CN103524627A

CN103524627A - 一种增强trail抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白

Info

Publication number: CN103524627A
Application number: CN201310478404.7A
Authority: CN
Inventors: 陈守春; 潘凤; 闫娟; 徐琦; 胡海洋; 李昭君; 朱文彦
Original assignee: Chengdu Hua Chuan Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Chengdu Hua Chuan Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2014-01-22
Also published as: WO2015078237A1

Abstract

本发明涉及基因工程药物技术领域，公开了一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，全长融合基因序列1的编码cDNA序列见SEQ ID NO1；全长融合基因序列1的编码氨基酸序列见SEQ ID NO2；全长融合基因序列2的编码cDNA序列见SEQ ID NO4；全长融合基因序列2的编码氨基酸序列见SEQ ID NO5。本发明与单独TRAIL蛋白可溶性片段编码cDNA序列的原核表达载体相比，原核表达载体的融合蛋白具有更高的可溶性表达，融合蛋白的回收及纯化效率更高；体外生物活性分析表明，所获融合蛋白能同时激动细胞膜上死亡受体和抑制细胞质内XIAP基因的表达，通过凋亡途径双靶点的作用增强诱导肿瘤细胞凋亡的活性，具有更强的抗肿瘤作用。

Description

一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白

技术领域

本发明涉及基因工程药物技术领域，特别涉及将野生型TRAIL蛋白编码cDNA序列与一内源性凋亡抑制剂分子XIAP的拮抗蛋白SMAC的N端7肽编码cDNA通过一特定的细胞内源性蛋白酶剪切位点AP编码cDNA序列连接，在融合基因前面再加上高效穿膜肽序列，构建成R8+SMAC N7+AP+TRAIL（114-281aa）或TAT+SMAC N7+AP+TRAIL（114-281aa）融合基因序列，采用经pTWIN1改造的大肠杆菌表达载体表达上述融合蛋白，分离纯化上述融合蛋白得到能增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白。

背景技术

1.TRAIL蛋白结构及分子生物学

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand；TRAIL）为肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）超家族的成员，其基因序列分别于1995年由Wiley等人（Wiley et al.1995）和1996年由Pitti等人（Pitti et al.1996）独立克隆获得。后者将其命名为凋亡素2配体（Apo2ligand，Apo2L），后来的研究证实Apo2L与TRAIL实为同一种蛋白，因此习惯上可将其称为Apo2L/TRAIL。

人Apo2L/TRAIL的编码基因定位于染色体3q26（Miriani and Krammer.1998），完整的Apo2L/TRAIL的cDNA序列编码全长为281个氨基酸的前体蛋白，其相对分子质量为32.5kDa。天然的Apo2L/TRAIL蛋白表现为Ⅱ型跨膜蛋白，分细胞外C端区域、跨膜区、细胞内N端区域等三部分。Apo2L/TRAIL的N端1-14aa为短小的胞内段，无信号肽序列；第15-40位aa为疏水区，形成跨膜结构；C端第41-281位aa为胞外区，保守性强。C端能形成几个β折叠，再形成典型的β夹心结构，进而形成同源三聚体的亚单位，胞外区为蛋白发挥功能的主要结构区。Apo2L/TRAIL前体蛋白在特定的蛋白酶作用下水解形成可溶性TRAIL，其第114-281aa为蛋白质的可溶性片段（Miriani and Krammer.1998）。

人Apo2L/TRAIL的C端（胞外区）序列与TNF和Fas配体一样高度保守，人TRAIL分子的胞外区与Fas配体、肿瘤坏死因子α、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β的同源性分别为28%、23%和22%（Wiley et al.1995）。TRAIL与TNF家族其他成员最独特的区别在于其第137-152位形成一个12-16个aa的插入环（AA’loop），此结构可插入受体的TRAIL结合位点，保证受体与TRAIL的特异性结合。结构突变研究证实，此插入环在TRAIL细胞毒性中起着关键的作用。晶体结构研究表明，Apo2L/TRAIL分子为一个同源三聚体分子，内部含有一个Zn原子，Zn原子同时与三个配体亚单位的第230位半胱氨酸连接，通过相互作用以维持分子的稳定（Hymowitz，et al.2000）。TRAIL是TNF家族中唯一的具有一个Cys残基的成员，Zn原子的结合对于同源三聚体的稳定性和生物活性至关重要（Bodmer et al.2000；Hymowitz，et al.2000）。Jean等研究证实，如将第230位半胱氨酸（Cys）突变为丝氨酸或丙氨酸后，TRAIL将形成无活性的二聚体结构，与受体的亲和力将下降200倍，严重影响TRAIL诱导细胞凋亡的活性（Jean et al.2000）。

TRAIL的功能首先是作为生物体先天性或获得性免疫的调节剂，其次在细胞外源性凋亡途径过程中发挥重要作用，作为免疫监视在抗肿瘤过程中发挥重要作用。TRAIL的最大优点是可以选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞几乎没有毒性。研究资料表明，Apo2L/TRAIL无论在体内，还是体外对于各种来源的人肿瘤细胞系，包括结（直）肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、白血病以及多发性骨髓瘤等都具有诱导凋亡的作用（Ashkenazi et al.1999；Ashkenazi2002）。

从TRAIL发现至今近20年时间里，TRAIL一直被作为一个重要的潜在抗肿瘤药物开发，TRAIL的临床试验在国外已进入Ⅱ期，在国内已完成Ⅲ期。大量体内外试验均证实，TRAIL具有肿瘤特异性细胞毒性，尤其当它与小剂量化疗药物联用时即表现出明显的协同和增效作用。相反，研究发现机体中凋亡机制的缺失导致的TRAIL耐受与肿瘤细胞的快速生长和转移明确相关。

2.TRAIL受体结构及分子生物学

TRAIL发挥作用是通过与其相应特异性死亡受体结合而实现的。目前发现的人TRAIL细胞膜上受体共5种（LeBlanc and Ashkenazi2003），它们分别被称为死亡受体4（Death receptor4，DR4）、死亡受体5（Death receptor5，DR5）、诱骗受体1（Decoy receptor1，DcR1）、诱骗受体2（Decoy receptor2，DcR2）和护骨素（osteoprotegerin，OPG）。前四种已定位于染色体8p22-21上，这表明上述受体在遗传学上均起源于较近的基因复制事件。8p21还包含有许多推定可能为抑癌基因的序列，8p21位置的基因转位在头颈部肿瘤中亦较常发现。

DR4和DR5均属肿瘤坏死因子受体超家族。DR4和DR5结构类似，均包含一个推定的信号肽序列，两个富含半胱氨酸的假重复序列，一个跨膜结构域，一个细胞内死亡结构域。DR4和DR5分子分别由468个aa和440个aa组成，两者序列相似性为58%。Northern blot分析表明，DR4在大多数人体组织中表达；DR5亦在所有检测组织中表达，尤其最高表达于外周血淋巴细胞、脾和卵巢组织。DR4和DR5均可表达于多种肿瘤细胞表面。

Pan等（Pan et al.1997）研究证实，与FAS、TNFR和DR3一样，DR4过表达可诱导细胞凋亡。Walczak等（Walczak et al.1997）也发现，与DR4一样，DR5过表达也可引起凋亡酶依赖的细胞凋亡途径活化。Apo2L/TRAIL-DR5复合物的晶体结构分析表明，在配体三聚体的每一个单体分子之间，3个受体分子相互靠近形成一个长的狭缝，这种接触面又可分为两个区段，一个区段位于受体细胞表面复合物的底部，一个区段位于复合物的顶部。两个区段均含有与受体-配体高亲和力相关的特定氨基酸序列（Hymowitz et al.1999）。DR4传递死亡信号不通过FADD的募集，这表明DR4可能使用与DR5不同的旁路短截信号机制。与DR4不同，DR5通过细胞内适配体分子FADD的募集而传递死亡信号。

与DR4不同，DR5与受体的结合是受温度控制的，在4℃时，TRAIL与其所有受体结合力均相似，而在37℃时，TRAIL与DR5的结合力最高。因此在机体及细胞最适宜的生存温度（37℃），DR5相对于其他受体来讲，以最强的亲和力与TRAIL结合并在TRAIL诱导的凋亡通路中发挥最大作用（Truneh A et al.2000）。

与死亡受体不同，诱骗受体不仅能竞争性结合TRAIL，也能与DR4、DR5形成异源三聚体从而干扰DR4和DR5诱导的细胞凋亡作用。

诱骗受体1（Decoy receptor1，DcR1）由259个aa组成，其胞外区序列类似于DR4（相似度69%）和DR5（相似度52%），无死亡结构域。DcR1通过共价连接与糖磷脂肌醇（GPI）的糖链结合，形成“蛋白-糖-脂肪酸复合物”。因缺乏胞内死亡域，DcR1与TRAIL结合不能诱导细胞凋亡，反而竞争性抑制TRAIL与DR4或DR5的结合，起到一定的凋亡抑制作用。DcR1的mRNA在外周血淋巴细胞、脾、心、肺、肾、骨髓及胎盘呈高水平表达，在脑及结肠中未见表达（Sheridan et al.1997；Pan et al.1997）。

诱骗受体2（Decoy receptor2，DcR2）由386个aa组成，胞内含有不完整的死亡结构域，因此，DcR2与TRAIL结合不能介导凋亡，但可以通过其胞外区抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。DcR2的mRNA在许多组织中均有表达，包括睾丸、外周血淋巴细胞、胸腺、结肠、小肠及前列腺。DcR2和DcR1的重要区别在于，DcR2含有一个胞浆结构域，该结构域可以促进凋亡转录因子NF-κB的活化（Marsters et al.1997；Degli-Esposti et al.1997），从而拮抗凋亡。

可溶性TNF受体家族成员护骨素（Osteoprotegerin，OPG）由401个aa组成，最初发现其能够与TNF超家族成员RANKL结合，在体内具有抑制破骨细胞发生、增加骨密度的作用（Simonet et al.1997）。后来发现OPG能够与TRAIL结合，也是一种TRAIL的诱骗受体，可抑制TRAIL诱导的细胞凋亡（Emery et al.1998）。这可能是部分肿瘤细胞对抗TRAIL诱导细胞凋亡的重要原因。激素不敏感的前列腺癌细胞系PC3、Du145和激素敏感的细胞系LNCaP可通过产生OPG而产生抗凋亡效应（Holen et al.2002）。MG63造骨样细胞来源的OPG可抑制TRAIL诱导的骨髓瘤细胞凋亡，这一作用能被可溶性NF-κB（Nuclear factor kappa B）受体激动剂逆转（Shipman et al.2003）。

3.TRAIL诱导细胞凋亡的机制

凋亡是一系列的复杂的分子事件，众多的促凋亡因子和凋亡抑制因子相互作用形成一个信号传递过程的复杂网络。凋亡信号传递通路主要包括细胞外（或死亡受体）信号传导途径和细胞内（线粒体）信号传导途径。细胞外途径对于免疫系统的调节起着重要的作用，其作用过程包括死亡受体与其配体家族成员（肿瘤坏死因子超家族）的结合，随后导致受体的三聚化和适配体分子在受体细胞膜内侧死亡区域的募集[适配体分子包括FADD（FAS相关死亡结构域），TRADD（TNF受体相关死亡区域）]。迄今为止，已经阐明的死亡受体包括FasL/FasR，TNFα/TNFR1，Apo3L/DR3，Apo2L/DR4和Apo2L/DR5等系统。

当Apo2L/TRAIL与细胞膜上的两种死亡受体DR4或DR5结合后，DR5通过死亡区域包含适配体分子（FADD）的募集和活化起始凋亡诱导酶。凋亡酶（Caspases）是一组半胱氨酸蛋白酶，包括作为起始作用的凋亡酶，如Caspase2、8、9、10和作为效应作用的凋亡酶，如Caspase3、6、7。适配体分子，如FADD通过其死亡效应区域前Caspase8的募集并与死亡受体同源三聚体结合进而形成死亡信号复合物。活化的Caspase8和Caspase10可直接活化效应Caspases或裂解替代途径中的促凋亡分子Bid。Bid为Bcl-2家族中重要的促凋亡线粒体蛋白，Bid又与另外两种促凋亡线粒体蛋白Bax及Bak相互作用，共同促使线粒体释放细胞色素C和第二个线粒衍生的凋亡酶激活剂（Second mitochondria-derived activator of caspase，SMAC）。一方面Caspase8、10直接活化凋亡效应作用Caspase3、6、7，后者直接导致细胞凋亡的发生。细胞色素C与Apaf-1一起，活化另一个起始阶段凋亡酶Caspase9，Caspase9进一步增强Caspase3的活化。Caspase9受一种凋亡抑制因子（Inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）的抑制。SMAC通过与IAPs，如X-连锁凋亡蛋白抑制因子（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的结合阻止IAPs对Caspase9的抑制，从而促进Caspase3、6、7的活化，于是在细胞内、外凋亡信号传递途径中形成交叉联结。

Caspases以非活化的前酶形成存在于细胞浆中，通过N端裂解而活化，启动Caspases顺序活化效应而导致细胞凋亡。一些Caspase通过与其他Caspase形成聚合而活化。在Caspase家族中，Caspase3被认为是最重要的效应分子，该分子通过活化CAD而促进DNA片段化。Caspase3通常通过与其阴性调节分子CAD抑制剂（ICAD）结合存在于核内而保持非活化状态，ICAD被Caspase3裂解继而释放CAD。

细胞内途径是通过启动线粒体内促凋亡蛋白的释放而活化。刺激线粒体释放促凋亡蛋白的因素包括细胞缺氧、DNA损伤、细胞应激、Ca2⁺波动、一氧化氮、脂肪酸和蛋白酶等。上述所有刺激均可导致线粒体PT孔的形成，线粒体膜内层的改变，PT孔开放以及Bcl-2家族蛋白的释放。

线粒体及其与Bcl-2家族蛋白的相互作用在调节凋亡过程中发挥关键作用。凋亡有赖于线粒体外膜完整性的改变，作为结果，促凋亡蛋白从线粒体膜间隙释放出来。上述事件受Bcl-2家族蛋白的调控，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两个亚家族。总体上讲，抗凋亡Bcl-2家族成员维持线粒体外膜的稳定性，抑制膜间蛋白从线粒体中释放出来，而促凋亡蛋白正好相反。线粒体膜的去稳定性可导致外膜通透性增高，通透性转移孔形成，线粒体跨膜电势丧失从而导致细胞色素c、SMAC/Diablo和HrA2/Omi蛋白从线粒体中释放出来。

所有凋亡蛋白均包含能够与凋亡抑制Bcl-2家族形成二聚体的BH3结构域，促凋亡蛋白又分为仅含一个BH3结构域的蛋白和包含BH3结构域在内的多结构域蛋白。前者不能直接导致线粒体膜通透性升高而引起细胞凋亡，但可以活化多结构域促凋亡蛋白，通过后者而发挥诱导凋亡的活性。

转录因子和肿瘤抑制因子P53及其家族成员因子，如P63、P73等对于凋亡过程也十分重要。P53基因突变发生于大多数恶性肿瘤中，尤其是头颈部肿瘤，提示其在肿瘤发生过程中扮演着关键的作用。P53在细胞面临应急刺激时通过导致细胞周期停滞或凋亡而起着保护作用。P53主要通过三种机制而活化。一是放射线照射增加双链DNA断裂可导致P53磷酸化，降低其与阴性调节剂，MDM-2的亲和力。其次可通过肿瘤生长信号（如Ras和Myc活化）刺激活化而导致P14ARF介导的MDM-2的隔离。第三，化疗药物、紫外线和蛋白激酶抑制剂促进ATR和Casein KinaseⅡ介导的MDM-2磷酸化。P53活化后，刺激促凋亡基因，如 Fas/CD95、Noxa和凋亡诱导因子1（APAF-1）的转录。

TRAIL作为抗肿瘤药物的优越性与其固有的局限一直相伴存在，而广泛耐药的存在妨碍了TRAIL在临床应用过程中发挥更好的疗效。根据Roberta di pietro和Giorgia Zauli的综述（Roberta di pietro and Giorgia Zauli，2004），TRAIL对于业已研究的92种传代及原代肿瘤细胞中的61种敏感，敏感率为66.30%，而对其余的31种耐药，耐药率为33.70%。我们先前进行的研究中，TRAIL对于参与试验的29株传代肿瘤细胞系中的15株敏感，敏感率为51.72%，而对14株耐药，耐药率为48.28%。无疑，广泛耐药成了TRAIL临床应用的最大瓶颈。

尽管有关TRAIL耐药的机理业已进行了广泛和深入的研究，但Cummins等人把研究的重点集中在XIAP基因上。通过靶向性基因缺失，Cummins等人破坏了人结肠癌细胞中的XIAP基因。尽管XIAP基因的缺失并不影响细胞的基础增殖，但却明显增加了细胞对外源性TRAIL的敏感性。TRAIL对野生型肿瘤细胞和XIAP敲除的肿瘤细胞均可诱导细胞凋亡，但对后者的作用明显强于对野生型细胞。在XIAP基因敲除的肿瘤细胞中促凋亡作用与其细胞内较高的Caspase3水平相关。XIAP基因敲除可以减少肿瘤细胞的存活和克隆增殖，XIAP在肿瘤细胞的高表达是诸多肿瘤细胞对TRAIL耐受的关键非冗余调节因素（Cummins et al.2004）。

第二个线粒体衍化的凋亡酶激活剂（SMAC）是第二个被发现的线粒体蛋白（第一个是细胞色素c）。SMAC基因定位于染色体12q24.31，推定的SMAC编码蛋白为239个aa的多肽，SMAC的N端有55个aa，为线粒体靶向序列（信号肽），成熟SMAC蛋白编码184aa。SMAC通过与IAPs结合解除IAPs对Caspase的抑制效应从而活化Caspase9的活性，进而增加细胞对凋亡刺激的敏感性，促进细胞的凋亡。Chai等人研究（Chai et al.2000）表明，SMAC的N端7肽在体外能促进前Caspase3的活化。一些学者（Liu et al.2000）通过构效研究证实SMAC的N端4个氨基酸（Ala-Val-Pro-Ile）通过与XIAP表面BIR3沟结合从而解除IAPs对Caspase9的抑制。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，设计的融合蛋白的作用靶点既针对TRAIL受体DR₄、DR₅，又同时针对凋亡拮抗因子XIAP，以期对于TRAIL具有明显的增效作用。融合蛋白1和融合蛋白2编码cDNA序列采用去除了融合标签序列的原核载体进行克隆，可溶性表达水平较高，蛋白回收及纯化效率较高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，编码该融合蛋白（双靶点融合蛋白1）的全长融合基因序列1的编码cDNA序列见SEQ ID NO1。

作为一种优选的技术方案，全长融合基因序列1的编码氨基酸序列见SEQ ID NO2。

作为一种优选的技术方案，双靶点融合蛋白1（编码氨基酸序列见SEQ ID NO2）由R8（含有连续精氨酸的8肽序列）、SMAC N7（SMAC蛋白N端7肽）、内源性蛋白酶酶切位点（AP）与TRAIL蛋白（114-281aa）等肽段顺序融合而成。

本发明提供一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，编码该融合蛋白（双靶点融合蛋白2）的全长融合基因序列2的编码cDNA序列见SEQ ID NO4。

作为一种优选的技术方案，全长融合基因序列2的编码氨基酸序列见SEQ ID NO5。

作为一种优选的技术方案，双靶点融合蛋白2（编码氨基酸序列见SEQ ID NO5）由TAT（含有不连续精氨酸的11肽序列）、SMAC N7（SMAC蛋白N端7肽）、内源性蛋白酶酶切位点（AP）与TRAIL蛋白（114-281aa）等肽段顺序融合而成。

作为一种优选的技术方案，双靶点融合蛋白1和双靶点融合蛋白2治疗的靶点为TRAIL受体DR₄、DR₅和凋亡拮抗因子XIAP。

作为一种优选的技术方案，将全长融合基因序列1和全长融合基因序列2的编码cDNA克隆于原核表达载体pET32a或pTWIN1上以获得高效可溶性非融合表达。

作为一种优选的技术方案，表达载体pET32a中切除Trx标签序列。

作为一种优选的技术方案，表达载体pTWIN1中切除Intein内含肽序列。

作为一种优选的技术方案，表达载体采用BL21（DE3）宿主菌表达。

作为一种优选技术方案的结果，表达载体的最佳诱导温度为18℃，可溶性表达水平为60-100%。

作为一种优选技术方案的结果，新构建的全长融合基因序列1和全长融合基因序列2表达载体比单独TRAIL表达载体的可溶性表达比例显著升高。

作为一种优选技术方案的结果，双靶点融合蛋白1和双靶点融合蛋白2经分离纯化后进行体外生物学活性检测，抗肿瘤活性明显强于TRAIL蛋白。

作为一种优选技术方案的结果，任一所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白用作抗肿瘤药物的用途。

本发明同现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明与单独TRAIL蛋白可溶性片段（114-281aa）编码cDNA序列的原核表达载体相比，原核表达载体的融合蛋白具有更高的可溶性表达，融合蛋白的回收及纯化效率更高。体外生物活性分析表明，所获融合蛋白能同时激动细胞膜上死亡受体和抑制细胞质内XIAP基因的表达，通过凋亡途径双靶点的作用增强诱导肿瘤细胞凋亡的活性，具有更强的抗肿瘤作用。上述双靶点TRAIL融合蛋白极具发展潜力和优势，极有可能发展成为新一代肿瘤细胞凋亡诱导药物。

附图说明

图1是融合前段拼接后PCR产物电泳图。

图2是TRAIL（114-281aa）基因PCR产物电泳图。

图3是融合蛋白基因拼接PCR产物电泳图。

图4是融合蛋白基因pMD19-T连接酶切鉴定电泳图。

图5是融合蛋白基因pTWIN1连接酶切鉴定电泳图。

图6是pTWIN1/TRAIL蛋白表达SDS-PAGE电泳图。

图7是pTWIN1/融合基因1、2蛋白表达SDS-PAGE电泳图。

图8是pTWIN1/融合基因2蛋白表达SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

全长融合基因序列1、2的拼接合成

设计的融合蛋白中的TRAIL蛋白（114-281aa）的作用靶点针对TRAIL受体DR₄、DR₅，SMAC N7肽段针对凋亡拮抗因子XIAP，以期对于TRAIL具有明显的增效作用。

将所要合成的全长融合基因序列（见序列1、4）分为融合前段序列（见序列3、6）和TRAIL序列（见序列7）两部分。融合前段序列包括（R8+SMAC N7+AP）（见序列3）及（TAT+SMAC N7+AP）（见序列6）肽段编码cDNA序列两种，融合前段序列采用委托华大基因合成的分段双链拼接引物（见序列8-18）为原料，将合成的双链拼接引物一起反应，在无Taq DNA Polymerase的条件下，先得到拼接的融合前段序列（R8+SMAC N7+AP）及（TAT+SMAC N7+AP）编码cDNA。同时通过以含有TRAIL基因cDNA的质粒（实验室自备）作为模板，采用TRAIL上下游引物（见序列19、20）扩增TRAIL蛋白（114-281aa）编码cDNA序列，最后将融合前段序列（序列3、6）分别与TRAIL序列（序列7）进行连接PCR反应得到全长融合基因序列（序列1、4）。

（一）全长融合基因序列1、2的设计与拼接合成

1.全长融合基因序列1的组成及拼接合成

全长融合基因序列1包括R8+SMAC N7+AP+TRAIL（114-281aa）编码cDNA序列的顺序组合及序列连接。

拟合成及拼接的全长融合基因序列1全长如下（序列1：564bp）：

ATG CGT CGT CGT CGT CGT CGT CGT CGT GCT GTT CCG ATT GCG CAG AAA GCT CCG GTT CGT GAA CGT GGT CCG CAG CGT GTT GCT GCT CAC ATC ACT GGT ACT CGT GGT CGT TCT AAC ACT CTT TCT TCT CCG AAC TCT AAA AAC GAA AAA GCT CTT GGT CGT AAA ATC AAC TCT TGG GAA TCT TCT CGT TCT GGT CAC TCT TTC CTT TCT AAC CTT CAC CTT CGT AAC GGT GAA CTT GTT ATC CAC GAA AAA GGT TTC TAC TAC ATC TAC TCT CAG ACT TAC TTC CGT TTC CAG GAA GAA ATC AAA GAA AAC ACT AAA AAC GAT AAA CAG ATG GTT CAG TAC ATC TAC AAA TAC ACC TCT TAC CCG GAC CCG ATC CTT CTT ATG AAA TCT GCT CGT AAC TCT TGC TGG TCT AAA GAT GCT GAA TAC GGT CTT TAC TCT ATC TAC CAG GGT GGT ATC TTC GAA CTT AAA GAA AAC GAT CGT ATC TTC GTT TCT GTT ACT AAC GAA CAC CTT ATC GAT ATG GAT CAC GAG GCT TCT TTC TTC GGT GCT TTC CTT GTT GGT TAA TAA

全长融合基因序列1编码氨基酸序列如下（序列2：186aa）：

Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Val Pro Ile Ala Gln Lys Ala Pro Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

将全长融合基因序列1分为融合前段序列（见序列3）和TRAIL序列（见序列7）两部分。融合前段序列包括（R8+SMAC N7+AP）（见序列3）肽段编码cDNA序列，融合前段序列采用委托华大基因合成的分段双链拼接引物（见序列8-12）为原料，将合成的双链拼接引物一起反应，在无Taq DNA Polymerase的条件下，先得到拼接的融合前段序列（R8+SMAC N7+AP）编码cDNA。同时通过以含有TRAIL基因cDNA的质粒（实验室自备）作为模板，采用TRAIL上下游引物（见序列19、20）扩增TRAIL蛋白（114-281aa）编码cDNA序列，最后将融合前段序列（序列3）与TRAIL序列（序列7）进行连接PCR反应得到全长融合基因序列1。

考虑在融合前段序列的5’端加上NdeⅠ酶切位点序列及保护碱基GGT，在序列3’端加上与TRAIL蛋白（114-281aa）编码cDNA序列相重叠的部分序列GTT CGT GAA CGT GGT CGTG，组合在一起的融合前段序列（序列3：79bp）即变成：

GGTCATATGCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAAAGTCCCGGTTCGTGAACGTGGTCGTG

TRAIL蛋白（114-281aa）编码cDNA序列（序列7：510bp）如下：

GTT CGT GAA CGT GGT CCG CAG CGT GTT GCT GCT CAC ATC ACT GGT ACT CGT GGT CGT TCT AAC ACT CTT TCT TCT CCG AAC TCT AAA AAC GAA AAA GCT CTT GGT CGT AAA ATC AAC TCT TGG GAA TCT TCT CGT TCT GGT CAC TCT TTC CTT TCT AAC CTT CAC CTT CGT AAC GGT GAA CTT GTT ATC CAC GAA AAA GGT TTC TAC TAC ATC TAC TCT CAG ACT TAC TTC CGT TTC CAG GAA GAA ATC AAA GAA AAC ACT AAA AAC GAT AAA CAG ATG GTT CAG TAC ATC TAC AAA TAC ACC TCT TAC CCG GAC CCG ATC CTT CTT ATG AAA TCT GCT CGT AAC TCT TGC TGG TCT AAA GAT GCT GAA TAC GGT CTT TAC TCT ATC TAC CAG GGT GGT ATC TTC GAA CTT AAA GAA AAC GAT CGT ATC TTC GTT TCT GTT ACT AAC GAA CAC CTT ATC GAT ATG GAT CAC GAG GCT TCT TTC TTC GGT GCT TTC CTT GTT GGT TAA TAA

设计融合蛋白1融合前段序列基因拼接引物：

CPP-1-1F（序列8:40bp）:GGTCATATGCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTGCTGTTC

CPP-1-2F（序列9：39bp）:CGATTGCGCAGAAAGCTCCGGTTCGTGAACGTGGTCGTG

CPP-1-3R（序列10：19bp）:CACGACCACGTTCACGAAC

CPP-1-4R（序列11：40bp）:CGGAGCTTTCTGCGCAATCGGAACAGCACGACGACGACGA

CPP-1-5R（序列12：20bp）:CGACGACGACGCATATGACC

2.全长融合基因序列2的组成及拼接合成

全长融合基因序列2包括TAT+SMAC N7+AP+TRAIL（114-281aa）编码cDNA序列的顺序组合及序列连接。

拟合成及拼接的全长融合基因序列2全长如下（序列4：573bp）：

ATG TAC GGC CGT AAA AAG CGT CGT CAG CGT CGT CGT GCT GTT CCG ATT GCG CAG AAA GCT CCG GTT CGT GAA CGT GGT CCG CAG CGT GTT GCT GCT CAC ATC ACT GGT ACT CGT GGT CGT TCT AAC ACT CTT TCT TCT CCG AAC TCT AAA AAC GAA AAA GCT CTT GGT CGT AAA ATC AAC TCT TGG GAA TCT TCT CGT TCT GGT CAC TCT TTC CTT TCT AAC CTT CAC CTT CGT AAC GGT GAA CTT GTT ATC CAC GAA AAA GGT TTC TAC TAC ATC TAC TCT CAG ACT TAC TTC CGT TTC CAG GAA GAA ATC AAA GAA AAC ACT AAA AAC GAT AAA CAG ATG GTT CAG TAC ATC TAC AAA TAC ACC TCT TAC CCG GAC CCG ATC CTT CTT ATG AAA TCT GCT CGT AAC TCT TGC TGG TCT AAA GAT GCT GAA TAC GGT CTT TAC TCT ATC TAC CAG GGT GGT ATC TTC GAA CTT AAA GAA AAC GAT CGT ATC TTC GTT TCT GTT ACT AAC GAA CAC CTT ATC GAT ATG GAT CAC GAG GCT TCT TTC TTC GGT GCT TTC CTT GTT GGT TAA TAA

全长融合基因序列2编码氨基酸序列如下（序列5：189aa）：

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Val Pro Ile Ala Gln Lys Ala Pro Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

将全长融合基因序列2分为融合前段序列（见序列6）和TRAIL序列（见序列7）两部分。融合前段序列包括（TAT+SMAC N7+AP）（见序列6）肽段编码cDNA序列，融合前段序列采用委托华大基因合成的分段双链拼接引物（见序列13-18），将合成的双链拼接引物一起反应，在无Taq DNA Polymerase的条件下，先得到拼接的融合前段序列（TAT+SMACN7+AP）编码cDNA。同时通过以含有TRAIL基因cDNA的质粒（实验室自备）作为模板，采用TRAIL上下游引物（见序列19、20）扩增TRAIL蛋白（114-281aa）编码cDNA序列，最后将融合前段序列（序列6）与TRAIL序列（序列7）进行连接PCR反应得到全长融合基因序列2。

考虑在融合前段序列的5’端加上NdeⅠ酶切位点序列及保护碱基GGT，在序列3’端加上与TRAIL蛋白（114-281aa）编码cDNA序列相重叠的部分序列GTT CGT GAA CGT GGT CGTG，组合在一起的融合前段序列（序列6：88bp）即变成：

GGTCATATGTACGGCCGTAAAAAGCGTCGTCAGCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAAAGCTCCGGTTCGTGAACGTGGTCGTG

设计融合蛋白2融合前段序列基因拼接引物：

CPP-2-1F（序列13：37bp）:GGTCATATGTACGGCCGTAAAAAGCGTCGTCAGCGTC

CPP-2-2F（序列14：30bp）:GTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAAAGCTC

CPP-2-3F（序列15：21bp）:CGGTTCGTGAACGTGGTCGTG

CPP-2-4R（序列16：37bp）:CACGACCACGTTCACGAACCGGAGCTTTCTGCGCAAT

CPP-2-5R（序列17：35bp）:CGGAACAGCACGACGACGCTGACGACGCTTTTTAC

CPP-2-6R（序列18：16bp）:GGCCGTACATATGACC

TRAIL蛋白（114-281aa）编码cDNA序列扩增引物（见序列19、20），在下游引物之前加上PstⅠ酶切位点序列和保护碱基GGT序列。

上游引物（序列19）：GTTCGTGAACGTGGTCCGCAGCGTGTTGCTGCT

下游引物（序列20）：GGTCTGCAGTTATTACAAAACAAGGAAAGCACC

（二）实验材料、试剂与仪器设备

1.材料：合成的引物20120328-YJ1、实验室自备的TLP（TRAIL cDNA）质粒模板、批号20120406。

2.试剂见表1所示：

表1.融合基因序列拼接合成所用试剂

试剂名称	规格	批号	生产厂家
				TaKaRa Ex Taq	250U5U/μl	CKA4201A	TaKaRa
25mM MgCl₂	1ml	AA1601A	TaKaRa
				10X Ex Taq Buffer(Mg²⁺free)	1ml	A2701A	TaKaRa
dNTP Mixture（2.5mM each）	180μl	BG8201A	TaKaRa
				DL2000DNA Marker	500μl	B6701A	TaKaRa
DL500DNA Marker	500μl	B901A	TaKaRa
				GelRedTM10000×in water	0.5ml	11G0127	BIOTIUM
Agarose G-10	100g	111860	GENE COMPANY LTD

3.仪器设备见表2所示：

表2.融合基因序列拼接合成所用仪器

设备名	型号	生产厂家
			基因扩增仪	TC-24/H（b）	杭州博日科技有限公司
基因扩增仪	MG25+	杭州朗基科学仪器有限公司
			低温冷冻离心机	5403	eppendorf

[0105]

漩涡混合器	QL-901	海门市其林贝尔仪器制造有限公司
			电泳仪	DYCP-31BN	北京市六一仪器厂
电泳仪电源	DYY-8C	北京市六一仪器厂
			凝胶成像系统	ChemiDOC XRS	BIO-RAD

（三）实验方法及步骤

1.引物溶解：用超纯水按引物资料上提供的摩尔比，溶解成100pmol/μl，备用。再取5μl加45μl的超纯水，稀释成10pmol/μl做扩增用。

2.根据表3配制融合前段序列拼接反应体系，每个片段各做1管。

表3.融合前段序列拼接反应体系

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

4.将PCR管置于PCR仪中，进行PCR反应，反应条件见表4。

表4.融合前段序列拼接反应条件

（PCR仪-博日存盘号：E11)

5.将以上PCR产物做纯化，纯化步骤见操作规程，最后用30μl纯水洗脱，备用。

6.将步骤5纯化产物再用融合前段序列上下游引物（对于融合前段序列1，即序列3上下游引物分别为序列8、序列12；对于融合前段序列2，即序列6上下游引物分别为序列13、序列18）做一次PCR，以增加序列的拷贝数，PCR反应体系见表5，各做1管。

表5.融合前段序列PCR反应体系

7.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

8.PCR扩增反应条件见表6。

表6.融合前段序列PCR反应条件

9.将以上PCR产物电泳，由于片段在80bp左右，因此用3%胶电泳，观察电泳结果后做胶回收。胶回收步骤见操作规程，最后用35μl纯水洗脱，备用。

10.根据表7配制TRAIL序列（序列7）PCR扩增反应体系；TRAIL下游引物含有方便与表达载体连接的PstⅠ酶切位点，TRAIL序列共做2管。

表7TRAIL序列PCR反应体系

试剂	50μl反应体系
		TLP质粒模板（稀释10倍）	1μl
10X Ex Taq Buffer（Mg²⁺free）	5μl
		dNTP Mix，2.5mM each	4μl
25mM MgCl₂	4μl
		TaKaRa Ex Taq	0.5μl
上游引物（10pmol/μl）	1μl
		下游引物（10pmol/μl）	1μl
RNase-Free Water	34.5μl

11.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

12.PCR扩增反应条件见表8。

表8.TRAIL序列PCR反应条件

（PCR仪-博日存盘号：E2）

13.PCR产物电泳，用1%的胶，观察结果，有目的条带后做胶回收。胶回收步骤见试剂盒操作规程，最后用30μl水洗脱，备用。

14.融合前段序列的胶回收产物（融合前段1，即序列3；融合前段2，即序列6）分别与胶回收的TRAIL序列（即序列7）进行PCR拼接反应，拼接反应体系及反应条件见表9、表10，最后得到全长融合基因序列1、2（即序列1、序列4）。

表9.全长融合基因序列PCR拼接反应体系

15.漩涡震荡混匀后短暂离心，将溶液收集到管底。

16.再继续PCR扩增，反应条件见表10。

表10.全长融合基因序列PCR拼接反应条件

（PCR仪-博日存盘号：Ejoin）

17.将以上PCR产物电泳，用1%的胶，观察结果，有目的条带后做胶回收。合并4管PCR产物胶回收，胶回收步骤见操作规程，最后用30μl纯水洗脱，备用。

（四）实验结果

1.融合前段序列1、2拼接后PCR结果见图1。

图1是融合前段拼接后PCR产物电泳图。

电泳条件：3%Agarose，电压100V，20min。lane1～2：融合前段序列1、2拼接后PCR产物电泳条带；M：DL500分子量Marker，上样量5μl。PCR产物上样量均为5μl。图中可见，分别扩增得到约80bp的融合前段序列1、2基因。

2.TRAIL（114-281aa）编码cDNA序列PCR结果见图2。

图2是TRAIL（114-281aa）基因PCR产物电泳图。

电泳条件：1%Agarose，电压100V，20min。lane1：TRAIL（114-281aa）编码cDNA序列PCR产物电泳条带；M：DM2000分子量Marker，上样量5μl；PCR产物上样量均为5μl。图中可见，扩增得到大小约500bp的TRAIL（114-281aa）编码cDNA序列。

3.全长融合基因序列拼接PCR结果见图3。

图3是融合蛋白基因拼接PCR产物电泳图。

电泳条件：1%Agarose，电压100V，20min。lane1～2：融合基因1、2拼接PCR产物电泳条带；M：DM2000分子量Marker，Marker上样量5μl；胶回收产物上样量均为2μl。图中可见，拼接扩增得到大小约580bp的全长融合基因序列1、2。

最后，试验成功获得全长融合基因序列1、2，可用于后续与pMD19-T载体的连接。

实施例2

全长融合基因序列1、2与pMD19-T载体的连接

为增加表达载体构建的成功率，首先将全长融合基因序列1、2与pMD19-T载体连接及转化，然后再将成功转化的克隆子亚克隆到表达载体pTWIN1和pET-32a上，构建全长融合基因序列1、2的原核表达载体。

（一）实验材料、试剂与仪器设备

1.材料：全长融合基因序列1、2来源于实施例1的结果。

2.试剂见表11。

表11.全长融合基因序列1、2与pMD19-T载体连接所用试剂

试剂名称	规格	批号	生产厂家
				pMD19-T Vector	20T	CK2401AA	TAKARA
Top10感受态细胞	100μl	111108	天根生物
				Tryptone	500g	829408	OXOID
Yeast Extract	500g	990951	OXOID
				NaCl	AR 500g	20110113	成都市科龙化工试剂厂

3.仪器设备见表12。

表12.全长融合基因序列1、2与pMD19-T载体连接所用仪器

设备名	型号	生产厂家
			漩涡混合器	QL-901	海门市其林贝尔仪器制造有限公司
电热三用水箱	BS2	北京医疗设备厂
			台式恒温振荡器	THZ-82A	上海市跃进医疗器械厂
超净工作台	46	苏州净化设备厂

[0166]

隔水式电热恒温培养箱

PYX-DHS-40×50

上海市跃进医疗器械厂

（二）实验方法及步骤

1.按照表13配制连接反应体系，各做1管。

表13.全长融合基因序列1、2与pMD19-T载体连接反应体系

2.pMD19-T Vector连接反应体系使用16℃连接4.5小时。

3.往连接产物中加入50μl感受态细胞，冰浴30分钟。

4.在水浴42℃热击45秒。

5.置冰上孵育2分钟。

6.加入600μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

7.转化的感受态细胞离心后，在超净工作台，弃去大部分培养基，余约100μl培养基，将细菌吹匀，全部涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

（三）实验结果

2种连接片段的平板均长出较多菌落。菌种接种经细菌培养、质粒提取及酶切鉴定均有多个阳性克隆，保存菌种，送测序。全长融合基因序列1、2均获得测序完全正确质粒。

图4是融合蛋白基因pMD19-T连接酶切鉴定电泳图。

电泳条件：1%Agarose，电压100V，20min。lane1～8：平板挑取菌落质粒提取酶切鉴定电泳条带；M：DM2000分子量Marker，Marker上样量5μl；酶切产物上样量均为2μl。如图4所示，图4是融合蛋白基因pMD19-T连接酶切鉴定电泳图。

实施例3

全长融合基因序列1、2与原核表达载体的连接

选用原核表达载体pTWIN1和pET-32a，分别用NdeI和PstI双酶切载体pTWIN1、pET-32a载体及阳性克隆载体pMD19/全长融合基因序列1和pMD19/全长融合基因序列2。pTWIN1得到去除了Intern区域（约1549bp）两个粘性末端，再在此区域插入经同样双酶切的全长融合基因序列1、2；而pET-32a得到去除Trx融合蛋白标签表达区域的两个粘性末端，再在此区域插入经同样双酶切的全长融合基因序列1、2。因此采用NdeI和PstI双酶切，用TaKaRa连接试剂盒连接后转化入天根生物的Top10感受态细胞。

（一）实验材料、试剂与仪器设备

1.材料：阳性克隆载体pMD19/全长融合基因序列1和pMD19/全长融合基因序列2来源于实施例2，质粒批号20120515，pTWIN1批号20120406、来源于20120406-YJ2。pET-32a批号20120406、来源于20120406-YJ2。

2.试剂见表14

表14.全长融合基因序列1、2与原核表达载体的连接所用试剂

试剂名称	规格	批号	生产厂家
				GelRedTM10000×in water	0.5ml	11G0127	BIOTIUM
Agarose G-10	100g	111860	GENE COMPANY LTD
				GeneRuler1kb DNA Ladder	0.5μg/μl	00013872	Fermentas
DL2000	500μl	B6701A	TaKaRa
				Pst I	3000U，15U/μl	CK707A	TaKaRa
NdeI	400U，10U/μl	CKA201A	TaKaRa
				10×H Buffer	500μl	CA2101B	TaKaRa
Sol I	75μl	CD1401A	TaKaRa
				Gel Extraction Kit(50)	50次	00D2500010000K27K065	OMEGA
Top10感受态细胞	100μl	111108	天根生物

3.仪器设备见表15。

表15.全长融合基因序列1、2与原核表达载体的连接所用仪器

设备名	型号	生产厂家
			低温冷冻离心机	5403	eppendorf
漩涡混合器	QL-901	海门市其林贝尔仪器制造有限公司
			电泳仪	DYCP-31BN	北京市六一仪器厂
电泳仪电源	DYY-8C	北京市六一仪器厂
			凝胶成像系统	ChemiDOC XRS	BIO-RAD
隔水式电热恒温培养箱	PYX-DHS-40×50	上海市跃进医疗器械厂

（二）实验方法及步骤

1.酶切载体和目的片段

（1）NdeI、PstI双酶切载体pTWIN1、pET-32a与pMD19/全长融合基因序列1、2质粒，酶切体系见表16，反应体系100μl。

表16.载体pTWIN1、pET-32a与pMD19/全长融合基因序列1、2质粒酶切反应体系

（2）将EP管放入多用恒温箱中，37℃，2.5小时。

（3）纯化酶切产物，用OMEGA的Cycle-Pure Kit。用30μl超纯水洗脱，电泳，照相，备用。

2.载体pTWIN1、pET-32a与融合蛋白基因1、2的连接并转化

（1）连接体系见表17，各做1管。

表17.全长融合基因序列1、2与载体pTWIN1、pET-32a连接反应体系

（2）16℃连接过夜。

（3）将连接产物5μl分别加入50μl Top10感受态细胞，冰浴30分钟。

（4）在水浴42℃热击90秒。

（5）置冰上孵育2分钟。

（6）加入500μl SOC培养基，37℃振荡培养45分钟。

（7）转化的感受态细胞离心后，在超净工作台，弃去400μl，余约100μl培养基，将细菌吹匀，全部涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

（三）实验结果

转化入Top10的感受态细胞，每一种连接产物的平板均有菌落长出。此次实验比较成功，有待进一步鉴定转化子。菌种接种经细菌培养、质粒提取及酶切鉴定均有多个阳性克隆，保存菌种，送测序。融合蛋白基因序列1、2在两种载体均获得测序完全正确重组质粒。

图5是融合蛋白基因pTWIN1连接酶切鉴定电泳图。

电泳条件：1%Agarose，电压100V，20min。lane1～10：平板挑取菌落质粒提取酶切鉴定电泳条带；M：DM10000分子量Marker，Marker上样量5μl；酶切产物上样量均为2μl。

实施例4

pTWIN1/全长融合基因序列1、pTWIN1/全长融合基因序列2载体的表达研究

试验使用TB培养基培养及诱导表达pTWIN1/全长融合基因序列1、pTWIN1/全长融合基因序列2并与野生型TRAIL原核表达载体pTWIN1/TRAIL表达进行对比研究。由于需要制备少量样品用于纯化目的蛋白，使用大量摇瓶方式进行制备。此前实验培养及诱导表达TRAIL系列蛋白使用的培养基均为LB培养基。因此拟选择主要碳源为甘油的TB培养基，本实验试验使用该培养基的可行性。

（一）实验材料、试剂与仪器设备

1.SDS-PAGE电泳相关溶液配制于20120428-XQ2，pTWIN1/全长融合基因序列1、 pTWIN1/全长融合基因序列2菌种来源于20120608-HY1，pTWIN1/TRAIL菌种由本实验室保存。

2.试剂见表18。

表18.融合基因序列1、2载体表达研究所用试剂

3.仪器设备见表19。

表19.融合基因序列1、2载体表达研究所用仪器

设备名	型号	生产厂家
			超净工作台	46	苏州净化设备厂
全温振荡器	HZQ-QX	哈尔滨东联电子技术开发有限公司
			实验室pH计	FE20	METTLER TOLEDO
低温冷冻离心机	5403	eppendorf
			高效冷冻离心机	J2-21	BECKMAN
超声波细胞粉碎机	JY96-Ⅱ	上海比朗仪器有限公司
			垂直电泳仪	Mini-PROTEAN Tetra system	BIO-RAD
电泳仪电源	Power Pac Universal	BIO-RAD
			水平摇床	WD-9405B	北京市六一仪器厂

（二）实验方法及步骤

1.取pTWIN1/全长融合基因序列1、pTWIN1/全长融合基因序列2及pTWIN1/TRAIL甘油菌各500μl接入4ml LB（Amp+）培养基中，37℃，220rpm振摇活化过夜。

2.取活化过夜的菌液各1ml接入50ml TB培养基中，37℃，220rpm振摇培养2h（OD600 大约1），降温至28℃，加入0.1M IPTG500μl诱导培养，诱导前取样1ml离心弃去上清，加入25μl H₂O重悬后加入25μl 2×loading buffer制成诱导后电泳样品。

3.诱导6h后收菌，测量pH值，取样300μl离心弃去上清，加入50μl H₂O重悬后加入50μl 2×loading buffer制成诱导后电泳样品，剩余菌液10000rpm离心2min，弃去上清后保存。

4.菌体使用5ml H₂O重悬，超声波破菌。破菌条件为：150W脉冲破菌5s后暂停8s，循环60次。

5.破菌液取1ml12000rpm离心10min，分离上清和沉淀，沉淀使用1ml H₂O重悬，上清和沉淀重悬液各取25μl加入25μl 2×loading buffer，制成电泳样品。

6.将制成的电泳样品置于沸水浴中处理10min，12000rpm离心10min，然后取上清10μl电泳。

（三）实验结果

1.由SDS-PAGE蛋白电泳图6可见，野生型TRAIL原核表达载体目的蛋白的表达较弱，且目的蛋白主要存在于沉淀中。

图6是pTWIN1/TRAIL蛋白表达SDS-PAGE电泳图。

电泳条件：15%凝胶，200V，35min。lane1：TRAIL诱导前电泳条带；lane2：TRAIL诱导后电泳条带；lane3：TRAIL破菌后上清电泳条带；line4：TRAIL破菌后沉淀电泳条带；M：Unstained Protein Molecular Weight Marker（条带分子量从上到下依次为：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa），样品上样量均为10μl，Marker上样量为5μl。

2.由SDS-PAGE蛋白电泳图7可见，pTWIN1/全长融合基因序列1、pTWIN1/全长融合基因序列2目的蛋白的表达较强，且目的蛋白主要存在于上清中。

图7是pTWIN1/融合基因1、2蛋白表达SDS-PAGE电泳图。

电泳条件：15%凝胶，200V，35min。lane1：pTWIN1/融合蛋白基因1诱导前电泳条带；lane2：pTWIN1/融合蛋白基因1诱导后电泳条带；lane3：pTWIN1/融合蛋白基因1破菌后上清电泳条带；lane4：pTWIN1/融合蛋白基因1破菌后沉淀电泳条带；lane5：pTWIN1/融合蛋白基因2诱导前电泳条带；lane6：pTWIN1/融合蛋白基因2诱导后电泳条带；lane7：pTWIN1/融合蛋白基因2破菌后上清电泳条带；lane8：pTWIN1/融合蛋白基因2破菌后沉淀电泳条带；M：Unstained Protein Molecular Weight Marker（条带分子量从上到下依次为：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa），样品上样量均为10μl，Marker上样量为5μl。

从实验结果可以看到，野生型TRAIL原核表达载体目的蛋白的表达较弱，且目的蛋白的表达主要分布在沉淀中，不利于纯化。新构建的pTWIN1/全长融合基因序列1、pTWIN1/全长融合基因序列2目的蛋白的表达较强，且目的蛋白主要存在于上清中。其中pTWIN1/全长融合基因序列1表达蛋白几乎完全可溶，pTWIN1/融合蛋白基因2可溶性蛋白大约占60%，这个结果虽不及18℃诱导结果，但明显优于30℃诱导结果，上清中目的蛋白含量也能够达到方便纯化的要求。野生型TRAIL的表达依然不佳，可能与其蛋白质的空间结构相关。

实施例5

pTWIN1/全长融合基因序列2不同温度、不同培养基表达研究

实验材料和方法同实施例3，如图8所示，图8是pTWIN1/融合基因2蛋白表达SDS-PAGE电泳图。37℃条件下诱导即有大量目的蛋白表达，但蛋白可溶性很差，上清中仅存在少量目的蛋白；降低温度至30℃诱导发现目的蛋白表达强度未受诱导期间温度影响，依然有较高水平的表达，而可溶性有所改善。将诱导温度降至极限18℃，目的蛋白表达强度有所减弱，但表达的目的蛋白完全可溶。将培养基由LB培养基换成以甘油为主要碳源的营养更丰富的TB培养基后，表达的目的蛋白约60%可溶，这个结果虽不及18℃结果，但明显优于30℃结果，上清中目的蛋白含量也能够达到方便纯化的要求。

图8是pTWIN1/融合基因2蛋白表达SDS-PAGE电泳图。

电泳条件：15%凝胶，200V，35min。M：Unstained Protein Molecular Weight Marker（条带分子量从上到下依次为：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa），样品上样量均为10μl，Marker上样量为5μl。

实施例6

融合蛋白1、2及TRAIL蛋白生物活性检测

融合蛋白1、2、野生型TRAIL蛋白及空白对照作用48小时后取相同浓度加药孔在光镜下观察，明显可以观察出四组在细胞数量上的不同，空白对照组细胞形态未发生明显变化，对于乳腺癌细胞株而言，三个加药组细胞数量明显减少，野生型TRAIL蛋白组尚残存部分形态正常的梭形MDA-MB-231，融合蛋白1、2组大部分细胞变圆，失去原有正常形态。野生型TRAIL蛋白对SPCA1细胞的杀伤作用微弱，极少细胞出现形态变化，与对照组相比细胞数量减少不明显。

1.SRB法肿瘤细胞毒性增殖抑制作用

MDA-MB-231为野生型TRAIL蛋白敏感细胞株，融合蛋白1、2和野生型TRAIL蛋白在50-0.02ug/ml范围内，作用48小时后观察，三者对MDA-MB-231均具有量效关系，融合蛋白1对生长抑制作用较明显，IC50为4.04×10^-6ng/ml，融合蛋白2对生长抑制作用也较明显IC50为6.67×10^-6ng/ml，野生型TRAIL蛋白IC50为9.45ng/ml。

SPCA1对野生型TRAIL蛋白不够敏感，在50～0.003ug/ml范围内生长抑制作用不明显，IC50为428.05ug/ml。而融合蛋白1、2在相同浓度范围内，具有较明显的生长抑制作用，其中融合蛋白1的IC50为4.64ug/ml，融合蛋白2的IC50为8.78ug/ml，较大程度逆转了肿瘤细胞对野生型TRAIL的耐受，细胞毒性试验结果见表20。

表20.融合蛋白1、2及野生型TRAIL对肿瘤细胞SRB细胞毒性试验结果

蛋白	细胞	IC50
			融合蛋白1	MDA-MB-231	4.04×10^-6ng/ml
融合蛋白2	MDA-MB-231	6.67×10^-6ng/ml
			融合蛋白1	SPCA1	4.64ug/ml

[0252]

融合蛋白2	SPCA1	8.78ug/ml
			天然TRAIL	MDA-MB-231	9.45ng/ml
天然TRAIL	SPCA1	428.05ug/ml

(IC50<10ug/ml为敏感)

2.AnnexinV-FITC/PI荧光标记流式细胞术检测凋亡

融合蛋白1、2和野生型TRAIL作用浓度皆为10ng/ml，在加药后6小时检测凋亡，结果显示在两种细胞株中，融合蛋白1、2诱导凋亡作用都强于野生型TRAIL蛋白，特别是在对TRAIL不敏感的肺癌细胞株中，融合蛋白仍然能起到较强的杀伤作用。两组凋亡率差异有统计学意义（P<0.01）。

本实施例的结果，进一步验证了实验设计的采用针对TRAIL受体DR₄、DR₅和凋亡拮抗因子XIAP双靶点对于TRAIL的明显增效作用。

表21.融合蛋白1、2及野生型TRAIL对肿瘤细胞作用流式分析结果

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

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