WO2021029385A1 - 腫瘍溶解性ワクシニアウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
[1]ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素(RNR)の機能が欠損したワクシニアウイルス。
[2]正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性が向上した制限増殖型の[1]に記載のウイルス。
[3]C11R、O1L、及びF4Lの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、[1]又は[2]に記載のウイルス。
[4]ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素(RNR)の機能が欠損しており、さらに、細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性及び生産性が向上した制限増殖型ワクシニアウイルス。
[5]C11R、O1L、及びF4Lの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、[4]に記載のウイルス。
[6]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13Lよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子であり、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、[4]又は[5]に記載のウイルス。
[7]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子であり、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、[4]又は[5]に記載のウイルス。
[8]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子であり、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、[4]又は[5]に記載のウイルス。
[9]EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、IHD-J株又はIHD-W株である、[4]~[8]のいずれかに記載のウイルス。
[10][1]~[9]のいずれかに記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
[11]静脈内投与用、腹腔内投与用又は腫瘍内投与用である、[10]に記載の医薬組成物。
[12][1]~[9]のいずれかに記載のウイルスに外来DNAを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
[13]外来DNAが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするDNAである、[12]に記載のベクター。
[14]正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子のDNA配列が、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のDNA配列で置換されている、生産性が向上した前記ウイルス。
[15]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13Lよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、[14]に記載のウイルス。
[16]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、[14]に記載のウイルス。
[17]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、[14]に記載のウイルス。
[18]EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、IHD-J株又はIHD-W株である、[14]~[17]のいずれかに記載のウイルス。
[19][14]~[18]のいずれかに記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
[20][14]~[18]のいずれかに記載のウイルスに外来DNAを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
[21]外来DNAが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするDNAである、[20]に記載のベクター。
[22]正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子のDNA配列を、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のDNA配列で置換することを含む、制限増殖型ワクシニアウイルスの生産性を向上させる方法。
[23]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13Lよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、[22]に記載の方法。
[24]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、[22]に記載の方法。
[25]細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、[22]に記載の方法。
[26]EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、IHD-J株又はIHD-W株である、[22]に記載の方法。
「LC16m8-B5RmO」は、LC16m8のB5R遺伝子をその親株ウイルスであるLC16mOのB5R遺伝子のDNA配列に改変したウイルスである。
「MD-RVV」は、LC16m8-B5RmOウイルスのC11R及びO1L遺伝子を欠損させたウイルスである。
「MD-RVV-ΔRR」は、MD-RVVウイルスのF4L遺伝子を欠損させたウイルスである。
「MD-RVV-A34R」は、MD-RVVのA34R遺伝子をIHD-Jワクシニアウイルス株のA34R遺伝子DNA配列に置換したウイルスである。
「MD-RVV-ΔRR-A34R」は、MD-RVV-ΔRRウイルスのA34R遺伝子をIHD-Jワクシニアウイルス株のA34R遺伝子のDNA配列に置換したウイルスである。
「MD-RVV-EEV6」は、MD-RVVウイルスのA33R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子を、それぞれ、IHD-Jワクシニアウイルス株のA33R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子のDNA配列に置換したウイルスである。
「MD-RVV-ΔRR-EEV6」は、MD-RVV-ΔRRウイルスのA33R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子を、それぞれ、IHD-Jワクシニアウイルス株のA33R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子のDNA配列に置換したウイルスである。
「MD-RVV-EEV7」は、MD-RVVウイルスのA33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子を、それぞれ、IHD-Jワクシニアウイルス株のA33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子のDNA配列に置換したウイルスである。
「MD-RVV-ΔRR-EEV7」は、MD-RVV-ΔRRウイルスのA33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子を、それぞれ、IHD-Jワクシニアウイルス株のA33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、F13L遺伝子のDNA配列に置換したウイルスである。
人体への投与実績のある痘そうワクチン株であるLC16m8ワクシニアウイルスゲノム(Morikawa,S.,et al.,Journal of General Virology,79(18),11873-11891,2005)の改変により、遺伝子組換えワクシニアウイルスを作製した(図1)。
BACシステムを用いてワクシニアウイルスゲノムを改変した(図2参照)。細胞培養での相同組換えにより、ワクシニアウイルスLC16m8株のゲノムにBACgfp配列を挿入したBACウイルスを作製し、BACウイルスのゲノムを環状化してLC16m8-BACmidを作製した。第一段階として、LC16m8にマーカーとなるBACgfp配列を導入するためのインサーションプラスミド(pUC-VVTK-BAC-EGFP)の構築を行った。具体的な手法は、ワクシニアウイルスLC16m8株ゲノム(GenBank:AY678275.1)を鋳型に、TK1プライマーFw(配列番号1)及びTK1プライマーRe(配列番号2)を用いてTK1を増幅し、また、同株ゲノムを鋳型に、TK2プライマーFw(配列番号3)及びTK2プライマーRe(配列番号4)を用いてTK2を増幅した。TK1に制限酵素KpnI及びPacIを処理し、TK2に制限酵素XbaI及びPacIを処理した後、アガロースゲルから目的断片を精製した。
LC16m8-BACmidを鋳型として改変BACmidを作製した。あらかじめ、後に培養細胞からBACgfp配列が除かれた組換えウイルスを回収するために必要なBACgfp除去配列カセット(配列番号6)を作製した。BACgfp除去配列カセットの作製方法は以下の通りであった。pUC119プラスミド(GenBank:U07650.1)を制限酵素HincII及びBamHIで処理後精製し、アルカリフォスファターゼ処理し、また、pBSIIプラスミド(GenBank:U25267.1)にpBeloBAC11配列(GenBank:CVU51113.1)を挿入したプラスミドを制限酵素XbaIで処理後精製した断片に、制限酵素ScaI及びBglIIを処理後精製し、前述のプラスミドとライゲーションさせ、pUC119-pBeloSBを構築した。さらに、pUC119-pBeloSBに制限酵素NruIを処理し、精製した(pUC119-pBeloSB/NruI/elution)。次に、ワクシニアウイルスLC16m8株ゲノム(GenBank:AY678275.1)を鋳型に、TKプライマーFw(配列番号7)及びTKプライマーRe(配列番号8)を用いてTK領域を増幅し、また、pEPkan-Sプラスミド(Addgene)を鋳型に、カナマイシンプライマー1Fw(配列番号9)及びカナマイシンプライマー1Re(配列番号10)を用いてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅させた。上述2つのPCR産物を精製し、pUC119-pBeloSB/NruI/elutionとともに、In-Fusion HD Cloning Kit(Takara)を用いて3つの断片を反応させ、反応液を大腸菌JM109(Takara)へ導入し、反応後、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールを添加したCG寒天培地にプレーティングし、目的のプラスミド(pUC119-BAC-SBTKdup)を保持したクローンを得た。培養した大腸菌からpUC119-BAC-SBTKdupプラスミドを抽出し、制限酵素PstI及びKpnIで処理後精製してpUC119-BAC-SBTKdup/PstI/KpnI/elutionを作製し、BACgfp除去配列カセット(配列番号6)とした。
目的の組換えウイルスを作製するために、改変する遺伝子の発現カセットを以下の方法で作製した。LC16m8株は安全なワクチン株として弱毒化されたウイルスであるが、腫瘍溶解性ウイルスの有効性においては、培養細胞での増殖性の高い親株であるLC16mO株を用いる方が望ましい。LC16m8は、B5R遺伝子配列中の1塩基欠損(グアニン欠損)によるフレームシフトにより不完全なB5Rタンパク質が産生されることが知られている(Morikawa,S.,et al.,Journal of General Virology,79(18),11873-11891,2005)。そこで、LC16m8-BACmidのB5R遺伝子配列を、完全なB5R遺伝子配列をもつLC16mOの配列に改変したBACmidを構築するため、B5R改変カセット(配列番号11)を以下の方法で作製した。LC16mOのB5R遺伝子配列中の、上記グアニンから上流、下流それぞれ約1kb、計2132bpを人工合成し、pUCFk-B5RmO(配列番号12)を構築した。このDNAを制限酵素EcoRIで処理し精製後、アルカリフォスファターゼ処理した(pUCFk-B5RmO/EcoRI/elution/BAP)。また、pEPkan-Sプラスミド(Addgene)を鋳型に、カナマイシンプライマー2Fw(配列番号13)及びカナマイシンプライマー2Re(配列番号14)を用いてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅し、精製後、制限酵素EcoRIで処理し精製してrKanI/EcoRI/elutionを作製した。pUCFk-B5RmO/EcoRI/elution/BAPとrKanI/EcoRI/elutionをライゲーションし、pUCFk-B5RmO-rKanIを構築した。pUCFk-B5RmO-rKanIを制限酵素XbaI及びDraIで処理後精製し、pUCFk-B5RmO-rKanI/XbaI/DraI/elutionを作製した。これをB5R改変カセット(配列番号11)としてBACmidの改変に用いた。
VGFの機能を欠損したウイルスを回収するために、C11R欠損カセット(配列番号15)を作製した。C11R遺伝子配列の開始コドンから制限酵素AccIサイトまでの255bpを欠失させた配列及びその前後約1kbを人工合成し、pUC57-ΔVGF(配列番号16)を構築した。pUC57-ΔVGFを制限酵素AccIで処理し精製後、アルカリフォスファターゼ処理しpUC57-ΔVGF/AccI/elution/BAPを作製した。pEPkan-Sプラスミド(Addgene)を鋳型に、カナマイシンプライマー3Fw(配列番号17)及びカナマイシンプライマー3Re(配列番号18)を用いたPCRによりカナマイシン耐性遺伝子を増幅し、アガロースゲルから精製後、TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングした。反応液を大腸菌JM109(Takara)へ導入し、得られたコロニーからプラスミドを抽出してTOPO-rKanIを作製した。TOPO-rKanIを制限酵素AccIで処理し、精製後、制限酵素ScaIで処理し、アガロースゲルから精製し、rKanI/AccI/ScaI/elutionを作製した。pUC57-ΔVGF/AccI/elution/BAPとrKanI/AccI/ScaI/elutionをライゲーションし、pUC57-ΔVGF-rKanIを構築した。pUC57-ΔVGF-rKanIを制限酵素ScaIで処理し、さらに、制限酵素BamHI及びEcoRIで処理後アガロースゲルから精製し、C11R欠損カセット(配列番号15)としてBACmidの改変に用いた。
O1Lの機能を欠損したウイルスを回収するために、O1L欠損カセット(配列番号19)を作製した。O1L遺伝子配列の開始コドンから制限酵素XbaIサイトまでの1049bpを欠失させた後に、XbaIサイト直後の50bpに、カナマイシン耐性遺伝子配列(Addgene)を挿入した配列を人工合成し、pUC57-ΔO1L-rKanI(配列番号20)を構築した。pUC57-ΔO1L-rKanIに、制限酵素ScaI及びEcoRIを処理し、アガロースゲルから精製し、O1L欠損カセット(配列番号19)としてBACmidの改変に用いた。
RNRの機能を欠損したウイルスを回収するために、F4L欠損カセット(配列番号21)を作製した。F4L遺伝子配列の開始コドンからEcoRIサイトまでの765bpを欠失させた後に、EcoRIサイト直後の50bpに、カナマイシン耐性遺伝子配列(Addgene)を挿入した配列を人工合成し、pUC57-ΔF4L-rKanI(配列番号22)を構築した。pUC57-ΔF4L-rKanIに、制限酵素BamHI及びHindIIIを処理し、アガロースゲルから精製し、F4L欠損カセット(配列番号21)としてBACmidの改変に用いた。
EEV関連遺伝子をIHD-J株もしくはIHD-W株のDNA配列に置換したウイルスを回収するために、A33R改変カセット(配列番号23)、A34R改変カセット(配列番号24)、A36R改変カセット(配列番号25)、A33-34-36R改変カセット(配列番号26)、A56R改変カセット(配列番号27)、B5R改変カセット(配列番号28)、F12-13L改変カセット(配列番号29)を作製した。その具体的な手法は、IHD-J株もしくはIHD-W株由来の各遺伝子配列を用意し、特定の部位の直後50bpに、カナマイシン耐性遺伝子配列(Addgene)を挿入した配列を人工合成し、pUC57-A33R-rKanI(配列番号30)、pUC57-A34R-rKanI(配列番号31)、pUC57-A36R-rKanI(配列番号32)、pUC57-A33―34-36R-rKanI(配列番号33)、pUC57-A56R-rKanI(配列番号34)、pUC57-B5R-rKanI(配列番号35)、pUC57-F12-13L-rKanI(配列番号36)を構築した。pUC57-B5R-rKanI(配列番号35)に制限酵素XbaI及びBglIを処理し、それ以外には制限酵素BamHI及びBglIを処理し、アガロースゲルから精製し、エンベロープ改変カセットとして各BACmidの改変に用いた。
LC16m8-B5RmO-BACmidの作製方法を下記に記す。前述のLC16m8-BACmidを保持した大腸菌を培養し、B5R改変カセット(配列番号11)をエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーション溶液を、クロラムフェニコール及びカナマイシンを添加したCG寒天培地で培養し、カセット中のカナマイシン耐性をマーカーとして、カセットが導入されたクローンを選択し、さらにカナマイシン耐性遺伝子除去操作を行い、BACgfp配列中のクロラムフェニコール耐性をマーカーとして目的クローンを取得した。プライマーペア(配列番号37及び配列番号38)を用いたPCRにより目的遺伝子断片を増幅し、精製後、シーケンス用プライマー(配列番号37)を用いた塩基配列解析により、得られたクローンは目的の改変BACmid(LC16m8-B5RmO-BACmid)であることが確認された。
C11R欠損確認プライマーFw(配列番号39)及びC11R欠損確認プライマーRe(配列番号40);
O1L欠損確認プライマーFw(配列番号41)及びO1L欠損確認プライマーRe(配列番号42);
F4L欠損確認プライマーFw(配列番号43)及びF4L欠損確認プライマーRe(配列番号44);
A33R改変確認プライマーFw(配列番号45)及びA33R改変確認プライマーRe(配列番号46);
A34R改変確認プライマーFw(配列番号47)及びA34R改変確認プライマーRe(配列番号48);
A36R改変確認プライマーFw(配列番号49)及びA36R改変確認プライマーRe(配列番号50);
A56R改変確認プライマーFw(配列番号51)及びA56R改変確認プライマーRe(配列番号52);
B5R改変確認プライマーFw(配列番号53)及びB5R改変確認プライマーRe(配列番号54);
F12―13L改変確認プライマーFw(配列番号55)及びF12―13L改変確認プライマーRe(配列番号56)
BACgfp除去配列カセットを持つBACmid由来のウイルスは、培養細胞で継代を重ねることでBACgfpが抜けるように設計されている。前述のBACウイルス(LC16m8-BACgfp)をヘルパーウイルスとして用い、RK13細胞からLC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid由来のウイルスを回収した。6穴プレートで培養したRK13細胞に、ヘルパーウイルスとしてLC16m8-BACgfpをMOI=1で接種し、1時間培養後にウイルスを除き、新たに培地を加えた。次に、LC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid及びトランスフェクション試薬を混合し、15分間反応後、細胞へ添加し、37℃で一晩培養した。蛍光顕微鏡を用いてGFP発現を確認した後、GFP蛍光陰性プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結融解後、超音波処置し、遠心後の上清をウイルス液として得た。ウイルス液を培地で段階希釈し、96穴プレートで培養したRK13細胞に接種し、37℃で二晩培養した。蛍光顕微鏡でGFP蛍光陰性プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結融解後、超音波処置し、遠心後、上清をウイルス液として得た。本作業を繰り返し、2回連続で、RK13細胞におけるウイルスプラークが全て蛍光陰性になったところでウイルス純化完了とした。回収したウイルスを6穴プレートで培養したRK13細胞に接種し、37℃で二晩培養後、ゲノム抽出キットを用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、プライマーペア(配列番号61及び配列番号62)を用いてPCRを実施し、バンドサイズからBACgfp配列の除去を確認した。さらに、PCR産物を精製し、BACgfp除去確認プライマー(配列番号61)及びB5Rグアニン挿入確認プライマー(配列番号37)を用いて塩基配列解析を行い、BACgfp配列挿入部位から当該配列が除去されていること、さらに、B5R遺伝子配列中の特定の位置に、LC16m8では欠失している塩基(グアニン)が挿入されたことが確認され、これをLC16m8-B5RmOとした。
C11R欠損確認プライマーFw(配列番号39)及びC11R欠損確認プライマーRe(配列番号40);
O1L欠損確認プライマーFw(配列番号41)及びO1L欠損確認プライマーRe(配列番号42);
F4L欠損確認プライマーFw(配列番号43)及びF4L欠損確認プライマーRe(配列番号44);
A33R改変確認プライマーFw(配列番号45)及びA33R改変確認プライマーRe(配列番号46);
A34R改変確認プライマーFw(配列番号47)及びA34R改変確認プライマーRe(配列番号48);
A36R改変確認プライマーFw(配列番号49)及びA36R改変確認プライマーRe(配列番号50);
A56R改変確認プライマーFw(配列番号51)及びA56R改変確認プライマーRe(配列番号52);
B5R改変確認プライマーFw(配列番号53)及びB5R改変確認プライマーRe(配列番号54);
F12―13L改変確認プライマーFw(配列番号55)及びF12―13L改変確認プライマーRe(配列番号56);
BACgfp合成プライマーFw(配列番号61)及びBACgfp合成プライマーRe(配列番号62)
C11R及びO1L遺伝子が欠損した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであるMD-RVV及びそのEEV関連遺伝子改変ウイルス、並びにそれらのウイルスゲノムに存在するリボヌクレオチド還元酵素(RNR)小サブユニットをコードするF4L遺伝子を欠損させた改変ウイルスを、癌細胞及び正常細胞由来の培養細胞に感染させ、細胞障害性を細胞数測定キット(Cell Counting Kit-8,同仁化学)により評価した。癌細胞(ヒト子宮頸癌由来細胞株:HeLa細胞)及び正常細胞(ヒト皮膚線維芽細胞:NHDF)を96穴プレートに播種し、血清含有培地で接着培養後、無血清EMEM培地で血清飢餓培養した各細胞に、LC16m8-B5RmO、MD-RVV、MD-RVV-ΔRR、MD-RVV-ΔRR-A34R、MD-RVV-ΔRR-EEV6、MD-RVV-ΔRR-EEV7の各ウイルスを低濃度(0.8×106PFU/mL)及び高濃度(4.0×106PFU/mL)で接種し、72時間後、ウイルスを接種していない対照群の吸光度を100%とした場合の各ウイルス接種群の細胞生存率を細胞数測定キットにより定量した。その結果を図3に示す。ここで用いたすべてのウイルスは癌細胞に対し同様の細胞障害性を示したが(図3A)、正常細胞に対してはF4L遺伝子を欠損したウイルス(ΔRR)においてウイルス毒性が著しく軽減された(図3B)。
免疫不全マウス(SCIDマウス、5週齢、雌、各群5匹)にLC16m8-B5RmO、MD-RVV、MD-RVV-ΔRR-EEV6を2.5×104、5×105、1×107PFU/0.1mLの用量でマウス静脈内に投与し、生存数、体重、ウイルス症状スコアを観察した。ウイルス症状スコアは、最大5点で、0点:症状なし、1点:発痘1~2個、2点:発痘3~4個、3点:発痘多数、毛並みの荒れ、立毛、4点:呼吸困難、瀕死、5点:死亡、とした。その結果を図4~6に示す。LC16m8-B5RmO及びMD-RVV投与群は、それぞれ、ウイルス投与19日後及び40日後までにすべての用量群の動物が死亡したが、MD-RVV-ΔRR-EEV6は、観察終了とした71日まで、高用量投与群、中用量投与群は5匹中3匹が生存し、また、低用量投与群はすべての動物が生存していた(図4)。いずれのウイルスも投与量依存的に体重の減少が観察され、体重減少の程度は、LC16m8-B5RmO、MD-RVV、MD-RVV-ΔRR-EEV6の順に大きかった(図5)。ウイルス症状スコアもまた、LC16m8-B5RmO、MD-RVV、MD-RVV-ΔRR-EEV6の順に、投与量依存的に高値を示した(図6)。
HeLa細胞を24穴プレートに播種し、血清含有培地で接着培養後、MD-RVV、MD-RVV-A34R、MD-RVV-EEV6、MD-RVV-EEV7、MD-RVV-ΔRR、MD-RVV-ΔRR-A34R、MD-RVV-ΔRR-EEV6、MD-RVV-ΔRR-EEV7をMOI=1で接種し、1時間培養後にウイルスを除き、新たに血清含有培地を加え、16、24、32、48時間後に培地を回収し、培養上清ウイルスを得た。回収ウイルスを段階希釈し、6穴プレートで培養したRK13細胞に接種し、1時間培養後にウイルスを除き、新たにメチルセルロース培地を加え、37℃で72時間培養後、プラークをカウントし感染価を算出した。その結果を図7に示す。MD-RVV(図7A)及びMD-RVVのF4L遺伝子を欠損させたウイルス(図7B)に対して、EEV関連タンパク質を改変することにより、いずれの改変ウイルスも培養期間を通して培養上清ウイルスの産生量の増加傾向が示された。特に、EEV関連タンパク質の改変数が多いほどその効果は大きかった。
腹腔内投与において、RNR遺伝子欠損ウイルスが腹膜播種モデルマウスの生存延長効果を示すことを確認するために、3×106個のヒト膵がんBxPC3-Luc細胞を、免疫不全マウス(SCIDマウス、6週齢、雌)の腹腔内に移植しヒト膵がん腹膜播種マウスを構築後、21日後にMD-RVVまたはMD-RVV-△RR-EEV6(105PFU/0.1mL)を、マウス腹腔内に投与した。また、対照としたウイルス非投与群には、同じく21日後に、PBS(0.1mL)をマウス腹腔内に投与した。投与後、ウイルス毒性、生存数を観察した。なお、ウイルス毒性はその症状をスコア化し、最大5点で、0点:症状なし、1点:発痘(ポックス)1~2個、2点:発痘(ポックス)3~4個、3点:発痘(ポックス)多数、毛並みの荒れ、立毛、4点:呼吸困難、瀕死、5点:ウイルス関連死、とした。結果を図9~10に示す(図9:ウイルス症状スコア、図10:生存率)。
静脈内投与において、RNR遺伝子欠損ウイルスが膵がんモデルマウスの生存延長効果を示すことを確認するために、1×106個のヒト膵がんMIA-PaCa2/CMV-Luc細胞を、免疫不全マウス(SCIDマウス、5週齢、雌)の膵被膜に移植しヒト膵がん同所移植マウスを構築後、12日後にMD-RVV-RLuc(105PFU/0.1mL)またはMD-RVV-△RR-EEV6-RLuc(105PFU/0.1mL)をマウス静脈内に投与した。なお、RLucはウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子を意味し、将来ウイルスの生体内分布を確認することを目的に、RLuc発現カセット(配列番号63)を構築後、実施例1で欠損後のC11R-AccIサイトの直前に挿入した。また、MD-RVV-△RR-EEV6-RLucは、1回目の投与後、1週間以内に追加で2回投与した(頻回投与)。また、ウイルス非投与群には、同じく12日後に、PBS(0.1mL)をマウス静脈内に投与した。投与後、ウイルス毒性、生存数を観察した。なお、ウイルス毒性はその症状をスコア化し、最大5点で、0点:症状なし、1点:発痘(ポックス)1~2個、2点:発痘(ポックス)3~4個、3点:発痘(ポックス)多数、毛並みの荒れ、立毛、4点:呼吸困難、瀕死、5点:ウイルス関連死、とした。結果を図13及び14に示す(図13:ウイルス症状スコア、図14:生存率)。
RNR遺伝子欠損ウイルスの腫瘍内投与での腫瘍増殖抑制効果を確認するために、5×106個のヒト膵がんMIA-PaCa2/CMV-Luc細胞を、免疫不全マウス(SCIDマウス、6週齢、雌)の右大腿部皮下に移植し、腫瘍体積が100mm3以上に達した個体に対して、MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc(104、105、106PFU/0.1mL)を腫瘍内に投与した。また、ウイルス非投与群には、PBS(0.1mL)を腫瘍内に投与した。投与後、腫瘍体積変化を観察した。腫瘍体積は、短径×短径×長径×1/2で算出した。
配列番号2は、TK1プライマーReの塩基配列である。
配列番号3は、TK2プライマーFwの塩基配列である。
配列番号4は、TK2プライマーReの塩基配列である。
配列番号5は、pUCIDT-KAN-op7.5+EGFPプラスミドの塩基配列である。
配列番号6は、BACgfp除去配列カセットの塩基配列である。
配列番号7は、TKプライマーFwの塩基配列である。
配列番号8は、TKプライマーReの塩基配列である。
配列番号9は、カナマイシンプライマー1Fwの塩基配列である。
配列番号10は、カナマイシンプライマー1Reの塩基配列である。
配列番号11は、B5R改変カセットの塩基配列である。
配列番号12は、pUCFk-B5RmOの塩基配列である。
配列番号13は、カナマイシンプライマー2Fwの塩基配列である。
配列番号14は、カナマイシンプライマー2Reの塩基配列である。
配列番号15は、C11R欠損カセットの塩基配列である。
配列番号16は、pUC57-ΔVGFの塩基配列である。
配列番号17は、カナマイシンプライマー3Fwの塩基配列である。
配列番号18は、カナマイシンプライマー3Reの塩基配列である。
配列番号19は、O1L欠損カセットの塩基配列である。
配列番号20は、pUC57-ΔO1L-rKanIの塩基配列である。
配列番号21は、F4L欠損カセットの塩基配列である。
配列番号22は、pUC57-ΔF4L-rKanIの塩基配列である。
配列番号23は、A33R改変カセットの塩基配列である。
配列番号24は、A34R改変カセットの塩基配列である。
配列番号25は、A36R改変カセットの塩基配列である。
配列番号26は、A33-34-36R改変カセットの塩基配列である。
配列番号27は、A56R改変カセットの塩基配列である。
配列番号28は、B5R改変カセットの塩基配列である。
配列番号29は、F12-13L改変カセットの塩基配列である。
配列番号30は、pUC57-A33R-rKanIの塩基配列である。
配列番号31は、pUC57-A34R-rKanIの塩基配列である。
配列番号32は、pUC57-A36R-rKanIの塩基配列である。
配列番号33は、pUC57-A33―34-36R-rKanIの塩基配列である。
配列番号34は、pUC57-A56R-rKanIの塩基配列である。
配列番号35は、pUC57-B5R-rKanIの塩基配列である。
配列番号36は、pUC57-F12-13L-rKanIの塩基配列である。
配列番号37は、B5R改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号38は、B5R改変確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号39は、C11R欠損確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号40は、C11R欠損確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号41は、O1L欠損確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号42は、O1L欠損確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号43は、F4L欠損確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号44は、F4L欠損確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号45は、A33R改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号46は、A33R改変確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号47は、A34R改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号48は、A34R改変確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号49は、A36R改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号50は、A36R改変確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号51は、A56R改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号52は、A56R改変確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号53は、B5R改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号54は、B5R改変確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号55は、F12―13L改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号56は、F12―13L改変確認プライマーReの塩基配列である。
配列番号57は、A56R改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号58は、F12―13L改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号59は、F12―13L改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号60は、F12―13L改変確認プライマーFwの塩基配列である。
配列番号61は、BACgfp合成プライマーFwの塩基配列である。
配列番号62は、BACgfp合成プライマーReの塩基配列である。
配列番号63は、RLuc発現カセットの塩基配列である。
Claims (26)
- ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素(RNR)の機能が欠損したワクシニアウイルス。
- 正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性が向上した制限増殖型の請求項1に記載のウイルス。
- C11R、O1L、及びF4Lの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、請求項1又は2に記載のウイルス。
- ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素(RNR)の機能が欠損しており、さらに、細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性及び生産性が向上した制限増殖型ワクシニアウイルス。
- C11R、O1L、及びF4Lの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、請求項4に記載のウイルス。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13Lよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子であり、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、請求項4又は5に記載のウイルス。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子であり、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、請求項4又は5に記載のウイルス。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子であり、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、請求項4又は5に記載のウイルス。
- EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、IHD-J株又はIHD-W株である、請求項4~8のいずれか1項に記載のウイルス。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
- 静脈内投与用、腹腔内投与用又は腫瘍内投与用である、請求項10に記載の医薬組成物。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載のウイルスに外来DNAを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
- 外来DNAが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするDNAである、請求項12に記載のベクター。
- 正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子のDNA配列が、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のDNA配列で置換されている、生産性が向上した前記ウイルス。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13Lよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、請求項14に記載のウイルス。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、請求項14に記載のウイルス。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、請求項14に記載のウイルス。
- EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、IHD-J株又はIHD-W株である、請求項14~17のいずれか1項に記載のウイルス。
- 請求項14~18のいずれか1項に記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
- 請求項14~18のいずれか1項に記載のウイルスに外来DNAを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
- 外来DNAが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするDNAである、請求項20に記載のベクター。
- 正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子のDNA配列を、EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のDNA配列で置換することを含む、制限増殖型ワクシニアウイルスの生産性を向上させる方法。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13Lよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、請求項22に記載の方法。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、請求項22に記載の方法。
- 細胞外エンベロープウイルス(EEV)関連タンパク質をコードする遺伝子が、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L、及びF13L遺伝子である、請求項22に記載の方法。
- EEV産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、IHD-J株又はIHD-W株である、請求項22に記載の方法。
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