CN114364792A - 溶瘤牛痘病毒 - Google Patents

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Abstract

提供的是具有改善的安全性和生产率两者的溶瘤病毒。提供的是：条件复制性牛痘病毒，其缺乏牛痘病毒生长因子(VGF)、细胞外信号调节激酶(ERK)活化蛋白和核糖核苷酸还原酶(RNR)的功能，在正常细胞中并不复制，在增殖细胞中可选择性地复制，并且具有改善的安全性；以及条件复制性牛痘病毒，其缺乏VGF、ERK活化蛋白和RNR的功能，在正常细胞中并不复制，在增殖细胞中可选择性地复制，并且具有改善的安全性和生产率，并且其中编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因由具有高EEV产生能力的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。

Description

溶瘤牛痘病毒
技术领域
本发明涉及溶瘤牛痘病毒，其可以静脉内施用，并且具有下述特征：通过损害牛痘病毒生长因子(VGF)、细胞外信号调节激酶(ERK)活化蛋白和核糖核苷酸还原酶(RNR)的功能，限制正常细胞中的病毒复制来改善安全性，并且通过改变涉及牛痘病毒的细胞外包膜病毒(EEV)的病毒粒子形成的蛋白质的氨基酸残基，来改善肿瘤细胞和用于工业生产的宿主细胞中的病毒生产。本发明的牛痘病毒具有改善的病毒安全性和生产率，并且可以有效地用作抗癌剂。
背景技术
促分裂原活化蛋白激酶依赖性重组牛痘病毒(MD-RVV)已作为溶瘤牛痘病毒得到公开，其中编码牛痘病毒生长因子(下文也称为“VGF”)以及作为活化细胞外信号调节激酶(下文也称为“ERK”)的蛋白质的O1L蛋白的基因两者缺失，以限制在正常细胞中的生长，然而，在癌细胞中特异性增殖，从而损坏癌细胞(专利文件1)。
牛痘病毒利用表皮生长因子(下文也称为“EGF”)受体信号传导途径，以通过受感染细胞的快速和直接的运动性来促进病毒的传播(非专利文件1)。C11R蛋白是与EGF高度同源且在牛痘病毒感染的早期阶段分泌的牛痘病毒生长因子(VGF)，与受感染细胞和周围细胞上的EGF受体结合，以通过MAP激酶级联(Ras/Raf/MEK/ERK代谢途径)转导信号。另外，牛痘病毒的O1L蛋白在受感染的细胞中组成性地活化细胞外信号调节激酶(ERK)，并且促进病毒的致病性(非专利文件2)。C11R和O1L缺陷病毒(MD-RVV)降低病毒生长，因为ERK不能在正常细胞中被活化。然而，在具有异常活化的ERK途径的癌细胞中，灭活病毒的ERK活化功能得到补充，并且病毒增殖且成为破坏癌细胞的溶瘤病毒(专利文件1)。
为了减少病毒毒性，公开的是使用痘病毒的溶瘤病毒，在所述痘病毒中，在病毒基因组中编码的核糖核苷酸还原酶是失活的(专利文件2)。
众所周知的是，在牛痘病毒的A34R多肽的氨基酸位置K151处的点突变改善了细胞外包膜病毒的产生(非专利文件3和专利文件3)。
现有技术文件
专利文件
专利文件1：JP-A-2015-076422
专利文件2：JP-A-2011-504104
专利文件3：JP-A-2006-506974
非专利文件
非专利文件1：Beerli C.等人，Nature Microbiology，4(2)，216-225，2019
非专利文件2：Schweneker，M.等人，Journal of Virology，86(4)，2323-2336，2012
非专利文件3：Blasco，R.等人，Journal of Virology，67(6)，3319-3325，1993
非专利文件4：Downs-Canner，S.等人，Molecular Therapy，24(8)，1492-1501，2016
非专利文件5：Loren，K.等人，Clinical Cancer Research，23 (19)，5696-5702，2017
非专利文件6：McIntosh A. A.，Smith G. L.，Journal of Virology，70(1)，272-281，1996
非专利文件7：Ferguson M. S.等人，Advances in Virology，2012，805629，2012
非专利文件8：Badrinath N等人，International Journal of Nanomedicine，11，4835-4847，2016
非专利文件9：Bernet J.等人，Journal of Biosciences，28(3)，249-264，2003
非专利文件10：Dehaven B. C.等人，Journal of General Virology，92，1971-1980，2011
非专利文件11：Chung，C.-S.，Journal of Virology，72(2)，1577-1585，1998
非专利文件12：Gammon，D. B.等人，PLOS Pathogens，6(7)，e1000984，2010
非专利文件13：Aye Y.等人，Oncogene，34(16)，2011-2021，2015
非专利文件14：Engstroem Y.等人，The Journal of Biological Chemistry，260(16)，9114-9116，1985
非专利文件15：Torii，S.等人，Cancer Science，97(8)，697-702，2006。
发明内容
发明解决的问题
预计溶瘤牛痘病毒不仅通过瘤内施用有效治疗原发性肿瘤，而且通过使用静脉内注射的全身施用有效治疗全身微转移。然而，在其中溶瘤牛痘病毒静脉内施用的先前临床试验中，观察到与病毒排泄相关的不良作用连同提示功效的结果(非专利文件4；非专利文件5)。已寻求溶瘤病毒的安全性的进一步改善。
另一方面，已遗传修饰为压制正常细胞中的病毒增殖以改善安全性的溶瘤病毒在癌细胞和用于工业生产的宿主细胞中不同于其遗传修饰之前的亲株病毒。相比之下，它经常伴随着病毒增殖的降低，并且存在关于功效和生产率的降低的担心。因此，已期望改善病毒的安全性以及生产率。
然而，对于改善的功效和生产率，修饰编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因以增加EEV的比例是有用的。然而，EEV产生的增加涉及病毒毒性(非专利文件6)。
先前报道的关于溶瘤病毒的静脉内施用的临床试验数据已显示了，该病毒可以以有限的毒性安全且全身性地递送，然而，在功效方面存在个体差异。已发现了此类不完整性。这主要是因为在已确认为安全的剂量和剂量方案下，病毒在它到达其靶之前从循环中快速清除。这种现象主要是由于中和抗体、补体活化、抗病毒细胞因子和内源性组织巨噬细胞而发生，伴随其它组织如肺、肝和脾脏的非特异性摄取(非专利文件7)。在溶瘤病毒中，由于其许多有利的性质，牛痘病毒已成为临床前和临床研究的焦点(非专利文件8)。一些溶瘤牛痘病毒已通过静脉内施用进行临床测试。牛痘病毒分泌的牛痘病毒补体调节蛋白(下文也称为“VCP”)与补体C4b和C3b结合并使其失活，从而抑制补体活化的经典途径和替代途径(非专利文件9)。另外，EEV形式的牛痘病毒在其膜中掺入宿主蛋白质，所述蛋白质可以阻止补体活化，并且EEV蛋白A56R还固定分泌的VCP，以保护其免于补体攻击(非专利文件10)。
牛痘病毒并不具有特异性受体。此处，普遍存在于动物的所有组织(主要包括结缔组织)中的糖胺聚糖，如硫酸乙酰肝素，介导牛痘病毒和宿主细胞之间的相互作用。病毒直接与质膜融合，并且通过胞吞作用进入肿瘤细胞(非专利文件11)。因此，溶瘤牛痘病毒并不显示出对器官特异性的细胞偏好，并且应该对广泛范围的癌症类型具有疗效。另一方面，在通过静脉内施用治疗时，由于病毒生长所致的全身副作用成为问题。为了解决这个问题，必须严格限制在牛痘病毒感染正常细胞并侵入正常细胞后发生的细胞内病毒复制。一般而言，由于每种抗癌药物的有效范围和毒性范围彼此接近，因此不良作用在预计有效的剂量和剂量方案下发生。
解决问题的手段
牛痘病毒基因组具有编码核糖核苷酸还原酶(下文也称为"RNR")的基因，所述核糖核苷酸还原酶是DNA合成中的限速酶，并且包括I4L (大亚基；RRM1)和F4L (小亚基；RRM2)。F4L是培养细胞中的有效复制和小鼠中的病毒毒性所需的(非专利文件12)。同时，细胞中的RNR表达升高是许多癌症的特性，并且作为通过使用ONCOMINE数据库调查人癌症中的RNR基因表达的结果，RRM2在分析的168种癌症中的73种中最多过表达的基因中排名前10% (非专利文件13)。另外，哺乳动物的RNR活性是细胞周期依赖性的，并且RRM1的蛋白质水平在细胞周期自始至终是恒定的，而RRM2在DNA复制过程中的G1/S期表达，并且细胞周期依赖性酶活性受RRM2的水平调控(非专利文件14)。相比之下，细胞周期从G1期到S期的进展通过活化的ERK途径触发(非专利文件15)。相应地，具有受抑制的F4L功能的牛痘病毒可以使用细胞来源的RRM2在其中细胞活跃增殖的癌细胞中复制。然而，在正常细胞中，RRM2的表达水平低，使得病毒复制受到限制。从C11R和O1L的功能受抑制的MD-RVV中进一步缺失F4L，显著压制了正常细胞中的病毒生长并进一步改善了安全性。
预测作为生长受限的病毒(其不能在正常细胞中增殖，并且可以在靶癌细胞中选择性地生长)的溶瘤病毒，即使在肿瘤细胞和用于工业生产的宿主细胞中，也趋于具有比亲本病毒更低的生长潜力。F4L基因以及上文提到的C11R和O1L基因已缺失的溶瘤牛痘病毒，通过使用高度复制性癌细胞中的酶来补充病毒复制所需的ERK和RNR，使得病毒可以复制。
作为进一步补充缺乏与细胞增殖有关的ERK和RNR功能的病毒的生产率的方法，本发明人已集中于在病毒生命周期的晚期过程中表达的病毒粒子形成相关分子，同时通过使用来源于癌细胞的酶来补充ERK和RNR活性。此处，存在牛痘病毒的病毒粒子的四种不同形式(包括细胞内成熟病毒(下文也称为“IMV”)、细胞内包膜病毒(下文也称为“IEV”)、细胞相关包膜病毒(下文也称为“CEV”)和细胞外包膜病毒(下文也称为“EEV”))。编码作为EEV组分的七种不同蛋白质(A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L)的基因可以替代为具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因。已发现这改善病毒的生产率并且使得静脉内施用安全。于是，完成了本发明。
本发明提供了下述[1]至[20]。
[1]一种牛痘病毒，其缺乏牛痘病毒生长因子(VGF)、细胞外信号调节激酶(ERK)活化蛋白和核糖核苷酸还原酶(RNR)的功能。
[2]根据[1]的病毒，其是具有改善安全性的生长受限的病毒，其中所述病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制。
[3]根据[1]或[2]的病毒，其中C11R、O1L和F4L基因各自的全部或部分区域已缺失或修饰，并且这些基因产物的功能已失活。
[4]一种缺乏牛痘病毒生长因子(VGF)、细胞外信号调节激酶(ERK)活化蛋白和核糖核苷酸还原酶(RNR)的功能的生长受限的牛痘病毒，其中编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代，并且其中所述病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制，从而具有改善的安全性和生产率。
[5]根据[4]的病毒，其中C11R、O1L和F4L基因各自的全部或部分区域已缺失或修饰，以使这些基因产物的功能失活。
[6]根据[4]或[5]的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是选自A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L的一种或多种基因，并且已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。
[7]根据[4]或[5]的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L，并且已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。
[8]根据[4]或[5]的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L，并且已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。
[9]根据[4]至[8]中任一项的病毒，其中具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株是IHD-J株或IHD-W株。
[10]一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含根据[1]至[9]中任一项的病毒。
[11]根据[10]的药物组合物，其用于静脉内施用、腹膜内施用或瘤内施用。
[12]一种生长受限的牛痘病毒载体，其是外来DNA已引入其内的根据[1]至[9]中任一项的病毒。
[13]根据[12]的载体，其中所述外来DNA是编码癌症特异性抗原、免疫应答调节剂或对于癌细胞表面抗原具有亲和性的蛋白质的基因。
[14]一种具有改善生产率的生长受限的牛痘病毒，其中编码生长受限的牛痘病毒的细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因的DNA序列，已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因的DNA序列替代，并且其中所述生长受限的牛痘病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制。
[15]根据[14]的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是选自A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L的一种或多种基因。
[16]根据[14]的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
[17]根据[14]的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
[18]根据[14]至[17]中任一项的病毒，其中具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株是IHD-J株或IHD-W株。
[19]一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含根据[14]至[18]中任一项的病毒。
[20]一种生长受限的牛痘病毒载体，其是外来DNA已引入其内的根据权利要求14至18中任一项的病毒。
[21]根据[20]的载体，其中所述外来DNA是编码癌症特异性抗原、免疫应答调节剂或对于癌细胞表面抗原具有亲和性的蛋白质的基因。
本发明进一步提供了下述[22]至[26]。
[22]一种改善生长受限的牛痘病毒的生产率的方法，其包括：
编码生长受限的牛痘病毒的细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因的DNA序列由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因的DNA序列替代，其中所述生长受限的牛痘病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制。
[23]根据[22]的方法，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是选自A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L的一种或多种基因。
[24]根据[22]的方法，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
[25]根据[22]的方法，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
[26]根据[22]的方法，其中具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株是IHD-J株或IHD-W株。
发明效果
本发明可以提供可静脉内施用的溶瘤牛痘病毒，其通过损害牛痘病毒来源的VGF、ERK和RNR的功能，以便显著地压制正常细胞中的病毒生长，从而改善安全性，并且通过编码病毒的EEV相关蛋白的基因由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代，具有改善的生产率。该病毒可以有效地用作新型抗癌剂。
附图说明
图1是显示本发明的每种示例性重组牛痘病毒的结构的图解。
图2是说明如何产生本发明的示例性重组牛痘病毒的图解。
图3是显示F4L缺陷型修饰病毒对癌细胞或正常细胞中的细胞毒性的作用的图。A：HeLa (人宫颈癌细胞)；B：NHDF (正常人真皮成纤维细胞)。
图4是显示用F4L缺陷型修饰病毒静脉内施用的免疫缺陷小鼠的存活率的图表。
图5是显示用F4L缺陷型修饰病毒静脉内施用的免疫缺陷小鼠的体重变化的图表。
图6是显示用F4L缺陷型修饰病毒静脉内施用的免疫缺陷小鼠的状态变化的图表。
图7是显示EEV相关蛋白的修饰对使用含血清培养基的HeLa细胞中的生产率的作用的图。修饰基于(A) MD-RVV和(B)缺乏MD-RVV的F4L基因的病毒。
图8是显示EEV相关蛋白的修饰对使用化学成分确定的培养基的HeLa细胞中的生产率的作用的图。A：培养上清液病毒；B：细胞内病毒。
图9是显示在RNR基因缺陷型病毒的腹膜内施用后，腹膜转移的人胰腺癌小鼠的病毒症状评分的图表。
图10是显示在RNR基因缺陷型病毒的腹膜内施用后，腹膜转移的人胰腺癌小鼠的存活率的图表。
图11是显示在RNR基因缺陷型病毒的腹膜内施用后，腹膜转移的人胰腺癌小鼠的病毒症状评分的图表。
图12是显示在RNR基因缺陷型病毒的腹膜内施用后，腹膜转移的人胰腺癌小鼠的存活率的图表。
图13是显示在RNR基因缺陷型病毒的静脉内施用后，原位移植的人胰腺癌小鼠的病毒症状评分的图表。
图14是显示在RNR基因缺陷型病毒的静脉内施用后，原位移植的人胰腺癌小鼠的存活率的图表。
图15是显示在RNR基因缺陷型病毒的瘤内施用后，皮下移植的人胰腺癌小鼠中的肿瘤体积的图。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文使用的基因命名法是用于牛痘病毒Copenhagen株的那些基因命名法，并且也用于其它痘病毒科的同源基因。
本发明的溶瘤病毒可以通过修饰牛痘病毒基因组而制备为重组牛痘病毒。亲株牛痘病毒的实例包括Copenhagen、Western Reserve、Lister、LC16mO、LC16m8、TianTan或Wyeth。
此类牛痘病毒基因组可以使用例如LC16m8牛痘病毒的基因组进行修饰，所述LC16m8牛痘病毒是已施用于人体的天花疫苗株(Morikawa，S.等人，Journal of GeneralVirology，79 (18)，11873-11891，2005)。减毒株LC16m8由于B5R基因中的突变而具有减少的病毒感染和传播效率，所述B5R基因编码其亲株LC16mO的EEV组分之一。期望其复制能力在正常细胞中受限的本发明的牛痘病毒，在癌细胞中显著增殖且传播并且显示出强细胞毒性。因此，为了构建溶瘤牛痘病毒，可以使用LC16mO或通过将LC16m8病毒基因组的B5R基因改变为LC16mO病毒的B5R区的DNA序列而获得的病毒。
可以使用载体通过同源重组来修饰牛痘病毒基因组。将含有修饰的DNA基因序列的分离质粒转染到具有牛痘病毒感染的培养细胞内。由于修饰的DNA序列的存在，质粒的同源病毒DNA和病毒基因组之间的重组产生修饰的病毒。细菌人工染色体(BAC)系统可以用于修饰牛痘病毒DNA。BAC系统涉及这样的方法，其中将具有整合的BACgfp序列的病毒基因组保留在大肠杆菌中，并且通过利用大肠杆菌的遗传学来重组病毒基因组 (图2)。
本发明通过损害VGF、ERK活化蛋白和RNR的功能，使得能够获得可以在增殖细胞中选择性地复制且具有改善的安全性的生长受限的牛痘病毒。
编码VGF的基因是C11R，编码作为ERK活化蛋白的O1L蛋白的基因是O1L，并且编码作为RNR的小亚基的RRM2的基因是F4L。通过修饰牛痘病毒基因组中的这些基因，可以损害VGF、ERK活化蛋白和RNR的功能。
牛痘病毒中的VGF、O1L蛋白和RRM2功能缺乏意指C11R、O1L和F4L基因并不表达，或者即使它们表达，所表达的蛋白也未能保留VGF、O1L蛋白和RRM2的正常功能。为了损害VGF、O1L蛋白和RRM2的功能，C11R、O1L和F4L基因的全部或部分可以被缺失。另外，每种基因可以通过核苷酸取代、缺失或添加进行突变，使得既不能表达正常的VGF、O1L蛋白，也不能表达RRM2。另外，可以将外来基因插入C11R、O1L或F4L基因内。可以插入外来基因，或者可以通过例如公众已知的同源重组或位点特异性诱变使基因缺失或突变。在本发明中，当正常基因产物由于基因的缺失或突变而不表达时，可以说该基因是缺失的。C11R、O1L或F4L基因的缺乏可以通过使用特异性地扩增每种基因的引物对的PCR来检查。
进一步地，除VGF、ERK活化蛋白和RNR的功能损害之外，编码EEV相关蛋白的基因还由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。这可以改善增殖受限的牛痘病毒的生产率，伴随改善的安全性。
编码待修饰的EEV相关蛋白的基因可以是编码七种不同蛋白质(A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L)的基因中的至少一种，所述蛋白质是EEV的组分。例如，可以通过修饰编码A34R的基因来改善牛痘病毒的生产率。优选修饰A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L中的全部，并且更优选修饰A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L中的全部。
用于修饰编码EEV相关蛋白的基因的DNA序列的来源牛痘病毒的实例包括但不限于IHD-J或IHD-W。
在本发明中，为了改善生产率，通过编码EEV相关蛋白的基因由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代，来获得目的生长受限的牛痘病毒。这种牛痘病毒并无特别限制，只要生长受限的牛痘病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制。此类生长受限的牛痘病毒的优选实例包括但不限于本发明的上述生长受限的牛痘病毒，其通过损害VGF、ERK活化蛋白和RNR的功能而具有改善的安全性。例如，通过编码EEV相关蛋白的基因由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代，即使缺乏C11R和O1L的病毒(MD-RVV)也可以具有改善的生产率。
图1说明根据本发明产生的修饰的牛痘病毒。
“LC16m8-B5RmO”是其中LC16m8的B5R基因被修饰为其亲本病毒LC16mO的B5R基因的DNA序列的病毒。
“MD-RVV”是缺乏LC16m8-B5RmO病毒的C11R和O1L基因的病毒。
“MD-RVV-ΔRR”是其中MD-RVV病毒的F4L基因缺失的病毒。
“MD-RVV-A34R”是其中MD-RVV的A34R基因替代为IHD-J牛痘病毒株的A34R基因的DNA序列的病毒。
“MD-RVV-ΔRR-A34R”是其中MD-RVV-ΔRR病毒的A34R基因替代为IHD-J牛痘病毒株的A34R基因的DNA序列的病毒。
“MD-RVV-EEV6”是其中MD-RVV病毒的A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因分别替代为IHD-J牛痘病毒株的A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因的DNA序列的病毒。
“MD-RVV-ΔRR-EEV6”是其中MD-RVV-ΔRR病毒的A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因分别替代为IHD-J牛痘病毒株的A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因的DNA序列的病毒。
“MD-RVV-EEV7”是其中MD-RVV病毒的A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因分别替代为IHD-J牛痘病毒株的A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因的DNA序列的病毒。
“MD-RVV-ΔRR-EEV7”是其中MD-RVV-ΔRR病毒的A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因分别由IHD-J牛痘病毒株的A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因的DNA序列替代的病毒。
如本文使用的，“增殖细胞”意指具有比正常细胞更高的增殖功能的细胞，并且其实例包括但不限于癌细胞或恶性肿瘤细胞。
本发明的生长受限的牛痘病毒可以用于肿瘤细胞和用于工业生产的宿主细胞两者中。肿瘤细胞主要意指恶性肿瘤细胞，并且具有与癌细胞相同的含义。当按起源器官分类时，靶癌细胞的实例包括但不特别限于任何癌症类型的癌细胞，所述癌症类型例如肺癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肛门/直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、食道癌、脑/神经肿瘤、淋巴瘤/白血病、骨/骨肉瘤、平滑肌肌瘤或横纹肌瘤肌瘤。用于工业生产的宿主细胞的实例包括用于生产疫苗或生物药物的哺乳动物细胞(例如，Vero、GL37、CHO、HeLa、MRC-5、huGK-14)。
本发明的生长受限的牛痘病毒可以通过任何药物方法作为药物组合物产生，用于将该病毒施用到包括人在内的哺乳动物体内。例如，在生物反应器中培养的哺乳动物细胞用作宿主，以接种且培养本发明的病毒。然后，从细胞培养基中提取目的病毒并进行纯化。这之后，例如，添加药学上可接受的盐以产生制剂。
含有本发明的生长受限的牛痘病毒的药物组合物包含药学有效量的作为活性成分的本发明的生长受限的牛痘病毒，并且可以是无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳状液的形式。进一步地，药物组合物任选地包含例如药学上可接受的稀释剂、助剂或载体(例如盐、缓冲剂、佐剂)。施用方法并无特别限制，并且可以使用本领域技术人员已知的方法，在体内施用药物组合物。实例包括瘤内、静脉内、动脉、腹膜内、皮内、皮下、肌内、心室内、胸内、脊柱内、表皮内或粘膜表面注射。优选的是静脉内、腹膜内或瘤内施用。优选地，药物组合物通过静脉内施用进行全身施用。在本发明中，可以进行通过静脉内施用的全身性溶瘤病毒疗法，以不仅治疗原发性肿瘤，而且还治疗微转移癌。适当时，可以取决于每个受试者的年龄、性别、健康、体重等来确定有效剂量。用于成人的有效剂量不受限制，并且是例如约106-1011个噬斑形成单位(PFU)，且优选108-109个噬斑形成单位(PFU)/给药。
由牛痘病毒感染的细胞产生在病毒生命周期中发挥不同作用的四种病毒形式。IMV是最丰富的病毒形式，由于其物理上稳健的性质，适合于介导宿主之间的传递。然而，由于IMV对补体和抗体的敏感性，它不太适合于宿主中的传播。IEV充当IMV和CEV/EEV之间的中间体，确保EEV特异性蛋白质的摄取，使用微管将病毒粒子转运到细胞表面，并且用另外的膜和宿主蛋白覆盖IMV颗粒，以降低对抗体和补体的敏感性。这可以拓宽可以与牛痘病毒结合的宿主受体的范围。需要CEV以诱导来自在细胞表面上的病毒粒子下部的肌动蛋白尾的形成，并且促进病毒的有效细胞间转运。最终，EEV从细胞表面释放并介导宿主中的感染传播(Smith G. L.，Journal of General Virology，83 (Pt 12)，2915-2931，2002)。EEV形式的病毒制剂对于用于静脉内施用的溶瘤牛痘病毒是期望的。然而，由于病毒粒子的形态在病毒的生命周期过程中不断变化，因此不仅EEV在病毒培养过程中释放到培养上清液内，而且还混合了从通过病毒增殖破坏的细胞中泄漏的病毒粒子如IMV。从生产率和物理稳定性的观点来看，难以仅分离EEV用于生产。因此，EEV相关分子的修饰可以促成改善包括各种病毒粒子形式在内的溶瘤病毒制剂的功效和生产率。
预测由溶瘤病毒破坏的癌细胞的片段诱导对于自体癌症特异性的抗肿瘤免疫应答。掺入关于癌症特异性抗原和/或免疫应答调节剂的基因的各种病毒载体已作为癌症疫苗进行研究。牛痘病毒具有相对较大的病毒基因组，允许插入抗原蛋白的整个基因，并且具有在受感染细胞的细胞质中而不是在核中复制的能力。相应地，遗传材料整合到宿主细胞的基因组内的风险降到最低。因此，牛痘病毒作为病毒载体是极佳的。在哺乳动物细胞中具有极低的增殖能力的减毒牛痘病毒的MVA株，已用作安全的病毒载体。溶瘤病毒是减毒病毒，其生长在正常细胞中受到显著限制。使用每种溶瘤病毒作为病毒载体有利于诱导抗肿瘤免疫应答(Guo，Z. S.等人，Journal for ImmunoTherapy of Cancer，7 (1)，6，2019)。本发明的溶瘤牛痘病毒也可以用作具有基因插入的载体。所插入的基因和插入位点并无特别限制。例如，存在将关于癌症特异性抗原、免疫应答调节剂或对于癌细胞表面抗原具有亲和力的蛋白质的基因插入C11R、O1L或F4L基因(其基因功能在本发明中将受到损害)内或附近，或者插入EEV相关基因内或附近的方法。
通过从牛痘病毒基因组中缺失C11R、O1L和F4L，并且进一步用IHD-J株的氨基酸序列替代多个EEV相关蛋白的氨基酸序列，根据本发明的溶瘤病毒具有改善的安全性和生产率。
接下来，本发明将参考实施例更详细地进行描述。然而，本发明并不限于这些实施例。
实施例1
通过修饰疫苗株牛痘病毒的基因组产生生长受限的牛痘病毒
对LC16m8牛痘病毒的基因组进行修饰，以产生重组牛痘病毒(图1)，所述LC16m8牛痘病毒是已施用于人体的天花疫苗株(Morikawa，S.等人，Journal of General Virology，79 (18)，11873-11891，2005)。
1. 构建体LC16m8-BACmid的构建
牛痘病毒基因组使用BAC系统进行修饰(参见图2)。通过细胞培养中的同源重组，制备了其中BACgfp序列插入牛痘病毒LC16m8株的基因组内的BAC病毒，并且使BAC病毒基因组环化以构建LC16m8-BACmid。作为第一步，构建用于将作为标记物的BACgfp序列引入LC16m8内的插入质粒(pUC-VVTK-BAC-EGFP)。具体方法包括使用TK1引物Fw (SEQ ID NO:1)和TK1引物Re (SEQ ID NO: 2)，同时使用牛痘病毒LC16m8株基因组(GenBank：AY678275.1)作为模板来扩增TK1，并且使用毒株基因组作为模板以及TK2引物Fw (SEQ IDNO: 3)和TK2引物Re (SEQ ID NO: 4)来扩增TK2。TK1用限制性酶KpnI和PacI进行消化，而TK2用限制性酶XbaI和PacI进行消化。其后，从琼脂糖凝胶中纯化每个目的片段。
接下来，pUC119质粒(GenBank：U07650.1)用限制性酶KpnI和XbaI进行消化，并且进行纯化。然后，将上述两个片段插入碱性磷酸酶处理的质粒的KpnI/XbaI位点内，以构建pUC119-TK1-2。接下来，人工合成pUCIDT-KAN-op7.5+EGFP质粒(SEQ ID NO: 5)，用限制性酶PacI消化并纯化。随后，pUC119-TK1-2用限制性酶PacI进行消化，纯化，然后连接到碱性磷酸酶处理的质粒的PacI位点内，以构建pUC-VVTK-op7.5+EGFP质粒。进一步地，其中pBeloBAC11序列(GenBank：CVU51113.1)插入pBSII质粒(GenBank：U25267.1)内的质粒用限制性酶NotI进行消化，然后从琼脂糖凝胶中进行纯化。将所得到的质粒连接到质粒的NotI位点内，所述质粒通过用限制性酶NotI消化pUC-VVTK-op7.5+EGFP、纯化并用碱性磷酸酶处理进行制备。以这种方式，构建了pUC-VVTK-BAC-EGFP质粒。
接下来，下文描述了如何将BACgfp序列引入LC16m8基因组内。原代兔肾细胞(PRK)用牛痘病毒LC16m8株以MOI = 10进行感染，然后培养1小时以回收细胞。将回收的细胞悬浮于HeBS缓冲液中，并且加入用限制性酶HindIII线性化的pUC-VVTK-BAC-EGFP质粒，然后进行电穿孔。将电穿孔溶液连续稀释，并且用其感染已在96孔板上培养的PRK并进行培养。然后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达。选择在具有高稀释比的孔中具有荧光阳性噬斑或致细胞病变效应(CPE)的那些细胞。收集每个选定孔的细胞，超声处理且离心。然后，获得上清液作为其中BACgfp序列插入LC16m8内的病毒(LC16m8-BACgfp)。
进一步地，LC16m8-BACmid通过如下将LC16m8-BACgfp基因组环化并克隆到大肠杆菌内进行构建。通过使用转染试剂，用pCAGGS-Cre质粒(自行制备的)转染用LC16m8-BACgfp以MOI = 5感染的PRK。随后，将LC16m8-BACmid作为环化的病毒基因组进行提取，然后电穿孔到大肠杆菌GS1783 (WO2014077096A1)内。电穿孔溶液在补充有氯霉素的CG琼脂培养基上进行培养。这之后，使用BACgfp序列中的氯霉素抗性作为标记物，选择携带LC16m8-BACmid的大肠杆菌。最后，每个目的克隆都贮存于甘油中。
2. 修饰的BACmid的构建
使用LC16m8-BACmid作为模板来制备每种修饰的BACmid。从培养的细胞中预先制备BACgfp去除序列盒(SEQ ID NO: 6)，其是随后用于回收已去除BACgfp序列的重组病毒所需的。如何制备BACgfp去除序列盒如下所述。pUC119质粒(GenBank：U07650.1)用限制性酶HincII和BamHI进行消化，纯化并用碱性磷酸酶进行处理。此处，pBSII质粒(GenBank：U25267.1)与pBeloBAC11序列(GenBank：CVU51113.1)进行连接，以给出质粒。这种质粒用限制性酶XbaI进行消化并纯化，以给出片段。这种片段用限制性酶ScaI和BglII进行消化并纯化。将所得到的片段与上述质粒连接，以构建pUC119-pBeloSB。进一步地，pUC119-pBeloSB用限制性酶NruI进行消化并纯化(pUC119-pBeloSB/NruI/洗脱)。接下来，通过使用牛痘病毒LC16m8株基因组(GenBank：AY678275.1)作为模板，使用TK引物Fw (SEQ ID NO: 7)和TK引物Re (SEQ ID NO: 8)来扩增TK区。另外，通过使用pEPkan-S质粒(Addgene)作为模板，使用卡那霉素引物1Fw (SEQ ID NO: 9)和卡那霉素引物1Re (SEQ ID NO: 10)执行PCR，以扩增卡那霉素抗性基因。将上述两种PCR产物纯化。使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara)，使包括pUC119-pBeloSB/NruI/洗脱的三个片段反应。然后，将反应溶液引入大肠杆菌JM109 (Takara)内。在反应后，所得到的细菌在补充有氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的CG琼脂培养基上铺平板，以获得携带目的质粒(pUC119-BAC-SBTKdup)的克隆。从培养的大肠杆菌中提取pUC119-BAC-SBTKdup质粒，用限制性酶PstI和KpnI进行消化并纯化，以制备pUC119-BAC-SBTKdup/PstI/KpnI/洗脱作为BACgfp去除序列盒(SEQ ID NO: 6)。
B5R修饰盒：
为了制备目的重组病毒，通过下述方案制备待修饰基因的表达盒。虽然LC16m8株是作为安全疫苗株的减毒病毒，但考虑到溶瘤病毒的效力，期望使用作为培养细胞中的高度增殖性亲株的LC16mO株。已知LC16m8由于B5R基因序列中的单核苷酸缺失(鸟嘌呤缺失)，通过移码产生不完整的B5R蛋白(Morikawa，S.等人，Journal of General Virology，79(18)，11873-11891，2005)。然后，为了构建其中LC16m8-BACmid的B5R基因序列改变为具有完整B5R基因序列的LC16mO序列的BACmid，通过下述方案制备B5R修饰盒(SEQ ID NO: 11)。在LC16mO的B5R基因序列中，人工合成距离上文鸟嘌呤上游或下游各约1 kb，共计2132 bp，以构建pUCFk-B5RmO (SEQ ID NO: 12)。这种DNA用限制性酶EcoRI进行消化，纯化，然后用碱性磷酸酶进行处理(pUCFk-B5RmO/EcoRI/洗脱/BAP)。另外，使用pEPkan-S质粒(Addgene)作为模板、以及卡那霉素引物2Fw (SEQ ID NO: 13)和卡那霉素引物2Re (SEQ ID NO: 14)来执行PCR，以扩增卡那霉素抗性基因。扩增后产物进行纯化，用限制性酶EcoRI进行消化且纯化，以制备rKanI/EcoRI/洗脱。然后，通过连接pUCFk-B5RmO/EcoRI/洗脱/BAP和rKanI/EcoRI/洗脱，来构建pUCFk-B5RmO-rKanI。pUCFk-B5RmO-rKanI用限制性酶XbaI和DraI进行消化，然后纯化，以制备pUCFk-B5RmO-rKanI/XbaI/DraI/洗脱。这用作B5R修饰盒(SEQ IDNO: 11)，用于BACmid的修饰。
C11R缺陷盒：
制备C11R缺陷盒(SEQ ID NO: 15)，以便回收缺乏VGF功能的病毒。人工合成缺少从C11R基因序列的起始密码子到限制性酶AccI位点的255 bp的序列、以及在该序列前和在该位点后的约1 kb片段，以构建pUC57-ΔVGF (SEQ ID NO: 16)。pUC57-ΔVGF用限制性酶AccI进行消化，纯化且用碱性磷酸酶进行处理，以制备pUC57-ΔVGF/AccI/洗脱/BAP。通过使用pEPkan-S质粒(Addgene)作为模板，通过使用卡那霉素引物3Fw (SEQ ID NO: 17)和卡那霉素引物3Re (SEQ ID NO: 18)的PCR扩增卡那霉素抗性基因，从琼脂糖凝胶中进行纯化，然后克隆到TOPO载体(Invitrogen)内。将反应溶液引入大肠杆菌JM109 (Takara)内，并且从所得到的菌落中提取质粒，以产生TOPO-rKanI。TOPO-rKanI用限制性酶AccI进行消化，纯化，用限制性酶ScaI进行消化，并且从琼脂糖凝胶中进行纯化，以制备rKanI/AccI/ScaI/洗脱。然后，通过连接pUC57-ΔVGF/AccI/洗脱/BAP和rKanI/AccI/ScaI/洗脱，来构建pUC57-ΔVGF-rKanI。pUC57-ΔVGF-rKanI用限制性酶ScaI进行消化，并且用限制性酶BamHI和EcoRI进一步进行消化。所得到的片段从琼脂糖凝胶中进行纯化，并且用作C11R缺陷盒(SEQ ID NO: 15)，用于BACmid的修饰。
O1L缺陷盒：
制备O1L缺陷盒(SEQ ID NO: 19)，以便回收缺乏O1L功能的病毒。从O1L基因序列的起始密码子到限制性酶XbaI位点的1049 bp序列被缺失。接下来，人工合成其中紧在XbaI位点后50 bp处插入卡那霉素抗性基因序列(Addgene)的序列。以这种方式，构建了pUC57-ΔO1L-rKanI (SEQ ID NO: 20)。pUC57-ΔO1L-rKanI用限制性酶ScaI和EcoRI进行消化。所得到的片段从琼脂糖凝胶中进行纯化，并且用作O1L缺陷盒(SEQ ID NO: 19)，用于BACmid的修饰。
F4L缺陷盒：
制备F4L缺陷盒(SEQ ID NO: 21)，以便回收缺乏RNR功能的病毒。从F4L基因序列的起始密码子到EcoRI位点的765 bp序列被缺失。接下来，人工合成其中紧在EcoRI位点后50 bp处插入卡那霉素抗性基因序列(Addgene)的序列。以这种方式，构建了pUC57-ΔF4L-rKanI (SEQ ID NO: 22)。pUC57-ΔF4L-rKanI用限制性酶BamHI和HindIII进行消化。所得到的片段从琼脂糖凝胶中进行纯化，并且用作F4L缺陷盒(SEQ ID NO: 21)，用于BACmid的修饰。
包膜修饰盒：
为了回收其中EEV相关基因由IHD-J株或IHD-W株的DNA序列替代的病毒，制备A33R修饰盒(SEQ ID NO: 23)、A34R修饰盒(SEQ ID NO: 24)、A36R修饰盒(SEQ ID NO: 25)、A33-34-36R修饰盒(SEQ ID NO: 26)、A56R修饰盒(SEQ ID NO: 27)、B5R修饰盒(SEQ IDNO: 28)或F12-13L修饰盒(SEQ ID NO: 29)中的每种。具体方法包括：提供来源于IHD-J株或IHD-W株的每种基因序列；人工合成其中卡那霉素抗性基因序列(Addgene)紧在特异性位点后50 bp处插入的序列；并且构建pUC57-A33R-rKanI (SEQ ID NO: 30)、pUC57-A34R-rKanI (SEQ ID NO: 31)、pUC57-A36R-rKanI (SEQ ID NO: 32)、pUC57-A33-34-36R-rKanI(SEQ ID NO: 33)、pUC57- A56R-rKanI (SEQ ID NO: 34)、pUC57-B5R-rKanI (SEQ ID NO:35)或pUC57-F12-13L-rKanI (SEQ ID NO: 36)。pUC57-B5R-rKanI (SEQ ID NO: 35)用限制性酶XbaI和BglI进行消化。其它构建体各自用限制性酶BamHI和BglI进行消化。每种构建体从琼脂糖凝胶中进行纯化，并且用作包膜修饰盒，用于每种BACmid的修饰。
LC16m8-B5RmO-BACmid的构建：
LC16m8-B5RmO-BACmid的构建在下文进行描述。培养携带上述LC16m8-BACmid的大肠杆菌，并且用B5R修饰盒(SEQ ID NO: 11)进行电穿孔。电穿孔溶液在补充有氯霉素和卡那霉素的CG琼脂培养基上进行培养。通过使用盒中的卡那霉素抗性作为标记物来选择具有所引入的盒的每个克隆。进一步地，去除卡那霉素抗性基因。然后，通过使用BACgfp序列中给出的氯霉素抗性获得每个目的克隆。通过使用引物对(SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO: 38)的PCR来扩增目的基因片段，并且进行纯化。然后，使用测序引物(SEQ ID NO: 37)分析核苷酸序列。这证实了所获得的克隆是所需的修饰的BACmid (LC16m8-B5RmO-BACmid)。
其它修饰的BACmid也通过与上文基本上相同的方案进行制备。通过使用对于相应修饰特异性的引物对的PCR来检查条带大小。对于相应修饰特异性的各引物对如下。
C11R缺陷检查引物Fw (SEQ ID NO: 39)和C11R缺陷检查引物Re (SEQ ID NO:40)；
O1L缺陷检查引物Fw (SEQ ID NO: 41)和O1L缺陷检查引物Re (SEQ ID NO: 42)；
F4L缺陷检查引物Fw (SEQ ID NO: 43)和F4L缺陷检查引物Re (SEQ ID NO: 44)；
A33R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 45)和A33R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:46)；
A34R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 47)和A34R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:48)；
A36R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 49)和A36R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:50)；
A56R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 51)和A56R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:52)；
B5R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 53)和B5R修饰检查引物Re (SEQ ID NO: 54)；和
F12-13L修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 55)和F12-13L修饰检查引物Re (SEQ IDNO: 56)。
进一步地，在基因组纯化后，每个修饰检查测序引物[A33R修饰(SEQ ID NO: 45)、A34R修饰(SEQ ID NO: 47)、A36R修饰(SEQ ID NO: 49)、A56R修饰(SEQ ID NO: 51、SEQ IDNO: 57)、B5R修饰(SEQ ID NO: 53)或F12-13L修饰(SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 58、SEQID NO: 59、SEQ ID NO: 60)]用于核苷酸序列分析，以确认所获得的克隆是所需的修饰的BACmid (MD-RVV-BACmid、MD-RVV-ΔRR-BACmid、MD-RVV-EEV7-BACmid、MD-RVV-EEV6-BACmid、MD-RVV-A34R-BACmid、MD-RVV-ΔRR-EEV7-BACmid、MD-RVV-ΔRR -EEV6-BACmid、或MD-RVV-ΔRR-A34R-BACmid)。
BACgfp去除序列盒(SBTKdup序列) (SEQ ID NO: 6)以类似方式引入每种修饰的BACmid内。通过使用引物对(BACgfp合成引物Fw (SEQ ID NO: 61)和BACgfp合成引物Re(SEQ ID NO: 62))的PCR来检查条带大小。将PCR产物纯化，并且使用测序引物(SEQ ID NO:61)分析核苷酸序列。每个获得的克隆确认为所需的修饰的BACmid (MD-RVV-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-ΔRR-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-EEV7-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-EEV6-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-A34R-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-ΔRR-EEV7-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-ΔRR-EEV6-SBTKdup-BACmid、或MD-RVV-ΔRR-A34R-SBTKdup-BACmid)。
3. 病毒基因组的提取
设计具有BACgfp去除序列盒的每种BACmid来源的病毒，使得在培养的细胞进行传代培养时可以去除BACgfp。使用上述BAC病毒(LC16m8-BACgfp)作为辅助病毒，从RK13细胞中回收来源于LC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid的病毒。在6孔板上培养的RK13细胞用作为辅助病毒的LC16m8-BACgfp以MOI = 1进行接种。在培养1小时后，去除病毒并加入新的培养基。接下来，将LC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid和转染试剂混合。使混合物反应15分钟，加入细胞中，并且在37°C下培养过夜。在荧光显微镜下检查GFP表达。然后，从具有高比例的GFP荧光阴性噬斑的孔中收获细胞，冷冻且解冻，超声处理，离心以给出作为病毒液体的上清液。病毒液体用培养基进行连续稀释，接种到在96孔板上培养的RK13细胞内，并且在37℃下培养两晚。然后，在荧光显微镜下，从具有高比例的GFP荧光阴性噬斑的孔中收获细胞，冷冻且解冻，超声处理并离心，以给出作为病毒液体的上清液。重复该程序，并且当RK13细胞中的所有病毒噬斑连续两次变成荧光阴性时，病毒纯化完成。将回收的病毒接种到在6孔板上培养的RK13细胞内，并且在37℃下培养两晚。这之后，使用基因组提取试剂盒提取病毒基因组。通过使用所提取的病毒基因组作为模板，使用引物对(SEQ ID NO: 61和SEQ ID NO:62)执行PCR，以根据条带大小验证BACgfp序列的去除。进一步地，将PCR产物纯化，并且使用BACgfp去除检查引物(SEQ ID NO: 61)和B5R鸟嘌呤插入检查引物(SEQ ID NO: 37)分析核苷酸序列。该分析验证了序列从BACgfp序列插入位点中的去除，以及在B5R基因序列的特异性位点处核苷酸(鸟嘌呤)的进一步插入，所述核苷酸在LC16m8中缺失。所得到的产物用作LC16m8-B5RmO。
使用与上文基本上相同的方案和LC16m8-BACgfp作为辅助病毒，以产生来源于MD-RVV-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-ΔRR-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-EEV7-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-EEV6-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-A34R-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-ΔRR-EEV7-SBTKdup-BACmid、MD-RVV-ΔRR-EEV6-SBTKdup-BACmid、或MD-RVV-ΔRR-A34R-SBTKdup-BACmid的病毒。使用从其中提取的基因组作为模板和特异性引物对来执行PCR，以检查条带大小。各特异性引物对如下。
C11R缺陷检查引物Fw (SEQ ID NO: 39)和C11R缺陷检查引物Re (SEQ ID NO:40)；
O1L缺陷检查引物Fw (SEQ ID NO: 41)和O1L缺陷检查引物Re (SEQ ID NO: 42)；
F4L缺陷检查引物Fw (SEQ ID NO: 43)和F4L缺陷检查引物Re (SEQ ID NO: 44)；
A33R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 45)和A33R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:46)；
A34R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 47)和A34R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:48)；
A36R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 49)和A36R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:50)；
A56R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 51)和A56R修饰检查引物Re (SEQ ID NO:52)；
B5R修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 53)和B5R修饰检查引物Re (SEQ ID NO: 54)；和
F12-13L修饰检查引物Fw (SEQ ID NO: 55)和F12-13L修饰检查引物Re (SEQ IDNO: 56)；和
BACgfp合成引物Fw (SEQ ID NO: 61)和BACgfp合成引物Re (SEQ ID NO: 62)。
此外，将每种PCR产物纯化，并且使用每种修饰检查测序引物[A33R修饰(SEQ IDNO: 45)、A34R修饰(SEQ ID NO: 47)、A36R修饰(SEQ ID NO: 49)、A56R修饰(SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 57)、B5R修饰(SEQ ID NO: 53)、F12-13L修饰(SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60)、或BACgfp去除(SEQ ID NO: 61)]，来分析核苷酸序列。该分析验证了所获得的每个克隆都是所需的重组病毒(MD-RVV、MD-RVV-ΔRR、MD-RVV-EEV7、MD-RVV-EEV6、MD-RVV-A34R、MD-RVV-ΔRR-EEV7、MD-RVV-ΔRR-EEV6、或MD-RVV-ΔRR-A34R)。
实施例2
通过RNR基因缺陷降低在正常细胞中的细胞毒性
来源于癌细胞或正常细胞的培养细胞用以下进行感染：缺乏C11R和O1L基因的溶瘤牛痘病毒MD-RVV或其EEV相关基因修饰的病毒，或它们的缺乏编码核糖核苷酸还原酶(RNR)的小亚基并且存在于其病毒基因组中的F4L基因的修饰病毒。然后，使用CellCounting Kit-8 (DOJINDO LABORATORIES)评估细胞毒性。将癌细胞(人宫颈癌来源的细胞系：HeLa细胞)和正常细胞(正常人真皮成纤维细胞：NHDF)接种到96孔板上，并且在含血清培养基中经受贴壁培养。接下来，将各自的细胞在无血清培养基中进行血清饥饿培养，并且用以下进行接种：低水平(0.8 × 106 PFU/mL)或高水平(4.0 × 106 PFU/mL)的选自LC16m8-B5RmO、MD-RVV、MD-RVV-ΔRR、MD-RVV-ΔRR-A34R、MD-RVV-ΔRR-EEV6、或MD-RVV-ΔRR-EEV7的每种病毒。在72小时后，使用细胞计数试剂盒来定量每个病毒接种组的细胞活力，同时将没有病毒接种的对照组的吸光度设定为100%。结果显示于图3中。此处使用的所有病毒都显示了对于癌细胞相似的细胞毒性(图3A)，但在F4L基因缺陷病毒(ΔRR)中，对于正常细胞的病毒毒性显著减少(图3B)。
实施例3
通过RNR基因缺陷降低静脉施用于免疫缺陷小鼠后的病毒毒性
对免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，5周龄，雌性，每组5只)给予2.5 × 104、5 × 105或1× 107 PFU/0.1 mL的LC16m8-B5RmO、MD-RVV、MD-RVV-ΔRR-EEV6。将剂量静脉内施用于小鼠，并且记录存活者数目、体重和病毒症状评分。病毒症状评分如下最高为5分：0分：无症状；1分：1-2个天花病灶；2分：3-4个天花病灶；3分：多个天花病灶，皮毛粗糙，竖毛；4分：呼吸困难，垂死；以及5分：死亡。结果显示在图4至6中。在LC16m8-B5RmO和MD-RVV施用组中，所有剂量组中的动物分别在病毒施用后19天和40天死亡。然而，对于MD-RVV-ΔRR-EEV6，高剂量和中剂量组的5只动物中的3只存活直到观察结束时的71天。另外，低剂量组中的所有动物都是活的(图4)。观察到两种病毒均以剂量依赖性方式引起体重减轻。体重减轻程度按从MD-RVV-ΔRR-EEV6到MD-RVV再到LC16m8-B5RmO的次序(更小到更大)更大(图5)。病毒症状评分也取决于剂量，并且按从MD-RVV-ΔRR-EEV6到MD-RVV再到LC16m8-B5RmO的次序(更低到更高)变得更高(图6)。
实施例4
通过修饰EEV相关蛋白增加在癌细胞中的生产率
将HeLa细胞接种到24孔板上，并且经受在含血清的培养基中的贴壁培养。接下来，细胞用MD-RVV、MD-RVV-A34R、MD-RVV-EEV6、MD-RVV-EEV7、MD-RVV-ΔRR、MD-RVV-ΔRR-A34R、MD-RVV-ΔRR-EEV6、或MD-RVV-ΔRR-EEV7以MOI = 1进行接种。在培养1小时后，去除病毒并加入新鲜的含血清培养基。在16、24、32或48小时后收集培养基，以获得培养上清液中的每种病毒。将回收的病毒连续稀释，接种到在6孔板上培养的RK13细胞内，并且培养1小时。然后，去除病毒，并且重新加入甲基纤维素培养基。在37℃下培养72小时后，计数噬斑，以计算感染滴度。结果显示于图7中。这证实了，与在MD-RVV(图7A)或在MD-RVV中缺乏F4L基因的病毒(图7B)中修饰EEV相关蛋白相比，修饰病毒中的任一种都显示出在培养期自始至终，增加培养上清液中的每种病毒的生产量的趋势。特别地，EEV相关蛋白的修饰数目越多，效应就越大。
另外，将HeLa细胞接种到24孔板上，并且经受在含血清的培养基中的贴壁培养。接下来，将细胞在化学成分确定的培养基中培养，并且用LC16m8-B5RmO、MD-RVV-ΔRR、MD-RVV-ΔRR-A34R、MD-RVV-ΔRR-EEV6、或MD-RVV-ΔRR-EEV7以MOI = 0.01进行接种。在培养1小时后，去除病毒并加入新鲜的化学成分确定的培养基。在48小时后收集培养基，以获得培养上清液中的每种病毒。进一步地，收集细胞、冷冻且解冻、超声处理且离心，以获得上清液中的细胞内病毒。将回收的病毒连续稀释，接种到在6孔板上培养的RK13细胞内，并且培养1小时。然后，去除病毒，并且重新加入甲基纤维素培养基。在37℃下培养72小时后，计数噬斑，以计算感染滴度。结果显示于图8中。EEV相关蛋白的修饰引起恢复由于培养上清液病毒(图8A)和细胞内病毒(图8B)两者中的RNR基因缺失而降低的病毒生产的趋势。特别地，EEV相关蛋白的修饰数目越多，效应就越大。
实施例5
腹膜内施用于腹膜转移的人胰腺癌小鼠的RNR基因缺陷型病毒的效应
检查了当腹膜内施用时，RNR基因缺陷型病毒是否对腹膜转移的模型小鼠引发延长存活的效应。为此，通过将3 × 106个人胰腺癌BxPC3-Luc细胞移植到每只免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，6周龄，雌性)的腹腔内，建立了腹膜转移的人胰腺癌小鼠。然后，21天后，将MD-RVV或MD-RVV-ΔRR-EEV6 (105 PFU/0.1 mL)腹膜内施用于小鼠。另外，21天后，同样将PBS(0.1 mL)腹膜内施用于病毒未施用组作为对照。在施用后，记录病毒毒性和存活者数目。另外，病毒毒性通过如下用最高5分来评分症状进行确定：0分：无症状；1分：1-2个天花(痘)病灶；2分：3-4个天花(痘)病灶；3分：多个天花(痘)病灶，皮毛粗糙，竖毛；4分：呼吸困难，垂死；5分：病毒相关死亡。结果显示于图9至10中(图9：病毒症状评分；图10：存活率)。
关于病毒毒性，MD-RVV施用组从施用后约10天开始出现天花(痘)症状，并且这之后，发展严重的病毒症状例如天花(痘)病灶的数目增加、皮毛粗糙和呼吸困难。最后，到第42天，所有病例都死于其病毒毒性(图9)。相比之下，MD-RVV-ΔRR-EEV6施用组并未显示病毒症状。这已证实了通过RNR基因缺陷改善安全性的效应(图9)。
在基于存活者数目的评估中，MD-RVV施用组伴随着严重的病毒毒性，并且所有病例都与其中肿瘤生长的病毒未施用组的病例同时死亡(图10)。相比之下，在用于测试存活期差异的时序检验中，当与病毒未施用组和MD-RVV施用组相比时，MD-RVV-ΔRR-EEV6施用组具有显著的存活延长效应(图10)。
随后，通过将不同的3 × 106个人胰腺癌MIA-PaCa2/CMV-Luc细胞移植到每只免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，6周龄，雌性)的腹腔内，建立了腹膜转移的人胰腺癌小鼠。然后，14天后，将MD-RVV (106 PFU/0.1 mL)或MD-RVV-ΔRR-EEV6 (106或107 PFU/0.1 mL)腹膜内施用于小鼠。另外，14天后，同样将PBS (0.1 mL)腹膜内施用于病毒未施用组。在施用后，记录病毒毒性和存活者数目。另外，病毒毒性通过如下用最高5分来评分症状进行确定：0分：无症状；1分：1-2个天花(痘)病灶；2分：3-4个天花(痘)病灶；3分：多个天花(痘)病灶，皮毛粗糙，竖毛；4分：呼吸困难，垂死；5分：病毒相关死亡。结果显示于图11和12中(图11：病毒症状评分，图12：存活率)。
关于MD-RVV施用组中的病毒毒性，在具有明显病毒症状的个体和没有明显病毒症状的个体之间观察到变化，然而，总体而言，观察到中度至重度病毒症状(图11)。相比之下，MD-RVV-ΔRR-EEV6施用组并未显示病毒症状。这已证实了通过RNR基因缺陷改善安全性的效应(图11)。
在基于存活者数目的评估中，由于严重的病毒毒性和肿瘤生长，MD-RVV施用组中的所有病例都与病毒未接种组的病例同时死亡(图12)。相比之下，当与病毒未施用组和MD-RVV施用组相比时，MD-RVV-ΔRR-EEV6施用组显示延长存活的剂量依赖性趋势(图12)。
上述结果已提示了，RNR基因缺陷型病毒是可以腹膜内施用的高度安全的溶瘤病毒。
实施例6
静脉内施用于原位移植的人胰腺癌小鼠的RNR基因缺陷型病毒的效应
检查了当静脉内施用时，RNR基因缺陷型病毒是否对胰腺癌模型小鼠引发延长存活的效应。为此，通过将1 × 106个人胰腺癌MIA-PaCa2/CMV-Luc细胞移植到每只免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，5周龄，雌性)的胰膜内，建立了原位移植的人胰腺癌小鼠。然后，12天后，将MD-RVV-RLuc (105 PFU/0.1 mL)或MD-RVV-ΔRR-EEV6-RLuc (105 PFU/0.1 mL)静脉内施用于小鼠。应注意RLuc意指海肾萤光素酶基因。为了检查病毒将来的体内分布，构建了RLuc表达盒(SEQ ID NO: 63)。然后，将盒紧在实施例1中的缺失后的C11R-AccI位点之前插入。另外，MD-RVV-ΔRR-EEV6-RLuc在第一次施用后1周内另外施用2次(频繁施用)。进一步地，12天后，同样将PBS (0.1 mL)静脉内施用于病毒未施用组。在施用后，记录病毒毒性和存活者数目。另外，病毒毒性通过如下用最高5分来评分症状进行确定：0分：无症状；1分：1-2个天花(痘)病灶；2分：3-4个天花(痘)病灶；3分：多个天花(痘)病灶，皮毛粗糙，竖毛；4分：呼吸困难，垂死；5分：病毒相关死亡。结果显示于图13和14中(图13：病毒症状评分，图14：存活率)。
关于病毒毒性，MD-RVV-RLuc施用组从施用后约10天开始出现天花(痘)症状，并且这之后，发展严重的病毒症状例如天花(痘)病灶的数目增加、皮毛粗糙和呼吸困难。最后，到第32天，所有病例都死于其伴随的病毒毒性(图13)。相比之下，在MD-RVV-ΔRR-EEV6-RLuc施用组中，在单次施用和频繁施用两者后均识别了一些病毒症状，然而，并未观察到致命症状。证实了通过RNR基因缺陷改善安全性的效应(图13)。
在基于存活者数目的评估中，MD-RVV-RLuc施用组中的所有病例都死于严重的病毒毒性，其时间早于其中肿瘤生长的病毒未施用组的病例(图14)。相比之下，在用于测试存活期差异的时序检验中，MD-RVV-ΔRR-EEV6-RLuc单次施用组具有与病毒未施用组基本上相同的存活变化。然而，频繁施用组引发了比病毒未施用组更显著的存活延长效应(图14)。
上述结果已提示了，RNR基因缺陷型病毒是可以静脉内且频繁施用的高度安全的溶瘤病毒。
实施例7
瘤内施用于皮下移植的人胰腺癌小鼠的RNR基因缺陷型病毒的效应
检查了当瘤内施用时，RNR基因缺陷型病毒是否发挥压制肿瘤生长的效应。为此，将5 × 106个人胰腺癌MIA-PaCa2/CMV-Luc细胞皮下移植到每只免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，6周龄，雌性)的右股骨中。将MD-RVV-ΔRR-EEV6-RLuc (104、105或106 PFU/0.1 mL)瘤内施用于其肿瘤体积达到100 mm3或更大的个体。另外，将PBS (0.1mL)瘤内施用于病毒未施用组。在施用后，记录肿瘤体积的变化。肿瘤体积通过短轴 × 短轴 × 长轴 × 1/2进行计算。
关于肿瘤体积的变化，MD-RVV-ΔRR-EEV6-RLuc显示了以近似剂量依赖性方式压制肿瘤生长的趋势。证实了在瘤内施用后压制肿瘤生长的效应(图15)。
实施例5至7的结果已提示了，RNR基因缺陷型病毒MD-RVV-ΔRR-EEV6和MD-RVV-ΔRR-EEV6-RLuc在不同的人胰腺癌小鼠中发挥其固有的溶瘤效应，从而在确保安全的同时引发延长存活的效应。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1是TK1引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是TK1引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 3是TK2引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 4是TK2引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 5是pUCIDT-KAN-op7.5+EGFP质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 6是BACgfp去除序列盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 7是TK引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 8是TK引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 9是卡那霉素引物1Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 10是卡那霉素引物1Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 11是B5R修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 12是pUCFk-B5RmO的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 13是卡那霉素引物2Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 14是卡那霉素引物2Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 15是C11R缺陷盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 16是pUC57-ΔVGF的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 17是卡那霉素引物3Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 18是卡那霉素引物3Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 19是O1L缺陷盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 20是pUC57-ΔO1L-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 21是F4L缺陷盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 22是pUC57-ΔF4L-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 23是A33R修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 24是A34R修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 25是A36R修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 26是A33-34-36R修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 27是A56R修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 28是B5R修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 29是F12-13L修饰盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 30是pUC57-A33R-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 31是pUC57-A34R-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 32是pUC57-A36R-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 33是pUC57-A33-34-36R-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 34是pUC57-A56R-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 35是pUC57-B5R-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 36是pUC57-F12-13L-rKanI的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 37是B5R修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 38是B5R修饰检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 39是C11R缺陷检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 40是C11R缺陷检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 41是O1L缺陷检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 42是O1L缺陷检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 43是F4L缺陷检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 44代表F4L缺失检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 45代表A33R修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 46代表A33R修饰检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 47代表A34R修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 48代表A34R修饰检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 49代表A36R修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 50代表A36R修饰检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 51代表A56R修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 52代表A56R修饰检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 53代表B5R修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 54代表B5R修饰检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 55代表F12-13L修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 56代表F12-13L修饰检查引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 57代表A56R修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 58代表F12-13L修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 59代表F12-13L修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 60代表F12-13L修饰检查引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 61代表BACgfp合成引物Fw的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 62代表BACgfp合成引物Re的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 63代表RLuc表达盒的核苷酸序列。
<110> KM Biologics Co., Ltd.
<120> 溶瘤牛痘病毒
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ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 600
gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgatcga gatcgtgatc 660
cggatcaaga tccagatcga attccatggt ctcaactttc acaggctgtc gccgtgctca 720
tttgattgaa ccggtcagct acggttcgaa tgcgtcagcg tcagcgattt aattaaggat 780
ccgcggccgc tagccgacat atactatata gtaataccaa tactcaagac tacgaaactg 840
atacaatctc ttatcatgtg ggtaatgttc tcgatgtcga atagccatat gccggtagtt 900
gcgatataca taaactgatc actaattcca aacccacccg ctttttatag taagtttttc 960
acccataaat aataaataca ataattaatt tctcgtaaaa gtagaaaata tattctaatt 1020
tattgcacgg taaggaagta gaatcataaa gaacagtgac ggatcgctag caccggtcgc 1080
caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 1140
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ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 1260
caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 1320
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gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 1560
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cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 1680
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ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc 3900
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tctaatacct ggaatgctgt ttttccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca 4080
ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt 4140
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tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc 4320
gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac 4380
agttttattg ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga 4440
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<210> 6
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 4153
<223> BACgfp去除盒
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cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac 420
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tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt 540
tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg 600
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aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt 720
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cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc gtcacaggta 840
tttattcgcc gcggaggttg taacatttta ttaccgtgtg ggatataaaa gtccttgatc 900
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gaaacaatta tcctgagaat aaatgccttg gcctttatat ggaaatgtgg aactgagtgg 3660
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aacagtcggg aaaatctccc attatcgtag agatccgcat tattaatctc aggagcctgt 3780
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ttacagccag tagtgctcgc cgcagtcgag cgacagggcg aagccctcga gtgagcgagg 4020
aagcaccagg gaacagcact tatatattct gcttacacac gatgcctgaa aaaacttccc 4080
ttggggttat ccacttatcc acggggatat ttttataatt atttttttta tagtttttag 4140
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<211>
<212> DNA
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<400> 8
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<211>
<212> DNA
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<400> 9
tcacaaagtc cgcggcgata agctcatgga gcggcgtaac cgtcgcacag gaaggacaga 60
gaaagtaagt agggataaca gggtaat 87
<210> 10
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 40
<223> 卡那霉素引物1 Re
<400> 10
tccatgagct tatcgtgcca gtgttacaac caattaacca 40
<210> 11
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> B5R修饰盒
<400> 11
tctagatttt tgatgctgtt gaatctttag attatctatt atccagagga gttattgata 60
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gatgtacatg tatttcggaa gcagtcgcaa acaacaacaa aataataatg gaagtactat 240
tgtctaaacg accatctttg aaaattatga tacagtctat gatagcaatt actaaacata 300
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tcgatgaaat agatatcatg aagagatgtt atataaaaaa taaaactgta ttccaattag 480
ttttttgtat caaagacatt aatactttaa tgagatacgg taaacatcct tctttcgtga 540
agtgcactag tctcgacgta tacggaagtc gtgtacgtaa tatcatagca tctattagat 600
atcgtcagag attaattagt ctattatcca agaagctgga tgcgggagat aaatggtcgt 660
gttttcctaa cgaaataaaa tataaaatat tggaaaactt taacgataac gaactatcca 720
catatctaaa aatcttataa acattattaa aatataaaat ctaagtggat aaaatcacac 780
tacatcattg tttcctttta gtgctcgaca gtgtatacta tttttaacgc tcataaataa 840
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catgtactgt acccactatg aataacgcta aattaacgtc taccgaaaca tcgtttaatg 960
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tctgtgaaac agataaatgg aaatacgaaa atccatgcaa gaaaatgtgc acagtttctg 1080
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gttgcaacgg cgaaacaaaa tattttcgtt taagtaggga taacagggta atcgatttat 1200
tcaacaaagc cacgttgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat 1260
atcatcatga acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag 1320
ccatattcaa cgggaaacgt cttgctcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 1380
tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 1440
attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 1500
caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 1560
gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc 1620
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cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga 1800
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cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 2040
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gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta atcagaattg gttaattggt tgtaacactg 2160
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aaaaaatgga aatacttctt ggaatgatac tgttacgtgt cctaatgcgg aatgtcaacc 2280
tcttcaatta gaacacggat cgtgtcaacc agttaaagaa aaatactcat ttggggaata 2340
tatgactatc aactgtgatg ttggatatga ggttattggt gcttcgtaca taagttgtac 2400
agctaattct tggaatgtta ttccatcatg tcaacaaaaa tgtgatatgc cgtctctatc 2460
taacggatta atttccggat ctacattttc tatcggtggc gttatacatc ttagttgtaa 2520
aagtggtttt acactaacgg ggtctccatc atccacatgt atcgacggta aatggaatcc 2580
catactccca acatgtgtac gatctaacga aaaatttgat ccagtggatg atggtcccga 2640
cgatgagaca gatttgagca aactctcgaa agacgttgta caatatgaac aagaaataga 2700
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tttaatctcc gttatagtat tagtttgttc ctgtgacaaa aataatgacc aatataagtt 2820
ccataaattg ctaccgtaaa tataaatccg ttaaaataat taataattaa taacgaacaa 2880
gtatcaaaag attaaagact tatagctaga atcaattgag atgtcttctt cagtggatgt 2940
tgatatctac gatgccgtta gagcattttt actcaggcac tattataaca agagatttat 3000
tgtgtatgga agaagtaacg ccatattaca taatatatac aggctattta caagatgcgc 3060
cgttataccg ttcgatgata tagtacgtac tatgccaaat gaatcacgtg ttaaacaatg 3120
ggtgatggat acacttaatg gtataatgat gaatgaacgc gatgtttctt ctaga 3175
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<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 5047
<223> pUCFk-B5RmO质粒
<400> 12
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ttaactatcg tactatatac aacgaaacat ctatttacga cgctgtcagt tataatgcgt 120
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tcgatgaaat agatatcatg aagagatgtt atataaaaaa taaaactgta ttccaattag 480
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agtgcactag tctcgacgta tacggaagtc gtgtacgtaa tatcatagca tctattagat 600
atcgtcagag attaattagt ctattatcca agaagctgga tgcgggagat aaatggtcgt 660
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catatctaaa aatcttataa acattattaa aatataaaat ctaagtggat aaaatcacac 780
tacatcattg tttcctttta gtgctcgaca gtgtatacta tttttaacgc tcataaataa 840
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catgtactgt acccactatg aataacgcta aattaacgtc taccgaaaca tcgtttaatg 960
ataaacagaa agttacattt acatgtgatc agggatatca ttctttggat ccaaatgctg 1020
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attatgtctc tgaattatat gataagccat tatacgaagt gaattccacc atgacactaa 1140
gttgcaacgg cgaaacaaaa tattttcgtt gcgaagaaaa aaatggaaat acttcttgga 1200
atgatactgt tacgtgtcct aatgcggaat gtcaacctct tcaattagaa cacggatcgt 1260
gtcaaccagt taaagaaaaa tactcatttg gggaatatat gactatcaac tgtgatgttg 1320
gatatgaggt tattggtgct tcgtacataa gttgtacagc taattcttgg aatgttattc 1380
catcatgtca acaaaaatgt gatatgccgt ctctatctaa cggattaatt tccggatcta 1440
cattttctat cggtggcgtt atacatctta gttgtaaaag tggttttaca ctaacggggt 1500
ctccatcatc cacatgtatc gacggtaaat ggaatcccat actcccaaca tgtgtacgat 1560
ctaacgaaaa atttgatcca gtggatgatg gtcccgacga tgagacagat ttgagcaaac 1620
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taatgatgaa tgaacgcgat gtttcttcta gaatcagatc ggaagagcgt cgttaaggga 2160
aagagtgttc cgtactcaga gagctattac aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 2220
gactgggaaa acccaggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc tccgtttgcg 2280
agttggcgga atagcgaaga agcgcgtaca gatcgtccgt cacagcagtt gcgctctctg 2340
taacgtaccg cagttcaaag tctacaccta caaacgcgaa agtcgctatc gcctgtttgt 2400
ggatgtgcaa agcgacatca tcgatactcc tggtcgtcgc acggtgattc cgttggcttc 2460
tgcacggtta ctgagcgaca aagtttcccg tgaactctat ccggttgtcc acattgggga 2520
tgaaagctgg cgtatgatga ccacggatat ggcgtcagta ccagtgtcgg taattggcga 2580
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atctgat 5047
<210> 13
<211>
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<213> 人工的
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<211>
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 卡那霉素引物2 Re
<400> 14
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<211>
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> C11R缺失盒
<400> 15
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ttataaattt tttttatgag tatttttaca aaaatgtata aagtgtatgt cttatgtata 2280
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ttcctgttat catcattagt taatgaaaat aactctcgtg cttcagaaaa gtcaaatatt 2640
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cctagatggt tatttactaa cagacatttt ccagatctat tgactataac tcctatagtt 2760
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tttgatttaa agtctagagt ctttgcaaac ataatatcct tatccgactt tatatttcct 3000
gtagggtggt ataattttat tttgcctcca catatcggtg tttccaaata tattagaatt 3060
c 3061
<210> 16
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> pUC57-仮VGF质粒
<400> 16
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aataatgtta aattttagtt tatgtttgta ccccgtattc atacttaaca aattggtatt 1080
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tttatttcag catattaaag taaaatctag ttaccttgaa aatgaataca gtgggtggtt 1800
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ttccagatct attgactata actcctatag tttccacatc aaccaagtaa tgatcatcta 2160
ttgttatata acaataacat aactcttttc catttttatc agtatgtata tctatatcaa 2220
cgtcgtcgtt gtagtgaata gtagtcattg atctattata tgaaacggat atgtctagaa 2280
cggcaattgt tttacgtcca gttaacactt tctttgattt aaagtctaga gtctttgcaa 2340
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taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 2640
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 2700
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2760
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2820
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cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 3780
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 3840
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 3900
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 3960
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<211>
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<223> 卡那霉素引物3 Re
<400> 18
ttctgaacgt tgatagtcta ctgccagtgt tacaaccaat taaccaattc t 51
<210> 19
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 2724
<223> O1L缺失盒
<400> 19
gaattctcgg tattttttat ggcaaacttt actcttccag catccgtttc taaaaaaata 60
ttaacgagtt ccatttatat catccaatat tattgaaatg acgttgatgg acagatgata 120
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attaacttta atgtatgaaa acagtacgcc acatgcttcc atgacagtgt gtaacacttt 240
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tcgttgaccg attaagtttt gattgatttt tccgtgtaag gcgtatctag tcagatcgta 600
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tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa 1980
attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca gaattggtta attggttgta 2040
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agaaggcaaa cgctataaaa aacataatta caacgagcat atttataaat atttttattc 2580
agcattactt gatatagtaa tattaggcac agtcaaacat tcaaccactc tcgatacatt 2640
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<210> 20
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
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tctggtttgc taccccaatg ataacaatag tcttgtaaag ataaaccgca agaaaattta 3060
tacgcatcca tccaaataac cctagcacca tcggatgata ttaatgtatt attatagatt 3120
ttccatccac aattattggg ccagtatact gttagcaacg gtatatcgaa tagattactc 3180
atgtaaccta ctagaatgat agttcgtgta ctagtcataa tatctttaat ccaatctaag 3240
aaatttaaaa ttagattttt tacactgtta aagttaacaa aggtattacc cggatacgtg 3300
gatatcatat atggcattgg tccattatca gtaatagctc cataaactga tacggcgatg 3360
gtttttatat gtgtttgatc taacgaggaa gaaattcgcg cccacaattc atctctagat 3420
atgtatttaa tatcaaacgg taacacatca atttcgggac gcgtatatgt ttctaaattt 3480
ttaatccaaa tataatgatg acctatatgc cctattatca tactgtcaac tatagtacac 3540
ctagagaact tacgatacat ctgtttccta taatcgttaa attttacaaa tctataacat 3600
gctaaacctt ttgacgacaa ccattcatta atttctgata tggaatctgt attctcgata 3660
ccgtattgtt ctaaagccag tgctatatct ccctgttcgt gggaacgctt tcgtataata 3720
tcgatcaacg gataatctga agtttttgga gaataatatg actcatgatc tatttcgtcc 3780
ataaacaatc tagacatagg aattggaggc gatgatctta attttgtgca atgagtcgtc 3840
aatcctataa cttctaatat tgtaatattc atcatcgaca taacactatc tatgttatca 3900
tcgtatatta gtataccacg gccttcttca tttcgtgcca aaataatata cagtcttaaa 3960
taattacgca atatctcaat agtttcataa ttgttagctg ttttcatcaa ggtttgtatc 4020
ctgtttaaca tgatggcgtt ctataacgtc tctattttct atttttaatt ttttaaattt 4080
ttaacgattt actgtggcta gatacccaat ctctctcaaa tattttttta gcctcgctta 4140
caagctgttt atctatacta ttaaaactga cgaatccgtg attttggtaa tgggttccgt 4200
cgaaatttgc cgaagtgata tgaacatatt cgtcgtcgac tatcaacaat tttgtattat 4260
tctgaatagt gaaaaccttc acagatagat cattttgaac acacaacgcg tctagacttc 4320
tggcggttgc catagaatat acgtcgttct tatcccaatt accaactaga agtctgatct 4380
taactcctct attaatggct gcttctataa tggagttgta aatgtcaggc caatagtagc 4440
tattaccgtc gacacgtgta gtgggaacta tggccaaatg ttcaatatct atactagtct 4500
tagccgactt gagtttatca ataactacat cagtgtctag atctctagaa tatcccaata 4560
ggtgttctgg agaatcagta aagaacactc cacctatagg attcttaata tgatacgcag 4620
tgctaactgg cagacaacaa gccgcagagc ataaattcaa ccatgaattt tttgcgctat 4680
taaaggcttt aaaagtatca aatcttctac gaagatctgt ggccagcggg ggataatcag 4740
aatatacacc taacgtttta atcgtatgta tagatcctcc agtaaatgac gcgtttccta 4800
cataacatct ttcatcatct gacacccaaa aacaaccgag tagtagtccc acattatttt 4860
ttttatctat attaacggtt ataaaattta tatccgggca gtgactttgt agctctccca 4920
gatttctttt ccctcgttca tctagcaaaa ctattatttt aatccctttt tcagatgcct 4980
cttttagttt atcaaaaata agcgcgcccc tagtcgtact cagaggatta caacaaaaag 5040
atgctatgta tatatatttc ttagctagag tgataatttc gttaaaacat tcaaatgttg 5100
ttaaatgatc ggatctaaaa tccatatttt ctggtagtgt ttctaccagc ctacattttg 5160
ctcccgcagg taccggtgca aatggccaca tttagttaac ataaaaactt atacatcctg 5220
ttctatcaac gattctagaa tatcatcggc tatatcgcta aaattttcat caaagtcgac 5280
atcacaacct aactcagtca atatattaag aagttccatg atgtcatctt cgtctatttc 5340
tatatccgta tccattgtag attgttgacc gattatcgag tttaaatcat tactaatact 5400
caatccttca gaatacaatc tgtgtttcat tgtaaattta taggcggtgt atttaagttg 5460
gtagattttc aattatgtat taatatagca acagtagttt ttgctcctcc ttgattctag 5520
catcctcttc attattttct tctacgtaca taagcatgtc caatacgtta gacaacacac 5580
cgacgatggc ggccgccaca gacacgaata tgactaaacc gatgaccatt taaaaacccc 5640
tctctagctt tcacttaaac tgtatcgatc attcttttag cacatgtata atataaaaac 5700
attattctat ttcgaattta ggcttccaaa aatttttcat ccgtaaaccg ataataatat 5760
atatagactt gttaatagtc ggaataaata gattaatgct taaactatca tcatctccac 5820
gattagagat acaatattta cattcttttt gctgtttcga aactttatca atacacgtta 5880
atacaaaccc aggaaggaga tattgaaact gaggctgttg aaaatgaaac ggtgaataca 5940
ataattcaga taatgtaaaa tcatgattcc gtattctgat gatattagaa ctgctaatgg 6000
atgtcgatgg tatgtatcta ggagtatcta ttttaacaaa gcatcgattt gctaatatac 6060
aattatcatt ttgattaatt gttattttat tcatattctt aaaaggtttc atatttatca 6120
attcttctac attaaaaatt tccattttta atttatgtag ccccgcaata ctcctcatta 6180
cgtttcattt tttgtctata 6209
<210> 37
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> B5R修饰提供引物Fw
<400> 37
atccaagaag ctggatgcgg 20
<210> 38
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> B5R修饰提供引物Re
<400> 38
tggatgatgg agaccccgtt 20
<210> 39
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 21
<223> C11R缺失提供引物Fw
<400> 39
agaaccagct gctccatgat t 21
<210> 40
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> C11R缺失提供引物Re
<400> 40
gatacggaac cacccactgt 20
<210> 41
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> O1L缺失提供引物Fw
<400> 41
tgtcaacgga ccccaacatc 20
<210> 42
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> O1L缺失提供引物Re
<400> 42
acatggacgc attgggtgat 20
<210> 43
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 22
<223> F4L缺失提供引物Fw
<400> 43
caaggtctag acaaaccctc gt 22
<210> 44
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> F4L缺失提供引物Re
<400> 44
gcttcccaca acaatctcgc 20
<210> 45
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A33R修饰提供引物Fw
<400> 45
aggttgcgtc tagcactacg 20
<210> 46
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A33R修饰提供引物Re
<400> 46
tgtatccatc cattggcgca 20
<210> 47
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A34R修饰提供引物Fw
<400> 47
aagcaaattg cactgcggaa 20
<210> 48
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A34R修饰提供引物Re
<400> 48
cggtcaccgt gataagaggt 20
<210> 49
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A36R修饰提供引物Fw
<400> 49
agacggcaat ggatggatca 20
<210> 50
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A36R修饰提供引物Re
<400> 50
tacaacgtga cggcagcaat 20
<210> 51
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A56R修饰提供引物Fw
<400> 51
aatcccgctc tatggtcagc 20
<210> 52
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A56R修饰提供引物Re
<400> 52
agaaagtttc cggcggctat 20
<210> 53
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> B5R修饰提供引物Fw
<400> 53
tgcgtactac ctgctgttgt 20
<210> 54
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> B5R修饰提供引物Re
<400> 54
aaatgctcta acggcatcgt 20
<210> 55
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 24
<223> F12乗13L修饰提供引物Fw
<400> 55
tggatacgaa gatgctatcc atca 24
<210> 56
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> F12乗13L修饰提供引物Re
<400> 56
ccaattccta tgtctagatt 20
<210> 57
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> A56R修饰提供引物Fw
<400> 57
tctccatacg atgatctagt 20
<210> 58
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> F12乗13L修饰提供引物Fw
<400> 58
tgtactagtc ataatatctt 20
<210> 59
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> F12乗13L修饰提供引物Fw
<400> 59
aatctagaca taggaattgg 20
<210> 60
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 20
<223> F12乗13L修饰提供引物Fw
<400> 60
ctctattaat ggctgcttct 20
<210> 61
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 23
<223> BACgfp合成引物Fw
<400> 61
cgggactatg gacgcatgat aag 23
<210> 62
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 23
<223> BACgfp合成引物Re
<400> 62
aaatccgccg tactaggttc att 23
<210> 63
<211>
<212> DNA
<213> 人工的
<220> 4209
<223> RLuc表达盒
<400> 63
acattgcttt aaaatggacg gcgctaacaa ctgtcatacg agtattaatg gatagcggac 60
tagtcaataa ggaattaatt ttaccatttg tcattgtctt aacccattcg ttgattagtt 120
cctttgtttg gttagcatta ttaaagttta cagtttgaaa atcgtctttt attttttgta 180
ggaaggaggc atggaactcg atactatcgc taccgtatat tttatttgcg gtagctagtg 240
tcgcacaata cggaatatct acgtccatgt cattattgtc atcgggtgta ttctcattca 300
tattctctat atattttgat agttgttcag ctgtagaacc agctgctcca tgatttagaa 360
tagataaagt agataaaata gaaactggag aaatcaaaac attttcatcc gtgtgtttta 420
agattagttc tttaaagata tccatggtat agaccaaaca ataacgataa cgatatatat 480
cataaataaa taatgttaaa ttttagttta tgtttgtacc ccgtattcat acttaacaaa 540
ttggtattgc gtacacaatc aatcatatta cataccatta ataatgcaag cataaaaaat 600
cgttagtaga tgtttctaaa tataggttcc gtaagcaaag aatataagaa tgaagcggta 660
atgataaaat caattgttat ctaaaatgat catactcatt tattttattc tattatatta 720
acacatacat ttttaacagc aacacattca atattgtatt gttattttta tattatttac 780
acaattaaca atatattatt agtttatatt actgaattaa taatataaaa ttcccaatct 840
tgtcataaac acacactgag aaacagcata aacacaaaat ccatcaaaat tattgttcat 900
ttttgagaac tcgctcaacg aacgatttga tatattttcc catttcatca ggtgcatctt 960
cttgcgaaaa atgaagacct tttactttga caaattcagt attaggaaac ttcttggcac 1020
cttcaacaat agcattggaa aagaatcctg ggtccgattc aataaacatt tttggtaaat 1080
catcacttgc acgtagataa gcattataat tcctaacaat ttgtacaacg tcaggtttac 1140
caccttttac taacgggatt tcacgaggcc atgataatgt tggacgacga acttcacctt 1200
tctcttttgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat 1260
caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 1320
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 1380
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 1440
aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa 1500
aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa 1560
atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac 1620
gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 1680
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 1740
tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg 1800
cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt 1860
aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt 1920
cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata 1980
cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg 2040
ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt 2100
tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg 2160
gctttgttga ataaatcgat taccctgtta tccctactta gccatgataa tgttggacga 2220
cgaacttcac ctttctcttt gaatggttca agatatgctg caaattcttc tggttctaac 2280
tttctcatga tttttgatgg caacatggtt tccacgaaga agttattctc caaaaccatt 2340
ttttctcctt cttcagattt gatcaacgca atatcttctt caatatcagg ccattcatcc 2400
catgattcaa tcacatctac tacactttca gcgtgaacta ttgctttgat cttatcttga 2460
tgctcatagc tataatgaaa tgccaaacaa gcaccccaat catggccgac aaaaatgatc 2520
ttctttggta aattaagaag ttcaaaccat gcagtaagat atttgtaatg atcaagtaac 2580
ctataagaac cattaccaga tttgcctgat ttgcccatac caataaggtc tggtataata 2640
caccgcgcta ctggctcaat atgtggcaca acatgtcgcc ataaataaga agaggccgcg 2700
ttaccatgta aaaaaataac agcattttct gcatgttttt ctgaatcata ataattaata 2760
aatgaatcaa gaacattcat ttgtttacat ctggcccacc actgcggacc agttatcatc 2820
cgtttccttt gttctggatc ataaactttc gaagtcatgg tggcgaccgg tgctagcgta 2880
ccagaccgcc acggcttacg gcaataatgc ctttccattg ttcagaaggc atcagtcggc 2940
ttgcgagttt acgtgcatgg atctgcaaca tgtcccaggt gacgatgtat ttttcgctca 3000
tgtgaagtgt cccagcctgt ttatctacgg cttaaaaagt gttcgagggg aaaataggtt 3060
gcgcgagatt atagagatcc gtcactgttc tttatgatct acttccttac cgtgcaataa 3120
attagaatat attttctact tttacgagaa attaattatt gtatttatta tttatgggtg 3180
aaaaacttac tataaaaagc gggtgggttt ggaattagtg atcagtttat gtatatcgca 3240
actaccggca tatggctatt cgacatcgag aacattaccc acatgataag agattgtatc 3300
agtttcgtag tcttgagtat tggtattact atatagtata tgtcgggaat tcatcgatgt 3360
agactatcaa cgttcagaaa acccaaacac tacaacgtca tatatcccat ctcccggtat 3420
tatgcttgta ttagtaggca ttattattat tacgtgttgt ctattatctg tttataggtt 3480
cactcgacga actaaactac ttatacaaga tatggttgtg ccataatttt tataaatttt 3540
ttttatgagt atttttacaa aaatgtataa agtgtatgtc ttatgtatat ttataaaaat 3600
gctaaatatg cgatgtatct atgttatttg tatttatcta aacaatacct ctacctctag 3660
atattataca aaaatttttt atttcagcat attaaagtaa aatctagtta ccttgaaaat 3720
gaatacagtg ggtggttccg tatcaccagt aagaacataa tagtcgaata cagtatccga 3780
ttgagatttt gcatacaata ctagtctaga aagaaatttg taatcatttt ctgtgacggg 3840
agtccatata tctgtatcat cgtctagttt atcagtgtcc catgctatat tcctgttatc 3900
atcattagtt aatgaaaata actctcgtgc ttcagaaaag tcaaatattg tatccataca 3960
tacatctcca aaactatcgc ttatacgttt atctttaacg atacctatac ctagatggtt 4020
atttactaac agacattttc cagatctatt gactataact cctatagttt ccacatcaac 4080
caagtaatga tcatctattg ttatataaca ataacataac tcttttccat ttttatcagt 4140
atgtatatct atatcaacgt cgtcgttgta gtgaatagta gtcattgatc tattatatga 4200
aacggatat 4209

Claims (26)

1.一种牛痘病毒，其缺乏牛痘病毒生长因子(VGF)、细胞外信号调节激酶(ERK)活化蛋白和核糖核苷酸还原酶(RNR)的功能。
2.根据权利要求1的病毒，其是具有改善安全性的生长受限的病毒，其中所述病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制。
3.根据权利要求1或2的病毒，其中C11R、O1L和F4L基因各自的全部或部分区域已缺失或修饰，并且这些基因产物的功能已失活。
4.一种缺乏牛痘病毒生长因子(VGF)、细胞外信号调节激酶(ERK)活化蛋白和核糖核苷酸还原酶(RNR)的功能的生长受限的牛痘病毒，其中编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代，并且其中所述生长受限的牛痘病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制，从而具有改善的安全性和生产率。
5.根据权利要求4的病毒，其中C11R、O1L和F4L基因各自的全部或部分区域已缺失或修饰，以使这些基因产物的功能失活。
6.根据权利要求4或5的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是选自A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L的一种或多种基因，并且已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。
7.根据权利要求4或5的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L，并且已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。
8.根据权利要求4或5的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L，并且已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因替代。
9.根据权利要求4至8中任一项的病毒，其中具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株是IHD-J株或IHD-W株。
10.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项的病毒。
11.根据权利要求10的药物组合物，其用于静脉内施用、腹膜内施用或瘤内施用。
12.一种生长受限的牛痘病毒载体，其是外来DNA已引入其内的根据权利要求1至9中任一项的病毒。
13.根据权利要求12的载体，其中所述外来DNA是编码癌症特异性抗原、免疫应答调节剂或对于癌细胞表面抗原具有亲和性的蛋白质的基因。
14.一种具有改善生产率的生长受限的牛痘病毒，其中编码生长受限的牛痘病毒的细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因的DNA序列，已由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因的DNA序列替代，并且其中所述生长受限的牛痘病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制。
15.根据权利要求14的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是选自A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L的一种或多种基因。
16.根据权利要求14的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
17.根据权利要求14的病毒，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
18.根据权利要求14至17中任一项的病毒，其中具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株是IHD-J株或IHD-W株。
19.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含根据权利要求14至18中任一项的病毒。
20.一种生长受限的牛痘病毒载体，其是外来DNA已引入其内的根据权利要求14至18中任一项的病毒。
21.根据权利要求20的载体，其中所述外来DNA是编码癌症特异性抗原、免疫应答调节剂或对于癌细胞表面抗原具有亲和性的蛋白质的基因。
22.一种改善生长受限的牛痘病毒的生产率的方法，其包括：
编码生长受限的牛痘病毒的细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因的DNA序列由具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株的相应基因的DNA序列替代，其中所述生长受限的牛痘病毒在正常细胞中并不复制，并且可以在增殖细胞中选择性地复制。
23.根据权利要求22的方法，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是选自A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L的一种或多种基因。
24.根据权利要求22的方法，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
25.根据权利要求22的方法，其中所述编码细胞外包膜病毒(EEV)相关蛋白的基因是A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、F12L和F13L基因。
26.根据权利要求22的方法，其中具有高EEV生产率的另一种牛痘病毒株是IHD-J株或IHD-W株。
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