在真核生物細胞中使用抗-RIP抗體作為中和劑，以 保護宿主核糖體對抗失活，同時仍允許以具生物活性之形 74 201235469 式分泌大部分經合成之多肽。雖然已經在SAp共軛物的產 製中使用中和性抗-皂草毒蛋白（SAP)抗體，但這樣的策略需 •要在宿主細胞中在組成上且穩定地表現抗_RIP抗體片段。 因此在本文申提供生產RIP或含有RIP之配體_毒素 共軛物，藉著利用RIP藉以介導其對原核生物和真核生物 宿主細胞之毒性影響的N_糖苷酶機制，以克服這些限制的 方法。腺嘌呤及其數個類似物能夠抑制RIp活性，如同藉 著在試管内的核糖體失活，包括例如藉由4_胺基吡唑并 [3,4-d]-嘧啶（4-APP)抑制所測量到的（Brig〇ui等人（2〇〇〇) 28:2383_8; Brigotti 等人（2〇〇〇) ^介 ， 68:33 1-6)。在本文中承認腺嘌呤類似物（例如4App)的用 途’可用以挑選細胞表現殖系，例如細菌殖系，以及用在 肯素和配體-毋素共輛物分子，包括例如白血球族群調節子 (LPM)的大規模表現。 設計本文提供之方法，以1)挑選經修改RIp毒素，其 對宿主細胞表現出降低的毒性，同時仍維持足夠的毒性活 性’可在腺嘌呤類似物的存在下調節該挑選，並2)在宿主 細胞中，在一或多個腺嘌呤類似物的存在下表現所挑選的 經修改RIP毒素，或含有經修改rIP毒素之共軛物。這類 方法允許鑑認所挑選的經修改RIP毒素，可測試以鑑認仍 保留足以對抗目標宿主細胞核糖體之毒性活性的那些。此 外，本文提供之方法容許在一或多個RIP抑制劑（如4-APP) 的存在下，大規模表現和產製RIP毒素及含有該RIp毒素 之共軛物。 75 201235469 因此，該方法允許鑑認經修改RIP毒素，其可用來設 計含有經修改RIP毒素的配體-毒素共軛物，該毒素對宿2 表現之細菌品系顯示出降低的胞毒性，並藉此替用於臨床 前和臨床研究之較大量產物的生產提供了可行的表現策 略。可使用評估活性或生物活性的試管内和活體内測定， 評估經修改之配體-毒素共軛物對治療疾病和病症（如與提 升炎性反應之細胞的增殖、移行及/或生理學活性有關之炎 性疾病狀態，包括二次組織傷害）的適用性。 C.核糖體失活蛋白質（RIP)和作用方法 核糖體失活蛋白質（RIP)是一種在植物、真菌和細菌年 表現的蛋白質，其經由一經保留機制，為真核生物和原杉 生物蛋白質合成的有效抑制劑。RIP A N_糖苷酶或多核与 酸：腺苦糖普酶，並能夠使核糖體和非核糖體之核酸受賀 ，活。將RIP分成兩組。第J型RIP(又稱為全_Rip ;即天 花粉蛋白和絲瓜籽蛋白）具有大_ 3〇心的單—多月太鍵，具 有使核糖體失活之活性。第n型RIp(又稱為嵌合·㈣；即莲 麻毒素、4目思豆毒素，以及細菌毒素，如志贺毒素）含有兩 個多狀鍵或物種’代表A(通常為單-的次單元）和B(單一或 多個次早儿)’藉著二硫鍵連接。第^型⑽的B鏈為進入 細胞所必須的，但可姑—Λ、a ^ 1 - J破疋成細胞進入的多肽取代。也有不 在第I型或第Π型家族内之兑 ， 他的貫例。廷些被稱為兩 -鏈第I型RIP，其僅冬古Λ _ 丹馑3有A-鏈，但需要蛋白水解加工，以 及第^型㈣蛋白質’其為在結構和功能上與大麥⑽】㈣ 有關的蛋白質（peumans # , 、 1 nS 4人（2001)『心5⑽/ 76 201235469 15:1493)。 第Π型RIP的B-鏈與在細胞表面上含有半乳糖之受體 結合，並允許A-鏈進入細胞質，在這裡其等使核糖體失活。 第Π型RIP典型地以含有A和B鏈的前多肽原 (prepropolypeptide)之形式合成。在使該前多肽原靶定内質 網（ER)之後’便切下信號序列，產生多肽原。在中，蛋 白質在兩鏈之間經歷二硫鍵形成，並發生N_糖基化。經由 尚爾基氏體將該多肽原運送至蛋白質體内，在那裡藉著蛋 白質體内的肽鏈内切酶，以蛋白水解方式將其切開。該肽 鏈内切酶將多肽原切開成為A-鏈和B-鏈，或仍藉著單一二 硫鍵連接的鏈。以該方式加工RIP，確保毒素免於毒死它自 己的宿主細胞核糖體，如在合成和運送期間經由漏到胞液 内。 RIP的毒性活性需要將催化次單元内化至宿主細胞之 胞液内。藉著B-次單元促使第π型RIP進入細胞，但第i 塑RIP，其無法被血原性、組織居留性和内在的組織細胞專 一地§忍出，在其等之毒性活性上比第辽型RIp的效果更差。 為了毒素的内化而出現各種細胞進入機制，包括但不限於 依賴包涵素的和不依賴包涵素的細胞攝粒作用、不依賴小 窩的細胞攝粒作用和巨胞飲作用（macr〇pin〇eyt〇sis)。此 外，在進入細胞内後，經由不同的機制將毒素運送至胞液 (Sandvig 等人（2005) Ge„e 以“叩少，12· 865 872)。一 但在胞 液内，RIP便催化核糖體的脫嘌呤作用，藉此瓦解蛋白質合 成0 77 201235469 第I型RIP和第r[型RIP的A-鏈是這些毒素之酵素活 性的原因，藉著從真核生物和原核生物核糖體之28S rRNA 中移除特定的腺嘌呤而抑制蛋白質合成。通常，認為第π 型RIP僅對真核生物核糖體有活性，而第I型Rip對真核 生物和原核生物核糖體都有活性。有些第n型Rip，像是例 如志贺毒素（STX)，亦抑制原核生物核糖體（Skinner等人 (1998)，Microbial Pathogenesis, 24:1 17-122)。 RIP的毒性活性，單-鏈（第I型）或兩·鏈（第π型，經由 Α-鏈介導），是由蛋白質之义糖苷酶活性介導。該酵素活性 結果在大多數rRNA之經廣泛保留的GAGΑ四環（亦稱為〇：-带曲菌素/蓖麻毒素環）之精確位置（在大鼠肝臟28S rRN a的 案例中為Aw4 ’大腸桿菌rRNA的A2660)中，從腺苷中移除 一個腺嘌呤（參見例如Endo等人（1987) 乂价〇/. CTzem·， 262:8128 ; Barbieri 等人（1993)仏0£；/„所. 1 154:237; Sandvig 等人（2001) 39: 1629-1635;
Ippoliti 專人（2004) _/7α//αη 心好⑽/ …厂少， 53:92; Stirpe 和 Battelli，Ce" Mo/ h/e 5W.，63:1850-66, 2006)。腺嘌呤鹼基的移除，導致核糖體不能結合延伸因子 2，並因此終止了 RNa轉譯。GagA序列出現在原核生物和 真核生物的核糖體中。
Rip毒素的酵素活性是由催化鏈與核糖體蛋白質之交 互作用介導。與腺嘌呤之交互作用發生在毒素蛋白質之活 性位置裂縫。在毒素之間受質結合上的差異可歸因於在活 f生位皇裂縫中的胺基酸差異。例如’雖然X _射線結晶術數 78 201235469
據顯不在Stx《A_次單元和蓖麻毒素之間的活性位置裂縫 疋類似的’但在這些蛋白質之活性位置中有至少七個不變 的殘基（Bng〇tti 等人（2000) A 2 8.23 83 23 8 8)。此外’咸相信在真核生物和原核生物細胞 之間’在毋素中受質專—性上的差異是因為RIp與不同核 糖肢蛋白處父互作用的不同能力。例如，大鼠肝臟蛋白質 L9和L10e是蓖麻毒素A_鏈的結合目標，而核糖體蛋白質 L3是美洲商陸抗病毒蛋白（pAp)的結合因子。L3是高度保 留的核糖體蛋白質，其說明了 PAP對不同物種之核糖體的 廣泛專一性（peuman等人（2〇〇1) ^如乙 15:1493_1496)。腺嘌呤的移除，導致rRNA的構象改變並阻 止延伸因子2的結合。因此，經脫嘌呤之核糖體不能夠延 伸新生的肽鏈。 除了使核糖體失活並抑制蛋白質合成之外，Rip亦具有 其他功能’歸因於其等與rRNA以外之其他受質的交互作 用。RIP可將DNA、mRNA和病毒多核苷酸脫嘌呤（ippo〖iti 專人The Italian Journal of Biochemistry, 53: 92 I Parikh 專人（2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4:523-543)。因此，除了 N-糖苷酶活性之外，亦已經證實 RIP具有多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，因為其等使含有腺嘌 呤之多核苷酸、單股DNA、雙股DNA和mRNA脫腺苷基 的能力。例如，已經報告了 RIP降解超螺旋DNA(參見例如， Li 等人（1991) iVwc/ez.c JczW Λα.，22:6309 ; Ling 等人（1994) Ze".，345:143 ; Roncuzzi 等人（1996)尸五⑽ Ze".， 79 201235469 392:16)和片段基因組DNA(Bagga等人（2003)以化/. Ckw.， 278:48 13-4820)。此外，有些RIP從核糖體中釋放一個以上 的腺嘌呤殘基（Barbieri 等人（1992) J., 286:1)，在 核糖體RNA以外的RNA物種上發生作用，包括病毒 RNAs，或也在聚（A)和在DNA上發生作用（Barbieri等人 (1994) iVaiwre，372:624 ; Stirpe 等人（1996) le"·, 382:309 ； Picard 等人（2005J J Biol. Chem., 2 80:20069-20075)。已經顯示額外的數個RIp抑制HIV-1接 合酶的3-端加工和股-轉移活性，其轉而抑制了病毒基因組 插入宿主細胞基因組内（Au等人，凡Leii，471:169-72, 2000)。因此抑制了病毒繁殖。結果，一些Rip經由核糖體 的失活’展現出除了蛋白質合成抑制或代替其之抗-病毒活 性（Parikh 荨人（2004) Λ/βί/ζϋα/ C/iemz'iir少， 4.523-543 ’ Erice 荨人（1993) C/zemoMerap}，37: 835-838)。因此，許多（若非全部的）RIP 具有一或多個N-糖苷酶活性、rna酶活性、DNA酶活性及 其他活性，像是但不限於超氧物歧化酶、磷脂酶活性、幾 丁質酶活性和抗-病毒活性（park等人（2004) 219.1093-1096 ’ Bag ga 等人（2003) J 5ζ·σ/. Chem., 278.4813-4820 ，Parikh 等人（2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry， 4:523-543; Au 等人，F五Ze"， 471:169-72, 2000)。
1.例示性的RIP 為了挑選經修改毒素（其具有降低之毒性，像是為了改 80 201235469 ::素或其共輛物的生產，或在產製配體毒素_時)， 在本文提供之方法中使用的例示性毒素可以是任何毒素， 其經由rRNA的脫嗓呤而顯示出起因於n_糖苦酶酵素活性 的細胞毒性。這類毒素為熟諳此藝者已知的 含⑽家族的毒素。例如，已經提出超㉟柳個⑽，立甲 已經定序及/或選殖超過50個第巧Rip和Η個第辽型 RiP(P_ans 等人（2001) 1以咖 15: 14叫。例 不性第I RIP包括，但不限於康乃馨蛋白3〇、康乃馨蛋 白32、萊屈寧、息草毒蛋白心、息草毒蛋白_2、息草毒蛋 :小息草毒蛋白·4、喜草毒蛋白-5、皂草毒蛋白_6、息草 毋蛋白-7、皂草毒蛋白_8、皂草毒蛋白_9、、PA?]、 PAP-R、PAP_S、PAp_c、馬帕明、多迪肯郡、拜歐丁 _l、 拜歐丁、大腸桿菌素·卜大腸桿菌素_2、絲瓜籽蛋白小絲 瓜籽蛋白-B、絲瓜籽蛋白-S、19K-PSI、15K-PSI、9K_PSI、 克里洛文、万-克里洛文、截短型細胞毒素、地膚子皂苷、 地膚子息*-![、地膚子终Ic、MAp_3〇、α_苦瓜籽毒蛋 白、卢-苦瓜籽毒蛋白、天花粉蛋白、ΤΑρ_29、括樓軒毒蛋 白、大麥RH>、曲亭、亞麻RIP、玉米RIp、阿司帕林」和 阿司帕林-2。例示性第㈣RIp包括，但不限於萌蓮素、葱 =素、志贺毒素、尼格林_CIP务相思豆毒素、維古明、 毒素、依布利亭1、依布利亭-点、依布利亭1和黃 才早毋蛋白。通常，A_鏈或其活性片段便有足夠的第！[型RIp 之酵素活性。 各種RIP毒素多肽的討論，並無意限制所提供之具體 81 201235469 事實的範圍。應瞭解在本文提供之方法中，考慮到熟諳此 藝者已知的任何RIP多肽或後續經鑑認的。熟諳此藝者熟 悉RIP毒素的鑑認及定出其功能特徵。在表3中陳述例示 性RIP毒素多肽的列表及其相對應之SEQ ID NOs。 表3 :例示性RIP毒素
S RIP毒素 同義字 UniProt 編號:_ 信號 序列 酵素次單元 (即A鏈） SEQ ID NO: 志賀毒素A-鏈 (Stx) StxA ; Stxl; Stxl ;類志賀 毒素I次單元A ; SLT-A; SLT-I ; SLT-1 ;維羅毒素 (Verotoxin)l 次單元 A ; VTl P10149 1-22 23-315 1 類志賀毒素Π次 單元 A(Stx2) StxA2 ; Stx2A ;維羅毒素 2次單元A ; VT2 ; SLT-IIA ； SLT2 P09385 1-22 23-319 3 皂草毒蛋白6 SAP-6 ； SO-6 P20656 1-24 25-277 89 大麥RIP I 蛋白質合成抑制劑I; RIP30 P22244 1-280 90 大麥RIP II 蛋白質合成抑制劑II ; RIP30A P04399 1-280 91 截短型細胞毒素 GEL P33186 1-26 47-297 92 蓖麻毒素A P02879 1-35 36-302 93 地膚子皂苷I α-苦瓜軒毒蛋白;α-MMC PI6094 1-23 24-269 94 地膚子皂苷II P29339 1-23 24-286 95 拜歐丁 I BD1 P33185 1-23 24-270 96 拜歐丁 II BD2 P98184 1-21 22-282 97 Pap-S 美洲商陸抗病毒蛋白S P23339 1-261 98 絲瓜籽蛋白 絲瓜軒蛋白-(X Q00465 1-19 20-277 99 天花粉蛋白 a-天花粉蛋6，a-TCS P09989 1-23 24-270 100 克雷芬 P49074 1-27 28-177 101 相思豆毒素-a P11140 1-251 102 玉黍蜀RIP 3 CRIP3 P25891 1-300 103 玉黍蜀RIP 9 CRIP9 P25892 1-304 104 玉黍蜀RIPX P28522 1-16 17-161 105 曲手 Trig7 ;小麥 RIP Q07810 1-275 106 MAP P21326 1-28 29-278 107 康乃馨蛋白30 DAP-30 P24476 1-23 24-293 108 82 201235469 RIP毒素 同義字 UniProt 編號： 信號 序列 酵素次單元 (即A鏈） SEQ ID NO: 尼格林b 凝集素V ; SNAV P33183 1-25 26-297 109 尼格林I Q8GT32 1-25 26-274 110 依布利亭 Ebul Q9AVR 2 1-25 26-298 111 志贺毒素 志賀毒素（STX)是由細菌產生的RIP蛋白質家族。將志 賀毒素分成不同的三組。志賀毒素（Stx)是由痢疾志贺桿菌 產生，並為第Π型RIP蛋白質，含有32-kDa酵素A次單元 (StxA)，以非共價方式與五個7.7kDa之B次單元（StxB)的 環結合。Stx在胺基酸序列上與由大腸桿菌產生的類志贺毒 素l(Stxl，亦稱為維羅毒素、SLT1或VT1)是相同的。Stx 和Stx 1的A-鏈前驅物長度為315個胺基酸（在SEQ ID NO: 1 中陳述），並含有長度為22個胺基酸的信號序列，相當於 SEQ ID ΝΟ:1的胺基酸1-22。成熟Stx/Stxl A鏈之長度為 293個胺基酸，相當於SEQ ID ΝΟ:1的胺基酸23-315，並 在SEQ ID NO:5中陳述。第三個Stx為類志贺毒素2(Stx2， 亦稱為維羅毒素2、SLT2或VT2)，與Stx和Stxl相比較， 其顯示有序列差異。Stx2的A-鏈前驅物長度為319個胺基 酸（在SEQ ID NO :3中陳述），並含有長度為22個胺基酸的 信號序列，相當於SEQ ID NO:3的胺基酸1-22。成熟Stx2 A 鏈之長度為297個胺基酸，相當於SEQ ID NO:3的胺基酸 23-3 19。Stx/Stxl和Stx2的B次單元長度為89個胺基酸（分 別在SEQ ID ΝΟ··2和4中陳述）。亦已經報告了在弗氏檸檬 酸桿菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和陰溝腸桿菌中產 83 201235469 生的類志贺毒素（Sandvig等人（2001) Toxicon, 39:1629-1635)。
Stx的A鏈（StxA)具有有酵素活性之a片段，其含有在 SEQ ID NO:5中陳述之序列的〇242和C261(分別相當於在 SEQ ID ΝΟ:1中陳述之序列的C264和C283)之間形成的内 部二硫鍵。由胰蛋白酶或由細胞之蛋白酶弗林（furin)，認出 在 SEQ ID NO:5 中之序列 248Arg Val Ala_Arg25i，其位在兩 個半胱胺酸之間的環中。在高爾基氏體外側網絡（TGN)中和 在一些内囊胞中找到弗林，並可能在其轉譯後加工期間切 開StxA。胰蛋白酶或弗林在SEQ ID NO:5中陳述之序列中 的Arg251之COOH端那邊切開stxA，將A鏈分成A1和A2 片段（Sandvig 等人（2001) 39:1629_1635 ; Garred 等 人（1995) J Biol. Chem.，270:10817-10821)。因此，Stx 之經 切開A1片段（SA1)相當於在SEq id NO:5中陳述之胺基酸 序列的胺基酸1到251 ’而stx的A2片段（SA2)相當於胺基 酸 252-293 。 弗林切開活化了 A1片段（SA1)。因為在C242和C261 之間的二硫鍵，使A1功能部位仍與A2/B次單元結合，直 到經由ER運送，在那裡還原二硫鍵，並允許a丨片段逆位 移至胞液（LaPointe 等人（2〇〇5) / 5Z.0/· c/zem·，280: 23 310-8) » Stx之A1片段比完整Stx蛋白質的活性更高6_ 到 400-倍（Suh 等人（1998) 少，37:9394- 9398)。 SA1本身含有RIP酵素活性，並成為經由6〇s核糖體次單 元之28S RNA的脫嘌呤作用抑制蛋白質合成的原因。A j鏈 84 δ 201235469 的前239個胺基酸代表StxAl RIP功能部位的最低催化活性 區（LaPointe 等人（2005) ·/ βι·〇/. C/zem.，280: 23310-8) 〇 保留 催化活性的SA1截短’包括例如在SEQ ID NO:22中陳述的 變體1 SA1序列，並由在SEQ ID NO:23中陳述之核苷酸序 列編碼，以及在SEQ ID NO:24中陳述之變體2序列，並由 在SEQ ID ΝΟ··25中陳述之核苷酸序列編碼。 像其他RIP —樣’ Stx的活性SA1次單元攻擊真核生物 核糖體；然而’它也具有對細菌核糖體之活性。例如，各 種團體已經報告在SA1的存在下降低了大腸桿菌細胞的生 長（參見例如，Skinner 專人（1998) 24:117-122 ; Suh 等人（1998) 37:9394-9398)。 SA1對原核生物細胞的毒性活性，需要在細胞質中表現毒 素’這是因為缺少其天然的信號序列；在由其信號序列輸 出SA1至漿周間隙内之後，在細胞中沒有觀察到Stx-介導 之毒性。S A1對原核生物細胞之毒性活性可與其對真核生物 細胞的毒性活性相比擬。其他的RIp亦靶定原核生物細胞， 包括例如植物RIP PAP和MAP，雖然在大多數的情況下， 追類植物RIP的毒性活性比其對真核生物核糖體的更有效 大約 100 倍（Suh 荨人（1998) 37:9394-9398)。 相反的’其他的RIP，如RTA(蓖麻毒素之酵素次單元）對原 核生物細胞則沒有展現出毒性。 2-RIP毒性抑制劑 抑制劑為已知的，或可鑑認其使有毒之RIP失活。這 類抑制劑的研究已經提供了關於毒素活性位置之結構的洞 85 201235469 察。此外’有興趣為各種理由鐘認和發展RIp抑制劑，包 括但不限於診斷目的、在中毒時的解毒劑，或在由表現RIp * 之細菌誘發的感染中作為預防和治療劑（Brig〇ui等人 . (2000) Life Sciences，68:33 1-336，美國專利申請案第 6,562,969號）》有些RIP抑制劑靶定RIp毒素經保留的N_ 糖苷酶活性。在這類RIP毒素抑制劑中包括RIp_專一的寡 核苷酸抑制劑，如RNA適體（aptamers)(參見例如， Hesselberth 等人（2000) 乂 出0/_ c/^所.，275:4937- 4942 ;
Hirao 等人（2000) «/_ 5/〇/· C/zem.，275: 4943-4948)、RIP-專一 的抗體及/或腺°票。令異構體，包括例如腺嗓吟、4 _胺基α比唾 并[3,4-d]嘧啶（4-ΑΡΡ)及其他類似的異構體（PaUanca等人 (1998) Biochimica et Biophysica Acta, 1384:277-284 ；
Brigotti 專人（2000) TVwc/ez’c 28:2383-2388 ;
Brigotti等人（2000) W·，68:33 1-6 ;美國專利申請案第 6,562,969 號）。 4-APP及其他腺嘌呤類似物 腺嘌呤是在RIP毒素之天然受質中的鹼基（即在gaga 環序列中的第一個腺嗓吟驗基）。因此，腺„票吟及其類似物 精者擔任RNA N-糖皆酶活性之抑制劑，抑制Rip毒性活性 (Pallanca 等人（1998)細咖所心 ei Jcia， 1384:277-284 ; Brigotti 等人（2000) ⑷細縱c/j， 28:23 83-23 88，Brigotti 等人（2000) &/，68:33 i_6)。典 型地’腺嘌呤類似物包括任何稠合的二環化合物，其中一 個環是6-胺基嘧啶，而另一個環是5_員的雜環，其含有至 86 201235469 少兩個相鄰的碳原子，包括但 一 卜限於吡咯、吡唑、咪唑、 二唑、聘唑、異聘唑、噻唑、 呉噻唑、呋喃和噻吩。環的 稠合以附接之方式，典型地發 s生在6-胺基嘧啶之4和5位 置處的碳原子和5 -員環的杯r3Wm上 貝衣的任兩個相鄰碳原子之間。這包 括’例如腺嘌呤它自己的5_ g瑗 曰〇幻）貝％疋呈咪唑之構型。腺嘌呤 之結構如下： νη2
N 此外，這類類似物亦包含任何5 _員環之氮原子的重 排，從咪唑變成吡唑構型，包括例如4-APP和間型黴素鹼， /、差異僅在於^胺基嘧π定與5 _員吡唑環的附接模式（參見例 如’ Brigotti等人（2〇〇〇)厶的&/·，68:3 3 1-6)。此外，本文提 供之抑制劑亦包含間型黴素A鹼的核糖核苷和脫氧核糖核 I類似物’如間型黴素A鹼的核糖核苷酸5，單-、5，二-、5， —和3 ’單磷酸類似物，以及間型黴素a鹼的脫氧核糖核苷 酸5 ’單-、5,二-、5,三和3,單磷酸類似物，或任何其他類似 的或已知的化合物，如任何後續對此鑑認的（參見例如，美 國專利申請案第6,562,969號）。4-APP和間型黴素A鹼的 結構如下： 87 201235469 nh2
問细街素A驗 不管RIP毒素的經保留N_糖苷酶活性，腺嘌呤和腺嘌 呤類似物，如4-APP，展現出不同的保護核糖體免於被RIp 失活的能力（Pallanca等人（1998)如oc/n_w/ca以飢叩 AM，1384:277-284 ; Brigotti 等人（2〇〇〇)胸c/eic 28:2383-2388 ; Brigcmi 等人（2〇〇〇) &z·， 68:33 1-6)«»例如4-APP是Stx、地膚子皂苷及其他植物RIp 的強抑制劑’但展現少3:的乾麻毒素抑制。此外，4_App 對Stx顯示出比腺嘌吟更大的抑制活性，然而4_App和腺 嗓吟對RIP毋素地膚子皂普顯示出可相比擬的抑制活性。 再者’腺嘌呤保護核糖體免於被蓖麻毒素失活，而4_App 對蓖麻毒素之毒性活性展現出較少的抑制作用。因此，RIp 毒素在其等被各種腺嘌呤異構體抑制的能力上有差異，表 示RIP毒素並未共旱共同的活性位置結合裂縫。腺嗓吟異 構體對RIP活性的抑制活性為已知的（pallanca等人（1998) 5/oc/nwzco； ei 1384:277-284 ; Brigotti 等人 (2000)胸c/ezc Jcz'A 28:2383-2388 ; Brigotti 等人 (2000) I% b·.，68:331-6) ’或可由熟諳此藝者，如藉著在 抑制劑的存在下決定毒素之RNA N-糖苦酶活性（即Rip活 性）來判定。 如同在下文中詳細說明的，RIP抑制劑，如腺嗓吟及其
S 88 201235469 類似物包括例如4_APP，可用在挑選RIp之經修改形式的方 =中’亦:用在改良RIP毒素或其共輛物（如任何在本文中 提供的或藉著本文提供之挑選方法鑑認的經修改幻 生產的方法中。 ) D·挑選經修改毒素或其共軛物的方法 在本文中提供挑選經修改RIP毒素（其對宿主表現細胞 展現出降低之胞毒性)的方法。在本文之方法中，已經發現 因為RIP對特定宿主細胞的毒性，故經常以低水平在細胞 培養物中表現RIP ’即使在其中它終究是對所有或實質上所 :細胞有毒的條件下。典型地，表現RIP，因為對細胞展現 毋性需要必需的量，有些細胞可能會變成對RIP之毒性影 響有抵抗力的，並如同在本文中所示，RIP突變種。結果， 在含有編碼RIP之核酸的細胞培養物中表現Rip，但以相對 上較低的水平。 因此，設計方法以挑選並鑑認那些在不產生或以低水 平產生起始RIP蛋白質之條件下，可由宿主細胞產生的Rip f素。欲進行本文提供之方法，將編碼RIP毒素之未經修 改或起始形式的核酸導入宿主細胞内，允許該宿主細胞生 長’分離生長的細胞，然後鑑認在該細胞中表現的RIP毒 素’並測試活性，像是例如N-糖苷酶活性及/或其他的RIP 活性，包括但不限於RNA酶活性、DNA酶活性、超氧物歧 化酶活性和磷脂酶活性。在某些實例中，額外地在挑選調 節子’如RIP抑制劑的存在下進行挑選。 通韦’與起始Rip蛋白質相比較’這類經鑑認的RIp 89 201235469 毒素是經修改的’並憑藉著修改，RIP毒素與起始rip毒素 相比較，具有經改變之活性，如經改變的毒性活性或其他 活性。通常’降低了經修改RIP多肽的毒性。在某些實例 中，在'本文之挑選方法中鑑認的經修改RIP多肽，顯示沒 有毒性活性。然而，典型地經修改之RIP毒素或其共辆物， 與毒素之野外型形式或其共軛物相比較，保留了 〇 5 %、丨％、 1.50/〇、2%、50/〇、10〇/〇、20%、3 0% ' 40%、50%、60%、70%、 80%、90%、95°/。或100°/。的毒性活性。因為保留的胞毒活性， 可設計含有這類經修改毒素之共扼物，以靶定特定的細 胞’藉此導致在將該共辆物内化後，殺死經乾定之細胞或 細胞群。例如’如同在下文中詳述的，可在藉著把定一或 多個涉及該疾病過程之細胞或細胞族群，來治療各種疾病 或病症的方法中使用含有經修改RIP毒素之共軛物。亦可 在表現和產生RIP毒素或其共軛物的方法中使用這類經修 改毒素’藉此得以以高產量生產蛋白質。 1·候選的RIP蛋白質或其共軛物 通常，因為許多RIP蛋白質展現出對原核生物及/或真 核生物細胞的毒性活性，故其等藉著細胞核糖體（其等不能 在一些或所有宿主細胞系統中以高水平表現）抑制蛋白質合 成。在本文中提供的是降低RIP之毒性的方法，而使得其 等可以較高的水平表現，但在使用RIp之共軛物中仍顯示 有足以用在治療上的毒性。包括在美國專利第7，166,7〇2 號、7，15 7,418號和7，192,73ό號中的共軛物，以及細胞介 素，如生長因子，包括FGF、VEGF、EGF及其他的共軛物。 90 201235469 在本文提供之方法中，產生RIP毒素或其共軛物，其 在佰主細胞中顯示降低的毒性。這類經修改RIp毒素或其 共軛物藉此減少對細胞之毒性。挑選RIp蛋白質或其共軛 物，其經修改以顯示降低之毒性，允許由宿主細胞表現這 類毒素，並改善產量。因此，這類方法允許產製R][p毒素 或其共軛物，可有效並有效率地生產其等，並藉此使用在 為其没計之治療疾病或病症的方法中 欲藉著本文提供之挑選方法修改的RIP蛋白質可以是 4何RIP蛋白質，或含有RIp蛋白質或其活性部分的任何 多肽’其在標準或正常的生長條件下’因為對宿主細胞核 糖體之毋性活性而在宿主細胞中不表現或以低水平表現。 修改遠蛋白質，然後在相同的條件下，以較高的水平表現。 可供挑選的候it RIP蛋白f包括野外型或野外型Rip蛋白 質的變體形式’或其顯示出毒性活性的活性部分，包括對 偶基因或物種變體，以及尚未藉著本文之方法挑選之RIP 蛋白質的同功型。 在這類⑽蛋白質中包括任何在上文表 Π:具有在t:SEQlD_，⑴中陳述之胺基酸 加1特別疋k類RIP蛋白質之A-鏈的活性部分，如志 厂素之鏈（即SA1)或其任何活性片段。例如，在本文 提供之方法中使用的起始蛋白質可以是任何在並等之A鏈 :A1财經截短，但仍顯示出催化活性者。在本文提供之 方去中的起始蛋白質亦包括任何含有 式’如其對偶基因或物種$白質之變體形 戈物種相的多肽。⑽蛋白質的例示性 91 201235469 變體是在任何SEQIDNO:6、9-21或162_167中陳述的。亦 提供含有與靶定劑連接之這類蛋白質的共耗物。 在本文提供之方法中作為起始蛋白質的，亦包括含有 任何上文提及之這類RIP毒素，或這類RIp毒素之活性部 分（直接或間接與其他多肽部分連接）的共軛物。例如這類共 軛物包括配體-毒素共軛物，包括其中該RIp毒素與趨化因 子、細胞介素 '抗體、生長因子或其他這類能夠與細胞表 面受體結合之配體蛋白質直接或間接連接的那些。典型 地，這類共軛物是由編碼融合蛋白之核酸分子編碼的。 在本文提供之方法中用來作為起始蛋白質的例示性 RIP蛋白質包括SA卜例如具有相當於SEQ ID N〇:5之胺基 酸1-251的胺基酸序列，或其截短，如分別具有在SEQ ID >?0:22(即變體18八1)或8丑卩10^^0:24(即變體2 8八1)中陳 述之胺基酸序列的SA1 ’或其任何對偶基因或物種變體。這 類共軛物的範例為任何含有上文提及之任何SA1部分者， 其中該S A1部分與配體或其他細胞受體結合分子直接或間 接連接。例如這類共軛物包括趨化因子共軛物（即白血球族 群凋節子）’如在美國專利第7，166,7〇2號、7，157,418號和 7，192,736號中陳述及描述的。這些包括，例如具有與SA1 連接之MCP-1趨化因子的共軛物。在SEq ID N〇:38中陳 述與變體1 SA1 RIP蛋白質連接之Mcpj-SAi共軛物（即 LPMla)的例示性序列，並由在SEQmN〇:37中陳述之核苷 酉欠的序列編碼。在SEq ID N〇:4〇中陳述與變體2 SA1 Rip 蛋白質連接之MCP-1-SA1共軛物（即LPMlb)的額外例示性 92 δ 201235469 序列’並由在SEQ ID NO:39中陳述之核苷酸的序列編碼β 2·將RIP或其共軛物導入宿主細胞内 將編碼想要之起始RIP蛋白質或其共軛物的核酸導入 任何想要的宿主細胞内。典型地，在挑選方法中選出的宿 主細胞，是易感受起始RIP蛋白質或其共軛物之毒性影響 的宿主細胞，使得該宿主細胞的蛋白質合成被廢除，或在 該宿主細胞中表現RIP後明顯受到損害。在本文之挑選方 法中使用的宿主細胞中，包含任何原核生物細胞，包括但 不限於任何細菌細胞，如大腸桿菌。在宿主細胞中亦包含 任何真核生物細胞，包括但不限於酵母菌，如巴斯德畢赤 酵母、爪蟾印細胞和哺乳動物細胞，像是例如Ver〇、Hep2、 Chang、A549、coy和HeLa細胞。在決定在本文之挑選 方法中使用的適當宿主細胞時，可藉著下文描述或熟諸此 藝者已知的各種方法，決定RIp $白質或其共轆物在宿主 細胞中對重組蛋白質表現的影響。評估對蛋白質合成之影 的測疋，包括例如脫嘌呤測定（即腺嘌呤之釋放卜不含細 胞：蛋白質合成測定，如兔子網狀細胞溶胞產物或小麥胚 芽办胞產物蛋白質合成測定或細胞生長/活力敎。例如， =使用這類測定，…A1對真核生物和原核生物核糖 體展現出明顯的毒性活性（Suh等人（w_， 形Π4:因此，在—實例中’ S A 1之經修改形式或其活性 …挑選’是在真核生物細胞中進行。在另 改形式或其活性部分的挑選，是在細菌細胞，如 大腸杯滴中進行。可利用各種大腸桿菌宿主品系，並包括 93 201235469 但不限於 BL21(DE3)或 BL21(DE3)pLysS 細胞。 為了用在本文之方法中，可藉著任何在技術領域中已 知的方法’生產或分離編碼起始RIp蛋白質或其共軛物的 核酸分子，包括從天然來源中分離、藉著標準重組DNA技 術產製’如經由標準選殖程序從細胞、組織和器官中，並 藉著其他的重組方法，以及藉著包括在矽中之步驟的方 法合成方法及任何熟諸此藝者已知的方法。這類核酸分 子可包括額外的序列，如限制酵素序列、連接子、標籤或 其他的這類序列。核酸分子的範例包括任何編瑪RIp蛋白 質其活性形式或其變體的核酸分子，如任何編碼在任何 SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7-22、24、89-111 或 162-169 中陳述 之多肽的核酸分子，或任何編碼含有任何這類RIp蛋白質 之共軛物的核酸分子。例示性核酸序列包括，例如s A丨之 4體1或變體2形式的序列，如分別在SEq ID N〇:23或seq ID N〇:25中陳述的。其他例示性核酸序列包括編碼共軛物 (像是例如趨化因子之共軛物，如與SA1變體連接之MCP_n 的序列。例如，可在本文提供之方法十使用編碼LPMla或 LPMlb共軛物的核酸序列，且其包括分別在SEQIDn〇:37 和SEQ ID NO:39中陳述之序列。 典型地，為了經修改RIP蛋白質或其共軛物的挑選和 表現，用以導入宿主細胞内的核酸分子為表現載體之形 式，其包含具有表現控制序列（其以可操作之方式與為了表 現該多肽而編碼之梭酸序列連接）的那些。在後文中將詳述 這類表現載體。可視宿主細胞及/或任何想要的轉錄/轉譯元
S 94 201235469 件，包括例如組成上和可誘導之啟動基因、轉 件、轉錄終止序列等等，而選擇適當的載 ：子： —# 貫例中， 在表現Μ法中使用可誘導的表現系、统，其允許宿主細胞 在表見I素之前最適宜地生長。在大腸桿菌令，可 統的範例為PET載體，如PET9c質體，其在τ7晚期啟動基 因的控制之下，並需要藉著IPTG誘導。在其他實例中，； 選擇用來表現導入其中之編碼性核酸的宿主細胞，它自己 亦▼有更多針對毒素表現最適化的組份。例如，在宿主細 胞為大腸桿菌之處，可使用細胞株BL21(DE3)pLyss，與可 能有漏洞的親代宿主細胞BL21(DE3)相比較，其在缺少誘導 時強烈地壓抑來自丁7啟動基因（如在pET載體中）的表現。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法’將編碼蛋白 質、其活性形式或其共軛物的核酸分子導入宿主細胞内。 視所遥擇之伯主細胞來選擇這類方法，並包括但不限於轉 染、轉型、電穿透和任何其他適當的方法。在某些情況下， 亦可藉著使用病毒載體的轉導，將DNA導入細胞内。典型 地’當將DNA導入細菌細胞内時，使用轉型或電穿透方法。 a.轉染 可使用轉染將核酸導入真核生物或原核生物細胞内。 可藉著各種方法達成轉染，但典型地涉及進入細胞内之臨 時”孔”的開啟，以允許DNA進入，然後其在宿主細胞内變 成暫時表現的。藉著轉染導入DNA之方法的實例包括，但 不限於磷酸鈣法、脂染作用和基因搶途徑。例如，在脂染 途徑中，將DNA納入脂質體内，或藉著使用脂質-陽離子試 95 201235469 劑’然後其能夠與細胞膜融合，將dna釋放至細胞内。陽 離子脂質的實例包括’但不限於脂染丁（lipofectin)(Life
Technologies，Inc.，Burlington，Ont.)(陽離子脂質 n-[1-(2,3- 二油醢氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氣化錄（DOTMA)和二油醯 基填脂醯乙醇胺（DOPE)的1:1(重量/重量）調配物）；脂染胺 (LipofectAMINE)(Life Technologies, Inc.} Burlington, Ont., 參見美國專利第5,334,761號）（聚陽離子脂質2,3-二油醯氧 基-N-[2(精胺-曱醯胺基）乙墓]_n,N-二曱基-1-丙敍三氟乙酸 酯（008?八）和二油醯基磷脂醯乙醇胺（〇〇?£)的3:1(重量/重 量）調配物））、脂染胺 + (LipofectAMINE PLUS)(Life
Technologies，Burlington, Ont.參見美國專利第 5,334,761 號和5,736,392號；亦參見美國專利第6,051，429號）（脂染胺 和 + 試劑）、脂染胺 2000(Life Technologies, Burlington， Ont.;亦參見國際PCT申請案第WOOO/27795號）（陽離子脂 質）、艾菲克亭（Effectene) (Qiagen，Inc.，Mississauga， Ontario)(非脂質體脂質調配物）、間菲克亭 (Metafectene)(Biontex，Munich，Germany)(聚陽離子脂質）、 優-菲克丁（Eu-fectins) (Promega Biosciences，Inc·，San Luis Obispo，CA)(乙醇系陽離子脂質1到12號：（：5211106]^6〇4· 4CF3C02H、C88H178N804S2 . 4CF3C02H、C40H84NO3P . CF3CO2H、C50H103N7O3-4CF3CO2H、C55H116N8O2· 6CF3CO2H ' C49Hi〇2N6〇3 · 4CF3CO2H ' C44H89N5〇3 · 2CF3CO2H ' C100H206N12O4S2 8CF3CO2H ' C162H330N22O9 13CF3C02H、C43H88N402 . 2CF3C02H、C43H88N403 _ 96 201235469 2CF3C02H、C4iH78N08P)，塞托菲克亭（Cyt〇fectene)(Bio-Rad，
Hercules，CA)(陽離子脂質和中性脂質的混合物）、基因普特 (GenePORTER)(Gene Therapy Systems Inc., San Diego, C A)(中性脂質（Dope)和陽離子脂質的調配物），以及富基因 (FuGENE)6(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)(基於多-組份脂質的非-脂質體試劑）。 b. 轉型 轉型與轉染之差別在於將所導入之DNA併入細胞的基 因組内，以便表現这傳物質。典型地，用於穩定轉型的表 現載體具有可遠擇標記，像是例如抗生素抗藥性，其允許 所轉型之細胞的選擇和維持。轉型需要將DNA轉移至細胞 内，這係在為天然勝任的或可使其成為勝任的細胞中完 成，以便攝取DNA跨越該細胞的膜或膜們。氣化鈣是一種 用來使細胞，如大腸桿菌細胞成為較勝任者的方法。在細 菌細胞的熱-休克之後，誘導其等攝入DNA〇轉型並不限於 細菌，亦可在酵母菌、植物和哺乳動物細胞中進行，包括 胚胎幹細胞。轉型的方法為已熟知的（參見例如MeU〇等人 (1995) Mei/zoA Ce// 48:451-82)。 c. 電穿透 電穿透藉著使用脈衝旋轉電場，暫時打開在細胞外膜 中的孔。用於試管内和活體内之電穿透的方法和裝置為已 熟知的（參見，例如美國專利第6,027,488號 5州川號、5，谢心號、5州，662號、5⑽，:^號戒、 5,318,515號）。可使用標準草案。 97 201235469 3.表現、挑選和鑑認 以DNA分子.人总士 Λ ‘ 于導入伯主細胞，結果擴大了基 藉此得以表現該基因的多個 物並 令使用的起始RIP毒素咬…：為t本文之挑選方法 京次其共軛物，正常對所選擇之宿主 細胞是有毒性的，故典型地 ^ , 货玍肩起始蛋白質的擴大和 表現，例如因為細胞死亡。闵 . 匕亡因此，在本文中提供之方法使
用起始蛋白質之正常毒性作A 作為挑選方法，以挑選蛋白質的
那些經修改形式，其對宿φ h的β 貝J 八對宿主細胞展現出較低的毒性，並藉 此而被表現。典型地，在1犛 ，、孚之—級序列中藉著一或多個 胺基酸突變使該蛋白質較不毒， 租 毋來修改廷類經表現的蛋白 質。在某些情況下，與起妗陆上 灸始蛋白質相比較，經由胺基酸序 列的截短使該蛋白質變得較春 于平又不毐，來修改經表現之蛋白 質。在大多數的宿主細胞表玥糸 匕表現系統中，可藉著使轉型物生 長，從該轉型物中分離重組Dn . , ^ 以八刀子’並在需要時從經分 離之重組DNA中取回所插入其 拖入之基因，大量獲得編碼經修改 RIP毒素的基因。 在某些實例中，可在挑選方法中加入額外的製劑或製 劑們’以便❹挑選，針對經修&⑽毒素或其共輛物的 回收最適化。這類挑選調節子血 | 丁八型地為任何降低RIP毒素 或其共辆物之毒性活性的調節子。
P十 例如’可使用任何RIP 抑制劑來调卽挑選。任何熟锋士卜蓺.
J热°日此藝者已知或後續鑑認的RIP 毒素抑制劑’其可使Rip毒* 4 I天，舌’均可用在本文提供之 方法中0典型地，這類Rjp差本本，山 毒素抑制劑為任何藉著靶定， 例如RIP毒素之經保留N_糖苷酿 ^ ^ ^ 甘姆/舌性，而抑制毒性活性的 201235469 抑制劑。可選擇靶定任一或多個其他RIP活性，包括但不 限於RNA酶活性、DNA酶活性和超氧物歧化酶及磷脂酶活 性的其他RIP毒素抑制劑。為了本文之目的，可在本文之 方法中使用任何RIP抑制劑，如腺嘌呤或其任何類似物， 只要該抑制劑展現出對RIP毒素之起始形式，例如Rip毒 素之野外型形式或其活性片段的抑制活性即可。例如，可 在本文之方法中使用4-APP，以挑選經修改RIp，包括但不 限於經修改SA1、皂草毒蛋白、地膚子皂苷或拜歐丁 (Brigotti 等人（2000) 加以，68:33 1 336)。典型地在 本文之方法中使用4-ΑΡΡ，以挑選經修改SA1。亦考慮到可 使用其他的抑制劑來挑選經修改S a 1。 在挑遠方法中使用之RIP抑制劑的量，可基於其對 蛋白質或其共軛物之毒性活性的已知影響，憑經驗決定。 重要的是’在本文之方法中使用的RIp抑制劑本身對特定 之宿主細胞是無毒性的，其毒性為已知的，或可由熟諳此 藝者視所選擇之宿主細胞來決定。此外’欲確保Rp抑制 劑有效地調節經修改RIP毒素或其共軛物的挑選，選擇Rip 抑制劑之濃度，使其得以抑制起始蛋白質的毒性活性。典 型地，選擇RIP抑制劑之濃度，使得起始RIp蛋白質在該 RIP抑制劑的存在下保留一些活性，藉此允許在挑選方法中 有某種程度的選擇壓力或RIP抑制劑的調節。通常選擇Rip 抑制劑之濃度，其抑制RIP毒素或其共軛物之毒性活性至 少或大 '約 1%、20/。、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、1〇〇/〇、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%，但低於 99 201235469 100%的毒性活性。可使用熟諳此藝者已知的各種測定，測 試各種RIP抑制劑濃度對宿主細胞或RIP蛋白質之活性的 影響。 典型地，在本文之挑選方法中，以大約或在〇 lmM、 〇.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、〇.8mM、 〇.9mM、l.OmM、1.5mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、 6.0mM、7.0mM、8.0mM、9.0mM、lO.OmM 或更高，加入 RIP抑制劑，像是例如4_APP，以調節挑選，只要該抑制劑 本身對所選擇之宿主細胞是無毒性的即可。應瞭解可視所 選擇之宿主細胞或用於重組表現之條件，改變所選擇之RIp 抑制劑的濃度。例如，在本文之挑選方法中，在大腸桿菌 細胞表現系統中使用4-APP，所選擇濃度的範例是在或大約 0.2到〇.8mM，通常是〇_5mM之抑制劑。 可在以起始蛋白質RIP毒素或其共軛物處理宿主細胞 之刚 期間或之後加入RIP抑制劑。在一些實例中，將Rip 抑制劑加至液體培養物或培養基中，像是例如細胞培養 基。在其他實例中’將RIP抑制劑加至能夠固化的培養基 中’如固體瓊脂。例如，可將RIp抑制劑，像是例如4 App 加至路里亞（liiria)肉湯（LB)瓊脂中，產製含有RIP抑制劑的 瓊脂盤。可使用Rip抑制劑單獨作為挑選調節子，或可在 其他挑選調節子或選擇劑，像是但不限於其他RIp抑制劑 或賦予抗生素抗藥性之抗生素的存在下使用。 可擴大從宿主細胞轉型物中表現的所挑選之經修改毒 素’以便鑑認該所挑選之經修改RIP毒素或其共軛物。這
100 S 201235469 類=法包括普通的重組DNA技術，並對熟請此藝者而言為 y亍的可從含有經修改毒素DNA的宿主細胞轉型物中分 離載體’而能夠純化所挑選之蛋白質。例士。，在如上述以 ⑽起始蛋白質轉型大腸桿菌宿主細胞之後，使細胞轉型物 生長成個別的殖系，像是可藉著分別挑選集落來分離之， 並使其生長以進行質體純化，使隸何熟諳此藝者已知的 方法，且若需要可大量製備，像是例如使肖Midi質體純化 套組（Qiagenh可使用經純化之質體進行Dna定序，以鑑 認經修改毒素的序列，或可為了其進—步表現和生產用來 轉染至任何細胞内，像是但不限於原核生物或真核生物表 現系統。在某些實例中，可進行—或兩步驟的pcR，以擴 大所挑選之序列，可將其繼代選殖到選擇的表現載體内。 可設計PCR引子以促成繼代選殖，如藉著包含限制酵素位 置的加入。 在任何想要的細胞表現系統，進一步表現和生產所挑 選的毒素之後，可在活性測定中測試含有Rlp毒素多肽或 其共輛物的經調節培養基，或可用來進一步純化。典塑地， 在RIP抑制劑的存在下進行所挑選之經修改毒素或其 共辆物的任何進一步表現和生產m G章節中詳述了 關於改善RIP毒素或其共軛物之生產的這類方法。 4.活性評估 可測試在本文提供之方法中挑選的經修改RIP毒素或 其共輛物’以判定在挑選之後其等是否保留對宿主細胞核 糖體的毒性活性。典型地，因為與起始RIp蛋白質或其共 101 201235469 扼物相比較’其等顯示出降低之毒性活性，而挑選這類經 修改毒素。然而’通常所挑選之經修改毒素仍保留起始毒 素蛋白質的一些活性。在本文中提供的經修改RIp毒素或 其共軛物，與該毒素或其共軛物之參考或起始形式相比 較’保留 0.5%、1%、1.5%、2%、5%、10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70。/。、80% ' 90%、95%或更多的毒性活 性°測定的範例可以是任何測試rIP多肽活性的測定，包 括例如評估N_糖苷酶活性、DNA酶活性、RNA酶活性或其 他活性的測疋。可使用熟諳此藝者已知的任何方法，評枯 rip蛋白質或其共軛物的毒性活性，並典型地包括任何測定 Rip蛋白質之N-糖苷酶活性之影響的測定。在下文中描述 評估任何RIP毒性或其共軛物，包括這類毒素之經修改形 式之毒性活性的例示性測定。 a.蛋白質合成測定 可使用蛋白質合成測定 任何經修改RIP，包括例如任何在本文提供之挑選方法中鑑 認的經修改毒素）的活性，以判定該毒素對轉譯的影響。這 類測定為例行的，並為熟諳此藝者已知的。這類測定的範 例為兔子網狀細胞溶胞產物測定。兔子網狀細胞溶胞產物 典型地含有或以有效轉錄和轉譯所需之組份補充，如鎂和 鉀離子及NTPs。亦加入模板RNA ’其為所合成之蛋白質的 來源。這類測定允許經由可被憤測到的兔子核糖體，偶聯 在試管内轉錄和轉譯的蛋白f。在一方法中，可經由放射 性’如[3H]Leu、[35s]Met或[35s]Met_Cys的併入而達成偵 201235469 測，其被倂入所合成之蛋白質内，並可在利用三氣乙酸使 其沉澱後來測量（TCA ; Baas 等人（19 9 2 ) 77ze Ce//， ’ 4:225-234 ; Zhao 等人（2005) Journal of Microbiology, 54:1023-1030)。在另一方法中，可使用蟲螢光素酶DNA作 為模板，然後使用發光計來偵測它。兔子網狀細胞溶胞產 物系統的範例為由Promega販售的那些，包括例如TNT@ 經偶聯網狀細胞溶胞產物系統。在實施例2中描述這類測 疋。可改編s亥測疋以供其他轉譯系統使用，包括小麥或玉 蜀黍網狀細胞溶胞產物’或可在轉譯反應中進行改編，使 其含有完整的細胞溶胞產物或從各種上清液部分和經純化 核糖體或多核糖體重建的溶胞產物（Baas等人（1992) 尸/α/ίί Ce//，4:225-234)。在某些方法中，可改編該測定以評 估在完整細胞中對蛋白質合成的影響，其中可藉著腺病毒 表現之蟲螢光素酶助長蛋白質合成的偵測（Zha〇等人（2〇〇5) ⑽54:1023-1030)。此外，可進行動力 學分析和劑量反應曲線，藉著得到一半最大反應所需的毒 素濃度（RIC50) ’決定毒素的相對活性。 b.脫嘌呤測定 可在脫嗓吟測定中判定RIP毒素或其共軛物（如任何經 修改RIP，包括例如任何在本文提供之挑選方法令鑑認的經 修改毒素）的活性。RIP-介導之RNA大核糖體次單元的脫嘌 吟’在脫嗓吟位置增加了糖-磷酸主鏈對水解的感受性 (Turner 等人（1997) 以·，94: 3866-3871)。 在以苯胺處理之後’典型地可藉著小片段的釋放觀察到水 103 201235469 解。因此，可在漸增濃度之毒素的存在或缺乏下處理核糖 體，萃取RNA並以苯胺處理，並藉著凝膠電泳分析。可藉 著以溴化乙錠染色使片段顯影（Turner等人（1997) Proc. #加/
Zcac/. Scz··，94:3866-3871 ; Hartley 等人（1991) 290:1:65-68)。可藉著掃描RNA凝膠照片的底片判定脫嘌呤 百分比（參見例如，Taylor 等人（19 9 4 ) 77ze P/aw 5:827-835) ° c.細胞生長/存活/活力測定 可藉著直接評估對細胞生長的影響，判定RIp毒素或 其共軛物（如任何經修改RIP，包括例如任何在本文=供之 挑選方法中鑑認的經修改毒素）的活性。在這類測定中；'可 利用編碼毒素之DNA導入任佃甩技止&上士 守八仕何原核生物或真核生物細胞 中’如以適當表現載體之形式。哎去， ^ 次者，可直接將RIP多肽 或其共輛物，像是例如配體_毒奇妓 母京共軛物投與任何原核生物 或真核生物細胞。可測試任何細 』a札，包括但不限於任 始細胞，如直接獲自個體的， 寻自血液、血毁或盆仙么 織來源的細胞。在這類細胞中包杯 ^ 活化之& a f- ^ 可白血球亞型或其經 :白血球。在该測定中亦可使用細胞株，以評估RIp 多肽或其共軛物的毒性。細胞株 HT-29細胞。 範例為THP-1、U251或 可藉著測定細胞增殖、細胞 胞生長。可在一段時間Θ，在 3、’’田胞存活來監視細 乏之下監視生長。例如，可藉9，&之毒素的存在或缺 胞數目、在-段時間内測量;C:er計數器上計算細 光雄、度（Suh等人（1998) 201235469 別oc/2em/Wr_y，37:9394-9398)、使用DNA染料（如由活細胞 還原的MTT，形成可測量的不溶性紫色甲脂結晶）（Arora等 人（1999) Aewarc/z，59:183-1 88; McDonald 等人（2001) /Z)rMglS，4:427-442) ’或藉著使用染料（如錐蟲藍，其從存活 細胞但不會從死細胞中排除）(McDonal(l等人（2001) /乃〜队 4:427-442)來監視細胞生長。在另一實例中，可藉著測量釋 放至細胞培養基中ATP的量來評估細胞活力。這類測定的 範例為CellTiter-Glo®發光細胞活力測定套組（Pr〇mega， Madison WI)，例如在實施例5中描述的。在以ATP反應混 合物（由CellTiter-Glo®試劑製造者供應）溶解細胞後，ATP 駕馭蟲螢光素的氧合作用，結果產生與在孔中之Ατρ濃度 成比例的發光信號《這與在培養物中存活細胞的數目成正 比。 E ·例示性經修改毒素 在本文中提供經修改RIP毒素多肽或其共軛物，與野 外型RIP多肽相比較，其展現出降低之毒性活性。例如經 修改RIP毒素多肽或其共軛物，與該毒素或其共辆物之參 考或起始形式相比較’展現出〇.5%、' 1 5% ' 2〇/。、5%、 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95〇/〇 或更多的毒性活性。藉著降低毒性，可由宿主細胞表現這 類經修改RIP毒素多肽，並可從其中純化、分離及/或鑑認。 經修改毒素或其共軛物對真核生物或原核生物細胞展現出 降低的毒性。通常，經修改RIP毒素或其共軛物對細菌細 胞，如大腸桿菌展現出降低之毒性，藉此容許該毒素來源 105 201235469 可被用在在大腸桿菌中生產的方法中。 典型地，這類經修改RIP毒素多肽或其共軛物保留了 該蛋白質之起始或野外型形式（即未經修改之多肽）的一或 多個活性。例如，該經修改RIP毒素多肽或其共軛物，與 未經修改或野外型RIP多肽或其共軛物相比較，保留了一 或一個以上的RIP活性的至少或大約〇 5%、1%、丨5%、2〇/〇、 5% ' 10% ' 20% > 30% > 40% ' 50% - 60% ' 70% ' 80% ' 90% ^ 95%或更多活性。rIP多肽的活性包括但不限於任一或多個 N-糖苷酶活性、多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，包括rna酶 活性和DNA酶活性、超氧物歧化酶活性、磷脂酶活性、幾 丁質酶活性和抗-病毒活性。可在試管内或在活體内評估活 ί·生’並可與起始RIP多肽的活性作比較。 在某些實例中，在本文之挑選方法中鑑認這類經修改 Rip多肽，像是藉著其等由宿主細胞之表現，與不由宿主細 胞表現或以低水平表現的起始RIp多肽或含有RIp多肽之 夕肽共軛物作比較。如同上述，在導入編碼起始或野外型 Rip多肽之核酸，例如任何編碼在表3中陳述之RIp多肽或 其’舌性片段的核酸之後，鑑認這類經修改RIp毒素多肽， 接著挑選和鑑認經表現之RIp多肽。在某些實例中，在從 以編碼起始RIP毒素或其活性部分之核酸導入的宿主細胞 中表現毒素之後，鑑認本文提供的經修改RIP毒素多肽。 在其他的實例巾’在從以編碼含# RIP料或其活性部分 之多肽的起始共軛物導入的宿主細胞中表現RIP毒素共軛 物多肽（即配體-毒素共軛物）之後，鑑認本文提供的經修改 106 201235469
Rip毋素多肽》典型地，這類共軛物為融合蛋白，藉此而能 夠將編碼該融合蛋白的核酸分子導入細胞内。 使用在本文中描述的方法，可鑑認在經表現之RIp多 肽中的特殊修改，像是例如藉著定序該多肽。典型地，在 本文之方法中鑑認的修改，包括任何改變未經修改多肽之 一級序列的修改，並包括但不限於任一或多個胺基酸置 換、胺基酸刪除及/或絲酸截短1如該修改包括在一級 序列中的任一或多個胺基酸突變，或一級序列的截短，或 其任何組合。因此，可藉著改變多肽之一級序列，鑑認在
Rip多肽或其活性片段中賦予降低細胞毒性的胺基酸殘基 之修改。 可在任何目標蛋白質(例如任何相關的多狀，像是但不 限於所表現之RIP多肽的任何對偶基因、物種、經截短或 其他變體形式）之相對應位置中，進行在本文之挑選方法中 在斤表現之RIP夕肽中鐘認的修改。可藉著標準重組測A 技術’如熟諳此藝者慣用的，來進行這類修改。可使用任 何在技術領域中已知的在目標蛋白f中完成任—或多個胺 土馱大的方法。β亥方法包括編碼性核酸分子的標準指定 位置犬變生成(使用例如套組，如可獲自的 QuikChange)，或藉著固相多肽合成法。 纟外，任何在本文之方法中鑑認的，或基於在本文方 ，中鑑認之修改而產製的經修改Rip多肽，均可用來產製 -合蛋白或共軛物。例如’可產製配體-毒素共軛物，其且 有作為被Μ劑的經修改毒素部分（參見下文f章節），直接 107 201235469 或間接與任何靶定細胞表面受體的部分連接，以便將其内 化。可藉著例行的重組DNA技術產製這類共槪物。例如， 可使用適合例行繼代選殖想要之共輛物組份的限制酵素和 選殖方法，來產製共軛物。產製任何經修改多肽，包括呈 有在本文之挑選方法中鑑認之修改’仍保留毒性活性的任 何共軛物。這類經修改多肽通常仍保留或展現出任—或多 個RIP活性。可測試該共軛物的毒性活性及其他活性。 在經修改RIP多肽或其共扼物中，亦可包含其他是戈 .不是在該多肽之一級序列中的修改，像是但不限於添加碳 水化合物部分、添加聚乙二醇（PEG)部分、添加Fc功能部 位等等。例如’可進行這類額外的修改以增加該蛋白質的 穩定性或半衰本文提供之RIP毒素的範例為SA1之經修改 形式’包括在其任何活性形式中的修改，例如其任何經截 短形式’只要該經截短多肽展現出RIp活性即可，以及其 對偶基因或物種變體。例如，經修改S/U多肽可在sai之 經截短變體，如在SEq ID NO:22或SEQ ID N〇:24中陳述 的，或其任何對偶基因或物種變體中包含任一或多個修 改。與在挑選方法中使用之起始SA1毒素相比較，經修改 SA1毒素可被截短或可表現胺基酸突變。典型地，與起始 SA1多肽相比較，這類經修改毒素仍保留一或多個活性。因 了在改。S A1夕肽生產的方法中使用這類經修改$ a工 多肽’並可用在融合蛋白中，以產製含有該經修改sai多 肽的共軛物蛋白質》 可在本文之挑選方法中鑑認經修改SA1多肽。在一實 108 201235469 例中，在導入編碼SA1多肽或其活性片段的核酸之後，鑑 認經修改SA1多肽。例如，可在導入編碼如在seqidn〇:22 中陳述之變體1 SA1多肽的核酸之後，完成經修改SA1多 肽的挑選。在另一實例中，可在導入編碼變體2 SAi多肽 的核酸之後，完成經修改SA1多肽的挑選。變體2 SA1是 與在SEQIDNO:22中陳述之變體1SA1相比較，缺少5個 c-端胺基酸（CHHHA)所製成的SA1形式，以避免半胱胺酸_ 引起的二聚化。在SEQ ID NO:24中陳述變體2 SA1的胺基 酸序列，並由在SEQ IDN〇:25中陳述之核酸序列編碼。 在某些情況下，可在導入編碼含有SA1多肽部分之共 軛物的核酸分子之後，完成經修改SA1多肽的挑選。該共 軛物可包含任何配體-毒素共軛物或其他共軛物，只要該共 軛物含有SA1多肽或其活性片段即可。例如，可使用在美 國專利第7，166,702號、7，157,418號和7，192,736號中描述 的趨化因子共軛物做為起使蛋白質，以鑑認變體丨SA1多 肽的經修改形式（在SEQIDNO:22中陳述，並由在SEQID NO_23中陳述之核酸序列編碼）。在一實例中，使用^ & 多狀作為起使蛋白質，其為與變體1 SA1多肽間接連接之 趨化因子MCP-1的共軛物。在SEQ IDNO:38中陳述LPMla 共軛物，並由在SEQ ID NO:3 7中陳述之核酸序列編碼。在 另—實例中，可使用含有與SA1之變體2形式連接之趨化 因子MCP-1的共軛物作為起始之未經修改蛋白質，在本文 中亦稱為LPMlb。在SEQ ID NO:40中陳述LPMlb共軛物， 並由在SEQ ID NO:39中陳述之核酸序列編碼。 109 201235469 在本文中提供經修改SA1毒素，其在位置38處含有胺 基酸突變，相當於在SEQIDNO:22中陳述之變體SA1多肽 的位置38。例如胺基酸修改可相當於位置L38。在本文提 供之方法中鑑認的例示性胺基酸突變，相當於在變體sai 多肽（如在seqIDNO:22中陳述的）中的修改L38R。在某些 實例中，在其他的SA1變體形式，包括對偶基因或物種變 體中鑑認或製造相對應之L38R突變。例如，可在SEQ m N0.24中陳述之SA1的變體2序列中製造相對應之L38R突 變。例示性SA1毒素具有在SEq ID n〇:26中陳述之L38R 的胺基酸突變，並由在SEq IDN〇:27中陳述之核酸序列編 碼。在本文中穸將該經修改SA1稱為突變種變體丨（亦稱為 變體3)。可使用突變種變體1 SA1多肽產製更多的毒素共 軛物，其可用在，例如治療為其設計共軛物之疾病或病症 的方法中。此外，突變種變體i s A【多肽亦可用在改善sA丄 或其共輛物之生產的方法中β 在另一實例中’本文提供經修改SA1毒素，其在位置 219處含有胺基酸突變，相當於在SEq id ΝΟ:22中陳述之 變體S A1多肽的位置2 1 9。例如胺基酸修改可相當於位置 V2 1 9。在本文提供之方法中鑑認在δ A1中的例示性胺基酸 突變’相當於在變體SA1多肽（如在SEQ ID NO:22中陳述 的）中的修改V219A。在某些實例中’在其他的SA1變體形 式’包括對偶基因或物種變體中鑑認或製造相對應之V2 1 9 A 突變。例如，可在SEQ ID NO:24中陳述之SA1的變體2序 列中製造相對應之V 219 A突變。例示性經修改S A1多肽具 110 201235469 有在SEQ ID NO:28中陳述之V219A的胺基酸突變，並由 在SEQ ID NO:29中陳述之核酸序列編碼。在本文中亦將該 經修改S A1稱為突變種變體2 (亦稱為變體4)。可使用突變 種變體2 SA1多肽產製更多的毒素共軛物，其可用在，例 如治療為其設計共輛物之疾病或病症的方法中。此外，突 變種變體2 SA1多肽亦可用在改善SA1或其共軛物之生產 的方法中。 此外’可混合任何在本文之挑選方法中在經修改Rip 多肽中鑑認的突變。例如，可產製具有L38和V219修改（相 當於在任何SEQ ID N〇:22中陳述之變體SA1中的位置）的 經修改SA1多肽或其共軛物。可在任何SA1多肽，如分別 在SEQ ID NO:22或24中陳述之SA1多狀、其任何對偶基 因或物種變體，或任何熟諳此藝者已知的其他Sai變體中 的相對應位置’進行這類修改。此外，亦可將任何在本文 之挑選方法中在經修改RIP多肽中鑑認的突變與任何在RIp 多肽中為熟諳此藝者已知或後續對其鑑認的其他突變混 合。典型地’在RIP多肽或其共軛物中的任何這類混合突 變種，與RIP多肽之野外型或起始形式相比較，對宿主細 胞展現出降低之毒性，其與毒素或其共軛物的參考或起始 形式相比較’尚保留 0.5%、1%、1.5%、2%、5%、1〇%、2〇%、 3 0%、40%、5 0%、60%、70%、80%、90%、95。/〇或更多的 毒性活性。 F.靶定劑及其共軛物 在本文中提供含有RIP多肽毒素或其活性片段的共軛
111 201235469 物’直接或間接與-或多個部分或製劑，如化學物質、多 肽或肽部分或其-部分連接。典型地，用在本文提供之共 耗物中的毒素是含有任冑RIP #素變體，包括任何經修改 RIP毒素變體的那些。這類經修改毒素包括任何本文提供或 使用本文提供之挑選方法鑑認的經修改RIp毒素像是例 如經修改SA1 .毒素或其對偶基因變體或#段。在這類經修 文S A 1中包g在本文之挑選方法中鑑認的突變種變體1 SA1(即變體3)或突變種變體2 SA1(即變體4)。 典型地，經修改RIP毒素直接或間接與靶定劑連接， 包括任何藉著選擇性地與細胞|面受體結纟而使共軛物靶 定一或多個細胞類型之製劑（即在本文中稱為配體_毒素共 軛物）因此，在本文中打算使用任何與細胞表面受體結合 並被細胞内化的多肽或分子。這類把^劑包括，但不限於 生長因.子、細胞介素、趨化因+、抗體和激素，或其對偶 土因體、犬變蛋白或片段，只要該靶定劑被細胞表面受 體内化即可。it匕外，本文提供之共輛物可視需要含有額外 的組份，像是例如但不限於額外的序列或部分，以促成選 殖表現、轉譯後修改、純化、偵測和投藥。這些包括， 例如限制酵素序列、轉譯起始或終止密碼子序列' His標籤 或其他的這類组份❶例如，可將起始的曱硫胺酸密碼子或 Kozak序列加至編碼性核酸序列中，以允許或增強成熟多肽 或多肽片段的轉譯。此外，如在上文D章節中所述，可使 用任何編碼含有靶定劑（其連接被靶定劑，如Sai次單元或 其活性部分）之配體·毒素共軛物的核酸分子，篩選被靶定劑 201235469 之變體’如經修改SM’如同在上文和在本文之實施例中所 述0 1.靶定劑 通常，本文提供的經修改RIP毒素共軛物含有靶定劑， 其使該共輛物以在涉及各種疾病過程之病理學的細胞或 :田胞族群上的受體或受體們。依據疾病或病症，這類細胞 是經活化的細胞’其在疾病以及疾病過程中是有功能的， 或是支持該疾病過程的旁觀細胞。結果，靶定這些受體和 表現這些受體的細胞，允許治療得以配合特定的疾病以 及該疾病之進行。因此，在各種疾病之治療中可使用本文 提供之共輛物作為治療劑。 例如，本文提供之共軛物包含配體毒素，其含有與在 涉及免疫反應之特定細胞類型，包括各種涉及炎性疾病之 白血球亞型上的受體結合的靶定部分。例如，作為本文提 供之共軛物的組份，靶定部分可包含配體，其靶定一或多 個在免疫系統之細胞（如白血球家系的任何細胞或其他組織 居留細胞，包括在涉及疾病過程之經活化細胞）上表現的細 胞表面受體。在本文中可被共軛物靶定之細胞類型的實例 包括，但不限於白血球，包括但不限於單核細胞、巨噬細 胞，包括組織巨噬細胞，如腦的小神經膠質細胞、肝臟的 庫弗細胞或肺的肺泡巨噬細胞、B細胞、T細胞，包括Thl 和Th2細胞、嗜鹼性白血球、嗜酸性白血球、樹突細胞， 包括未成熟和成熟的樹突細胞以及朗格漢斯細胞、肥大細 胞、自然殺手細胞和嗜中性白血球。在本文中可被靶定之 113 201235469 細胞類型的其他實例包括血小板、星狀細胞、内皮細胞、 神經元、上皮細胞和脂肪細胞。 a ·趨化因子 在本文中提供共軛物，藉以在配體-毒素共軛物中使用 選自趨化因子家族的靶定劑。欲察知在本文之共軛物中， 作為靶定劑之趨化因子的用途，瞭解趨化因子配體及其受 體之功能和交互作用是有幫助的。下列的討論提供了這類 背景。 趨化因子是40或更多個小蛋白質的家族，其典型地由 細胞分泌並刺激附近反應性細胞，典型地為白血球（其表現 同族的趨化因子受體）的活化及/或移行（“趨化性，，）。趨化因 子一起靶定全部範圍的白血球亞型；每個分別靶定—部分 的範圍。雖然一些趨化因子是組成上的，並涉及體内平衡 的免疫反應，但許多趨化因子被稱為炎性趨化因子，並從 各種細胞中反映細菌感染、病毒和其他刺激原而被誘導。 趨化因子具有各種生物活性。一開始藉著其等之刺激 白血球移行和活化的能力分離之。趨化因子，與黏連分子 結合，招募白血球亞組至炎性反應和組織傷害的特定位 置。例如，趨化因子之功能主要是作為化學吸引劑，經由 刺激在各種白血球，包括在先天免疫性中的那些上表現的 趨化因子受體，藉此從血液中招募單核細胞、嗜中性白血 球及其他效應細胞至感染或受傷的部位，還有在繼承免疫 f生中的那些’包括招募淋巴細胞至免疫反應的部位。通常， 在疾病中向上調節趨化因子和趨化因子受體的表現，使趨 114 201235469 化因子以自分泌（autocrine)或旁分泌（paracrine)之方式作用 (Glabinski 等人（1995) /«ί. /. _Dev. iVeMrosci··，13:1 53-65; Furie 泮 口 Randolph( 1995) Am. J. Pathol，, 146:1287-301 ； Benveniste E.N.(1997) J. Mol. Med., 75:165-73 ； Schall 等人 (1994) Cwrre/ιί 5z.o/.，6: 865-73 ; Taub 等人（1994) 77^广 1:229-46; Baggliolini 等人（1994) /所所《；7〇/.， 55:97-179 ;以及 Haelens 等人（1996) Immunobiol., 195:499-521 ； Taub, Cytokine Growth Factor Res., 7:355-76, 1996; Dong 等人，Eur. J. Dermatol.，13:224-30, 2003;Pastore 等人，Enr. J. Dermatol” 14:203-8, 2004: Charo 和 Rans〇h〇ff, N Eng J Med.，354:610-21，2006)。 趨化因子亦引起細胞的活化，包括但不限於小神經膠 質細胞和巨噬細胞。因此，咸認為趨化因子從各種白血球 族群中引起活性氧物種、降解酵素和炎性及有毒之細胞介 素的產生和釋放。此外，已經顯示趨化因子調節負面造血 創始者的增殖，而數個CXC趨化因子可調節血管生成。趨 化因子亦在許多涉及炎性組織破壞的疾病，如成人呼吸窘 迫徵候群、錢梗塞、風濕性關節炎和動脈㈣硬化中扮 演一角色。 趨化因子-開始，例如根據其功能或起源來命名。在 本文之正文中使用特定配體最常用的名稱。已經採用最近 的系統命名法’其使用趨化因子的集群名稱，接著是編號。 例如’配體單核細胞化學吸引蛋白質(Μ。。」和介白素 ()”财系統地稱之為CCL2和CXcl8。將其受體分別 115 201235469 稱為 CCR2 和 CXCR1/2^ 乂和 7;Bac〇n，等人，了ϋΓ〇η Cytokine Res., 22:1067-8, 2002 ； Murphy, Pharmacol. Rev, 54:227-9, 2002 ； Murphy f A, Pharmacol. Rev., 52:145-76, 2000)。在本文中提及的趨化因子和趨化因子受體，可交替 參考俗名和系統命名法。提供熟諳此藝者已知的名稱，或 可決定相對應的名稱。 i·配體 .趨化因子，如上文提及的，為小型（大約6到大約 14kDa) ’可誘導並經分泌之化學吸引性細胞介素的超級家 、八主要作用在白血球亞型上。趨化因子配體在其原始 Ό構中八有在1 5到50%之間的同一性，但為其等所共享之 、座问度保留的二維結構，是造成受體結合和活化的主要原 因。基於在原始結構中四個經保留半胱胺酸殘基的位置（或 存幻^將該超級家族分成四個亞-家族。有三組含有四個半 ^胺馱，另一組則否。藉著前兩個半胱胺酸的排列來定義
右刖兩個半胱胺酸被一個胺基酸分開，則其為CXC 豕族之t員（亦稱為α);若半胱胺酸為相鄰的，則將其分類 為CC家族（亦稱為ρ);若半耽胺酸被3個胺基酸分開， CX3C’貝’!其為第三組之成員(亦稱為δ卜第四組的趨化因 子，c或γ’含有兩個半胱胺酸，相當於在其他组中的第一 和第三個半胱胺酸。 結構分析證實大多數的趨化因子具有單體功能，而受 合所需的兩個區域位在成熟多肽之有彈性Ν-端的前35 固胺基酸内（Clark_Lewis等人（i995w仏―^
116 S 201235469 57:703-1 1 ; Beall 等人（1996) 5z.oc/^w· /· 313:633-40;和
Steitz等人（1998)尸五似43〇:158_64)。可形成趨化因子 '的二聚體’其形成在趨化因子之間有差異。典型地在溶液 中’在高濃度下發生二聚體的形成（Baggi〇Uni等人（2〇〇1) j hi. Med.，250:91-104)。然而，二聚體在稀釋後解離，並由 單體組成具有生物活性的分子。 通常，α趨化因子成員優先是對嗜中性白血球和τ_淋巴 細胞有活性的’而β趨化因子則是對單核細胞、巨噬細胞、 耆酉欠性白血_球和Τ -淋巴細胞有活性的。此外，α和β趨化 因子亞家族的數個成員對樹突細胞是有活性的，其為移行 細胞’且在其活化及從未成熟吞噬細胞中成熟之後，展現 出有效的抗原提交特性，並認為其參與許多炎性疾病的病 理生理學（例如 Xu 等人，《/. Zewhc. 5ζ.〇/.，60: 365-7 1，1 996 ; 和 Sozzani 等人，J. 759: 1993-2000，1997 ;
Hashimoto 等人，J Dermatol Sci., 44: 93-9, 2006 ； van Rijt 等人，J Exp Med，201:981-91, 2005)。最近已經報告了第四 個人類CX3C -型趨化因子’稱為人神經趨化蛋白（Bazan等 人，iWziwre，385:640-4，1997; Imai 等人，Ce//，97:521-30, 1997 ; Mackay，Cwrr_ 5ζ·ο/· 7:R384-6，1997)。不像其他的趨 化因子，人神經趨化蛋白存在於膜中，並以可溶形式存在。 可溶形式為單核細胞和T-細胞的有效化學吸引劑。該趨化 因子的細胞表面受體叫做CX3CIU。應注意到在衍生自不同 物種之趨化因子的化學性質和物理作用之間可能有細微的 差異（Baggliolini 等人，3办· Wwwwo/.，55:97-179, 1994 ;和 117 201235469
Haelens 等人，ο/·, 795:499-521，1996) 〇 表4陳述例示性趨化因子，包括其同義字，以及例示 性SEQ ID NO。此外，表4陳述編碼成熟趨化因子的信號 序列和胺基酸位置，參考在個別SEQ ID NO中的位置。應 注意胺基酸位置之說明僅為了解釋，並無意限制所提供之 具體事實的範圍。應瞭解理論上基於與類似多肽之同種分 析和排列來衍生多肽及其說明。因此，精確位點可能改變， 且對每個多肽而言不一定是相同的。趨化因子之對偶基因 變體或物種變體亦為已知的。在任何SEQ ID NO:170- 191 中陳述了例示性趨化因子中之對偶基因變化的範例。 表4 :例示性趨化因子配體 趨化因子 同義字 UniProt 編號： 信號 序列 成熟的趨 化因子 SEQ ID NO: MCP-1(單核細 胞化學吸引蛋 白質-1) CCL2 ;小型可誘導之細胞介素 Α2 ; MCAF ;單核細胞分泌性 蛋白質 JE ; HC11 ; SCYA2 P13500 1-23 24-99 112 嗜酸球趨化蛋 白(嗜酸性白血 球趨化蛋白） CCL11 ;小型可誘導之細胞介 素 All ; SCYA11 P51671 1-23 24-97 113 SDF-取基質細 胞-衍生因子1) CXCL12 ;前-B細胞生長-刺激 因子(PBSH) ; hIRH P48061 1-21 22-93 114 GRO-ct(生長-調節蛋白α) CXCL1 ;黑色素瘤生長刺激活 性(MGSA);嗜中性白血球-活化 蛋白質 3(NAP-3) ; SCYB1 P09341 1-34 35-107 115 ΜΙΡ-1β(巨噬細 胞炎性蛋白質 ΐ-β) CCL4 ;小型可誘導之細胞介素 A4 ; T-細胞活化蛋白質2 ; ACT-2 ； PAT 744 ； H400 ； SIS-γ ； 淋巴細胞活化基因1蛋白質 (LAG-1) ; HC21 ; G-26T-淋巴 細胞-分泌性蛋白質；SCYA4 P13236 1-23 24-92 116 118 201235469 趨化因子 同義字 UniProt 編號： 信號 序列 成熟的趨 化因子 SEQ ID NO: IL-8(介白素-8) CXCL8 ;單核細胞-衍生之嗜中 性白血球趨化因子(MDNCF); T-細胞趨化因子；嗜中性白血 球-活化性蛋白質1(NAP-1);蛋 白質3-10C ;顆粒球趨化蛋白1 (GCP-1);單核細胞-衍生之嗜中 性白血球-活化肽(MONAP);依 莫白介素(Emoctakin) P10145 1-20 21-99 117 IP-10 (干擾素-可誘導之蛋白 質-10) CXCL10;小型可誘導之細胞介 素B10 ; 10kDa干擾素-γ-誘導 之蛋白質；γ-ΙΡ1〇 ; SCYB10 P02778 1-21 22-98 118 MCP-3(單核細 胞趨化蛋白3) CCL7 ;小型可誘導之細胞介素 Α7 ； NC28 ； SCYA7 P80098 1-23 24-99 119 ΜΙΡ-3α(巨嗤細 胞炎性蛋白質 3 α) CCL20 ;小型可誘導之細胞介 素Α20 ;肝臟和活化-調節之趨 化因子(LARC) ; β趨化因子艾 索朵斯-1 ; SCYA20 P78556 1-26 27-96 120 MDC(巨噬細 胞-衍生之趨化 因子） CCL22 ;小型可誘導之細胞介 素Α22 ;經刺激之Τ-細胞趨化 蛋白 l(STCP-l) ; SCYA22 000626 1-24 25-93 121 ΜΙΡ-1α(巨嗤細 胞炎性蛋白質 1-α) CCL3 ;小型可誘導之細胞介素 A3 ;扁桃腺淋巴細胞LD78a蛋 白質；G0/G1轉換調節蛋白質 19-1(G0S19-1 蛋白質）；SIS-β ; PAT 464.1 ； SCYA3 P10147 1-23 24-92 122 BCA-1(B 細胞-吸引性趨化因 子1) CXCL13 ;小型可誘導之細胞介 素B13 ; B淋巴細胞化學吸引 劑；CXC趨化因子BLC ; ANGIE ； SCYB13 043927 1-22 23-109 123 GCP-2(顆粒球 趨化蛋白2) CXCL6 ;小型可誘導之細胞介 素B6 ;趨化因子a3(CKA-3); SCYB6 P80162 1-37 38-114 124 ENA-78(上皮-衍生之嗜中性 白血球-活化性 蛋白質78) CXCL5 ;小型可誘導之細胞介 素 B5 ;SCYB5 P42830 1-36 37-114 125 119 201235469 趨化因子 同義字 UniProt 編號： 信號 序列 成熟的趨 化因子 SEQ ID NO: PBP(血小板驗 性蛋白質） CXCL7 ;小型可誘導之細胞介 素Β7;白血球-衍生之生長因子 (LDGF);巨嗤細胞-衍生之生長 因子(MDGF);結締組織-活化 肽III(CTAP-III);低親和力血小 板因子 IV(LA-PF4) ; TC-2 ; β-丘小板球蛋白；嗜中性白命球-活化肽 2(NAP-2) ; SCYB7 P02775 1-34 35-128 126 ΜΚ5(γ干擾素 誘導之單核細 胞活素） CXCL9 ;小型可誘導之細胞介 素 Β9;SCYB9 Q07325 1-22 23-125 127 PF-4(血小板因 子4) CXCL4 ;制瘤素(Oncostatin)A; 艾若普克(Ironplact) ; SCYB4 P02776 1-31 32-101 128 PF-4變體1(血 小板因子4變 體） CXCL4L1 ； PF4alt ； PF4V1 ； SCYB4V1 PI0720 1-30 31-104 129 SDF-2(基質細 胞-衍生因子2) Q99470 1-18 19-211 130 MCP-2(單核細 胞趨化蛋白2) CCL8 ;小型可誘導之細胞介素 A8 ； HC14 ； SCYA10 ； SCYA8 P80075 1-23 24-99 131 MCP-4(單核細 胞趨化蛋白4) CCL13 ;小型可誘導之細胞介 素 A13 ; CK-β-ΙΟ ; NCC-1 ; SCYA13 Q99616 1-16 17-98 132 MIP-4(巨噬細 胞炎性蛋白質 4) CCL18 ;小型可誘導之細胞介 素A18 ;肺臟和活化-調節之趨 化因子(PARC);另一種巨噬細 胞活化-關聯之CC趨化因子 l(AMAC-l);樹突細胞趨化因 子 l(DC-CKl) P55774 1-20 21-89 133 ΜΙΡ-3β(巨噬細 胞炎性蛋白質 3-β) CCL19 ;小型可誘導之細胞介 素A19 ; EBI1-配體趨化因子 (ELC) ; β趨化因子艾索朵斯 -3 ； CKp-ll ； SCYA19 Q99731 1-21 22-98 134 ΜΙΡ-2α(巨噬細 胞炎性蛋白質 2-α) CXCL2 ;生長-調節蛋白質β (GRO-β) ； GR02 ； GROB ； SCYB2 P19875 1-34 35-107 135 ΜΙΡ-2β(巨噬細 胞炎性蛋白質 2-β) CXCL3 ;生長-調節蛋白質γ (GRO-γ) ； GR03 ； GROG ； SCYB3 P19876 1-34 35-107 136 120 201235469 趨化因子 同義字 UniProt 編號： 信號 序列 成熟的趨 化因子 SEQ ID NO: MIP_5(巨嗤細 胞炎性蛋白質 5) CCL15 ;小型可誘導之細胞介 素A15 ;趨化因子CC-2 ; HCC-2 ; NCC-3 ; MIP-Ιδ;白血 球趨化因子(Leukotactin); LKN-1 ； Mrp-2b ； SCYA15 Q16663 1-21 22-113 137 HCC-1(血液濾 液CC趨化因 子1) CCL14 ;小型可誘導之細胞介 素A14;趨化因子CC-1/CC- 3 ; HCC-1/HCC-3 ； NCC-2 ； SCYA14 Q16627 1-19 20-93 138 RANTES(正常 T-細胞表現和 分泌調節活化 因子） CCL5 ;小型可誘導之細胞介素 A5 ; SIS-δ ; T細胞-專一性蛋白 質 P228(TCP228) ; SCYA5 P13501 1-23 24-91 139 嗜酸球趨化蛋 白-2 (嗜酸性白 血球趨化蛋白 2) CCL24 ;小型可誘導之細胞介 素A24;髓樣創始者抑制因子2 (MPIF-2) ； CK-β-ό ； SCYA24) 000175 1-26 27-119 140 TARC(胸腺和 活化-調節之趨 化因子） CCL17 ;小型可誘導之細胞介 素 A17 ; SCYA17 Q92583 1-23 24-94 141 T淋巴細胞-分 泌蛋白質1-309 CCL1 ;小型可誘導之細胞介素 Al ；SCYA1 P22362 1-23 24-96 142 淋巴細胞趨化 因子 XCL ;小型可誘導之細胞介素 C ;細胞介素 SCM-1 ; ATAC ; 淋巴細胞趨化因子，SCM-1-ct， XC趨化因子配體1 ; SCYC1 P47992 1-21 22-114 143 肺活素 CXCL15 ;小型可誘導之細胞介 素 B15 ; SCYB15 Q9WVL 17 1-25 26-167 144 C10 CCL6 ;小型可誘導之細胞介素 A6;SCYA6 P27784 1-21 22-116 145 ΜΙΡ-1γ(巨嗟細 胞炎性蛋白質 1-γ) CCL9 ; CCL10 ;小型可誘導之 細胞介素A9 ;巨噬細胞炎性蛋 白質-相關之蛋白質2 (MRP-2) ； CCF18 ； SCYA9 ； SCYA10 P51670 1-21 22-122 146 MCP-5(單核細 胞趨化蛋白5) CCL12 ;小型可誘導之細胞介 素A12 ; MCP-1-相關之趨化因 子；SCYA12 Q62401 1-22 23-104 147 LEC(肝臟-表現 之趨化因子） CCL16 ;小型可誘導之細胞介 素A16 ; IL-10-可誘導之趨化因 015467 1-23 24-120 148 121 201235469 趨化因子 同義字 UniProt 編號： 信號 序列 成熟的趨 化因子 SEQ ID NO: 子；單核細胞趨化因子 (Monotactin)-l(MTN-l)； HCC-4 ; NCC-4 ;淋巴細胞和單 核細胞化學吸引劑(LMC); LCC-1 ； ILINCK ； SCYA16 艾索朵斯-2 CCL21 ;小型可誘導之細胞介 素A21 ; 6C活素;二級淋巴樣-組織趨化因子(SLC) ; SCYA21 000585 1-23 24-134 149 MIP-3(巨噬細 胞炎性蛋白質 3) CCL23 ;小型可誘導之細胞介 素A23 ;髓樣創始者抑制因子1 (MPIF1) ； CK-β-δ ； CKB-8 ； SCYA23 P55773 1-21 22-120 150 TECK(胸腺表 現之趨化因子） CCL25 ;小型可誘導之細胞介 素 A25 ; SCYA25 015444 1-23 24-150 151 嗜酸球趨化蛋 白-3 CCL26 ;小型可誘導之細胞介 素A26 ;巨噬細胞炎性蛋白質 4-α(ΜΙΡ-4-α);胸腺基質趨化因 子-l(TSC-l) ; IMAC ; SCYA26 Q9Y258 1-23 24-94 152 CTACK(皮膚 T-細胞-吸引性 趨化因子） CCL27 ;小型可誘導之細胞介 素 A27 ; ILC ; IL-11 R-α-位點 趨化因子；皮膚活素 (Skinkine) ; ES 活素；SCYA27 Q9Y4X 3 1-24 25-112 153 MEC(黏膜-結 合之上皮趨化 因子） CCL28 ;小型可誘導之細胞介 素 A28 ; CCK1 ; SCYA28 Q9NRJ3 1-19 20-127 154 SCM-Ιβ(單一 C 基序-1β) XCL2 ; XC趨化因子配體2 ; SCM-lb ； SCYC2 Q9UBD 3 1-21 22-114 155 I-TAC(干擾素-可誘導之Τ-細 胞α化學吸引 劑） CXCL11 ;小型可誘導之細胞介 素B11 ;干擾素-γ-可誘導之蛋 白質 9(ΙΡ-9) ; Η174 ; β-Rl ; SCYB9B ；SCYB11 014625 1-21 22-94 156 BRAK(乳房和 腎臟-表現之趨 化因子） CXCL14;小型可誘導之細胞介 素Β14 ;波爾活素(Bolekine); NJAC ； SCYB14 095715 1-22 23-99 157 SR-PSOX(磷脂 醯絲胺酸和經 氧化之低密度 之蛋白的清除 劑受體） CXCL16;小型可誘導之細胞介 素 B16;SCYB16 Q9H2A 7 1-29 30-254 158 122 201235469 趨化因子 同義字 UniProt 編號： 信號 序列 成熟的趨 化因子 SEQ ID NO: 人神經趨化蛋 白 CX3CL1 ;小型可誘導之細胞介 素D1 ;神經元趨化因子 (Neurotactin); CX3C 膜-固定之 趨化因子；FKN ; SCYD1 035188 1-24 25-395 159 LD78-P CCL3L1 ;類-小型可誘導之細 胞介素A3-1 ;扁桃腺淋巴細胞 ΙΧ)78β蛋白質；G0/G1轉換調 節蛋白質19-2(G0S 19-2蛋白 質）；PAT464.2 ; SCYA3L1 P16619 1-23 24-93 160 MIP-lb2(巨噬 細胞炎性蛋白 質-lb2) CCL4L1 ; CC趨化因子配體 4L1 Q8NH W4 1-23 24-92 161 ii.趨化因子受體 趨化因子經由G-蛋白質-偶聯之七個穿透膜、類-視紫 質的細胞表面受體介導其等之活性。典型地，CXC趨化因 子與七個CXC-受體中之一或多個結合（CXCFJ、2、3A、3B、 4、5、6)，而CC趨化因子貝與1 1個CC-受體中之一或多 個結合（CCR1、2A、2B、3-10)。其他的趨化因子受體包括 XCR1、CX3CR、D6、CKX-CKR 和達菲（Duffy)(亦稱為趨化 因子的達菲抗原受體或DARC)。DARC、D6和CKX-CKR 是清除劑趨化因子受體，其可與來自所有四組之趨化因子 配體結合（Hansell 等人，Biochem Soc Trans.，34: 1009-13, 2006 ; Locati 等人，Cytokine Growth Factor Rev., 16:679-86, 2005)。例示性趨化因子受體包括，但不限於趨化因子之達 菲抗原受體（DARC)、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、 CXCR-3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、CXCR-7、CCR-1、 CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、 CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、XCR1、D6 及其他趨 123 201235469 化因子受體。 趨化因子對其等之目標細胞的受體結合為一複雜且不 斷-發展的研究領域。通常，受體以部分重疊和複合之方式 與各種配體結合。炎性細胞典型地表現數個趨化因子受 體，而有一個以上的趨化因子可與一受體結合。例如，p趨 化因子受體CCR3不只與MCP-3、MCP-4和RANTES結合， 還與二個其他的C C趨化因子受體’嗜酸球趨化蛋白、嗜酸 球趨化蛋白-2和嗜酸球趨化蛋白_3結合（He等人， 355:645-49，1997 ; Jose 等人，J. Εχρ· Met/·, /79:881-7, 1994 ’ Jose 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun·, 205:788-94, 1994 ； Ponath # A, J. Clin. Invest., P7:604-12, 1996 ; Daugherty 等人，Mei 753:2349-54，1996 ;和
Forssman 等人，J_ 五印· Mec/·，/55:2171-6，1997)。嗜酸球趙 化蛋白、嗜酸球趨化蛋白-2和-3是CCR3-專一的（Ponath等 人，《/. C7z.«. /«vej/·，P7:604-12, 1996; Daugherty 等人，义丑印. Met/. /53:2349-54, 1996 ;和 Forssman 等人，·/· Met/.， 755:2171-6, 1997； Kit aura et al., J Biol Chem., 274:27975-80 1999)。第二個實例為 a-趨化因子 CXCR4 (融合素 (fusin))HIV共同-受體。已經鑑認出包括SDF-1 a、SDF-1 β 和SDF-2之趨化因子基質細胞-衍生因子（SDF)的數個同功 型，其專一地與出現在各種炎性細胞亞型上的受體結合， 並為極有效的MNP細胞吸引劑（Ueda等人，J.以〇/· C/2eW.， 272: 24966-70，1997 ; Yi 等人，丄「卜〇厂，72:772-7，1998 ; Shirozu 等人，Genom/cs, 25:495-500. 1995 ’ Shirozu 等人， 124 201235469
Gewomics，37:273-80，1996 ; Bleul 等人，《/· Mec?.， 184:1 101-9, 1996 ； Tanabe 等人，J. Immunol. 75P:905-1 1, 1997;和 Hamada 等人，776:211-4，1996;Yu 等人，Gene 374:174-9, 2006) ° 在某些實例中，藉著特殊胺基酸基序，像是例如三肽 ELR基序（Glu-Leu-Arg)的存在或缺乏，影響趨化因子與專 一性受體的結合。CXC-受體結合受到這類基序的影響。通 常與CXCR2受體結合的ELR陽性趨化因子是血管源性的， 且優先靶定嗜中性白血球。相反的，與CXCR3和5結合的 ELR陰性趨化因子是抗-血管源性的，並優先把定τ_淋巴細 胞、ΝΚ細胞、未成熟的樹突細胞（IDC)和經活化之内皮細 胞。ELR陰性趨化因子SDF-lp(CXCR4)以及一些CC趨化 因子，包括MCP-1(CCR2)亦為血管源性的（Strieter等人 (2005) Cytokine Growth Factor Res., 16:593-609 ； Salcedo 等人（2000) 96:34-40)。趨化因子亦以咸認為有助於維 持白血球活化所需之梯度以及從循環中運送（溢出）至發炎 織内的方式，與細胞表面肝素和葡萄糖胺聚合醣結合 (Schall 等人，CwrreW Bio/·，6:865-73 τ ，1994;和 Tanaka 等人,
125 201235469 於人類。可能在趨化因子 趨化因子可能對不同的受^專-性之間有物種差異，且 備物種-專一和受體專—有不同的親和力。因此，可製 能有對偶基因差里，且的共誕物。受體在物種成員中亦可 輕物。此外，不同的物：需表=亦可製備對偶基因-專一的共 如，TCA-3是人類“：現人類趨化因子的同系物。例 Immunol.，160:1975_81)。鼠同系物（I. Goya 等人（1 998) J.
IL-8(介白素8) ΠΜ〇(干擾素-可誘 MCP-3(單核細胞趨:- ΜΙΡ-3α(巨嗤細月气炎3 α j CCR5； D6 CXCR1 ； CXCR2 ；達If CXCR3A ； CXCR3B CCR1 ； CCR2 ； CCR3" GCP-2(顆粒球趨化_ ΕΝ4·78(上皮白血玻-活 MIG(t干擾素-誘導胞活$ — SDF-2(基質細胞-衍王百^Γ_2丨 MCP-2(單核細胞趨彳 MCP-4(單核細胞趨 MIP-4(巨噬細胞炎 MDC(巨噬細胞-衍 ΜΙΡ-1α(巨噬細胞炎丨^) BCA-1(B細胞-吸引因子j)
CXCR5 CXCR1 ； CXCR2 CXCR2
CXCR3A ； CXCR3B 未知的 CCR1 ； CCR2 ； CCR3 ； CCR5 ； D6 CCR1 ； CCR2 ； CCR3 ；~〇6" ΜΙΡ-3β(巨噬細胞炎11¾¾質3_yg) ΜΙΡ-2α(巨噬細胞炎，1¾¾質2- α) ΜΙΡ-2β(巨噬細胞炎皙2_θ)— ΜΙΡ-5(巨嗤細胞炎性冑5) HCC-1(血液滤'液 Ccf^^g]子 ι)_ RANTES(正常T-細和分泌調節 未知的 CCR7 ； CCR11 CXCR2 CXCR2 CCR1 ； CCR3 ； D6 CCR1 ； CCR5 ； D6 CCR1 ； CCR3 ； CCR5；^
126 201235469 趨化因子配體 趨化因子受體 嗜酸球趨化蛋白-2(嗜^^ TARC(胸腺和丨^ T淋巴細胞-分泌之^ 1 淋巴細胞趨化因子 肺活素 D6 CCR3 CCR4 CCR8 ;達菲 XCR1 C10 未知的 ΜΠΜγ(巨噬細胞炎 MCP-5(單核細胞趨化 LEC(肝臟-表現之趨彳 艾索朵斯 MIP-3(巨噬細胞炎性質3) TECK ⑽ 之趨化 ~~嗜酸球遍石1^3 ~~'~ CTACK(^^ T-細胞 齡 m 吞 MEC(黏膜-丽聯之上皮^子、 - ^cNyw-c^T^y 素-可誘導之T-細胞a化學吸引劑） 腎臟-表子） (咖1麟紐柄綠化麟度脂蛋白的清 丨牙、吳〗又篮） 人神經趨化蛋白 LD78-P ~~~~~--~~- ^敲錄自質~^~ CCR1 CCR1 CCR2 ； CCR3 CCR1；CCR2；CCR5；CCR8 CCR7 ； CCR11 CCR1 CCR9 ； CCR11 CCR3 CCR10 CCR10 XCR1
CXCR3A ； CXCR3B 未知的 CXCR6 CX3CR1 CCR5； D6 CCR5 趨化因子/趨化因子受體細胞特徵 每個趨化因子受體均有不同的白血球專一性，雖然各 種趨化因子受體-白血球專一性可能有相當多部分重疊（參 見例如表6)。例如，不同的受體亞型對相同趨化因子是專 一的’並可在相同細胞上共同表現相同的功能。此外，不 同的趨化因子配體在相同細胞上的不同受體處發揮作用， 可引起相同的細胞反應。此外，不同的趨化因子配體可與
127 201235469 共同受體結合’並對目標細胞引起不同的細胞反應。大多 數的趨化因子與在白血球’特別是經活化之白血球上表現 的受體結合，雖然有些趨化因子受體可在其他的細胞類型 上表現，如各種組織居留細胞，例如紅血球、企小板、星 狀細胞、内皮細胞、神經元、上皮細胞、脂肪細胞和腦的 小神經膠質細胞。表6包含趨化因子受體的非-概括性範例 列表，並陳述已知在各種疾病和非-疾病環境下分別表現這 類趨化因子受體的例示性白血球亞型及其他細胞類型。 表ό:例示性掘化因子受體-白也球專一性 趨化因子受體 白血球亞型 CCR1 ΝΚ細胞；Τ細胞；IDC，MNP，ΤΑΜ，嗜鹼性白血球；嗜酸 ,Μ：白血球；ΡΜΝ ;血小板 CCR2 ΝΚ細胞；Β細胞；丁細胞’ IDC ’ MNP ’.嗜驗性白血球；ΡΜΝ CCR3 T細胞；Th2 ; MDC，嗜驗性白血球，嗜酸性白企球；血小 Hi ； MaC CCR4 胸腺細胞;NK 細胞;T 細胞 ’Th2 ’IDC’MDC;MNP: Basophil; 血小板 CCR5 胸腺細胞；NK細胞，B細胞，T細胞，Thl，IDC ; MDC ; ΜΜΡ ; GC ; ΤΑΜ ;脂肪細胞 CCR6 Β細胞；Τ細胞；IDC CCR7 Β細胞；Τ細胞；MDC CCR8 胸腺細胞；Β細胞；Τ細胞；Th2 ; IDC ; MDC ; MNP CCR9 胸腺細胞；T細胞；MDC ; MNP CCR10 T細胞 CXCR1 MNP ; ΡΜΝ ·，MaC ;星狀細胞 CXCR2 MNP ;嗜酸性白血球；PMN ; MaC CXCR3A NK_細胞；B細胞；T細胞；Thl ; MaC CXCR3B NK細胞；B細胞；T細胞 CXCR4 胸腺細胞；Β細胞；Τ細胞；IDC ; MDC ; MNP ; GC ; ΡΜΝ ; 血小板；脂肪細胞；星狀細胞 CXCR5 Β細胞；Τ細胞；星狀細胞 CXCR6 ΝΚ細胞；Τ細胞 XCR1 ΝΚ細胞；Τ細胞 CX3CR1 ΝΚ細胞；Τ細胞；MNP ; ΡΜΝ ;星狀細胞 128 201235469 關鍵：ΝΚ=天然殺手；Thl=第1塑協助者T細胞；Th2=第2型'助者T細胞；IDO未 成熟的樹突細胞；MDC=成熟的樹突細胞；MNP=單核巨嗤細胞(單核細胞’巨噬細胞和 » 小神經膠質細胞）；GC=巨細胞(多核融合的巨噬細胞）；TAM=腫瘤關聯之巨噬細胞； PMN=多單核嗜中性白血球；MaC=肥大細胞。注意：上表代表表現特定趨化因子受體 * 之細胞類型的例示性、非-概括性列表。 母種細胞類型都有類似指紋或”化學足跡（chem〇print)，， 的趨化因子受體特徵，其視特定的細胞類型、功能類型、 組織類型、疾病狀態和疾病之類型、細胞類型的發育狀態、 細胞受體的活化狀態’以及細胞外環境，包括周圍的細胞 類型和分子而定。例如’單核細胞家系的細胞有與cxcr4 及CCRI-3和5受體相關的傾向，嗜酸性白血球和嗜鹼性白 血球與 CCR1-3 及 CXCR3 和 4;PMN 與 CXCR1、2 和 CCR1; B-細胞與CCR1_7和CXCR3_5 ; Thl細胞與cxCR3和 CCR5 ;而最後Th2細胞與CCR2、3、4和8(例如叫㈣喊 J. Intern. Med” 250:91-104, 2001)。 通常’受體亞型跨越目標細胞的結合親和力、專一性 和差異分布決定了特定趨化因子會帶給炎性過程的貢獻。 在一背景中決定的特定趨化因子之生物學特徵，可能不適 用於另一背景，最特別的是在創傷或疾病期間是否^變了 目標細胞的比例和活化狀態。因，匕，若需要可逐一建立特 定趨化因子的生物學特徵。例如，單核細胞趨化蛋白質 -3(MCP-3)的影響，類似MCp—丨的那些，但前者結合較大範 圍的細胞和受體。除了在不同的細胞上表現不同的受體之 外，在細胞表面上表現的受體數目亦可能不同。例如，ccri 和CCR2以每個單核細胞和淋巴細胞3,〇〇〇個受體的比例表 現，而在嗜酸性白血球上約有50,000個CCR3受體（B〇Hsh 129 201235469
Steinke, J Allergy Clin Immunol., 111: S460-75, 2003) o 這類差異可能涉及移行方向和反應時間。例如，在T細胞 上高密度的CXCR4與由HIV引起的較快死亡相關，而較高 . _ 密度的受體（包括CCR2和CCR4)與在過敏性氣喘患者中招 募肺泡 T 細胞有關（Kallinich 等人（2005) 35,26-33 ί Lelievre ^ A(2004) AIDS Res. Hum. Retroviruses 20:1230-43)。 同樣的，在創傷或疾病期間趨化因子受體特徵經常改 變。將趨化因子配體/受體軸分類為組成上/體内平衡的、可 誘導/炎性或兩者（參見例如表7)。因此，不一定表現炎性趨 化因子配體及其受體’直到隨後發生疾病或創傷為止。例 如，一旦活化，靜止細胞便會迅速改變，並向上調節受體 表現（例如 Ghirnikar，等人（2000) A^ewroscz’. 59:63-73 ; Henneken 等人（2005) 及以· 7: RlOOl-13 ;
Klitgaard 等人（2004) Jcia. iScawt/· 82:179-83 ;
McDonald 等人（2001) /Z)rwgi 4:427-42)。化學足跡的身分亦 視在環境中炎性和非-炎性介體的類型和富含量而定（例如
Porcheray 等人（2006) hro/ogy 349:1 12-20 ; Stout 和
Suttles(2004) J. Leukoc. Biol. 76:509-13 i Sozzani(2005) Cyiohw Growi/z Facior 16:581-92 ; Mantovanni 等人，
Trends Immunol., 25:677-86, 2004 ； Ben-Baruch, Cancer i?ev·，2006，在印刷前發表）。表7陳述由於在體 内平衡或炎性條件下的功能，趨化因子/受體軸的例示性表 現特徵。
130 S 201235469 表7:趨化因子超級家族之成員的配體和受體 系統名稱 配體 受體 例示性的功能 CC趨化因子 CCL1 1-309 CCR8 炎性 CCL2 MCP-1 CCR2 炎性 CCL3 ΜΙΡ-Ια CCR1 ' CCR5 炎性 CCL4 ΜΙΡ-1β CCR5 炎性 CCL5 RANTES CCR1 ' CCR3 ' CCR5 炎性 CCL6 未知的 未知的 未知的 CCL7 MCP-3 CCRl、CCR2、CCR3 炎性 CCL8 MCP-2 CCR3 > CCR2 炎性 CCL9 未知的 未知的 未知的 CCL10 未知的 未知的 未知的 CCL11 嗜酸球趨化蛋白 CCR3 炎性 CCL12 未知的 CCR2 ' CCR3 未知的 CCL13 MCP-4 CCR2 ' CCR3 炎性 CCL14 HCC-1 CCRl 未知的 CCL15 HCC-2 CCRl ' CCR3 未知的 CCL16 HCC-4、LEC CCRl ' CCR2 ' CCR5 未知的 CCL17 TARC CCR4 炎性/體内平衡的 CCL18 DC-CK1 未知的 體内平衡的 CCL19 ΜΙΡ-3β CCR7 體内平衡的 CCL20 ΜΙΡ·3α CCR6 炎性/體内平衡的 CCL21 SCL CCR7 體内平衡的 CCL22 MDC CCR4 炎性/體内平衡的 CCL23 MPIF-1 CCRl 未知的 CCL24 MPIF-2 CCR3 炎性 CCL25 TECK CCR9 體内平衡的 CCL26 嗜酸球趨化蛋白-3 CCR3 炎性 CCL27 CTACK CCR10 體内平衡的 CCL28 MEC CCR10 炎性/體内平衡的 c趨化因子 XCL1 淋巴細胞趨化因子 XCR1 未知的 XCL2 SCMl-α XCR1 未知的 CXC趨化因子 CXCL1 GROa CXCR2 炎性 CXCL2 GROp CXCR2 炎性 CXCL3 GROy CXCR2 炎性 CXCL4 PF4 CXCR3A 未知的 CXCL5 ENA-78 CXCR2 未知的 CXCL6 GCP-2 CXCR1 'CXCR2 未知的 CXCL7 NAP-2 CXCR2 未知的 131 201235469 系統名稱 配體 受體 例示性的功能 CXCL8 IL-8 CXCR1'CXCR2 炎性 CXCL9 MIG CXCR3B 炎性 CXCL10 IP-10 CXCR3B 炎性 CXCL11 I-TAC CXCR3B 炎性 CXCL12 SDF-Ια ' SDF-Ιβ CXCR4、CXCR7 未知的 CXCL13 BCA-1 CXCR5 體内平衡的 CXCL14 BRAK 未知的 體内平衡的 CXCL15 未知的 未知的 未知的 CXCL16 未知的 CXCR6 CX3CL1 人神經趨化蛋白 CX3CR1 應瞭解表7僅舉例說明，而不同的趨化因子/受體對之 表現視許多因素而定，像是但不限於疾病的狀態或嚴重 性。例如，某些白血球亞型可能未出現，直到臨床症狀已 經達到特殊階段為止。再者，受體表現可能有所改變。例 如，在大鼠的脊髓挫傷之前並沒有偵測到趨化因子受體。 以時間依賴性之方式，從在受傷後1天到受傷後14天，有 差別地向上調節 CCR2、CCR3 ' CCR5、CCR10 和 CXCR4 的表現（Ghirnikar，等人（2000) TVewroseζ·. Λα.，59:63-73)。 某些配體/受體軸在特定疾病中扮演重要的角色。例 如，MCP-1/CCR2軸在各種疾病中是很重要的，其包括但不 限於關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、再狹窄、多發性硬化 症、脊髓傷害（SCI)、癌症和數種慢性腎臟疾病（CKD)。在 其他實例中，SDF-1P/CXCR4與關節炎和許多癌症有關，包 括卵巢、前列腺、乳房和腦癌。在另一實例中，MIG、IP-10、 I-TAC/CXCR3 A軸與器官移植排斥、第1型糖尿病、增殖性 腎小球腎炎（GN)和多發性硬化症有關。在另一實例中，嗜 酸球趨化蛋白、嗜酸球趨化蛋白-2和嗜酸球趨化蛋白
S 132 201235469 -3/CCR3在氣喘、嗜酸性白血球性肺炎、食道炎和炎性皮膚 -· 疾病中是重要的主軸。 ' 在大多數的情況下，在特殊的疾病狀態中表現多個趨 化因子配體和趨化因子受體（例如Mantovani( 1999)
Toc/a少 20:254-7 ; Borish 和 Steinke(2003) «/· j/Zergy C7/«. ，111 :S460-75 ; Charo 和 Ransohoff，N Engl J Med·， 354:610_21，2006) »例如，在多發性硬化症（MS)的實驗性自 體免疫腦脊趙炎（EAE)模式中’ T細胞可表現CCR5、CCR2 和 CXCR3(Matsui 專人（2002) «/· TV"ewroz.mmw；7〇/.， 128:16-22)。在另一實例中，在試管内的金-腦-障礙（bbb) 穿透移動（transmigration)研究中，MCP-1/CCR2軸對於表現 CCR2之MNP和T細胞的CNS溢出是很重要的，雖然τ細 胞可表現 CCR2、CCR5 和 CXCR3 (Mahad 等人（2006) — 129:212-23 ； Callahan 等人（2004) 乂 則⑽/， 1 5 3 :1 5 0-7)。因此，當研究特定的疾病或創傷時，可在選擇 毋·素共扼物之把定劑或劑群時建立任何特定之配體/受體軸 或軸群的空間、時間、生物學和臨床特徵。 除了該複雜性之外，在病理學條件中’免疫細胞和助 成性組織居留細胞（TRC)可經歷表現型的深奥改變，並可表 現並非正常與該特定細胞類型有關的趨化因子受體。例 如，不管PMN較喜愛CXC趨化因子，在脈管炎敗血症的大 鼠模式和敗血症的老鼠模式中，發生藉著cc趨化因子 MCiM和ΜΙΙΜα的深奥PMN化學吸引作用（j〇hnst〇n等人 (1999)/·咖.—1〇3:1269_76;等人（2〇〇4)狀 133 201235469 义 ΡαίΛο/· 165:2187-96)。在 MNP、T 淋巴細胞和 MaC 上， 在疾病時亦出現受體改變。可誘導其等在特定的炎性微環 境中表現 CXCR1 和 CXCR2(Smith 等人（2005) Zm. 乂尸/2；^〇/· //ear’ 289: H1976-84; Lippert 等人（200今）五叩. 則ί〇/_ 13:520-5)。嗜酸性白血球經常表現有功能的 CCR2，其為 MCP-1 的同族受體（Dunzendorfer (2001) 乂
Allergy Clin. Immunol. 1QS..5S1-7)。 iv.例示性趨化因子靶定劑 在本文中提供之配體-毒素共軛物中使用的趨化因子配 體典型地為任何對至少一個趨化因子受體（但典型地對一個 以上趨化因子受體）具有專一性的趨化因子，該受體在一或 夕個免疫效應細胞上表現，包括白血球或其他助成性效應 細胞，其涉及免疫調節或炎性過程，如提升二次組織傷害 的病理學炎性反應。這類受體通常是經G-蛋白質偶聯、7 個穿透膜-功能部位、類視紫質受體之超級家族的成員，包 括Ϊ不限於，例如一或多個在技術領域中已知的受體，如 趨化因子之達菲抗原受體（DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、 CXCR-3B' CXCR-4'CXCR-5 ' CXCR-6> CXCR-7' CR 2A'CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、 CCR-7' CCR-8、CCR_9、CCR1〇、CX3cr i、及其他 趨化因子受體。在某些實例中，$了在本文提供之共扼物 中用來作為|巴疋劑而選擇的趨化因子，可與專—的受體結 合’而在其他實例+，所選擇的趨化因子可與一個以上的 受體結合。此外’ $ 了在共㈣中絲作為衫劑，所選
134 W 201235469 擇之趨化因子可對其他趨化因子展現出部分重疊且有差別. 的受體專一性（參見，例如表5)。 在這類趨化因子配體中，包括任何在上文表4中陳述 的，包括任何的α和β趨化因子，以及其他類似的趨化因 子亞組。更特定而言’目前較喜歡在配體-毒素共軛物中用 來作為蛋白質配體部分的趨化因子，包括但不限於在技術 領域中已知的α-趨化因子，如IL-8 ;顆粒球趨化蛋白 -2(GCP-2);生長-相關致癌基因-a (GR〇_ α )、gr〇_点和 GRO-γ ;上皮細胞-衍生之嗜中性白血球活化肽 -7 8(ΕΝΑ-7 8);結締組織活化肽瓜（CTAPm);嗜中性白血球 活化肽-2(ΝΑΡ-2);由干擾素-γ誘導之單核細胞活素（mig); 干擾素可誘導之蛋白質10(IP-10，其主要具有有效的化學吸 引劑作用’但並非完全針對嗜中性白血球和T細胞）；基質 細胞衍生因子SDF-1 α、SDF-1/5和SDF-2 ;在技術領域中 已知的々-趨化因子，如單核細胞趨化蛋白MCP-l、MCP-2、 MCP-3、MCP-4和MCP-5 ;巨噬細胞炎性蛋白質Mjpq α、 MIP-ly?、ΜΙΡ-1γ、ΜΙΡ-2、ΜΙΡ-2α、ΜΙΡ-2 0、ΜΙΡ-3α、 ΜΙΡ-3 yS、ΜΙΡ-4和ΜΙΡ-5 ;巨噬細胞-衍生之趨化因子 (MDC) ·’人類趨化因子KHCd) ; RANTES ;嗜酸球趨化蛋 白1;嗜酸球趨化蛋白2;嗜酸球趨化蛋白3;TARC;SCYA17 和1-309 ;樹突細胞趨化因子·1(DC_CK-1) ; r -趨化因子、 淋巴細胞趨化因子；CX3C趨化因子人神經趨化蛋白的可溶 形式（其主要是化學吸引劑，但並非完全針對單核細胞、巨 噬細胞、嗜酸性白血球和τ細胞）；任何熟諳此藝者已知的 135 201235469 其他趨化因子，以及任何為了結合趨化因子受體所設計的 合成或經修改蛋白質。可使用例行的方法，從天然來源中 为離趨化因子，或使用編碼該趨化因子之核酸表現。已經 在大腸桿菌中重組表現具有生物活性之趨化因子（例如從 R&D Systems，Minneapolis，MN 購得的那些）。 其他趨化因子靶定劑的實例包括任何結合及/或活化一 或多個免疫細胞’如任何提升二次組織傷害之細胞的趨化 因子，像是例如乙醯基化的LDL清除劑受體丨和2，以及 LDL、極低密度脂蛋白·uvldlj)、vldL-2、糖蛋白330/ 美嘉林（megalin)、脂蛋白受體_相關之蛋白質（LRp)、α _2_ 巨球蛋白、sorL A-1的受體。一特別有用但尚未命名的受體 關聯蛋白質，其具有大約39,〇〇〇道爾吞之分子量，並與蛋 白質，如低密度脂蛋白（LDL)-受體家族之成員結合而調節其 活性。 應瞭解其他趨化因子為已知的，並可鑑認這類趨化因 子及對其專一之受體，並在需要生產和使用之處按照本文 之描述生產共軛物。如在下文中詳述的，可藉著專一性和 在其上表現該受體的細胞族群，亦可憑經驗使用熟諳此藝 者已知的試管内和活體内之模式，包括在本文中舉例說 明、描述及/或提及的那些，決定可使用所得之共軛物的疾 病0 b.非·趨化因子之細胞介素 在本文提供之共扼物，以及在本文提供之產製共軛物 的方法中，亦可使用包含典型細胞介素的共軛物，該典型 136 201235469 細胞介素為非-趨介 因子之細胞介素，其與在涉及二次組織 傷害之細胞類型（包括 ％ 主d栝亦表現趨化因子受體的任何細 的特疋細胞介素夸靜纟士 〃 體…合。包含這類典型細胞介素的共軛 物已、&用在/α療上，如藉著靶定腫瘤細胞的癌症治療。在 本文中打开就其等與攜帶趨化因子-受體之細胞，如 瘤的白血球，以及直仙咖 4 以及其他與不想要炎性反應有關之細胞結合 的能力，來挑選細胞介素。 雖…、:表面上將趨化因子分類為細胞介素，但其等是不 同種類的蛋白f。將其等分類為細胞介素，是比實際更根 據歷史的。當發現新的蛋白質時，在例如其等的明顯活性 或其等的細胞來源之後命名。因此，認為早期的細胞介素 是激素或稱為生長因子。因為細胞介素與激素和生長因子 共子斗夕特被’差別已經且仍是一灰色地帶。例如，在一 回顧論文（參見’例如Wells等人（1996) j㈣心v 心所 (55:609-34)中，使用片語”造血激素/細胞介素”（提到與各種 集落-刺激性因子之生物活性的類似性）來描述細胞介素。有 些細胞介素活性’ 一開始分離自淋巴細胞和單核細胞，並 分別稱為淋巴細胞活素和單核細胞活素。在了解這些分子 代表廣泛的活性，並衍生自許多細胞類型時，創造了名詞” 細胞介素”。 典型的細胞介素（12-40 kD a蛋白質）包含干擾素（ifn)、 腫瘤壞死因子（TNF)和介白素（所謂的，因為其活性包含在白 血球之間的通訊）、造血生長因子、生長激素、睫狀神經營 養因子及其他。這些細胞介素經由結構上同種的第I類細 137
V 201235469 胞"素党體，調節許多不同細胞類型的增殖和分化。第工 類受體典型地由兩個多肽鏈構成，一，，配體_專一性次單元” 和一 /5信號轉導次單元。基於相同的次單元和第三次單元 之用途’可細分這類受體。干擾素經由在結構上不同組的 (α、沒和r )第π類受體產生作用。有新出現的獨特tnf 受體家族。 細胞介素受體通常經由JAK/STAT細胞内信號路徑發 送仏號’但亦可經由其他的信號級聯發送信號。重要的是， ;又有任何與這些受體結合的細胞介素，如介白素，會與任 何在結構上不同的趨化因子受體（上述的）結合，也沒有趨化 因子配體會與任何上述的細胞介素受體結合。 因此，提到非-趨化因子之細胞介素，意指包括典型的 細胞介素。非-趨化因子之細胞介素可用來作為配體部分， 使共槪物乾定細胞上的受體，例如，亦攜帶趨化因子受體 的細胞，包括但不限於内皮細胞單核細胞活化多肽π (ΕΜΑΡ- Π )、集落刺激性因子（CSF)、顆粒球巨噬細胞 -CSF(GM-CSF)、顆粒球 _CSF(G_CSF)、巨噬細胞 -CSF(M-CSF) '介白素叫])、化七、a_ib、介白= 2(IL-2)、介白素 3(IL_3)、介白素 4(IL 4) 介白素6叫6)、介白…)、介白素8(il^ 10(IL-10)、介白素12(il_12)、介白素13(江七）、介白素 15(IL-15)、白素 18(IL-l8)、干擾素 α (IFNa )、干擾素 w㈣ /5)、干擾素r(IFNr)、干擾素ω(·ω)、干擾素τ (㈣ r)'干擾素7誘導因子1(1卿、叩_3配體、紅血球生成 138 δ 201235469 素（EPO)、腫瘤壞死因子（TNF)、增殖-誘導性配體（APRIL)、 CD40配體、CD3 0配體、CD27配體、fas配體、4-1BB配 體、LIGHT、HVEM、TWEAK、GITRL、TNF-相關之細胞 凋亡-誘導性配體（TRAIL)、TNF-相關之活化-誘導之細胞介 素（TRANCE)、TNF和細胞凋亡配體-相關之白血球-表現配 體l(TALL-l)，其與在涉及炎性反應之細胞上（如在提升二 次組織傷害之細胞上）的細胞介素受體家族結合。 為了藉由任何本文提供之非-趨化因子之細胞介素靶 定，細胞介素受體的實例包括，但不限於造血素家族受體（例 如IL-2到IL-7和GM-CSF的受體）、干擾素家族受體（例如 IFN a、IFN召和IFN r的受體），以及腫瘤壞死因子家族受 體（例如TNF α、淋巴毒素、Fas配體、LIGHT、BTLA、CD40 配體、4-1BB配體、OX-40配體及其他的受體，包括但不限 於任何TNF受體（TNFR)，像是但不限於TNFR1、TNFR2、 Lt0 R、Fas、CD40、CD27、D30、4-1BB、0X40、DR3、 DR5 和 HVEM)。 c.抗體配體部分 在配體-毒素共軛物中的靶定劑亦可以是抗體，特別是 單株抗體或其功能片段，其對在涉及炎性反應之細胞表面 上表現的受體，特別是趨化因子受體、細胞介素受體及其 他在表現趨化因子受體之細胞上表現的受體是專一的。較 佳的是對趨化因子受體’例如CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、 CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、 CCR-10、CXCR小 CXCR-2、CXCR-3A、CXCR-3B、CXCR-4、 139 201235469 CXCR-5、CXCR-6、DARC、XCR1、CX3CR-1 及其他這類 受體專一的單株抗體° 在某些情況下’該抗體可能是對非-趨化因子之細胞介 素受體，像是例如任一或多個細胞介素ΕΜΑΡ Π GM-CSF、 G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2' IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、 IL-13之受體專一的。可使用含有這些抗體的共扼物靶定表 現經輕定之細胞介素受體的細胞。這類細胞包括涉及二次 組織傷害的細胞。經革巴定之細胞亦可表現一或多個趨化因 子受體。 可用在共軛物中之單株抗體的非限制性實例，包括但 不限於 MAC-1、MAC-3、ED-1、ED-2、ED-3 ,以及對抗下 列抗原的單株抗體：CD5、14、15、19、22、34、35、54 和 68，0X4、6、7、19 和 42; Ber-H2、BR96、Fib75、EMB-11、 HLA-DR、LN-1和蓖麻凝集素4。 可藉著抗體的蛋白水解或藉著在大腸桿菌中表現編碼 該片段的DNA，製備抗體片段。可藉著傳統方法，經由胃 蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整個抗體，獲得抗體片段。例如， 可藉著以胃蛋白酶’藉著酵素切開抗體產生抗體片段，提 供代表F(ab )2 @ 5S >}段《可使用硫醇還原劑進—步切開 °玄片&’並可視需要使用保護基來保護起因於切開二硫鍵 的硫氫基’產生3.5S的Fab，單價片段。另外，使用胃蛋白 鉍的酵素切開產生兩個單價㈣，片段和正 ^見’例如美國專利第4观945號和4,331，647號，^ 所含有之參考文獻，其全部以引用方式納入本文 201235469 中’亦參見 Porter，R.R·，（1959) Biochem. J.，73: 1 19-126) °其他切開抗體的方法，如分離重鏈以形成單價輕 -重鏈片段，進一步切開片段，或可使用其他酵素、化學或 遺傳技術’只要該片段與可被完整抗體認出的抗原結合即 "crj* 〇
Fv片段含有VH和VL鏈的結合。該結合可能是非共價 的’如在 Inbar 等人（1972) #加7 Jed. 5W. 69:2659-62中描述的。或者，可藉著分子間二硫鍵連接可變 鏈，或藉著化學物質，如戊二醛交聯。典型地，Fv片段含 有由狀連接子連㈣VH#0 VL^。藉著建構編碼由寡核苦 酸連接之VH和VL功能部位的核酸分子，製備這些單-鏈 抗原結合蛋白（sFv)。將所得的構築體插入表現載體内，將 其導入宿主細⑽，如大腸桿菌内。重組宿主細胞合成單一 夕肽鏈’以連接子肽橋接兩個V功能部位。例如，由Whitlow 和 FUPUUU99D Μ⑽_，2: 97_105 ; Bird 等人（1988) —e 242:423_426; Pack 等人（1993) Μ。— · 1 1:1271-77，和 Ladner 笼人 ^ m * -t» **· Γ寺人，美國專利第4,946,778號描述 了產生sFvs的方法。 其他形式的抗體片’段是編碼單一互補性_決定區（cdr) 的肽。可藉著建構編碼感興趣抗體之CDR的基因，獲得⑽ 肽（“最小辨認單位”）。例如，使用聚合酶連鎖反應，從產生 抗體之細胞的RNA中合成可變區，來製備這類基因（參見， 例如Lardck等人（1991)如_，2:1〇6_1〇 ;和㈤⑽等 U.S.A. 86:3833-3837) ° 尺（\9%9、Proc. Natl. Acad. Sci 141 201235469 可使用完整多肽或含有感興趣小型肽之具有生物學功 能的片段作為免疫性抗原，製備與在提升二次組織傷害之 細胞上的趨化因子受體或非-化學激動之細胞介素受體結合 的抗體。若需要，可將用來免疫動物的多肽或肽（例如衍生 自經轉譯cDNA或化學合成的）與載劑蛋白質共軛。以化學 方式與肽偶聯的常用載劑包括，但不限於鎖孔帽貝血藍蛋 白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白、牛 血清白蛋白（BSA)和破傷風類毒素。然後使用經偶聯的肽免 疫動物（例如老鼠、大鼠或兔子）。 單株抗體之製備為熟諳此藝者已熟知的（參見，例如
Kohler 等人（1975) 256:495-7 ;和 Harlow 等人，在抗 體：實驗室手冊（Antibodies: a Laboratory Manual)，（CQld SpHngHarborPub.，1988)中）。簡言之，可藉著以含有抗原 之組合物注射老鼠，藉著移出血清試樣證實有抗體產生， 移出脾臟而獲得B淋巴細胞，將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞 融合以產生融合瘤，選殖融合瘤，挑選產生對該抗原之抗 體的％丨生殖系，並從融合瘤培養物中分離抗體，獲得單株 抗體。可藉著各種已完全確立的技術，從融合瘤培養物中 分離並純化單株抗體。這類分離技術包括利用蛋白質_A瓊 脂糖的親和力層析法、尺寸排阻層析法和離子-交換層析 法，並為熟諳此藝者已熟知的（參見，例如pharmacia單株 抗體純化手冊（Mon〇cl〇nal Antib〇dy Purificati〇n
Handbook)(例如，目錄#ΐ8_ι〇37_46))。 抗體亦可衍生自比人類低等的靈長動物抗體。這類在 142 201235469 .7狒中使在治療上有用之抗體升高的方法為熟諸此藝者已 知=(參見，例如Goldenberg等人（1991)經發表之國際心 申請案第WO 91/1 1465號和Losman等人（199〇) ^ j C⑽46:31〇_314)。在治療上有用的抗體可衍生自^經人 類化的”單株抗體。這類方法和抗體為已知的。例如，藉著 將老鼠互補性決定區從老鼠免疫球蛋白之重和輕可變^中 移到人類可變功能部位内，然後在老鼠相對物的架構區中 以人類殘基取代，產生經人類化的單株抗體。使用衍生自 人類化單株抗體的抗體組份，排除了與老鼠恆定區之免疫 原性有關的可能問題。由例如〇rlandi等人（1989)尸⑺^ 86:3833_7描述了選殖老鼠免疫球蛋白可變 功能部位的一般技術，全部以引用方式納入本文中。由例 女 Jones 專人（1986) μ 321:522-5; Riechmann 等人（1988)
Nature 332:323-7 ； Verhoeyen 等人（1988) Science 239:1534-6 ; Carter 等人（1992) Tto，/ Ad.如·· 89:4285-9 ; Sandhu (1992) O". /?ev. 12:437-62 ;和
Singer 等人（1993) j. i5〇: 2844-67 描述了產生經人 類化單株抗體的技術。 可使用抗-遺傳性型技術以產生單株抗體，其模仿抗原 決定位。例如’抗-遺傳性型之單株抗體製造第一個單株抗 體’會在高變區具有結合功能部位，其為被第一個單株抗 體結合之抗原決定位的”影像”。 d.其他靶定劑和受體目標 本文供之共扼物可含有任何把定劑，其使該共辄物 143 201235469 把定細胞表面受體。除了上文提及包括趨化因子、細胞介 素和抗體的靶定劑之外，這類耙定劑亦包括，例如但不限 於生長因子、激素及其他配體或其對偶基因變體、突變蛋 白或片段，只要該靶定劑被與其結合的細胞表面受體内化 即可。可使用這類靶定劑，使用本文提供之方法產製配體-毒素共軛物。此外，亦可使用這類靶定劑建構配體-毒素共 軛物，其含有與經修改毒素或毒素變體，包括本文提供= 經修改SA1變體直接或間接連接的靶定劑。 例示性靶定劑包括，但不限於轉型性生長因子万（tgf_ /5 )、利什曼原蟲屬延伸起始因子（LEIF)、血小板衍生之生 長因子（PDGF)、上皮生長因子（EGF)、雙調蛋白 (amphiregulin)、神經調節蛋白（neureguHn)1、神經調節蛋 白-2、神經調節蛋白_3或神經調節蛋白_4、生長因子，包括 血管内皮生長因子（VEGF)、纖維母細胞生長因子（FGF) '肝 細胞生長因子（HGF)、神經生長因子（NGF)、胎盤生長因子 (P1GF)、腦衍生之神經營養因子（BDNF)、万細胞素 (betacellulin)(BTC)、中期因子（midkine)、抑制素（inhibin)、 内皮生長因子、胰島素、類姨島素生長因子（IGF)、神經營 養素-2(NT-2)、神經營養素_3(NT-3)、神經營養素_4(NT-4)、 神經營養素-5(NT-5)、神經膠質細胞株_衍生之神經營養因 子（GDNF)、睫狀神經營養因子（CNTF)、原癌基因 (pleiotrophin)、幹細胞因子（SCF)、制瘤素M、感覺和運動 神經元-衍生因子（SMDF)、白血病抑制因子（LIF)、苗勒氏 (Miillerian)-抑制物質（MIS)、心肌營養素（cardi〇tr〇phin)_ i、 144 201235469 血小板生成素（thrombopoietin)、 血管生成素 (angiopoietin)、活化素（activin)、骨形態發生蛋白質（BMP)、 APM 1、生長激素（GH)、瘦體素（leptin)和催乳激素，或其對 偶基因變體、突變蛋白或片段。靶定劑亦包括病原體辨認 受體（PRR)，其參與病原體之吞噬或細胞攝粒作用❺例如， 其他例示性靶定劑包括靶定下列受體的分子：甘露糖受體 (MR)模式識別受體（Dectin)-1和膠凝素（c〇llectin)或類膠 凝素蛋白質之受體，包括但不限於表面活性劑蛋白質 a(sp-a)、表面活性劑蛋白質D、甘露糖結合外源凝集素 (MBL)或補體蛋白f lq(Clq)之受體。較佳的靶定劑是多 肽’當其與受體結合時被内化至細胞内。 可使用使用這類革巴定劑產製的配體-毒素共輛物來治療 任何具有涉及其病理學之細胞組份的錢或病1在這類 疾病或病症中’較佳的是任何具有病理學細胞組份者，該 :胞組份表現一或多個可被無定的細胞表面受體。亦考;t ^他的疾病和録，特収血#源性疾病，包括 癌症和視網膜病變，如目㈣或 —、 把定涉及血管生成的内皮細胞。—病’如經由 生長因子 與在涉及炎性反應及/或二次
細胞攝粒之細胞表面受體結合的生長因 之細胞類型B 本文提供之共輛物的乾定劑，並可用在太亦可用來㈣ 中。這類生長因子亦可用來 $本文提供之方淨 共輛物乾定内皮細胞，乾定^^，'經由使配體-毒毒 疋涉及血管源性疾病(包括癌症和 145 201235469 其他疾病，如眼睛疾病或各種慢性炎性狀態）的目標細胞。 生長因子，像是例如血管内皮生長因子（VEGF)或其任何經 修改版本，包括具有胺基酸取代、刪除、插入或添加的那 些，均可用來使毒素部分靶定特定的細胞類型，只要其等 保留與受體結合的能力並被内化即可（參見，例如美國專利 申請案第2004/0166565號和US20010031485)。因此，可使 用這類生長因子建構含有與經修改毒素或毒素變體，包括 本文提供之經修改志贺毒素A1變體直接或間接連接之生長 因子的配體-毒素共軛物。經靶定之細胞類型可包括，例如 涉及企管生成的内皮細胞，該血管生成為逐漸增加新血管 之過程，經常與腫瘤生長和慢性炎性狀態有關。 血管生成是逐漸增加新血管的嚴密控制過程（關於回顧 參見，例如 Folkman & Shing(1992) J 仏〇/. c/zem·，267: 1093 1-4 ; Hanahan( 19 97) 277:48-50)。在正常狀況 下’僅在胚胎發育 '創傷癒合和黃體發育期間發生血管生 成。在許多病理學中發生血管生成，如固體腫瘤和轉移生 長、各種眼睛疾病、慢性炎性狀況和局部缺企傷害（關於回 顧參見，Folkman( 1 995) iVai. Med.，1:27-3 1)。因此，逐漸增 加之内皮細胞代表數個重大病理學的獨特治療目標。 VEGF蛋白質是經分泌之二聚糖蛋白家族，其為血管生 成的正向調節子（例如Cross和Claesson-Welsh， P/iarwaco/ «SW.，22:201-7，2001)。例示性 VEGF 蛋白質包 括，但不限於 VEGF-A(UniProt 編號：P15692)、VEGF-B (UniProt 編號：P49765)、VEGF-C(UniProt 編號：P49767)、 146 201235469 k VEGF-D(UniProt 編號：043915)和 PGF(胎盤生長因子， .· VEGF-相關蛋白質；UniProt編號：Q53XY6)，及其接合變 ， 體、對偶基因變體或物種變體。在SEQ ID N0:204-210中 陳述了 VEGF-A前驅物多肽之範例，並包括26個胺基酸信 號肽，相當於SEQ ID NO:204-206的胺基酸1-26，並由於 另一種選擇接合的結果，成熟多肽具有各種長度。例如， 成熟VEGF-A多肽的長度可以是206、189、183、165、148、 145或121個胺基酸。在SEQ ID NO :211和212中陳述了 VEGF-B前驅物多肽，並包括21個胺基酸信號肽，相當於 SEQ ID NO:211和212的胺基酸1-21，而成熟多肽的長度 為186和167個胺基酸，分別相當於SEQ ID NO:21 1的胺 基酸 22-207 和 SEQ ID NO:212 的 22-188。在 SEQ ID NO:213 中陳述了 VEGF-C的前驅物多肽，並包含3 1個胺基酸信號 肽，相當於SEQ ID NO:213的胺基酸1_31 ’兩個前肽序列 相當於SEQ ID NO:213的胺基酸31-1 Π和228-419，而成 熟的116個胺基酸之多肽，相當於SEQ ID NO:2 13的胺基 酸1 12-227。在SEQ ID NO:214中陳述了 VEGF_D的前驅物 多肽，並包括21個胺基酸信號肽’相當於SEQ ID NO:214 的胺基酸1-21，兩個前肽序列相當於SEQ ID N0:2 14的胺 基酸22-8 8和206-3 54，而成熟的117個胺基酸之多肽’相 當於 SEQ ID NO:214 的胺基酸 89-205。在 SEQ ID NO:215 中陳述了 PGF的前驅物多肽。 VEGF對内皮細胞的作用，係由酷胺酸激酶受體’ VEGFR-l(flt-l)、VEGFR-2(KDR/flk-l)和 VEGFR-1-相關者 147 201235469 介導。優先在内皮細胞上表現這些受體。該受體為單一跨 越穿透膜的蛋白質酪胺酸激酶，其屬於免疫球蛋白超級家 族’並在細胞外功能部位中含有七個類_ig環，且與血小板 -衍生之生長因子的受體共享同種性。與這些受體結合的 VEGF引起受體二聚化，接著是在二聚體中SH2和SH3功 能部位的路胺酸構酸化《然後經由受體_介導之細胞攝粒作 用將KDR/flk-1-VEGF複合體内化。因此，因為它可被表現 其受體或受體們的細胞内化，故任何VEGF蛋白質，如本 文描述的任一者，可在含有經修改RIp多肽，如經修改SA1 多肽或其活性片段的共扼物中作為革巴定劑。 2.連接子部分 在製備本文提供之共軛物時，將Rjp毒素，像是例如 本文提供的經修改SA1毒素，與靶定劑直接或間接連接。 例如，本文提供之共軛物含有下列的組份：（靶定劑）。、（L)q 和（被靶疋劑）m，其中L為連接靶定劑和毒素的連接子；該 靶定劑為任何與在細胞表面上表現之受體結合並被内化的 部分；分別選擇m和η，至少是丨；且q為〇或更多，只要 所得的共軛物與經靶定之受體結合，被内化並遞送該被靶 定劑即可。在共輥物中之組份的連接，可藉著在技術領域 中目前已知用來附接兩個部分的任何方法，只要連接子部 分與蛋白質配體的附接，實質上不妨害該蛋白質配體與目 標細胞，即在目標細胞上之受體的結纟，或實質上不妨害 配體毒素之内化或代謫卜而得以降低經修& rip毒素對目 標細胞的毒性即可。連接可以是任何類型的連接，包括但 148 201235469 不限於離子和共價鍵，以及任何其他充份穩定的聯合，藉 此使被靶定劑（例如經修改RIP毒素）會被該共軛物所靶定 的細胞内化。 靶定劑，如趨化因子，可視需要經由一或多個連接子， 與經修改RIP毒素或其活性片段連接。視之後想要的特性 來挑選該連接子部分。例如，可選擇連接子部分的長度， 以便針對配體結合之動力學和專一性最適化，包括任何由 配體與目標受體結合所引起的構象改變。連接子部分應該 夠長且有彈性’足以允許蛋白f配體部分和目標細胞受體 自由地交互作用。若連接子太短或太硬，則可能在蛋白質 配體部分與細胞毒素之間有立體位阻。若連接子部分太 長，則細胞毒素可能在生產過程中被蛋白水解，或可能無 法將其毒性影響有效地遞送至目標細胞。可使用許多在技 術領域中已知的草案，將連接子，如趨化因子連接子附接 至經純化的配體（參見Pierce Chemieals “溶液、蛋白質之交 聯：基本概念和策略（Soluti〇ns，Cross_linking 〇f Pr〇teins:
BaS1C C〇ncepts and Strategies)” 研討會 #i2, iL)。 a ·例示性連接子 在本文中可使用任何熟諳 會在共概物為融合蛋白時，使 車厄物中的連接子不同組的連接 共輕物的連接子和鍵結包括， 受阻二硫鍵，以及在自由反應 價鍵。使用異雙功能之試劑產 此藝者已知的連接子。通常 用與在以化學方式產生之共 子。適合以化學方式連接之 但不限於二硫鍵、硫醚鍵、 基，如胺和硫醇基之間的共 生這些鍵結，以便在一或兩 149 201235469 個多肽上產生反應性硫醇基，然後使在一個客 μ ^狀上的硫醇 基團與反應性硫醇基或胺基反應，然後可將對其起反應的 順丁烯二醯亞胺基基團或硫醇基團附接在另一個多狀上。 其他的連接子包括酸可切開的連接子，如雙順丁稀二酿亞 胺乙氧基丙烷、對酸不穩定的-鐵傳遞蛋白共軛物和己二酸 二醯肼，其會在較酸性的細胞内隔間中被切開；在接觸 或可見光後被切開的交聯劑，以及諸如得自人類igGi恆定 區之各種功能部位，如CHI、CH2* CH3的連接子（參見，
Batra 等人（1993) Mo/ecw/w 30:379-386)。在某此 具體事實中，可納入數個連接子以便利用每個連接子的想 要特，。可藉著使連接子與趨化因子受體革巴定劑和經修改 RIP毋素共價偶聯，插入化學連接子和肽連接子。可使用下 述的異雙功能試劑’完成這類共價偶聯。亦可藉著以融合 蛋白之形式，表現編碼連接子和乾定劑 '連接子和經修改 說毒素，或連接子、經修改RIp#素和衫劑的dna, =接肽連接子。考慮使用有彈性的連接子和增加共輕物之 洛解度的連接子；在本文中亦考慮到單獨或與其他 倂用。 ^連接子可以是任何適合聯合經修?文RIp 4素和乾定劑 =部分。這類部分包括，但不限於肽鍵結；胺基酸和肽鍵 ^ ’典型地含有在1到大約60個之間的胺基酸；化學連接 子’如異雙功能可切開的交聯劑。其他的連接子包括，但 不限於肽及其他降低在經修& Rip毒素與&定劑之間空間 ^阻的4分、細胞内的酵素受質、增加共輕物之彈性的連 150 201235469 接子、增加共軛物之溶解度的連接子、增加共軛物之血清 穩定性的連接子、光可切開的連接子和酸可切開的連接子。 L異雙功能的交聯試劑 許多用以在胺基基團和硫醇基基團之間形成共價鍵， 或將硫醇基團導入蛋白質内的異雙功能之交聯試劑，為熟 諸此藝者已知的（參見，例如the PIERCE CATALOG，免疫 技術目錄和手冊（ImmunoTechnology Catalog & Handbook)， 1992-1993，其描述這類試劑的製備和用途，並提供這類試 劑的商業來源’亦參見，例如Cumber等人（1992) CTzem. 3:397-401 ; Thorpe 等人（1987) Cancer h·?· 47:5924-593 1 ; Gordon 等人（1987) Ρπ «SW. 84:308-312 ; Walden 等人（1986) 乂 Mo/. Ce// 2:191-197 ; Carlsson 等人（1978j Bbc/zem. J. 173: 723-737 ;
Mahan 4 人（1987) Anal. Biochem. 162:163-170 ;
Wawryznaczak 等人（1992) Br. J. Cancer 66:361-366 ； Fattom 等人（1992) ά / 所顧《· 60:584-589 ;可獲得 交聯試劑：Pierce Chemical Company，Rockford，IL ; Sigma Chemical Company, St· Louis, MO. ; Molecular Probes, Inc.，
Eugene，OR) »可用來交聯的官能基包括一級胺、硫氫基、 羰基、碳水化合物和羧酸。在異雙功能交聯試劑中使用的 例示性基團，包括但不限於芳基疊氮化物、順丁烯二醯亞 胺、碳化二醯亞胺、N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)-酯、醯肼、 PEP-酯、羥曱基膦、補骨脂素、亞氨酸酯、吡啶二硫化物、 異氰酸酯和乙烯基砜。可使用異雙功能交聯試劑，在靶定 151 201235469 劑-像是例如趨化因子與經修改RIP毒素之間形成共價鍵。 例示性異-雙功能交聯劑含有兩個反應基：一個與一級胺基 團（例如N-羥基琥珀醯亞胺）反應，而另一個與硫醇基團（例 如吡啶二硫化物、順丁烯二醯亞胺、_素等等）反應。經由 一級胺反應基團，父聯劑可與.一多肽的離胺酸殘基反應， 並經由、醇反應基，使業已綁在第一個蛋白質上的交聯劑 與另一個多肽的半胱胺酸殘基（自由硫氫基）反應。例示性異 雙功能交聯試劑包括’但不限於：N-琥珀醯亞胺基_3-(2-吡 咬二硫基）丙酸酯（SPDP ;二硫化物連接子）；橫基琥珀醯亞 胺基6-[3-(2- °比啶二硫基）丙醯胺基]己酸酯（磺基 -LC-SPDP);琥珀醯亞胺基氧羰基-甲苄基硫代硫酸酯 (SMBT，受阻二硫化物連接子）；琥珀醯亞胺基6_[3_(2_吡啶 二硫基）丙醯胺基]己酸酯（LC-SPDP);磺基琥珀醯亞胺基 4-(N-順丁浠二酿亞胺基甲基）環己烧-i_叛酸酯（績基 -SMCC);破珀龜亞胺基3-(2-°比咬二硫基）丁酸酯（SPDB ;受 阻二硫化物鍵連接子）；磺基琥珀醯亞胺基2-(7-疊氮基-4-曱基香豆素-3-乙醯胺基）乙基-1，3’-二硫代丙酸酯（SAED); 績基-琥珀醯亞胺基7-疊氮基-4-甲基香豆素-3 -乙酸酯 (SAMCA);磺基琥珀醯亞胺基6-[α -曱基-α _(2_吡啶二硫基） 甲苯醯胺基]己酸酯（磺基4(：-8]^?丁）；1,4-二-[3’-(2，-吡啶二 硫基）丙醯胺基]丁烷（DPDPB) ; 4-琥珀醯亞胺基-氧羰基-曱 基-(2-吡啶硫基）曱苯（SMPT，受阻二硫化物連接子）；4-琥 珀醯亞胺基-氧羰基-a-(2-吡啶二硫基）曱苯；磺基琥珀醯亞 胺基6-[甲基-(2-。比啶二硫基）甲苯醯胺基]己酸酯（磺基 152 201235469 -LC-SMPT);間-順丁稀二醯亞胺苯曱醯基_N-經基琥泊醯亞 胺醋（MB S);間-順丁烯二醯亞胺苯甲醯基_N_羥基續基破珀 醞亞胺醋（磺基-MBS) ; N-琥珀醯亞胺基（4-碘乙醯基）胺基苯 曱酸醋（SIAB ;硫醚連接子）；磺基琥珀醯亞胺基（4-碘乙醯 基）胺基苯曱酸酯（磺基_SIAB);琥珀醯亞胺基4_(對·順丁烯 二醯亞胺苯基）丁酸酯（SMPB);磺基琥珀醯亞胺基4-(對-順 丁烯二醯亞胺苯基）丁酸酯（磺基-SMPB);疊氮苯曱醯肼 (ABH) ; 3-(2-吡啶二硫基）_丙醯肼；艾爾曼氏（Ellman’s)試 劑；二氣三阱酸、S-(2-硫代吡啶基）-L-半胱胺酸。在例如美 國專利第 5,349,066 號、5,61 8,528 號、4,569,789 號、4,952,394 號和5,137,877號中揭示更多例示性雙功能連接性化合物。 ii.酸可切開、光可切開和熱敏感性連接子 亦可使用酸可切開、光可切開和熱敏感性連接子，特 別是在需要切開經修改RIP毒素，以允許其可更迅速接近 反應之處。在技術領域中已知許多可切開的基團（參見，例 如 Jung 等人（1983) h’oc/zew· Jcia 761:152- 162 ;
Joshi 等人（1990) «/. 5ζ·ο/. C/2em· 265:14518-14525 ; Zarling 等人（1980) «/· /所124:913-920 ; Bouizar 等人（1986) 丑Mr. 乂 155:141-147; Park 等人（1986) 乂 別〇/· CTiern. 261:205-210 ; Browning 等人（1989) /. 143: 18 59-1867)。此外，可從供應商，如Pierce購得廣泛的酸可 切開、雙功能之連接子集團。 酸可切開之連接子包括’但不限於雙順丁稀二醯亞胺 乙氧基丙烷；和己二酸二醯肼連接子（參見，例如Fatt〇m等 153 201235469 人（1 992) /”/eci/o« 60:5 84-5 89)，以及對酸不穩定 的鐵傳遞蛋白共軛物，其含有足夠部分的鐵傳遞蛋白，以 允許進入細胞内的鐵傳遞蛋白循環路徑内（參見，例如
Welh6ner 等人（1991) «/.仏〇/. C/zew· 266:4309-4314)。 光可切開的連接子是在接觸到光後被切開的連接子（參 見，例如 Goldmacher 等人（1992) Bioconj. Chem. 3 :1 04-107) ’藉此在接觸光後釋放出被靶定劑。在接觸光後 被切開的光可切開之連接子為已熟知的（參見，例如Hazum 4 人（1981)在 Pepi., 户印，办—，第 μ 版，
Brunfeldt，K(編輯），第105-no頁中，其描述使用硝苄基基 團做為半胱胺酸的光可切開之保護基；Yen等人（1989) Mahowo/. C/zew 190:69-82，其描述水溶性光可切開之共聚 物’包括羥丙基曱基丙烯醯胺共聚物、甘胺酸共聚物、螢 光素共聚物和甲基若丹明共聚物；Goldmacher等人（1992) C/^m. 3:104-107’其描述交聯劑和試劑，其在接觸 接近UV光（350奈米）後經歷光解降解；以及Senter等人 (1985) P/ioioc/zew. 42:23 1_237，其描述硝基苄氧 羰基氣交聯試劑，其產生光可切開之鍵結）。這類連接子在 治療皮膚學或眼睛疾病時有特殊用途’可使用光纖使其接 觸光。在投與共軛物之後，可使眼睛或皮膚或其他身體部 分接觸光，導致從共輛物中釋放出經修改RIp毒素。這類 光可切開之連接子，對於其中想要移出靶定劑，以允許從 動物體内迅速清除的診斷草案是有用的。 iii.適合化學共軛的其他連接子 154 201235469 其他連接子’包括三苯甲基連接子，特別是經衍生之 三苯曱基基團，產製一屬共軛物，其提供在各種程度之酸 性或驗性下釋放治療劑，，藉著預先挑選會在該處釋 放治療劑之PH範圍的能力所給與之適應性，允許基於在需 要遞送治療劑的組織之間已知的生理學差#，來挑選連接 子(參見，例如美國專利第5,612,474號Η列如，腫瘤組織 的酸性似乎比正常組織更低。 iv.肽連接子 連接子部分可能是肽。可在融合蛋白中，亦可在以化 學方式連接的共|ra物巾使用肽連接子。肽典型地具有從大 約2到大約60個胺基酸殘基，例如從大約$到大約4〇個， 或從大约W到大約30個胺基酸殘基。會依據因素，如納 入該連接子的用途，來選擇長度。 蛋白質配體專一地與在一或多個目標細胞上的受體結 合’並被該目標細胞攝入。& 了有助於配體_毒素共軛物通 過至目標細胞β ’目前較佳的是該配體_毒素共輕物的大 小，不比能被感興趣之目標細胞攝入的更大。通常，配體_ 毒素共輛物的大小會視其組成而定。在配體毒素共轆物含 有化學連接子和化學毒素（即不是蛋白質毒素）的情況下，該 配體-毒素的大小通常比配體-毒素共扼物為融合蛋白時更 小。肽連接子可由核酸便利地編碼，並在宿主細胞，例如 大腸桿菌中表現後，便被併入融合蛋白中。 當靶定劑為蛋白質的時，肽連接子是有利的。例如， 連接子部分可能是有彈性的間隔胺基酸序列，如在單鏈抗 155 201235469 體研究中已知的那些。這類已知連接子部分之實例包括， 但不限於 GGGGS(SEQ ID NO:192)、（GGGGS)n(SEQ ID NO:193) 、 GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:194)、 GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:195) 、 GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:196) 、 GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:197) 、 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:198) 、 EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:199)、SRSSG(SEQ ID N0:200)、SGSSC(SEQ ID NO:201)。亦可使用具有序列 AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(SEQ ID NO:202) 的白喉毒素胰蛋白酶敏感性連接子》 或者，肽連接子部分可能是 VM或 AM(SEQ ID NO:34)，或具有以公式：AM(G2至4S)XAM描述的結構，其 中X為從1到11之整數（SEQ ID NO:203)。在例如Huston 等人（1988) Proc. iVa". Jcai t/.孓儿 85:5879-5 883;
Whitlow, M·，等人（1993) Protein Engineering 6:989-995 ; Newton 等人（1996) jSioc/zembiry 35:545-553 ; A. J. Cumber 等人（1992) 5沁C/zew. 3:397-401 ; Ladurner 等人（1997) J_ Mol. Biol. 273:330-337 ;以及美國專利第 4,894,443 號中 描述了額外的連接子部分。 其他的連接子包括，但不限於：酵素受質，如組織蛋 白酶B受質、組織蛋白酶D受質、胰蛋白酶受質、凝血酶 受質、枯草桿菌蛋白酶受質、因子Xa受質和腸激酶受質； 增加溶解度、彈性及/或細胞内可切開性的連接子，包括諸 156 201235469 参 如（glymSer)n和（sermgly)n之類的連接子，其中m為i到6， ••通常是1到4,且典型地為2到4，而以i到3〇，或i到 10，且典型地為1到4(參見，例如國際PCT申請案第w〇 96/06641號，其提供用在共軛物中的例示性連接子卜在某 些具體事實中，可納入數個連接子，以便利用每個連接^ 想要的特性。 3.例示性白金球族群調節子（LpM)共軛物 例示性配體-毒素共軛物包含LPM共輛物，其含有與志 貞毋素Al(SAl)變體，像是例如任何在本文中描述之sai 變體直接或間接連接的趨化因子。典型地，這類共桃物含 有趨化因子多肽的成熟部分，或該多肽可與受體結合的部 分。在間接鍵結之處，編碼共概物的核酸分子可視需要在 趨化因子靶定劑多肽和S A1變體經靶定部分之間含有編碼 連接子多肽，像是例如Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34 ;在 技術上Met是志賀毒素供細菌表現之起始密碼子）的序列。 在某些貫例中’可將額外的核酸分子加至編碼配體_毒素共 輛物的核酸中’或可藉著其他方法與配體_毒素共扼物連 接，像是藉著化學連接子’以促進純化、表現、選殖或谓 測。例如，可在核酸分子之3’和5,端的一或兩端設計限制 酵素位置’而有助於選殖。在一這類的實例令，在SEQ ID NO:37和37中陳述之核酸分子中，設計在位置u處的Ndel 限制位置和在位置967-972處的BamHI限制位置。 在本文提供之LPM共軛物中的是與作為被靶定劑之變 體1志賀毒素A1(SA1)次單元直接或間接連接的成熟 157 201235469 MCP-1趨化因子多肽的共輛物。例如，如同在所提供之實 施例中描述的’ LPMla共軛物含有成熟的MCP-1多肽（在 SEQ ID N〇:69中陳述），與SA1次單元多肽的殘基23_268 連接’其含有核糖體失活（RIP)功能部位（在本文中稱為SA1 變體1 ;相當於在SEQ ID N〇:22中陳述之胺基酸序列）。 MCP-1夕肽和sai多肽經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34) 間接連接，產生配體：連接子：毒素融合多肽。在seq ID N0.37中陳述編碼LPMla多狀的例示性核酸。在§eq ID NO:38中陳述所編碼的LPMla多肽。 在本文提供之LPM共輛物中的還有與作為被|巴定劑之 變體2志贺毒素A1(SA1)次單元直接或間接連接的成熟 MCP-1趨化因子多肽的共輛物。例如’如同在所提供之實 施例中描述的，LPMlb共軛物含有成熟的MCP-1多肽（在 SEQ ID NO:69中陳述），與經截短之志賀毒素Ai次單元多 肽（在本文中稱為SA1變體2;相當於在SEQ ID NO:24中陳 述之胺基酸序列）連接。MCPd多肽和變體2 SA1多肽經由 Ala-Met連接子（SEqidn〇:34)間接連接，產生配體：連接 子.毋素融合多肽。在SEQ ID NO: 39中陳述編碼LPMlb 多肽的例不性核酸，在那裡核苷酸7_966編碼配體-毒素共 軛物多肽，而核苷酸964-966編碼經設計的終止密碼子。在 SEQ ID NO:40中陳述所編碼的LpMlb多肽，長度為32〇個 胺基酸，並含有5，起始甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置丨），接 著是成熟MCP-1(胺基酸2_77)、AU_Met連接子（胺基酸 78-79)和SA1變體2次單元（胺基酸8〇_32〇)。 158 201235469 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被革巴定劑 之突變種變體1(亦稱為變體3)志賀毒素Al(SAl)次單元（其 為在本文之挑選方法中鑑認的經修改SA1多肽）直接或間接 連接的成熟MCP-1趨化因子多肽的共軛物。例如，lpmIc 共軛物含有成熟MCP-1多肽（在SEQ ID NO:69中陳述），與 突變種志賀毒素A1次單元多肽（在本文中稱為SA1變體3, 相當於在SEQ ID NO:26中陳述之胺基酸序列）連接。Mcpq 多肽和SA1多肽變體經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34) 間接連接，產生配體：連接子：毒素融合多肽。SA1變體3 在關於在SEQ ID NO:22中陳述之成熟野外型SAi多肽的位 置38處具有L至R的突變。如同在實施例中所述，在筛選 !^1^113共軛物（8£()1〇：^0:38)之8八1部分的經修改形式時 產生了 LPMlc。在SEQ ID ΝΟ:41中陳述編碼LPMlc多肽 的例示性核酸。在SEQ ID NO:42陳述所編碼的LPMlc多 肽。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被乾定劑 之突變種變體2(亦稱為變體4)志贺毒素Ai(Sai)次單元（其 為在本文之挑遠方法中鑑認的經修改S A1多狀）直接或間接 連接的成熟M C P -1趨化因子多狀的共輛物。例如，l ρ μ 1 d 共軛物含有成熟MCP-1趨化因子多肽（在SEQ ID NO:69中 陳述），與突變種志賀毒素A1次單元多肽（在本文中稱為 SA1變體4,相當於在SEQIDNO:28中陳述之胺基酸序列） 連接。MCP-1多狀和SA1多狀變體經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34)間接連接’產生配體：連接子：毒素融合多肽。 159 201235469 SA1變體4在關於在SEQ ID NO:24中陳述之成熟經截短 SA1變體2多肽的位置219處具有V至A的突變。如同在 實施例中所述，在篩選LPMlb共軛物（SEQ ID NO:40)之SA1 部分的變體時產生了 LPMld。在SEQ ID NO:43中陳述編碼 LPMld多肽的例示性核酸0在SEQ ID NO:44陳述所編碼的 LPMld多肽。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被乾定劑 之經修改志賀毒素A 1 (S A 1)次單元直接或間接連接的趨化 因子嗜酸球趨化蛋白的共軛物。例如，LPM2共軛物含有成 熟的嗜酸球趨化蛋白多肽（相當於在SEQ ID NO: 1 1 3中陳述 之序列的胺基酸24-97)，經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳 述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:45之核苷酸7 — 960 中陳述了編碼LPM2之核酸分子的範例，在核苦酸958_96〇 處包括經設計的終止密碼子。在SEqIDN〇:46中陳述所編 碼之LPM2多肽，長度為318個胺基酸，其含有5，起始曱 硫胺酸殘基（在胺基酸位置υ，接著是成熟的嗜酸球趨化蛋 白（胺基酸2-75)、Ala-Met連接子（胺基酸76_77)和SA1變 體4次單元（胺基酸78_3 is)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被靶定劑 之經修改志贺毒素A1(SA1)次單元連接的趨化因子嗜酸球 趨化蛋白的共軛物，為LpM12。在LpMu中使用的嗜酸球 趨化蛋白多肽，具有與在LPM2中之嗜酸球趨化蛋白相同的 胺基酸序列，然而因為在合成其等之方法上的差異（參見實 160 201235469 施例3) ’而使其核酸序列有所不同。在SEQ ID NO:65之核 苷酸7-960中陳述了編碼LPM12之核酸分子的範例，在核 苷酸95 8-960處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:46 中陳述了所編碼之LPM12多肽，長度為3 1 8個胺基酸，其 含有5’起始甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置丨），接著是成熟的 嗜酸球趨化蛋白（胺基酸2-75)、Ala-Met連接子（胺基酸 76-77)和SA1變體4次單元（胺基酸78-318)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被靶定劑 之經修改志贺毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子SDF-Ιβ的共軛物。在一實例中，該經修改SA1次單元 為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 S A1多肽。例如，LPM3 共軛物含有成熟的SDF-1 /3多肽（相當於在SEQ ID NO: 114 中陳述之序列的胺基酸22-93)，經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:3 4)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中 陳述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:47之核苷酸7-954 中陳述了編碼LPM3之核酸分子的範例，在核苷酸952-954 處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:48中陳述了所 編碼之LPM3多肽，長度為316個胺基酸，其含有5,起始 甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置1)，接著是成熟的SDF-1 /3 (胺 基酸2-73)、Ala-Met連接子（胺基酸74-75)和SA1變體4次 單元（胺基酸76-316)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被乾定劑 之經修改志贺毒素A1(SA1)次單元直接或間接連接的趨化 因子GRO-α的共軛物。在一實例中，該經修改sa 1次單元 161 201235469 為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 SA1多肽。例如，LPM4 ' 共軛物含有成熟的GRO-α多肽（相當於在SEQ ID ΝΟ:115 、 中陳述之多肽的胺基酸35-107)，經由Ala-Met連接子（SEQ ’ ID NO:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:2 8中 陳述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:49之核苷酸7-957 中陳述了編碼LPM4之核酸分子的範例，在核苦酸955-957 處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:50中陳述了所 編碼之LPM4多肽，長度為317個胺基酸，其含有5,起始 曱硫胺酸殘基（在胺基酸位置1)，接著是成熟的GR0_a (胺 基酸2-74)、Ala-Met連接子（胺基酸75-76)和SA1變體4次 單元（胺基酸77-3 17)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被乾定劑 之經修改志贺毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子MIP-1 /5的共軛物。在一實例中，該經修改s A1次單 元為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 SA1多肽。例如， LPM5共軛物含有成熟的MIP-1 /5多肽（相當於在SEQ ID NO: 116中陳述之多肽的胺基酸24_92)，經由Ala-Met連接 子（SEQ ID NO:3 4)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳述之胺基酸序列）連接。這類LPM5序列的範例 為在SEQ ID NO:51中陳述之核酸序列的核苷酸7-945，在 核苷酸943-945處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:52中陳述了所編碼之LPM5多肽，長度為313個胺基 酸，其含有5’起始甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置丨），接著是 成熟的MIP-1/3 (胺基酸2-70)、Ala-Met連接子（胺基酸71-72) 162 201235469 和SA1變體4次單元（胺基酸73-313)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被靶定劑 之經修改志賀毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子IL-8的共轆物。在一實例中，該經修改sa 1次單元為 在本文之挑選方法中鑑認的變體4 SA1多肽。例如，lPM6 共軛物含有成熟的IL-8多肽（相當於在SEQ ID NO: 117中陳 述之多肽的胺基酸21-99)，經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳 述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:453之核苷酸7-969 中陳述了編碼LPM6之核酸分子的範例，在核苦酸967-969 處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:54中陳述了所 編碼之LPM6多肽，長度為321個胺基酸，其含有5’起始 曱硫胺酸殘基（在胺基酸位置1)，接著是成熟的IL-8(胺基酸 2-78)、Ala-Met連接子（胺基酸79-80)和SA1變體4次單元 (胺基酸81-321)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被靶定劑 之經修改志賀毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子IP-1 0的共軛物。在一實例中，該經修改SA1次單元 為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 SA1多肽。例如，LPM7 共輛物含有成熟的IP-10多肽（相當於在SEQ ID NO:118中 陳述之多肽的胺基酸22-98)，經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳 述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:55之核苷酸7-969 中陳述了編碼LPM7之核酸分子的範例，在核苷酸967-969 163 201235469 處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:56中陳述了所 編碼之LPM7多肽，長度為321個胺基酸，其含有5,起始 甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置1)，接著是成熟的IP_10(胺基 酸2-7 8)、Ala-Met連接子（胺基酸79-80)和SA1變體4次單 元（胺基酸81-321)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被把定劑 之經修改志賀毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子MCP-3的共軛物。在一實例中，該經修改SA1次單元 為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 SA1多肽。例如，LPM8 共軛物含有成熟的MCP-3多肽（相當於在SEQ ID NO: 1 19中 陳述之多肽的胺基酸24-99)，經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳 述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:57之核芽酸7-966 中陳述了編碼LPM8之核酸分子的範例，在核皆酸964-966 處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:58中陳述了所 編碼之LPM8多肽，長度為320個胺基酸，其含有5,起始 甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置1)，接著是成熟的MCP-3(胺基 酸2-77)、Ala-Met連接子（胺基酸.78-79)和SA1變體4次單 元（胺基酸80-320)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被乾定劑 之經修改志賀毒素A1 (S A1)次單元直接或間接連接的趨化 因子ΜΙΡ-3α的共軛物。在一實例中，該經修改sAi次單元 為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 S A1多肽》例如，LPM9 共李厄物含有成熟的ΜΙΡ-3α多肽（相當於在SEQ ID NO: 120 164 201235469 中陳述之多肽的胺基酸27-96)，經由Ala-Met連接子（SEQ •’ ID NO:3 4) ’與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中 " 陳述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:59之核苷酸7-948 中陳述了編碼LPM9之核酸分子的範例，在核苷酸946-948 處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:60中陳述了所 編碼之LPM9多肽，長度為314個胺基酸，其含有5,起始 甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置1)，接著是成熟的ΜΙΡ-3α(胺 基酸2-71)、Ala-Met連接子（胺基酸72-73)和SA1變體4次 單元（胺基酸74-314)。 在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被乾定劑 之經修改志贺毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子MDC的共軛物。在一實例中，該經修改sA1次單元為 在本文之挑選方法中鑑認的變體4 S A1多肽。例如，LPM10 共輛物含有成熟的]VIDC多肽（相當於在SEQ ID NO: 121中 陳述之多肽的胺基酸25-93) ’經由Ala-Met連接子（SEQ ID NO:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳 述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:61之核苦酸7-945 中陳述了編碼LPM 1 0之核酸分子的範例，在核苦酸943 -94 5 處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:62中陳述了所 編碼之LPM10多肽，長度為313個胺基酸，其含有5’起始 甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置1) ’接著是成熟的MDC(胺基 酉欠2-70)、Ala-Met連接子（胺基酸7 1 -72)和SA1變體4次單 元（胺基酸73-313)。 在本文中提供的其他另一個例示性是與作為被乾定劑 165 201235469 之經修改志贺毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子MIP-1 α的共軛物。在一實例中，該經修改sA 1次單元 為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 SA1多肽。例如， LPM11共耗物含有成熟的MIP-Ια多肽（相當於在SEQ ID NO: 122中陳述之多肽的胺基酸24-92)，經由Ala-Met連接 子（SEQ ID NO:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳述之胺基酸序列）連接。在SEq id NO:63之核苦 酸7-945中陳述了編碼LPM11之核酸分子的範例，在核普 酸943_945處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:64 中陳述了所編碼之LPM11多肽，長度為313個胺基酸，其 含有5 ’起始甲硫胺酸殘基（在胺基酸位置丨），接著是成熟的 ΜΙΡ-1α(胺基酸2-70)、Ala-Met連接子（胺基酸71-72)和SA1 變體4次單元（胺基酸73-3 13)。
在本文中提供的另一個例示性LPM是與作為被靶定劑 之經修改志贺毒素Al(SAl)次單元直接或間接連接的趨化 因子BCA-1的共軛物。在一實例中，該經修改sA1次單元 為在本文之挑選方法中鑑認的變體4 SA1多肽。例如， LPM13共軛物含有成熟的BCA-1多肽（相當於在SEQ ID N0:123中陳述之多肽的胺基酸23-109)，經由Ala-Met連接 子（SEQ ID N〇:34)，與SA1變體4多肽（相當於在SEQ ID NO:28中陳述之胺基酸序列）連接。在SEQ ID NO:66之核苦 酸7-999中陳述了編碼LPM13之核酸分子的範例，在核發 酸997-999處包含經設計的終止密碼子。在SEQ ID NO:67 中陳述了所編碼之LPM 1 3多肽，長度為3 3 1個胺基酸，其 166 201235469 含有5’起始曱硫胺酸殘基（在胺基酸位置1)，接著是成熟的 BCA-1(胺基酸2-88)、Ala-Met連接子（胺基酸89-90)和SA1 變體4次單元（胺基酸331)。 G.經修改Rip毒素及其共軛物的製備 可藉著化學共軛、重組DNA技術或重組表現和化學共 輕之組合’來製備與被靶定劑連接之靶定部分的共軛物。 可使用本文之方法來製備，並使用直接或經由本文描述之 連接子連接任何被靶定劑，如RIp毒素之任何靶定劑的共 輛物。可按任何方位連接靶定劑和被靶定劑，且在共軛物 中可出現一個以上的靶定劑及/或被靶定劑。舉例說明本文 之方法，特別提到含有靶定劑，如趨化因子和被靶定劑， 如經修改志贺毒素A1多肽的共軛物。 此外’本文提供表現和生產重組多肽的方法。可使用 這類方法’單獨或以帶有所挑選之把定劑，如趨化因子的 共辆物融合蛋白（例如配體-RIP毒素共軛物）之形式，表現在 本文中k供的經修改毒素或毒素變體。例如，在以個別肽 表現被疋劑’如本文提供之經修改毒素，和乾定劑之處， 可經由在本文其他地方討論的化學方法，產製經修改之被 靶定劑與靶定劑的共軛物。 1·產製和選殖毒素多肽或含有毒素多肽之共輕物的方 法 可使用任何在技術領域中已知可用於選殖和分離核酸 分子的方法，選殖或分離編碼經修改毒素或含有經修改毒 素之共軛物，包括配體-毒素共軛物的核酸。例如，若已知 167 201235469 革巴定劑或被靶定劑的核酸序列，可藉著已熟知的蛋白質合 成技術，或編碼所挑選之把定劑或被乾定劑的DNA分子的 化學合成’生產含有靶定劑或配體和一或多個被靶定劑之 嵌合型融合蛋白的共軛物。或者，若靶定劑或被靶定劑之 核酸序列是未知的，則先使用已熟知的方法，像是但不限 於庫的篩選，包括核酸雜交篩選、基於抗體的篩選和基於 活性的篩選來決定序列。亦可在僅知道一部分胺基酸序列 時，使用這類筛選方法獲得編碼特殊蛋白質的核酸序列。 可使用擴大核酸的方法，分離編碼靶定劑及/或被靶定 劑的核酸分子’包括例如聚合酶連鎖反應（pCR)法。可使用 含有材料的核酸作為起始材料，可從其中分離編碼靶定劑 或被乾定劑的核酸分子。例如’在擴大方法中可使用DNA 和mRNA製劑、細胞萃取物、組織萃取物、流體試樣（例如 血液、企清、唾液）、得自健康及/或生病個體的試樣。亦可 使用核酸庫作為起始材料的來源。可設計引子以擴大想要 的分子。例如’可基於從其中產製毒素或配體分子（即趨化 因子）的經表現序列來設計引子。可基於特殊之已知胺基酸 序列的反-轉譯來設計引子。可將藉著擴大產製的核酸分子 定序並證實，以編碼該分子。 有些編碼革巴定劑或被把定劑的基因是買得到的。例 如，可獲得編碼趨化因子或細胞毒素的核酸分子。獲得市 售基因的優點為通常已經針對在宿主，如大腸桿菌中表現 而將該序列最適化了。可使用核酸合成技術生產編碼感興 趣之蛋白質、肽或多肽的多核苷酸。操縱DNA分子的方法 168 201235469 包括’但不限於選殖到載體内、核酸殘基的突變生成，以 及核酸殘基的添加或刪除，為技術領域中已熟知的，並可 用來產製本文提供的經修改RIP毒素或配體_RIp毒素共輛 物。 在-具體事實中，以融合蛋白之形式產生敌合型配體 -RIP毒素。可藉著重組核酸技術產生融合蛋白，其中將含 有靶定部分，如趨化因子的單一多肽直接與蛋白質的被靶 疋劑，如細胞毒素連接。或者，可分開蛋白質一段距離， 以確保该蛋白質形成適當的二級和三級結構。適當的連接 子序列⑴會採納有彈性的延伸㈣，⑺不㈣示有發展出 規律之二級結構的傾向，該二級結構可與融合多肽之有功 月t*的功此。卩位父互作用，以及（3)會有最少的忌水性或帶電 何特徵’可提升與有功能之蛋白質功能部位的交互作用。 :將乾定部分安置在多肽中相對於細胞毒素部分的胺基_ 端I類融α蛋白的實例具有一般化的結構：（胺基端）靶定 連接子.母素（缓基端）。或者，可將乾定部分安置在 阳口蛋白内相對於細胞毒素部分的幾基端，例 > 具有一般 化的、。構·（胺基端）毒素：肽連接子：la定劑（致基端）。 在本文中亦考慮融合蛋白，其在胺基及/或羧基端含有 額外的胺基酸i t _圩列，如抗原決定位標籤或有助於蛋白質純 化之其他部分的皮 幻序列。例如，可使用多組胺酸標籤，其可 月b有助於諸如遗 — 選殖、表現、轉譯後修改、純化、偵測和投 樂之類的進行。Λ 在某些情況下’在有一個以上RIP毒素、 一個以上連接； ” 于或一個以上配體之處，可以任何順序排列 169 201235469 基因，只要不排除靶定劑或被靶定劑的想要活性即可。 可使用酵素切開的傳統技術，並連接來自想要序列的 片段，來製備融合蛋白。例如，可使用寡核苷酸合成器合 成、從親代細胞之DNA中分離（其藉著適當的限制酵素消化 產生蛋白質）’或（藉著基因組DNA的PCR，利用適當的弓丨 子）從目標來源，如細胞、組織、載體或其他目標來源中獲 得想要的序列。在一實例中，可藉著將DNA目標序列連接 到載體内經設計之重組位置處的連續循環，產製毒素共軛 物，如任何在本文中提供之含有經修改毒素部分的配體毒 素共軛物。可將經消化產物繼代選殖到載體内，以進行序 列的進一步重組搡縱，如創造與在載體内業已含有之其他 核酸序列的融合’或進行目標分子的表現。 在某些情況下，可使用PCR擴大作為獲得足量之經消 化產物的方法。亦可設計在PCR擴大中使用的pcR引子， 以促成核酸序列的操作連接。例如，可在引子中加入非-模 板互補的5’延伸’以允許進彳pcR產物的各種擴大後操 縱，而對擴大本身沒有顯著的影響。例如，這# 5，延伸可 包含限制位置、啟動基因序列 '限制酵素連接子序列、蛋 白酶切開位置序列或抗原決定位標籤之序列。在一實例 中’為了創造-融合蛋白’可被倂入引子内的序列包括， 例如編碼myc標籤、his標藏或其他小型抗原決定位標籤的 序列’使該經擴大的PCR產物得以有效地含有感興趣之核 酸序列與抗原決定位標籤的融合。 在其他實财，將限制酵素位置併入引子内，可促成 201235469 擴大產物繼代選殖到含有可相容之限制位置的載體内，如 藉著提供黏性末端’以便連接核酸序列。可使用將多個經 PCR擴大之產物繼代選殖到單一载體内的方法，作為以可 操作之方式連接或融合不同核酸序列的策略。其他繼代選 殖PCR產物至載體内的方法包括鈍端選殖、選殖、與選 殖無關的連接和活體内選殖。 在將3有經暴露之限制酵素位置的pCR產物繼代選殖 到載體内，如創造與感興趣之序列的融合之前，有時需要 從仍未切開的那些中解離經消化的pCR產物。在這類實例 中可在PCR之則將螢光標籤加在引子的5,端。這容許鑑 、、’二肖化的產物，因為在消化後已經被順利消化的那些 會失去螢光標記。在某些情況下，為了產製融合序列，使 用含有限制位置之經擴大PCR產物進行後續的繼代選殖到 載體内，結果將限制酵素連接子序列倂入融合蛋白產物 中。通常這類連接子序列很短，不損害多肽的功能，只要 以可操作之方式連接該序列即可。 2.含有融合蛋白之共輛物的生產和表現系統 編碼毒素或其共輥物’如任何本文提供之配體-毒素共 :物：核酸分子’均可以載體的形式提供，其含有核酸分 蔽者e :載體的—個實例為質體。許多表現載體為熟諳此 :扼物T利用且可用來表現毒素多肽，包括毒素 響：常:見載體的選擇受到宿主表現系統之選擇的影 促進子 I載體可包含轉錄啟動基因’可視需要還有 促進子、轉譯信號’以及轉錄和轉譯終止信號。為了穩定 171 201235469 轉型而使用的表現載體，典型地具有可選擇標記，其允許 經轉型細胞的選擇和維持。在某些情況下，可使用複製起 點擴大載體的副本數目。此外，許多表現載體提供與多個 選殖位置相鄰的N-端或c-端抗原決定位標籤，使得從該載 體令表現的任何所得之蛋白會有插入多肽序列之架構中的 抗原決定位標籤。 可使用已熟知的技術產生融合蛋白，其中以含有表現 控制序列（其以可操作之方式與編碼欲表現之融合蛋白的核 酸分子連接）的表現載體轉染宿主細胞（分子選殖：實驗室手 冊（Mo/ecw/a;- C/o⑴.叹义 少从“⑽“/)，sarnbro〇k 等人 編輯，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Ν·Υ.， 1989)。為了表現’將編碼毒素之〇να(通常是融合蛋白之 形式’其含有與經修改毒素直接或間接連接的配體，如任 何在本文中k供之配體-毒素共辆物）轉染到宿主細胞内。可 在任何適合產生投藥及治療所需之多肽必要量和形式的生 物中表現毒素多肽，包括配體_毒素共軛物。通常，可經過 設計以表現異種DNA並具有分泌路徑的任何細胞類型都是 適合的。表現宿主包括原核生物和真核生物，如大腸桿菌、 酵母菌、植物、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，包括人類細胞 株和基因轉殖動物。表現宿主可能在其蛋白質生產水平和 在經表現蛋白質上出現的轉譯後修改之類型上有所差異。 表現宿主的選擇可基於這些及其他因素’如調節和安全性 考量、生產成本和純化的需求及方法。 a.用於表現的質趙和宿主細胞 172 201235469 含有編碼本文提供之Rip毒素變體或配體_RIp毒素變 體共軛物的核酸分子之表現載體的建構，以及核酸在經轉 染細胞中的表現，涉及在技術領域中已知之分子選殖技術 的使用。這類方法包括建構表現載體，其含有編瑪以可操 作之方式與適當轉錄/轉譯控制信號連接之多肽的核酸分 子。這些方法亦包含在試管内的重組核酸（例如DNa或RNA) 技術、合成技術和在活體内的重組/遺傳重組（參見，例如在 分子選殖·實驗室手冊（Mo/ecw/ar C7on/«g.. j 少 ^^如/入8&«11^0〇1^等人，編輯，第2版，（：〇1(13?141^以1^〇1· Laboratory，Ν.γ” 1989 ;分子生物學中的最新草案（Cwmw
Protocols in Molecular Biology),第 1 和 2 冊，A^xxbe\，専 k 編輯，Current Protocols，1987-1994 ; John Wiley and Sons， Inc.，1994-1999 ;以及選殖載體：實驗室手冊 Vectors: A Laboratory Manual),第 ϊ—IV 冊，pouweis，等人， 編輯，及其中之附錄，Elsevier, N.Y.，1995-1998中描述的技 術）。 在宿主細胞中表現感興趣之多肽的重組核酸分子，通 常會呈表現載體之形式，其包含表現控制序列，以可操作 之方式與編碼多肽的核酸分子連接。獲得穩定轉移，而得 以將外來核酸持續維持在宿主中的方法亦為在技術領域中 已知的。可藉著傳統技術，如熟諳此藝者已熟知的，完成 以重組核酸轉型宿主細胞。 可使用各種宿主-表現載體系統，表現rip毒素變體或 配體-RIP毒素變體共輛(物蛋白。這些包括，但不限於以含
iJ 173 201235469 有核酸分子（其編碼RIP毒素變體或配體-RIP毒素變體共輕 物）之重組質體DNA、噬菌體DNA或粘接質體DNA表現載 體轉型的微生物，如細菌；以含有核酸分子（其編碼RIp毒 素變體或配體-RIP毒素變體共輛物）之重組酵母菌表現載體 轉型的酵母菌；以重組病毒表現載體（例如花椰菜花葉病 毋CaMV，知草；^葉病毒，TMV)感染，或以含有核酸分 子（其編碼RIP毒素變體或配體_RIp毒素變體共軛物）之重 組植物表現載體（例如Ti質體）轉型的植物細胞系統；以含 有核酸分子（其編碼RIP毒素變體或配體_RIp毒素變體共軛 物）之重組病毒表現載體（例如桿狀病毒）感染的昆蟲細胞系 統，或以含有核酸分子（其編碼RIp毒素變體或配體-RIp毒 素變體共軛物）之重組質體表現載體轉型，或以含有核酸分 子（其編碼RIP毒素變體或配體_RIp毒素變體共軛物）之重 組病毒.表現載體（例如DNA或RNA病毒，像是但不限於逆 轉錄病毒、腺病毒和痘苗病毒）感染的動物細胞系統，或為 了穩定表現RIP毒素變體或配體_RIp毒素變體共軛物而設 計的經轉型之動物細胞系統。 依據所使用的宿主/載體系統，可在表現載體中，將任 何的各種適當轉錄和轉譯元件_包括組成上和可誘導的啟動 基因、轉錄促進子元件、轉錄終止序列等等，以可操作之 方式與編碼RIP毒素變體或配體_RIp毒素變艟共轆物的核 酸連接（參見，例如Bitter.等人，心以心矸_/〇耵 516-5 44，1987)。例如，當使用細菌系統時，可使用可誘導 之啟動基因，像是但不限於噬菌體s的Pl、p^c、Pup、 174 201235469 ptac(ptrp-lac雜種啟動基因）或T7。在其他實例中，當使用 哺乳動物細胞系統時，可使用衍生自哺乳動物細胞基因組 的啟動基因（例如金屬硫肽啟動基因），或得自哺乳動物病毒 的啟動基因（例如逆轉錄病毒長端重複段、腺病毒晚期啟動 基因或痘苗病毒7 · 5 Κ啟動基因)。亦可使用藉著重組核酸或 合成技術產生的啟動基因，以提供經插入之核酸分子（其編 碼RIP毒素變體或配體-RIP毒素變體共軛物）的轉錄。” 當宿主為原核生物，如大腸桿菌時，可藉著在技術領 域中已熟知的程序，從細胞來製備能夠攝取dna(即轉型） 的勝任細胞。例如，可在指數生長期之後收穫細胞，隨後 藉著CaCl2方法處理之。或者，可使用或咖卜亦 可在形成宿主細胞的原生質體之後或藉著電穿透進行轉 型。通常使用原核生物宿主作為宿主細胞。 當宿主為真核生物細胞時，重組核酸分子之轉染方法 包括形成磷酸鈣共·沉澱物，以及傳統的機械程序，如顯微 注射、電穿透和插入包裝在脂質體中的質體。核酸轉移的 其他方法，涉及使用真核生物病毒載體，如猿病毒 4〇(SV40)、腺病毒、痘苗病毒、牛乳頭狀瘤病毒或重組的自 主微小病毒載體（例如，像是在美國專利第5,585,254號中描 述的）以暫時感染或轉型真核生物細胞，並表現蛋白質（真 核生物病毒載體ρζ>α/〜以〇~，C()ld
Harbor Laboratory，GlUzman 編輯，1982)。亦可以編碼 Rip 毒素變體或配體-RIP毒素變體共軛物多肽的核酸分子和編 碼可選擇表現型，如單純疱疹胸腺核苷激酶基因的第二個 175 201235469 核酸分子’共同轉染真核生物細胞《或者，編碼RIp毒素 變體或配體-RIP毒素變體共輛物多肽的核酸分子和編瑪可 選擇表現型的核酸分子可出現在相同的載體或質體上。 真核生物表現系統可允許進一步發生經表現之哺乳動 物蛋白質的轉譯後修改。若如此需要，這類細胞具有轉課 後加工原始轉錄本的細胞機器。這類修改包括，但不限於 糖基化、磷酸化和法呢基化。這類宿主細胞株可包括，作 不限於 CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、 HEK-293 和 WI38。 i.細菌細胞表現系統 在細菌系統中，可視系統的想要屬性有利地選擇許多 表現載體。例如，當欲產生大量的RIP毒素變體或配體_Rlp 毒素變體共軛物蛋白質時，可能想要指揮可迅速純化之RIP 毒素變體或配體-RIP毒素變體共軛物蛋白質產物的高水平 表現的載體。經過設計而含有切開位置，以幫助回收所表 現之多肽的那些是較佳的。使用數個市售的載體，包括pET 1 la、b、c或d(Novagen，Madison，WI)可以並已經獲得優異 的結果。 轉型大腸桿菌細胞的特佳質體包括pET表現載體（參 見’例如美國專利第4,952,496號；購自NOVAGEN，Madison， WI，亦參見由Novagen發表之描述該系統的文獻）。這類質 體包含PET 11c及/或pET 1U，其含有T7iac啟動基因、T7 、’s止序列、可誘導之大腸桿菌lac操縱子和lac阻遏物基因； pETl2a-c’其含有丁7啟動基因、T7終止序列和大腸桿菌 176 201235469 ompT 分泌信號；以及 pET15b(Novagen，Madison, WI)，其 含有His-標籤以前導序列（SEQmN〇:40)，其可供利用His 管柱純化’以及凝血酶切開位置，其允許在純化後在管柱 上切開；T7-lac啟動基因區和T7終止序列。 可將編碼與被靶定劑連接（有或無連接子）之乾定劑，如 趨化因子的核酸，以及其他這類構築體插入pET載體内， 如 pETllc、pET-lla 和 PET-15b 表現載體（n〇VaGen,
Madison, WI)，以便在細胞内或漿周間隙表現RIp毒素變體 或配體- RIP毒素變體共輛物蛋白質。或者，可將被乾定劑 或革巴定劑插入pET載體内並分別表現。 其他質體包括pKK質體’特別是ρκΚ223-3，其含有tac 啟動基因（購自Pharmacia;亦參見Brosius等人（1984)尸roc. /Vai厂Jcac/· 8 1:6929 ; Ausubel等人分子生物學中的最 新萆案（Current Protocols in Molecular Biology).，以反美風 專利第 5，122,463 號、5,173,403 號、5,187,153 號、5,204,254 號、5,212,058 號、5,212,286 號、5,215,907 號、5,220,013 號、5,223,483號和5,229,279號），其含有tac啟動基因。 已經藉著將具有EcoRI黏性末端的康黴素抗藥性卡匣（購自
Pharmacia;獲自 pUC4K (參見，例如 Vieira 等人（1982) 19:259-268 ;和美國專利第4,7 19,179號）插入氨苄青黴素抗 藥性標記基因内，來修改質體PKK。 其他較佳的載體包括，但不限於PPL- λ可誘導之表現 載體和tac啟動基因載體pDR450(參見，例如美國專利第 5,281，525 號、5,262,309 號、5,240,83 1 號、5,231，008 號、 177 201235469 5,227,469 號 ' 5,227,293 號；購自 pharmacia p_L.
Biochemicals，亦參見 Mott，等人（1985) ^ ί/ϋ 82:88 ;和 De Boer 等人（1983) Pn TWz". dcai/· VU· 80:21);以及桿狀病毒載體，如pBlueBac載體（亦稱 為pJVETL·及其衍生物；參見，例如美國專利第5,278,〇5〇 u虎、5,244,805 號、5,243,041 號、5,242,687 號、5,266,3 17 號、4,745,051 號和 5，169,784 號），其包括 pBlueBac瓜。 其他的載體包括，但不限於pIN_ jjj 0Inp A質體，如pIN-瓜ompA2(參見，例如美國專利第4,575,013號，和Duffaud
等人（1987) Mei/z.五―則/〇g少 153:492_5〇7)opIN-m()rnpA 質體包含異種DNA的插入位置，與帶有衍生自大腸桿菌之 月曰蛋白基因之功能片段的轉錄讀框連接。該質體亦含有編 碼大腸桿菌之ompA蛋白質之信號肽的DNA片段，安置在 使所表現的想要多肽得以在其胺基端具有該〇rnpA信號肽 的位置’藉此容許跨越細胞質膜的有效分泌。該質體更含 有編碼大腸桿菌lac啟動基因-操縱子之特定斷片的DNA , 以適合想要多肽之轉錄表現的方位安置它，還有編碼相關 阻遏物分子之不同功能的大腸桿菌lacI基因，在缺少lac 操縱子誘導劑時’其與lac啟動基因-操縱子交互作用，以 防止從其中轉錄。想要多肽的表現是在脂蛋白（lpp)啟動基 因和lac啟動基因-操縱子的控制之下，雖然正常藉著阻遏 物分子阻斷來自任一啟動基因的轉錄。藉著誘導劑分子選 擇性地使阻遏物失活，藉此從兩個啟動基因中誘導想要多 肽的轉錄表現。 178 201235469 可由含有構築體之質體或含有編碼阻遏物-蛋白質之基 因的第二質體，編碼阻遏物蛋白質。阻遏物_蛋白質能夠壓 抑含有核苷酸序列（阻遏.物-蛋白質與其結合）之啟動基因的 轉錄。可藉著改變細胞的生理學條件，將啟動基因去阻遏。 可藉著在生長培養基中加入一分子（其抑制，例如與操縱子 或與調節蛋白質或DNA之其他區域產生交互作用的能 力）’或藉著改變生長培養基之溫度，而達到改變。較佳的 阻遏物-蛋白質包括，但不限於大腸桿菌lacI阻遏物，其對 IPTG誘導是敏感的，對溫度敏感的cI857阻遏物。大腸桿 菌lacI阻遏物是較佳的。 在某些具體事實中，構築體亦包含轉錄終止序列。啟 動基因區和轉錄終止序列分別選自相同或不同的基因。在 某些具體事貫中，DNA片段在細菌細胞，如在大腸桿菌中 複製。DNA片段典型地亦包含細菌的複製起點，以確保將 該DNA片段世世代代維持在細菌中。這樣子’可藉著在細 菌中複製，產生大量的DNA片段。較佳的細菌複製起點， 包括但不限於fl-〇ri和colEl複製起點。 例示性細菌宿主含有編碼T7 RNA聚合酶之DNA的染 色體副本，其以可操作之方式與可誘導啟動基因，如“…乂 啟動基因連接（參見，美國專利第4,952,496號）。這類宿主 包括，但不限於溶素原大腸桿菌品系HMS174(DE3)pLysS、 BL2l(DE3)pLysS、HMSm(DE3)和 BL21(DE3)。較佳的是 口口系BL21(DE3)。pLys品系提供低水平的T7溶菌酶，T7 RNA聚合酶的天然抑制劑。較佳的細菌宿主是昆蟲細胞草 179 201235469 地夜蛾（5>〇而；?^〜1/>叩//^心）（8£9細胞；參見，例如1^(^〇〜 等人（1988) 幻；6:47-55 和美國專利第 4,745,05 1 號）。 為了小或大規模的蛋白質生產，可輕易地按比例放大 或縮小使用表現系統的細菌宿主》為了大規模的蛋白質生 產，可使用諸如批次發酵之類的方法，表現重組蛋白質， 如本文提供的經修改RIP毒素或配體-RIP毒素共辆物。批 次發酵的例示性方法為在技術領域中已知的，並可在例如 本文提供之實施例中找到。例如，為了批次發酵，可使含 有表現載體，如pET載體（其帶有編碼本文提供之Rip毒素 或配體-RIP毒素共軛物的核酸分子）的細菌宿主細胞生長在 容器’如發酵器中。典型地使用這類發酵器，使細菌以5 到100公升或更多的液體培養物生長。用於生長的液體培 養物典型地是標準的增強培養物，其可視需要含有額外的 組份，增強細菌的生長及/或經表現蛋白質的產生。例如， 可將RIP毒素抑制劑，如4-APP加至培養物中，以提高表 現RIP毒素或配體-RIP毒素共軛物蛋白質之細菌的生長。 如在本文其他地方描述的，加入4-APP抑制了在宿主細菌 細胞上表現之RIP毒素的毒性活性’藉此允許較高的蛋白 質生產。至於在使用可誘導載體，如pET載體時的蛋白質 表現’典型地在培養物一旦達到特定的生長密度時，便將 誘導劑（例如IPTG)加至培養物中一段時間。可憑經驗夫 定，或使用在技術領域中已熟知的用以決定蛋白質表現之 最適生長條件的方法，以實驗決定誘導劑的濃度和誘導時 180 201235469 間的長度。從細菌宿主細胞中純化所表現之蛋白質的方法 為在技術領域中已熟知的，並可包括，例如在適當的增溶 缓衝/谷液，如強變性溶液（例如胍鹽酸鹽/脲溶液）中，以均 貝益增溶，該增溶緩衝溶液可視需要包含去垢劑’接著進 行官柱純化。在本文之實施例中提供了純化RIP毒素和配 體-RIP毒素共聚物的例示性方法。 Η.昆蟲細胞表現系統 另種可用來表現RIP毒素變體或配體_Rip毒素變體 共聚物蛋白質的表現系統是昆蟲系統。在一種這類系統 中使用目為銀紋夜蛾（3 ca/(/brm.c<3)核型多角體 病毒（nuclear polyhedr〇sis virus)(AcNpv)作為表現外來基因 的載體^病毋生長在草地夜蛾細胞中。可將編碼Rip毒 素變體或配體-RIP毒素變體共軛物的核酸選殖到病毒的非_ 必需區（例如多角體基因），並放在ACNPV啟動基因（例如多 角體啟動基因）的控制之下。成功的插入編碼RIP毒素變體 或配體-RIP毒素變體共軛物的核酸，結果會使多角體基因 失’舌並產生無包涵體的重組病毒（即病毒缺少由多角體基 因編碼的蛋白質外殼）。然後使用這些重組病毒感染其中已 插入欲表現之基因的草地夜蛾細胞（參見，例如美國專利第 4,215,051 號）。 關於昆蟲宿主，亦'可使用桿狀病毒載體，如pBlueBac (亦稱為pJVETL及其衍生物）載體’特別是pBlueBacDI(參 見，例如美國專利第4,745,051號、5,242,687號、5,243,〇4ι 號、5,244,805 號、5,266,3 17 號、5,270,458 號、5,278,〇5〇 181 201235469 號和5，169,784號；以及經發表的國際pCT申請案w〇 93/10139 ;從 Invitr〇gen，San Dieg〇 獲得），來表現多肽。 pBlueBacm載體是雙重啟動基因載體，並可藉著藍/白篩選 (因該質體含有在昆蟲可辨認之ETL啟動基因控制之下的卜 半乳糖苷酶基因（iacZ)，並可利用IPTG誘導），提供重組體 的選擇。被導入pBlueBacm桿狀病毒載體内的DNA構築 體，以可操作之方式與多角體啟動基因連接，產製表現質 體，然後將其與野外型病毒共同_轉染至昆蟲細胞草地夜蛾 (sf9細胞；參見，例如Luck〇w等人（1988) ㈣/〇以 6:47-55和美國專利帛4,745,〇51號)内。選擇無藍色包涵體 的病毒斑，並純化該斑，然後藉著任何標準方法，如西方 墨點法，使用適當的抗-血清，或南方墨點法，使用適當的 探針’就編碼共軛物蛋白質之DNA分子的存在來篩選之。 然後將所挑選之經純化重組病毒，如藉著CaP〇4轉染或脂 質體，與野外型桿狀病毒共同-轉染到草地夜蛾細胞（sf9細 胞）内’並在組織培養燒瓶中或在懸浮培養物中生長。 iii.酵母菌細胞表現系統 其他可用來表現RIP毒素變體或配體_RIP毒素變體共 軛物蛋白質的表現系統是酵母菌。在酵母菌中，可使用一 些含有組成上或可誘導啟動基因的載體。這類載體為已熟 知的（參見，例如在分子選殖：實驗室手冊 Cloning: A Laboratory Manual), Sambrook % 編輯，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory，Ν·Υ·，1989 ; Bitter，等 人（1987) Mei/zo心 153:516-544;Bitter 等人（1987) 201235469
Methods in Enzymol., 152:673-684 ; Rothstein，DNA 選殖 • - (DNA Cloning),第 Π 冊，Glover，D.M·，編輯，IRL Press， Wash.，D.C.，第3章，1986 ;和酒酵母菌的分子生物學（J7je Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces), Strathern 人，編輯，Cold Spring Harbor Press，第 I 和 II 冊，1982 中 描述的技術）。可使用組成的酵母菌啟動基因，如ADH或 LEU2 ’或可誘導之啟動基因，如GAL(參見，例如Rothstein， DNA 選殖（Z)AM C7om’《g)，第 II 冊，Glover，D.M·，編輯，irl Press, Wash.，D.C”第3章，1986)。或者，亦可使用促進外 來DNA序列整合到酵母菌染色體内的載體。 iv.植物細胞表現系統 其他可用來表現RIP毒素變體或配體-RIP毒素變體共 軛物蛋白質的表現系統是植物細胞系統。在使用植物表現 载體的情況下’可由許多啟動基因中的任一者駕馭編碼共 輛物蛋白質之DN A分子的表現。例如，可使用病毒啟動基 因’如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動基因（參見，例 如 Brisson 等人（1984) 310:511-514)，或 TMV 的外殼 蛋白質啟動基因（參見，例如Takamatsu等人（1987)五Μΰ〇丄 6:307-3 1 1);或者，可使用植物啟動基因，如RuBisC〇的小 型次單元（參見’例如Coruzzi等人（1984)丑«/. 3 : 1671-1680 和 Broglie 等人（1984) 224:838-843);或 熱休克啟動基因，例如大豆hspl7.5-E或hspl7.3-B(參見， 例如 Gurley，等人（1986) Mo/. Ce/Γ Bio/. 6:559- 565)。可使 用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉型、顯 183 201235469 微注射、電穿透及其他技術，將這些構築體導入植物細胞 内。關於這類技術的回顧，參見例如Weissbach和Weissbach (1988) 植物分子生物學的方法（Mei/zo心/〇， Molecular Biology), Academic Press, NY,第 VIII 節，第 421-463 頁，和植物分子生物學（ρ/β«ί Mo/ecw/ar 第 2 版，Covet，S.N·，編輯，第 7-9 章，Blackie, London 1988)。 V·哺乳動物細胞表現系統 其他用來表現RIP毒素變體或配體_RIP毒素變體共軛 物蛋白質的表現系統是哺乳動物細胞系統。可藉著病毒感 染’如腺病毒或疫苗病毒，或藉著直接DNA轉移，如脂質 體、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖，並藉著物理方法，如電穿透和 顯微注射，將表現構築體轉移到哺乳動物細胞。哺乳動物 細胞的表現載體，典型地包括mRNA加帽位置、TATA盒 子、轉譯起始序列（Kozak —致序列）和聚腺苷酸化元件。這 類載體經常包含可供高水平表現的轉錄啟動基因_促進子， 例如SV40啟動基因_促進子、人類細胞巨大病毒（CMV)啟動 基因和勞氏肉瘤病毒（RS V)的長端重複段。這些啟動基因_ 促進子在許多細胞類型中是有活性的。亦可金用組織和細 月己-類型啟動基因和促進子區域來表現。例示性啟動基因/ 促進子區域包括，但不限於得自諸如彈性蛋白酶ς、胰島 ”免疫球蛋白、老鼠乳房腫瘤病毒、白蛋白、α_胎兒蛋白、 α1-抗胰蛋白酶、β_球蛋白、骨髓磷脂鹼性蛋白質肌球蛋 白輕鏈-2和促性腺激素釋放激素基因控制之類基因的那 184 201235469 些。可使用可選擇標記，以挑選並維持帶有表現構築體的 細胞。可選擇標記基因的實例包括，但不限於潮黴素B磷 酸轉移酶、腺苷脫胺酶、黄嘌呤-烏嘌呤轉磷酸核糖基酶、1 胺基糖苷磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶和胸腺核苷激酶。 與細胞表面發送信號分子，如TCR-ζ和FCeRl_Y的融合，可 在細胞表面指揮呈活性狀態之蛋白質的表現。 許多可用於哺乳動物表現的細胞株包括老氣、大鼠、 人類、猴子和雞及倉鼠細胞。例示性細胞株包括’但不限 於 CHO、VERO、ΒΗΚ、HT1080、MDCK、W138、Balb/3T3、
HeLa、MT2、老鼠NS〇(非-分泌性）及其他骨髓瘤細胞株、 融合瘤和雜種融合瘤細胞株、淋巴細胞、RPMI 1788細胞、 纖維母細胞、SP2/0、COS、NIH3T3、HEK293、2%S、2B8、 EBNA-1和HKB細胞（參見，例如美國專利第5,6i8,698號、 6,777,2G5號）。亦可利用已適應不含血清之培養基的細胞 株，其有助於從細胞培養基令純化所分泌之蛋白質（例如 EBNA-l，Pham 等人，（2003)扪釕•出〇印尽 84:332 42)。 可設計使用重組病毒或病毒元件來指揮表現的哺乳動 物細胞系、统。例如’當使用腺病毒表現載體時，可將編碼 ⑽毒素變體或配體-RIP毒素變體共扼物的核酸與腺病毒 轉錄/轉譯控制複合體，例如晚期啟動基因和三分前導序列 連接。然:後可藉著在試管内或在活體内的重組作用，將該 嵌合型基因插人腺病毒基因組中。插人病毒基因組的非_必 需區域（例如區域E1或E3)中，結果會產生重組病毒，其可 存活並能夠在經感染之宿主中表現編@ RIp毒素變體或配 185 201235469 體-RIP毒素變體共輕物的核酸（例如，參見Logan和Shenk (1 984) Proc. TVa". ·/(cat/. 5W. 81:3655-3659)。或者，可 使用痘苗病毒7.5Κ啟動基因（參見例如Mackett等人（1982) Proc. 5Ά CASX, 79:7415-7419; Mackett 等人 (1984) J. F/ro/· 49:857-864，1984 ;和 Panicali 等人（1982) hoc. iVai/· dead 79: 4927-4931)。特別感興趣的 是基於牛乳頭狀瘤病毒的載體，其具有以染色體外元件之 形式複製的能力（Sarver，等人，Mo/. Ce//.仏〇/. 7:486-96, 198 1)。在該DNA進入老鼠細胞内之後，質體很快地複製達 到每個細胞大約1 〇〇到200個副本。經插入之cdnA的轉 錄不需要將質體整合到宿主的染色體内，藉此產生高水平 的表現。藉著在質體中納入可選擇標記，如neo基因，可使 用這些載體進行穩定表現。或者，可修改逆轉錄病毒基因 組，以便用來作為能夠導入並指揮RIP毒素變體或配體_RIp 毋素變體共軛物在宿主細胞中表現的載體（c〇ne和Muiiigan， hoc. 仏’· t/以，57:6349-6353, 1984)。亦可使用 可誘導啟動基因，包括但不限於金屬硫肽ΠΑ啟動基因和熱 休克啟動基因，達成高水平的表現。 為了重組蛋白質的長期、高產量生產’想要穩定的表 現。與其使用含有病毒複製起點的表現載體，寧可以編碼 rip毒素變體或配體播毒素變體共軛物蛋白質的錢轉 型宿主細胞，該eDNA受到適當表現控制元件（例如啟動基 因、促進子序列、轉錄終止序列、聚腺皆酸化位置等等）和 可選擇標記的控制。在重組質體中的可選擇標記，賦與對 186 201235469 挑選的抵抗力，並允許細胞穩定地將質體整合到其等之染 色體内’且生長形成集中點，可轉而選殖它並擴展成細胞 株。例如，在導入外來DNA之後，可允許經設計之細胞在 增強培養基中生長1_2天，然後轉換成挑選培養基。可使用 。午夕挑選系統’包括但不限於在tk·、hgprt·或aprt-細胞中 可分別使用單純疱疹病毒胸腺核苷激酶（Wigiei·等人，〇//, U:223-32，1977)、次黄嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶 (Szybalska 和 Szybalski(1982) Proc.心".&Z··仍/4, 48:2026-30)’和腺嘌呤轉磷酸-核糖基酶（Lowy等人（1980) Ce// 22:817-31)基因。再者，亦可使用抗代謝產物的抵抗力 作為挑選下列基因的基礎：dhfr，其賦與對胺甲碟呤的抵抗 力（Wigler 等人（1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3567-70 ; O’Hare 等人（1981) Pn iVa". dead «Scz·. ί/以， 8:1527-3 1，1981) ; gpt，其賦與對黴酚酸的抵抗力（Mulligan 和 Berg(1981) Pr0c. #如/· 5W. t/a 78:2072-6) ; neo， 其賦與對胺基糖苷G-418的抵抗力（Colberre-Garapin等人 (1981) J. Μο/· 5ζ·ο/_ 150: 1-14);和 hygro，其賦與對潮徽素 的抵抗力（Santerre 等人（1984) 30:147-56)。最近，已 經描述了額外的可選擇基因，叫做trpB，其允許細胞使用 吲哚代替色胺酸；hisD，其允許細胞使用組織醇（histinol) 代替組胺酸（Hartman 和 Mulligan (1988) iVoc. #加/. &ζ·.⑽乂 85:8047-51);以及〇DC(鳥胺酸脫羧酶），其賦與 對烏胺酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基）-DL-烏胺酸，DFMO的 抵抗力（McConlogue 和 Coffino(1983) X Bzo/. C/zew. 258: 187 201235469 8384-8388)。 b.純化 從宿主細胞中分離和純化所表現之.經修改RIp毒素或 配體-RIP毒素共軛物的技術，視所選擇的宿主細胞和表現 系統而定。關於經分泌之分子，通常在移出細胞之後，從 培養基中純化蛋白質。至於細胞内的表現，可將細胞溶解， 並從萃取物中純化蛋白質。當使用基因轉殖的生物，如基 因轉殖的植物和動物來表現時，可使用組織或器官作為起 始材料，製造經溶解的細胞萃取物。此外，基因轉殖動物 產品可包括在乳汁或卵中產生的多肽，可收集之，且若有 進一步的需要’可使用在技術領域中的標準方法萃取蛋白 質並進一步純化之。 在某些情況下，可在純化之前獲得含有所分泌之融合 多肽（包含配體-毒素共軛物）的經調節培養基。可以純淨之 升> 式測試該經調節培養基。在其他實例中，可使經調節培 養基澄清及/或將其濃縮。可藉著離心接著過濾而澄清化。 可藉著熟諳此藝者已知的任何方法濃縮，像是例如，使用 切向流膜或使用攪拌細胞系統濾紙。濃縮過程可使用各種 分子量（MW)的分離截斷。例如，可使用1〇,〇〇〇MW分離截 斷。 可使用在技術領域中已知的標準蛋白質純化技術，包 括但不限於SDS-PAGE、差示沉澱、透析過濾、超過濾、管 柱聚焦電泳、平-板聚焦電泳、凝膠過濾、等速電泳、大小 分級分離、硫酸銨沉澱、高效率液體層析法、螯合層析法、 188 201235469 11 j曰析/去离隹子交換層析法（例如陽離子、陰離子）、忌水 性交互作用層析法和分子排阻層析法，獲得由原核生物或 真h生物產生的經修改RIP毒素或配體up毒素共輕物。 亦可使用親和力純化技術，卩改善製劑的效能和純度。例 1在親和力純化中可使用與經修改Rip毒素或配體_RIp 毒素共軛物結合的單株或多株抗體，受體和其他分子。亦 可設:十表現構築體’加入親和力標籤，如〒抗原決定位、 GST融合& His6，並分別卩㈣抗體、榖胱甘肽樹脂和 樹脂對蛋白質進行親和力純化。可藉著任何在技術領域中 已知的方法評估純度，句；^_存、』 巴栝凝膠電泳和染色及分光光度分 析技術。 在轉型之後，可根據傳統方法分離並純化大量的蛋白 質。例如’可從表現宿主來製備溶胞產物，並使用Ηηχ、 排阻層析法、凝膠電泳、親和力層析法或其他純化技術， 純化想要的蛋白質（例如配體.毒素變體）。經純化之蛋白 質通常會有大約8〇%到大約90%的純度，並可能高達且包 括麵的純度。純的意指不含其他蛋白質和細胞碎肩。 在某些實例中，所選擇的純化方法可能影響蛋白質結 構，並因此在純化之後需要額外的製備步驟，以產製相： 的重組蛋白質。，有些經表現的蛋白質在使用強變性 條件的純化技術之後，雹要五棚& ^ ^祐要再摺疊。再摺疊蛋白質的方法 為在技術領域中已知的，並可包括例如在低含量還原劑的 存在下透析（參見，例如實施例4)。 3.化學共扼物的產生 189 201235469 二:成本文的化學共軛，使靶定劑經由一或多個所挑 子或直接與被衫劑連接。若以分㈣多狀表現 :’則可使用化學共輕若㈣定劑是狀 S & f U #的’如核酸或非·肽藥物’則必須使用化學共 軛可使用任何熟諸此藝者已知的以化學方式共㈣挑選 部分的方法。在本文中其他地方描述了數個方法，並包括 但不限於交聯劑’如同·或異雙功能的連接化合物β 亦可修改編碼RiP毒素變體或靶定劑的核酸分子，以 促成被靶定劑，如本文提供的經修改Rlp毒素變體與靶定 劑的轉澤後化學共辆。例如’可將編％ RIp毒素變體或乾 定劑的核酸分子與編碼連接子多肽的核酸分子融合該連 接子多肽可在表現，可視需要還有在純化RIp毒素及靶定 劑之後連接該RIP毒素與靶定劑。在另一實例中，可修改 編碼RIP毒素變體或靶定劑的核酸分子，使特定的密碼子 突變’在多肽中產生胺基酸，其可用來作為多肽的化學修 改和附接位置，如共軛用的連接子。更明確地說，藉著移 除及/或導入一胺基酸殘基，其含有連接子部分的附接基 團’有可能專一地改裝該多肽，而得以製造更容易與所選 擇之連接子部分共輕的分子（參見’例如美國專利公開案第 20060252690 號）。 H.增加RIP多肽或其共軛物生產的方法 在本文中藉著降低RIP毒素的毒性活性，以便允許宿 主產生增加量的毒性多肽，提供增加重組表現之RIP毒素 或配體-RIP毒素共輛物或其變體生產的方法。在這類方法 201235469 中’可按照在例如上文G章節中的描述，並在—或多個 抑制劑的存在下，產生RIP毒素或其共輛物，如任何 文中提供的。在本文提供之方法中，可使用任何熟諳此蓺 者已知的’或後續鑑認可使RIP毒素失活的RI : 劑。如同在本文其他地方描述的，例稀RIp #素抑制劑 包括，例如RIP-專一的寡核芽酸抑制劑，如rna適體、 專一的抗體，及/或腺嗓吟異構體，包括例如腺嗓呤、4_胺 基対并从❿密心-八⑺及其他類似的異構體❶關於本 文提供之方法’這_ RIP毒素抑制劑典型地是任何藉著靶 定RIP毒素之經保留N-糖普酶活性而抑制毒性活性^。為 了本文之目的，在本文之方法t可使用任_ RIP抑制劑， 如腺嗓吟或其任何類似物，只要該抑制劑展現出對⑽毒 素或其共輕物的抑制活性即可。因此，可在本文之RIP毒 素、配體-RIP毒素共輛物或其變體，包括但不限於經修改 SA1、皂草毒蛋白、地膚子或拜歐丁的蛋白質生產方法 中使用RIP抑制劑，如4-APP。 在本文提供之改善生產方法中，所使用之Rip抑制劑 的選擇’視許多因素而定’包括但不限於重組蛋白質表現 所使用之伯主細胞的選擇，以及欲表現的特定⑽多狀。 ⑽抑制劑對既定RIP多肽的專—性是已知的，或可基於評 估⑽多肽之毒性的例行測定來判定之。在本文中其他地 方描述了 RIP抑制劑專一性的討論。例如，基於已知的專 ϋ針對志f毒素（包括SA1部分、其活性片段及其共 軛物)的表現和改善生產’測試腺嗓呤類似物“Μ，其為 191 201235469 在本文之方法中使用的候選者。特定而言，可在本文之改 善=的方法中使用4_APP’以增加任何本文提供之經修改 SA1夕肽或其任何共軛物，像是 共輛物的產量。 t文提供之任何 可基於贈抑制劑對RIp毒素、配體·⑽毒素共輛物 或其變體之毒性活性的已知影響，憑經驗決定用在多肽表 現方法中之RIP抑制劑的量。重要的是，用在本文之方法 中的RIP抑制劑’本身對料宿主細胞是無毒性的，其毒 :為已知的或可由熟諳此藝者視所選擇之宿主細胞來決 疋。因此’在本文之表現方法中典型地以大約或以O.lmM、 〇.2mM、0.3mM、〇 4mM、η < λ/γ Λ ^ Μ 〇.5mM、〇.6mM、〇.7mM、0.8mM、 〇.9mM、l.OmM、1 5miu、ο η Λ
UmM、2.GmM、3.GmM、4.GmM、5.0mM、 lOmM、15mM、20mM、3GmM、4GmM、5QmM 或更多加入 RIP抑制釗’像疋例如4_App，只要該抑制劑本身對所選擇 之宿主細胞是無毒性的即可。應瞭解所選擇之Rip抑制劑 的濃度可視所選擇之宿主細胞重組表現所使用之條件、 與-亥抑帝J Μ起培養的時間、所選擇之特殊抑制劑， 或欲產生之特疋Rjp毒素或配體-毒素共扼物而改變。 在實例中，可藉著進行劑量-反應實驗，並測定在每 個抑制劑濃度下' # | β 斤表見之蛋白質的量，憑經驗決定RIP抑 制劑的濃度。例如，在本文中之實施例4，描述了這類決定 ，用以產生各種LPM之4_ App最適濃度的例示性實驗，其 :著在漸增浪度之4_App的存在下表現各種LpM之後，藉 著考馬斯藍染色評估其等的表現特徵。如同在實施例4中 192 201235469 舉例說明的，結果顯示在漸增濃度之4_App的存在下，在 不同LPM共扼物之間，在多肽表現的水平上有—此差異。 -欲決定在生產方法中使用之RIP抑制劑的濃度，可進行類 似的實驗，使用任何RIP多肽或其共軛物，以及任何RIP 抑制劑，像是例如4-APP，以決定提供最大蛋白質表現的 RIP抑制劑濃度。例如，在或在大約〖或更多的4_App 下，LPMld以最大水平表現，而在或在大約2 〇mM或更多 的4-APP的存在下，LPM7以最大水平表現。通常，在本文 之方法中，在或在大約2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、 10.OmM或20mM之4-APP的存在下，產生lpm共輛物， 如含有直接或間接與變體4經修改s A1部分連接之趨化因 子配體的那些。 可在以編碼RIP毒素、配體_毒素共軛物或其變體的核 酸轉型很主細胞之前、期間或之後，加入Rjp抑制劑。在 使用誘導劑誘導蛋白質表現的情況下，可在將誘導劑導入 宿主細胞之前、期間及/或之後加入RIp抑制劑。例如，可 在加入誘導劑之前，以單一濃度加入RIp抑制劑。在另一 實例中’可在加入誘導劑之前’以單一濃度加入RIp抑制 劑’並可在與誘導劑培養的期間或之後，以額外的Rlp抑 制劑補充培養基。在某些情況下，可根據所使用的特定表 現系統’在不同階段改變加至該表現系統中的RIp抑制劑 之濃度。例如’如同在實施例4中舉例說明的，在配體-毒 素共輛物最初的過夜和生長期間，以2.〇mM之濃度將RIP 抑制劑4-APP加至以編碼LpM之核酸轉型的大腸桿菌細胞 193 201235469 中，然而，在與誘導劑一起培養的期間，以高達ι〇倍的較 高濃度加入額外的4-AP卜如同在實施例4中舉例說=的= 可視所使用的特定表現系統，將所使用的RIp抑制劑濃度 和投與RIP抑制劑的時間安排最適化。 在本文之改善RIP毒素或其共軛物生產的方法中，可 使用-或多個RIP抑制劑。此外，在本文之方法中亦可使 用其他改善重組蛋白質表現和生產的方法，如任何上述 的。例如，可在有或無RIP抑制劑，如4_App之下，進行 任何在技術領域中已知，已經用以增# RIp多肽或其⑼ 物之表現和生產的方法。 增加蛋白質生產的額外方法 除了藉著在蛋白質表現和生產期間使RIp抑制劑， 如4_APP，增加RIp多狀或配體-毒素共扼物的生產之外， :可使用其他的方法。改善多肽，如本文提供之任何灿 夕肽或其絲物表現和生產的方法，包括在技術領域中已 知的任何方法。視用以產製多肽之表現系統（例如細菌、酵 2菌、哺鶴物、昆蟲、植物料）而使用這類方法，並可 步t諸如表現載體的選擇(例如為了經調節或組成的表 )#主細胞的生長條件或蛋白質誘導參數之類的修改因 :、亦可藉著在技術領域中已知可改善蛋白質產製量的變 匕么針對從宿主細胞中分離所表現之多月大，將如上文提及 方法（例如貊主細胞溶解和蛋白質分離之方法）最適 匕。在下文中討論改善生產之額外方法的範例。 ma ’可藉著各種方法’包括但不限於改變pH值、溫 194 201235469 度、大氣内容（例如氧或二氧化碳 厌，晨度）、培養基内容，句托 滲透性、養分濃度（例如葡葙铵 、 葡萄搪和其他糖類、礦物質和磷酸 鹽或其他離子），或影響宿主生長 我之其他分子的存在（例如抗 生素、抗病毒劑或抗微生物化人榀 土鄉化口物、蛋白質抑制劑等等）， 改變宿主細胞的生長條件。亦 J u改生長條件，以降低抑 制劑分子，如硫酸鹽（其可影塑I " 」和警蛋白質表現）的產生（參見， 例如美國專利第6,686，180號）。 例如，可藉著改變誘導劑（例如IpTG或其他誘導劑分 子、溫度、氧含量等等）的濃度、誘導時間的長度、誘導溫 度、宿主細胞在誘導時的濃度，以及宿主背景對表現水平 的影響，來改變誘導參數。 宿主細胞的選擇亦可影響蛋白質生產的水平。例如， 可使用在遺傳#景上有差異的細菌品彡，其可影響蛋白質 生產。這類差異包括，但不限於在蛋白酶.（例如1〇n和 〇mPT)、重組酶（例如recA)或核酸内切酶（例如endA)上的突 變、改善二硫鍵形成和蛋白質摺疊（例如trxB/g〇r)的突變、 出現與T7啟動基因-駕馭之表現有關的DE3溶素原（例如 LysE或LysS) ’以及影響蛋白質誘導之控制的突變（例如 lacZY或laclq)，或宿主細胞的糖使用。宿主細胞亦可含有 罕見tRNA基因的副本，以改善對在編碼多肽之核酸序列中 之罕見密碼子的認知。 其他改變本文提供之多肽的表現水平的方法，是修改 編碼該多肽之核酸’或改變含有編碼該多肽之核酸分子的 表現載體。如同在本文中其他地方描述且在技術領域中已
195 201235469 知的，許多載體可用來表現本文提供之多肽，包括本文提 供之RIP毒素變體和配體_RIP毒素變體。改善本文提供之 多肽生產的方法，包括以特性挑選載體，像是但不限於適 合高水平表現的強啟動基因、適合控制表現時間安排的可 調節啟動基因、適合持續表現的組成啟動基因或適合長期 表現的穩定啟動基因。使用允許高水平之蛋白質表現和緊 密調節的載體，對於毒性蛋白質，如本文提供之Rip毒素 變體和配體RIP毒素變體的表現是較佳的。這類載體的實 例為在技術領域中已知的，例如ρΕΊΓ載體，如在本文中其 他地方和在實施例中描述的，具有厭氧調節之啟動基因的 載體（例如nirB)和L-鼠李糖可誘導之載體，其受到D_葡萄 糖抑制（pET載體可購自Novagen;Debinski等人，（1991) Mo/ Ce//·則〇/· 1 1:3 :1 75 1 -1 753 ; Debinski 和 Pastan (1992) Ca«cer 及52:5379-5385 ; Debinski 等人（1992)丄 /«ve". 90:405-41 1 ; 〇xer 等人（1991) #wc/ 心油細 19(1 1):2889-2892 ; Giacalone 等人（2006)仏 40(3):355-363) 〇 ' 亦可修改編碼多肽之核酸，在編碼多肽之胺基酸的密 碼子中含有突變’使得在欲在其中表現該多肽之宿主中為 罕見的密碼子突變成在該宿主中較常見的密碼子，不會改 變所編碼之胺基酸。使用對特定宿主而言較高使用率之密 .碼子’可藉著改善多肽之轉譯速率而改善該多肽的生產。 特定宿主，如細菌宿主的密碼子使用頻率，為在技術領域 中已知的，並可用來產製針對編碼本文提供之多肽的最適 196 201235469 化核酸。 ι·測量毒素共軛物之活性的試管内和活體内測定 通常’本文提供之配體-毒素共軛物對—或多個宿主細 胞展現出毒性活性，並㈤展現出—或多個不同的活性，如 經由其等衫並結合細胞表面受體的能力。共㈣本身是 :選的治療劑。若需要，可使用在試管内和在活體内的測 定•選“軛物’以監視或鑑認毒素共軛物的毒性，並挑選 展現出這類活性的共軛物。測試本文提供之任何共軛物的 試管内測’包括任何料共輛物是否對特定之宿主細胞 :靶定組群展現出活性的測定。這類活性包括，但不限於 毒性測定，包括基於細胞的毒性収、受體結合測定、細 胞内化測定和趨化性測定。此外，已知或可設計各種在活 體内的動物模式，崎估特殊毒素在料疾病模式中 響。 1·在試管内的活性測定 a.基於細胞的毒性測定 可針對其對宿主細胞的毒性活性，如起因於其等之 糖苷酶活性，測試本文提供之共軛物。在上文D章節中詳 述了測<4 f性活性的測定，並包括但不限於評估蛋白質合 成的測定、核糖體的脫嘌呤，以及宿主細胞的細胞生長或 活力。例如，為了毒性活性評估所選擇的宿主細胞，可从 疋已知表現經靶定受體的細胞。這類細胞可包括直接獲自 Ί固 尸仔自血液、血清或其他組織來源的那些，或任
已去口 φ J °現細胞表面受體的細胞株。這類細胞包括經活化的 197 201235469 細胞°可在試管内藉著幾個刺激活化細胞，並/或可從患有 疾病或病症（特別是其特徵為經活化之白血球或其他細胞類 型的任何炎性疾病或病症）之個體中直接獲得細胞。可在毒 性活性測定中測試之細胞類型的實例包括，但不限於任何 免疫細胞’包括但不限於單核細胞、巨噬細胞（包括肺泡巨 里、·田也】、神經膠質細胞、庫弗細胞）、樹突細胞（包括未成 熱或成热的樹突細胞或朗格漢斯細胞）' Τ細胞（包括CD4 陽性的’像是但不限於Thl及/或Th2細胞，或CD8陽性的）、 B細胞、嗜酸性白血球、嗜鹼性白血球、肥大細胞、自然殺 手（NK)細胞、嗜中性白血球和内皮細胞，或其經活化形式。 其他可用以測試配體毒素共輛物之毒性的細胞’包括例如 癌細胞或癌細胞株，如U251、HT-29或THP-1細胞。如同 上述’例如可藉著釋放ATP至培養基中的能力、藉著細胞 還原致命染料MTT的能力，及/或經由排除染料錐蟲藍的能 力’判定細胞的細胞存活（或細胞死亡）。 b_受體結合測定和内化 設計含有經修改SA1部分的配體-毒素共軛物，如任何 趨化因子毒素共軛物，例如任何本文提供之LPM，以靶定 在一或多個經靶定之宿主細胞上的細胞表面受體。可藉著 評估毒素共軛物與細胞的結合，直接評估毒素共軛物與這 類細胞表面受體的結合。在某些實例中，可判定毒素共輕 物與單核細胞、巨嗤細胞（包括肺泡巨嗟細胞、小神經膠質 細胞）、T細胞（包括Th 1和Th2細胞）、b細胞、嗜酸性白 灰球、嗜鹼性白血球、樹突細胞、庫弗細胞、肥大細胞、 198 201235469 自然殺手（NK)細胞、嗜中，吨& & & ) a甲f生白血球和内皮細胞的結合。若 需要，可在進行結合實驗之前，先利用任何已知的活化劑 活化細胞，以便誘導受體的表現，就像料在㈣疾病和 病症中觀察到，發生在炎性和病原性條件下的。受試的細 胞可以是細胞株或衍生自任何適當捐贈者的原始細胞，從 捐贈者中直接分離或在誘導適#細胞表現型的條件下長期 培養。在某些實射’可使用競爭性測定，利用同族的未 經共輛之配體，評估與配體比較之毒素共輛物的活性。例 如，若測試毒性共軛物LPMld(含有與經修改sai共軛之趨 化因子MCiM)，則可在競爭性測定中使用單獨的Mcp卜 在Λ例中，可藉著以任何已知的可偵測劑，像是但 不限於螢光部分、放射性部分或標籤多肽(即㈣、ms標 籤、myc標籤）標示毒素共軛物，評估該共軛物與已知表現 特定細胞表面受體之宿主細胞結合的能力。例如，可利用 螢光部分，如螢光素異硫氰酸鹽（FITC)標示毒素共扼物。可 將漸增濃度的經FITC_標示之毒素共軛物加至任何想要的 細胞類型中，並在4°C下培養經指定的時間，例如3〇分鐘 或1小時。在沖洗細胞以移除任何未經結合的毒素共軛物 後，可藉著流式細胞技術測量結合螢光的細胞。在某些情 況下，可藉著比較配體對配體毒素共軛物之結合親和力， 藉著將毒素共軛物的濃度除以在流式細胞測量中得到等於 平均螢光值之配體濃度，判定毒素共軛物的結合親和力（參 見例如 Thompson 專人（200 1) 呈，14: 1035-1041)。此外，若需要，可藉著比較在斗^對37它下的 199 201235469 螢光，評估毒素共軛物被細胞内化的能力。可調整培養時 · 間，以確保該毒素共軛物在37。(：培養的期間對細胞是無毒 .·_ 性的。其他評估結合和内化的方法為熟諳此藝者已知的，. 並包括但不限於使用放射性、基於細胞的ELISAs，以及其 他的這類測定。 c·趨化性測定 可使用傳統的趨化性測定，就其等調節細胞趨化性的 能力，測試毒素共輒物，特別是任一或多個含有經修改sai 部分的趨化因子毒素共軛物，如本文提供之任何LpM共軛 物。這類判定與趨化因子結合同族之趨化因子受體的能力 有關。在這類測定中，可藉著趨化因子引起白血球，包括 經活化白血球的移行，並藉著使用例行的B〇yden小室結構 (參見例如，McDonald 等人（2001) IDrugs, 4:427- 442)計算 移行通過濾紙的細胞數目來測量之。例如，可將任何想要 的細胞，包括但不限於單核細胞、巨噬細胞（包括肺泡巨噬 細胞、小神經膠質細胞）、τ細胞（包括Thl和Th2細胞）、B 細胞、嗜酸性白血球 '嗜驗性白▲球、樹突細胞、庫弗細 胞月A 田月匕自然殺手（NK)細胞、唁中性白▲球和内皮 細胞放在經修改之Bc)yden小室的上方孔内。這類細胞可以 疋細胞株或可以是得自任何適當捐贈者的原始細胞，直接 從捐贈者中分離’或在誘導適當細胞表現型的條件下長期 。養的Boyderi小室的下方小室典型地含有含配體趨化因 子的培養基。在某些情況下，某些細胞在組成上是有活性 的’不需任何特定的外源刺激便可移行。這類細胞包括， 200 201235469 例如ΤΗΡ-l細胞。因此，若在趨化性測定中使用ΤΗρ_ι細 胞，便不需要外源的趨化因子，並可比較趨化因子共軛物 的影響，活性細胞經由移行出現在下方小室中，而無活性 的細胞仍留在上方小室中（McD〇nald等人（2〇〇1)①⑺队 4.427 442)。可利用各種濃度的趨化因子毒素共辆物處理
Boyden小至的上和下孔之一或兩者。在從分鐘、工小時、 2小時、5小時、10小時、15小時、24小時或更久的時間 内培養之後，可決定在該室各孔中（或出現在濾紙上）的細胞 數目。可分別判定在每個個別室中之趨化因子毒素共軛物 對細胞的影響，並與不含毒素共軛物的對照組孔相比較。 在小室的一或兩孔中沒有細胞，及/或在下方小室中沒有移 行活性細胞，代表該趨化因子毒素共軛物是具有對抗目標 細胞族群之活性的。 下 可使用本文提供之共軛物，如任何與經修改sai或其 '舌性部分共輛之多肽，包括例如任何含有經修改SA1部分 之本文提供的LPM共軛物，來治療其中涉及或牽連趨化因 子及，或其受體的疾病。在本文中描述適合特定疾病的特殊 共:物1需要，熟諳此藝者可利用已熟知的模式測試共 軛物，以證實或鑑認共M對 fh iin Μ 模式為已熟知的。這類模式包括任何炎性疾病的動物 表及經活化之白血球，或在某些㈣狀態中 體-毒f i因子又體之細胞的疾病，在本文中考慮欲利用配 母〜、軛物來治療之。在這類動物模式中測定毒素共軛 201 201235469 物之活性’可證實活性’並/或鑑認適合用來治療本文考慮 之特疋疾病或病症的那些毒素共輕物。 亦可在其他共軛物已經用過的疾病模式中，測試本文 提供之配體-毒素共輕物’包括任何含有經修改S a 1部分之 LPM共軛物，像是例如老鼠異種移植模式，以鑑認抗腫瘤 活性（參見，例如 Beitz 等人（1992) Cwcer 52: 227-230 ’ Houghton 等人（1982) Λα. 42:535-539 ; Bogden 等人（1981) C<2/2cer(Philadelpliia) 48:10-20 ;
Hoogenhout 等人（1983) Ιηί·丄 Radiat. 〇加0!.，Bi〇r Phys 9.871-879，Stastny 等人（1993) Cancer 53:5740-5744)。 為了哺乳動物之治療而挑選候選者的動物模式，為已 熟知的’並有許多經公認的模式。此外，亦已經證實經活 化免疫細胞在這些疾病狀態中的角色。這類疾病和病症的 例示性模式，包括但不限於在以下討論中的那些。 a.脊髓傷害（SCI) 測試並證實本文之共軛物在治療SCI上之活性的模 式，為熟諳此藝者已知的。例示性參考文獻提供並使用sci 之動物模式，其可用來測試配體·毒素共軛物，如含有經修 改SA1部分之LPM共軛物，包括但不限於在本文中陳述的 下列參考文獻。
Bennett等人（1999)，在有薦椎脊髓傷害之大鼠中的痙 攣性（Spasticity in rats with sacral spinal c〇rd 叫町），义 #⑽16:69-84，提供肌肉痙攣性的大鼠模式，其為 最低的破壞，不影響膀胱、腸或後肢運動功能。在S2薦椎 202 201235469
伸肌痙攣而盤捲尾巴。在痙攣期間移動，經 如同利用力和肌電圖紀 自發或反射引起屈肌和 移動，經常在尾巴末端 引起陣攀。尾巴的毛和皮膚對輕觸是極度反射過強的，在 碰觸時很快縮回，且在此時可藉著重複碰觸尾巴表面而夾 帶陣攣。在使脊髓損傷之前和之後測量分段尾巴的肌肉反 射，例如Hoffman反射（H-反射），並在横切之後2週明顯增 加。這些結果指出薦椎脊髓傷害大鼠在尾巴肌肉中發展出 的痙攣性症狀，具有與在患有脊髓傷害之人類肢體肌肉中 看到的那些類似的特徵，並因此提供了研究該病症的便利 製品。
Taoka等人（1998)，在大鼠中的脊髓傷害（Spinal c〇rd injury in the rat)，Prog A^ewr ο Wo/ 56:341-58，提供在大鼠中 創傷引起之脊髓傷害的病理學機制之回顧，以進一步發展 新賴的治療策略。由創傷引起之脊髓傷害是最初物理損傷 的結果，而後續漸進的傷害過程涉及各種病理化學事件， 導致組織破壞；因此’後者的過程應該是藥理學治療的目 標。最近，已經顯示經活化的嗜中性白血球涉及大鼠之脊 髓·傷害的晚期過程。經活化的嗜中性白血球藉著釋放炎性 203 201235469 介體，如嗜中性白血球彈性蛋白酶和氧自由基，傷 細胞。經活化之嗜中性白血球與内皮細胞的料，亦可处 在内皮細胞傷害"分演-“。該内皮細胞傷害可能轉： 引起微循環的擾亂，導致脊髓局部缺血。有些抑制嗜中性 白a球活化的治療劑，減輕了在脊髓傷害之大鼠模式中觀 察到的運動擾亂。甲潑尼龍（MPS)和GM1神經節苦脂，為 目前在臨床上可用來治療急性脊髓傷害的唯二藥學製劑， 在該大鼠模式中不抑制嗜中性白血球活化。總而言之，這 些觀察提高了將其他抑制嗜t性白血球活化的藥學製劑與 MPS或GM1神經節芽脂倂用，可能在治療人類之創傷性脊 髓傷害上有協同作用的可能性。
Carlson等人（199.8)，在衝擊傷害之後，脊髓的急性炎 性反應（Acute inflammat〇ry resp〇nse in 咖㈤ following impact injury)，心心〇/ i51:77 88，在挫傷大 鼠之τιο脊髓（i〇克重’ 50毫米落下）之後4、6、24和48 小時，檢查嗜中性白血球和巨噬細胞/小神經膠質細胞的前_ 後为布。耆中性白jk球優先位在壞死區，利用髓過氧物酶 活性的測定（MPO)，隨著時間經過測量，在24小時達到高 峰。最尖銳的MPO活性高峰位在受傷前後4毫米之間。以 對抗ED 1和OX-42的抗體，使巨嗟細胞/小神經膠質細胞顯 影。在24小時内，出現許多具有吞噬細胞形態學的細胞， 在4 8小時有較高的數目。這些細胞主要位在灰質和脊髓背 索白質内。在離病灶前後6毫米處，細胞的數目逐漸減少。 OX-42染色亦顯示反應性小神經膠質細胞，具有純的突起， 204 201235469 特別是在遠離病灶的層面，巨噬細胞/小神經膠質細胞的數 目’顯然與在每個層面組織損傷的量有關。 在老鼠的實驗性脊髓傷害後，前-炎性細胞介素和趨化 因子mRNA的表現：就地雜交研究，Barth〇ldi等人（1997) 五以《/ 9:1422-38，描述前-炎性和化學吸引性細胞 ;ι素在老鼠貫驗性脊髓損傷模式中之表現模式的研究。就 地雜交顯不在受傷後第丨個小時内，向上調節前炎性細胞 介素TNFa和IL-1，以及趨化因子ΜΙρ_1α和Μΐρ ΐβ的轉 錄本。在此早期，前-炎性細胞介素的表現，受限於在病灶 周圍區域中的細胞，或許是居留CNS細胞。而TNFa在極 窄的時間窗中表現，可在第二期在多形核顆粒球的亞組中 偵測到IL-1，該細胞在大約6小時移動進入脊髓内。在大 約24小時，以普遍化之方式在整個脊髓的灰質中表現趨化 因子NIP la和-β的化息，並在受傷後4天，再度受限於在 病灶位置的細胞浸潤》該數據表示居留的CNS細胞，大多 數或許是小神經膠質細胞，而非周圍炎性細胞，{細胞介 素和趨化因子mRNAs的主要來源。觀察到經限定的細胞介 :模式’表示炎性事件在發生病灶之後，緊緊地控制⑽。 前-炎性細胞介素和趨化因子信息的極早表現，可代表招募 炎性細胞的重要元件。
在慢性實驗性脊髓傷害中的血管形態測量分析：血管 過多和功能的恢復，Blig"人(1991W 1〇6··Ι58-74，基於壓迫一 模式，其為先前描述的。 固疋厚度，提供天竺鼠的脊髓創傷 在11隻經麻醉的成年天竺鼠中產 205 201235469 2胸索的壓冑’並使用連續的行為測試和病灶的形態測 量監視結果2.3個月。該報告描述了在脊髓之血管供應:的 改變，基於通過病灶中心之]微米塑膠横切片的光；顯微 鏡刀析。在這些病灶中的平均血管密度約為在正常未受傷 脊髓之相當區域中發現的兩倍，I白質的血管過多從病灶 中心往頭和尾延伸至少4節脊椎。毛細血管直徑分布明顯 改變為較大值，並在大多數毛細企管和前_及後·毛細也管周 圍有大型血管周隙。血管過多的程度與傷害的整體嚴重性 無關’但在受傷後第-天到8週之間看到在白質外側彻 微米中的血管密度與在病灶下神經學功能的二次喪失之間 有明顯的正相關。這些數據代表病灶的血管過多，與在脊 髓傷害中的二次病理學機制_可能是炎性反應有關，相對上 與原始的機械傷害較無關，但與功能的喪失和恢復有較密 切的關聯。 在挫傷之後，增加了脊髓中之興奮毒素（exch〇t〇xin)喹 啉酸的含量，：81丨§1^等人（1993)，5"^心5 632:3 14_6，顯示 k〖生吞嗑細胞的產物是對脊髓創傷後之二次病理學的可能 貢獻者，並提出在短暫壓迫傷害之後5天，在成年天竺鼠 之下胸脊趙中’定量神經毒素及經活化巨噬細胞之產物， 喳啉酸（QUIN)含量的研究。在受傷位置（T13)處，升高組織 中QUIN含量（>10-倍），伴隨有按比例增加之吲哚胺_2,3_二 氧化酶的活性（>2-倍）和L_犬尿胺酸的濃度（>2 5_倍）。相反 的，與對照組，即頸部脊髓（C2)和軀體感覺皮質相比較，檢 查兩個未受傷的區域，沒有發生明顯的改變。 206 201235469 邱缺血春S等人(,1994)’抑制嗜‘中性白血球黏連不能防止局 ㈣血脊髓傷害（InhibitlQn Qf neutrGphii a—^ _ Γ二 1lschemic spinal c°rd injury)，“ 心⑽ ^ 10队8’依賴動物模式，顯示可在暫時主動脈閉合（由於 在再’扭注期間脊髓的初期局部缺血或傷害)之後發生截癱。 在局。p缺i/再灌注的動物模式中，有可能㈣中性白金球 部分調節再灌注傷害的證據。在兔子中，在脊髓局部缺血/ 再/瞿庄時評估嗜中性白血球料阻斷老鼠單株抗體（祕 6〇_3)的效力。II著腎下主動脈的氣球導管閉合，完成脊髓 局：缺血。將神經學評估分成正常的、有部分神經孥缺陷 或70全癱瘓之等級。使用以體感覺誘發電位的電生理學監 視，決定閉合的最佳時間長度。以2毫克/公斤的靜脈内Μ 60.3(n-8)或生理鹽水溶液（n = 9)隨機處理動物，不讓研究者 头道疋那種處理。平均閉合時間在組別之間沒有差異（對 照組32.7±3,6分鐘對MAb 32 4±6〇分鐘）。五隻（55%)以生 理鹽水處理的和四隻（50%)以MAb 6〇 3處理的動物變成截 癱的。一開始有後躯輕癱的動物都在24小時内進展成弛緩 性截癱。研究的結論是在暫時主動脈閉合之後的脊髓傷害 與嗜中性白血球的CD11/CD18糖蛋白複合體無關。在該背 景中的傷害可發生在局部缺血期間，並因此可能不依賴嗜 中性白血球或再灌注。
Liu等人（1997) ’在創傷性脊髓傷害之後的神經元和小 神經腾·夤細胞之細胞;周亡（Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury)，《7 iVeWr〇lSCZ· 17:5395-406，檢查 207 201235469 經歷輕微到中等嚴重度之創‘傷性損傷之大鼠的脊髓。在輕 微重物落下衝擊〇〇克重，落下6.25毫米)之後的數分鐘内， 在直接衝擊區中的神經元顯示喪失了細胞質的尼氏物質 (NiSSlSUbStanCeS)。在接下來的7天内’該病灶區擴大並成 穴。在受傷後4_24小時’注.意到末端的脫氧㈣酸基轉移 酶⑽)-介導之脫氧尿苦三碌酸_生物素裂縫末端標示 (TUNEL)-陽性的神經元主要限制在肉眼病灶區，在受傷後8 小時出現最大量。TUNEL-陽性之神經膠質細胞出現在研究 中的所有階段，從4小時到14天，在受傷後24小時在病 灶區中出現最大量。在受傷7天後，在病灶周圍的白質中 注意到第二波TUNEL-陽性的神經膠質細胞，並延伸遠離病 灶中心至少數毫米。藉著電子顯微鏡，並藉著以
Hoechst33342染料的核染色，然後檢查從病灶位置製備的 DNA，證明細胞凋亡成為機制。此外.，在12 5毫米重物落 下損傷之後，立刻開始重複腹腔内注射放線菌酮，在4週 後評估，在脊髓損傷和運動功能障礙之組織學證據上產生 實際的降低。該數據支持由輕微到中等嚴重度之大鼠脊髓 的創傷性損傷引起之細胞凋亡，係依賴活性蛋白質合成以 促成神經元和神經膠質細胞死亡，以及神經學功能障礙的 假設。 在實施例8中陳述LPM共軛物在脊髓傷害模式中的例 不性結果，其顯示LPMld在脊髓傷害模式中的例示性結 果°亦可以類似的測定測試其他的LPM，如任何在本文中 提供之含有與經修改SA1共軛的趨化因子。這類結果證實 208 201235469 可使用LPM作為治療脊髓傷害的候選治療劑。 b.神經變性疾病，包括創傷性腦外傷和猝發 測4和證實本文之共輥物治療神經變性疾病，如創傷 性腦外傷和猝發之活性的模式，為熟諸此藝者已知的。提 ί、例不性參考文獻，其提供並使用神經變性疾病，如創傷 性腦外傷和猝發的動物模式。可使用這類模式證明或一 配體-毒素共輛物，如含有經修改SA1部分之Lm共輛物， 包括但不限於在本文中陳述的下列參考文獻。
Ghirnikar等人（1996)，在大鼠刺傷性腦外傷中的趨化 因子表現（Chemokine expressi〇n in 加 _ w〇und 心如 injury)，J 咖·細46:727_33，描述對成年哺乳動物中 樞神㈣統（⑽）的創傷性外傷’結果產生反應性星狀神經 膠質細胞增生（astrogli〇sis)，以及血源性細胞移行至受傷神 經組織内。承認趨化因子為在受傷後發生之炎性改變的介 體。已經證實MCP]在大鼠腦部創傷中的表現（Berman等 人（1996) J 156:3017_3〇23)。關於機械傷害，使用 刺傷模式，研究兩個其他的趨化因子：RANTES和Μιρ_ιρ 在大鼠腦部的表現。刺傷傷害之特徵為廣泛的神經膠質細 胞增生和血源性細胞的浸潤。免疫組織化學染色，顯示在 受傷的腦中出現RANTES和MIP_丨β。在壞死組織中散布地 表現RANTES和MIP-Ιβ兩者，並早在受傷後i天㈨“）便偵 測到。雙重-標示的研究顯示MIP_ip，由在靠近病灶位置的 反應性星狀細胞表現’ RANTES則否。此外，亦在受傷部位 之巨噬細胞上偵測到MIP-Ιβ染色。趨化因子的最初表現， 209 201235469 與在受傷CNS中出現炎性細胞密切相關，表示ranTES和 MIP-1 β可能在創傷性腦外傷的炎性事件中扮演一角色。該 研究亦證實在大鼠CNS受傷後，在反應性星狀細胞中表現 MIP-Ιβ 〇
Wang等人（1998) ’在大鼠中腦動脈的永久閉合 干擾素可誘導之蛋白質10在局部缺血之皮質中的延長表現 (Prolonged expression of interferon-inducible protein-10 in ischemic cortex after permanent occlusion of the middle cerebral artery in rat)，㈣ 71:U94_2〇4，在大鼠中 月®動脈閉合之後，藉著北方分析，調查Ip_丨〇在局部猝發中 的角色，並研究IP-10 mRNA的暫時表現。在局部猝發後的 IP-lOmRNA表現證實特有的雙相特徵，在中腦動脈閉合之 後，早期在3小時有明顯的增加（超過對照組4 9_倍； Ρ<0·01)，在6小時的高峰水平（14 5_倍；p<〇 〇〇1)，並在局 部缺血傷害之後1G-15天有第二波的誘導（第㈢口 Η天分 別有7.2-和9.3-倍的增力σ . τλ<·λλλι、 町曰加，Ρ<0.001)。就地雜交證明引起 IP-10 mRNA的表現，並萌子甘六& #心 .·"貝不其在局部猝發後的空間分布。 免疫組織化學研究證實在局部缺血帶之神經元（Μ小時） 和星狀神經膠質細胞(6小時至,丨15天)中表現㈣肽。證實 ΠΜ0對C6神經膠質細胞的劑量依賴性之趨化作用，並提 咼大鼠小腦顆粒神經元的附接。 7 ^ 數據指出局部缺血誘導 IP -10 ’其在局部猝發後的延長白 贲白血球招募、星狀細胞移行/ 活化和神經元附接/長出中扮演多效的角色。
Galasso等人(1998)，Ae丄 生大鼠中，興奮毒性腦損傷 201235469 刺激了趨化因子受體CCR5的表現（Excitotoxic brain injury " stimulates expression of the chemokine receptor CCR5 in J neonatal rats)，«/Ραί/ζο/ 153:1631-4 0’ 在出生後 7 天的大 鼠中’評估在海馬内注射NMDA對CCR5表現的衝擊《逆 轉錄聚合酶連鎖反應顯示在出現病灶後24小時，增加了海 馬中CCR5 mRNA表現，且就地雜交分析證實在已發生病灶 之海馬和鄰近組織中表現CCR5 mRNA。西方墨點分析證實 在出現病灶之後32小時的海馬組織萃取物中增加了 CCR5 蛋白質。補體免疫細胞化學研究鑑認出浸潤性小神經膠質 細胞/單核細胞和受傷的神經元，為主要的CCR5-免疫反應 性細胞。這些結果提供了急性興奮毒性損傷調節CCR5表現 的證據。 vannucci等人（1999)，圍產期之缺氧局部缺血腦損傷 的大鼠模式（Rat model of perinatal hyp〇xic_ischemic brain damage)，及以55:1 58 63，使用察知圍產期缺氧_ 局部缺企腦損傷之發病機制和管理的幼年大鼠模式。該模 式需要結紮總頸動脈，隨後伴隨著全身性缺氧。該損害產 生永久的缺氧局部缺血腦損傷，侷限於大腦半球同側至頸 動脈閉合處。使用該模式進行調查，以鑑認防止或使缺氧_ 局部缺灰腦損傷減至最少的治療策略。 c.神經變性疾病_阿茲海默氏症（AD) 、J式並戍貫本文之共輕物治療神經變性疾病，如阿茲 海默氏症（AD)的模式為熟諳此藝者已知的。提供這類疾病 的例示性動物模式。可使用這些模式，以證明或鑑認共輕 211 201235469 物對於治療神經變性疾病，如阿茲海默氏症的用途，其可 用以測試配體-毒素共輕物，如含有經修改S a 1部分之LPM 共輥物’包括但不限於在本文中陳述的下列參考文獻。 Hauss-Wegrzyniak等人（1998)，大鼠的慢性神經炎性反 應’再現阿兹海默氏症的神經生物學組份（Chr〇nic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology 〇f Alzheimer's disease), Brain Res 780:294-3 03，描述炎性過程在與阿茲海默氏症有關之變性 變化和認知損傷的發病機制中扮演的角色，並描述使用得 自革蘭氏陰性細菌之細胞壁的脂多醣（Lps)，在年輕大鼠的 腦中產生慢性全面性炎性反應。將Lps(〇 25微克/小時）長 期輸液至第四腦室，持續4週，產生⑴增加神經膠質原纖 維酸性蛋白質-陽性的經活化星狀細胞和〇χ_6_陽性之反應 性小神經膠質細胞在整個腦中的分布，而最大的增加發生 在顳葉，特別是海馬中，（2)在基底.前腦區和海馬内，誘導 介白素-1β、腫瘤壞死因子_α和卜澱粉樣前驅物蛋白質 mRNA含量，（3)海馬CA3錐體神經元的變性，和⑷在空間 =憶上的明顯損傷’藉著在迷宮上降低自發變換行為來判 定。 許多其他的阿兹海默氏症模式，包括經遺傳設計以表 現人類基因之突變形式的類，該基因係在患有早發性 阿兹海默氏症之家族中涉及Αβ的產生，為熟諳此藝者已去 並可利用的。 筑有巳知 d.多發性硬化症 212 201235469 多發性硬化症（MS)是中樞神經系統（CNS)的炎性疾 病’特徵為局部化的脫髓鞘區域。對骨髓磷脂抗原的免疫 反應助成該疾病過程。MS是異種的慢性自體免疫疾病，其 特徵在於明顯的炎性反應、寡樹突細胞骨髓磷脂鞘的喪 失、神經變性、神經膠質細胞增生和軸突喪失（參見，例如 Bruck，W. & Stadelmann，C. Neurol Sci 24 附錄 5，S265-7 (2003) ’ Bruck，W. & Stadelmann，C.，Curr Opin Neurol 18， 221-4(2005) ； Fox, E.J., Neurology 63, S3-7(2004) ； Fox, R.J. «& Ransohoff, r.m, Trends Immunol 25, 632-6 (2004)；
Hendriks, J.J., Teunissen, C.E., de Vries, H.E. & Dijkstra, C.D. Brain Res Brain Res Rev 48, 1 85-95 (2005) ； Prat, A. & Antel, J., Curr Opin Neurol 18, 225-30(2005) ； Liu, L., Callahan, M.K., Huang, D. & Ransohoff, R.M., Curr Top Dev Biol 68，149-8 1(2005) ; Mahad，D.等人，Ernst Schering Res Found Workshop, 59-68(2004))。該疾病在北美影響大約 400,000人，而在全世界影響250萬人（參見，例如Cross，A.Η. & Stark, J.L., Immunol Res 32, 85-98(2005) ； Hafler, D.A., J Clin Invest 113, 788-94(2004) ； Sindern, E., Front Biosci 9, 457-63(2004);和 Steinman, L.，Neuron 24，51 1-4 (1999)) 〇 正常在20到40歲之間發病，但有非典型MS之形式，包括 在早期（1 8歲以下）和晚期（5 0歲以上）發病的案例，其提供不 同的預後和診斷挑戰（參見，例如Krupp, L.B. & Macallister， W.S.，Curr Treat Options Neurol 7， 191-199(2005);
Martinelli, V., Rodegher, M., Moiola, L. & Comi, G., Neurol 213 201235469
Sci 25 附錄 4, S350-5(2004) ; Stadelmann，C· & Bruck, W.，
Neurol Sci 25 附錄 4, S319_22(2〇〇4) ; Stadelrnann，c 等人， Brain 128, 979-87(2005)) 〇 大約85°/。的普通案例開始是受損之感覺調節的復發-緩 解事件，包括受損的視力、暫時失明和運動協調》這可能 投降至二次進行性疾病。其他形式的MS稱為原發性進行性 MS。復發持續出現，直到神經變性期接管為止（參見，例如
Bruck，W. & Stadelmann，C.，Neurol Sci 24 附錄 5, S265-7 (2003) ； Bruck, W. & Stadelmann, C., Curr Opin Neurol 18, 221-4(2005)； Fox, E.J., Neurology 63, S3-7 (2004)； Fox, R.J. & Ransohoff, R.M., Trends Immunol 25, 632-6(2004)； Steinman, L.，Curr Opin Immunol 13，597-600(2001)；和 Zaffaroni，M.，Neurol Sci 24 附錄 5，S279-82(2003))。在 MS的病因學中涉及免疫、遺傳和環境（如病毒、細菌）組份 (參見，例如 Zaffaroni，M·， Neurol Sci 24 附錄 5, S279-82(2003))。
MS病理學的特點是遍布於CNS中的白質斑塊或病 灶，包括脊趙（參見，例如 Bruck，W. & Stadelmann，C., Neurol Sci 24 附錄 5，S265-7(2003) ; Mahad，D.等人，Ernst Schering Res Found Workshop, 59-68(2004)； Fawcett, J.W. & Asher, R.A.，Brain Res Bull 49，377-91(1999);和 Zhang，Y. 等人，J Clin Immunol 25，254-64(2005))。在慢性主動性病灶 中最常見的 白血球群是經活化的 CCR2+/CCR3+/CCR5+/CXCR3+巨噬細胞。其他細胞包括B 214 201235469 細胞、τ細胞和小神經膠質細胞，具有類似的受體表現模 式。在星狀細胞周圍的病灶和參與的白血球群中產生這些 受體的同族配體（參見，例如Banisor，I.，Leist，Τ.Ρ. & Kalman, B., J Neuroinflammation 2, 7(2005) ； Cartier, L.,
Hartley，〇.，Dubois-Dauphin，M. & Krause, K.H·，Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42(2005) ； Galimberti, D., Bresolin, N.
& Scarpini, E.，Expert Rev Neurother 4, 439-53(2004);和 Putheti，P.等人，Eur J Neurol 10, 529-35(2003))。一旦在 CNS 白A球群中經由有害物質，包括活性氧和氮物種；MMP ; 白二浠的武裝，引起免疫傷害；便產生自身抗體，並釋放 前炎性細胞介素和趨化因子。這轉而引起軸突傷害、病灶 形成’以及寡樹突細胞和神經元細胞死亡。 1)EAE模式 在EAE模式中，在老鼠中引起脫髓鞘疾病。經活化之 單核細胞、巨噬細胞、小神經膠質細胞和τ細胞成為損傷 組織的原因。雖然在該情況下，該模式為急性的（像慢性進 行性MS，與復發-缓解相反），但在本質上，在惡化之前在 那些白血球群上有CCR2(例如，LpMlk受體；在seqid NO:44中陳述了 LpMld多肽的胺基酸序列）的向上調節、 CNS的浸潤和疾病。因此，該模式證明治療可應用在所有 類型的MS上。例示性參考文獻提供並使用多發性硬化症的 動物模式，其可用來測試配體_毒素共輛物，如含有經修改 S A i部分之LPM共輛物’包括但不限於—等人（} $叫細 胸4:78-83，其描述使用屬齒類模式，實驗性自體免疫腦 215 201235469 脊髓炎（ΕΑΈ)來研究MS。在實施例1 〇中提供了顯示本文提 供之共軛物在ΕΑΕ模式中有效的數據。 2)涉及MS的白血球 在許多研究中，巨噬細胞和小神經膠質細胞在人類MS 之病理學中和在ΕΑΕ模式中是不可或缺的。dc、MaC和B 細胞亦扮次一角色（Cross, A.Η. & Stark，J.L.，Immunol Res 32，85-98(2005) ’ Zhang, Y.專人，j ciin Immunol 25, 254-64(2005)» Mouzaki, A., Tselios, T., Papathanassopoulos, P., Matsoukas, I. & Chatzantoni, K., Curr Neurovasc Res 1, 325-40(2004) ; Heppner， F.L.等人， Nat Med 11, 146-52(2005)，Huitinga, I.等人，Clin Exp Immunol 100, 344-51(1995)，Polfliet，M.M.等人，J Neuroimmunol 122, 1-8(2002) ; Behi，M.E_ 等人，Immunol Lett 96，1 1-26(2005); Theoharides, T.C. & Cochrane, D.E., J Neuroimmunol 146, 1-12(2004) ； Chavarria, A. & Alcocer-Varela, J., Autoimmun Rev 3， 251-60(2004) ； Kouwenhoven, M.等人，
J Neuroimmunol 126，161-71(2002) ; Greter，M.等人，Nat Med 11，328-34 (2005))。在EAE侵襲之前，小神經膠質細 胞被活化並增殖（參見，例如Ponomarev, E.D.，Shriver，L.P.， Maresz, K. & Dittel, B.N., J Neurosci Res 81， 374-89(2005))。小神經膠質細胞和巨噬細胞失活，且T和 MNP細胞耗盡，改善了 EAE的嚴重性（參見，例如Heppner， F.L.等人，Nat Med 1 1，146-52(2005) ; Huitinga，I.等人，Clin Exp Immunol 100，344-5 1(1995) ; Polfliet，M.M.等人，J 216 201235469
Neuroimmunol 122, 1-8(2002) i Rajan, A.J., Asensio, V.C., Campbell, I.L. & Brosnan, C.F., J Immunol 164, 2120-3 0(2000) ； Rajan, A.J., Klein, J.D. & Brosnan, C.F. J Immunol 160, 595 5-62( 1998) ; Bauer, J.等人，Glia 15， 437-46(1995) ； Kotter, M.R., Zhao, C., van Rooijen, N. & Franklin，R.J.，Neurobiol Dis 1 8，1 66-75(2005);和 Tran，E.H·， Hoekstra, K., van Rooijen, N., Dijkstra, C.D. & Owens, T., J Immunol 161，3767-75(1998))。研究已經顯示周圍巨噬細胞 對於其等的T細胞活化和EAE之發展是很重要的（參見，例 如 Polfliet, M.M.等人，J Neuroimmunol 122，1-8(2002); Deloire，M.S.等人，Mult Scler 10, 540-8(2004) ; Imrich，Η. & :Harzer, K., J Neural Transm 1 08, 379-95(2001) ； Raivich, G. & Banati，R.，Brain Res Brain Res Rev 46，261-81(2004))。 在MS患者中，利用美羅華（Rituxan)(抗-CD20 mAb)耗盡B 細胞，結果產生明顯的臨床改善（參見Stuve, 〇.等人，Arch
Neurol 62，1620-3(2005))。在 EAE 中耗盡 PMN，抑制了該 疾病的效應期。PMN在MS患者中，表現高水平的數個細 胞-表面抗原’其與疾病的惡化有關聯（參見，例如Mcc〇ll，
S.R,等人，J lmmun〇i 161，642l-6(1998); Ziaber，J.等人， Mediators Inflamm 7, 335_8(1998))。老鼠研究指出 cns PMN 是反映骨髓磷脂和佐劑抗原之T細胞的有效抑制劑，並在 MS男性患者中報告了自體免疫嗜中性白血球減少的最新案 例（Kozuka，Τ·等人，Intern Med 42, 102-4(2003);和 Zehntner， s.p.等人，j immunol 174, 5124_31(2005))。 217 201235469 經高度活化的小神經膠質細胞、血管周圍的MNP和浸 潤性MNP在MS中扮演數個角色。除了其等藉著釋放有害 物質的炎性破壞角色之外，其等對浸潤性T細胞提交抗原， 提升了骨髓磷脂專一的T細胞反應，更進一步經由趨化因 子招募T細胞和巨嗤細胞（參見，例如Deng, X. & Sriram，S.， Curr Neurol Neurosci Rep 5，239-44(2005) ; Behi，M.E.等人， Immunol Lett 96，1 1-26(2005) i Raivich, G. & Banati, R., Brain Res Brain Res Rev 46, 261-81 (2004) ； Nelson, P.T., Soma, L.A. & Lavi, E., Ann Med 34, 491-5 00(2002) ； Zhang, S.C., Goetz, B.D., Carre, J.L. & Duncan, I.D., Glia 34, 101-9(2001)； Izikson, L., Klein, R.S., Luster, A.D. & Weiner, H.L.，Clin Immunol 103，125-3 1(2002))。巨嗜細胞亦涉及 MS中之變性的病理學。細胞浸潤與在MS病灶中的軸索喪 失有關（參見，例如 Hendriks，J.J.，Teunissen，C.E.，de Vries， H.E. & Dijkstra, C.D., Brain Res Brain Res Rev 48, 185-95 (2005))。吞嗤細胞的MNP和小神經膠質細胞破壞軸索的骨 髓磷脂鞘，其導致患者的功能障礙（參見，例如Cartier，L.， Hartley, 0., Dubois-Dauphin, Μ. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42(2005) ； Raivich, G. & Banati, R.,
Brain Res Brain Res Rev 46，261-81(2004);和 Smith, M.E·， van der Maesen, K. & Somera, F.P., J Neurosci Res 54, 68-78(1998))。小神經膠質細胞可誘導神經元細胞死亡，抑 制軸突過度生長，並吞噬神經元細胞凋亡體（參見，例如
Munch, G.等人，Exp Brain Res 1 50，1-8(2003);和 Stolzing，A 218 201235469 & Grune，T,，F.aseb J 18，743-5(2004))。 單核細胞-衍生之DC、B-細胞' MaC和經活化的星狀 細胞亦涉及MS之病理學（參見，例如Zhang，Y.等人，J Clin Immunol 25，254-64(2005); Behi，Μ.E.等人，Immunol Lett 96, 1 1-26(2005)； Chavarria, A. & Alcocer-Varela, J., Autoimmun Rev 3，251-60(2004) ; Corcione，A·等人，Autoimmun Rev 4， 549-54(2005);和 Zang，Y.-C.等人，Mult Scler 10, 499-5 06(2004))。經活化的星狀細胞釋放出數個趨化因子和 其他介體，以吸引白血球至炎性反應位置（參見，例如 Ambrosini， E.等人，J Neuropathol Exp Neurol 64， 706-15(2005) ； Andjelkovic, A.V., Kerkovich, D. & Pachter, J.S., J Leukoc Biol 68, 545-52(2000) ； Krumbholz, M.等人， J Exp Med 201，195-200(2005))。MaC 釋放蛋白酶，其引起 血管滲透性’並促使血纖維蛋白沉積在病灶中（參見，例如 Theoharides, T.C. & Cochrane, D.E·，J Neuroimmunol 146， 1-12(2004) ； Pedotti, R., De Voss, J.J., Steinman, L. & Galli, S.J.，Trends Immunol 24，479-84(2003))。DC 提交抗原，有 助於T細胞的活化和疾病的進行（Greter, M.等人，Nat Med 11，328-34 (2005))。異位淋巴組織在MS患者腦膜中之炎性 反應位置處是明顯的。這類患者的腦膜含有B、T、漿和DC 細胞’其代表維持體液自體免疫性和疾病惡化的階段（參 見，例如 Serafini，B·，Rosicareiii，B.，Magli〇zzi，R., Stigliano, Ε· & Aloisi，F·，Brain Pathol 14, 164-74 (2004))。 除了 MNP、T細胞、lg和免疫複合體之外，B細胞亦 219 201235469 出現在MS病灶中。超過70%的主動性病灶含有補體和抗體 (參見’例如 Cross，A.H. & Stark, J.L. Immunol Res 32, 85-98 (2005))。在MS患者的CNS中找到經選殖擴大的抗體-分泌 性B細胞和中心母細胞（centr〇blasts)(參見，例如Zhang，Y. 尊人，J Clin Immunol 25，254-64(2005); Ziemssen，T. & Ziemssen, F., Autoimmun Rev 4, 460-7(2005) ； Corcione, A. 等人，Autoimmun Rev 4, 549-54(2005);和 Corcione, A.等人， Proc Natl Acad Sci U S A 101，1 1064-9(2004))。超過 90%的 MS患者在CSF中具有鞘内寡殖系ig，以及增加含量的抗 體’其與MS惡化的事件有關（參見’例如Cross, A.H. & Stark, J.L·.，Immunol Res 32, 85-98(2005))。咸認為 b 細胞是衍生 自CNS生長中心；腦提供適合的微環境，以供長期存活、 增殖和異位淋巴樣結構的形成。B細胞對骨髓磷脂蛋白質製 造抗體（使骨髓填脂助噬素作用增加）、提交抗原和共同刺激 分子給T細胞，並增加白血球招募。研究已經發現一部分 正在循環的B細胞並不是永久失活的，而是持續被活化， 成為自體免疫攻擊的原因（參見’例如Gauld，S.B.，Benschop, R.J·，Merrell，K.T. & Cambier，j.c·，Nat Immunol 6, 1160-7 (2 005))。在MS中的B細胞，當其等在CNS中分化 時可被活化。 3)在MS中的趨化因子 配體和受體的趨化因子-傳訊系統，在EAE和MS之病 理學中扮演重要的角色。該系統在這些自體免疫疾病中， 結合了交易、CNS浸潤和一系列白血球亞型的異常炎性功 220 201235469 能。已經在多發性硬化症病灶中，鑑認出許多趨化因子及 沪·其受體，包括 CCL-l-8、CXCL8-13、CCR1-3、5 和 CXCR1-3、
- 4(參見，例如 Banisor，I·，Leist，T.P_ & Kalman, B.，J
Neuroinflammation 2, 7(2005) ； Cartier, L., Hartley, 〇.,
Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42(2005)； Galimberti, D., Bresolin, N. & Scarpini,
E.，Expert Rev Neurother 4, 439-53(2004) ; Putheti，P.等人， Eur J Neurol 10, 529-35(2003);和 Raivich，G. & Banati，R.， Brain Res Brain Res Rev 46，261-81(2004))。例如，在 MS 病灶中，CCRJ、2、5和6及CXCR3出現在CD3+ T細胞上， 而CCR1、2、3和5及CXCR3出現在泡沫狀巨噬細胞和經 活化之小神經膠質細胞上（參見，例如Banisor，I.，Leist，Τ.Ρ. & Kalman, B., J Neuroinflammation 2, 7(2005) ； Cartier, L., Hartley, 0., Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42(2005) ； Galimberti, D., Bresolin, N. & Scarpini, E., Expert Rev Neurother 4，439-53(2004)； Putheti，P.等人，Eur J Neurol 10, 529-35(2003) ; Raivich，G. & Banati, R., Brain Res Brain Res Rev 46, 261-81(2004)； Malamud, V·等人，J Neuroimmunol 138，1 15-22(2003); Pedotti, R., De Voss, J.J., Steinman, L. & Galli, S.J., Trends Immunol 24, 479-84(2003) ; Serafini, B., Rosicarelli, B.,
Magliozzi, R., Stigliano, E. & Aloisi, F., Brain Pathol 14, 164-74(2004) ; Corcione, A.等人，Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1 1064-9(2004) i Gauld, S.B., Benschop, R.J., Merrell,
221 201235469 K.T. & Cambier, J.C., Nat Immunol 6, 1 160-7(2005)；
Bartosik-Psujek, H. & Stelmasiak, Z., Eur J Neurol 12, 49-54(2005))。 在EAE研究中證實星狀細胞-衍生之CCL2和 CXCL 1 0。這些趨化因子誘發更多神經免疫反應，並協助從 周圍招募白血球（參見，例如Galimberti，D·，Bresolin，N. &
Scarpini，E.，Expert Rev Neurother 4, 439-53(2004) ; Huang, D·等人，Immun〇l Rev 177, 52-67(2000) ; Jee, Y·，Yoon, W.K.， Okura, Y., Tanuma, N. & Matsumoto, Y.3 J Neuroimmunol 128, 49-57(2002))。CCL2/CCR2 和 CXCL9/10/11/CXCR3 是 治療介入的目標之一，因為其等分希在數個特定的病理學 白血球細胞類型上，且其等經常在MS和EAE研究中被债 測到。趨化因子軸CCL1/CCR2在MNP和T細胞通過内皮 移動至CNS内扮演一角色，並涉及血-腦障礙（BBB)傷害和 崩潰（參見，例如 Chavarria, A. & Alcocer-Varela，J Autoimmun Rev 3， 251-60(2004) ; Mahad， D.等人，
Brain(2005) ； Dzenko, K.A., Andjelkovic, A.V., Kuziel, W.A. & Pachter, J.S.}. J Neurosci 21, 9214-23 (2001) ； Dzenko, K.A., Song, L., Ge, S., Kuziel, W.A. & Pachter, J.S., Microvasc Res(2005) ; Stamatovic, S.M.等人，J Cereb Blood Flow Metab 25, 593-606(2005) » Minagar, A. & Alexander, J.S., Mult Scler 9, 540-9 (2003))。CCL2 藉著經由 CCR2 改 變在内皮細胞之間的緊密接合，而增加BBB滲透性 (Stamatovic，S.M.等人，J Cereb Blood Flow Metab 25, 222 201235469 593-606(2005))。接著來的MNP，亦藉著分泌CCL2改變渗 透性，然後移行至CNS内。MNP-和T細胞-衍生之MMP亦 與BBB的瓦解和崩潰有關，並幫助細胞的移位（參見，例如 Abraham, M., Shapiro, S., Kami, A., Weiner, H.L. & Miller, A., J Neuroimmunol 163，157-64(2005) ; Avolio，C.等人，J Neuroimmunol 136, 46-53(2003) ; Karabudak，R·等人，j Neurol 251, 279-83(2004) ； Uccelli, A., Pedemonte, E., Narciso, E. & Mancardi，G.，Neurol Sci 24 附錄 5， S271-4(2003) ； Brundula, V., Rewcastle, N.B., Metz, L.M., Bernard, C.C. & Yong, V.W., Brain 125, 1297-308(2002)；
Sellebjerg, F. & Sorensen, T.L., Brain Res Bull 61, 347-55(2003) ； Vos, C.M., van Haastert, E.S., de Groot, C.J., van der Valk, P. & de Vries, H.E., J Neuroimmunol 138, 106-14(2003))。CXCR3 +標記與BBB交易的T細胞，但它是 在這些允許血球滲出之細胞上CCR2的表現（參見Mahad，D. 等人，Brain(2005); Callahan, Μ·Κ·等人，J Neuroimmunol 153, 1 5 0-7(2004)，其描述在越過BBB之後，在T細胞和單核細 胞上之CCR2的向下調節）。CCL2/CCR2趨化因子對涉及 BBB滲透性’並在CNS實質中和在病灶内的數個白血球類 型上觀察到 CCL2/CCR2軸的明顯增加（Mahad, D_J. & Hansohoff，R.M.， Semin Immunol 15, 23-32 (2003)) 。 it匕夕卜， 亦在MS腦的病灶、患者的血液和CSF中注意到CCL2/CCR2 軸（參見，Banisor，I·，Leist，T_P. & Kalman, B_，· J Neuroinflammation 2, 7(2005) ； Cartier, L., Hartley, 〇.,
223 201235469
Dubois-Dauphin, Μ. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42(2005) ; Putheti，p 等人，Eur j Neur〇1 i〇, 529-35(2003);和 Mahad，D.J. & Ransohoff，R.m.，Semin
Immunol 15，23-32(2003))。受體表現會隨著時間改變，因 為化學足跡是時間性和空間性的，並根據佔優勢的微環境 而改變（Karpus，W.J. & Rans〇h〇ff，R M· j Immun〇1 161， 2667-71(1998))。當單核細胞越過BBB時，其等向下調節然 後再-表現CCR2，使其等成熟分化成巨噬細胞。這在利用 驗屍的研究中被證明，MS生檢顯示在對照組CNS組織中， 由小神經膠質細胞表現低水平的CCR2、CCR3和CCR5。在 慢性主動性MS病灶中，CCR2、CCR3和CCR5出現在泡沫 狀巨嗤細胞和經活化的小神經膠質細胞上。CCR2和CCR5 亦出現在大量浸潤性淋巴細胞上，並有少量的CCR3_陽性 淋巴細胞（參見’例如Simpson，J.等人，JNeuroimmun〇i 1〇8, 192_200(2000))。同樣的，CXCR3 和 CCR5 亦優先在 Thl 細 胞（前炎性細胞介素生產者）上表現，並MS復發期間，在周 圍血液中明顯地向上調節。當患者進入緩解時，受體的含 量下降（Mahad，D.J.，Lawry，J.，Howell，S.J. & Woodroofe， Μ·Ν.，Mult Scler 9, 189-98(2003))。在得自 MS 患者的 CSF 中，向上s周郎了 CXCL1 0的.表現，並在與其受體CXCR3之 表現有緊密關聯的CNS組織切片中，在空間上與脫髓勒有 關（參見’例如 Sorensen，T.L.等人，J Neuroimmunol 127, 59-68 (2002))。從EAE研究中，有更多CCL2/CCR2參與自 體免疫脫髓鞘的證據。已經發現CCL2在CNS中高度表現， 224 201235469 而抗-CCL2治療在老鼠中阻斷了疾病的復發。利用CCR2-" 老鼠的研究顯示CCL2/CCR2對於eae之發展是很重要的 (Fife, B.T., Huffnagle, G.B., Kuziel, W.A. & Karpus, W.J., J Exp Med 192, 899-905(2000) ； Izikson, L., Klein, R.S., Charo, I.F., Weiner, H.L. & Luster, A.D., J Exp Med 192, 107 5-80(2000))。CCL2 DNA疫苗防止動物發展出EAE，且 CCL2和CCR2的向上調節與疾病之復發期密切相關（jee，γ.，
Yoon, W.K., Okura, Y., Tanuma, N. & Matsumoto, Y., J Neuroimmunol 128, 49-57(2002) ; Y〇ussef，s.等人，J Immunol 161，3870-9(1998))。顯示CCL2在老鼠中慢性表現 時，引起腦病變’顯示細胞介素可引起病灶形成（Huang，D. 等人，Faseb J 19, 761-72(2005))。 CXCL9/10/11趨化因子及其同族的CXCR3受體亦在 EAE和MS中扮演一角色（參見，例如Liu，L.，Callahan，M.K., Huang, D. & Ransohoff, R.M., Curr Top Dev Biol 68, 149-8 1(2005) > Cartier, L., Hartley, 0., Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42(2005)； Sorensen, T.L·等人，J Neuroimmunol 127, 59-68(2002)； Mahad, D.J., Lawry, J., Howell, S.J. & Woodroofe, M.N.,
Mult Scler 9，189-98 (2003);和 Lazzeri，E. & Romagnani, P.，
Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 5, 109-1 18(2005))。在MS中’炎性平衡有利於Thl細胞（前炎 性細胞介素生產者），其與對抗Th2細胞環境（抗-炎性細胞 介素生產者）的CXC3和CCR5表現有關，且獨特地表現 225 201235469 CCR3、4 和 8(參見，例如 Mouzaki，A·，Tselios，. Τ·, Papathanassopoulos, Ρ.} Matsoukas, I. & Chatzantoni, K.} Curr Neurovasc Res 1, 325-40(2004) ； Teleshova，N.等人，J Neurol 249，723-9(2002);和 Misu, T.等人，J Neuroimmunol 1 14, 207-12(2001))。與血液相比較，在MS CSF中明顯富含 表現CXCR3和CCR5的T細胞。CSF中缺少CCR5 + /CCR3· 細胞’代表CCR5不是T細胞單獨與CSF交易的原因（參見， 例如 Kivisakk， P.等人，Clin Exp Immunol 129, 510-8(2002);和 Sorensen, T.L.等人，J Clin Invest 103, 807-15(1999)) »在炎性反應模式中，抗-CXCR3治療改善了 Th 1細胞移行至發炎組織，證實CXCR3是交易所需的受體 (參見’例如 Xie，J.H.等人，J Leukoc Biol 73, 771-80(2003); 和 Sindern，E·，Patzold，T·，Ossege，L.M., Gisevius, A. & Malin，J.P.，J Neuroimmunol 131，186-90 (2002))。在主動性 MS病灶中，由巨噬細胞以及由在病灶周圍的星狀細胞表現 CXCL9和CXCL· 1 0 〇在病灶内的τ細胞和星狀細胞上表現 CXCR3。Thl細胞-衍生之IFN- 7*刺激細胞表現化學吸引 劑’以持續招募T細胞至CNS (Simpson, J.等人，j
Neur〇immun〇i 1〇8’ 192-200 (2000))。在數個 EAE 模式中研 究CXCR3和同族的配體。該軸在特定的EAE模式和嚅齒類 物種中扮演一角色。在一研究中，無CXCL10的老鼠展現 出像對照組一樣的表現、嚴重性和組織病理學。研究的結 論為CXCL10不是交易所需的，但與對照組比較，在外圍 決定降低疾病感受性的閾值（Klein，R.S.等人，J Immun〇1 226 201235469 172，550-9(2004) ; Oppenheim，J.J.等.人，J Leukoc Biol 7.7, 8 5 4-61(200 5))。CXCR3亦在上文討論的至少一部分白血球 群中表現（Sorensen， T.L_ 等人，J Clin Invest 103, 807-1.5(1999) ; Oppenheim，J.J.等人，J Leukoc. B.iol 77, 854-61(2005) ; Kuipers，H.F·等人，Glia(2005) ; Foley，J.F. 等人，J Immunol 174, 4892-900(2005))。例如，在主動性 MS 中’患者在CSF和血液中的B細胞上分別有比對照組更高 的 CXCR3 和 CCR5 表現（Sorensen, T.L·，Roed, H. & Sellebjerg，F.，J Neuroimmunol 122，125-3 1(2002))。老鼠和 人類星狀細胞及小神經膠質細胞在試管内反映同族配體而 表現受體’並經歷趨化性（參見，例如Biber，K.等人， Neuroscience 1 12, 487-97(2002))。因此，可藉著挑選靶定這 些受體之一或多個的共軛物，藉著適當地挑選本文提供之 共輛物，靶定這些受體之一（參見本文的表、實施例和說明 4)在MS中的治療 甲潑尼龍、干擾素和可舒鬆（Copaxone)減慢復發緩解性 疾病的過程。在原發和繼發性進行性MS中使用免疫抑制藥 物’包括鹽酸米托蒽酿（novantrone)、硫唾B票口令 (azathioprine)、胺甲碟呤和環磷醯胺（表5)。沒有藥物（除了 受组咒的坎帕斯（Campath)之外）曾經確實地修改疾病的過 程（參見，例如 Galimberti，D.，Bresolin，N. & Scarpini E Expert Rev Neurother 4，439-53(2004);和 Leary，s.M &
Thompson，A.J·，CNS Drugs 19, 369-76(2005))。白血球耗盡 研究和藉著坎帕斯耗盡白血球（不管毒性）引起的良好病理 227 201235469 學和緩解，完全預示了趨化因子-介導之白企球族群減少（參 見，例如 Coles, A.J.等人，Ann Neurol 46，296-304 (1999); Moreau，T.等人，Lancet 344, 298-301(1994))。趨化因子傳訊 系統可作為MS的強治療目標。因為許多白血球亞型在MS 中活躍，表現CCR2及/或CXCR3，故可使用乾定這類受體 的共軛物，如LPM7或LPM1 d，及其他在本文中舉例說明 的’來治療MS。可使用其他靶定二或多個CCL1-8、 CXCL8-13、CCR1-3、5、6 和 CXCR1-3、4 中任一或組合的 共概物。 e·關節炎和自體免疫疾病 測試並證實本文之共輛物治療自體免疫疾病，如上文 討論的關節炎、狼瘡和MS之活性的模式，為熟諳此藝者已 知的。例示性參考文獻提供並使用關節炎和自體免疫疾病 的模式’可使用該模式測試配體-毒素共軛物，如含有經修 改S A1部分之LPM共輛物，包括但不限於在本文中陳述的 下列參考文獻。
Barnes等人（1998)，在Lewis大鼠佐劑_誘導之關節炎 的模式中’針對人類RANTES之多株抗體改善了疾病 (Polyclonal antibody directed against human RANTES ameliorates disease in the Lewis rat adjuvant-induced arthritis model)，/«vew 101:2910-9，描述佐劑誘導之 關節炎（ΑΙΑ)是許多風濕性關節炎的動物模式之一，特徵為 τ-淋巴細胞和巨噬細胞細胞浸潤的疾病。Barnes等人定出 該疾病模式之發展相對於趨化因子表現的特徵，並顯示在 228 201235469 全血和在關節中，發現增加兩種趨化因子RANTES-T淋巴 ** 細胞和單核細胞之化學吸引劑，和KC(人類GRO- α的老鼠 4 * 同系物）-嗜中性白血球之化學吸引劑的含量。在整個疾病過 程中’在全血中ΜΙΡ-1 α -另一種Τ淋巴細胞和單核細胞化 學吸引劑的含量沒有改變，而在關節中僅有些微的升高。 RANTES表現在疾病中扮演重要的角色，因為對RENTES 的多株抗體在動物中大大地改善了 ΑΙΑ引起的症狀，並發 現在治療上像吲哚美辛（indomethacin)-非類固醇消炎藥一 樣有效。對MIP- 1α或KC的多株抗體是無效的。
Weinberg，A. D. (1998)，對 〇X-40(CD134)之抗體可鑑 認並排除自身反應性T細胞：涉及人類自體免疫疾病 (Antibodies to OX-40 (CD134) can identify and eliminate autoreactive T cells: implications for human autoimmune disease)，Mo/ Med ：To而少4:76-83，描述自身抗原-專一的 CD4+ T細胞已經涉及並成為在：多發性硬化症、風濕性關 郎炎、自體免疫葡萄膜炎、糖尿病、炎性腸病和移植物_對_ 宿主疾病中之起因的細胞類型。Weinberg亦描述使用以實 驗方式引起之自體免疫疾病，發展出有效的治療，其在自 體免疫組織破壞之處耗盡自身反應性T細胞。
Schrier等人（1998)，趨化因子和細胞介素在藉著注射 鏈球菌細胞壁引起之大鼠關節炎的再活化模式中的角色 (Role of chemokines and cytokines in a reactivation model 〇f arthritis in rats induced by injection with streptococcal cell walls)，63:359-63 ’提供在關節炎之動物模式 229 201235469 中趨化因子角色的研究。關節内注射鏈球菌細胞壁（scw) 抗原，接著靜脈内攻毒，結果在雌性Lewis大鼠中產生τ 細胞-介導的單一關節之關節炎。最初的研究顯示該對靜脈 内SCW抗原的再活化反應，係依賴介白素_1(IL1H〇腫瘤壞 死因子a (TNF- α )的出現，且在腫脹早期是嗜中性白血球依 賴性的。嗜中性白血球耗盡或以對？_選擇蛋白（seUctin)或 MIP-2的抗體被動免疫，降低了足踝腫脹的強度和嗜中性白 血球的湧入。然而，在前幾天之後，關節炎反應主要由單 核細胞介導《關節組織顯示對MCP-1之mRNA的向上調 節’可藉著抗-IL-4部分抑制它；以對IL_4或Mcpq之抗 體治療大鼠，明顯地塵抑了足踝腫脹的發展，和炎性反應 的組織病理學證據。對干擾素-7或IL_丨〇的抗體沒有效力。 利用抗-MCP-1的治療亦壓抑了經標示之τ細胞湧入足踝關 節内。這些數據指出在雌性Lewis大鼠中，SC W-引起之關 節炎較晚的單核細胞-依賴期需要細胞介素，其向上調節 MCP-1，其可轉而促成單核細胞的招募和溢出至關節内。
Oppenheimer-Marks等人（1998)，由内皮細胞產生介白 素15 ’並在試管内和在活體内在sciD老鼠-人類風濕性關 印炎模式中增加T細胞通過内皮的移行（interieukin 15 is produced by endothelial cells and increases the transendothelial migration of T cells in vitro and in the SCID mouse- human rheumatoid arthritis model in vivo), J Clin /«vesi 101:1261-72 ’檢查内皮細胞（EC)產生IL-15的能力， 和IL-1 5影響T細胞通過内皮移行的能力。人類臍靜脈内皮 230 201235469 細胞表現IL-15 mRNA和蛋白質。内皮細胞_衍生之iL_15 提尚了 T細胞通過内皮的移行’證據是藉著對il_i5的單株 抗體阻斷了該過程。IL-15藉著活化整合素黏連分子 1^八-1(€〇11&/0〇18)的結合能力，還有增加丁細胞的運動 性’提咼T細胞通過内皮的移行。此外，il_ 1 5誘導早期活 化分子CD69的表現。藉著其提高經收養轉移之人類τ細胞 堆積在被移植到免疫不全SCID老鼠内的風濕性關節炎滑膜 組織中的能力’證明在活體内IL-15在調節T細胞之移行上 的重要性。這些結果證貫EC產生il- 1 5，其在刺激τ細胞 溢出至炎性組織内扮演一角色。
Kasama等人（1995)，在老鼠第辽型膠原蛋白-誘導之關 節炎的演變期間’介白素-10的表現和趨化因子的調節 (Interleukin-10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type II collagen- induced arthritis) J 95:2868-76,研究在第n型膠原蛋白誘導之關節 炎（CIA)的演變期間’特定趨化因子Μιρ_1〇^σ MIp_2，以 及介白素-10(IL-10)的表現和貢獻。首先在最初之第η型膠 原蛋白攻毒之後第3 2到3 6天之間’觀察到可偵測含量的 ΜΙΡ-1 α和ΜΙΡ-2的趨化性細胞介素蛋白質，而在第％到 44天之間發現IL-10的增加。以對抗ΜΙΙΜ α或Μιρ_2的 抗體被動免疫CIA老鼠，證實延遲了關節炎的發作並降低 了關節炎的嚴重性。接受中和抗_IL-l〇抗體的CIA老鼠， 證實發作的加速並增加關節炎的嚴重性。抗_IL_1〇治療，增 加了 MIP-1 α和MIP-2的表現，也在發炎的關節中增加了髓
231 201235469 過氧物酶（MPO)活性和白血球浸潤。這些數據指出 和MIP-2在開始和維持上扮演一角色，而IL_丨〇似乎在實驗 性關節炎的發展期間扮演調節的角色。
Keffer等人（1991)，表現人類腫瘤壞死因子的基因轉殖 老鼠.關節炎的預示遺傳模式（Transgenic mice human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis)，五讲心10:4〇25_31，提供基因轉殖老鼠株其攜 帶並表現野外型和3 ’ -經修改之人類腫瘤壞死因子（hTNF_ α，惡病質素（cachectin))轉殖基因，顯示可在基因轉殖老 鼠中建立正確的、内毒素_反應性和巨噬細胞專一的hTNF 基因表現，並提出hTNF基因之3，_區可能涉及巨噬細胞_專 一之轉錄的證據。攜帶3，-經修改hTNF轉殖基因的基因轉 殖老鼠，顯示取消表現管制的模式，並發展出慢性炎性多 關節炎《Keffer等人顯示可預料到發展出關節炎的基因轉殖 老鼠代表可藉以進一步調查該疾病在人類t之發病機制和 治療的遺傳模式。
Sakai等人（1998)，使用新穎的風濕性關節炎之活體内 模式，藉著誘導細胞凋亡而有可能使風濕性滑膜消退 (Potential withdrawal of rheumatoid synovium by the induction of apoptosis using a novel in vivo m〇del 〇f rheumatoid arthritis), dri/zrzD 41:125 1-7 ,萨著使用 其中將人類RA組織移植至SCID老鼠内的模式，調查 Fas "導之細胞/周亡疋否有可此成為風濕性關節炎（汉八）的 治療策略。將新鮮的風濕性滑膜組織（包括關節軟骨）皮下移 232 201235469 植到SCID老鼠的背内。在移植後六週，腹腔内注射抗_Fas 單株抗體。藉著缺口末端-標示之組織化學法評估在經移植 之滑膜中，由抗- Fas單株抗體引起的時間-相關細胞调亡變 化。在注射後36小時’在經移植之滑臈中觀察到散布的細 胞凋亡變化。在注射後4週’排除了風濕性滑膜組織。
Smith等人（1999)，在骨關節炎之犬十字韌帶_缺陷模式 中’雙醋瑞因（Diacerhein)治療降低了骨關節炎的嚴重性 (Diacerhein treatment reduces the severity of osteoarthritis in the canine cruciate-deficiency model of osteoarthritis), AArzD及心請42:545-54，描述骨關節炎（〇A)的犬模式。 在20隻成年蒙古種犬中’藉著橫切左膝的前十字韌帶引起 OA。使用該模式測試〇A的治療。 f.炎性肺病 測s式並證實本文之共輕物治療炎性肺病之活性的模式 為熟諳此藝者已知的。例示性參考文獻提供並使用炎性肺 病之動物模式’其可用來測試配體-毒素共軛物，如含有經 修改S A 1部分之LPM共軛物，包括但不限於在本文中陳述 的下列參考文獻。
Kumagai等人（1999)，基質金屬蛋白酶的抑制’在氣喘 的老鼠模式中防止了過敏原—引起之氣道炎性反應 (Inhibition of Matrix Metalloproteinases Prevents Allergen-Induced Airway Inflammation in a Murine Model of Asthma)，/ 162:4212-4219，調查 MMPs 在支氣管氣 喘之發病機制中的角色，使用過敏性氣喘的老鼠模式。使 〇 233 201235469 在Ag吸入後 用β亥模式’報告了在以ova敏化之老鼠中 增加了在支氣管肺泡灌洗液中MMP_2和MMp_9的釋放， 這是藉著淋巴細胞和嗜酸性白血球的浸潤而完成。對氣道 投與金屬蛋白酶-2的組織抑制劑，抑制了 Ag_引起之淋巴細 胞和嗜酸性白血球對氣道壁和管腔的浸㈤，降低〜引起之 氣道過度反應性’並增加在關血液中嗜酸性白也球和淋 巴細胞的數目。利用金屬蛋白酶」之組織抑制劑和合成的 基質金屬蛋白酶抑制劑’亦觀察到抑制了細胞對氣道管腔 之浸潤。數據指4 MMPs，尤其是MMp 2和MMp_9，對炎 性，胞浸潤和料氣道過度反純是騎性的，其為支氣 管氣喘的病理生理學特徵。
Griffhhs-Johnson等人（1997)，氣喘的動物模式：趨化 因子的角色(Animal models 〇f asthma: _ 〇f —s)， 勤⑽_則/ 288:241_66，描述已經經由使用⑴在試管 内細胞培養上清液和在活體内得自炎性反應之動物模式的 渗出液的生物測^，和⑺分子生物學技術，發現的許多趨 化因子。有得自動物和臨床研究的強制性證據，嗜酸性白 ，球在氣喘中是重要的效應細胞。Grifmhs_j〇h_n等人鑑 涊兩個目標，以防止招募嗜酸性白血球至肺：及其受 體’其在數嗜酸性白血球生物學的數個方面是很重要的； 以及嗜酸球趨化蛋白及其受體咖3。嗜酸球趨化蛋白受體 ^嗜酸性白丘球上以高數量表現，但在其他的白血球上則 …，且似乎是嗜酸性白血球對嗜酸球趨化蛋白及其他趨化 如MCP-4的主要偵測器。嗜酸球趨化蛋白和咖3 201235469 基因剔除老鼠會允許評估涉及氣喘的介體，並測試特定的 治療程式。
Campbell等人（1998)，趨化因子在蟑螂過敏原引起之 氣道過度反應性和嗜酸性白血球增多症的老鼠模式中的時 間性角色（Temporal role of chem〇kines in & muHne 。£ cockroach allergen-induced airway hyperreactivity and eosinophilia)，J ⑽/ i61:7047_53，提供蟑螂過敏原引 起之氣道疾病的老鼠模式，並評估該反應的特定機制，其 類似異位性人類氣喘。在該模式中的過敏反應包括過敏原_ 專一的氣道嗜酸性白jk球增多症和明顯改變的氣道生理 學，其與炎性反應有直接關聯。CC趨化因子在這些階段期 間有特定的角色’其中MIP-lcx在最初的階段是重要的嗜酸 性白血球吸引劑’而在二次再-攻毒階段鑑認出嗜酸球趨化 蛋白。這些模式允§午評估涉及罈螂過敏原攻毒之兩個階段 的介體，以及測試特定的治療程式。
Piguet專人（1989)，腫瘤壞死因子/惡病質素在博菜黴素 -引起之肺病和纖維化中扮演一角色（Tum〇r necrosis factor/cachectin plays a role in bleomycin-induced pneumopathy and fibrosis)，Med 170:655-63 牙a Schrier 等人（1983) ’裸鼠（nu/nu)突變對博菜黴素-引起之肺纖維化 的影響。生化評估（The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation)，dm Db 127:614-617，描述肺纖維化 的老鼠模式。 235 201235469
Steinhauser等人（1999)，在肺抗細菌的宿主防紫中， IL-10是敗灰症-引起之損害的主要介體（IL-10 is a majc)r mediator 〇f sepsis-induced impairment in lung antibacterial host defense)，"咖咖/ 162:392 399，描述敗血症引起之 綠膿桿菌肺炎的老氣模式，以探查與敗血症有關之免疫抑 制的機制。使CD- i老鼠經歷使用26_號針頭穿刺（cLp)的盲 腸結紮或假手術，接著鞘内（i.t )投與綠膿桿菌或生理鹽 水:經歷CLP接著在24小時後藉著u投與生理鹽水或綠 才于菌的老鼠之存活分別為58%和i 〇〇/。，而有95%經歷假 手術，接著投與綠膿桿菌的動物存活。認為在⑽綠腹桿 菌組中增加了死亡率，是明顯損害肺細菌清除和㈣桿g :血症，早期發展的結果1 CLP-而非假手術的老鼠it 杈與細菌，結果產生嗜t性白血球的肺内堆積。此外，在 敗血症老鼠中以綠膿桿菌攻毒，結果產生朝向增強肺HO 產生的相對轉換，伴隨著降低IL_12的傾向。在敗血症動物 :’在綠腺桿菌攻毒之前給予i_P.而非i.t.的IL-10 Abs投 桌’明顯改善了存活’以及從經投與綠膿桿菌之敗血症動 物的肺臟令清除細菌。最後，從經歷CLp之動物中分離的 肺泡巨嗟細胞’在活體外攝食和殺死綠腹桿菌的能力上展 =明顯的損害，而該缺陷可藉著在活體内比…的中和而 部分逆轉。集體地，這些觀察指出敗血性反應實質上損害 了肺對綠膿桿菌的先天免疫力，並可藉著内源產生的IL_1() 介導該影響。 g.在基因治療之後的炎性反應 236 201235469 a登貫或鑑認本文之共扼物治療炎性反應’包括在基因 、:口療後之炎性反應的模式為已知的。例如Muruve等人 (1999) ’腺病毒基因治療導致在活體内眾多趨化因子之迅速 誘導和急性嗜中性白血球-依賴性肝傷害（Aden〇viral gene therapy leads to rapid induction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic injury in vivo), Hum Gwe 10:965-76，研究藉以使複製-有缺陷的腺病毒引 起被感染組織之急性傷害和炎性反應的分子機制，其限制 其4對人類基因治療的用途。欲定出該反應的特徵，在靜 脈内投與各種腺病毒載體之後，在DBA/2老鼠中評估趨化 因子表現。靜脈内投與adCMVp ga卜adCMV-GFP或FG140, 在老鼠肝臟中以劑量-依賴性之方式，迅速誘導c_x_c和 C-C趨化因子表現的一致特徵。在以1〇(1〇)pFlJ的adCMVp gal感染後一小時，，ΜΙΡ-2 mRNA的肝臟含量增加超過基準 線>60-倍。在以各種腺病毒載體感染之後，亦立刻增加 MCP-1和IP-10 mRNA含量，在ό小時達到高峰，分別有>25-和>100-倍表現。亦發生藉著腺病毒載體早期誘導rantes 和MIP-Ιβ mRNA，但程度較低。發生趨化因子的誘導與病 毒基因表現無關，因為補骨脂素_失活的腺病毒顆粒，在投 藥的前16小時内，產生相同的趨化因子基因轉錄特徵。趨 化因子的表現如預期地與嗜中性白血球和CD1 lb+細胞渴 入被感染動物的肝臟内有關。在對DBA/2老鼠全身性投藥 之後，所有的腺病毒載體均以高力價引起明顯的肝壞死和 細胞凋亡。欲調查嗜中性白血球在該腺病毒_引起之肝傷害 237 201235469 中的角色，以中和抗-MIP-2抗體預先處理動物或耗盡嗜中 性白血球。MIP-2拮抗作用和嗜中性白血球耗盡，分別且兩 者結果皆導致降低血清ALT/AST水平，並在組織學上減少 腺病毒-引起之肝傷害，證明該早期傷害主要歸因於趨化因 子產生和嗜中性白血球招募。結果弄清楚該早期免疫反應 係對抗有複製缺陷的腺病毒載體，並指出藉著干擾趨化因 子或嗜中性白血球功能，以防止腺病毒-介導之炎性反應和 組織傷害的策略。 h.血管生成 本文提供之共軛物可靶定在血管生成和其中涉及之力 工時向上調節的細胞。例示性參考文獻提供並使用血管」 成之動物模式，祖貫或鏗έ忍配體-毒素共輛物，如含有經允 改S A1。卩分之LPM共軛物，包括但不限於下列的參考文獻 F〇lkman等人〇987) ’血管生成因子（八吨⑻㈤ fact〇rS)，&/ace 235:442_7,確立血管生成和因子，如酸相 和鹼性纖維母細胞生長因子、血管生成素和轉型性生長区 子“和冷的角色’及其等在瞭解血管系統之生長調節上# 重要性。在根據目標評估時，利子們分成兩群：直接作 用j血管内皮細胞上，刺激運動或有絲分裂的那些，以及 藉著使伤主細胞（例如，巨噬細胞）動員以釋放内皮生長因子 ^間接作用的那些。除了其等出現在經歷丘管新生：腫瘤 二亦在許多沒有發生血管新生之正常組織中發現相同的 上*原性肽。這代表血管源性因子的生理學表現受到緊密 的调卽。& 了由腫瘤引起的持續血管生成之外，目前似乎 238 201235469 〜為各種非贅瘤疾病（先前認為是無關的）可能是，，血管源性 疾病’因為其等受到毛細血管之病理學生長支配。
Leibovich等人（1987)，藉著腫瘤壞死因子α介導巨噬 細胞-引起之血管生成（Macrophage_inducedk mediated by tumor necrosis factor-alpha), Nature 329·63 0·632，描述巨嗟細胞在創傷修補、炎性&應和腫^ 生長期間誘導新血管生長方面是很重要的，並藉著在大鼠 角膜和正在發育之雞絨毛膜尿囊膜中研究毛細血管形成來 調查之。
Koch等人（1992)，介白素成為血管生成的巨噬細胞_ ^ ^ ϋ (Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angi〇genesis)，258:1798 18〇i，描述由單核細胞/ 巨喔細胞產生的血管源性因子，涉及其特徵為持續性血管 生成之慢性炎性病症的發病機制。顯示介白素_8(il_8)(其對 淋巴細胞和嗜中性白血球是趨化性的）之角色，當移植到大 鼠角膜中時是有效血管源性的，並誘導人類腾靜脈内皮細 胞的增殖和趨化性。該數據指出巨噬細胞-衍生之在血 管生成-依賴性病症’如風濕性關節炎、腫瘤生長和創傷修 補中的角色。 i.腫瘤生長 可使用本文提供之共輕物(如生長因子-毒素共輛物、 議受體共輛物及其他）來治療腫瘤，如藉著乾定腫瘤受體 及/或涉及腫瘤生成，包括血管生成的細胞。招募涉及企管 生成和炎性反應的細胞與腫瘤的生長和發展有關。下列的 239 201235469 參考文獻描述這些關係，而用以鑑認腫瘤治療、血管生成 和炎性反應抑制劑的動物模式為熟諳此藝者已知的Y這此 參考文獻證明了動物模式在研究用以抑制腫瘤生長和與其 有關之細胞的治療上的利用性。本文提供之配體毒素共軛 物，包括含有經修改SA1部分之LPM共軛物，可用在這類 模式中，以評估對腫瘤生長的影響。
Phillips等人（1994)，在無胸腺老鼠中，皮下和腦内人 類神經膠質瘤和神經管胚細胞瘤異種移植的轉型性生長因 子-α -假單胞菌外毒素融合蛋白（TGF_ α ·ρΕ38)治療 (Transforming growth factor-alpha-Pseudomonas exotoxin fusion protein (TGF-alpha-PE38) treatment of subcutaneous and intracranial human gli〇ma and medulloblastoma xenografts in athymic mice), Cancer 54:1008-15，利用 上皮生長因子受體（EGFR)的差異表現（其在許多惡性神經 膠質瘤和其他原發性腦腫瘤中被擴大或過度表現，但在正 常的腦中很低或無法偵測），為了使用TGF- a -假單胞菌外 毒素重組毒素TGF- a -PE38乾定腦腫瘤之治療，使用攜帶 神經膠質母細胞瘤或神經管胚細胞瘤皮下異種移植的裸 鼠。該異種移植模式可用來研究趨化因子受體-靶定共軛 物’以供治療炎性反應’並靶定涉及腫瘤發育的細胞。
Debinski等人（1994)，在腫瘤細胞上表現的介白素_4受 體’可作為使用嵌合型假單胞菌外毒素之抗癌治療的目標 (Interleukin-4 receptors expressed on tumor cells can serve as a target for anticancer therapy using chimeric 201235469
Pseudomonas exotoxin)，/ Cimcer 58:744-748，報告了在 人類固體腫瘤異種移植模式中，使用由人類IL4(hIL4)和2 個不同突變形式之強細菌毒素_假單胞菌外毒素A(pE)構成 的嵌合型蛋台質。2個嵌合型毒素，稱為hIL4_pE4]g和 hIL4-PE38QQR，顯示出專一的hIL4R_依賴性和劑量_依賴 性之抗腫瘤活性。
Husain等人（1998)，藉著介白素_4毒素治療，使所建立 之人類神經膠質母細胞瘤腫瘤異種移植完全退化（c〇mplete regression of established human glioblastoma tumor xenograft by interleukin-4 toxin therapy), Cancer Res 5 8:3 649-53，顯示為了在裸鼠中之神經膠質母細胞瘤腹側腫 瘤的靶定治療，使用IL-4毒素共軛物。Kreitman等人 (1998) ’在活體内在腫瘤中堆積重組的免疫毒素：每個細胞 低於1000個分子便足以完成反應（Accumulati〇n a recombinant immunotoxin in a tumor in vivo, fewer than 1000 molecules per cell are sufficient f〇r complete responses), Cancer及以5 8:968-975，亦證實該模式之用途。
McDonald等人（2001)，趨化因子_毒素融合蛋白的治療 潛力（The therapeutic potential 〇f chem〇kine_t〇xin fusi〇n proteins)，/ Da" 4:427-442，報告了在兩個不同的老鼠異 種移植模式中，SDF-1 /5 -SA1(野外型SA1)妨礙HT 29結腸 癌腫瘤的生長。SDF-1/9-SA1亦根絕新形成的腫瘤内血管， 藉著在經處理之腫瘤中對對照址腫瘤缺少橫斷的血管而證 明。 241 201235469 在實施例9中陳述在腫瘤生長之模式中，lpm共軛物 * 的例示性結果，其顯示在腫瘤生長的異種移植模式中，測 · _ 试LPM1 d的貫驗結果。亦可在類似的測定中’測試含有與 -. 經修改SA1共軛之趨化因子的其他LpM,如本文提供的任 一個。這類結果證實可使用LPM作為治療癌症和血管生成 的候選治療劑。 j.人類免疫不全病毒（HIV)和其他病毒 帶有毒素部分的共軛物可靶定以病毒感染的細胞，像 是但不限於HIV、A、B及/或C型肝炎，以及其他慢性感 染細胞的病毒。作用模式可能是經由毒素對細胞代謝的影 響。此外’毒素，如志賀毒素’以及本文提供之經修改志 賀毒素及活性片段，是多核苷酸腺苷糖苷酶，其使多核苷 酸’包括RNA和DNA，包括病毒的核酸脫嘌呤。因此，靶 定在經病毒感染之細胞上表現之受體的共軛物可治療病毒 感染。
例如’可使用本文提供之共轆物，靶定經HIV感染的 細胞，並破壞病毒的核酸及/或抑制或殺死該細胞。一些例 示性參考文獻提供並使用HIV之動物模式，其可用來測試 配體-毒素共輕物，如含有經修改SA1之LPM共桃物，包 括但不限於下列的參考文獻》Westmoreland等人（1998)，在 患有猿免疫不全病毒腦炎之獼猴的腦中，在居留和炎性細 胞上表現趨化因子受體（Chemokine receptor expression on resident and inflammatory cells in the brain of macaques with simian immunodeficiency virus encephalitis), Am J 242 201235469 />感/ 1 52:659·665，㈣在單核細胞/巨仙胞在腦中浸润 與神經學疾病存在之間的關冑，且趨化因子和趨化因子受 體可能在則神經病發生中扮演一角色，並描述其等在謂 腦炎的SW-感染之怪河猴模式中的表現特徵。已經證實在 患有siv腦炎之獼猴的腦中，升高了趨化因子、 MHMmNTES和ΠΜ0的表現，並在該研究中，顯示 在這些相同組織中在血管周圍浸潤中表現相對應之趨化因 子爻體CCR3、CCR5、CXCR3和CXCR4。此外，亦在正常 和腦炎的腦中，在大海馬和新皮質錐體神經元的亞族群 上’以及在神經膠質細胞上偵測到CCR3、CCR5和CXCR4。 數據和結果指出在SIV腦炎中，多個趨化因子及其受體促 成將單核細胞和淋巴細胞招募至腦。此外，已知的HIV/SIV 共同-受體在神經元上表現，代表HIV或SIV可藉以直接與 這些細胞交互作用的可能機制，中斷其等正常的生理學功 能’並對AIDS癡呆複合症的發病機制提供援助。
Tyor等人（1993) ’人類免疫不全病毒腦炎在sciD老鼠 中的模式（A model of human immunodeficiency virus encephalitis in SCID mice)，Proc Jcac/ nScz. 90:865 8-62，提供HIV-相關之癡呆複合症的動物模式，幫 助發展對其之治療。將具有嚴重混合型免疫不全（severe combined immunodeficiency，SCID)的老鼠，其接受異種移 植而無排斥，腦内接種人類周圍血液單核細胞和HIV。在接 種之後1到4週，這些老鼠的腦含有人類巨噬細胞（其中有 些是HIV p24抗原陽性的），偶爾有多核細胞，並藉著免疫
243 201235469 細胞化學染色’有明顯的神經膠質增生。人類巨嗔細胞亦 經常對腫瘤壞死因子α型為陽性的，偶爾對介白素i和 VLA-4為陽性的。這些腦的培養物對hiv為陽性的。通常， 人類巨噬細胞沒有出現在對照組老鼠的腦中，也沒有明顯 的神經膠質增生。無法從僅接受腦内HIV的老鼠中回收 HIV。在病理學上’在SCID老鼠中之hiv腦炎的模式，類 似在人類中的HIV腦炎，且數據指出藉著以HIV感染活化 巨噬細胞，結果導致其等堆積並存留於腦中，以及神經膠 質增生的發展。該HIV腦炎之模式提供了對該病症之發病 機制和治療的洞察。
Toggas等人（1994)，藉著HIV-1外殼蛋白gpl2〇在基 因轉殖老鼠中的表現，產生中樞神經系統損傷（Central nervous system damage produced by expression of the HIV-1 coat protein gP120 in transgenic mice), Nature 367:188·193，提供在其腦中表現gpl2〇的基因轉殖老鼠， 並使用這些老鼠研究在人類中觀察到之gpl2〇在神經元和 神經膠質細胞中的角色。在基因轉殖老鼠的腦中觀察到的 改變’與在經HIV-1-感染之人類腦中的異常類似。損傷的 嚴重性與gp 120表現的腦水平呈正相關。這些結果提供了 gpl20在與HIV-1-有關之神經系統損害中扮演的部分角色 的活體内證據。這有助於評估和發展瞄準腦交互作用 的治療策略。
Wykrzykowska等人（1998)，在利用猿免疫不全病毒感 染之值》可猴中’胸腺祖先的早期再生（Early regeneration of 244 201235469 thymic progenitors in rhesus macaques infected with simian immunodeficiency Virus)，Med 187:1767-1778，使用 AIDS的SIV/獼猴模式，檢查SIv對胸腺的早期影響。
Krucker等人（1998)，帶有人類免疫不全病毒第1型外 殼蛋白質gp 120的基因轉殖老鼠，顯示在CA1海馬中在短-和長-期增益現象中的分歧變化（丁ranSgenic mice with cerebral expression of human immunodeficiency virus type-1 coat protein gpl20 show divergent changes in short- and long-term potentiation in CA1 hippocampus), Neuroscience 8 3 :6 9 1 - 7 0 0 ’研究在組成上表現得自腦星狀細胞的神經膠質 原纖維酸性蛋白質-駕馭之gp 120的基因轉殖老鼠，其展現 神經元和神經膠質細胞改變，與在經人類免疫不全病毒第1 型-感染之人類腦中的異常相似。
Power等人（1998)，在貓免疫不全病毒-感染之新生貓中 的神經毋性’是病毒品系專一且依賴系統免疫抑制的 (Neurovirulence in feline immunodeficiency virus-infected neonatal cats is viral strain specific and dependent 〇n systemic immune suppression)，Fz'ro/ 72:9109-15)，提供 HIV的動物模式，及其在免疫抑制上的角色。豸苗免疫不全病 毒（FIV)是慢病毒’其在貓中引起免疫抑制和神經學疾病。 欲判定不同FIV品系引起神經學疾病的程度，在活體外測 定並在活體内比較FIV V1CSF和彼塔隆馬（Petaluma)。兩個 病毋以類似的水平感染並在巨嗤細胞和經混合之神經膠質 細胞培養物中複製，但V1CSF在神經毒性測定中引起明顯
245 201235469 比彼塔隆馬更多的神經元死亡。與經.彼塔隆馬感染和未經 感染的動物相比較，經V1CSF_感染的動物顯示出明顯的神 、至發月延遲。額葉皮質的磁共振質譜分析研究，與其他組 減較，在V1CSF組中顯示出明顯降低的N_乙酿基天冬胺 酸’肌酸比例。經彼塔隆馬-感染之動物的環孢靈A治療，在 腦十引起神經發育延遲並降i N•乙醯基天冬胺酸/肌酸比 例。與未經感染和經彼塔隆馬_感染的組別相比較，在經 νΉ染組中觀察到降低了 cd4⑴和⑽⑴細胞計 數這一發現私出神經發育延遲和神經元傷害是FIV品系 專一的，但系統的免疫抑制亦是πν_引起之神經毒性的重 要決定因素。 其他病毋感染的模式為已知的，並可用來證實對其他 病毒的抗-病毒活性。 k·腎臟疾病 可使用本文提供之共軛物來治療腎臟疾病。可使用腎 臟疾病之動物模式，測試配體_毒素共軛物，如含有經修改 S A1之LPM共軛物。這類動物模式包括模仿不同人類慢性 腎病（CKDs)的那些，已完全定出其特徵。例示性參考文獻 回顧數個已完全定出特徵的CKD模式，包括抗·gbm疾病 及其與人類疾病之關聯，為Durvasula和Shankland(MeiWi
Mo/ Mei，86:47-66, 2003)。 例如，抗-Thy-1在大鼠中引起腎小球腎炎，為已經充 分描述的人類系膜增殖性腎小球腎炎之模式（參見，
Jefferson 和 J〇hnSon(l999) */· 12:297-307 ; 201235469 .Westerhuis 等人（测）um〇/.，156:303-1〇hu 之，以抗-胸腺細胞抗體（其與腎小球腎小球膜細胞（MGCS) .結合，並導致補體-依賴性的系膜溶解（mesangiolysis))注射 大鼠H容解結束後2天，接著是MGCs增歹直，並在大 、.勺5 7天達到細胞增多（hyperceiiuiadty)的高峰。之後MGCs 經歷細胞〉周亡，直到模式本身解決為止。在增殖期間，在 MGC表現型上有變化，其與細胞外基質蛋白質（ecm)_纖維 化之早期指標的沉降有關。一開始有可溶性炎性介體的向 上調節，包括趨化因子MCP4，其與白血球的湧入有關， 最重要的疋巨嗟細胞。咸認為巨嗟細胞在早期藉著產生活 性氮和氧物種而有助於系膜溶解。在較晚的階段，認為其 等經由細胞介素和生長因子，包括促纖維化 (pronbrotic)TGF-冷的產生，而促成MGC增殖和ECM產 生。巨噬細胞的數目在大約2到4天之間達到高岭，然後 逐漸降低。已經顯示在該模式中的MCP_1中和作用，改善 了巨嗤細胞浸潤、TGF -卢產生和ECM蛋白質的合成。在其 他的研究中’利用氯屈膦酸二納（clodronate)脂質體耗盡巨 噬細胞，結果產生系膜基質擴展的明顯降低。 在實施例6中陳述LPM共軛物在腎臟疾病模式中的例 示性結果，其顯示在抗-Thy-1引起之腎小球腎炎模式中測 試LPM1 d的實驗結果。該結果顯示LPM1 d在許多受試的生 理學參數中，提供了腎臟保護。亦可在類似的測定中測試 其他的L P Μ，如任何在本文中提供，含有與經修改s A1共 輛的趨化因子者。這類結果證實可使用LPM作為治療腎臟 247 201235469 疾病的候選治療劑。 1·過敏 一些例示性參考文獻提供並使用過敏的動物模式，其 可用來測試配體-毒素共軛物，如含有經修改SA1之LPM 共輕物’包括但不限於在本文中陳述的下列參考文獻。一 開始發展老鼠延遲型過敏（MDTH)，以提供接觸性過敏的測 試。已經改編以篩選T_細胞調節之免疫反應的壓抑，並普 遍用來作為慢性炎性疾病的模式（Staite等人，（1996) 88:2973-2979)。 例如，在數個模式中，且特別已經使用聘吖酮 (〇xazal〇ne)(〇XA)-引起之過敏性接觸性皮炎老鼠模式，鑑 5忍可此的消炎藥和免疫調節藥物（Chapman等人，（1986) Jw. ·/· Dermwopai/jo/. 13 0-8)。當將腭吖酮的溶液直接塗在耳朵 上時，老鼠對聘吖酮敏化，經歷可再現並可測量的炎性反 應。誘發附著素-專一的皮膚T淋巴細胞（Thl和Th2細胞的 混合物）及巨噬細胞’釋放前炎性細胞介素和趨化因子。亦 有嗜中性白血球活化和浸潤’雖然在這裡是少數β其他的 DTH模式研究已經顯示嗜中性白血球可能藉著釋放細胞介 素和趨化因子，間接或直接調節Τ細胞的招募。在幾小時 内’耳朵腫服，且白血球開始浸潤血管外的組織。耳朵變 厚，而細胞浸潤在24小時達到高峰，然後在幾天内逐漸降 低至基準線水平。老鼠耳朵的重量增加’有白金球的潘入 和滲出液的產生。 在實施例7中陳述了 LPM共軛物在過敏模式中的例示 248 201235469 性結果，其顯示在過敏模式中測試Lpmic和LPMld的實驗 結果。在MDTTH模式中涉及耳朵腫脹的大多數白血球亞型 表現CCR2，MCP-1的靶定受體，其中有趨化因子受體。因 此，為了排除’挑選含有經修改SA1之MCP-l-SAl(LPMl) 共軛物，以靶定這些細胞。這些結果舉例說明了 MCP-l-SAl(LPMl)變體LPMlc和LPMld在治療過敏上是有 效的，且LPMlc和LPMld具有不同的效力，與其毒性活性 致如同所述（參見例如在實施例3中）。亦可在類似的測 定中測試其他的LPM，如任何在本文中提供之含有與經修 改SA 1共軛的趨化因子者。可測試任何LpM共軛物，特別 是任何已知可靶定細胞表面受體（如在一或多個涉及過敏之 白血球上表現的任何細胞表面受體）的LpM共軛物。因此， 這類結果證實可使用LPM作為治療過敏的候選治療劑。 的病症’包括二次組丨 疾病的組合物。這類矣 J.含有毒素及其共軛物之組合物的調配與投藥 在本文中提供用來治療與病理生理學之炎性反應有關 二次組織傷害和相關之疾病狀態，以及其他 。足類組合物含有治療有效量的配體-毒素共 乾定劑，像是例如趨化因子或其活性片段， 以及nrn * *
> 5耶考虚冬古；含跑: 知的 亦亏慮含有這類共軛物的組合物。
效濃, LPM» 249 201235469 劑混合。以有效治療所挑選病症的量，納入化合物。活性 化合物在組合物中的濃度，會視活性化合物之吸收、失活、 排泄速率、給藥St畫和投與量’以及熟諳此藝者已知的其 他因素而定。 適合投與共軛物及本文提供之方法的藥學載劑或媒 劑’包括任何熟諳此藝者已知.，適合特定投藥方式的這類 載劑。此外，可將化合物當作唯一有藥學活性的成份來調 配’或可與其他活性成分混合。 所投與之治療劑的精確量或劑量，視特殊的共扼物、 投藥路徑及其他的這類考量而定。可在緩釋遞送媒劑甲投 與，像是但不限於微球體、脂質體、微粒、奈米顆粒和膠 態碳。治療有效量典型地應產生從大約〇丨 大約一克/毫升的活性成分之血清濃度。克醫= 物，視所挑選的共軛物而定，典型地應提供每公斤體重每 天從大約0_01毫克到大約100 2000毫克共軛物之劑量。典 型地’關於靜脈内或全身性治療，大約在0.05到05毫克'/ 2斤2每曰劑量應該足多句了。@部施用應提供每次單一劑 里杈藥大約1毫微克到最高i〇〇微克’典型地為大約1微 ^到大約1G微克。應瞭解投藥的量會是所挑選之共輕物、 /。療之適應症和可能會忍受之副作用的函數。可使用每個 病症經公認的模式，憑經驗決定劑量。 可一-人投與活性成分，或可將其分成幾個較小的劑量 按時間間隔投斑。庙略站至 、應瞭解和確的劑量和治療期間，為欲治 療之組織的函數，廿π m 並可使用已知的測試草案憑經驗決定， 250 201235469 •或藉著從在活體内或在試管内的測試數據以外插法推定。 - 注意到濃度和劑量值亦可隨著所治療之個體的年齡而改 *變。更應瞭解對於任何特殊的個體，應該根據個體的需求 和投藥或監督該組合物投藥之人的專業判斷’隨著時g調 整特定的劑量攝生法，而在本文中陳述的濃度範圍只是= 例。 疋 化合物可以微粉化或其他適當的形式懸浮，或可衍生 以產生較可溶的活性產物或產生前藥。所得之混合物的形 式視許多因子而定，包括想要的投藥形式和化合物在所選 之載劑或媒劑中的溶解度。有效濃度是足以改善目標病症 的，並可憑經驗決定。欲調配組合物，將重量分數的化合 物，以有效濃度溶解、懸浮、分散或以其他方式與所挑選 的媒劑混合’而得以減輕或改善目標病症。 至於局部内部投藥，如肌肉内、非經腸或關節内投藥， 通；1¾在含水-基底的介質，如等張的經緩衝之生理鹽水中， 將化合物調配成溶液或懸浮液，或與生物可相容的擔體或 生物黏附劑混合，以供内部投藥。 所得之混合物可以是溶液、懸浮液、乳劑或其他這類 混合物，並可調配成含水混合物、乳霜、凝膠、軟膏、乳 劑、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、油膏、泡沫、氣 溶膠、沖洗劑、喷霧劑、栓劑、繃帶或任何其他適合全身 性、局部或局部投藥的調配物。 適合投與本文提供之化合物的藥學和美容載劑或媒 劑，包括任何熟諳此藝者已知，適合特殊投藥模式的這類 251 201235469 載劑。此外，亦可調配化合物，作為組合物中唯一的藥學 活性成分’或可與其他活性成分混合。以足以發揮治療有 用之效果，但對經治療之個體沒有嚴重毒性影響的量，將 活性化合物納入載劑中。可藉著使用在試管内和在活體内 的系統’包括本文描述之動物模式，憑經驗決定有效濃度。 用於局部施用的溶液或懸浮液，可包括任何的下列組 伤·無菌的稀釋劑，如注射用水、生理鹽水溶液、固定油、 聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他的合成溶劑；抗微生物劑， 如苯曱醇和對羥基苯曱酸曱酯；抗氧化劑，如抗壞血酸和 亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸[EDTA];緩衝劑， 如乙酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽；以及調整張力之製劑，如 氣化鈉或右旋糖。可將液體製劑封入以玻璃、塑膠或其他 適合材料製造的安瓿、用後即丟的注射筒或多劑量小瓶 中。適當的載劑可含有生理鹽水或磷酸緩衝之生理鹽水 [PBS]，而懸浮液和溶液可含有增稠劑和促溶劑，如葡萄糖、 聚乙一醇和聚丙二醇及其混合物。脂質體懸浮液也可能適 合作為在藥學上可接受的載劑。可根據熟諳此藝者已知的 方法製備這些。 可藉著任何熟諳此藝者已知的路徑，投與用在該方法 中的治療劑’像是但不限於局部、關節内、腦池内、眼内、 腦室内1内、靜脈内、肌肉内、腹腔内、皮内、氣管内， 以及藉著其任兩或多個的任何組合。 最適合的投藥路徑會視欲治療之疾病狀態，例如炎性 症狀的位置而改變。投藥模式包括，但不限於局部'局部、 201235469 關節内、腦池内、眼内、腦室内、鞘内、靜脈内、肌肉内、 氣管内、腹腔内、皮内、向實體，以及藉著其任兩或多個 的任何組合。例如，為了治療SCI及其他CNS炎性症狀， 局部投藥’包括投藥至CNS液或投藥至腦内（例如鞘内、腦 至内或腦池内）提供了可以高濃度投與治療劑，卻沒有可能 伴隨著系統投與治療劑之併發症風險的優點。或者，可藉 著向貫體接種至腦内來投藥，像是例如在治療腫瘤時。同 樣的’為了治療炎性關節疾病，可使用藉著將治療劑注射 至發炎關節内的局部投藥（即關節内、靜脈内或皮下之方 式）。如同其他的實例’可藉著治療劑的局部投藥，例如調 配成乳霜、凝膠或軟膏，有利地治療與炎性皮膚病症有關 的疾病狀態。為了治療與炎性肺臟病症有關的疾病狀態， 治療劑的較佳投藥路徑可藉著吸入氣溶膠，或以氣管内投 藥。 因此’可藉著任何適當的路徑投與共軛物，例如口服、 非經腸（例如靜脈内、腹腔内、肌肉内、皮内、經皮下注射 或輸液或植入）、經鼻、或經肺臟、陰道、直腸、舌下或局 =路徑，以液體、半-液體或固體形式，並可以適合每種投 ，路徑的方式調配。較佳的投藥路徑視所治療之適應症而 疋。典型地以局部治療皮膚病學和眼科學適應症；而典型 地藉著全身性、皮内、肌肉Θ、向實質或其他的投藥模式 治療腫瘤和SCI及其他這類病症。可藉著注射投藥（使用^ 如靜脈内或皮下之方式)’但亦可藉著持續輸液緩慢或按 時投藥(使用例如緩釋裝置或迷你幫浦，如滲透幫浦或皮膚 253 201235469 貼片）。 以有效量投與治療劑。對治療用途有效的[當然會 視疾病的嚴重性和個體的體重與一般健康狀況，以及投藥 路徑而^。治療劑的局部投藥典型地會需要比任何全身性 投藥模式更少的劑量’雖然治療劑的局部濃度，在某些情 況下’在局部投藥之後可能比在全身性投藥後安全地達到 的濃度更高。 因為個別的個體可能在症狀的嚴重性上有所不同，且 每個治療劑有它獨特的治療特徵，&由醫師判定個體對治 療之反應，並因此改變劑量。在試管内使用的劑量，可對 就地投與醫藥組合物的有效量提供有用的指導，並在某些 情況下可使用動物模式，決定有效治療特殊病症的劑量^ 然而，通常關於局部投藥，考慮到治療劑之有效量會是在 每么斤體重從大約0.1皮克（微微克）到大約丨毫微克範圍内 的量。在例如古德曼和吉爾曼氏：治療的藥理學基礎 (Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases 〇f Therapeutics)，第 8 版，Pergamon Press，1990 ;和雷明頓氏 藥物科學（Remingt〇n，s pharmaceutical Sciences),第 17版
Mack Publishing Co.，Easton, Pa.，1990 ;以及在 Mantyh 等 人，（1997) Sc — ce 278:275-79的研究（涉及神經元專一之配 體-毒素的鞘内投藥）中描述了對有效量的各種考量。 在本文提供之組合物和方法的一具體事實中，局部投 與在緩釋遞送媒劑中的治療劑，例如包膠在膠態分散系統 中’或在聚合物穩定化之結晶中。有用的膠態分散系統包 254 201235469 括奈米膠囊、微球體、小珠和基於脂質的系統，包括水包 油乳劑、膠束、混合的膠束和脂質體。膠態系統目前較佳 •的是脂質體或微球體。脂質體是人造的膜囊，其在被注射 或植入時’可用來作為緩釋遞送媒劑。在美國專利第 5,631，018號中揭示了脂質-聚合物共軛物和脂質體的一些 實例，全部以引用方式納入本文中。緩釋遞送媒劑的其他 實例為生物可降解的水凝膠基質（美國專利第5,〇41，292 號）、樹枝狀聚合物共軛物（美國專利第5,714，166號）和多囊 脂質體（迪普泡（Depofoam)®，Depotech，San Diego, CA)(美 國專利第5,723，147號和5,766,627號）。一型適合包膠治療 劑以供局部注射（例如至皮下組織内）的微球體是聚（D，L)丙 父酯微球體，如同在D· Fletcher (1997) 4⑽化 84:90-94中描述的。 除了遞送有效治療劑量至創傷部位並降低系統毒性的 機會之外，局部投藥亦降低了治療劑與降解過程的接觸， 如蛋白水解降解和經由抗原和免疫原反應的免疫學介入。 利用例如單曱氧基聚（乙一醇）的藥物衍生化，亦可降低上述 缺點的可能性。已經報告了治療劑的聚乙二醇化，增加對 蛋白水解的抵抗力；增加血漿半衰期，並降低抗原性和免 疫原性。由Lu和Felix(1994) /此乂〜⑽^， 43:127-138 ·，Lu 和 Felix(1993) 細·，6:142_6 ; FeHx 等人（1995) P印及以，46:253_64;〜沾“等人 (1994) 乂仏(：心所.，269:13398_4〇4; Brumeanu 等人（Η%) J /·，154:3〇88-95提供了聚乙二醇化方法的實例。 255 201235469 本文提供之組合物更可含有一或多個有助於遞送的佐 劑，像是但不限於惰性載劑或膠態分散系統。這類惰性載 劑的代表性和非-限制性實例，可選自水、異丙醇、氣態的 石反氟化合物、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、產生凝膠 之材料'硬脂醇、硬脂酸、鯨蠟、脫水山梨糖醇單油酸酯' 甲基纖維素，以及其二或多個的適當組合。 ^亦可根據已知的方法，使用適當的分散或濕潤劑和懸 浮劑’將本文提供之組合物調配成無帛的注射肖懸浮液。 無菌的注射用製劑亦可以是在無毒性非經腸可接受之稀釋 劑或溶劑中的&菌注射用溶液或懸浮液，例#，像是在Η 丁二醇中的溶液。在傳統上使用無菌的以油作為 懸浮介質。為了該目的，可使用任何溫和的固定油，包括 但不限於合成的單-或二甘油3旨、脂肪酸（包括油 存在的植物油，如芝麻油 …' 仏.丄相 柄丨卞，由化生油、棉籽油和i 他油類’或合成的脂肪媒劑，像油酸乙醋 併 入緩衝溶液、防腐劑、浐备儿十丨 饮…4要併 1方關k氧化劑和適當的成 成組合物。 *刀亚·Γ凋配 口服組合物通常包含，陪 被壓製成錠劑或包封在明膠膠囊中二=用：劑，並可 藥’可將活性化合物或化合物們與賦形劑合=投 成錠劑、膠囊或σ含鍵 、’用來形 和佐劑材料，成為組合物的一=樂…相容的黏合劑 鍵劑、藥丸、膠囊、口含錠：及 下列的成分，《具有類似性質的化合物.點八：3有任何 黏合劑，如微晶 201235469 纖維素、普蓍跋4 像是但不限於;心二;賦：劑，如澱粉和乳糖；崩解劑， 硬脂酸鎂；滑動粉：㈣劑，像是但不限於 如嚴糖或奸 是料限於膠態二氧切；增甜劑， 香料/ 月，以及调味劑，如薄荷、水揚酸甲酷和水果 州i為膠囊時，除了以上類型的材 可含有液體載劑，如月m “…。杯討之外其 女知肪油。此外，早位劑型亦可含有各 ”他的材料’其修改該劑量單位的物理形式，例如糖衣 和其他腸用製劑。亦可作為酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙、 口香糖或類似物的組份來投與共輛物。除了活性化合物之 外，糖漿可含有作為增甜劑的篇糖，以及某些防腐劑、毕 料和著色劑及香料。 〃 亦可將活性材料與其他不損害想要作用的活性材料， 或與補充想要作用的材料混合，像是治療腫瘤用的順氣氨 在白。 最後，可將化合物包裝成製品，其含有包裝材料，在 該包裝材料中的一或多個本文提供之共軛物或組合物以 及指不為其提供該共軛物之適應症的標籤。 κ.使用毒素或其共軛物治療疾病和病症的方法 在本文中提供使用任一或多個本文提供之配體-毒素共 輕物’包括含有經修改RIP部分，如經修改S A1的那些， 來冶療為其設計該配體-毒素共軛物以靶定之疾病或病症的 方法。憑藉著共軛物對表現經靶定受體之細胞的受體-專— 性革ε定，本文提供之組合物和方法允許選擇性地、審慎並 257 201235469 秘密地遞送治療劑至細胞，其協調對傷害或疾病的反應。 使共軛物靶定涉及免疫調節和炎性疾病及其他創傷之病理 生理學過程的細胞，允許該共軛物之受體-介導的内化，藉 此促成毒素-介導之細胞毒性，並排除病理學之細胞組份。 因此，在本文中提供使用共扼物以治療炎性或免疫疾 病和病症的方法。欲察知這類共軛物在治療這類疾病或病 症上的用途’在討論目前候選治療劑的限制時，需要瞭解 免疫系統和病理學細胞的參與使這類疾病惡化。下列的討 論提供了這類背景，為在治療例示性疾病時，討論配體-毒 素共軛物，如含有經修改毒素的那些之挑選和使用的開端。 1.免疫宿主防禦系統和炎性反應 可將免疫系統分成先天的和繼承的武器，其一起賦與 完整的免疫監督和宿主防禦系統。該系統包含數個異質的 白灰球族群’其包括但不限於單核細胞或巨噬細胞（集體地 稱為單核吞噬細胞（MNPs)、嗜中性白血球（多形核嗜中性白 血球，PMN)、τ細胞、B細胞、嗜酸性白血球、嗜驗性白 血球、自然殺手（NK)細胞、樹突細胞（DCs)和肥大細胞 (MaCs))。先天的免疫系統依賴立刻對侵入性實體，如微生 物反應的細胞，並包含MNPs、樹突細胞、嗜中性白血球和 NK細胞。繼承性免疫系統包含τ和B細胞，其需要藉由提 交抗原的細胞，主要是樹突細胞活化，以便靶定特定的宿 主侵入者。先天和繼承性免疫反應的細胞，與組織居留細 胞（TRC，例如上皮細胞）一起工作，以便在許多器官特有的 過程中維持體内平衡，包括胚胎發育、血管生成、淋巴細 258 201235469 胞交易、傷口癒合、組織修補、移除細胞碎屑及其他不想 要的物質，如微生物、病毒或癌細胞殖系（例如Esche等人， J. Invest. Dermatol., 125:615-28, 2005 ； Chaturvedi 等人， Indian J. Med. Res., 124:23-40, 2006 ； Bunde, J. Exp. Med. 201:1031-6，2005 ; Krishnaswamy 等人，Methods Mol. Biol. 315:13-34，2005 ; Martin 和 Leibovich，Trends Cell Biol·， 15:599-607, 2005 ； Kim, Curr. Drug Targets Immune Endocr.
Metabol. Disord.，4:343-61，2004 ; Moser 和 Willimann, Ann· Rheum. Dis. 63(附錄 2): 84-9，2004 ; Hoebe 等人，Nat. Immunol.，5:971-4，2004; Schaerli 等人，j· Exp Med， 199:1265-75，2004, Olson 和 Miller，J. Immunol. 173.3916-24 2004 ; Middleton 等人，Blood，100:3853-60, 2002 ; Beyer 等 人，Glia 31:262-66，2000)。 a.體内平衡的炎性反應 體内平衡的炎性反應是多因素的生化過程，藉著活化 TRCs並活化在趨化因子-傳訊系統中具有極重要角色之白 血球家系的細胞協調並使其永存。從受傷或死亡的細胞中 釋放出可溶性因子，免疫複合體或裝有抗原（像細菌之脂多 醣（LPS)和病毒外殼蛋白質）的複合體，經由補體和鐘受體系 統運作，共同誘發白血球活化和招募。在反應中，白血球 經歷重大的表現型改變’包括細胞黏連分子（CAMs)和前炎 性細胞介素及趨化因子的向上調節，以便交易並與其他的 白血球群通訊。在曾經侵人之處，白血球產生細胞毒性介 體的武器。例如’活性氧和氮物種、$白水解酵素和類花
259 201235469 生酸（eicosanoids)，殺死侵入的微生物和真菌，其主要是被 巨嗤細胞和PMN吞嗤。在受傷之處，例如白血球（尤其是巨 嗟細胞）-衍生之生長因子（GFs)包括jk管内皮生長因子 (VEGF)和纖維母細胞GF(FGF)促成血管生成。促纖維化因 子，如轉型生長因子-召（TGF-冷）促成結痂和傷口癒合 (Krishnaswamy 等人（2005) Mo/· 5ζ’〇/· 315:13-34 ;
Puneet 等人（2005) Jm. Lwng Ce// M<?/· Physiol. 288:L3-15 ; Taylor 等人（2005) /?ev. 23:901-44 ; Byrne 等人（2005) «/· Ce// Mo/· Mei/· 9:777-94 ; Carroll(2004) N at. Immunol. 5:981-6 ; Iwasaki 和
Medzhitov(2004) Nat. Immunol. 5:987-95 ; Martin 和 Leibovich(2005) Ce// 仏〇/. 15:599-607 ; Liu 和
Pope(2004) Rheum. Dis. Clin. North. Am., 30:19-39 ； Stark 等人（2005) JwmMm·/;;，22:285-94; Gordon(2003) iVai· /?ev. /mwwwo/·，3:23-5 ; Borish 和 Steinke(2003) «/. J//erg少 //www«〇/.，lll:S460-75 ;· Cross 和 Claesson-Welsh(2001) P/mrmaco/. 6W.，22, 201-7 ; Trautmann 等人（2000) J. Ραί/ζσ/.，190:100-6)。通常，由經活化之白血球產生的這類 免疫’I體疋保s蒦性的，但在某些病理學情況下，其等可變 成有害且永存的疾病。 b.病理學的炎性反應 炎性反應由免疫防禦細胞介導，其堆積在組織受傷或 創傷之處，以驅除身體不想要的外源物（如微生物）或内源物 (例如癌細胞殖系）；清除細胞碎屑並參與組織和傷口癒合。 260 201235469 .不幸的是，涉及這些修補（炎性）過程 次組織傷害，其轉而促成許多炎性疾=制可能引起二 、虑捆悤 人性疾病的發病機制和持久 病理學。纟人類大多數的炎性疾病中， ., V及—次組織傷空 “子機制和細胞及化學介體1不相同也是類似的。二 °，在由大量刺激(包括但不限於病毒、細菌、 炎性細胞介素、趨化因子、缺氧、 *月 .^ ^ 局。p缺血、蛋白尿（在尿 中有蛋白質）、高級糖化終產物（AGE)、自身抗體、全身性 核芽酸、補體、免疫複合體、免疫球蛋白和環境污染，如 香菸)之活化引起的病理學狀況中，可能導致細胞，包括作 不限於各種白血球和TRC，包括CNS之神經膠質細胞腎 臟之腎小球臈細胞（MC)和許多器官之内皮細胞的活化。刺 激可能是疾病的起始因子，但TRC和炎性白血球則是疾病 病理學的Η 士。在經活化之TRC和居留白血球表現並分泌 的事物中，有細胞介素、趨化因子和生長因子超家族的成 員’其促成白血球在炎性反應位置的活化、浸潤及增殖。 由任何特定組織之TRC釋放的獨特趨化因子及其他前炎性 分子，在任何特定的疾病或創傷中，限定了獨特的白血球 浸潤（Lindemans 專尺Clin. Exp. I_unoL， 144:409-17; Puneet 等人（2005) dm. J.尸知❿/. Ce// Mo/.
Physiol. 288: L3-15 ； Boyle, J.J.(2005) Curr. Vase. P/mrmaco/. 3: 63-8 ; Liu 和 Pope (2004)
North. Am., 30:19-39 ； Tetley (2002) Chest 12 1:1 56S-1 59S ； de Leeuw 等人（2005) 从 r. Scz·. 1051:362-71 ; Drinda，等人（2005)及/2eMwaio/· /«i. 25:411-3 ; Raivich 和
261 201235469
Banati(2004) Brain Res. Brain Res. Rev., 46:261-81 I
Tokarska-Rodak 等人（2004) Met/· 1 1:227-31 ； Hou 等人（2004) J. Am. Soc. Nephrol., 15:1889-96 ; Hayashida 等人（2001) 及以· 3:118-26 ;
Garcia-Ramallo 等人，（2002)丄 /mmwwo/· 169:6467-73 ; Kim ^ A(2002) Blood 100:11-6» Perez de Lema(2001) J. Am. Soc. Nephroi，，12:1369-82 Barnes 等人，Euf. Respir. J·, 22:672-88，2003 ; Luster 等人，Nat. Immunol·，6:1 182-90, 2005 ; Charo 和 Ransohoff，*/· Mec?.，354:610-21， 2006)〇 在病理學炎性反應中使用的精確炎性介 素、趨化因子和同族受體，視所涉及之正確白血球亞型、 正在討論中的組織或器官，以及受傷或疾病的階段而定。 此外’炎性介體的釋放可能導發病理學循環變成永存的。 例如’細胞介素和趨化因子經由自分泌和旁分泌機制使 其自己不停地產生並從白血球中釋放。其等亦誘導胞毒化 合物從其等靶定之細胞中合成及釋放。除了神經毒素之 外，居留和浸潤性白血球亦釋放與用於體内平衡相同的分 子^以便介導組織傷害。細胞介素和趨化因子引起細胞黏 連分子（CAMs)和細胞表面抗原（包括細胞介素和趨化因子 ，體)在各種細胞類型上表現，包括白血球、内皮細胞、神 經膠質細胞和癌細胞。CAMs和葡萄糖胺聚 衫易u移行）所必要的，不僅是在體内平衡的環境中)為亦 病理學炎性症狀中，包括癌症轉移。細胞表面抗原的向 201235469 上調節，促使細胞活化，其助成炎性介體的進一步產生。 此外，炎性因子之微環境的組合物，影響不同細胞的表現 型。例如，已知嗜中性白血球表現CXC受體，但在某些情 況下，如敗血性急性肺傷害和再灌注傷害，其等表現CC受 體’包括CCR2。 已經明確地證實，白血球相對上對疾病較專一之亞型 的過度狂熱浸潤、（慢性）活化和增殖（增加數目）為各式各樣 數以百计之不同臨床病症、疾病和創傷的免疫病理學基礎 (參見例如表6 ;表7)。組織-專一的改變主要是不同白血球 亞群佔有領導角色的事件，例如，在CNS炎性反應早期的 小神經膠質細胞；在肺臟之過敏性炎性反應中的嗜酸性白 血球、Th2細胞和肥大細胞（MaCs);在慢性腎臟疾病（ckDs) 中的巨噬細胞、Thl細胞和MaCs。此外，白血球衍生之可 冷f生"體，如血小板衍生之生長因子（pDGF)和轉型生長因 子P(TGF- /3 )分別是其他病理學過程，如血管生成和纖維化 的調卽子。藉著最近的研究，瞭解白血球的絕對數目在疾 病/〖又性炎性反應過程中的重要性，其顯示具有高白血球細 U數的^•級後婦女，有比低計數的那些婦女更冑40-50% 風險的心臟病發作、猝發和死亡（CUshman，Arch. Intern. 65.487-8，2005 ; Margolis，等人，Arch. Intern. Med. 165:500-8, 200S、。% ’肺泡巨噬細胞在慢性阻塞性肺病（COPD) 的發病機制中松涫_ A ^ /貝一角色。與對照組相比較，患有COpd 之患者在氣道、姑· igt 肺霄質、支氣管肺泡灌洗液和痰中有高達 1 〇-倍的MNP數目 的增加。同樣地 患有氣腫的患者，顯示 263 201235469 在組織和肺泡空間中的MNP數目增加&位π +丨 ^ (1 etley, Chest m:156S-159S，2002)。繼承性轉移研究颟示增加腎小球巨 嗤細胞的數目’與巨嗟細胞引起之蛋白尿（腎臟傷害的標 記）、腎小球細胞增殖和細胞過多有關連。更在白血球亞型 數目和多種疾病的嚴重性和進行之間有相互關係（例如
Ikezumi，等人，Kidney Int·，63:83-95, 2003 ; Brightling 等人 Ν· Engl. J. Med_ 346:1699-705，2002 ; Panzer 等人 Transplantation 78:1341-50, 2004)。下文之表 8 陳述支持各 種白血球在各種疾病和病症之病理學中之角色的參考文 獻。表9陳述涉及許多疾病之病理學的例示性白血球族群 和其他免疫細胞或組織居留細胞。 264 201235469 表8 :在疾病之病理學中的白血球 疾病/創傷 例示性參考文獻 關節疾病 Haringman 等人，Ann. Rheum. Dis·，65:294-300, 2006; Adamopoulos 等人，J. Pathol·，208:35-43, 2006 ; Ma 和 Pope，Curr. Pharm. Des·， 11:569-580, 2005 ; Haringman 等人，Ann. Rheum. Dis.，63:1186_94， 2004 ; Koch, Arthritis· Rheum·，52:710-21，2005 0 炎性、jk管生成 和轉移 Lewis 和 Pollard，Cancer Res·，6:605-12, 2006 ; Kakinumama 和 Hwang，J Leukoc· Biol·，79:639-51，2006 ; Allavena 等人，Curr. Cancer Ther. Rev·，1:81-92, 2005 ; Wang 等人，J· Transl. Med.，4:30， 2006 ; Mantovani 等人，Semin Cancer Biol.，14:155-60, 2004 ; Ben-Baruch，Cancer Metastasis Rev，Published ahead of print，2006 o 心血管疾病 Hansson 等人，Annu· Rev· Pathol. Mech. Dis. 1:297-329, 2006; Boyle, Curr· Vase. Pharmacol.，3:63-8,2005 ; Charo 和 Taubman，Circ. Res·， 9:858-66,2004 ; Usui 等人，Faseb J·，1:1838-40,2002。 慢性腎臟疾病 Galkina 和 Ley, J.Am.Soc.Nephrol·，17:368-77, 2006 ; Eddy，Adv. Chronic Kidney Dis.，12:353-65, 2005 ; Segerer 和 Nelson，World Scientific Journal 5:835-44, 2005; Segerer 等人，J· Am· Soc. Nephrol·， 11:152-76, 2000 ; Tipping 和 Kitching，Clin. Exp, Immunol.， 142:207-15, 2005。 疾病和創傷 Minami 等人，J. Pharmacol. Sci.，100:461-470,2006 ; Jones 等人， Curr. Pharm. Des. 11:1223-36,2005 ； Sindem, Front. Biosci., 9:457-63,2004 ; Kim 和 de Vellis, J. Neurosci. Res·, 81:302-13， 2005 ; Offner 等人，J. Cereb. Blood Flow Metab·, 26:654-65,2006 ; Kaul 和 Lipton，Neurotox. Res.，8:167-86,2005 ; Eugenin 等人，J. Neurosci.，26:1098-106, 2006 ; Kaul 等人，Cell Death Differ” 12(附 錄 1):878-92,2005 ; Ubogu 等人,Trends Pharmacol. Sci_, 27:48-55, 2006。 眼8月疾病 Maruyama 等人，J. Clin· Invest., 115:2363-72,2005 ; Klitgaard 等人， Acta. Ophthalmol. Scand. 82:179-83,2004; Wallace 等人，Prog. Retin. Eye Res.，23:435-48, 2004; Yoshida 等人，J. Leukoc· Biol.，73:137-44, 2003。 灸性腸蜗 α-r. η·» A -------- Hanauer，Inflamm. Bowel Dis” 12:S1，S3-9,200ό ; Oki 等人，Lab Invest.，85:137-45,2005 ; Gijsbers 等人，Eur，J. Immunol., 34:1992-2000,2004 ; Middel 等人,Gut 55:220-7,2006 » 月T臟供病 Jaeschke 和 Haseqawa，Liver Int., 26:912-9, 2006 ; Simpson 等人， Clin. Sci. (Lond)，104:47-63, 2003 ; Wald 等人，Eur· J. Immunol. 34:1164-74,2004 ; Srazzabosco 等人，J. Clin· Gastroenterol·， 39:S90-S102,2005 ; Duffield 等人，JClinInvest·，115:56-65,2005。 肺贜疾病 1 Puneet 等人，Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.，288:L3-15， 2005 ; Scott 和 Wardlaw，Semin. Respir. Crit. Care Med.，27:128-33， 2006 ； Pawankar, Clin. Exp. Allergy 36:1-4,2006 ； Barnes, Pharmacol. 265 201235469 疾病/創傷 例示性參考文獻 Rev.，56:515-48, 2004 ; Manabe 等人，J_ Med· Invest” 52:85-92， 2005 ; Razzaque 和 Taguchi，Pathol. Int· 53:133-45, 2003。 皮膚病 Homey，Adv. Dermatol” 21:251-77, 2005 ; Ottaviani 等人，Eur. J. Immunol·，36:118-28, 2006 ; Fischer 等人，J. Clin. Invest., 116:2748-56, 2006 ; Wang 等人，J. Clin. Invest” 116:2105-14, 2006 ; Kim 等人，J. Clin. Invest.，115:798-812,2005 ; Stratis 等人，J. Clin. Invest·, 116:2094-2104,2006 ; Pastore 等人，Eur. J. Dermatol.， 14:203-8, 2004。 全身性疾病 Hussein 等人，J· Clin. Pathol·，58:178-84, 2005; Carulli 等人，Arthritis Rheum.，52:3772-82, 2005 ; Cancello 和 Clement, BJOG，113:1141-7， 2006 ; Tsiligianni 等人，BMC Pulm. Med.，5:8, 2005 ; Hansen 等人， Arthritis Rheum·，52:2109-19,2005 ; Zampieri 等人，Ann. N.Y. Acad. Sci·，1051:351·61，2005 ; Uzun，Chest 127:2243-53,2005。 移植^ Hoffmann 等人，Nephrol. Dial. Transplant·，21:1373-81，2006 ; Nicod， Proc. Am. Thorac· Soc.，3:444-9, 2006 ; Wybum 等人，Transplantation 80:1641-7, 2005 ; Perez-Simon 等人，Drugs 66:1041-57, 2006 ; Ruster 等人，Clin. Nephrol.，61:30-9, 2004; Belperio 等人，Semin. Crit, Care· Med.，24:499-530, 2003。 血管疾病 Aries 等人，IMAJ.,7:768-73, 2005 ; Foell 等人，J. Pathol.,204:311-6， 2004 ; Ishibashi，等人，Circ. Res·，94:1203-10, 2004 ; Wagner 等人， Clin. Exp. Rheumatol.，21:185-92,2003; Falk 和 Jennette，J. Nephrol” 17(附錄 8):S3-9,2004。 肥胖 '~~~' Neels 和 Olefsky，J. Clin. Invest.，116:33-5,2006 ; Weisberg 等人，J. Clin. Invest., 116:115-24,2006 ； Fantuzzi, J. Allergy Clin. Immunol., 115:911-9,2005 ; Martinovic 等人，Circ. J.，69: 1484-9,2005 ; Weisberg 等人，J. Clin. Invest.，112:1796-808,2003)。 266 201235469 表9 :在人 疾病/創傷 ^~ 癌症(所有器官 .類疾病中的例示性白血球細胞類型 例示性白血球亞型
ΤΑΜ ' T、嗜酸性白血球、B、MaC、PMN、DC、 嗜驗性白血球 TAM、DC、T、PMN、B ΤΑΜ ' PMN > DC TAM > PMN MNP ' T ' NK ' MaC
MNP ' T ' PMN MNP ' T > Thl ' PMN ' B MNP ' T ' PMN MNP、T、PMN MNP、T、B、DC MNP、T、PMN、DC、MaC MNP、T、MaC、嗜酸性白血球、B MNP、PMN、T
DC ' T、MNP、B、MaC、嗜酸性白血球、PMN MNP、T、B、DC、嗜酸性白血球、MaC、PMN 嗜酸性白血球、Th2、MaC、B、PMN MNP、PMN、T、嗜酸性白血球 MNP、B、T、PMN、DC -般的生長、i管生成和轉移 乳癌 神經膠質瘤 腎癌 卵巢癌 心血管疾病 動脈粥樣硬化 心肌梗塞 再狹窄 慢性腎臟疾病 糖尿病性腎病變 腎小球腎炎 IgA腎病 狼瘡性腎炎 CNS疾病和創傷 阿茲海默氏症 多發性硬化症 創傷性腦外傷 脊趙傷害 海綿樣腦病 猝發 眼睛疾病 結膜炎 增殖性玻璃體視網膜病變 視網膜炎和虹膜炎 葡萄膜炎 HIV 和 AIDS 炎性腸病 克隆氏症 潰瘍性結腸炎 嗜酸性白血球性胃腸炎 關節疾病 痛風 骨關節炎 骨質疏鬆症 風濕性關節炎 肝臟疾病 肺臟疾病
MNP ' T ' PMN MNP、PMN、T、MaC MNP、T、嗜酸性白A球
MNP、T、PMN、MaC MNP、PMN、T、MaC、DC MNP、T、PMN、MaC、DC、B MNP、T、PMN、B、DC、MaC
MNP > PMN ' B ' T MNP、T、PMN、DC MNP、T、MaC、DC
MNP ' T
MNP、DC、PMN、B、T MNP、Th卜 K、NK、MaC、B、GC 267 201235469
疾病/創傷 例示性白血球亞型 急性肺傷害 PMN ' MNP ' T ' MaC 急性呼吸窘迫徵候群 PMN ' MNP > T ' GC, MaC 氣喘 嗜酸性白血球、MNP、B、Th2、MaC、NK 慢性阻塞性肺病 MNP、T、PMN、DC、MaC、嗜酸性白血球 囊性纖維變性 PMN、MNP、嗜酸性白血球、MaC、T、B 氣腫 MNP、PMN、T、MaC、嗜酸性白 球 嗜酸性白血球性肺炎 嗜酸性白血球、MNP、_P、Τ、GC 肺纖維化 PMN、Τ、嗜酸性白血球、MNP、MaC 皮膚疾病 皮膚炎 MNP、DC、Τ、MaC、嗜酸性白血球、B、PMN 濕奢 MNP、Τ、DC、MaC、嗜驗性白血球 牛皮癬 Τ、MNP、DC、MaC、嗜鹼性白血球、嗜酸性白 血球、PMN 全身性疾病 貝塞特氏症 PMN、Τ、B、MNP、嗜鹼性白血球、MaC 類肉瘤病 MNP、PMN、T、嗜酸性白血球、NK、GC 硬皮病 MNP、T、嗜酸性白血球、MNP ' DC、B、嗜鹼 性白血球、NK 敗血症 PMN ' MNP ' Τ 修格蘭氏徵候群 Τ、Β、MNP、DC、MaC、PMN 全身性紅斑性狼瘡 PMN、Τ、MaC、B、MNP、DC、嗜驗性白血球 肥胖 MNP、Τ、MaC、脂肪細胞 移植 移植物對宿主疾病 MNP、Τ、DC、MaC、嗜酸性白血球、PMN、Β 移植物/器官排斥 MNP ' Τ、DC、MaC、嗜酸性白血球、NK、Β 血管疾病 巨細胞關節炎 GC、MNP、Τ、DC 兩血壓 _P、PMN、T、嗜鹼性白血球 靜脈曲張 MaC、MNP、DC、Τ 血管炎 T、PMN、MNP、嗜酸性白血球、GC 肥胖 MNP、Τ、PMN 關鍵字：B=B細胞；Τ=Τ細胞；ΝΚ=自然殺手細胞；Th2=第2型協助者τ細胞；DC= 樹突細胞；MNP=單核吞嗔細胞(單核細胞' 巨嗤細胞和小神經膠質細胞）；GO巨細胞(多 核融合巨噬細胞）；TAM=腫瘤結合之巨噬細胞；PMN=多單核嗜中性白血球；MaC=肥 大細胞。 2.候選治療劑 已經並正在探討數個瞄準干擾細胞活性，包括例如病 理學白血球和癌細胞活性的途徑。在這許多製劑中經常遇 268 201235469 到：問題是缺少專一性。例如’已經使用免疫抑制劑，如 “皮質類固醇、環磷醯胺和硫唑嘌呤治療炎性疾病，然而， -适些藥物的非專一性免疫抑制效果有數個缺點。首先，損. Q 了伯主防禦，並可能引起威脅生命的感染，且因為缺少 免疫i督而增加惡性的發生率。其次，直接的器官毒性和 破壞代謝過私是常見的（參見例如，Ingelfinger和 见五«/. Md. 353:836-9, 2005 ; Siegal 和 SandS，J"m_ P/mrmaco/. Ther.，22:1-16，2005 ; Duncan 和 Wilkes, Proc. rhn &C·，2:449-55, 2005 ; Perez-Simon 等人， 66:1041-57, 2006)。亦使用其他的途徑以增加專一性，並因 此降低藥物的副作用。例如，已經發展出生物反應改性劑 (BRMs) ’其包含細胞介素和趨化因子受體枯抗劑；細胞介 素和趨化因子抗-配體抗體；抗-細胞黏連分子（CAms)、抗 -GAG試劑和干擾細胞内信號轉導路徑的分子（例如，
Johnson 等人（2004) Biochem. Soc_ Trans·，32:366- 77 ; Johnson 等人（2004) J. Immunol.，173:5776-85 ; Eis 等人 (2004) Arch. Immunol. Ther. Exp.(Warsz) 52:164-72 ； McDonald 等人（2001) IDrugs.，4:427-42 ; Ribeiro 和 Horuk(2005) Pharmacol. Ther. 107:44-58； Wong(2005) Curr. Opin. Pharmacol. 5:264-71 ； de Boer(2005) Drug Discov. 10:93-105 ; Haringman 和 Tak(2004) dri/zrz·"··? 77zer.，6:93-7 ; Barber 等人（2005) Nat Med 1 1:93 3-5 ; Camps 等人（2005) Nat Med 1 1:936-43 ; Schon 等人（2003) hveW Dermaio/.，121:95 1-962)。 269 201235469 然而，BRMs有疾病治療上的限制，因為在體内平衡和 炎性免疫反應中所使用之各種網和級聯的補償、多效和異 質性質。因此’限制BRMs在治療疾病之用途的理由之一 歸因於細胞發送信號機構的冗長和雜音，包括在涉及疾病 之細胞受體和可溶性介體中的冗長。例如，在涉及炎性之 介體中是非常冗長的，像是藉著例如細胞介素、趨化因子 和生長因子系統的成員。 典型地，免疫細胞可表現數個可 體，而每個受體可與一個以上的可溶性配體反應❶例如 趨化因子MIP-Ια、RANTES和LEC與CCR5結合，但亦： 別與CCR1 ; CCR1和CCR3 ;以及CCR1和CCR2結合〇 見表5)。因此，CCR5的拮抗劑不干擾ΜΙΙΜ α、rante 和LEC對CCR卜CCR2A/或CCR3的結合，並持續發们 性影響（參見，例如Matsui等人，（2〇〇2)】Neur〇im_〇 128: 16-22)。在其他實例中，趨化因子Mcp]的抑制，^ 疾病中經由CCR2降低了巨噬細胞浸潤，不是最佳的治邊 劑，因為其他的趨化因子亦使帛CCR2，包括例如Mcp_3 MCP 2 MCP-5、MCP-4 和 LEC，且巨喔細胞表現 CCR2 外的其他趨化因子受體（參見例如表小例如Fujinaka#/ (J.Am.So，Nephr〇l.,8:1 174-8(1997))l|^tfMCp_1^t^ Π:”療個體第4天時，在腎小球中降低了單核細游 '細胞的數目’以及蛋白尿，然而在第8天之後，拍 -MCP-1治療沒有降低細胞浸閏、 .„ 尿蛋白排泄或新月體布 在該系統中，不僅由⑽-1活化巨嗤細胞，還 270 6、 201235469 藉著其他因子造成腎小球的傷害。例如，除了其他的CCR2 酉己體之外，巨噬細胞亦表現CCR1、CCR3、CCR5CCR8， 並在某些情況下表現CXCR1和2，其中一些或全部可能曾 經是與所觀察到之病理學有關的因子。亦已經在關節炎試 驗中’觀察到抗-MCP-1治療對臨床或免疫組織學的改善沒 有影響（參見例如Haringman等人，（2006) 及心謂， 54:2387-92) 〇 因此’在單一細胞類型是一特定疾病之唯一原因的錯 誤前提（即使有也是罕見的）下，大多數的候選治療劑靶定一 個而非所有由白血球釋放或活化的生化介體，或其等殺死 一種特定的白血球亞型。治療疾病、病症或創傷的較廣泛 方法是排除涉及疾病之病理學的細胞組份，如包括病理學 ^球及/或TOCs @白&球Q在白血球之數目和增加活性 與疾病之嚴重性和測量到的病理學參數之間有相互關係（參 見例如 wada 等人（1996); zoja 等人（1996);和 chiang 等 i (1996; Nikolic_Paters〇n 和級心，ν_γ〇ι 咖 η㈣， 16(附錄5):3_7, 2〇〇1)。例如，病理學白血球，如經活化之 白血球的排除，廢止了炎性介體和毒性分子的產生，並降 低白血球交易，其為許多疾病惡化的原因。這類候選治療 劑的範例為配體-毒素共軛物，特別是靶定經活化白血球的 趨化因子-受體乾定共輥物。因此，這類共輛物為具有炎性 組份或共享基礎炎性病理學之疾病的候選治療劑。 3.配體-毒素共軛物 其專一地le«定 已經產製且為已知的配體-毒素共軛物 271 201235469 一或一個以上涉及疾病之病理學的細胞族群。在這些中包 括趨化因子毒素共軛物，如在美國申請案第〇9/36〇,242號； 09/453,85 1號；以及09/792,793號，現為美國專利第 7,166,702號、7,157，418號和7,192,736中描述的。這類共 軛物經由辨認（藉著一或一個以上的專一細胞表面受體”靶 定一個’且典型地靶定一個以上細胞類型，並被内化，導 致經由母素部分殺死細胞。使用這類毒素共扼物，已經證 實了專一且明智地根除白企球及其他細胞，包括病理學白 血球’在疾病治療上是有效的（參見例如，McCarron等人 (2005)，Mol· Interv.，5:368-80 ; Pastan 等人（2006)，Nat. Rev. Cancer 6:559-65; Frankel 等人（2003)，Semin. Oncol.，30: 545-57 ； Pastan(2003), Immunol. Ther. 52: 338-41 ；
Kreitman，（2006) AAPS. J·.，8:E532-5 1 ; Carter (2006)，Nat.
Rev. Immunol., 6:343-57 ； Cohen(2005) MedGenMed., 7:72 ； Edwards 等人（2004) N_ Engl. J· Med. 350:2572-8 1 ; Zeisberger 等人（2006) Br. J Cancer，95: 272-81 ; Cross 等人， J. Neuroimmunol. Aug 10，2006，（已線上發表）；Cailhier 等 人（2005)，J. Immunol.，174: 2336-42 ; van Roon 等人（2005) Ann. Rheum. Dis. 64: 865-70 ; Sfikakis 等人（2005) Arthritis Rheum.，52: 50 1- 1 3 ; Nikolic-Paterson 和 Atkins(2001)
Nephrol· Dial. Transplant” 16:附錄 5，3-7; Rajan 等人（1998)， J· Immunol. 160:5955-62; Hu 等人（1997) Cell Immunol.，177: 26-34; Schuh 等人（2003) Eur. J. Immunol., 33:3080-90; Taoka 等人（1997)，A/'ewroscz’ewce 79:1 177-82 ; Wolff 等人， 272 201235469 (2004) J_ Vase. Surg.，39:878-88 ; Duffield 等人，dw. 乂 Paί/ζo/.，167:1207-19，2005)。 在本文中提供含有經修改RIP毒素多肽的配體_毒素共 輕物。可使用該共軛物來治療各種為其設計含有未經修改 RIP毒素之共輛物的疾病和病症。如同上文討論的，這些經 修改之配體-毒素共軛物對宿主細胞展現出降低之毒性，藉 此而能夠以高產量生產該毒素。增加這類經修改配體毒素 共軛物的生產，對其等作為候選治療劑以及作為治療經靶 定疾病和病症之治療劑的用途是有利的。經修改之配體-毒 素共軛物，包括含有經修改SA1的那些，可用來排除細胞， 或另行抑制其生長，或改變其代謝。經靶定之細胞是涉及 疾病或病症之病理學的那些，例如涉及炎性反應、血管生 成或癌症的細胞。 在含有經修改毒素之共軛物令，有趨化因子配體-毒素 共軛物，稱為白血球族群調節子（LPM)。如下述，經由利用 在這二細胞上表現的經高度調節之趨化因子受體，設計 來根除經活化的病理學（炎性）白血球及其他細胞，或改 變其代謝。LPM的配體部分，經由表現同族之趨化因子受 體，成為得以進入細胞内的原因。表現適當之趨化因子受 體的細胞，會攝取LPM分子，其包含抑制該細胞生長、殺 死該細胞或另行改變其代謝(如藉著降解病毒核酸或藉著干 擾蛋白質合成)的毒素。當移除或抑制或殺死病理學細胞 =在細胞中涉及疾病過程的通訊越來越少，且不再合成 &尺Ιι冑°因此’伴隨著關閉涉及炎性反應之不同過程 273 201235469 或其他疾病過程（血管生成，在這裡經靶定之細胞為内皮細 胞，如表現VEGFR的那些）的多重刺激。 本文提供之方法允許產製並分離經修改毒素，如Rlp， 或含有這類毒素的共軛物，其對在其中產生以便用在共軛 物中’或以共軛物之形式產生其等的宿主細胞有較低之毒 性。因此，可產生較高的量。因為毒素是如此有效，降低 毒性10-倍、100-倍，甚至1000_倍或更多，不損害其在治 療共軛物中的用途。可藉著本文之方法修改熟諳此藝者已 知或由熟諳此藝者製備的任何含有毒素，特別是RIp毒素 之共轆物，或可藉著以本文提供的經修改毒素置換該毒 素。許多的這類共軛物為已知的。這些包括在美國專利第 7’166,702號、7，157,418號和7，192,736號中的那些，以及 細胞介素共軛物，如生長因子和抗體，及其他多肽靶定劑 的共輛•物。 在配體-毒素共軛物中，包含具有配體，如趨化因子或 其活性片段，其直接或間接與SAi之截短形式，像是例如 如本文描述之變體1或變體2 S A1連接的那些。這類共軏 物的範例為LPMla和LPMlb，分別在SEQ ID NO:38和40 中陳述。特定而言，已知或發現含有與經修改S A 1 (包括但 不限於任何在本文之方法中鑑認的經修改S a 1，如突變種變 體1 SA1(即變體3)或突變種變體2(即變體4)SA1部分，或 任何其他經修改SA1)連接之趨化因子配體的共軛物，展現 出降低的毒性。用在本文之治療方法中的這類LPM之範例 為在任何 SEQ ID NO:42、44、46、48、50、52、54、56、 274 201235469 58、60、62、64或66中陳述的任何LPM共軛物。 -任何細胞或細胞群均可被本文提供之配體-共軛物靶 ' 定’只要該細胞表現一或一個以上的細胞表面受體，其與 配體-毒素共軛物交互作用，藉此導致該共軛物的内化。例 如’可藉著將趨化因子受體靶定劑與經修改毒素連接，靶 定任何表現一或多個趨化因子受體的這類細胞。在本文中 提供例示性共輛物’並包括任一或多個本文提供的LPM分 子。在經靶定之細胞中，包括白血球或其他免疫細胞，特 別是經活化之白血球和免疫細胞，像是但不限於單核細 胞、巨噬細胞（包括肺泡巨噬細胞、小神經膠質細胞、庫弗 細胞）、樹突細胞（包括未成熟或成熟的樹突細胞，以及朗格 漢斯細胞）、T細胞（包括CD4陽性的，像是但不限於Thl 及/或Th2細胞，或CD8陽性的細胞）、B細胞、嗜酸性白血 球、嗜鹼性白血球、肥大細胞、自然殺手（NK)細胞和嗜中 性白血球。再者，亦包含任何組織居留細胞（TRC)，如腎小 球膜細胞、神經膠質細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘤細 胞'纖維母細胞、脂肪細胞、星狀細胞及/或滑膜細胞。趨 化因子受體在細胞上的表現，可以是組成上的或可以是可 誘導的，如因為細胞的活化。典型地，靜止的白血球或從 事其他功能的白血球不是LPM的目標，如任何本文提供的 (McDonald 等人，IDrugs，4:427-42, 2001)。通常，lpm 對可 誘導之趨化因子是專一的，如在經活化之細胞上因為炎性 或其他病症而被向上調節的那些趨化因子，其可變成病理 學的’並使各種疾病或病症之徵候惡化。因此，僅耗盡攜
275 201235469 帶經乾定之趨化因+受體的經活化白幻求或其他經活化之 TRC。 例如，在許多情況下，為了開始及維持疾病過程（例如 癌症）或炎性反應，所涉及之細胞被活化，並向上調節其等 對各種配體之細胞表面受體的表現。因為經常向上調節涉 及創傷和疾病的受體，故增加了由正確細胞内化治療劑的 可旎性。因此，靶定在疾病過程中向上調節的細胞受體， 增加了特定毒素共軛物治療特殊疾病或病症的專一性。 在本文中⑺療之疾病或病症的範例，為具有與疾病病 理學有關之免疫或炎性細胞組份的那些，如在上文表8和9 中討論的。這些包括，例如像創傷之類的病症，以及具有 過敏血管生成、自體免疫、炎性或腫瘤生成之組份的任 何疾病。因此，在本文中考慮到靶定經活化的細胞，像是 但不限於任何經活化的白血球，如任何經活化的免疫效應 細胞及/或任何經活化的組織居留細胞或其他涉及疾病或病 症的細胞，其表現一或一個以上的趨化因子受體，以便利 用配體-毒素共軛物，如本文提供的任何LPM共軛物，來治 療疾病或病症。 然而’藉著毒素共軛物治療任何疾病或病症，該共輕 物包括靶定涉及血管生成和癌症及其他疾病之細胞的那 些’其可藉著以本文提供之經修改毒素置換毒素多肽部分 來修改之’或可藉著本文提供之方法來修改之。例示性 核准之治療劑，可以是經修改的，包括例如吉妥珠單抗-奥 坐米星（Gemtuzumab-ozogamicin)，是由對抗CD33的經人類 276 201235469 化之單株抗體構成的配體_毒素融合蛋白；地尼介白素地弗 毒素（Denileukin diftit〇x)是由人類IL_2配體構成的配體-毒 素融合蛋白。. 挑選配體·毒素共軛物來治療所挑選之疾病或病症 如同上文在表8和9中討論並舉例說明的，各種細胞 類型惡化及/或促成各種疾病、病症及其他病症的病理學。 在特定的疾病或病症中，可能組合出所涉及之白血球亞型 或其他細胞類型的特徵，以及所表現之經結合細胞表面受 體的類型和分布。因此，可設計配體_毒素共軛物，其靶定 特定的細胞表面受體或受體們，藉此提供進入受影響之細 胞内的程式，以及治療特定疾病的機制。如上述，這類配 體-毒素共軛物通常含有經修改RIP毒素或其活性部分，如 ’’··£ 改S A1 ’其在進入目標宿主細胞後，殺死該細胞，成為 治療疾病的工具。因此，挑選靶定宿主細胞的經選擇配體 部分，是設計配體-毒素共軛物的重要因素。為了治療疾病 挑選特定的配體-毒素共軛物，需要下列步驟：丨）挑選欲治 療之疾病；2)決定過量出現及/或促成這類疾病的細胞；3) 決定細胞表面受體在該所挑選之細胞類型上的表現特徵； 4)與在其他可能亦涉及該疾病之細胞類型上表現的細胞表 面受體產生關聯；5)選出針對所選擇之細胞表面受體的配 體：並6)建構配體-毒素共軛物。 正確要乾定的細胞介素、趨化因子、生長因子及/或其 同族受體’視在特定疾病或病症中所涉及之精確細胞族 群、正在議論的組織，及/或傷害或疾病之階段而定。例如， 277 201235469 已經顯示在特定疾病中表現且著名的特定炎性趨化因子 體/受體軸。因此，有可能藉著選擇靶定其在特定疾病和: 傷中著名之白血球亞型上的同族受體之相關配體(即趨化因 子、細胞介素、生長因子），而設計㈣合特定疾病的藥物。 表9陳述疾病，以及成為這類疾病之病理學或惡化原 因的白血球和其他細胞族群的例示性列表。熟諳此藝者知 道或可鑑認對疾病進行有貢獻的細胞族群，如任—或多個 在表9中陳述的細胞。藉著配體-毒素共軛物，如可使用任 何在本文中提供的’乾定任一或多個涉及疾病或病症的細 胞，以治療該疾病或病症。在這類治療中，依據在細胞或 細胞族群上表現的細胞表面受體，以及配體對這類受體的 專一性，挑選欲使用的配體-毒素共軛物。熟諳此藝者知道 或可錕認在特定細胞類型上表現的受體，包括考慮在議論 中之組織或傷害及/或疾病之階段。例如，可使用例行的表 現研究，像是但不限於流式細胞分析或即時pCR方法，判 定在細胞或細胞族群上的受體表現。受試的細胞可以是細 胞株、經培養的原始細胞，或直接獲自患有疾病或病症之 患者的細胞（即獲自患者之組織、血液或其他來源的細胞）。 同樣地’可使用熟諳此藝者已知之例行的結合測定，如本 文描述的，評估配體-受體專一性。例如，為了經由流式細 胞分析、螢光測定法或放射性工具’直接測量與所挑選之 目標細胞的結合’可藉著直接以瑩光或放射性標示配體， 偵測配體結合。典型地，在4°C下進行這類結合測定，但亦 可在3 7 C下進行’以判定被把疋之細胞表面受體是否介導 278 201235469 特定配體的細胞攝粒作用和内化。為了配體-共扼物融合， 内化是必要的考量，因為毒素必須進入細胞的細胞質内， 以便發揮其毒性影響。 以下的时§命描述配體-毒素共辆物的設計和挑選，藉著 基於趨化因子及其同族受體的已知表現特徵挑選白血球族 群調節子來舉例說明。類似的策略為已知的，或可用來設 計其他的配體-毒素共軛物。該討論只意圖舉例說明。配體_ 毒素共軛物的設計需要疾病專一的考量，包括例如疾病的 階段和嚴重性。熟諳此藝者可設計並在各種毒性活性的試 管内測定中，如對抗特定細胞或細胞族群之毒性活性，以 及在疾病的活體内測定中，像是但不限於任何在本文中描 述的，測試配體-毒素共軛物。 白a球族群調節子的挑選和設計 協助治療特定疾病之LPM的設計，需要挑選適當的靶 定劑，像是例如趨化因子配體。根據欲治療之疾病或病症， 挑選用在共辆物中的趨化因子。按照第一個需求鑑認與 特定疾病或病症有關的白血球或其他細胞。如同本文討掄 的，對疾病有貢獻的各種白血球族群為已知的（參見例如， 表8和表9)，或可判定之。第二個步驟是選擇特定的趨化 因子配體，其靶定一或一個以上在欲靶定之—或_個以上 、’田胞族群上表現的趨化因子受體。基於趨化因子對受體的 專:性，以及趨化因子受體在各種細胞上的表現特徵，選 擇廷類趨化因子配體。纟白血球亞型上的趨化因子受體表 現’以及趨化因子配體·受體交互作用，為在技術領域中已
279 201235469 知的（參見例如，表5釦— π , ，或可由熟諳此藝者以實驗決定。 特疋而8，為了用在配體-毒 趨化因子H定m t而挑選的較佳 疋^在炎性和病理學條件下被誘導，但在免 疫體内平衡期.間不會在矣 、、匕上表現之趨化因子受體的趨化 。歹’如，表7陳述在炎性（即病理學）和體内平衡條件下 •的趨化因子受體特徵。這類的表僅作為舉例說明，並應瞭 解趨化因子受體的經誘導 、 泠导之表現，在則後文中依賴並受到
各種因素的影響，你丨石A 對刺激、疾病、疾病之狀態或嚴重 性’以及受試的特定細胞族群。熟諸此藝者知曉或可以實 驗決定趨化因子在各種病症或疾病狀態_，在細胞或細 胞私群上的特徵表現（即化學足跡）。挑選對病理學細胞具有 活吐ϋ其他旁觀者或靜止白血球沒有的輕定劑，確保 靶定而殺死對疾病進行有貢獻的經活化之細胞。 某些趨化因子似乎在特定的疾病狀態中，具有比其他 更夕的衫響。例如，MCp_丨表現似乎調節急性實驗性自體 免疫腦脊髓炎（EAE)，而驗]α表現則與復發性EAE的嚴 重性有關。在其他實例中，阿茲海默氏症（AD)腦樣本的免 疫組織化學染色指出MIP- 1召表現的優勢超過數個其他的 趨化因子。因此，例如，MIP-1 α和MIP-1 /3將分別會是治 療MS和阿兹海默氏症之LPM共軛物的配體選擇。配體， 如MCP-1、ιρ_10和RANTES則會用來治療人類ms，因為 在疾病中分別向上調節其等之同族受體CCR2、CXCR3和 CCR5。嗜酸球趨化蛋白1、2和3對CCR3顯示出高專一性， 其優先由嗜酸性白血球表現。因此，可使用嗜酸球趨化蛋 280 201235469 白LPM對付嗜酸性白血球增多性（過敏）疾病，包括各種肺 臟和皮膚疾病，包括氣喘、嗜酸性白血球增多性_肌痛徵候 群、鼻過敏、異位性皮膚炎和息肉病。在額外的實例中， PF-4是用來乾定内皮細胞的趨化因子，並可用來治療血管 生成或其他有關的血管；^ ,降、&, 扪血吕原r生疾病，如眼睛的病症或糖尿病 (參見例如 W 0 9 5 /12 4 1 4 )。 因此，考量其他的因素，像是例如疾病的階段、疾病 的厭重性，以及治療的時間和期Fb，，亦影響趨化因子配體 的選擇例如在一次組織傷害的早期可能想要展現出高 程度之受體專-性的特殊趨化因+ LpM，在那裡例如，小 神經膠質細胞及/或巨嗟細胞正在發動炎性反應。利用極專 -的製劑移除這些細胞，可降低周圍還是良性之細胞活化 的可此。當在疾病的中間或晚期，招募其他的白血球亞群 夺可月b心要車乂廣效的細胞專一性。此外，適當廣效的趨 因子LPM a對表現多類型細胞介素受體的那些受限制之 白血球族群遞送極強的打擊。 例々MCP'1、唁酸球趨化蛋白和SDF-Ιβ是展現受限 隹吊專之支體結合特徵的趨化因子配體之範例。這 類配體經由受限击,丨π & & _ <, 制亞組的可利用配體，靶定非常專一的細 ⑽貝型。MCP-3和RANTES是具有廣泛細胞和配體結合特 徵之配體的實例。這類趨化因子配體可能是與單一或廣泛 床病症有關的。靶定廣泛細胞-類型的配體，使用可在所 有：胞或只有某些細胞上表現的受體亞型。這主要是對一 、疋病症##或對一系列病症常見之細胞類型的功能。 281 201235469 基於以上的考量’可設計LPM。例如，若考慮治療肺 . 臟疾病，如急性肺傷害（AU)、急性呼吸窘迫徵候群（ards) 或慢性阻塞性肺病（C0PD) ’熟諳此藝者已知（即如在上文表 9中陳述的）或可決定在這類疾病中表現的任—或多個細胞 類型’包括PMN、MNP、T細胞、肥大細胞、未成熟或成 熟的DCs，及/或嗜酸性白血球，其表現一或多個例如 CCR1、CCR2和CCR3。因此，在設計用以治療任一或多個 ALI ARDS或COPD之配體-毒素共輕物時，第一個步驟是 挑選對一或多個這類趨化因子受體專一的配體（例如 MCP-1、MCP-3或嗜酸球趨化蛋白p第二個步驟是瞭解特 疋之趨化因子受體在涉及疾病之不同病理學白血球亞型上 的表現。在治療肺臟疾病時，可考慮使用具有與經修改Rip 毒素（如任何由本文之方法發現及/或在本文中描述的）直接 或間接連接，作為配體部分之MCP-1、MCP-3或嗜酸球趨 化蛋白的配體-毒素共輛物。在這類配體_毒素共輥物中，包 含 LPMld。 下表概述一些為了治療所挑選之疾病和病症，用來設 計LPM的例示性配體。 282 201235469 表ίο:例芝性配體和經治療之疾病 __配體 MCIM 和 jj RANTES、IP-10、IL-8、GROa MCP·1 和 RANTES、SDF-Ιβ MCP-i #°TTrantes - IP-10_ 嗜酸球趨化蛋白、RANTES、MDC、MCP-1 SDF-Ιβ 疾病/狀況 動脈粥樣硬化和再狹窄 傷性腦外傷、 多發性硬化症
HIV 嗜酸球趨化蛋白、MCP-1和4、MDC、IL-8 ENA-78 炎性腸病 MCP-1-4、RANTES、IP-10、MIG、IL-8、 ENA-78、GR〇a、I-TAC 炎性關節疾病(例如，關^^^·
MIP-la、ΜΙΡ-Ιβ、MCP-1、2、3、4、RANTES IP-10、IL-8、ENA-78_ 嗜酸球趨石、MCP-4、MDC 急性肺傷害和纖維化 嗜酸性白血球
見、血管炎矛 MCP-1 ' IL-8 SDF-Ιβ、IP-10、MIG、IL-8、ENA-78、GROa MCP-卜 317?、RANTES、SDF-Ιβ MCP-1 > ENA-78 MCP-1、RANTES、IP-10 為了那個目的’已經根據涉及疾病之病理學 主要細胞類型，設計許多趨化因子-配體毒素融合“的 '^白（即
LPM LPM)來治療疾病。在表U中陳述治療特定疾病的例示性 283 201235469 表1 1 :白血球族群調節子的例示性疾病應用 趨化因子配體-毒素 例示性臨床應用 MCP-1-SA1 變體 4(LPMld) 腎臟、CNS、肺臟、心臟和關節疾病、移植 嗜酸球趨化蛋白-SA1變體4 (LPM2) '過敏性肺臟、鼻和皮膚疾病、嗜酸性白血球性胃 腸炎 SDF-lp-SAl 變體 4(LPM3) 癌症、關節疾病和HIV IP-10-SA1 變體 4(LPM7) 癌症、CNS、關節、腎臟、移植 MCP-3-SA1 變體 4(LPM8) CNS、心臟、關節、腎臟 Gro-a-SAl 變體 4(LPM4) 癌症和關節疾病 IL-8-SA1 變體 4(LPM6) 癌症、肺臟、腎臟、關節疾病 4.例示性疾病 已知或可製備靶定涉及病理學之細胞，如與異常血管 生成有關的那些、與為炎性組份之基礎的那些、腫瘤細胞 和其他異常細胞、經病毒感染之細胞的配體-毒素共軛物。 欲治療之特殊疾病指定所挑選的配體（靶定劑）或其片段。任 何的這類共軛物，可包括本文提供及描述的經修改毒素（所 有的這類說明，在本章節及所有其他章節中，均以引用方 式納入本文中）。 疾病和疾病狀態的範例，是與各種類型之炎性免疫細 胞，包括白血球及其他有貢獻的上皮或内皮來源之細胞的 增殖、活化和移行有關的那些。這些事件的組合，在受傷 或疾病之處產生非常具侵略性且不親切的環境。數百種疾 病和病症的細胞生物學涉及大多數的器官系統，涉及病理 生理學之炎性反應。在上文表9中舉例說明許多這些病理 生理學疾病的細胞組份。可利用任何在本文中提供及/或按 照本文描述產生的配體-毒素共軛物，包括任何含有經修改 RIP，如經修改SA1部分的配體-毒素共軛物，來治療這類 284 201235469 •和病症。在本文之方法中使用的這類配體-毒素 ==應’特別是任何本文提供的lpm，其已： :::?，以治療特定的疾病。因此，本文提供之方法 ^ 疋經過設計，以暫時抑制㈣抑白血球亞型（及/ 或其他細胞，如脂肪細胞、 ρΛ... ^ ^ 星狀、，，田胞及其他）的活性，並移 除補給炎性機制和二次傷害的來源。 =不性病症和疾病包括，但不限於任何在上文表9中 東^的，像是例如心血管疾病，包括猝發、動脈粥樣硬化 =壓；肝臟疾病；肺臟疾病，如氣喘、慢性阻塞性肺 :ΡΕ〇、急性肺傷害和急性啤吸箸迫徵候群（細s);炎 性關節疾病，如風濕性關節炎和骨關節炎；急性過敏、慢 性腎臟疾病，包括糖尿病性神經病變和腎小球腎炎；全身 丨生疾病，如全身性紅斑性狼瘡和肥胖；hiv感染及相關疾 病，包括癡呆、腦炎和腎病生長、新血管化（企管生成） 和數個類型癌症的轉移’包括所有器官的癌症，如腦、乳 房、肺癌，以及印巢癌；中樞神經全身性疾病，包括阿兹 海默氏症·，唐氏症；多發性硬化症；脊骑傷害；海綿樣腦 病：炎性腸病，如敗血症；潰瘍性結腸炎和克隆氏症；皮 膚疾病，如濕療和牛皮癬；眼睛疾病，包括葡萄膜炎和視 ，周膜炎及虹膜炎，以及增殖性玻璃體視網膜病變；和移植， 如移植物對宿主疾病（GVHD)和移植物/器官排斥。 在下文中描述涉及追些疾病中一些之病理學的白血球 和其他細胞類型的說明。這些說明僅意圖舉例說明，無意 限制特疋的LPM共軛物毒素或特定的配體_毒素共軛物。熟 285 201235469 諳此藝者可基於已知的細胞組机 °又a十並挑選用於治療任 何心要之疾病的配體-毒素共輛物。可由熟諸此藝者決定特 殊的治療和劑量。在評估治療時的考量包括：&治療之疾 病、涉及該疾病的細胞組份、該疾病的嚴重性和過程、是 否為了預防或治療目的而投與該分子、先前之治療、患者 的臨床病史及對治療之反應，並由負責醫師自行斟酌： a.癌症 可將癌症視為炎性疾病，即使細胞並不屬於血液學來 源的。癌症細胞展現出許多被認為屬於白血球亞群的表現 型，並按定義可被看做是炎性細胞。其等有分泌蛋白酶和 前炎性介體（包括趨化因子），並執行吞噬作用的能力。此 外，癌細胞表現各種受體，包括細胞介素、趨化因子、生 長因子（GF)受體，CAMs以促成轉移；並經歷轉分化。對後 者舉例說明，結腸癌細胞經歷上皮·間葉轉.變，伴.隨著 CXCR1和CXCL8的表現增加，其提高運動性和侵入性 (Bates 等人（2004)五χρ· Ce// 299:315-24)。白血球浸潤 的定量檢查已經顯示，例如，腫瘤結合之巨噬細胞（ΤΑΜ) 和淋巴細胞構成乳癌中5 0%的細胞團塊，且無疑可被當作 腫瘤（Elkak 等人（2005) ·/· Carc/wog·，4:7 ; Leek 等人（1996) Cawcer Ae·?. 56:4625-9 ; Miirdoch 等人（2004) 5 104:2224-3 4 ; Queen 等人(2005) Corwcer 65:8896-904)。 MNP和招募之單核細胞分化成TAM，提供生長因子並協助 血管生成和轉移的事實’證明該觀念（參見例如’ Ueno等人 (2000) C/h. Cawcer Λα.，6:3282-9; Valkovic 等人（2002) 201235469
Kz.rc/iowsJrd，440:583-8;以及在表8中的參考文獻）。 b.腎臟疾病 有許多種類的腎臟疾病’將其中一些分成亞群。這此 疾病包括但不限於急性腎炎徵候群；抗-腎小球基底膜疾 病；常染色體-顯性的多囊性腎病；腎小球腎炎（GN)、抗 嗜中性白血球細胞質抗體GN;糖尿病性腎病變；糖尿病性 腎小球硬化症；局部性腎小球硬化症；古德巴斯德症候群 (Goodpasture’s syndrome)、HIV 腎病變；特發性新月體 gn ; 特發性快速進行之GN ; IgA腎病IgAN ; IgM系膜增殖性 GN ;狼瘡性腎炎；膜增殖性GN(MPGN、I、π、m);輕 微腎小球病變；膜腎病變；腎炎徵候群；多瘤病毒腎病變； 鏈球菌後的GN;快速新月體GN;腎移植排斥；腎血管炎（例 如韋格納氏肉芽腫）和腎小管間質性腎炎。小部分的腎臟疾 病可解決’但大多數常見的病變是迅速或緩慢衰退成無法 治癒的慢性腎病（CKD)〇CKD患者最後衰退成腎衰竭和末期 賢病（ESRD)。ESRD使患者需要依賴透析治療或移植。 白血球和趨化因子在腎病中及在腎同種移植排斥中扮 /貝重要的角色。可藉者經活化之白血_球、自身抗體、免疫 複合體免疫球蛋白、DNA物種、染色質單體、AGE、補體 或這些物質的組合，發動CKDs中的炎性反應。一個重要的 發動機制是介導腎小管和腎小球傷害的抗體。抗體與不可 溶之腎小球抗原形成複合體，及/或與循環性抗原形成免疫 複合體，最後都沉降在腎小球的系膜中。活化數個腎和非_ 腎細胞，並釋放出許多不同種類的可溶性介體，包括細胞 287 201235469 介素、趨化因子和促纖維化生長因子至環境内。一旦活化 浸潤性白血球和所有固有的腎細胞，包括纖維母細胞；腎 小球膜細胞（MGCs);腎小管上皮細胞（TEC);足細胞；和腎 小球壁的上皮細胞（PEC)，便能夠表現這些相同的前炎性介 體。CKD的普遍性病理學涉及腎盂腎炎（pn)或腎臟的感 染；腎小球基底膜（GBM)和壁基底膜（PBM)的瓦解；白血球 〉父 >間’新月體形成；纖維化；腎小管和腎元的破壞；以及 崩清的腎小球。除非有解決或醫學介入，該疾病會繼續前 進至炎性反應、重複腎的傷害、纖維化並進行至ESRD ^巨 嗤細胞/單核細胞、T細胞和MaC是涉及CKD的著名白血 球。在CKDs中調節這些白血球亞型之活化、移行和增殖的 數個趨化因子及其同族受體，包括MIP-l α /CCR1、 ENA-78/CCR5 、人神經趨化蛋白/CX3CIU 、 MIGAP-Ltac/cxc^ 和 IL_8/CXCR1/2。如同藉著動物 模式和人類研究證實的’巨噬細胞/單核細胞和 MCP-1/CCR2在數個不同類型之CKD中的角色是極為重要 的，並使該趨化因子/受體軸成為一強制性的治療介入（參見 表8的參考文獻並沒有成功治療CKD之所有症狀的治療 劑，且很少沒有副作用（例如Busauschina等人，TransphM Proc·，36:229S-233S，2004; Slattery 等人，Am 】path〇i i67 395-407，薦；Bir 等人，j.RheumatQl，33:i85'鳩）。 因此，需要對於CKDs的不同治療方法，如在本文中提供的。 c.脊髓傷害（SCI) " 脊髓·傷害（SCI)的成果是最初 之機械和局部缺血創傷 201235469 連同細胞離子體内平衡瓦解的結果，迅速隨之而來的是藉 由、’’i活化白血球亞型_包括小神經.膠質細胞（Cns的居留巨 嗟細胞的作用、白血球炎性介體產生和強大之炎性級聯施 的一人、’且織傷害。在數分鐘内觀察到這些級聯，並進行 數週’接著是-段需要内源修補和再生的部分恢復期。可 根據神經7L和寡樹突細胞之壞死和細胞凋亡的細胞死亡； 細胞的興奮毒性；血-腦障礙/血_脊髓障礙瓦解；反應性神 經膠質細胞增生（其導致神經膠質細胞結痂）；新血管化；脫 髓勒；喪失感覺和運動功能#⑽㈣慢#疼痛㈣測二 人傷害（Jones 等人（2005) Curr. Pharm. Des.，1 1:1223-6;
Klussman ^ Martin-Villalba(2005) J. M〇l. Med., 83.657 71 , Lee #A(2000) Neurochem. Int., 36: 417-25 ； =Tigue 等人（1998) j. Neur〇sci Res，53: 368 76 ; ^議 等人（1998)邮· Arewro/，151:77 88 ; 和 SChWab(1"7) £以·乂 cz··，9: 1422_38 ; 和
Waxman(2006) X Neurosci., 26: 4308-17 ； Abbadie, Trends Immunol.，26:529_34, 2〇〇5)。藉著最初的物理傷害產生之原 始壞死，與藉著白血球和星狀神經膠質細㈣生之炎性介 體發動的細胞凋亡事件的組合，在SCI中導致二次傷害’ 且病理學機制類似在各式各樣CNS創傷和疾病中的二括 例如創傷性腦外傷；促發；多發性硬化症(ms)、阿茲海默 氏症和與HIV有關的癡呆（參見表8之參考文獻）。 在SCI中的急性炎性傷害持續數天，但與修補機 制部分重4 ’如軸索生長和受限制的再髓鞘化，部分是歸 289 201235469 因於分化性前驅物寡樹突細胞。現在已經鑑認MNPs(小神 經膠質細胞和巨噬細胞）為修補的促成者。這些細胞吞噬死 亡的細胞及碎屑’並提供基質蛋白質生長因子、神經營養 因子和細胞介素’其協助CNS修補。MNPs在傷害和修補 中的雙重角色’在其他白血球介導之疾病中是很明顯的， 包括實驗性腎小球腎炎、肝傷害；頸動脈傷害和MS (Duffield 等人（2005) ·/. d /„v_ ;
Duffield(2003) C"«心ζ· 104:27-38; Danenberg 等人（2002) Cz>cw/aho« 106:599-605; Raiyich 和 Banati (2004)心ah Λα. 46:261-81)。實驗的SCI研究已經證實暫時 抑制MNP活性或外滲作用，並稍後撤回治療，允許增加組 織保護並改善行為成果。這一部分歸因於MNPs或許還有T ，、·田胞的修補活性（Jones 專人（2005) Cwrr. ZDes.， 11:1223-36; Gris 等人（2004)«/· A/'ewrosin·. 24:4043-5 1 ; Wells 等人（2003)仏azi 126:1628-3 7)。在實驗的SCI早期耗盡 PMN或巨噬細胞，已經顯示類似的肯定成果（Ta〇ka和
Okajima，Prog. Nenrobiol.，56:341-58, 1998 ; Popovich 等人 (1999) Exp. Wewro/.，158:35 1-365)。在 SCI 中，涉及二次組 織傷害之病理學的趨化因子配體和受體有不同的表現，允 許鑑認使用LPM的目標受體（Glaser等人（2004) J. Neurosci.
Res.，77.701-8 ’ Glaser 等人，（2006) J· Neurosci. Res· 84.724-34 , Ghirnikar 專人（2000) J. Neurosci. Res. 59.63-73，McTigue 等人（1998) J. Neurosci. Res·，53: 368-76 ; Lee 等人，Neurochem. Int. 36:417-25，2000)。已知 290 201235469 在SCI之後，僅需要一些殘餘的軸索（10_15%)完成重要的功 -能恢復（Jones 等人（2005) Cwrr 隱 ，u: 1223 36)。 ' 因此’在急性期使炎性反應受挫，是可.行的治療方法。根 除經活化的病理學白血球是一種手段。 d.過敏 已經將過敏反應分成四種（且有時重複）主要類型 (I -IV)，其等全都可能與免疫_介導之組織傷害有關。第Σ 型（速發型）過敏在接觸過敏原數分鐘到數小時發生，並涉及 產生IgE抗體的Β細胞，其介導肥大細胞和嗜驗性白企球 去顆粒。亦涉及嗜酸性白血球。在數個疾病中涉及該反應， 包括氣喘、異位性皮膚炎、濕疹、結膜炎和鼻炎。第jj型（胞 毒型）過敏歸因於認得在細胞表面上自己或外來抗原的抗 體’並藉著經活化之巨噬細胞和自然殺手T細胞，介導補 體·依賴性胞毒性或抗體-依賴性細胞介導之胞毒性。與該反 應有關的疾病包括古德巴斯德症候群（肺和腎臟），以及甲狀 腺炎。第m型免疫複合體-介導之過敏，發生在抗體結合自 己或外來抗原時’其可能沉降在組織中，結果導致補體活 化和炎性反應（各種白血球亞型的活化、增殖和浸潤）。這是 涉及諸如腎小球腎炎、血管炎、全身性紅斑性狼瘡和關節 炎之類疾病的典型病理學。第IV型（延遲型）細胞-介導之過 敏’經常花數天發展，且非抗體依賴性的。該反應依賴不 同亞組的T細胞、胞毒T細胞和巨嗤細胞，其反常地破壞 與自身或外來抗原複合的自己的目標細胞。嗜中性白血 球、嗜酸性白血球和肥大細胞亦涉及該類型之反應。在諸 291 201235469 如接觸性皮膚炎、牛皮癖、炎性腸病、胰島素-依賴性糖尿 病、多發性硬化症和風濕性關節炎之類的疾病中發現該反 應。所有以上的免疫反應均涉及白血球對受影響之組織和 器官的交易、活化和增殖（參見表8的參考文獻）。 接觸性皮膚炎研究已經鑑認數個趨化因子軸，是造成 招募經活化之白血球的原因，包括但不限於IP-10/CXCR3、 IL-8/CXCR2、RANTES/CCR5、MCP-1/CCR2、MIP-U/CCR1 和5。已經替過敏性接觸性皮膚炎、牛皮癖、異位性濕殄和 異位性皮膚炎鑑認出不同的化學足跡。同樣地，已經鑑認 出涉及數個形式之皮膚T細胞淋巴瘤、黑色素瘤、硬皮病 和全身性硬化症的著名趨化因子軸。這代表以小心選擇的 含有相關趨化因子受體靶定劑之LPM治療，在治療炎性皮 膚疾病和癌症中會是有用的（參見在表6中的參考文獻）。 e.HIV感染和AIDS及以其他病原體感染 CNS小神經膠質細胞和浸潤性巨噬細胞的活化和感染 是引起疾病之HIV發病機制的一個特點，人類免疫不全病 毒（HI V)經由某些受體，典型地為CD4受體進入細胞，其與 特定的趨化因子共同-受體結合。CXCR4、CCR2b、CCR3、 CCR5、CCR6、CCR8、CX3CR1及其他均可以共同-受體的 身分發生作用。例如，親巨噬細胞的HIV-1品系通常使用 CCR5共同-受體，而親T-細胞的品系通常使用CXCR4。此 外，兩親的病毒可使用CXCR4和CCR5共同-受體進入，而 其他亞組之HIV病毒品系則使用各種其他的趨化因子共同-受體（參見 Rubbert 等人，HIV 醫學（HIV Medicine) 2006，第 292 201235469 4 章，H〇ffman 等人，編輯，Flying Publisher, Pads)。 在患有HIV腦炎（hive)的患者中，在MNPs、星狀細胞 和膽鹼能神經元的亞-族群上表現CXCR-4,但CCR5主要在 MNPs上表現。應注意到在HIVE患者（兒童和成人）中大多 數經感染之細胞似乎都是MNPs，且增加CCR5的表現似乎 與疾病的嚴重性有關。這代表MNp_介導之事件，至少在 HIVE的晚期和嚴重階段中是很重要的。在cns的細菌感染 和在局部缺血腦傷害的大鼠模式中，亦向上調節受 體。 增加細胞介素（例如TNF-α)和趨化因子（例如 RANTES、MCP-1、ΜΐΡ_1α 和 ΜΙρ_1β)的產生，與 mv 感染 有關在HIV中增加CNS趨化因子會成為周圍白血球招募 的原因，且細胞介素釋放伴隨有直接的胞毒影響（至少在細 胞厂素TNF- α對神經元和寡樹突細胞的情況下），並明確地 反映在CNS創傷的實驗中。數個細胞介素，包括GM_CSF、 巨噬細胞-CSF、IL-1 点、il-2、IL-3、IL-6、TNF- α 和 TNF- 召亦可藉著活化及/或增加HIV複製而助成HIV疾病的發病 機制》 —次傷害發生在HIV-1陽性、無症狀的前—AIDS患者中 (An 專人（1997) ΡαίΑο/ 4_5，94-105)。這些研 究者能夠在50%無症狀患者的腦中偵測到Hiv-l DNA，並 有將近90%展現出星狀神經膠質細胞增生。這些患者亦已 經有升向水平的免疫分子和細胞介素，包括Tnf_ 〇；、il- 1、 IL-4和IL-6。藉著偵測細胞凋亡之神經元，證實神經元損 293
V 201235469 傷。 直接的神經毒性和藉著MNP-衍生之興奮性胺基酸向 上調節CCR5共同-受體，亦已經涉及hiv感染的病理學。 已經在付自AIDS患者的經HIV感染之小神經膠質細胞中 積測到在可誘導之氧化氣合成酶活性上的增加。這表示氧 化氮的產生可能對在神經系統之經HIV感染區中形成病灶 有所貝獻。再一次，HIV腦病變，以及影響CNS的前-和充 分發展之AIDS的病理學，似乎模仿在SCI及其他炎性疾病 中觀察到的二次組織傷害。 亦已經發現某些趨化因子和趨化因子受體亦是前微生 物因素，並有助於傳染病（參見，Pease等人（1998)心所以 /mmw〇/70:169-178)。病原體利用趨化因子系統。例如，為 了進入細胞，細胞内病原體，包括HIV使用細胞的趨化因 子受體。此外，病毒亦使用病毒_編碼之趨化因子受體，以 促進宿主細胞增殖。病原體亦破壞趨化因子系統。病毒-編 碼的趨化因子拮抗劑和病毒編碼的趨化因子清除劑為已知 的（例如 Murphy，Nat Immunol·，2:1 16-22, 2001 ; Kotwal,
Immunol Today，21:242-8, 2000) 〇 f·炎性關節疾病和自體免疫疾病 風濕性關節炎（RA)是炎性自體免疫疾病，其特徵在 慢性結締組織傷害和骨糜爛。該疾病之發病機制包括白 球浸潤至滑膜空間内、其活化，並釋放炎性介體，最後 形並破壞受影響之關節。實際的關節反應似乎在MM。釋 前炎性細胞介素和趨化因子時開始。在得自ra患者之關 294 201235469 組織中發現豐富的TNF α、IL-l、IL-6、GM-CSF和趨化因 子IL-8 ’而其等最有可能的來源除了 MNPs之外，包括滑 膜纖維母細胞。MNPs、嗜中性白血球和T -細胞之組合，連 同滑膜纖維母細胞和滑膜細胞的參與，建立炎性反應之級 聯。 咸相信IL-1和TNF α是在關節炎之關節中產生趨化因 子的原因。在一研究中，在分離自RA患者之人類滑膜纖維 母細胞中，增加這兩種細胞介素的濃度，引起IL_8(有效的 T-細胞化學吸引劑）和RANTES(有效的嗜中性白血球化學 吸引劑）的表現（Rathanaswami 等人（1993) 厶/0/ 5834-9) »其他的研究者已經顯示得自RA和骨關節炎患者 的發炎滑膜組織，含有高濃度的MCP-1，且在衍生自這些 樣本的經培養滑膜細胞中，TNF α和IL-1明顯增加了該趨 化因子的mRNA表現。顯然得自MNPs和細胞介素刺激之 滑膜纖維母細胞及滑膜細胞的趨化因子，藉著促成周圍單 核細胞 '嗜中性白血球和T-細胞的招募和外參作用，而在 RA的病理學中扮演一角色。與其他疾病和病症一致，經活 化的白血球釋放一系列的其他組織傷害介體。更明確地 說，白血球-衍生之活性氧物種和蛋白水解酵素（例如基質金 屬蛋白酶、組織蛋白酶和嗜中性白血球-衍生之彈性蛋白酶） 已經涉及在炎性關節疾病中之組織損傷的發動和維持（參見 表8的參考文獻）。 g·肺臟疾病 肺臟傷害涵蓋各種臨床病症。為了本文之目的，將其 295 201235469 集體地稱為肺臟的炎性疾病(ILDs)。…型地為特定損 傷’例如全身性細菌感染(例如敗血症)、創傷(例如局部缺 再灌/主傷害）和吸入抗原（例如毒素、像香煙）的結果。 ILDs亦包括過敏性肺泡炎、ards(急性或成人呼吸箸迫徵 候群）、务種形式的氣喘、支氣管炎、膠原蛋白·血管疾病、 肺《瘤病、嗜酸性白血球增多性肺病、肺炎和肺纖維化。 簡s之’這些疾病和病症之病理學涉及巨嗟細胞的活化， 特別是位在肺泡中的那些。D耆中性白血球、嗜酸性白血球 泮T、·'田胞，被活化並招募至傷害部位，隨後釋放巨噬細胞
及鄰近内皮細胞和上皮細胞衍生之細胞介素和趨化因子。 所涉及之專一的細胞介素和趨化因子包括：GM_CSF、TNF α、IL-1、il-3、IL-5、IL-8、MCP-1、MCP-3、MIP-1 q：、 RANTES和嗜酸球趨化蛋白。 白血球藉著釋放許多二次組織傷害之介體，包括：蛋 白酶、活性氧物種’和具生物活性之脂質，並藉著表現細 胞表面抗原和細胞黏連分子’對前-炎性細胞介素和趨化因 子起反應。此外，顯然特定的白血球族群在一些ILDs中扮 廣比在其他ILDs中更重要的角色。嗜中性白血球和mNPs 對在急性肺傷害，像ARDS和各種肺纖維化中的二次傷害， 是更著名的貢獻者；而T-細胞和嗜酸性白血球則在嗜酸性 白企球增多性肺病中是主要的罪犯’其包括過敏性氣喘、 纖維化肺泡炎和類肉瘤病（參見表8之參考文獻）。 h.其他由二次組織傷害介導的疾病 可根據本文提供之方法，並使用本文提供之共軛物
S 296 201235469 以及某些熟諳此藝者已知之用來治療其他疾病的非-趨化因 一 子之細胞介素，治療與二次組織傷害有關的疾病狀態。這 • 些疾病狀態包括，但不限於CNS傷害、CNS炎性疾病、神 經變性病症、心臟病、炎性眼睛疾病、炎性腸病、炎性關 ^疾病 乂性腎臟疾病或腎病、炎性肺臟疾病、炎性鼻病、 义丨生曱狀腺疾病、細胞介素調節的癌症，及其他涉及或與 二次組織傷害有關的疾病狀態。 可使用本文之方法及本文提供之共軛物治療之Cns炎 吐疾病及/或神經變性病症的實例包括，但不限於猝發、閉 鎖性頭部外傷 '腦白質病、脈絡叢腦膜炎、腦膜炎、腎上 腺腦白質退化症、AIDS癡呆複合症、阿茲海默氏症 '唐氏 症、慢性疲勞徵候群、腦炎、腦脊髓炎、海錦樣腦病、多 發性硬化症、帕金森氏症、脊髓傷害/創傷（SCI)和創傷性腦 卜傷，了使用本文k供之方法治療的心臟病包括，但不限 於動脈粥樣硬化、内膜增生和再狭窄；可使用本文提供之 方法和共扼物治療的炎性眼睛疾病包括，但不限於增殖性 糖尿病性視網膜病、增殖性玻璃體視網膜病變、視網膜炎、 鞏膜义、鞏膜虹膜炎、脈絡膜炎和葡萄膜炎。可使用本文 提供之共軛物和方法治療的炎性皮膚疾病之實例包括，但 不限於牛皮癬、濕疹和皮膚炎。 可使用本文提供之方法和共軛物治療的炎性腸病之實 例包括，但不限於慢性結腸炎、克隆氏症和潰瘍性結腸炎。 可使用本文提供之方法和共軛物治療的炎性關節疾病之實 例包括’但不限於幼年型風濕性關節《、骨關節炎、風濕 297 201235469 Ί椎關節病’如僵直性脊椎炎、賴特氏徵候群 :e" Syndr〇me )、反應性.關節炎 '牛皮癖性關節炎、 ’曰、未分頬的脊椎關節病和貝塞特氏徵候群；可使用 本文提供之方法和共概物治療的炎性腎臟或腎病之實例包 括，但^限於腎小球腎炎、狼瘡性腎炎和IgA f病。可使 用本文提供之方法和共概物治療的炎性肺臟疾病之實例包 括，但不限於嗜酸性白血球增多性肺病、慢性嗜酸性白血 球增夕性肺炎、纖維化肺病、急性嗜酸性白血球增多性肺 炎、支氣管攣縮，包括氣喘、支氣管肺發育不良、支氣管 肺泡嗜酸性白血球增多症、過敏性支氣管肺臟趨菌病、肺 炎、急性呼吸奢迫徵候群和慢性阻塞性肺病（c〇pD);可使 用本文提供之方法和共軛物治療的炎性鼻病之實例包括’ 但不限於息肉#、鼻炎、鼻竇炎；可使用本文提供之方法 和共桃物治療的炎性甲狀腺疾病之實例包括，但不限於甲 狀腺炎；且可使用本文提供之方法和共輕物治療的細胞介 素-調節之癌症的實例包括，但不限於神經膠質瘤粉瘤、 腺癌、肉芽腫、神經膠質母細胞瘤、肉芽腫病、淋巴瘤、 白血病、黑色素瘤、肺癌、骨髓瘤、肉瘤、類肉瘤病、小 神經膠質瘤、腦膜瘤、星狀細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、 何杰金氏症，以及乳癌和前列腺癌。其他易感受使用本文 提供之方法和共軛物之治療的炎性疾病，包括但不限於血 官炎、自體免疫糖尿病、胰島素依賴性糖尿病、移植物對 宿主疾病（GVHD)、牛皮癣、全身性紅斑性狼瘡、敗血症、 全身性炎性反應徵候群（SIRS)和起因於燒傷的外傷性炎性
298 S 201235469 反應。 如同上文提及的，這些疾病雖有不同，但共享與炎性 反應有關的共同特徵。脊髓傷害或創傷，可藉著對需要其 之個體投與有效量的本文描述之治療劑來治療，為考量之 病症的範例.。設計本文之治療，以攻擊該反應涉及白血球 之杧殖和移行的不利結果。治療會排除或降低白血球增殖 和移行，並藉此導致症狀的改善、降低不利的事件，^其 他可促進其他治療之效力的有益結果。 5.混合治療 配體-毒素共軛物，如本文提供的任何LPM，可與指定 疾病之治療併用。可藉著投與配體-毒素共軛物，連同、二可 :他的治療劑，治療特定的疾病，而達成混合治療。這類 J劑為熟諳此藝者已知的。亦可使用二或多個，如附接在 2素部分任一端之兩個不同趨化因子組成的分子，來完成 /吧合治療。纟此情況下，這些雙重趨化因子融合可含有分 別得自0：和β趨化因子家族的各一個配體。 刀 L·實施例 為了解釋之目的而納入下列的實施例，並 本發明之範圍。 制 實施例1
挑選經修改志贺毒素A1(SA1)變體，來建構LPM A.為了選擇SA1變體’選殖並表現LpM 分八設計編碼MCP-i/志賀毒素融合蛋白（稱為LpMia)的核 酸分子，使得該融合蛋白從曱硫胺酸（Met)殘基開始，接著 299 201235469 是經發表的成熟MCP-1序列（在SEq id N〇:69中陳述並 由在SEQ ID NO:68中陳述之核苷酸序列編碼）、Ma_Met連 接子（SEQ.ID NO:34)和志贺-A1毒素次單元的殘基23 268， 其含有核糖體失活（RIP)功能部位（在本文中稱為變體i SA1 ;相當於SEQ ID NO:22，並由在SEQ ID NO:23中陳述 之核酸序列編碼）。為了有助於移動並置換該基因序列至不 同的表現載體内’在3’和5,端將核酸内切限制酶位置併入 基因序列内。設計LPMla的序列，使其具有NdeI限制位置， 其在5’端含有曱硫胺酸起始密碼子（SEq NO:31)，亦設 計使其具有終止密碼子，接著是在3 ’端的B amHI限制位置 (SEQ ID NO:33)。依據密碼子使用和二級結構最適化的原 則’由 DNA 合成供應機構（Blue Heron Biotechnology， Seattle WA)合成編碼LPM1 a的核酸分子，並以移除多重選 殖位置的卩11(：質體（？1；(：減]^，8£(^10>10:86)提供》分別 在SEQ ID NO:37和38中陳述LPMla核酸分子和所編碼之 融合蛋白的序列。 因為在LPMla融合蛋白中所含之SA1的變體1序列， 含有相當於SEQ ID NO:22之胺基酸242的半胱胺酸殘基， 可產製進一步截短的S A1部分，以避免在經高度純化之 LPM融合蛋白中，半胱胺酸-引起的二聚化。該SA1部分（在 本文中稱為變體2)缺少5個C-端胺基酸（CHHHA)，相當於 在SEQ ID NO:22中陳述之多肽序列的胺基酸242-246。在 SEQ ID NO:24中陳述變體2 SA1的胺基酸序列，並由在SEQ ID NO:25中陳述之核酸序列編碼。產製含有變體2 SA1部
300 S 201235469 ' 分的MCP-1融合蛋白，稱為LPMlb。合成編碼LPMlb融合 - 蛋白（MCP-1-AM-SA1(變體2))的核酸序列，其含有變體2 . SA1序列’並按照上文關於LPMla融合蛋白之描述提供》 分別在SEQ ID NO:39和40中睐述LPMlb核酸分子和所編 碼之融合蛋白的序列》 利用Ndel和BamHI消化在PUC減Μ載體中的所得 LPMla和LPMlb構築體，產生大約1Kb之Ndel/BamHI片 段，將其選殖到T7表現載體pET9c(Novagen，SEQ ID NO:84) 的相對應Ndel/BamHI位置内◊根據製造者的說明 (Novagen)，將含有LPMla的pET9c質體轉型至表現宿主品 系 HMS174(DE3) pLyS(F'recAl hsdR(rK12mK12+)(DE3)pLysS(CamR，RifR)内。根據製造者的 s兒明（Novagen)’將含有LPMlb的pET9c質體轉型至表現宿 主品系 HMS174(DE3)(F-recAl hsdR(rKi2.mK12+) (DE3)(RifR) 内。 Β·突變種的挑選 按照在上文Α部分中的描述，LPMla和LPMlb產生含 有SA1 RIP毒素部分的融合蛋白。SA1部分的表現對宿主 細胞是有毒性的’並破壞LPM融合蛋白的產生。欲挑選在 S A1中顯示較低毒性的突變種，使用含有LpM 1 a或lpm 1 a 的pET9c質體構築體，在各種濃度之4App(4胺基吡唑并 [3,4-d]-嘧啶）的存在或缺乏下進行突變挑選。在按照在A部 分中之描述’使含有LPM構築體之pET9c轉型至適當的宿 主品系内之後，在各種濃度之APP的存在或缺乏下，在5() 301 201235469 微克/毫升之LB康黴素（km)上挑選經轉型的細菌。在下文 中陳述的結果，是基於在50微克/毫升之LB康黴素（km) 上，在沒有4APP下挑選經LPMla轉型之細菌，以及在50 微克/毫升之.LB康黴素（km)上，在0.5mM 4APP存在下挑選 經LPMlb轉型之細菌。 1.LPMla突變種
在沒有4APP之下，以含有LPMla之pET9c質體構築 體轉型HMS174(DE3)pLyS宿主細胞，產生82個轉型物。 針對LPM 1 a表現和質體完整，篩選所有的82個經挑選集 落。使用標準迷你製備程序，從細菌轉型物中分離質體 DNA。藉著 SDS-PAGE證實全長蛋白質的表現。在以 Ndel/BamHI消化之後，從pET9c質體中純化LPMla插入 物，並利用T7引子和T7t引子定序該插入物，證實序列。 T7 ： 5, TAA,TAC,GAC，TCA，CTA，TAG，GG 3，（SEQ ID NO:35) ; T7t : 5’ GCT，AGT，TAT，TGC,TCA，GCG 3’（SEQ ID NO:36)。 少數幾個集落表現LPMb —些經挑選的集落表現截短 形式的LPM1。一個集落表現與在SEQ ID NO:38中陳述之 LPM 1 a序列相比較，在融合蛋白之S A1部分中的位置1 1 7 處含有L至R突變的LPM1 (相當於在SEQ ID NO:22中陳述 之變體1 SA1部分之胺基酸序列中的L38R)。在本文中將該 突變種LPM1稱為LPMlc。分別在SEQ ID NO:41和42中 陳述LPMlc的核苷酸和胺基酸序列，並可與在SEQ ID NO:37和38中陳述之親代LPMla分子相比較。在本文中將
302 S 201235469 在SA1中的L38R突變稱為突變種變體1(在本文中亦稱為 變體3)，並在SEQ ID NO:26申陳述，且由具有在SEQ ID NO:27中陳述之序列的核酸編碼。 2.LPMlb突變種 在0.5mM 4APP的存在下，以含有LPMlb之pET9c質 體構築體轉型HMS174(DE3)宿主細胞，產生10個轉型物。 挑選所有的1 0個轉型物，製備質體DNA，並按照上文關於 LPM1 a突變種的描述分析之。 兩個經挑選的集落表現LPM1，與在SEQ ID NO:40中 陳述之親代LPMlb序列相比較，在位置298處的SA1部分 令含有V至A突變（相當於分別在SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24中陳述之變體1和變體2 SA1部分之胺基酸序列中 的V219A)。在本文中將該突變種lpmI稱為LPMld。分別 在SEQ ID NO:43和44中陳述LPMld的核苷酸和胺基酸序 列’並可與在SEQ ID NO:39和40中陳述之親代LPMlb序 列相比較》在本文中將在s A1中的V2丨9 A突變稱為突變種 支體2(在本文中亦稱為變體4)，並在SEQ ID NO:28中陳 述，且由具有在SEQIDN〇:29中陳述之序列的核酸編碼。 實施例2 比較變體LPMls的活性 藉著在兔子網狀細胞溶胞產物（Rip)測定中，測量 LpMU(s有變體3 SA1序列）和购（含有變體*序 1'生》平估在SA1中之突變對LpM1活性的影響。表 303 201235469 現並部分純化（參見實施例4)LPM1C和LPMld蛋白質。藉 著使用设δ十用以測定蟲螢光素酶Rna之轉譯的市售兔子網 狀細胞溶胞產物系統（即RIP測定）（Pr〇mega，Madis〇n，WI ; 包含所有試劑）測量蛋白質合成的抑制，來評估這些蛋白質 的活性。簡言之，將蛋白質試樣稀釋成1微克/毫升，並以 含有1毫克/毫升BSA之PBS，ρΗ7·4，按10倍間隔連續稀 釋。將經稀釋之蛋白質（1〇微升）加至5微升反應混合物（反 應混合物：2微升的丨毫克/毫升蟲螢光素酶rnA溶液；1 微升的1:1比例之〇.丨mM扣除曱硫胺酸之胺基酸混合物和 扣除離胺酸之胺基酸混合物；2微升之核糖核酸酶抑制劑） 和35微升兔子網狀細胞溶胞產物中。在3〇〇c下培養試樣 1.5小時’然後藉著在冰上培養試樣使該反應中止。使用上 述的反應混合物稀釋該試樣1:25。將該反應混合物（1 〇〇微 升）移至96-孔白色聚苯乙烯盤（c〇rning Corporation，NY) 中’並在每個反應中加入1〇〇微升發光染料Bright_G1〇 (Promega)。使用經預熱（2〇_25。〇 的 FLUOstar 發光計（BMG Lab Technologies，Durham, NC)分析培養盤。平行地，使用 只有反應混合物或試劑空白作為陰性對照組，以及作為陽 性對照組的Rip蛋白質肥皂草毒素（Sigma，st. Louis, MO)。 肥皂草毒素陽性對照組一致地具有範圍在8_丨2pM的相對活 性（RIC5G)值。志贺全毒素具有經報告的9ρΜ之RIC5〇值 (Skinner 和 Jackson(1997) 乂 BackWo/· 179:1368- 174)。經 純化之變體4 SA1次單元（SEQ ID NO:28)具有50pM之 RIC5〇 值。LPMlc(SEQ ID NO:42)和 LPMld(SEQ ID NO:44) 304 s 201235469 分別具有5nM和80-l〇〇pM的RIC5〇值。基於對受試突變種 - 變體觀察到的RIP活性’按照在下文實施例3中的描述， • 建構含有得自LPMld之SA1序列的新穎LPM，其為突變種 變體2(即變體4)SA1。 實施例3 建構含有SA1變體4的LPM基因 建構LPM2-13(表12)’以編碼藉著丙胺酸-甲硫胺酸二 肽與成熟SA1志贺毒素次單元之突變種變體2(即變體4)戴 短版本（在SEQ ID NO:28中陳述）連接之個別趨化因子序列 的融合蛋白。藉著下述兩種不同的方法，將編碼LPM2-13 的序列插入pET9c質體（SEQ ID NO:84)内。每個方法均依 賴出現在S A1志賀毒素次單元序列之5 ’序列内的内部 EcoRI限制位置（例如，相當於在SEQ ID ΝΟ··23中陳述之變 體1序列或在SEQ ID NO:29中陳述之變體4序列的核苷酸 4-9)，結果在SA1部分中缺少5’離胺酸殘基，藉著設計在 與EcoRI限制位置相鄰處含有編碼離胺酸的趨化因子連接 子部分來重建之。所有用於質體操縱之草案均得自Maniatis 荨人，分子選殖：實驗室手冊（Μο/ecM/ar C/om’ng: /1
Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982)。 305 201235469 表12 : LPM變體 LPM 趨化因子 SA1變體 SEQ ID NO (核苷酸） SEQ ID NO (胺基酸） LPMla MCP-1 1 37 38 LPM lb MCP-1 2 39 40 LPMlc MCP-1 3 41 42 LPM Id MCP-1 4 43 44 LPM2 嗜酸球趨化蛋白-1 4 45 46 LPM3 SDF-Ιβ 4 47 48 LPM4 GRO-α 4 49 50 LPM5 ΜΙΡ-1β 4 51 52 LPM6 IL-8 4 53 54 LPM7 IP-10 4 55 56 LPM8 MCP-3 4 57 58 LPM9 ΜΙΡ-3α 4 59 60 LPM 10 MDC 4 61 62 LPM 11 ΜΙΡ-1α 4 63 64 LPM 12 嗜酸球趨化蛋白-1 4 65 46 LPM 13 BCA-1 4 66 67 簡言之，依據密碼子使用和二級結構最適化的原則， 由DNA合成供應機構（Bio S&T, Montreal)合成編碼用以建 構LPM2-13(表12)之趨化因子之核酸分子的序列，並以pUC 質體（pUC19，SEQ ID NO:8 5)提供。對每個趨化因子基因， 將含有甲硫胺酸起始密碼子的Ndel限制位置（SEQ ID NO:31)加至5’端，並將編碼胺基酸Ala-Met-Lys之連接子序 列，隨後是EcoRI位置（SEQIDNO:32)加至3’端。在表13 中描述並在SEQ ID NO:72-83中陳述每個趨化因子構築體 的核苷酸序列。將第二個嗜酸球趨化蛋白序列最適化，並 由 Blue Heron Biotechnology 提供，亦在 SEQ ID NO:82 中 陳述。藉著下文陳述的兩種選殖方法之一，分別使用編碼 趨化因子的個別核酸分子，以產製LPM融合蛋白。 306 201235469 表1 3 : LPM2-1 3之趨化因子構築體之序列組份的核苷 酸位置 LP Μ 趨化因子構築體 SEQ ID NO: Ndel I 限 制位置 成熟的趨 化因子 連接子序 列 EcoRI 位 置 2 嗜酸球趨化蛋白 72 1-6 7-228 229-237 238-243 3 SDF-Ιβ 73 1-6 7-222 223-231 232-237 4 GRO-a 74 1-6 7-225 226-234 235-240 5 ΜΙΡ-1β 75 1-6 7-213 214-222 223-228 6 IL-8 76 1-6 7-237 238-246 247-252 7 IP-10 77 1-6 7-237 238-246 247-252 8 MCP-3 78 1-6 7-234 235-243 244-249 9 MIP-3a 79 1-6 7-216 217-225 226-231 10 MDC 80 1-6 7-213 214-222 223-228 11 MIP-la 81 1-6 7-213 214-222 223-228 12 嗜酸球趨化蛋白 82 1-6 7-228 229-237 238-243 13 BCA-1 83 1-6 7-267 268-276 277-282 A.選殖方法1 在 pUC19 質體（SEQ ID NO:85)中組裝 LPM4-10、LPM12 和LPM13(參見表13)的組份，然後繼代選殖到pET9c載體 内。簡言之，藉著以EcoRI和BamHI消化含有LPMld的 pET9c載體（參見實施例1)產製SA1變體4組份，產生含有 SA1變體4基因之750個鹼基對的EcoRI/BamHI DNA片 段。以凝膠純化經消化的片段，並插入亦已經在相對應之 EcoRI/BamHI位置被切開的pUC 19質體内，產生pUC 19BB 質體。按照上述，藉著以Ndel和EcoRI消化，藉著含有各 307 201235469 別趨化因子之PUC19質體的消化，產製LPM4-10、LPM12 和LPM1 3的趨化因子序列組份，產生每個趨化因子大約250 個驗基對的Ndel/EcoRI DNA片段。欲產製完整的LPM序 列（參見表12 )，以凝膠純化經消化的趨化因子片段，並插 入已經在相對應之Ndel和EcoRI限制位置被消化的含有 SA1變體4序列之pUC19BB質體内。然後以Ndel和BamHI 消化含有完整LPM基因序列的pUC19BB質體，產生大約 1 kb之片段，以凝膠純化之，並繼代選殖到已經以Ndel和 丑&111111消化過的卩丑丁9〇質體（8丑(^10 1^0:84)内。證實質體 表現個別的LPM ’並定序以證實插入物的身分。上文的表 12陳述經選殖之LPM變體LPM4-10、LPM12和LPM13個 別的核酸和所編碼之胺基酸的序列識別號。 B.選殖方法2 欲產製LPM2、3和11(參見表I2)，使用本文描述的方 法’直接將個別的趨化因子基因插入pET9c表現質體（SEQ ID NO:84)内。首先，欲防止在後續的選殖步驟期間消化載 體’從pET9c質體中移除EcoRI位置，產生載體PET9DE。 簡言之’以EcoRI消化pET9c質體，並以T4 DNA聚合酶 填滿末端。連接質體DNA，產生pET9DE載體，並轉型至 DH5 a大腸桿菌細胞（invhrogen，Carlsbad, CA)内》使用標 準迷你製備程序’從細菌轉型物中分離質體DNA，並藉著 限制消化證實了在pET9DE載體中EcoRI位置的刪除。 如選殖編碼LPM2、3和11之基因，以Ndel和BamHI 消化得自上文之選殖方法1，含有完整LPM 1 d基因之序列 308 201235469 的PUC19BB質體，產生lkb的片段。以凝膠純化該片段， ' 並繼代選殖到亦已經以Ndel和BamHI消化過的pET9DE載 ‘體内，產製PET9DE-BB質體。按照上述，藉著以NdeI和 EcoRI消化，藉著含有個別趨化因子之pUC 19質體的消化， 產製LPM2、3和1 1的趨化因子序列組份，產生每個趨化因 子大約250個驗基對的Ndel/EcoRI DNA片段。欲產製完整 的LPM序列（參見表12)，以凝膠純化經消化的片段，並插 入已經在相對應之Ndel/EcoRI位置被消化的pET9DE-BB 質體内。上文的表12陳述經選殖之LPM變體LPM2、3和 11個別的核酸和所編碼之胺基酸的序列識別號。 實施例4 LPM變艘的表現和純化 A.LPM變體的表現 在以pET9c/LPM質體轉型HMS174(DE3)之後，藉著使 轉型物在37C下生長在帶有5〇微克/毫升康黴素和2lnM 4APP的MTB培養基(；lxM9培養基，帶有24克/公升酵母萃 取物、12克/公升胰蛋白腺和〇 4〇/。甘油）中過夜，測試 抑制劑4APP對不同LPM表現的影響。在以IpTG誘導個別 的LPM之前’先在相同的培養基繼代培養細胞（丨：丨〇稀釋）， 並在37°C下生長另外3小時。藉著在相同的溫度下，以有 或無ImM IPTG誘導’並在漸增濃度之4App(例如，〇、〇 j、 2、5、10、15和20mM 4APP)的存在下，誘導細胞另外3·5 小時。從細胞中收穫含有LPM融合蛋白的包涵體（參見下文 309 201235469 方法）。在IPTG的存在下誘導後，具有想要表現特徵之品 系，以4APP劑量反應模式，顯示出大約36kD之表現譜帶。 藉著西方墨點，使用抗-S A 1抗體證實蛋白質身分。在兔子 中，對SA1次單元之抗體會對合成的SA1肽（SEQ ID NO:30) (Covance Research Laboratories, Denver PA)升高，並收集血 清。 表 14 陳述 LPM 共軛物 LPMld、LPM8、LPM3、LPM6 或LPM7的相對表現。在表現並從細胞中收穫LPM融合蛋 白之後，在SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質，並藉著以考馬 斯藍染色，使總蛋白質顯影。藉著裝載得自每個相同震盪 燒瓶發酵物之以相同方式製備的試樣（0.1至 20mM 4-APP)，估計表現百分比連同4-APP劑量曲線。任何特定 LPM的100%表現是基於在特定濃度之4-APP下，在凝膠上 看到不再增加的蛋白質水平。藉著以肉眼比較指定的1 〇〇% 表現與具有較低表現和在發酵肉湯中有較低4-APP之試樣 的跑道，估計表現百分比。進行實驗至少兩次。通常，表 現水平從在0.1 mM 4 APP下很少或沒有可偵測量的想要蛋 白質，增加到在10-20mM 4APP下的高水平。 表14 :利用4-APP的LPM表現水平 LPM 4-APP (mM) 0.1 2.0 5.0 10.0 15.0 LPMld >5 >5 >5 70 100 LPM8 >5 >5 25 100 100 LPM3 15 30 100 100 100 LPM6 >5 0 100 100 100 LPM7 >5 100 100 100 100
310 S 201235469 Β·蛋白質生產 為了 LPM生產而發展出批次發酵方法。使攜帶具有所 挑選SA1變體之pET9c/LpM質體的宿主細胞 (HMSm(DE3))，在37°C下在2福4APP的存在下，生長 在液態增強的培養基（在發酵器中的51〇〇公升，或在2 8 公升震盪燒瓶中的400毫升）中。在1〇mM4App的存在下， 藉著ImM IPTG誘導產物表現3_6小時，然後藉著離心收穫 細胞。將細胞小球均質化（經由超音波震盪或通過均質機3 = 次）’接著使用離心移除碎屑並回收包涵體（Ibs)。以數倍體 積的d&O沖洗Ibs2-3次。在含有6M胍鹽酸鹽的緩衝溶液 中使lbs加溶，離心並對8M脲透析上清液^估計得自發酵 器或震盪燒瓶的典型起始LpM產量分別約為丨克/公升 (〇D_ " *約50)和3〇〇毫克/公升（〇D_毫㈣約7)。在刚 宅小土米處&到的光雄度（〇D)是使用uitraspec Pro分光光度 計之大腸桿菌密度的測量值。利用〇1%(體積/體積）聚乙烯 亞胺從IB溶液中移出核酸。在離心之後，藉著通過陰離子 父換樹脂濾紙或管柱（Q-瓊脂糖-FF)移除額外的DNA，其結 合殘餘的DNA ’並允許具有高等電點的蛋白質，如LPM通 過。經由陽離子交換樹脂層析法（s_瓊脂糖_FF或HP)捕捉蛋 白質產物’並以出現脲的NaCl梯度沖提。得自該管柱的流 通溶離份含有少量的自由SA1毒素部分。在NaCl梯度中收 集蛋白質溶離份，並藉著SDS-P AGE分析。然後集合含有 LPM 的溶離份。藉著對 25mM Tris-HCl、1M 脲、0.5M L- 311 201235469 精胺酸、ImM經還原之榖胱甘肽和〇 lmM經氧化之榖胱甘 肽，在pH8_0下透析16-24小時，完成產物的再摺疊。然後 將經再摺疊的物質透析到調配緩衝溶液（5〇mM檸檬酸鈉、 0.05mM EDTA和20%蔗糖）内，並儲存在_8〇tT。藉著 SDS-PAGE評估該物質之純度超過8〇%，並使用陽離子交換 或忌水性交互作用層析法進一步純化，在調配之前作為潤 掷的步驟。其他過程使用相同的起始步驟，但得自最初之 陰離子交換的產物，立刻藉著以25rnM磷酸鈉、1M脲、 200mM L-精胺酸、20%(重量/體積）蔗糖、imM經還原之榖 胱甘肽和O.lmM經氧化之穀胱甘肽，在pH8 〇稀釋16_24 小時再摺疊。然後使經再摺疊之物質經歷陽離子-交換，接 著是忌水性交互作用層析法，之後按照上述透析至調配緩 衝溶液内。 實施例5 基於細胞的胞毒性測定 在基於細胞之胞毒性測定中測量LPM1 d和LPM12的細 胞毒性。在該測定中，使細胞在有或無毒素（即含有S A 1部 分的LPM蛋白質）之下生長一段時間。在細胞溶解後，在培 養物中的ATP含量，便成為細胞活力的可測量指標。 A.細胞培養和試樣加入 根據製造者的說明（ATCC，Manassas，VA)，使THP-1 單核細胞生長在含有補充有10%FBS之RPMI培養基 (Invitrogen，Carlsbad, CA)的完全培養基中，並每週繼代兩 312 201235469 次，保持細胞密度低於5xl〇5個細胞/毫升。藉著離心收集 、、用胞並以新鮮的溫培養基沖洗，再懸浮於適當體積的培 養基中，達到3-4x1 〇4個細胞/毫升之密度，以便進行基於 細胞的胞毒性測定。藉著將100微升等份的細胞懸浮液分 別移至96-孔細胞培養盤内側的6〇個孔中，播種細胞（外侧 的孔僅裝入完全培養基）。以一式三份將2〇微升媒劑（只有 緩衝溶液）和LPMld或LPM12蛋白質試樣（以範圍從25微. 克/宅升到1 00微克/毫升之濃度）加至孔中，並輕輕地與細 胞混合。然後在37t：(5%C〇2)下培養該細胞24小時。 B.基於細胞之胞毒性的評估 使用CellTiter-Gl〇TM發光細胞活力測定套組（pr〇mega， Madison WI)(根據每個製造者的說明），根據基於細胞之胞 毒性的測量，以測定細胞活力。在以ATP反應混合物（由 CellTiter-Glo®試劑之製造者供應）溶解細胞後，ATP驅動蟲 螢光素的氧合作用，結果產生發光信號，其與孔中的ATP 濃度成比例。這與在培養物中存活細胞的數目成正比。將 得自上文A部分之THP-1細胞培養盤的1 〇〇微升等份移至 白色平底培養盤（Corning Corporation，NY)中，允許測量發 光，並允許平衡30分鐘，之後加入100微升ATP反應混合 物。在加入ATP反應混合物之後，使用渦動輕輕搖動培養 盤的内容物3 0秒，引起細胞溶解，並在室溫下培養1 〇分 鐘，使發光信號穩定。使用FLUOstar發光計（BMG Lab Technologies, Durham, NC)測量發光。替每個LMP蛋白質 製備僅含有媒劑的相配對照組孔（只有緩衝溶液）。平均一式 313 201235469 三份數值，並扣除所有受試條件的背景發光。按照在相配 之對照組存在下ATP内含量的百分比（將其設為100%)，提 供在LPM融合蛋白存在下出現的ATP内含量。在基於細胞 之胞毒性測定中測試LPM1 d和LPM1 2，並分別在表1 5和 表16中陳述結果。結果顯示ATP内含量，在漸增濃度之 LPM1 d的存在下，以劑量-依賴性之方式減少，顯示LPM 1 d 對THP-1細胞是有毒的。LPM12對THP-1細胞也是有毒的， 但僅在33微克/毫升或更高的濃度下，且沒有觀察到LPM 12 對這些細胞的劑量-依賴性之影響。所觀察到之LPM12(含有 嗜酸球趨化蛋白趨化因子的融合蛋白）的影響，可歸因於在 THP-1細胞上缺少嗜酸球趨化蛋白受體，CCR3的表現，而 在THP-1細胞上出現MCP-1受體，CCR2，嗜酸球趨化蛋白 對其以高濃度結合（Ogilvie 等人，（2001) Blood 97:1920-1924)。 表1 5 : LPM 1 d對THP-1細胞的細胞毒性 LMP的濃度 相配之對照組(只有緩衝溶 液)ATP内含量的百分比 0微券./亮井 100% 25微吾./奎并 96 07% 35檄券./¾井 ^ S?% 50撒券./亳井 75檄券./亮井 MSWn 100 檄 $,/¾井 96 47% 314 s 201235469 LMP的濃度 相配之對照組— 液)ATP内含量的百公μ_ 0微貳/毫井 . 100% 25微免/¾井 35撒券./ΐ朴 _i2zn^ZZZ3ZI~* 50微券./臺斗 75微免/臺井 100撒并 61 88%_ 實施例6 LPMld在大鼠中，在抗_胸腺細胞血清（ATs)_引起之系 膜增殖性腎小球腎炎中的活性 以下的實施例證實LPM治療在大鼠中對抗-胸腺細胞 血/月（A T S)-引起之系膜增殖性腎小球腎炎之進行的影變。 A.ATS注射和LPMld治療 评估LPM1 d治療在大鼠中對ATS-引起之系膜增殖性 腎小球腎炎之進行的影響。將24隻大鼠秤重，並在代謝籠 中設定24小時的基礎尿液收集。記錄尿液的體積，並使用 寺示準程序將尿液加工處理及定量肌酸酐和蛋白質。麻醉大 鼠’從周邊的尾靜脈抽取0.5-1.〇毫升的血液。讓血液凝固 並保留血清’使用標準程序測量血中尿素氮（bun)、肌酸酐 和膽固醇。在第0天，以20毫克/1〇〇克體重的抗-胸腺細胞 (Thyl)IgG 部分（Probotex，SanAntonio，TX)注射大鼠，並在 恢復後送回牠們的籠子。每天監視大鼠，並記錄體重和健 康狀況。將大鼠分成每組8隻的三組：兩組每隔一天（第2、 4、6和8天）分別注射5 0或1 〇〇微克/公斤的LPM1 d，而第 三組在抗體投藥後第2天開始僅注射媒劑（5〇mM獰檬酸鈉 315 201235469 緩粒液，ΡΗ6·2，含有〇.〇5mM EDTA)，作為疾病對照板。 在第4天，將大鼠送回代謝籠中，進行令點尿液收集。隔 天，從尾靜脈獲得血液，進行中點血清收集。在第8天， 再度將大鼠關在代謝籠中，進行最後的24•小時尿液收集。 在整個實驗中動物都是健康的。麗治療組的腎小球過遽 率（以^中肌酸野清除來測量），通常與對照組沒有差異，僅 在較高劑量的動物t在第5㈣天觀察到些微增加。所有 動物的刪和膽固醇含量都在正常範圍内。在研究中在中 點判定尿蛋白（在第4_5天的24小時尿液收集）。發現經低 和尚劑量治療的大鼠，與對照組相比較，尿蛋白分別降低 34%和39%，表示LPMld對腎功能有保護效果。 B.組織學分析 在第9天’犧牲所有的大鼠，收集血液並為了組織學 處理腎臟。將得自本實驗的腎臟皮質切成2 3毫米的冠狀切 片並在液態氮中急速冷凍，放在福馬林中或放在曱醇氯 仿醋酸（methacarn)中，並在代下固定過夜。 1·纖維化加工標記的免疫組織化學染色 使用對纖維網蛋白和α平滑肌肌動蛋白（α _SMA)的抗 體（分別為殖系 IST_9，Serotec，Harlan Bi〇pr〇ducts f〇r
Science，Indianap〇lis，IN 和殖系 1A4，得自 sigma，St L〇uis MO)處理冷康切片。纖維網蛋白是細胞外基質沉降和 合成的標記，而α平滑肌肌動蛋白（a_SMA)是經歷表現型 改變之高細胞性腎小球膜細胞的標記-其為ECM沉降之前 死纖准網蛋白和α _SMA的表現暗示纖維化進行。關於^ 316 δ 201235469 -SMA或纖維網蛋白的染色’以0-4級來敘述結果，其分別 ^ 代表沒有、輕微、中等、高度和劇烈.的染色。表17按照一 • 組中全部四隻大鼠的平均（AV)分數，敘述以α -SMA染色冷 凍切片的結果。結果顯示在漸增濃度之LPMld的存在下， 降低了 a -SMA的表現。因此，在經LPMld治療之腎臟令， 降低了腎小球膜細胞的活化。 表1 7 :在冷康腎臟切片中的a -SMA含量 治療 AV分數第1組 AV分數第2組 媒劑 2.18 2.10 50微克/公斤LPMld 1.76 2.08 1.00微克/公斤LPMld 1.69 1.30 表18敘述在以LPMId治療大鼠後，對纖維網蛋白染色 冷凍腎臟切片的結果。結果顯示降低了藉著免疫組織化學 染色之纖維網蛋白的表現，特別是在高濃度的LPMld(100 微克/公斤）下。因此，在經LPMld治療之腎臟中，降低了 ECM沉降。 317 201235469
——媒刮_ !〇微克/公斤 100微免/公斤 1.86 1.48 1.49 1.98 2.0 1.43 LPMld LPMld 2.腎病灶的蘇木素和曙紅（H&E)染色 為了腎病灶的蘇木素和曙紅染色（H&E)評估加工經福 馬林處理的試樣。冷;東切片的H&E染色，允許腎病灶和腎 小球7G整性與結構的視覺化和全面評估，將其按從正常外 觀到厫重損傷的“級來計分。結果(表19)顯示纟LPMld 的存在下，在經α _Thyl治療之大鼠腎臟中減少了腎病灶的 出現。在以100微克/公斤LPMld治療的大鼠組中，沒有觀 察到不同的病灶（即等於144分^因此，在經LPMld治療 之腎臟中，降低了腎病灶和結構損傷。 表在冷凍腎臟切片中，腎病灶的H&E染色 治療 平均分數(n=4) - 媒劑 2.4 50微克/公斤LPM1H 2.25 100微克/公斤LPM1H 1.44 3·增殖細胞的免疫組織化學染色 為 了使用 ED-1 抗體（chemicon Corporation, Temecula， cA)之巨噬細胞數目的免疫組織化學評估，使用經甲醇氣仿 醋酸處理之試樣《在該模式中，巨噬細胞的數目在大約第5 天達到高峰。為了評估ED-1陽性的巨噬細胞，在第9天計 算得自2 5個腎小球之巨噬細胞（即ED-1陽性細胞）的總數。 在表20中按照在一組中四隻大鼠分別經計算之巨噬細胞的 原始數目，來敘述結果。結果顯示在經LPM1 d治療之腎臟
S 318 201235469 中，降低了巨噬細胞的出現。 表20 :在天數=9時，在腎小球中巨噬細胞的數目 治療 「每隻動物的原始數目 媒劑 109、100、120、110 50微克/公斤LPMld 79、71、63、90 100微克/公斤LPMld 62 > 71 ' 68 ' 87 實施例7 LPMlc和LPMld在老鼠延遲型過敏模式中的活性 下列的實施例證實LPMlc和LPMld治療對在老鼠耳朵 中對聘吖酮之炎性反應程度的影響。 在藉著施用抗原晴吖酮引起之延遲型過敏（MDTH)的 老鼠模式中，評估LPM蛋白質對基於細胞之免疫反應的影 響。評估LPM1 c和LPM1 d治療對在老鼠耳朵中對聘吖酮之 炎性反應程度的影響。按照在表21中概述的，將5 6隻重 約20-25克的雌性Balb/c老鼠分成七個治療組。在第_7天 和-6天，藉著將抗原溶液施用在身體剃光的地方，使老鼠 對2%聘吖酮（Sigma，St. Louis，MO)敏化。在第〇天，利用 直接塗在兩耳上的2°/。曜吖酮溶液攻毒老鼠。在第〇天和第 1天，以LPMlc(l〇〇微克/公斤）、LPMld(l〇微克/公斤或25 微克/公斤）、地塞米松（抗-炎性的皮質類固醇，〇.2毫克/公 斤（Vedco Inc，St. Joseph，MO)) ’或媒劑對照組治療老鼠。 319 201235469 表21 : MDTH治療組 組別 治療(n=8) 1 未經敏化，經攻毒+媒劑 2 經敏化，經攻毒+媒劑 3 經敏化，經攻毒+LMP1C 100微克/公斤 4 經敏化，經攻毒+LPMld25微克/公斤 5 經敏化》經攻毒+LPMld 10微克/公斤 6 經敏化，經攻毒+地塞米松0.2毫克/公斤 7 来經攻毒 欲評估對腭吖酮之炎性反應的程度，並比較在表2 1中 概述之治療的效果，測量耳朵的厚度和總重量。在攻毒之 前、在攻毒後24小時，以及在研究結束時（攻毒後48小時）， 利用測徑器測量老鼠的兩隻耳朵。此外，在研究結束時移 出耳朵並秤重。 判定按公克計之最後耳朵重量的平均值土標準差。使用 雙尾t-檢定，分析結果的統計顯著性，而所有的LPM治療 在耳朵寬度上，與經媒劑-治療/經敏化/經攻毒組（表21中的 第2組）相比較，均得到在統計上顯著的（*ρ<〇·〇5)相對降 低，就像陽性對照組地塞米松治療組一樣。替每一組計算 相對於經媒劑-治療/經敏化/經攻毒組之耳朵寬度的降低百 分比。藉著公式計算降低百分比：1-[(經治療-陰性對照 組）/(陽性對照組-陰性對照組）]xl〇〇°/。。在表22中陳述結 果。在LPMlc(第3組）和LPMld(第4和第5組）治療組中的 耳朵厚度測量，幾乎像地塞米松（第6組）治療組一樣地降低 (29%) ° 320 201235469 表22 : LPM治療對在MDTH ^ 卜之耳朵重量的影響 治療組 相對於媒劑/經敏化經攻毒之第 2組的耳朵重量降低百分比 第1組：未經敏化，經攻毒+媒劑 74% 第2組：經敏化，經攻毒+媒劑 0% 第3組：經敏化，經攻毒+LMPlc 100微克/公斤 20% 第4組：經敏化，經攻毒+LPMld 25微克/公斤 29% 第5組：經敏化，經攻毒+LPMld 10微克/公斤 22% 第6組：經敏化，經攻毒+地塞米松0.2毫克/公斤 28% 第7組：未經攻毒 100% 實施例8 LPMld在脊髓傷害模式中的活性 A.脊髓傷害和LPM投藥 設計脊髓傷害（SCI)模式實驗，其中僅在傷害後的前1-3 天投與LPM 1 d，以便定量巨噬細胞和嗜中性白血球族群的 減少。簡言之，如下引起脊髓傷害：以氯胺酮-甲苯噻嗪的 混合物（分別為85毫克/公斤和15毫克/公斤，腹腔内（I.P.)) 麻醉成年的 6-8 週齡 CD-1 老鼠（Charles River Laboratories， Montreal，Quebec, Canada)，並使其接受適度的（60千達 因）T9/10 挫傷脊髓傷害（SCI)(Infinite Horizons Impactor， Precision Systems Instrumentation, Kentucky, USA) ° 已經在 嚅齒類中完全定出傷害的特徵，並以可再現之方式產生中 等的病灶，其模仿人類SCI的病理生理學（參見例如Wells 等人（2003) Brain, 126:1628- 37)。在傷害之後，允許老鼠在 溫暖的毯子中恢復，並接受0.5毫升生理鹽水，以補償失血 和脫水。每天2-3次以手工擠壓膀胱，直到恢復自發排泄為 321 201235469 止所有的貫驗均根據卡爾加里大學（University of Calgary) 動物關懷倫理委員會（Animal Care Ethics Committee)堅守加 旱大動物保破協會（Canadian Council on Animal Care)的指 導方針來進行。 ...... · · . 在傷害之後，對老鼠投與LPM1 d或媒劑對照組。按照 在下表23中的陳述，將老鼠隨機分派成四個治療組。 —_^23 :在SCI模式中以LPMld治療 組別 治療 I Lf>Mld的單一積儲(100微克/公斤，I.P.)SCI後2小時 II LPMld的兩次注射(1〇〇微克/公斤，IP)SCI後2小時和24小時 III LPMld的二次注射(1〇〇微克/公斤，IR)SCI後2小時、24小時和48小時 IV 媒劑(I.P.) Β·收穫組織和血液以供數據分析 1 ·新鮮的組織 在SCI傷害之後24和48小時，在將老鼠麻醉後，從 每個治療組中收集新鮮的組織，並藉著心臟穿刺收集大約i 毫升全血至100微升肝素溶液中。在收集血液之後，立刻 以冰冷的PBS灌流動物，並快速分離脊髓（以病灶位置為圓 心周圍2公分）’然後放在冰冷的PBS中。然後為了流式細 胞分析製備灰液和脊趙試樣。 2.經固定之組織 在S CI傷害後第5天’從每個治療組收集經固定之組 織。以致命劑量的氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉動物，以PB S灌流， 接著以4%在PBS中之仲曱醛溶液灌流-固定。移出脊髓（T6
S 322 201235469 • 到T13)，並在4%仲甲醛中後-固定過夜，隨後在30%蔗糖 - 中冷/東保護。然後將脊髓放在小方塊中’冷床並儲存在_ 7 0 °C . 下直到切片為止。以横面將小方塊切成20微米之厚度，並 在 Superfrost 玻片（Fisher Scientific，Houston，TX)上收集組 織切片’組織成5個鄰接的連續切片。 3.統計分析 使用SigmaStat軟體（SPSS，Inc.)進行統計分析。使用變 方分析（ANOVA)測試在治療組之間的差異，並在認為合理 時使用Holm-Sidak因果分析。在不等變異數的情況下，使 用按次序的Kruskal-Wallis單尾ANOVA。將具有小於〇.〇5 之P值的差異視為顯著的。 C.數據分析 1.流式細胞分析 利.用小型玻璃杜恩斯（dounce)均質機，以機械方式使得 自新鮮組織的脊髓試樣破裂，並藉著使該溶液通過鐵絲網 筛（Sigma-Aldrich，Canada)，獲得單細胞懸浮液。然後在4°c 下以1100RPM(200xg)離心試樣1〇分鐘，慢慢打破。將小球 再懸浮於FBS染色緩衝溶液中（bd Biosciences)，並接受離 心（3000RPM持續7分鐘，在4°C下慢慢打破）。然後將小球 再懸浮於FBS染色緩衝溶液中。 以針對標記（其用以判定居留之小神經膠質細胞 (0045心111丄0111))和血液-衍生之白血球（顆粒球和單核細 胞；CD45high:CDllb)之族群）的抗體染色脊髓細胞。欲最 適化抗體稀釋，首先使用錐蟲藍染色計算細胞數目，藉著 323 201235469 以錐蟲藍1:1稀釋細胞（10微升錐蟲藍對試樣各1 〇微升）， 並使用血球細胞計數器計算細胞數目。先將試樣與Fc阻斷 物™(經純化的大鼠抗-老鼠CD16/CD32(FcYl[[/n受體；BD Biosciences; 0.5毫克/毫升））一起培養，降低起因於抗體與 Fc受體結合的非專一結合。在與Fc阻斷物培養大約5分鐘 之後，在細胞試樣中加入下列的單株抗體（BD Biosciences)，以評估居.留小神經膠質細胞和血液衍生之白 血球的存在：R-藻紅蛋白（R-PE)-共輛的大鼠抗-老鼠 CD11(0.2 毫克/毫升）、FITC 抗-老鼠 Ly-6G 和 Ly-6C(Gr-l ; 0.5毫克/毫升）、FITC抗-老鼠CD3分子複合體（〇·5毫克/毫 升）和曱藻素（Peridinin)葉綠素-a蛋白質（PerCP)-共軛的大 鼠抗-老鼠CD45(白血球共同抗原，Ly-5 ; 0.2毫克/毫升）。 欲控制非-專一結合和自身螢光，亦使用適當的同型物對照 組抗體（即P E標示之大鼠I g G 2 a ’ k同型物對照組（〇. 2毫克/ 毫升）；FITC標示之大鼠IgG2b，k同型物對照組（0.5毫克/ 毫升）；以及PerCP-共軛之大鼠igG2b同型物對照組（〇_2毫 克/毫升））進行染色。在染色培養中亦納入只有細胞的試 樣。在4°C下培養細胞3 0分鐘》在培養之後，以fb S染色 緩衝溶液沖洗細胞試樣兩次，並再懸浮於1%經缓衝的福馬 林中。將細胞試樣儲存在4。(：下，並使用BD FACScan(BD Biosciences)分析。 使用 WinMDl 2.8 版的軟體（Scripps Research Institute，
California，USA)，從密度作圖（CD45，y_軸；CDUb，χ 軸） 判定流式細胞分析的結果，並在不同的治療組之間做比
S 324 201235469 • 較。使用WinlV1Dl 2.8版的軟體，決定每個治療組的CD45 - 和CD1 lb染色之平均螢光。按照CD45 : CD1 lb之平均螢光 _ 值的比例’決定血液-衍生之白血球超過居留小神經膠質細 胞的比例。亦決定每個治療組平均值之標準差。在表24中 敘述結果。結果顯示在SCI之後24小時，在以LPMld治 療之第I組中的老鼠，在SCI後2小時，與僅以媒劑治療之 老鼠相比較’在脊髓中展現出降低比例的血液衍生之白血 球。該分析顯示在SCI後2小時接受一個劑量LpMld的老 鼠，顯不與對照組相比較，在24小時時明顯降低了血液_ 衍生之白血球：小神經膠質細胞比例（p<〇 〇5)。這代表根據 小神經膠質細胞的數目，血液-衍生之白血球降低3 ，在 組別之間沒有改變。在SCI後48小時，得自在感染後2和 24小時，以兩個劑量LpMld治療之老鼠（即第辽組）的脊髓 細胞比例’顯示在試驗和對照組比例之間沒有顯著差異。 表24:在SCI後“和48小時，血液衍生之白血球對 治療 η 平均值 SEM 時間點 媒劑 6 2.431 0.317 24 小 第I組 6 1.703 0.102 24小時 媒劑 6 3.02 0.38 48小時 第II組 6 3.619 0.965 48小時 2·摘測小神經膠質細胞/巨噬細胞的免疫組織化學法 在含有得自傷害脊髓後5天之經固定組織切片的破片 進行螢光免疫組織化學法。將玻片融化，以PB $沖洗二 325 201235469 次，並在室溫下以1 〇%正常山羊血清阻斷30分鐘。欲偵測 小神經膠質細胞/巨噬細胞，在室溫下將玻片與兔子抗_Ibai 抗體（1:1000 ; Wako Chemicals US A, Inc.)— 起培養 2 小時。 在以PBS沖洗三次之後’在室溫下將玻片與Aiexa488山羊 抗-兔子一級抗體（1:1000，Molecular Probes Inc.，USA)—起 培養1小時’使Iba-1顯影。然後以PBS沖洗玻片三次，並 將其浸入 Hoechst 33258(1 微克 /毫升，Sigma_Aldrich, Canada)中。 欲疋塁在發生病灶之脊趙内的小神經膠質細胞/巨噬細 胞活化/招募，使用 SigmaScan Pro 軟體（SPSS，Chicag〇, IL)，將影像重疊處理器（1〇24χ1〇24晝素）放在含有uaj信 號之脊髓横切片的數位捕捉之共焦閾影像上。計算被Iba_ i 信號佔據之區域的百分比，以判定在SCI後5天，使用iba_ ^ 、、且織h色之脊髓小神經膠質細胞/巨喧細胞的密度。每隻動 物至少評估兩個得自病灶位置中心的切片（每組n=2 3隻動 物）。判疋Iba-1信號的平均值和平均值之標準差（sem)，並 在表25中敘述結果。结果顯示與僅有媒劑之對照組相比 較，在SCI後2小時接受單一劑量之LpMid的動物（第！組） 和在SCI後2、24和48小時接受三個劑量之LpMld的老 鼠（第瓜組）’顯示細胞數目分別降低4〇%和㈣。這在統計 上是顯著的（在治療細夕Μ μ ¥ Λ 縻·祖之間的差異Ρ<0.05，按次序的
Kruskal-Wallis 單层 amov a、 . , _ 早尾AN〇VA)。在本實驗中，在第辽組中的 老鼠在2小時和24 /j、昧垃為a & f接又兩個劑虿的LPM1 d，與對照組 細胞相比較’顯示在為Tha 1炫ω 仕局iba-1 %性之細胞的百分比上沒有顯 326 201235469 著差異。 表25 :在SCI之後5天’几3-1(面積％)陽性之小神經 膠質細胞/巨噬細胞的密度 治療 η 平均值 SEM 媒劑 2 12.148 2.822 第I組 3 7.342 0.503 第II組 2 13.465 1.337 第III組 2 4.89 1.297 實施例9 LPM在異種移植模式中的活性 使用已建立的腫瘤異種移植模式，評估LPM在乳癌中 的影響。以雌激素依賴性乳癌細胞株MCF-7(美國典型培養 物收集中心（American Type Culture Collection，ATCC)， Manassas, VA)的250萬個細胞（在0.2毫升PBS/基質膠 (Matrigel))，注射雌性無胸腺裸鼠（nu/nu)，並評估兩種[PM 分子對腫瘤生長的影響。
A.SDF-ip-SAl 變體 1 LPM 在本研究中’在治療攝生法中使用SDF-ip-SAl變體1 LPM(SEQ ID NO:216)。該LPM含有成熟的SDF-Ιβ趨化因 子，與野外型SA1部分連接。在MCF_7注射後第7天，開 始腹腔内給予100微克/公斤SDF-ip-SAl變體1 LPM或媒 劑對照組’並每天持續至第21天。允許腫瘤持續生長至第 3 1天。 I腫瘤生長 327 201235469 藉著以測量腫瘤重量和腫瘤體積來評估腫瘤生長，判 定變體！在該老鼠異種移植模式中阻礙 MCF-7乳癌細胞前進的影響。在沒有8Ε)ΙΜ^_8αι變體1 時，腫瘤生長從第7天（以大約100立方毫米開始）到第31 天不斷地增加，在第28天達到大約98〇立方毫米的最大腫 瘤體積。^⑽微克/公斤之劑量的LPM治療老鼠，結果腫 瘤生長亦不斷地增加；％而，腫瘤生長的大小明顯比沒有 LPM時更小。例如，在LpM的存在下，在第28天達到最 大腫瘤生長，然而，最大腫瘤體積只達到大約5〇〇立方毫 米。結果顯示以LPM治療老鼠，在MCF_7腫瘤生長的速率 ^產生統計學上顯著的降低。得自受試動物之最終腫瘤重 里平均比對照組降低了 35% ,而最終腫瘤體積降低了 41·5%(是顯著的，使用P<〇.〇5雙尾t_檢定）。 2·炎性浸潤 在本模式中，使用顯微鏡檢查以判定SDF_丨0 _s A1變 體1 對炎性浸潤的影響。在給予老鼠最後一劑SDF1 点-SA1變體！ LPM之後1〇天（即第3ι天），切除腫瘤並切 片然後藉著顯彳政鏡檢查，以評估白血球在腫瘤周圍的浸 潤。以蘇木素和曙紅(H&E)染色，使細胞顯影。結果顯示在 經LPM治療之動物的組織中，與僅以媒劑治療之動物相比 較’減少了 36%的細胞，其在統計學上是顯著的。 3«CD-31 染色 ，'哉子檢查允許目視檢查腫瘤内壞死和空泡化的程 又使用抗-CD-31(山羊多株PECam](殖系M 2〇)，以咖 328 201235469
Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA),使 PECAM-1(一種 I田 胞黏連分子及糖蛋白’在單核細胞、嗜中性白*灰球、企小 板和T細胞之亞族群的細胞表面表現）可見。PEc AM-1亦在 成人和胚胎内皮細胞的表面上表現。在給予老鼠最後一劑 SDF-1 /5 -SA1變體1 LPM之後10天（即第31天），切除腫 瘤，切片’並以抗-CD-3 1抗體染色。簡言之，將經福馬林_ 固定和石蠟包埋的腫瘤樣本切片脫石蠟並水合。在一級抗 體培養之如’使用在目標恢復溶液（Target Retrieval
Solution)(pH9.0，DakoCytomation，Carpenteria，CA)中之熱- 誘導-抗原決定位恢復的預先處理。藉著與3%H2〇2 一起培 養’抑制内源的過氧化酶活性，並以DAK0蛋白質無企清 阻斷劑(DakoCytomation，Carpenteria, CA)阻斷非專一的染 色。在室溫下’將試樣與稀釋1:800的一級（抗_CD-3 1)抗體 一起培養30分鐘。然後在室溫下，將組織切片與稀釋1:4〇〇 的經生物素基化之兔子抗-山羊免疫球蛋白（Vect〇r Laboratories，Burlington，CA)— 起培養 3〇 分鐘，接著施用 Dako想像+兔子系統標示之聚合物（Envisi〇n+ RabMt System Labeled Polymer) ， HRP(DakoCytomation, Carpenteria, CA)。利用液態 DAB + (Dak〇Cyt〇mati〇n，
Carpenteria, CA)展開染色，並以蘇木素進行對比染色。一 些白血·球（在組織學分析下看見環狀染色）和内皮細胞（看到 具有拉長形狀之細胞的染色）對CD-3 1為染色陽性的。這些 結果表示在生長中的腫瘤中出現血管生成。相反地，在經 SDF-1 /3 -SA1變體1 LPM治療之腫瘤中沒有cd-3 1染色， 329 201235469 表不沒有巨噬細胞（無胸腺老鼠沒有τ細胞），也沒有腫瘤内 的内皮細胞血管。 4.KU67染色 亦使用組織學檢查，藉著在給予老鼠最後一劑SDF_ i 冷- SA1變體1 LPM之後1〇天（即第31天），以兔子多株抗 67 抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)染色 細胞，e平估SDF-1冷-SA1變體1 [PM在本模式中對細胞增 殖的影響。在細胞週期之所有活躍期（G1、s、G2和M期） 的期間表現該抗原，但在靜止細胞（G〇期）中則無◊當細胞 進入非-增殖階段時，迅速地降解Ki_67抗原，且在DNA修 補過程中不表現Ki-67。簡言之，將經福馬林-固定和石蠟 包埋的腫瘤樣本切片脫石樣並水合。在一級抗體培養之 月』 使用在目才示恢復溶液（pH9.0, DakoCytomation,
Carpenteria，CA)中之熱-誘導-抗原決定位恢復的預先處 理。藉著與3%Η2〇2 —起培養，抑制内源的過氧化酶活性， 並以DAKO蛋白質無血清阻斷劑（Dak〇Cyt〇mati〇n， Carpenteria，CA)阻斷非專一的染色。在室溫下，將試樣與 稀釋1:200的一級（抗-Ki-67)抗體一起培養30分鐘。然後在 室溫下’將組織切片與稀釋1:400的經生物素基化之山羊抗 -兔子免疫球蛋白（Vector Laboratories, Burlington, CA)—起 培養30分鐘’接著施用Dako想像+兔子系統標示之聚合 物，HRP(DakoCytomation，Carpenteria，CA)。利用液態 DAB + (DakoCytomation，Carpenteria，CA)展開染色，並以蘇 木素進行對比染色。藉著Ki-67染色顯示，在未蟫治療之腫 330 201235469 瘤中，大量細胞正在增殖。相反的，經SDF-1万乂sai變體丄 lpm治療之腫瘤顯示出少量抗_Ki_67的染色，代表降低了 腫瘤進行。此外，藉著在視野中清楚的空洞，似乎證實許 多癌細胞已經經歷了壞死。 B.MCP-1-SA1 變體 4(LPMld) 在本研究中，在治療攝生法中使用MCPd-SAi變體 4(LPMld)。在第7天開始腹腔内給藥，並讓隊員接受媒劑； (1)在第7天一個劑量的2毫克/公斤LpMld;(2)在第7、u、 15和21天2毫克/公斤的LPMld;或（3)從第7到第2i天， 每天100微克/公斤LPMld。允許腫瘤持續生長至第32天。 在包括對照組的不同隊員之間，經治療動物的體重改變百 分比不超過〇. 5 %。 增加 在缺少LPMld時，踵瘤生長從第7天到第32天不斷地 ，在第32天達到大約1500立方毫米的最大腫瘤體積。 在所有給藥攝生法中以LPM治療老鼠 結果腫瘤生長不斷 地增加’·然而，腫瘤生長的大小明顯比沒有LpMid時更 以曰MCIM-SA1變體4(LPMld)治療，根據腫瘤體積和重量的 測量’在MCP-7腫瘤生長上引起統計學上顯著的降低。在 所有LPMld治療組之腫瘤生長上的降低，從第7天到第29 天都是類似的，雖然第32天在不同咖心療组中對腫瘤 生長的影響有一些差異。最終的腫瘤重量，從帛！到3组 降低了對照組的41、58.6和36%(顯著的，使用p復以雙 尾t-檢定）。最終的腫瘤體積’從第工到3 331 201235469 研究指出單一或最少的重複給藥，便足以明顯地降低腫瘤 生長的速率。 以LPMld進行第二個MCP-7異種移植實驗。來自第一 個研九的給藥攝生法產生類似的結果。加入額外的給藥攝 生法，藉此在以LPMld治療之前，允許腫瘤先生長到大約 7〇〇立方毫米之腫瘤體積（代替大約100立方毫米），以便測 試治療是否能影響大型生長的腫瘤（具有較顯著的脈管結 構）。因此’允許腫瘤生長直到大約27天，之後投與LpMld 或媒劑對照組。從第27天到第43天，每隔四天經由腹腔 内注射，以100微克/公斤LPMld治療動物。在第一次注射 後，與對照組相比較，以LPM丨d治療立刻明顯降低了腫瘤 體積（ρ<〇·〇5)。該傾向持續到第43天。 實施例1 0 LPMld在實驗性自體免疫腦脊髓炎（ΕΑΕ)_多發性硬化 症之動物模式中的活性 將 8-到 10-週齡的 C57BL/6 雌鼠（Jacks〇n Lab〇rat〇ry，
Bar Harbor，Maine)分成 4 組（1 -4 組）。欲引起 EAE，在第 〇 天’在第1和2組（η=9)的尾背皮下注射以ι〇〇微升完全福 瑞德氏佐劑（Difco Laboratories, Detroit, ΜΙ)乳化的 1〇〇 微 克骨髓磷脂寡樹突細胞糖蛋白（M〇G)33_55肽（Bernard等人 (1997) J Mol Med 75:77-8 8)。這些老鼠亦在第〇天接受以 200微升磷酸緩衝之生理鹽水重建的3〇〇毫微克經冷凍乾燥 之百日咳毒素的腹腔内（i_p_)給藥，並在第2天再一次（匕比 201235469 專人（1998) Nat Med 4:78-83)。第1和2組，分別接秉6 -欠 - 每天注射（第3-8天）在緩衝溶液（5〇mM檸檬酸鈉緩衝溶液， • PH6.2，0.05mM EDTA和1〇〇/0體積/體積甘油）中的 LPM1 d(500微克/公斤）或僅有緩衝溶液，在第3和4組中的 對照組老鼠（n=6)分別完全沒有接受注射，以及6次每天（第 3-8天）僅注射500微克/公斤的LPMl d。 每天使用計分系統評估動物，其制定刻度範圍從〇到 15的疾病評估（Weaver等人，2005)。疾病分數是尾巴和全部 四肢狀態的總和。關於尾巴，〇分反映無症狀，丨代表—半 麻痺的尾巴’巾2分収給尾巴完全麻痺的老^至於前 或後肢則分別進行評估，G分表示無症狀，丨分是輕微或有 改變步態，2代表輕癱，而3分代表完全麻痒的肢體。因此， 完全麻痺的四肢癱動物會得到14分。死亡等於Η分。姓 果顯示對照組老鼠（第3和4組）未展現麻痒。第2組，以^ ^谷液治療的EAE模式，在注射後大約9天開始發展出麻 :，並以線性增加至第14天超過6的平均臨床分數。經治 大動物開始發展出麻痒，在第iq天的平均分數低於 ，其在第12天降低至對照組水 13天依然保持。 7仕弟 :多發性硬化症的急性實驗性自體免疫 對疾病過程有戲劇化的影響。分 緩和降低疾病的開始和嚴重性。在該研究中， 療動物。對照組和試驗動 月在第10天顯示出疾病開始侵襲。在接下來的四 333 201235469 天’相對於對照組動物（展現出6-10的臨床嚴重性分數）， 經治療動物之後的疾病臨床嚴重性分數回到〇(沒有疾病的 行為表現）。 平均臨床嚴重性分數（轉至最接近刻度上的0.5) 天數 對照組（媒劑） 經LPM治 1-9 0 0 10 2.5 2.5 11 3.5 1.0 12 4.5 0.0 13 6.5 0.5 14 10.0 1.0 15 10.0 3.5 16 9.5 6 · 5 17 9.0 6.5 久有/主射或僅注射媒劑（無疾病）之動物，始終都是〇 分 實施例11 在抗-胸腺細胞血清（ATS)_引起之系膜增殖性腎小球腎 :的模式中測3式0PL_CLL2_LPM。在第〇天以ATS注射雄 性大鼠’並從第2到第8天以媒劑、5G或100微克/公斤之 重’且蛋白質每2天-次靜脈内治療。纟ATS注射之前，以 乃第彳第9天收集尿液和血液。在第9天犧牲動物。 /又有觀察㈣體重或臨床毒性症狀的治療相關影響。在經 334 201235469 >台療之動物中， t 降低了尿蛋白含量。腎臌± 學分析顯示腎小社^ •刀片的組織病理
月丁月小球病灶、M/M 肌肌動i & a Κιί & 7 纖維網蛋白和α _平滑 所=刀別降低最多4G、36、38和鳩。後兩個蛋白 士 :、田胞外基質合成和腎小球膜細胞活化的標記。這 果代表在該腎炎之模式中，顯著的腎_保護效果，並表 不可使用趨化因子·配體毒素來治療疾病。 因為修改對熟諳此藝者為顯而易見的，故打算僅藉著 附錄之申請專利範圍限制本發明。 【圖式簡單說明】 Μ 【主要元件符號說明】 益 #»»、 335 201235469 序列表 <Π0> 歐斯布雷製藥有限公司 蘇洪宣 菲力浦〗柯金斯 約翰R麥當勞 蘿拉Μ麥因透許 <120>挑選和生產經修改毒素的方法，含有經修改毒素之共軛物，與其等之用途
<130> 17080-010TW1/609TW <140>未指派 <141>據此建檔 <160> 216 <170〉FastSEQ視窗4.0版
<210> I <211> 315 <212> PRT <213>痢疾志賀桿菌，大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素A-鏈前驅物 <400〉 1
Met Lys lie lie lie Phe Arg Val Leu Thr Phe Phe Phe Val lie Phe 15 10 15
Ser Val Asn Val Val Ala Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala 20 25 30
Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr 35 40 45
Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp 50 55 60
Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp 65 70 75 80
Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn 85 90 95
Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr 100 105 110
Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val 115 120 125
Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly 130 135 140 lie Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser 145 150 155 160
Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val 165 170 175
Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg 180 185 190
Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser 195 200 205
Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn 2l〇 215 220
Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser 225 230 235 240
Val Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly 245 250 255
Ser Val Ala Leu lie Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala 260 265 270
Arg Met Ala Ser Asp Glu Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg ' 275 280 285
Val Arg Gly lie Thr His Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu 290 295 300
Gly Ala He Leu Met Arg Arg Thr lie Ser Ser 305 310 315
<210> 2 <211> 89 <212> PRT <213>痢疾志賀桿菌，大腸桿菌 201235469 <220> <223>志賀毒素B-鏈 <400> 2
Met Lys Lys Thr Leu Leu lie Ala Ala Ser Leu Ser Phe Phe Ser Ala 15 10 15
Ser Ala Leu Ala Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr 20 25 30
Lys Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp Lys Glu 35 40 45
Leu Phe Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gin Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gin 50 55 60 lie Thr Gly Met Thr Val Thr He Lys Thr Asn Ala Cys His Asn Gly 65 70 75 80
Gly Gly Phe Ser Glu Val lie Phe Arg 85 <210> 3 <211> 319 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220〉 <223>類志賀毒素11次單元4前驅物 <400> 3
Met Lys Cys lie Leu Phe Lys 丁rp Val Leu Cys Leu Leu Leu Gly Phe l 5 10 15
Ser Ser Val Ser Tyr Ser Arg Glu Phe Thr lie Asp Phe Ser Thr Gin 20 25 30
Gin Ser Tyr Val Ser Ser Leu Asn Ser lie Arg Thr Glu lie Ser Thr 35 40 45
Pro Leu Glu His lie Ser Gin Gly Thr Thr Ser Val Ser Val lie Asn 50 55 60
His Thr Pro Pro Gly Ser Tyr Phe Ala Val Asp He Arg Gly Leu Asp 65 70 75 80
Val Tyr Gin Ala Arg Phe Asp His Leu Arg Leu lie lie Glu Gin Asn 85 90 95
Asn Leu Tyr Val Ala Gly Phe Val Asn Thr Ala Thr Asn Thr Phe Tyr 100 105 110
Avg Phe Ser Asp Phe Thr His lie Ser Val Pro Gly Val Thr Thr Val 115 120 125
Ser Met Thr Thr Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Ala 130 135 140
Leu Glu Arg Ser Gly Met Gin lie Ser Arg His Ser Leu Val Ser Ser 145 150 155 160
Tyr Leu Ala Leu Met Glu Phe Ser Gly Asn Thr Met Thr Arg Asp Ala 165 170 175
Ser Arg Ala Val Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg 180 185 190
Phe Arg Gin lie Gin Arg Glu Phe Arg Gin Ala Leu Ser Glu Thr Ala 195 200 205
Pro Val Tyr Thr Met Thr Pro Gly Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp 210 215 220
Gly Arg lie Ser Asn Val Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Val 225 230 235 240
Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Asn Asn lie Ser Ala lie Leu Gly Thr 245 250 255
Val Ala Val lie Leu Asn Cys His His Gin Gly Ala Arg Ser Val Arg 260 265 270
Ala Val Asn Glu Glu Ser Gin Pro Glu Cys Gin lie Thr Gly Asp Arg 275 280 285
Pro Val lie Lys lie Asn Asn Thr Leu Trp Glu Ser Asn Thr Ala Ala 290 295 300
Ala Phe Leu Asn Arg Lys Ser Gin Phe Leu Tyr Thr Thr Gly Lys 305 310 315 <210> 4 <211> 89 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223>類志賀毒素11次單元8前驅物 201235469 <400> 4
Met Lys Lys Met Phe Met Ala Val Leu Phe Ala Leu Ala Ser Val Asn 15 10 15
Ala Met Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys lie Giu Phe Ser Lys Tyr 20 25 30
Asn Glu Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Asp Gly Lys Glu Tyr Trp 35 40 45
Thr Ser Arg Trp Asn Leu Gin Pro Leu Leu Gin Ser Ala Gin Leu Thr 50 55 60
Gly Met Thr Val Thr lie Lys Ser Ser Thr Cys Glu Ser Gly Ser Gly 65 70 75 80
Phe Ala Glu Val Gin Phe Asn Asn Asp S5
<210> 5 <2]]> 293 <212> PRT <2 ]3>痢疾志賀桿菌，大腸桿菌 <220〉 <223>志賀毒素A-鏈成熟 <400> 5
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser 1 5
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie 20
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met 35 40
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly 50 55
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu 65 70
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val 85
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr 100
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val 115 120
Gin He Asn Arg His Ser Leu Thr 130 135
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin 145 150
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala 165
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp 180
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr 195 200
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin 210 215
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie 225 230
Asn Cys His His His Ala Ser Arg 245
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp 260
Asn Lys lie Lea Trp Asp Ser Ser 275 280
Arg Thr Me Ser Ser 290
Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 10 15
Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 25 30 lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 45 lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 60
Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 75 80
Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 90 95
Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 105 110
Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 125
Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 140
Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 155 160
Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 170 175
Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 185 190
Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 205
Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 220
Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 235 240
Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 250 255
Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 265 270
Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 285
<210> 6 <211> 293 <212> PRT <2 ]3>痢疾志賀桿菌，大腸桿菌 <220> <221>變體 <222> 45 <223〉 Xaa= Thr或Ser <220> 201235469 <221>變體 <222> 77 <223> Xaa= Tyr，Ph^Ser <220> <221>變體 <222> 114 <223> Xaa= Tyr, Phe或Ser <220> <221>變體 <222> 167 <223〉 Xaa= Glu， Gin或Asp <220> <221>變體 <222> 170 <223> Xaa= Arg或Leu <220> <221>變體 <222> 203 <223〉 Xaa= Try， Ala或Phe <220> <221>變體 <222> 204 <223> Xaa二 Gly或Ala <220> <221 >變體 <222> 205 <223〉 Xaa= Arg或Ala <220> <221>變體 <222> 226 <223> Xaa= Phe或Tyr <220> <22丨> 變體 <222> 231 <223> Xaa= AU或Asp <220> <221>變體 <222> 232 <223> Xaa= lie或Glu <220> <221>變體 <222> 233
Xaa= Leu或Glu <220> <221>變體 <222> 234 <223> Xaa= Gly或Glu <220> <221 >變體 <222> 240 <223> Xaa= Leu, Lys, Ala, Asn， Arg或Asp <220> <221 >變體 <222> 241 <223〉 Xaa= Asn或Asp <220> <221>變體 <222> 242 <223> Xaa= Cys或Ser <220> <221>變體 201235469 <222> 253 <223> Xaa= Ala或Gly <220> <221>變體 <222> 254 <223> Xaa= Ser或Thr <220> <221>變體 <222> 277 <223> Xaa= Try, Phe^Gly <220> <221>變體 <222> 278 <223> Xaa= Asp或Lys <220> <221>變體 <222> 288 <223> Xaa= Arg， Gly或Glu. <220> <22]>變體 <222> 289 <223〉 Xaa= Arg， Gly或Glu <400> 6
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Xaa Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gty lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Xaa Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Xaa Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Xaa Ala Leu Xaa Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Tlir Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Xaa Xaa Xaa Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Xaa Gly Ser He Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Val Ala Leu lie Xaa 225 230 235 240
Xaa Xaa His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Xaa Xaa Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Xaa Xaa Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Xaa 275 280 285
Xaa Thr lie Ser Ser 290 <210> 7 <211> 293 <212> PRT <213> 昜桿菌 <220〉 <223> Stxlc成熟 201235469 <400> 7
Lys Glu Phe Tlir Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg lie Val Pro Asn Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly He Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu lie Arg 275 280 285
Arg Ala lie Ser Ser 290 <210> 8 <211> 293 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223> Suld成熟 <400> 8
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Lys Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp lie Met Gly Leu Glu Pro Glu Glu Glu Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Arg Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 6 201235469 * lie Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240 一 Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Thr Pro Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Thr Asp Gly Ser Gly Arg Gly lie Thr His 260 265 270 - Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu lie Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 9 <211> 293 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 9
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Giy lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser He Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Gin A3a Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 10 <211> 293 <212> PRT <213>夫腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 10
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val fie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30 7 201235469
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Ser Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser He Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210〉 11 <211> 293 <212> PRT <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 11
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr He Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Pro Leu Arg Phe Arg Gin He Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 8 201235469 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 12 <211> 293 <212> PRT <2]3>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 12
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val He Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Aia Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin He Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Leu Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr Ile Ser Ser 290 <210> 13 <211> 293 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 13
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly He Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 9 201235469 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Ser Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin He Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 2i〇 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 14 <21I> 293 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 14
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin He Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Glu Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys He Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285 10 201235469
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 15 <211> 293 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 15
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met He Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Arg Gly Thr Ser Leu Pro Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 ' 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala He Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly He Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr I]e Ser Ser 290 <210> 16 <211> 293 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 16
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 11 201235469
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Arg Gly Thr Ser Leu Pro Gin Ser Gly Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Va] Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 17 <211> 293 <212> PRT <213>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 17
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val He Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Gin Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Gly Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu Met Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 18 12 201235469 <211> 293 <212> PRT <2]3>夫腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 18
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Gly Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thv Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg lie Val Pro Asn Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu lie Arg 275 280 285
Arg Ala lie Ser Ser 290 <210> 19 <211> 293 <212> PRT <213>夭腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 19
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 13 201235469 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Ϊ80 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 , 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu He Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg lie Val Pro Asn Glu 245 250 255
Leu Pro Ser Met Cys Fro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu lie Arg 275 280 285
Arg Ala lie Ser Ser 290 <210> 20 <211> 293 <212> PRT <2]3>大腸桿菌 <220> <223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 20
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly G]y Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Me Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Pro Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Pro 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys Pro His His Ala Ser Arg Val Ala Arg He Val Pro Asn Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys He Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu lie Arg 275 280 285
Arg Ala lie Ser Ser 290 <210> 21 <2]1> 293 <212> PRT <213>夭|昜桿菌 14 <220〉 201235469 .<223>志賀毒素對偶基因變體 <400> 21
Lys GIu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Lys Tyr Val Asp Ser •15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn • 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp lie Met Gly Leu Glu Pro Glu Glu Glu Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Arg Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin He Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 lie Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 210 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Thr Pro Asp Glu 245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Thr Asp Gly Ser Gly Arg Gly lie Thr His 260 265 270
Asn Lys lie Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala lie Leu He Arg 275 280 285
Arg Thr lie Ser Ser 290 <210> 22 <211> 246
<212> PRT <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223> SA1 變體 1 <400> 22
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asa Val lie Arg Ser Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190 15 201235469
Thr Ala Clu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg ile 210 215 220
Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala 245
<210> 23 <211> 738 <212> DNA <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223> SA1 變體] <400> 23 aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 60 cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 120 atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 180 gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 240 ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 300 cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 360 gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 420 gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 480 tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 540 actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 600 ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 660 gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 720 aactgccacc accatgca 738 <210> 24 <211> 241
<212> PRT <213>痢疾志賀桿菌 <220〉 <223> SA1 變體2 <400> 24 Lys Giu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15 Leu Asn Val lie Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gin Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Giy Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile 210 215 220
Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240
Asn 16 201235469 <210> 25 ^ <2!1> 723 <212〉 DNA <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223> SA1 變體2 • <400> 25 aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg aac <210> 26 <211> 246
<212> PRT <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223> SA1 變體3 <400> 26
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Arg Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin Me Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie 2l〇 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala 245 <210> 27 <211> 738
<212> DNA <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223〉SA1 變體3 <400〉 27 aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 17 201235469 cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tcgcttaatg atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg aactgccacc accatgca <210> 28 <211> 241 <212> PRT <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223> SA1 變體4 <400> 28
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 15 10 15
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin He Gin Arg 165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg He 210 215 220
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 225 230 235 240
Asn
<210> 29 <211> 723 <212> DNA <213>痢疾志賀桿菌 <220> <223> SA1 變體4 <400> 29 aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca acicttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgcacgt s 18 201235469 gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 720 aac 723 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：用於抗體生產之SA1肽 <400> 30
Cys Leu Phe Ala Val Asp Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu 15 10 15
Gly Arg Phe Asn Asn Leu 20 <210〉 31 <2I1> 6 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：Ndel限制位置 <400> 31 catatg 6 <210> 32 <211> 6 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：EcoRI限制位置 <400> 32 gaattc 6 <210> 33 <21]> 6 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：BamHI限制位置 <400> 33 ggattc 6 <210> 34 <211> 6 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：Ala-Met連接子 <400> 34 gccatg 6 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：T7引子 <400> 35 taatacgact cactataggg 20
<210> 36 <211> 18 <212> DNA 18 201235469 <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述 <400> 36 gctagttatt gctcagcg <210> 37 <211> 987 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述 T7t引子 ¥體編碼趨化因子· 毒素融合蛋白質MCP-1-AM·志賀-A1變體1 <220〉 <223> LPMla <400> 37 catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc 60 aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa 120 gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa 180 tgggtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg 240 aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 300 cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 360 atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 420 gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 480 ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 540 cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 600 gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 660 gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccag.tccg tcgcacgcgc aatgttacgt 720 tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 780 actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 840 ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 900 gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 960 aactgccacc accatgcata aggatcc 987 <210> 38 <211> 325 <212> PRT <213>人工序列 <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質MCP-1-AM-志賀-A1變體1 <220> <223> LPMla <400> 38
Met Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 15 10 15
Thr Asn Arg Lys He Ser Val Gin Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg lie 20 25 30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val lie Phe Lys Thr lie Val 35 40 45
Ala Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Gin Lys Trp Val Gin Asp Ser 50 55 60
Met Asp His Leu Asp Lys Gin Thr Gin Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys 65 70 75 80
Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu 85 90 95
Asn Val lie Arg Ser Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser 100 105 110
Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu 115 120 125
Phe Ala Val Asp Val Arg Gly He Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn 130 135 140
Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe 145 150 155 160
Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His 165 170 175
Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser 180 185 190 sr 20 201235469 . Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin 195 200 205 lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His 210 215 220
Ser G!y Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe 225 230 235 240
Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly 245 250 255 - Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr 260 265 270
Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val 275 280 285
Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie Ser 290 295 300
Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 320
Cys His His His Ala 325 <210> 39 <211> 972 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋白質MCP-1-AM-志賀-A1變體2 <220> <223> LPMlb <400> 39 catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa tgggtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg aaagaattea cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tetettaatg atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa gaaggccgtt tcaataacct gegettaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttegteaga ttcaacgtgg tttccgcaca actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc aettattetg aactaaggat cc <210> 40 <211> 320 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子·毒素融合 蛋白質MCP-1-AM-志賀-A1變體2 <220> <223> LPMlb <400> 40
Met Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 15 10 15
Thr Asn Arg Lys lie Ser Val Gin Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg lie 20 25 30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val lie Phe Lys Thr lie Val 35 40 45
Ala Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Gin Lys Trp Val Gin Asp Ser 50 55 60
Met Asp His Leu Asp Lys Gin Thr Gin Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys 65 70 75 80
Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu 85 90 95 21 201235469
Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser 100 105 110
Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu 115 120 125
Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn 130 135 140
Asn Leu Arg Leu He Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe 145 150 155 160
Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His 165 170 175
Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser 180 185 190
Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly He Ser Arg Thr Gly Met Gin 195 200 205
He Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His 210 215 220
Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe 225 230 235 240
Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly 245 250 255
Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr 260 265 270
Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val 275 280 285
Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie Ser 290 295 300
Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 320 <210> 41 <211> 987 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋έ質MCP-1-AM-志賀·Α1變體3 <220> <223> LPMlc <400> 41 catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa tg§gtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tcgcttaatg atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcctttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca actctigatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg aactgccacc accatgcata aggatcc <210> 42 <211> 325 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子·毒素融合 蛋白質MCP·卜AM-志賀·Α1變體3 <220> <223〉 LPMlc <400> 42
Mel Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 15 10 15 22 201235469 .Thr Asn Arg Lys lie Ser Val Gin Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg lie 20 25 30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val lie Phe Lys Thr lie Val 35 40 45 • Ala Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Gin Lys Trp Val Gin Asp Ser 50 55 60
Met Asp His Leu Asp Lys Gin Thr Gin Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys 65 70 75 80 - Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu 85 90 95
Asn Val lie Arg Ser Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser 100 105 110
Gly Gly Thr Ser Arg Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu 115 120 125
Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn 130 135 140
Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe 145 150 155 160
Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His 165 170 175
Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser ISO 185 190
Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly He Ser Arg Thr Gly Met Gin 195 200 205 lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His 210 215 220
Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe 225 230 235 240
Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly 245 250 ， 255
Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr 260 265 270
Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val 275 280 285
Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie Ser 290 295 300
Phe Gly Ser lie Asn Ala He Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 320
Cys His His His Ala 325 <210> 43 <211> 972 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋白質MCP-1-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPMld <400> 43 catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa tgggtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc ttcgtaaacc glaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc gatt taatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca actcttgatg aittatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgcacgt gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg aactaaggat cc
<210> 44 <211> 320 <212> PRT 23 201235469 <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子·毒素融合 蛋白質MCP-1-AM·志賀-A1變體4
Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr 260 265 270 Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val 275 280 285 <220〉 <223> LPMld <400> 44
Met Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala 1 5
Thr Asn Arg Lys lie Ser Val Gin 20
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu 35 40
Ala Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro 50 55
Met Asp His Leu Asp Lys Gin Thr 65 70
Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr 85
Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly 100
Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie 115 120
Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie 130 135
Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg 145 150
Va) Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe 165
Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala 180
Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala 195 200 lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr 210 215
Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser 225 230
Val Thr Val TKr Ala Glu Ala Leu 245
Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 10 15
Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg lie 25 30
Ala Val lie Phe Lys Thr lie Val 45
Lys Gin Lys Trp Val Gin Asp Ser 60
Gin Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys 75 80
Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu 90 95
Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser 105 110
Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu 125
Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn 140
Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe 155 160
Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His 170 175
Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser 185 190
Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin 205
Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His 220
Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe 235 240
Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly 250 255
Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser 290 295 300 Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 320 <210> 45 <211> 966 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子· 毒素融合蛋白質嗜酸球趨化蛋白·1·ΑΜ_志賀-A1變體4 <220> <223> LPM2 <400> 45 catatgggcc ccgcatccgt tccaactaca tgttgtttta atctggcgaa ccgcaagatt 60 cctctccagc gtcttgaatc atacagacgg atcacgtctg gtaaatgccc gcaaaaggcc 120 gtgatattca aaaccaaatt ggcgaaagat atctgcgctg accctaagaa aaagtgggta 180 caggactcga tgaagtatct ggatcaaaaa agcccaaccc cgaaaccggc catgaaagaa 240 ttcacactcg acttcagcac cgcaaaaact tacgtagact ccctgaatgt aatccgctcc 300 gctatcggca ccccgttaca aactattagc tccggcggta catctctctt aatgatcgat 360 tccggtactg gcgacaattt attcgctgtg gatgtacgtg gcattgaccc agaagaaggc 420 cgtttcaata acctgcgctt aattgttgaa cgtaataacc tgtatgtaac tggcttcgta 480 aaccgtacca acaacgtctt ttaccgcttc gctgactttt ctcacgtaac ctttcccgga 540 acaactgcag taactctctc cggcgacagt tcctatacga ccctccaacg tgttgcaggt 600 atttctcgca ccggtatgca aatcaatcgt cactctctta ctacatcgta tctcgattta 660 s 24 201235469 . atgtcacact ccggcacctc tttaacccag tccgtcgcac gcgcaatgtt acgttttgtt 720 actgtcacag cagaggctct tcgctttcgt cagattcaac gtggtttccg cacaactctt 780 gatgatttat ctggccgctc ttatgtaatg accgcagaag atgtagatct gaccttgaac 840 tggggccgcc tgagcagtgt gttacctgat tatcacggac aagacagtgc acgtgtaggc 900 cgtatctcct ttggttccat taacgccatt ttaggttctg ttgcacttat tctgaactaa 960 ggatcc 966 <210> 46 - <211> 318
<212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子·毒素融合 蛋白質嗜酸球趨化蛋志賀·Α1變體4 <220> <223> LPM2 <400> 46
Met Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn 15 10 15
Arg Lys lie Pro Leu Gin Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg lie Thr Ser 20 25 30
Gty Lys Cys Pro Gin Lys Ala Val lie Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys 35 40 45
Asp lie Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gin Asp Ser Met Lys 50 55 60
Tyr Leu Asp Gin Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro Ala Met Lys Glu Phe 65 70 75 80
Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val 85 90 ,95 lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly 100 105 110
Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala 115 120 125
Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asa Leu 130 135 140
Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn 145 150 155 160
Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr 165 170 175
Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr 180 185 190
Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn 195 200 205
Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly 210 215 220
Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr 225 230 235 240
Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg 245 250 255
Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu 260 265 270
Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro 275 280 285
Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly 290 295 300
Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 <210> 47 <211> 960 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋白質SDF-lbeta-AM-志賀·Α1變體4 <220> <223> LPM3 <400> 47 catatgaagc cggtgtctct gtcctaccgt tgcccatgta gatttttcga gagccatgtt 60 25 V. 201235469 gcccgggcaa acgttaaaca cctaaagata ctcaataccc ctaactgtgc gttacagatc 120 gtcgcgaggc t taaaaacaa taaccgccaa gtatgcatcg accccaagtt gaagtggatt 180 caggaatatc tggaaaaagc tctgaataaa cgattcaaaa tggccatgaa agaattcaca 240 ctcgacttca gcaccgcaaa aacttacgta gactccctga atgtaatccg ctccgctatc 300 ggcaccccgt tacaaactat tagctccggc ggtacatctc tcttaatgat cgattccggt 360 actggcgaca atttattcgc tgtggatgta cgtggcattg acccagaaga aggccgtttc 420 aataacctgc gcttaattgt tgaacgtaat aacctgtatg taactggctt cgtaaaccgt 480 accaacaacg tcttttaccg cttcgctgac ttttctcacg taacctttcc cggaacaact 540 gcagtaactc tctccggcga cagttcctat acgaccctcc aacgtgttgc aggtatttct 600 cgcaccggta tgcaaatcaa tcgtcactct cttactacat cgtatctcga tttaatgtca 660 cactccggca cctctttaac ccagtccgtc gcacgcgcaa tgttacgttt tgttactgtc 720 acagcagagg ctcttcgctt tcgtcagatt caacgtggtt tccgcacaac tcttgatgat 780 ttatctggcc gctcttatgt aatgaccgca gaagatgtag atctgacctt gaactggggc 840 cgcctgagca gtgtgttacc tgattatcac ggacaagaca gtgcacgtgt aggccgtatc 900 tcctttggtt ccattaacgc cattttaggt tctgttgcac ttattctgaa ctaaggatcc 960 <210> 48 <211> 316 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質SDF-lbeta-AM-志賀·Α1變體4 <220> <223> LPM3 <400> 48
Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu 15 10 15
Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys lie Leu Asn Thr 20 25 30
Pro Asn Cys Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg 35 40 45
Gin Val Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp lie Gin Glu Tyr Leu Glu 50 55 60
Lys Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu 65 70 75 80
Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg 85 90 95
Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Ser 100 105 110
Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp 115 120 125
Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu 130 135 HO
He Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr 145 150 155 160
Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro 165 170 175
Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu 180 185 190
Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin He Asn Arg His 195 200 205
Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser 210 215 220
Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr 225 230 235 240
Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr 245 250 255
Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val 260 265 270
Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr 275 280 285
His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie 290 295 300
Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 <210> 49 <211> 963 <212> DNA <213>人工序列 201235469 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋白質GRO-alpha-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM4 -<400> 49 catatggcgt ccgttgctac cgagctgcgt tgtcagtgcc tgcaaactct gcagggtatc cacccgaaaa acatccagag cgtaaacgtg aaatctccag gtccgcactg cgcgcagacc gaagttattg ctaccctgaa aaacggccgt aaagcgtgtc tgaacccggc ctccccgatc gttaagaaaa ttatcgaaaa gatgctgaac tctgacaaaa gcaatgcaat gaaagaattc acactcgact tcagcaccgc aaaaacttac gtagactccc tgaatgtaat ccgctccgct atcggcaccc cgttacaaac tattagctcc ggcggtacat ctctcttaat gatcgattcc ggtactggcg acaatttatt cgctgtggat gtacgtggca ttgacccaga agaaggccgt ttcaataacc tgcgcttaat tgttgaacgt aataacctgt atgtaactgg cttcgtaaac cgtaccaaca acgtct11ta ccgcttcgct gacttttctc acgtaacctt tcccggaaca actgcagtaa ctctctccgg cgacagttcc tatacgaccc tccaacgtgt tgcaggtatt tctcgcaccg gtatgcaaat caatcgtcac tctcttacta catcgtatct cgatttaatg tcacactccg gcacctcttt aacccagtcc gtcgcacgcg caatgttacg ttttgttact gtcacagcag aggctcttcg ctttcgtcag attcaacgtg gtttccgcac aactcttgat gatttatctg gccgctctta tgtaatgacc gcagaagatg tagatctgac cttgaactgg ggccgcctga gcagtgtgtt acctgattat cacggacaag acagtgcacg tgtaggccgt atctcctttg gttccattaa cgccatttta ggttctgttg cacttattct gaactaagga tcc <210> 50 <2]1> 317 <212> PRT <213>人工序列 <220> . <223>人工序列之敘述：趨化因子·毒素融合 蛋白質GRO-alpha-AM-志賀-A1變體4 <220> <223〉 LPM4 <400> 50
Met Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr Leu 15 10 15
Gin Gly lie His Pro Lys Asn lie Gin Ser Val Asn Val Lys Ser Pro 20 25 30
Gly Pro His Cys Ala Gin Thr Glu Val lie Ala Thr Leu Lys Asn Gly 35 40 45
Arg Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro lie Val Lys Lys lie lie 50 55 60
Glu Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn Ala Met Lys Glu Phe Thr 65 70 75 80
Leu Asp Phe Ser Thr A!a Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie 85 90 95
Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr 100 105 110
Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val 115 120 125
Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg 130 135 140
Leu He Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg 145 150 155 160
Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe 165 170 175
Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr 180 185 190
Leu Gin Arg Val Ala Gly He Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg 195 200 205
His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr 210 215 220
Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val 225 230 235 240
Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr 245 250 255
Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp 260 265 270
Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp 275 280 285 27 201235469
Tyr His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser 290 295 300 lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 <210> 51 <211> 951 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工學列之敘述：構築體編碼趨化因子· 毒素融合蛋0質MIIMbeta-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM5 <400> 51 catatggctc cgatgggttc tgacccgccg actgcttgct gtttttctta taccgcacgt 60 aaactgccgc gtaacttcgt tgttgactac tacgagacct cctctctgtg ctctcagcca 120 gccgtagtct tccagaccaa gcgcagcaaa caggtgtgcg cggatccttc cgaaagctgg 180 gtgcaagaat atgtttacga tctggaactg aacgcgatga aagaattcac actcgacttc 240 agcaccgcaa aaacttacgt agactccctg aatgtaatcc gctccgctat cggcaccccg 300 ttacaaacta ttagctccgg cggtacatct ctcttaatga tcgattccgg tactggcgac 360 aatttattcg ctgtggatgt acgtggcatt gacccagaag aaggccgttt caataacctg 420 cgcttaattg ttgaacgtaa taacctgtat gtaactggct tcgtaaaccg taccaacaac 480 gtcttttacc gcttcgctga cttttctcac gtaacctttc ccggaacaac tgcagtaact 540 ctctccggcg acagttccta tacgaccctc caacgtgttg caggtatttc tcgcaccggt 600 atgcaaatca atcgtcactc tcttactaca tcgtatctcg atttaatgtc acactccggc 660 acctctttaa cccagtccgt cgcacgcgca atgttacgtt ttgttactgt cacagcagag 720 gctcttcgct ttcgtcagat tcaacgtggt ttccgcacaa ctcttgatga tttatctggc 780 cgctcttatg taatgaccgc agaagatgta gatctgacct tgaactgggg ccgcctgagc 840 agtgtgttac ctgattatca cggacaagac agtgcacgtg taggccgtat ctcctttggt 900 tccattaacg ccattttagg ttctgttgca cttattctga actaaggatc c 951 <210> 52 <211> 313 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質MIP-lbeU-AM-志賀·Α1變體4 <220> <223> LPM5 <400> 52
Met Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr 15 10 15
Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr 20 25 30
Ser Ser Leu Cys Ser Gin Pro Ala Val Val Phe Gin Thr Lys Arg Ser 35 40 45
Lys Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gin Glu Tyr Val 50 55 60
Tyr Asp Leu Glu Leu Asn Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser 65 70 75 80
Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie 85 90 95
Gly Thr Pro Leu Gin Thr He Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met 100 105 110 lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly 115 120 125
He Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu 130 135 140
Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val 145 150 155 160
Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr 165 170 175
Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val 180 185 190
Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr 195 200 205
Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Lea Thr Gin 28 201235469 210 215 220
Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala 225 230 235 240
Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp 245 250 255
Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr 260 265 270
Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin 275 280 285
Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie 290 295 300
Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 <210> 53 <211> 975 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋白質IL-8-AM-志賀·Α1變體4 <220> <223> LPM6 <400> 53 catatggcgg tcctgccacg ttccgcgaaa gaactgcgct gccagtgcat taagacctac agcaaaccgt ttcacccgaa attcatcaaa gaactgcgtg ttatcgagtc tggtccgcac tgtgcaaaca ccgaaattat cgttaaactg tctgatggcc gtgaactgtg cctggacccg aaagagaact gggtgcagcg tgtggtagaa aagttcctga aacgcgccga aaattccgct atgaaagaat tcacactcga cttcagcacc gcaaaaactt acgtagactc cctgaatgta atccgctccg ctatcggcac cccgttacaa actattagct ccggcggtac atctctctta atgatcgatt ccggtactgg cgacaattta ttcgctgtgg atgtacgtgg cattgaccca gaagaaggcc gtttcaataa cctgcgctta attgttgaac gtaataacct gtatgtaact ggcttcgtaa accgtaccaa caacgtcttt taccgcttcg ctgactmc tcacgtaacc tttcccggaa caactgcagt aactctctcc ggcgacagtt cctatacgac cctccaacgt gttgcaggta tttctcgcac cggtatgcaa atcaatcgtc actctcttac tacatcgtat ctcgatttaa tgtcacactc cggcacctct ttaacccagt ccgtcgcacg cgcaatgtta cgttttgtta ctgtcacagc agaggctctt cgctttcgtc agattcaacg tggtttccgc acaactcttg atgatttatc tggccgctct tatgtaatga ccgcagaaga tgtagatctg accttgaact ggggccgcct gagcagtgtg ttacctgatt atcacggaca agacagtgca cgtgtaggcc gtatctcctt tggttccatt aacgccattt taggttctgt tgcacttatt ctgaactaag gatcc <210> 54 <211> 321 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質IL-8-AM-志賀-Al·變體4 <220> <223> LPM6 <400> 54
Met Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gin Cys lie 15 10 15
Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe lie Lys Glu Leu Arg 20 25 30
Val lie Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu lie He Val Lys 35 40 45
Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val 50 55 60
Gin Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser Ala Met 65 70 75 80
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 85 90 95
Leu Asn Val He Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser 100 105 110
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 115 120 125
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 29 201235469 130 135 140
Asn Asn Leu Arg Leu lie Vai GIu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 145 150 155 160
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 165 170 175
His Val Thr Phe Fro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 180 185 190
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 195 200 205
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 210 215 220
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Va] Ala Arg Ala Met Leu Arg 225 230 235 240
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 245 250 255
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 260 265 270
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 275 280 285
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie 290 295 300
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 305 310 315 320
Asn <210> 55 <211> 975 <212> DNA <213>人工序列 g|>融罐1諾&構志雲If因子-<220> <223> LPM7 <400> 55 catatggttc cgctgtctcg caccgttcgt tgtacttgca tctctatctc taatcagccg 60 gtcaacccgc gcagcctgga aaaactggaa atcatcccgg cgtcccagtt ctgccctcgt 120 gtggaaatta tcgctaccat gaagaagaaa ggtgagaagc gttgcctgaa cccagagtct 180 aaagcaatta aaaacctgct gaaagctgta tccaaagaac ggtcgaaacg tagcccggcg 240 atgaaagaat tcacactcga cttcagcacc gcaaaaactt acgtagactc cctgaatgta 300 atccgctccg ctatcggcac cccgttacaa actattagct ccggcggtac atctctctta 360 atgatcgatt ccggtactgg cgacaattta ttcgctgtgg atgtacgtgg cattgaccca 420 gaagaaggcc gtttcaataa cctgcgctta attgttgaac gtaataacct gtatgtaact 480 ggcttcgtaa accgtaccaa caacgtcttt taccgcttcg ctgacttttc tcacgtaacc 540 tttcccggaa caactgcagt aactctctcc ggcgacagtt cctatacgac cctccaacgt 600 gttgcaggta tttctcgcac cggtatgcaa atcaatcgtc actctcttac tacatcgtat 660 ctcgatttaa tgtcacactc cggcacctct ttaacccagt ccgtcgcacg cgcaatgtta 720 cgttttgtta ctgtcacagc agaggctctt cgctttcgtc agattcaacg tggtttccgc 780 acaactcttg atgatttatc tggccgctct tatgtaatga ccgcagaaga tgtagatctg 840 accttgaact ggggccgcct gagcagtgtg ttacctgatt atcacggaca agacagtgca 900 cgigtaggcc gtatctcctt tggttccatt aacgccattt taggttctgt tgcacttatt 960 ctgaactaag gatcc 975 <210> 56 <211> 321 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之敘述：趨化因子·毒素融合 蛋白質丨P-10-AM-志賀-A丨變體4 <220> <223> LPM7 <400> 56
Met Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys lie Ser lie Ser 15 10 15
Asn Gin Fro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu lie lie Pro 20 25 30
Ala Ser Gin Phe Cys Pro Arg Val Glu lie lie Ala Thr Met Lys Lys s 30 . 201235469 35 40 45
Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala lie Lys Asn 50 55 60
Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro Ala Met 65 70 75 80
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 85 90 95
Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr He Ser 100 105 110
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met He Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 115 120 125
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 130 135 140
Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 145 150 155 160
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 165 170 175
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 180 185 190
Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met 195 200 205
Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 210 215 220
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 225 230 235 240
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg 245 250 255
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 260 265 270
Tlir Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 275 280 285
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie 290 295 300
Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala He Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu 305 310 315 320
Asn <210> 57 <211> 972 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子· 毒素融合蛋白質MCP-3-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM8 <400> 57 catatgcagc ctgtgggtat caatacctct accacttgtt gctatcgctt tatcaacaaa aagatcccga agcagcgtct cgaatcgtac cgtcgcacga cttccagcca ttgcccgcgt gaggctgtta ttttcaaaac caaacttgat aaagaaattt gcgcggaccc aacccagaaa tgggtacagg atttcatgaa acacttggac aaaaagactc aaaccccgaa actggccatg aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgcacgt gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg aactaaggat cc <210〉 58 <211> 320 <212> PRT <213>人工序列 31 <220〉 201235469 <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質MCP-3-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM8 <400> 58
Met Gin Pro Val Gly lie Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe 15 10 15 lie Asn Lys Lys lie Pro Lys Gin Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr 20 25 30
Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val lie Phe Lys Thr Lys Leu 35 40 45
Asp Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Thr Gin Lys Trp Val Gin Asp Phe 50 55 60
Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gin Thr Pro Lys Leu Ala Met Lys 65 70 75 80
Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu 85 90 95
Asn Val lie Arg Ser Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser 100 105 110
Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu 115 120 125
Phe Ala Val Asp Val Arg Gly He Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn 130 135 140
Asn Leu Arg Leu lie Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe 145 150 155 160
Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His 165 170 175
Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser 180 185 190
Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin 195 200 205 lie Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His 210 215 220
Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe 225 230 235 240
Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly 245 250 255
Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr 260 265 270
Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val 275 280 285
Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser 290 295 300
Phe Gly Ser He Asn Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 315 320 <210> 59 <21i> 954 <212> DNA <213>人工序列 <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子· 毒素融合蛋白質MIP-3alpha-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM9 <400> 59 catatggcaa gcaactttga ttgttgtctg ggttataccg accgcaltct gcatccgaaa 60 ttcattgtcg gcttcactcg tcagctggct aatgaaggtt gcgacatcaa cgccatcatc 120 ttccacacca aaaagaaact ctccgtatgc gcgaacccaa aacagacgtg ggttaaatac 180 atcgttcgtc tgctttctaa aaaggtgaag aacatggcca tgaaagaatt cacactcgac 240 ttcagcaccg caaaaactta cgtagactcc ctgaatgtaa tccgctccgc tatcggcacc 300 ccgttacaaa ctattagctc cggcggtaca tctctcttaa tgatcgattc cggtactggc 360 gacaatttat tcgctgtgga tgtacgtggc attgacccag aagaaggccg tttcaataac 420 ctgcgcttaa ttgttgaacg taataacctg tatgtaactg gcttcgtaaa ccgtaccaac 480 aacgtctttt accgcttcgc tgacttttct cacgtaacct ttcccggaac aactgcagta 540 actctctccg gcgacagttc ctatacgacc ctccaacgtg ttgcaggtat ttctcgcacc 600 ggtatgcaaa tcaatcgtca ctctcttact acatcgtatc tcgatttaat gtcacactcc 660 ggcacctctt taacccagtc cgtcgcacgc gcaatgttac gttttgttac tgtcacagca 720 gaggctcttc gctttcgtca gattcaacgt ggtttccgca caactcttga tgatttatct 780 ggccgctctt atgtaatgac cgcagaagat gtagatctga ccttgaactg gggccgcctg 840 32 201235469 agcagtgtgt tacctgatta tcacggacaa gacagtgcac gtgtaggccg tatctccttt 900 ggttccatta acgccatttt aggttctgtt gcacttattc tgaactaagg atcc 954 <210> 60 <211> 314 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質MIP-3alpha-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM9 <400> 60
Met Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg lie Leu 15 10 15
His Pro Lys Phe lie Val Gly Phe Thr Arg Gin Leu Ala Asn Glu Gly 20 25 30
Cys Asp lie Asn Ala lie lie Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val 35 40 45
Cys Ala Asn Pro Lys Gin Thr Trp Val Lys Tyr lie Val Arg Leu Leu 50 55 60
Ser Lys Lys Val Lys Asn Met Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe 65 70 75 80
Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg Ser Ala 85 90 95 lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu 100 105 110
Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg 115 120 125
Gly Me Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu lie Val 130 135 140
Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn 145 150 155 160
Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr 165 170 175
Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg 180 185 190
Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg His Ser Leu 195 200 205
Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr 210 215 220
Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu 225 230 235 240
Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp 245 250 255
Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu 260 265 270
Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly 275 280 285
Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala 290 295 300 lie Leu Gly Ser Val Ala Leu He Leu Asn 305 310 <210> 61 <211> 951 <212> DNA <213>入工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋白質MDC-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM10 <400> 61 catatgggtc catacggtgc gaatatggag gactccgtgt gctgtcgtga ttatgtccgt 60 tatcgtctgc ctctgcgtgt ggttaaacac ttttactgga cttctgactc ttgcccgcgc 120 ccgggcgttg ttctgctgac cttccgtgac aaagaaattt gcgctgatcc gcgcgttccg 180 tgggtaaaaa tgatcctgaa caagctgagc caggccatga aagaattcac actcgacttc 240 agcaccgcaa aaacttacgt agactccctg aatgtaatcc gctccgctat cggcaccccg 300 33 201235469 ttacaaacta ttagctccgg cggtacatct ctcttaatga tcgattccgg tactggcgac aatttattcg ctgtggatgt acgtggcatt gacccagaag aaggccgttt caataacctg cgcttaattg ttgaacgtaa taacctgtat gtaactggct tcgtaaaccg taccaacaac gtcttttacc gcttcgctga cttttctcac gtaacctttc ccggaacaac tgcagtaact ctctccggcg acagttccta tacgaccctc caacgtgttg caggtatttc tcgcaccggt atgcaaatca atcgtcactc tcttactaca tcgtatctcg atttaatgtc acactccggc acctctttaa cccagtccgt cgcacgcgca atgttacgtt ttgttactgt cacagcagag gctcttcgct ttcgtcagat tcaacgtggt ttccgcacaa ctcttgatga tttatctggc cgctcttatg taatgaccgc agaagatgta gatctgacct tgaactgggg ccgcctgagc agtgtgttac ctgattatca cggacaagac agtgcacgtg taggccgtat ctcctttggt tccattaacg ccattttagg ttctgttgca cttattctga actaaggatc c <210> 62 <211> 313 <2】2> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質MDC-AM-志賀·Α1變體4 <220> <223> LPM10 <400> 62
Met Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp 15 10 15
Tyr Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp 20 25 30
Thr Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg 35 40 45
Asp Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met He 50 55 60
Leu Asn Lys Leu Ser Gin Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser 65 70 75 80
Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg Ser Ala He 85 90 95
Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met 100 105 110 lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly 115 120 125 lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu 130 135 140
Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val 145 150 155 160
Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr 165 170 175
Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val 180 185 190
Ala Gly He Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr 195 200 205
Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin 210 215 · 220
Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala 225 230 235 240
Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp 245 250 255
Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr 260 265 270
Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin 275 280 285
Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie 290 295 300
Leu Gly Ser Val Ala Leu He Leu Asn 305 310 <210> 63 <211> 951 <212> DNA <213>人工序列 融罐慧雲趨4因體子4- 34 201235469 <220> * <223> LPM31 <400> 63 一 catatgtctc tggcggctga taccccgact gcatgttgct tctcttacac gtcccgccag atcccacaga acttcatcgc cgattatttt gaaacctcct ctcaatgcag caaacctggt gtaattttcc tgaccaagcg tagccgtcag gtctgcgctg acccgtccga ggaatgggtt cagaaatacg tgtctgacct ggaactgagc gcggccatga aagaattcac actcgacttc - agcaccgcaa aaacttacgt agactccctg aatgtaatcc gctccgctat cggcaccccg ttacaaacta ttagctccgg cggtacatct ctcttaatga tcgattccgg tactggcgac aatttattcg ctgtggatgt acgtggcatt gacccagaag aaggccgttt caataacctg cgcttaattg ttgaacgtaa taacctgtat gtaactggct tcgtaaaccg taccaacaac gtcttttacc gcttcgctga cttttctcac gtaacctttc ccggaacaac tgcagtaact ctctccggcg acagttccta tacgaccctc caacgtgttg caggtatttc tcgcaccggt atgcaaatca atcgtcactc tcttactaca tcgtatctcg atttaatgtc acactccggc acctctttaa cccagtccgt cgcacgcgca atgttacgtt ttgttactgt cacagcagag gctcEtcgct ttcgtcagat tcaacgtggt ttccgcacaa ctcttgatga tttatctggc cgctcttatg taatgaccgc agaagatgta gatctgacct tgaactgggg ccgcctgagc agtgtgttac ctgattatca cggacaagac agtgcacgtg taggccgtat ctcctttggt tccattaacg ccattttagg ttctgttgca cttattctga actaaggatc c <210> 64 <211> 313 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：趨化因子·毒素融合 蛋白質MIP-la丨pha-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM11 <400> 64
Met Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 15 10 15
Ser Arg Gin lie Pro Gin Asn Phe lie Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30
Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg 35 40 45
Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gin Lys Tyr Val Ser 50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser Ala Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser 65 70 75 80
Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg Ser Ala lie 85 90 95
Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met 100 105 110
He Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly 115 120 125 lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu lie Val Glu 130 135 140
Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val 145 150 155 160
Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr 165 170 175
Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin Arg Val 180 185 190
Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg His Ser Leu Thr 195 200 205
Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gin 210 215 220
Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala 225 230 235 240
Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp 245 250 255
Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr 260 265 270
Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gin 275 280 285
Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie Asn Ala lie 290 295 300
Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 305 310 35 201235469 <210> 65 <21l> 966 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子· 毒素融合蛋白質嗜酸球趨化蛋白-1-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM12 <400> 65 catatgggcc ctgcctccgt tccaaccacc tgctgtttta atctcgccaa tcgtaaaatc 60 ccccttcaac gcttagaatc ttaccgtcgt attacctctg gaaaatgccc tcaaaaagcc 120 gtaatcttia aaaccaaact tgccaaagac atctgtgccg atccaaaaaa aaaatgggtt 180 caagactcaa tgaaatatct cgaccaaaaa tctccaactc ccaaacctgc catgaaagaa 240 ttcacactcg acttcagcac cgcaaaaact tacgtagact ccctgaatgt aatccgctcc 300 gctatcggca ccccgttaca aactattagc tccggcggta catctctctt aatgatcgat 360 tccggtactg gcgacaattt attcgctgtg gatgtacgtg gcattgaccc agaagaaggc 420 cgtttcaata acctgcgctt aattgttgaa cgtaataacc tgtatgtaac tggcttcgta 480 aaccgtacca acaacgtctt ttaccgcttc gctgactttt ctcacgtaac ctttcccgga 540 acaactgcag taactctctc cggcgacagt tcctatacga ccctccaacg tgttgcaggt 600 atttctcgca ccggtatgca aatcaatcgt cactctctta ctacatcgta tctcgattta 660 atgtcacact ccggcacctc tttaacccag tccgtcgcac gcgcaatgtt acgttttgtt 720 actgtcacag cagaggctct tcgctttcgt cagattcaac gtggtttccg cacaactctt 780 gatgatttat ctggccgctc ttatgtaatg accgcagaag atgtagatct gaccttgaac 840 tggigccgcc tgagcagtgt gttacctgat tatcacggac aagacagtgc acgtgtaggc 900 cgtatctcct ttggttccat taacgccatt ttaggttctg ttgcacttat tctgaactaa 960 ggatcc 966 <210> 66 <211> 1005 <212> DNA' <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-瑋素融合蛋白質BCA-1-AM-志賀-A1變體4 <220> <223> LPM13 ctgcgctgcc gctgcgtgca agaatcctct 60 atccagattc tgccgcgtgg taacggctgc 120 aacaaatcta tcgtttgtgt agatccgcag 180 ctgcgcaaac gtagctcttc caccctgcca 240 atgaaagaat tcacactcga cttcagcacc 300 atccgctccg ctatcggcac cccgttacaa 360 atgatcgatt ccggtactgg cgacaattta 420 gaagaaggcc gtttcaataa cctgcgctta 480 ggcttcgtaa accgtaccaa caacgtcttt 540 tttcccggaa caactgcagt aactctctcc 600 gttgcaggta tttctcgcac cggtatgcaa 660 ctcgatttaa tgtcacactc cggcacctct 720 cgttttgtta ctgtcacagc agaggctctt 780 acaactcttg atgatttatc tggccgctct 840 accttgaact ggggccgcct gagcagtgtg 900 cgtgtaggcc gtatctcctt tggttccatt 960 ctgaactaag gatcc 1005 <400> 66 catatggttc gttttcatcc ccgcgtaaag gcggagtgga gtaccggtct gcaaaaactt actat tagct itcgctgtgg attgttgaac taccgcttcg ggcgacagtt atcaatcgtc ttaacccagt cgct t tcgtc tatgtaatga ttacctgatt aacgccat tt tggaagtgta ctcgtcgctt aaatcatcgt ttcagcgtat ttaaacgtaa acgtagactc ccggcggtac atgtacgtgg gtaataacct ctgacttttc cctatacgac actctcttac ccgtcgcacg agattcaacg ccgcagaaga atcacggaca taggttctgt ctataccagc catcgaccgt gtggaaaaag gatggaagtt aattccggcc cctgaatgta atctctctta cattgaccca gtatgtaact tcacgtaacc cctccaacgt tacatcgtat cgcaatgtta tggtttccgc tgtagatctg agacagtgca tgcacttatt <210〉 67 <2ll> 331 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之敘述：趨化因子-毒素融合 蛋白質BCA-1-AM-志賀-A1變體4 <220〉 <223> LPM13 <400> 67
Met Va) Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gin 36 201235469 , 15 10 15
Glu Ser Ser Val Phe lie Pro Arg Arg Phe lie Asp Arg lie Gin lie 20 25 30
Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu lie lie Val Trp Lys 35 40 45
Lys Asn Lys Ser lie Val Cys Val Asp Pro Gin Ala Glu Trp lie Gin 50 55 60
Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val -65 70 75 80
Pro Val Phe Lys Arg Lys He Pro Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp 85 90 95
Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg Ser 100 105 110
Ala lie Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu 115 120 125
Leu Met He Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val 130 135 140
Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu lie 145 150 155 160
Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn 165 170 175
Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly 180 185 190
Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin 195 200 205
Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg His Ser 210 215 220
Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu 225 230 235 240
Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala 245 250 255
Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu 260 265 270
Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp 275 280 285
Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His 290 295 300
Gly Gin Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie Asn 305 310 315 320
Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn 325 330 <210> 68 <211> 228 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> 成熟MCP-1 <400〉 68 caacctgacg caatcaacgc tcctgtcacc tgttgttaca attttaccaa tcgcaaaatt 60 tctgtccaac gtcttgcatc ttatcgccgt attacttcct ctaaatgtcc taaagaagcc 120 gtcattttca aaaccattgt tgcaaaagaa atctgtgccg acccgaaaca aaaatgggta 180 caagactcca tggaccacct cgataaacaa actcaaaccc caaaaaca 228 <210> 69 <211> 76 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> 成熟MCP-1 <400> 69
Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 15 10 15
Asn Arg Lys lie Ser Val Gin Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg lie Thr 20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val lie Phe Lys Thr lie Val Ala 35 40 45
Lys Glu He Cys Ala Asp Pro Lys Gin Lys Trp Val Gin Asp Ser Met 50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gin Thr Gin Thr Pro Lys Thr 65 70 75 37 201235469 <210> 70 <211> 231 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223>具有N·端甲硫胺酸的成熟MCP-1 <400> 70 atgcaacctg atttctgtcc gccgtcattt gtacaagact acgcaatcaa aacgtcttgc tcaaaaccat ccatggacca cgctcctgtc atcttatcgc tgttgcaaaa cctcgataaa acctgttgtt acaattttac caatcgcaaa 60 cgtattactt cctctaaatg tcctaaagaa 120 gaaatctgtg ccgacccgaa acaaaaatgg 180 caaactcaaa ccccaaaaac a 231 <210> 71 <211> 77 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>具有N-端甲硫胺酸的成熟MCP_1 <400> 71
Met Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 15 10 15
Thr Asn Arg Lys lie Ser Val Gin Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg He 20 25 30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val lie Phe Lys Thr lie Val 35 40 45
Ala Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Gin Lys Trp Val Gin Asp Ser 50 55 60
Met Asp His Leu Asp Lys Gin Thr Gin Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 72 <211> 243 <212> DNA <213>智愨人 <220> <223>嗜酸球趨化蛋白構築體 <400> 72 catatgggcc ccgcatccgt tccaactaca cctctccagc gtcttgaatc atacagacgg gtgatattca aaaccaaatt ggcgaaagat caggactcga tgaagtatct ggatcaaaaa ttc <210> 73 <211> 237 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> SDF-lbeta構築體 <400> 73 catatgaagc cggtgtctct gtcctaccgt gcccgggcaa acgttaaaca cctaaagata gtcgcgaggc ttaaaaacaa taaccgccaa caggaatatc tggaaaaagc tctgaataaa <210> 74 <211> 240 <212> DNA <213>智愨人 <220> <223> GRO-alpha構築體 <400> 74 catatggcgt ccgttgctac cgagctgcgt tgttgtttta atctggcgaa ccgcaagatt 60 atcacgtctg gtaaatgccc gcaaaaggcc 120 atctgcgctg accctaagaa aaagtgggta 180 agcccaaccc cgaaaccggc catgaaagaa 240 243 tgcccatgta gatttttcga gagccatgtt 60 ctcaataccc ctaactgtgc gttacagatc 120 gtatgcatcg accccaagtt gaagtggatt 180 cgattcaaaa tggccatgaa agaattc 237 tgtcagtgcc tgcaaactct gcagggtatc 60 38 201235469 cacccgaaaa acatccagag cgtaaacgtg aaatctccag gtccgcactg cgcgcagacc 120 gaagttattg ctaccctgaa aaacggccgt aaagcgtgtc tgaacccggc ctccccgatc 180 gttaagaaaa ttatcgaaaa gatgctgaac tctgacaaaa gcaatgcaat gaaagaattc 240 <210> 75 <211> 228 <212> DNA ' <213>智慧人 <220> <223>卜11卩-10〇13構築體 <400> 75 catatggctc cgatgggttc tgacccgccg actgcttgct gtttttctta taccgcacgf 60 aaactgccgc gtaacttcgt tgttgactac tacgagacct cctctctgtg ctctcagcca 120 gccgtagtct tccagaccaa gcgcagcaaa caggtgtgcg cggatccttc cgaaagctgg 180 gtgcaagaat atgtttacga tctggaactg aacgcgatga aagaattc 228 <210> 76 <211> 252 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> IL-8構築體 <400> 76 catatggcgg tcctgccacg ttccgcgaaa gaactgcgct gccagtgcat taagacctac 60 agcaaaccgt ttcacccgaa attcatcaaa gaactgcgtg ttatcgagtc tggtccgcac 120 tgtgcaaaca ccgaaattat cgttaaactg tctgatggcc gtgaactgtg cctggacccg 180 aaagagaact gggtgcagcg tgtggtagaa aagttcctga aacgcgccga aaattccgct 240 atgaaagaat tc 252 <210> 77 <211> 252 <212> DNA <2】3>智慧人 <220> <223>丨P-10構築體 cgctgtctcg caccgttcgt tgtacttgca tctctatctc taatcagccg 60 gcagcctgga aaaactggaa atcatcccgg cgtcccagtt ctgccctcgt 120 tcgctaccat gaagaagaaa ggtgagaagc gttgcctgaa cccagagtct 180 aaaacctgct gaaagctgta tccaaagaac ggtcgaaacg tagcccggcg 240 tc 252 <400> 77 catatggttc gtcaacccgc gtggaaatta aaagcaat ta atgaaagaat <210> 78 <211> 249 <212> DNA <2〗3>智慧人 <220> <223> MCP-3構築體 <400> 78 catatgcagc ctgtgggtat caatacctct accacttg-tt gctategctt tatcaacaaa 60 aagatcccga agcagcgtct cgaatcgtac cgtcgcacga cttccagcca ttgcccgcgt 120 gaggctgtta ttttcaaaac caaacttgat aaagaaattt gcgcggaccc aacccagaaa 180 tgggtacagg atttcatgaa acacttggac aaaaagactc aaaccccgaa actggccatg 240 aaagaattc 249 <210> 79 <211> 231 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> MIP-3a丨pha構築體 <400> 79 catatggcaa gcaactttga ttgttgtctg ggttataccg accgcattct gcatccgaaa 60 ttcattgtcg gcttcactcg tcagctggct aatgaaggtt gcgacatcaa cgccatcatc 120 ttccacacca aaaagaaact ctccgtatgc gcgaacccaa aacagacgtg ggttaaatac 180 39 ι 201235469 atcgttcgtc tgctttctaa aaaggtgaag aacatggcca tgaaagaatt c 231 <210> 80 <211> 228 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> MDC構築體 <400> 80 catatgggic catacggtgc gaatatggag gactccgtgt gctgtcgtga ttatgtccgt 60 tatcgtctgc ctctgcgtgt ggttaaacac ttttactgga cttctgactc ttgcccgcgc 120 ccgggcgttg ttctgctgac cttccgtgac aaagaaattt gcgctgatcc gcgcgttccg 180 tgggtaaaaa tgatcctgaa caagctgagc caggccatga aagaattc 228 <210> 81 <211> 228 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> MIP.lalpha構築體 <400> 81 catatgtctc tggcggctga taccccgact gcatgttgct tctcttacac gtcccgccag 60 atcccacaga acttcatcgc cgattatttt gaaacctcct ctcaatgcag caaacctggt 120 gtaattttcc tgaccaagcg tagccgtcag gtctgcgctg acccgtccga ggaatgggtt 180 cagaaatacg tgtctgacct ggaactgagc gcggccatga aagaattc 228 <210> 82 <211> 243 <212> DNA <213>智慧人 <220〉 <223>嗜酸球趨化蛋白構築體(Bliie Heron) <400> 82 catatgggcc cccct tcaac gtaatcttta caagactcaa ttc ctgcctccgt tccaaccacc tgctgtttta atctcgccaa tcgtaaaatc 60 gcttagaatc ttaccgtcgt attacctctg gaaaatgccc tcaaaaagcc 120 aaaccaaact tgccaaagac atctgtgccg atccaaaaaa aaaatgggtt 180 tgaaatatct cgaccaaaaa tctccaactc ccaaacctgc catgaaagaa 240 243 <210> 83 <2II> 282 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> BCA-1 構築體 <400> 83 catatggttc tggaagtgta ctataccagc ctgcgctgcc gctgcgtgca agaatcctct 60 guttcatcc ctcgtcgctt catcgaccgt atccagattc tgccgcgtgg taacggctgc 120 ccgcgtaaag aaatcatcgt gtggaaaaag aacaaatcta tcgtttgtgt agatccgcag 180 gcggagtgga ttcagcgtat gatggaagtt ctgcgcaaac gtagctcttc caccctgcca 240 gtaccggtct ttaaacgtaa aattccggcc atgaaagaat tc 282 <210〉 84 <211> 4339 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：pET9C«體(Novagen) <400> 84 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180 gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240 tgcgitgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300 ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360 cacacccgtc ctgtggatat ccggatatag ttcctccttt cagcaaaaaa cccctcaaga 420 40 201235469 cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca gcagccaact 480 cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatccgaccc atttgctgtc caccagtcat 540 gctagccata tgtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag agggaaaccg 600 ttgtggtctc cctatagtga gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatctc gatcctctac 660 gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 720 gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 780 ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 840 gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 900 atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 960 agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 1020 atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 1080 tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg· tatrcggaat ctt'gcaCgcc 1140 ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggegagaa*gcaggccatt 1200 atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 1260 tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 1320 caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1380 gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1440 gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1500 tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc 1560 ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg agccaatcaa ttcttgcgga 1620 gaactgtgaa tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc catcgcgtcc gccatctcca 1680 gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg gccacgggtg cgcatgatcg 1740 tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg 1800 aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag 1860 caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtcag 1920 cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa 1980 cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc 2040 gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat 2100 catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga 2160 acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca 2220 tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg 2280 cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca 2340 gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 2400 cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 2460 cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt 2520 atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatatgcgg 2580 tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 2640 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gageggtatc agctcactca 2700 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 2760 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 2820 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 2880 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 2940 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 3000 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 3060 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 3120 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 3180 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 3240 tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 3300 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 3360 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 3420 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgaacaat 3480 aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga 3540 aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa 3600 atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc 3660 cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga 3720 tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt 3780 tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atCGCCggga aaacagcatt 3840 ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt 3900 cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt 3960 tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga 4020 tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcuttgcc 4080 attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga 4140 cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca 4200 ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct 4260 itttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct 4320 cgatgagttt ttctaagaa 4339 <210> 85 <211> 2686 <212> DNA <213>人土序列 <220> <223>人工序列之敘述：pUC19載體 <400> 85 41 201235469 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttgscgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420 cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 480 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080 ctcagttcgg tgtaggtcgi tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1320 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620 gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2460 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2520 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2580 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2640 atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2686 <210> 86 <211> 3171 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：pUC質體M (減去MCS) <400> 86 gaaagtcctc tccactgact gtagcctcca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 60 actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 120 gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 180 atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 240 gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt 300 ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc 360 tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg 420 gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt 480 gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt 540 ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat 600 ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa 660 tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt 720 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 780 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 840 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 900 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 960 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 1020 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1080 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1140 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1200 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1260 42 201235469 • taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1320 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1380 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1440 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1500 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1560 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1620 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1680 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1740 • taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1800 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 1860 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 1920 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgrcagaccaagt 1980 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2040 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2100 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2160 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2220 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2280 tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2340 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2400 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2460 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2520 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2580 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2640 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2700 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2760 cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 2820 ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 2880 cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 2940 ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 3000 gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 3060 gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 3120 ctatgaccat gattacgcca agctccttcc tcttccagcc cttcctcttt c 3171 <210> 87 <211> 5675 <212> DNA <2Π>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：pETMlc載體(Novagen) <400> 87 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180 gcgggatatc cggatatagt tcctcctttc agcaaaaaac ccctcaagac ccgtttagag 240 gccccaaggg gttatgctag ttattgctca gcggtggcag cagccaactc agcttccttt 300 cgggctttgt tagcagccgg atccgaccca tttgctgtcc accagtcatg ctagccatat 360 gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 420 caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 480 ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 540 gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 600 £tgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 660 ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 720 caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 780 tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 840 agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct- tatcagaccg-t-ttcccgcgt 900 ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 960 ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 1020 gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1080 taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1140 cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1200 cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1260 tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1320 tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1380 gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1440 atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1500 gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1560 ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1620 cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1680 cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1740 cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1800 ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1860 cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1920 acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1980 gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 2040 43 201235469 ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2100 ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2160 tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2220 gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac gtcttgctgg 2280 cgttcgcgac gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct tccggcggca 2340 tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac catcagggac 2400 agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcactgga ccgctgatcg 2460 tcacggcgat ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg attgtaggcg 2520 ccgccctata ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc cgggccacct 2580 cgacctgaat ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa gaattggagc 2640 caatcaattc ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat 2700 cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg ggtcctggcc 2760 acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt gaggacccgg ctaggctggc ggggttgcct 2820 tactggttag cagaatgaat caccgatacg cgagcgaacg tgaagcgact gctgctgcaa 2880 aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat ggtcttcggt itccgtgttt cgtaaagtct 2940 ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat tatgttccgg atctgcatcg caggatgctg 3000 ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt 3060 gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag 3120 taaccgggca tgttcatcal cagtaacccg tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg 3180 tatcattacc cccatgaaca gaaatccccc ttacacggag gcatcagtga ccaaacagga 3240 aaaaaccgcc cttaacatgg cccgctttat cagaagccag acattaacgc ttctggagaa 3300 actcaacgag ctggacgcgg atgaacaggc agacatctgt gaatcgcttc acgaccacgc 3360 tgatgagctt taccgcagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 3420 catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 3480 ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 3540 tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 3600 gtgcaccata tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 3660 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 3720 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 3780 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 3840 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 3900 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 3960 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 4020 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagitcg gtgtaggtcg 4080 ttcgctccaa gctgggctgi gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 4140 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 4200 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 4260 ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 4320 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 4380 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 4440 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 4500 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 4560 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 4620 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4680 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 4740 laccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 4800 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 4860 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4920 ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4980 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 5040 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 5100 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 5160 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 5220 caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 5280 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 5340 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 5400 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 5460 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 5520 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5580 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 5640 ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaa 5675 <210> 88 <211> 4338 <2]2> DNA <2I3>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：pET-9d質體 <400> 88 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180 44 201235469 gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240 tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300 ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360 cacacccgtc ctgtggatat ccggatatag ttcctccttt cagcaaaaaa cccctcaaga 420 cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca gcagccaact 480 cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatccgaccc atttgctgtc caccagtcat 540 gctagccatg gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga gggaaaccgt 600 tgtggtctcc ctatagtgag tcgtattaat ttcgcgggat cgagatctcg atcctctacg 660 ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg 720 ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg 780 gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg 840 caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa 900 tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca 960 gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta 1020 tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct 1080 ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc 1140 tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta 1200 tcgccggcat ggcggccgac gcgctgggct acgtcttgct ggcgttcgcg acgcgaggct 1260 ggatggcctt ccccattatg attcttctcg cttccggcgg catcgggatg cccgcgttgc 1320 aggccatgct gtccaggcag gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa ggatcgctcg 1380 cggctcttac cagcctaact tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg atttatgccg 1440 cctcggcgag cacatggaac gggttggcat ggattgtagg cgccgcccta taccttgtct 1500 gcctccccgc gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg 1560 gcggcacctc gctaacggat tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag 1620 aactgtgaat gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag 1680 cagccgcacg cggcgcatct cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcgt 1740 gctcctgtcg ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga 1800 atcaccgata cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc I860 aacaacatga atggtcttcg gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc 1920 gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac 1980 acctacatct gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg 2040 ccgcatccat accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc 2100 atcagtaacc cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa 2160 cagaaatccc ccttacacgg aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat 2220 ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc 2280 ggatgaacag gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag 2340 ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 2400 ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 2460 gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta 2520 tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatatgcggt 2580 gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 2640 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2700 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2760 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2820 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2880 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2940 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 3000 ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 3060 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 3120 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 3180 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 3240 acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3300 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3360 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3420 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgaacaata 3480 aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa 3540 acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg c.tga.tttata tgggtataaa 3600 tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc 3660 gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat 3720 gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt 3780 atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc 3840 caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc 3900 ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt 3960 cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat 4020 gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca 4080 ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac 4140 gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag 4200 gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt 4260 utcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc 4320 gatgagtttt tctaagaa 4338
<210> 89 <211> 299 <212> PRT <2i3> 跑官草(Saponaria officinalis) 45 201235469 <220〉 <223>核糖體失活蛋白質皂草毒蛋白·6前驅物 <400> 89
Met Lys lie Tyr Val Val Ala Thr lie Ala Trp lie Leu Leu Gin Phe 15 10 15
Ser Ala Trp Thr Thr Thr Asp Ala Val Thr Ser lie Thr Leu Asp Leu 20 25 30
Val Asn Pro Thr Ala Gly Gin Tyr Ser Ser Phe Val Asp Lys lie Arg 35 40 45
Asn Asn Val Lys Asp Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Gly Thr Asp lie Ala 50 55 60
Val lie Gly Pro Pro Ser Lys Glu Lys Phe Leu Arg lie Asn Phe Gin 65 70 75 80
Ser Ser Arg Gly Thr Val Ser Leu Gly Leu Lys Arg Asp Asn Leu Tyr 85 90 95
Val Val Ala Tyr Leu Ala Met Asp Asn Thr Asn Val Asn Arg Ala Tyr 100 105 110
Tyr Phe Arg Ser Glu lie Thr Ser Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro 115 120 125
Glu Ala Thr Thr Ala Asn Gin Lys Ala Leu Glu Tyr Thr Glu Asp Tyr 130 135 140
Gin Ser lie Glu Lys Asn Ala Gin lie Thr Gin Gly Asp Gin Ser Arg 145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Leu Gly lie Asp Leu Leu Ser Thr Ser Met Glu Ala 165 170 175
Val Asn Lys Lys Ala Arg Val Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu 180 185 190 lie Ala lie Gin Met Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr lie Gin 195 200 205
Asn Leu Val lie Lys Asn Phe Pro Asn Lys Phe Asn Ser Glu Asn Lys 210 215 220
Val ile Gin Phe Glu Vai Asn Trp Lys Lys lie Ser Thr Ala lie Tyr 225 230 235 240
Gly Asp Ala Lys Asn Gly Val Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe 245 . 250 255
Gly Lys Val Arg Gin Val Lys Asp Leu Gin Met Gly Leu Leu Met Tyr 260 265 270
Leu Gly Lys Pro Lys Ser Ser Asn Glu Ala Asn Ser Thr Val Arg His 275 280 285
Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Thr Leu Leu Ile Thr 290 295 <210> 90 <211> 280 <212> PRT <2Π>大麥 <220> <223>核糖體失活蛋白質I (Barley) <400> 90
Ala Ala Lys Met Ala Lys Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala Thr 15 10 15
Phe Asn Val Gin Ala Ser Ser Ala Asp Tyr Ala Thr Phe Ile Ala Gly 20 25 30
Ile Arg Asn Lys Leu Arg Asn Pro Ala His Phe Ser His Asn Arg Pro 35 40 45
Val Leu Pro Pro Val Glu Pro Asn Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe His 50 55 60
Val Val Leu Lys Ala Ser Pro Thr Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Ile 65 70 75 80
Arg Ala Asp Asn Ile Tyr Leu Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly Thr 85 90 95
Trp Trp Glu Leu Thr Pro Gly Leu Ile Pro Gly Ala Thr Tyr Val Gly 100 105 110
Phe Gly Gly Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu Thr 115 120 125
Asn Val Ala Leu Gly Arg Gin Gin Leu Ala Asp Ala Val Thr Ala Leu 130 135 140
His Gly Arg Thr Lys Ala Asp Lys Pro Ser Gly Pro Lys Gin Gin Gin 145 150 155 160
Ala Arg Glu Ala Val Thr Thr Leu Leu Leu Met Val Asn Glu Ala Thr 165 170 175
Arg Phe Gin Thr Val Ser Giy Phe Val Ala Gly Leu Leu His Pro Lys 46 201235469 180 185 190
Ala Val Glu Lys Lys Ser Gly Lys lie Gly Asn Glu Met Lys Ala Gin 195 200 205
Val Asn Gly Trp Gin Asp Leu Ser Ala Ala Leu Leu Lys Thr Asp Val 210 215 220
Lys Pro Pro Pro Gly Lys Ser Pro Ala Lys Phe Ala Pro lie Glu Lys 225 230 235 240
Met Gly Val Arg Thr Ala Val Gin Ala Ala Asn Thr Leu Gly lie Leu 245 250 255
Leu Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Leu Thr Val Ala Lys Ala Leu Glu 260 265 270
Leu Phe His Ala Ser Gly Gly Lys 275 280 <210> 91 <211> 280 <212> PRT <213>大麥 <220> <223>核糖體失活蛋白質II (Barley) <400> 91
Ala Ala Lys Met Ala Ly's Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala Thr 15 10 15
Phe Asn Val Gin Ala Ser Ser Ala Asp Tyr Ala Thr Phe lie Ala Gly 20 25 30 lie Arg Asn Lys Leu Arg Asn Pro Ala His Phe Ser His Asn Glu Pro 35 40 45
Val Leu Pro Pro Val Glu Pro Asn Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe His 50 55 60
Val Val Leu Lys Ala Ser Pro Thr Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala lie 65 70 75 80
Arg Ala Asp Asn lie Tyr Leu Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly Thr 85 90 95
Trp Trp Glu Leu Thr Pro Gly Leu lie Pro Gly Ala Thr Tyr Val Gly 100 105 110
Phe Gly Gly Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu Thr 115 120 125
Asn Val Ala Leu Gly Arg Gin Gin Leu Glu Asp Ala Val Thr Ala Leu 130 135 140
His Gly Arg Thr Lys Ala Asp Lys Ala Ser Gly Pro Lys Gin Gin Gin 145 150 155 160
Ala Arg Glu Ala Val Thr Thr Leu Leu Leu Met Val Asn Glu Ala Thr 165 170 175
Arg Phe Gin Thr Val Ser Gly Phe Val Ala Gly Leu Leu His Pro Lys 180 185 190
Ala Val Glu Lys Lys Ser Gly Lys lie Gly Asn Glu Met Lys Ala Gin 195 200 205
Val Asn Gly Trp Gin Asp Leu Ser Ala Ala Leu Leu Lys Thr Asp Val 210 215 220
Lys Pro Pro Pro Gly Lys Ser Pro Ala Lys Phe Thr Pro lie Glu Lys 225 230 235 240
Met Gly Val Arg Thr Ala Glu Gin Ala Ala Ala Thr Leu Gly lie Leu 245 250 255
Leu Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Leu Thr Val Ala Lys Ala Leu Glu 260 265 270
Leu Phe His Ala Ser Gly Gly Lys 275 280
<210> 92 <211> 316 <212> PRT <213> Gelonium multiflorum <220> <223>核糖體失活蛋白質截短型細胞毒素(Gelonin)前驅物 <400> 92
Met Lys Gly Asn Met Lys Val Tyr Trp lie Lys lie Ala Val Ala Thr 15 10 15
Trp Phe Cys Cys Thr Thr lie Val Leu Gly Ser Thr Ala Arg lie Phe 20 25 30
Ser Leu Pro Thr Asn Asp Glu Glu Glu Thr Ser Lys Thr Leu Gly Leu 47 201235469 35 40 45
Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr lie Thr Tyr Val 50 55 60
Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly Asn Ser 65 70 75 80
His Gly He Pro Leu Leu Arg Lys Lys Cys Asp Asp Pro Gly Lys Cys 85 90 95
Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gin Leu Ala Glu lie 100 105 110
Ala lie Asp Val Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gin Val Arg Asn 115 120 125
Arg Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Gly Leu 130 135 140
Phe Lys Asn Thr lie Lys Thr Arg Leu His Phe Gly Gly Ser Tyr Pro 145 150 155 160
Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu Gly lie 165 170 175
Glu Pro Leu Arg lie Gly He Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala lie Asp 180 185 190
Asn Tyr Lys Pro Thr Glu lie Ala Ser Ser Leu Leu Val Val lie Gin 195 200 205
Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Thr Phe lie Glu Asn Gin lie Arg 210 215 220
Asn Asn Phe Gin Gin Arg lie Arg Pro Ala Asn Asn Thr lie Ser Leu 225 230 235 240
Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu Ser Phe Gin lie Arg Thr Ser Gly Ala 245 250 255
Asn Gly Met Phe Ser Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Lys 260 265 270
Lys Tyr Tyr Val Thr Ala Val Asp Gin Val Lys Pro Lys lie Ala Leu 275 280 285
Leu Lys Phe Val Asp Lys Asp Pro Lys Thr Ser Leu Ala Ala Glu Leu 290 295 300 lie lie Gin Asn Tyr Glu Ser Leu Val Gly Phe Asp 305 310 315 <210> 93 <211> 576 <212> PRT <213>蔑麻 <220> <223>蓖麻毒素前驅物 <400> 93
Met Lys Pro Gly Gly Asn Thr lie Val lie Trp Met Tyr Ala Val Ala 15 10 15
Thr Trp Leu Cys Phe Gly Ser Thr Ser Gly Trp Ser Phe Thr Leu Glu 20 25 30
Asp Asn Asn lie Phe Pro Lys Gin Tyr Pro lie lie Asn Phe Thr Thr 35 40 45
Ala Gly Ala Thr Val Gin Ser Tyr Thr Asn Phe lie Arg Ala Val Arg 50 55 60
Gly Arg Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu lie Pro Val Leu 65 70 75 80
Pro Asn Arg Val Gly Leu Pro lie Asn Gin Arg Phe lie Leu Val Glu 85 90 95
Leu Ser Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr 100 105 110
Asn Ala Tyr Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe 115 120 125
His Pro Asp Asn Gin Glu Asp Ala Glu Ala lie Thr His Leu Phe Thr 130 135 140
Asp Val Gin Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg 145 150 155 160
Leu Glu Gin Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn lie Glu Leu Gly Asn 165 170 175
Gly Pro Leu Glu Glu Ala lie Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly 180 185 190
Gly Thr Gin Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe lie lie Cys He Gin 195 200 205
Met lie Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gin Tyr lie Glu Gly Glu Met Arg 210 215 220
Thr Arg lie Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val lie 225 230 235 240 48 201235469
Thr Leu Glu Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala lie Gin Glu Ser 245 250 255
Asn Gin Gly Ala Phe Ala Ser Pro lie Gin Leu Gin Arg Arg Asn Gly 260 265 270
Ser Lys Phe Ser Val Tyr Asp Val Ser lie Leu lie Pro lie lie Ala 275 280 285
Leu Met Val Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gin Phe Ser Leu 290 295 300
Leu lie Arg Pro Val Val Pro Asn Phe Asn Ala Asp Val Cys Met Asp 305 310 315 320
Pro Glu Pro lie Val Arg lie Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp 325 330 335
Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn Ala lie Gin Leu Trp Pro 340 345 350
Cys Lys Ser Asn Tbr Asp Ala Asn Gin Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp 355 360 365
Asn Thr lie Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser 370 375 380
Pro Gly Val Tyr Val Met lie Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp 385 390 395 400
Ala Thr Arg Trp Gin lie Trp Asp Asn Gly Thr lie lie Asn Pro Arg 405 410 415
Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr Thr Leu 420 425 430
Thr Val Gin Thr Asn lie Tyr Ala Val Ser Gin Gly Trp Leu Pro Thr 435 440 445
Asn Asn Thr Gin Pro Phe Val Thr Thr lie Val Gly Leu Tyr Gly Leu 450 455 460
Cys Leu Gin Ala Asn Ser Gly Gin Val Trp lie Glu Asp Cys Ser Ser 465 470 475 480
Glu Lys Ala Glu Gin Gin Trp Ala Leu Tyr Ala Asp Gly Ser lie Arg 485 490 495
Pro Gin Gin Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr Ser Asp Ser Asn lie Arg 500 505 510
Glu Thr Val Val Lys lie Leu Ser Cys Gly Pro Ala Ser Ser Gly Gin 515 520 525
Arg Trp Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr lie Leu Asn Leu Tyr Ser Gly 530 535 540
Leu Val Leu Asp Val Arg Ala Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gin lie lie 545 550 555 560
Leu Tyr Pro Leu His Gly Asp Pro Asn Gin lie Trp Leu Pro Leu Phe 565 570 575
<210> 94 <211> 286 <212> PRT <213> 苦瓜(Momordica charantia) <220> <223>核糖體失活蛋白質地膚子皂苷I前驅物 <400> 94
Met Ser Arg Phe Ser Val Leu Ser Phe Leu lie Leu Ala lie Phe Leu 15 10 15
Gly Gly Ser lie Val Lys Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala 20 25 30
Asp Pro Arg Ser Tyr Gly Met Phe lie Lys Asp Leu Arg Asn Ala Leu 35 40 45
Pro Phe Arg Glu Lys Val Tyr Asn lie Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val 50 55 60
Ser Gly Ala Gly Arg Tyr Leu Leu Met His Leu Phe Asn Tyr Asp Gly 65 70 75 80
Lys Thr lie Thr Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr lie Met Gly 85 90 95
Tyr Leu Ala Asp Thr Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Pro Ala Ala Glu 100 105 110
Leu Ala Ser Gin Tyr Val Phe Arg Asp Ala Arg Arg Lys lie Thr Leu 115 120 125
Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gin lie Ala Ala Gly Lys Pro 130 135 140
Arg Glu Lys lie Pro lie Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala lie Ser H5 150 155 160
Thr Leu Leu His Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val 165 170 175
Leu lie Gin Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr lie Glu Gin 49 201235469 180 185 190
Gin He Gin Glu Arg Ala Tyr Arg Asp Glu Val Pro Ser Leu Ala Thr 195 200 205 lie Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Gly Leu Ser Lys Gin lie Gin Leu 210 215 220
Ala Gin Gly Asn Asn Gly lie Phe Arg Thr Pro lie Val Leu Val Asp 225 230 235 240
Asn Lys Gly Asn Arg Val Gin lie Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val 245 250 255
Thr Ser Asn lie Gin Leu Leu Leu Asn Thr Arg Asn lie Ala Glu Gly 260 265 270
Asp Asn Gly Asp Val Ser Thr Thr His Gly Phe Ser Ser Tyr 275 280 285
<210> 95 <211> 286 <212> PRT <213〉香苦瓜(Momordica balsamina) <220> <223>核糖體失活蛋白質地0子皂苷II 前驅物 <400〉 95
Met Val Lys Cys Leu Leu Leu Ser Phe Leu lie lie Ala He Phe lie 15 10 15
Gly Val Pro Thr Ala Lys Gly Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala 20 25 30
Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys Phe lie Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu 35 40 45
Pro Phe Ser His Lys Val Tyr Asp lie Pro Leu Leu Tyr Ser Thr lie 50 55 60
Ser Asp Ser Arg Arg Phe lie Leu Leu Asp Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr 65 70 75 80
Glu Thr lie Ser Val Ala lie Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala 85 90 95
Tyr Arg Thr Arg Asp Val Ser Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu 100 105 110
Ala Tyr Asn lie Leu Phe Lys Gly Thr Arg Lys lie Thr Leu Pro Tyr 115 120 125
Thr Gly Asn Tyr Glu Asn Leu Gin Thr Ala Ala His Lys lie Arg Glu 130 135 140
Asn lie Asp Leu Gly Leu Pro Ala Leu Ser Ser Ala lie Thr Thr Leu 145 150 155 160
Phe Tyr Tyr Asn Ala Gin Ser Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu lie 165 170 175
Gin Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr lie Glu Arg His Val 180 185 190
Ala Lys Tyr Val Ala Thr Asn Phe Lys Pro Asn Leu Ala lie lie Ser 195 200 205
Leu Glu Asn Gin Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gin lie Phe Leu Ala Gin 210 215 220
Asn Gin Gly Gly Lys Phe Arg Asn Pro Val Asp Leu lie Lys Pro Thr 225 230 235 240
Gly Glu Arg Phe Gin Val Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys Gly 245 250 255
Asn lie Lys Leu Leu Leu Asn Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn 260 265 270
Phe lie Thr Thr Met Thr Leu Leu Gly Glu Ser Val Val Asn 275 280 285
<210> 96 <211> 290 <212> PRT <213> 歐洲甜瓜(Bryonia dioica) <220> <223>核糖體失活蛋白質拜歐丁I前驅物 <400> 96
Met lie Lys Leu Leu Val Leu Trp Leu Leu Ile Leu Thr Ile Phe Leu 15 10 15
Lys Ser Pro Thr Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala 20 25 30 50 201235469 .Thr Thr Thr Ser Tyr Gly Val Phe lie Lys Asn Leu Arg Glu Ala Leu 35 40 45
Pro Tyr Glu Arg Lys Val Tyr Asn lie Pro Leu Leu Arg Ser Ser lie 50 55 60 - Ser Gly Ser Gly Arg Tyr Thr Leu Leu His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Glu Thr lie Ser Val Ala Vai Asp Val Thr Asn Val Tyr lie Met Gly 85 90 95 -Tyr Leu Ala Gly Asp Val Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr 100 105 110
Glu A!a Ala Lys Phe Val Phe Lys Asp Ala Lys Lys Lys Val Thr Leu 115 120 125
Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gin Thr Ala Ala Gly Lys lie 130 135 140
Arg Glu Asn lie Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala lie Thr 145 150 155 160
Thr Leu Tyr Tyr Tyr Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ala Leu Leu Val 165 170 175
Leu lie Gin Ser Thr Ala Glu Ser Ala Arg Tyr Lys Phe lie Glu Gin 180 185 190
Gin lie Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Thr 195 200 205 lie Ser Leu Glu Asn Asn Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gin lie Gin lie 210 215 220
Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gin Phe Glu Ser Pro Val Val Leu lie Asp 225 230 235 240
Gly Asn Asn Gin Arg Val Ser lie Thr Asn Ala Ser Ala Arg Val Val 245 250 255
Thr Ser Asn lie Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn lie Ala Ala lie 260 265 270
Gly Glu Asp lie Ser Met Thr Leu lie Gly Phe Glu His Gly Leu Tyr 275 280 285
Gly lie 290 <210> 97 <211> 282 <212> PRT <213>歐洲甜瓜 <220> <223>核糖體失活蛋白質拜歐丁II前驅物 <400> 97
Met Arg Ser lie Gly Phe Tyr Ser Val Leu Ala Leu Tyr Val Gly Ala 15 10 15
His Val Thr Glu Asp Val Asp lie Asn Phe Ser Leu lie Gly Ala Thr 20 25 30
Gly Ala Thr Tyr Lys Thr Phe lie Arg Asn Leu Arg Thr Lys Leu Thr 35 40 45
Val Gly Thr Pro Arg Val Tyr Asp lie Pro Val Leu Arg Asn Ala Ala 50 55 60
Ala Gly Leu Ala Arg Phe Gin Leu Val Thr Leu Thr Asn Tyr Asn Gly 65 70 75 80
Glu Ser Val Thr Val Ala Leu Asp Val Val Asn Val Tyr Val Val Ala 85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Asn Thr Ala Tyr Phe Leu Ala Asp Ala Ser Thr Glu 100 105 110
Ala Asn Asn Val Leu Phe Ala Gly lie Asn His Val Arg Leu Pro Tyr 115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asp Gly Leu Glu Thr Ala Ala Gly Arg lie Ser Arg 130 135 140
Glu Asn lie Glu Leu Gly Phe Ser Glu lie Ser Ser Ala lie Gly Asn 145 150 155 160
Met Phe Arg His Asn Pro Gly Thr Ser Val Pro Arg Ala Phe lie Val 165 170 175 lie lie Gin Thr Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr lie Glu Gin 180 185 190
Arg Val Ser Glu Asn Val Gly Thr Lys Phe Lys Pro Asp Pro Ala Phe 195 200 205
Leu Ser Leu Gin Asn Ala Trp Gly Ser Leu Ser Glu Gin lie Gin lie 210 215 220
Ala Gin Thr Arg Gly Gly Glu Phe Ala Arg Pro Val Glu Leu Arg Thr 225 230 235 240
Val Ser Asn Thr Pro Thr Phe Val Thr Asn Val Asn Ser Pro Val Val 51 201235469 245 250 255
Lys Gly lie Ala Leu Leu Leu Tyr Phe Arg Val Asn Val Gly Thr Asp 260 265 270
Asn Val Phe Ala Met Ser Leu Ser Thr Tyr 275 280
<210> 98 <211> 261 <212> PRT <213> 美洲商陸(Phytolacca americana) <220> <223>核糖體失活蛋白質PAP-S <400> 98 lie Asn Thr lie Thr Phe Asp Ala Gly Asn Ala Thr lie Asn Lys Tyr 15 10 15
Ala Thr Phe Met Glu Ser Leu Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro Ser Leu 20 25 30
Lys Cys Tyr Giy lie Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Ser Thr lie Lys 35 40 45
Tyr Leu Leu Val Lys Leu Gin Gly Ala Ser Leu Lys Thr lie Thr Leu 50 55 60
Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp Pro Tyr 65 70 75 80
Asp Asn Lys Cys Arg Tyr His lie Phe Asn Asp lie Lys Gly Thr Glu 85 90 95
Tyr Ser Asp Val Glu Asn Thr Leu Cys Pro Ser Ser Asn Pro Arg Val 100 105 110
Ala Lys Pro lie Asn Tyr Asn Gly Leu Tyr Pro Thr Leu Glu Lys Lys 115 120 125
Ala Gly Val Thr Ser Arg Asn Glu Val Gin Leu Gly lie Gin lie Leu 130 135 140
Ser Ser Asp lie Gly Lys lie Ser Gly Gin Gly Ser Phe Thr Glu Lys 145 150 155 160
He Glu Ala Lys Phe Leu Leu Val Ala lie Gin Met Val Ser Glu Ala 165 170 175
Ala Arg Phe Lys Tyr lie Glu Asn Gin Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg 180 185 190
Asp Phe Ser Pro Asn Asp Lys Val Leu Asp Leu Glu Glu Asn Trp Gly 195 200 205
Lys lie Ser Thr Ala lie His Asn Ser Lys Asn Gly Ala Leu Pro Lys 210 215 220
Pro Leu Glu Leu Lys Asn Ala Asp Gly Thr Lys Trp lie Val Leu Arg 225 230 235 240
Val Asp Glu lie Lys Pro Asp Val Gly Leu Leu Asn Tyr Val Asn Gly 245 250 255
Thr Cys Gin Ala Thr 260
<210> 99 <211> 277 <212> PRT <213> 絲瓜(Luffa cylindrica) <220> <223>核糖體失活蛋白質絲瓜籽蛋白-alpha 前驅物 <400> 99
Met Lys Arg Phe Thr Val Leu lie Leu Ala lie Phe Val Ala Ala Ser 15 10 15
Thr Val Glu Ala Asp Val Arg Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr 20 25 30
Ser Tyr Ser Lys Phe lie Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn 35 40 45
Gly Thr Val Tyr Asn lie Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala 50 55 60
Ser Arg Tyr Thr Leu Met Thr Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala lie 65 70 75 80
Thr Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr lie Met Gly Tyr Leu Val 85 90 95
Asn Ser Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser 100 105 110 52 201235469
Gin Tyr Val Phe Lys Gly Ser Thr lie Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly ' 115 120 125
Asn Tyr Glu Lys Leu Gin Thr Ala Ala Gly Lys lie Arg Glu Lys lie 130 135 140
Pro Leu Gly Phe Pro Ala Leu Asp Ser Ala lie Thr Thr Leu Phe His 145 150 155 160
Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Phe Leu Val lie lie Gin Thr 165 170 175 -Thr Ala Glu Ala Ser Arg Phe Lys Tyr lie Glu Gly Gin lie lie Glu 180 185 190
Arg He Ser Lys Asn Gin Val Pro Ser Leu Ala Thr lie Ser Leu Glu 195 200 205
Asn Giu Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gin lie Gin Leu Ala Gin Thr Asn 210 215 220
Asn Gly Thr Phe Lys Thr Pro Val Val lie Thr Asp Asp Lys Gly Gin 225 230 235 240
Arg Val Glu He Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn lie 245 250 255
Gin Leu Leu Leu Asn Tyr Lys Gin Asn Val Ala Ala Phe Asp Glu Asp 260 265 270
Val Ser Ala Lys His 275
<210> 100 <211> 289 <212> PRT <213〉栝樓(Trichosanthes kirilowii) <220> <223>核糖體失活蛋白質alpha-天花粉蛋白（trichosanthin) 前驅物 <400> 100
Met lie Arg Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu lie Leu Thr Leu Phe Leu 15 10 15
Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala 20 25 30
Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe lie Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu 35 40 45
Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp lie Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu 50 55 60
Pro Gly Ser Gin Arg Tyr Ala Leu lie His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Glu Thr lie Ser Val Ala lie Asp Val Thr Asn Val Tyr lie Met Gly 85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr 100 105 110
Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu 115 120 125
Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gin Thr Ala Ala Gly Lys lie 130 135 140
Arg Glu Asn lie Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala lie Thr 145 150 155 160
Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val 165 170 175
Leu Me Gin Ser Thr Ser Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe lie Glu Gin 180 185 190
Gin Me Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala lie 195 200 205
He Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gin lie Gin He 21〇 215 220
Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gin Phe Glu Ser Pro Val Val Leu lie Asn 225 230 235 240
Ala Gin Asn Gin Arg Val Thr lie Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val 245 250 255
Thr Ser Asn lie Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met 260 265 270
Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gin Ser Phe Gly Cys Gly Ser Tyr Ala 275 280 285 lie <210> 101 <211> 177 53 201235469 <212> PRT <213>棒狀麴菌 <220> <223>核糖核酸酶克雷芬前驅物 <400> 101
Met Val Ala lie Lys Asn Leu Val 1 5
Ala Leu Ala Met Pro Ser Pro Leu 20
Cys Met Asn Glu Gin Lys Asn Pro 35 40
Arg Leu Leu Tyr Asn Gin Asn Asn 50 55
Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly 65 70
Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Gly Lys 85
Lys Trp Gly Asn Ser Asp Cys Asp 100
Gly Asp Gly Lys Asn Asp His Tyr 115 120
Asp Gly His Gin Tyr Asn Phe Asp 130 135
Gly Pro Ala Arg Val lie Tyr Thr 145 150 lie Val Ala His Thr Arg Glu Asn 165 His
Leu Val Ala Leu Thr Ala Val Thr 10 15
Glu Glu Arg Ala Ala Thr Trp Thr 25 30
Lys Thr Asn Lys Tyr Glu Asn Lys 45
Ala Glu Ser Asn Ala His His Ala 60
Ser Ser Tyr Pro His Trp Phe Thr 75 80 lie Leu Lys Gly Arg Thr Pro lie 90 95
Arg Pro Pro Lys His Ser Lys Asn 105 110
Leu Leu Glu Phe Pro Thr Phe Pro 125
Ser Lys Lys Pro Lys Glu Asp Pro 140
Tyr Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly 155 160
Gin Gly Asp Leu Lys Leu Cys Ser 170 175 <210> 102 <2U> 528 <212> PRT _ <213> 相思豆(Abrus precatorius) <220> <223>相思豆毒素-a <400> 102 G!n Asp Arg Pro lie Lys Phe Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gin Ser 15 10 15
Tyr Lys Gin Phe lie Glu Ala Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu 20 25 30 lie His Asp lie Pro Val Leu Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gin Glu Arg 35 40 45
Asn Arg Tyr lie Thr Val Glu Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser lie 50 55 60
Glu Val Gly lie Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala 65 70 75 80
Gly Thr Gin Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp 85 90 95
Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gin His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr 100 105 110
Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala His Gin Ser Arg Gin Gin lie Pro 115 120 125
Leu Gly Leu Gin Ala Leu Thr His Gly lie Ser Phe Phe Arg Ser Gly 130 135 140
Gly Asn Asp Asn Glu Glu Lys Ala Arg Thr Leu lie Val lie lie Gin 145 150 155 160
Mel Val Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr lie Ser Asn Arg Val Arg 165 170 175
Val Ser lie Gin Thr Giy Thr Ala Phe Gin Pro Asp Ala Ala Met lie 180 185 190
Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Asn Leu Ser Arg Gly Va) Gin Glu Ser 195 200 205
Val Gin Asp Thr Phe Pro Asn Gin Val Thr Leu Thr Asn lie Arg Asn 210 215 220
Glu Pro Val lie Val Asp Ser Leu Ser His Pro Thr Vai Ala Val Leu 225 230 235 240
Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn Pro Pro Asn Ala Asn Gin Ser Pro 245 250 255
Leu Leu lie Arg Ser lie Val Glu Lys Ser Lys lie Cys Ser Ser Arg 260 265 270 54 201235469
Tyr Glu Pro Thr Val Arg lie Gly Gly Arg Asp Gly Met Cys Val Asp 275 280 285
Va! Tyr Asp Asn Gly Tyr His Asn Gly Asn Arg lie lie Met Trp Lys 290 295 300
Cys Lys Asp Arg Leu Glu Glu Asn Gin Leu Trp Thr Leu Lys Ser Asp 305 310 315 320
Lys Thr lie Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ala 325 330 335
Pro Gly Ser Tyr Val Met lie Tyr Asp Cys Thr Ser Ala Val Ala Glu 340 345 350
Ala Thr Tyr Trp Glu lie Trp Asp Asn Gly Thr lie lie Asn Pro Lys 355 360 365
Ser Ala Leu Val Leu Ser Ala Glu Ser Ser Ser Met Gly Gly Thr Leu 370 375 380
Thr Val Gin Thr Asn Glu Tyr Leu Met Arg Gin Gly Trp Arg Thr Gly 385 390 395 400
Asn Asn Thr Ser Pro Phe Val Thr Ser lie Ser Gly Tyr Ser Asp Leu 405 410 415
Cys Met Gin Ala Gin Gly Ser Asn Val Trp Met Ala Asp Cys Asp Ser 420 425 430
Asn Lys Lys Glu Gin Gin Trp Ala Leu Tyr Thr Asp Gly Ser lie Arg 435 440 445
Ser Val Gin Asn Thr Asn Asn Cys Leu Thr Ser Lys Asp His Lys Gin 450 455 460
Gly Ser Thr lie Leu Leu Met Gly Cys Ser Asn Gly Trp Ala Ser Gin 465 470 475 480
Arg Trp Val Phe Lys Asn Asp Gly Ser lie Tyr Ser Leu Tyr Asp Asp 485 490 495
Met Val Met Asp Val Lys Gly Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gin lie lie 500 505 510
Leu Trp Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Asn Gin lie Trp Leu Thr Leu Phe 515 520 525 <210> 103 <211> 300 <212> PRT <213>玉蜀黍 <220> <223>核糖體失活蛋白質3 (玉蜀黍)前驅物 <400> 103
Met Ala Glu lie Thr Leu Glu Pro Ser Asp Leu Met Ala Gin Thr Asn 15 10 15
Lys Arg lie Val Pro Lys Phe Thr Glu lie Phe Pro Val Glu Asp Ala 20 25 30
Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe lie Ala Ser Val Arg Lys Asp Val lie 35 40 45
Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly lie Phe Gin Pro Val Leu Pro Pro 50 55 60
Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Leu Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg 65 70 75 80
Thr Ser Ser lie Thr Leu Ala lie Arg Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val 85 90 95
Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly 100 105 110
Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly 115 120 125
Arg Tyr Gin Asp Leu lie Gly Asn Lys Gly Leu Glu Thr Val Thr Met 130 135 140
Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys 145 150 155 160
Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Glu Glu Val Gin Met Gin Met Gin Met 165 170 175
Pro Glu Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Gin Ala 180 185 190
Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu Gly 195 200 205
Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser 210 215 220
Gin His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gin Gly Lys Gin Val Gin Lys 225 230 235 240
Trp Asp Arg lie Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr 245 250 255
Ala Val lie Pro Asp Met Gin Lys Leu Gly lie Lys Asp Lys Asn Glu 55 201235469 260 265 270
Ala Ala Arg lie Val Ala Leu Val Lys Asn Gin Thr Thr Ala Cys Ala 275 280 285
Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp Asp Asp Glu Ala 290 295 300 <210> 104 <211> 304 <212> PRT <213>玉蜀黍 <220> <223>核糖體失活蛋白質9 (玉蜀黍)前驅物 <400> 104
Met Ala G!u Thr Asn Pro Glu Leu Ser Asp Leu Met Ala Gin Thr Asn 15 10 15
Lys Lys lie Val Pro Lys Phe Thr Glu lie Phe Pro Val Glu Asp Val 20 25 30
Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe lie Ala Ser Val Arg Lys Asp Val lie 35 40 45
Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly lie Phe Gin Pro Val. Leu Pro Pro 50 55 60
Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Phe Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg 65 70 75 80
Thr Ser Ser lie Thr Leu Ala lie Arg Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val 85 90 95
Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp Trp Glu Phe Gly Lys Ala Gly 100 105 110
Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly 115 120 125
Arg Tyr Gin Asp Leu lie Gly Asn Lys Gly Leu Glu Thr Val Thr Met 130 135 140
Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys 145 150 155 160
Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Glu Glu Val Gin Met Gin Met Gin Met 165 170 175
Pro Glu Ala Ala Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Gin 180 185 190
Ala Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu 195 200 205
Gly Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn 210 215 220
Ser Gin His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gin Gly Lys Gin Val Gin 225 230 235 240
Lys Trp Asp Arg lie Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro 245 250 255
Thr Ala Val lie Pro Asp Met Gin Lys Leu Gly lie Lys Asp Lys Asn 260 265 270
Glu Ala Ala Arg lie Val Ala Leu Val Lys Asn Gin Thr Thr Ala Ala 275 280 285
Ala Ala Ala A!a Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp Asp Asp Glu Ala 290 295 300 <210> 105 <211> 301 <212> PRT <213>玉蜀黍 <220> <223>核糖體失活蛋白質X (玉蜀黍)前驅物 <400> 105
Met Ala Glu lie Thr Leu Glu Pro Ser Asp Leu Met Ala Gin Thr Asn 15 10 15
Lys Arg ile Val Pro Lys Phe Thr Glu He Phe Pro Val Glu Asp Aia 20 25 30
Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala Ser Val Arg Lys Asp Val lie 35 40 45
Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly Ile Phe Gin Pro Val Leu Pro Pro 50 55 60
Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Phe Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg 65 70 75 80
Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val 56 201235469 85 90 95
Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly 100 105 110
Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly 115 120 125
Arg Tyr Gin Asp Leu lie Gly Asn Lys Gly Leu Glu Thr Val Thr Met 130 135 140
Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys 145 150 155 160
Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Glu Glu Val Lys Met Gin Met Gin Met 165 170 175
Pro Glu Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Gin Ala 180 185 190
Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu Gly 195 200 205
Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser 210 215 220
Gin His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gin Gly Lys Gin Val Gin Lys 225 230 235 240
Trp Asp Arg lie Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr 245 250 255
Ala Val lie Pro Asp Met Gin Lys Leu Gly lie Lys Asp Lys Asn Glu 260 265 270
Ala Ala Arg He Val Ala Leu Val Lys Asn Gin Thr Thr Ala Ala Ala 275 280 285
Ala Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp Asp Asp Glu Ala 290 295 300 <210〉 106 <211> 275 <212> PRT <213>小麥. <220> <223>曲亭前驅物 <400> 106
Met Ala Lys Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala Thr Phe Asn Val 15 10 15
Gin Ala Ser Ser Ala Asp Tyr Val Thr Phe lie Asn Gly lie Arg Asn 20 25 30
Lys Leu Arg Asn Pro Gly His Ser Ser His Asn Arg Pro Val Leu Pro 35 40 45
Pro lie Glu Pro Asn Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe His lie Val Leu 50 55 60
Lys Thr Ser Pro Ala Ser Thr Gly Leu Thr Leu Ala Thr Arg Ala Asp 65 70 75 ' 80
Asn Leu Tyr Trp Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly Thr Trp Trp Glu 85 90 95
Leu Thr Pro Gly Leu lie Pro Gly Ala Thr His Val Gly Phe Gly Gly 100 105 110
Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu Thr Asn Val Ala 115 120 125
Leu Gly Arg Gin Gin Met Ala Asp Ala Val Thr Ala Leu Tyr Gly Arg 130 135 140
Thr Lys Ala Asp Lys Thr Ser Gly Pro Lys Gin Gin Gin Ala Arg Glu 145 150 155 160
Ala Val Thr Thr Leu Leu Leu Met Val His Glu Ala Thr Arg Phe Gin 165 170 175
Thr Val Ser Gly Phe Val Ala Gly Val Leu His Pro Lys Glu Lys Lys 180 185 190
Ser Gly Lys lie Gly Asn Glu Met Lys Ala Gin Val Asn Gly Trp Gin 195 200 205
Asp Leu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Thr Asp Ala Asn Ala Pro Pro Gly 210 215 220
Lys Ala Pro Ala Lys Phe Thr Pro lie Glu Lys Met Gly Val Arg Thr 225 230 235 240
Ala Glu Gin Ala Ala Ala Thr Leu Gly lie Leu Leu Phe Val Gin Val 245 250 255
Pro Gly Gly Met Thr Val Ala Gin Ala Leu Glu Leu Phe His Lys Ser 260 265 270
Gly Gly Lys 275 57 201235469
<210> 107 I <211> 278 <212> PRT <2Ϊ3> 法茉莉(Mirabilis jalapa) <220> <223>核糖體失活蛋白質MAP前驅物 <400> 107
Met Leu Thr Thr Thr Lys Val Phe Phe Leu Leu Leu Thr Thr Trp lie 1 5 10 15
Thr Trp Tyr Ala lie Val Asn Pro Gin Ser Arg Ala Ala Pro Thr Leu 20 25 30
Glu Thr lie Ala Ser Leu Asp Leu Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Leu Ser 35 40 45
Phe lie Thr Asn lie Arg Thr Lys Val Ala Asp Lys Thr Glu Gin Cys 50 55 60
Thr lie Gin Lys lie Ser Lys Thr Phe Thr Gin Arg Tyr Ser Tyr lie 65 70 75 80
Asp Leu lie Val Ser Ser Thr Gin Lys lie Thr Leu Ala lie Asp Met 85 90 95
Ala Asp Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Ser Asp lie Ala Asn Asn Lys Gly loo 105 no
Arg Ala Phe Phe Phe Lys Asp Val Thr Glu Ala Val Ala Asn Asn Phe 115 120 125
Phe Pro Gly Ala Thr Gly Thr Asn Arg lie Lys Leu Thr Phe Thr Gly 130 135 140
Ser Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Asn Gly Gly Leu Arg Lys Asp Asn Pro 145 150 155 160
Leu Gly lie Phe Arg Leu Glu Asn Ser lie Val Asn He Tyr Gly Lys 165 170 175
Ala Gly Asp Val Lys Lys Gin Ala Lys Phe Phe Leu Leu Ala lie Gin . 180 185 . 190
Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr lie Ser Asp Lys lie Pro 195 200 205
Ser Glu Lys Tyr Glu Glu Val Thr Val Asp Glu Tyr Met Thr Ala Leu 210 215 220
Glu Asn Asn Trp Ala Lys Leu Ser Thr Ala Val Tyr Asn Ser Lys Pro 225 230 235 240
Ser Thr Thr Thr Ala Thr Lys Cys Gin Leu Ala Thr Ser Pro Val Thr 245 250 255 lie Ser Pro Trp lie Phe Lys Thr Val Glu Glu lie Lys Leu Val Met 260 265 270
Gly Leu Leu Lys Ser Ser 275 <210> 108 <211> 293 <212> PRT <2Π>香石竹 <220> <223>核糖體失活蛋白質康乃馨蛋白30 前驅物 <400> 108
Met Lys lie Tyr Leu Val Ala Ala lie Ala Trp lie Leu Phe Gin Ser 15 10 15
Ser Ser Trp Thr Thr Asp Ala Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Asn Leu Ala 20 25 30
Asn Pro Ser Ala Ser Gin Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Gin lie Arg Asn 35 40 45
Asn Val Arg Asp Thr Ser Leu lie Tyr Gly Gly Thr Asp Val Ala Val 50 55 60 lie Gly Ala Pro Ser Thr Thr Asp Lys Phe Leu Arg Leu Asn Phe Gin 65 70 75 80
Gly Pro Arg Gly Thr Val Ser Leu Gly Leu Arg Arg Glu Asn Leu Tyr 85 90 95
Val Val Ala Tyr Leu Ala Met Asp Asn Ala Asn Val Asn Arg Ala Tyr 100 105 110
Tyr Phe Lys Asn Gin lie Thr Ser Ala Glu Leu Thr Ala Leu Phe Pro 115 120 125
Glu Val Val Val Ala Asn Gin Lys Gin Leu Glu Tyr Gly Glu Asp Tyr 130 135 140
Gin Ala lie Glu Lys Asn Ala Lys lie Thr Thr Gly Asp Gin Ser Arg 58 201235469 145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Leu Gly lie Asn Leu Leu lie Thr Met lie Asp Gly 165 170 175
Val Asn Lys Lys Val Arg Val Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu 180 185 190 lie Ala He Gin Met Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr lie Gin 195 200 205
Asn Lea Val Thr Lys Asn Phe Pro Asn Lys Phe Asp Ser Glu Asn Lys 210 215 220
Val lie Gin Phe Gin Val Ser Trp Ser Lys lie Ser Thr Ala lie Phe 225 230 235 240
Gly Asp Cys Lys Asn Gly Val Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe 245 250 255
Gly Lys Val Arg Gin Ala Lys Asp Leu Gin Met Gly Leu Leu Lys Tyr 260 265 270
Leu Gly Arg Pro Lys Ser Ser Ser lie Glu Ala Asn Ser Thr Asp Asp 275 280 285
Thr Ala Asp Val Leu 290
<210> 109 <211> 563 <212> PRT <213> 西洋接骨木(Sambucus nigra) <220> <223>尼格林b前驅物 <400> 109
Met Arg Val Val Ala Ala Ala Met Leu Tyr Phe Tyr lie Val Val Leu 15 10 15
Ala lie Cys Ser Val Gly lie Gin Gly lie Asp Tyr Pro Ser Val Ser 20 25 30
Phe Asn Leu Asp Gly Ala Lys Ser Ala Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Ser 35 40 45
Asn Leu Arg Lys Thr Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu 50 55 60
Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gin Val Lys Ser Arg Phe Val 65 70 75 80
Leu Va) Pro Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Val Thr Leu Ala Val 85 90 95
Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Phe Ser Gly Asn Ala Asn Ser 100 105 110
Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Val Gin Lys Ser Asn Leu Phe Val 115 120 125
Gly Thr Lys Gin Asn Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu 130 135 140
Glu Thr Ala Ala Asn Thr Arg Arg Glu Ser lie Glu Leu Gly Pro Ser 145 150 155 160
Pro Leu Asp Gly Ala lie Thr Ser Leu Tyr His Gly Asp Ser Val Ala 165 170 175
Arg Ser Leu Leu Val Val lie Gin Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe 180 185 190
Arg Tyr lie Glu Gin Glu Val Arg Arg Ser Leu Gin Gin Ala Thr Ser 195 200 205
Phe Thr Pro Asn Ala Leu Met Leu Ser Met Glu Asn Asn Trp Ser Ser 210 215 220
Met Ser Leu Glu He Gin Gin Ala Gly Asn Asn Val Ser Pro Phe Phe 225 230 235 240
Gly Thr Val Gin Leu Leu Asn Tyr Asp His Thr His Arg Leu Val Asp 245 250 255
Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys lie Thr Gly He Ala lie Leu Leu Phe 260 265 270
Arg Cys Ser Ser Pro Ser Asn Asp Asn Ala lie Arg Met Pro Leu Asp 275 280 285
Leu Ala Gly Glu Asp Asn Lys Tyr Asn Asp Gly Glu Thr Cys Thr Leu 290 295 300
Arg Thr Ser Phe Thr Arg Asn lie Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys Vai 305 310 315 320
Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr Pro Leu Gin Leu trp 325 330 335
Pro Cys Gly Thr Gin Arg Asn Gin Arg Trp Thr Phe Asp Ser Asp Asp 340 345 350
Thr lie Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn Asn 355 360 365 59 201235469
Gly Ser Asn lie Val lie Phe Asn Cys Ser Thr Ala Ala Glu Asn Ala 370 375 380 lie Lys Trp Glu Val Pro lie Asp Gly Ser lie lie Asn Pro Ser Ser 385 390 ‘ 395 400
Gly Leu Val Met Thr Ala Pro Arg Ala Ala Ser Arg Thr lie Leu Leu 405 410 415
Leu Glu Asp Asn lie Tyr Ala Ala Ser Gin Gly Trp Thr Val Thr Asn 420 425 430
Asn Val Lys Pro lie Val Ala Ser lie Val Gly Tyr Lys Glu Met Cys 435 440 445
Leu Gin Ser Asn Gly Glu Asn Asn Gly Val Trp Met Glu Asp Cys Glu 450 455 460
Ala Thr Ser Leu Gin Gin Gin Trp Ala Leu Tyr Gly Asp Arg Thr lie 465 470 475 480
Arg Val Asn Ser Thr Arg Gly Leu Cys Val Thr Thr Asn Gly Tyr Asn 485 490 495
Ser Lys Asp Leu lie lie lie Leu Lys Cys Gin Gly Leu Pro Ser Gin 500 505 510
Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ala lie Val Asn Pro Lys Ser Arg 515 520 525
His Val Met Asp Val Arg Ala Ser Asn Val Ser Leu Arg Glu lie lie 530 535 540 lie Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gin Gin Trp Val Thr Gin Val 545 550 555 560
Leu Pro Ser <210> 110 <211> 563 <212> PRT <213.>西洋接骨木 <220> <223>核糖體失活蛋白質尼格林I前驅物 <400> 110
Met Arg Val Val Ala Ala Ala Met Leu Tyr Phe Tyr lie Val Val Leu '1 5 10 15
Ala He Cys Ser Val Gly lie Gin Gly lie Asp Tyr Pro Ser Val Ser 20 25 30
Phe Asn Leu Asp Gly Ala Lys Ser Ala Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Ser 35 40 45
Asn Leu Arg Lys Thr Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu 50 55 60
Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gin Val Lys Ser Arg Phe Val 65 70 75 80
Leu Val Pro Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Val Thr Leu Ala Val 85 90 95
Asp Va! Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Phe Ser Gly Asn Ala Asn Ser 100 105 110
Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Val Gin Lys Ser Asn Leu Phe Val 115 120 125
Gly Thr Lys Gin Asn Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu 130 135 140
Glu ilir Ala Ala Asn Thr Arg Arg Glu Ser lie Glu Leu Gly Pro Ser 145 150 155 160
Pro Leu Asp Gly Ala lie Thr Ser Leu Tyr His Gly Asp Ser Val Ala 165 170 175
Arg Ser Leu Leu Val Val lie Gin Met Va3 Ser Glu Ala Ala Arg Phe 180 185 190
Arg Tyr lie Glu Gin Glu Val Arg Arg Ser Leu Gin Gin Ala Thr Ser 195 200 205
Phe Thr Pro Asn Ala Ser Met Leu Ser Met Glu Asn Asn Trp Ser Ser 210 215 220
Met Ser Leu Glu lie Gin Gin Ala Gly Asn Asn Val Ser Pro Phe Ser 225 230 235 240
Gly Thr Val Gin Leu Leu Asn Tyr Asp His Thr His Arg Leu Val Asp 245 250 255
Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys He Thr Gly lie Ala lie Leu Leu Phe 260 265 270
Arg Cys Ser Ser Pro Ser Asn Asp Asn Ala lie Arg Met Pro Leu Asp 275 280 285
Leu Ala Gly Glu Asp Asn Lys Tyr Asn Asp Gly Glu Thr Cys Thr Leu 290 · 295 300
Arg Thr Ser Phe Thr Arg Asn lie Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys Val s 60 201235469 305 310 315 320
Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr Pro Leu Gin Leu Trp 325 330 335
Pro Cys Gly Thr Gin Arg Asn Gin Arg Trp Thr Phe Asn Thr Asp Asp 340 345 350
Thr He Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn Asn 355 360 365
Gly Ser Asn lie Val lie Phe Asn Cys Ser Thr Ala Val Glu Asn Ala 370 375 380
He Lys Trp Glu Val Pro lie Asp Gly Ser lie lie Asn Pro Ser Ser 385 390 395 400
Gly Arg Val Val Thr Ala Pro Ser Ala Ala Ser Arg Thr lie Leu Leu 405 410 415
Leu Glu Asp Asn lie Tyr Ala Ala Ser Gin Gly Trp Thr Val Thr Asn 420 425 430
Asn Val Lys Pro lie Val Ala Ser lie Val Gly Tyr Lys Glu Met Cys 435 440 445
Leu Gin Ser Asn Gly Glu Asn Asn Gly Val Trp Met Glu Asp Cys Glu 450 455 460
Ala Thr Ser Leu Gin Gin Gin Trp Ala Leu Tyr Gly Asp Arg Thr lie 465 470 475 480
Arg Val Asn Ser Thr Arg Gly Leu Cys Val Thr Thr Asn Gly Tyr Asn 485 490 495
Ser Lys Asp Leu lie lie He Leu Lys Cys Gin Gly Leu Pro Ser Gin 500 505 510
Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ala lie Val Asn Pro Lys Ser Arg 515 520 525
Leu Val Met Asp Val Arg Ala Ser Asn Val Ser Leu Arg Glu lie lie 530 535 540 lie Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gin Gin Trp Val Thr Gin Val 545 550 555 560
Leu Pro Ser
<210> 111 <211> 564 <212> PRT <213> 短接骨草（Sambucus ebulus) <220> <223>核糖體失活蛋白質依布林1前驅物 <400> 111
Met Arg Val Val Lys Ala Ala Met Leu Tyr Leu His lie Val Val Leu 15 10 15
Ala lie Tyr Ser Val Gly lie Gin Gly lie Asp Tyr Pro Ser Val Ser 20 25 30
Phe Asn Leu Ala Gly Ala Lys Ser Thr Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Lys 35 40 45
Asn Leu Arg Asp Arg Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu 50 55 60
Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gin Val Lys Asn Arg Phe Val 65 70 75 80
Leu Val Arg Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asp Thr Val Thr Ser Ala Val 85 90 95
Asp Val Thr Asn Leu Tyr Leu Val Ala Phe Ser Ala Asn Gly Asn Ser 100 105 110
Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Leu Gin Lys Ser Asn Leu Phe Leu 115 120 125
Gly Thr Thr Gin His Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu 130 135 140
Glu Thr Ala Ala Gly Thr Arg Arg Glu Ser lie Glu Leu Gly Pro Asn 145 150 155 160
Pro Leu Asp Gly Ala lie Thr Ser Leu Trp Tyr Asp Gly Gly Val Ala 165 170 175
Arg Ser Leu Leu Val Leu lie Gin Met Val Pro Glu Ala Ala Arg Phe 180 185 190
Arg Tyr lie Glu Gin Glu Val Arg Arg Ser Leu Gin Gin Leu Thr Ser 195 200 205
Phe Thr Pro Asn Ala Leu Met Leu Ser Met Glu Asn Asn 丁rp Ser Ser 210 215 220
Met Ser Leu Glu Val Gin Leu Ser Gly Asp Asn Val Ser Pro Phe Ser 225 230 235 240
Gly Thr Val Gin Leu Gin Asn Tyr Asp His Thr Pro Arg Leu Val Asp 245 250 255 61 201235469
Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys lie Thr Gly He Ala lie Leu Leu Phe 260 265 270
Arg Cys Val Ala Thr Lys Thr Thr His Asn Ala lie Arg Met Pro His 275 280 285
Val Leu Val Gly Glu Asp Asn Lys Phe Asn Asp Gly Glu Thr Cys Ala 290 295 300 lie Pro Ala Pro Phe Thr Arg Arg lie Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys 305 310 315 320
Val Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr Pro lie Gin Leu 325 330 335
Trp Pro Cys Gly Thr Gin Arg Asn Gin Gin Trp Thr Phe Tyr Asn Asp 340 345 350
Lys Thr lie Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn 355 360 365
Ser Gly Ser Tyr lie Met lie Thr Asp Cys Ser Thr Ala Ala Glu Asp 370 375 380
Ala Thr Lys Trp Glu Val Leu lie Asp Gly Ser lie lie Asn Pro Ser 385 390 395 400
Ser Gly Leu Val Met Thr Ala Pro Ser Gly Ala Ser Arg Thr Thr Leu 405 410 415
Leu Leu Glu Asn Asn lie His Ala Ala Ser Gin Gly Trp Thr Val Ser 420 425 430
Asn Asp Val Gin Pro lie Ala Thr Leu lie Val Gly Tyr Asn Glu Met 435 440 445
Cys Leu Gin Ala Asn Gly Glu Asn Asn Asn Val Trp Met Glu Asp Cys 450 455 460
Asp Val Thr Ser Val Gin Gin Gin Trp Ala Leu Phe Asp Asp Arg Thr 465 470 475 480 lie Arg Val Asn Asn Ser Arg Gly Leu Cys Val Thr Ser Asn Gly Tyr 485 490 495
Val Ser Lys Asp Leu lie Val lie Arg Lys Cys Gin Gly Leu Ala Thr 500 505 510
Gin Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ser Val Val Asn Leu Lys Ser 515 520 525
Thr Arg Val Met Asp Val Lys Glu Ser Asp Val Ser Leu Gin Glu Val 530 535 540
He lie Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gin Gin Trp Arg Thr Gin 545 550 555 560
Val Pro Gin lie <210> 112 <211> 99 <212> PRT •<213>智慧人 <220> <223> MCP-1 前驅物 <400> 112
Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu lie Ala Ala Thr 15 10 15
Phe lie Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro Val 20 25 30
Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys lie Ser Val Gin Arg Leu 35 40 45
Ala Ser Tyr Arg Arg lie Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val 50 55 60 lie Phe Lys Thr lie Val Ala Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Gin 65 70 75 80
Lys Trp Val Gin Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gin Thr Gin Thr 85 90 95
Pro Lys Thr <210> 113 <211> 97 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>嗜酸球趨化蛋白前驅物 <400> 113 62 201235469
Met Lys Vai Set* Ala Ala Leu Leu Trp Leu Leu Leu lie Ala Ala Ala 15 10 15
Phe Ser Pro Gin Gly Leu Ala Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys 20 25 30
Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys lie Pro Leu Gin Arg Leu Glu Ser 35 40 45
Tyr Arg Arg He Thr Ser Gly Lys Cys Pro Gin Lys Ala Val lie Phe 50 55 60
Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp lie Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp 65 70 75 80
Val Gin Asp Ser Met Lys Tyr Leu Asp Gin Lys Ser Pro Thr Pro Lys 85 90 95
Pro <210> 114 <211> 93 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> SDF-1 前驅物 <400> 114
Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu l 5 10 15
Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30
Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 lie Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60
Asn Asn Asn Arg Gin Val Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp lie Gin 65 70 75 80
Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met 85 90 <210> 115 <211> 107 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> GRO-alpha前驅物 <400> 115
Met Ala Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu 15 10 15
Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Arg Arg Ala 20 25 30
Ala Gly Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr 35 40 45
Leu Gin Gly lie His Pro Lys Asn lie Gin Ser Val Asn Val Lys Ser 50 55 60
Pro Gly Pro His Cys Ala Gin Thr Glu Val lie Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80
Gly Arg Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro lie Val Lys Lys lie 85 90 95 lie Glu Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn 100 105 <210> 116 <211> 92 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>1\11?-14613前驅物 <400> Π6
Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Ala Ala 15 10 15
Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr 63 201235469 20 25 30
Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val 35 40 45
Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gin Pro Ala Val Val 50 55 60
Phe Gin Thr Lys Arg Ser Lys Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser 65 70 75 80
Trp Val Gin Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn 85 90 <210> 117 <211> 99 <212> PRT <2丨3>智慧人 <220> <223> 1L-8前驅物 <400> 117
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu lie Ser 15 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 20 25 30
Arg Cys Gin Cys lie Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe 35 40 45 lie Lys Glu Leu Arg Val He Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr 50 55 60
Glu Me lie Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro 65 70 75 80
Lys Glu Asn Trp Val Gin Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala 85 90 95
Glu Asn Ser <210> 118 <211> 98 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>丨？-10前驅物 <400> 118
Met Asn Gin Thr Ala lie Leu lie Cys Cys Leu Me Phe Leu Thr Leu 15 10 15
Ser Gly Me Gin Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys 20 25 30 lie Ser Me Ser Asn Gin Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu 35 40 45
Glu He Me Pro Ala Ser Gin Phe Cys Pro Arg Val Giu lie lie Ala 50 55 60
Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys 65 70 75 80
Ala lie Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg 85 90 95
Ser Pro <210〉 119 <211> 99 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MCP-3前驅物 <400> 119
Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala 15 10 15
Phe Ser Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Val Gly lie Asn Thr Ser Thr 20 25 30
Thr Cys Cys Tyr Arg Phe He Asn Lys Lys lie Pro Lys Gin Arg Leu 35 40 45 64 201235469
Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val • 50 55 60 lie Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Thr Gin 65 70 75 80
Lys Trp Val Gin Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gin Thr - 85 90 95
Pro Lys Leu <210> 120 <211> 96 <212> PRT <2Π>智慧人 <220> <223> MIP-3-alpha前驅物 <400> 120
Met Cys CysvThr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu 15 10 15
Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys 20 25 30
Cys Leu Giy Tyr Thr Asp Arg lie Leu His Pro Lys Phe lie Val Gly 35 40 45
Phe Thr Arg Gin Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp lie Asn Ala lie lie 50 55 60
Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gin Thr 65 70 75 80
Trp Val Lys Tyr lie Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met 85 90 95 <210> 121 <211> 93 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MDC前驅物 <400> 121
Met Ala Arg Leu Gin Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu Ala 15 10 15
Val Ala Leu Gin Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu 20 25 30
Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg 35 40 45
Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly 50 55 60
Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Arg 65 70 75 80
Val Pro Trp Val Lys Met lie Leu Asn Lys Leu Ser Gin 85 90 <210> 122 <211> 92 <212> PRT <213>智慧人 <220> <22Ϊ> MIP-1-alpha前驅物 <400> 122
Met Gin Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 15 10 15
Leu Cys Asn Gin Phe Ser Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala 20 25 30
Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gin lie Pro Gin Asn Phe lie Ala 35 40 45
Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly Val lie Phe 50 55 60
Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp 65 70 75 80
Val Gin Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 201235469 85 90 <210> 123 <211> 109 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> BCA-1 前驅物 <400> 123
Met Lys Phe lie Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser 15 10 15
Leu Ser Pro Val Gin Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg 20 25 30
Cys Arg Cys Val Gin Glu Ser Ser Val Phe lie Pro Arg Arg Phe He 35 40 45
Asp Arg lie Gin lie Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 50 55 60 lie lie Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser lie Val Cys Val Asp Pro Gin 65 70 75 80
Ala Glu Trp lie Gin Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 85 90 95
Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys lie Pro 100 105 <210> 124 <211> 114 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223> GCP-2前驅物 <400> 124
Met Ser Leu Pro Ser Ser Arg Ala Ala Arg Val Pro Gly Pro Ser Gly 15 10 15
Ser Leu Cys Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Thr Pro Pro Gly 20 25 30
Pro Leu Ala Ser Ala Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg 35 40 45
Cys Thr Cys Leu Arg Val Thr Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr lie Gly 50 55 60
Lys Leu Gin Val Phe Pro Ala Gly Pro Gin Cys Ser Lys Val Glu Val 65 70 75 80
Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly Lys Gin Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala 85 90 95
Pro Phe Leu Lys Lys Val lie Gin Lys lie Leu Asp Ser Gly Asn Lys 100 105 110
Lys Asn <210> 125 <211> 114 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>£似-78前驅物 <400> 125
Met Ser Leu Leu Ser Ser Arg Ala Ala Arg Val Pro Gly Pro Ser Ser 15 10 15
Ser Leu Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gin Pro Gly 20 25 30
Pro lie Ala Ser Ala Gly Pro Ala Aia Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg 35 40 45
Cys Val Cys Leu Gin Thr Thr Gin Gly Val His Pro Lys Met lie Ser 50 55 60
Asn Leu Gin Val Phe Ala He Gly Pro Gin Cys Ser Lys Val Glu Val 65 70 75 80
Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly Lys Glu lie Cys Leu Asp Pro Glu Ala 66 201235469 85 90 95 ' Pro Phe Leu Lys Lys Val lie Gin Lys lie Leu Asp G!y Gly Asn Lys loo 105 no
Glu Asn <210> 126 <211> 128 <212> PRT <213>智慧人 <220> c223> PBP前驅物 <400> 126
Met Ser Leu Arg Leu Asp Thr Thr Pro Ser Cys Asn Ser Ala Arg Pro 15 10 15
Leu His Ala Leu Gin Val Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Thr Ala 20 25 30
Leu Ala Ser Ser Thr Lys Gly Gin Thr Lys Arg Asn Leu Ala Lys Gly 35 40 45
Lys Glu Glu Ser Leu Asp Ser Asp Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Cys Met 50 55 60
Cys lie Lys Thr Thr Ser Gly lie His Pro Lys Asn lie Gin Ser Leu 65 70 75 80
Glu Val 丨le Gly Lys Gly Thr His Cys Asn Gin Val Glu Val lie Aia 85 90 95
Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys lie Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Arg 100 105 110 lie Lys Lys lie Val Gin Lys Lys Leu Ala Gly Asp Glu Ser Ala Asp 115 120 125 <210〉 127 <211> 125 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MiG前驅物 <400> 127
Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly lie lie Leu Leu Val 15 10 15
Leu lie Gly Val Gin Gly Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser 20 25 30
Cys lie Ser Thr Asn Gin Gly Thr lie His Leu Gin Ser Leu Lys Asp 35 40 45
Leu Lys Gin Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys lie Glu lie lie 50 55 60
Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gin Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala 65 70 75 80
Asp Val Lys Glu Leu lie Lys Lys Trp Glu Lys Gin Val Ser Gin Lys 85 90 95
Lys Lys Gin Lys Asn Gly Lys Lys His Gin Lys Lys Lys Val Leu Lys 100 105 110
Val Arg Lys Ser Gin Arg Ser Arg Gin Lys Lys Thr Thr 115 120 125 <210> 12S <211> 101 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> PF-4前驅物 <400> 128
Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe 15 10 15
Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu 20 25 30
Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gin Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser 35 40 45 67 201235469
Gin Val Arg Pro Arg His lie Thr Ser Leu Glu Val lie Lys Ala Gly 50 55 60
Pro His Cys Pro Thr Ala Gin Leu lie Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg 65 70 75 80
Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gin Ala Pro Leu Tyr Lys Lys lie lie Lys 85 90 95
Lys Leu Leu Glu Ser 100 <210> 129 <211> 104 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223> PF4變體前驅物 <400> 129
Met Ser Ser Ala Ala Arg Ser Arg Leu Thr Arg Ala Thr Arg Gin Glu 15 10 15
Met Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Pro Val Val Val Ala Phe Ala 20 25 30
Arg Ala Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gin Cys Leu Cys Val Lys 35 40 45
Thr Thr Ser Gin Val Arg Pro Arg His lie Thr Ser Leu Glu Val lie 50 55 60
Lys Ala Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gin Leu lie Ala Thr Leu Lys 65 70 75 80
Asn Gly Arg Lys He Cys Leu Asp Leu Gin Ala Leu Leu Tyr Lys Lys 85 90 95 lie lie Lys Glu His Leu Glu Ser 100 <210> 130 <211> 211 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> SDF-2前驅物 <400> 130
Met Ala Val Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Trp Ser Ala Val 15 10 15
Gly Ala Ser Ser Leu Gly Val Val Thr Cys Gly Ser Val Val Lys Leu 20 25 30
Leu Asn Thr Arg His Asn Val Arg Leu His Ser His Asp Val Arg Tyr 35 40 45
Gly Ser Ser Ser Gly Gin Gin Ser Val Thr Gly Val Thr Ser Val Asp 50 55 60
Asp Ser Asn Ser Tyr Trp Arg lie Arg Arg Lys Ser Ala Thr Val Cys 65 70 75 80
Glu Arg Gly Thr Pro lie Lys Cys Gly Gin Pro lie Arg Leu Thr His 85 90 95
Val Asn Thr Gly Arg Asn Leu His Ser His His Phe Thr Ser Pro Leu 100 105 110
Ser Gly Asn Gin Glu Val Thr Ala Phe Gly Glu Glu Gly Glu Gly Asp 115 120 125
Tyr Leu Asp Asp Trp Thr Val Leu Cys Asn Gly Pro Tyr Trp Val Arg 130 135 140
Asp Gly Glu Val Arg Phe Lys His Ser Ser Thr Glu Val Leu Leu Ser 145 150 155 160
Val Thr Gly Glu Gin Tyr Gly Arg Pro lie Ser Gly Gin Lys Glu Val 165 170 175
His Gly Met Ala Gin Pro Ser Gin Asn Asn Tyr Trp Lys Ala Met Glu 180 185 190
Gly lie Phe Met Lys Pro Ser Glu Leu Leu Lys Ala Glu Ala His His 195 200 205
Ala Glu Leu 210 <210> 131 <211> 99 68 201235469 <212> PRT 、<2Π>智慧人 <220> ^ <223> MCP-2前驅物 <400> 131
Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr , 15 10 15
Phe Ser Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Asp Ser Val Ser lie Pro lie 20 25 30
Thr Cys Cys Phe Asn Val lie Asn Arg Lys lie Pro lie Gin Arg Leu 35 40 45
Glu Ser Tyr Thr Arg lie Thr Asn lie Gin Cys Pro Lys Glu Ala Val 50 55 60 lie Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu 65 70 75 80
Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gin lie Phe Gin Asn 85 90 95
Leu Lys Pro <210> 132 <211> 98 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MCP-4前驅物 <400> 132
Met Lys Val Ser Ala Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Thr Ala Ala 15 10 15
Phe Asn Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser 20 25 30
Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser Ser Lys Lys lie Ser Leu Gin Arg Leu 35 40 45
Lys Ser Tyr Val He Thr Thr Ser Arg Cys Pro Gin Lys Ala Val lie 50 55 60
Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys Glu He Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys 65 70 75 80
Trp Val Gin Asn Tyr Met Lys Hts Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu 85 90 95
Lys Thr <210> 133 <211> 89 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>^11?-4前驅物 <400> 133
Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met Ala 15 10 15
Leu Cys Ser Cys Ala Gin Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu 20 25 30
Val Tyr Thr Ser Trp Gin lie Pro Gin Lys Phe lie Val Asp Tyr Ser 35 40 45
Glu Thr Ser Fro Gin Cys Pro Lys Pro Gly Val lie Leu Leu Thr Lys 50 55 60
Arg Gly Arg Gin lie Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gin Lys 65 70 75 80
Tyr lie Ser Asp Leu Ly's Leu Asn Ala 85 <210> 134 <211> 98 <212> PRT <213>智慧人 69 201235469 <220> <223> MIP-3-beta前驅物 <400> 134 '
Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro 15 10 15
Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 20 25 30
Val Thr Gin Lys Pro lie Pro Gly Tyr lie Val Arg Asn Phe His Tyr 35 40 45
Leu Leu lie Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 50 55 60
Leu Arg Gly Arg Gin Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gin Pro Trp Val Glu 65 70 75 80
Arg He lie Gin Arg Lea Gin Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 85 90 95
Ser Ser <210> 135 <211> 107 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> M[P2-alpha前驅物 <400> 135
Met Ala Arg Ala Thr Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu 15 10 15
Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ser Arg Arg Ala 20 25 30
Ala Gly Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr 35 40 45
Leu Gin Gly He His Leu Lys Asn lie Gin Ser Val Lys Val Lys Ser 50 55 60
Pro Gly Pro His Cys Ala Gin Thr Glu Val lie Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80
Gly Gin Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys lie 85 90 95 lie Glu Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn 100 105 <210> 136 <211> 107 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> 1^?24〇13前驅物 <400> 136
Met Ala His Ala Thr Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu 15 10 15
Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ser Arg Arg Ala 20 25 30
Ala Gly Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr 35 40 45
Leu Gin Gly He His Leu Lys Asn lie Gin Ser Val Asn Val Arg Ser 50 55 60
Pro Gly Pro His Cys Ala Gin Thr Glu Val lie Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80
Gly Lys Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gin Lys lie 85 90 95 lie Glu Lys lie Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn 100 105 <210> 137 <211> 113 <212> PRT <213>智慧人 70 <220> 201235469 <223>1^?-5前驅物 <400> 137
Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Ala Val 1 5 10 15
Leu Gly Ser Gin Ala Gin Phe He Asn Asp Ala Glu Thr Glu Leu Met 20 25 30
Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Val Leu Asn Ser Phe His 35 40 45
Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr lie Ser Gin Ser lie Pro Cys 50 55 60
Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro 65 70 75 80
Gly Vat lie Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gin Val Cys Ala Lys Pro 85 90 95
Ser Gly Pro Gly Val Gin Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser 100 105 110 lie <210> 138 <211> 93 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> HCC-1 前驅物 <400> 138
Met Lys lie Ser Val Ala Ala lie Pro Phe Phe Leu Leu lie Thr lie 15 10 15
Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro 20 25 30
Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys lie Pro Arg Gin Arg 35 40 45
He Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly lie 50 55 60
Val Phe lie Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp 65 70 75 80
Lys Trp Val Gin Asp Tyr lie Lys Asp Met Lys Glu Asn 85 90 <210> 139 <211> 91 <212> PRT <2丨3>智慧人 <220> <223> RANTES前驅物 <400> 139
Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val lie Leu lie Ala Thr Ala 15 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30
Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys 35 40 45
Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60
Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Aia Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80
Va) Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 140 <211> 119 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223>嗜酸球趨化蛋白-2前驅物 201235469 <400> 140
Met Ala Gly Leu Met Thr lie Val 1 5
Cys Ala His His He lie Pro Thr 20
Cys Cys Met Phe Phe Val Ser Lys 35 40
Ser Tyr Gin Leu Ser Ser Arg Ser 50 55
Phe Thr Thr Lys Lys Gly Gin Gin 65 70
Trp Val Gin Arg Tyr Met Lys Asn 85
Ser Pro Arg Ala Arg Ala Val Ala 100
Pro Gly Asn Gin Thr Thr Cys 115
Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gly Val 10 15
Gly Ser Val Val He Pro Ser Pro 25 30
Arg lie Pro Glu Asn Arg Val Val 45
Thr Cys Leu Lys Ala Gly Val lie 60
Phe Cys Gly Asp Pro Lys Gin Glu 75 80
Leu Asp Ala Lys Gin Lys Lys Ala 90 95
Val Lys Gly Pro Val Gin Arg Tyr 105 110 <210> 141 <211> 94 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> TARC前驅物 <400> 141
Met Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala 15 10 15
Ser Leu Gin His lie His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu 20 25 30
Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys Gly Ala lie Pro Leu Arg Lys Leu Lys 35 40 45
Thr Trp Tyr Gin Thr Ser Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala lie Val Phe 50 55 60
Val Thr Val Gin Gly Arg Ala lie Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg 65 70 75 80
Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gin Ser Leu Glu Arg Ser 85 90 <210> 142 <211> 96 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>丨-309前驅物 <400> 142
Met Gin Ne lie Thr Thr Ala Leu Val Cys Leu Leu Leu Ala Gly Met 15 10 15
Trp Pro Glu Asp Val Asp Ser Lys Ser Met Gin Val Pro Phe Ser Arg 20 25 30
Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu Gin Glu lie Pro Leu Arg Ala lie Leu 35 40 45
Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser lie Cys Ser Asn Glu Gly Leu lie Phe 50 55 60
Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp 65 70 75 80
Val Gin Arg His Arg Lys Met Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys 85 90 95 <210> 143 <211> 114 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>淋巴細胞趨化因子前驅物 <400> 143
Met Arg Leu Leu lie Leu Ala Leu Leu Gly lie Cys Ser Leu Thr Ala 72 201235469 15 10 15 * Tyr lie Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys 20 25 30
Val Ser Leu Thr Thr Gin Arg Leu Pro Val Ser Arg lie Lys Thr Tyr 35 40 45 "Thr I le Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val lie Phe lie Thr Lys Arg 50 55 60
Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gin Ala Thr Trp Val Arg Asp Val _ 65 70 75 80 * Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met lie Gin 85 90 95
Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gin Gin Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu 100 105 110
Thr Gly <210> 144 <211> 167 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223>肺活素前驅物 <400> 144
Met Ala Ala Gin Gly Trp Ser Met Leu Leu Leu Ala Val Leu Asn Leu 15 10 15
Gly lie Phe Val Arg Pro Cys Asp Thr Gin Glu Leu Arg Cys Leu Cys 20 25 30 lie Gin Glu His Ser Glu Phe lie Pro Leu Lys Leu lie Lys Asn lie 35 40 45
Met Val lie Phe Glu Thr lie Tyr Cys Asn Arg Lys Glu Val lie Ala 50 55 60
Val Pro Lys Asn Gly Ser Met lie Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Trp 65 70 75 80
Val Lys Ala Thr Val Gly Pro lie Thr Asn Arg Phe Leu Pro Glu Asp 85 90 95
Leu Lys Gin Lys Glu Phe Pro Pro Ala Met Lys Leu Leu Tyr Ser Val 100 105 110
Glu His Glu Lys Pro Leu Tyr Leu Ser Phe Gly Arg Pro Glu Asn Lys 115 120 125
Arg lie Phe Pro Phe Pro lie Arg Glu Thr Ser Arg His Phe Ala Asp 130 135 140
Leu Ala His Asn Ser Asp Arg Asn Phe Leu Arg Asp Ser Ser Glu Val 145 150 155 160
Ser Leu Thr Gly Ser Asp Ala 165 <210> 145 <211> 116 <212> PRT <213>小鼠 <220> <223> CIO前驅物 <400> 145
Met Arg Asn Ser Lys Thr Ala He Ser Phe Phe lie Leu Val Ala Val 15 10 15
Leu Gly Ser Gin Ala Gly Leu lie Gin Glu Met Glu Lys Glu Asp Arg 20 25 30
Arg Tyr Asn Pro Pro lie lie His Gin Gly Phe Gin Asp Thr Ser Ser 35 40 45
Asp Cys Cys Phe Ser Tyr Ala Thr Gin lie Pro Cys Lys Arg Phe lie 50 55 60
Tyr Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys lie Lys Pro Gly lie lie Phe 65 70 75 80 lie Ser Arg Arg Gly Thv Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Asp Arg Arg 85 90 95
Val Gin Arg Cys Leu Ser Thr Leu Lys Gin Gly Pro Arg Ser Gly Asn 100 105 110
Lys Val lie Ala 115 73 201235469 <210> 146 <211> 122 <212> PRT <213> 小® <220> <223> MIP-1-gamma前驅物 <400> 146
Met Lys Pro Phe His Thr Ala Leu Ser Phe Leu He Leu Thr Thr Ala 15 10 15
Leu Gly He Trp Ala Gin lie Thr His Ala Thr Glu Thr Lys Glu Val 20 25 30
Gin Ser Ser Leu Lys Ala Gin Gin Gly Leu Glu lie Glu Met Phe His 35 40 45
Met Gly Phe Gin Asp Ser Ser Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Asn Ser Arg 50 55 60 lie Gin Cys Ser Arg Phe lie Gly Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys 65 70 75 80
Thr Arg Pro Gly lie I!e Phe lie Ser Lys Arg Gly Phe Gin Val Cys 85 90 95
Ala Asn Pro Ser Asp Arg Arg Val Gin Arg Cys lie Glu Arg Leu Glu 100 105 110
Gin Asn Ser Gin Pro Arg Thr Tyr Lys Gin 115 120 <210> 147 <211> 104 <212> PRT <213>小鼠 <220> <223> MCP-5前驅物 <400> 147
Met Lys lie Ser 丁hr Leu Leu Cys Leu Leu Leu lie Ala Thr Thr lie 15 10 15
Ser Pro Gin Val Leu Ala Gly Pro Asp Ala Val Ser Thr Pro Val Thr 20 25 30
Cys Cys Tyr Asn Val Val Lys Gin Lys lie His Val Arg Lys Leu Lys 35 40 45
Ser Tyr Arg Arg lie Thr Ser Ser Gin Cys Pro Arg Glu Ala Val lie 50 55 60
Phe Arg Thr lie Leu Asp Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys 65 70 75 80
Trp Val Lys Asn Ser lie Asn His Leu Asp Lys Thr Ser Gin Thr Phe 85 90 95 lie Leu Glu Pro Ser Cys Leu Gly 100 <2I0> 148 <211> 120 <212〉 PRT <213>智慧人 <220> <223> LEC前驅物 <400> 148
Met Lys Val Ser Glu Ala Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu lie Leu lie 15 10 15 lie Thr Ser Ala Ser Arg Ser Gin Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn 20 25 30
Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg 35 40 45
Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala 50 55 60
He lie Phe Val Thr Lys Arg Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn 65 70 75 80
Asp Asp Trp Val Gin Glu Tyr lie Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu 85 90 95
Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr Val Lys lie lie Thr Ala Lys Asn Gly 100 105 110 74 201235469
Gin Pro Gin Leu Leu Asn Ser Gin - 115 120 <210> 149 - <211> 134 <212〉 PRT <213>智慧人 * <220> <223>艾索朵斯-2前驅物 <400> 149
Met Ala Gin Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu lie Leu Val Leu Ala Phe 15 10 15
Gly lie Pro Arg Thr Gin Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gin Asp Cys Cys 20 25 30
Leu Lys Tyr Ser Gin Arg Lys lie Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr 35 40 45
Arg Lys Gin Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser lie Pro Ala lie Leu Phe 50 55 60
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gin Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu 65 70 75 80
Leu Trp Val Gin Gin Leu Met Gin His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro 85 90 95
Gin Lys Pro Ala Gin Q\y Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr 100 105 110
Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser 115 120 125
Gin Thr Pro Lys Gly Pro 130 <210> 150 <211> 120 <212> PRT <2]3>智慧人 <220> <223>[^11?-3前驅物 <400> 150
Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala 15 10 15
Leu Gly Ser Gin Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met 20 25 30
Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His 35 40 45
Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys lie Ser Tyr Thr Pro Arg Ser lie Pro 50 55 60
Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys 65 70 75 80
Pro Gly Val lie Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn 85 90 95
Pro Ser Asp Lys Gin Val Gin Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp 100 105 110
Thr Arg lie Lys Thr Arg Lys Asn 115 120 <210> 151 <211> 150 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> TECK前驅物 <400> 151
Met Asn Leu Trp Leu Leu Ala Cys Leu Val Ala Gly Phe Leu Gly Ala 15 10 15
Trp Ala Pro Ala Val His Thr Gin Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu 20 25 30
Ala Tyr His Tyr Pro lie Gly Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr 35 40 45
Tyr Arg lie Gin Glu Val Ser Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala lie 75 201235469 50 55 60
Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser 65 70 75 80
Arg Glu Val Gin Arg Ala Met Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val 85 90 95
Phe Ala Lys Leu His His Asn Met Gin Thr Phe Gin Ala Gly Pro His 100 105 110
Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys 115 120 125
Phe Ser Asn Pro lie Ser Ser Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu lie 130 135 140
Ser Ala Asn Ser Gly Leu 145 150 <210> 152 <211> 94 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>嗜酸球趨化蛋白_3前驅物 <400> 152
Met Met Gly Leu Ser Leu Ala Ser Ala Val Leu Leu Ala Ser Leu Leu 15 10 15
Ser Leu His Leu Gly Thr Ala Thr Arg Gly Ser Asp lie Ser Lys Thr 20 25 30
Cys Cys Phe Gin Tyr Ser His Lys Pro Leu Pro Trp Thr Trp Val Arg 35 40 45
Ser Tyr Glu Phe Thr Ser Asn Ser Cys Ser Gin Arg Ala Val lie Phe 50 55 60
Thr Thr Lys Arg Gly Lys Lys Val Cys Thr His Pro Arg Lys Lys Trp 65 70 75 80
Val Gin Lys Tyr lie Ser Leu Leu Lys Thr Pro Lys Gin Leu 85 90 <210> 153 <211> 112 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> CTACK前驅物 <400> 153
Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15
Leu Ser Pro Asp Pro Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala 20 25 30
Cys Cys Thr Gin Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg 35 40 45
Lys Val lie Gin Val Glu Leu Gin Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu 50 55 60
Gin Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gin Arg Ser lie Cys lie His Pro 65 70 75 80
Gin Asn Pro Ser Leu Ser Gin Trp Phe Glu His Gin Glu Arg Lys Leu 85 90 95
His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly 100 105 110 <210> 154 <211> 127 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MEC前驅物 <400> 154
Met Gin Gin Arg Gly Leu Ala lie Val Ala Leu Ala Val Cys Ala Ala 1 5 10 15
Leu His Ala Ser Glu Ala lie Leu Pro lie Ala Ser Ser Cys Cys Thr 20 25 30 76 201235469
Glu Val Ser His His lie Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met - 35 40 45
Cys Arg He Gin Arg Ala Asp Gly Asp Cys Asp Leu Ala Ala Val lie 50 55 60
Leu His Val Lys Arg Arg Arg lie Cys Val Ser Pro His Asn His Thr -65 70 75 80
Val Lys Gin Trp Met Lys Val Gin Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly 85 90 95
Asn Val Cys His Arg Lys Lys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg ' 100 105 110
Ala His Gin Gly Lys His Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr 115 120 125 <210> 155 <211> 114 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>50^-1匕613前驅物 <400> 155
Met Arg Leu Leu lie Leu Ala Leu Leu Gly lie Cys Ser Leu Thr Ala 15 10 15
Tyr He Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser His Arg Arg Thr Cys 20 25 30
Val Ser Leu Thv Thr Gin Arg Leu Pro Val Ser Arg ile Lys Thr Tyr 35 40 45
Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg 50 55 60
Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gin Ala Thr Trp Val Arg Asp Val 65 70 75 80
Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gin 85 90 95
Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gin Gin Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu 100 105 110
Thr Gly <210> 156 <211> 94 <212> PRT <2]3>智慧人 <220> <223> I_TAC前驅物 <400> 156
Met Ser Val Lys Gly Met Ala lie Ala Leu Ala Val Ile Leu Cys Ala 15 10 15
Thr Val Val Gin Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys 20 25 30
Ile Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala 35 40 45
Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val lie Ile 50 55 60
Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gin Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys 65 70 75 80
Gin Ala Arg Leu Ile lie Lys Lys Val Glu Arg Lys Asn Phe 85 90 <210> 157 <211> 99 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> BRAK前驅物 <400> 157
Met Arg Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Tyr 15 10 15
Thr Ala Arg Val Asp Gly Ser Lys Cys Lys Cys Ser Arg Lys Gly Pro 77 201235469 20
Lys He Arg Tyr Ser Asp Val Lys 35 40
Pro His Cys Glu Glu Lys Met Val 50 55
Arg Tyr Arg Gly Gin Glu His Cys 65 70
Lys Arg Phe lie Lys Trp Tyr Asn 85
Tyr Glu Glu 25 30
Lys Leu Glu Met Lys Pro Lys Tyr 45 lie lie Thr Thr Lys Ser Val Ser 60
Leu His Pro Lys Leu Gin Ser Thr 75 80
Ala Trp Asn Glu Lys Arg Arg Val 90 95 <210〉 158 <211> 254 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> SR-PSOX前驅物 <400> 158
Met Gly Arg Asp Leu Arg Pro Gly 1 5
Leu Leu Leu Leu Val Tyr Leu Thr 20
Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys 35 40
Pro Pro Ser Val Gin Phe Met Asn 50 55
Tyr His Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr 65 70
Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro 85
Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His 100
Gin Lys His Leu Leu Pro Thr Ser 115 120
Gly Ala Ser Ser Asp lie His Thr 130 135
Leu Gin Ser Thr Gin Arg Pro Thr 145 150
Asp Lys Glu Leu Thr Arg Pro Asn 165
His Ser Leu Ala Val Gly Pro Glu 180
Glu Lys Asn Ala Gly Pro Thr Ala 195 200
Leu Cys Leu Leu Ala lie lie Phe 210 215
Val Leu Cys Lys Arg Arg Arg Gly 225 230
Leu Pro Val His Tyr lie Pro Val 245
Ser Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu 10 15
Gin Pro Gly Asn Gly Asn Glu Gly 25 30
Gly Lys Arg lie Ser Ser Asp Ser 45
Arg Leu Arg Lys His Leu Arg Ala 60
Arg Phe Gin Leu Leu Ser Trp Ser 75 80
Trp Val Gin Glu Leu Met Ser Cys 90 95
Ala Tyr Ser Gly lie Val Ala His 105 110
Pro Pro lie Ser Gin Ala Ser Glu 125
Pro Ala Gin Met Leu Leu Ser Thr 140
Leu Pro Val Gly Ser Leu Ser Ser 155 160
Glu Thr Thr lie His Thr Ala Gly 170 175
Ala Gly Glu Asn Gin Lys Gin Pro 185 190
Arg Thr Ser Ala Thr Val Pro Val 205 lie Leu Thr Ala Ala Leu Ser Tyr 220
Gin Ser Pro Gin Ser Ser Pro Asp 235 240
Ala Pro Asp Ser Asn Thr 250 <210> 159 <211> 395 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>人神經趨化蛋白前驅物 <400> 159
Met Ala Pro Ser Pro Leu Ala Trp Leu Leu Arg Leu Ala Ala Phe Phe 15 10 15
His Leu Cys Thr Leu Leu'Pro Gly Gin His Leu Gly Met Thr Lys Cys 20 25 30
Glu He Met Cys Gly Lys Met Thr Ser Arg He Pro Val Ala Leu Leu 35 40 45 lie Arg Tyr G)n Leu Asn Gin Glu Ser Cys Gly Lys Arg Ala lie Val 50 -55 60
Leu Glu Thr Thr Gin His Arg Arg Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys 65 70 75 80
Trp Val Gin Asp Ala Met Lys His Leu Asp His Gin Ala Ala Ala Leu 78 201235469 85 90 95 ‘ Thr Lys Asn Gly Gly Lys Phe Glu Lys Arg Val Asp Asn Val Thr Pro 100 105 110
Gly lie Thr Leu Ala Thr Arg Gly Leu Ser Pro Ser Ala Leu Thr Lys 115 120 125 -. Pro Glu Ser Ala Thr Leu Giu Asp Leu Ala Leu Glu Leu Thr Thr lie 130 135 140
Ser Gin Glu Ala Arg Gly Thr Met Gly Thr Ser Gin Glu Pro Pro Ala ,145 150 155 160 ' Ala Val Thr Gly Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Ala Gin Asp Ala Gly 165 170 175
Leu Thr Ala Lys Pro Gin Ser lie Gly Ser Phe Glu Ala Ala Asp lie 180 185 190
Ser Thr Thr Val Trp Pro Ser Pro Ala Val Tyr Gin Ser Gly Ser Ser 195 200 205
Ser Trp Ala Glu Glu Lys Ala Thr Glu Ser Pro Ser Thr Thr Ala Pro 210 215 220
Ser Pro Gin Val Ser Thr Thr Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Val 225 230 235 240
Gly Ser Glu Gly Gin Pro Pro Trp Val Gin Gly Gin Asp Leu Ser Pro 245 250 255
Glu Lys Ser Leu Gly Ser Glu Glu He Asn Pro Val His Thr Asp Asn 260 265 270
Phe Gin Glu Arg Gly Pro Gly Asn Thr Val His Pro Ser Val Ala Pro 275 280 285 lie Ser Ser Glu Glu Thr Pro Ser Pro Glu Leu Val Ala Ser Gly Ser 290 295 300
Gin Ala Pro Lys He Glu Glu Pro lie His Ala Thr Ala Asp Pro Gin 305 310 315 320
Lys Leu Ser Val Leu lie Thr Pro Val Pro Asp Thr Gin Ala Ala Thr 325 330 335
Arg Arg Gin Ala Val Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys 340 345 350
Leu Gly Val Ala Met Phe Ala Tyr Gin Ser Leu Gin Gly Cys Pro Arg 355 360 365
Lys Met Ala Gly Glu Met Val Glu Gly Leu Arg Tyr Val Pro Arg Ser 370 375 380
Cys Gly Ser Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Val 385 390 395 <210> 160 <211〉 93 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> LD78-beta前驅物 <400> 160
Met Gin Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 15 10 15
Leu Cys Asn Gin Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30
Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gin lie Pro Gin Asn Phe lie 35 40 45
Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gin Cys Ser Lys Pro Ser Val lie 50 55 60
Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80
Trp Val Gin Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90
<210> 161 <211> 92 <212> PRT <213>智慧人 _ <220> <223> MIP-lb2前驅物 <400> 161
Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Val Leu Val Ala Ala 15 10 15
Phe Cys Ser Leu Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr 79 201235469 20 25 30
Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val 35 40 45
Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gin Pro Ala Val Val 50 55 60
Phe Gin Thr Lys Arg Giy Lys Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser 65 70 75 80
Trp Val Gin Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn 85 90 <210> 162 <211> 299 <212> PRT <213>肥皂草 <220> <223>皂草毒蛋白變體 <220> <221>變體 <222> 60 <223〉 kaa= Gly或Ser <220> <221>’變體 <222> 72 <223> Xaa= Glu或Asp <220> <221>變體 <222> 115 <223> Xaa= Arg或Lys <220> <221>變體 <222> 123 <223> Xaa= Ser或Leu <220> <221>變體 - <222> 212 <223〉 Xaa= lie或Thr <400> 162
Met 'Lys lie Tyr Val Val Ala Thr lie Ala Trp lie Leu Leu Gin Phe 15 10 15
Ser Ala Trp Thr Thr Thr Asp Ala Val Thr Ser lie Thr Leu Asp Leu 20 25 30
Val Asn Pro Thr Ala Gly Gin Tyr Ser Ser Phe Val Asp Lys lie Arg 35 40 45
Asn Asn Val Lys Asp Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Xaa Thr Asp lie Ala 50 55 60
Val lie Gly Pro Pro Ser Lys Xaa Lys Phe Leu Arg lie Asn Phe Gin 65 70 75 80
Ser Ser Arg Gly Thr Val Ser Leu Gly Leu Lys Arg Asp Asn Leu Tyr 85 90 95
Val Val Ala Tyr Leu Ala Met Asp Asn Thr Asn Val Asn Arg Ala Tyr loo 105 no
Tyr Phe Xaa Ser Glu He Thr Ser Ala Glu Xaa Thr Ala Leu Phe Pro 115 120 125
Glu Ala Thr Thr Ala Asn Gin Lys Ala Leu Glu Tyr Thr Glu Asp Tyr 130 135 140
Gin Ser lie Glu Lys Asn Ala Gin lie Thr Gin Gly Asp Gin Ser Arg 145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Leu Gly lie Asp Leu Leu Ser Thr Ser Met Glu Ala 165 170 175
Val Asn Lys Lys Ala Arg Val Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu 180 185 190 lie Ala lie Gin Met Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr lie Gin 195 200 205
Asn Leu Val Xaa Lys Asn Phe Pro Asn Lys Phe Asn Ser Glu Asn Lys 210 215 220
Val He Gin Phe Glu Val Asn Trp Lys Lys lie Ser Thr Ala lie Tyr 225 230 235 240
Gly Asp Ala Lys Asn Gly Val Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe 80 201235469 245 250 255 、Gly Lys Val Arg Gin Val Lys Asp Leu Gin Met Gly Leu Leu Met Tyr 260 265 270
Leu Gly Lys Pro Lys Ser Ser Asn Glu Ala Asn Ser Thr Val Arg His 275 280 285 - Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Thr Leu Leu lie Thr 290 295
<210> 163 <211> 316 <212> PRT <213> Gelonium multiflorum <220> <223>截短型細胞毒素變體 <220> <221>變體 <222> 90 <223> Xaa= Cys或Lys <220> <221>變體 <222> 93 <223> Xaa= Pm或Asp <400>163
Met Lys Gly Asn Met Lys Val Tyr Trp lie Lys lie Ala Val Ala Thr 15 10 15
Trp Phe Cys Cys Thr Thr lie Val Leu Gly Ser Thr Ala Arg lie Phe 20 25 30
Ser Leu Pro Thr Asn Asp Glu Glu Glu Thr Ser Lys Thr Leu Gly Leu 35 40 45
Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr lie Thr Tyr Val 50 55 60
Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly Asn Ser 65 70 75 80
His Gly He Pro Leu Leu Arg Lys Lys Xaa Asp Asp Xaa Gly Lys Cys 85 90 95
Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gin Leu Ala Glu lie 100 105 110
Ala lie Asp Val Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gin Val Arg Asn 115 120 125
Ar^ Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Gly Leu 130 135 140
Phe Lys Asn Thr lie Lys Thr Arg Leu His Phe Gly Gly Ser Tyr Pro 145 150 155 160
Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu Gly lie 165 170 175
Glu Pro Leu Arg lie Gly lie Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala lie Asp 180 185 190
Asn Tyr Lys Pro Thr Glu lie Ala Ser Ser Leu Leu Val Val lie Gin 195 200 205
Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Thr Phe lie Glu Asn Gin lie Arg 210 215 220
Asn Asn Phe Gin Gin Arg lie Arg Pro Ala Asn Asn Thr lie Ser Leu 225 230 235 240
Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu Ser Phe Gin lie Arg Thr Ser Gly Ala 245 250 255
Asn Gly Met Phe Ser Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Lys 260 265 270
Lys Tyr Tyr Val Thr Ma Val Asp Gin Val Lys Pro Lys lie Ala Leu 275 280 285
Leu Lys Phe Val Asp Lys Asp Pro Lys Thr Ser Leu Ala Ala Glu Leu 290 295 300 lie lie Gin Asn Tyr Glu Ser Leu Val Gly Phe Asp 305 310 315 <210> 164 <211> 576 <212> PRT <213>蓖麻 81 <220〉 201235469 <223>蓖麻毒素A變體 <220> <221>變體 <222> 76 <223> Xaa= Glu或Asp <220> <221>變體 <222> 83 <223> Xaa=： Arg或Ala <220> <221>變體 <222> 109 <223> Xaa= Leu， Ala或Met <220> <221>變體 <222> 110 <223> Xaa= Asp， Ala, Glu或Asn <220> <221>變體 <222> 111 <223〉 Xaa= Val， Ala或Met <220> <22丨> 變體 <222> 132 <223〉 Xaa= Asn或Ala <220> <221>變體 <222> 551 <223> Xaa= Ala或Arg <400> 164
Met Lys Pro Gly Gly Asn Thr lie Val lie Trp Met Tyr Ala Val Ala 15 10 15
Thr Trp Leu Cys Phe Gly Ser Thr Ser Gly Trp Ser Phe Thr Leu Glu 20 25 30
Asp Asn Asn Ite Phe Pro Lys Gin Tyr Pro lie lie Asn Phe Thr Thr 35 40 45
Ala Qly Ala Thr Val Gin Ser Tyr Thr Asn Phe Ite Arg Ala Val Arg 50 55 60
Gly Arg Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Xaa ile Pro Val Leu 65 70 75 80
Pro Asn Xaa Val Gly Leu Pro Ile Asn Gin Arg Phe Ile Leu Val Glu 85 90 95
Leu Ser Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Xaa Xaa Xaa Thr 100 105 110
Asn Ala Tyr Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe 115 120 125
His Pro Asp Xaa Gin Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr 130 135 140
Asp Val Gin Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg 145 150 155 160
Leu Glu Gin Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn lie Glu Leu Gly Asn 165 170 175
Gly Pro Leu Glu Glu Ala lie Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly 180 185 190
Gly Thr Gin Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gin 195 200 205
Met Ile Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gin Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg 210 215 220
Thr Arg lie Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile 225 230 235 240
Thr Leu Glu Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala lie Gin Glu Ser 245 250 255
Asn Gin Gly Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gin Leu Gin Arg Arg Asn Gly 260 265 270
Ser Lys Phe Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala 275 280 285
Leu Met Val Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gin Phe Ser Leu 82 201235469 290 295 300 ^ Leu lie Arg Pro Val Val Pro Asn Phe Asn Ala Asp Val Cys Met Asp 305 310 315 320
Pro Glu Pro lie Val Arg lie Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp 325 330 335 - Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn Ala tie Gin Leu Trp Pro 340 345 350
Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gin Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp 355 360 365 ' Asn Thr lie Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser 370 375 380
Pro Gly Val Tyr Val Met lie Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp 385 390 395 400
Ala Thr Arg Trp Gin lie Trp Asp Asn Gly Thr lie lie Asn Pro Arg 405 410 415
Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr Thr Leu 420 425 430
Thr Val Gin Thr Asn lie Tyr Ala Val Ser Gin Gly Trp Leu Pro Thr 435 440 445
Asn Asn Thr Gin Pro Phe Val Thr Thr lie Val Gly Leu Tyr Gly Leu 450 455 460
Cys Leu Gin Ala Asn Ser Gly Gin Val Trp lie Glu Asp Cys Ser Ser 465 470 475 480
Glu Lys Ala Glu Gin Gin Trp Ala Leu Tyr Ala Asp Gly Ser lie Arg 485 490 495
Pro Gin Gin Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr Ser Asp Ser Asn lie Arg 500 505 510
Glu Thr Val Val Lys lie Leu Ser Cys Gly Pro Ala Ser Ser Gly Gin 515 520 525
Arg Trp Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr He Leu Asn Leu Tyr Ser Gly 530 535 540
Leu Val Leu Asp Val Arg Xaa Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gin lie lie 545 550 555 560
Leu Tyr Pro Leu His Gly Asp Pro Asn Gin lie Trp Leu Pro Leu Phe 565 570 575 <210> 165 <211> 290 <212> PRT <213>歐洲甜瓜 <220> <223>拜歐丁 I變體 <220> <221>變體 <222> 212 <223> Xaa= Glu或Lys <400> 165
Met lie Lys Leu Leu Val Leu Trp Leu Leu lie Leu Thr lie Phe Leu 15 10 15
Lys Ser Pro Thr Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala 20 25 30
Thr Thr Thr Ser Tyr Gly Val Phe lie Lys Asn Leu Arg Glu Ala Leu 35 40 45
Pro Tyr Glu Arg Lys Val Tyr Asn lie Pro Leu Leu Arg Ser Ser lie 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Tyr Thr Leu Leu His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Glu Thr lie Ser Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr He Met Gly 85 90 95
Tyr Leu Ala Gly Asp Val Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr 100 105 110
Glu Ala Ala Lys Phe Vat Phe Lys Asp Ala Lys Lys Lys Val Thr Leu 115 120 125
Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gin Thr Ala Ala Gly Lys He 130 135 140
Arg Glu Asn Tie Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala lie Thr 145 150 155 160
Thr Leu Tyr Tyr Tyr Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ala Leu Leu Val 165 170 175
Leu lie Gin Ser Thr Ala Glu Ser Ala Arg Tyr Lys Phe lie Glu Gin 180 185 190 83 201235469
Gin lie Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Thr 195 200 205 lie Ser Leu Xaa Asn Asn Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gin lie Gin lie 210 215 220
Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gin Phe Glu Ser Pro Val Val Leu lie Asp 225 230 235 240
Gly Asn Asn Gin Arg Val Ser lie Thr Asn Ala Ser Ala Arg Val Val 245 250 255
Thr Ser Asn lie Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn lie Ala Ala lie 260 265 270
Gly Glu Asp lie Ser Met Thr Leu lie Gly Phe Glu His Gly Leu Tyr 275 280 285
Gly lie 290 <210> 166 <211> 289 <212> PRT <213>栝樓 <220> <223>天花粉蛋白變體 <220> <221>變體 <222> 87 <223> Xaa= lie或Leu <220> <221>變體 <222> 196 <223〉 Xaa= Lys或Ser <220> <221>變體 <222> 231 <223〉 Xaa= Gin或Thr <220> <221>變體 <222> 234 <》23> Xaa= Ser或Thr <220> <221>變體 <222> 247 <223> Xaa= Thr或Met <400> 166
Met I le Arg Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu lie Leu Thr Leu Phe Leu 15 10 15
Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala 20 25 30
Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe lie Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu 35 40 45
Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp lie Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu 50 55 60
Pro Gly Ser Gin Arg Tyr Ala Leu lie His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Glu Thr lie Ser Val Ala Xaa Asp Val Thr Asn Val Tyr lie Met Gly 85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr 100 105 110
Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu 115 120 125
Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gin Thr Ala Ala Gly Lys lie 130 135 140
Arg Glu Asn lie Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala lie Thr 145 150 155 160
Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val 165 170 175
Leu He Gin Ser Thr Ser Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe lie Glu Gin 180 185 190 84 201235469
Gin lie Gly Xaa Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala lie • 195 200 205 lie Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gin lie Gin lie 210 215 220
Ala Ser Thr Asn Asn Gly Xaa Phe Glu Xaa Pro Val Val Leu lie Asn - 225 230 235 240
Ala Gin Asn Gin Arg Val Xaa lie Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val 245 250 255
Thr Ser Asn Me Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met ' 260 265 270
Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gin Ser Phe Gly Cys Gly Ser Tyr Ala 275 280 285 lie <210> 167 <211> 528 <212> PRT <213>相思豆 <220> <223>相思豆毒素變體 <220> <221 >變體 <222> l <223〉 Xaa= Gin或Glu <220> <221>變體 <222> 200 <223> Xaa= Asn或Pro <220> <221>變體 <222> 298 <223> Xaa= Asn^Tyr <220> <221>變體 <222> 427 ' <223> Xaa= Met或Leu <220> <221>變體 <222> 467 <223> Xaa= Thr或Pro <220> <221>變體 <222> 483 <》23> Xaa= Val或Leu <400> 167
Xaa Asp Arg Pro lie Lys Phe Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gin Ser 15 10 15
Tyr Lys Gin Phe lie Glu Ala Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu 20 25 30 lie His Asp lie Pro Val Leu Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gin Glu Arg 35 40 45
Asn Arg Tyr lie Thr Val Glu Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser lie 50 55 60
Glu Val Gly lie Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala 65 70 75 80
Gly Thr Gin Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp 85 90 95
Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gin His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr 100 105 110
Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala His Gin Ser Arg Gin Gin lie Pro 115 120 125
Leu Gly Leu Gin Ala Leu Thr His Gly lie Ser Phe Phe Arg Ser Gly 130 135 140
Gly Asn Asp Asn Glu Glu Lys Ala Arg Thr Leu He Val lie lie Gin 145 150 155 160
Met Val Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr lie Ser Asn Arg Val Arg 85 201235469 165 170 175
Val Ser lie Gin Thr Gly Thr Ala Phe Gin Pro Asp Ala Ala Met lie 180 185 190
Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Xaa Leu Ser Arg Gly Val Gin Glu Ser 195 200 205
Val Gin Asp Thr Phe Pro Asn Gin Val Thr Leu Thr Asn lie Arg Asn 210 215 220
Glu Pro Val lie Val Asp Ser Leu Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu 225 230 235 240
Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn Pro Pro Asn Ala Asa Gin Ser Pro 245 250 255
Lea Leu lie Arg Ser lie Val Glu Lys Ser Lys lie Cys Ser Ser Arg 260 265 270
Tyr Glu Pro Thr Val Arg lie Gly Gly Arg Asp Gly Met Cys Val Asp 275 280 285
Val Tyr Asp Asn Gly Tyr His Asn Gly Xaa Arg lie lie Met Trp Lys 290 295 300
Cys Lys Asp Arg Leu Glu Glu Asn Gin Leu Trp Thr Leu Lys Ser Asp 305 310 ' 315 320
Lys Thr lie Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ala 325 330 335
Pro Gly Ser Tyr Val Met lie Tyr Asp Cys Thr Ser Ala Val Ala Glu 340 345 350
Ala Thr Tyr trp Glu lie Trp Asp Asn Gly Thr lie lie Asn Pro Lys 355 360 365
Ser Ala Leu Val Leu Ser Ala Glu Ser Ser Ser Met Gly Gly Thr Leu 370 375 380
Thr Val Gin Thr Asn Glu Tyr Leu Met Arg Gin Gly Trp Arg Thr Gly 385 390 395 400
Asn Asn Thr Ser Pro Phe Val Thr Ser lie Ser Gly Tyr Ser Asp Leu 405 410 415
Cys Met Gin Ala Gin Gly Ser Asn Val Trp Xaa Ala Asp Cys Asp Ser 420 425 430
Asn Lys Lys Glu Gin Gin Trp Ala Leu Tyr Thr Asp Gly Ser lie Arg 435 440 445
Ser Val Gin Asn Thr Asn Asn Cys Leu Thr Ser Lys Asp His Lys Gin 450 455 460
Gly Ser Xaa He Leu Leu Met Gly Cys Ser Asn Gly Trp Ala Ser Gin 465 470 475 480
Arg Trp Xaa Phe Lys Asn Asp Gly Ser lie Tyr Ser Leu Tyr Asp Asp 485 490 495
Met Val Met Asp Val Lys Gly Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gin lie lie 500 505 510
Leu Trp Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Asn Gin lie Trp Leu Thr Leu Phe 515 520 525 <210> 168 <211> 278 <212> PRT <213>紫茉莉 <220> <223> MAP變體 <220> <221>變體 <222> 35 <223> Xaa= lie或Leu <220〉 <221>變體 <222> 58 <223> Xaa= Ala或Val <220> <221>變體 <222> 180 <223> Xaa= Val或Cys <220> <221>變體 <222> 218: <223> Xaa= Asp或Gly <400> 168 86 201235469
Met Leu Thr Thr Thr Lys Val Phe Phe Leu Leu Leu Thr Thr Trp lie . 15 10 15
Thr Trp Tyr Ala lie Val Asn Pro Gin Ser Arg Ala Ala Pro Thr Leu 20 25 30
Glu Thr Xaa Ala Ser Leu Asp Leu Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Leu Ser - 35 40 45
Phe lie Thr Asn lie Arg Thr Lys Val Xaa Asp Lys Thr Glu Gin Cys 50 55 60
Thr ile Gin Lys lie Ser Lys Thr Phe Thr Gin Arg Tyr Ser Tyr lie ' 65 Ί0 75 80
Asp Leu lie Val Ser Ser-Thr Gin Lys Ile Thr Leu Ala Ile Asp Met 85 90 95
Ala Asp Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Ser Asp Ile Ala Asn Asn Lys Gly 100 105 110
Arg Ala Phe Phe Phe Lys Asp Val Thr Glu Ala Val Ala Asn Asn Phe 115 120 125
Phe Pro Gly Ala Thr Gly Thr Asn Arg Ile Lys Leu Thr Phe Thr Gly 130 135 140
Ser Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Asn Gly Gly Leu Arg Lys Asp Asn Pro 145 150 155 160
Leu Gly lie Phe Arg Leu Glu Asn Ser Ile Val Asn Ile Tyr Gly Lys 165 170 175
Ala Gly Asp Xaa Lys Lys Gin Ala Lys Phe Phe Leu Leu Ala Ile Gin 180 185 190
Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Ser Asp Lys Ile Pro 195 200 205
Ser Glu Lys Tyr Glu Glu Val Thr Val Xaa Glu Tyr Met Thr Ala Leu 210 215 220
Glu Asn Asn Trp Ala Lys Leu Ser Thr Ala Val Tyr Asn Ser Lys Pro 225 230 235 240
Ser Thr Thr Thr Ala Thr Lys Cys Gin Leu Ala Thr Ser Pro Val Thr 245 250 255 lie Ser Pro Trp Ile Phe Lys Thr Val Glu Glu Ile Lys Leu Val Met 260 265 270
Gly Leu Leu Lys Ser Ser 275 <210> 169 <211> 563 <212> PRT <213>西洋接骨木 <220> <223>尼格林b變體 <220> <221>變體 <222> 39 <也> Xaa= Lys或Val <400> 169
Met Arg Val Val Ala Ala Ala Met Leu Tyr Phe Tyr Ile Val Val Leu 15 10 15
Ala lie Cys Ser Val Gly Ile Gin Gly lie Asp Tyr Pro Ser Val Ser 20 25 30
Phe Asn Leu Asp Gly Ala Xaa Ser Ala Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Ser 35 40 45
Asn Leu Arg Lys Thr Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu 50 55 60
Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gin Val Lys Ser Arg Phe Val 65 70 75 80
Leu Val Pro Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Val Thr Leu Ala Val 85 90 95
Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Phe Ser Gly Asn Ala Asn Ser 100 105 110
Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Val Gin Lys Ser Asn Leu Phe Val 115 120 125
Gly Thr Lys Gin Asn Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu 130 135 140
Glu Thr Ala Ala Asn Thr Arg Arg Glu Ser Ile Glu Leu Gly Pro Ser 145 150 155 160
Pro Leu Asp Gly Ala Ile Thr Ser Leu Tyr His Gly Asp Ser Val Ala 165 170 175
Arg Ser Leu Leu Val Val Ile Gin Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe 180 185 190 87 201235469
Arg Tyr lie Glu Gin Glu Val Arg Arg Ser Leu Gin Gin Ala Thr Ser 195 200 205
Phe Thr Pro Asn Ala Leu Met Leu Ser Met Glu Asn Asn Trp Ser Ser 210 215 220
Met Ser Leu Glu He Gin Gin Ala Gly Asn Asn Val Ser Pro Phe Phe 225 230 235 240
Gly Thr Val Gin Leu Leu Asn Tyr Asp His Thr His Arg Leu Val Asp 245 250 255
Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys lie Thr Gly lie Ala lie Leu Leu Phe 260 265 270
Arg Cys Ser Ser Pro Ser Asn Asp Asn Ala He Arg Met Pro Leu Asp 275 280 285
Leu Ala Gly Glu Asp Asn Lys Tyr Asn Asp Gly Glu Thr Cys Thr Leu 290 295 300
Arg Thr Ser Phe Thr Arg Asn lie Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys Val 305 310 315 320
Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr. Pro Leu Gin Leu Trp 325 330 335
Pro Cys Gly Thr Gin Arg Asn Gin Arg Trp Thr Phe Asp Ser Asp Asp 340 345 350
Thr He Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn Asn 355 360 365
Gly Ser Asn lie Val lie Phe Asn Cys Ser Thr Ala Ala Glu Asn Ala 370 375 380 lie Lys Trp Glu Val Pro lie Asp Gly Ser lie lie Asn Pro Ser Ser 385 390 395 400
Gly Leu Val Met Thr Ala Pro Arg Ala Ala Ser Arg Thr lie Leu Leu 405 410 415
Leu Glu Asp Asn lie Tyr Ala Ala Ser Gin Gly Trp Thr Val Thr Asn 420 425 430
Asn Val Lys Pro lie Val Ala Ser He Val Gly Tyr Lys Glu Met Cys 435 440 445
Leu Gin Ser Asn Gly Glu Asn Asn Gly Val Trp Met Glu Asp Cys Glu 450 455 460
Ala Thr Ser Leu Gin Gin Gtn Trp Ala Leu Tyr Gly Asp Arg Thr lie 465 470 475 480
Arg Val Asn Ser Thr Arg Gly Leu Cys Val Thr Thr Asn Gly Tyr Asn 485 490 495
Ser Lys Asp Leu lie lie lie Leu Lys Cys Gin Gly Leu Pro Ser Gin 500 505 510
Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ala lie Val Asn Pro Lys Ser Arg 515 520 525
His Val Met Asp Val Arg Ala Ser Asn Val Ser Leu Arg Glu lie lie 530 535 540 lie Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gin Gin Trp Val Thr Gin Val 545 550 555 560
Leu Pro Ser <210> 170 <211> 99 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MCP-1 變體 <220> <221>變體 <222> 26 <223〉 Xaa= Asp或Ala <220〉 <221>變體 <222> 28 <223> Xaa= lie或Ala <220> <221>變體 <222> 29 <223〉 Xaa= Asn或Ala <220> <221>變體 <222> 31 88 201235469 <223>Xaa=Prc^Ala '<220> <221>變體 <222> 32 - <223> Xaa= Val, Ala或Glu '<220> <221>變體 - <222> 33 <223> Xaa= Thr, AlagoGlu <220> <221>變體 <222> 36 <223> Xaa= Tyr或Ala <220> <221>變體 <222> 47 <223> Xaa= Arg或Phe <220> <221>變體 <222> 50 <223> Xaa= Ser或Gin <220> <221>變體 <222> 51 <223〉 Xaa= Tyr或Asp <220> <221>變體 <222> 53 <223> Xaa= Arg或Leu <220> <22丨> 變體 <222> 79 <223>Xaa=LysSAla <220> <221>變體 <222> 81 <223> Xaa= Lys或Ala <220> <221>變體 <222> 89 <223〉 Xaa= His或Ala <220> <221>變體 <222> 91 <223> Xaa= Asp或Leu <400> 170
Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu lie Ala Ala Thr 15 10 15
Phe lie Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Xaa Ala Xaa Xaa Ala Xaa Xaa 20 25 30
Xaa Cys Cys Xaa Asn Phe Thr Asn Arg Lys lie Ser Val Gin Xaa Leu 35 40 45
Ma Xaa Xaa Arg Xaa lie Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val 50 55 60 lie Phe Lys Thr lie Val Ala Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Xaa Gin
65 70 75 SO
Xaa Trp Val Gin Asp Ser Met Asp Xaa Leu Xaa Lys Gin Thr Gin Thr 85 90 95
Pro Lys Thr <210> 171 <211> 97 89 201235469 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>嗜酸球趨化蛋白變體 <220> <221>變體 <222> 7 <223> Xaa= Leu或Pro <220> <221>變體 <222> 23 <223> Xaa= Ala或Thr <220> <221 >變體 <222> 51 <223〉 Xaa= Arg或Ser <220> <221>變體 <222> 79 <223> Xaa= Lys或Arg <400> 171
Met Lys Val Ser Ala Ala Xaa Leu Trp Leu Leu Leu He Ala Ala Aia 15 10 15
Phe Ser Pro Gin Gly Leu Xaa Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys 20 25 30
Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys lie Pro Leu Gin Arg Leu Glu Ser 35 40 45
Tyr Arg Xaa lie Thr Ser Gly Lys Cys Pro Gin Lys Ala Val lie Phe 50 55 60
Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp lie Cys Ala Asp Pro Lys Lys Xaa Trp 65 70 75 80
Val Gin Asp Ser Met Lys Tyr Leu Asp Gin Lys Ser Pro Thr Pro Lys 85 90 95
Pro <210> 172 <211> 92 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>則卩-1-變體 <220> <221>變體 <222> 6 <223> Xaa= Thr或Cys <220> <22丨> 變體 <222> 15 <220> <221>變體 <222> 56 <223> j(aa= Ser或Ile <220> <221>變體 <222> 70 <223> Xaa= Ser或Gly <220> <221>變體 <222> 80 <223> Xaa= Ser或Thr 90 201235469 <400> 172 • Met Lys Leu Cys Val Xaa Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Xaa Ala 15 10 15
Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr 20 25 30 -Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val 35 40 45
Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Xaa Leu Cys Ser Gin Pro Ala Val Val 50 55 60 ' Phe Gin Thr Lys Arg Xaa Lys Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Xaa 65 70 75 80
Trp Val Gin Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn 85 90 <210> 173 <211〉 99 <212> PITT <213>智慧人 <220> <223> [L-8變體 <220> <221>變體 <222> 53 <223> Xaa= Arg或Leu <400〉 173
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu lie Ser 15 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 20 25 30
Arg Cys Gin Cys lie Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe 35 40 45
Ue Lys Glu Leu Xaa Val lie Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr 50 55 60
Glu lie Me Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro 65 70 75 80
Lys Glu Asn Trp Val Gin Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala 85 90 95
Glu Asn Ser <210> 174 <211> 98 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>1卩-10變體 <220> <221>變體 <222> 93 <223> Saa= Arg或Met <400> 174
Met Asn Gin Thr Ala lie Leu lie Cys Cys Leu lie Phe Leu Thr Leu 15 10 15
Ser Gly lie Gin Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys 20 25 30 lie Ser lie Ser Asn Gin Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu 35 40 45
Glu He lie Pro Ala Ser Gin Phe Cys Pro Arg Val Glu He lie Ala 50 55 60
Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys 65 70 75 80
Ala lie Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Xaa Ser Lys Arg 85 90 95
Ser Pro <210> 175 201235469 <2Π> 99 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MCP-3變體 <220> <221>變體 <222> 30 <223> Xaa= Thr或Lys <400> 175
Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala 15 10 15
Phe Ser Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Val Gly lie Asn Xaa Ser Thr 20 25 30
Thr Cys Cys Tyr Arg Phe lie Asn Lys Lys lie Pro Lys Gin Arg Leu 35 40 45
Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val 50 55 60 lie Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Thr Gin 65 70 75 80
Lys Trp Val Gin Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gin Thr 85 90 95
Pro Lys Leu <210> 176 <211> 96 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MIP.3-alpha變體 <220> <221>變體 <222> 47 <223> Xaa= Val或Met <400> 176
Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu l 5 10 15
Leu Leu His-Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys 20 25 30
Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg lie Leu His Pro Lys Phe lie Xaa Gly 35 40 45
Phe Thr Arg Gin Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp lie Asn Ala lie lie 50 55 60
Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gin Thr 65 70 75 80
Trp Val Lys Tyr lie Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met 85 90 95 <210> 177 <2Π> 92 <212> PRT <2丨3>智慧人 <220> <223> MIF>-l-alpl^a變體 <220> <221>變體 <222> 40 <223> Xaa= Arg^AIa <220> <221>變體 <222> 49 <223> Xaa= Asp或Ala 92 <220> 201235469 <221 >變體 * <222> 68 <223〉 Xaa= Arg或Ala <220> -<221>變體 <222> 70 "<220> <221>變體 <222> 89 <223>父33=0111或八13 <400> 177
Met Gin Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 15 10 15
Leu Cys Asn Gin Phe Ser Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala 20 25 30
Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Xaa Gin lie Pro Gin Asn Phe He Ala 35 40 45
Xaa Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly Val lie Phe 50 55 60
Leu Thr Lys Xaa Ser Xaa Gin Va! Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp 65 70 75 80
Va] Gin Lys Tyr Val Ser Asp Leu Xaa Leu Ser Ala 85 90 <210> 17S <211> 101 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> PF-4變體 <220> <221>變體 <222> 78 <223> Xaa= Asn或Asp <400> 丨78
Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe 15 10 15
Leu Gl.y Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu 20 25 30
Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gin Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser 35 40 45
Gin Val Arg Pro Arg His lie Thr Ser Leu Glu Val lie Lys Ala Gly 50 55 60
Pro His Cys Pro Thr Ala Gin Leu lie Ala Thr Leu Lys Xaa Gly Arg 65 70 75 80
Lys He Cys Leu Asp Le\i Gin Ala Pro Leu Tyr Lys Lys lie lie Lys 85 90 95
Lys Leu Leu Glu Ser 100 <210> 179 <211> 104 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> PF-4 varl變體 <220> <221>變體 <222> 77 <223> Xaa= /Ua或Ser <400> 179
Met Ser Ser Ala Ala Arg Ser Arg Leu Thr Arg Ala Thr Arg Gin Glu 15 10 15
Met Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Pro Val Val Val Ala Phe Ala 93 201235469 20 25 30
Arg Ala Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gin Cys Leu Cys Val Lys 35 40 45
Thr Thr Ser Gin Val Arg Pro Arg His lie Thr Ser Leu Glu Val lie 50 55 60
Lys Ala Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gin Leu lie Xaa Thr Leu Lys 65 70 75 80
Asn Gly Arg Lys lie Cys Leu Asp Leu Gin Ala Leu Leu Tyr Lys Lys 85 90 95 lie lie Lys Glu His Leu Glu Ser 100 <210> 180 <211> 211 <212> PRT <2丨3>智慧人 <220> <223> SDF-2變體 <220> <221>變體 <222> 51 <223> Xaa= Ser或Gly <220> <221>變體 <222> 74 <223> Xaa= Arg或Gly <220> <221 >變體 <222> 119 <223> Xaa= Thr或Ser <400> 180
Met Ala Val Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Trp Ser Ala Val 15 10 15
Gly Ala Ser Ser Leu Gly Val Val Thr Cys Gly Ser Val Val Lys Leu 20 25 30
Leu Asn Thr Arg His Asn Val Arg Leu His Ser His Asp Val Arg Tyr 35 40 45
Gly Ser Xaa Ser Gly Gin Gin Ser Val Thr Gly Val Thr Ser Val Asp 50 55 60
Asp Ser Asn Ser Tyr Trp Arg lie Arg Xaa Lys Ser Ala Thr Val Cys 65 70 75 80
Glu Arg Gly Thr Pro lie Lys Cys Gly Gin Pro lie Arg Leu Thr His 85 90 95
Val Asn Thr Gly Arg Asn Leu His Ser His His Phe Thr Ser Pro Leu 100 · 105 110
Ser Gly Asn Gin Glu Val Xaa Ala Phe Gly Glu Glu Gly Glu Gly Asp 115 120 125
Tyr Leu Asp Asp Trp Thr Val Leu Cys Asn Gly Pro Tyr Trp Val Arg 130 135 140-
Asp Gly Glu Val Arg Phe Lys His Ser Ser Thr Glu Val Leu Leu Ser 145 150 155 160
Val Thr Gly Glu Gin Tyr Gly Arg Pro lie Ser Gly Gin Lys Glu Val 165 170 175
His Gly Met Ala Gin Pro Ser Gin Asn Asn Tyr Trp Lys Ala Met Glu 180 185 190
Gly lie Phe Met Lys Pro Ser Glu Leu Leu Lys Ala Glu Ala His His 195 200 205
Ala Glu Leu 210 <210> 181 <211> 99 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MCP-2變體 94 <220> 201235469 <221>變體 -<222> 69 -<223〉 Xaa= Lys或Gin <400> 181 一 Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr 15 10 15
Phe Ser Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Asp Ser Val Ser lie Pro lie 20 25 30 * Thr Cys Cys Phe Asn Val ile Asn Arg Lys lie Pro lie Gin Arg Leu 35 40 45
Glu Sei· Tyr Thr Arg lie Thr Asn Ile Gin Cys Pro Lys Glu Ala Val 50 55 60
Ile Phe Lys Thr Xaa Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu 65 70 75 80
Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gin Ile Phe Gin Asn 85 90 95
Leu Lys Pro <210> 182 <21I> 113 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> MIP-5變體 <220> <221>變體 <222> 14 <223〉 Xaa= Val或Ile <220> <221>變體 <222> 24 <223> Xaa= Ile或Thr <400> 182
Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Xaa Ala Val 15 10 15
Leu Gly Ser Gin Ala Gin Phe Xaa Asn Asp Ala Glu Thr Glu Leu Met 20 25 30
Mel Ser Lys Leu Pro Leu Giu Asn Pro Val Val Leu Asn Ser Phe His 35 40 45
Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gin Ser Ile Pro Cys 50 55 60
Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro 65 70 75 80
Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gin Val Cys Ala Lys Pro 85 90 95
Ser Gly Pro Gly Val Gin Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser 100 105 110
Ile <210> 183 <2Π> 119 <212> PRT <2】3>智慧人 <220> <223>嗜酸球趨化蛋白-2變體 <220> <221>變體 <222> 29 <223> Xaa= lie或Leu <220> <221>變體 <222> 61 <223>心3=八13或61丫 95 201235469 <220> <221>變體 <222> 73 <223〉 Xaa= Phe或Ser <400> 183
MeE Ala Gly Leu Met Thr lie Va! Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gly Val 15 10 15
Cys Ala His His lie He Pro Thr Gly Ser Val Val Xaa Pro Ser Pro 20 25 30
Cys Cys Met Phe Phe Val Ser Lys Arg He Pro Glu Asn Arg Val Val 35 40 45
Ser Tyr Gin Leu Ser Ser Arg Ser Thr Cys Leu Lys Xaa Gly Val lie 50 55 60
Phe Thr Thr Lys Lys Gly Gin Gin Xaa Cys Gly Asp Pro Lys Gin Glu 65 70 75 80
Trp Val Gin Arg Tyr Met Lys Asn Leu Asp Ala Lys Gin Lys Lys Ala 85 90 95
Ser Pro Arg Ala Arg Ala Val Ala Val Lys Gly Pro Val Gin Arg Tyr 100 105 110
Pro Gly Asn Gin Thr Thr Cys 115 <210> 184 <211> 116 <212> PRT <213>小鼠 <220> <223> CIO變體 <220> <221>變體 <222> 43 <223> Xaa= Phe或Val <220> <221>變體 <222> 93 <223> Xaa= Ser或Arg <220> <221>變體 <222> 111 <223> Xaa= Gly或Arg <400> 184
Met Arg Asn Ser Lys Thr Ala lie Ser Phe Phe lie Leu Val Ala Val 15 10 15
Leu Gly Ser Gin Ala Gly Leu lie Gin Glu Met Glu Lys Glu Asp Arg 20 25 30
Arg Tyr Asn Pro Pro lie lie His Gin Gly Xaa Gin Asp Thr Ser Ser 35 40 45
Asp Cys Cys Phe Ser Tyr Ala Thr Gin lie Pro Cys Lys Arg Phe lie 50 55 60
Tyr Tyr Phe Pro Thr Sei· Gly Gly Cys lie Lys Pro Gly lie lie Phe 65 70 75 80 lie Ser Arg Arg Gly Thr Gin Val Cys Ala Asp Pro Xaa Asp Arg Arg 85 90 95
Val Gin Arg Cys Leu Ser Thr Leu Lys Gin Gly Pro Arg Ser Xaa Asn 100 105 110
Lys Val Ile Aia 115 <210> 185 <211> 122 <212> PRT <213>小鼠 <220> <223> MIP-1-gamma變體 <220> <221>變體 96 201235469 <222> 113 .‘ <223〉Xaa= Gin或Lys <400> 185
Met Lys Pro Phe His Thr Ala Leu Ser Phe Leu lie Leu Thr Thr Ala - 15 10 15
Leu Gly He Trp Ala Gin lie Thr His Ala Thr Glu Thr Lys Glu Val 20 25 30
Gin Ser Ser Leu Lys Ala Gin Gin Gly Leu Glu lie Glu Met Phe His * 35 40 45
Met Gly Phe Gin Asp Ser Ser Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Asn Ser Arg 50 55 60 lie Gin Cys Ser Arg Phe lie Gly Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys 65 70 75 80
Thr Arg Pro Gly lie lie Phe lie Ser Lys Arg Gly Phe Gin Val Cys 85 90 95
Ala Asn Pro Ser Asp Arg Arg Val Gin Arg Cys lie Glu Arg Leu Glu 100 105 110
Xaa Asn Ser Gin Pro Arg Thr Tyr Lys Gin 115 120 <210> 186 <211> 120 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>(^卩-3變體 <220> <221 >變體 <222> 106 <223〉 Xaa= Met或Val <400> 186
Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala 15 10 15
Leu Gly Ser Gin Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met 20 25 30
Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His 35 40 45
Ma Thr Ser Ala Asp Cys Cys lie Ser Tyr Thr Pro Arg Ser lie Pro 50 55 60
Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys 65 70 75 80
Pro Gly Val lie Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn 85 90 95
Pro Ser Asp Lys Gin Val Gin Val Cys Xaa Arg Met Leu Lys Leu Asp 100 105 110'
Thr Arg lie Lys Thr Arg Lys Asn 115 120 <210> 187 <211> 112 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> CTACK變體 <220> <221>變體 <222> 78 <223> Xaa= lie或Val <220> <221>變體 <222> 96 <223> Xaa= Leu^Phe <400〉 187
Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 15 10 15
Leu Ser Pro Asp Pro Tlir Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala 97 201235469 20 25 30
Cys Cys Thr Gin Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg 35 40 45
Lys Val lie Gin Val Glu Leu Gin Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu 50 55 60 G!n Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gin Arg Ser lie Cys Xaa His Pro 65 70 75 80
Gin Asn Pro Ser Leu Ser Gin Trp Phe Glu His Gin Glu Arg Lys Xaa 85 90 95
His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly 100 105 110 <210> 188 <211> 94 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> I-TAC變體 <220〉 <221>變體 <222> 89 <223>Xaa=Va_la <400> 188
Met Ser Val Lys Gly Met Ala lie Ala Leu Ala Val lie Leu Cys Ala I 5 10 15
Thr Val Val Gin Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys 20 25 30 lie Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp lie Glu Lys Ala 35 40 45
Ser He Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys lie Glu Val lie lie 50 55 60
Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gin Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys 65 70 75 80
Gin Ala Arg Leu lie lie Lys Lys Xaa Glu Arg Lys Asn Phe 85 90 <210> 189 <211> 254 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> SR.PS0X變體 <220> <221>變體 <222> 123 <223> Xaa= lie或Thr <220> <221>變體 <222> 135 <223> Xaa= His或Leu <220> <221>變體 <222> 181 <223> Xaa= Val或Ala <220> <221>變體 <222> 222 <223> Xaa= Leu或Pro <400> 189
Met Gly Arg Asp Leu Arg Pro Gly Ser Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15
Leu Leu Leu Leu Val Tyr Leu Thr Gin Pro Gly Asn Gly Asn Glu Gly 20 25 30
Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys Gly Lys Arg lie Ser Ser Asp Ser 35 40 45 98 201235469
Pro Pro Ser Val Gin Phe Met Asn Arg Leu Arg Lys His Leu Arg Ala - 50 55 60
Tyr His Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Gin Leu Leu Ser Trp Ser 65 70 75 80
Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro Trp Val Gin Glu Leu Met Ser Cys - 85 90 95
Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His Ala Tyr Ser Gly lie Val Ala His 100 105 110
Gin Lys His Leu Leu Pro Thr Ser Pro Pro Xaa Ser Gin Ala Ser Glu - 115 120 125
Gly Ala Ser Ser Asp lie Xaa Thr Pro Ala Gin Met Leu Leu Ser Thr 130 135 140
Leu Gin Ser Thr Gin Arg Pro Thr Leu Pro Val Gly Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160
Asp Lys Glu Leu Thr Arg Pro Asn Glu Thr Thr lie His Thr Ala Gly 165 170 175
His Ser Leu Ala Xaa Gly Pro Glu Ala Gly Glu Asn Gin Lys Gin Pro 180 185 190
Glu Lys Asn Ala Gly Pro Thr Ala Arg Thr Ser Ala Thr Val Pro Val 195 200 205
Leu Cys Leu Leu Ala lie He Phe lie Leu Thr Ala Ala Xaa Ser Tyr 210 215 220
Val Leu Cys Lys Arg Arg Arg Gly Gin Ser Pro Gin Ser Ser Pro Asp 225 230 235 240
Leu Pro Val His Tyr lie Pro Val Ala Pro Asp Ser Asn Thr 245 250 <210> 190 <211> 395 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>人神經趨化蛋白變體 <220> <221>變體 <222> 37 <223> Xaa= Gly或Asp <400> 190
Met Ala Pro Ser Pro Leu Ala Trp Leu Leu Arg Leu Ala Ala Phe Phe 15 10 15
His Leu Cys Thr Leu Leu Pro Gly Gin His Leu Gly Met Thr Lys Cys 20 25 30
Glu lie Met Cys Xaa Lys Met Thr Ser Arg lie Pro Val Ala Leu Leu 35 40 45
He Arg Tyr Gin Leu Asn Gin Glu Ser Cys Gly Lys Arg Ala lie Val 50 55 60
Leu Glu Thr Thr Gin His Arg Arg Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys
65 70 75 SO
Trp Val Gin Asp Ala Met Lys His Leu Asp His Gin Ala Ala Ala Leu 85 90 95
Thr Lys Asn Gly Gly Lys Phe Glu Lys Arg Val Asp Asn Val Thr Pro 100 105 110
Gly lie Thr Leu Ala Thr Arg Gly Leu Ser Pro Ser Ala Leu Thr Lys 115 120 125
Pro Glu Ser Ala Thr Leu Glu Asp Leu Ala Leu Glu Leu Thr Thr lie 130 135 140
Ser Gin Glu Ala Arg Gly Thr Met Gly Thr Ser Gin Glu Pro Pro Ala 145 150 155 160
Ala Val Thr Gly Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Ala Gin Asp Ala Gly 165 170 175
Leu Thr Ala Lys Pro Gin Ser lie Gly Ser Phe Glu Ala Ala Asp lie 180 185 190
Ser Thr Thr Val Trp Pro Ser Pro Ala Val Tyr Gin Ser Gly Ser Ser 195 200 205
Ser Trp Ala Glu Glu Lys Ala Thr Glu Ser Pro Ser Thr Thr Ala Pro 2i〇 215 220
Ser Pro Gin Val Ser Thr Thr Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Val 225 230 235 240
Gly Ser Glu Gly Gin Pro Pro Trp Val Gin Gly Gin Asp Leu Ser Pro 245 250 255
Glu Lys Ser Leu Gly Ser Glu Glu lie Asn Pro Val His Thr Asp Asn 260 265 270 99 201235469
Phe Gin Glu Arg Gly Pro Gly Asn Thr Val His Pro Ser Val Ala Pro 275 280 285 lie Ser Ser Glu Glu Thr Pro Ser Pro Glu Leu Val Ala Ser Gly Ser 290 295 300
Gin Ala Pro Lys Me Glu Glu Pro lie His Aia Thr Ala Asp Pro Gin 305 310 315 320
Lys Leu Ser Val Leu lie Thr Pro Val Pro Asp Thr Gin Ala Ala Thr 325 330 335
Arg Arg Gin Aia Val Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys 340 345 350
Leu Gly Val Ala Met Phe Ala Tyr Gin Ser Leu Gin Gly Cys Pro Arg 355 360 365
Lys Met Ala Gly Glu Met Val Glu Gly Leu Arg Tyr Val Pro Arg Ser 370 375 380
Cys Gly Ser Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Val 385 390 395 <210> 191 <211> 93 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> LD78-變體 <220> <221>變體 <222> 91 <223> Xaa= Leu或Pro <400> 191
Met Gin Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 15 10 15
Leu Cys Asn Gin Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30
Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gin lie Pro Gin Asn Phe lie 35 40 45
Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gin Cys Ser Lys Pro Ser Val lie 50 55 60
Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80
Trp Val Gin Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Xaa Ser Ala 85 90 <210> 192 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400> 192.
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 193 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <220> <221>重覆 <222> (1)...(5) <400> 193
Gly Gly Gly Gly Ser 100 201235469 <210> 194 ^ <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 _ <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400〉 194 • Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 <210> 195 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400> 195
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 196 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400> 196
Giy Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr <210> 197 <2I1> 14 <212> PRT <2Π>人工序列 <220〉 <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400> 197
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 198 <2U> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400> 198
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 15 10 15
Lys Gly <210> 199 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 101 201235469 <400> 199
Clu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe 1 5 10 <210〉 200 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400> 200
Ser Arg Ser Ser Gly <210> 201 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <400> 201
Ser Gly Ser Ser Cys <210> 202 <211> 28 <212> PRT <213>白喉桿菌 <220> <223>白喉毒素胰蛋白酶敏感性肽連接子 <400> 202
Ala Met Gly Arg Ser Gly Gly Gly Cys Ala Gly Asn Arg Val Gly Ser 15 10 15
Ser Leu Ser Cys Gly Gly Leu Asn Leu Gin Ala Met 20 25 <210> 203 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：連接子肽 <220> <221>重稷 <222> (3)...(3) <223>重覆單位2-4次 <220> <221>重覆 <222> (3)...(4) <223>重覆家族Ml次 <400> 203
Ala Met Gly Ser Ala Met <210> 204 <211> 232 <2!2> PRT <213>智慧人 102 <220> 201235469 <223> VEGF-A前驅物（接合變體206) • <400> 204
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15 - Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45 _ Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110
Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys 115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gin Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp 165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys 180 185 190
His Leu Phe Val Gin Asp Pro Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn 195 200 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr 210 215 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 225 230 <210> 205 <211> 215 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-A前驅物（接合變體189) <400> 205
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin He Met Arg He Lys Pro His 100 105 110
Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys 115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gin Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His 165 170 175
Leu Phe Val Gin Asp Pro Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr 180 185 190
Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys 195 200 205
Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 210 215 <210> 206 <211> 209 103 201235469 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-A前驅物（接合變體183) <400> 206
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Me Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110
Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys 115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gin Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Pro 145 150 155 160
Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gin Asp Pro 165 170 175
Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala 180 185 190
Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg 195 200 205
Arg <210〉 207 <211> 191 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223> VEGF-A (接合變體丨65) <400> 207
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110
Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys 115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Asn Pro Cys Gly 130 135 140
Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gin Asp Pro Gin Thr 145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr· Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gin 165 170 175
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 208 <211> 174 <2i2> PRT <2]3>智慧人 104 201235469 w <220> <223〉VEGF4前驅物（接合變體148) <400> 208 - Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 -Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95
Thr Giu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110
Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys 115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Asn Pro Cys Gly 130 135 140
Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gin Asp Pro Gin Thr 145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser·Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Met 165 170 <210> 209 <211> 171 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-A前驅物（接合變體145) <400> 209
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyv lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110
Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys IIS 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gin Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Cys Asp Lys Pro Arg Arg 165 170 <210> 210 <211> 147 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-A前驅物（接合變體121) <400> 210
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 105 201235469 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110
Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys 115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Asn Cys Asp Lys 130 135 140
Pro Arg Arg 145 <210> 211 <211> 207 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-B前驅物（接合變體186) <400> 211
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15
Ala Pro Ala Gin Ala Pro Val Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His Gin 20 25 30
Arg Lys Val Val Ser Trp lie Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gin 35 40 45
Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val 50 55 60
Ala Lys Gin Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gin Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80
Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His Gin 85 90 95
Val Arg Met Gin lie Leu Met He Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu Gly 100 105 110
Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125
Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg 130 135 140
Pro Gin Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro 145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp lie Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala 165 170 175
His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala 180 185 190
Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala 195 200 205 <210> 212 <211> 188 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-B前驅物（接合變體167) <400> 212
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15
Ala Pro Ala Gin Ala Pro Val Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His Gin 20 25 30
Arg Lys Val Val Ser Trp lie Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gin 35 40 45
Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val 50 55 60
Ala Lys Gin Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gin Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80
Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His Gin 85 90 95
Val Arg Met Gin lie Leu Met lie Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu Gly 106 201235469 100 105 110 _ Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125
Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg 130 135 140 - Cys Thr Gin His His Gin Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg 145 150 155 160
Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gin Gly Arg Gly Leu Glu Leu 165 170 175 - Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg 180 185 <210> 213 <211> 419 <212〉 PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-C前驅物 <400> 213
Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala 15 10 15
Aia Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe 20 25 30
Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala 35 40 45
Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gin Leu Arg Ser Val Ser 50 55 60
Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met 65 70 75 80
Tyr Lys Cys Gin Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gin His Asn Arg Glu Gin 85 90 95
Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr lie Lys Phe Ala Ala Ala 100 105 110
His Tyr Asn Thr Glu lie Leu Lys Ser He Asp Asn Glu Trp Arg Lys 115 120 125
Thf Gin Cys Met Pro Arg Glu Val Cys lie Asp Val Gly Lys Glu Phe 130 135 140
Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr 145 150 155 160
Arg Cys Giy Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gin Cys Met Asn Thr 165 170 175
Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu lie Thr Val Pro Leu 180 185 190
Ser Gin Gly Pro Lys Pro Val Thr lie Ser Phe Ala Asn His Thr Ser 195 200 205
Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gin Val His Ser lie 2i〇 215 220 lie Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gin Cys Gin Ala Ala Asn 225 230 235 240
Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His lie Cys Arg Cys 245 250 255
Leu Ala Gin Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser 260 265 270
Thr Asp Gly Phe His Asp lie Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu 275 280 285
Glu Thr Cys Gin Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys 290 295 300
Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gin Cys Val Cys Lys 305 310 315 320
Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gin Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu 325 330 335
Asn Thr Cys Gin Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gin Pro 340 345 350
Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gin Lys 355 . 360 365
Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gin Thr Cys Ser Cys Tyr 370 375 380
Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gin Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser 385 390 395 400
Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro
Gin Met Ser 405 410 415 107 201235469 <210> 214 <211> 354 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> VEGF-D前驅物 <400> 214
Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val 15 10 15
Gin Leu Val Gin Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser 20 25 30
Ser Gin Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gin Gin lie Arg Ala Ala Ser 35 40 45
Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg lie Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu 50 55 60
Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg 65 70 75 80
Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp lie 85 90 95
Glu Thr Leu Lys Val lie Asp Glu Glu Trp Gin Arg Thr Gin Cys Ser 100 105 110
Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr 115 120 125
Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly 130 135 140
Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu lie Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr 145 150 155 160 lie Ser Lys Gin Leu Phe Glu He Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro 165 170 175
Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu 180 185 190
Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser lie lie Arg Arg Ser lie Gin 195 200 205 lie Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro lie 210 215 220
Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gin Glu Glu 225 230 235 240
Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gin Glu Pro Ala 245 250 255
Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val 260 265 270
Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu lie Gin His Pro Lys Asn Cys 275 280 285
Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gin Lys His 290 295 300
Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe 305 310 315 320
His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys 325 330 335
Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gin Gly Pro His Ser Arg Lys 340 345 350
Asn Pro <2I0> 215 <211> 170 <212> PRT .<2Π>智慧人 <220〉 <223>眙盤生長因子前驅物 <400> 215
Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gin Leu Leu Ala Gly 15 10 15
Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gin Gin Trp Ala Leu Ser Ala Gly 20 25 30
Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gin Glu Val Trp Gly 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu 50 55 60 108 201235469
Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu # 65 70 75 80
Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro 85 90 95
Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gin Leu Leu Lys lie Arg Ser Gly - 100 105 110
Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gin His Val Arg Cys 115 120 125
Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro - 130 135 140
Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gin Arg Pro Thr Asp Cys 145 150 155 160
His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg 165 170 <210〉 216 <211> 963 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：構築體編碼趨化因子-毒素融合蛋白質SDF-lbeta-AM-經截短志賀-A1次單元 <220> <221> CDS <222> (1)..(963) <400> 216 aag ccc gtc age ctg age tac aga tgc cca tgc ega ttc ttc gaa age
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 15 10 15 cat gtt gcc aga gcc aac gtc aag cat etc aaa att etc aac act cca
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys lie Leu Asn Thr Pro 20 25 30 aac tgt gcc ctt cag att gta gcc egg ctg aag aac aac aac aga caa
Asn Cys Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gin 35 40 45 gtg tgc att gac ccg aag eta aag tgg att cag gag tac ctg gag aaa
Val Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp He Gin Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 get tta aac aag agg ttc aag atg geg atg aaa gaa ttc acc ctg gac
Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp 65 70 75 80 ttt tcc act gca aaa act tac gtc gat age ctg aat gtg att cgt tcc
Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val lie Arg Ser 85 90 95 geg ate ggt aeg ccg ctg caa aeg att tcc age ggt ggt act tcc etc
Ala He Gly Thr Pro Leu Gin Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu 100 105 110 ctg atg att gat tcc ggt aeg ggt gat aac ttg ttt get gtt gat gtg
Leu Met lie Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Π5 120 125 ege ggc att gac ccg gaa gaa ggc cgt ttt aat aat ctg cgt ctg ate
Arg Gly lie Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu lie 130 135 140 gtc gaa ege aac aac ctg tat gtg aeg ggt ttt gtg aac cgt aeg aac
Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn 145 150 155 160 aac gtc ttc tat cgt ttc get gat ttc tcc cac gta aeg ttt ccg ggc
Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly 165 170 175 109 576 201235469 acc act get gtt act ctg age ggc gat tet tet tat act aeg tta cag
Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gin 180 185 190 cgt gtg get ggt ate age ege act ggt atg caa ate aat ege cat tet
Arg Val Ala Gly lie Ser Arg Thr Gly Met Gin lie Asn Arg His Ser 195 200 205 ctg aeg acc age tat ctg gac tta atg age cat tet ggc acc age ctg
Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu 210 215 220 acc cag tet gtt gee cgt geg atg ctg ege ttc gtg aeg gtc acc gee
Thr Gin Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala 225 230 235 240 gaa gee ctg cgt ttc cgt caa ate caa ege ggc ttc ege acc act tta
Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gin lie Gin Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu 245 250 255 gac gat ctg tet ggc ege age tat gtg atg act gee gaa gat gtc gat
Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp 260 265 270 ctg acc ctg aac tgg ggt ege ttg tet tee gtt ctg ccg; gat tat cac
Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His 275 280 285 ggt cag gat tet gtc cgt gtt ggc cgt ate age ttt ggc tet att aat
Gly Gin Asp Ser Val Arg Val Gly Arg lie Ser Phe Gly Ser lie Asn 290 295 300 gee ate eta ggc tee gtc gca ctg att etc aat tgc cac cac cac get
Ala lie Leu Gly Ser Val Ala Leu lie Leu Asn Cys His His His Ala 305 310 315 320 taa 624 672 720 768 816 864 912 960 963 110

Claims (1)

  1. 201235469 , 七、申請專利範圍： 1 _ 一種挑選經修改核糖體失活蛋白質（RIP)或其活性片 段的方法，其包括： a) 將編碼RIP或其活性片段之核酸分子導入宿主細胞 内； b) 使該細胞生長； c) 分離生長的細胞；並 d) 從生長的細胞中，分離表現Rip或其活性片段的細 胞，其中與由在步驟a)中被導入之核酸分子編碼的相比較， §亥RIP或片段含有修改。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，更包括： e) 鑑認或分離或純化在該經分離細胞中表現的經修改 RIP或其活性片段。 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中使該細胞生 長在不含挑選調節子的培養基中。 4 ·如申請專利範圍第！項之方法，其中該細胞在其中生 長的培養基不含腺嘌呤類似物。 5.如申請專利範圍第4項之方法，其中該腺嘌呤類似物 為4-胺基"比唾并[3,4-d]鳴η定（4-APp)。 、6.如申請專利範圍帛i項之方法，更包括：在步驟〇 或d)之後，擴大該表現RIp的經分離細胞。 7曰如申請專利範圍第1項之方法，其巾㈣其序列或其 刀子量或藉著定序，鑑認該經修改RIP。 8.如申請專利範圍第“戈2項之方法，更包括使在步驟 201235469 b)中的細胞在挑選調節子的存在下生長。 9.如申請專利範圍第8項之方法，其中該挑選調節子為 RIP抑制劑。 1 0‘如申請專利範圍第9項之方法，其中該Rip抑制劑 為腺嘌呤類似物。 11.如申請專利範圍第1〇項之方法，其中該腺嘌呤類似 物為4-胺基α比唑并[3,4_d]嘧啶（4 App)。 1 2 _如申請專利範圍第9項之方法，其中該RIp抑制劑 的濃度為對宿主細胞無毒性的。 13. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該RIp抑制劑 之濃度降低了該RIP對宿主細胞之毒性。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該毒性的抑制 或降低是與沒有該RIP抑制劑相比較，足以增加該RIp表 現的量。 1 5.如申請專利範圍第14項之方法，其中該rip的毒性 被抑制至少 1 %、5 %、1 〇 %、1 5 %、2 0 %、3 0 %、4 0 %、5 0 %、 60%、70%、80%、90%、95%或 1〇〇〇/0。 16. 如申請專利範圍第n項之方法，其中該4_App之濃 度為大約或為〇.lmM到大約或5.0mM。 17. 如令請專利範圍第n項之方法，其中該4_APP之濃 度是在大約或為〇·1到2、3或4mM之間，或是大約或為 0.2、0.3、0.4、〇.5、0.6、0.7、0.8、0.9 或 lmM。 18_如申請專利範圍第11項之方法，其中該4_aPP之濃 度是大約或為0.5mM。 201235469 • 19.如申請專利範圍第1項之方法，其中該宿主細胞為 _ 真核生物細胞。 20·如申請專利範圍第1項之方法，其中該宿主細胞為 原核生物細胞。 2 1 ·如申請專利範圍第2 0項之方法，其中該原核生物細 胞為大腸桿菌。 22·如申請專利範圍第1項之方法，其中該由經導入之 核酸分子編碼的RIP為第I型RIP，或其活性片段。 23.如申請專利範圍第22項之方法，其中該RIp係選自 康乃馨蛋白（dianthin)30、康乃馨蛋白32、萊屈寧（lychnin)、 皂草毒蛋白（saporin)-l、皂草毒蛋白-2、皂草毒蛋白_3、皂 草毒蛋白-4、皂草毒蛋白_5、皂草毒蛋白_6、皂草毒蛋白_7、 皂草毒蛋白-8、皂草毒蛋白_9、PAP、ΡΑΡ Π、PAP-R、PAP-S、 PAP-C、馬帕明（mapalmin)、多迪肯郡（d〇decandrin)、拜歐 丁（bryodin) -L、拜歐丁、拜歐丁 _ Π、克雷芬（ciaWn)、大腸 桿菌素（colicin)-l、大腸桿菌素_2、絲瓜籽蛋白（iuffin)_A、 絲瓜籽蛋白-B、絲瓜籽蛋白_s、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、 α-克里洛文（kirilowin)、β_克里洛文、截短型細胞毒素 (gelonin)、地膚子皂芽（mom〇rdin)、地膚子皂苷_辽、地膚 子息苦-I c、紫茉莉（始·ra6z•山）抗病毒蛋白（map)、 MAP-30、a-苦瓜籽毒蛋白（m〇m〇rcharin)、卜苦瓜籽毒蛋白、 天花粉蛋白（tdchosanthin)、TAP-29、栝樓籽毒蛋白 (trichokidn)、大麥 RIP !、大麥 RIp π、曲亭（tHtin)、亞麻 RIP玉蜀黍RIP3、玉蜀黍Rip9、玉蜀黍RIpx、阿司帕林 201235469 (asparin)-l和阿司帕林·2。 24·如申請專利範圍第1項之方法，其中該由經導入之 核酸分子編碼的RIP為第Π型RIP，其催化次單元或其活性 片段。 25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該RIP係選自 志夤毒素（Stx)、類志賀毒素jj (stx2)、銷蓮素（vilkensin)、 蓖麻毒素、尼格林（nigrin)_CIp_29、相思豆毒素、維古明 (vircumin)、藥蓮毒棄（modeccin)、依布利亭（ebulitin)-a、依 布利乎-β、依布利亭_γ和黄樟毒蛋白（P〇rrectin)。 26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該RIP包括次 單元A，或其活性片段。 27. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該志賀毒素包 括次單元A1 (S A1)或其活性片段，或由次單元a 1或其活性 片段所組成。 28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該SA1是經 截短的。 29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中藉著在C-端 刪除 1、2、3、4、5、0、7、8、9、10、11 或 12 個相鄰胺 基酸，截短該SA1。 3 0.如申請專利範圍第27項之方法，其中藉著以其他胺 基酸置換Cys ’進一步修改該SA1。 3 1.如申請專利範圍第3〇項之方法，其中該置換性胺基 酸為S e r。 32.如申請專利範圍第27項之方法，其中該SA1包括 201235469 在 SEQ ID NO:22 或 SEO ΤΓ» xrn o/i tb & 乂 ID NO:24中陳述之胺基酸殘基的 序列。 33. 如申請專利範圍第27項之方法，其"亥⑷係由 包括在_ Π3 N0:21或SEQ ID N〇:23中陳述之序列的核 酸分子編碼。 34. 如申„月專利範圍第i項之方法，其中使該由經導入 之核酸分子編碼的RIP與配體共軛，形成配體-毒素共軛物。 35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中在該共輛物中 的RIP和配體’直接或間接經由共價或離子鍵連接。 36. 如申請專利範圍第35項之方法’其中該Rip和配體 係經由連接子接合。 37. 如申請專利範圍帛36 ,員之方法，丨中該連接子為 肽、多肽或胺基酸。 38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該連接子為 Ala-Met連接子。 39. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該配體毒素 共軛物為融合蛋白。 40. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該配體係選自 趨化因子受體靶定劑、非-趨化因子之細胞介素、激素、生 長因子、對細胞表面受體專一的抗體、TNF超家族配體和 特徵辨 a忍受體（pattern recognition receptor，PRR)配體。 41. 如申請專利範圍第4〇項之方法，其中該生長因子為 VEGF。 42_如申請專利範圍第4〇項之方法，其中： 201235469 該趨化因子受體革巴定劑為趨化因子，或趨化因子之片 段或與趨化因子受體專—結合的抗體，或抗體之片段， 其中5亥片段與趨化因子受體結合。 43 _如申請專利範圍第42項之方法，其中該抗體為單株 抗體’或其抗原-專一的片段。 44.如申請專利範圍第43項之方法其中該單株抗體與 選自（DARC)、D6、CXCR-卜 CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、 CXCR-4、CXCR-5、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、 CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、 CX3CR-1和XCR1之抗原專一地結合。 45 ·如申請專利範圍第43項之方法，其中該單株抗體與 選自CXCR-6和CXCR-7之抗原專一地結合。 46_如申請專利範圍第42項之方法，其中該趨化因子受 體靶定劑為趨化因子。 47·如申請專利範圍第46項之方法，其中該趨化因子係 選自單核細胞趨化蛋白-WMCP-l)、MCP-2、MCP-3、 MCP-4、MCP-5、嗜酸性白血球趨化蛋白丨（嗜酸球趨化蛋白 -1 ( eotaxin-Ι ))、嗜酸球趨化蛋白j、嗜酸球趨化蛋白·3、 基質衍生因子-1 万（stromal derived factor-ΐβ，SDF-Ιβ)、 SDF-1 α、SDF-2、巨噬細胞抑制蛋白質1 α (macr〇phage inhibitory protein 1 α，ΜΙΡ-1 α )、MIP-1 冷、ΜΙΡ-1γ、MIP-2、 ΜΙΡ-2α、ΜΙΡ-2 召、ΜΙΡ-3、MIP-3yS、ΜΙΡ-3α、ΜΙΡ-4、 ΜΙΡ-5、活化後立即調節的，正常Τ細胞表現和分泌的 (Regulated on Activition，Normal T cell Expressed and 201235469 * Secreted，RANTES)蛋白質、介白素-8(IL-8)、生長調節蛋 _ 白 <2 (grow regulated protein 〇:，GRO- α)、干擾素-可誘導之 蛋白質 10(interferon-inducible protein 10，IP-10)、巨喔細 胞-衍生之趨化因子（macrophage-derived chemokine， MDC)、顆粒球趨化蛋白 2(granulocyte chemotactic protein 2，GCP-2)、上皮-衍生之嗜中性白血球-活化性蛋白質 78( epithelial-derived neutrophil-activating protein 78 ， ENA-78)、血小板驗性蛋白質（platelet basic protein，PBP)、 7干擾素-誘導之單核細胞活素（gamma interferon-induced monokine，MIG)、jk 小板因子 4(platelet factor 4，PF-4)、 血液渡液 CC 趨化因子 l(hemofiltrate CC chemokine 1， HCC-1)、胸腺和活化-調節的趨化因子（thymus and activation-regulated chemokine，TARC)、淋巴細胞趨化因 子（lymphotactin )、肺活素（lungkine ) 、CIO、肝-表現 之趨化因子（liver-expressed chemokine，LEC)、艾索朵斯 -2(exodus-2，SLC)、胸腺表現之趨化因子（thymus expressed chemokine ’ TECK)、皮膚的T-細胞吸引性趨化因子 (cutaneous T-cell attracting chemokine » CTACK)、黏膜'结 合之上皮趨化因子（mucosae-associated epithelial chemokine ’ MEC)、單一 C 基序 1-/S (single C motif 1-β， SCM-1 /3 )、干擾素-可誘導之T-細胞α化學吸引劑 (interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant » I-TAC) ' 乳房和腎臟-表現之趨化因子（breast and kidney-expressed chemokine，BRAK)、人神經趨化蛋白（fractalkine)和 B-細胞 201235469 吸引性趨化因子
    及其對偶基因或物種變體。 4 8.如申晴專利範圍第4 6項之方法，其中該趨化因子係 選自MCP-1 IL-8、ΠΜο、 嗜酸球趨化蛋白-卜SDF-Ιβ、GRO-a、MIP-Ιβ、 MCP-3、ΜΙΡ-3α、MDC、MIP-U 和 BCA-1 , BCA-1 , 及其對偶基因或物種變體。 49.如申凊專利範圍第46項之方法，其中該趨化因子為 MCP-1。 5 〇.如申凊專利範圍第3 4項之方法，其中該配體-毒素 共扼物包括在SEQ id NO:3 8或SEQ ID NO:40中陳述之胺 基酸殘基的序列。 5 1 ·如申睛專利範圍第3 4項之方法，其中該配體-毒素 共辄物係由包括在SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39中陳述 之序列的核酸分子編碼。 5 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中與由該經導入 之核酸分子編碼的RIP相比較，該經鑑認之PJP含有突變。 5 3 .如申請專利範圍第1項之方法，更包括評估該經鑑 認之RIP的毒性。 54·如申請專利範圍第53項之方法，其中係在選自蛋白 質合成測定、脫嘌呤測定和細胞生長/活力測定的測定中評 估該毒性。 5 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中與由該經導入 之核酸分子編碼的RIP相比較’該經鑑認之Rip保留了毒 201235469 5 6.如申請專利範圍第5 5項之方法，其中該經鑑認之 RIP 保留了 0·5ο/〇、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、20%、3 0%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多的毒性。 5 7.如申請專利範圍第1項之方法，更包括： a) 將編碼邊經鑑認之Rip，或其活性片段的核酸分子導 入宿主細胞内； b) 在RIP抑制劑的存在下培養該細胞，其中挑選該Rlp 抑制劑的量，以降低該RIP多肽的毒性；並 e)使該細胞在條件下生長，藉此產生該RIp或其活性片 段。 58. 如申請專利範圍第57項之方法，更包括純化步驟 c)之RIP，藉此使所表現或純化或兩者之RIp的量，比沒有 HIP抑制劑時更多。 59. 如申4專利範圍第丨項之方法更包括製備含有該 經鑑認之RIP的共軛物。 ^ 6〇_ 一種經修改核糖體失活蛋白質（RIP)，其係藉著如申 睛專利範圍第1項之方法挑選。 61. —種增加核糖體失活蛋白質（RIp)或其活性片段生 產的方法，包括： v 將包括編蜗RIP，或其活性片段之核«序列的核酸 刀子導入宿主細胞内； )在RIP抑制齊1的存在下培養該細胞，其+挑選該RIP 抑制劑的量，以降低該RIP之毒性；並 201235469 〇)使。亥細胞在條件下n，藉此以比在沒有up抑制劑 下生長時更多的量產生RIP或其活性片段。 62. 如申明專利範圍帛6 i項之方法更包括純化步驟 c)之RIP，藉此使所表現或純化或兩者之⑽的量，比沒有 RIP抑制劑時更多。 63. 如申明專利範圍第61或62項之方法其中由該經 導入之核酸編碼的RIP是第I型RIP，或其活性片段。 虫申π專利範圍第63項之方法，其中該RIp係選自 康乃馨蛋白3〇、康乃馨蛋白32、萊屈寧 '皂草毒蛋白]、 皂草毒蛋白2、皂草毒蛋白·3'皂草毒蛋白_4、皂草毒蛋白 -5、皂草毒蛋白·6、4草毒蛋白_7、皂草毒蛋白_卜息草毒 蛋白-9、PAP、PAP]I、pAp_R、pAp s、pA]M： ^ph t迪肯郡、拜歐丁_"、拜歐丁、拜歐丁-Π、克雷芬、大腸 桿素大腸才干菌素·2、絲瓜軒蛋白_A、絲瓜軒蛋白B、 絲瓜軒蛋白-S、1 Q Υ τ> c τ , r 尤曰 & 19K-PSI、l5K_PSI、9K_psi、α 克里洛文、 β-克里洛文、截短型細胞毒素 '地膚子皂苦、地膚子息芽_ Π也膚子息普-Ic、紫茉莉抗病毒蛋白（ΜΑΡ)、ΜΑΡ3〇、 α_苦瓜籽毒蛋自、β苦瓜籽毒蛋白m蛋白、ΤΑΡ_29、 栝樓籽毋蛋白、大麥RIp J、大麥Rip卜曲亭、亞麻RIP、 蜀黍RIP3玉蜀黍RIP9、玉蜀黍RIPX、阿司帕林_1和 阿司帕林-2。 65·如申吻專利範圍第61或62項之方法，其中該由經 導入之核酸編碼的RIP為第Π型RH>，其催化次單元或其活 性片段。 10 201235469 • 66·如申請專利範圍第65項之方法，其中該Rip係選自 一志贺毒素（stx)、類志賀毒素n (stx2)、類志賀毒素I、蒴蓮 .素、蓖麻毒素、尼格林-CIP-29、相思豆毒素、維古明、藥 蓮毒素、依布利亭_α、依布利亭、依布利亭-γ和黄樟毒蛋 白0 67. 如申請專利範圍第a項之方法，其中該RIP包括次 單元A，或其活性片段。 68. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該志贺毒素包 括次單元A1(SA1)，或其活性片段。 69_如申請專利範圍第68項之方法’其中該SA1是經 截短的。 70. 如申請專利範圍第69項之方法，其中藉著在C-端 刪除 1、2、3、4、5、ό、7、8、9、10、11 或 12 個相鄰胺 基酸，截短該S A1。 71. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該RIp是經修 改的。 72. 如申請專利範圍第68項之方法，其中該SA1是經 修改的。 73.如申請專利範圍帛72項之方法，其中藉$置換一或 多個胺基酸修改該S A1。D 如申請專利範圍第73項之方法，其中藉著以其他胺 基酸置換Cys來修改該sai。 75.如申請專利範圍第74項之方 酸為Ser。 -中該置換性胺基 201235469 76. 如申請專利範圍第73項之方法，其中： 藉著置換位置38或位釁219之一或兩者來修改該 SA1 ;且 該位置是關於具有SEQ I0 N〇:22申陳述之胺基酸序列 的SA1中之胺基酸位置。 77. 如申請專利範圍第76頊之方法，其中該胺基酸置換 相當於L38R及/或V219A。 78. 如申請專利範圍第77項之方法，其中該胺基酸置換 相當於V219A。 79. 如申請專利範圍第76項之方法，其中該SA1具有 在SEQ ID NO:26或28中陳述之胺基酸序列。 80. 如申請專利範圍第76項之方法，其中該SAI係由 在SEQ ID NO:27或29中陳述之梭酸序列編碼。 81 ·如申請專利範圍第61項之方法，其中該RIP抑制劑 為腺嘌呤類似物。 82. 如申請專利範圍第8 1項之方法，其中該腺嘌呤類似 物為4-胺基吡唑并[3,4-d]嘧啶（4-APP)。 83. 如申請專利範圍第82項之方法，其中該RIP抑制 劑，腺嘌呤類似物或4-APP的濃度是有效降低RIP之毒性 至或大約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、91%、92%、93%、94% ' 95%、96%、97%、980/〇、99% 或 100%。 84. 如申請專利範圍第82項之方法，其中該4-APP之濃 度為大約或是ImM至大約或40.0mM。 201235469 ’ 85·如申請專利範圍第84項之方法，其中該4-APP之濃 - 度在大約或為 2.〇mM、3,0mM、4.0mM、5.0mM、6.0mM、 j _ 7.〇mM、8.0mM、9.0mM、lO.OmM、15.0mM 或 20.0mM 之 間。 86_如申請專利範圍第61項之方法，其中該宿主細胞為 真核生物細胞。 87. 如申請專利範圍第6 1項之方法，其中該宿主細胞為 原核生物細胞。 88. 如申請專利範圍第87項之方法，其中該原核生物細 胞為大腸桿菌。 89. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該RIP多肽係 在以誘導劑誘導之後表現。 90. ·如申請專利範圍第89項之方法，其中該誘導劑為 IPTG。 9 1 ·如申請專利範圍第89項之方法，其中在加入誘導劑 之前、期間及/或之後，加入該RIP抑制劑。 92.如申請專利範圍第6 1項之方法，其中編碼該RIP之 核酸分子包括編碼配體之核苷酸的序列，藉此使該分子編 碼配體-毒素共軛物。 93_如申請專利範圍第92項之方法，其中在該共軛物中 的RIP和配體，經由共價或離子鍵直接連接。 94. 如申请專利範圍第93項之方法，其中該RIp和配體 係經由連接子接合。 95. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該連接子為 13 201235469 肽、多肽或胺基酸。 96. 如申請專利範圍第95項之方法，其中該連接子為 Ala-Met連接子。 97. 如申請專利範圍第92項之方法，其中該配體-毒素 共輕物為融合蛋白。 队如申請專利範圍第92項之方法，其中在該配體毒 素共輛物中的配體係選自趨化因子受體輕定劑、非-趨化因 子之細胞介素、激辛、 系生長因子、對細胞表面受體專一的 抗體、TNF超家族配體和特徵辨認受體(pRR)配體。 99. 如申請專利範圍帛9"之方法，其中該生長因子為 VEGF。 100. 如申請專利範圍第98項之方法，#中該趨化因子 受體乾定#1是趨化因子，或與趨化因子受體結合的趨化因 子之片段，或與趨化因子受體專一地結合的抗體，或與該 受體結合之抗體的片段。 101. 如申請專利範圍第100項之方法’其中該抗體為單 株抗體，或其抗原-專一的片段。 1〇2.如申請專利範圍第101項之方法，其中該單株抗體 是對選自（DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、 CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CCR-卜 CCR-2A、CCR-2B、 CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、 CCR10、CX3CR-1 和 XCR1 之抗原專—的。 1 0 3 ·如申請專利範圍第1 〇 1項之方法，其中該單株抗體 是對選自CXCR-6和CXCR-7之抗原專一的。 14 201235469 104•如申請專利範圍第100項之方法，其中該趨化因子 受體把定劑是趨化因子。 105. 如申請專利範圍第1〇4項之方法，其中該趨化因子 係選自單核細胞趨化蛋白-l(MCP-l)、MCP-2、MCP-3、 MCP-4、MCP-5、嗜酸性白血球趨化蛋白丨（嗜酸球趨化蛋白 -1)、嗜酸球趨化蛋白-2、嗜酸球趨化蛋白_3、基質衍生因子 -1 /3 (SDF-Ιβ)、SDF-1 α、SDF-2、巨噬細胞抑制蛋白質1 α (ΜΙΡ-1 a )、ΜΙΡ-1 召、ΜΙΡ-1γ、ΜΙΡ-2、ΜΙΡ-2 α、ΜΙΡ-2 /3、ΜΙΡ-3、ΜΙΡ-3 /3、ΜΙΡ-3 α、ΜΙΡ-4、ΜΙΡ-5、活化後立 即調節的，正常Τ細胞表現和分泌的（RANTES)蛋白質、介 白素-8(IL-8)、生長調節蛋白α (GRO- α)、干擾素-可誘導之 蛋白質ΙΟ(ΙΡ-ΙΟ)、巨噬細胞-衍生之趨化因子（MDc)、顆粒 球趨化蛋白2(GCP-2)、上皮-衍生之嗜中性白血球-活化性蛋 白質78(ENA-78)、血小板驗性蛋白質（pBp)、了干擾素-誘 導之單核細胞活素（MIG)、血小板因子4(PF-4)、血液濾液 CC趨化因子i(HCC-l)、胸腺和活化_調節之趨化因子 (TARC)、淋巴細胞趨化因子、肺活素、匸1 〇、肝-表現之趨 化因子（LEC)、艾索朵斯-2(SLC)、胸腺表現之趨化因子 (TECK)、皮膚的T-細胞吸引性趨化因子（CTACK)、黏膜_ 結合之上皮趨化因子（MEC)、單一 c基序 干擾素-可誘導之T-細胞α化學吸引劑（uac)、乳房和腎臟 -表現之趨化因子（BRAK)、人神經趨化蛋白和Β_細胞吸引性 趨化因子l(BCA-l)，及其對偶基因或物種變體。 106. 如申請專利範圍第104項之方法，其中該趨化因子 15 201235469 係選自M C P -1、π老酸七 s酉欠球趨化蛋白-1、SDF-Ιβ、GRO-a、 ΜΙΡ-1β ' IL-8 ^ ΐρ,ΐΛ 、MCP-3、MIP-3a、MDC、MIP-la 和 BCA-1 ’及其對偶基因或物種變體。 107.如申„月專利範圍第ι〇4項之方法，其中該趨化因子 為 MCP-1。 1〇8·如申5月專利範圍帛92項之方法，其巾該RIP為志 貝毋素或其活性片| ’或為經修改志贺毒素或其包含修改 的活性；Η段。 1 〇 9.如申請專利範圍第1 〇 8項之方法，其中該志贺毒素 包括Α1次單元（sai)。 110.如申請專利範圍第92項之方法，其中該配體-毒素 共輕物包括在 SEQ ID Ν〇:42、44、46、48、5〇、52、Μ、 56 58 60 '62、64或67之任-者中陳述之胺基酸殘基的 序列。 1Π·如申請專利範圍第92項之方法’其令該配體_毒素 共輛物係由包括在 SEq ID Ν〇:4ι、43、45 ' 47 ' 49、50、 3 55 57、59、61、63、65或66之任一者中陳述之序列 的核酸分子編碼。 112.如申請專利範圍第丨u項之方法，更包括合成該共 輛物。 113·—種經修改RIP,其係藉著如申請專利範圍第Η 項之方法產生。
TW101109621A 2006-12-29 2007-12-25 Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins, and uses thereof TW201235469A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87816606P 2006-12-29 2006-12-29
US96597707P 2007-08-22 2007-08-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201235469A true TW201235469A (en) 2012-09-01

Family

ID=39588090

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101109621A TW201235469A (en) 2006-12-29 2007-12-25 Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins, and uses thereof
TW096149852A TW200833843A (en) 2006-12-29 2007-12-25 Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins, and uses thereof

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096149852A TW200833843A (en) 2006-12-29 2007-12-25 Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins, and uses thereof

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20090092578A1 (zh)
EP (1) EP2097529A4 (zh)
JP (2) JP4954293B2 (zh)
KR (1) KR20090130849A (zh)
AR (1) AR064696A1 (zh)
AU (1) AU2007339753A1 (zh)
BR (1) BRPI0720647A2 (zh)
CA (1) CA2673668A1 (zh)
IL (1) IL218716A0 (zh)
MX (1) MX2009007021A (zh)
SG (1) SG163558A1 (zh)
TW (2) TW201235469A (zh)
WO (1) WO2008080218A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113831416A (zh) * 2014-06-11 2021-12-24 分子模板公司 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子
US12037367B2 (en) 2014-01-27 2024-07-16 Molecular Templates, Inc. MHC class I epitope delivering polypeptides

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030215421A1 (en) * 1999-07-21 2003-11-20 Mcdonald John R. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
EP1229045A1 (en) * 2001-02-01 2002-08-07 Institut Curie Universal carrier for targeting molecules to Gb3 receptor expressing cells
US7824691B2 (en) * 2005-04-04 2010-11-02 Centegen, Inc. Use of RIP in treating staphylococcus aureus infections
CA2646319A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine , Incorporated Methods and compositions based on shiga toxin type 1 protein
EP2207793A2 (en) * 2007-10-08 2010-07-21 Rutgers, The State University Nontoxic shiga-like toxin mutant compositions and methods
US8481033B2 (en) * 2008-10-07 2013-07-09 INSERM (Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale) Neutralizing antibodies and fragments thereof directed against platelet factor-4 variant 1 (PF4V1)
DK2379722T3 (da) * 2008-12-16 2017-01-02 C-Lecta Gmbh Ekspressionsvektor
EP2381954B8 (en) 2009-01-23 2017-01-25 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Methods and compositions based on shiga toxin type 2 protein
KR102044948B1 (ko) * 2010-06-25 2019-11-14 백시바디 에이에스 동종이합체 단백질 구조물
US9200251B1 (en) 2011-03-31 2015-12-01 David Gordon Bermudes Bacterial methionine analogue and methionine synthesis inhibitor anticancer, antiinfective and coronary heart disease protective microcins and methods of treatment therewith
WO2013006514A2 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 University Of South Florida Recombinant adeno-associated virus-mediated expression of fractalkine for treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
PL397167A1 (pl) 2011-11-28 2013-06-10 Adamed Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe bialko fuzyjne
HK1209276A1 (zh) * 2012-06-12 2016-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag 用於产生条件性敲除等位基因的方法和组合物
EP2970487B1 (en) 2013-03-12 2020-03-11 Molecular Templates, Inc. Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types
US11886952B2 (en) * 2013-09-17 2024-01-30 Integrated Solutions International, Llc Systems and methods for point of sale age verification
US20160177284A1 (en) * 2014-01-27 2016-06-23 Molecular Templates, Inc. Cell-targeted molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal shiga toxin a subunit effector regions
JP6814634B2 (ja) * 2014-02-05 2021-01-20 モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. リボ毒性の一時的な減少に基づき、細胞毒性組換えポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法
PL3604333T3 (pl) * 2014-03-11 2021-11-08 Molecular Templates, Inc. Białka zawierające regiony efektorowe podjednostki a toksyny shiga proksymalnie do końca aminowego oraz celujące w komórki regiony wiążące typu immunoglobuliny zdolne do swoistego wiązania cd38
ES2864124T3 (es) * 2014-03-11 2021-10-13 Molecular Templates Inc Proteínas que comprenden regiones de unión, regiones efectoras de la subunidad A de toxina Shiga y motivos señal de localización de retículo endoplasmático carboxi terminal
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
ES2856457T3 (es) 2015-02-05 2021-09-27 Molecular Templates Inc Moléculas de unión a CD20 multivalentes que comprenden regiones efectoras de una subunidad de toxina shiga y composiciones enriquecidas de estas
SI3303373T1 (sl) * 2015-05-30 2020-07-31 Molecular Templates, Inc. Deimunizirana ogrodja A podenot Shiga toksina in celice-ciljajoče molekule, ki jih obsegajo
ES2776243T3 (es) 2015-06-03 2020-07-29 Medical College Wisconsin Inc Un polipéptido de dímero CCL20 bloqueado modificado por ingeniería
US11571462B2 (en) 2015-06-03 2023-02-07 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Engineered CCL20 locked dimer polypeptide
WO2017053290A1 (en) * 2015-09-23 2017-03-30 Research Corporation Technologies, Inc. Ribotoxin molecules derived from sarcin and other related fungal ribotoxins
WO2017118695A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Vaccibody As Therapeutic anticancer neoepitope vaccine
WO2018106895A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
WO2018134731A1 (en) * 2017-01-17 2018-07-26 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Non peptidic heterobivalent molecules for treating inflammatory diseases
CA3049456A1 (en) 2017-01-25 2018-08-02 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
US11491150B2 (en) * 2017-05-22 2022-11-08 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
MX2019009726A (es) 2018-04-17 2020-02-05 Molecular Templates Inc Moleculas con direccion hacia her2 que comprenden andamiajes de la sub-unidad a de la toxina shiga desinmunizados.
US11880438B2 (en) 2018-10-17 2024-01-23 Integrated Solutions International, Llc Systems and methods for age restricted product activation
WO2020158691A1 (ja) * 2019-01-28 2020-08-06 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
CN111887202B (zh) * 2020-08-26 2021-11-26 安发（福建）生物科技有限公司 一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7157418B1 (en) * 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
ATE246517T1 (de) * 1998-07-22 2003-08-15 Osprey Pharmaceuticals Ltd Konjugate zur behandlung von entzündungskrankheiten und von assozierter gewebeschädigung
US20030215421A1 (en) * 1999-07-21 2003-11-20 Mcdonald John R. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
WO2006091677A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Jean Gariepy Yeast strains expressing ribosome-inactivating protein domain and method of using same

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12037367B2 (en) 2014-01-27 2024-07-16 Molecular Templates, Inc. MHC class I epitope delivering polypeptides
US12065469B2 (en) 2014-01-27 2024-08-20 Molecular Templates, Inc. De-immunized Shiga toxin a subunit effector polypeptides for applications in mammals
CN113831416A (zh) * 2014-06-11 2021-12-24 分子模板公司 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子

Also Published As

Publication number Publication date
AR064696A1 (es) 2009-04-22
SG163558A1 (en) 2010-08-30
BRPI0720647A2 (pt) 2014-01-14
KR20090130849A (ko) 2009-12-24
CA2673668A1 (en) 2008-07-10
EP2097529A1 (en) 2009-09-09
US20090092578A1 (en) 2009-04-09
JP4954293B2 (ja) 2012-06-13
JP2011050388A (ja) 2011-03-17
AU2007339753A1 (en) 2008-07-10
MX2009007021A (es) 2009-08-07
TW200833843A (en) 2008-08-16
JP2010514425A (ja) 2010-05-06
WO2008080218A1 (en) 2008-07-10
EP2097529A4 (en) 2010-03-24
WO2008080218A9 (en) 2008-08-28
IL218716A0 (en) 2012-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201235469A (en) Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins, and uses thereof
CN101622352A (zh) 选择和产生修饰的毒素、含有修饰的毒素的缀合物的方法及其应用
CN113444179B (zh) 一种抗gpc3抗体和包含该抗体的药物组合物
WO2017175176A1 (en) Vectors for cloning and expression of proteins, methods and applications thereof
JP6942356B2 (ja) 制御性ｔ細胞の活性化剤及びその使用
CN111518221B (zh) 一种重组il-15融合蛋白及其应用
EP4554961A2 (en) Aav capsids that enable cns-wide gene delivery through interactions with the transferrin receptor
KR20150100606A (ko) 아테리바이러스 단백질 및 발현 메커니즘
CN1904053B (zh) 一种日本血吸虫多价dna疫苗和制备方法
CN116783298A (zh) 供治疗ild、pf-ild和ipf之用的病毒载体和核酸
CN105693845B (zh) 一种cd40胞外区的表达纯化及其用途
US20250228976A1 (en) Aav capsids that enable cns-wide gene delivery through interactions with the transferrin receptor
CA3236210A1 (en) Methods of improving systemic disease outcomes by inhibition of zhx2
AU2022379455A1 (en) Methods of treating the effects of cytokine storms
WO2022242500A1 (zh) 一种基于基因改造脊椎动物的携带通用定点偶联接口的抗体的制备方法
KR20230040348A (ko) Sars-cov-2 감염에 대한 인간화 마우스 모델
WO2024041236A1 (zh) 包含angptl3单抗的融合蛋白
CN120265308A (zh) 用于治疗生物膜和中性粒细胞胞外陷阱形成的组合物和方法
US20190135904A1 (en) Method of Producing Antibody Fragment
CN116783297A (zh) 供治疗ild、pf-ild和ipf之用的病毒载体和核酸
CN101068835A (zh) 可溶性ZcytoR21、抗ZcytoR21抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法
DE3701301A1 (de) Herstellung von expressionsplasmiden fuer die viralen huellenproteinbereiche von hrv2 und hrv89