KR20030047819A - 인터루킨-18 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 및그를 이용한 유전자치료 - Google Patents

인터루킨-18 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 및그를 이용한 유전자치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터루킨-18 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 및 그를 이용한 유전자치료에 관한 것이다. 특히 본 발명은 세포내 면역반응을 촉진 및 유도하여 다양한 종류의 암세포를 효과적으로 치료할 수 있는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

Description

인터루킨-18 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 및 그를 이용한 유전자치료{RECOMBINANT ADENOVIRUS FOR EXPRESSING INTERLEUKIN-18 AND GENE THERAPHY USING SAME}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 인터루킨-18 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 및 그를 이용한 유전자치료에 관한 것이다. 보다 상세하게는 인터루킨-18을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 암세포에 전달하여 종양세포에 대한 면역반응을 유도함으로써 암세포를 치료하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
암 치료는 외과적 수술, 방사선조사, 화학약품을 이용한 치료, 면역촉진제를 이용한 방법 등에 의하여 주로 실시되고 있다. 하지만 빈번한 재발과 여러 가지 부작용으로 인하여 좀 더 효율적이고 안전한 치료법이 요구되고 있다.
최근 유전자 조작 기술의 발달로 인하여 생체 내에 존재하는 유전자를 이용한 유전자 치료(gene therapy)가 종양을 비롯한 여러 선천적 난치성 질환을 치료하는데 각광을 받고 있다. 유전자 치료는 질환들의 분자생물학적, 생화학적 원인을 조사한 후, 생체내 존재하는 유전자를 세포내로 주입, 발현시켜 만들어지는 단백질로 치료하는 기술이다. 유전자 치료는 1990년 9월 미국에서 프렌치 앤더슨(FrenchAnderson) 그룹에서 처음으로 시도하였으며, 종합면역결핍증을 앓고 있는 환자에게 유전자를 도입하여 치료한 이래 최근 들어 2천5백명 이상의 환자들이 임상실험을 받고 있다.
암에 대한 유전자 치료요법이 효과적으로 이루어지기 위해서는 치료 유전자 및 질환에 선택적, 특이적으로 전달할 벡터 선별이 중요하다. 이용되고 있는 유전자로는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)의 티미딘 키나제(thymidine kinase), 대장균의 시토신 디아미나제(cytosine deaminase), 카스파제 (caspase), TRAIL(TNF-관련 세포사멸 유도 리간드), 혈관형성 억제 유전자 등이 있다. 벡터로는 아데노바이러스, 아데노부속바이러스, 레트로바이러스, 리포좀 등이 있으나 이러한 벡터들은 실제로 암세포에 적용했을 때 극히 일부분의 암세포에만 전달되어 치료유전자가 발현되기 때문에 유전자의 치료효과가 그리 효과적이지 않은 실정이다 (Mountain A, TIBTECH 18 : 119-128, 2000).
종양제거를 목적으로 면역반응 촉진인자인 사이토카인을 이용하는 경우, 일부분의 종양세포에만 치료유전자가 도입되더라도 종양 특이적 신체 면역 반응이 유도되어 치료유전자가 도입되지 않은 그 주변의 다른 종양세포까지 제거되는 바이스탠드 효과(bystander effect)를 나타내게 됨으로써 좀 더 효과적인 유전자치료가 가능하다.
인터루킨-18(IL-18)은 면역반응 촉진 인자로서 인터페론 감마 활성 인자(Interferon gamma inducing factor: IGIF)로서도 알려져 있다. 인터루킨-18은 T 세포나 NK 세포의 세포독성을 증가시키고, 활성화된 T 세포를 증식시키며,Th1 세포를 자극하여 인터루킨-2와 인터페론-γ를 생산시킨다(Dinarello C.A. Method 19: 121-132, 1999). 또한 B 세포로부터 인터페론 감마를 유도하여 IgE 합성을 억제하고, 과식구 거식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor; 이하 ‘GM-CSF’라 함)의 생성을 증가시킬 뿐만 아니라 인터루킨-2의 생성을 촉진하며, 면역저해 사이토카인인 인터루킨-10의 생성을 억제한다.
인터루킨-18은 생물학적으로 불활성상태의 전구체로 합성된 후 세포내에 존재하는 시스테인 프로테아제인 인터루킨-1β-전환효소(ICE, caspase-1)에 의해서 잘려지면 활성형태로 전환된다. 전구체 또는 활성된 성숙 인터루킨-18은 카스파제-3(caspase-3, CPP32)에 의해서 분해되어 불활성화된다.
인터루킨-18의 유전자는 사람(GenBank accession number E17135)과 쥐(GenBank accession number E17139)에서 분리되어 있고, 최근 인터루킨-18 단백질을 생쥐에 직접 투여하여 항암효과실험이 시도되고 있으며, 어느 정도 효과를 보이는 것으로 보고되고 있다. 이러한 효과는 T 세포에 의한 인터페론 감마나 활성화된 NK 세포가 중요한 역할을 하리라고 생각되어진다(Micallef et al. Cancer Research 57, 4557-4563, 1997).
본 발명은 인터루킨-18 단백질을 세포외로 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 카스파제-3에 의해 불활성화되지 않으며 인터페론 감마 활성화능을 갖는 인터루킨-18 단백질 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 카스파제-3에 의해 불활성화되지 않으며 인터페론 감마 활성화능을 갖는 인터루킨-18 단백질 변이체를 암호화하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 인터루킨-18 단백질을 종양세포에서 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 인터루킨-18 단백질 및 변이체 인터루킨-18 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 인터루킨-18 단백질 및 변이체 인터루킨-18 단백질을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 인터루킨-18을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 종양세포를 치료할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 재조합 아데노바이러스 제작용 재조합 벡터 pX.dCMV.mIL-18, pX.dCMV.GMmIL-18, pX.dCMV.hIL-18 및 pX.dCMV.hIL-18CPP32-의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터를 이용한 재조합 아데노바이러스를 제작하는 과정을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 의한 재조합 인터루킨-18 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블롯사진이다.
도 4는 재조합 인터루킨-18 단백질에 의한 인터페론 감마 생성율을 ELISA 방법으로 확인한 것이다.
도 5는 생쥐 신장암 종양에 Ad.GMmIL-18를 투여한 후 종양세포의 증식억제정도를 측정한 그래프이다.
도 6은 간암 생쥐모델에 Ad.hIL-18CPP32-와 Ad.ICE를 병합투여한 후 종양세포 증식저해도를 특정한 그래프이다.
도 7은 Ad.GMmIL-18로부터 생산되는 인터루킨-18 단백질에 의한 종양세포 특이적인 세포독성 임파구의 생성율을 측정한 그래프이다.
도 8은 Ad.GMmIL-18과 Ad.hIL-18CPP32-로부터 생산되는 인터루킨-18 단백질에 의한 자연살상 세포의 활성을 증가도를 측정한 그래프이다.
본 발명은 인터루킨-18 단백질의 카스파제-3 절단부위가 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 인터루킨-18 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 인터루킨-18 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 인터루킨-18 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 인터루킨-18 유전자의 발현이 작동가능하도록 연결된 프로모터, (b) 인터루킨-18 유전자 및 (c) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 재조합 아데노바이러스를 세포에 주입하고, 재조합 인터루킨-18 단백질을 발현시켜 종양세포의 증식을 억제시키는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 종양세포의 증식을 억제하고 면역반응을 증강시킬 수 있는 인터루킨-18 단백질을 발현 및 세포 밖으로 분비시키는 방법을 제공한다.
인터루킨-18 단백질은 면역세포의 성장, 분화 및 활성에 작용하는 사이토카인이다. 인터루킨-18 유전자는 전구체(프로-인터루킨-18 폴리펩타이드)로 발현되고, 카스파제-1에 의해 프로 부분(서열번호 1)이 제거되어 성숙 인터루킨-18 단백질(사람: Gene Bank No. BAA08706, 쥐:Gene Bank No. NP032386)이 생성된다. 성숙 인터루킨-18 단백질은 사이토카인으로 작용할 수 있는 활성을 가진다. 이후 전구체 또는 성숙 인터루킨-18 단백질은 카스파제-3에 의해 아스파르트산 뒤쪽이 잘려 불활성화된다. 따라서, 카스파제-3에 의해 분해되지 않는 IL-18 변이체를 제조할 수 함으로써, 카스파제-3이 존재하거나 활성화될 수 있는 종양세포에서 인터루킨-18 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다. 또한 인터루킨-18 단백질이 세포외로 발현되도록 함으로써, 인터루킨-18 단백질을 발현하지 않는 세포에까지 인터루킨-18에 의한 면역증강효과를 발생시킬 수 있다.
본 발명에서 언급하는 인터루킨-18 단백질은 인터루킨-18 단백질의 활성을가지는 것으로, 바람직하게는 야생형 인터루킨-18 단백질 전구체, 야생형 성숙 인터루킨-18 단백질, 인터루킨-18 단백질 전구체의 변이체 또는 성숙 인터루킨-18 단백질 변이체이다. 인터루킨-18 유전자는 인터루킨-18 유전자 전구체(프로-성숙 인터루킨-18), 성숙 인터루킨-18 유전자, 인터루킨-18 유전자 전구체 변이체, 성숙 인터루킨-18 유전자 변이체, 세포외 분비신호서열을 포함하는 인터루킨-18 유전자 전구체, 세포외 분비신호서열을 포함하는 성숙 인터루킨-18 유전자 및 세포외 분비신호서열을 포함하는 인터루킨-18 유전자 변이체를 포함한다.
본 발명에서는 인터루킨-18 단백질의 반감기가 증가된 변이체를 제공한다. 상기 변이체는 카스파제-3에 의해 잘리는 부분의 아미노산 서열을 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환시킨 것이다. 치환된 아미노산은 성숙 인터루킨-18 단백질의 활성을 저해시키지 않는 것이 좋으며, 바람직하게는 글루타민산이다.
상기 카스파제-3 절단부위는 사람 인터루킨-18 단백질(Gene Bank NO. Q14116)의 71번 또는 76번의 아스파르트산이다. 생쥐의 인터루킨-18 단백질(Gene Bank No.NP_032386)의 카스파제-3 절단부위는 69번 아스파르트산이다.
인터루킨-18 단백질 변이체의 예로는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 단백질을 들 수 있다. 서열번호 4는 사람 인터루킨-18 전구체 단백질의 변이체로 인터루킨-18 단백질의 71번 및 76번의 아미노산이 글루타민산으로 치환된 것이고, 서열번호 5는 쥐 인터루킨-18 전구체 단백질의 변이체로 인터루킨-18 단백질의 69번 아미노산이 글루타민산으로 치환된 것이다. 서열번호 10은 35번 및 40번의 아미노산이 글루타민산으로 치환된 사람 성숙 인터루킨-18 단백질의 변이체의 아미노산 서열이고, 서열번호 11은 쥐 성숙 인터루킨-18 단백질의 변이체 아미노산 서열이다.
본 발명에 따른 인터루킨-18 단백질 변이체는 특히 전자는 카스파제-3에 의해 잘리는 부분의 아미노산 서열이 치환된 경우, 세포내 또는 세포외에서 카스파제-3에 의해 분해되지 않아 장기간 활성을 가짐으로써 종양증식 억제에 효과적일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인터루킨-18 단백질 변이체를 암호하는 변이체 유전자를 제공한다. 상기 변이체 유전자는 카스파제-3에 의해 잘리는 부분의 아미노산 서열이 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 인터루킨-18 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함한다.
바람직한 변이체 유전자는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다. 변이체 유전자의 일예는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드이다.
또한, 본 발명에서는 인터루킨-18 단백질의 세포외분비를 증가시키기 위해세포외분비 신호서열 및 인터루킨-18 유전자서열을 포함하는 뉴클레오타이드를 제조한다. 바람직하게는 상기 뉴클레오타이드는 성숙 인터루킨-18 단백질 또는 성숙 인터루킨-18 단백질 변이체를 코딩하는 염기서열의 5' 말단에 과식구 대식 세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor: 이하 'GM-CSF'라 함) 신호서열을 포함하는 것이다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 2의 염기서열, 서열번호 10의 단백질을 코딩하는 염기서열 또는 서열번호 11의 단백질을 코딩하는 염기서열이다. 서열번호 10의 단백질을 코딩하는 염기서열의 일예는 서열번호 8이고, 서열번호 11의 단백질을 코딩하는 염기서열의 일예는 서열번호 9이다. 상기 신호서열의 일예는 서열번호 3의 염기서열이다.
한편, 본 발명은 인터루킨-18 단백질 또는 그의 변이체를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
먼저, 인터루킨-18 단백질 또는 그의 변이체를 발현할 수 있는 구조체를 포함하는 재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터를 제조하였다. 아데노바이러스 트랜스퍼벡터는 아데노바이러스에 특정 유전자를 상동재조합으로 이동시킬 수 있는 벡터이다.
상기 구조체는 프로모터, 성숙 인터루킨-18 단백질 또는 그의 변이체를 암호하는 인터루킨-18 유전자 및 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다.
프로모터는 CMV(Cytomegalovirus), 라우스 살코마 바이러스 LTR, 생쥐의 류케미아 바이러스 LTR, 시미언 바이러스 40 전기 또는 후기, 또는 인터루킨-18 프로모터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 CMV 유래의 프로모터이다.
상기 인터루킨-18 유전자는 인터루킨-18 전구체(프로-성숙인터루킨-18 유전자), 성숙 인터루킨-18 유전자, 인터루킨-18 전구체 변이체 또는 성숙 인터루킨-18 변이체이다.
성숙 인터루킨-18 유전자 또는 성숙 인터루킨-18 변이체를 포함하는 아데노바이러스 트랜스퍼벡터는 추가로 전사개시코돈(ATG)을 포함할 수 있다.
인터루킨-18 전구체 변이체 및 성숙 인터루킨-18 변이체, 인터루킨-18 변이체 유전자는 카스파제-3에 의해 잘리는 부분의 아미노산 서열이 알라닌, 아르기닌, 스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 인터루킨-18 단백질 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함한다.
상기 재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터는 재조합 단백질을 세포외로 분비시킬 수 있는 분비 신호서열을 추가로 포함할 수 있다. 분비 신호서열은 지금까지 공지된 모든 서열이 바람직하며, 가장 바람직하게는 과식구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor; 이하 'GM-CSF'라 함) 신호서열 또는 preprotrysin 효소의 신호서열이다.
일예로 제조한 재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터는 pX.dCMV.mIL-18, pX.dCMV.hIL-18, pX.dCMV.GMmIL-18, pX.dCMV.hIL-18CPP32- 및 pX.preprotrypsin.hIL-18CPP32-이며, 벡터의 구조는 도 1에 나타내었다.
재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터와 아데노바이러스 모체벡터를 함께 세포에 감염시켜, 트랜스퍼벡터내의 인터루킨-18 발현 구조체(프로모터-인터루킨-18 유전자-전사종결자)를 모체벡터로 이동시킨다. 인터루킨-18 발현 구조체의 전이는 재조합 벡터의 아데노바이러스 유전자 일부와 이를 함유하는 모체벡터간의 상동재조합에 의한 것이며, 도 2에 간략하게 나타내었다.
아데노바이러스 모체벡터는 pBHG10 또는 pJM17이 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 모체벡터에 프로모터, 인터루킨-18 유전자 및 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함한다. 바람직한 재조합 아데노바이러스는 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18 및 Ad.hIL-18CPP32- 이다.
Ad.promIL-18는 쥐의 야생형 인터루킨-18 유전자가 포함된 것이고, Ad.GMmIL-18은 GM-CSF 신호서열(서열번호 3) 및 쥐의 성숙 인터루킨-18 유전자(서열번호 2)가 포함된 것이다. Ad.GMmIL-18은 Ad.IL-18로 명하고, 2001년 8월 31일에 기탁하여 KCTC10062BP를 부여받았다. Ad.prohIL-18은 사람의 야생형 인터루킨-18 유전자가 포함된 것이고, Ad.hIL-18CPP32- 는 인터루킨-18 단백질의 카스파제-3에 의해 잘리는 부분이 치환되도록 한 것으로 서열번호 6을 포함한다.
또한 hIL-18CPP32-를 성숙된 형태로 세포외로 분비시키기 위하여 preprotrypsin 신호서열(서열번호 8)과 연결하여 제조한 preprotrypsin.hIL-18CPP32- 유전자(서열번호 9)는 아데노바이러스 제조용 트랜스퍼벡터인 pX.CMV에 클로닝하여 pX.preprotrypsin.hIL-18CPP32- 벡터로 제조하고 재조합 아데노바이러스 Ad.preprotrysin.hIL-18CPP32-를 제작하여 세포외로 분비되는 카스파제-3에 의해 분해되지 않는 성숙된 사람의 인터루킨 단백질(서열번호 10)을 만들어내어 항암 효과가 더욱 크게 기대되는 바이러스를 제작하였다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 바이러스의 증식에 필수적인 E1 유전자가 결여되어 있기 때문에 암세포내로 도입되었을 때 복제와 증식을 할 수 없으나, CMV 프로모터의 조절하에 많은 양의 인터루킨-18 단백질을 발현 및 세포 밖으로 분비시킨다.
Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18 및 Ad.hIL-18CPP32-를 각각 Hela 세포에 감염시켜 발현되는 단백질을 확인하였다. Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18 및 Ad.hIL-18CPP32-에서 발현된 인터루킨-18 단백질이 전구체 또는 성숙 형태로 세포내 및 세포 외에서 검출되었다.(도 3)
또한 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 발현하는 재조합 인터루킨-18 단백질은 생리활성을 가진다. 인터루킨-18은 인터페론 감마의 활성인자이므로, 쥐에서 비장을 적출한 후 일정량의 비장세포를 본 발명에서 제작된 재조합 아데노바이러스로 감염시킨 세포의 배양액으로 처리하고 배양액에서 인터페론 감마의 생성정도를 관찰하였다. 그 결과 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18 및 Ad.hIL-18CPP32-는 모두 인터페론 감마의 생성을 증가시켰으며, 특히 재조합 인터루킨-18 단백질을 세포외로 분비시키는 Ad.GMmIL-18가 가장 많은 양의 인터페론 감마를 유도하였다.(도 4) 따라서, 세포외분비 신호가 인터루킨-18 단백질의 사이토카인으로써의 영향을 증대시킴을 알 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터에서 발현되는 재조합 인터루킨-18 단백질은 통상적인 방법으로 순수분리하여, 면역증강제로 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 아데노바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 재조합 아데노바이러스는 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18, Ad.hIL-18CPP32- 및 Ad.preprotrysin.hIL-18CPP32-로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며, Ad.promIL-18, Ad.prohIL-18 또는 Ad.hIL-18CPP32-는 Ad.ICE와 병용하여 사용할 수 있다. Ad.ICE는 카스파제-1을 발현하는 재조합 아데노바이러스로, 프로-인터루킨-18형태로 발현된 재조합 단백질의 프로부위를 제거하여 성숙한 인터루킨-18 단백질을 제조한다.
상기 조성물은 1종 이상의 허용가능한 약리학적 조성물을 더욱 포함할 수 있다. 약리학적 조성물은 부형제 또는 희석제로, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것이다. 하지만 상기 부형제 또는 희석제는 이에 국한되지 않는다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 기재되어 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 주사용으로 사용되는 것이다. 일예로 종양세포에 1회 종양 세포내 주사(intratumoral injection)로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 사용량은 아데노바이러스 벡터를 이용한 종양의 유전자 치료에 통상적으로 사용되는 양으로, 예를 들어 최대 1 X 1012 - 1013 개의 재조합 아데노바이러스 입자를 주사하는 것이나, 상기 용량은 이에 한정되진 않는다. 정확한 용량은 환자의 상태, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달리 적용되는 것이 바람직하고, 이러한 용량은 전임상 및 임상을 통하여 결정할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 재조합 아데노바이러스를 포함하는 조성물에 의한 면역반응 증진시키는 방법 또는 종양세포의 증식을 억제시키는 방법을 제공한다.
상기 재조합 아데노바이러스의 처리는 면역증강을 위한 목적으로 사용될 수 있으며, 특히 모든 종류의 암, 예를 들어 신장암, 간암, 두경부암, 피부암, 위암, 유방암 등에 실시할 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양세포에 전달했을 때 많은 양의 인터루킨-18 단백질을 발현 및 세포밖으로 분비시킬 수 있는 복제불능의 바이러스로서, 이때 과량 발현되는 인터루킨-18 단백질은 세포성 면역반응을 유도하는 사이토카인으로 작용하여 종양세포에 대한 신체 면역 반응을 촉진, 유도하게 된다
Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18 및 Ad.hIL-18CPP32-를 각각 종양세포에 처리한 경우 종양증식이 억제되었다.(도 5, 도 6) 특히, Ad.GMmIL-18는 Ad.promIL-18에 비하여 보다 강한 항암효과를 보이므로, 인터루킨-18의 세포외 분비가 항암효과에 중요함을 알 수 있다. 또한, 종양을 가진 쥐에 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18 및 Ad.ICE + Ad.hIL-18CPP32-를 각각 처리하면 암세포 특이적인 T 임파구의 세포독성이 증가되고, Th1 사이토카인이 유도되며, NK 세포활성이 증가됨을 관찰할 수 있다.(도 7, 도 8)
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인터루킨-18 유전자 클로닝
(1-1) 생쥐의 인터루킨-18 유전자 클로닝
생쥐의 대식세포인 RAW 세포를 배양하고 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머세트로 RT-PCR을 실시하여 인터루킨-18 유전자를 증폭시켰다. PCR 산물 중 약 500 bp의 DNA를 분리하여 pBluescriptSK에 클로닝하고, 유전자 서열분석과 제한 효소 처리 분석을 통해 생쥐의 인터루킨-18 유전자(GenBank accession number NM_E17139)임을 확인하였다.
(1-2) 분비신호서열을 포함하는 생쥐 인터루킨-18 유전자 제조
생쥐의 인터루킨-18 단백질(GenBank accession number NP_032386)은 카스파제-1에 의해 1에서 35번(아스파틴 산)의 아미노산이 잘리고, 36(아스파라긴)번에서 192번의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 활성을 나타낸다. 이에 생쥐의 인터루킨-18 유전자에서 1번에서 35번의 펩타이드에 해당하는 DNA 부분(GenBank accession number NM_008360의 1번에서 269번까지의 염기서열을 포함하는 부분)이 제거된 서열번호 2의 성숙 인터루킨-18 유전자에 GM-CSF(GenBank accession number X03221)의 31 ~ 82번의 세포외 분비 신호서열(서열번호 3)를 5'말단에 연결하였다.
(2) 사람의 인터루킨-18 유전자 클로닝
사람의 간 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 사용하여 사람 인터루킨-18(GenBank accession number NM_E17135)을 클로닝하였다.
(2-1) 사람 인터루킨-18 유전자 변이체 제조
사람의 인터루킨-18 단백질(GenBank accession number BAA08706)은 카스파제-3에 의해 잘려 불활성화 되므로, 71번과 76번의 아스파르트산을 글루타민산을 치환시킨 서열번호 5의 변이체 단백질을 제조하기 위하여, 71과 76번에 해당하는 염기서열 GAT를 GAG로 치환하여 서열번호 6의 뉴클레오타이드를 포함하는 사람 인터루킨-18 유전자 변이체를 제조하였다.
(2-2) 성숙한 사람의 인터루킨-18 유전자 변이체 제조
위 (2-1)에서 제조한 71번과 76번 아스파틴 산이 글루타민산으로 치환된 사람의 인터루킨-18 단백질 변이체는 카스파제-1에 의해 1번에서 36번(아스파틴 산)의 아미노산이 잘려져서 활성화되어지므로 생쥐의 신호서열을 연결하는 것과 마찬가지방법으로 37번의 아미노산 앞쪽에 신호서열을 연결하였다. 이에 사람의 인터루킨-18 변이체 유전자(서열번호 6)에서 1번에서 36번의 펩타이드에 해당하는 DNA 부분의 1번에서 285번까지의 염기서열을 포함하는 부분이 제거된 서열번호 7의 성숙 인터루킨-18 유전자(서열번호 9)에 preprotrypsin 효소의 세포외 분비 신호서열(서열번호 8)를 5'말단에 연결하였다.
실시예 2: 재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터 및 재조합 바이러스의 제조
(1) 재조합 아데노바이러스 트랜스퍼벡터의 제조
생쥐 인터루킨-18 유전자(GenBank accession number NM_E17139), 사람 인터루킨-18 유전자(GenBank accession number NM_E17135), 분비신호서열을 포함하는 생쥐 인터루킨-18 유전자(서열번호 3 + 서열번호 2) 및 사람 인터루킨-18 유전자변이체(서열번호 6)를 각각 pcDNA3(Invitrogen 제품)에 클로닝하고, 단백질 발현을 확인하였다.
생쥐 인터루킨-18 유전자(GenBank accession number NM_E17139), 사람 인터루킨-18 유전자(GenBank accession number NM_E17135), 분비신호서열을 포함하는 생쥐 인터루킨-18 유전자(서열번호 3 + 서열번호 2) 및 사람 인터루킨-18 유전자 변이체를 각각 아데노바이러스 트랜스퍼벡터인 pXCX2.dCMV(한국생명공학연구원 임동수박사 실험실에서 제작된 벡터)에 클로닝하여 pX.dCMV.mIL-18, pX.dCMV.GMmIL-18, pX.dCMV.hIL-18, pX.dCMV.hIL-18CPP32- 및 pX.preprotrypsin.hIL-18CPP32-를 제작하였다.(도 1)
(2) 재조합 아데노바이러스의 제조
5종류의 벡터를 각각 아데노바이러스 모체벡터인 pBHG10(Microbix Biosystem Industry, Canada)과 함께 293 세포주에 코트렌스펙션(cotransfection)하였고, 상동재조합방법을 통해 아데노바이러스 E1 부위에 인터루킨-18 유전자가 도입되도록 하였다.(도 2) 제조된 재조합 바이러스는 각각 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18, Ad.hIL-18CPP32- 및 Ad.preprotrysin.hIL-18CPP32-라 명명하였고 Ad.GMmIL-18을 유전자은행에 KCTC10062BP로 기탁하였다.
각 바이러스에 삽입된 생쥐 인터루킨-18 유전자(GenBank accession number NM_E17139), 사람 인터루킨-18 유전자(GenBank accession number NM_E17135), 분비신호서열을 포함하는 생쥐 인터루킨-18 유전자(서열번호 3 + 서열번호 2) 및 사람 인터루킨-18 유전자 변이체는 제한효소 절단과 PCR분석을 통해 확인하였다.
(3) 아데노바이러스의 증식과 타이터의 결정
바이러스를 증식시키기 위하여 인체 293 세포주를 사용하였다. 293 세포주는 10 % FBS가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였다.
5 MOI의 바이러스를 혈청이 없는 DMEM 배지 0.8 ml에 섞은 후 90 % 세포가 가득찬 293 세포주에 배양액을 제거하고, 바이러스 용액을 넣어 37 ℃에서 1시간 감염시켰다. 이때 20분 간격으로 배양접시를 기울여 주면서 바이러스 배양액이 세포 전체에 골고루 접촉되도록 하였다. 1시간 후 바이러스 감염액을 제거하고 새로운 배양액을 가하였다. 24-36시간 배양후 CPE(cytopathinc effect)가 관찰되었다. CPE는 세포가 둥글게 되면서 배양접시에서 떨어져 나오는 상태로 확인할 수 있었으며, CPE가 나타난 후 배지를 제거하고 약 1-2ml의 FBS가 들어있는 DMEM 배양액에 세포를 긁어서 모았다. 세포는 -70 ℃와 상온에서 동결/해동과정을 3번 수행하였다. 원심분리로 상층액만 모아서 바이러스 타이터 결정에 사용하였다. 10 mm 배양접시에서 약 106에서 1010까지 다양하게 바이러스들이 얻어졌고, 증식된 바이러스들은 이러한 상태로 실험에 사용하거나 -20 ℃에서 장기간 보존하였다.
바이러스 타이터는 60 mm 배양접시를 사용하여 아가 오버레이(agar overlay) 방법으로 플라크 에세이에 의해 결정하였다. 바이러스 원액을 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9의 농도로 혈청이 없는 배지에 단계적으로 희석하였다. 희석된 바이러스를 0.4 ml씩 상기와 같은 방법으로 293 세포주에 감염시키고, 1 % 검 아가(gum agar)가 포함된 혈청이 있는 배지를 5ml씩 세포위로 붓고 37 ℃에서 배양하였다. 감염 후 4-5일째 지나서 검 아가가 포함된 배지를 다시 한 번 첨가해 주었다. 보통 바이러스의 플라크는 5일에서 9일정도 사이에 생기는 것을 육안으로 확인할 수 있어서 타이터를 결정할 수 있었다.
실시예 3: 재조합 인터루킨-18의 발현 검증
재조합 아데노바이러스의 단백질의 발현을 확인하기 위해서 인체 자궁암 세포주인 HeLa를 이용하였다. HeLa 세포는 10 % FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.
HeLa 세포를 배양접시에 90% 이상으로 배양하고, Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18, Ad.hIL-18CPP32- 및 대조군 바이러스 Ad.GFP를 각각 50 MOI로 2시간 감염시켰다. 37 ℃에서 48시간 동안 배양하여 단백질들이 충분히 발현되도록 하였다.
인터루킨-18 단백질의 발현을 확인하기 위해서 원심분리를 통해 배지와 세포를 분리하였다. 분비된 인터루킨-18은 면역침전 방법으로 확인하였다. 배양배지에 플래그-항체가 고정화된 겔슬러리를 첨가하여 4 ℃에서 4시간 반응시키고, 원심분리하여 겔을 모아서 비드 세척액(40 mM Hepes pH 7.4, 100 mM KCl, 0.1 % NP-40, 0.1 mM DTT) 및 PBS 용액(10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4)으로 차례로 씻어 준 후 SDS-PAGE를 수행하고 PVDF 멤브레인로 단백질을 전이하였다. 멤브레인을 10 % 스킴 밀크가 포함된 PBST(0.05% 트윈 20 포함하는 PBS)용액으로 반응시킨 후 세척하고, 1차 항체인 쥐 항-플래그 항체로 반응시켰다. 멤브레인을 다시 2차 항체인 HRP(horse raddish peroxidase)가 접합된 토끼 항-쥐 항체를 반응시키고, PBST로 세척한 후 ECL 키트(Amersham)을 사용하여 발색반응을 확인하였다.
세포는 PBS 완충액으로 씻어 준 후 RIPA 용해액(10 mM Tris-Cl, pH 8.2, 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소디움 디옥시콜레이트, 0.1 % SDS, 0.15 M NaCl, 0.02 % 소디움 아지드)로 세포를 현탁하였다. 세포를 초음파분쇄한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액 일부를 상기와 같은 방법으로 SDS-PAGE와 면역블롯을 수행하여 인터루킨-18 단백질의 발현유무를 확인하였다.
도 3a 및 도 3b은 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 의하여 발현되는 인터루킨-18 단백질을 확인한 웨스턴블롯 사진이다. 도 3a에서 마커 1은 바이러스를 감염시키지 않은 세포에서 발현된 단백질이고, 마커 2는 대조군 Ad.GFP이고, 마커 3은 Ad.promIL-18이고, 마커 4는 Ad.GMmIL-18이고, 마커 5는 Ad.prohIL-18이고, 마커 6은 Ad.hIL-18CPP32-이다. 도 3b에서 마커 1은 바이러스를 감염시키지 않은 세포에서 발현된 단백질이고, 마커 2는 대조군 Ad.GFP이고, 마커 3은 Ad.preprotrysin.hIL-18CPP32-이고, 마커 4는 Ad.prohIL-18CPP32-이고, 마커 5는 Ad.GMmIL-18이다.
성숙 인터루킨-18은 18 kDa이다. Ad.GFP 바이러스에서는 인터루킨-18이 발현되지 않았고(도 3a 및 도 3b의 마커 2), 그 외 재조합 바이러스에서는 인터루킨-18이 세포내, 외에서 발현되어 존재하였다. 또한 Ad.promIL-18에 비하여 분비서열을 가지는 Ad.GMmIL-18, Ad.preprotrysin.hIL-18CPP32-가 더욱 많은 양의 단백질을 발현하고 세포 외로 분비시켰다.
실시예 4: 재조합 인터루킨-18 단백질의 인터페론 감마 활성 능력 검증.
재조합 인터루킨-18 단백질이 사이토카인으로서 본래의 기능을 지니고 있는지 알아보기 위하여 생쥐 비장세포 (T 세포)의 인터페론 감마 유도 정도를 확인하였다.
HeLa 세포에 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18, Ad.hIL-18CPP32- 및 대조군 바이러스 Ad.GFP를 각각 감염시켜 세포추출물과 배지액을 수득하였다.
생쥐의 비장세포를 추출하여 적혈구와 B세포를 제거하고 T 세포만을배양하였다. 세포추출물과 배지액을 각각 50 ㎕로 생쥐의 비장 (T 세포)에 첨가하여 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양물은 원심분리하여 상층액을 수득하였다.
인터페론 감마의 항체를 상층액에 반응시켜 샌드위치 ELISA 방법(Genzyme)을 실시하여 비장 (T 세포)에서의 인터페론 감마의 생성여부를 확인하였다. 캡쳐 항체로 햄스터 항-쥐 인터페론 감마항체를 150 ng/ml의 농도로 캡쳐 완충액(카보네이트 완충액; 1.59 g의 Na2CO3, 2.95 g의 NaHCO3, 0.2 g의 NaN3, pH 9.6)에 희석하여 웰에 넣어 부착시키고, 3 %의 지방산이 없는 BSA가 포함된 PBST로 웰을 블라킹하고 PBS로 세척하였다. 상층액을 웰에 각각 첨가하고 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 웰을 다시 세척한 후 2차 항체인 바이오틴이 접합된 항-쥐 인터페론 감마를 1 ㎍/ml로 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. HRP이 접합된 스트렙트아비딘을 웰에 첨가하여 반응시키고, 세척하였다. OPD(o-phenylene diamine)를 H2O2와 함께 인산-시트르산 완충액(0.1M 시트르산, 0.2M Na2HPO4)에 혼합하여 각각의 웰에 첨가하여 발색반응을 유도하였다. 2 M H2SO4를 첨가하여 발색반응을 중지한 후 이를 ELISA 리더에서 492 nm의 파장으로 그 흡광도를 측정하였다. 이때 흡광도와 인터페론 양과의 관계를 나타낼 수 있는 표준 곡선을 사용하여 생성되는 인터페론의 양을 측정하기 위해 키트안에 포함된 인터페론 감마를 희석하여 사용하였다.
도 4는 본 발명의 재조합 인터루킨-18 단백질에 의하여 생성된 인터페론 감마의 양을 나타낸 그래프이다. 마커 1은 바이러스를 감염시키지 않은 세포에서 발현된 단백질이고, 마커 2는 대조군 Ad.GFP이고, 마커 3은 Ad.promIL-18이고, 마커 4는 Ad.GMmIL-18이고, 마커 5는 Ad.prohIL-18이고, 마커 6은 Ad.hIL-18CPP32-이다. 도 4에서 Ad.GMmIL-18에서 발현되는 인터루킨-18 단백질이 가장 많은 인터페론 감마를 생성하였으며, 특히 배지로 분비된 인터루킨-18 단백질이 가장 우수한 인터페론 감마 생성율을 나타내었다.
실시예 5: 신장암 세포주(Renca)에 대한 Ad.GMmIL-18의 항암효과 검증.
인터루킨-18에 의한 항암효과를 알아보기 위해 생쥐의 신장암 세포주인 Renca 세포주과 사람의 간암세포주인 Huh-7 세포주를 사용하였다. Renca 세포주는 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 배양하였으며, Huh-7 세포주는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.
신장암 세포주 Renca 세포를 10 %의 FBS가 포함된 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 수거한 후 세포수를 측정하고, 살아있는 세포가 전체의 80 % 이상일 경우 1 X PBS로 세척한 다음 106 세포/ml가 되도록 1 X PBS에 현탁하였다. 현탁액은 BALB/c 생쥐 한 마리당 100 ㎕(105 개의 세포수)씩 피하주사하였고, 7 - 9 일 동안 종양 결절을 형성시켰다.
종양결절이 형성된 15 마리의 생쥐를 3군(한군당 5마리)으로 나누고, 제 1군에는 Ad.promIL-18, 제 2 군에는 Ad.GMmIL-18, 그리고 대조군(제 3 군)으로 Ad.GFP를 각각 종양결절의 직경이 5 mm 되었을 때 결절내로 재조합 바이러스 양이 1 x 109 pfu/100 ㎕ 되도록 주사하였다. 이때 재조합 바이러스는 주사용 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 1mM MgCl2)를 이용하여 희석하였고, 주사량은 각 마리당 100 ㎕ 씩 하였다. 종양의 크기는 장축 x 단축 x 높이/2로 계산하여 그 평균값을 취하였다.
도 5는 종양결절이 형성된 쥐에 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18 및 Ad.GFP를 주사한 다음 시간에 따른 종양 크기변화를 도시한 그래프이다. 도 5에서 인터루킨-18를 발현하는 바이러스(Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18)가 도입된 종양의 크기가 대조군(Ad.GFP:▲)에 비해 현저히 감소하였고, 인터루킨-18 단백질을 세포외로 발현하는 Ad.GMmIL-18(●)가 가장 큰 종양 증식억제효과를 나타내었다.
또한 항암효능을 종양이 완전히 소실된 경우, 종양이 완전히 소실되지는 않았지만 종양의 증식속도가 대조군보다 현저하게 감소하거나 거의 증식하지 않은 경우 및 종양의 증식속도가 대조군에 비해 차이가 없는 경우를 각각 완전 퇴행(Complete regression), 부분 퇴행(Partial regression), 무반응(Unresponse)으로 분류하였다. 항암효능의 유의성은 Student's t test 로 검증하여 P 값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
치료 반응 (%)
완전 퇴행 부분 퇴행 무반응
Ad.GMmIL-18(1x109 pfu) 4/20 (20) 8/20 (40) 8/20 (40)
Ad.GFP(1x109 pfu) 0/20 (0) 4/20 (20) 16/20 (80)
Ad.GMmIL-18의 항암효능이 통계적으로 유의성이 있는지를 조사하기 위하여, 생쥐신장암을 갖는 생쥐 40마리를 두 개의 군으로 나누고 Ad.GMmIL-18 및 Ad.GFP (대조군) 각각을 종양결절내로 주사한 후 21일 간 종양의 소실 및 증식정도를 조사하였다. 항암효능을 종양이 완전히 소실된 경우, 종양이 완전히 소실되지는 않았지만 종양의 증식속도가 대조군보다 현저하게 감소하거나 거의 증식하지 않은 경우 및 종양의 증식속도가 대조군에 비해 차이가 없는 경우를 각각 완전 퇴행(Complete regression), 부분 퇴행(Partial regression), 무반응(Unresponse)으로 분류하였다. 항암효능의 유의성은 Student's t test 로 검증하여 P 값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 대조군은 부분퇴행이 4/20으로서 종양증식억제효율은 20%이었으나, Ad.GMmIL-18은 8/20에서 부분퇴행이, 4/20에서 완전퇴행이 나타나 Ad.GMmIL-18의 종양증식억제효율은 60%이었다. Ad.GMmIL-18의 종양증식억제효과가 대조군에 통계적으로 유의성이 있는지를 조사한 결과 완전퇴행된 경우 P 값이 0.035 이었고, 완전퇴행과 부분퇴행을 함께 통계적으로 처리한 경우 P 값이 0.0098이었다. 이 결과는 Ad.GMmIL-18의 종양성장억제 효능이 통계적으로 유의성이 있음을 제시해 준다.
실시예 6: 간암세포주(Huh-7)에 대한 Ad.hIL-18CPP32-의 항암효과 검증
BALB/c-누드 생쥐에 Huh-7 생쥐 간암세포주를 피하에 주사하여 종양결절을 형성시킨 후 종양결절의 직경이 4 - 5 mm 되도록 하였다.
생쥐를 3군으로 나누고, 제 1 군에는 Ad.hIL-18CPP32- + Ad.ICE, 제 2 군에는 Ad.ICE, 제 3 군에는 Ad.GFP(대조군)으로 각각 10마리씩 사용하였다. 종양결절에 재조합 바이러스를 주입하고, 종양결절 크기변화를 측정하였다.
도 6은 간암세포에 의하여 종양결절이 형성된 생쥐에 재조합 바이러스를 주입하여 종양결절의 크기를 측정한 그래프로, Ad.hIL-18CPP32-와 Ad.ICE의 병합요법을 한 경우(●)에서 가장 큰 종양성장 억제효과를 나타내었다.
Ad.hIL-18CPP32- + Ad.ICE로 처리한 경우의 종양증식억제효과가 통계적으로 유의성이 있는지를 Ad.GFP (대조군)로 처리한 경우와 비교분석한 결과 P 값이 0.0098이었다. 이 결과는 Ad.hIL-18CPP32- + Ad.ICE의 종양성장억제 효능이 통계적으로 유의성이 있다는 것을 제시해 준다.
치료 반응 (%)
완전 퇴행 부분 퇴행 무반응
Ad.hIL-18CPP32- + Ad.ICE(5x108 pfu + 5x108 pfu) 2/10 (20) 3/10 (30) 5/10 (50)
Ad.ICE(1x109 pfu) 0/10 (0) 1/10 (10) 9/10 (90)
Ad.GFP(1x109 pfu) 0/10 (0) 0/10 (0) 10/10 (100)
5 마리중 종양결절의 완전 퇴행이 1 마리에서 보였으며 2 마리에서 부분 퇴행을 보였고 종양증식억제효율은 Ad.hIL-18CPP32- + Ad.ICE의 경우 50%이었고, 대조군 Ad.ICE의 경우 10% 이었다 (표 2).
실시예 7: 세포 독성 임파구 유도능력 검증
Ad.GMmIL-18와 Ad.GFP를 각각 생쥐의 피하에 생긴 종양결절내로 주입하였다. 21일 후, 종양증식이 억제된 생쥐의 비장세포를 무균조작을 통하여 금속 메쉬로 단세포 혼탁액으로 만든 후 적혈구세포를 용해(8.3g/L 암모니움 클로라이드)시켰다. 비장세포는 T 세포 배지(RPMI, Eeagle-Hanks amino acid, FBS, L-글루타민, 베타-머캡토에타놀, 페니실린-스트렙토마이신)로 현탁한 다음 웰당 1 x 107 세포가 되도록 12개 웰에 첨가하였다. Renca 세포를 트립신-EDTA로 혼탁하고, 미토마이신 C(mitomycin C. 50 ㎍/ml)으로 20분간 37 ℃에서 배양하였다. 배양액으로 3-4 회 세척한 후 T 세포 배지로 현탁하여 비장세포와의 비율이 10:1이 되도록 웰에 첨가하여 배양하였다. 3-4일 후에 자극된 T 세포 (effector 세포)를 51Cr(100 μCi/106 세포; Dupont)으로 표지(90분)한 Renca 세포 (target 세포)와 각각 11:1, 33:1, 100:1가 되도록 하여 96개 U자 바닥 플레이트에 혼합하여 최종 부피 200 ㎕ 되도록 섞어주었다. 37 ℃에서 3-4 시간 배양하고, 배양액을 원심분리하였다. 상층액 100 ㎕를 취하여 감마 측정기(gamma counter)로 측정하여 세포 용해도 백분율(% specific lysis)을 계산하였다.
도 7은 Ad.GMmIL-18 또는 Ad.GFP로 활성화된 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 생성을 세포용해도 백분율로 나타낸 그래프이다. Ad.GMmIL-18로 처리한 생쥐에서 암세포 특이적인 세포독성 임파구 (CTL 생성)가 유도되었다는 것을 알 수 있었다.
실시예 8: 자연 살상 세포(natural killer cell: NK cell)의 활성촉진 능력 검증
AdGMmIL-18, AdhIL-18CPP32-, AdGFP 및 AdICE를 각각 생쥐의 종양결절내로 주입한 후 3 주째 종양이 억제된 비장세포를 단세포 현탁액으로 만든 다음 비장세포를 T 세포 배지로 현탁한 후 자극된 T 세포(effector T cell)로 사용하였다. 자극된 T 세포와 51Cr(100μCi/106 세포; Dupont)으로 표지(90분)한 YAC-1 세포 (표적세포)의 비가 11:1, 33:1, 100:1가 되도록 하여 96개 U자 바닥 플레이트에 혼합하여 최종 부피가 200 ㎕ 되도록 섞어준 후 37 ℃에서 3-4 시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 100 ㎕을 취하여 감마 카운터로 측정하여 세포용해도 백분율 (% specific lysis)을 계산하였다. 그 결과 인터루킨-18을 포함하는 아데노바이러스로 처리한 생쥐에서 NK 세포의 활성이 현저하게 증가되어 있는 것을 확인 할 수 있었다(도 8).
본 발명의 인터루킨-18을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 면역세포들의 활성을 촉진함으로써 암세포를 사멸시키거나 암세포의 성장을 억제시키는데 탁월한 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 면역증강 및 암을 치료하기 위한 유전자 치료에 이용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 인터루킨-18 단백질의 카스파제-3 절단부위가 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 트립토판, 티로신 및 발린으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 인터루킨-18 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인터루킨-18 단백질은 성숙 인터루킨-18 단백질 또는 인터루킨-18 전구체인 것인 인터루킨-18 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 카스파제-3 절단부위는 사람 인터루킨-18 단백질의 71번 또는 76번의 아스파르트산인 것인 인터루킨-18 단백질.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 카스파제-3 절단부위는 쥐 인터루킨-18 단백질의 69번 아스파르트산인 것인 인터루킨-18 단백질.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 인터루킨-18 단백질의 카스파제-3 절단부위가 글루타민산으로 치환된 것인 인터루킨-18 단백질.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 인터루킨-18 단백질은 서열번호 4의 폴리펩타이드,서열번호 5의 폴리펩타이드, 서열번호 10의 폴리펩타이드 및 서열번호 11의 폴리펩타이드로 구성되는 군으로부터 선택된 것인 인터루킨-18 단백질.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 인터루킨-18 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 인터루킨-18 유전자.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 인터루킨-18 유전자는 서열번호 6의 염기서열, 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택된 염기서열을 포함하는 것인 인터루킨-18 유전자.
  9. 세포외분비 신호서열 및 성숙 인터루킨-18 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 성숙 인터루킨-18 유전자는 야생형 성숙 인터루킨-18 단백질 또는 카스파제-3 절단부위가 글루타민산으로 치환된 성숙 인터루킨-18 단백질을 코딩하는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 성숙 인터루킨-18 유전자는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 2의 염기서열, 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택된 염기서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 세포외분비 신호서열은 과식구 대식 세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor: 이하 'GM-CSF'라 함) 신호서열 또는 preprotrysin 효소의 신호서열(Invitrogen)인 것인 폴리뉴클레오타이드.
  13. (a) 인터루킨-18 유전자의 발현이 작동가능하도록 연결된 프로모터,
    (b) 인터루킨-18 유전자;
    (c) 폴리아데닐레이션 신호서열
    을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 인터루킨-18 유전자는 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 인터루킨-18 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 인터루킨-18 유전자는 서열번호 6의 염기서열 또는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것인 인터루킨-18 유전자.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 인터루킨-18 유전자는 제 9항 내지 제 12항의 폴리뉴클레오타이드인 것인 재조합 아데노바이러스.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 Ad.promIL-18, Ad.GMmIL-18, Ad.prohIL-18, Ad.hIL-18CPP32- 및 Ad.preprotrypsin.hIL-18CPP32-로 구성되는 군으로부터 선택된 것인 재조합 아데노바이러스.
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