JP2022061989A - 腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性ウイルスを含む薬物、医薬品の製造における使用、および腫瘍溶解性ウイルスの作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
治療を行うこと、化学療法、放射線療法および免疫療法と組み合わせてIL-12を使用することによって腫瘍療法を行うことを含む。これらの研究は、これらのIL-12が、ヒトおよびマウスの腫瘍細胞量の退縮および減少、ならびに腫瘍における血管新生の減少を引き起こし得ることを示した。しかしながら、上記の種々のIL-12のin vivo半減
期は非常に短く、治療効果を達成するためにはこれらのIL-12に対する持続投与および比較的大量(1から10μg/日)が通常必要であるのに対し、高用量のIL-12はしばしば重篤な全身性の副作用を招く。従って、in vivoでのIL-12の短い半減期お
よび毒性副作用の問題に対処することが急務である。
。
インターロイキン12をコードするヌクレオチド配列が提供される。
ド配列であってもよく、それによってコードされるタンパク質は抗腫瘍効果を示すか、または腫瘍退縮を引き起こす可能性があり、既存のIL-12と比較してより低い毒性および副作用を有する。
E3gp19Kプロモーターを用いて改変型IL-12遺伝子の発現を制御する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターAd-TD-nsIL-12(China Center for Type Culture Collection、中国、武漢市、Wuhan University、受入番号CCTCC 番号:V201520、寄託日:2015年5月21日、ヒトアデノウイルス血清型5変異体、Ad-TD-nsIL12としても知られている)である。
2 p40サブユニット(ns-p40、配列番号4に示すヌクレオチド配列)をコードする遺伝子に連結することによって得られる。
ノウイルス血清型5であるが、E1A-CR2、E1B19K及びE3gp19Kの3つ
の遺伝子の欠失を有し、E3gp19Kプロモーターを用いて改変型IL-12遺伝子の発現を制御する。組換えアデノウイルスベクターは、腫瘍細胞で選択的に複製され、腫瘍への進入後に改変型ヒトIL-12を発現するため改変型IL-12の発現が腫瘍細胞に限定される。腫瘍細胞の溶解により、発現されたIL-12が放出され、腫瘍関連抗原が同時に放出され、放出された腫瘍関連抗原およびIL-12は、ウイルスに感染していない転移性小腫瘍病変を含む遠隔腫瘍細胞をさらに死滅させるためのin vivoで効率的で特
異的な抗腫瘍応答を誘導する相乗効果を示す。これらの腫瘍には、固形腫瘍、転移性腫瘍、および肉眼で観察することができるかまたは顕微鏡下で見ることができる浸潤性腫瘍が含まれる。組換えアデノウイルスベクターは、腹腔内に播種する腫瘍および同所性腫瘍に対してより強い腫瘍増殖抑制効果を有し、より低い毒性を有する。
(1)nsIL-12融合遺伝子のクローニング:培養したRPMI-8866細胞の全RNAを抽出してcDNAに逆転写し、改変型p35サブユニット遺伝子(ns-p35、配列番号3にヌクレオチド配列を示す)および改変型p40サブユニット遺伝子(プライマー:p40-F:CCTACGTAATGATATGGGAACTGAAGAAAG、p40-R:GCCCACCCCAGGTACCCCTACTCCAGGAACACTGCAGGGCACAGATGC、ns-p40、配列番号4にヌクレオチド配列を示す)をクロー二ングするために、SnaBI切断部位とエラスチン配列(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)を含むプライマー(p35-F: GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTG, p35-R: GCTACGTATTAGGAAGCATTCAGATA)を用いてPCRを行い、ns-p40サブユニット遺伝子断片およびns-p35サブユニット遺伝子断片をPCRで連結してnsIL-12全遺伝子断片を形成し、nsIL-12全遺伝子断片をクローニングベクターTベクターに連結し、これをT-nsIL-12とする。T-nsIL-12プラスミドをSnaBIで消化してnsIL-12遺伝子断片(配列番号1)を得る。
(2)pSSE3gp19Kシャトルベクターの構築:pSS-CHLのCHL上流のマルチクローニングサイト(図1参照)をSal1およびEcoRVで消化し、左腕として
使用するE3 6.7K遺伝子終止コドンの上流1091bp配列を両端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、pSS-CHLに連結してpSSE3gp19K-Lを形成する。pSSE3gp19K-LをSnaB1とXho1で消化し、E3gp19K遺伝子終止コドンの下流1146bp配列をその2つの末端にSnaB1とXho1切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をpS
SE3gp19Kシャトルベクターを形成するために連結する。
(3)pSSE3gp19K-nsIL-12ベクターの構築:pSSE3gp19KベクターをEcoRVで消化し、その末端リン酸基をホスファターゼで除去した後、nsIL-12遺伝子断片と連結してpSSE3gp19K-nsIL-12ベクターを作製し、その配列を配列解析によって決定する。
(4)Ad-TD-nsIL-12-CHLの構築:pSSE3gp19K-nsIL-12をPme1で線状化し、nsIL-12を含む大きな断片を回収し、BJ5183コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってpAd-TDベクター(特許文献ZL200910066130.4参照)との相同組換えを行い、陽性クローンpAd-TD-nsIL-12-CHLを選別する。
(5)pAd-TD-nsIL-12の構築:ポジティブベクターpAd-TD-nsIL-12-CHLをSwa1で消化してCHL遺伝子を欠失させ、Swa1及びT4リガーゼを失活させた後、それを用いてTOP10コンピテント細胞を形質転換してpAd-TD-nsIL-12ベクターを得る。及び
(6)Ad-TD-nsIL-12ウイルスベクターの構築:組換えpAd-TD-nsIL-12ベクターをPac1で線状化し、293細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターAd-TD-nsIL-12を作製する。
p40-リンカー-p35またはp35―リンカー-p40
非分泌性IL-12は分泌シグナルペプチドを含まない。好ましくは、上記構造中のp40もp35もシグナルペプチドを含まない。
「リンカー」については、当業者は、従来技術(例えば、Adv Drug DelivRev. 2013 October 15; 65 (10):1357-1369およびFront Immunol. 2015 Apr 7;6: 136)に従って、種々の既知のリンカーに由来する適切なリンカーを設計または選択することができる。好ましくは、リンカーは(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)の配列を有する。当業者であれば、本開示に基づいて、当業者は様々な他の配列(J Biomed Nanotechnol. 2015 Aug; 11
(8): 1418-30)を有するリンカーを設計することができる。
アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されてもよく、置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持してもよい。例えば、p40は、配列番号6に基づいて1または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入また
は付加によって得られるアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成されてもよく、置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持していてもよい。
本発明に記載される置換において、アミノ酸残基の置換は、好ましくは以下の各群の中で行われる:
1:ロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン
2:アスパラギン酸、グルタミン酸;
3:アスパラギン、グルタミン;
4:リジン、アルギニン;
5:プロリン、ヒドロキシプロリン;
6:セリン、スレオニン; そして
7:フェニルアラニン、チロシン。
ないことが好ましい。バリアントは、親またはその天然のアミノ酸配列に対し約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%99.8%
以上、または99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、親または天然のアミノ酸配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
8%以上、または99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、その天然アミノ
酸配列又は親配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
、99.7%以上、99.8%以上、または99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配
列を含み、その天然アミノ酸配列又は親配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
、99.7%以上、99.8%以上、または99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配
列を含み、その天然アミノ酸配列又は親配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
9.8%以上、または99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、配
列番号2の活性を有してもよい。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
的配列を含むか、またはそれから構成される。
以下の配列を含むか、またはそれから構成される:
a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
b)配列番号1のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズすること
が可能で、非分泌性IL-12活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;または
c)上記a)またはb)の相補的配列。
a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
b)配列番号1のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズすること
が可能で、非分泌性IL-12活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;または
c)上記a)またはb)の相補的配列。
et al: J MoI Biol 215: 403, 1990)。BLASTNを使用してアミノ酸配列を分析す
る場合、パラメーターはスコア=100、語長=12、さらにBLASTXを使用してア
ミノ酸配列を分析する場合、パラメーターはスコア=50、語長=3、BLASTおよびGapped BLASTを使用する場合、各プログラムのパラメーターはそれらのデフォルトパラメーター値であってもよい。
Culture Collection、中国、武漢市、Wuhan University、受入番号CCTCC 番号:V201520、寄託日:2015年5月21日、ヒトアデノウイルス血清型5変異体)である。
できるベクター、または本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを対象に投与することを含む。
癌、子宮頸癌、腎臓癌、脳腫瘍、骨肉腫、胃癌、食道癌、結腸直腸癌(直腸癌および十二指腸癌)、肝臓癌、肺癌、骨癌、膀胱癌、卵巣癌、リンパ腫、血液癌、乳癌、頭頚部癌、子宮癌、メラノーマおよび他の癌、ならびに癌の症状を含むが、これらに限定されない固形腫瘍、腹腔内に播種する腫瘍または転移性腫瘍であってもよい。好ましくは、本発明により治療される癌は、好ましくは、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌または胃癌およびそれらの関連症状である。
望であれば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してもよい。所望であれば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してもよい。
できる。
たは「being characterized in」と類義語であり、包括的またはオープンであり、記載されていない追加の要素または方法ステップを排除するものではない。「含む」という用語が、本明細書中の任意の表現において、特に本発明の方法、使用または製品を記載する際に使用される場合、その方法、使用または製品は、実質的に構成成分または要素またはステップからまたはこれらによって構成される製品、方法および使用、および構成成分または要素またはステップからまたはこれらによって構成される製品、方法および使用、を包含することを理解されるべきである。本発明の例示的に記載された実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない、1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限が存在しない場合に実行されてもよい。
ベルの発現によって引き起こされる毒性および副作用のような欠点を克服することを見いだした。加えて、それはより強い腫瘍増殖阻害効果を有し、有意に毒性を有さない。さらに、シグナルペプチドを含まないIL-12をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター(例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルス)は、腫瘍または癌(例えば、腹腔内に播種する腫瘍およびin situの腫瘍)に対してより強い腫瘍増殖阻害効果と弱い毒性を有す
る。
えば、腫瘍溶解性ウイルス)が腫瘍細胞または癌細胞を溶解し、腫瘍関連抗原または癌細胞関連抗原を放出する場合に、身体は放出された腫瘍関連抗原または癌細胞関連抗原と相乗的に作用するための有効量のIL-12を体内に有効に補充することができない。したがって、シグナルペプチドを含まないIL-12をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター(例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルス)と比較して、シグナルペプチドを含むIL-12をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクター(例えば組換え腫瘍溶解性ウイルス)は、より強い毒性および副作用を引き起こし、身体に効率的で特異的な抗腫瘍または抗癌応答を生じさせることはできない。
1.既存のIL-12と比較して、本発明の改変型IL-12は主に局所腫瘍組織に分布しており、腫瘍細胞に対する特異性を高め、IL-12の全身性副作用を減少させる。
2.本発明の方法は、IL-12タンパク質を安定で持続的かつ低レベルで発現させることができる改変型IL-12を発現させるために腫瘍標的化ウイルスベクターを利用し、短い半減期および高レベルの発現によって引き起こされる毒性および副作用のような既存のIL-12タンパク質の欠点を克服する。
3.既存のIL-12と比較して、本発明の改変型IL-12は、腹腔内に播種した腫瘍およびin situの腫瘍に対してより強い腫瘍増殖阻害効果を有し、重大な毒性はない。
本発明を実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似のまたは同じ結果を得るために、本発明の教示に照らしてこれらの実施形態を改変することができ、これらの改変はすべて本発明の範囲内にある。
(1)nsIL-12融合遺伝子のクローニング:培養したRPMI-8866細胞の全RNAを抽出し、cDNAに逆転写し、改変型p35サブユニット遺伝子(ns-p35、配列番号3にヌクレオチド配列を示す)および改変型p40サブユニット遺伝子(プライマー:p40-F:CCTACGTAATGATATGGGAACTGAAGAAAG、p40-R:GCCCACCCCAGGTACCCCTACTCCAGGAACACTGCAGGGCACAGATGC、ns-p40、配列番号5にヌクレオチド配列を示す)をクロー二ングするために、SnaBI切断部位とエラスチン配列(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)を含むプライマー(p35-F:GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTG、p35-R:GCTACGTATTAGGAAGCATTCAGATA)を用いてPCRを行い、ns-p40サブユニット遺伝子断片およびns-p35サブユニット遺伝子断片をPCRで連結してnsIL-12全遺伝子断片を形成し、nsIL-12全遺伝子断片をクローニングベクターTベクターに連結し、これをT-nsIL-12とした。T-nsIL-12プラスミドをSnaBIで消化して、nsIL-12遺伝子断片(配列番号1)を得て使用のためにスタンバイした。
(2)pSSE3gp19Kシャトルベクターの構築:pSS-CHLのCHL上流のマ
ルチクローニングサイト(図1参照)をSal1およびEcoRVで消化し、左腕として
使用するE3 6.7K遺伝子終止コドンの上流1091bp配列を両端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、pSS-CHLに連結してpSSE3gp19K-Lを形成した。pSSE3gp19K-LをSnaB1とXho1で消化し、E3gp19K遺伝子終止コドンの下流1146bp配列をその2つの末端にSnaB1とXho1切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をpSSE3gp19Kシャトルベクターを形成するために連結した。
(3)pSSE3gp19K-nsIL-12ベクターの構築:pSSE3gp19Kベ
クターをEcoRVで消化し、その末端リン酸基をホスファターゼで除去した後、nsIL-12遺伝子断片と連結してpSSE3gp19K-nsIL-12ベクターを作製し、その配列を配列解析によって決定した。
(4)Ad-TD-nsIL-12-CHLの構築:pSSE3gp19K-nsIL-12をPme1で線状化し、nsIL-12を含む大きな断片を回収し、BJ5183コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってpAd-TDベクター(特許文献ZL200910066130.4参照)との相同組換えを行い、陽性クローンpAd-TD-nsIL-12-CHLを選別した。
(5)pAd-TD-nsIL-12の構築:ポジティブベクターpAd-TD-nsIL-12-CHLをSwa1で消化してCHL遺伝子を欠失させ、Swa1及びT4リガーゼを失活させた後、それを用いてTOP10コンピテント細胞を形質転換してpAd-TD-nsIL-12ベクターを得た。そして
(6)Ad-TD-nsIL-12ウイルスベクターの構築:組換えpAd-TD-nsIL-12ベクターをPac1で線状化し、293細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターAd-TD-nsIL-12を作製した。
3.組換えAd-TD-nsIL-12ベクターをPac1で線状化し、293細胞に導入して、Ad-TD-nsIL12としても知られている組換えアデノウイルスベクターAd-TD-nsIL-12(ヒトアデノウイルス血清型5変異体、China Center for Type Culture Collection、武漢市、中国、Wuhan University、受入番号CCTCC 番号:V201520、寄託日:2015年5月21日)を作製した。
1.シャトルベクターpVV-TK-nsIL-12の構築
実施例1に記載したように、Sal1およびNheI切断部位を含むプライマーでnsI
L-12遺伝子をクローニングし、対応する酵素で消化して利用するためにスタンバイし、pVV-TKプラスミドをSal1およびNheIで消化(図2参照、構築は本発明者らによって公開された方法によって行われた、Mol Ther Methods Clin Dev. 2015 Sep 16;2:15035. doi: 10.1038/mtm.2015.35. eCollection 2015)し、nsIL-12遺伝子はpVV-TK-nsIL-12ベクターを構築するためにpVV-TKと連結した(図3)。
CV1細胞を培養し、次いでCV1を96ウェルプレートに接種した。細胞が90%コンフルエントになったら、CRISP-cas9およびgRNAプラスミドでトランスフェクションし、24時間後にワクシニアウイルスVVL15に感染させ、2時間後にpVV-TKでトランスフェクトした。24時間後、それらを蛍光顕微鏡下で観察し、VV-TK-nsIL-12ウイルスベクター(図4)がうまく組換えられたことを示す赤色蛍光細胞クローンを選別した。
採取した赤色蛍光クローンを1度凍結および解凍した後、再びCV1細胞に感染させ、赤色蛍光クローンを採取し、このスクリーニングプロセスを5回繰り返し、CV1細胞を感染させてウイルスを産生した。そのゲノムを配列決定のために抽出した。
Ad11-Tel-nsIL-12の構築方法であって、以下のステップを含む。
1.nsIL-12を含むシャトルベクターpSSE3-18.5K-nsIL-12の構築
(1)pSSE3-18.5Kの構築:pSS-CHL(pBR322プラスミドに基づ
いて構築、図1参照)のマルチクローニングサイトをSnaB1およびXho1で消化し
、左腕として使用するE3 16.1K遺伝子終止コドンの上流535bp配列を両端にSnaB1およびXho1切断部位を含むプライマーを用いてクロー二ングし、pSS-CHLに連結してpSSE3-18.5K-Lを形成した。pSSE3-18.5K-LをSal1およびEcoRVで消化し、2つの末端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてE3-18.5K遺伝子終止コドンの下流584bp配列をその2つの末端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をpSSE3-18.5Kシャトルベクターを形成するために連結した。(2)pSSE3-18.5K-nsIL-12ベクターの構築:pSSE3-18.5KベクターをSnaB1で消化し、ホスファターゼを用いて末端リン酸基を除去した後、nsIL-12遺伝子断片と連結してpSSE3-18.5K-NsIL-12ベクターを作製し、その配列解析を行った。
(3)pSS3gp19K-nsIL-12をPme1で線状化し、nsIL-12を含む大きな断片を回収し、BJ5183コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってAd11-Tel-GFP(特許文献ZL20110143385.3の構築方法を参照)との相同組換えを行い、陽性クローンAd11-Tel-nsIL-12(図4参照)を選別した。
細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターAd11-Tel-nsIL-12を作製した。
培養ヒト膵癌Suit2およびCapan1、頭頸部腫瘍EC9706、肺癌A549およびH1299、食道癌EC9706およびZZB、卵巣癌SKOV3、結腸直腸癌SW620およびHCT116ならびに胃癌AGS細胞をトリプシンで消化し、計数し、6ウェルプレートに2×105細胞/ウェルで播種し、Ad-TD-nsIL-12およびVV-TK-nsIL-12で別々に感染させ、上清および細胞混合物をそれぞれ回収し、それらのIL-12発現レベルをELISAによって検出した。図5および図6にその結果を示す。
培養膵癌SUIT2およびCapan1、頭頸部腫瘍EC9706、肺癌A549およびH1299、食道癌EC9706およびZZB、卵巣癌SKOV3、結腸直腸癌SW620およびHCT116ならびに胃癌AGS細胞をトリプシンで消化し、2%FBSを含むDMEMで細胞懸濁液にし、B1~G1が無細胞培地であり、他の3つがPBSである9
6ウェルプレートの中央に接種した。
勾配を形成し、最後の列の細胞にはウイルスを加えなかった。複数の割合の希釈の後、10μl/ウェルずつ各列において同じウイルス勾配になるよう、バレーピペッターを用い
てウイルスを96ウェルプレートの中心に加えた。
に添加した。1~4時間後、溶液を取り出し、490nmの波長における吸光度を決定するためマイクロプレートリーダーで測定した。それに応じてEC50を計算し、結果を図7および8に示した。
5~6週齢シリアンハムスターの腹腔内に、1×107SHPC6細胞(セントルイス大
学のWSM Wold提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞)を接種し、そして動物は4日後にグループごとに9匹ずつ4つのグループに分けた。動物は、500μlのPBS、
1×109PFUのAd-TD-LUC(LUCは、実施例1でのAd-TD-nsIL
-12の構築方法に従って構成されるpGL3ベクタールシフェラーゼに由来する)、Ad-TD-IL-12(全長ヒトIL-12、実施例1に記載のAd-TD-nsIL-12の構築方法に従って構築)、またはAd-TD-nsIL-12を別々に1回腹腔内
注射した。注射後1日目、3日目および5日目に、血清試料を採取し、末梢血中のIL-12発現の変化を分析し、その結果を図9に示した。
5~6週齢の各シリアンハムスターの背中の右上に、1×107HPD1-NR(セント
ルイス大学のWSM Wold提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞)を接種した。各グループの動物の平均腫瘍体積は約330mm3であった。PBS、Ad-TD-LUC、
Ad-TD-IL-12およびAd-TD-nsIL-12を用いて、それぞれの腫瘍内注射を行った。ウイルスベクターを1×109PFUの用量で1日1回、合計6回注射し
、腫瘍増殖曲線および腫瘍フリーレートを観察した。結果を図10および図11に示した。
10%抱水クロラールを用いて4~5週齢のシリアンハムスターの麻酔を行い、シリアンハムスターの左腹部を開き、脾臓に接続する膵臓を見つけ、3×106個のHapT1細
胞(セントルイス大学のWSM Wold提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞)を膵臓実質に接種した。6日後、腫瘍を有する動物をグループごとに7匹ずつ4グループに分けた。1日おきに合計6回、500μlのPBS、1×109PFUのAd-TD-LUC、Ad-TD-IL-12またはAd-TD-nsIL-12をそれぞれ腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図12に示した。
4~5週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種した。
4日後、動物はグループごとに10匹ずつ4つのグループに分けた。治療のために1日おきに計3回、500μlのPBS、1×109PFUのAd-TD-LUC、Ad-TD-IL-12またはAd-TD-nsIL-12を別々に腹腔内注射した。動物の生存時
間を観察し、その結果を図13に示した。
5~6週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種し、4
日後、動物はグループごとに9匹ずつ分けた。500μlのPBS、1×109PFUのAd-TD-LUC、Ad-TD-nsIL-12または5×108PFUのAd-TD-
IL-12の腹腔内注射を1回行い、注射後1日目、3日目および5日目に、血清試料を
採取した。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアルカリホスファターゼ(ALP)を検出し、その結果を図14に示す。
-12の肝毒性がAd-TD-IL-12のそれより有意に低いことを示す。
5~6週齢の各シリアンハムスターの背部の右上部に1×107のHCPC1細胞(シリ
アンハムスター頭頸部腫瘍細胞)を接種した。各グループの平均腫瘍体積が約330mm3であるとき、PBS、Ad-TD-LUCおよびAd-TD-nsIL-12をそれぞ
れ腫瘍内注射した。ウイルスベクターを5×107PFUの用量で1日1回、合計6回注
射した。腫瘍増殖曲線および腫瘍フリーレートを観察し、その結果を図15に示した。
4~5週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種した。
4日後、動物はグループごとに10匹ずつ4つのグループに分けた。治療のために1日おきに計3回、500μlのPBS、4×107PFUのVV-TK-RFP(赤色蛍光タンパク質を挿入。VV-TK-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)、VV-TK-IL-12(全長ヒトIL-12遺伝子を挿入。VV-TK-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)またはVV-TK-nsIL-12を腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図16に示す。
4~5週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種した。
4日後、動物はグループごとに10匹ずつ4つのグループに分けた。治療のために1日おきに計3回、500μlのPBS、1×109PFUのAd11-Tel-GFP(緑色蛍光タンパク質を挿入。Ad11-Tel-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)、Ad11-Tel-IL-12(全長ヒトIL-12遺伝子を挿入。Ad11-Tel-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)またはAd11-Tel-nsIL-12を腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図17に示す。
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