JP7340222B2 - 腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性ウイルスを含む薬物、医薬品の製造における使用、および腫瘍溶解性ウイルスの作製方法 - Google Patents
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Description
(1)nsIL-12融合遺伝子のクローニング:培養したRPMI-8866細胞の全RNAを抽出してcDNAに逆転写し、改変型p35サブユニット遺伝子(ns-p35、配列番号3にヌクレオチド配列を示す)および改変型p40サブユニット遺伝子(プライマー:p40-F:CCTACGTAATGATATGGGAACTGAAGAAAG、p40-R:GCCCACCCCAGGTACCCCTACTCCAGGAACACTGCAGGGCACAGATGC、ns-p40、配列番号4にヌクレオチド配列を示す)をクロー二ングするために、SnaBI切断部位とエラスチン配列(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)を含むプライマー(p35-F: GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTG, p35-R: GCTACGTATTAGGAAGCATTCAGATA)を用いてPCRを行い、ns-p40サブユニット遺伝子断片およびns-p35サブユニット遺伝子断片をPCRで連結してnsIL-12全遺伝子断片を形成し、nsIL-12全遺伝子断片をクローニングベクターTベクターに連結し、これをT-nsIL-12とする。T-nsIL-12プラスミドをSnaBIで消化してnsIL-12遺伝子断片(配列番号1)を得る。
(2)pSSE3gp19Kシャトルベクターの構築:pSS-CHLのCHL上流のマルチクローニングサイト(図1参照)をSal1およびEcoRVで消化し、左腕として使用するE3 6.7K遺伝子終止コドンの上流1091bp配列を両端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、pSS-CHLに連結してpSSE3gp19K-Lを形成する。pSSE3gp19K-LをSnaB1とXho1で消化し、E3gp19K遺伝子終止コドンの下流1146bp配列をその2つの末端にSnaB1とXho1切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をpSSE3gp19Kシャトルベクターを形成するために連結する。
(3)pSSE3gp19K-nsIL-12ベクターの構築:pSSE3gp19KベクターをEcoRVで消化し、その末端リン酸基をホスファターゼで除去した後、nsIL-12遺伝子断片と連結してpSSE3gp19K-nsIL-12ベクターを作製し、その配列を配列解析によって決定する。
(4)Ad-TD-nsIL-12-CHLの構築:pSSE3gp19K-nsIL-12をPme1で線状化し、nsIL-12を含む大きな断片を回収し、BJ5183コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってpAd-TDベクター(特許文献ZL200910066130.4参照)との相同組換えを行い、陽性クローンpAd-TD-nsIL-12-CHLを選別する。
(5)pAd-TD-nsIL-12の構築:ポジティブベクターpAd-TD-nsIL-12-CHLをSwa1で消化してCHL遺伝子を欠失させ、Swa1及びT4リガーゼを失活させた後、それを用いてTOP10コンピテント細胞を形質転換してpAd-TD-nsIL-12ベクターを得る。及び
(6)Ad-TD-nsIL-12ウイルスベクターの構築:組換えpAd-TD-nsIL-12ベクターをPac1で線状化し、293細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターAd-TD-nsIL-12を作製する。
p40-リンカー-p35またはp35―リンカー-p40
非分泌性IL-12は分泌シグナルペプチドを含まない。好ましくは、上記構造中のp40もp35もシグナルペプチドを含まない。
「リンカー」については、当業者は、従来技術(例えば、Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65 (10): 1357-1369およびFront Immunol. 2015 Apr 7; 6: 136)に従って、種々の既知のリンカーに由来する適切なリンカーを設計または選択することができる。好ましくは、リンカーは(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)の配列を有する。当業者であれば、本開示に基づいて、当業者は様々な他の配列(J Biomed Nanotechnol. 2015 Aug; 11 (8): 1418-30)を有するリンカーを設計することができる。
本発明に記載される置換において、アミノ酸残基の置換は、好ましくは以下の各群の中で行われる:
1:ロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン
2:アスパラギン酸、グルタミン酸;
3:アスパラギン、グルタミン;
4:リジン、アルギニン;
5:プロリン、ヒドロキシプロリン;
6:セリン、スレオニン; そして
7:フェニルアラニン、チロシン。
a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
b)配列番号1のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能で、非分泌性IL-12活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;または
c)上記a)またはb)の相補的配列。
a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
b)配列番号1のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能で、非分泌性IL-12活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;または
c)上記a)またはb)の相補的配列。
1.既存のIL-12と比較して、本発明の改変型IL-12は主に局所腫瘍組織に分布しており、腫瘍細胞に対する特異性を高め、IL-12の全身性副作用を減少させる。
2.本発明の方法は、IL-12タンパク質を安定で持続的かつ低レベルで発現させることができる改変型IL-12を発現させるために腫瘍標的化ウイルスベクターを利用し、短い半減期および高レベルの発現によって引き起こされる毒性および副作用のような既存のIL-12タンパク質の欠点を克服する。
3.既存のIL-12と比較して、本発明の改変型IL-12は、腹腔内に播種した腫瘍およびin situの腫瘍に対してより強い腫瘍増殖阻害効果を有し、重大な毒性はない。
本発明を実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似のまたは同じ結果を得るために、本発明の教示に照らしてこれらの実施形態を改変することができ、これらの改変はすべて本発明の範囲内にある。
(1)nsIL-12融合遺伝子のクローニング:培養したRPMI-8866細胞の全RNAを抽出し、cDNAに逆転写し、改変型p35サブユニット遺伝子(ns-p35、配列番号3にヌクレオチド配列を示す)および改変型p40サブユニット遺伝子(プライマー:p40-F:CCTACGTAATGATATGGGAACTGAAGAAAG、p40-R:GCCCACCCCAGGTACCCCTACTCCAGGAACACTGCAGGGCACAGATGC、ns-p40、配列番号5にヌクレオチド配列を示す)をクロー二ングするために、SnaBI切断部位とエラスチン配列(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)を含むプライマー(p35-F:GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTG、p35-R:GCTACGTATTAGGAAGCATTCAGATA)を用いてPCRを行い、ns-p40サブユニット遺伝子断片およびns-p35サブユニット遺伝子断片をPCRで連結してnsIL-12全遺伝子断片を形成し、nsIL-12全遺伝子断片をクローニングベクターTベクターに連結し、これをT-nsIL-12とした。T-nsIL-12プラスミドをSnaBIで消化して、nsIL-12遺伝子断片(配列番号1)を得て使用のためにスタンバイした。
(2)pSSE3gp19Kシャトルベクターの構築:pSS-CHLのCHL上流のマルチクローニングサイト(図1参照)をSal1およびEcoRVで消化し、左腕として使用するE3 6.7K遺伝子終止コドンの上流1091bp配列を両端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、pSS-CHLに連結してpSSE3gp19K-Lを形成した。pSSE3gp19K-LをSnaB1とXho1で消化し、E3gp19K遺伝子終止コドンの下流1146bp配列をその2つの末端にSnaB1とXho1切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をpSSE3gp19Kシャトルベクターを形成するために連結した。
(3)pSSE3gp19K-nsIL-12ベクターの構築:pSSE3gp19KベクターをEcoRVで消化し、その末端リン酸基をホスファターゼで除去した後、nsIL-12遺伝子断片と連結してpSSE3gp19K-nsIL-12ベクターを作製し、その配列を配列解析によって決定した。
(4)Ad-TD-nsIL-12-CHLの構築:pSSE3gp19K-nsIL-12をPme1で線状化し、nsIL-12を含む大きな断片を回収し、BJ5183コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってpAd-TDベクター(特許文献ZL200910066130.4参照)との相同組換えを行い、陽性クローンpAd-TD-nsIL-12-CHLを選別した。
(5)pAd-TD-nsIL-12の構築:ポジティブベクターpAd-TD-nsIL-12-CHLをSwa1で消化してCHL遺伝子を欠失させ、Swa1及びT4リガーゼを失活させた後、それを用いてTOP10コンピテント細胞を形質転換してpAd-TD-nsIL-12ベクターを得た。そして
(6)Ad-TD-nsIL-12ウイルスベクターの構築:組換えpAd-TD-nsIL-12ベクターをPac1で線状化し、293細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターAd-TD-nsIL-12を作製した。
3.組換えAd-TD-nsIL-12ベクターをPac1で線状化し、293細胞に導入して、Ad-TD-nsIL12としても知られている組換えアデノウイルスベクターAd-TD-nsIL-12(ヒトアデノウイルス血清型5変異体、China Center for Type Culture Collection、武漢市、中国、Wuhan University、受入番号CCTCC 番号:V201520、寄託日:2015年5月21日)を作製した。
1.シャトルベクターpVV-TK-nsIL-12の構築
実施例1に記載したように、Sal1およびNheI切断部位を含むプライマーでnsIL-12遺伝子をクローニングし、対応する酵素で消化して利用するためにスタンバイし、pVV-TKプラスミドをSal1およびNheIで消化(図2参照、構築は本発明者らによって公開された方法によって行われた、Mol Ther Methods Clin Dev. 2015 Sep 16; 2:15035. doi: 10.1038/mtm. 2015.35. eCollection 2015)し、nsIL-12遺伝子はpVV-TK-nsIL-12ベクターを構築するためにpVV-TKと連結した(図3)。
CV1細胞を培養し、次いでCV1を96ウェルプレートに接種した。細胞が90%コンフルエントになったら、CRISP-cas9およびgRNAプラスミドでトランスフェクションし、24時間後にワクシニアウイルスVVL15に感染させ、2時間後にpVV-TKでトランスフェクトした。24時間後、それらを蛍光顕微鏡下で観察し、VV-TK-nsIL-12ウイルスベクター(図4)がうまく組換えられたことを示す赤色蛍光細胞クローンを選別した。
採取した赤色蛍光クローンを1度凍結および解凍した後、再びCV1細胞に感染させ、赤色蛍光クローンを採取し、このスクリーニングプロセスを5回繰り返し、CV1細胞を感染させてウイルスを産生した。そのゲノムを配列決定のために抽出した。
1.nsIL-12を含むシャトルベクターpSSE3-18.5K-nsIL-12の構築
(1)pSSE3-18.5Kの構築:pSS-CHL(pBR322プラスミドに基づいて構築、図1参照)のマルチクローニングサイトをSnaB1およびXho1で消化し、左腕として使用するE3 16.1K遺伝子終止コドンの上流535bp配列を両端にSnaB1およびXho1切断部位を含むプライマーを用いてクロー二ングし、pSS-CHLに連結してpSSE3-18.5K-Lを形成した。pSSE3-18.5K-LをSal1およびEcoRVで消化し、2つの末端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてE3-18.5K遺伝子終止コドンの下流584bp配列をその2つの末端にSal1およびEcoRV切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をpSSE3-18.5Kシャトルベクターを形成するために連結した。
(2)pSSE3-18.5K-nsIL-12ベクターの構築:pSSE3-18.5KベクターをSnaB1で消化し、ホスファターゼを用いて末端リン酸基を除去した後、nsIL-12遺伝子断片と連結してpSSE3-18.5K-NsIL-12ベクターを作製し、その配列解析を行った。
(3)pSS3gp19K-nsIL-12をPme1で線状化し、nsIL-12を含む大きな断片を回収し、BJ5183コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってAd11-Tel-GFP(特許文献ZL20110143385.3の構築方法を参照)との相同組換えを行い、陽性クローンAd11-Tel-nsIL-12(図4参照)を選別した。
培養ヒト膵癌Suit2およびCapan1、頭頸部腫瘍EC9706、肺癌A549およびH1299、食道癌EC9706およびZZB、卵巣癌SKOV3、結腸直腸癌SW620およびHCT116ならびに胃癌AGS細胞をトリプシンで消化し、計数し、6ウェルプレートに2×105細胞/ウェルで播種し、Ad-TD-nsIL-12およびVV-TK-nsIL-12で別々に感染させ、上清および細胞混合物をそれぞれ回収し、それらのIL-12発現レベルをELISAによって検出した。図5および図6にその結果を示す。
培養膵癌SUIT2およびCapan1、頭頸部腫瘍EC9706、肺癌A549およびH1299、食道癌EC9706およびZZB、卵巣癌SKOV3、結腸直腸癌SW620およびHCT116ならびに胃癌AGS細胞をトリプシンで消化し、2%FBSを含むDMEMで細胞懸濁液にし、B1~G1が無細胞培地であり、他の3つがPBSである96ウェルプレートの中央に接種した。
5~6週齢シリアンハムスターの腹腔内に、1×107SHPC6細胞(セントルイス大学のWSM Wold提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞)を接種し、そして動物は4日後にグループごとに9匹ずつ4つのグループに分けた。動物は、500μlのPBS、1×109PFUのAd-TD-LUC(LUCは、実施例1でのAd-TD-nsIL-12の構築方法に従って構成されるpGL3ベクタールシフェラーゼに由来する)、Ad-TD-IL-12(全長ヒトIL-12、実施例1に記載のAd-TD-nsIL-12の構築方法に従って構築)、またはAd-TD-nsIL-12を別々に1回腹腔内注射した。注射後1日目、3日目および5日目に、血清試料を採取し、末梢血中のIL-12発現の変化を分析し、その結果を図9に示した。
5~6週齢の各シリアンハムスターの背中の右上に、1×107HPD1-NR(セントルイス大学のWSM Wold提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞)を接種した。各グループの動物の平均腫瘍体積は約330mm3であった。PBS、Ad-TD-LUC、Ad-TD-IL-12およびAd-TD-nsIL-12を用いて、それぞれの腫瘍内注射を行った。ウイルスベクターを1×109PFUの用量で1日1回、合計6回注射し、腫瘍増殖曲線および腫瘍フリーレートを観察した。結果を図10および図11に示した。
10%抱水クロラールを用いて4~5週齢のシリアンハムスターの麻酔を行い、シリアンハムスターの左腹部を開き、脾臓に接続する膵臓を見つけ、3×106個のHapT1細胞(セントルイス大学のWSM Wold提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞)を膵臓実質に接種した。6日後、腫瘍を有する動物をグループごとに7匹ずつ4グループに分けた。1日おきに合計6回、500μlのPBS、1×109PFUのAd-TD-LUC、Ad-TD-IL-12またはAd-TD-nsIL-12をそれぞれ腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図12に示した。
4~5週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種した。4日後、動物はグループごとに10匹ずつ4つのグループに分けた。治療のために1日おきに計3回、500μlのPBS、1×109PFUのAd-TD-LUC、Ad-TD-IL-12またはAd-TD-nsIL-12を別々に腹腔内注射した。 動物の生存時間を観察し、その結果を図13に示した。
5~6週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種し、4日後、動物はグループごとに9匹ずつ分けた。500μlのPBS、1×109PFUのAd-TD-LUC、Ad-TD-nsIL-12または5×108PFUのAd-TD-IL-12の腹腔内注射を1回行い、注射後1日目、3日目および5日目に、血清試料を採取した。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアルカリホスファターゼ(ALP)を検出し、その結果を図14に示す。
5~6週齢の各シリアンハムスターの背部の右上部に1×107のHCPC1細胞(シリアンハムスター頭頸部腫瘍細胞)を接種した。各グループの平均腫瘍体積が約330mm3であるとき、PBS、Ad-TD-LUCおよびAd-TD-nsIL-12をそれぞれ腫瘍内注射した。ウイルスベクターを5×107PFUの用量で1日1回、合計6回注射した。腫瘍増殖曲線および腫瘍フリーレートを観察し、その結果を図15に示した。
4~5週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種した。4日後、動物はグループごとに10匹ずつ4つのグループに分けた。治療のために1日おきに計3回、500μlのPBS、4×107PFUのVV-TK-RFP(赤色蛍光タンパク質を挿入。VV-TK-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)、VV-TK-IL-12(全長ヒトIL-12遺伝子を挿入。VV-TK-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)またはVV-TK-nsIL-12を腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図16に示す。
4~5週齢の各シリアンハムスターの腹腔に1×107個のSHPC6細胞を接種した。4日後、動物はグループごとに10匹ずつ4つのグループに分けた。治療のために1日おきに計3回、500μlのPBS、1×109PFUのAd11-Tel-GFP(緑色蛍光タンパク質を挿入。Ad11-Tel-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)、Ad11-Tel-IL-12(全長ヒトIL-12遺伝子を挿入。Ad11-Tel-nsIL-12の構築方法に従って構築される。)またはAd11-Tel-nsIL-12を腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図17に示す。
Claims (12)
- p40-リンカー-p35の構造を有し、分泌シグナルペプチドを含まず、発現したときに細胞から分泌されない非分泌性IL-12をコードするヌクレオチド配列を含み、前記非分泌性IL-12を発現することができる腫瘍溶解性ウイルス。
- 腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス血清型5ベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルス血清型11ベクター、または受入番号CCTCC 番号:V201520のウイルスベクターである請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記p35は配列番号5の配列を含み、前記p40は配列番号6の配列を含む、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記p35および前記p40は天然のヒトp35およびヒトp40またはそのバリアントであり、前記バリアントは、その親または天然のアミノ酸配列に対し96%以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、その親または天然のアミノ酸配列の活性を有する、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記バリアントは、その天然のアミノ酸配列または親配列に基づいて1から9個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列を含み、前記置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持する、請求項4に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記リンカーは、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 配列番号2のアミノ酸配列またはそのバリアントを含み、前記バリアントは、前記配列番号2のアミノ酸配列に対し96%以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、その親または天然のアミノ酸配列の活性を有する、請求項1乃至請求項4の何れか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記バリアントは、前記配列番号2に基づいて1から9個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列を含み、前記置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持する、請求項7に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記非分泌性IL-12をコードするヌクレオチド配列は以下の配列を含む請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス:
a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
b)上記a)の相補的配列。 - 請求項1乃至請求項9の何れか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む薬物。
- 請求項1乃至請求項9の何れか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの、対象におけるIL-12に関連する疾患の治療のための医薬品の製造における使用。
- 非分泌性IL-12を発現することができる腫瘍溶解性ウイルスを得るために、前記ヌクレオチド配列を腫瘍溶解性ウイルスに挿入することを含む、請求項1乃至請求項9の何れか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの作製方法。
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