ITMI20131142A1 - Ceppi batterici ricombinanti per la produzione di nucleosidi naturali e analoghi modificati. - Google Patents

Ceppi batterici ricombinanti per la produzione di nucleosidi naturali e analoghi modificati.

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ITMI20131142A1
ITMI20131142A1 IT001142A ITMI20131142A ITMI20131142A1 IT MI20131142 A1 ITMI20131142 A1 IT MI20131142A1 IT 001142 A IT001142 A IT 001142A IT MI20131142 A ITMI20131142 A IT MI20131142A IT MI20131142 A1 ITMI20131142 A1 IT MI20131142A1
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Francesca Forti
Daniela Erica Ghisotti
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Frau Pharma S R L
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
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Description

CEPPI BATTERICI RICOMBINANTI PER LA PRODUZIONE DI NUCLEOSIDI NATURALI E ANALOGHI MODIFICATI.
DESCRIZIONE
Campo dell ’invenzione.
La presente invenzione riguarda nuovi ceppi batterici geneticamente modificati, capaci di esprimere polipeptidi aventi l'attività enzimatica degli enzimi (TP) e/o (TP UdP) e/o (TP+PNP) e/o (TP UdP PNP); i ceppi in questione possono essere usati per catalizzare reazioni di transglicosilazione tra un nucleoside donatore ed una base accettore.
Nucleosidi naturali o loro analoghi modificati hanno importanti applicazioni, sia direttamente sia come intermedi, nel campo di farmaci ad azione anti -virale e anti-tumorale , ed anche nella preparazione di oligonucleotidi per uso diagnostico e terapeutico.
I nucleosidi possono essere preparati con metodi di sintesi chimica che normalmente richiedono un gran numero di passaggi per la protezione e deprotezione dei gruppi labili e l'uso di reagenti e condizioni di funzionamento che, a livello industriale, possono essere di difficile applicazione ed economicamente svantaggiosi.
Un approccio alternativo per la preparazione di nucleosidi ed analoghi modificati si basa invece sull<1>interconversione fra un nucleoside zuccherodonatore ed una base accettore per mezzo di enzimi che catalizzano reazioni reversibili generali, come ad es. la pirimidina fosforilasi (detta anche uridina fosforilasi, "UdP"; gene udp; EC 2.4.2.3), vedi reazioni (1) e (2) nello schema 1 sotto, o la purina fosforilasi (detta anche purina nucleoside fosforilasi, "PNP" ; gene deoD; EC 2.4.2.1), vedi reazione (3) nello schema 1 sotto (Hutchinson, Trends Biotecnologia. 8,348-353,1990):
Schema 1
(1) pirimidina- β-(desossì) ribonucleoside fosfato organico O pirimidina base a-(desossi)ribosio-1 -fosfato;
oppure
(2) uridina fosfato organico <=> uracile α-Dribosio 1-fosfato
(3) purina -β- (desossi}ribonucleoside fosfato organico <Φ purina base a- (desossi)ribosio -1-fosfato .
Ad esempio, PNP metabolizza adenosina in adenina, inosina in ipoxantina e guanosina in guanina.
Benché la uridina fosforilasi (UdP) sia anche in grado di processare la timidina secondo la reazione (4) di schema 2 sotto, la rispettiva attività è bassa:
Schema 2
(4) timidina fosfato organico <=> timina 2-desossi-of-D-ribosio 1-fosfato.
La reazione (4) viene invece conseguita con maggiore attività dalla timidina fosforilasi ("TP", gene deoA, EC 2.4.2.4).
Gli enzimi UdP, TP e PNP possono essere utilizzati singolarmente per catalizzare reazioni di transglicosilazione tra un nucleoside pirimidinico donatore ed una base accettore pirimidinica o tra un nucleoside purinico donatore ed una base accettore purinica, rispettivamente. Inoltre, quando gli enzimi sono utilizzati in combinazione, è possibile trasferire lo zucchero da un nucleoside donatore pirimidinico ad una base accettore purinica o pirimidinica come pure da un nucleoside purinico donatore ad una base accettore pirimidinica o purinica, a seconda dei materiali di partenza utilizzati.
In questo contesto, WO 00/39307 a nome Keryos SpA, insegna ceppi batterici di E. coli geneticamente modificati che contengono, su un vettore di espressione plasmidico ricombinante, a) le sequenze geniche di un batterio mesofilo che codificano per polipeptìdi aventi l'attività enzimatica degli enzimi uridina fosforilasi (UdP) e/o purina nucleoside fosforilasi (PNP), sia separatamente che insieme, e b) almeno una sequenza genica codificante per resistenza contro tetraciclina, kanamicina e/o ampicillina; i quali ceppi batterici come sopra esibiscono (a seconda del ceppo concreto utilizzato) attività enzimatiche UdP che sono ca. 340-1040 volte più elevate delle attività di cellule E. coli corrispondenti non trasformate e/o attività enzimatiche PNP che sono (sempre a seconda del ceppo concreto utilizzato) ca . 120-200 volte più elevate delle attività di cellule E. coli corrispondenti non trasformate.
Tuttavia, mentre i ceppi con attività UdP secondo WO 00/39307 sono in grado di processare timidina, la rispettiva attività non è ottimale. Inoltre, lo spettro di diverse attività enzimatiche ottenibile miscelando i ceppi di WO 00/39307 in varie proporzioni tra di loro rimane sostanzialmente limitato .
Uno scopo della presente invenzione è dunque la messa a disposizione dì nuovi ceppi batterici ricombinanti la cui facoltà di processare la timidina sia migliorata. Questo perché il nucleoside timidina è facilmente disponibile da fonti commerciali e costituisce un materiale di partenza di elevato interesse per effettuare le seguenti reazione di trans-glicosilazione, mediante dall'enzima timidina fosforilasi (TP):
(4) timidina fosfato organico <4> timina a-(desossi) ribosio-l-fosfato
(1) pirimidina-3-ribonucleoside fosfato organico <4> pirimidina base a-D-ribosio-lfosfato
Per quanto riguarda il clonaggio del gene deoA che codifica per la timidina fosforilasi, nella letteratura recente si trovano i seguenti lavori dove il gene deoA è stato clonato da solo oppure in combinazione con il gene deoD:
Esipov et al. in Protein Expression and Purification 24: 56-60, 2002 hanno clonato i geni udp, deoD e deoA di E. coli separatamente in un plasmide pET, sotto il controllo di un promotore inducibile con IPTG, nel ceppo BL21(DE3) di E. coli . Gli autori riferiscono sovrapproduzione di tutti e tre gli enzimi in seguito a induzione con IPTG e riportano l'ottenimento di elevati livelli di attività fosforilasica, ma l'incremento di attività non è riportato e non risulta calcolabile in mancanza dell'espressione dei rispettivi ceppi di controllo.
- Ge et al. in Appi. Biochem. Biotechnol . 159: 168-177, 2009 hanno clonato combinazioni binarie degli enzimi (PNP UdP) e (PNP TP) nel medesimo microrganismo per allargare lo spettro dell'applicabilità industriale rispetto a propri lavori antecedenti e rispetto al lavoro di Esipov et al. Per clonare i due geni da E. coli K12 nel ceppo BL21(DE3) di E. coli, Ge et al. hanno usato due strategie diverse. La prima strategia (i) impiegava un sistema con due plasmidi distinti e resistenze ad antibiotici diverse (un derivato di pETlla, che porta la resistenza all' ampicillina, in cui è clonato PNP, accoppiato ad un derivato di pET28a, che porta la resistenza alla kanamicina, in cui è clonato UdP o TP; ottenendo DUD = (PNP UdP) e DAD = (PNP TP), rispettivamente); invece la seconda strategia (ii) impiegava un plasmide, derivato da pET28a, che portava la combinazione di geni desiderata in tandem (pDU (PNP UdP) oppure pDA = (PNP TP)). Gli autori riferiscono nel caso (i) il manifestarsi di tendenziale perdita dei plasmidi anche in presenza di antibiotico (probabilmente perché i due plasmidi non sono compatibili), mentre osservano miglioramento nel caso (ii) in cui mantengono con successo il plasmide con clonati i due geni in tandem. Gli autori osservano comunque che l'induzione con IPTG risulta necessaria in entrambi casi (i) ed (ii) per avere espressione apprezzabile delle proteine.
Gli autori osservano anche che l'espressione enzimatica ottenuta nei ceppi con due plasmidi distinti risulta superiore a quella dei ceppi portanti un plasmide con i due geni clonati in tandem. Dai dati pubblicati in tabella 4 di Ge et al. è stato possibile calcolare gli incrementi di attività ottenuti dopo induzione, riportati qui sotto :
Attività DAD-PNP/TP DUD=PNP/UDP TDU-PNP+TP TDA=PNP+UDP Dinq et al. in Nucleosides , Nucleotides and Nucleic Acids 30: 360-368, 2011 hanno clonato ed espresso TP di E. coli nel ceppo BL21(DE3) di E. coli (plasmidi utilizzati pMD-18T e pET-lla) sotto il controllo di un promotore inducibile e dimostrano che il lattosio come induttore può costituire una valida alternativa ad IPTG nel sistema studiato. L'incremento massimo di attività ottenuto da Ding et al. mediante induzione è di 12,6 come si vede dai loro dati pubblicati.
Dalle pubblicazioni di cui sopra emerge dunque che mentre la clonazione del gene deoA è stata eseguita da distinti gruppi di ricercatori, l'incremento massimo di attività ottenuto non è prevedibile e comunque dipende fortemente dalla combinazione di ceppo e plasmidi utilizzati e/o dalle condizioni di coltura, e richiede induzione per ottenere la sovraespressione . Gli incrementi dell'espressione del gene deoA rispetto al ceppo selvatico, ove dichiarati dagli autori, rimangono comunque modesti e non superano il fattore di ca.
40 volte. Inoltre, laddove il gene deoA viene clonato in tandem con un altro gene, come ad esempio il gene deoD, per venire incontro a specifici fabbisogni industriali, questo riduce sensibilmente l'incremento ottenuto per deoA.
Questo risulta insoddisfacente in quanto la messa a disposizione di singoli ceppi clonati monofunzionali, ossia che sovraesprimono ciascuno un solo enzima, pone problemi logistici nella loro applicazione industriale (che richiede la facoltà di condurre un ampio spettro di reazioni diverse nel minimo tempo e/o nel minimo numero di reattori possibile} che risulterebbe dunque teoricamente più efficiente con ceppi multifunzionali. Dal lato pratico comunque, la resa della clonazione - in termini dell'incremento ottenuto rispetto al ceppo selvatico - si abbassa notoriamente con il numero di geni clonati nel medesimo plasmide, limitando la razionalità dell'impiego di ceppi bi - o addirittura plurif unzionali .
In questo contesto, la presente invenzione si pone il problema tecnico della messa a disposizione di nuovi ceppi batterici ricombinanti bi- e trifunzionali che portino specifiche combinazioni di geni clonati e che esibiscano un'incremento dell'attività enzimatica rispetto al substrato timidina che sia più elevata rispetto a quello ottenibile con i ceppi bifunzionali noti da WO 00/39307 e da Ge et al.
□n ulteriore problema tecnico risolto dalla presente invenzione è la messa a disposizione di ulteriori ceppi ricombinanti che usati soli, in miscela tra di loro, oppure in miscela con ceppi noti allarghino lo spettro delle proporzioni di attività enzimatiche ottenuto come da WO 00/39307 e da Ge et al.
Descrizione delle Figure.
In Fig. 1 sono riportati gli schemi dei clonaggi effettuati per ottenere i diversi plasmidi qui descritti (maggiori dettagli sono riportati nell'esempio 2) .
Figura la riguarda il plasmide pGM973, derivato di pUCl8 in cui la resistenza all'ampicillina è stata sostituita con la cassetta di resistenza al d oramienicolo . Il gene cat è stato amplificato per PCR da pGZH 9, derivato di pKF3 (Lessi et al.
1992. J. Bacteriol . 174:2493-2500) con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, digerito Ndel EcoRV e ligato a pUC18 digerito Ndel Seal.
Figura lb riguarda il plasmide pGM974, derivato di pUCl8, in cui è stato clonato il gene deoD di E. coli e la resistenza al cloramfenicolo . Il gene deoD di E. coli è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi 304 e 305, digerito EcoRI Sali e ligato a pUC18 digerito EcoRI Sali, ottenendo pGMF970 (descritto nell'esempio 2); il gene cat, amplificato da pGZ119 con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, è stato digerito Ndel EcoRV e ligato a pGMF970 digerito Ndel Seal. Figura le riguarda il plasmide pGM975, derivato di pUC18, in cui è stato clonato il gene udp di E. coli e la resistenza al cloramf enicolo . Il gene udp di E. coli è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi 306 e 307, digerito Kpnl Sali e ligato a pUC18 digerito Kpnl Sali, ottenendo pGMF971 (descritto nell'esempio 2); il gene cat è stato amplificato per PCR da pGZ119 con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, digerito Ndel EcoRV e ligato a pGMF971 digerito Ndel Seal.
Figura ld riguarda il plasmide pGM976, derivato di pUCl8, in cui sono clonati i geni udp e deoD di E. coli e la resistenza al d oramienicolo. Il gene deoD di E. coli è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi xxl e yyl, digerito Sali Sphl e ligato a pGMF972 (descritto nell'esempio 2) , digerito Sali Sphl; il gene cat è stato amplificato per PCR da pGZH 9 con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, digerito Ndel EcoRV e ligato a pGMF972 digerito Ndel Seal.
Figura le riguarda il plasmide pGM977, derivato di pUCl8, in cui è clonato il gene deoA di E. coli. Il gene deoA di E. coli è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi 2826 e 2827, digerito EcoRI Sali e ligato a pUC18 digerito EcoRI Sali.
Figura lf riguarda il plasmide pGM986, derivato di pUC18, in cui sono clonati i geni udp e deoA di E. coli. Il gene deoA di E. coli, è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotìdi 2863 e 2864, digerito Sphl e clonato in pGM975 digerito Sphl. I geni udp e deoA sono nello stesso orientamento, in tandem.
Figura lg riguarda il plasmide pGM987, in cui sono clonati i geni udp, deoD e deoA di E. coli. Il gene deoA di E. coli, è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotìdi 2863 e 2864, digerito Sphl e ligato in pGM976 digerito Sphl. I geni udp, deoD e deoA sono nello stesso orientamento.
In Figura 2 è riportata la sovraespressione delle proteine espresse dai ceppi E. coli DH10B trasformati con i diversi plasmidi, analizzata mediante elettroforesi dopo diversi tempi di crescita (Figura 2A e 2B). I pesi molecolari dei marcatori (M) corsi nel primo pozzetto di ciascun gel sono indicati sulla sinistra in kDa.
Figura 2A riguarda estrazioni fatte dopo 2 e 4 ore di crescita esponenziale ed in fase stazionaria (on) e le proteine separate per elettroforesi su gel di polìacrilammide al 10%, SDS 0,1%.
Figura 2B riguarda le estrazioni fatte nella fase stazionaria. Le proteine sono state separate per elettroforesi in gel di poliacrìlanunide al 15%, SDS 0,1%. Si noti che pGM973 corrisponde al plasmide di controllo, nel quale non è stato clonato alcun gene, se non la resistenza al cloramf enicolo . Per DHlOB/pGM986 e 987 sono stati analizzati due cloni indipendenti (cl.l e cl.2). Nella Figura 3 sono riportate le fusioni nei vari plasmidi, con la regione aggiunta al 5' del gene sottolineata. Inoltre sono riportate le sequenze dei linker posti tra il gene udp e deoD, nei costrutti che portano entrambi gli enzimi (pGM976 e pGM987) e quella a monte di deoA in pGM986 e pGM987. In questi casi, la sequenza di attacco dei ribosomi (RBS) è in grassetto.
Sommario dell<1>invenzione.
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda la messa a disposizione di un nuovo vettore ricombinante di espressione plasmidico, basato sul plasmide pUC18, comprendente:
a) almeno una sequenza genica di un batterio mesofilo codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di timidina fosforilasi; e
b) almeno una sequenza genica che codifica per la resistenza ad almeno un antibiotico. Nell'ambito della presente invenzione è preferita la resistenza contro il cloramfenicolo .
Secondo una prima forma di esecuzione preferita, il nuovo vettore plasmidico come sopra, può comprendere almeno una prima ulteriore sequenza genica di un batterio mesofilo codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di pirimidina fosforilasi.
Secondo una seconda forma di esecuzione preferita, il nuovo vettore plasmidico qui descritto può comprendere, oltre alla prima ulteriore sequenza genica anzidetta, almeno una seconda ulteriore sequenza genica di un batterio mesofilo codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di purina fosforilasi.
Secondo una terza forma di esecuzione preferita, il nuovo vettore plasmidico qui descritto può comprendere, oltre alla prima sequenza genica di un batterio mesofilo codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di timidina fosforilasi, almeno una prima ulteriore sequenza genica di un batterio mesofrio codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di purina fosforilasi .
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda la messa a disposizione di cellule ospiti procariotiche, preferibilmente del ceppo E. coli K12 DH10B, caratterizzate dal fatto di contenere almeno un vettore plasmidico secondo la presente invenzione .
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda l'uso delle cellule ospiti della presente invenzione o del corrispondente greggio o estratti purificati, separatamente o in combinazione, per la produzione di polipeptidi o loro miscele aventi attività enzimatica (TP) e/o (UdP TP) e/o (PNP TP) e/o (UdP PNP TP).
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda l'uso di cellule ospiti secondo la presente invenzione o del corrispondente greggio o estratti purificati, separatamente o in combinazione , come catalizzatori in reazioni di transglicosilazione tra un nucleoside donatore e una base accettore.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda l'uso di cellule ospiti secondo la presente invenzione, separatamente o in combinazione, o del corrispondente greggio o estratti purificati, nella preparazione di analoghi nucleosidici contenenti basi timidiniche o puriniche o pirimidiniche o contenenti basi eterocicliche aromatiche o non aromatiche. Solo a scopo esemplificativo, ma non limitato a, tali basi eterocicliche possono essere costituite da uno o piu' anelli, a 5, 6, 7 atomi e possono contenere da uno a piu' atomi di azoto.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda l'uso di cellule ospiti secondo la presente invenzione, separatamente o in combinazione, o del corrispondente greggio o estratti purificati, nella preparazione di zuccheri cx-pentosio-l-fosfatici tramite reazioni di fosforolisi.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda l’uso di cellule ospiti secondo la presente invenzione, separatamente o in combinazione, o del grezzo corrispondente o estratti purificati, nella produzione di nucleosidi e loro analoghi modificati.
Descrizione dettagliata dell'invenzione.
Gli inventori della presente domanda hanno costruito plasmidi che sovraesprimono gli enzimi timidina fosforilasi (gene deoA) , pirimidina fosforilasi (gene udp) e purina fosforilasi (gene deoD } di Escherìchia coli. Tra i plasmidi costruiti dagli inventori della presente domanda, 7 plasmidi sono elencati in Tabella 1, di cui 6 plasmidi portano o un singolo gene o combinazioni di 2 o 3 geni insieme. I plasmidi che sono elencati nella Tabella 1 e le caratteristiche della loro costruzione, oltre che la costruzione dì ulteriori plasmidi, sono riportati negli esempi della presente domanda. In Tabella 1 è indicata anche la resistenza all'antibiotico portata da ciascun plasmide. Inoltre in Tabella 1 è riportato il plasmide di controllo (pGM973) in cui non è stata clonata nessuna attività fosforilasìca .
Tabella 1. Plasraidi ricombinanti che sovraesprimono le fosforilasi di Escherichia coli.
Nome Geni clonati* Attività Resistenza enzimatica portata dal espressa plasmide pGM973 Cat
pGM974 deoD PNP Cat
pGM975 udp UdP Cat
pGM976 udp deoD UdP PNP Cat
pGM977 deoA TP Amp
pGM986 udp deoA UdP TP Cat
pGM987 Udp deoD deoA UdP PNP TP Cat
*1/ ordine dei geni da sinistra a destra corrisponde alla loro posizione dopo il clonaggio nel plasmide, partendo da quello fuso a lacZ (vedi Figura 3) Gli inventori della presente domanda hanno comunque trovato che l'ordine concreto secondo il quale sono stati clonati i geni nel plasmide non incide sulle attività delle cellule ospite trasformate con i plasmidi.
Con i plasmidi cosi ottenuti è stato trasformato il ceppo di E. coli DH10B (vedi Tabella 2) ed è stata verificata la crescita in terreno completo LD con l'aggiunta dell'antibiotico per selezionare per il mantenimento del plasmide (d oramienicolo o ampicillina a seconda del plasmide). Il confronto delle curve di crescita tra i ceppi che portano il plasmide scarico e quelli che portano i plasmidi che esprimono uno o più proteine non ha mostrato rilevanti variazioni. I ceppi che esprimono più proteine hanno una crescita leggermente rallentata, ma raggiungono lo stesso titolo in fase stazionaria. In conclusione, la presenza dei plasmidi non causa particolari alterazioni nella vitalità dei ceppi.
Tabella 2. Ceppi di Escherìchia coli DH10B che portano i plasmidi ricombinanti che sovraesprimono le fosforilasi.
Ceppo batterico Gene clonato Gene fuso a lacZ
DH10B/pGM973 —
DH10B/pGM974 deoD deoD
DH10B/pGM975 udp udp
DH10B/pGM976 udp deoD udp
DH10B/pGM977 deoA deoA
DH10B/pGM986 udp deoA udp
DH10B/pGM987 udp deoD deoA udp
Ciascun ceppo che contiene un plasmìde ricombinante esprime in alta quantità una proteina che corrisponde per PM a quella prevista, vedi Figura 2 che riporta la separazione elettroforetica in gel di poliacrilammìde delle proteine estratte dai diversi ceppi. Come si può osservare, tutti i ceppi esprimono una elevata quantità della o delle proteine clonate, in particolare in fase stazionaria di crescita, crescita che e avvenuta senza aggiunta di induttore (IPTG o lattosio) .
Le attività fosf orilasiche (in U/mg di proteine estratte) espresse dalle proteine clonate sono state saggiate mediante test allo spettrofotometro (i protocolli utilizzati sono descritti negli esempi) . Sono state saggiate le attività di uridina fosforilasi, purina fosforilasi e timidina fosforilasi presenti negli estratti grezzi di colture in fase stazionaria di crescita. I risultati, nella Tabella 3, riportano, le attività misurate in colture su scala di laboratorio (5 mi ).
Tabella 3. Attività enzimatica espressa dai ceppi trasformati .
Ceppo Gene Uridina Purina Timidina batterico clonato fosforilasi fosforilasi fosforilasi
U/mg IncreU/mg IncreU/mg Increpro mento pro mento pro- mento teine teine teine§ DHlOB/pGM — 0,2 1 0,01 1 0,03 1 973
DHlOB/pGM deoD NT 1,6 160 NT
974
DHlOB/pGM udp 35,6 178 NT 1,9 63 975
DHlOB/pGM udp deoD 33,4 167 1,6 160 2,1 70 976
DHlOB/pGM deoA NT NT 6,9 230 977
DHlOB/pGM udp deoA 29,2 146 NT 5,6 186 986
DHlOB/pGM udp deoD 23,4 117 1,3 130 5,4 180 987 deoA
§La presenza di attività timidina fosf orilasica nei ceppi in cui è espresso udp è attesa in quanto questo enzima trasforma anche la timidina, NT = non testato
Per quanto riguarda le attività espresse dalle colture in laboratorio, tutte le attività fosforilasiche (U/mg proteina) sono incrementate . Da Tabella 3 appare che l'attività maggiormente aumentata è TP, che risulta più di 200 volte (in particolare 230 volte) quella del ceppo di controllo, quando espressa da sola, mentre Ding et al. e Ge et al. osservavano fattori di incremento di 12.6 e 36.7, rispettivamente. L'attività di TP resta comunque sempre molto elevata anche in combinazione con uno o altri due enzimi (almeno 180 volte il controllo) , corrispondente ad una perdita di ca. 22% dell'incremento quando si passa dalla clonazione singola alla clonazione binaria o ternaria. In questo contesto, è soprattutto degno di nota che l'ulteriore passaggio dalla clonazione binaria a quella ternaria non comporta riduzioni apprezzabili dell'incremento (che scende da 186 a 180) .
Per quanto riguarda l'espressione enzimatica in colture di scale up (volume di 5 1), è stata saggiata ad esempio l'espressione di TP nel ceppo DHlOB/pGM977 , che è risultata di 6,3 U/mg proteine, quindi con un incremento sìmile a quello rilevato in coltura di laboratorio (6,9 U/mg).
Come detto sopra, il nucleoside timidina è
facilmente disponibile da fonti commerciali e
costituisce un materiale di partenza interessante
per effettuare le seguenti reazione di trans-
glicosilazione , mediate dall'enzima timidina
fosforilasi (TP):
(4) timidina fosfato organico « timina a-(desossi) ribosio-l-fosfato
(1) pirimidina-p-ribonucleoside fosfato organico « pirimidina base a-D-ribosio-1-fostato
Se un ceppo che sovraesprime l'enzima timidina fosforilasi (TP) e' in grado di sovraesprimere pure l'enzima uridina fosforilasi (UdP) e/o l'enzima purina nucleoside fosforilasi (PNP) , allora divengono possibili anche le seguenti reazioni :
(2') uracile α-D-ribosio-l-fosf ato <=> uridina fosfato organico
(3') purina base a- (desossi)ribosio-l-fosfato <=> purina-β-(desossi )ribonucleoside fosfato organico
Combinando pertanto le reazioni (1), (2'), (3’) e (4), in tutte le permutazioni possibili, risulta che i nuovi ceppi oggetto della presente invenzione sono in grado di effettuare le seguenti reazioni di trans-glicosilazione, che non erano dominanti coi ceppi del brevetto Keryos WO 00/39307 :
Nucleoside Base A dare Nucleoside Base donatore accettore Prodotto Prodotto
Nucleoside
Timidina Pirìmidina A dare Timina pirimidinico
Nucleoside
Timidina Purina A dare Timina purinico
Pirimidina
Nucleoside a struttura Nucleoside
A dare Pirimidina pirimidinico timidinica timidinico modificata
Pirimidina
Nucleoside a struttura Nucleoside
A dare Purina purinico timidinica timidinico modificata
1/ importanza dei ceppi oggetto della presente
invenzione è da una parte evidente se si considera
che la timidina è materiale di partenza facilmente
disponibile interessante e i ceppi sono in grado
di trasformarlo in prodotti di interesse
farmaceutico ad alto valore aggiunto (ad es .
antivirali , antitumorali), per reazione con una opportuna base accettore purinica o pirimidinica naturale o di sintesi. Inoltre, l'importanza dei ceppi oggetto della presente invenzione risiede pure nella possibilità' di produrre nucleosidi che recano una base a struttura timidinica piu' o meno modificata (nucleoside timidinico) . Tali composti possono avere interesse farmaceutico come antivirali o antitumorali.
In questo contesto, le cellule ospite secondo la presente invenzione che sono caratterizzate dal fatto di comprendere almeno un vettore ricombinante di espressione plasmidico secondo la presente invenzione, il loro corrispondente greggio o estratti purificati possono essere impiegati, separatamente o in combinazione, come catalizzatori in reazioni di transglicosilazione tra un nucleoside donatore ed una base accettore.
Secondo una prima forma di esecuzione, la base accettore è una base eterociclica aromatica o non aromatica, preferibilmente una timidina o una pirimidina o una purina. Nell'ambito della prima forma di esecuzione, le basi eterocicliche aromatiche, preferibilmente le basi di timidina o pirimidina o purìna sono scelte tra timidina naturale o sostituita, pirimidina naturale o sostituita e basi puriniche naturali o sostituite; basi puriniche sostituite alle posizioni 1,2 e/o 6; basi pirimidiniche sostituite alle posizioni 3 e/o 5; purina, 2-azapurina, 8-azapurina e loro analoghi sostituiti, 1-deazapurina (imidazopiridina ), 3-deazapurina, 7 -deazapurina e loro analoghi sostituiti .
Secondo una seconda forma di esecuzione, le basi accettore sono costituiti da composti eterociclici contenenti almeno un atomo di azoto, come, ad esempio, imidazoli e loro analoghi sostituiti, triazoli e loro analoghi sostituiti e pirazoli e loro analoghi sostituiti, pirroli e loro analoghi modificati, tiazoli e benzotiazoli e loro analoghi modificati, oxazoli e benzoxazoli e loro analoghi modificati, isotiazoli e benzisotiazoli e loro analoghi modificati, isoxazoli e benzisoxazoli e loro analoghi modificati, indoli e loro analoghi modificati, benzimidazoli e loro analoghi modificati, indazoli e loro analoghi modificati, piridazine e loro analoghi modificati, pirazìne e loro analoghi modificati, piridine e loro analoghi modificati, tetrazoli e loro analoghi modificati, oxadiazoli e loro analoghi modificati, tiadiazoli e loro analoghi modificati, triazine e loro analoghi modificati, tetrazine e loro analoghi modificati, benzotriazoli e loro analoghi modificati .
Secondo una terza forma di esecuzione, le basi accettore sono costituite da eterocicli che recano un anello eterociclico a 5 fuso con un anello eterociclico a 6, preferibilmente scelte dal gruppo consistente delle imidazopiridine, imidazopirimidine, imidazopirazine, imidazopiridazìne, pirrolopiridine, pirrolopìrimidine, pirrolopirazine, pirrolopiridazine, pirazolopiridine, pirazolopirimidine, pirazolopirazine, pirazolopiridazine o loro analoghi sostituiti .
Secondo una quarta forma di esecuzione, il nucleoside donatore è scelto tra nucleosidi naturali e/o modificati contenenti D-ribosio, lixosio e 2'-deossiribosio o uno zucchero modificato, ossia uno zucchero prodotto per sintesi e che reca sull'anello diverse modificazioni e gruppi non presenti negli zuccheri naturali; nucleosidi contenenti il gruppo ribosio modificato nelle posizioni 2’, 3' e o 5', nucleosidi, in cui lo zucchero è β-D-arabinosio, α-L-xilosio, 3'-desossiribosio, 3 ',5'-didesossiribosio, 2 *,3*— didesossiribosio, 5 '-desossiribosio, 2',5'-didesossiribosio, 2 '-ammino-2 '-desossiribosio, 3'-ammino-3 '-desossiribosio, 2'-fluoro-2 '-desossiribosio.
Le cellule ospite secondo la presente invenzione che sono caratterizzate dal fatto di comprendere almeno un vettore rìcombinante di espressione plasmidico secondo la presente invenzione, il loro corrispondente greggio o estratti purificati possono essere impiegati, separatamente o in combinazione, nella preparazione di analoghi nucleosidici contenenti basì timidiniche o puriniche o pirimìdiniche o contenenti basi eterocicliche aromatiche o non aromatiche, preferibilmente tali basi eterocicliche possono essere costituite da uno o piu' anelli, a 5, 6, 7 atomi e possono contenere da uno a piu' atomi di azoto .
Le cellule ospite secondo la presente invenzione che sono caratterizzate dal fatto di comprendere almeno un vettore ricombinante di espressione plasmidico secondo la presente invenzione, il loro corrispondente greggio o estratti purificati possono anche essere impiegati, separatamente o in combinazione, nella preparazione di zuccheri apentosio-l-fosf atici tramite reazioni di fosforolisi .
Esempi .
Esempio 1: CLONAZIONI, TERRENI E SOLUZIONI.
Per i protocolli utilizzati per i clonaggi e le trasformazioni si rimanda al manuale Sambrook et al (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) nel quale sono descritte in dettaglio tutte le classiche metodologie di laboratorio. I terreni utilizzati sono LD brodo [composizione per litro: Bactotryptone (Difco) 10 g, Yeast extract (Difco) 5 g, NaCl 5 g] e LD agar (LD 10 g/1 agar), addizionati con cloramfenicolo (30 pg/ml) o ampicìllina (100 pg/ml), a seconda del plasmide presente.
Esempio 2: COSTRUZIONE DEI PLASMIDI RICOMBINANTI Frammenti di DNA di Escherichia coli K12 (ceppo MG1655; Blattner et al. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277:1453-1462) sono stati amplificati per PCR con oligonucleotidi adeguati (riportati in Tab. 5), digeriti con opportuni enzimi di restrizione e clonati nel plasmide pUC18 (Yanish-Perron et al.
1985. Gene 33:103-119; EMBL accession number L08752) . I geni udp, deoD e deoA amplificati in questa maniera sono identici alle relative sequenze depositate in EMBL data bank. I relativi numeri di accesso in EMBL data bank sono udp: CG01747, deoD: CG00327; deoA: CG00324. I codici EMBL relativi alle proteine sono invece udp : X15689, deoD: M60917; deoA: U14003.
Le sequenze dei geni sono identiche nei diversi ceppi di Escherichia coli K12 (e anche altri). Con le miscele di ligation è stato trasformato il ceppo di E. coli K12 DH10B (Grant, SG et al. 1990 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87 4645-9; CP00948), selezionando per il marcatore portato dal plasmide. Il DNA plasmidico portato dai cloni trasformanti è stato estratto, controllato su gel di agarosio e analizzato per la presenza dell'inserto. I plasmidi ricombinanti sono stati sequenziati per verificare la corretta inserzione del gene clonato.
Tabella 5. Oligonucleotidi utilizzati
OLIGO SEQUENZA 5' 3'
304 ACTGAATTCTTCCATGGCTACCCCACACATTAATGCAG
305 TCATGGTCGACTTACTCTTTATCGCCCAGCAGAACG
306 ATCGGTACCATCCATGTCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTC
307 AGACGGTCGACAAGAGAATTACAGCAGACGACGC
xxl cagcTgatcgtcctccttaagaaggtaccgatggggt
yyi ATGCGCATGCCTGCAGGTCGACTTACTCTTTATCGCCCAG 2824 AGTCCATATGAAAT ACATTCAAATAT GTAT CCGCT
2825 AGCTGATATCTTTCTGCCATTCATCCGC
2826 GACCGAATTCCTTGTTTCTCGCACAAGAAA
2827 ACTGGTCGACTTATTCGCTGATACGGCG
2863 ACTGGCATGCAGGAGGTTCTCCTATGTTTCTCCACAAGAAATTA 2864 ACTGGCATGCATTATTCGCTGATACGGCGAT
Descrizione del clonacrgio :
- pGMF970: gene deoD di E. coli, amplificato con oligonucleotidi 304 e 305, digerito EcoRI Sali e ligato a pUC18 digerito EcoRI Sali [Coordinata 1 = coordinata 1 pUCl8: pUC18 da 1 a 417 (inizio sequenza - Sali tagliato), deoD da 418 a 1147 (Sali tagliato - EcoRI tagliato) pUCl8 da 1148 a 3383 (EcoRI tagliato - fine sequenza)] SEQ ID No. 1 pGMF971: gene udp di E. coli, amplificato con oligonucleotidi 306 e 307, digerito Kpnl Sali e ligato a pUC18 digerito Kpnl Sali [Coordinata 1 = coordinata 1 di pUCl8: pUC18 da 1 a 417 (inizio sequenza - Sali tagliato) udp da 418 a 1196 (Sali tagliato - Kpnl tagliato) pUC18 da 1197 a 3444 (Kpnl tagliato - fine sequenza)] SEQ ID No. 2
- pGMF972: gene deoD di E. coli amplificato con oligonucleotidi xxl e yyl, digerito Sali Sphl e ligato a pGMF971 digerito Sali Sphl [Coordinata 1 = coordinata 1 di pUCl8: pUC18 da 1 a 405 (inizio sequenza - Sphl tagliato) deoD da 406 a 1162 (Sphl tagliato - Sali tagliato) udp da 1163 a 1941 (Sali tagliato - Kpnl tagliato) pUCl8 da 1942 a 4189 (Kpnl tagliato - fine sequenza) SEQ ID No.
3
- pGM973: il gene cat è stato amplificato per PCR da pGZH 9, derivato di pKF3 (Lessi et al. 1992. J. Bacteriol. 174:2493-2500) con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, digerito Ndel EcoRV e ligato a pUC18 digerito Ndel Seal. Il gene per la resistenza all'ampicillina è stato parzialmente deleto e sostituito con la resistenza al cloramf enicolo . [Coordinata 1 al sito Ndel tagliato di pUC18: pUC18 da 1 a 1995 (sito Seal tagliato) cat da 1996 a 2901 (sito EcoRV tagliato - Ndel tagliato)] SEQ ID No. 4
- pGM974: il gene cat, amplificato da pKF3 con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, è stato digerito Ndel EcoRV e ligato a pGMF970 digerito Ndel Seal.
[Coordinata 1 al sito Ndel tagliato di pUC18: pUC18 da 1 a 233 (Ndel tagliato - Sali tagliato) deoD da 234 a 963 (Sali tagliato - EcoRI tagliato) pUC18 da 964 a 2692 (EcoRI tagliato - Seal tagliato) cat da 2693 a 3598 (EcoRV tagliato -Ndel tagliato)] SEQ ID No. 5
- pGM975: il gene cat è stato amplificato per PCR da pKF3 con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, digerito Ndel EcoRV e ligato a pGMF971 digerito Ndel Seal. [Coordinata 1 al sito Ndel tagliato di pUC18: pUCl8 da 1 a 233 (Ndel tagliato - Sali tagliato) udp da 234 a 1016 (Sali tagliato - Kpnl tagliato) pUC18 da 1017 a 2753 (Kpnl tagliato Seal tagliato) cat da 2754 a 3659 (EcoRV tagliato - Ndel tagliato)] SEQ ID No. 6
- pGM976: il gene cat è stato amplificato per PCR da pKF3 con gli oligonucleotidi 2824 e 2825, digerito Ndel EcoRV e ligato a pGMF972 digerito Ndel Seal. [Coordinata 1 al sito Ndel tagliato di pUCl8: pUC18 da 1 a 231 (Ndel tagliato - Sphl tagliato deoD da 232 a 978 (Sphl tagliato - Sali tagliato) udp da 979 a 1757 (Sali tagliato - Kpnl tagliato) pUC18 da 1758 a 3498 (Kpnl tagliato -Seal tagliato) cat da 3499 a 4004 (EcoRV tagliato . Ndel tagliato] SEQ ID No. 7
- pGM977: il gene deoA di E. coli è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi 2826 e 2827, digerito EcoRI Sali e ligato a pUC18 digerito EcoRI Sali. [Coordinata 1 = coordinata 1 di pUC18: pUC18 da 1 a 417 (inizio sequenza -Sali tagliato) deoA da 418 a 1748 (Sali tagliato -EcoRI tagliato) pUC18 da 1749 a 3983 (EcoRI tagliato a fine sequenza)] SEQ ID No. 8
pGM986amp: il gene deoA di E. coli è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi 2863 e 2864, digerito Sphl e clonato in pGMF971 digerito Sphl . I geni udp e deoA sono nello stesso orientamento, in tandem. [Coordinata 1 = coordinata 1 di pUC18: pUC18 da 1 a 409 (inizio sequenza - Sphl tagliato) deoA da 410 a 1752 (Sphl tagliato - Sphl tagliato) pUC18 da 1753 a 1759 (Sphl tagliato a Sali tagliato) udp da 1760 a 2543 (Sali tagliato- Kpnl tagliato) pUC18 da 2544 a 4787 (Kpnl tagliato - fine sequenza)] SEQ ID No. 9
pGM986: il gene deoA di E. coli è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi 2863 e 2864, digerito Sphl e clonato in pGM975 digerito Sphl. I geni udp e deoA sono nello stesso orientamento, in tandem. [Coordinata 1 al sito Ndel tagliato di pUCl8: pUC18 da 1 a 225 (Ndel tagliato - Sphl tagliato) deoA da 226 a 1568 (Sphl tagliato - Sphl tagliato) pUC18 da 1569 a 1576 (Sphl tagliato - Sali tagliato) udp da 1577 a 2359 (Sali tagliato - Kpnl tagliato) pUC18 da 2360 a 4096 (Kpnl tagliato - Seal tagliato) cat da 4097 a 5002 (EcoRV tagliato Ndel tagliato)] SEQ ID No.
10
pGM987: il gene deoA di E. coli, è stato amplificato per PCR con gli oligonucleotidi 2863 e 2864, digerito Sphl e ligato in pGM976 digerito Sphl . I geni udp, deoD e deoA sono nello stesso orientamento. [Coordinata 1 al sito Ndel tagliato di pUC18: pUC18 da 1 a 222 (Ndel tagliato - Sphl tagliato) deoA da 223 a 1564 (Sphl tagliato - Sphl tagliato) deoD da 1565 a 2919 (Sphl tagliato -Sali tagliato) udp da 2920 a 3702 (Sali tagliato -Kpnl tagliato) pUC18 da 3703 a 5439 (Kpnl tagliato - Seal tagliato)cat da 5440 a 6345 (EcoRV tagliato -Ndel tagliato)] ] SEQ ID No. 11
In Figura 1 è riassunta la costruzione dei plasmidi .
Esempio 3: FUSIONI CREATE PER CLONARE I DIVERSI GENI.
Si riportano le fusioni che si sono create tra il gene lacZ del vettore pUC18 ed il primo gene codificante per fosforilasi clonato a valle e, quando sono clonati più geni in sequenza, le sequenze della regione intergenica (linker).
Nella Fig. 3 sono riportate le fusioni nei vari plasmidi, con la regione aggiunta al 5' del gene sottolineata. Inoltre sono riportate le sequenze dei linker posti tra il gene udp e deoD, nei costrutti che portano entrambi gli enzimi (pGM976 e pGM987) e quella a monte di deoA in pGM986 e pGM987. In questi casi, la sequenza di attacco dei ribosomi (RBS) è in grassetto.
Esempio 4; ESPRESSIONE DELLE PROTEINE CLONATE
In Figura 2 è riportata la sovraespressione delle proteine espresse dai ceppi E. coli DH10B trasformati con i diversi plasmidi, analizzata mediante elettroforesi. I pesi molecolari dei marcatori (M) corsi nel primo pozzetto di ciascun gel sono indicati sulla sinistra in kDa.
Figura 2Δ riguarda estrazioni fatte dopo 2 e 4 ore di crescita esponenziale ed in fase stazionaria (on) e le proteine separate per elettroforesi su gel di poliacrilammide al 10%, SDS 0,1%.
Figura 2B riguarda le estrazioni fatte nella fase stazionaria. Le proteine sono state separate per elettroforesi in gel di poliacrilammide al 15%, SDS 0,1%. Si noti che pGM973 corrisponde al plasmide di controllo, nel quale non è stato clonato alcun gene, se non la resistenza al cloramf enicolo . Per DH10B/pGM986 e 987 sono stati analizzati due cloni indipendenti (cl.l e cl.2).
In Tabella 6 sono riportati i PM attesi per le diverse proteine clonate, tenendo conto della fusione che si è venuta a creare nel costrutto) .
Tabella 6. Pesi molecolari attesi per le proteine clonate
PROTEINA PM (kDa) ESPRESSA DAI PLASMIDI
CLONATA
Cat 25,00 pGM973 , pGM974, pGM975, pGM976, pGM986 , pGM987
lacZ -UdP 28,40 pGM975 , pGM976, pGM986, pGM987 Udp 27,16
lacZ-PNP 26,80 pGM974
PNP 25,95 pGM976 , pGM987
lacZ -TP 47,97 pGM977
TP 47,19 pGM986 , pGM987
Sono state saggiate sia condizioni di crescita esponenziale (2 e 4 ore dall'inoculo) sia la fase stazionaria di crescita (over night = on) per confrontare la quantità di proteine espresse. La quantità maggiore di proteina corrisponde alla fase stazionaria.
In conclusione, tutti i ceppi sovraesprimono la proteina o le proteine ricombinanti clonate.
Esempio 5: MISURA DELL'ATTIVITÀ' ENZIMATICA
Preparazione dell'estratto proteico:
Colture cresciute per una notte in 5 mi di brodo LD, addizionato con l'antibiotico opportuno, sono state centrifugate e risospese in 500 μΐ di tampone fosfato 0,1 M, EDTA ImM pH 7,5 raffreddato in ghiaccio, e sonicate per 25 sec x 2 volte a intervalli di 30 sec, centrifugate e il sovranatante conservato a -20°C. La quantità di proteine presente nell'estratto è stata valutata con il metodo Bradford (Bradford, M.M. 1976. Anal. Biochem.l2\ 248-54).
Misura dell 'attività purina fosforiiasica:
L'attività è stata saggiata allo spettrofotometro, misurando la diminuzione di assorbanza per fosforolisi del substrato inosina in ipoxantina. In 1 mi di tampone fosfato contenente 4 mM dì inosina è stata aggiunta una quantità di estratto tale da poter seguire la diminuzione dell' assorbanza (OD 251) nel tempo allo spettrofotometro. Le unità di enzima, espresse come pmol ipoxantina/min/mg proteine, sono state calcolate in base alla formula:
(Vtot x AA/min)/(1,50 x Vs)
dove: Vtot = volume totale della reazione; ΔΑ/min = variazione media dell'assorbanza ; 1,50 = coefficiente di estinzione dell 'inosina ; Vs = volume di estratto utilizzato.
Misura dell'attività pirimidina fosforiiasica:
L'attività è stata saggiata allo spettrofotometro, misurando la diminuzione di assorbanza per fosforolisi del substrato uridina in uracile. In 1 mi di tampone fosfato contenente 20 mM di uridina è stata aggiunta una quantità di estratto tale da poter seguire la diminuzione dell 'assorbanza (OD 282) nel tempo allo spettrofotometro. Le unità di enzima, espresse come micromol uracile/min/mg proteine, sono state calcolate in base alla formula :
(Vtot x ΔΑ/min)/(1,37 x Vs)
dove: Vtot = volume totale della reazione; ΔΑ/mìn = variazione media dell'assorbanza; 1,37 = coefficiente di estinzione dell 'uridina; Vs = volume di estratto utilizzato.
Attività timidina fosforilasica :
Per la determinazione della velocità di fosforolisi dei nucleosidi pirimidinici è stato ottimizzato un saggio riportato in letteratura (Yamada, E.W., Uridine Phosphorylase from Rat Liver, Methods in enzymology, 1978, 51, 423-431) che sfrutta la diversa assorbanza a 297 nm del nucleoside e della base libera a pH alcalino. Infatti in queste condizioni, viene rilevata soltanto la base libera e non il corrispondente nucleoside, permettendo così di quantificare le pinoli di base azotata liberata in seguito alla reazione di fosforolisi senza interferenze dovute al nucleoside di partenza. La reazione di fosforolisi è stata allestita in 1 mi di tampone fosfato pH 7,4, contenente timidina 5mM e diverse quantità di estratto proteico. Dopo 5 min a T ambiente, la reazione è fermata con l'aggiunta di 70 pi di NaOH 10 M. I campioni vengono quindi letti allo spettrofotometro a 297 nm. Le unità enzimatiche espresse come pmol timina/min/mg proteine sono state ottenute in base alla formula:
(Abs x 1000 x mi volume reazione)/ε (M-lcm-1) x min x mi enzima
dove Abs = valore dell 'assorbanza; ε =
-1 coefficiente di estinzione della timina = 3946 M SEQUENCE LISTING
<110> Frau Pharma srl.
<120> Recombinant bacterial strains for the production of naturai nucleosides and modified analogues
<130> B159265
<160> 11
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 3383
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pGMF970
<4 00> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420
acttactctt tatcgcccag cagaacggat tccagtgcga ttttgatcat gtcgttgaag 480
gtagtctgac gctcagcggc agtggtctgc tcgtgagtgc ggatgtggtc agatacggtg 540
cagatggtca gggctttcgc gccaaattct gcagcgacgc cgtagatacc agccgcttcc 600
atttccacgc cgagaatgcc gtatttttcc atcacgtcga acatttcgcc gtccggagag 660
tagaacaggt cagcggagaa caggttaccc acgcgagcat caatacccag tgctttagct 720
gcatctactg cgttacgcac catgtcgaag tcagcgatag cggcaaagtc atggtcttta 780
aaacggatgc ggttaacttt ggaatcggtg caggcaccca taccgataac gacgtcgcgc 840
agttttacgt gcggcagaac tgcgccacag gaacccacgc ggataatttt cttcacgccg 900
aaatcggtga tcagttcttt ggtgtagatg gagcaggacg ggatacccat accgtgaccc 960
attacggaaa ttttgcggcc tttgtaagta ccggtgaagc ccagcatacc gcgaacgttg 1020
ttcacttcac gggcatcttc aaggaaagtt tcagcaatat acttcgcacg cagcgggtcg 1080
cctggcatca aaactacgtc agcgaaatcg cccatttctg cattaatgtg tggggtagcc 1140
atggaagaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 1200
aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 1260
gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 1320
gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 1380
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 1440
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 1500
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 1560
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 1620
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 1680
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 1740
aagcgtggcg ctttctcaaa gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 1800
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 1860
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 1920
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 1980
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 2040
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 2100
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 2160
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 2220
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 2280
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 2340
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 2400
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 2460
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 2520
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 2580
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 2640
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 2700
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 2760
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 2820
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 2880
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 2940
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 3000
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 3060
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 3120
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 3180
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 3240
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 3300
aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatgatg acattaacct ataaaaatag 3360
gcgtatcacg aggccctttc gtc
3383
<210> 2
<211> 3444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 5280
gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 5340
gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 5400
tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta tctttctgcc attcatccgc 5460
ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa 5520
aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg taattcatta agcattctgc 5580
cgacatggaa gccatcacag acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct 5640
tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatag tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat 5700
tagccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca 5760
tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac gccacatctt 5820
gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa 5880
acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg aacactatcc catatcacca 5940
gctcaccgtc tttcattgcc atacgaaatt ccgtatgagc
attcatcagg cgggcaagaa 6000
tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt
tacggtcttt aaaaaggccg 6060
taatatccag atgaacggtc tggttatagg tacattgagc
aactgactga aatgcctcaa 6120
aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt
atatccagtg atttttttct 6180
ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc tcgataactc
aaaaaatacg cccggtagtg 6240
atcttatttc attatggtga aagttggaac ctcttacgtg
ccgatcaacg tctcattttc 6300
gccaaaactt ggccctagag cggatacata tttgaatgta tttca 6345

Claims (21)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un vettore ricombinante di espressione plasmidico, basato sul plasmide pUC18, comprendente : a) almeno una sequenza genica di un batterio mesofilo codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di timidina fosforilasi; e b) almeno una sequenza genica che codifica per la resistenza ad almeno un antibiotico.
  2. 2. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1, comprendente almeno una ulteriore sequenza genica di un batterio mesofilo codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di pirimidina fosforilasi.
  3. 3. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente almeno una ulteriore sequenza genica di un batterio mesofilo codificante per un polipeptide avente attività enzimatica di purina fosforilasi.
  4. 4. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1, 2 o 3, caratterizzato dal fatto che 1'almeno una sequenza codificante per la resistenza ad almeno un antibiotico è una sequenza codificante per la resistenza all ’ampicillina oppure per la resistenza al d oramienicolo, preferibilmente cloramfenicolo .
  5. 5. Vettore plasmidico secondo una o più delle rivendicazioni antecedenti, caratterizzato dal fatto che il batterio mesofrio è E. coli.
  6. 6. Vettore plasmidico secondo una o più delle rivendicazioni antecedenti, caratterizzato dal fatto che la sequenza codificante un polipeptide avente attività enzimatica di timidina fosforilasi è la sequenza deoA.
  7. 7. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che la sequenza deoA è la Sequenza (EMBL) CG00324, come contenuta in SEQ ID No. 8-11.
  8. 8. Vettore plasmidico secondo una o più delle rivendicazioni 2-5, caratterizzato dal fatto che la sequenza codificante un polipeptide avente attività enzimatica di pirimidina fosforilasi è la sequenza udp .
  9. 9 . Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che la sequenza udp è la Sequenza (EMBL) CG01747, come contenuta in SEQ ID No. 6,7 e 9-11.
  10. 10. Vettore plasmidico secondo una o più delle rivendicazioni 3-6, caratterizzato dal fatto che la sequenza codificante un polipeptide avente attività enzimatica di purina fosforilasi è la sequenza deoD.
  11. 11. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che la sequenza deoD è la Sequenza (EMBL) CG00327, come contenuta in SEQ ID No. 5 e 11.
  12. 12 . Vettore plasmidico secondo una o più delle rivendicazioni antecedenti, caratterizzato dal fatto che la sequenza codificante per la resistenza al d oramienicolo è il gene cat da pKF3 (GenBank D14641) .
  13. 13. Vettore plasmidico scelto tra: pGM977 (SEQ ID No.8), pGM986amp (SEQ ID No.9) pGM986 (SEQ ID No.10), pGM987 (SEQ ID No.ll).
  14. 14. Vettore plasmidico secondo rivendicazione 13 scelto da pGM987 (SEQ ID No.11).
  15. 15. Cellule ospiti procariotiche, caratterizzate dal fatto di contenere almeno un vettore plasmidico secondo le rivendicazioni 1 a 14 .
  16. 16. Cellule ospiti secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che esse sono cellule di Escherichia coli.
  17. 17. Cellule ospite secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che sono cellule del ceppo K12, preferibilmente DH10B.
  18. 18. Uso di cellule ospiti secondo le rivendicazioni da 15-17, o del corrispondente greggio o estratti purificati, separatamente o in combinazione, per la produzione di polipeptidi o loro miscele aventi attività enzimatica (TP) e/o (UdP TP) e/o (PNP TP) e/o (UdP PNP TP).
  19. 19. Uso secondo la rivendicazione 18, in cui la crescita delle cellule rivolta alla produzione dei polipeptidi avviene senza aggiunta di induttore ai terreni di coltura, in particilare senza aggiunta di IPTG o lattosio.
  20. 20. Uso di cellule ospiti secondo le rivendicazioni 15-17, o del corrispondente greggio o estratti purificati, separatamente o in combinazione, come catalizzatori in reazioni di transglicosilazione tra un nucleoside donatore e una base accettore.
  21. 21. Uso di cellule ospiti secondo le rivendicazioni 15-17, separatamente o in combinazione, o del grezzo corrispondente o estratti purificati, nella produzione di nucleosidi e loro analoghi modificati.
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