KR20040060834A

KR20040060834A - Il-18 단백질 또는 il-12 단백질을 발현하는 재조합벡터를 동시에 포함하는 항암조성물

Info

Publication number: KR20040060834A
Application number: KR1020030101030A
Authority: KR
Inventors: 임동수; 황경선; 조원경; 유진상; 성영림; 이연희; 김민지; 서상희; 박시영; 박연성
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스; 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-12-30
Filing date: 2003-12-30
Publication date: 2004-07-06

Abstract

본 발명은 IL-18과 IL-12를 발현하는 재조합 벡터 및 그를 이용한 항암 유전자 치료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 세포내 면역반응을 더 효과적으로 유도하여 다양한 종류의 암세포를 효과적으로 치료할 수 있도록 IL-18 변이체를 발현하는 재조합 바이러스와 IL-12 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 병합하여 투여하는 방법 및 이를 구성하는 재조합 바이러스를 제공한다.

Description

IL-18 단백질 또는 IL-12 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 동시에 포함하는 항암조성물 {COMPOSITION FOR TREATING CANCER COMPRISING VECTOR EXPRESSING INTERLEUKIN-18 OR INTERLEUKIN-12 GENE}

본 발명은 재조합 바이러스의 병합요법을 이용한 유전자치료 및 이에 유용한 조성물에 관한 것이다.

유전자 요법은 결손 유전자의 교정을 통해서 유전질환 및 암과 같은 난치성 질환의 치료를 위한 새로운 접근 방법이다. 지난 십여 년간 치료유전자를 세포나 조직으로 전달하기 위한 다양한 방법들이 발전이 되어 왔으며 크게는 바이러스성 벡터 시스템과 비바이러스성 벡터 시스템으로 나뉘어진다. 비바이러스성 시스템에는 Naked 플라스미드 DNA, 양이온성 리피드-DNA 복합체, 양이온성 폴리머-DNA 복합체 등이 있다. 비바이러스성 시스템은 도입유전자의 크기에 제한이 없으며 면역반응이 낮으며 생산이 용이하다는 장점이 있으나 유전자 전달효율은 아주 낮다. 반면, 바이러스성 벡터 시스템에 이용되는 바이러스는 동물조직의 여러 가지 세포 타입에 잘 감염이 일어나므로 다양한 바이러스 벡터가 유전자 치료용 벡터로 개발되었다. 예를 들면 아데노바이러스, 아데노부속 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 등이 있는데, 초기에 이들 바이러스는 야생형 바이러스와는 달리 유전자를 운반하는 기능만을 할 뿐 표적 세포에서 복제 및 증식이 불가능하도록 디자인되었다. 따라서 이들은 재조합 바이러스의 증식을 위해 특별히 고안된 포장 세포주에서만 증식이 가능하다.

전통적으로 종양치료에 사용되는 아데노바이러스는 종양세포에 외부유전자를 전달하는 벡터로 사용되어져 왔다. 먼저 일세대 벡터는 복제불능을 유도하기 위해 E1구역이 결실되어 있으며 이 부위에 외부 유전자의 삽입이 가능하다. 또한 바이러스에 의한 면역회피구역인 E3 구역이 결실될 경우 최고 8kb 정도의 외부 유전자를 도입할 수 있다. 전형적으로 상시 고발현을 유도하는 사이토메갈로바이러스의 최 초기 프로모터가 외부유전자의 발현에 사용되며 이 뒤에는 일반적인 폴리에이 신호가 이어진다.

종양치료에 일반적으로 쓰이는 치료 유전자로는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)의 티미딘 키내이즈 (TK)와 같은 전구약물 활성화 효소, 종양세포의 증식을 차단할 수 있는 야생형 p53과 같은 종양억제 단백질, 캐스패이즈와 같은 아포토시스 유도 단백질, 엔도스타틴과 같은 신생혈관 형성 억제 단백질의 유전자 등이 사용된다.

면역 유전자 치료요법은 종양세포에 대한 숙주세포의 자기방어 메커니즘을이용하므로 가장 이상적인 치료법이라고 할 수 있다. 따라서 암의 유전자 치료 임상 프로토콜의 60% 이상을 차지하고 있다. 치료유전자로서 면역반응 촉진 인자인 사이토카인을 사용하는 경우, 일부분의 종양세포에만 치료 유전자가 도입되더라도 종양 특이적인 신체 면역반응이 유도되어 치료유전자가 도입되지 않은 그 주변의 다른 종양세포까지 제거되는 효과를 나타내므로 좀더 효과적인 유전자 치료가 가능하다. 종양치료를 위한 성공적인 유전자요법에 대한 가장 큰 관건은 치료유전자의 효능과 고효율의 유전자 전달이 가능한가에 달려있다. 세포성 면역을 유도하는 생물학적인 반응 조절인자를 사용하는 면역-유전자 요법은 소량의 유전자 발현으로도 반응을 충분히 일으킬 수 있으므로 가장 이상적인 종양치료법이라고 할 수 있다. 한 예로, 인터루킨-12 (IL-12)를 이용하여 종양을 억제할 수 있다는 것이 보고되었다 (Tahara H et al. Cancer Res(1994), 54; 182-9, Tahara H et al. J Immunol (1995) 154; 6466-74). 또한 Mackiewicz 등은 IL-6 + sIL-6R(bicistronic reroviral vector를 함께 사용한 예를 보고하였다. (Mackiewicz A et al. Adv Exp Med Bio 451, 557-60, 1998.) 그러나 면역조절인자를 단독으로 사용하는 경우 종양세포를 완전히 제거할 만한 강력한 항암효과를 나타내지는 못하는 것으로 보고가 되었다. 따라서 종양세포에 사이토카인, 케모카인, 코스티뮬레이토리 팩터 (costimulatory factor) 등에서 선택된 2가지 이상 유전자를 함께 발현시켜 항암 면역활성을 증진하고자 하는 시도가 이루어지고 있으며, IL-2와 IL-12를 함께 사용한 경우가 보고되었다 (Tanaka M et al., Cancer Gene Ther (2000) 7;1481-89).

인터루킨-18 (IL-18)은 면역반응 촉진인자로, 인터페론 감마 활성인자(Interferon gamma inducing factor: IGIF)로도 알려져 있다. IL-18은 T 세포나 NK 세포의 세포독성을 증가시키고, 활성화된 T 세포를 증식시키며, Th1 세포를 자극하여 IL-2와 인터페론 감마 (IFN-γ)를 생산시킨다 (Dinarello C.A. Method 19: 121-132, 1999). 또한 B 세포로부터 IFN-γ를 유도하여 IgE 합성을 억제하고, 과식구 거식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF)의 생성을 증가시킬 뿐만 아니라 IL-2의 생성을 촉진하며, 면역저해 사이토카인인 IL-10의 생성을 억제한다.

IL-12와 IL-18은 IFN-γ를 생성하는데 신호전달체계를 공유하여 상승작용을 한다는 것이 보고되었다 (Eur. J. Immunol. 26: 1647-1651).

본 발명은 IL-18과 IL-12의 유전자를 각각 또는 동시에 발현하는 재조합 벡터로 이루어진 항암 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 IL-12 유전자를 발현하는 재조합 바이러스와 IL-18 유전자를 발현하는 재조합 바이러스로 이루어지는 항암 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 IL-12 유전자와 IL-18 유전자를 동시에 발현하도록 고안된 재조합 바이러스로 이루어진 항암 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기한 재조합 바이러스로 이루어진 항암조성물을 이용하여 종양을 치료하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 재조합 바이러스 제작에 사용된 인터루킨 유전자 모식도이다.

도 2a는 본 발명의 재조합 바이러스에 의한 IL-18 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블롯 사진이다.

도 2b는 본 발명의 재조합 바이러스에 의한 IL-12 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블롯 사진이다.

도 3a은 본 발명의 재조합 바이러스로부터 발현되는 IL-18 단백질에 의한 IFN-γ 생성율을 측정한 것이다.

도 3b은 본 발명의 재조합 바이러스로부터 발현되는 IL-12 단백질에 의한 IFN-γ 생성율을 측정한 것이다.

도 4a 및 도 4b는 대장암 세포주(CT-26)에 의해 유도된 생쥐의 종양결절에 Ad.GMmIL-18과 Ad.IL-12 병합처리했을 때 항암효능을 나타내는 그래프이다.

도 5는 재조합 바이러스 Ad. IL-12 또는 Ad.GMmIL-18을 단독 혹은 병합 투여 후 종양결절이 완전히 제거된 생쥐를 대상으로 세포독성 임파구활성을 측정한 그래프이다.

도 6은 재조합 바이러스 Ad. IL-12 또는 Ad.GMmIL-18을 단독 혹은 병합 투여 후 종양결절이 완전히 제거된 생쥐를 대상으로 자연살상 세포 활성을 측정한 그래프이다.

도 7는 생쥐 신장암 종양에 Ad.GMmIL-18 또는 Ad.IL-12을 단독 혹은 병합투여한 후 종양세포의 증식억제에 따른 생쥐의 생존 곡선을 나타낸 표이다.

도 8는 생쥐 신장암 세포주를 이용한 전이암 모델을 이용하여 Ad.GMmIL-18과 Ad.IL-12 병합요법을 행하였을 때 전이암 억제여부를 측정한 사진이다.

본 발명은 IL-18 유전자와 IL-12 유전자를 각각 또는 동시에 발현하는 재조합 벡터로 이루어지는 항암 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물의 한 예는 IL-18 유전자를 포함하는 재조합 바이러스와 IL-12 유전자를 포함하는 재조합 바이러스로 이루어진다.

본 발명에서 IL-18 유전자는 천연 상태의 IL-18을 코딩하는 유전자와 IL-18의 활성을 유지하면서 안정성이 향상되도록 변형된 IL-18 변이체를 코딩하는 유전자를 모두 포함한다.

본 발명에서 IL-12 유전자는 천연 상태의 IL-12를 코딩하는 유전자와 IL-12의 활성을 유지하면서 안정성이 향상되도록 변형된 IL-12 변이체를 코딩하는 유전자를 모두 포함한다.

본 발명에서 병합 요법이라 함은 IL-18 혹은 IL-12를 동시에 따로 발현시켜 신체 면역반응을 증진시키는 방법 및 이에 의해 종양세포의 증식을 억제시키는 방법을 의미한다.

본 발명에서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, RNA 또는 DNA 바이러스일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되며, 벡터는 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노부속 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 벡터 등에서 선택될 수 있으며 가장 바람직하게는 아데노바이러스이다.

최근 IL-18 단백질을 생쥐에 직접 투여하였을 때 항암 효과가 있다는 것이 보고되었으며, 이러한 효과는 T 세포에 의한 IFN-γ나 활성화된 NK 세포에 기인한 것이라고 생각되어진다(Micallef et al. Cancer Research 57, 4557-4563, 1997). IL-18은 생물학적으로 불활성 상태인 전구체로 합성된 후 세포 내에 존재하는 IL-1β-전환효소 (ICE, caspase-1)에 의해서 잘려지면 활성형태로 전환된다. 전구체 또는 활성화된 성숙 IL-18은 카스파제-3 (caspase-3, CPP32)에 의해서 분해되어 불활성화된다. 따라서, 카스파제-3에 의해 분해되지 않는 IL-18 변이체를 제조함으로써, 카스파제-3이 존재하거나 활성화될 수 있는 종양세포에서 IL-18 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있으며, 한 예로 IL-18 단백질의 카스파제-3 절단부위가 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 IL-18 단백질을 코딩하는 유전자를 이용할 수 있다. 또한 체내 반감기를 길게 하기 위하여, 종양 주위에 많이 분포하는 인터루킨-18 결합 단백질에 대한 결합 불능 돌연변이주들의 유전자를 이용할 수도 있다. 또한 IL-18과 결합하여 IL-18의 생물학적 기능을 중화시키는 IL-18결합 단백질(IL-18 binding protein)이 IL-18보다 20배정도의 많은 양으로 정상인의 체내에 존재하고 몇몇 암세포에서 항상 발현되고 있는 것으로 보고된 바 (Kim SHet al.Structural requirements of six naturally occurring isoform of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18.Proc Natl Acad Sci USA2000; 97: 1190-119524) 암세포에 주입된 IL-18의 항암효능을 증대시키기 위하여IL-18BP 결합불능 IL-18 변이체에서 선택될 수가 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 IL-18 유전자를 발현하는 재조합 바이러스는 특별히 한정되지 않으며, 바이러스 제조 기술에 따라 제조된, IL-18을 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 모두 포함한다. 또한 IL-18 단백질이 세포외로 발현되도록 함으로써 IL-18 단백질을 발현하지 않는 세포에까지 IL-18에 의한 면역증강효과를 발생시키기 위하여, 분비 서열을 연결하여 세포외 분비량을 늘리도록 할 수 있다. 예를 들어 한국특허출원 2002-77684호에 자세히 기재된, IL-18을 발현시킬 수 있는 재조합 아데노바이러스를 사용할 수 있다.

IL-12 단백질은 p35 와 p40 서브유닛으로 이루어져 있으며 이들이 이형중합체를 이룰 때 활성을 나타낸다. 이 단백질은 T 세포와 자연살상세포를 포함한 면역세포를 활성화시켜 강력한 항암효과를 유도하며 암전이 억제 및 신생혈관 억제와 관련된 종양억제 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 IL-12 유전자를 발현하는 재조합 바이러스는 특별히 한정되지 않으며, 바이러스 제조기술에 따라 제조된, IL-12을 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 모두 포함한다. 예를 들어, 한국특허출원 2002-10013호에 자세히 기재된, (a) IL-12 p35 유전자, IRES(Internal ribosome Entry Site) 및 IL-12 p40 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 (b) 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시킬 수 있는 프로모터 및 (c) 전사종결인자를 포함하는 재조합 바이러스를 발현시킬 수 있는 재조합 아데노바이러스를 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 1종 이상의 허용 가능한 약리학적 조성물을 부가적으로포함할 수 있다. 약리학적 조성물은 부형제 또는 희석제를 함유할 수 있다. 예를 들어 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 등으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)을 참고하여 선택할 수 있다.

또한 바이러스가 종양세포로 보다 안전하게 전달될 뿐 아니라 체내 부작용을 줄이기 위해 적당한 약물전달 시스템을 사용할 수도 있다. 이러한 용도로 예를 들어 하이드로젤, 콜라겐, CMC(carboxy methyl cellulose), PEG 등이 사용될 수 있으며, 바이러스의 구조 유전자를 변형시켜 종양부위에 전달효율을 증진시킬 수도 있다.

본 발명의 조성물은 전신투여 및 국소 투여될 수 있다. 국소투여의 경우 예를 들어 종양부위에 종양세포 내 주사(intratumoral injection)로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 사용량은 바이러스 벡터를 이용한 종양의 유전자 치료에 통상적으로 사용되는 함량으로, 예를 들어 아데노바이러스 벡터를 사용하는 경우 최대 1 X 10¹²- 10¹³개의 재조합 바이러스 입자를 주사할 수 있으나 이에 한정되진 않는다. 정확한 용량은 환자의 상태, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 것이다.

또한 본 발명의 조성물은 IL-18 유전자와 IL-12 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진다.

또한 본 발명은 치료가 필요한 개체에 본 발명에 따른 항암용 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 IL-18 혹은 IL-12를 발현시켜 신체 면역반응을 증진시키는 방법 및 이에 의해 종양세포의 증식을 억제시키는 방법을 제공한다.

종양세포는 간암세포, 유방암 세포, 자궁경부암 세포 또는 대장암 세포와 같은 일반적인 고형암 세포를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 IL-12 및 IL-18 병합 요법은 면역반응을 촉진시키고 종양의 전이 및 신생혈관 형성을 억제하여 우수한 종양증식억제 및 치료효과를 가져온다. 또한 IL-12 및 IL-18의 발현을 종양부위에서만 유도할 수 있으므로, IL-12 재조합 단백질의 전신적 투여시 나타날 수 있는 독성을 낮출 수 있어 안전성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 재조합 바이러스를 종양에 병합 처리했을 때 각각의 재조합 바이러스를 단독으로 투여했을 때보다 생쥐 생존율에서 더 강한 항암효과를 보이며 (도 7), Ad.IL-12 단독의 경우보다 2배 이상의 암세포특이적인 세포독성임파구의 생성을 유도하며 (도 5), NK세포의 활성화를 더 많이 유도한다 (도 6). 또한 단독투여보다는 병행투여시 종양의 완전퇴행이 더 높은 빈도로 나타났으며 (표 1), 또한 종양의 완전 퇴행이 일어난 실험군에서 다른 종양세포를 재투여하는 실험에서도 병합 요법을 행한 실험군에서 종양의 성장이 억제된다 (표 2). 또한 실험결과 IL-18 및 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스에 의해, 종양특이적인 종양면역체계와 비특이적 종양면역체계가 유도되며, IL-12 단독 처리시보다 CTL, NK 활성도에서 보다 높게 활성도를 나타낸다.

세포주의 배양

자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주와 인체 태아 신장암세포인 293 세포주 및 생쥐 신장암세포인 CT-26는 10% 소태아 혈청을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양한다. 생쥐 신장암세포인 렌카(Renca) 세포는, 10% 소태아혈청을 포함한 배지 (RPMI1640)에서 배양한다.

IL-12 및 IL-18의 유전자 클로닝 및 재조합 바이러스의 제조는 각각 한국특허출원 2002-10013 및 한국특허출원 2002-77684호에 상세히 설명된 방법에 따라 제조한다. 이들 두 출원의 명세서는 본 출원의 명세서에 합쳐진다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 아래 실시예는 본 발명을 예시하기 위한것일 뿐 본 발명이 아래 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 아데노바이러스를 이용한 IL-18의 발현

재조합 아데노바이러스 제조에 사용된 면역조절 유전자 및 변이체의 모식도는 도 1과 같다. Ad.promIL-18는 쥐의 야생형 IL-18 유전자가 포함된 것이고, Ad.GMmIL-18은 GM-CSF 신호서열 및 쥐의 성숙 IL-18 유전자가 포함된 것으로, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지에 위치한 유전자은행에 2001년 8월 31일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 10062BP를 부여받았다. 재조합 아데노바이러스로부터 단백질의 발현을 확인하기 위해서는 인체 자궁암 세포주인 HeLa를 이용하였다. HeLa 세포는 10 % FBS가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였다. HeLa 세포를 배양접시에 90% 이상으로 배양하고, Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18, Ad.hIL-18CPP32- 및 대조군 아데노바이러스 Ad.GFP를 각각50MOI로 2시간 감염시켰다. 그 후 37℃에서 48시간 동안 배양하여 단백질들이 충분히 발현되도록 하였다.

IL-18 단백질의 발현을 확인하기 위해서 원심분리를 통해 배지와 세포를 분리하였다. 분비된 IL-18은 면역침전 방법으로 확인하였다. 배양배지에 플래그-항체가 고정화된 겔 슬러리를 첨가하여 4℃에서 4시간 반응시키고, 원심분리하여 겔을 모아서 비드 세척액(40 mM Hepes pH 7.4, 100 mM KCl, 0.1 % NP-40, 0.1 mM DTT) 및 PBS 용액(10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4)으로 차례로 씻어준 후 SDS-PAGE를 수행하고 PVDF 멤브레인로 단백질을 전이하였다. 멤브레인을 10% 스킴 밀크가 포함된 PBST(0.05% 트윈 20 포함하는 PBS)용액과 반응시킨 후 세척하고, 1차 항체인 쥐 항-플래그 항체로 반응시켰다. 멤브레인을 다시 2차 항체인 HRP(horse raddish peroxidase)가 접합된 토끼 항-쥐 항체와 반응시키고, PBST로 세척한 후 ECL 키트(Amersham)을 사용하여 발색반응을 확인하였다. 세포를 PBS 완충액으로 씻어 준 후 RIPA 용해액(10 mM Tris-Cl, PH 8.2, 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소디움 디옥시콜레이트, 0.1 % SDS, 0.15 M NaCl, 0.02 % 소디움 아지드)로 세포를 현탁하였다. 세포를 초음파분쇄한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액 일부를 상기와 같은 방법으로 SDS-PAGE와 면역블롯을 수행하여 IL-18 단백질의 발현유무를 확인하였다.

도 2A은 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 의하여 발현되는 IL-18 단백질을 확인한 웨스턴블롯 사진이다. 마커 1 내지 6은 세포 추출물에서, 마커 7 내지 12는 배지액으로부터 얻은 시료이다. 마커 1, 7은 바이러스를 감염시키지 않은 세포에서 발현된 단백질이고, 마커 2, 8은 대조군 Ad.GFP이고, 마커 3, 9는 Ad.promIL-18이고, 마커 4, 10은 Ad.GMmIL-18이고, 마커 5, 11은 Ad.prohIL-18이고, 마커 6, 12는 Ad.hIL-18CPP32-이다. Ad.GFP 바이러스에서는 IL-18이 발현되지 않았고(도 2의 마커 2), 그 외 재조합 아데노바이러스에서는 IL-18이 세포내, 외에서 발현되었다. 또한 Ad.promIL-18에 비하여 GM-CSF 신호 서열를 지닌 Ad.GMmIL-18이 더욱 많은 양의 단백질을 발현하고 세포 외로 분비시켰다.

실시예 2. 아데노바이러스를 이용한 IL-12의 발현

대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지에 위치한 유전자은행에 2001년 9월 7일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 10060BP를 부여받은, (a) IL-12 p35 유전자, IRES(Internal ribosome Entry Site) 및 IL-12 p40 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 (b) 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시킬 수 있는 프로모터 및 (c) 전사종결인자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 (Ad.IL-12)를 사용하였다.

100 혹은 500 pfu/cell 바이러스를 HeLa 세포에 처리하여 48시간 배양한 후, 용해용액(20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % N-옥틸글루코사이드, 100 mM NaCl, pH8.0) 300 ㎕에 현탁하여 -70 ℃와 상온에서 동결과 해동을 3회 반복하였다. 현탁액은 5000 rpm 에서 5분간 원심분리하여 상층액(50 ㎍)을 취하고, SDS 시료 완충용액(62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% 소디움 도데실 설페이트, 10% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루)을 혼합하여 5분간 끓여 웨스턴 블롯 시료로 준비하였다. 웨스턴 블롯용 시료를 10 % SDS-폴리아크릴아마이드에 전기영동한 다음 분리된 단백질 밴드를 PVDF 필터에 이동시켰다. 상기 필터를 0.1 % 트윈20 및 5 % 탈지분유가 포함된 인산완충용액으로 블로킹하였다. 단백질은 항-p40 항체 및 이차 항체인 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 항-염소 항체를 사용하여 표지하였다. 단백질 밴드는 ECL 키트(enhanced chemiluminescence, 에머샴사)로 화학발광을 확인하였다.

도 2B는 재조합 아데노바이러스 Ad.IL-12가 감염된 HeLa 세포에서 IL-12 단백질이 생산되는 양상을 웨스턴 블롯으로 분석한 사진이다. 마커 1은 대조군으로 사용된 Ad.GFP를 500moi처리한 것이고 마커 2와 3은 Ad.IL-12를 100 moi 혹은 500 moi처리한 것이다. p35/p40의 이형중합체 형태(75 kDa)와 p40/p40의 동형중합체 형태(80 kDa)의 단백질의 발현을 확인하였다.

실시예 3. 재조합 IL-18 단백질과 재조합 IL-12 단백질의 생물학적 활성조사

재조합 IL-18 단백질 및 재조합 IL-12 단백질이 사이토카인으로서 본래의 기능을 지니고 있는지 알아보기 위하여 생쥐 비장세포 (T 세포)의 IFN-γ 유도 정도를 확인하였다.

HeLa 세포에 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18, Ad.hIL-18CPP32-, Ad.IL-12 및 대조군 바이러스 Ad.GFP를 각각 감염시켜 세포추출물과 배지액을 얻었다. 각각 50 ㎕를 T 세포 촉진인자용 시료로 준비하였다.

BALB/c 생쥐(9주령, 대한실험동물센터)로부터 비장세포를 추출하여 적혈구를 제거하고 혼합 림프구를 분리하여 1~5 x 10⁶의 세포를 24-웰 플레이트에 첨가하고, TCM (RPMI 90ml, EHAA(Eagle-Hanks Amino acid) 90ml, FBS 20ml, 100X L-글루타민 2ml, 1000X BME 200㎕, 100X 페니실린 스트렙토마이신 2ml/200ml) 배지에서 2~4 일간 배양하였다. 배양된 세포를 웰당 1.5 x 10⁶/150 ㎕ 농도로 96-웰 플레이트에 옮기고, T 세포 촉진인자용 시료 50 ㎕를 첨가하여 24시간 배양하였다. IFN-γ 키트(Genzyme)을 사용하여 IFN-γ 생성검사를 수행하였고, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타낸다. 이때 흡광도와 인터페론 양과의 관계를 나타낼 수 있는 표준 곡선을 사용하여 생성되는 인터페론의 양을 측정하기 위해 키트 안에 포함된 IFN-γ를 희석하여 사용하였다.

도 3a는 본 발명의 재조합 IL-18 단백질 변이체에 의하여 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸 그래프이다. 마커 1은 바이러스를 감염시키지 않은 세포에서 발현된 단백질이고, 마커 2는 대조군 Ad.GFP이고, 마커 3은 Ad.promIL-18이고, 마커 4는 Ad.GMmIL-18이고, 마커 5는 Ad.prohIL-18이고, 마커 6은 Ad.hIL-18CPP32-이다. 도 3a에서 GM-CSF 분비 서열을 포함하는 Ad.GMmIL-18에서 발현되는 IL-18 단백질이 가장 많은 IFN-γ를 생성하였다.

도 3b는 재조합 아데노바이러스 Ad.IL-12에 의해 생성되는 IL-12 단백질의 생물학적 활성을 IFN-γ 생성정도로 확인한 그래프이다. 마커 1은 바이러스를 감염시키지 않은 세포의 배양액이고 마커 2는 Ad.GFP를 50 moi 처리한 배양액이고 마커 3, 4는 각각 Ad.IL-12를 10 moi, 50 moi처리한 세포 배양액이다. 재조합 바이러스 Ad.IL-12의 moi가 높을수록 IFN-γ 생성량이 증가하였음을 의미하며, 따라서 재조합 바이러스 Ad.IL-12가 생물학적 활성을 가지는 IL-12 단백질을 생성함을 확인하였다.

실시예 4 : 재조합 바이러스 Ad.GMmIL-18 혹은 Ad. IL-12의 단독 혹은 병합 투여에 의한 종양억제 효과

IL-12와 IL-18에 의한 항암효과를 알아보기 위해 생쥐의 대장암 세포주인 CT-26 세포주를 사용하였다. CT-26 세포주는 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 수거한 후 세포수를 측정하고, 살아있는 세포가 전체의 80 % 이상일 경우 1 X PBS로 세척한 다음 10⁶세포/ml가 되도록 1 X PBS에 현탁하였다. 현탁액은 BALB/c 생쥐 한 마리당 100 ㎕(1.5 x 10⁵개의 세포수)씩 피하주사하고, 7 - 9 일 동안 종양 결절을 형성시켰다.

종양결절이 형성된 20마리의 생쥐를 4군(한군당 5마리)으로 나누고, 종양결절의 직경이 6 - 9 mm 되었을 때, 제 1 군에는 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18, 제 2 군에는 Ad.IL-12, 제 3 군에는 Ad.GMmIL-18, 그리고 대조군(제 4 군)으로 Ad.GFP를 각각 종양 결절내로 재조합 바이러스 양이 1 x 10⁹pfu/100 ㎕ 되도록 주사하였다. 이때 재조합 바이러스는 주사용 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 1mM MgCl₂)를 이용하여 희석하였고, 주사량은 각 마리당 100 ㎕ 씩 하였다. 종양의 크기는 장축 x 단축 x 높이/2로 계산하여 그 평균값을 취하였다. 종양결절이 형성된 생쥐에 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18, Ad.IL-12, Ad.GMmIL-18 및 Ad.GFP를 주사한 다음 시간에 따른 종양 크기변화를 관찰하였다. 도 4a는 형성된 종양결절의 직경이 6-7 mm일 때, 도 4b는 종양결절의 직경이 8.5-9mm일 때의 결과를 나타낸다. 도 4a 및 도 4b에서,IL-12와 IL-18를 동시에 발현하는 경우 (Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18), 종양의 크기가 대조군(Ad.GFP: x)과 Ad.GMmIL-18이 단독으로 도입된 군(▲)에 비해 현저히 감소하였고, 종양이 큰 경우에 Ad.IL-12를 단독으로 도입한 군과 비슷한 종양 증식 억제효과를 보이나 (도 4a) 종양이 작은 경우에는 Ad.IL-12를 단독으로 도입한 군에 비해 탁월한 종양 증식억제효과를 나타내었다. Ad.IL-12 단독 투여시 13일 이후 다시 종양이 성장하는 것이 관찰되었다 (데이타 미 첨가).

항암 효능을 확인하기 위하여, 종양이 완전히 소실된 경우, 종양이 완전히 소실되지는 않았지만 종양의 증식속도가 대조군보다 현저하게 감소하거나 거의 증식하지 않은 경우 및 종양의 증식속도가 대조군에 비해 차이가 없는 경우를 각각 완전 퇴행(Complete regression), 부분 퇴행(Partial regression), 무반응(Nonresponse)으로 분류하였다(표 1). 항암효능의 유의성은 Chi Square test로 검증하여 P 값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 간주하였다. Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18을 투여한 군의 증식억제효과가 대조군에 통계적으로 유의성이 있는지를 조사한 결과 완전퇴행된 경우 P 값이 0.038 이었고, 완전퇴행과 부분퇴행을 함께 통계적으로 처리한 경우 P 값이 0.0098이었다. 이 결과는 Ad.GMmIL-18 + Ad.IL-12의 종양성장억제 효능이 통계적으로 유의성이 있음을 제시해 준다. Ad.IL-12이나 Ad.GMmIL-18을 단독으로 투여한 군은 완전퇴행된 경우 P 값이 모두 0.292 으로 유의한 차이가 없었으나 완전퇴행과 부분퇴행을 함께 통계적으로 처리한 경우 P 값이 각각 0.0098, 0.038로 대조군에 비해 유의한 차이가 있었다.

[표 1]

실시예 5. 세포 독성 임파구 유도능력 검증

IL-18 혹은 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스를 생쥐에서 형성된 종양결절 (직경: 6 - 9 mm)에 단독 혹은 병합 투여한 후 종양결절이 완전히 제거된 생쥐를 대상으로 하여 세포독성 임파구의 활성화정도를 측정하기 위하여 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18 또는 Ad.IL-12를 각각 생쥐의 피하에 생긴 종양결절 내로 주입하였다. 바이러스 주입한지 80일 후 종양증식이 완전히 억제된 생쥐(Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18 또는 Ad.IL-12를 처리한 구)의 비장세포와 대조구로 종양결절을 생성시키지 않은 쥐의 비장세포를 무균조작을 통하여 금속 메쉬로 단세포 혼탁액으로 만든 후 적혈구세포를 용해(8.3g/L 암모니움 클로라이드)시켰다. 비장세포는 T 세포 배지(RPMI, Eeagle-Hanks amino acid, FBS, L-글루타민, 베타-머캡토에탄올, 페니실린-스트렙토마이신, mIL-2)로 현탁한 다음 웰당 1 x 10⁷세포가 되도록 12개 웰에 첨가하였다. CT-26 세포에 50 Gy의⁶⁰Co 감마 방사선을 조사한 후, T 세포 배지로 현탁하여 비장세포와의 비율이 10:1이 되도록 웰에 첨가하여 배양하였다. 6 일 후에 자극된 T 세포 (effector 세포)와⁵¹Cr(100℃ Ci/10⁶세포; Dupont)으로 90분 간표지한 CT-26 세포 (표적세포)를 각각 8:1, 25:1, 75:1가 되도록 하여 96개 U자 바닥 플레이트에 혼합하여 최종 부피 200 ㎕ 되도록 섞어주었다. 37 ℃에서 3-4 시간 배양하고, 배양액을 원심분리하였다. 상층액 100 ㎕를 취하여 감마 측정기 (gamma counter)로 측정하여 세포 용해도 백분율(% specific lysis)을 계산하였다.

도 5는 각각 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18, Ad.IL-12 투여에 따른 암세포특이적인 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 생성 정도를 세포용해도 백분율로 나타낸 그래프이다. Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18로 처리한 생쥐에서 보다 높은 암세포 특이적인 세포 독성 임파구가 유도되었다는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. 자연 살상 세포의 활성촉진 능력 검증

IL-18 혹은 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스를 생쥐에서 형성된 종양결절에 단독 혹은 병합 투여한 후 종양결절이 완전히 제거된 생쥐를 대상으로 하여 자연살상세포의 활성화정도를 측정하기 위하여 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18 또는 Ad.IL-12를 각각 생쥐의 피하에 생긴 종양결절내로 주입하였다. 80일 후 종양증식이 완전히 억제된 생쥐(Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18 또는 Ad.IL-12를 처리한 구)의 비장세포와 대조구로 종양결절을 생성시키지 않은 쥐의 비장세포를 무균조작을 통하여 금속 메쉬로 단세포 혼탁액으로 만든 후 적혈구세포를 용해(8.3g/L 암모니움 클로라이드)시켰다. 비장세포는 T 세포 배지(RPMI, Eeagle-Hanks amino acid, FBS, L-글루타민, 베타-머캡토에타놀, 페니실린-스트렙토마이신, mIL-2)로 현탁한 다음 웰당 1 x 10⁷세포가 되도록 12개 웰에 첨가한 후 5일간 배양하였다.

자극된 T 세포와⁵¹Cr(100℃ Ci/10⁶세포; Dupont)으로 표지(90분)한 YAC-1 세포 (표적세포)의 비가 8:1, 25:1, 75:1가 되도록 하여 96개 U자 바닥 플레이트에 혼합하여 최종 부피 200 ㎕ 되도록 섞어준 후 37 ℃에서 3-4 시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 100 ㎕을 취하여 감마 카운터로 측정하여 세포용해도 백분율 (% specific lysis)을 계산하였다.

도 6에서 나타난 바와 같이 IL-12와 IL-18를 모두 발현시키는 아데노바이러스 조성물로 처리한 생쥐에서 자연살상세포의 활성이 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 재조합 바이러스 투여 후 생존곡선

IL-18 혹은 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스를 생쥐에서 형성된 종양결절에 단독 혹은 병합 투여한 후 생쥐의 생존기간을 측정하기 위해 종양결절이 형성된 20 마리의 생쥐를 4군 (한군당 5마리)으로 나누고, 제 1 군에는 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18, 제 2 군에는 Ad.IL-12, 제 3 군에는 Ad.GMmIL-18, 그리고 대조군(제 4 군)으로 Ad.GFP를 각각 종양결절의 직경이 6 - 9 mm 되었을 때 결절내로 재조합바이러스 양이 1 x 10⁹pfu/100 ㎕ 되도록 주사한 후 80일간 관찰하였다.

IL-12와 IL-18를 모두 발현시키는 아데노바이러스 조성물(Ad.IL-12, Ad.GMmIL-18)이 도입된 생쥐(생존율;60%)가 대조군(Ad.GFP, 생존율 0%)뿐만 아니라 Ad.IL-12를 단독으로 도입한 생쥐 (생존율 20%)과 Ad.GMmIL-18이 단독으로 도입된 생쥐(생존율 20%)에 비해 현저히 높은 생존률을 나타내었다(도 7)

실시예 8. 종양이 사라진 생쥐에서 종양 세포 재 이식 실험

IL-18 혹은 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스를 CT-26 대장암 세포로 유도된 생쥐 종양결절에 투여한 후 종양결절이 사라진 생쥐에서 종양특이적인 면역체계 및 종양 비특이적인 면역체계가 성립되었는지를 알아보기 위해 종양을 투여하였던 반대쪽 측복부에 CT-26 대장암 세포를 2 x 10⁵개의 세포수로 피하주사하고 동측 측복부에 Renca 신장암 세포를 2 x 10⁵개의 세포수로 피하주사한 후 종양성장 유무를 관찰하였다. 실험군은 완전퇴행이 일어난 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18군 3 마리 그리고 Ad.IL-12군의 1 마리로 하였으며, 대조군은 정상 생쥐 4 마리에 실험군과 같은 수의 종양세포를 같은 위치에 피하주사하였다. 완전퇴행이 일어난 Ad.IL-12 + Ad.GMmIL-18군 3 마리와 Ad.IL-12군의 1 마리에서 반대쪽 측복부의 CT-26 대장암 세포종양은 8일째까지는 종양이 모두 존재하였으나 21일 째에서는 모두 완전퇴행되었고, 동측 측복부에 Renca 신장암 세포종양은 8일째 모두 완전퇴행되었다 (표 2). 반면에 대조군은 CT-26 대장암 세포종양과 Renca 신장암 세포종양이 모두 형성되었다.

[표 2]

실시예 9. 종양세포의 폐전이 억제 실험

IL-18 혹은 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스를 생쥐에서 유도된 종양결절에 병합처리한 후 Ad.IL-12 + Ad.IL-18를 투여한 생쥐에서 전신적인 종양특이적인 면역체계가 성립되었는지를 알아보기 위해 CT-26 대장암 종양세포를 2 x 105 개의 세포수로 피하주사하여 종양결절을 만들고, 결절의 직경이 약 6 mm 일 때 2 x 106 개의 세포수의 CT-26 대장암세포를 PBS에 현탁하여 생쥐의 꼬리의 측부정맥에 주입하고 동시에 Ad.IL-12 (2 x 108 pfu) + Ad.IL-18 (8 x 108 pfu)을 종양결절 내에 주입하였다. 이때 재조합 바이러스는 주사용 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 1mM MgCl2)를 이용하여 희석하였고, 주사량은 각 마리당 100 ㎕ 씩 하였다. 14일간 관찰한 후에 폐에 종양이 발생하는가를 알아보았다. 대조군으로는 정상생쥐에 2 x 106 개의 세포수의 CT-26 대장암세포를 PBS에 현탁하여 생쥐의 꼬리의 측부정맥에 주입하여 비교하였다. 실험결과(도 8) 다수의 종양결절이 형성된 대조군의 폐와 비교하여 Ad.IL-12 + Ad.IL-18을 종양내에 투여한 생쥐의 폐에서는 종양결절이 거의 보이지 않았다. 이것으로부터 IL-12와 IL-18을 포함하는 아데노바이러스로 처리한 생쥐에서 전신적인 종양특이적인 면역체계가 성립되어 종양세포의 폐 전이를 억제한다는 것을 알 수 있었다.

IL-12 및 IL-18을 종양세포에서 발현시키는 재조합 벡터로 이루어진 조성물을 투여함으로써, 효과적으로 종양세포의 증식 및 종양의 전이를 억제할 수 있다.

Claims

IL-18 유전자를 발현하는 재조합 벡터와 IL-12 유전자를 발현하는 재조합 벡터로 이루어지는 항암 조성물.
IL-18 유전자와 IL-12 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 항암 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL-18 유전자가 IL-18 단백질의 카스파제-3 절단부위가 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 트립토판, 티로신 및 발린으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 IL-18 단백질을 코딩하는 유전자인 항암 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL-18 유전자가 분비 서열을 포함하는 유전자인 항암 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL-12 유전자를 포함하는 아데노바이러스가 (a) IL-12 p35 유전자, IRES(Internal ribosome Entry Site) 및 IL-12 p40 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 (b) 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시킬 수 있는 프로모터 및 (c) 전사종결인자를 포함하는 재조합 바이러스를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스인 항암 조성물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 재조합 바이러스인 항암조성물.
제6항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 아데노바이러스인 항암조성물.
항암 치료가 필요한 개체에 IL-18 유전자를 발현하는 재조합 벡터와 IL-12 유전자를 발현하는 재조합 벡터로 이루어지는 항암용 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 IL-18 혹은 IL-12를 발현시켜 신체 면역반응을 증진시키는 방법.
항암 치료가 필요한 개체에 IL-18 유전자와 IL-12 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 항암용 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 IL-18 및 IL-12를 발현시켜 신체 면역반응을 증진시키는 방법.
항암 치료가 필요한 개체에 IL-18 유전자를 발현하는 재조합 바이러스와 IL-12 유전자를 발현하는 재조합 바이러스로 이루어지는 항암용 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 IL-18 혹은 IL-12를 발현시켜 종양세포의 증식을 억제시키는 방법.
항암 치료가 필요한 개체에 IL-18 유전자와 IL-12 유전자를 포함하는 재조합바이러스로 이루어지는 항암용 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 IL-18 및 IL-12를 발현시켜 종양세포의 증식을 억제시키는 방법.