CN108026181B

CN108026181B - 一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR、其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN108026181B
Application number: CN201580018308.1A
Authority: CN
Inventors: 陈守春; 徐琦; 闫娟; 黄先洲; 魏利佳; 胡海洋
Original assignee: Chengdu Huachuang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Huachuang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: US20180170993A1; EP3348578A1; EP3348578B1; WO2017066963A1; CN108026181A; EP3348578A4

Abstract

本发明属于基因工程药物领域，提供了一种TRAIL的突变蛋白MuR6S4TR、其制备方法及用途。该突变蛋白氨基酸序列N端的第2‑11位由穿膜肽序列RRRRR(R6)和凋亡抑制因子XIAP的结合序列AVPI组成，第12‑169位为TRAIL蛋白肽段(124‑281aa)，具体序列如SEQ ID NO:2所示。

Description

一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程药物领域，特别涉及一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR、制备方法及应用，本发明中的TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR对于多种不同类型的肿瘤具有优越的治疗作用，是极具潜力的新一代高效诱导肿瘤细胞凋亡药物。

背景技术

1、Apo 2L/TRAIL用于肿瘤治疗的进展及意义

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)为肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)超家族的成员，其基因序列分别于1995年由Wiley等人和1996年由Pitti等人独立克隆获得，后者将其命名为凋亡素2配体(Apo 2Ligand，Apo 2L)。后来的研究证实，Apo 2L与TRAIL实质上是同一种蛋白质，因此习惯上可将其称为Apo 2L/TRAIL。TRAIL的功能首先是作为生物体先天性或获得性免疫的调节剂，其次在细胞外源性凋亡途径中作为免疫监视发挥抗肿瘤作用。TRAIL的最大优点是可以选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞几乎没有毒性。研究资料表明，无论在体外还是体内，Apo 2L/TRAIL对于各种来源的人肿瘤细胞系，包括结(直)肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、白血病以及多发性骨髓瘤等都具有诱导凋亡的作用。

从发现至今的近20年时间里，TRAIL一直被作为一种重要的潜在抗肿瘤药物开发，TRAIL的临床实验在国外已进入Ⅱ期，在国内已完成Ⅲ期。大量体内外试验均证实，TRAIL具有肿瘤特异性细胞毒性，尤其当它与小剂量化疗药物联用时即表现出明显的协同和增效作用。相反，研究发现机体中凋亡机制的缺失导致的TRAIL耐受与肿瘤细胞的快速生长和转移明确相关。

肿瘤是一组高度异质性的疾病，传统上按照组织器官、病理改变的分型方法已经不适合肿瘤的诊疗，目前的研究方向在于阐明不同肿瘤细胞的基因表达、分子分型，给予患者更具针对性的治疗。对于抗肿瘤药物认识的深入使人们了解到，无论细胞毒性药物、分子靶向药物还是单克隆抗体，其发挥作用的过程中均涉及到肿瘤细胞凋亡途径的激活。诱导肿瘤细胞凋亡的信号通路途径是这些药物发挥作用的枢纽和中心环节，而凋亡逃避正是肿瘤发生发展以及耐药的重要机制。

2、Apo 2L/TRAIL用于肿瘤治疗的缺陷和对策

最近进展显示，仅依赖Apo 2L/TRAIL治疗多种不同类型的肿瘤仍是远远不够的。尽管重组Apo 2L/TRAIL或TRAIL受体DR4/DR5的激动性单克隆抗体在Ⅰ期临床治疗中取得令人鼓舞的结果，但在随后进行的Ⅱ期临床研究中却没有显示出明确的临床受益。大量研究表明，正常细胞以及大约一半(甚至高达60％)以上的传代肿瘤细胞株对TRAIL表现出耐药。根据Roberta di peitro和Giorgia zauli的综述，Apo 2L/TRAIL对已经研究的92株原代或传代肿瘤细胞中的61株敏感，敏感率为66.3％，而对其余的31株耐药，耐药率为33.7％。TRAIL对正常细胞的耐受有着其生理意义，TRAIL在体内保持着精准的调控，只在生长发育过程中清除衰老退化和转化细胞中发挥作用，而不至于对正常细胞产生杀伤。几乎所有的TRAIL敏感肿瘤细胞在其凋亡信号通路中的各个环节和因素均具有相似的完整和功能，而每一种TRAIL耐药肿瘤细胞均在凋亡信号通路中的一些环节和因素存在缺陷和变异，这些缺陷和变异使得这些耐药的肿瘤细胞凋亡阈值异常升高，较易逃避凋亡清除，从而持续生长增殖。

大量研究证实，单用Apo 2L/TRAIL对于许多肿瘤细胞并不产生高效的抑制和杀伤作用。究其原因，肿瘤细胞凋亡信号通路是一个十分复杂庞大的系统，其中既包含许多促凋亡因素，又包含大量的凋亡抑制因子，这两方面因素的相互作用决定了肿瘤细胞的最后归宿。凋亡信号通路的健全和功能是肿瘤细胞凋亡的必要条件，但并不是充分条件。多种不同类型的药物、分子或基因干预均可增强TRAIL对肿瘤细胞的敏感性，这些药物包括不同类型的化疗药物、天然产物、小分子激酶抑制剂等。他们分别通过强化细胞外源性凋亡信号通路(如上调DRs表达，增强DRs在细胞膜上脂筏微区域的聚集和重分布，增强TRAIL/DRs复合物在细胞膜的内吞，促使DISC向TRAIL/DRs复合物的募集，激活起始阶段Caspase(Caspase 8)的活性，抑制凋亡拮抗因子FLIP、XIAP和IAPs的活性等)或线粒体凋亡信号通路(如增强线粒体膜电势的去极化，促使线粒体通透性增加并释放Cyt c、Smac或ARTs，促使Bid裂解为tBid，促使Bax、Bad寡聚化，抑制凋亡拮抗Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、survivin因子等)或抑制其他细胞生存信号通路(如ERK/PI3K/AKt、MEK、Jak-STAT 3、MAPK、NF-κB等)或几条通路的联合而增强TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡活性。

尽管TRAIL及其受体激动性单克隆抗体药物开发过程暂时受挫，但是随着细胞凋亡信号通路途径的完全阐明，凋亡/耐受相互转换关系的完全揭示，基于凋亡信号通路的靶向抗肿瘤药物研发并未停步。目前研究较多的是将TRAIL与细胞毒类的联合应用，但大多数实验显示这种联合仅能对TRAIL相对敏感的肿瘤细胞产生明显的协同和增效作用，而不能完全逆转多种不同耐药机制产生的耐药现象。由于TRAIL与细胞毒类药物分属两类不同药物，存在药物品种剂量、给药途径、作用方式的不同和差异，开发成单一、稳定、可控的新药可能性较小，且TRAIL与细胞毒类药物联用后，其毒副作用依然存在，故其优势并不明显。

3、Apo 2L/TRAIL双靶点突变蛋白的设计思路

研究表明，凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein，IAPs)中的多个蛋白是肿瘤细胞凋亡的强力抑制剂。IAPs的过表达发现于许多耐药性肿瘤细胞中，其中X-连锁凋亡抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP)是IAP家族中的重要成员，对于多种肿瘤细胞的凋亡具有负性调控作用。

Ducketl等人于1996年克隆了XIAP基因，该基因编码一个497个氨基酸的蛋白质，分子量约为57KD。XIAP属于凋亡抑制蛋白家族中一个重要成员，因其序列中含有多个杆状病毒重复序列片段(Baculovirus IAP repeats，BIRs)，是一个强力的凋亡信号抑制因子。XIAP在多种耐药的肿瘤细胞中高水平表达。

Du等人于2000年鉴定和纯化了一种蛋白质，将其命名为第二线粒体衍生的凋亡酶激活剂(Second mitochondrial-derived activator of caspase，Smac)，该蛋白在其他文献中又被称为低pI凋亡结合蛋白直接抑制因子(Direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI，DIABLO)。Chai等人研究显示，Smac不仅促进前凋亡酶3(Procaspase-3)的裂解活化，而且增强成熟凋亡酶3(Caspase-3)的酶活性，上述过程均依赖Smac与IAPs的特异性作用。Smac的晶体结构研究证实，Smac N端的氨基酸序列与其功能存在着密切的关系，Smac N端7个氨基酸单独应用在体外即可促进前凋亡酶3的活化。为进一步理解Smac与IAPs作用的分子结构基础，Liu等人和Wu等人分别测定了XIAP与Smac N端具有完整功能的9个氨基酸的分子结构。结果发现，Smac N端4个氨基酸(Ala-Val-Pro-Ile，AVPI)可识别XIAP蛋白BIR3区域表面小沟。这个结果提示，Smac N端序列可代表整个蛋白质行使抑制XIAP蛋白的完整功能。由于Smac N端4个氨基酸与凋亡酶9(Caspase-9)N端4个氨基酸序列具有同源性，Smac亦能竞争性结合XIAP的BIR3区域而破坏凋亡酶9与XIAP BIR3片段的连接从而释放Caspase-9，增强Caspase-9的活性。

线粒体启动的下游凋亡事件在TRAIL耐受肿瘤细胞的药物抵抗发生过程中具有重要作用。Smac/DIABLO激动剂增强TRAIL耐药肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，主要是因为Smac/DIABLO激动剂强有力地抑制了耐药性凋亡抑制蛋白IAPs家族，尤其是XIAP活性，从而增强了线粒体凋亡途径的信号转导。

目前已有多种方法用于抑制IAPs家族蛋白活性，其中Smac激动剂通过抑制XIAP蛋白活性，从而提高耐药性肿瘤细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性。目前采用Smac激动剂与TRAIL联用研究涉及的肿瘤类型主要有肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肾癌、黑色素瘤、白血病、鼻咽癌、卵巢癌等多种。

Smac激动剂包括：

(1)Smac穿膜肽融合蛋白

Roa等观察到Smac-Tat肽通过抑制XIAP的活性，从而增强耐药性神经胶质瘤细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性。Yang等观察到，Smac N7(R8)能靶向IAPs蛋白家族，尤其是XIAP，逆转耐药性肺癌细胞H460对TRAIL的耐受。

(2)Smac基因的病毒载体

Khorashadizadeh等采用hA-MSC-ST载体转染细胞，分泌一种新型细胞穿膜形式Smac和三聚体TRAIL，能明显增强耐药性乳腺癌细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性。Pei等采用腺病毒载体ZD55-Smac与ZD55-TRAIL联用，能明显降低肝癌细胞中XIAP水平，完全清除荷瘤动物移植瘤肿瘤细胞。Wang等采用包含TRAIL-IETD-Smac的腺病毒载体ZD55-TRAIL-IETD-Smac，能完全清除肝癌移植瘤模型动物的肿瘤细胞。

(3)Smac N末端4或7肽

Kandasamy等采用预先给予耐药性肿瘤细胞Smac N端7肽处理，观察到可以逆转耐药性肿瘤的药物耐受，恢复其对TRAIL的敏感性。Mao等观察到，Smac N7与TRAIL联用可明显增强耐药性卵巢癌细胞A2780移植瘤模型对TRAIL的敏感性，二者具有明显的协同增效作用。Yang等观察到，Smac N7(R8)能靶向IAPs蛋白家族，尤其是XIAP，逆转耐药性肺癌细胞H460对TRAIL的耐受。Guo等采用Smac N端7肽(Smac-7)或N端4肽(Smac-4)均能明显增强TRAIL诱导的caspase 3的PARP裂解活性，促进肿瘤细胞的凋亡。

(4)Smac小分子模拟物

Metwalli等发现Smac模拟物单独应用仅有轻微的抑制膀胱癌细胞的作用，但与TRAIL联用能明显增强TRAIL的抑瘤作用。Wu等观察到Smac模拟物与TRAIL联用能减少鼻咽癌细胞SP中肿瘤干细胞样(CSC-like)细胞比例，抑制肿瘤干细胞克隆和微球形成，在动物移植瘤模型上，联合用药可引起干细胞样肿瘤细胞的清除。Allensworth等观察发现，一种双价Smac模拟物Birinapant单独应用可诱导TRAIL耐药SUM 190(Erb2过表达)乳腺癌细胞死亡，增强TRAIL敏感SUM149(三阴性，EGFR活化)乳腺癌细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性。Rockbrader等观察到Smac模拟物能明显增强TRAIL对MDA-MB-231、T47D和MDA-MB-453乳腺癌细胞的抑制作用。Huang等观察发现，联合使用TRAIL与Smac模拟物可明显增强诱导KRAS突变肺癌细胞凋亡能力而对正常细胞几乎没有影响，体内实验观察到荷瘤动物肿瘤负荷的明显降低。Lu等观察到Smac模拟物SM-164与TRAIL联用，无论对于TRAIL敏感细胞还是TRAIL非敏感细胞，包括乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌均能发挥高度的协同增效作用，在乳腺癌动物体内模型上，SM-164与TRAIL联用能引起动物移植瘤的快速清除。此外，Smac模拟物能诱导耐药性卵巢癌、肝癌、白血病细胞及黑色素瘤细胞的死亡，Smac模拟物能克服TRAIL导致的NF-κB活性增高，具有同时抑制NF-κB活性的作用。

(5)Smac siRNA

Vogler等通过RNA干扰敲除XIAP基因的方法能与TRAIL发生协同增效，诱导胰腺癌细胞凋亡。在两项胰腺癌细胞动物体内移植瘤模型实验中，通过XIAP siRNA抑制与TRAIL联合可获得移植瘤的完全消退。Chawla-Sarkar等观察到在黑色素瘤细胞中，siRNA干扰XIAP或Survivin具有最强的抑瘤作用，同样的结果也在肾癌细胞中观察到。

(6)Smac-TRAIL融合蛋白

Jerzy等将Smac N端8肽(AVPIAQKP)、R7(RRRRRRR)穿膜肽结构、MMP2及MMP9和尿激酶酶切位点(PLGLAGRVVR)序列、TRAIL(95～281aa)序列编码cDNA顺序连接，克隆于原核表达载体pET30a，得到重组表达载体pET30a-AD-O53.2。该表达载体转化表达大肠杆菌BL21(DE3)，获得良好表达，通过离子交换纯化得到目的蛋白。融合突变蛋白O53.2对于大多数敏感细胞(包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌和泌尿系统肿瘤等)的半数致死剂量为fmol级，而对非转化的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)、人或鼠肝细胞没有毒性。该融合蛋白对于动物耐受性良好，在移植瘤动物模型上能明显抑制结直肠癌和肺癌细胞的生长。

TRAIL-Smac双靶点联合的方法治疗多种不同类型的肿瘤，在体内外均证实可明显增强多种不同类型肿瘤细胞或肿瘤移植瘤模型对药物的敏感性，增强其抗肿瘤的活性，而对正常细胞较少毒性。

上述TRAIL与Smac联合治疗方法尽管获得了一定的效果，但离临床应用仍有较远的距离。在小分子Smac激动剂药物的开发进程中，受制于小分子药物的安全性，与TRAIL两类不同药物的差异，单独使用的便利性，临床疗效的稳定性等因素的制约，不是一种最佳的药学实现方式。基于基因治疗的Smac激动策略，由于基因治疗潜在的安全性问题，目前仍有大量关切有待阐明，很长一段时间内仍停留在基础研究阶段，成药的可能性小。

发明内容

文献研究表明Smac N4具有完整Smac蛋白的功能，是多种耐药性肿瘤细胞中主要存在的TRAIL耐药的关键凋亡拮抗因子XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)的强有力的抑制因子。因此我们设想，在TRAIL穿膜肽样突变体TRAIL-MuR6的基础上，采用组合生物学的手段和方法，在紧邻TRAIL-MuR6的RRRRRR(R6)序列后，将原TRAIL序列中的QRVA突变为Smac N端4肽AVPI，将新构建的突变蛋白命名为TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR。TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR同时针对肿瘤细胞凋亡的细胞外受体凋亡途径和多种耐药性肿瘤细胞的凋亡抑制因子XIAP，具有双靶点明确的协同增效作用。多靶点组合的作用方式，符合诱导肿瘤细胞凋亡药物设计的最新思想，对于XIAP高表达的耐药性肿瘤具有更好的治疗效果。在药物结构设计中主动地引进了XIAP基因表达的生物分子标记物，优选最佳分子表型的肿瘤类型，可望极大地提高抗肿瘤的临床疗效。

本发明是在TRAIL穿膜肽样突变体TRAIL-MuR6(PCT/CN2015/073524：TRAIL穿膜肽样突变体MuR6、制备方法及应用)序列的基础上，选择性地将MuR6序列中第2～7位RRRRRR(R6)之后的第8～11位氨基酸序列由谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、丙氨酸(QRVA)顺序突变为Smac蛋白N端4肽，即丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸(AVPI)序列，使得新的突变蛋白既具有穿膜肽样突变体的性能，又具有第二线粒体衍生的凋亡酶激活剂(Secondmitochondrial-derived activator of caspase)的活性。我们将新的突变蛋白命名为TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR。该蛋白同时针对肿瘤细胞凋亡的细胞外受体凋亡途径和多种耐药性肿瘤细胞的凋亡抑制因子XIAP，具有双靶点明确的协同增效作用。

针对现有技术的缺陷，本发明的目的涉及一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR、其制备方法及其应用的三个目的，其中第一个目的是提供一种能够大幅度增强TRAIL野生型蛋白抗肿瘤活性，尤其是能够逆转多种耐药肿瘤细胞对TRAIL野生型蛋白耐药的新型TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR。制备的突变蛋白既能通过穿透细胞膜直接进入细胞浆而快速起效，又能促进死亡受体/突变蛋白复合物在细胞膜脂筏微区域的聚集和内化，增强外源性凋亡信号途径的转导。MuR6S4TR突变蛋白具有更高的表达效率和更好的结构稳定性。TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR对于各种耐药性肿瘤细胞具有优越的治疗作用，是极具潜力的新一代高效诱导耐药性肿瘤细胞凋亡的药物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR，该突变蛋白是通过选择性地将TRAIL-MuR6序列中的第8～11位氨基酸序列由QRVA改造为AVPI，即第8位由谷氨酰胺突变为丙氨酸，第9位由精氨酸突变为缬氨酸，第10位由缬氨酸突变为脯氨酸，第11位由丙氨酸突变为异亮氨酸，使得突变蛋白N端第2～11位成为既包含穿膜肽序列RRRRRR(R6)，又包含凋亡抑制因子XIAP结合序列AVPI的双靶点突变蛋白。这种突变蛋白的结构设计不同于传统上采用外源性序列融合的蛋白质改造思路，采用内源性突变的方法使原有蛋白获得新的性能，在尽量不改变原有蛋白序列长短、空间构像的前提下，最大程度维护蛋白质的稳定性和生物活性。

进一步的，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

进一步的，编码所述突变蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO：1。

本发明的第二个目的是提供一种上述TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR的制备方法，包括如下步骤：

A、cDNA片段扩增与克隆；

B、表达载体的构建与鉴定；

C、重组TRAIL双靶点突变蛋白的表达；

D、TRAIL双靶点突变蛋白的纯化；

E、TRAIL双靶点突变蛋白的鉴定。

进一步的，步骤B中，表达载体的构建与鉴定步骤包括：

B₁、将原核表达载体中对应的融合标签序列切除；

B₂、将优化后编码TRAIL双靶点突变蛋白的cDNA序列克隆于原核表达载体上以获得高效可溶性非融合表达。

进一步的，步骤B₁中，所述原核表达载体为pET 32a。

进一步的，步骤C中，重组蛋白的表达时，诱导温度为18～30℃。

进一步的，步骤D中，TRAIL双靶点突变蛋白的纯化步骤包括：

D₁、阳离子交换树脂作为第一步纯化以捕获破菌后上清中的目的蛋白；

D₂、高密度苯基疏水作为第二步中度纯化以进一步提高蛋白质纯度和去除内毒素；

D₃、采用阴离子交换树脂作为最终步骤精细纯化以使产品满足工业化放大和将来临床应用所需。

本发明的第三个目的是提供一种上述TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR在抗肿瘤药物中的应用。

本发明诱导肿瘤细胞凋亡的作用机理，TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR既具有穿膜肽样突变体的性能，又具有第二线粒体衍生的凋亡酶激活剂(Smac)的活性。该蛋白同时针对肿瘤细胞凋亡的细胞外受体凋亡途径和多种耐药性肿瘤细胞的凋亡抑制因子XIAP，具有双靶点明确的协同增效作用，对于耐药性肿瘤具有更好的疗效。

本发明的有益技术效果是：

1、全新的蛋白质结构。采用较少位点的突变，在现有成熟蛋白质前体的基础上进行最小化改构，保留了原有野生型蛋白的空间构像和活性基础，大幅度提高了蛋白质的结构稳定性和生物学活性。

2、高的蛋白表达水平及可溶性表达比例。采用高效原核表达载体pET32a的改造形式，表达载体在18～30℃的较宽诱导温度范围内均可获得大大高于TRAIL野生型蛋白的表达水平和可溶性表达比例，可溶性蛋白比例达80％。

3、不同于TRAIL野生型蛋白的纯化制备工艺，工艺的有效性、回收率和产品质量显著提升，由于不采用特异性亲和层析的纯化方法，纯化成本相应降低，可放大潜力显著，能完全满足将来的临床所需。

4、广泛的体内外生物学活性。TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR与TRAIL野生型蛋白相比，在经过检测的几乎所有肿瘤细胞类型中，其抗肿瘤活性均明显提高，尤其对于TRAIL耐药的肿瘤细胞株，能明显逆转TRAIL野生型蛋白的耐受，具有更强的治疗作用。预期MuR6S4TR单用或联用，可用于耐药性结(直)肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌及脑瘤的治疗。

5、完善的作用靶点选择组合。选择将经典的肿瘤细胞凋亡受体激动剂TRAIL经过穿膜肽样突变与线粒体途径凋亡促进剂Smac分子的N端4肽组合，同时激活诱导肿瘤细胞凋亡的细胞外受体途径和细胞内线粒体途径。TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR针对多种耐药性肿瘤细胞中主要存在的TRAIL耐药关键因素，增强肿瘤细胞凋亡的同时强力抑制凋亡拮抗因子XIAP的活性，并同时具有穿透细胞膜进入细胞浆的能力，成为多途径抗肿瘤突变蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为MuR6S4TR-1片段PCR产物电泳图。电泳条件：1％Agarose，电压150V，25min。Lane 1：MuR6S4TR-1PCR产物电泳条带；M：DL2000(条带分子量从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，上样量5μl；PCR产物上样量均为3μl。

图2为MuR6S4TR片段PCR产物电泳图。电泳条件：1％Agarose，电压150V，25min。Lane 1：MuR6S4TR PCR产物电泳条带；M：DL2000(条带分子量从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，上样量5μl；PCR产物上样量均为3μl。

图3为Nde I、EcoR I酶切后胶回收电泳结果图。电泳条件：1％Agarose，电压150V，25min。Lane 1：pET32a酶切后胶回收产物电泳条带；Lane 2：MuR6S4TR酶切后胶回收产物电泳条带；M：GeneRuler 1kb DNA Ladder(条带分子量从上到下依次为：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，上样量5μl；PCR产物上样量均为3μl。

图4为酶切鉴定结果图。电泳条件：1％Agarose，电压150V，30min。Lane1～8：pET32a/MuR6S4TR 1^#～8^#菌种所提取质粒酶切后电泳图；M：GeneRuler1kb DNA Ladder(条带分子量从上到下依次为：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)。鉴定产物上样量均为10μl，Marker上样量为5μl。

图5为pET32a/MuR6S4TR SDS-PAGE电泳图。电泳条件：15％凝胶，200V，35min。Lane1：pET32a/MuR6S4TR诱导前电泳条带，Lane 2：pET32a/MuR6S4TR诱导后电泳条带，Lane 3：pET32a/MuR6S4TR破菌后上清电泳条带，Lane 4：pET32a/MuR6S4TR破菌后沉淀电泳条带，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(条带分子量从上到下依次为：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)，Marker上样量为5μl，其它样品上样量均为20μl。

图6为阳离子交换过程SDS-PAGE电泳图。电泳条件：15％凝胶，200V，50min。Lane1：料液，Lane 2：穿透液，Lane 3：第一步洗脱液，Lane 4：第二步洗脱液，Lane 5：NaOH洗脱液，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(条带分子量从上到下依次为：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)。样品上样量Marker为5μl，其它均为20μl。

图7为高密度苯基疏水过程SDS-PAGE电泳图。电泳条件：15％凝胶，200V，50min。Lane 1：料液，Lane 2：穿透液，Lane 3：第一步洗脱液，Lane 4：第二步洗脱液，Lane 5：NaOH洗脱液，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(条带分子量从上到下依次为：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)。样品上样量Marker为5μl，其它均为20μl。

图8为阴离子交换过程SDS-PAGE电泳图。电泳条件：15％凝胶，200V，50min；Lane1：阴离子交换原液，Lane 2：阴离子交换穿透液，Lane 3：2M NaCl洗脱液，Lane 4：0.5MNaOH洗脱液，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(条带分子量从上到下依次为：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)；样品上样量Marker为5μl，其它均为20μl；

图9为MuR6S4TR Western blot鉴定图。Lane 1：pET32a/MuR6S4TR破菌上清Western blot结果图；Lane 2：pET32a/TRAIL破菌上清Western blot结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

TRAIL双靶点突变蛋白的序列及引物设计

本发明是在TRAIL穿膜肽样突变体TRAIL-MuR6(PCT/CN2015/073524：TRAIL穿膜肽样突变体MuR6、制备方法及应用)序列的基础上，选择性地将MuR6序列中第2～7位RRRRRR(R6)之后的8～11位氨基酸序列由谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、丙氨酸(QRVA)顺序突变为Smac蛋白N端4肽，即丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸(AVPI)序列，突变位点为4处，使得突变体蛋白的N端成为连续6个精氨酸(RRRRRR)之后紧接Smac蛋白N端4肽丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸(AVPI)的编码序列。新的突变蛋白既具有穿膜肽样突变体性能，又具有第二线粒体衍生的凋亡酶激活剂(Second mitochondrial-derived activator of caspase)活性。我们将新的突变蛋白命名为TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR。

编码突变蛋白的cDNA如SEQ ID NO：1，突变蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

引物合成如下：

上游引物：

MuR6S4TR-NdeI-1：

GGTCATATGCGTCGTCGTCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCT

MuR6S4TR-2：

CGTCGTGCTGTTCCGATTGCTCACATCACTGGTAC

下游引物：

TR-Eco-R：

GTTGAATTCTTATTAACCAACAAGGAAAGCACCGAAGAAAG

实施例2

分两步PCR扩增MuR6S4TR基因片段，将片段双酶切后直接与相同酶切的表达载体pET32a连接，连接产物单菌落挑取及鉴定。

引物设计见实施例1，pET32a/MuR6TR模板来自专利PCT/CN2015/073524。

具体的，该pET32a/MuR6TR cDNA序列见SEQ ID No：3。

实验步骤

一、PCR扩增MuR6S4TR目的片段

1、以MuR6S4TR-2/TR-Eco-R引物对扩增MuR6S4TR-1目的片段，根据表1配制反应体系，反应体系50μl。

2、涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

3、PCR扩增反应条件见表2。

4、电泳，照相。

5、将PCR扩增的MuR6S4TR-1目的片段以Omega PCR纯化试剂盒纯化样本，用30μl超纯水洗脱，电泳，照相，以备作为第二轮PCR的模板。

6、以MuR6S4TR-NdeI-1/TR-Eco-R引物对扩增MuR6S4TR目的片段，根据表3配制反应体系，反应体系50μl。

7、涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

8、PCR扩增反应条件见表4。

9、电泳，照相。

10、将PCR扩增的MuR6S4TR目的片段用Omega胶回收试剂盒做胶回收，用50μl超纯水洗脱，电泳，照相，备用。

表1 MuR6S4TR-1PCR反应体系

表2 MuR6S4TR-1PCR反应条件

表3 MuR6S4TR PCR反应体系

表4 MuR6S4TR PCR反应条件

二、目的片段MuR6S4TR与pET32a质粒双酶切后连接

1、用NdeI和EcoRI双酶切载体与目的基因片段，酶切体系见表5，反应体系100μl。

2、将EP管放入多用恒温箱中，30℃，2小时。

3、用OMEGA的胶回收试剂盒做胶回收，载体和目的片段分别用30μl超纯水洗脱。电泳，照相。

4、将胶回收目的片段和载体连接，连接体系见表6。

5、于16℃金属浴孵育过夜。

6、将连接产物10μl加入100μl Top10感受态细胞，冰浴30min。

7、在水浴42℃热击90秒。

8、置冰上孵育2分钟。

9、加入500μl SOC培养基，37℃振荡培养45分钟。

10、转化的感受态细胞离心后，在超净工作台，弃去400μl，余约100μl培养基，将细菌吹匀，全部涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

表5载体与目的基因酶切反应体系

表6载体与目的基因连接反应体系

三、单菌落挑取及酶切鉴定

(一)单菌落挑取

1、准备已灭菌试管40支，已加入氨苄青霉素LB培养基100ml。

2、将培养基分装于各个试管中，每管分装约4ml。

3、在已长好菌落的平皿上，使用经充分灼烧的镊子夹取无菌枪头，挑取平板所长出的菌落8个。将枪头投入装有LB培养基的试管中。

4、将各试管捆扎好，放入摇床夹具上充分固定。37℃、220rpm振摇过夜。

(二)质粒提取

1、将菌液各取1ml分别加入离心管中。10000×g离心1min，尽量吸取上清。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Solution I(预先加入RNAase A)，彻底悬浮细菌沉淀。

3、加入250μl Solution II，温和地混匀，使菌体充分裂解，此时菌液应变得清亮粘稠，并在5min内完成此步骤。

4、向离心管中加入350μl Solution III，立即颠倒混匀，此时出现白色絮状沉淀，13000×g以上离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

5、将步骤5中所得上清均分加入到2个已装入收集管的HiBind Miniprep吸附柱中，注意不要吸出沉淀，10000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6、向收集管中加入500μl Buffer HB，10000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7、向收集管中加入700μl Wash Buffer，10000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8、重复步骤7。

9、将吸附柱重新放回收集管中，13000×g以上离心2min干燥吸附柱，倒掉收集管中的废液。

10、将各吸附柱置于一个新的1.5ml EP管中，向每个吸附膜的中间部位悬空滴加65μl Elution Buffer，室温放置数分钟，13000×g以上离心1min，将质粒溶液收集到1.5mlEP管中。

11、各得到60μl质粒DNA。-20℃保存质粒。

(三)酶切鉴定

1、pET32a/MuR6S4TR质粒用Xba I和EcoR I双酶切。酶切反应体系见表7。

2、将EP管放入多用恒温箱中，37℃，孵育2小时。

3、酶切结束后电泳鉴定。

表7 pET32a/MuR6S4TR质粒酶切反应体系

(四)选择酶切正确的连接成功的菌种，保存甘油菌种，送测序。

实验结果

一、PCR扩增目的片段结果

1、以MuR6S4TR-2/TR-Eco-R引物对扩增MuR6S4TR-1目的基因片段，片段分子量大小均为500bp左右。如图1所示，根据上述PCR反应条件得到目的基因。

2、以MuR6S4TR-NdeI-1/TR-Eco-R引物对分别扩增MuR6S4TR目的基因片段，片段分子量大小均为500bp左右。如图2所示，根据上述PCR反应条件得到目的基因。

二、目的片段分别与pET32a连接及转化结果

(一)理论上MuR6S4TR与pET32a用NdeI和EcoRI双酶切后片段大小分别约为500bp左右和5.4Kb左右，如图3所示，酶切后胶回收均得到单一条带。

(二)MuR6S4TR与pET32a连接及转化结果

1、平皿有菌落长出，密度正常。

2、挑取的单菌落，第二日所有试管长出细菌，密度正常。

3、用酶切方法鉴定质粒，pET32a/MuR6S4TR质粒可用XbaI和EcoRI双酶切鉴定，连接成功质粒酶切后应出现5.4Kb左右载体片段及550bp左右目的片段。如图所示pET32a/MuR6S4TR 1^#～8^#8个样本都为阳性克隆。

实施例3

质粒pET32a-MuR6S4TR表达试验

将在实施例2中获得测序正确的质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，挑取1个单菌进行表达试验，考察表达效果。

实验步骤

一、质粒转化及菌种保存

1、配制LB培养基100ml，121℃灭菌20min。

2、取pET32a-MuR6S4TR质粒1μl加入100μl BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min。

3、在水浴42℃热击90秒。

4、置冰上孵育3分钟。

5、取20μl转化的感受态细胞全部涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

6、次日平板长出菌落后，在平板上挑取两个单菌加入50ml LB(Amp⁺)中，37℃培养过夜。

7、保存甘油菌20支，甘油终浓度15％，-20℃保存。

二、菌种表达

1、取过夜培养的pET32a-MuR6S4TR培养液1000μl接入50ml LB(Amp⁺)培养基中。接种后37℃，250rpm振摇培养3h后降低培养温度至24℃。按1％的比例加入0.1M IPTG诱导培养，诱导前取样0.5ml离心弃去上清，加入50μl H₂O重悬后加入50μl 2×loading buffer制成诱导后电泳样品。

2、诱导过夜后收菌，检测A600值，取样150μl离心弃去上清，加入50μl H₂O重悬后加入50μl 2×loading buffer制成诱导后电泳样品，剩余菌液使用5430R型离心机，12000rpm离心5min。

3、取50ml培养液离心获得菌体，使用8ml 50mM Na₂HPO₄溶液重悬，超声波破菌。破菌条件为：Φ6探头，200W脉冲破菌2s后暂停2s，循环共10min。

4、破菌液取1ml 12000rpm离心10min，分离上清和沉淀，沉淀使用1ml H₂O重悬，上清和沉淀重悬液各取20μl，加入30μl H₂O及50μl 2×loading buffer，制成电泳样品。

5、将制成的电泳样品置于沸水浴中处理10min，使用5430R型离心机，A-45-30-11型转头，12000rpm离心10min，各取上清10μl电泳。

实验结果

实验电泳图见图5，pET32a-MuR5S4TR单菌表达量高。

实验结果显示pET32a-MuR6S4TR目的蛋白表达量高，破菌后上清含有约80％目的蛋白，便于分离纯化。

实施例4

MuR6S4TR蛋白的纯化制备

根据对于MuR6S4TR大量小试工艺的探索，我们建立了MuR6S4TR蛋白纯化工艺，我们使用SP-HP阳离子交换、高密度苯基疏水、阴离子交换穿透三步法批量纯化MuR6S4TR蛋白，以获取样品供体内外活性分析用。

实验步骤

一.菌体破碎及离心

1.取30g MuR6S4TR表达菌体，加入Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、甘油、Tween 20、DTT及NaCl，使以上物质终浓度分别为20mM、5％、0.1％、1mM、600mM，另加入H₂O使总体积达到80ml。

2.将菌液进行超声波破菌，破菌条件为：使用Φ10探头，500W脉冲破菌2s后暂停2s，共破菌15min。

3.使用5430R型离心机，F-35-6-30型转头，7850rpm离心40min，取上清，使用0.45μm滤膜过滤后作为上柱样品。

二.蛋白质纯化溶液及柱准备

1.配制如下溶液：

(1)阳离子交换缓冲液A：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，800mM NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，调节pH至7.0。

(2)阳离子交换缓冲液B：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，1M NaCl，5％甘油，0.1％Tween20，1mM DTT，调节pH至7.0。

(3)阳离子交换洗脱液：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，1.4M NaCl，5％甘油，0.1％Tween20，1mM DTT，调节pH至7.0。

(4)0.5M NaOH。

(5)苯基疏水缓冲液A：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，30％饱和度(NH₄)₂SO₄，1.4M NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，调节pH至7.0。

(6)苯基疏水缓冲液B：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，24％饱和度(NH₄)₂SO₄，1.4M NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，调节pH至7.0。

(7)苯基疏水洗脱液：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，700mM NaCl，5％甘油，0.1％Tween20，1mM DTT，调节pH至7.0。

(8)阴离子交换缓冲液：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，60mM NaCl，0.3M甘氨酸，调节pH至7.0。

2.使用SP Sepharose Fast Flow凝胶层析柱，使用5CV纯水冲洗柱上残存的乙醇，然后使用5CV相应的平衡缓冲液平衡。

3.使用MPC HCT XK16Grad凝胶层析柱，使用1CV纯水冲洗稀释柱上的NaOH，然后使用5CV预平衡缓冲液平衡，再使用平衡缓冲液平衡。

4.使用Sephadex G-25medium凝胶层析柱，使用5CV纯水冲洗柱上残存的乙醇，然后使用5CV阴离子交换缓冲液平衡。

5.使用Q Sepharose Fast Flow凝胶层析柱，使用5CV纯水冲洗柱上残留的乙醇，然后使用5CV阴离子交换缓冲液平衡。

三.阳离子交换纯化

按照如下纯化步骤进行阳离子交换纯化。纯化期间收集所有穿透及洗脱成分以备电泳分析：

1.平衡：使用阳离子交换A缓冲液平衡SP Sepharose Fast Flow层析柱至UV稳定。

2.样品制备及上样：取破菌离心上清，上样。

3.清洗：使用2CV阳离子交换缓冲液A洗涤柱子以除去残留的未结合蛋白。

4.洗脱：使用3CV阳离子交换缓冲液B洗脱目的蛋白。

5.NaOH清洗：使用2CV 0.5M NaOH溶液清洗柱子。

6.再平衡(Reequilibration)：使用5CV阳离子交换缓冲液A再平衡柱子。

四.苯基疏水纯化

按照如下纯化步骤进行苯基疏水纯化。纯化期间收集所有穿透及洗脱成分以备电泳分析：

1.平衡：使用苯基疏水平衡缓冲液平衡MPC HCT XK16Grad层析柱至UV稳定。

2.样品制备及上样：取阳离子交换洗脱液样品，加入(NH₄)₂SO₄至30％饱和度，上样。

3.清洗：使用2CV苯基疏水缓冲液B洗涤柱子以除去残留的未结合蛋白。

4.洗脱：使用3CV苯基疏水洗脱液洗涤柱子，控制pH。

5.NaOH清洗：使用2CV 0.5M NaOH溶液洗脱剩余的杂质，并保存柱子。

6.再平衡(Reequilibration)：使用5CV苯基疏水缓冲液A再平衡柱子。

五.阴离子交换纯化

按照如下纯化步骤进行第三步阴离子交换纯化。纯化期间收集所有穿透及洗脱成分以备电泳分析：

1.平衡：使用阴离子交换缓冲液平衡Q Sepharose Fast Flow层析柱至UV稳定。

2.样品制备及上样：取苯基疏水洗脱样品，经Sephadex G-25medium层析柱置换缓冲液为阴离子交换缓冲液后，上样。

3.平衡液清洗：使用1CV阴离子交换缓冲液清洗柱子以获得未结合上柱子的目的蛋白。

4.NaCl清洗：使用2CV 2M NaCl洗涤柱子以除去结合在柱上的蛋白。

5.NaOH清洗：使用2CV 0.5M NaOH溶液清洗柱子。

6.再平衡(Reequilibration)：使用阴离子交换缓冲液再平衡柱子。

实验结果

每一步纯化过程样品的电泳结果见图6、7、8，阳离子交换纯化目的蛋白洗脱液收集25ml，浓度5.85mg/ml，经检测目的蛋白纯度为80.5％，第二步高密度苯基疏水目的蛋白洗脱液收集23ml，浓度2.56mg/ml，经检测目的蛋白纯度为83.7％，而第三部阴离子交换穿透63ml，浓度0.9402mg/ml，目的蛋白纯度为93.2％。多次重复本实施例的实验操作，获得了足够体外生活学活性评价的蛋白量。

实施例5

MuR6S4TR蛋白的Western Blot检测

由于MuR6S4TR为野生型TRAIL N端10个位点突变所得，TRAIL的抗原决定簇仍然保留，能够与TRAIL的多克隆抗体发生特异性结合，因此可用TRAIL多克隆抗体进行检测鉴定。

实验步骤

一.样品配制

1.实施例4纯化的MuR6S4TR蛋白从-20℃解冻后，按其提供的浓度用超纯水稀释成1mg/ml。取样本50μl加入50μl 2×loading buffer，制成电泳样品。各取10μl电泳，即上样量为5ug。

2.对照品TRAIL-20131204冻干品(实验室自备)用1mlPBS溶解，取样本50μl加入50μl 2×loading buffer，制成电泳样品。各取10μl电泳，即上样量为5ug。

二.检测过程

样品经15％SDS-PAGE电泳分离后，转膜至PVDF膜上。首先4℃封闭过夜，再与一抗[兔抗人TRAIL多克隆抗体(1:500)]室温孵育2小时，然后与二抗[羊抗兔IgG-HRP(1:5000)]室温孵育2小时，最后使用增强型化学发光(ECL)检测。具体步骤如下：

1.15％SDS-PAGE电泳分离蛋白；取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于TBST缓冲液中，时间15min。

2.使用PVDF膜转膜(湿转)：PVDF膜使用前必须用甲醇略微浸湿15秒，然后在蒸馏水中浸泡1～3min，随后在转膜缓冲液中平衡；在转膜夹中，由负极到正极依次铺上：海绵垫、滤纸(4～8张)、目的胶、PVDF膜、滤纸(4～8张)、海绵垫，排气泡后加紧夹子放入转膜槽中，电压40V，时间45min。

3.封闭膜：将膜在封闭液(3％BSA)中4℃条件下封闭过夜，次日取出在室温振摇30min，以封闭非特异结合位点。

4.一抗孵育：将一抗用封闭液稀释至工作浓度[兔抗人TRAIL多克隆抗体(1:500)]，与膜一起振摇，室温孵育2h。

5.洗膜：用TBST洗膜三次，每次10min。10×10cm的膜需洗涤液50ml以上。

6.二抗孵育：将HRP标记的二抗用封闭液稀释至工作浓度[羊抗兔IgG-HRP(1:5000)]，与膜一起振摇，室温孵育2h。

7.洗膜：用TBST洗膜三次，每次10min。10×10cm的膜需洗涤液50ml以上。

8.显色：(1)将等体积的Solution A和Solution B混合，制备足够的检测混合液(0.125ml/cm²)。检测混合液配置后立即使用，室温1h内可保持稳定。(2)沥去洗过的印迹膜上多余的洗液，但不可使膜干燥。在膜上有蛋白的一面加上检测混合液，沥去多余的检测混合液，放在柯达凝胶成像Image Station 4000R上，用X-ray曝光，首次选择曝光时间1min，根据图像结果调整曝光时间。电脑记录图像。

9.结果判断：阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。

实验结果

如图9所示，MuR6S4TR及TRAIL对照品呈阳性反应，阴性对照呈阴性反应。

实施例7

蛋白MuR6S4TR及TRAIL生物活性分析

应用CCK-8检测试剂盒检测MuR6S4TR及野生型TRAIL 2个蛋白样品对11个肿瘤细胞株的体外抗增殖活性IC50值，以评价其体外生物活性。

材料和方法

检测用细胞株均来自中国科学院上海细胞库或美国ATCC。

试剂和耗材

Cell Counting Kit-8(Cat#CK04-13，Dojindo)

96孔培养板(Cat#3599，Corning Costar)

胎牛血清(Cat#10099-141，GIBCO)

培养基(购自GIBCO)

台式酶标仪SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices)

2个蛋白样品：通过实施例4制备或实验室自备。

实验步骤

1.试剂配制

培养基的配制

蛋白样品的制备

用无菌的PBS缓冲液稀释2个蛋白样品使终浓度为5mg/ml，并过滤除菌。

2.IC50实验

a)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。细胞(SW620细胞除外，不需要5％CO₂)在37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育24小时。

b)用无菌PBS缓冲液将待测蛋白样品稀释至5mg/ml后梯度稀释8次，按25μl/孔加入细胞。化合物终浓度从1mg/ml至0，3倍梯度稀释，共10个浓度点；并根据初步的实验结果，对蛋白样品的作用终浓度进行相应的调整。

c)细胞(SW620细胞除外，不需要5％CO₂)置于37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育48小时。

d)吸弃培养基，加入含10％CCK-8的完全培养基置于37℃培养箱中孵育2～4小时。

e)轻轻震荡后在SpectraMax M5Microplate Reader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。

3.数据处理

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％

As：样品的OA/RLU(细胞+CCK-8+待测化合物)

Ac：阴性对照的OA/RLU(细胞+CCK-8)

Ab：阳性对照的OA/RLU(培养基+CCK-8)

运用软件Graphpad Prism 5并采用计算公式log(inhibitor)vs.normalizedresponse-Variable slope进行IC50曲线拟合并计算出IC50值。

实验结果

本实验测试了2个蛋白样品(MuR6S4TR和野生型TRAIL)对3个胰腺癌

细胞株(CFPAC-1、BxPC-3、PANC-1)，2个肺癌细胞株(NCI-H460、A 549、)，3个结(直)肠癌细胞株(SW620、HT-29、HCT 116),3个乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7、T47D、)的体外抗细胞增殖活性。实验结果如下表所示。

实验结论

TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR与TRAIL野生型蛋白相比，在经过检测的几乎所有的肿瘤细胞类型中(包括多种结直肠癌细胞、多种肺癌细胞、多种胰腺细胞、多种乳腺细胞)，其抗肿瘤活性均明显提高，尤其对于TRAIL野生型蛋白耐药的肿瘤细胞株，能明显逆转这些细胞对TRAIL野生型蛋白的耐受，具有更强的治疗作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都华创生物技术有限公司

<120> 一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR、其制备方法及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcgtcgtc gtcgtcgtcg tgctgttccg attgctcaca tcactggtac tcgtggtcgt 60

tctaacactc tttcttctcc gaactctaaa aacgaaaaag ctcttggtcg taaaatcaac 120

tcttgggaat cttctcgttc tggtcactct ttcctttcta accttcacct tcgtaacggt 180

gaacttgtta tccacgaaaa aggtttctac tacatctact ctcagactta cttccgtttc 240

caggaagaaa tcaaagaaaa cactaaaaac gataaacaga tggttcagta catctacaaa 300

tacacctctt acccggaccc gatccttctt atgaaatctg ctcgtaactc ttgctggtct 360

aaagatgctg aatacggtct ttactctatc taccagggtg gtatcttcga acttaaagaa 420

aacgatcgta tcttcgtttc tgttactaac gaacacctta tcgatatgga tcacgaggct 480

tctttcttcg gtgctttcct tgttggttaa 510

<210> 2

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Val Pro Ile Ala His Ile Thr Gly

1 5 10 15

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

20 25 30

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

35 40 45

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

50 55 60

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

65 70 75 80

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

85 90 95

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

100 105 110

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

115 120 125

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

130 135 140

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

145 150 155 160

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

165

<210> 3

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcgtcgtc gtcgtcgtcg tcagcgtgtg gctgctcaca tcactggtac tcgtggtcgt 60

tctaacactc tttcttctcc gaactctaaa aacgaaaaag ctcttggtcg taaaatcaac 120

tcttgggaat cttctcgttc tggtcactct ttcctttcta accttcacct tcgtaacggt 180

gaacttgtta tccacgaaaa aggtttctac tacatctact ctcagactta cttccgtttc 240

caggaagaaa tcaaagaaaa cactaaaaac gataaacaga tggttcagta catctacaaa 300

tacacctctt acccggaccc gatccttctt atgaaatctg ctcgtaactc ttgctggtct 360

aaagatgctg aatacggtct ttactctatc taccagggtg gtatcttcga acttaaagaa 420

aacgatcgta tcttcgtttc tgttactaac gaacacctta tcgatatgga tcacgaggct 480

tctttcttcg gtgctttcct tgttggttaa taa 513

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtcatatgc gtcgtcgtcg tcgtcgtgct gttccgattg ct 42

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgtcgtgctg ttccgattgc tcacatcact ggtac 35

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttgaattct tattaaccaa caaggaaagc accgaagaaa g 41

Claims

1.一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR，其特征在于，该突变蛋白的N端第2～11位既包含穿膜肽序列RRRRRR，又包含凋亡抑制因子XIAP的结合序列AVPI；所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

2.一种权利要求1所述的TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、cDNA片段扩增与克隆；

B、表达载体的构建与鉴定；

C、重组TRAIL双靶点突变蛋白的表达；

D、TRAIL双靶点突变蛋白的纯化；

E、TRAIL双靶点突变蛋白的鉴定。

3.根据权利要求2所述的TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR的制备方法，其特征在于，步骤B中，表达载体的构建与鉴定步骤包括：

B₁、将原核表达载体中的融合标签序列切除；

4.根据权利要求3所述的TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR的制备方法，其特征在于，步骤B₁中，所述原核表达载体为pET 32a。

5.根据权利要求2所述的TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR的制备方法，其特征在于，步骤C中，重组蛋白的表达时，诱导温度为18～30℃。

6.权利要求1所述的TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR在制备抗胰腺癌、肺癌、结肠癌及乳腺癌药物中的应用。