CN105693845B - 一种cd40胞外区的表达纯化及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种CD40胞外区的表达纯化及其用途。首次通过优化实现了利用酵母细胞重组表达CD40蛋白氨基端胞外区。并且首次论证了CD40蛋白氨基端胞外区对肿瘤细胞有明显的抑制作用，可以作为一种抗肿瘤药物。

Description

一种CD40胞外区的表达纯化及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种CD40胞外区的表达纯化及其用途。

背景技术

CD40-CD40L信号通路是免疫系统激活的辅助信号之一，抗原递呈细胞激活T细胞免疫不仅需要TCR MHC抗原肽信号，还需要、CD28-B7等共刺激信号，CD40-CD40L信号增加B7.1、B7.2分子表达。CD40不仅在B细胞、DC细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞中表达，还广泛表达于内皮细胞、肥大细胞，成纤维细胞，肿瘤细胞，平滑肌细胞表面。这也提示着CD40具有广泛的功能，除了前续提到的抗原递呈作用，它还参与辅助性T细胞启动和细胞毒性T细胞功能，在B细胞发育和抗体类型转换时也发挥重要作用等等。

CD40-CD40L信号通路在1型糖尿病、多发性硬化症、炎症性肠炎(IBD)、牛皮癣、关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫病中是过度激活的，阻断该信号通路已经在相应小鼠模型中(NOD小鼠、EAE小鼠、IBD小鼠、CIA、SLE小鼠)被证明可以减轻病理作用。

目前阻断该信号通路的主要策略是应用针对CD40L的抗体，其中包括Ruplizumab(BG9588)和Toralizumab(IDEC-131)，它们早在21世纪初就进入临床研究，Ruplizumab在二期临床治疗SLE和肾脏移植中显现出疗效。但是它们都因为并发血管栓塞而没能实现应用。治疗思路相应转移到针对CD40的单抗研究上，ch5D12正在进行克罗恩病(Crohn’sdisease)一期和二期临床试验，另一个CD40单抗HCD122也在进行治疗MM和CLL的一期临床研究。

综上，鉴于CD40-CD40L信号通路与多种疾病存在相关性，本领域迫切需要进一步针对CD40-CD40L信号通路加以研究，开发以该信号通路为突破口的新型治疗手段或治疗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CD40胞外区的表达纯化及其用途。

在本发明的第一方面，提供CD40蛋白氨基端胞外区的用途，用于制备抑制肿瘤或抑制炎症的药物组合物。

在一个优选例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外区是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白。

在另一优选例中，所述的肿瘤是淋巴瘤。

在另一优选例中，所述的炎症是肠炎。

在另一优选例中，所述的淋巴瘤是弥漫型大B细胞淋巴瘤。

在另一优选例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外区是不包含CD40蛋白第20位脯氨酸的蛋白。

在另一优选例中，所述的药物组合物还用于：阻断CD40-CD40L信号通路；阻断CD40介导的非经典NF-κB信号通路的激活；和/或降低细胞内原癌基因cMYC的表达。

在本发明的另一方面，提供一种CD40蛋白氨基端胞外区，其是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白；较佳地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的CD40蛋白氨基端胞外区；较佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤或抑制炎症的药物组合物，其含有所述的CD40蛋白氨基端胞外区。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体，其中包含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组酵母细胞，其中包含有所述的多核苷酸或含有所述多核苷酸的重组表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达CD40蛋白氨基端胞外区的方法，所述方法包括：

(1)提供一重组表达载体，其包含CD40蛋白氨基端胞外区的编码序列，所述的CD40蛋白氨基端胞外区是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白；

(2)将(1)的重组表达载体转化酵母细胞，获得重组酵母细胞；

(3)培养(2)的重组酵母细胞，从而表达CD40蛋白氨基端胞外区。

在一个优选例中，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。

在另一优选例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外区的编码序列的核苷酸序列如SEQID NO:2中第16-537位所示(即密码子优化后的序列)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、CD40胞外端基因克隆和鉴定。人CD40胞外段基因PCR扩增后琼脂糖凝胶检测：右侧条带为CD40-N基因条带，左边条带为DNA marker：DL2000，每孔上样均为5μl。

图2、pPIC9K-CD40-N(P)构建后XhoI NotI双酶切鉴定：左边泳道为基因大小分子标记(Marker)，剩下的8条泳道均为质粒酶切后的样品，Marker上样5μl，其余上样9μl/孔。

图3、酵母菌株表达CD40-N和Western blot鉴定(至少三次实验重复)。

(A)酵母菌株甲醇诱导表达SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色结果，泳道1为Marker，左侧为分子量大小对照，0，12……84小时分别为不同时间样品，单位kD，样品20μl/孔，SDS-PAGE浓缩胶5％，分离胶12％；

(B)各个时间点样品Western blot，p为转染CD40的HEK293T细胞样品，作为阳性对照。

图4、CD40-N表达菌株高密度发酵和表达分析(至少三次实验重复)。

(A)酵母发酵生长曲线，纵坐标为吸光度OD600读数，横坐标为时间；

(B)不同时间点发酵液上清蛋白SDS-PAGE电泳：左边泳道为蛋白Marker，泳道1-14分别为0、4、12、16、20、24、32、36、40、48、56、61小时样品，蛋白样品用5Xloading煮沸10分钟后每孔上样14μl，Marker上样5μl/孔，单位kD，SDS-PAGE胶：浓缩胶5％，分离胶12％。

图5、蛋白纯化和糖基化分析(至少三次实验重复)。

(A)凝胶过滤层析图(Sephadex G-50)，Y轴为OD280nm吸收值，X轴为流过层析柱的体积(单位：ml)，蓝色线为样品OD280nm吸收值值，红色为OD254nm吸收值；

(B)离子交换层析图(Q Sepharose Fast Flow)，XY轴与A图相同，垂直线为标记，标记线后开始0-1.0M NaCl线性洗脱,箭头处为目标蛋白洗脱下来位置；

(C)SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图，各泳道名称见上面标注，M表示Marker，1-1、1-2、1-3分别表示第一个吸收峰收集的三管，左侧为分子量大小，单位kD；

(D)糖肽酶F(PNGaseF)处理样品后SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果，M表示Marker，CON为对照组，PNGaseF为糖肽酶F处理组，PNGaseF组中35kD处为糖肽酶F(细箭头标识)。SDS-PAGE中样品上样量为Marker5μl/孔，样品20μl/孔，单位kD，SDS-PAGE浓缩胶5％，分离胶12％。

图6、CD40N阻断CD40-CD40L信号通路(至少三次实验重复)。

(A)CD40-N可以阻断G28-5对于BJAB细胞中非经典NF-κB信号通路的激活，G28-5为1ug/ml，CD40N为10ug/ml，*为非特异性带；

(B)不同浓度的CD40-N可以阻断CD40-L激活的非经典NF-κB信号通路，0.1、1、10分别表示0.1、1、10ug/ml，CD40-L为1ug/ml。

图7、CD40N可以减少病人来源的DLBCL细胞存活。左图为病人来源的DLBCL细胞(PDC)体外不加入和加入骨髓来源的基质细胞(BMSC)以及加入和不加入CD40-N后培养后进行流式检测结果(左上角图为不加入BMSC和CD40-N，左下角图加入BMSC，右上角图加入CD40-N，右下角图加入BMSC和CD40-N)；右图左图的量化结果，CD40-N为10ug/ml。至少三次实验重复，**p<0.01。

图8、CD40-N抑制DLBCL(Diffuse large B-cell lymphoma)肿瘤组织块体内生长。

(A)病人来源的淋巴瘤组织移植到裸鼠肾囊膜下，经过5次传代稳定。取一只裸鼠体内淋巴瘤组织块移植到10只裸鼠肾囊膜下，1周后将带瘤老鼠分为两组，一组腹腔注射PBS，一组注射CD40-N，每周三次，20mg/kg，2个月肿瘤块如图；

(B)肿瘤重量比较(*p<0.05，**p<0.01)；

(C)肿瘤体积大小比较(*p<0.05，**p<0.01)。

图9、DLBCL PDX肿瘤块Western blot检测。左侧为检测的不同分子，P2为CD40-N处理组，CON2为对照组，其中1-5分别表示5只老鼠肿瘤块样品，CD40-N表示CD40-N处理组，1-3表示3只老鼠肿瘤块样品。

图10、功能性CD40-N可以减轻DSS诱导的急性肠炎模型症状。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过在多种宿主细胞进行表达研究，首次通过序列优化实现了利用酵母细胞重组表达CD40蛋白氨基端胞外区。本发明人优化方案解决了现有技术中难以利用酵母细胞重组表达CD40蛋白氨基端胞外区的技术难题。并且，本发明人还首次论证了CD40蛋白氨基端胞外区对肿瘤有明显的抑制作用，可以作为一种抗肿瘤药物；其还可以抑制炎症，如肠炎。

蛋白氨基端胞外区(CD40-N)

CD40-N是CD40蛋白的氨基端胞外段序列，它因为没有细胞内信号序列，但可以和CD40L信号结合而不传递信号，因此可以实现阻断该信号通路的作用。

作为本发明的优选方式，所述的CD40-N是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白，其不包含CD40蛋白第20位脯氨酸的蛋白。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的CD40-N也包括在本发明中。CD40-N或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/CummingsPub.Co.P224。

本发明也可采用经修饰或改良的CD40-N，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的CD40-N。所述经过修饰或改良的CD40-N可以是一种CD40-N的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。也就是说，任何不影响CD40-N的生物活性或不影响CD40-N在毕赤酵母中表达的变化形式都可用于本发明中。

在获得了CD40-N的氨基酸序列后，编码CD40-N的编码序列是易于获得的。作为本发明的优选方式，其是一种经过密码子优化的序列，较佳地其具有SEQ ID NO:2中第16-537位所示的编码区序列，利用其可以一定程度地提高表达效率。此外，编码CD40-N的编码序列也可以是SEQ ID NO:2中第16-537位所示的编码区序列的简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码的蛋白质氨基酸序列与SEQ ID NO:2中第16-537位所编码的氨基酸序列相同，但核苷酸序列与SEQ ID NO:2中第16-537位所示序列有差别的核酸序列。

本发明的CD40-N的编码通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。例如，本领域人员可以通过化学合成法来得到编码CD40-N的编码序列。然后可将该编码序列引入表达载体和细胞中。

蛋白氨基端胞外区(CD40-N)的重组表达

本发明人在研究中发现，CD40-N在利用大肠杆菌表达系统进行重组表达时，蛋白在表达过程中会易于形成包涵体，表达效率很低；并且通过变复性操作后，蛋白活性变得不理想。在毕赤酵母表达系统中，研究之初，本发明人克隆了CD40-N的全部序列(CD40蛋白第20-193位，174aa)，在将其编码序列克隆入毕赤酵母后，发现无法实现蛋白的表达。之后，本发明人尝试了多种多样的优化表达方案，意外地发现在编码序列中删除CD40蛋白第20位脯氨酸的编码序列后，可以在毕赤酵母中实现良好的表达。较佳地，采用密码子优化且排除了CD40蛋白第20位的脯氨酸的编码序列后，不仅表达量非常高，表达稳定，并且蛋白可以获得正确折叠加工，生物活性非常理想。

为了实现CD40-N的重组表达，本发明还提供了包含CD40-N的编码序列的表达载体，以及用本发明的载体经基因工程转化产生的宿主细胞。

本发明所述的表达载体是适用于毕赤酵母细胞表达的表达载体，其中含有CD40-N的表达盒。如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为CD40-N)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

将所述的表达载体转化毕赤酵母，培养转化有所述表达载体的重组毕赤酵母，从而可表达CD40-N。较佳地，所述的表达载体先进行线性化，之后转化毕赤酵母。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物如毕赤酵母时，可选用如下的DNA转染方法：电转化、磷酸钙共沉淀法、显微注射、脂质体包装等；较佳地选用电转化。

本发明人构建的CD40-N毕赤酵母表达系统，通过高密度发酵的方法，获得较为大量的有功能的蛋白。利用本发明的酵母分泌表达系统分泌表达蛋白，分泌到培养上清的目的蛋白超过总蛋白的50％，非常利于后续纯化操作获得较高纯度的蛋白。

基于此本发明人还成功建立了超滤-Sephadex G-50-Q Sepharose FF的纯化技术方案，可以简单有效的获得大量的蛋白。

糖基化修饰是CD40蛋白一个保守的翻译后修饰，CD40-N有两个保守的N-糖基化修饰位点(Asn153，Asn180)。而糖基化修饰在酵母表达系统与哺乳系统表达不同，纯化的CD40-N大小在略大于25KDa位置，与理论值19KDa不同，这是由于酵母中糖基化修饰的结果。有趣的是，本发明人发现在哺乳细胞里面表达的CD40-N和酵母中表达的CD40-N大小接近。

本发明人建立了一个简单高效的CD40-N表达纯化系统，为其科研和临床应用奠定了基础。

CD40-N及其用途

CD40L-CD40信号通路是免疫系统中一个关键调节信号通路，一方面可以促进抗原递呈细胞(如树突状细胞)的抗原递呈能力；另一方面可以激活B细胞，促进抗体产生；CD40介导的信号通路在中枢免疫耐受的建立过程中也起关键的作用，因而CD40L-CD40已经成为抑制移植排斥、防疗自身免疫性疾病等的重要靶点。

本发明人利用重组表达获得的CD40-N，进行了一系列的功能实验，发现了CD40-N可以在体内抑制肿瘤的生长。基于本发明人的新发现，本发明提供了CD40-N的用途，用于制备抑制肿瘤的药物组合物。

所述的CD40-N还用于：阻断CD40-CD40L信号通路；阻断CD40介导的非经典NF-κB信号通路的激活；和/或降低细胞内原癌基因cMYC的表达。

所述的CD40-N还用于：抑制炎症，特别是肠炎。其可使得炎症症状发生显著的改善。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的CD40-N，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于抑制肿瘤或抑制炎症。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将CD40-N配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的CD40-N以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的CD40-N的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的CD40-N的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的CD40-N每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明还提供了一种抑制肿瘤或炎症的方法，包括给予受试者有效量的CD40-N。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

实验材料

巴斯德毕赤酵母GS115(获自复旦大学)，大肠杆菌DH-5α菌株(TIANGEN公司)，HEK293T、RKO、BJAB细胞系获自ATCC。

相关载体

pPIC9K载体(复旦大学分子医学教育部重点实验室于敏实验室)。

试剂盒

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Axygen)、PCR产物纯化回收试剂盒(Axygen)、普通质粒小提试剂盒(Axygen)、PCR产物纯化回收试剂盒(TransGene Biotech)。质粒大量抽提试剂盒(MACHEREY-NAGEL)KOD-plus(TOYOBO)。

分子量标记

DNA分子量标记：DL2000(TAKARA)，Trans2Kplus(TransGene Biotech)。

蛋白分子量标记：PageRuler Plus Prestained Protein Ladder(26617Thermoscientific)。

主要溶液配制

10×YNB：溶解134g YNB于l000ml去离子水中，磁力搅拌溶解，0.22um滤器过滤除菌。

10×D(20％葡萄糖)：溶解200g D-葡萄糖于l000ml水中，121℃高压灭菌20分钟。

生物素(500×)：即0.02％生物素，称取0.01g生物素加入50ml去离子水中0.22um滤器过滤除菌。

YPD培养基(100ml)：酵母提取物1g，胰蛋白胨2g。去离子水定容至90ml，121℃高压灭菌15分钟后加入20％葡萄糖溶液10ml。

YPD平板(100ml)：酵母提取物1g，胰蛋白胨2g，琼脂1.5g。去离子水定容至90ml，121℃高压灭菌15分钟后加入20％葡萄糖溶液10ml，倒平板。

MD(HIS-)平板(100ml)：琼脂1.5g去离子水定容至80ml，121℃高压灭菌15分钟后加入10×YNB溶液10ml，生物素(500×)200ul，20％葡萄糖溶液10ml，倒平板。

MM平板(100ml)：琼脂1.5g，去离子水定容至80ml，121℃高压灭菌15分钟后加入10×YNB溶液10ml，生物素(500×)200ul，10％(v/v)甲醇10ml，倒平板。

BMGY培养基(1L)：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，溶于700ml去离子水中，121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温，加入1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)100ml，10×YNB溶液100ml，生物素(500×)2ml，10％(v/v)甘油100ml。

BMMY培养基(1L)：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，溶于700ml去离子水中，121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温，加入1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)100ml，10×YNB溶液100ml，生物素(500×)2ml，无菌去离子水90ml，使用时加甲醇(1％)。

BSM无机盐培养基(1L)：Sodium Citrate·2H₂0 1.5g，CaSO₄·H₂O 1.01g，K₂SO₄18g，MgSO₄7.32g，KOH4.13g，85％H₃PO₄27ml，甘油32ml，补去离子水至1L，121℃1.5kg/cm2高压灭菌20分钟。

PTM1溶液(1L)：CuSO₄·5H₂O 6g，MnSO₄·H₂O 3g，H₃BO₄0.02g，ZnCl₂20g，KI0.8g，NaMoO₄·2H₂O 0.2g，CoCl₂·6H₂O 0.49g，FeSO₄·7H₂O 65.06g，H₂SO₄10ml，CaSO₄·2H₂O0.5g，MgSO₄1.71g，生物素0.2g，0.22um滤器过滤除菌2ml/L。

CD40-N基因克隆

根据Genbank上CD40(522bp)基因序列设计并合成引物：

正向引物：CGCCTCGAGAAAAGA CCAGAACCACCCACTGCA(SEQ ID NO:4)；

反向引物：TTAATAATGCGGCCGCTCATCTCAGCCGATCCTG(SEQ ID NO:5)；

将培养的RKO细胞裂解抽取RNA，采用Trizol法从哺乳动物细胞或组织样品中抽提RNA。

RNA经Nanodrop测定浓度后，使用Transcript First Strand SynthesisSupermix(TransGene Biotech)反转录mRNA成cDNA。

应用正向引物和反向引物进行PCR，获得含有CD40-N基因的扩增产物。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳120v20分钟，然后用胶回收试剂盒(Axygen公司)回收。

PCR回收产物、载体pPIC9K分别用XhoI NotI双酶切，连接获得连接产物，pPIC9K-CD40-N。将连接产物化DH-5α。筛选阳性克隆。阳性克隆菌株抽提质粒鉴定正确性，菌液等体积加入50％无菌甘油-80℃保存。

CD40-N密码子优化，并构建到PIC9K上

根据NCBI CD40基因胞外段序列送公司序列优化合成。

CD40-N天然序列如SEQ ID NO:3。密码子优化后的序列如SEQ ID NO:2中第16-537位：

CGCCTCGAGAAAAGAGAGCCACCCACAGCTTGCAGAGAGAAACAATATCTGATTAACTCCCAGTGTTGCTCTCTGTGCCAACCAGGTCAGAAATTGGTGTCTGATTGCACTGAATTTACCGAGACAGAATGCCTTCCATGCGGCGAATCAGAATTCCTTGATACCTGGAATCGTGAAACTCACTGTCATCAACATAAGTACTGTGATCCTAACTTAGGATTGAGGGTACAGCAAAAGGGAACTTCCGAAACCGACACAATCTGTACTTGTGAGGAGGGTTGGCATTGTACTTCAGAAGCTTGTGAAAGTTGTGTCTTGCACAGATCCTGTTCCCCTGGTTTTGGTGTCAAGCAAATTGCAACGGGTGTCTCTGATACTATATGTGAACCTTGCCCCGTTGGCTTTTTCTCTAACGTTAGTTCTGCCTTCGAGAAGTGTCACCCATGGACTTCATGTGAGACGAAAGATTTAGTTGTTCAGCAAGCTGGAACCAATAAAACAGACGTGGTTTGTGGACCTCAAGACAGACTACGATAAGCGGCCGCATTATTAA(SEQ ID NO:2)

将合成的序列、载体pPIC9K分别用XhoI/NotI双酶切。双酶切产物切胶回收，连接，转化，摇菌，小抽鉴定。

构建CD40-N表达质粒

引物设计如下：

正向引物(2条)：

CD40-S-F：TGAATGATGCGGCCGCGAAATGGTTCGTCTGCCTCTGC(SEQ ID NO:6)；

CD40-M-F：TTAATAATGCGGCCGCGAAATGCCAGAACCACCCACTG CA(SEQ ID NO:7)；

反向引物(1条)：

CD40-FLAG-R：CGCCTCGAGTCACTTGTCATCATCGTCCTTGTAGTCTCTC AGCCGATCCTG(SEQID NO:8)。

利用前述获得的RKO细胞系cDNA作为模板，分别利用引物CD40-S-F/CD40-FLAG-R进行PCR获得含信号肽的CD40胞外段基因，引物CD40-M-F/CD40-FLAG-R获得成熟CD40胞外段基因。

PCR回收产物、载体pPIC9K分别用XhoI/NotI双酶切。双酶切产物切胶，连接，获得pPIC9K-CD40-N-Flag(没有优化的，含信号肽)和pPIC9K-CD40-N-Flag(不含信号肽)。

连接产物转化DH-5α。质粒抽提试剂盒(Axygen公司)进行质粒抽提。抽提质粒用XhoI/NotI进行双酶切鉴定。将酶切后样品进行琼脂糖凝胶电泳1％琼脂糖，20分钟到30分钟，出现9k+0.5k条带即为阳性克隆，测序进一步确定序列是否正确，同时阳性克隆菌株菌液等体积加入50％无菌甘油-80℃保存。

将前述制备的pPIC9K-CD40-N-Flag(CD40-N为密码子优化的，不含信号肽)利用SalI进行质粒的线性化。电转化巴斯德毕赤酵母GS115，筛选G418抗性菌株。

(1)将筛选的菌株划到平板上，划线尽量长，出现单克隆。

(2)挑单克隆接种到5ml BMGY中30℃250rpm过夜培养。

(3)菌液1:100接种到50ml BMGY中，30℃250rpm培养。

(4)约16h后，菌液OD达到2-6之间，换BMMY(甲醇1％)培养基开始诱导，同时留样200ul，留样样品离心12000，1分钟，取上清160ul，-30℃存放。

(5)24h后，加50％甲醇1ml，留样200ul，留样样品离心12000，1分钟，取上清160ul，-30℃存放。

(6)48小时、72小时后，同操作5。

(7)96小时时，收集摇瓶培养液，离心3500rpm，5分钟，收集上清。

(8)检测表达将0小时、24小时、48小时、72小时、96小时样品加5x上样缓冲液40ul，100℃煮沸10分钟，12％分离胶SDS-PAGE，150v，约70分钟。考马斯亮蓝染色液染色过夜，脱色后查看结果。

免疫蛋白印迹Western Blot

(1)上样：2好的12％SDS-PAGE胶中；

(2)电泳：80V30分钟120V10ug或者40ug样品加入配置20分钟；

(3)转膜：将PVDF(4.5cm×8cm)泡在甲醇中1分钟，转膜液冰上预冷；采用夹心法转膜，顺序为：黑色塑料板(负极)-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白色塑料板(正极)，再将转膜夹按照正确电极顺序放入转膜槽中，加入转膜液，冰块，恒压100V50分钟冰浴中进行；

(4)封闭：5％脱脂牛奶放在摇床上1个小时；

(5)一抗：按适宜一抗浓度稀释抗体(根据抗体说明书)，4℃孵育过夜；

(6)洗膜：PBS-0.05％Tween20洗膜三次，每次5分钟；

(7)二抗：加入适当浓度的HRP标记二抗(根据抗体说明书)，室温孵育1小时；

(8)洗膜：PBS-0.05％Tween20洗膜三次，每次5分钟；

(9)显影：用Pierce West Pico底物或者millipore显影，FujiFilm LAS4000扫膜成像。

pPIC9K-CD40(P)-N的高密度发酵(P指代密码子优化序列)

接种：

(1)-80℃低温冰箱中取出菌株，划YPD平板。

(2)2至3天后，待平板长出单克隆，挑单克隆菌株于5ml YPD培养基中30℃250rpm过夜培养，此为一级种子液。

(3)将一级种子液全部倒入含200ml YPD摇瓶中，30℃250rpm培养约12小时达到OD6004，作为二级种子液。

发酵：

(4)在5L发酵罐中装入3L BSM无机盐培养基，121℃高压灭菌20分钟分钟，冷却至室温，加入PTM₁6ml，用氨水调节PH至4.5。

(5)接入二级种子液200ml，溶氧控制为35％，搅拌速度为650rpm，温度设置为30℃，开始发酵，每隔4小时测定一次OD，当甘油耗尽后，使用50％甘油进行补料，至OD600达到110停止。待发酵罐中甘油被耗尽后，开始加入甲醇开始补料诱导，添加甲醇量在4小时内从0.8ml/分钟到4ml/分钟，以后一直维持此速度。每隔4小时测定发酵液0D。诱导36小时后，收集发酵液上清。

蛋白纯化超滤-G50-Q-Sepharose-FF法纯化

(1)超滤发酵液上清通过Millipore超滤系统用截留3KD的膜浓缩到500ml以内。

(2)SephadexG-50凝胶过滤层析使用前先用0.1M NaOH清洗SephadexG-50 1-2柱体积(CV)，后用Tris-HCL(PH7.4)平衡2个CV以上。接下来准备上样，将浓缩液500ml以5ml/分钟过柱，紫外280nm监测收集各个吸收峰下蛋白。

(3)电泳检测目的蛋白峰凝胶过滤层析后收集样品进行电泳，考马斯亮蓝染色脱色后，确定是否含有目的条带的组分。

(4)Q-Sepharose-FF离子交换层析使用前用0.1M NaOH清洗Q-Sepharose-FF1个柱体积，100％B将B通道充满洗脱缓冲液(1M Nacl Tris-HCL)过柱1个CV，平衡缓冲液平衡柱子10个柱体积后开始上样，3)中获得到的目的蛋白组分样品以5ml/分钟过柱。样品上样结束后，速度调为10ml/分钟平衡缓冲液清洗柱子3个柱体积，接下来将B通道调为20％100分钟速度还是10ml/分钟开始洗脱，紫外280nm监测各个蛋白吸收峰并收集各组份蛋白，各组份蛋白使用考马斯亮蓝染色和免疫蛋白印迹确定含有目的蛋白的组份。

CD40-N功能验证

(1)培养好的BJAB细胞(购自ATCC)铺12孔板，10⁶细胞/孔，共12孔。

(2)24小时后，在两个孔分别加入G28-5(购自ATCC)1ug/ml和G28-5 1ug/ml+CD40N10ug/ml。

(3)8小时后，在两孔分别加入G28-5 1ug/ml和G28-5 1ug/ml+CD40N10ug/ml。

(4)16小时后，在两个孔分别加入G28-5 1ug/ml和G28-5 1ug/ml+CD40N10ug/ml。

(5)20小时后，在两个孔分别加入G28-5 1ug/ml和G28-5 1ug/ml+CD40N10ug/ml。

(6)22小时后，在两个孔分别加入G28-5 1ug/ml和G28-5 1ug/ml+CD40N10ug/ml。

(7)24小时后，收样，将细胞转移到EP管中，500g4分钟离心去上清。

(8)用1ml PBS重悬细胞，500g4分钟离心去上清。

(9)用80ul1×上样缓冲液重悬细胞，100℃10分钟，样品冻存于-30℃冰箱。

(10)Western blot检测。

实施例1、克隆获得CD40胞外段基因

成熟CD40的胞外蛋白片段(CD40-N)为全长蛋白的20-193aa，相应mRNA长度为522bp。利用RKO细胞系cDNA作为模板，设计特异性引物，PCR可得单一DNA条带，琼脂糖凝胶电泳结果显示此条带略大于500bp(见图1)。PCR产物使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收。回收产物使用XhoI和NotI酶切，pPIC9k也使用相同酶切。酶切产物使用胶回收试剂盒回收，使用T4连接酶连接1小时，连接产物转化DH5α细菌。摇菌小抽质粒后，将获得的质粒再次用XhoI和NotI进行酶切鉴定，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果呈现两条带(9000bp+500bp)为阳性克隆，鉴定为阳性克隆的质粒送公司测序。测序结果在Pubmed网站上的用blast进行比对。插入片段序列与Genbank网站中CD40序列完全一致。使用该质粒pPIC9k-CD40-N电转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株，并筛选其中G418抗性的菌株。最后筛选到两株高性菌株，将这两只菌株分别扩大培养后，用甲醇进行诱导表达，收集诱导后0、24、48、72、96小时的酵母上清液，进行SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色，在目的大小位置没有观察到肉眼可见的条带(结果未示)。蛋白没有分泌或者表达过低。

实施例2、CD40-N序列密码子优化及获得CD40-N高表达毕赤酵母菌株

为了促进CD40-N在毕赤酵母中的表达，本发明人将CD40-N序列进行毕赤酵母偏好密码子优化，并去除了序列中的第一个氨基酸(脯氨酸)。将优化后的序列使用全基因合成，简称CD40N(P)，并构建到pPIC9K上，命名为pPIC9K-CD40N(P)，酶切鉴定见图2。将pPIC9K-CD40N(P)电转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115，筛选获得G418抗性菌株。

将筛选获得的菌株进行甲醇诱导表达：每隔12小时收集一次样品并补加甲醇，保持甲醇浓度为1％。84小时后停止诱导，将收集的样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色脱色后，发现在目的蛋白大小区域(27KDa)有一个明显的逐渐增加的蛋白带(图3A)。接下来用CD40抗体(af632R&D)对样品进行免疫蛋白印记(Western blot)分析。接下来，利用此抗体对1号菌株诱导表达的上清进行免疫印迹分析，该条带被CD40抗体特异性识别，证明该条带为CD40-N(图3B)。

实施例3、CD40-N表达菌株高密度发酵研究

为了获得高表达的CD40-N，接下来本发明人对所获得表达菌株进行了高密度发酵。将菌株扩大培养后灌装于发酵罐中进行高密度发酵培养。在溶氧控制为35％，搅拌速度为650rpm，温度设置为30℃的条件下，开始发酵，每隔4小时取样测OD值，酵母生长曲线如图(图4A)。酵母菌株在发酵罐中生长迅速，OD600达到70时，甘油被耗尽，使用50％甘油补料继续培养，待OD600达到110后约(20小时)，加入甲醇开始诱导。诱导过程中，每隔4小时收集一次发酵液，诱导60小时后下结束发酵。

发酵液离心后取上清进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色(图5B)。上清中目的蛋白不断积累增加，在36小时后不再明显增加，此后蛋白维持在一定水平。

实施例4、CD40-N纯化和糖基化鉴定

离心收集酵母培养上清，3L发酵液上清被收集后使用截留3kD超滤膜进行超滤，收集超滤后截留的组分体积约为500ml。接下来样品用AKTA仪器进行SephadexG-50凝胶层析。收集OD280紫外吸收峰下的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯亮蓝染色显示含目的蛋白组分出现在第一个紫外吸收峰中(图5A)。收集到样品约750ml，这时候盐分和部分色素已经被去除。将含有目的蛋白组分用Q-Sepharose-FF阴离子交换柱继续纯化，0-1.0MNaCl线性洗脱，目的蛋白组分在3％B通道处被收集获得(第一个紫外吸收峰1600ml处，见图5B箭头处)，共收集到3管，分别40ml。分子筛收集到样品和离子交换纯化后获得的样品进行SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后结果见图5C。

为了证实表达纯化的蛋白大小(约27KDa)与理论大小(19KDa)是不是由于糖基化导致的，将纯化的蛋白用去除N-糖基化的糖肽酶F(PNGaseF)处理，发现处理后蛋白大小变小为19KD，与理论一致(图5D)，因此该蛋白发生了N-糖基化。

实施例5、CD40-N的体外功能

1、功能性CD40-N可以体外阻断CD40-CD40L信号介导的非经典NF-κB信号通路

为了探索CD40-N是否具有阻断CD40介导的信号转导功能，进行如下实验。首先建立CD40激活的细胞系系统：BJAB细胞系在CD40激活性单抗G28-5作用下非经典NF-κB信号通路激活，TRAF3随时间增加而减少，p52随时间增加而增多。而在CD40-N加入后TRAF3的降解没有对照组明显，p100剪切成p52也没有对照组多(图6A)，因此证明CD40-N部分阻断了G28-5的对非经典NF-κB信号通路激活作用。

在另外一个实验中，BJAB细胞在CD40L作用24小时后p100剪切成p52明显增加，在仅仅加入0.1ug/ml CD40-N后，p52的增加相对于对照组减少，且这种减少随着CD40-N浓度增加而更加明显(图6B)。

上述实验证明，CD40-N可以体外阻断CD40介导的非经典NF-κB信号通路激活。

2、功能性CD40-N可以减少病人来源弥漫型大B细胞淋巴瘤细胞(DLBCL)的存活

为了探索CD40-N是否具有功能，在体外培养的病人来源的弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞(DLBCL PDC)和小鼠骨髓来源干细胞(BMSC)共培养中加入CD40-N检测细胞存活情况。在没有CD40-N加入时，可以看到BMSC能增加DLBCL PDC的存活率从没有加入时的3.05％到加入后的31％(图7左图，ANNEXIN V-，7-AAD-细胞)，在加入CD40-N后，DLBCL PDC存活降低为5.2％(图7)。

实施例6、CD40-N的体内功能

1、功能性CD40-N可以减弱病人来源弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)体内生长

既然CD40-N可以减少DLBCL PDC细胞体外存活，那么它能不能减弱DLBCL肿瘤体内生长呢？本发明人建立了PDX(病人来源的肿瘤移植物)肾囊膜模型进行研究。

PDX肾囊膜模型：将病人的淋巴瘤组织块(3mm*3mm*1mm)移植到裸鼠肾囊膜下，约2个月后肿瘤长出，取出肿瘤再次移植到新的裸鼠中，如此传递5代，肿瘤组织稳定。将稳定的肿瘤组织块(3mm*3mm*1mm)移植到裸鼠肾囊膜一周后，腹腔注射CD40-N(20mg/kg)或者等体积PBS(对照组)于小鼠，一周三次，2个月后取出肿瘤块分析。

2个月后观察DLBCL肿瘤的体内生长情况，发现CD40-N处理组肿瘤无论是质量和体积都显著小于对照组，如图8。

因此，CD40-N是可以阻断DLBCL肿瘤体内生长。

2、功能性CD40-N通过cMYC减弱病人来源弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)体内生长

为了探索CD40-N抑制DLBCL PDX肿瘤大小的机制，本发明人检测了两组肿瘤中与肿瘤生长和生长密切相关的分子表达情况。

首先，本发明人检测发现p100剪切成p52在CD40-N作用后是减少的，这证明CD40-N在体内是有活性的。

接下来，本发明人检测了肿瘤组织中的cMYC、p-STAT3、CyclinD1表达情况，结果发现cMYC在CD40-N处理后比对照组减少，而p-STAT3、CYCLIND1等没有明显减少(图9)。

3、功能性CD40-N可以减轻急性肠炎症状

在含DSS诱导急性肠炎模型(含2.75％DSS的水喂C57小鼠6天)中，实验组小鼠间隔一天腹腔注射CD40-N(5mg/kg)，对照组用PBS处理。第7天开始喂DSS的小鼠体重开始下降，第8天时，PBS处理组小鼠体重平均降到最高体重的76％左右，而CD40-N注射组体重只降低为最高体重的88％，如图10。

因此，功能性CD40-N可以减轻DSS诱导的急性肠炎模型症状。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.CD40蛋白氨基端胞外区的用途，用于制备抑制炎症的药物组合物，所述的炎症是肠炎；所述的CD40蛋白氨基端胞外区是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白，其由核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示的多核苷酸编码，且由毕赤酵母细胞表达。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还用于阻断CD40-CD40L信号通路和阻断CD40介导的非经典NF-κB信号通路的激活。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还用于：降低细胞内原癌基因cMYC的表达。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸包含于重组表达载体中。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，重组表达CD40蛋白氨基端胞外区的方法包括：

(1)提供一重组表达载体，其包含CD40蛋白氨基端胞外区的编码序列，所述的CD40蛋白氨基端胞外区是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白；

(2)将(1)的重组表达载体转化酵母细胞，获得重组酵母细胞；和

(3)培养(2)的重组酵母细胞，从而表达CD40蛋白氨基端胞外区。

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