JP2021063820A - リボ毒性の一時的な減少に基づき、細胞毒性組換えポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法を提供する。【解決手段】a)複数のタンパク質を用意するステップであって、各タンパク質が、i)ペプチド又はポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とii)リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域から修飾された、修飾リボ毒性領域とを含む、ステップと;b)前記タンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴うタンパク質を選択するステップと;c)前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた、同定された結合領域に由来するか又はこれを含む1又は2以上のリボ毒性タンパク質を構築するために、選択されたタンパク質のペプチド領域又はポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む、前記方法。【選択図】なし
Description
本発明は、細胞毒性組換えポリペプチドを同定するために、分子ライブラリーをスクリーニングする方法であって、各ポリペプチドが、標的結合領域とリボ毒性領域(ribotoxic region)とを含み、これらが協同して、例えば、標的分子への結合アフィニティー、標的細胞への結合アフィニティー、及び/又は標的細胞への内部化など、所望される特徴を保有する方法に関する。
患者への投与の後に細胞ターゲティング型細胞毒性を呈示する新たな治療剤を創出しようとする試みでは、合成毒素構造体がデザインされている(総説については、Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007)を参照されたい)。このような分子操作の目標
は、少なくとも2つの機能的ドメイン:細胞ターゲティング領域及び細胞毒性毒素領域を含む細胞毒性分子をデザインすることである。このような細胞毒性分子の一般的な種類は、細胞ターゲティング領域及び毒素由来の細胞毒性領域の両方を含むキメラタンパク質である。細胞毒性キメラタンパク質をデザインする1つの方式は、例えば、高アフィニティーによる標的への結合及び/又は細胞への内部化など、所望される特徴について選択する技術を使用する、分子ライブラリーに対するハイスループットスクリーニングにより、有望な候補物質又は分子的枠組みを同定することである(Poul M et al., J Mol Biol, 301: 1149-61 (2000); Levin A, Weiss G,Mol Biosyst 2: 49-57 (2006); Mazor Y et al.,
J Immunol Methods 321: 41-59 (2007); Bidlingmaier S et al., Cancer Res 69:1570-7 (2009); Zou Y, Marks J, Methods Enzymol 502: 43-66 (2012)を参照されたい)。
は、少なくとも2つの機能的ドメイン:細胞ターゲティング領域及び細胞毒性毒素領域を含む細胞毒性分子をデザインすることである。このような細胞毒性分子の一般的な種類は、細胞ターゲティング領域及び毒素由来の細胞毒性領域の両方を含むキメラタンパク質である。細胞毒性キメラタンパク質をデザインする1つの方式は、例えば、高アフィニティーによる標的への結合及び/又は細胞への内部化など、所望される特徴について選択する技術を使用する、分子ライブラリーに対するハイスループットスクリーニングにより、有望な候補物質又は分子的枠組みを同定することである(Poul M et al., J Mol Biol, 301: 1149-61 (2000); Levin A, Weiss G,Mol Biosyst 2: 49-57 (2006); Mazor Y et al.,
J Immunol Methods 321: 41-59 (2007); Bidlingmaier S et al., Cancer Res 69:1570-7 (2009); Zou Y, Marks J, Methods Enzymol 502: 43-66 (2012)を参照されたい)。
分子ライブラリースクリーニングの目的は、多種多様な分子の中から、所望される特性又は機能を伴う分子を探索することである。特に、タンパク質ディスプレイ技術は、特異的な分子間相互作用など、所望される特性を呈示するポリペプチドを同定するための、大規模なタンパク質ライブラリーについての、統計学的検出力が大きなハイスループットスクリーニングを可能とする(総説については、Gloeckler J et al., Molecules 15: 2478-90 (2010)を参照されたい)。例えば、バクテリオファージディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、細胞表面ディスプレイ(原核細胞又は真核細胞)、RNAディスプレイ、タンパク質−DNA連結ディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びウイルスディスプレイなど、多様なタンパク質ディスプレイスクリーニング法が、タンパク質−リガンド相互作用についてスクリーニングするのに使用されている。特に、インビトロディスプレイ技術は、生物医学的適用のために、ヒトタンパク質に結合する免疫グロブリン型ドメインを同定するための強力なツールとなっている(Bradbury A et al., Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011))。
バクテリオファージディスプレイ(ファージディスプレイ)と呼ばれるインビトロディスプレイ法は、早くも2005年には標準法となった(Hoogenboom H, Nat Biotechnol 23: 1105-16 (2005))。特に、免疫グロブリンドメインについてのファージディスプレイ
スクリーニングは、大きな技術的ブレークスルーであった(McCafferty J et al., Nature348: 552-4 (1990)を参照されたい)。ファージディスプレイ法は、比較的大規模なポ
リペプチドライブラリー(例えば、1×109を超える固有のライブラリーメンバー)のスクリーニング検出力の改善を可能とした。その後、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びタンパク質−DNA連結系など、無細胞のインビトロタンパク質ディスプレイ系の開発により、なおより大規模なライブラリー(例えば、1×1015の固有のライブラリーメンバー)の広範なスクリーニングが可能となった。
スクリーニングは、大きな技術的ブレークスルーであった(McCafferty J et al., Nature348: 552-4 (1990)を参照されたい)。ファージディスプレイ法は、比較的大規模なポ
リペプチドライブラリー(例えば、1×109を超える固有のライブラリーメンバー)のスクリーニング検出力の改善を可能とした。その後、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びタンパク質−DNA連結系など、無細胞のインビトロタンパク質ディスプレイ系の開発により、なおより大規模なライブラリー(例えば、1×1015の固有のライブラリーメンバー)の広範なスクリーニングが可能となった。
タンパク質ディスプレイを介する分子ライブラリーのスクリーニングは、タンパク質ライブラリーのメンバーの一括発現及び一括スクリーニングを伴う一方で、表現型と遺伝子型との物理的接続を維持する、すなわち、提示されるタンパク質は、その個々のタンパク質をコードする核酸へと物理的に連結されている。例えば、1)ファージディスプレイでは、各ライブラリーポリペプチドは、特異的ポリペプチドをコードする遺伝子素材を含有するファージ粒子の外側カプシドの一部であり、2)酵母ディスプレイでは、各ライブラリーポリペプチドを、特異的ライブラリーポリペプチドをコードする遺伝子素材を含有する酵母細胞の外側細胞壁の一部を形成するようにデザインし、3)リボソームディスプレイでは、各ライブラリーポリペプチドは、特異的ポリペプチドをコードするRNAと物理的に会合するリボソームへのテザリングを維持し、4)RNAディスプレイでは、各ライブラリーポリペプチドを、特異的ポリペプチドをコードするRNAへと共有結合的にカップリングさせる(Valencia C et al., Methods 60: 55-69 (2013))。遺伝子型と表現型
との物理的連結は、特異的な分子間相互作用の一括スクリーニングを可能とする一方で、所望される表現型と関連する生物学的配列を同定するために、各ライブラリーメンバーとその個々の遺伝子型との間の接続を維持する。
との物理的連結は、特異的な分子間相互作用の一括スクリーニングを可能とする一方で、所望される表現型と関連する生物学的配列を同定するために、各ライブラリーメンバーとその個々の遺伝子型との間の接続を維持する。
ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、RNAディスプレイ、及びリボソームディスプレイなどのタンパク質ディスプレイ技術は全て、所望される分子間アフィニティー相互作用についてスクリーニングするのに広く使用されている(Chen T, Keating A, Protein Sci 21: 949-63 (2012))。タンパク質ディスプレイスクリーニングはまた、細胞への結合及び細胞への内部化など、他の特徴又は機能を伴うポリペプチドを同定するのにも使用することができる(Poul M et al., J Mol Biol, 301: 1149-61 (2000); Nielsen U et al.,Biochim Biophys Acta 1591: 109-18 (2002); Liu B et al., Cancer Res 64: 704-10(2004); Levin A, Weiss G, Mol Biosyst 2: 49-57 (2006); Mazor Y et al., JImmunol Methods 321: 41-59 (2007); Bidlingmaier S et al., Cancer Res 69: 1570-7(2009); Zhou Y et al., J Mol Biol 404: 88-99 (2010); Zhou Y et al., ArchBiochem Biophys 526: 107-13 (2012); Zhou Y, Marks J, Methods Enzymol 502: 43-66(2012))。
キメラ融合タンパク質は、タンパク質ディスプレイスクリーニングを使用して発見及び/又は改善されうる分子の1つのクラスを表す。ある特定の毒素に由来する細胞毒性融合タンパク質は、大半のタンパク質内には存在しない、強力なリボ毒性に部分的に依存する。一般に、細胞毒性融合タンパク質は、リボ毒性酵素ドメインを含む、自然発生のタンパク質毒素に由来する(Pastan I, et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Potala S, et al.,Drug Discov Today 13: 807-15 (2008); Kreitman R, BioDrugs 23: 1-13 (2009))。例えば、リボソームN−グリコシダーゼ活性を伴う、リボソーム不活性化タンパク
質(RIP,ribosome inactivating protein)であって、リシン、サルシン、志賀毒素
、アブリン、ゲロニン、及びサポリンを含むRIP、並びに、例えば、ADPリボシル化活性を伴う細菌AB毒素であって、ジフテリア毒素及びシュードモナス(Pseudomonas)
属外毒素を含む細菌AB毒素など、例えば、ある特定の毒素は、リボソーム機能を、触媒作用により阻害する(ShapiraA, Benhar I, Toxins 2: 2519-83 (2010))。これらの毒
素の全ての細胞毒性機構は、リボソーム機能の損傷、すなわち、リボ毒性を介して、タンパク質への翻訳を阻害する能力に基づく。
質(RIP,ribosome inactivating protein)であって、リシン、サルシン、志賀毒素
、アブリン、ゲロニン、及びサポリンを含むRIP、並びに、例えば、ADPリボシル化活性を伴う細菌AB毒素であって、ジフテリア毒素及びシュードモナス(Pseudomonas)
属外毒素を含む細菌AB毒素など、例えば、ある特定の毒素は、リボソーム機能を、触媒作用により阻害する(ShapiraA, Benhar I, Toxins 2: 2519-83 (2010))。これらの毒
素の全ての細胞毒性機構は、リボソーム機能の損傷、すなわち、リボ毒性を介して、タンパク質への翻訳を阻害する能力に基づく。
タンパク質ディスプレイスクリーニングを使用して、例えば、免疫毒素、リガンド−毒素融合体、及びイムノRNアーゼなど、毒素由来のリボ毒性領域を含む細胞毒性キメラタンパク質を発見及び開発することが所望される。タンパク質ディスプレイスクリーニングを使用して、新規のキメラ細胞毒性ポリペプチドの同定、並びに/又は細胞毒性ポリペプチドの任意の選択可能な特徴であって、例えば、標的分子への結合アフィニティー、細胞
のターゲティング、細胞への結合、細胞への内部化、細胞内の経路決定、酵素活性、及び細胞毒性などの特徴の最適化を行うことができる。しかし、毒素由来のポリペプチドを含むライブラリーについての、有効なタンパク質ディスプレイスクリーニングは、毒素由来のポリペプチド領域のリボ毒性作用により損なわれる場合もある。
のターゲティング、細胞への結合、細胞への内部化、細胞内の経路決定、酵素活性、及び細胞毒性などの特徴の最適化を行うことができる。しかし、毒素由来のポリペプチドを含むライブラリーについての、有効なタンパク質ディスプレイスクリーニングは、毒素由来のポリペプチド領域のリボ毒性作用により損なわれる場合もある。
タンパク質ディスプレイスクリーニングは、毒素由来のリボ毒性領域を含む発現ライブラリー内に存在するリボ毒性により妨げられる場合がある。この問題について取り組むために、リボ毒性ポリペプチドは多くの場合、漸次方式により、毒素由来ドメインの非存在下で細胞ターゲティングドメインをスクリーニングし、次いで、2つのドメインを併せて連結して、細胞毒性キメラ分子を形成することにより、開発されている。代替的に、リボ毒性ポリペプチドのタンパク質ディスプレイスクリーニングが成功した少数のまれな場合でも、成功は、比較的小型(例えば、約1×104〜約4×105)のライブラリーであって、可能となる検出力が、毒素由来のリボ毒性ドメインを欠くポリペプチド発現ライブラリーに利用可能な日常的スクリーニング法を使用して可能な検出力より有意に小さなライブラリーの場合に限り可能であった(Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010); Cizeau et al., J BiomolScreen 16: 90-100 (2011))。
リボ毒性領域を含む大半のキメラ融合タンパク質は、細胞ターゲティング領域を、リボ毒性領域と別個に単離して、漸次方式で開発されているため、この結果として、完全なキメラ構造を構築するためには、さらなる分子操作ステップが必要とされ、このために、キメラ構造は、異なる物理的属性及び機能的属性を獲得する可能性もあろう。さらに、細胞毒性構成要素を付加することによりキメラ構造を完成させる追加のステップは、開発工程のさらなる非効率性も表す。さらに、キメラ構造が、その構成要素の、所望される機能的活性を保持する場合でもなお、最終的な細胞毒性キメラ構造を作製するための産生工程は、細胞ターゲティングとリボ毒性ドメインとを独立に産生する場合には明らかとならなかった、さらなる最適化ステップを要請する場合もある。これら全ての理由により、おそらく他の理由にもより、毒素由来のリボ毒性融合タンパク質をデザインし、産生する現行の手法により選択される分子は一般に、理想的な特性に満たない(Weldon J, Pastan I, FEBS J 278: 4683-700 (2011))。
Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37(2007)
Poul M et al., J Mol Biol, 301: 1149-61(2000)
Levin A, Weiss G, Mol Biosyst 2: 49-57 (2006)
Mazor Y et al., J Immunol Methods 321: 41-59(2007)
Bidlingmaier S et al., Cancer Res 69: 1570-7(2009)
Zou Y, Marks J, Methods Enzymol 502: 43-66(2012)
Gloeckler J et al., Molecules 15: 2478-90(2010)
Bradbury A et al., Nat Biotechnol 29: 245-54(2011)
Hoogenboom H, Nat Biotechnol 23: 1105-16(2005)
McCafferty J et al., Nature 348: 552-4(1990)
Valencia C et al., Methods 60: 55-69 (2013)
Chen T, Keating A, Protein Sci 21: 949-63(2012)
Nielsen U et al., Biochim Biophys Acta 1591:109-18 (2002)
Liu B et al., Cancer Res 64: 704-10 (2004)
Zhou Y et al., J Mol Biol 404: 88-99 (2010)
Zhou Y et al., Arch Biochem Biophys 526:107-13 (2012)
Potala S, et al., Drug Discov Today 13:807-15 (2008)
Kreitman R, BioDrugs 23: 1-13 (2009)
Shapira A, Benhar I, Toxins 2: 2519-83(2010)
Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)
Cizeau et al., J Biomol Screen 16: 90-100(2011)
Weldon J, Pastan I, FEBS J 278: 4683-700(2011)
当技術分野では、タンパク質ディスプレイフォーマット内に、毒素由来のリボ毒性ポリペプチドを含む、ディスプレイスクリーニングライブラリーによる方法であって、より有効であり、より効率的であり、統計学的検出力がより大きく、例えば、高アフィニティー、標的細胞への結合、細胞への内部化の促進、及び産生の容易さなど、所望される程度がより大きな特性を伴うリボ毒性タンパク質及びリボ毒性ポリペプチドを、より効率的に同定及び選択するために、望ましくない選択バイアスを最小化する方法が依然として必要とされている。
本発明は、リボ毒性の一時的な低減又は消失に基づき、2つ又は3つ以上の連結されたポリペプチド領域である、リボ毒性領域及び結合領域の文脈で、細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定するための改善された方法を提供する。本発明の方法を、任意のタンパク質ディスプレイ系と共に使用して、例えば、標的分子への結合アフィニティー、標的細胞への結合アフィニティー、及び/又は標的細胞への内部化など、1又は2以上のアッセイ選択可能な特徴を選択することができる。リボ毒性の低減又は消失は、少なくとも2つの方式で:1)リボ毒性領域内の1カ所若しくは2カ所以上の変異によりもたらされる、毒素領域の非リボ毒性形態を使用すること、並びに/又は2)阻害剤の存在下で、適切なリボ毒性領域を有する分子のスクリーニング及び/若しくは選択を実施することにより、達成することができる。
本発明の方法のある特定の実施形態は、1)各々が、リボ毒性を低減するか又は消失させた、毒素由来のリボ毒素領域を含むポリペプチドを、アッセイにより選択される機能的形態でディスプレイするように、タンパク質ディスプレイ技術を使用して、組換えポリペプチドの多様なライブラリーを発現させるステップと;2)ポリペプチドの中から選択するステップと;3)選択されたポリペプチドに由来するが、リボ毒性のより強いリボ毒性領域を伴うリボ毒性ポリペプチドのデザインにおける使用のために、選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を同定するステップとを含む様々な方法を伴う。本発明の方法のある特定の他の実施形態は、上記で列挙されたステップを含むが、各々が非修飾リボ毒性領域を含むポリペプチドの多様なライブラリーを使用する様々な方法であって、ステップを、リボ毒性領域の適切な阻害剤の存在下で実施する方法を伴う。ポリペプチドの多様なライブラリーは、各々が、標的細胞と会合した細胞外標的生体分子に特異的に結合する結合領域を含む、複数のポリペプチドを含みうる。本発明のスクリーニング法を使用して同定された細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドは、例えば、細胞殺滅のターゲティングのための使用、並びにがん、免疫障害、及び微生物感染を含む、様々な疾患、障害、及び状態の治療における治療剤としての使用など、様々な使用に供される。
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法であって、細胞毒性タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数のタンパク質を用意するステップであり、各分子が、(1)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と、(2)リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒
性領域とを含むステップと;(b)複数のタンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴うタンパク質を選択するステップと;(c)前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた同定された結合領域に由来するか又はこれを含む1又は2以上のリボ毒性タンパク質を構築するために、選択されたタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
性領域とを含むステップと;(b)複数のタンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴うタンパク質を選択するステップと;(c)前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた同定された結合領域に由来するか又はこれを含む1又は2以上のリボ毒性タンパク質を構築するために、選択されたタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
本発明のある特定の実施形態では、方法は、ステップ(a)である、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップの前に、(a’)複数の結合領域をコードすることが可能な、複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも2つのサブセットが、異なる結合領域を伴うポリペプチドをコードするステップと、(b’)前記ライブラリーのポリヌクレオチドを、修飾リボ毒性領域をコードすることが可能な毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、複数のポリペプチドをコードすることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と会合させた結合領域を含むステップとをさらに含む。
本発明のある特定の実施形態では、方法は、ステップ(a)である、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップの前に、(a’)複数の結合領域をコードすることが可能な、複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも2つのサブセットが、異なる前記結合領域を伴うポリペプチドをコードするステップと;(b’)前記ライブラリーのポリヌクレオチドを、修飾リボ毒性領域をコードすることが可能な毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、複数のポリペプチドをコードすることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含むステップと;(c’)前記ポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドを、発現ポリヌクレオチド鋳型へと組み換えて、複数のポリペプチドを発現させることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含むステップとをさらに含む。
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性融合ポリペプチドを同定するための方法であって、細胞毒性融合ポリペプチドが、(1)リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、(2)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドから構築された、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップであり、各融合ポリペプチドが、(1)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と、(2)リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域とを含むステップと;(b)複数の融合ポリペプチドが産生されるように、多様な核酸の発現ライブラリーを発現させるステップと;(c)産生された融合ポリペプチドの中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴う発現させた融合ポリペプチドを選択するステップと;(d)前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態へと融合させた同定された結合領域を含むか又はこれに由来する1又は2以上のリボ毒性融合ポリペプチドを構築するために、選択された融合ポリペプチドのアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
ある特定のさらなる実施形態では、方法は、(e)前記リボ毒性融合ポリペプチドを産生するステップをさらに含み、産生するステップは、(e1)前記同定されたリボ毒性融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用意することと、任意に、(e2)宿主細胞又は無細胞翻訳系を使用して、前記ポリヌクレオチドを発現させることとをさらに含む。
本発明のある特定の実施形態では、方法は、ステップ(a)である、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップの前に、(a’)複数の結合領域をコードすることが可能な、複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも2つのサブセットが、異なる結合領域を伴うポリペプチドをコードするステップと;(b’)前記ライブラリーのポリヌクレオチドを、修飾リボ毒性領域をコードすることが可能な毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含むステップとをさらに含む。
本発明のある特定の実施形態では、方法は、ステップ(a)である、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップの前に、(a’)複数の結合領域をコードすることが可能な、複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも2つのサブセットが、異なる前記結合領域を伴うポリペプチドをコードするステップと;(b’)前記ライブラリーのポリヌクレオチドを、修飾リボ毒性領域をコードすることが可能な毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含むステップと;(c’)前記ポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドを、発現ポリヌクレオチド鋳型へと組み換えて、複数の融合ポリペプチドを発現させることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含むステップとをさらに含む。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ(Amaranthus)属抗ウイルス性タンパク質/RIP、アンギオジェニン、A.パテンス(A.patens)RIP、アーティクラチンD、ア
スパリン、アスペルギリン、Aspf1、バルサミン、トウガン(B. hispida)RIP、ブーガニン、ブーゲンビレア(Bougainvillea x buttiana)抗ウイルス性タンパク質1、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキ(B. rubra)RIP、ブリオジン(例えば、ブリオジン1、ブリオジン2)、イカダカズラ(B. spectabilis)RIP、ビート(B.
vulgaris)RIP、シロザ(C. album)RIP、カンホリン、トゲエビス(C. aculeatum)全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲ(C. cristata)RIP、ククミス・フィガレイ(C. figarei)RIP、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャ(C. moschata)RIP、コチニンB、コロシン、クロチン、ククルモシン、ク
ルシン、ナデシコ(Dianthus)属種RIP、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属
種ジフテリア毒素(C.ウルセランス(C. ulcerans)内、コリネファージオメガ(Corynephage omega)内、C.シュードツベルクローシス(C.pseudotuberculosis)内のジフ
テリア毒素)、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウ(E. hyemalis)RIP、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミ
ン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキ(H. crepitans)RIP、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンA、ヒヤシンス(H. orientalis)RIP、オオ
ムギ(H. vulgare)RIP、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリス(I. hollandica
)RIP、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマ(L. cylindrical)RIP、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマ(L. usitatissimum)RIP、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシ(M. charantia)レクチン、アイスプラント(M. crystallinum)RIP、メロニン、メキシン
、オシロイバナ(Mirabilis)属種RIP、ミトギリン、モデクシン、MOR、ツルレイ
シ(Mormordica)属種RIP、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコ(N.
tabacum)RIP、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピー(P.californicum)レクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジ
ン、ヤマゴボウ(Phytolacca)属種RIP(例えば、オールスパイス(P. dioica)RI
Pである、PD−L1、PD−L2、PD−L3、PD−L4)、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナ(A. thaliana)ペクチンメチルトランスフェラー
ゼ(PME,pectin methyl transferase)、ソロモンズシール(P. multiforum)RIP、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP,pokeweedantiviral protein)、ポレクチン、エロモナス菌(Aeromonas)属種シュードモナス属毒素(エロモナス・ハ
イドロフィラ(A. hydrophila)シュードモナス様毒素)、プルケリン、キンケギンシン
、トウゴマ(R. communis)アグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン
、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギ(S. cereale)RIP、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンb、セイヨウニワトコ(S. nigra)RIP(例えば、セイヨウニワトコアグルチニンI〜セイヨウニワトコアグルチニンV)、ツルコザクラ(S. ocymoides)RIP、ホウレンソウ(Spinacia oleracea)タンパク質、ステラリン、ステ
ノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ(Trichosanthes)属種RIP(例
えば、カラスリン、キリロウィン、トリコアングィン、トリコキリン、トリコサンチン、TYカイ)、コムギ(Triticum)属種RIP、ヤドリギ(V. album)RIP、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウ(V.hispanica)RIP、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケ(V. volvacea)RIP、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Z.ジプロペレ
ンニス(Z. diploperennis)RIP、トウモロコシ(Z. mays)RIP、及び前出のうち
のいずれかによる任意のリボ毒性断片からなる群から選択される毒素に由来する。
スパリン、アスペルギリン、Aspf1、バルサミン、トウガン(B. hispida)RIP、ブーガニン、ブーゲンビレア(Bougainvillea x buttiana)抗ウイルス性タンパク質1、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキ(B. rubra)RIP、ブリオジン(例えば、ブリオジン1、ブリオジン2)、イカダカズラ(B. spectabilis)RIP、ビート(B.
vulgaris)RIP、シロザ(C. album)RIP、カンホリン、トゲエビス(C. aculeatum)全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲ(C. cristata)RIP、ククミス・フィガレイ(C. figarei)RIP、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャ(C. moschata)RIP、コチニンB、コロシン、クロチン、ククルモシン、ク
ルシン、ナデシコ(Dianthus)属種RIP、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属
種ジフテリア毒素(C.ウルセランス(C. ulcerans)内、コリネファージオメガ(Corynephage omega)内、C.シュードツベルクローシス(C.pseudotuberculosis)内のジフ
テリア毒素)、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウ(E. hyemalis)RIP、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミ
ン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキ(H. crepitans)RIP、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンA、ヒヤシンス(H. orientalis)RIP、オオ
ムギ(H. vulgare)RIP、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリス(I. hollandica
)RIP、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマ(L. cylindrical)RIP、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマ(L. usitatissimum)RIP、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシ(M. charantia)レクチン、アイスプラント(M. crystallinum)RIP、メロニン、メキシン
、オシロイバナ(Mirabilis)属種RIP、ミトギリン、モデクシン、MOR、ツルレイ
シ(Mormordica)属種RIP、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコ(N.
tabacum)RIP、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピー(P.californicum)レクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジ
ン、ヤマゴボウ(Phytolacca)属種RIP(例えば、オールスパイス(P. dioica)RI
Pである、PD−L1、PD−L2、PD−L3、PD−L4)、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナ(A. thaliana)ペクチンメチルトランスフェラー
ゼ(PME,pectin methyl transferase)、ソロモンズシール(P. multiforum)RIP、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP,pokeweedantiviral protein)、ポレクチン、エロモナス菌(Aeromonas)属種シュードモナス属毒素(エロモナス・ハ
イドロフィラ(A. hydrophila)シュードモナス様毒素)、プルケリン、キンケギンシン
、トウゴマ(R. communis)アグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン
、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギ(S. cereale)RIP、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンb、セイヨウニワトコ(S. nigra)RIP(例えば、セイヨウニワトコアグルチニンI〜セイヨウニワトコアグルチニンV)、ツルコザクラ(S. ocymoides)RIP、ホウレンソウ(Spinacia oleracea)タンパク質、ステラリン、ステ
ノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ(Trichosanthes)属種RIP(例
えば、カラスリン、キリロウィン、トリコアングィン、トリコキリン、トリコサンチン、TYカイ)、コムギ(Triticum)属種RIP、ヤドリギ(V. album)RIP、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウ(V.hispanica)RIP、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケ(V. volvacea)RIP、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Z.ジプロペレ
ンニス(Z. diploperennis)RIP、トウモロコシ(Z. mays)RIP、及び前出のうち
のいずれかによる任意のリボ毒性断片からなる群から選択される毒素に由来する。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、結合領域は、相補性決定領域3断片、拘束性FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、単鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合性断片、Fd断片、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−Bクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、操作抗体模倣体、及び結合機能性を保持する前出のうちのいずれかによる任意の遺伝子操作対応物からなる群から選択される。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、発現ライブラリーは、バクテリオファージディスプレイ、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、DNAディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、微生物ディスプレイ、及び哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択される、特異的な特徴を選択するためのタンパク質ディスプレイ法を使用して作動可能である。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される標的生体分子に結合することが可能である。本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される、細胞外の標的生体分子に結合することが可能である。本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される、細胞内の標的生体分子に結合することが可能である。悪性細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、増生細胞、感染細胞、及び異常細胞として特徴づけられる細胞を含む。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、標的生体分子は、CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスY、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイスY2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、線維芽細胞増殖因子受容体、CD339、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ会合抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトタンパク質抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a〜CD11c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD120、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のうちのいずれかによる任意の抗原性断片からなる群から選択される。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、多様な核酸の発現ライブラリーの少なくとも1つの前記結合領域のアミノ酸配列は、抗原又は抗原性ペプチドをコードすることが可能な核酸により免疫化された脊椎動物に由来する。本発明のある特定のさらなる実施形態では、脊椎動物は、鳥類、ウシ科動物、ラクダ科動物、軟骨魚類、ウマ科動物、ウサギ目動物、霊長動物、齧歯動物、及びイノシシ亜目動物からなる群から選択される。本発明のある特定のさらなる実施形態では、抗原又は抗原性ペプチドは、CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスY、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイスY2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、線維芽細胞増殖因子受容体、CD339、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ会合抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトタンパク質抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a〜CD11c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD120、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のうちのいずれかによる任意の抗原性断片からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列に由来する。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、配列番号1〜39のアミノ酸配列のうちのいずれか1つ又はその任意のリボ毒性断片に由来する。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットのアミノ酸配列に由来する。本発明のある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、Aサブユニットの、天然で配置されたアミノ酸残基であって、N75、Y77、Y114、E167、R170、R172、R176、R179、R188、V191、W203、及びL233を含む群から選択されるアミノ酸残基の変異を含む。
本発明の一実施形態は、細胞毒性融合ポリペプチドをコードする核酸を産生するための方法であって、(a)上述の実施形態による方法を使用して、タンパク質ディスプレイにより選択された融合ポリペプチドのポリペプチド配列を同定するステップと、(b)リボ毒性領域へと融合させた結合領域を含む細胞毒性融合ポリペプチドをコードすることが可能であり、リボ毒性領域のリボ毒性が、同定されたポリペプチドの修飾リボ毒性領域より強くなるように、前記同定されたポリペプチド配列に由来する核酸を創出するステップとを含む方法である。
本発明の一実施形態は、細胞毒性融合ポリペプチドを同定するための核酸ライブラリーを産生するための方法であって、(a)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な複数の結合領域をコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドを用意するステップと、(b)前記複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、修飾リボ毒性領域のリボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸変異により、リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域をコードすることが可能な複数の毒素鋳型ポリヌクレオチドへと接合させるステップとを含み、接合させた複数のポリヌクレオチドが各々、前記修飾リボ毒性領域へと融合させた結合領域を含む融合ポリペプチドをコードすることが可能である方法である。
本発明の一実施形態は、細胞毒性融合ポリペプチドを同定するための発現ライブラリーを産生するための方法であって、(a)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な複数の結合領域をコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドを用意するステップと、(b)前記複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、修飾リボ毒性領域のリボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸変異により、リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域をコードすることが可能な複数の毒素鋳型ポリヌクレオチドへと接合させるステップと、(c)前記接合させた複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、発現ベクターへと接合させて、複数の融合ポリペプチドを発現させることが可能な発現ライブラリーを形成するステップであり、各融合ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含むステップとを含む方法である
。
。
本発明のある特定の実施形態は、上記の方法のうちのいずれか1つにより創出された分子ライブラリーであって、前記修飾リボ毒性領域は、アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ属抗ウイルス性タンパク質/RIP、アンギオジェニン、A.パテンスRIP、アーティクラチンD、アスパリン、アスペルギリン、Aspf1、バルサミン、トウガンRIP、ブーガニン、ブーゲンビレア抗ウイルス性タンパク質1、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキRIP、ブリオジン(例えば、ブリオジン1、ブリオジン2)、イカダカズラRIP、ビートRIP、シロザRIP、カンホリン、トゲエビス全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲRIP、ククミス・フィガレイRIP、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャRIP、コチニンB、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種RIP、コリネバクテリウム属種ジフテリア毒素(C.ウルセランス内、コリネファージオメガ内、C.シュードツベルクローシス内のジフテリア毒素)、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウRIP、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキRIP、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンA、ヒヤシンスRIP、オオムギRIP、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリスRIP、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマRIP、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマRIP、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシレクチン、アイスプラントRIP、メロニン、メキシン、オシロイバナ属種RIP、ミトギリン、モデクシン、MOR、ツルレイシ属種RIP、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコRIP、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピーレクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ属種RIP(例えば、オールスパイスRIPである、PD−L1、PD−L2、PD−L3、PD−L4)、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナペクチンメチルトランスフェラーゼ(PME)、ソロモンズシールRIP、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP)、ポレクチン、エロモナス菌属種シュードモナス属毒素(エロモナス・ハイドロフィラシュードモナス様毒素)、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマアグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギRIP、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンb、セイヨウニワトコRIP(例えば、セイヨウニワトコアグルチニンI〜セイヨウニワトコアグルチニンV)、ツルコザクラRIP、ホウレンソウタンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ属種RIP(例えば、カラスリン、キリロウィン、トリコアングィン、トリコキリン、トリコサンチン、TYカイ)、コムギ属種RIP、ヤドリギRIP、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウRIP、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケRIP、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Z.ジプロペレンニスRIP、トウモロコシRIP、及び前出のうちのいずれかによる任意のリボ毒性断片からなる群から選択される毒素のアミノ酸配列に由来する分子ライブラリーである。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、ライブラリーの結合領域は、相補性決定領域3断片、拘束性FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、単鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合性断片、Fd断片、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−Bクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、操作抗体模倣体、及び結合機能性を保持する前出のうちのいずれかによる任意の遺伝子操作対応物からなる群から選択される。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、ライブラリーの結合領域は、バクテリオファージディスプレイ、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、DNAディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、微生物ディスプレイ、及び哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択される、特異的な特徴を選択するためのタンパク質ディスプレイ法を使用して作動可能である。
ある特定のさらなる実施形態では、ライブラリーの少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される標的生体分子に結合することが可能である。本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される、細胞外の標的生体分子に結合することが可能である。本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される、細胞内の標的生体分子に結合することが可能である。悪性細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、増生細胞、感染細胞、及び異常細胞として特徴づけられる細胞を含む。
ある特定のさらなる実施形態では、ライブラリーの少なくとも1つの結合領域の標的生体分子は、CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスY、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイスY2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、線維芽細胞増殖因子受容体、CD339、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ会合抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトタンパク質抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a〜CD11c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD120、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のうちのいずれかによる任意の抗原性断片からなる群から選択される。
本発明のライブラリーのある特定のさらなる実施形態では、前記少なくとも1つの結合領域のアミノ酸配列は、抗原又は抗原性ペプチドをコードすることが可能な核酸により免疫化された脊椎動物に由来する。ある特定のさらなる実施形態では、免疫化された脊椎動物は、鳥類、ウシ科動物、ラクダ科動物、軟骨魚類、ウマ科動物、ウサギ目動物、霊長動物、齧歯動物、及びイノシシ亜目動物からなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態では、抗原又は抗原性ペプチドは、CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスY、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイスY2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、線維芽細胞増殖因子受容体、CD339、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ会合抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトタンパク質抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、CD193、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a〜CD11c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD120、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のうちのいずれかによる任意の抗原性断片からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列に由来する。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、配列番号1〜39又はその任意の機能的なリボ毒性断片に由来する。
本発明のライブラリーのある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットのアミノ酸配列に由来する。本発明のある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、Aサブユニットの、天然で配置されたアミノ酸残基であって、N75、Y77、Y114、E167、R170、R172、R176、R179、R188、V191、W203、及びL233を含む群から選択されるアミノ酸残基の変異を含む。
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法であって、細胞毒性タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数のタンパク質を用意するステップであり、各タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含むステップと;(b)リボ毒性領域の阻害剤の存在下で、複数のタンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴う1又は2以上のタンパク質を選択するステップと;(d)選択されたタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性融合ポリペプチドを同定するための方法であって、細胞毒性融合ポリペプチドが、(1)リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、(2)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドから構築された、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップであり、各融合ポリペプチドが、(1)リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、(2)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含むステップと;(b)複数の融合ポリペプチドが産生されるように、多様な核酸の発現ライブラリーを発現させるステップと;(c)リボ毒性領域の阻害剤の存在下で、産生された融合ポリペプチドの中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴う、1又は2以上の融合ポリペプチドを選択するステップと;(d)選択された融合ポリペプチドの配列を同定するステップとを含む方法である。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、方法は、(e)同定された細胞毒性融合ポリペプチドを産生するステップをさらに含み、ここで、前記産生するステップは、(e1)前記細胞毒性融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用意することと、(e2)宿主細胞又は無細胞翻訳系を使用して、前記ポリヌクレオチドを発現させることとをさらに含む。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、方法は、ステップ(a)である、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップの前に、(a’)複数の結合領域をコードすることが可能な、複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも2つのサブセットが、異なる結合領域を伴うポリペプチドをコードするステップと;(b’)前記ライブラリーのポリヌクレオチドを、リボ毒性領域をコードすることが可能な毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、結合領域及び前記リボ毒性領域を含むステップとをさらに含む。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、方法は、ステップ(a)である、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップの前に、(a’)複数の結合領域をコードすることが可能な、複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも2つのサブセットが、異なる前記結合領域を伴うポリペプチドをコードするステップと、(b’)前記ライブラリーのポリヌクレオチドを、リボ毒性領域をコードすることが可能な毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、前記結合領域及び前記リボ毒性領域により構成される、複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップと、(c’)前記ポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドを、発現ポリヌクレオチド鋳型へと組み換えて、複数の融合ポリペプチドを発現させることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、結合領域及び前記リボ毒性領域を含むステップとをさらに含む。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、方法のリボ毒性領域は、アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ属抗ウイルス性タンパク質/RIP、アンギオジェニン、A.パテンスRIP、アーティクラチンD、アスパリン、アスペルギリン、Aspf1、バルサミン、トウガンRIP、ブーガニン、ブーゲンビレア抗ウイルス性タンパク質1、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキRIP、ブリオジン(例えば、ブリオジン1、ブリオジン2)、イカダカズラRIP、ビートRIP、シロザRIP、カンホリン、トゲエビス全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲRIP、ククミス・フィ
ガレイRIP、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャRIP、コチニンB、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種RIP、コリネバクテリウム属種ジフテリア毒素(C.ウルセランス内、コリネファージオメガ内、C.シュードツベルクローシス内のジフテリア毒素)、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウRIP、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキRIP、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンA、ヒヤシンスRIP、オオムギRIP、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリスRIP、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマRIP、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマRIP、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシレクチン、アイスプラントRIP、メロニン、メキシン、オシロイバナ属種RIP、ミトギリン、モデクシン、MOR、ツルレイシ属種RIP、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコRIP、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピーレクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ属種RIP(例えば、オールスパイスRIPである、PD−L1、PD−L2、PD−L3、PD−L4)、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナペクチンメチルトランスフェラーゼ(PME)、ソロモンズシールRIP、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP)、ポレクチン、エロモナス菌属種シュードモナス属毒素(エロモナス・ハイドロフィラシュードモナス様毒素)、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマアグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギRIP、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンb、セイヨウニワトコRIP(例えば、セイヨウニワトコアグルチニンI〜セイヨウニワトコアグルチニンV)、ツルコザクラRIP、ホウレンソウタンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ属種RIP(例えば、カラスリン、キリロウィン、トリコアングィン、トリコキリン、トリコサンチン、TYカイ)、コムギ属種RIP、ヤドリギRIP、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウRIP、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケRIP、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Z.ジプロペレンニスRIP、トウモロコシRIP、及び前出のうちのいずれかによる任意のリボ毒性断片からなる群から選択される毒素に由来する。
ガレイRIP、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャRIP、コチニンB、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種RIP、コリネバクテリウム属種ジフテリア毒素(C.ウルセランス内、コリネファージオメガ内、C.シュードツベルクローシス内のジフテリア毒素)、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウRIP、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキRIP、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンA、ヒヤシンスRIP、オオムギRIP、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリスRIP、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマRIP、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマRIP、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシレクチン、アイスプラントRIP、メロニン、メキシン、オシロイバナ属種RIP、ミトギリン、モデクシン、MOR、ツルレイシ属種RIP、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコRIP、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピーレクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ属種RIP(例えば、オールスパイスRIPである、PD−L1、PD−L2、PD−L3、PD−L4)、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナペクチンメチルトランスフェラーゼ(PME)、ソロモンズシールRIP、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP)、ポレクチン、エロモナス菌属種シュードモナス属毒素(エロモナス・ハイドロフィラシュードモナス様毒素)、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマアグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギRIP、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンb、セイヨウニワトコRIP(例えば、セイヨウニワトコアグルチニンI〜セイヨウニワトコアグルチニンV)、ツルコザクラRIP、ホウレンソウタンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ属種RIP(例えば、カラスリン、キリロウィン、トリコアングィン、トリコキリン、トリコサンチン、TYカイ)、コムギ属種RIP、ヤドリギRIP、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウRIP、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケRIP、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Z.ジプロペレンニスRIP、トウモロコシRIP、及び前出のうちのいずれかによる任意のリボ毒性断片からなる群から選択される毒素に由来する。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、方法の少なくとも1つの結合領域は、相補性決定領域3断片、拘束性FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、単鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合性断片、Fd断片、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−Bクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、操作抗体模倣体、及び結合機能性を保持する前出のうちのいずれかによる任意の遺伝子操作対応物からなる群から選択される。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、方法の発現ライブラリーは、バクテリオファージディスプレイ、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、DNAディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、微生物ディスプレイ、及び哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択される、特異的な特徴を選択するためのタンパク質ディスプレイ法を使用して作動可能である。
ある特定のさらなる実施形態では、方法の少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される標的生体分子に結合することが可能である。本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される、細胞外の標的生体分子に結合
することが可能である。本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される、細胞内の標的生体分子に結合することが可能である。悪性細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、増生細胞、感染細胞、及び異常細胞として特徴づけられる細胞を含む。
することが可能である。本発明のある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの結合領域は、少なくとも1つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される、細胞内の標的生体分子に結合することが可能である。悪性細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、増生細胞、感染細胞、及び異常細胞として特徴づけられる細胞を含む。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、方法の少なくとも1つの結合領域の標的生体分子は、CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスY、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイスY2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、線維芽細胞増殖因子受容体、CD339、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ会合抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトタンパク質抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、CD193、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a〜CD11c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD120、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のうちのいずれかによる任意の抗原性断片からなる群から選択される。
本発明のライブラリーのある特定のさらなる実施形態では、少なくとも1つの前記結合領域のアミノ酸配列は、抗原又は抗原性ペプチドをコードすることが可能な核酸により免疫化された脊椎動物に由来する。ある特定のさらなる実施形態では、免疫化された脊椎動物は、鳥類、ウシ科動物、ラクダ科動物、軟骨魚類、ウマ科動物、ウサギ目動物、霊長動物、齧歯動物、及びイノシシ亜目動物からなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態では、抗原又は抗原性ペプチドは、CD20、CD22、CD40、CD79、C
D25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスY、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイスY2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、線維芽細胞増殖因子受容体、CD339、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ会合抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトタンパク質抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a〜CD11c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD120、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のうちのいずれかによる任意の抗原性断片からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列に由来する。
D25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスY、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイスY2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、線維芽細胞増殖因子受容体、CD339、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼ会合抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトタンパク質抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a〜CD11c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD120、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のうちのいずれかによる任意の抗原性断片からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列に由来する。
ある特定のさらなる実施形態では、リボ毒性領域は、配列番号1〜14又はそれらの任意のリボ毒性断片に由来する。
本発明のある特定のさらなる実施形態では、ライブラリーのリボ毒性領域は、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットのアミノ酸配列に由来する。
ある特定のさらなる実施形態では、修飾リボ毒性領域は、配列番号15〜39又はそれらの任意のリボ毒性断片を含むか又はこれらから本質的になる。
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドのある特定の実施形態では、細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドは、2つ又は3つ以上の異種ポリペプチド領域を含み、ここで、2つ又は3つ以上の領域のうちの少なくとも1つは、リボ毒性領域を含み、2つ又は3つ以上の異種領域のうちの異なる1つは、結合領域を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、本発明の任意の方法を使用して創出又は同定された細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドをコードする。
ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、本発明の任意の方法により産生された核酸である。ある特定のさらなる実施形態では、核酸は、配列番号40〜64のうちのいずれか1つによるポリヌクレオチド配列又はその誘導体を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の分子ライブラリーは、本発明の任意の方法により産生されたライブラリーである。ある特定のさらなる実施形態では、分子ライブラリーは、配列番号40〜64のうちのいずれか1つによるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
以下では、例示的な非限定的実施形態を使用し、付属の図を参照して、本発明についてより完全に記載する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、下記に示される実施形態に限定されるとみなすべきではない。そうではなくて、これらの実施形態は、本開示が完全であり、本発明の範囲を当業者へと伝達するように提示される。
本発明をより容易く理解しうるために、下記では、ある特定の用語について定義する。さらなる定義は、本発明についての詳細な記載の中に見出すことができる。
本明細書及び付属の特許請求の範囲において使用される「a」、「an」及び「the」という用語は、文脈によりそうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、単数及び複数両方の指示対象を含む。
2つの種であるA及びBに言及して本明細書及び付属の特許請求の範囲において使用される「及び/又は」という用語は、A及びBのうちの少なくとも1つを意味する。A、B、及びCなど、2つ以上の種に言及して本明細書及び付属の特許請求の範囲において使用される「及び/又は」という用語は、A、B、若しくはCのうちの少なくとも1つ、又はA、B、若しくはCの任意の組合せのうちの少なくとも1つ(各種は、単数又は複数の可能性がある)を意味する。
本明細書を通して、「〜を含む(comprise)」という語又は「〜を含む(comprises)
」又は「〜を含むこと(comprising)」などの変化形は、言明された整数(又は構成要素)又は整数(又は構成要素)の群の包含を含意するものであり、他の任意の整数(又は構成要素)又は整数(又は構成要素)の群の除外を含意するものではないと理解されよう。
」又は「〜を含むこと(comprising)」などの変化形は、言明された整数(又は構成要素)又は整数(又は構成要素)の群の包含を含意するものであり、他の任意の整数(又は構成要素)又は整数(又は構成要素)の群の除外を含意するものではないと理解されよう。
本明細書を通して、「〜を含むこと(including)」という用語は、「〜を含むがこれ
らに限定されないこと」を意味するように使用される。「〜を含むこと(including)」
と「〜を含むがこれらに限定されないこと」とは、互換的に使用される。
らに限定されないこと」を意味するように使用される。「〜を含むこと(including)」
と「〜を含むがこれらに限定されないこと」とは、互換的に使用される。
「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドへと組み込まれたアミノ酸に対する言及を含む。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸又はアミノ酸残基の任意のポリマーを含む。「ポリペプチド配列」という用語は、ポリペプチドを物理的に構成する、一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。「タンパク質」とは、1若しくは2以上のポリペプチド又はポリペプチド「鎖」を含む高分子である。「ペプチド」とは、サイズが合計15〜20アミノ酸残基未満である、小型のポリペプチドである。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で開示されるポリペプチド配列及びタンパク質配列は、左から右へと書き、それらの順序をアミノ末端からカルボキシ末端へと表す。
「アミノ酸」、「アミノ酸残基」又は「ポリペプチド配列」という用語は、自然発生のアミノ酸(L立体異性体及びD立体異性体を含む)を含み、他の形で限定されない限り、また、天然のアミノ酸の公知のアナログであって、セレノシステイン、ピロリシン、N−ホルミルメチオニン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ヒドロキシプロリンヒプシン、ピログルタミン酸、及びセレノメチオニンなど、自然発生のアミノ酸と同様に機能しうるアナログも含む。本明細書で言及されるアミノ酸は、以下の表Aの縮約表記により記載されている。
ポリペプチドに関する「保存的置換」という語句は、ポリペプチドのアミノ酸組成の変化であって、全体的なポリペプチドの機能及び構造を実質的に変化させない変化を指す(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H.Freeman and Company, New York(2nd ed., 1992)を参照されたい)。
本明細書で使用される「発現させた」、「〜を発現させること」又は「〜を発現させる」という用語、及びこれらの文法的変化形は、ポリヌクレオチド又は核酸の、ポリペプチド又はタンパク質への翻訳を指す。発現させたポリペプチド又はタンパク質は、細胞内にとどまり、細胞表面膜の構成要素となる場合もあり、細胞外腔へと分泌される場合もある。
本明細書で使用される「α」という記号は、記号に後続する生体分子に結合することが可能な免疫グロブリン型結合領域のための縮約記号である。「α」という記号は、記号に後続する生体分子に結合するその能力に基づき、免疫グロブリン型結合領域の機能的特徴を指すのに使用される。
「::」という記号は、その前後のポリペプチド領域が、連続ポリペプチドを形成するように、併せて、物理的に連結されていることを意味する。
本発明の目的では、「エフェクター」という用語は、細胞毒性、生体内シグナル伝達、酵素触媒作用、細胞内経路決定、及び/又は因子の動員及び/又はアロステリック効果を結果としてもたらす分子内結合などの生体活性をもたらすことを意味する。
本発明の目的では、「〜に由来する」という語句は、ポリペプチド領域が、タンパク質内で本来見出され、今や、元の配列と比べた付加、欠失、切断、又は他の変化であって、全体的な機能及び構造が、実質的に保存されるような、付加、欠失、切断、又は他の変化を含みうるアミノ酸配列を含むことを意味する。
例えば、RIP毒素又はABx毒素など、多量体毒素に関して本明細書で使用される「サブユニット」及び「鎖」という用語は、互換的に使用される。
本明細書で使用される「細胞毒性タンパク質」という用語は、細胞毒性タンパク質の細胞への投与により、一般に、細胞表面への結合、細胞への内部化、及びリボソームの不活性化を達成する細胞毒性タンパク質の能力を介して、細胞死が引き起こされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「細胞毒性ポリペプチド」という用語は、細胞毒性ポリペプチドの細胞への投与により、一般に、細胞表面への結合、細胞への内部化、及びリボソームの不活性化を達成する細胞毒性ポリペプチドの能力を介して、細胞死が引き起こされるポリペプチドを指す。
2つ又は3つ以上のポリペプチド領域又はペプチド領域に関する「異種」という用語は、同じタンパク質では併せて自然発生しないポリペプチド配列及び/又はペプチド配列を指す。
本発明のポリペプチドの結合領域構成要素及びリボ毒性領域構成要素に関する「〜との会合状態にある」又は「〜と会合させた」という語句は、結合領域とリボ毒性領域とが、例えば、ポリペプチド内に包埋又は挿入されていること、ポリペプチドへと融合させていること、及び/又はポリペプチドへと化学的にコンジュゲートさせていることなど、共有結合的連結によるのであれ、非共有結合的連結によるのであれ、物理的に一体に連結されていることを意味する。
本発明の目的では、リボ毒性領域は、複数の多様な生体活性を呈示しうる。ある特定のRIP毒素は、それらのアデノシン二リン酸リボシル(ADPR,adenosine diphosphate-ribosyl)トランスフェラーゼ活性を使用して、リボソームタンパク質をADPリボシ
ル化しうる。例えば、DT及びPEなど、ある特定のRIP毒素は、当技術分野で公知の技法を使用してアッセイしうる酵素反応において、ADPリボース部分を、ポリペプチド内又はタンパク質内のジフタミド残基へと転移させる(例えば、Collier R, J Mol Biol 25: 83-98 (1967); Gill D et al., Cold SpringHarb Symp Quant Biol 34: 595-602 (1969); Iglewski B, Kabat D, Proc Natl AcadSci USA 72: 2284-8 (1975)を参照された
い)。ある特定のRIPは、核酸、ポリヌクレオシド、ポリヌクレオチド、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(及びポリA)、及びウイルス核酸を脱プリン化しうる(Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al.,Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri Let al., Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L etal., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997); Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res27: 1900-5 (1999);
Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al.,
J Biochem 128: 883-9 (2000); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); P
icard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005))。一部のRIPは、抗ウイルス活性及びスーパーオキシドジムスターゼ活性を示す(Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au Tet al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B,
Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol134: 171-81 (2004))。例えば、志賀毒素の触媒活性は、リボソームの不活性化、タンパク
質合成の阻害、N−グリコシダーゼ活性、ポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性、RNアーゼ活性、及びDNアーゼ活性を含む。リボ毒性の触媒活性は、インビトロ及びインビボの両方で観察することができる。リボ毒性領域活性についてのアッセイの非限定的な例では、タンパク質合成の阻害活性、脱プリン化活性、細胞増殖の阻害、細胞毒性、DNAスーパーコイルの解除活性、及びヌクレアーゼ活性を測定する。
ル化しうる。例えば、DT及びPEなど、ある特定のRIP毒素は、当技術分野で公知の技法を使用してアッセイしうる酵素反応において、ADPリボース部分を、ポリペプチド内又はタンパク質内のジフタミド残基へと転移させる(例えば、Collier R, J Mol Biol 25: 83-98 (1967); Gill D et al., Cold SpringHarb Symp Quant Biol 34: 595-602 (1969); Iglewski B, Kabat D, Proc Natl AcadSci USA 72: 2284-8 (1975)を参照された
い)。ある特定のRIPは、核酸、ポリヌクレオシド、ポリヌクレオチド、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(及びポリA)、及びウイルス核酸を脱プリン化しうる(Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al.,Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri Let al., Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L etal., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997); Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res27: 1900-5 (1999);
Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al.,
J Biochem 128: 883-9 (2000); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); P
icard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005))。一部のRIPは、抗ウイルス活性及びスーパーオキシドジムスターゼ活性を示す(Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au Tet al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B,
Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol134: 171-81 (2004))。例えば、志賀毒素の触媒活性は、リボソームの不活性化、タンパク
質合成の阻害、N−グリコシダーゼ活性、ポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性、RNアーゼ活性、及びDNアーゼ活性を含む。リボ毒性の触媒活性は、インビトロ及びインビボの両方で観察することができる。リボ毒性領域活性についてのアッセイの非限定的な例では、タンパク質合成の阻害活性、脱プリン化活性、細胞増殖の阻害、細胞毒性、DNAスーパーコイルの解除活性、及びヌクレアーゼ活性を測定する。
本明細書で使用される、リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域とは、適切な定量アッセイにより再現性を伴って測定されるリボ毒性活性の、ゼロを超えるレベルを指す。リボソーム不活性化についてのアッセイの例は、例えば、合成されたタンパク質の量についてのリードアウトを伴うインビトロ翻訳アッセイなどのインビトロアッセイである(例えば、Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Wilson B,Collier R, Curr Top Microbiol Immunol 175: 27-41 (1992); Ohmura M et al.,Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Skinner L, Jackson M, J Bacteriol 179: 1368-74(1997)を参照されたい)。10,000ピコモル(pM,picomolar)又はこれ未満のIC50を呈示するリボ毒性領域は、リボソームを不活性化することが可能である。リボソーム不活性化についてのアッセイの別の例は、例えば、ゼロでないレベルのリボソーム阻害及び/又は細胞毒性を呈示するリボ毒性領域により測定される、リボ毒性領域のデノボでの発現の後におけるインビボアッセイなどのインビボアッセイである(Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); LaPointe, JBiol Chem 280: 23310-18 (2005);
Di R, Toxicon 57: 535-39 (2011))。リボソームの阻害についてのアッセイの別の例は、リボ毒性領域を含む細胞ターゲティング分子が、標的陽性細胞殺滅アッセイを使用して測定される、ゼロでない細胞毒性を呈示するインビボアッセイである。この種類のアッセイでは、志賀毒素由来のリボ毒性領域を含む細胞ターゲティング分子は、適切な細胞外標的生体分子の細胞型及びその発現に応じて、1,000ナノモル(nM,nanomolar)又
はこれ未満のCD50を呈示しうる。
Di R, Toxicon 57: 535-39 (2011))。リボソームの阻害についてのアッセイの別の例は、リボ毒性領域を含む細胞ターゲティング分子が、標的陽性細胞殺滅アッセイを使用して測定される、ゼロでない細胞毒性を呈示するインビボアッセイである。この種類のアッセイでは、志賀毒素由来のリボ毒性領域を含む細胞ターゲティング分子は、適切な細胞外標的生体分子の細胞型及びその発現に応じて、1,000ナノモル(nM,nanomolar)又
はこれ未満のCD50を呈示しうる。
本明細書で使用される、毒素エフェクター機能又はエフェクター活性は、とりわけ、細胞への内部化の促進、エンドソーム脱出の促進、細胞内経路決定の、細胞内コンパートメントへの方向付け、触媒機能、基質への結合、細胞のアポトーシスの誘導、細胞増殖抑制の招来、及び細胞毒性を含みうる。
本発明の目的では、「志賀毒素エフェクター領域」という語句は、少なくとも1つの志賀毒素機能を呈示することが可能な志賀毒素ファミリーのメンバーの志賀毒素Aサブユニットに由来するポリペプチド領域を指す。志賀毒素機能は、例えば、細胞への侵入、脂質膜の変形、細胞内経路決定の方向付け、触媒作用によるリボソームの不活性化、細胞毒性の惹起、及び細胞毒性作用の惹起を含む。
序説
望ましくない選択バイアスの形態で支障を招来しうる、毒性構成要素を含むライブラリーをスクリーニングする場合、タンパク質ディスプレイ技術の検出力にも拘らず、それらの有効な使用は妨げられる場合がある。リボ毒性構成要素は、スクリーニング時において、任意の所望される選択特徴とは無関係なリボ毒性の抑制に対する強力な生物学的バイアスを招来する、有害なリボソーム不活性化作用を及ぼすことが可能である。驚くべきことに、本明細書の実施例は、スクリーニングされるタンパク質ライブラリー内の、リボ毒性構成要素の使用により、一般にインビトロであると考えられているタンパク質ディスプレ
イ法でもなお損なわれうることを示す。特に、リボ毒性ポリペプチド構成要素を含むライブラリーのスクリーニングは、スクリーニング系自体に弊害をもたらす結果として、スクリーニングを無効とするような、大きな生物学的バイアスをもたらす場合がある(下記の実施例を参照されたい)。本発明は、リボ毒性構成要素の活性を、一時的に低減するか又は消失させた文脈及び/又は環境においてスクリーニングすることにより、この問題を克服する。
望ましくない選択バイアスの形態で支障を招来しうる、毒性構成要素を含むライブラリーをスクリーニングする場合、タンパク質ディスプレイ技術の検出力にも拘らず、それらの有効な使用は妨げられる場合がある。リボ毒性構成要素は、スクリーニング時において、任意の所望される選択特徴とは無関係なリボ毒性の抑制に対する強力な生物学的バイアスを招来する、有害なリボソーム不活性化作用を及ぼすことが可能である。驚くべきことに、本明細書の実施例は、スクリーニングされるタンパク質ライブラリー内の、リボ毒性構成要素の使用により、一般にインビトロであると考えられているタンパク質ディスプレ
イ法でもなお損なわれうることを示す。特に、リボ毒性ポリペプチド構成要素を含むライブラリーのスクリーニングは、スクリーニング系自体に弊害をもたらす結果として、スクリーニングを無効とするような、大きな生物学的バイアスをもたらす場合がある(下記の実施例を参照されたい)。本発明は、リボ毒性構成要素の活性を、一時的に低減するか又は消失させた文脈及び/又は環境においてスクリーニングすることにより、この問題を克服する。
より強力なスクリーニング法への移行において、統計学的検出力が大きなスクリーニング法を、毒素由来のライブラリーへと適用することが要望されているが、工程の効率を低下させることによりスクリーニングを無効にしうる、著明な偽陽性選択及び他の選択バイアスの可能性が存在する。例えば、分子への変化を介して、又は極めて非効率的な産生を介して、それらの毒性特性を失った分子は、偽陽性率の上昇に対する小さからぬ懸念をもたらす。毒素由来のタンパク質ライブラリーのファージディスプレイスクリーニングでは、2つの種類の偽陽性:1)選択系内の意図される標的以外の構成要素に結合するファージクローン、及び2)提示されたタンパク質が、スクリーニングされるライブラリー内の他のファージクローンの繁殖を有利にするファージクローンが報告されている(Vodnik M
et al., Molecules 16: 790-817 (2011))。
et al., Molecules 16: 790-817 (2011))。
これらの問題について取り組むため、毒素ベースのポリペプチドは、多くの場合、緩徐な漸次方式を介して、毒素領域の非存在下でターゲティングドメインをスクリーニングすることにより開発されている(Cheung, Mol Cancer 9: 28 (2010))。この断片的で区分
化された手法では、完全なキメラ構造を構築するために、さらなる遺伝子操作ステップへの必要が加わり、このために、キメラ構造は、細胞のターゲティング、細胞内プロセシング、及び細胞毒性の点で、異なる属性を獲得する可能性もあろう(Allen T, Nat Rev Cancer 2: 750-63 (2002); Pastan I, Cancer ImmunolImmunother 52: 338-41 (2003); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005))。加えて、構造を完成させる追加の
ステップは、その細胞毒性形態にある最終的な構造の開発において、さらなる非効率性ももたらす。さらに、最終的な細胞毒性形態を産生するための産生工程も、キメラ構造を完成させる追加のステップの後で最適化しなければならない。漸次方式又は無効なスクリーニングにより細胞毒性タンパク質を開発する手法では、産生特性及び薬物動態特性が理想に満たない分子が選択され、商業的に実現可能な細胞毒性融合タンパク質を開発するペースも大幅に遅れている(Weldon, FEBS J 278: 4683-700 (2011))。
化された手法では、完全なキメラ構造を構築するために、さらなる遺伝子操作ステップへの必要が加わり、このために、キメラ構造は、細胞のターゲティング、細胞内プロセシング、及び細胞毒性の点で、異なる属性を獲得する可能性もあろう(Allen T, Nat Rev Cancer 2: 750-63 (2002); Pastan I, Cancer ImmunolImmunother 52: 338-41 (2003); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005))。加えて、構造を完成させる追加の
ステップは、その細胞毒性形態にある最終的な構造の開発において、さらなる非効率性ももたらす。さらに、最終的な細胞毒性形態を産生するための産生工程も、キメラ構造を完成させる追加のステップの後で最適化しなければならない。漸次方式又は無効なスクリーニングにより細胞毒性タンパク質を開発する手法では、産生特性及び薬物動態特性が理想に満たない分子が選択され、商業的に実現可能な細胞毒性融合タンパク質を開発するペースも大幅に遅れている(Weldon, FEBS J 278: 4683-700 (2011))。
本発明は、リボ毒性の一時的な低減又は消失に基づき、細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法を提供することにより、迅速な、漸次式でないスクリーニング法に対する必要を満たし、小スケールの、無効なスクリーニング及び/又はバイアスのかかったスクリーニングの問題を解決する。本発明の方法は、完全キメラ分子の文脈では、キメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドのワンステップ式選択を可能とする一方で、リボ毒性の存在により引き起こされる、望ましくない選択バイアスを最小化する。こうして、最終的なキメラ分子の文脈で所望される発現、安定性、及び他の産生特徴を示すポリペプチドを、例えば、標的分子への結合アフィニティー、標的細胞への結合アフィニティー、及び/又は標的細胞への内部化など、他の所望される特徴について選択しながら、同時に、単一のスクリーニングステップで同定することができる。本発明は、スクリーニングの一方で、結合領域と毒素領域との領域間相互作用のより効率的な探索も可能とする。加えて、本発明では、例えば、産生量及びアッセイ選択可能な特徴など、複数の特徴を同時に査定しうるため、要請されるスクリーニング後の分子操作の量も制限される。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、所望される特徴を伴う、キメラ細胞毒性タンパク質又はキメラ細胞毒性ポリペプチドの発見及び構築のために選択される、融合ポリ
ペプチドの配列を同定するために、結合領域と、リボ毒性領域又は修飾リボ毒性領域とを含む融合ポリペプチドをコードする多様な核酸のスクリーニングライブラリーを伴う。
ペプチドの配列を同定するために、結合領域と、リボ毒性領域又は修飾リボ毒性領域とを含む融合ポリペプチドをコードする多様な核酸のスクリーニングライブラリーを伴う。
本発明の方法は、比較的大規模で多様なポリペプチドライブラリーのスクリーニングを可能とするタンパク質ディスプレイ技術などを使用することにより、効率的で、有効で、強力なスクリーニングを提供する。本発明の方法は、リボ毒性ポリペプチド領域を含むキメラ分子の、統計学的検出力が大きなワンステップスクリーニングであって、例えば、細胞表面ディスプレイ、RNAディスプレイ、ファージディスプレイ、タンパク質−DNA連結ディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びウイルスディスプレイなどのタンパク質ディスプレイ法を使用するワンステップスクリーニングを可能とする。本発明のスクリーニング法は、スクリーニングを損なうリボ毒性の存在から生じる、望ましくない選択バイアスを回避するために、より有効である。
リボ毒性の低減又は消失は、3つの方式で:1)1カ所若しくは2カ所以上の変異によりもたらされる、毒素領域の非リボ毒性形態を使用すること、2)阻害剤の存在下で、適切な毒素領域を有する分子のスクリーニング及び/若しくは選択を実施すること、又は3)1及び2の両方を組み合わせることにより達成することができる。非リボ毒性ライブラリーを使用して、本発明の方法により同定されるポリペプチド配列は、リボ毒性のより強いポリペプチド配列及び/又はリボ毒性が最高度のポリペプチド配列へと、容易く転換することができる。これらの2つの一般的手法は、個別に使用されるのであれ、組み合わせて使用されるのであれ、例えば、安全で有効な治療剤であることを指し示す特徴など、所望される特徴を呈示するキメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドのより効率的な発見を可能とする。
I.本発明の細胞毒性タンパク質及びポリペプチドの一般的構造
本発明は、例えば、免疫毒素、リガンド−毒素融合体、イムノRNアーゼ、及び合成ペプチド、ターゲティングドメインを含む毒素バリアントなど、細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法を提供する。
本発明は、例えば、免疫毒素、リガンド−毒素融合体、イムノRNアーゼ、及び合成ペプチド、ターゲティングドメインを含む毒素バリアントなど、細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法を提供する。
本明細書で言及される通り、「細胞毒性タンパク質」又は「細胞毒性ポリペプチド」は、1)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と、2)ポリペプチドを含み、触媒作用によるリボソームの不活性化が可能な、リボ毒性領域とを含む。本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドは、結合領域が、リボ毒性領域に対して異種であるという点でキメラであり、これは、これらの2つの領域が、同じ自然発生のタンパク質内で併せて自然発生しないことを意味する。
一般に、免疫毒素、リガンド−毒素融合タンパク質、及びイムノRNアーゼは、細胞ターゲティングのための細胞表面結合領域を、毒素領域と組み合わせるキメラタンパク質である。大半の既存の免疫毒素は、例えば、DT若しくはPEなどの細菌性毒素、又はリシン、サポリン、及びゲロニンなど、植物において天然で見出されるRIPに由来するポリペプチド領域へと融合させた免疫グロブリンベースのターゲティングモジュールから操作されている(表1を参照されたい)。リガンド−毒素融合タンパク質は、ターゲティングモジュールが、自然発生の受容体に結合することが可能な自然発生の部分に由来することを除き、免疫毒素と同様である。イムノRNアーゼは、RNアーゼ酵素ドメインを含み、前者のうちの一方のターゲティングモジュールを含みうるが、免疫グロブリンドメインを含むことが典型的である。治療的使用のために、免疫毒素、リガンド−毒素融合タンパク質、及びイムノRNアーゼは全て、標的細胞を効率的に死滅させ、投与時にターゲティングされていない細胞に対して比較的非毒性であるために、細胞のターゲティング、細胞への内部化及び細胞質ゾルへの効率的放出に依存する。
特許請求される本発明に関する「リボ毒性領域」及び「修飾リボ毒性領域」という語句は、自然発生の毒素及び合成毒素を含むタンパク質に由来するポリペプチドであって、インビトロにおけるリボソーム不活性化の惹起、インビトロ及び/若しくはインビボにおけるタンパク質合成の阻害、細胞毒性、並びに/又は細胞増殖抑制が可能なポリペプチドを指す。一般に、リボ毒性領域は、酵素的に活性なドメインであって、人為的介入により変化させるか又は操作した自然発生のタンパク質毒素又は毒素様構造に由来するドメインである(例えば、Newton D et al., Blood 97: 528-35 (2001); De Lorenzo C et al., FEBSLett 581: 296-300 (2007); De Lorenzo C, D'Alessio G, Curr Pharm Biotechnol 9:210-4 (2008); Menzel C et al., Blood 111: 3830-7 (2008)を参照されたい)。しかし
、例えば、毒素内又は合成ポリペプチド内に天然では存在しない自然発生の酵素ドメインなど、他のポリペプチドも、本明細書で使用されるこの用語の範囲内にある。こうして、
リボ毒性である毒素エフェクターポリペプチドは、リボ毒性を増大若しくは減少させた合成のタンパク質構築物若しくは操作されたタンパク質構築物、並びに/又は、例えば、安定性の増大、実験動物種若しくは細胞株における発現の最適化、可溶性の改善、薬物動態特性の改善、薬力学特性の改善、並びに/又は抗原性及び/若しくは免疫原性の低減など、非天然の特徴を有するように他の形で変化させた自然発生のタンパク質に由来しうる。
A.細胞殺滅を惹起するためのリボ毒性領域 特許請求される本発明に関する「リボ毒性領域」及び「修飾リボ毒性領域」という語句は、自然発生の毒素及び合成毒素を含むタンパク質に由来するポリペプチドであって、インビトロにおけるリボソーム不活性化の惹起、インビトロ及び/若しくはインビボにおけるタンパク質合成の阻害、細胞毒性、並びに/又は細胞増殖抑制が可能なポリペプチドを指す。一般に、リボ毒性領域は、酵素的に活性なドメインであって、人為的介入により変化させるか又は操作した自然発生のタンパク質毒素又は毒素様構造に由来するドメインである(例えば、Newton D et al., Blood 97: 528-35 (2001); De Lorenzo C et al., FEBS Lett 581: 296-300 (2007); De Lorenzo C, D'Alessio G, Curr Pharm Biotechnol 9: 210-4 (2008); Menzel C et al., Blood 111: 3830-7 (2008)を参照されたい)。しかし、例えば、毒素内又は合成ポリペプチド内に天然では存在しない自然発生の酵素ドメインなど、他のポリペプチドも、本明細書で使用されるこの用語の範囲内にある。こうして、リボ毒性である毒素エフェクターポリペプチドは、リボ毒性を増大若しくは減少させた合成のタンパク質構築物若しくは操作されたタンパク質構築物、並びに/又は、例えば、安定性の増大、実験動物種若しくは細胞株における発現の最適化、可溶性の改善、薬物動態特性の改善、薬力学特性の改善、並びに/又は抗原性及び/若しくは免疫原性の低減など、非天然の特徴を有するように他の形で変化させた自然発生のタンパク質に由来しうる。
本発明のキメラポリペプチドのリボ毒性領域及び修飾リボ毒性領域は、例えば、藻類、細菌、真菌、植物、及び動物など、多様な門に由来するタンパク質のリボ毒性ドメインに由来しうる。例えば、細胞型特異的細胞毒性治療剤を創出しようという要望から、多様な毒素に由来するポリペプチドの、免疫グロブリンドメイン、受容体リガンド、又はランダム化ペプチドへの、化学的コンジュゲーション又は組換えタンパク質操作を介する連結又は融合がなされている(例えば、Pastan I et al., Annu Rev Biochem 61: 331-54 (1992); Foss F et al.,Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81 (1998); Olsnes S, Toxicon 44: 361-70(2004); Pastan I, et al., Nat Rev Cancer 6: 559-65 (2006); Lacadena
J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); de Virgilio M et al., Toxins 2:
2699-737 (2011); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013); Weidle U et al., CancerGenomics Proteomics 11: 25-38 (2014)を参照されたい)。
J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); de Virgilio M et al., Toxins 2:
2699-737 (2011); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013); Weidle U et al., CancerGenomics Proteomics 11: 25-38 (2014)を参照されたい)。
本発明のリボ毒性領域及び修飾リボ毒性領域は、タンパク質リボ毒素のリボソーム不活性化タンパク質(RIP)スーパーファミリーのメンバーの触媒ドメインから導出することができる(de Virgilio M et al., Toxins 2: 2699-737 (2011); Lapadula W et al.,PLoS ONE 8: e72825 (2013); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013))。RIPとは、藻類、細菌、真菌、及び植物において発現するリボ毒性タンパク質であって、亜当量濃度において、真核生物及び原核生物によるタンパク質合成の強力な阻害剤であることが多いリボ毒性タンパク質である(Stirpe, F, Biochem J 202: 279-80 (1982)を参照されたい)
。多様なRIPは、がんを治療するための治療剤における使用のための毒素エフェクターポリペプチド配列の有望な供給源と考えられている(Pastan I, et al., Nat Rev Cancer
6: 559-65 (2006); Fracasso G et al., Ribosome-inactivating protein-containingconjugates for therapeutic use, Toxic Plant Proteins 18, pp. 225-63 (Eds. LordJ,
Hartley, M. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010); de Virgilio M et al.,Toxins 2: 2699-737 (2011); Puri M et al., Drug Discov Today 17: 774-83 (2012);Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013)を参照されたい)。
。多様なRIPは、がんを治療するための治療剤における使用のための毒素エフェクターポリペプチド配列の有望な供給源と考えられている(Pastan I, et al., Nat Rev Cancer
6: 559-65 (2006); Fracasso G et al., Ribosome-inactivating protein-containingconjugates for therapeutic use, Toxic Plant Proteins 18, pp. 225-63 (Eds. LordJ,
Hartley, M. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010); de Virgilio M et al.,Toxins 2: 2699-737 (2011); Puri M et al., Drug Discov Today 17: 774-83 (2012);Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013)を参照されたい)。
組換え細胞毒性ポリペプチド内で最も一般に使用されているリボ毒素は、DT、PE、リシン、α−サルシン、サポリン、及びゲロニンを含む(Shapira A, Benhar I, Toxins 2: 2519-83 (2010); Yu C et al., CancerRes 69: 8987-95 (2009); Fuenmayor J, Montano R, Cancers 3: 3370-93 (2011);Weldon, FEBS J 278: 4683-700 (2011); Carreras-Sangra N et al., Protein Eng DesSel 25: 425-35 (2012); Lyu M at al., Methods Enzymol 502: 167-214 (2012);Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013); Lin H et al., Anticancer Agents Med Chem13: 1259-66 (2013); Polito L et al., Toxins 5: 1698-722 (2013); Walsh M,Virulence 4: 774-84 (2013)を参照されたい)。これらのリボ毒素
は一般に、リボソーム不活性化タンパク質(RIP)と分類され、サルシン−リシンループ(SRL,sarcin-ricinloop)又はリボソーム機能に要請されるタンパク質であって
、SRLに結合するタンパク質を攻撃することにより、真核生物リボソームを不活性化する一般的細胞毒性機構を共有する。
は一般に、リボソーム不活性化タンパク質(RIP)と分類され、サルシン−リシンループ(SRL,sarcin-ricinloop)又はリボソーム機能に要請されるタンパク質であって
、SRLに結合するタンパク質を攻撃することにより、真核生物リボソームを不活性化する一般的細胞毒性機構を共有する。
SRL構造は、原核生物リボソーム及び真核生物リボソームのいずれもが、SRLリボソーム構造を共有するように、3つの系統発生群である古細菌、細菌及び真核生物の間で高度に保存されている(Gutell R et al., Nucleic Acids Res 21: 3055-74 (1993); Szewczak A,Moore P, J Mol Biol 247: 81-98 (1995); Glueck A, Wool I, J Mol Biol 256
: 838-48 (1996); Seggerson K, Moore P, RNA 4: 1203-15 (1998); Correll C et al.,J Mol Biol 292: 275-87 (1999))。多様な門に由来する多様な種のSRLを、高精度の
結晶構造電子密度マップへと重ね合わせることができる(Ban N et al., Science 11:905-20 (2000); Gabashvili I et al., Cell 100: 537-49 (2000))。SRLとは、最大の
、ユニバーサルに保存されたリボソーム配列であって、EF−Tu、EF−G、EF1、及びEF2などの伸長因子の協同を介するリボソームの移動機能に極めて重要な、保存された二次構造を形成するリボソーム配列である(Voorhees R et al., Science 330: 835-8 (2010); Shi X et al., J MolBiol 419: 125-38 (2012); Chen K et al., PLoS One 8: e66446 (2013))。SRL(サルシン−リシンループ)とは、真菌性リボ毒素であるサ
ルシンと、植物II型RIPであるリシンとの共通の標的であるために名づけられた。
: 838-48 (1996); Seggerson K, Moore P, RNA 4: 1203-15 (1998); Correll C et al.,J Mol Biol 292: 275-87 (1999))。多様な門に由来する多様な種のSRLを、高精度の
結晶構造電子密度マップへと重ね合わせることができる(Ban N et al., Science 11:905-20 (2000); Gabashvili I et al., Cell 100: 537-49 (2000))。SRLとは、最大の
、ユニバーサルに保存されたリボソーム配列であって、EF−Tu、EF−G、EF1、及びEF2などの伸長因子の協同を介するリボソームの移動機能に極めて重要な、保存された二次構造を形成するリボソーム配列である(Voorhees R et al., Science 330: 835-8 (2010); Shi X et al., J MolBiol 419: 125-38 (2012); Chen K et al., PLoS One 8: e66446 (2013))。SRL(サルシン−リシンループ)とは、真菌性リボ毒素であるサ
ルシンと、植物II型RIPであるリシンとの共通の標的であるために名づけられた。
RIPスーパーファミリーは、リボソームの移動機能に干渉する、RIP、真菌性リボ毒素、及び細菌性リボ毒素を含む(例えば、上掲の表1;Brigotti M et al., Biochem J
257: 723-7 (1989)を参照されたい)。アブリン、ゲロニン、リシン、及びサポリンなど、大半のRIPは、リボソームの大型rRNAの、ユニバーサルに保存されたサルシン/リシンループ(SRL)内の特異的なアデニン(例えば、動物におけるA4324、真菌におけるA3027、及び原核生物におけるA2660)を不可逆的に脱プリン化する。α−サルシンなど、大半の真菌性リボ毒素は、リボソームの損傷を介して、触媒作用によりタンパク質合成を阻害するように、SRL内の特異的な結合(例えば、動物におけるG4325とA4326との結合、真菌におけるG3028とA3029との結合、及び原核生物におけるG2661とA2662との結合)を不可逆的に切断する(Martinez-Ruiz A et al., Toxicon 37: 1549-63 (1999); Lacadena J etal., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); Tan Q et al., J Biotechnol 139:156-62 (2009))。細菌性タンパク質リボ毒素である、コリックス毒素、ジフテリア毒素(DT,diphtheriatoxin)、及びシュードモナス属外毒素A(PE,Pseudomonas exotoxin)は、触媒作用によるリボソーム機能の損傷を介してタンパク質合成を阻害することが可能であり、少数の毒素分子だけでアポトーシスを効率的に誘導しうるため、RIPスーパーファミリー内に分類されている。
257: 723-7 (1989)を参照されたい)。アブリン、ゲロニン、リシン、及びサポリンなど、大半のRIPは、リボソームの大型rRNAの、ユニバーサルに保存されたサルシン/リシンループ(SRL)内の特異的なアデニン(例えば、動物におけるA4324、真菌におけるA3027、及び原核生物におけるA2660)を不可逆的に脱プリン化する。α−サルシンなど、大半の真菌性リボ毒素は、リボソームの損傷を介して、触媒作用によりタンパク質合成を阻害するように、SRL内の特異的な結合(例えば、動物におけるG4325とA4326との結合、真菌におけるG3028とA3029との結合、及び原核生物におけるG2661とA2662との結合)を不可逆的に切断する(Martinez-Ruiz A et al., Toxicon 37: 1549-63 (1999); Lacadena J etal., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); Tan Q et al., J Biotechnol 139:156-62 (2009))。細菌性タンパク質リボ毒素である、コリックス毒素、ジフテリア毒素(DT,diphtheriatoxin)、及びシュードモナス属外毒素A(PE,Pseudomonas exotoxin)は、触媒作用によるリボソーム機能の損傷を介してタンパク質合成を阻害することが可能であり、少数の毒素分子だけでアポトーシスを効率的に誘導しうるため、RIPスーパーファミリー内に分類されている。
大半のRIPスーパーファミリーの毒素は、細胞に侵入し、リボソームを特異的に不活性化するように天然で適合している(Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007) de VirgilioM et al., Toxins 2: 2699-737 (2011); Walsh M, Virulence 4:
774-84 (2013))。細胞内に入ると、RIP、真菌性リボ毒素及び他の細菌性毒素は、極めて強く細胞毒性でありうる。RIPスーパーファミリーの一部のメンバーの毒力は、1つという少数の毒素分子でも、細胞を死滅させうるほどに、非常に大きいことが報告されている(Yamaizumi M et al., Cell 15: 245-50 (1978); Eiklid K et al., ExpCell Res 126: 321-6 (1980); Lamy et al., Targeted Diagn Ther 7: 237-58 (1992);Potala S
et al., Drug Discov Today 13: 807-15 (2008); Antignani A, Fitzgerald D, Toxins5: 1486-502 (2013))。RIPは、同じ細胞内のリボソームを、1分間当たりのリボソーム約1,500個の速度で、順次恒久的に機能させなくすることが可能である(Endo Y. Tsurugi K, Eur J Biochem 171: 45-50 (1988); Endo Y et al., JBiol Chem 263: 8735-9 (1988))。単一のRIP毒素分子でも、35分間で300個のリボソームを不可逆的
に不活性化することが可能であり、がん細胞を死滅させるのに十分であると考えられている(Weldon J,Pastan I, FEBS J 278: 4683-700 (2011))。
774-84 (2013))。細胞内に入ると、RIP、真菌性リボ毒素及び他の細菌性毒素は、極めて強く細胞毒性でありうる。RIPスーパーファミリーの一部のメンバーの毒力は、1つという少数の毒素分子でも、細胞を死滅させうるほどに、非常に大きいことが報告されている(Yamaizumi M et al., Cell 15: 245-50 (1978); Eiklid K et al., ExpCell Res 126: 321-6 (1980); Lamy et al., Targeted Diagn Ther 7: 237-58 (1992);Potala S
et al., Drug Discov Today 13: 807-15 (2008); Antignani A, Fitzgerald D, Toxins5: 1486-502 (2013))。RIPは、同じ細胞内のリボソームを、1分間当たりのリボソーム約1,500個の速度で、順次恒久的に機能させなくすることが可能である(Endo Y. Tsurugi K, Eur J Biochem 171: 45-50 (1988); Endo Y et al., JBiol Chem 263: 8735-9 (1988))。単一のRIP毒素分子でも、35分間で300個のリボソームを不可逆的
に不活性化することが可能であり、がん細胞を死滅させるのに十分であると考えられている(Weldon J,Pastan I, FEBS J 278: 4683-700 (2011))。
RIPは、リボソームRNA(rRNA,ribosomal RNA)N−グリコシダーゼ活性を
介してリボソームを損傷することにより、インビトロにおいて翻訳を阻害する能力という、1つの一般的な特徴により定義される。2013年までに、100を超えるRIPが記載されている(Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013))。大半のRIPは、真核生物リ
ボソーム及び原核生物リボソームのいずれの大型rRNAの、ユニバーサルに保存された
サルシン/リシンループ(SRL)内の特異的アデニン残基も、脱プリン化する。以下の科:ナデシコ(Caryophyllaceae)科、ニワトコ(Sambucaceae)科、ウリ(Cucurbitaceae)科、トウダイグサ(Euphorbiaceae)科、ヤマゴボウ(Phytolaccaceae)科、及びイネ(Poaceae)科では、最大数のRIPが見出されている。
介してリボソームを損傷することにより、インビトロにおいて翻訳を阻害する能力という、1つの一般的な特徴により定義される。2013年までに、100を超えるRIPが記載されている(Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013))。大半のRIPは、真核生物リ
ボソーム及び原核生物リボソームのいずれの大型rRNAの、ユニバーサルに保存された
サルシン/リシンループ(SRL)内の特異的アデニン残基も、脱プリン化する。以下の科:ナデシコ(Caryophyllaceae)科、ニワトコ(Sambucaceae)科、ウリ(Cucurbitaceae)科、トウダイグサ(Euphorbiaceae)科、ヤマゴボウ(Phytolaccaceae)科、及びイネ(Poaceae)科では、最大数のRIPが見出されている。
RIPファミリーのメンバーは、それらの構造に基づき、少なくとも3つのクラスへと類別される。I型RIP、例えば、ゲロニン、ルフィン、PAP、サポリン及びトリコサンチンは、酵素ドメインを含み、関連するターゲティングドメインを欠く単量体タンパク質である。II型RIP、例えば、アブリン、リシン、志賀毒素は、二元ABx毒素に典型的な、酵素Aサブユニット及びターゲティングBサブユニットを伴う、多重サブユニットのヘテロマータンパク質である(Ho M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 106: 20276-81
(2009))。III型RIP、例えば、オオムギJIP60 RIP及びコムギb−32 RIPは、活性化のために大規模なタンパク質分解性プロセシングを要請するプロ酵素として合成される(Peumans W et al., FASEB J 15: 1493-1506 (2001); Mak A et al.,Nucleic Acids Res 35: 6259-67 (2007))。
(2009))。III型RIP、例えば、オオムギJIP60 RIP及びコムギb−32 RIPは、活性化のために大規模なタンパク質分解性プロセシングを要請するプロ酵素として合成される(Peumans W et al., FASEB J 15: 1493-1506 (2001); Mak A et al.,Nucleic Acids Res 35: 6259-67 (2007))。
RIPファミリーのメンバーの間の配列相同性は低い(同一性は50%未満である)が、それらの触媒ドメインは、リボソームの脱プリン化に関与する、鍵となる残基が同定されるように重ね合わされる、保存された三次構造を共有する(de Virgilio M et al., Toxins 2: 2699-737 (2011); Walsh M, Virulence4: 774-84 (2013))。例えば、リシンの触媒ドメインと志賀毒素の触媒ドメインとは、それらのA鎖サブユニットの配列同一性は18%であるにも拘らず、結晶構造解析データを使用して重ね合わされる(Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994))。
例えば、ゲロニン、サポリン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP)、ブリオジン、ブーガニン、モモルジン、ジアンチン、モモルコキン、トリコキリン、ルフィン、レストリクトシン、ミトギリン、アルファ−サルシン、Onconase(登録商標)、及び膵臓リボヌクレアーゼなど、多くのリボ毒素及びリボ毒性領域を使用して、免疫毒素が創出されている。特に、RIP:リシン、ゲロニン、サポリン、モモルジン、及びPAPに由来するポリペプチドを使用して、細胞毒性の強い免疫毒素が作製されている(Pasqualucci L et al., Haematologica 80: 546-56 (1995))。
RIPスーパーファミリーの亜群は、細菌内で見出されるII型RIPの群である、志賀毒素ファミリーである。志賀毒素は、原型的なII型RIPと同様に挙動することが示されており、リシン及びアブリンと同等であると考えられている(Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013))。
志賀毒素ファミリーの、類縁のタンパク質毒素、とりわけ、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)及び大腸菌(E. coli)から単離された毒素は、構造的及び機能的に類縁である、多
様な自然発生の毒素から構成される(Johannes L, Roemer W, Nat RevMicrobiol 8: 105-16 (2010))。例えば、志賀毒素ファミリーは、志賀赤痢菌血清型1から単離される真性志賀毒素(Stx,true Shiga toxin)、腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素1(SLT1,Shiga-like toxin 1又はStx1又はSLT−1又はSlt−I)バリアント、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素2(SLT2,Shiga-like toxin 2又はStx2又はSLT−2)バリアントを包摂する。SLT1は、Stxと、1残基だけ異なり、いずれも、ベロ細胞毒素又はベロ毒素(VT,Verocytotoxin又はVerotoxin)と称されている(O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992))。SLT1バリアントとSLT2バリアントとは、アミノ酸配列レベルでは、互
いに約53〜60%同様であるに過ぎないが、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通の酵素活性機構及び細胞毒性機構を共有する(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (201
0))。明確な亜型であるStx1a、Stx1c、Stx1d、及びStx2a〜Stx2gなど、39を超える異なる志賀毒素が記載されている(Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012))。志賀毒素をコードする遺伝子は、遺伝子の水平伝播を
介して、細菌種間に広がりうるため、志賀毒素ファミリーのメンバーは、天然では、いかなる細菌種にも限局されない(StrauchE et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, CurrBiol 21: R242-6 (2011))。志賀毒素をコードするポリヌクレオチドが、新たな亜種又は種に侵入したら、志賀毒素のアミノ酸配列は、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通の細胞毒性機構をなおも維持しながら、遺伝子浮動及び/又は選択圧のために、わずかな配列変化を起こす可能性があると推定されている(Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)を参照されたい)。
様な自然発生の毒素から構成される(Johannes L, Roemer W, Nat RevMicrobiol 8: 105-16 (2010))。例えば、志賀毒素ファミリーは、志賀赤痢菌血清型1から単離される真性志賀毒素(Stx,true Shiga toxin)、腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素1(SLT1,Shiga-like toxin 1又はStx1又はSLT−1又はSlt−I)バリアント、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素2(SLT2,Shiga-like toxin 2又はStx2又はSLT−2)バリアントを包摂する。SLT1は、Stxと、1残基だけ異なり、いずれも、ベロ細胞毒素又はベロ毒素(VT,Verocytotoxin又はVerotoxin)と称されている(O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992))。SLT1バリアントとSLT2バリアントとは、アミノ酸配列レベルでは、互
いに約53〜60%同様であるに過ぎないが、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通の酵素活性機構及び細胞毒性機構を共有する(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (201
0))。明確な亜型であるStx1a、Stx1c、Stx1d、及びStx2a〜Stx2gなど、39を超える異なる志賀毒素が記載されている(Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012))。志賀毒素をコードする遺伝子は、遺伝子の水平伝播を
介して、細菌種間に広がりうるため、志賀毒素ファミリーのメンバーは、天然では、いかなる細菌種にも限局されない(StrauchE et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, CurrBiol 21: R242-6 (2011))。志賀毒素をコードするポリヌクレオチドが、新たな亜種又は種に侵入したら、志賀毒素のアミノ酸配列は、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通の細胞毒性機構をなおも維持しながら、遺伝子浮動及び/又は選択圧のために、わずかな配列変化を起こす可能性があると推定されている(Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)を参照されたい)。
RIPスーパーファミリーのサブファミリーは、真菌性リボ毒素を含む。最もよく特徴づけられた真菌性リボ毒素は、α−サルシン、Aspf1、ミトギリン、及びレストリクトシンである。多くのリボ毒素は、高度な配列類似性(約85%)を共有するが、一部のリボ毒素、例えば、ヒルステリンA(HtA,Hirsutelin A)の、大半のリボ毒素に対する配列類似性は極めて低度である。加えて、ある特定の真菌性リボ毒素は、例えば、ブルクホルデリア(Burkholderia)属致死因子1(BLF1,Burkholderia lethalfactor 1)など、異種機構を使用して、リボソームを不活性化する(Walsh M, Virulence4: 774-84 (2013))。
RIPスーパーファミリーのメンバーは、真核生物リボソームを不活性化することが可能なだけではなく、また、原核生物リボソームも不活性化することが可能であり、ネイキッド核酸も同様に切断しうる(Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); de VirgilioM et al., Toxins 2: 2699-737 (2010); Garcia-Ortega L et al., Nucleic Acids Res38: 4108-19 (2010))。例えば、サルシンは、様々な種の原核生物リボソーム及び真核生物リボソームの両方を不活性化することが示された(Schindler D, Davies J, Nucleic Acids Res 4: 1097-110 (1977); TurnayJ et al., Mol Cell Biochem 122: 39-47 (1993); Endo Y et al., Nucleic Acids SympSer 29: 165-6 (1993))。
多くのRIPは、インビトロにおいて、原核生物リボソームを不活性化することが示されている(Suh J etal., Biochem 37: 9394-8 (1998); Nagasawa Y et al., Phytochemistry 69: 1653-60(2008))。さらに、一部のRIPは、真核細胞に加えて、細菌細胞に
対しても細胞毒性であることが示されている(Suh J et al., Biochem 37: 9394-8(1998))。特に、志賀毒素のAサブユニットは、真核細胞及び原核細胞に対して同等の細胞毒
性を呈示した(Skinner L et al., Microbial Pathog 24: 117-22(1998); Suh J et al., Biochem 37: 9394-8 (1998))。
対しても細胞毒性であることが示されている(Suh J et al., Biochem 37: 9394-8(1998))。特に、志賀毒素のAサブユニットは、真核細胞及び原核細胞に対して同等の細胞毒
性を呈示した(Skinner L et al., Microbial Pathog 24: 117-22(1998); Suh J et al., Biochem 37: 9394-8 (1998))。
異なるRIPは、異なるリボソーム基質に対して、異なるアフィニティーを提示する(Korennykh A etal., Nat Struct Mol Biol 13: 436-43 (2006); Stirpe F, Battelli M,
Cell Mol Life Sci 63: 1850-66 (2006); Korennykh A et al., Biochem 46: 12744-56(2007); Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); de Virgilio Met al., Toxins 2: 2699-737 (2010))。例えば、リシンのA鎖の、真核生物リボソームに対する活性は、原核生物リボソームに対する活性と対比して、はるかに大きいが、リシンA鎖は、インビトロにおいて、原核生物の23S rRNAを脱プリン化しうる(Endo Y, Tsurugi K, J Biol Chem 263: 8735-9 (1998))。加えて、一部のRIPの、ある特定
の真核細胞に対する活性は、他の真核細胞に対する活性と対比して大きいことも示されている(Olmo N etal., Eur J Biochem 268: 2113-23 (2001))。
Cell Mol Life Sci 63: 1850-66 (2006); Korennykh A et al., Biochem 46: 12744-56(2007); Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); de Virgilio Met al., Toxins 2: 2699-737 (2010))。例えば、リシンのA鎖の、真核生物リボソームに対する活性は、原核生物リボソームに対する活性と対比して、はるかに大きいが、リシンA鎖は、インビトロにおいて、原核生物の23S rRNAを脱プリン化しうる(Endo Y, Tsurugi K, J Biol Chem 263: 8735-9 (1998))。加えて、一部のRIPの、ある特定
の真核細胞に対する活性は、他の真核細胞に対する活性と対比して大きいことも示されている(Olmo N etal., Eur J Biochem 268: 2113-23 (2001))。
RIPは、それらのリボソームへの相対アフィニティーを変化させるように操作することができる。RIPは、それが通常活性を示さないリボソーム型を不活性化するように操
作することができる。例えば、野生型カラスリンAは、真核生物リボソームを脱プリン化するが、原核生物リボソームは脱プリン化しない。原核生物リボソームに対する脱プリン化活性は、このような活性を伴う別のRIPに由来する27アミノ酸のドメインで置換することにより、カラスリンAの合成バリアントへと付与された(Nagasawa Y et al., Phytochemistry 69: 1653-60 (2008))。代替的に、RIPは、それが通常脱プリン化しないリボソーム型をもはや不活性化しないようにも操作することができる。例えば、野生型PAPは、原核生物リボソーム及び真核生物リボソームのいずれも脱プリン化するが、別のRIPに由来する、27アミノ酸のドメインスワップを伴う操作バリアントは、真核生物リボソームだけに、その活性を限定した(Nagasawa Y et al., Phytochemistry 69: 1653-60 (2008))。
作することができる。例えば、野生型カラスリンAは、真核生物リボソームを脱プリン化するが、原核生物リボソームは脱プリン化しない。原核生物リボソームに対する脱プリン化活性は、このような活性を伴う別のRIPに由来する27アミノ酸のドメインで置換することにより、カラスリンAの合成バリアントへと付与された(Nagasawa Y et al., Phytochemistry 69: 1653-60 (2008))。代替的に、RIPは、それが通常脱プリン化しないリボソーム型をもはや不活性化しないようにも操作することができる。例えば、野生型PAPは、原核生物リボソーム及び真核生物リボソームのいずれも脱プリン化するが、別のRIPに由来する、27アミノ酸のドメインスワップを伴う操作バリアントは、真核生物リボソームだけに、その活性を限定した(Nagasawa Y et al., Phytochemistry 69: 1653-60 (2008))。
リボ毒素及びRIPは、インビトロにおいてネイキッド核酸を切断しうる。インビトロにおいて、例えば、rRNA、DNA、ウイルスRNA、及びポリ(A)RNAなど、多様な核酸に対して、リボ核酸分解活性を呈示することが示されている、異なるRIPは、50を超える(Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994); Roncuzzi L,Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Barbieri L et al., Nucleic AcidRes 25: 518-22 (1997); Nicolas E et al., J Biol Chem 273: 17216-20 (1998);Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9 (2000); Hudak K et al., RNA 6: 369-80(2000); Hwu L et al., J Biomed Sci 7: 420-8 (2000); Nicolas E et al., J BiolChem 275: 31399-406 (2000); Fermani S et al., J Struct Biol 168: 278-87 (2009);Wang S et al., Appl Microbiol Biotechnol 96: 939-50 (2012); Wang S et al.,Protein Pept Lett 20: 1257-63 (2013); Wong Y et al., PLoS One 7: e49608 (2012);Meng Y et al., PLoS One 9:
e101998 (2014)を参照されたい)。
e101998 (2014)を参照されたい)。
加えて、多様なRNアーゼの酵素ドメインは、細胞殺滅性治療用分子の構成要素として操作することができる。例えば、ターゲティングドメインへと融合させる場合の非毒性RNアーゼは、1)rRNA、mRNA、tRNAを切断すること;2)細胞増殖を阻害すること;及び/又は3)細胞を死滅させることが可能である(Newton D et al., J Biol Chem 269: 739-45 (1994); Netwon D et al., JImmunol Meth 231: 159-67 (1999); Yoon J et al., Life Sci 64: 1435-45 (1999);Hugh M et al., Cancer Res 61: 8737-42 (2001); Newton D et al., Blood 97: 528-35(2001); Krauss J et al., Biochem Biophys Res Commun 331: 595-602 (2005); DeLorenzo C et al., FEBS Lett 581: 296-300 (2007); Lacadena J et al., FEMSMicrobiol Rev 31: 212-37 (2007); De Lorenzo C, D'Alessio G, Curr PharmBiotechnol 9: 210-4 (2008); Menzel C et al., Blood 111: 3830-7 (2008); Riccio Get al., J Immunother 31: 440-5 (2008)を参照されたい)。Argonaute酵素ドメイン又は真菌性リボ毒素及びArgonaute配列から構成されるハイブリッド体の酵素ドメインは、リボソームの不活性化のために操作することができる(Pichinuk E, Wreschner D, Protein Sci 19: 1272-8 (2010)を参照されたい)。リボ毒性領域として有用な酵素ドメインを伴うRNアーゼの例は、例えば、ビナーゼなどの細菌RNアーゼ、例えば、ランピルナーゼ及びOnconase(登録商標)などの両生動物RNアーゼ、並びに、例えば、ウシ精液RNアーゼ並びにヒトRNアーゼ:RNアーゼ2、RNアーゼ3、及びRNアーゼ5などの哺乳動物RNアーゼを含む(Newton D et al., J Biol Chem 269: 739-45 (1994); Netwon D et al., JImmunol Meth 231: 159-67 (1999);
Yoon J et al., Life Sci 64: 1435-45 (1999); Hugh M et al., Cancer Res 61:8737-42 (2001); Makarov A, Ilinskaya N, FEBS Lett 540: 15-20 (2003))。
Yoon J et al., Life Sci 64: 1435-45 (1999); Hugh M et al., Cancer Res 61:8737-42 (2001); Makarov A, Ilinskaya N, FEBS Lett 540: 15-20 (2003))。
多くの異なる毒素が、リボ毒性領域、修飾リボ毒性領域、及び毒素鋳型の供給源に活用されるように、本発明の範囲内にあると想定される。本発明のある特定の実施形態では、リボ毒性領域及び/又は修飾リボ毒性領域は、RIP、真菌性リボ毒素、並びに例えば、コリックス毒素、DT、及びPEなどの細菌性リボ毒素を含む、RIPスーパーファミリ
ーのメンバーに由来する。本発明のある特定の実施形態では、リボ毒性領域及び/又は修飾リボ毒性領域は、非毒性RNアーゼに由来する。本発明のある特定の実施形態では、リボ毒性領域及び/又は修飾リボ毒性領域は、アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ属抗ウイルス性タンパク質/RIP、アンギオジェニン、A.パテンスRIP、アーティクラチンD、アスパリン、アスペルギリン、Aspf1、バルサミン、トウガンRIP、ブーガニン、ブーゲンビレア抗ウイルス性タンパク質1、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキRIP、ブリオジン(例えば、ブリオジン1、ブリオジン2)、イカダカズラRIP、ビートRIP、シロザRIP、カンホリン、トゲエビス全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲRIP、ククミス・フィガレイRIP、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャRIP、コチニンB、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種RIP、コリネバクテリウム属種ジフテリア毒素(C.ウルセランス内、コリネファージオメガ内、C.シュードツベルクローシス内のジフテリア毒素)、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウRIP、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキRIP、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンA、ヒヤシンスRIP、オオムギRIP、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリスRIP、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマRIP、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマRIP、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシレクチン、アイスプラントRIP、メロニン、メキシン、オシロイバナ属種RIP、ミトギリン、モデクシン、MOR、ツルレイシ属種RIP、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコRIP、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピーレクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ属種RIP(例えば、オールスパイスRIPである、PD−L1、PD−L2、PD−L3、PD−L4)、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナペクチンメチルトランスフェラーゼ(PME)、ソロモンズシールRIP、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP)、ポレクチン、エロモナス菌属種シュードモナス属毒素(エロモナス・ハイドロフィラシュードモナス様毒素)、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマアグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギRIP、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンb、セイヨウニワトコRIP(例えば、セイヨウニワトコアグルチニンI〜セイヨウニワトコアグルチニンV)、ツルコザクラRIP、ホウレンソウタンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ属種RIP(例えば、カラスリン、キリロウィン、トリコアングィン、トリコキリン、トリコサンチン、TYカイ)、コムギ属種RIP、ヤドリギRIP、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウRIP、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケRIP、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Z.ジプロペレンニスRIP、トウモロコシRIP、及び前出のうちのいずれかによる、任意の機能的な断片からなる群から選択される毒素に由来する。しかし、インビトロにおいて、リボソーム機能を、酵素作用により阻害する任意のポリペプチドは、組換えリボ毒性タンパク質及び組換えリボ毒性ポリペプチドを同定する目的で、分子ライブラリーをスクリーニングするための、本出願で特許請求される方法、ライブラリー、キメラ分子、及び融合ポリペプチドの範囲内で機能すると期待される。
ーのメンバーに由来する。本発明のある特定の実施形態では、リボ毒性領域及び/又は修飾リボ毒性領域は、非毒性RNアーゼに由来する。本発明のある特定の実施形態では、リボ毒性領域及び/又は修飾リボ毒性領域は、アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ属抗ウイルス性タンパク質/RIP、アンギオジェニン、A.パテンスRIP、アーティクラチンD、アスパリン、アスペルギリン、Aspf1、バルサミン、トウガンRIP、ブーガニン、ブーゲンビレア抗ウイルス性タンパク質1、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキRIP、ブリオジン(例えば、ブリオジン1、ブリオジン2)、イカダカズラRIP、ビートRIP、シロザRIP、カンホリン、トゲエビス全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲRIP、ククミス・フィガレイRIP、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャRIP、コチニンB、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種RIP、コリネバクテリウム属種ジフテリア毒素(C.ウルセランス内、コリネファージオメガ内、C.シュードツベルクローシス内のジフテリア毒素)、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウRIP、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキRIP、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンA、ヒヤシンスRIP、オオムギRIP、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリスRIP、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマRIP、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマRIP、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシレクチン、アイスプラントRIP、メロニン、メキシン、オシロイバナ属種RIP、ミトギリン、モデクシン、MOR、ツルレイシ属種RIP、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコRIP、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピーレクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ属種RIP(例えば、オールスパイスRIPである、PD−L1、PD−L2、PD−L3、PD−L4)、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナペクチンメチルトランスフェラーゼ(PME)、ソロモンズシールRIP、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP)、ポレクチン、エロモナス菌属種シュードモナス属毒素(エロモナス・ハイドロフィラシュードモナス様毒素)、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマアグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギRIP、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンb、セイヨウニワトコRIP(例えば、セイヨウニワトコアグルチニンI〜セイヨウニワトコアグルチニンV)、ツルコザクラRIP、ホウレンソウタンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ属種RIP(例えば、カラスリン、キリロウィン、トリコアングィン、トリコキリン、トリコサンチン、TYカイ)、コムギ属種RIP、ヤドリギRIP、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウRIP、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケRIP、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Z.ジプロペレンニスRIP、トウモロコシRIP、及び前出のうちのいずれかによる、任意の機能的な断片からなる群から選択される毒素に由来する。しかし、インビトロにおいて、リボソーム機能を、酵素作用により阻害する任意のポリペプチドは、組換えリボ毒性タンパク質及び組換えリボ毒性ポリペプチドを同定する目的で、分子ライブラリーをスクリーニングするための、本出願で特許請求される方法、ライブラリー、キメラ分子、及び融合ポリペプチドの範囲内で機能すると期待される。
B.ターゲティング特異性のための結合領域
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドは、標的生体分子に特異的に結合することが可能な結合領域を含む。ある特定の実施形態では、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、標的生体分子に特異的に結合することが可能なペプチド領域又はポリペプチド領域を含む。ターゲティングのための結合領域のデザインは、例えば、細胞毒性を、特異的標的細胞へとターゲティングすることなどにより、細胞毒性特異性を伴うキメラ毒素治療剤を操作するのに重要である。一般に、例えば、が
ん細胞、腫瘍細胞、血漿細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を宿す宿主細胞など、所望の細胞型の表面へと物理的にカップリングして見出されうる、標的生体分子を選択する。しかし、標的生体分子はまた、所望の細胞の内部においても見出され、これにより、細胞内標的を表す場合もある。結合領域は、標的生体分子に結合するそれらの能力により機能的に定義される。
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドは、標的生体分子に特異的に結合することが可能な結合領域を含む。ある特定の実施形態では、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、標的生体分子に特異的に結合することが可能なペプチド領域又はポリペプチド領域を含む。ターゲティングのための結合領域のデザインは、例えば、細胞毒性を、特異的標的細胞へとターゲティングすることなどにより、細胞毒性特異性を伴うキメラ毒素治療剤を操作するのに重要である。一般に、例えば、が
ん細胞、腫瘍細胞、血漿細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を宿す宿主細胞など、所望の細胞型の表面へと物理的にカップリングして見出されうる、標的生体分子を選択する。しかし、標的生体分子はまた、所望の細胞の内部においても見出され、これにより、細胞内標的を表す場合もある。結合領域は、標的生体分子に結合するそれらの能力により機能的に定義される。
本発明のポリペプチドの結合領域は、ペプチド領域又はポリペプチド領域を含みうる。結合領域は、例えば、ランダムに作製されたペプチド配列、自然発生のリガンド又はその誘導体、免疫グロブリンに由来するドメイン、免疫グロブリンドメインの代替物としての、合成により操作された足場など、1又は2以上の多様なペプチド部分又はポリペプチド部分を含みうる。本発明の細胞毒性ポリペプチド内でタンパク質性結合領域を使用することにより、本発明のある特定の細胞毒性ポリペプチドの各々を、アミノ酸残基の単一の連続鎖で表すことが可能となる。
本発明のポリペプチドの結合領域は、リボ毒性領域と重複するか、又はこの中に含有される結合領域を含みうる。例えば、多様な毒素ポリペプチド骨格は、リボ毒性活性をそれほど攪乱せずに、ある特定の位置における、ペプチドを表すアミノ酸残基ストレッチによる置きかえ及び/又はその挿入を許容しうる(例えば、米国特許出願公開第2013/0196928A1号明細書;米国特許出願公開第2007/0298434A1号明細書を参照されたい)。高度な縮重ペプチドによる置きかえ及び/又は挿入、特異的なペプチドの挿入又は置きかえを伴う、リボ毒性領域を含むライブラリーをスクリーニングすることにより、どのペプチドが、本発明の分子の結合領域として用いられるのかを同定することができる。この手法により、リボ毒性領域内に含まれる結合領域及び/又はリボ毒性領域へと融合させた結合領域を作製することができる。
当技術分野では、リガンド、モノクローナル抗体、操作された抗体の誘導体、及び操作された抗体の代替物など、それらの結合特徴を介して、ポリペプチドを、特異的細胞型へとターゲティングするのに有用な、多数の結合領域が公知である。
具体的であるが非限定的な一態様に従い、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、一般に、細胞表面受容体である、標的生体分子への結合機能性を保持する、自然発生のリガンド又はその誘導体を含む。例えば、当技術分野で公知の、多様なサイトカイン、増殖因子、及びホルモンを使用して、細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドを、コグネイトのサイトカイン受容体、増殖因子受容体、又はホルモン受容体を発現させる、特異的細胞型の細胞表面へとターゲティングすることができる。リガンドのある特定の非限定的な例は、B細胞活性化因子(BAFF,B-cell activating factors、APRIL)、コロニー刺激因子(CSF,colony stimulating factor)、上皮増殖因子(EGF,epidermalgrowth factor)、線維芽細胞増殖因子(FGF,fibroblast growth factor)、血管内皮増殖因子(VEGF,vascular endothelial growth factor)、インスリン様増殖因子(IGF,insulin-like growth factor)、インターフ
ェロン、インターロイキン(IL−2、IL−6、及びIL−23など)、神経増殖因子(NGF,nervegrowth factor)、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子(TGF,transforminggrowth factor)、及び腫瘍壊死因子(TNF,tumor necrosis factor)を含む(括弧内に別名を指し示す)。
ェロン、インターロイキン(IL−2、IL−6、及びIL−23など)、神経増殖因子(NGF,nervegrowth factor)、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子(TGF,transforminggrowth factor)、及び腫瘍壊死因子(TNF,tumor necrosis factor)を含む(括弧内に別名を指し示す)。
ある特定の他の実施形態に従い、結合領域は、標的生体分子に結合することが可能な合成リガンドを含む。非限定的な一例は、細胞毒性Tリンパ球抗原4(CTLA−4,T-lymphocyte antigen 4)に対するアンタゴニストである。
具体的であるが非限定的な一態様に従い、結合領域は、免疫グロブリン型結合領域を含
みうる。本明細書で使用される「免疫グロブリン型結合領域」という用語は、抗原又はエピトープなど、1又は2以上の標的生体分子に結合することが可能なポリペプチド領域を指す。結合領域は、標的分子に結合するそれらの能力により機能的に定義することができる。免疫グロブリン型結合領域は一般に、抗体又は抗体様構造に由来するが、他の供給源に由来する代替的足場も、用語の範囲内にあることが想定される。
みうる。本明細書で使用される「免疫グロブリン型結合領域」という用語は、抗原又はエピトープなど、1又は2以上の標的生体分子に結合することが可能なポリペプチド領域を指す。結合領域は、標的分子に結合するそれらの能力により機能的に定義することができる。免疫グロブリン型結合領域は一般に、抗体又は抗体様構造に由来するが、他の供給源に由来する代替的足場も、用語の範囲内にあることが想定される。
免疫グロブリン(Ig,immunoglobulin)タンパク質は、Igドメインとして公知の構造ドメインを有する。Igドメインは、約70〜110アミノ酸残基の長さの範囲であり、特徴的なIgフォールドを保有し、ここでは、7つ〜9つのアンチパラレルのベータ鎖が、2つのベータシートへと配置され、これにより、サンドイッチ様構造が形成されることが典型的である。Igフォールドは、サンドイッチの内部表面上で、疎水性アミノ酸相互作用と、鎖中のシステイン残基間の高度に保存されたジスルフィド結合とにより安定化されている。Igドメインは、可変Igドメイン(IgV,variable Ig domain又はVセット)の場合もあり、定常Igドメイン(IgC,constant Ig domain又はCセット)の場合もあり、中間Igドメイン(IgI,intermediate Ig domain又はIセット)の場合もある。一部のIgドメインは、それらのエピトープに結合する抗体の特異性に重要な、相補性決定領域(CDR,complementarity determining region)と関連する場合がある。Ig様ドメインはまた、非免疫グロブリンタンパク質内でも見出され、Ig様ドメインに基づき、タンパク質のIgスーパーファミリーのメンバーとして分類されている。HGNC(HUGO Gene Nomenclature Committee)は、Ig様ドメインを含有するファミリーのメンバーのリストを提供している。
免疫グロブリン型結合領域は、抗体又はその抗原結合性断片のポリペプチド配列であって、アミノ酸配列を、例えば、分子操作又はライブラリーのスクリーニングを介する分子選択により、非免疫グロブリンタンパク質の天然抗体又はIg様ドメインのアミノ酸配列から変化させたポリペプチド配列でありうる。組換えDNA法及びインビトロライブラリースクリーニングは、免疫グロブリン型結合領域の作製に適合的であるため、抗体を再デザインして、小型のサイズ、細胞への侵入、又は他の治療的改善など、所望される特徴を得ることができる。可能な変化は多く、わずか1つのアミノ酸の変化から、例えば、可変領域の完全な再デザインの範囲でありうる。可変領域内の変化は、抗原結合特徴を改善するか、可変領域の安定性を改善するか、又は免疫原性応答の潜在的可能性を低減するために施すことが典型的である。
多数の免疫グロブリン型結合領域が、本発明の構成要素として想定されている。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン型結合領域は、標的生体分子に結合することが可能な抗体パラトープなど、免疫グロブリン結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態では、免疫グロブリン型結合領域は、いずれの免疫グロブリンドメインからも導出されない操作ポリペプチドであって、標的生体分子への高アフィニティーの結合をもたらすことにより、免疫グロブリン結合領域と同様に機能する操作ポリペプチドを含む。この操作ポリペプチドは、本明細書で記載される、免疫グロブリンに由来する相補性決定領域を含むか又はこれから本質的になるポリペプチド足場を含んでもよい。
先行技術では、それらの高アフィニティーの結合特徴を介して、ポリペプチドを、特異的細胞型へとターゲティングするのに有用な結合領域が多数存在する。ある特定の実施形態では、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、単一ドメイン抗体(sdAb,single-domain antibody)ドメイン、ナノボディー、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン(VHH断片)、二価ナノボディー、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新抗原受容体(IgNAR,immunoglobulin new antigen receptor)、VNAR断片、単鎖可変断片(scFv,single-chain variable fragment)、多量体化scFv断片(ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー)、
二特異性タンデムscFv断片、ジスルフィド安定化抗体可変断片(Fv,variable fragment)、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン及びCH1ドメインからなるジス
ルフィド安定化抗原結合性断片(Fab,antigen-binding fragment)、二価F(ab’)2断片、重鎖及びCH1ドメインからなるFd断片、単鎖Fv−CH3ミニボディー、二特異性ミニボディー、二量体CH2ドメイン(CH2D,CH2 domain)断片、Fc抗原結合性ドメイン(Fcab,Fcantigen binding domain)、単離相補性決定領域3(C
DR3,complementary determining region 3)断片、拘束性フレームワーク領域3、CDR3、フレームワーク領域4(FR3−CDR3−FR4,framework region 3, CDR3, framework region 4)ポリペプチド、低分子モジュール型免疫医薬(SMIP,small modular immunopharmaceutical)ドメイン、及び前出の任意の遺伝子操作対応物であって、そのパラトープ及び結合機能を保持する遺伝子操作対応物を含む群から選択される(Saerens D et al., Curr Opin Pharmacol 8: 600-8 (2008); Dimitrov D,MAbs 1: 26-8 (2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., ClinDev Immunol 2012: 980250 (2012)を参照されたい)。
二特異性タンデムscFv断片、ジスルフィド安定化抗体可変断片(Fv,variable fragment)、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン及びCH1ドメインからなるジス
ルフィド安定化抗原結合性断片(Fab,antigen-binding fragment)、二価F(ab’)2断片、重鎖及びCH1ドメインからなるFd断片、単鎖Fv−CH3ミニボディー、二特異性ミニボディー、二量体CH2ドメイン(CH2D,CH2 domain)断片、Fc抗原結合性ドメイン(Fcab,Fcantigen binding domain)、単離相補性決定領域3(C
DR3,complementary determining region 3)断片、拘束性フレームワーク領域3、CDR3、フレームワーク領域4(FR3−CDR3−FR4,framework region 3, CDR3, framework region 4)ポリペプチド、低分子モジュール型免疫医薬(SMIP,small modular immunopharmaceutical)ドメイン、及び前出の任意の遺伝子操作対応物であって、そのパラトープ及び結合機能を保持する遺伝子操作対応物を含む群から選択される(Saerens D et al., Curr Opin Pharmacol 8: 600-8 (2008); Dimitrov D,MAbs 1: 26-8 (2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., ClinDev Immunol 2012: 980250 (2012)を参照されたい)。
ある特定の他の実施形態に従い、結合領域は、免疫グロブリンドメインに対する、操作された代替的足場であって、標的生体分子への高アフィニティー及び特異的結合など、類似の機能的特徴を呈示し、安定性の増大又は免疫原性の低減など、改善された特徴の操作を可能とする代替的足場を含む。本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドのある特定の実施形態では、結合領域は、操作フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型(10Fn3,fibronectin-derived, 10thfibronectin type III)ドメイン
(モノボディー、AdNectins(商標)、又はAdNexins(商標));操作テネイシン由来テ
ネイシンIII型ドメイン(Centryns(商標));操作アンキリンリピートモチーフ含有ポ
リペプチド(DARPins(商標));操作低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン(L
DLR−A,low-density lipoprotein receptor-derived A domain)(Avimers(商標));リポカリン(アンチカリン);操作プロテアーゼ阻害剤由来クニッツドメイン;操作プロテインA由来Zドメイン(Affibodies(商標));操作ガンマ−Bクリスタリン由来足場又は操作ユビキチン由来足場(Affilin);Sac7d由来ポリペプチド(Nanoffitins(登録商標)又はアフィチン);操作Fyn由来SH2ドメイン(Fynomers(登録商標));ミニプロテイン;C型レクチン様ドメイン足場、操作抗体模倣体、及び前出の任意の遺伝子操作対応物であって、その結合機能を保持する遺伝子操作対応物を含む群から選択される(Worn A, Plueckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al.,Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62(2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Hey T et al., TrendsBiotechnol 23 :514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36(2005);
Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, MethodsMol Biol 352: 95-109 (2007); Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010);Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011))。一般に、免疫グロブリンの代替的足場は、20キロドルトン未満であり、単一のポリペプチド鎖からなり、システイン残基を欠き、比較的高い熱力学的安定性を有する。
(モノボディー、AdNectins(商標)、又はAdNexins(商標));操作テネイシン由来テ
ネイシンIII型ドメイン(Centryns(商標));操作アンキリンリピートモチーフ含有ポ
リペプチド(DARPins(商標));操作低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン(L
DLR−A,low-density lipoprotein receptor-derived A domain)(Avimers(商標));リポカリン(アンチカリン);操作プロテアーゼ阻害剤由来クニッツドメイン;操作プロテインA由来Zドメイン(Affibodies(商標));操作ガンマ−Bクリスタリン由来足場又は操作ユビキチン由来足場(Affilin);Sac7d由来ポリペプチド(Nanoffitins(登録商標)又はアフィチン);操作Fyn由来SH2ドメイン(Fynomers(登録商標));ミニプロテイン;C型レクチン様ドメイン足場、操作抗体模倣体、及び前出の任意の遺伝子操作対応物であって、その結合機能を保持する遺伝子操作対応物を含む群から選択される(Worn A, Plueckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al.,Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62(2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Hey T et al., TrendsBiotechnol 23 :514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36(2005);
Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, MethodsMol Biol 352: 95-109 (2007); Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010);Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011))。一般に、免疫グロブリンの代替的足場は、20キロドルトン未満であり、単一のポリペプチド鎖からなり、システイン残基を欠き、比較的高い熱力学的安定性を有する。
上記の結合領域のうちのいずれも、本明細書で記載される標的生体分子に対する、結合領域の構成要素の解離定数が、1リットル当たり10-5〜10-12モル、好ましくは、200nM未満である限りにおいて、本発明の構成要素として使用することができる。特異的標的生体分子は、多数の基準に基づき選択することができる。
本発明の細胞毒性ポリペプチドの標的生体分子
本発明の細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、それらの標的生体分子の細胞型特異的発現及び/又はそれらの標的生体分子の、特異的細胞型に照らした物理的局在化など、多数の基準に基づき、デザイン又は選択することができる。例えば、本発明のある特定の細胞
毒性ポリペプチドは、もっぱら1つの細胞型だけが細胞表面へと発現させる細胞表面標的に結合することが可能な結合領域を含む。
本発明の細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、それらの標的生体分子の細胞型特異的発現及び/又はそれらの標的生体分子の、特異的細胞型に照らした物理的局在化など、多数の基準に基づき、デザイン又は選択することができる。例えば、本発明のある特定の細胞
毒性ポリペプチドは、もっぱら1つの細胞型だけが細胞表面へと発現させる細胞表面標的に結合することが可能な結合領域を含む。
本発明のある特定の細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、細胞内標的生体分子に特異的に結合することが可能なポリペプチド領域を含む。細胞内標的生体分子の非限定的な例は、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTKキナーゼ,Brutin's tyrosine kinase)、サイクリン依存型キナーゼ(CDK,cyclin-dependentkinase)、低分子Ras GTPアー
ゼなどのGTPアーゼ、Myc転写因子、PRL−3(phosphatase of regeneratingliver 3)、ポリオーマウイルスミドルTがんタンパク質(mT,polyomavirus middle Toncoprotein)、Rafキナーゼ、Syk−ZAP−70などの脾臓チロシンキナーゼ、並びにc−Src及びv−SrcなどのSrcキナーゼを含む(例えば、Guo K et al., Sci Transl Med 3: 99-85 (2011)を参照されたい)。
ゼなどのGTPアーゼ、Myc転写因子、PRL−3(phosphatase of regeneratingliver 3)、ポリオーマウイルスミドルTがんタンパク質(mT,polyomavirus middle Toncoprotein)、Rafキナーゼ、Syk−ZAP−70などの脾臓チロシンキナーゼ、並びにc−Src及びv−SrcなどのSrcキナーゼを含む(例えば、Guo K et al., Sci Transl Med 3: 99-85 (2011)を参照されたい)。
本発明のある特定の細胞毒性ポリペプチドの結合領域は、好ましくは、がん細胞、腫瘍細胞、血漿細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を宿す宿主細胞など、所望の細胞型の表面へと物理的にカップリングした、細胞外標的生体分子に特異的に結合することが可能なポリペプチド領域を含む。
「標的生体分子」という用語は、生体分子、一般に、タンパク質を、特異的な細胞型又は生物内の場所へとターゲティングする結合領域が結合することが可能なタンパク質、又はグリコシル化などの翻訳後修飾により修飾されたタンパク質を指す。細胞外標的生体分子は、非修飾のポリペプチド、生化学的官能基の付加により修飾されたポリペプチド、及び糖脂質を含む、多様なエピトープを含みうる(例えば、米国特許第5,091,178号明細書;欧州特許第2431743号明細書を参照されたい)。細胞外標的生体分子は、本発明の細胞ターゲティング分子と相互作用すると、内因的に内部化されるか、又は内部化するように容易く仕向けられることが所望される。
加えて、例えば、ウイルス発現ベクター系を使用する感染、ある特定の化合物への曝露、及び/又はある特定の種類の電磁放射への曝露の後など、人工的手段により、標的生体分子を発現させるように、標的細胞を誘導及び/又は強制しうるため、標的生体分子は、天然で存在しなくともよい。
本発明の目的では、標的生体分子の修飾に関する「細胞外」という用語は、その構造の少なくとも一部が、細胞外環境へと曝露された生体分子を指す。細胞外標的生体分子は、細胞膜構成要素、膜貫通タンパク質、細胞膜にアンカリングされた生体分子、細胞表面結合性生体分子、及び分泌生体分子を含む。本発明の細胞毒性ポリペプチドの結合領域の細胞外標的生体分子は、がん細胞上、免疫細胞上、及びウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は原虫などの細胞内病原体に感染した細胞上に、過剰比率で存在するか、又はもっぱら存在するバイオマーカーを含みうる。細胞表面に局在する細胞外標的生体分子に対して、それらの細胞外標的生体分子が、殺滅のためにターゲティングされる細胞へは特異的に、物理的にカップリングするが、殺滅のためにターゲティングされない細胞上では、非存在であるか又は極めてまれであるように、結合領域を選択することが一般的である。
本発明に関して、標的生体分子について記載するのに使用される場合の「物理的にカップリングした」という語句は、標的生体分子又はその一部を細胞の外部へとカップリングさせる、共有結合的分子間相互作用及び/又は各単一の相互作用のエネルギーが、約1〜5キロカロリーのオーダーである、標的生体分子と細胞との間の複数の非共有結合的相互作用(例えば、静電結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性力など)など、非共有結合的分子間相互作用の両方を意味する。定義上、全ての内在性膜タンパク質は、細胞膜へと物理的にカップリングしており、表在性膜タンパク質も同様に、細胞膜へと
物理的にカップリングしている。例えば、細胞外標的生体分子は、膜貫通領域、脂質アンカー、糖脂質アンカーを含む場合もあり、及び/又は前出のうちのいずれか1つを含む因子により非共有結合的に会合する場合もある(例えば、非特異的疎水性相互作用及び/又は脂質結合性相互作用により)。
物理的にカップリングしている。例えば、細胞外標的生体分子は、膜貫通領域、脂質アンカー、糖脂質アンカーを含む場合もあり、及び/又は前出のうちのいずれか1つを含む因子により非共有結合的に会合する場合もある(例えば、非特異的疎水性相互作用及び/又は脂質結合性相互作用により)。
ある特定の実施形態では、結合領域は、がん細胞の細胞表面上の表面抗原への特異的結合及び高アフィニティー結合について選択される免疫グロブリン型ポリペプチドであって、抗原が、がん細胞への発現に限局されるポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になる(Glokler J et al., Molecules 15: 2478-90 (2010); Liu Y et al., LabChip 9: 1033-6 (2009)を参照されたい)。他の実施形態に従い、結合領域を、がん細胞の細胞表
面上の表面抗原であって、がん細胞が、非がん細胞と比較して過剰発現させるか又は優先的に発現させる抗原への特異的結合及び高アフィニティー結合について選択する(例えば、Dantas-Barbosa C et al., Int J Mol Sci 12: 5420-40 (2012)を参照されたい)。一
部の代表的な標的生体分子は、以下で列挙する標的であって、がん及び/又は特異的免疫細胞型と関連する標的を含むがこれらに限定されない。
面上の表面抗原であって、がん細胞が、非がん細胞と比較して過剰発現させるか又は優先的に発現させる抗原への特異的結合及び高アフィニティー結合について選択する(例えば、Dantas-Barbosa C et al., Int J Mol Sci 12: 5420-40 (2012)を参照されたい)。一
部の代表的な標的生体分子は、以下で列挙する標的であって、がん及び/又は特異的免疫細胞型と関連する標的を含むがこれらに限定されない。
先行技術では、アネキシンAI、B3型黒色腫抗原、B4型黒色腫抗原、CD2、CD3、CD4、CD20(Bリンパ球抗原タンパク質であるCD20)、CD22、CD25(インターロイキン2受容体であるIL2R(interleukin-2 receptor))、CD30(TNFRSF8)、CD38(サイクリックADPリボースヒドロラーゼ)、CD40、CD44(ヒアルロナン受容体)、ITGAV(CD51)、CD66、CD71(トランスフェリン受容体)、CD73、CD74(HLA−DR抗原会合型不変鎖)、CD79、CD98、エンドグリン(END,endoglin又はCD105)、CD106(VCAM−1)、4型ケモカイン受容体(CDCR−4,chemokine receptor type 4である
フシン(CD184))、CD200、インスリン様増殖因子1受容体(CD221)、ムチン1(MUC1,mucin1(CD227))、基底細胞接着分子(B−CAM,basal
cell adhesion molecule又はCD239)、CD248(エンドシアリン又はTEM1
)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー10b(TNFRSF10B,tumor necrosis factorreceptor super family 10bであるCD262)、腫瘍壊死因子受容体スーパ
ーファミリー13B(TNFRSF13BであるTACI(CD276))、血管内皮増殖因子受容体2(KDRであるCD309)、上皮細胞接着分子(EpCAM,epithelial cell adhesion moleculeであるCD326)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2
,human epidermal growth factor receptor 2/Neu/ErbB2/CD340)、がん抗原15−3(CA15−3,cancer antigen 15-3)、がん抗原19−9(CA19
−9)、がん抗原125(CA125であるMUC16)、CA242、癌胎児性抗原関連細胞接着分子(例えば、CEACAM(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule)3(CD66d)及びCEACAM5)、癌胎児性抗原(CEA,carcinoembryonic antigen)タンパク質、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSP4
,chondroitin sulfate proteoglycan 4、MCSP、NG2)、CTLA4、DLL4、上皮増殖因子受容体(EGFR,epidermal growth factor receptor/ErbB1)、葉酸受容体(FOLR,folate receptor)、G−28、ガングリオシドGD2、ガングリ
オシドGD3、HLA−Dr10、HLA−DRB、ヒト上皮増殖因子受容体1(HER1)、エフリンB型受容体2(EphB2,Ephrin type-B receptor 2)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP,fibroblast activation protein/セプラーゼ)、インスリン様増殖因子1受容体(IGF1R,insulin-like growth factor 1 receptor)、インターロイキン2受容体(IL−2R,interleukin 2 receptor)、インターロイキン6受容体(IL−6R)、インテグリンアルファVベータ3(αVβ3,integrin alpha-V beta-3)、インテグリンアルファVベータ5(αvβ5)
、インテグリンアルファ5ベータ1(α5β1)、L6、MPG、黒色腫関連抗原1(MAGE−1,melanoma-associated antigen 1)タンパク質、黒色腫関連抗原3(MAG
E−3)、メソテリン(MSLN,mesothelin)、MPG、MS4A、p21、p97、ポリオウイルス受容体様4(PVRL4,polio virus receptor-like 4)タンパク質、
プロテアーゼ活性化受容体(PAR1,protease-activated-receptor 1など)、前立腺
特異的膜抗原(PSMA,prostate-specific membrane antigen)タンパク質、栄養膜糖タンパク質(TPGB,trophoblast glycoprotein)、及び腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子(TACSTD,tumor-associated calcium signal transducer)をターゲティングする結合領域(括弧内に別名を指し示す)など、がん細胞と関連するエピトープを認識する、多くの免疫グロブリン型結合領域が存在する(例えば、Lui B et al., Cancer Res 64: 704-10 (2004); Novellino L et al.,Cancer Immunol Immunother 54: 187-207 (2005); Bagley R et al., Int J Oncol 34:619-27 (2009); Gerber H et al., mAbs 1:
247-53 (2009); Beck A et al., Nat Rev Immunol 10: 345-52 (2010); Andersen J etal., J Biol Chem 287: 22927-37 (2012); Nolan-Stevaux O et al., PLoS One 7:e50920 (2012); Rust S et al., Mol Cancer 12: 11 (2013)を参照されたい)。標的生体分子
のこのリストは、非限定的であることを意図する。当業者は、がん細胞型と関連する、任意の所望される標的生体分子を使用して、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドを産生するように、リボ毒性領域とカップリングさせる結合領域をデザイン又は選択しうることを察知するであろう。
フシン(CD184))、CD200、インスリン様増殖因子1受容体(CD221)、ムチン1(MUC1,mucin1(CD227))、基底細胞接着分子(B−CAM,basal
cell adhesion molecule又はCD239)、CD248(エンドシアリン又はTEM1
)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー10b(TNFRSF10B,tumor necrosis factorreceptor super family 10bであるCD262)、腫瘍壊死因子受容体スーパ
ーファミリー13B(TNFRSF13BであるTACI(CD276))、血管内皮増殖因子受容体2(KDRであるCD309)、上皮細胞接着分子(EpCAM,epithelial cell adhesion moleculeであるCD326)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2
,human epidermal growth factor receptor 2/Neu/ErbB2/CD340)、がん抗原15−3(CA15−3,cancer antigen 15-3)、がん抗原19−9(CA19
−9)、がん抗原125(CA125であるMUC16)、CA242、癌胎児性抗原関連細胞接着分子(例えば、CEACAM(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule)3(CD66d)及びCEACAM5)、癌胎児性抗原(CEA,carcinoembryonic antigen)タンパク質、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSP4
,chondroitin sulfate proteoglycan 4、MCSP、NG2)、CTLA4、DLL4、上皮増殖因子受容体(EGFR,epidermal growth factor receptor/ErbB1)、葉酸受容体(FOLR,folate receptor)、G−28、ガングリオシドGD2、ガングリ
オシドGD3、HLA−Dr10、HLA−DRB、ヒト上皮増殖因子受容体1(HER1)、エフリンB型受容体2(EphB2,Ephrin type-B receptor 2)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP,fibroblast activation protein/セプラーゼ)、インスリン様増殖因子1受容体(IGF1R,insulin-like growth factor 1 receptor)、インターロイキン2受容体(IL−2R,interleukin 2 receptor)、インターロイキン6受容体(IL−6R)、インテグリンアルファVベータ3(αVβ3,integrin alpha-V beta-3)、インテグリンアルファVベータ5(αvβ5)
、インテグリンアルファ5ベータ1(α5β1)、L6、MPG、黒色腫関連抗原1(MAGE−1,melanoma-associated antigen 1)タンパク質、黒色腫関連抗原3(MAG
E−3)、メソテリン(MSLN,mesothelin)、MPG、MS4A、p21、p97、ポリオウイルス受容体様4(PVRL4,polio virus receptor-like 4)タンパク質、
プロテアーゼ活性化受容体(PAR1,protease-activated-receptor 1など)、前立腺
特異的膜抗原(PSMA,prostate-specific membrane antigen)タンパク質、栄養膜糖タンパク質(TPGB,trophoblast glycoprotein)、及び腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子(TACSTD,tumor-associated calcium signal transducer)をターゲティングする結合領域(括弧内に別名を指し示す)など、がん細胞と関連するエピトープを認識する、多くの免疫グロブリン型結合領域が存在する(例えば、Lui B et al., Cancer Res 64: 704-10 (2004); Novellino L et al.,Cancer Immunol Immunother 54: 187-207 (2005); Bagley R et al., Int J Oncol 34:619-27 (2009); Gerber H et al., mAbs 1:
247-53 (2009); Beck A et al., Nat Rev Immunol 10: 345-52 (2010); Andersen J etal., J Biol Chem 287: 22927-37 (2012); Nolan-Stevaux O et al., PLoS One 7:e50920 (2012); Rust S et al., Mol Cancer 12: 11 (2013)を参照されたい)。標的生体分子
のこのリストは、非限定的であることを意図する。当業者は、がん細胞型と関連する、任意の所望される標的生体分子を使用して、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドを産生するように、リボ毒性領域とカップリングさせる結合領域をデザイン又は選択しうることを察知するであろう。
がん細胞と強く関連する他の標的生体分子の例は、BAGE(B melanoma antigen)タンパク質、基底細胞接着分子(BCAM,basal cell adhesion molecule又はLutheran血液型糖タンパク質)、膀胱腫瘍抗原(BTA,bladder tumor antigen)、がん精巣抗原
であるNY−ESO−1、がん精巣抗原であるLAGEタンパク質、CD19(Bリンパ球抗原タンパク質であるCD19)、CD21(補体受容体2又は補体3d受容体)、CD26(ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4,dipeptidyl peptidase-4)又はアデノシンデアミナーゼ複合体化タンパク質2)、CD33(シアル酸結合性免疫グロブリン型レクチン3)、CD52(CAMPATH−1抗原)、CD56、CD133(プロミニン1)、CS1(SLAMファミリー7又はSLAMF7(SLAM family number 7)、細胞表面A33抗原タンパク質(gpA33)、エプスタイン−バーウイルス抗原タンパク質、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR,fibroblast growth factor receptor)、C
D339(JAG1又はjagged−1)、GAGE/PAGEタンパク質(黒色腫関連がん/精巣抗原)、肝細胞増殖因子受容体(HGFR,hepatocyte growth factor receptor又はc−Met)、MAGEタンパク質、MART−1/MelanA(melanoma antigen recognized by T-cells 1(MARTI))タンパク質、ムチン、PRAME(preferentially expressed antigen of melanoma)タンパク質、前立腺特異的抗原(PS
A,prostate specific antigen protein)タンパク質、前立腺幹細胞抗原タンパク質(
PSCA,prostate stem cell antigen)、終末糖化産物受容体(RAGE,receptor for advanced glycation endroducts)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG−72,tumor-associated glycoprotein 72)、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR,vascular endothelial growth factor receptor)、及びウィルムス腫瘍抗原である。標的生体分子の
このリストは、非限定的であることを意図する。
であるNY−ESO−1、がん精巣抗原であるLAGEタンパク質、CD19(Bリンパ球抗原タンパク質であるCD19)、CD21(補体受容体2又は補体3d受容体)、CD26(ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4,dipeptidyl peptidase-4)又はアデノシンデアミナーゼ複合体化タンパク質2)、CD33(シアル酸結合性免疫グロブリン型レクチン3)、CD52(CAMPATH−1抗原)、CD56、CD133(プロミニン1)、CS1(SLAMファミリー7又はSLAMF7(SLAM family number 7)、細胞表面A33抗原タンパク質(gpA33)、エプスタイン−バーウイルス抗原タンパク質、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR,fibroblast growth factor receptor)、C
D339(JAG1又はjagged−1)、GAGE/PAGEタンパク質(黒色腫関連がん/精巣抗原)、肝細胞増殖因子受容体(HGFR,hepatocyte growth factor receptor又はc−Met)、MAGEタンパク質、MART−1/MelanA(melanoma antigen recognized by T-cells 1(MARTI))タンパク質、ムチン、PRAME(preferentially expressed antigen of melanoma)タンパク質、前立腺特異的抗原(PS
A,prostate specific antigen protein)タンパク質、前立腺幹細胞抗原タンパク質(
PSCA,prostate stem cell antigen)、終末糖化産物受容体(RAGE,receptor for advanced glycation endroducts)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG−72,tumor-associated glycoprotein 72)、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR,vascular endothelial growth factor receptor)、及びウィルムス腫瘍抗原である。標的生体分子の
このリストは、非限定的であることを意図する。
がん細胞と強く関連する他の標的生体分子の例は、炭酸脱水酵素IX(CA9/CAIX,carbonic anhydrase IX)、Claudinタンパク質(CLDN3,Claudinprotein
3、CLDN4)、エフリンA型受容体3(EphA3,Ephrin type-A receptor 3)、葉酸結合性タンパク質(FBP,folate binding protein)、ガングリオシドGM2、インスリン様増殖因子受容体、インテグリン(CD11a〜CD11cなど)、RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)、受容体チロシンタンパク質キナーゼerB−3、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー10A(TRAIL−R1/DR4)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー10B(TRAIL−R2)、テネイシンC、及びCD64である(FcγRI)(Hough C et al., Cancer Res 60: 6281-7 (2000)
; Thepen T et al., Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al., Nat RevCancer 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald Det al., Cancer Res 71: 6300-9 (2011); Scott et al., Cancer Immun 12: 14-22(2012)を参照されたい)。標的生体分子のこのリストは、非限定的であることを意図する。
3、CLDN4)、エフリンA型受容体3(EphA3,Ephrin type-A receptor 3)、葉酸結合性タンパク質(FBP,folate binding protein)、ガングリオシドGM2、インスリン様増殖因子受容体、インテグリン(CD11a〜CD11cなど)、RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)、受容体チロシンタンパク質キナーゼerB−3、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー10A(TRAIL−R1/DR4)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー10B(TRAIL−R2)、テネイシンC、及びCD64である(FcγRI)(Hough C et al., Cancer Res 60: 6281-7 (2000)
; Thepen T et al., Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al., Nat RevCancer 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald Det al., Cancer Res 71: 6300-9 (2011); Scott et al., Cancer Immun 12: 14-22(2012)を参照されたい)。標的生体分子のこのリストは、非限定的であることを意図する。
加えて、ADAMメタロプロテイナーゼ(例えば、ADAM−9、ADAM−10、ADAM−12、ADAM−15、ADAM−17)、ADPリボシルトランスフェラーゼ(ART1,ADP-ribosyltransferase、ART4)、F4/80抗原、骨髄間質抗原(BST1,bone marrow stroma antigen、BST2)、BCR−ABL(breakpoint cluster region-c-abl oncogene)タンパク質、C3aR(complementcomponent 3a receptor,補体成分3a受容体)、CD7、CD13、CD14、CD15(ルイスX又はステ
ージ特異的胎児抗原1)、CD23(FCイプシロンRII)、CD49d、CD53、CD54(細胞内接着分子1)、CD63(テトラスパニン)、CD69、CD80、CD86、CD88(補体成分5a受容体1)、CD115(コロニー刺激因子1受容体)、CD123(インターロイキン3受容体)、CD129(インターロイキン9受容体)、CD183(ケモカイン受容体であるCXCR3)、CD191(CCR1)、CD193(CCR3)、CD195(ケモカイン受容体であるCCR5)、CD203c、CD225(インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質1)、CD244(ナチュラルキラー細胞受容体2B4)、CD282(toll様受容体2)、CD284(toll様受容体4)、CD294(GPR44)、CD305(白血球関連免疫グロブリン様受容体1)、エフリンA型受容体2(EphA2)、FceRIa、ガレクチン−9、アルファ−フェトタンパク質抗原17−A1タンパク質、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ(HAAH,human aspartyl (asparaginyl) beta-hydroxylase)
、免疫グロブリン様転写物であるILT−3、リソファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1(LPGAT1,lysophosphatidylglycerolacyltransferase 1/IAA0205)、リソソーム会合膜タンパク質(LAMP,lysosome-associatedmembrane protein;CD107など)、メラニン細胞タンパク質であるPMEL(gp100)、骨髄関連タンパク質14(mrp−14,myeloid-related protein-14)、受容体チロシンタンパク質キナーゼerbB−3、SARTタンパク質、スカベンジャー受容体(CD64及びCD68など)、Siglec(シアル酸結合性免疫グロブリン型レクチン,sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin)、シンデカン(SDC1,syndecan 1又はCD138など)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1(TRP−1,tyrosinease-related protein 1)、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP−2)、チロシ
ナーゼ会合抗原(TAA)、APO−3、BCMA、CD2、CD3、CD4、CD8、CD18、CD27、CD28、CD29、CD41、CD49、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD134(OX40)、CD137(4−1BB)、CD152(CTLA−4)、ケモカイン受容体、補体タンパク質、サイトカイン受容体、組織適合性タンパク質、ICOS、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、MHCクラスI分子(ペプチドと共に複合体化してもよい)、MHCクラスII分子(ペプチドと共に複合体化してもよい)、c−myc、オステオプロテゲリン、PD−1、p53、RANK、TACI、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、TNF受容体スーパーファミリーメンバー(TNF−R1、TNFR−2)、Apo2/TRAIL−R1、TRAIL−R2、TRAIL−R3、及びTRAIL−R4など、標的生体分子の多数の他の例も想定される(標的生体分子については、Scott A et al., Cancer Immunity 12: 14 (2012); Cheever M et al.,Clin Cancer Res 15: 5323-37 (2009)を参照
されたいが、これらにおいて記載されている標的分子は、非限定的な例であることに留意されたい)。
ージ特異的胎児抗原1)、CD23(FCイプシロンRII)、CD49d、CD53、CD54(細胞内接着分子1)、CD63(テトラスパニン)、CD69、CD80、CD86、CD88(補体成分5a受容体1)、CD115(コロニー刺激因子1受容体)、CD123(インターロイキン3受容体)、CD129(インターロイキン9受容体)、CD183(ケモカイン受容体であるCXCR3)、CD191(CCR1)、CD193(CCR3)、CD195(ケモカイン受容体であるCCR5)、CD203c、CD225(インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質1)、CD244(ナチュラルキラー細胞受容体2B4)、CD282(toll様受容体2)、CD284(toll様受容体4)、CD294(GPR44)、CD305(白血球関連免疫グロブリン様受容体1)、エフリンA型受容体2(EphA2)、FceRIa、ガレクチン−9、アルファ−フェトタンパク質抗原17−A1タンパク質、ヒトアスパラチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ(HAAH,human aspartyl (asparaginyl) beta-hydroxylase)
、免疫グロブリン様転写物であるILT−3、リソファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1(LPGAT1,lysophosphatidylglycerolacyltransferase 1/IAA0205)、リソソーム会合膜タンパク質(LAMP,lysosome-associatedmembrane protein;CD107など)、メラニン細胞タンパク質であるPMEL(gp100)、骨髄関連タンパク質14(mrp−14,myeloid-related protein-14)、受容体チロシンタンパク質キナーゼerbB−3、SARTタンパク質、スカベンジャー受容体(CD64及びCD68など)、Siglec(シアル酸結合性免疫グロブリン型レクチン,sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin)、シンデカン(SDC1,syndecan 1又はCD138など)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1(TRP−1,tyrosinease-related protein 1)、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP−2)、チロシ
ナーゼ会合抗原(TAA)、APO−3、BCMA、CD2、CD3、CD4、CD8、CD18、CD27、CD28、CD29、CD41、CD49、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD134(OX40)、CD137(4−1BB)、CD152(CTLA−4)、ケモカイン受容体、補体タンパク質、サイトカイン受容体、組織適合性タンパク質、ICOS、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、MHCクラスI分子(ペプチドと共に複合体化してもよい)、MHCクラスII分子(ペプチドと共に複合体化してもよい)、c−myc、オステオプロテゲリン、PD−1、p53、RANK、TACI、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、TNF受容体スーパーファミリーメンバー(TNF−R1、TNFR−2)、Apo2/TRAIL−R1、TRAIL−R2、TRAIL−R3、及びTRAIL−R4など、標的生体分子の多数の他の例も想定される(標的生体分子については、Scott A et al., Cancer Immunity 12: 14 (2012); Cheever M et al.,Clin Cancer Res 15: 5323-37 (2009)を参照
されたいが、これらにおいて記載されている標的分子は、非限定的な例であることに留意されたい)。
ある特定の実施形態では、結合領域は、免疫系の細胞型の細胞表面への特異的結合及び高アフィニティー結合について選択される免疫グロブリン型ポリペプチドを含むか、又は
これから本質的になる。例えば、CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD41、CD56、CD61、CD62、CD66、CD95、CD117、CD123、CD235、CD146、CD326、インターロイキン2受容体(IL−2R)、RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)、SLAM会合タンパク
質(SAP,SLAM-associated protein)、及びTNFSF18(腫瘍壊死因子リガンド
スーパーファミリー18,tumor necrosis factor ligand super family18又はGITRL)に結合する免疫グロブリン型結合性ドメインが公知である。
これから本質的になる。例えば、CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD41、CD56、CD61、CD62、CD66、CD95、CD117、CD123、CD235、CD146、CD326、インターロイキン2受容体(IL−2R)、RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)、SLAM会合タンパク
質(SAP,SLAM-associated protein)、及びTNFSF18(腫瘍壊死因子リガンド
スーパーファミリー18,tumor necrosis factor ligand super family18又はGITRL)に結合する免疫グロブリン型結合性ドメインが公知である。
ある特定の実施形態では、結合領域は、細胞外受容体のターゲティングについて選択されるリガンドを含むか、又はこれから本質的になる。一部の代表的なリガンドは、以下の骨形成タンパク質、並びにアクチビン膜結合性阻害剤であるBAMBI(TGFBRとしてもまた公知である)、CD137L(4−1BBとしてもまた公知である)、囮受容体3(DcR3,decoy receptor 3)(TR6及びTNFRSF6Bとしてもまた公知である)、及び腫瘍壊死因子TWEAK(TNFRSF12及びAPO3Lとしてもまた公知である)を含むがこれらに限定されない。
当業者は、本発明の細胞毒性ポリペプチドを創出するために、本発明の方法を使用して、新規の結合領域を選択するのに、任意の所望される標的生体分子を使用しうることを察知するであろう。
C.本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性融合ポリペプチドの、リボ毒性領域のポリペプチド構成要素と、結合領域のポリペプチド構成要素とを接続する連結
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドの、リボ毒性領域ポリペプチドと、結合領域ポリペプチドとは、互いへと適切に、直接的に連結することもでき、当技術分野で周知の1若しくは2以上のリンカー及び/又は本明細書で記載される1若しくは2以上のリンカーを介して、間接的に連結することもできる。本発明のキメラ融合ポリペプチドのリボ毒性領域ポリペプチドと、結合領域ポリペプチドとは、互いへと適切に、介在アミノ酸残基を伴わずに直接的に連結することもでき、1又は2以上のタンパク質性リンカーであって、1又は2以上のアミノ酸残基を含む、当技術分野で周知の1若しくは2以上のリンカー及び/又は本明細書で記載される1若しくは2以上のリンカーを含むリンカーを介して間接的に連結することもできる。
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドの、リボ毒性領域ポリペプチドと、結合領域ポリペプチドとは、互いへと適切に、直接的に連結することもでき、当技術分野で周知の1若しくは2以上のリンカー及び/又は本明細書で記載される1若しくは2以上のリンカーを介して、間接的に連結することもできる。本発明のキメラ融合ポリペプチドのリボ毒性領域ポリペプチドと、結合領域ポリペプチドとは、互いへと適切に、介在アミノ酸残基を伴わずに直接的に連結することもでき、1又は2以上のタンパク質性リンカーであって、1又は2以上のアミノ酸残基を含む、当技術分野で周知の1若しくは2以上のリンカー及び/又は本明細書で記載される1若しくは2以上のリンカーを含むリンカーを介して間接的に連結することもできる。
適切なリンカーは、単一のアミノ酸、ペプチド、及びポリペプチドを含む(例えば、Chen X etal., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。結合領域の個々のポリペプチド部分構成要素、例えば、重鎖可変領域(VH,heavy chain variable region)、軽鎖可変領域(VL,light chain variable region)、CDR、及び/又はABR領域は、当技術分野で周知の1若しくは2以上のリンカー及び/又は本明細書で記載される1若しくは2以上のリンカーを介して、互いへと適切に連結することができる(例えば、Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20 (2009); Chen X et al.,Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。本発明のキメラ融合ポリペプチド
のペプチド構成要素、例えば、KDELファミリーの小胞体保持/復帰シグナルモチーフ(配列番号65として開示される「KDEL」)は、当技術分野で周知のタンパク質性リンカーなど、1又は2以上のリンカーを介して、本発明の別のポリペプチド構成要素へと適切に連結することができる。
のペプチド構成要素、例えば、KDELファミリーの小胞体保持/復帰シグナルモチーフ(配列番号65として開示される「KDEL」)は、当技術分野で周知のタンパク質性リンカーなど、1又は2以上のリンカーを介して、本発明の別のポリペプチド構成要素へと適切に連結することができる。
適切なリンカーは一般に、本発明の各ポリペプチド構成要素が、リンカー又は他の構成要素を伴わずに個別に産生されるポリペプチド構成要素と酷似する三次元構造でフォール
ドすることを可能とするリンカーである。適切なリンカーは、単一のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及び分枝状であれ、環状であれ、多様な非タンパク質性炭素鎖など、前述の他の構成要素を欠くリンカーを含む(例えば、Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。
ドすることを可能とするリンカーである。適切なリンカーは、単一のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及び分枝状であれ、環状であれ、多様な非タンパク質性炭素鎖など、前述の他の構成要素を欠くリンカーを含む(例えば、Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。
適切なリンカーは、タンパク質性であることが可能であり、1又は2以上のアミノ酸、ペプチド、及び/又はポリペプチドを含む。タンパク質性リンカーは、組換え融合タンパク質及び化学的に連結されたコンジュゲートの両方に適する。タンパク質性リンカーは、例えば、約5〜約30又は約6〜約25アミノ酸残基など、約2〜約50アミノ酸残基を有することが典型的である。選択されるリンカーの長さは、例えば、所望される特性又はリンカーがそれについて選択される特性など、様々な因子に依存するであろう(例えば、Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。
適切なリンカーは、例えば、化学的リンカーなど、非タンパク質性でありうる(例えば、Dosio F etal., Toxins 3: 848-83 (2011); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)を参照されたい)。当技術分野で公知の、多様な非タンパク質性リンカーであって、免疫グロブリン由来ポリペプチドを、異種ポリペプチドへとコンジュゲートするのに一般に使用されるリンカーなどのリンカーを使用して、本発明の細胞毒性タンパク質の構成要素を連結することができる。例えば、ポリペプチド領域は、例えば、カルボキシ基、アミン基、スルフヒドリル基、カルボン酸基、カルボニル基、ヒドロキシル基、及び/又は環状基など、それらのアミノ酸残基の官能性側鎖及び炭水化物部分を使用して連結することができる。例えば、ジスルフィド結合及びチオエーテル結合を使用して、2つ又は3つ以上のポリペプチドを連結することができる(例えば、Fitzgerald D et al., Bioconjugate Chem 1: 264-8 (1990); PasqualucciL et al., Haematologica 80: 546-56 (1995)
を参照されたい)。加えて、非天然のアミノ酸残基は、ケトン基など、他の官能性側鎖と共に使用することもできる(例えば、Sun S et al., Chembiochem Jul 18 (2014); Tian F et al., Proc NatlAcad Sci USA 111: 1766-71 (2014)を参照されたい)。非タンパク質性化学的リンカーの例は、N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸、S−(N−スクシンイミジル)チオ酢酸(SATA,N-succinimidyl (4-iodoacetyl)-aminobenzoate, S-(N-succinimidyl)thioacetate)、N−スクシンイミジル−オキ
シカルボニル−cu−メチル−a−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT:N-succinimidyl-oxycarbonyl-cu-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluene)、N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)−ペンタノエート(SPP,N-succinimidyl4-(2-pyridyldithio)-pentanoate)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサ
ンカルボキシレート(SMCC,succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane carboxylate又はMCC)、スルホスクシンイミジル(4−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸、4−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル−6−(α−メチル−α−(ピリジルジチオール)−トルアミド)ヘキサノエート、N−スクシンイミジル−3−(−2−ピリジルジチオ)−プロプリオネート(SPDP,N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-proprionate)、スクシンイ
ミジル6(3(−(−2−ピリジルジチオ)−プロプリオンアミド)ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル6(3(−(−2−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド)ヘキサノエート、マレイミドカプロイル(MC,maleimidocaproyl)、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−p−アミノベンジルオキシカルボニル(MC−vc−PAB,maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl)、3−マレイミドベンゾ
エートN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS,3-maleimidobenzoic acidN-hydroxysuccinimide ester)、アルファ−アルキル誘導体、スルホNHS−ATMBA(スルホスクシンイミジルN−[3−(アセチルチオ)−3−メチルブチリル−ベータ−アラニン],sulfosuccinimidyl N-[3-(acetylthio)-3-methylbutyryl-beta-alanine])、ス
ルホジクロロフェノール、2−イミノチオラン、3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオ
ニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロイソシアヌル酸、及びS−(2−チオピリジル)−L−システインを含むがこれらに限定されない(例えば、Thorpe P et al., Eur J Biochem 147: 197-206 (1985); Thorpe P et al.,Cancer Res 47: 5924-31 (1987); Thorpe P et al., Cancer Res 48: 6396-403 (1988);Grossbard M et al., Blood 79: 576-85 (1992); Lui C et al., Proc Natl Acad SciUSA 93: 8618-23 (1996); Doronina S et
al., Nat Biotechnol 21: 778-84 (2003); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412(2013)を参照されたい)。
を参照されたい)。加えて、非天然のアミノ酸残基は、ケトン基など、他の官能性側鎖と共に使用することもできる(例えば、Sun S et al., Chembiochem Jul 18 (2014); Tian F et al., Proc NatlAcad Sci USA 111: 1766-71 (2014)を参照されたい)。非タンパク質性化学的リンカーの例は、N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸、S−(N−スクシンイミジル)チオ酢酸(SATA,N-succinimidyl (4-iodoacetyl)-aminobenzoate, S-(N-succinimidyl)thioacetate)、N−スクシンイミジル−オキ
シカルボニル−cu−メチル−a−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT:N-succinimidyl-oxycarbonyl-cu-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluene)、N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)−ペンタノエート(SPP,N-succinimidyl4-(2-pyridyldithio)-pentanoate)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサ
ンカルボキシレート(SMCC,succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane carboxylate又はMCC)、スルホスクシンイミジル(4−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸、4−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル−6−(α−メチル−α−(ピリジルジチオール)−トルアミド)ヘキサノエート、N−スクシンイミジル−3−(−2−ピリジルジチオ)−プロプリオネート(SPDP,N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-proprionate)、スクシンイ
ミジル6(3(−(−2−ピリジルジチオ)−プロプリオンアミド)ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル6(3(−(−2−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド)ヘキサノエート、マレイミドカプロイル(MC,maleimidocaproyl)、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−p−アミノベンジルオキシカルボニル(MC−vc−PAB,maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl)、3−マレイミドベンゾ
エートN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS,3-maleimidobenzoic acidN-hydroxysuccinimide ester)、アルファ−アルキル誘導体、スルホNHS−ATMBA(スルホスクシンイミジルN−[3−(アセチルチオ)−3−メチルブチリル−ベータ−アラニン],sulfosuccinimidyl N-[3-(acetylthio)-3-methylbutyryl-beta-alanine])、ス
ルホジクロロフェノール、2−イミノチオラン、3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオ
ニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロイソシアヌル酸、及びS−(2−チオピリジル)−L−システインを含むがこれらに限定されない(例えば、Thorpe P et al., Eur J Biochem 147: 197-206 (1985); Thorpe P et al.,Cancer Res 47: 5924-31 (1987); Thorpe P et al., Cancer Res 48: 6396-403 (1988);Grossbard M et al., Blood 79: 576-85 (1992); Lui C et al., Proc Natl Acad SciUSA 93: 8618-23 (1996); Doronina S et
al., Nat Biotechnol 21: 778-84 (2003); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412(2013)を参照されたい)。
タンパク質性であれ、非タンパク質性であれ、適切なリンカーは、例えば、プロテアーゼ感受性、環境における酸化還元電位感受性、pH感受性、酸切断型、光切断型、及び/又は熱感受性リンカーを含みうる(例えば、Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011);
Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Feld J et al., Oncotarget
4: 397-412 (2013)を参照されたい)。
Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Feld J et al., Oncotarget
4: 397-412 (2013)を参照されたい)。
タンパク質性リンカーは、本発明の組換え融合ポリペプチドへの組込みのために選択することができる。本発明の細胞毒性融合ポリペプチドのために、リンカーは、約2〜50アミノ酸残基、好ましくは、約5〜30アミノ酸残基を含むことが典型的である(Argos P, J Mol Biol 211: 943-58 (1990); Williamson M, Biochem J 297:240-60 (1994); George R, Heringa J, Protein Eng 15: 871-9 (2002); Kreitman R,AAPS J 8: E532-51 (2006))。一般に、タンパク質性リンカーは、例えば、トレオニン、プロリン、グルタミ
ン、グリシン、及びアラニンなど、極性残基、非帯電残基、及び/又は帯電残基を伴うアミノ酸残基の大部分を含む(例えば、Huston J et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85: 5879-83 (1988); PastanI et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Li J et al., Cell Immunol 118: 85-99(1989); Cumber A et al. Bioconj Chem 3: 397-401 (1992); Friedman P et al.,Cancer Res 53: 334-9 (1993); Whitlow M et al., Protein Engineering 6: 989-95(1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994); Newton et
al. Biochemistry 35: 545-53 (1996); Ladurner et al. J Mol Biol 273: 330-7(1997); Kreitman R et al., Leuk Lymphom52: 82-6 (2011);米国特許第4,894,443号明細書を参照されたい)。タンパク質性リンカーの非限定的な例は、アラニン−セリン−グリシン−グリシン−プロリン−グルタミン酸(ASGGPE(配列番号66),alanine-serine-glycine-glycine-proline-glutamate)、バリン−メチオニン(VM,valine-methionine)、アラニン−メチオニン(AM,alanine-methionine)、AM(G2−4S)xAM[配列中、Gは、グリシンであり、Sは、セリンであり、xは、1〜10の整数である(配列番号67)]を含む。
ン、グリシン、及びアラニンなど、極性残基、非帯電残基、及び/又は帯電残基を伴うアミノ酸残基の大部分を含む(例えば、Huston J et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85: 5879-83 (1988); PastanI et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Li J et al., Cell Immunol 118: 85-99(1989); Cumber A et al. Bioconj Chem 3: 397-401 (1992); Friedman P et al.,Cancer Res 53: 334-9 (1993); Whitlow M et al., Protein Engineering 6: 989-95(1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994); Newton et
al. Biochemistry 35: 545-53 (1996); Ladurner et al. J Mol Biol 273: 330-7(1997); Kreitman R et al., Leuk Lymphom52: 82-6 (2011);米国特許第4,894,443号明細書を参照されたい)。タンパク質性リンカーの非限定的な例は、アラニン−セリン−グリシン−グリシン−プロリン−グルタミン酸(ASGGPE(配列番号66),alanine-serine-glycine-glycine-proline-glutamate)、バリン−メチオニン(VM,valine-methionine)、アラニン−メチオニン(AM,alanine-methionine)、AM(G2−4S)xAM[配列中、Gは、グリシンであり、Sは、セリンであり、xは、1〜10の整数である(配列番号67)]を含む。
タンパク質性リンカーは、所望される特性に基づき選択することができる。タンパク質性リンカーは、融合分子のフォールディング、安定性、発現、可溶性、薬物動態特性、薬力学特性、及び/又は融合構築物の文脈では、同じドメイン自体の活性と比較した融合ドメインの活性のうちの1又は2以上などを最適化するように、特異的特徴を想定する当業者が選択することができる。例えば、タンパク質性リンカーは、可撓性、剛性、及び/又は切断型に基づき選択することができる(例えば、Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。リンカーを選択する場合、当業者は、データベース及びリンカーデザインソフトウェアツールを使用することができる。ある特定のリンカーは、発現を最適化するように選択することができる(例えば、Turner D et al., J Immunl Methods 205: 43-54 (1997)を参照されたい)。ある特定のリンカーは、同一なポリ
ペプチド又はタンパク質の間の分子間相互作用を促進して、ホモ多量体を形成するように選択することもでき、異なるポリペプチド又はタンパク質の間の分子間相互作用を促進して、ヘテロ多量体を形成するように選択することもできる。例えば、二量体及び他の高次の多量体の形成に関連する相互作用など、例えば、本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドのポリペプチド構成要素の間で所望される非共有結合的相互作用を可能
とするタンパク質性リンカーを選択することができる(例えば、米国特許第4,946,778号明細書を参照されたい)。
ペプチド又はタンパク質の間の分子間相互作用を促進して、ホモ多量体を形成するように選択することもでき、異なるポリペプチド又はタンパク質の間の分子間相互作用を促進して、ヘテロ多量体を形成するように選択することもできる。例えば、二量体及び他の高次の多量体の形成に関連する相互作用など、例えば、本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドのポリペプチド構成要素の間で所望される非共有結合的相互作用を可能
とするタンパク質性リンカーを選択することができる(例えば、米国特許第4,946,778号明細書を参照されたい)。
可撓性のタンパク質性リンカーは、12アミノ酸残基の長さを超えることが多く、例えば、グリシン、セリン、及びトレオニンなど、小型の非極性アミノ酸残基、極性アミノ酸残基、及び/又は親水性アミノ酸残基に富む(例えば、Bird R et al., Science 242: 423-6 (1988); Friedman P et al., CancerRes 53: 334-9 (1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994)を参照されたい)。可撓性のタンパク質性リンカーは、構成要素の間の空間分離を増大させるように選択することもでき、及び/又は構成要素の間の分子間相互作用を可能とするように選択することもできる。例えば、当業者には、多様な「GS」リンカーが公知であるが、これらは、複数のグリシン及び/又は1若しくは2以上のセリンから構成され、場合によって、例えば、(GxS)n(配列番号68)、(SxG)n(配列番号69)、(GGGGS)n(配列番号70)、及び(G)n(配列番号71)[配列中、xは、1〜6であり、nは、1〜30である]などの反復単位で存在する(例えば、国際特許公開第96/06641号パンフレットを参照されたい)。可撓性のタンパク質性リンカーの非限定的な例は、GKSSGSGSESKS(配列番号72)、GSTSGSGKSSEGKG(配列番号73)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(配列番号74)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号75)、EGKSSGSGSESKEF(配列番号76)、SRSSG(配列番号77)、及びSGSSC(配列番号78)を含む。
非可撓性のタンパク質性リンカーは、非可動性のアルファ−へリックス構造であることが多く、プロリン残基及び/又は1若しくは2以上の、戦略的に配置されたプロリンに富む(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。非可撓性のリンカーは、連結された構成要素の間の分子間相互作用を防止するように選択することができる。
適切なリンカーは、例えば、切断及び/又は環境特異的不安定性などにより、インビボにおける構成要素の分離を可能とするように選択することができる(Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Chen X et al., Adv DrugDeliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参
照されたい)。インビボ切断型タンパク質性リンカーは、しばしば、生物内又はある特定の細胞型の内部の特異的な部位において、タンパク質分解性プロセシング及び/又は還元性環境により連結を解除することが可能である(例えば、Doronina S et al., BioconjugChem 17: 144-24 (2006); Erickson H etal., Cancer Res 66: 4426-33 (2006)を参照されたい)。インビボ切断型タンパク質性リンカーは、プロテアーゼ感受性モチーフ及び/又は1若しくは2以上のシステイン対により形成されるジスルフィド結合を含むことが多い(例えば、Pietersz G et al., Cancer Res 48: 4469-76 (1998); The J et al., JImmunol Methods 110: 101-9 (1998)を参照されたい。Chen X et al.,Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい。)。インビボ切断型タンパク質性リンカーは、生物内のある特定の場所、細胞内のコンパートメントだけに存在するプロテアーゼに対し
て感受性であるようにデザインすることもでき、及び/又はある特定の生理学的状態下若しくは病理学的状態下だけで活性となるようにデザインすることもできる(例えば、異常に高レベルのプロテアーゼ、ある特定の疾患部位で過剰発現するプロテアーゼ、及び病原性微生物により特異的に発現するプロテアーゼなど)。例えば、当技術分野では、細胞内だけに存在するプロテアーゼ、特異的細胞型内だけに存在するプロテアーゼ、及び、例えば、R−x−x−Rモチーフ及びAMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(配列番号79)など、がん又は炎症などの病理学的状態下だけにおいて存在するプロテアーゼにより切断されるタンパク質性リンカーが公知である。
照されたい)。インビボ切断型タンパク質性リンカーは、しばしば、生物内又はある特定の細胞型の内部の特異的な部位において、タンパク質分解性プロセシング及び/又は還元性環境により連結を解除することが可能である(例えば、Doronina S et al., BioconjugChem 17: 144-24 (2006); Erickson H etal., Cancer Res 66: 4426-33 (2006)を参照されたい)。インビボ切断型タンパク質性リンカーは、プロテアーゼ感受性モチーフ及び/又は1若しくは2以上のシステイン対により形成されるジスルフィド結合を含むことが多い(例えば、Pietersz G et al., Cancer Res 48: 4469-76 (1998); The J et al., JImmunol Methods 110: 101-9 (1998)を参照されたい。Chen X et al.,Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい。)。インビボ切断型タンパク質性リンカーは、生物内のある特定の場所、細胞内のコンパートメントだけに存在するプロテアーゼに対し
て感受性であるようにデザインすることもでき、及び/又はある特定の生理学的状態下若しくは病理学的状態下だけで活性となるようにデザインすることもできる(例えば、異常に高レベルのプロテアーゼ、ある特定の疾患部位で過剰発現するプロテアーゼ、及び病原性微生物により特異的に発現するプロテアーゼなど)。例えば、当技術分野では、細胞内だけに存在するプロテアーゼ、特異的細胞型内だけに存在するプロテアーゼ、及び、例えば、R−x−x−Rモチーフ及びAMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(配列番号79)など、がん又は炎症などの病理学的状態下だけにおいて存在するプロテアーゼにより切断されるタンパク質性リンカーが公知である。
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドのある特定の実施形態では、標的細胞内に存在するプロテアーゼによる切断をもたらすように、1又は2以上のプロテアーゼ感受性部位を含むリンカーを使用することができる。本発明の細胞毒性タンパク質及
び細胞毒性ポリペプチドのある特定の実施形態では、脊椎生物への投与の後における、望ましくない毒性を低減するように、切断型でないリンカーを使用することができる。
び細胞毒性ポリペプチドのある特定の実施形態では、脊椎生物への投与の後における、望ましくない毒性を低減するように、切断型でないリンカーを使用することができる。
タンパク質性であれ、非タンパク質性であれ、適切なリンカーは、例えば、プロテアーゼ感受性、環境における酸化還元電位感受性、pH感受性、酸切断型、光切断型、及び/又は熱感受性リンカーを含みうる(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。
適切な切断型リンカーは、例えば、Zarling D et al., J Immunol 124:913-20 (1980); Jung S, Moroi M, Biochem Biophys Acta 761: 152-62 (1983);Bouizar Z et al., Eur J Biochem 155: 141-7 (1986); Park L et al., J Biol Chem261: 205-10 (1986); Browning J, Ribolini A, J Immunol 143: 1859-67 (1989);Joshi S, Burrows R, J Biol Chem 265: 14518-25 (1990)など、当技術分野で公知の切断性基を含むリンカーを含みう
る。
る。
適切なリンカーは、pH感受性リンカーを含みうる。例えば、ある特定の適切なリンカーは、標的細胞の細胞内コンパートメント内部の解離をもたらすように、低pH環境内のそれらの不安定性について選択することができる。例えば、1若しくは2以上のトリチル基、誘導体化トリチル基、ビスマレイミドエトキシプロパン基、アジピン酸ジヒドラジド基、及び/又は酸不安定性トランスフェリン基を含むリンカーは、本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドの構成要素、例えば、ポリペプチド構成要素の、特異的pH範囲を伴う環境への放出をもたらしうる(例えば、Welhoener H et al., J Biol Chem 266: 4309-14 (1991); Fattom A etal., Infect Immun 60: 584-9 (1992)を参照され
たい)。例えば、腫瘍組織のpHは、健常組織より低値であることなど、組織間の生理学的pH差に対応するpH範囲内で切断される、ある特定のリンカーを選択することができる(例えば、米国特許第5,612,474号明細書を参照されたい)。
たい)。例えば、腫瘍組織のpHは、健常組織より低値であることなど、組織間の生理学的pH差に対応するpH範囲内で切断される、ある特定のリンカーを選択することができる(例えば、米国特許第5,612,474号明細書を参照されたい)。
光切断型リンカーとは、可視光範囲内の光など、ある特定の波長範囲の電磁放射へと曝露すると切断されるリンカーである(例えば、Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992)を参照されたい)。光切断型リンカーを使用して、ある特定の波長の光への
曝露時において、本発明の構成要素の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチド、例えば、ポリペプチド構成要素を放出することができる。光切断型リンカーの非限定的な例は、システインのための光切断保護基としてのニトロベンジル基、ニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋剤、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマー、及びメチルローダミンコポリマーを含む(Hazum E et al., Pept Proc Eur Pept Symp, 16th, Brunfeldt K, ed.,105-110 (1981); Senter et al., Photochem Photobiol 42: 231-7 (1985); Yen etal., Makromol Chem 190:
69-82 (1989); Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992))。光切断型リンカーは、光ファイバーを使用して光へと曝露されうる、疾患、障害、及び状態を治療するためにデザインされた、本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドを形成するように構成要素を連結するときに、特に使用することができる。
曝露時において、本発明の構成要素の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチド、例えば、ポリペプチド構成要素を放出することができる。光切断型リンカーの非限定的な例は、システインのための光切断保護基としてのニトロベンジル基、ニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋剤、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマー、及びメチルローダミンコポリマーを含む(Hazum E et al., Pept Proc Eur Pept Symp, 16th, Brunfeldt K, ed.,105-110 (1981); Senter et al., Photochem Photobiol 42: 231-7 (1985); Yen etal., Makromol Chem 190:
69-82 (1989); Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992))。光切断型リンカーは、光ファイバーを使用して光へと曝露されうる、疾患、障害、及び状態を治療するためにデザインされた、本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドを形成するように構成要素を連結するときに、特に使用することができる。
本発明の細胞毒性タンパク質のある特定の実施形態では、細胞ターゲティング結合領域を、当業者に公知の任意の数の手段であって、共有結合的連結及び非共有結合的連結の両方を含む手段を使用して、リボ毒性ポリペプチドへと連結する(例えば、Chen X et al.,
Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Behrens C, Liu B, MAbs 6: 46-53 (2014)を参照されたい)。
Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Behrens C, Liu B, MAbs 6: 46-53 (2014)を参照されたい)。
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドのある特定の実施形態では、タンパク質は、重鎖可変(VH)ドメインと軽鎖可変(VL)ドメインとを接続するリンカーを伴うscFvである結合領域を含む。当技術分野では、例えば、15残基の(Gly4Ser)3ペプチド(配列番号80)など、この目的に適する多数のリンカーが公知である。非共有結合的多価構造を形成するときに使用しうる適切なscFvリンカーは、GGS、GGGS(配列番号81)、GGGGS(配列番号82)、GGGGSGGG(配列番号83)、GGSGGGG(配列番号84)、GSTSGGGSGGGSGGGGSS(配列番号85)、及びGSTSGSGKPGSSEGSTKG(配列番号86)を含む(Plueckthun A, Pack P, Immunotechnology 3: 83-105 (1997); Atwell J etal., Protein Eng 12: 597-604 (1999); Wu A et al., Protein Eng 14: 1025-33(2001); Yazaki P et al., J Immunol Methods 253: 195-208 (2001); Carmichael J etal., J Mol Biol 326: 341-51 (2003); Arndt M et al., FEBS Lett 578: 257-61(2004); Bie C et al., World J Hepatol 2: 185-91 (2010))。
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性融合ポリペプチドの構成要素を連結するのに適する方法は、これを達成するために当技術分野で現在公知の任意の方法を介しうる。本発明の目的では、リボ毒性領域及び結合領域の具体的な順序又は配向性を、互いとの関係でも、細胞毒性融合ポリペプチド全体との関係でも、固定しない。ある特定の実施形態では、結合領域とリボ毒性領域とは、互いへと直接的に融合させることもでき、及び/又は1若しくは2以上の介在ポリペプチド配列であって、当技術分野で周知の1若しくは2以上のリンカーを伴う介在ポリペプチド配列などの介在ポリペプチド配列を介して、互いへと適切に連結することもできる。
II.融合ポリペプチドをスクリーニングするための発現ライブラリー
本発明に関する「発現ライブラリー」という語句は、2つ又は3つ以上の異なるクローンを表す、核酸のコレクション又はプールを指す(ここで、各クローンは、それがコードするポリペプチドのアミノ酸配列が異なり、各核酸は、修飾されているのであれ、非修飾であれ、結合領域とリボ毒性領域とを含むポリペプチドをコードすることが可能である)。一般に、発現ライブラリーは、発現ベクター、配列がポリペプチドの発現をもたらすために機能するように構築されたポリヌクレオチド配列から構成される。こうして、発現ライブラリーは、2つ又は3つ以上の異なるポリペプチドであって、各ポリペプチドが、互いへと共有結合的に連結された、結合領域のターゲティング部分と、リボ毒性領域とを含むポリペプチドをコードすることが可能である。発現ライブラリーとは、スクリーニング時において、所望される特徴を伴うリボ毒性ポリペプチドを選択、濃縮、及び/又は同定するために発現させるポリヌクレオチドのコレクションである。当業者は、ライブラリー内のあらゆるクローンが、作動可能な融合ポリペプチドを産生するわけではないが、デザインの行き届いたライブラリー内では、大半のクローンが、結合領域とリボ毒性領域とを含む固有の融合ポリペプチドをコードすることが可能なことを理解する。
本発明に関する「発現ライブラリー」という語句は、2つ又は3つ以上の異なるクローンを表す、核酸のコレクション又はプールを指す(ここで、各クローンは、それがコードするポリペプチドのアミノ酸配列が異なり、各核酸は、修飾されているのであれ、非修飾であれ、結合領域とリボ毒性領域とを含むポリペプチドをコードすることが可能である)。一般に、発現ライブラリーは、発現ベクター、配列がポリペプチドの発現をもたらすために機能するように構築されたポリヌクレオチド配列から構成される。こうして、発現ライブラリーは、2つ又は3つ以上の異なるポリペプチドであって、各ポリペプチドが、互いへと共有結合的に連結された、結合領域のターゲティング部分と、リボ毒性領域とを含むポリペプチドをコードすることが可能である。発現ライブラリーとは、スクリーニング時において、所望される特徴を伴うリボ毒性ポリペプチドを選択、濃縮、及び/又は同定するために発現させるポリヌクレオチドのコレクションである。当業者は、ライブラリー内のあらゆるクローンが、作動可能な融合ポリペプチドを産生するわけではないが、デザインの行き届いたライブラリー内では、大半のクローンが、結合領域とリボ毒性領域とを含む固有の融合ポリペプチドをコードすることが可能なことを理解する。
発現ライブラリーは、融合ポリペプチドを発現させ、1又は2以上の特徴について選択することによりスクリーニングすることができる。例えば、本発明のある特定の発現ライブラリーは、タンパク質ディスプレイ法の以下の非限定的な例:バクテリオファージディスプレイ、微生物ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、及びタンパク質−DNA連結ディスプレイを使用して、特異的な特徴の選択のために作動可能である。タンパク質ディスプレイ法に関する「ディスプレイ」という用語は、産生される発現ライブラリーのポリペプチドが、例えば、溶液中の他の分子に結合するか、若しくは溶液中の他の分子が結合するなど、物理的に接触可能であるか、プラスチック製のウェル、プラスチックプレート、クロマトグラフィーマトリックスなど、不動のプラットフォームへと固定化されているか、又は細胞、ウイルス、バクテリオファージ、若しくはマイクロビーズなどの他の比較的大型の分子部分へと取り付けられていることを意味する。タンパク質ディスプレイ法のために構築される、本発明の発現ライブラリーは、それらのそれぞれのタンパク質ディスプレイ法に要請されることが当業者に公知の全てのエレメントを有するであ
ろう。一般に、タンパク質ディスプレイ発現ライブラリーは、それをコードする核酸(すなわち、その遺伝子型)への物理的接続を維持しながら、ライブラリーの融合ポリペプチドを提示するように構築する。
ろう。一般に、タンパク質ディスプレイ発現ライブラリーは、それをコードする核酸(すなわち、その遺伝子型)への物理的接続を維持しながら、ライブラリーの融合ポリペプチドを提示するように構築する。
本発明の多様な発現ライブラリーは、ライブラリーメンバーの複雑性及び数の両方のために変化しうるが、一般に、大きな多様性が好ましい。本発明の発現ライブラリーに関して、その多様性は、例えば、それらの結合領域及び/又は毒素領域の複雑性など、ライブラリーの核酸のコード配列の複雑性の関数である。これらの核酸の複雑性は、例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(PCR,polymerase chain reaction)、部位指向
変異誘発、並びに/又は配列ランダム化合成核酸及び/若しくは核酸断片組換え法/シャフリング法を使用する、核酸のコンビナトリアルアセンブリーなど、変異誘発により達成することができる。
変異誘発、並びに/又は配列ランダム化合成核酸及び/若しくは核酸断片組換え法/シャフリング法を使用する、核酸のコンビナトリアルアセンブリーなど、変異誘発により達成することができる。
本発明のライブラリーをデザインするためのポリヌクレオチドの供給源は、ナイーブなものであれ、バイアスのかかったものであれ、脊椎動物の免疫グロブリンコード配列に由来する場合もあり、完全な合成供給源に由来する場合もある。加えて、本発明のライブラリーをデザインするための供給源ポリヌクレオチドは、半合成の場合もある。アンチボディオームについての知見であれば、半合成ライブラリーを作製するために使用しうるであろう(例えば、Dimitrov D, MAbs 2: 347-56 (2010)を参照されたい)。供給源ポリヌク
レオチド内に存在する多様性に関わらず、当技術分野で公知の技法及び/又は本明細書で記載される技法を使用して、多様性を増大させることができる。
レオチド内に存在する多様性に関わらず、当技術分野で公知の技法及び/又は本明細書で記載される技法を使用して、多様性を増大させることができる。
III.スクリーニング時における、リボ毒性領域ポリペプチドのリボ毒性の低減又は消失
本発明のスクリーニング法の目標は、キメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドを同定することであるが、本発明のスクリーニング法は全て、リボ毒性を低減されているか又はリボ毒性がみられない状況で実施する。リボ毒性の消失又は低減は、1)リボ毒性領域のアミノ酸配列を変化させること、及び/又は2)リボ毒性領域の分子阻害剤の存在下でスクリーニングすることにより達成することができる。第1の方式は、リボ毒素に由来するリボ毒性領域をスクリーニングするのに好ましい場合があるが、この場合、鍵となる触媒残基については既に記載されているが、特異的分子阻害剤についてはいまだ記載されていない。逆に、第2の方式は、リボ毒素に由来するリボ毒性領域をスクリーニングするのに好ましい場合があるが、この場合、有効な分子阻害剤については既に記載されているが、鍵となる触媒残基及び/又は不活性化変異はいまだ同定されていない。第3に、いずれの方式も、リボ毒性のなおより大幅な低減を達成しようとする試みにおいて組み合わせることができる。
本発明のスクリーニング法の目標は、キメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドを同定することであるが、本発明のスクリーニング法は全て、リボ毒性を低減されているか又はリボ毒性がみられない状況で実施する。リボ毒性の消失又は低減は、1)リボ毒性領域のアミノ酸配列を変化させること、及び/又は2)リボ毒性領域の分子阻害剤の存在下でスクリーニングすることにより達成することができる。第1の方式は、リボ毒素に由来するリボ毒性領域をスクリーニングするのに好ましい場合があるが、この場合、鍵となる触媒残基については既に記載されているが、特異的分子阻害剤についてはいまだ記載されていない。逆に、第2の方式は、リボ毒素に由来するリボ毒性領域をスクリーニングするのに好ましい場合があるが、この場合、有効な分子阻害剤については既に記載されているが、鍵となる触媒残基及び/又は不活性化変異はいまだ同定されていない。第3に、いずれの方式も、リボ毒性のなおより大幅な低減を達成しようとする試みにおいて組み合わせることができる。
A.修飾リボ毒性領域
本明細書で言及される通り、「修飾リボ毒性領域」は、1カ所又は2カ所以上の変異、すなわち、適切な非修飾リボ毒性領域と比較してそのリボ毒性を低減するか又は消失させる、アミノ酸置換、欠失、挿入、付加、又はこれらの任意の組合せを含む。修飾リボ毒性領域は、単独でも、分子又は融合ポリペプチドの構成要素としても、もはや細胞毒性ではない場合があるが、少なくとも1つのコグネイトの非修飾リボ毒性領域であって、より大きなリボ毒性を呈示する非修飾リボ毒性領域は存在するものとする。その増大又は減少を含むリボ毒性は、当業者に公知の多数の方法及び/又は本明細書で記載される多数の方法によりアッセイすることができる。
本明細書で言及される通り、「修飾リボ毒性領域」は、1カ所又は2カ所以上の変異、すなわち、適切な非修飾リボ毒性領域と比較してそのリボ毒性を低減するか又は消失させる、アミノ酸置換、欠失、挿入、付加、又はこれらの任意の組合せを含む。修飾リボ毒性領域は、単独でも、分子又は融合ポリペプチドの構成要素としても、もはや細胞毒性ではない場合があるが、少なくとも1つのコグネイトの非修飾リボ毒性領域であって、より大きなリボ毒性を呈示する非修飾リボ毒性領域は存在するものとする。その増大又は減少を含むリボ毒性は、当業者に公知の多数の方法及び/又は本明細書で記載される多数の方法によりアッセイすることができる。
一般に、リボ毒性ポリペプチドは、本明細書で使用される、自然発生の毒素及び/又は酵素(例えば、RNアーゼ)に由来する。本明細書で使用されるように、毒素の名称は、類縁の構造及びポリペプチド配列を伴う複数のタンパク質であって、例えば、異なる種に由来するタンパク質、又は異なる毒素アイソフォーム、並びに遺伝子変化、遺伝子多型、
及び/若しくは遺伝子変異と関連する毒素バリアントの存在のために、同じ種に由来するタンパク質などを指す場合があろう。当業者は、当技術分野で公知の技法を使用して、それが同じ名称で言及される配列と異なる場合でもなお、どのタンパク質構造及びポリペプチド配列が所与の毒素名称により言及されているのかを同定することが可能であろう。例えば、「リシン」という用語は、原型的なリシン(UniProt P02879 RICI_RICCO)を指す
が、例えば、多型、ホモログ、パラログ、及びオルソログなど、多数の異なるリシンも存在する。トウゴマ(Ricinuscommunis)には、少なくとも7つの野生型リシンが存在する(Leshin J et al., Toxicon55: 658-61 (2010))他、分子操作によるミュータント及びバリアントも存在する(例えば、MunishkinA, Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995); Lui X et al., MAbs 4: 57-68 (2012)を参照されたい)。
及び/若しくは遺伝子変異と関連する毒素バリアントの存在のために、同じ種に由来するタンパク質などを指す場合があろう。当業者は、当技術分野で公知の技法を使用して、それが同じ名称で言及される配列と異なる場合でもなお、どのタンパク質構造及びポリペプチド配列が所与の毒素名称により言及されているのかを同定することが可能であろう。例えば、「リシン」という用語は、原型的なリシン(UniProt P02879 RICI_RICCO)を指す
が、例えば、多型、ホモログ、パラログ、及びオルソログなど、多数の異なるリシンも存在する。トウゴマ(Ricinuscommunis)には、少なくとも7つの野生型リシンが存在する(Leshin J et al., Toxicon55: 658-61 (2010))他、分子操作によるミュータント及びバリアントも存在する(例えば、MunishkinA, Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995); Lui X et al., MAbs 4: 57-68 (2012)を参照されたい)。
本発明のある特定の実施形態では、インビトロにおける、触媒作用によるリボソームの不活性化をもはや支援しないように、修飾リボ毒性領域を変化させている。しかしまた、リボ毒性を低減するか又は消失させるようにリボ毒性領域を修飾する他の手段も、本発明の範囲内であることが想定される。例えば、ある特定の変異は、インビトロアッセイにより観察される触媒能を維持しながら、リボ毒性領域が、そのリボソーム基質に結合することを不可能にしうるのに対し、他の変異は、インビトロにおいて、ネイキッド核酸に対する触媒能を維持しながら、リボ毒性領域が、リボソーム内の特異的なリボ核酸配列をターゲティングすることを不可能にしうる(例えば、Alford S et al., BMC Biochem 10: 9(2009); Alvarez-Garcia E et al., Biochim Biophys Act 1814: 1377-82 (2011); WongY
et al., PLoS One 7: e49608 (2012)を参照されたい)。
et al., PLoS One 7: e49608 (2012)を参照されたい)。
DTには、例えば、ヒスチジン21、チロシン27、グリシン52、トリプトファン50、チロシン54、チロシン65、グルタミン酸148、及びトリプトファン153など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Tweten R et al.,
J Biol Chem 260: 10392-4 (1985); Wilson B et al., J Biol Chem 269: 23296-301(1994); Bell C, Eisenberg D, Biochemistry 36: 481-8 (1997); Cummings M et al.,Proteins 31: 282-98 (1998); Keyvani K et al., Life Sci 64: 1719-24 (1999);Dolan K et al., Biochemistry 39: 8266-75 (2000); Zdanovskaia M et al., ResMicrbiol 151:
557-62 (2000); Kahn K, Bruice T, J Am Chem Soc 123: 11960-9 (2001); Malito E et
al., Proc Natl Acad Sci USA 109: 5229-34 (2012))。コリックス毒素内のグルタミン酸581は、DT内のグルタミン酸148と共に保存されており(Jorgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008))、このため、コリックス毒素内のグルタミン酸581の変異は、コリックス毒素の酵素活性を低減することが予測される。
J Biol Chem 260: 10392-4 (1985); Wilson B et al., J Biol Chem 269: 23296-301(1994); Bell C, Eisenberg D, Biochemistry 36: 481-8 (1997); Cummings M et al.,Proteins 31: 282-98 (1998); Keyvani K et al., Life Sci 64: 1719-24 (1999);Dolan K et al., Biochemistry 39: 8266-75 (2000); Zdanovskaia M et al., ResMicrbiol 151:
557-62 (2000); Kahn K, Bruice T, J Am Chem Soc 123: 11960-9 (2001); Malito E et
al., Proc Natl Acad Sci USA 109: 5229-34 (2012))。コリックス毒素内のグルタミン酸581は、DT内のグルタミン酸148と共に保存されており(Jorgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008))、このため、コリックス毒素内のグルタミン酸581の変異は、コリックス毒素の酵素活性を低減することが予測される。
PEには、例えば、トリプトファン417、ヒスチジン426、ヒスチジン440、グリシン441、アルギニン485、トリプトファン458、トリプトファン466、チロシン470、チロシン481、グルタミン酸546、アルギニン551、グルタミン酸553、及びトリプトファン558など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Douglas C, Collier R, J Bacteriol 169: 4967-71 (1987); Wilson B,Colliver R, Curr Top Microbiol Immunol 175: 27-41 (1992); Beattie B et al.,Biochemistry 35: 15134-42 (1996); Roberts T, Merrill A, Biochem J 367: 601-8(2002); Yates S et al., Biochem J 385: 667-75 (2005); Jorgensen R et al., EMBORep 9: 802-9 (2008))。コリックス毒素内のグルタミン酸574及びグルタミン酸581は、PE内の、それぞれ、グルタミン酸546及びグルタミン酸553と共に保存されており(Jorgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008))、このため、コリックス毒素内のグルタミン酸574及び/又はグルタミン酸581の変異は、コリックス毒素の酵素活性を低減することが予測される。
コリックス毒素、DT、PE、及び他の類縁の酵素の触媒ドメインは、重ね合わされる
(Jorgensen R, et al., J Biol Chem 283: 10671-8 (2008))ため、当業者に公知の配列アライメント法により、触媒活性に要請されるアミノ酸残基を、類縁のポリペプチド配列内で予測することができる。
(Jorgensen R, et al., J Biol Chem 283: 10671-8 (2008))ため、当業者に公知の配列アライメント法により、触媒活性に要請されるアミノ酸残基を、類縁のポリペプチド配列内で予測することができる。
触媒残基に関しては、複数のRIPファミリーのメンバーがよく研究されている。例えば、大半のRIPファミリーメンバーは、触媒の鍵となる5つのアミノ酸残基であって、例えば、触媒ドメインのアミノ末端近傍における2つのチロシン残基、触媒ドメインの中央部近傍におけるグルタミン酸及びアルギニン、及び触媒ドメインのカルボキシ末端近傍におけるトリプトファンなどのアミノ酸残基を共有する(Lebeda F, Olson M, Int J Biol Macromol 24: 19-26 (1999); Mlsna D etal., Protein Sci 2: 429-35 (1993); de Virgilio M et al., Toxins 2: 2699-737(2011); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013)
)。RIPファミリーのメンバーの触媒ドメインは、重ね合わされるため、当業者に公知の配列アライメント法により、触媒活性に要請されるアミノ酸残基を、未研究のRIPファミリーのメンバー内及び/又は新たなRIPファミリーのメンバー内で予測することができる(例えば、Husain J et al., FEBS Lett 342: 154-8 (1994); Ren J et al.,Structure 2: 7-16 (1994); Lebeda F, Olson M, Int J Biol Macromol 24: 19-26(1999); Ma Q et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: 185-6 (2000);Savino C et al., FEBS Lett 470: 239-43 (2000); Robertus J, Monzingo A, Mini RevMed Chem 4: 477-86 (2004); Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005);Zhou C et al., Bioinformatics 21: 3089-96 (2005); Lubelli C et al., AnalBiochem 355: 102-9 (2006); Touloupakis E et al., FEBS J 273: 2684-92 (2006);Hou X et al., BMC Struct Biol 7: 29 (2007); Meyer A et al., Biochem Biophys ResCommun 364: 195-200 (2007); Ruggiero A et al., Protein Pept Lett 14: 97-100(2007); Wang T et al., Amino Acids 34: 239-43 (2008)を参照されたい)。
)。RIPファミリーのメンバーの触媒ドメインは、重ね合わされるため、当業者に公知の配列アライメント法により、触媒活性に要請されるアミノ酸残基を、未研究のRIPファミリーのメンバー内及び/又は新たなRIPファミリーのメンバー内で予測することができる(例えば、Husain J et al., FEBS Lett 342: 154-8 (1994); Ren J et al.,Structure 2: 7-16 (1994); Lebeda F, Olson M, Int J Biol Macromol 24: 19-26(1999); Ma Q et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: 185-6 (2000);Savino C et al., FEBS Lett 470: 239-43 (2000); Robertus J, Monzingo A, Mini RevMed Chem 4: 477-86 (2004); Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005);Zhou C et al., Bioinformatics 21: 3089-96 (2005); Lubelli C et al., AnalBiochem 355: 102-9 (2006); Touloupakis E et al., FEBS J 273: 2684-92 (2006);Hou X et al., BMC Struct Biol 7: 29 (2007); Meyer A et al., Biochem Biophys ResCommun 364: 195-200 (2007); Ruggiero A et al., Protein Pept Lett 14: 97-100(2007); Wang T et al., Amino Acids 34: 239-43 (2008)を参照されたい)。
アブリンのAサブユニットには、例えば、チロシン74、チロシン113、グルタミン酸164、アルギニン167、及びトリプトファン198など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Hung C et al., Eur J Biochem 219: 83-7 (1994); Chen J et al.,Protein Eng 10: 827-33 (1997); Xie L et al., Eur J Biochem
268: 5723-33 (2001))。
268: 5723-33 (2001))。
カリブジンには、例えば、バリン79、チロシン117、グルタミン酸167、及びアルギニン170など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Touloupakis E et al., FEBS J 273: 2684-92 (2006))。
シナモミンのAサブユニットには、例えば、チロシン75、チロシン115、グルタミン酸167、アルギニン170、及びトリプトファン201など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Hung C et al., Eur J Biochem 219: 83-7
(1994); Chen J et al., Protein Eng 10: 827-33 (1997))。
(1994); Chen J et al., Protein Eng 10: 827-33 (1997))。
ルファクリンには、例えば、チロシン70、グルタミン酸85、チロシン110、グルタミン酸159、及びアルギニン162など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Hou X et al., BMC Struct Biol 7: 29 (2007))。
ルフィンには、例えば、チロシン71、グルタミン酸86、チロシン111、グルタミン酸160、及びアルギニン163など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Ma Q et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: 185-6 (2000))。
コムギRIPには、例えば、チロシン79、チロシン115、グルタミン酸167、ア
ルギニン170、及びトリプトファン201など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(RobertusJ, Monzingo A, Mini Rev Med Chem 4: 477-86 (2004); Yang Y et al., J Mol Biol395: 897-907 (2009))。
ルギニン170、及びトリプトファン201など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(RobertusJ, Monzingo A, Mini Rev Med Chem 4: 477-86 (2004); Yang Y et al., J Mol Biol395: 897-907 (2009))。
PD−Lには、例えば、PDL−1内のチロシン72、チロシン122、グルタミン酸175、アルギニン178、及びトリプトファン207など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Ruggiero A et al., Biopolymer 91: 1135-42 (2009))。
ヤドリギRIPのAサブユニットには、例えば、チロシン66、フェニルアラニン75、チロシン110、グルタミン酸159、アルギニン162、グルタミン酸166、アルギニン169、及びトリプトファン193など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Langer M et al., Biochem Biophys Res Commun 264: 944-8
(1999); Mishra V et al., Act Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2295-2304(2004); Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005); Wacker R et al., JPept Sci 11: 289-302 (2005))。
(1999); Mishra V et al., Act Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2295-2304(2004); Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005); Wacker R et al., JPept Sci 11: 289-302 (2005))。
ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質(PAP)には、例えば、リシン48、チロシン49、アルギニン67、アルギニン68、アスパラギン69、アスパラギン70、チロシン72、フェニルアラニン90、アスパラギン91、アスパラギン酸92、アルギニン122、チロシン123、グルタミン酸176、アルギニン179、トリプトファン208、及びリシン210など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Rajamohan F et al., J Biol Chem 275: 3382-90 (2000); Rajamohan F etal., Biochemistry 40: 9104-14 (2001))。
リシンのA鎖には、例えば、アルギニン48、チロシン80、アスパラギン122、チロシン123、グルタミン酸177、アルギニン180、セリン203、アスパラギン209、トリプトファン211、グリシン212、アルギニン213、セリン215、及びイソロイシン252など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Frankel A et al., Mol Cell Biol 9: 415-20 (1989); Schlossman D etal., Mol
Cell Biol 9: 5012-21 (1989); Gould J et al., Mol Gen Genet 230: 91-90 (1991);Ready M et al., Proteins 10: 270-8 (1991); Rutenber E et al., Proteins 10:240-50
(1991); Monzingo A, Robertus, J, J Mol Biol 227: 1136-45 (1992); Day P et al.,Biochemistry 35: 11098-103 (1996); Marsden C et al., Eur J Biochem 27: 153-62(2004); Pang Y et al., PLoS One 6: e17883 (2011))。リシンには、例えば、N24、F25、A28、V29、Y81、V82、V83、G84、E146、E147、A148、I149、S168、F169、I170、I171、C172、I173、Q174、M175、I176、S177、E178、A179、A180、R181、F182、Q183、Y184、D202、P203、I206、T207、N210、S211、W212、及びG213など、欠失させるとリシンの触媒活性を損なうことが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Munishkin A, Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995); Berrondo M,Gray J, Proteins 79: 2844-60 (2011))。
Cell Biol 9: 5012-21 (1989); Gould J et al., Mol Gen Genet 230: 91-90 (1991);Ready M et al., Proteins 10: 270-8 (1991); Rutenber E et al., Proteins 10:240-50
(1991); Monzingo A, Robertus, J, J Mol Biol 227: 1136-45 (1992); Day P et al.,Biochemistry 35: 11098-103 (1996); Marsden C et al., Eur J Biochem 27: 153-62(2004); Pang Y et al., PLoS One 6: e17883 (2011))。リシンには、例えば、N24、F25、A28、V29、Y81、V82、V83、G84、E146、E147、A148、I149、S168、F169、I170、I171、C172、I173、Q174、M175、I176、S177、E178、A179、A180、R181、F182、Q183、Y184、D202、P203、I206、T207、N210、S211、W212、及びG213など、欠失させるとリシンの触媒活性を損なうことが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Munishkin A, Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995); Berrondo M,Gray J, Proteins 79: 2844-60 (2011))。
サポリンには、例えば、チロシン16、チロシン72、チロシン120、グルタミン酸176、アルギニン179、及びトリプトファン208など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Zarovni N et al.,Canc Gene Ther 14: 165-73 (2007); Lombardi A et al., FASEB J 24: 253-65 (2010))。加えて、触媒活性を低減するように、シグナルペプチドを
組み入れることもできる(Marshall R et al., Plant J 65: 218-29(2011))。
組み入れることもできる(Marshall R et al., Plant J 65: 218-29(2011))。
志賀毒素のAサブユニットには、例えば、チロシン77、グルタミン酸167、アルギニン170、チロシン114、及びトリプトファン203など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基であって、Stx、Stx1、及びStx2の触媒活性に重要であることが示されているアミノ酸残基が存在する(Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988);Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al.,Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76(1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C,Infect Immun 66: 5252-9 (1998))。無細胞リボソーム不活性化アッセイでは、グルタミン酸167及びアルギニン170の両方を変異させたところ、Slt−I A1の酵素活性が消失した(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。小胞体内のSlt−I A1のデノボでの発現を使用する別の手法では、グルタミン酸167及びアルギニン170の両方を変異させたところ、その発現レベルにおけるSlt−I A1断片の細胞毒性が消失した(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。
志賀毒素Aサブユニット内の酵素活性及び/又は細胞毒性に最も肝要な残基は、以下の残基位置:とりわけ、アスパラギン75、チロシン77、グルタミン酸167、アルギニン170、及びアルギニン176へとマッピングされた(Di, Toxicon 57: 535-39 (2011))。チロシン77をセリン残基へと特異的に変化させ、グルタミン酸167をアスパラ
ギン酸残基へと特異的に変化させる変異は、触媒活性の喪失を結果としてもたらすことが公知である。リシン残基へと変異させたグルタミン酸167及びリシン残基へと変異させたアルギニン176を含有するStx2Aの二重ミュータント構築物は完全に不活性化した。この位置における他の変異も、触媒作用によりリボソームを不活性化する能力を欠く毒素を産生すると期待されるであろう。これらのアミノ酸を包摂する欠失、挿入、及び/若しくは逆位又はこれらのアミノ酸の3D配向性を破壊する付加もまた、このファミリー内の毒素の毒性を変化させると期待されるであろう。
ギン酸残基へと特異的に変化させる変異は、触媒活性の喪失を結果としてもたらすことが公知である。リシン残基へと変異させたグルタミン酸167及びリシン残基へと変異させたアルギニン176を含有するStx2Aの二重ミュータント構築物は完全に不活性化した。この位置における他の変異も、触媒作用によりリボソームを不活性化する能力を欠く毒素を産生すると期待されるであろう。これらのアミノ酸を包摂する欠失、挿入、及び/若しくは逆位又はこれらのアミノ酸の3D配向性を破壊する付加もまた、このファミリー内の毒素の毒性を変化させると期待されるであろう。
志賀様毒素1のAサブユニットの切断型は、触媒作用により活性であり、インビトロにおいて、酵素作用によりリボソームを不活性化することが可能であり、細胞内で発現させると細胞毒性である(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。完全な酵素活性を呈示する、最も小型の志賀毒素Aサブユニット断片は、Slt1Aの残基1〜239から構成されるポリペプチドである(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。実質的な触媒活性を保持することが報告されている、志賀毒素Aサブユニットの最も小型の断片は、StxAの残基75〜247であった(Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994))が、細胞質ゾルに到達し、触媒作用によるリボソームの不活性化を及ぼすのに、真核細胞内においてデノボで発現させたStxA切断型が要請するのは、残基240までに限られる(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。
トリコサンチンには、例えば、チロシン70、チロシン111、グルタミン酸160、アルギニン163、リシン173、アルギニン174、リシン177、及びトリプトファン192など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Wong
et al., Eur J Biochem 221: 787-91 (1994); Li et al., Protein Eng 12: 999-1004(1999); Yan et al., Toxicon 37: 961-72 (1999); Ding et al., Protein Eng 16:351-6
(2003); Guo Q et al., Protein Eng 16: 391-6 (2003); Chan D et al., NucleicAcids Res 35: 1660-72 (2007))。
et al., Eur J Biochem 221: 787-91 (1994); Li et al., Protein Eng 12: 999-1004(1999); Yan et al., Toxicon 37: 961-72 (1999); Ding et al., Protein Eng 16:351-6
(2003); Guo Q et al., Protein Eng 16: 391-6 (2003); Chan D et al., NucleicAcids Res 35: 1660-72 (2007))。
真菌性リボ毒素は、RIPファミリーのメンバーと同じ、ユニバーサルに保存されたSRLリボソーム構造を酵素的にターゲティングし、大半の真菌性リボ毒素は、RNアーゼT1型触媒ドメイン配列及び二次構造を共有する(Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007))。大半の真菌性リボ毒素及び類縁の酵素は、触媒作用のための、3つの高度に保存されたアミノ酸残基、2つのヒスチジン残基及びグルタミン酸残基(例えば、RNアーゼT1内のヒスチジン40、グルタミン酸58、及びヒスチジン92)を共有する。真菌性リボ毒素内には、DSKKPモチーフ(配列番号87)が存在して、SRLに特異的結合することが多い(Kao R, Davies J, J Biol Chem 274: 12576-82 (1999))。真菌性リボ毒素の触媒ドメインは、重ね合わされるため、当業者に公知の配列ア
ライメント法により、触媒活性に要請されるアミノ酸残基を、未研究の真菌性リボ毒素内及び/又は新たな真菌性リボ毒素内で予測することができる。
ライメント法により、触媒活性に要請されるアミノ酸残基を、未研究の真菌性リボ毒素内及び/又は新たな真菌性リボ毒素内で予測することができる。
Aspf1では、16アミノ酸残基(7〜22位)の内部欠失により、そのリボ核酸分解活性及び細胞毒性が、大幅に損われた(Garcia-Ortega L et al., FEBS J 272: 2536-44 (2005))。
ミトギリンには、例えば、アスパラギン7、ヒスチジン49、グルタミン酸95、リシン111、アルギニン120、及びヒスチジン136など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Kao R et al., Mol Microbiol 29: 1019-27 (1998); Kao R, Davies J,FEBS Lett 466: 87-90 (2000))。
レストリクトシンには、例えば、チロシン47、ヒスチジン49、グルタミン酸95、リシン110、リシン111、リシン113、アルギニン120、及びヒスチジン136など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Nayak S, Batra J, Biochemistry 36: 13693-9 (1997); Nayak S et al.,Biochemistry 40: 9115-24 (2001); Plantinga M et al., Biochemistry 50: 3004-13(2011))。
α−サルシンには、例えば、トリプトファン48、ヒスチジン49、ヒスチジン50、トリプトファン51、アスパラギン54、イソロイシン69、グルタミン酸95、グルタミン酸96、リシン111、リシン112、リシン114、アルギニン121、ヒスチジン136、ヒスチジン137、リシン145など、触媒活性に重要であることが公知の複数のアミノ酸残基が存在する(Lacadena J et al., Biochem J 309: 581-6 (1995); Lacadena J et al.,Proteins 37: 474-84 (1999); Martinez-Ruiz A et al., Toxicon 37: 1549-63 (1999);de Antonio C et al., Proteins 41: 350-61 (2000); Masip M et al., Eur J Biochem268: 6190-6 (2001))。
B.リボ毒性領域のリボ毒性に対する分子阻害剤
リボ毒性を低減しているか又は伴わないスクリーニング環境を創出する別の手法は、例えば、適切なリボ毒性領域に対する1又は2以上の分子阻害剤の存在下における選択ステップなどのスクリーニングステップを実施することである。
リボ毒性を低減しているか又は伴わないスクリーニング環境を創出する別の手法は、例えば、適切なリボ毒性領域に対する1又は2以上の分子阻害剤の存在下における選択ステップなどのスクリーニングステップを実施することである。
本明細書で使用される、リボ毒性領域の「阻害剤」という用語は、所望のリボ毒性領域のリボ毒性活性を阻害するか、低減するか、又は消失させる、ペプチド、ポリペプチド、核酸、又は他の分子など、任意の化学物質である。阻害剤は、大半のRIPファミリーのメンバーにより共有されるN−グリコシダーゼ活性を阻害する任意の分子の他、真菌性リボ毒素のRNアーゼ活性又はコリックス毒素のADPリボシル化活性に対する阻害剤を含むことが典型的である。他の阻害剤は、例えば、核酸、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、RNA、又はDNAに対するリボ核酸分解活性など、多様な酵素活性を阻害する分子を含みうる。
非リボ毒性のスクリーニング環境は、適切なリボ毒性領域の分子阻害剤を使用して創出することができる。例えば、多様なタンパク質毒素、毒素サブユニット、又は酵素ドメインの酵素活性及び/又はリボ毒性を阻害する分子であって、それらのポリペプチド配列を、本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドのリボ毒性領域のために使用するか、又はこれらを形成するように導出しうる分子が記載されている。特に、RIPスー
パーファミリーのメンバーのリボ毒性及び/又は酵素活性は、本明細書で記載される様々な分子により阻害することができる。
パーファミリーのメンバーのリボ毒性及び/又は酵素活性は、本明細書で記載される様々な分子により阻害することができる。
RIP及び真菌性リボ毒素のいずれも、多様な低分子により阻害される。RIP及び真菌性毒素のN−グリコシダーゼ活性に対する低分子阻害剤の非限定的な例は、(1)ヌクレオチド;(2)核酸;(3)RNAアプタマー;(4)ハイスループットスクリーニングにより発見される低分子;(5)リボソームストークタンパク質のペプチド;(6)妥当な形でデザインされた低分子;及び基質又は遷移状態模倣体を含む(Skinner L, Jackson M, J Bacteriol 179: 1368-74 (1997); Pallanca etal., Biochimica et Biophysica
Acta 1384: 277-84 (1998); Brigotti et al., Life Sciences 68: 331-6 (2000);Briggoti et al., Nucl Acids Res 28: 2383-8 (2000); Hirao I et al., J Biol Chem275: 4943-8 (2002); Roday S et al., Biochemistry 43: 4923-33 (2004); McCluskeyA et al., J Mol Biol 378: 375-86 (2008); Wahome P et al., Toxicon 56: 313-23(2010); Jasheway K et al., Toxins 3: 1233-48 (2011); Pang Y et al., PLoS One 6:e17883 (2011); Preut J et al., Eur J Med Chem 46: 3608-15 (2011); Laruidsen L,Veedo R, Nucleic Acid Ther 22: 371-9 (2012); Pruet J et al., ACS Med Chem Lett3: 588-91 (2012); Wahome P et al., Curr Top Microbiol Immunol 357: 179-207(2012); Wiget P et al., Bioorg Med Chem Lett 23: 6799-804 (2013); Saito R etal., J Med Chem 56:
320-9 (2013);米国特許出願公開第2011/0201674号明細書を参照されたい
)。
Acta 1384: 277-84 (1998); Brigotti et al., Life Sciences 68: 331-6 (2000);Briggoti et al., Nucl Acids Res 28: 2383-8 (2000); Hirao I et al., J Biol Chem275: 4943-8 (2002); Roday S et al., Biochemistry 43: 4923-33 (2004); McCluskeyA et al., J Mol Biol 378: 375-86 (2008); Wahome P et al., Toxicon 56: 313-23(2010); Jasheway K et al., Toxins 3: 1233-48 (2011); Pang Y et al., PLoS One 6:e17883 (2011); Preut J et al., Eur J Med Chem 46: 3608-15 (2011); Laruidsen L,Veedo R, Nucleic Acid Ther 22: 371-9 (2012); Pruet J et al., ACS Med Chem Lett3: 588-91 (2012); Wahome P et al., Curr Top Microbiol Immunol 357: 179-207(2012); Wiget P et al., Bioorg Med Chem Lett 23: 6799-804 (2013); Saito R etal., J Med Chem 56:
320-9 (2013);米国特許出願公開第2011/0201674号明細書を参照されたい
)。
核酸型阻害剤は、例えば、RNA、DNA、DNA/RNAハイブリッド体、及び前述のアナログを含む(RodayS et al., Biochemistry 43: 4923-33 (2004); Sturm M et al., J Am Chem Soc 129:5544-50 (2007); Roday S et al., Biochemistry 46: 6169-82 (2007); Sturm M etal., Biochemistry 48: 9941-8 (2009))。例えば、リシンは、RN
A、DNA/RNAハイブリッド体、循環DNA、及びRNAアナログに結合することが示されている(Chen Xet al., J Am Chem Soc 122: 6109-17 (2000); Chen X et al., J
Am Chem Soc 122: 6527-34 (2000); Amukele T, Schramm V, Biochemistry 43: 4913-22
(2004); Amukele T et al., Biochemistry 44: 4416-25 (2005))。リシン阻害は、GAGA配列、並びに、例えば、d[G(N−Bn)GA、G(N−Bn)GA、d[G(N−Bn)G(N−Bn)]及びPS d[G(N−Bn)G(7−デアザA)]などの環状核酸について示されている(Sturm M et al., J Am Chem Soc 129: 5544-50 (2007))
。リシン阻害は、オキサカルベニウムイオンの遷移状態に類似するステムループRNAなどのステムループRNAについて示されている(Chen et al., Biochemistry 37: 11605-13 (1998); Tanaka K et al.,Biochemistry 40: 6845-51 (2001))。特に、9−デアザ
アデニル基を伴うか又はこれを伴わない、1,2−ジデオキシリビトール、1,4−ジデオキシ−1,4−イミノ−D−リビトール、(1S)−1−(9−デアザアデニン−9−イル)−1,4−ジデオキシ−1,4−イミノ−D−リビトール、及び/又は(3S,4R)−4−ヒドロキシ−3−(ヒドロキシメチル)ピロリジンを組み込む、10塩基のRNAステムループについて示されている。サポリンは、GAGAテトラループモチーフを含むRNAステムループ構造及びDNAステムループ構造、並びに2’−OMeを伴うアデニンなどの修飾塩基を含むRNAステムループ構造及びDNAステムループ構造により阻害される(米国特許出願公開第2011/0201674号明細書)。大半のRIP及びリボ毒素の基質は、リボソームのユニバーサルに保存されたSRL構造であるため、本発明の多くのリボ毒性領域は、小型の合成オリゴリボヌクレオチド、RNA、DNA、DNA/RNAハイブリッド体、ステムループ、四量体ループ、及びSRL構造を模倣する前述の誘導体により阻害されるであろう。
A、DNA/RNAハイブリッド体、循環DNA、及びRNAアナログに結合することが示されている(Chen Xet al., J Am Chem Soc 122: 6109-17 (2000); Chen X et al., J
Am Chem Soc 122: 6527-34 (2000); Amukele T, Schramm V, Biochemistry 43: 4913-22
(2004); Amukele T et al., Biochemistry 44: 4416-25 (2005))。リシン阻害は、GAGA配列、並びに、例えば、d[G(N−Bn)GA、G(N−Bn)GA、d[G(N−Bn)G(N−Bn)]及びPS d[G(N−Bn)G(7−デアザA)]などの環状核酸について示されている(Sturm M et al., J Am Chem Soc 129: 5544-50 (2007))
。リシン阻害は、オキサカルベニウムイオンの遷移状態に類似するステムループRNAなどのステムループRNAについて示されている(Chen et al., Biochemistry 37: 11605-13 (1998); Tanaka K et al.,Biochemistry 40: 6845-51 (2001))。特に、9−デアザ
アデニル基を伴うか又はこれを伴わない、1,2−ジデオキシリビトール、1,4−ジデオキシ−1,4−イミノ−D−リビトール、(1S)−1−(9−デアザアデニン−9−イル)−1,4−ジデオキシ−1,4−イミノ−D−リビトール、及び/又は(3S,4R)−4−ヒドロキシ−3−(ヒドロキシメチル)ピロリジンを組み込む、10塩基のRNAステムループについて示されている。サポリンは、GAGAテトラループモチーフを含むRNAステムループ構造及びDNAステムループ構造、並びに2’−OMeを伴うアデニンなどの修飾塩基を含むRNAステムループ構造及びDNAステムループ構造により阻害される(米国特許出願公開第2011/0201674号明細書)。大半のRIP及びリボ毒素の基質は、リボソームのユニバーサルに保存されたSRL構造であるため、本発明の多くのリボ毒性領域は、小型の合成オリゴリボヌクレオチド、RNA、DNA、DNA/RNAハイブリッド体、ステムループ、四量体ループ、及びSRL構造を模倣する前述の誘導体により阻害されるであろう。
RNAアプタマー型阻害剤は、例えば、31RA及びリシン活性を阻害する他のアプタマーを含む(HesselberthJ et al., J Biol Chem 275: 4937 -42 (2000); Hirao I et a
l., J Biol Chem 275: 4943-8 (2000); Fan S et al., World J Gastroenterol 14:6360-5 (2008))。
l., J Biol Chem 275: 4943-8 (2000); Fan S et al., World J Gastroenterol 14:6360-5 (2008))。
RIPの低分子阻害剤は、以下のクラスの分子:アザ糖模倣体、プリン、プテリン、及びジヒドロキシアミノ−ピリミジンを含む。低分子阻害剤は、例えば、8−メチル−9−オキソグアニン、2−アミノ−4,6−ジヒドロキシ−ピリミジン、(3S,4R)−3−ヒドロキシ−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン、4−アミノピラゾロ[3,4]ピリミジン(4−APP,4-aminopyrazolo [3,4] pyrimidine)、4−フルオロフェニルメチル2−(フラン−2−イル)キノリン−4−カルボキシレート、7−カルボキシプテリン(7CP,7-carboxy pterin)、フラン連結プテリン、トリアゾール連結プテリン、7−ペプチド置換プテリン、9−デアザアデニンN−ヒドロキシピロリジン糖、9−デアザアデニンN−ヒドロキシピロリジン糖を伴う環状オキシム構築物、G(9−DA)GA 2’OMe四量体、G(9−DA)Gs3 2’−OMe三量体、s3(9−DA)Gs3 2’−OMe二量体、及びs3(9−DA)s3−プロピルホスフェート単量体を含む(Yan X et al., J Mol Biol 266: 1043-49 (1997); Miller D et al., J MedChem 45: 90-8 (2002); Roday S et al., Biochemistry 43: 4923-33 (2004); Bai Y etal., Arch Biochem Biophys 483: 23-8 (2009); Bai Y et al., Toxicon 56: 526-34(2010)、米国特許出願公開第2011/0201674号明細書)。
例えば、アデニン、4−APP、及びこれらのアナログなどのアデノシン異性体は、オオムギRIPなどのRIP、ブリオジン、ゲロニン、ルフィン、モモルジン、PAP−S、リシン、サポリン、及びトリコサンチンによるリボソーム不活性化活性に対する強力な阻害活性を呈示する(Pallanca A et al., Biochim Biophys Acta 1384: 277-84 (1998);
Brigotti et al., Life Sciences 68: 331-6 (2000); Bai Y et al., Arch BiochemBiophys 483: 23-28 (2009))。アデニンアナログは、任意の融合させた二環式化合物であって、環のうちの一方が、6−アミノピリミジンであり、他方の環が、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フラン、又はチオフェンなど、とりわけ、4−APP及びホルミシンベースのアミノ置換ピラゾロピリミジンなど、少なくとも2つの隣接する炭素原子を含有するヘテロ五員環である二環式化合物を含む。アデニンアナログは、ヌクレオチド又はヌクレオシド、など、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオシド、及びデオキシリボヌクレオシドを含む。
Brigotti et al., Life Sciences 68: 331-6 (2000); Bai Y et al., Arch BiochemBiophys 483: 23-28 (2009))。アデニンアナログは、任意の融合させた二環式化合物であって、環のうちの一方が、6−アミノピリミジンであり、他方の環が、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フラン、又はチオフェンなど、とりわけ、4−APP及びホルミシンベースのアミノ置換ピラゾロピリミジンなど、少なくとも2つの隣接する炭素原子を含有するヘテロ五員環である二環式化合物を含む。アデニンアナログは、ヌクレオチド又はヌクレオシド、など、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオシド、及びデオキシリボヌクレオシドを含む。
例えば、プテリン酸などのプテリンは、リシンAサブユニットの触媒活性を阻害した(Yan X et al., JMol Biol 266: 1043-9 (1997))。例えば、ハイスループットスクリー
ニングにより発見された低分子阻害剤など、リシン及び志賀毒素の他の阻害剤についても記載されている(MillerD et al., J Med Chem 45: 90-8 (2002); Bai Y et al., Arch Biochem Biophys 483:23-8 (2009); Stechmann B et al., Cell 141: 231-42 (2010); Wahome P et al.,Toxicon 56: 313-23 (2010); Pang Y et al., PLoS One 6: e17883 (2011))。低分子であるR16、R16b、R19、R19b、R19c、R19d、R2
0、R20b、及びR22は各々、リシン及び志賀毒素Stx2のいずれの酵素活性を阻害することも可能であることが示されており、他のRIPの酵素活性も阻害することが予測される。低分子であるR16、R16b、R19、R19b、R19c、R19d、R20、R20b、及びR22は各々、リシン及び志賀毒素Stx2のいずれの酵素活性を阻害することも可能であることが示されており、他のRIPも同様に阻害することが予測される(Pang Y et al., PLoS One 6: e17883 (2011))。低分子であるRetro−1及びRetro−2は、リシンを阻害する(Park J et al., SREP 2: 631 (2012); Noel R et al., J Med Chem 56:3404-13 (2013))。
ニングにより発見された低分子阻害剤など、リシン及び志賀毒素の他の阻害剤についても記載されている(MillerD et al., J Med Chem 45: 90-8 (2002); Bai Y et al., Arch Biochem Biophys 483:23-8 (2009); Stechmann B et al., Cell 141: 231-42 (2010); Wahome P et al.,Toxicon 56: 313-23 (2010); Pang Y et al., PLoS One 6: e17883 (2011))。低分子であるR16、R16b、R19、R19b、R19c、R19d、R2
0、R20b、及びR22は各々、リシン及び志賀毒素Stx2のいずれの酵素活性を阻害することも可能であることが示されており、他のRIPの酵素活性も阻害することが予測される。低分子であるR16、R16b、R19、R19b、R19c、R19d、R20、R20b、及びR22は各々、リシン及び志賀毒素Stx2のいずれの酵素活性を阻害することも可能であることが示されており、他のRIPも同様に阻害することが予測される(Pang Y et al., PLoS One 6: e17883 (2011))。低分子であるRetro−1及びRetro−2は、リシンを阻害する(Park J et al., SREP 2: 631 (2012); Noel R et al., J Med Chem 56:3404-13 (2013))。
例えば、仮想又は現実の化合物ライブラリーのスクリーニングなど、他の化学的プラッ
トフォームを含む阻害剤も存在するか、又は当業者が同定しうる(Bai Y et al., Toxicon 56:526-34 (2010)を参照されたい)。例えば、ある特定の仮想スクリーニングプログ
ラムにより同定されたリシン志賀毒素阻害剤である、CB5225540、CB5282931、CB5978818、CB7543758、及びCB9062573は、大半の他のRIP阻害剤との類似性を明示しなかった(Bai Y et al., Toxicon 56: 526-34 (2010))。
トフォームを含む阻害剤も存在するか、又は当業者が同定しうる(Bai Y et al., Toxicon 56:526-34 (2010)を参照されたい)。例えば、ある特定の仮想スクリーニングプログ
ラムにより同定されたリシン志賀毒素阻害剤である、CB5225540、CB5282931、CB5978818、CB7543758、及びCB9062573は、大半の他のRIP阻害剤との類似性を明示しなかった(Bai Y et al., Toxicon 56: 526-34 (2010))。
加えて、多くのRIPが、リボソームストークタンパク質に結合することも示されている(Wong Y etal., PLoS One 7: e49608 (2012))。リボソームストークとは、原核生物及び真核生物のいずれにおいても、SRLに近接する大型リボソームサブユニットの動的構造である(Grela P et al., J Mol Evol 67: 154-67 (2008); Bernado P et al.,Biophys J 98: 2374-82 (2010); Grela P et al., Biochemistry 49: 924-33 (2010))。志賀毒素、並びにリシン及びトリコサンチンなど、他のRIPは、リボソームストークタンパク質内のコンセンサスポリペプチド配列に特異的に結合する(Hudak K et al., J Biol Chem 274: 3859-64 (1999); Chan D et al., NucleicAcids Res 35: 1660-72 (2007); Chiou J et al., Mol Microbiol 70: 1441-52 (2008);McCluskey A et al., J Mol Biol 378: 375-86 (2008); Too P et al., Nucleic AcidsRes 37: 602-10 (2009); Chiou J et
al., Int J Biochem Cell Biol 43: 1792-1801 (2011); May K et al., FEBS J 279:3925-36 (2012); McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012))。RIPが結合する
ストークタンパク質内のドメインに対応するペプチドは、志賀毒素を阻害することが示されている(McCluskeyA et al., J Mol Biol 378: 375-86 (2008))。
al., Int J Biochem Cell Biol 43: 1792-1801 (2011); May K et al., FEBS J 279:3925-36 (2012); McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012))。RIPが結合する
ストークタンパク質内のドメインに対応するペプチドは、志賀毒素を阻害することが示されている(McCluskeyA et al., J Mol Biol 378: 375-86 (2008))。
当技術分野では、他のRIPの低分子阻害剤も公知であるか、又はこれらを同定することができる(例えば、WahomeP, Mantis N, Curr Protoc Toxicol. Ch. 2: Unit 2.23 (2013); 米国特許第6,562,969号明細書を参照されたい)。これらの阻害剤は、酵素ドメインのグリコシダーゼ活性を阻害する場合もあり、及び/又は他の形でRIP毒性を阻害する場合もある。
細菌性リボ毒素である、コリックス毒素、DT、及びPEは、例えば、PJ34、β−メチレン−チアゾール−4−カルボキサミドアデニンジヌクレオチド(β−メチレン−TAD+,β-methylene-thiazole-4-carboxamide adenine dinucleotide)、及びApUp(Li M et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 6902-6 (1996); Kahn K,Bruice T, J Am Chem Soc 123: 11960-9 (2001); Jorgensen R et al., Nature 436:979-84 (2005); Yates S et al., Biochem J 385: 667-75 (2005))などのニコチン酸アミド模倣体により阻
害される。
害される。
非リボ毒性のスクリーニング環境は、適切な毒素内及び/又はリボ毒性領域内の抗原を認識する干渉抗体を使用して創出することができる。毒素及び毒素の酵素ドメインは、免疫グロブリン及び免疫グロブリンドメイン、特に、酵素活性部位を封鎖するか、又は基質への結合を防止することが可能な免疫グロブリン及び免疫グロブリンドメインにより阻害することができる。組換えDNA法及びインビトロライブラリースクリーニングは、免疫グロブリン型結合領域の作製に適合的であるため、免疫グロブリン及び免疫グロブリンドメインを再デザインして、小型のサイズ、細胞への侵入、又は他の治療的改善など、所望される特徴を得ることができる。
酵素サブユニットであるリシンのA鎖は、例えば、mAb 6C2、6G3、13C10、13G6、2D6、RAC mAb 1〜23、23D7、25A4、RTA 1〜18、RTA 24〜394、RiVax、RTA 1〜33/44〜198、GD12、SyH7、PB10、R70、SB1、RA36、IB2、WECB2、TB12、PA1、PH12、ヒト化GD12、単鎖モノクローナル抗体VHH(例えば、RTA−F
5、RTA−G12、RTA−D10、RTA−E5、及びRTA−G11)、及びscFv 43RCAなど、複数のモノクローナル抗体により中和又は遮断される(Foxwell B et al., Toxicology 34: 79-88 (1985); Colombatti M et al., Hybridoma5: 9-19 (1986); Lemley P et al., Hybridoma 13: 417-21 (1994); Maddaloni M etal., J Immunol 172: 6221-8 (2004); Dertzbaugh M et al., Hybridoma 24: 236-43(2005); Mantis N
et al., Infect Immun 74: 3455-62 (2006); Carra J et al., Vaccine 25: 4149-58(2007); Smallshaw J et al., Vaccine 25: 7459-69 (2007); Pelat et al., BMCBiotechnol 9: 60 (2009); Neal L et al., Infect Immun 78: 552-61 (2010); O'HaraJ et al.,
Vaccine 28: 7035-46 (2010); Dai J et al., J Biol Chem 286: 12166-71 (2011);Prigent J et al., PLoS One 6: e20166 (2011); O'Hara J et al., Vaccine 30:1239-43 (2012); Song K et al., PLoS One 8: e62417 (2013); Thomas J et al., HumVaccin Immunother 9: 744-52 (2013); Vance D et al., J Biol Chem 288: 36538-47(2013); Zhu Y et al., J Biol Chem 288: 25165-72 (2013); O'Hara J et al.,Immunol Lett 158: 7-13 (2014); Rudolph M et al., J Mol Biol 426: 3057-68 (2014))。大半のリシン毒素中和抗体は、リシンのB鎖ではなく、A鎖に結合する(Foxwell B et al., Toxicology 34: 79-88 (1985); Lemley P et al.,Hybridoma 13: 417-21 (1994); Maddaloni M et al., J Immunol 172: 6221-8 (2004);Song K et al., PLoS One 8: e62417 (2013))。マ
ウスモノクローナル抗体である、GD12、R70、PB10、及びSyH7は、インビトロにおいて、リシン酵素活性を阻害する(O'Hara J et al., Vaccine 28: 7035-46 (2010))。SyH7は、アルギニンに富む、正に帯電したパッチであって、基質への結合に
重要であり、リシンの一次アデニン特異性結合ポケットと二次アデニン特異性結合ポケットとの間に位置するrRNA領域と接触すると仮定されているパッチに結合する(Katzin
N et al., Proteins 10: 251-9 (1991); Li X et al., Biochemistry 48: 3853 -63(2009))。GD12は、活性部位の近傍において結合する(Neal L et al., InfectImmun 78: 552-61 (2010))。R70は、酵素活性に関与しうるアルファへリックスに結合する(LebedaF, Olson M, Int J Biol Macromol 24: 19-26 (1999); Neal L et al., Infect Immun78: 552-61 (2010); Dai J et al., J Biol Chem 286: 12166-71 (2011))。マウスモノクローナル抗体であるmAb 6C2は、リシン毒素を強力に中和し、mAb−6C2の結合は、リシンのアミノ酸96〜116位へとマッピングされているため、この中和活性は、リボソームドッキングの阻害に起因しうる(Zhu Y et al., J Biol Chem 288: 25165-72 (2013))。RAC14、RAC18及びRAC23はいずれも、インビトロにおいて、リシン酵素活性を遮断し、RAC18は、インビボにおいて、有効な中和活性を及ぼす(Maddaloni M et al., J Immunol 172: 6221-8 (2004); Pratt T et al.,Exp Lung
Res 33: 459-81 (2007); Roche J et al., Lab Invest 88: 1178-91 (2008))。
5、RTA−G12、RTA−D10、RTA−E5、及びRTA−G11)、及びscFv 43RCAなど、複数のモノクローナル抗体により中和又は遮断される(Foxwell B et al., Toxicology 34: 79-88 (1985); Colombatti M et al., Hybridoma5: 9-19 (1986); Lemley P et al., Hybridoma 13: 417-21 (1994); Maddaloni M etal., J Immunol 172: 6221-8 (2004); Dertzbaugh M et al., Hybridoma 24: 236-43(2005); Mantis N
et al., Infect Immun 74: 3455-62 (2006); Carra J et al., Vaccine 25: 4149-58(2007); Smallshaw J et al., Vaccine 25: 7459-69 (2007); Pelat et al., BMCBiotechnol 9: 60 (2009); Neal L et al., Infect Immun 78: 552-61 (2010); O'HaraJ et al.,
Vaccine 28: 7035-46 (2010); Dai J et al., J Biol Chem 286: 12166-71 (2011);Prigent J et al., PLoS One 6: e20166 (2011); O'Hara J et al., Vaccine 30:1239-43 (2012); Song K et al., PLoS One 8: e62417 (2013); Thomas J et al., HumVaccin Immunother 9: 744-52 (2013); Vance D et al., J Biol Chem 288: 36538-47(2013); Zhu Y et al., J Biol Chem 288: 25165-72 (2013); O'Hara J et al.,Immunol Lett 158: 7-13 (2014); Rudolph M et al., J Mol Biol 426: 3057-68 (2014))。大半のリシン毒素中和抗体は、リシンのB鎖ではなく、A鎖に結合する(Foxwell B et al., Toxicology 34: 79-88 (1985); Lemley P et al.,Hybridoma 13: 417-21 (1994); Maddaloni M et al., J Immunol 172: 6221-8 (2004);Song K et al., PLoS One 8: e62417 (2013))。マ
ウスモノクローナル抗体である、GD12、R70、PB10、及びSyH7は、インビトロにおいて、リシン酵素活性を阻害する(O'Hara J et al., Vaccine 28: 7035-46 (2010))。SyH7は、アルギニンに富む、正に帯電したパッチであって、基質への結合に
重要であり、リシンの一次アデニン特異性結合ポケットと二次アデニン特異性結合ポケットとの間に位置するrRNA領域と接触すると仮定されているパッチに結合する(Katzin
N et al., Proteins 10: 251-9 (1991); Li X et al., Biochemistry 48: 3853 -63(2009))。GD12は、活性部位の近傍において結合する(Neal L et al., InfectImmun 78: 552-61 (2010))。R70は、酵素活性に関与しうるアルファへリックスに結合する(LebedaF, Olson M, Int J Biol Macromol 24: 19-26 (1999); Neal L et al., Infect Immun78: 552-61 (2010); Dai J et al., J Biol Chem 286: 12166-71 (2011))。マウスモノクローナル抗体であるmAb 6C2は、リシン毒素を強力に中和し、mAb−6C2の結合は、リシンのアミノ酸96〜116位へとマッピングされているため、この中和活性は、リボソームドッキングの阻害に起因しうる(Zhu Y et al., J Biol Chem 288: 25165-72 (2013))。RAC14、RAC18及びRAC23はいずれも、インビトロにおいて、リシン酵素活性を遮断し、RAC18は、インビボにおいて、有効な中和活性を及ぼす(Maddaloni M et al., J Immunol 172: 6221-8 (2004); Pratt T et al.,Exp Lung
Res 33: 459-81 (2007); Roche J et al., Lab Invest 88: 1178-91 (2008))。
志賀毒素のAサブユニットには、モノクローナル抗体である、MAb 11F11、MAb 11G10、MAb 2E1、MAb 10E10、Hu−MAb 7E12、MAb 11E10、5C12、MAb DC1 EH5、MAb GB6 BA4、ヒト化11E10 cαStx2、HuMAb 5C12、HuMAb 5H8、HuMAb
3E9、HuMAb 2F10、HuMAb 1G3、HuMAb 4H9、HuMAb 5A4、Stx2−1、及びMAb S2C4など、複数の抗体が結合する(Stockbrine N et al., Infect Immun 50: 695-700 (1985); Downes F etal., Infect Imun 56:
1926-33 (1988); Perera L et al., J Clin Microbiol 26: 2127-31 (1988); Mukherjee
J et al., Infect Immun 70: 612-9 (2002); Mukherjee J et al., Infect Immun 70:5896-9 (2002); Sheoran A et al., Infect Immun 71: 3125-30 (2003);Krautz-Peterson
G et al., Infect Immun 76: 1931-9 (2008); Jiao Y et al., Prog Biochem Biophys36: 736-42 (2009); Smith M et al., Infect Immun 77: 2730-40 (2009); Guo X etal.,
J Med Mol Biol 5: 382-7 (2010); Rocha L et al., Toxins 4: 729-47 (2012); ChengL et al., Toxins 5: 1845-58 (2013); He X et al., J Immunol Methods 389: 18-28(2013))。これらの抗体の多くは、中和特徴及び/又は保護特徴を呈示する(Krautz-Peter
son G et al., Infect Immun 76: 1931-9 (2008); Jeong K et al., BMC Immunol 11:16
(2010))。例えば、インビトロにおけるStx2Aの酵素活性は、マウスモノクローナ
ル抗体である11E10により阻害される(Smith M et al., Infect Immun 77:2730-40
(2009); Rocha L et al., Toxins 4: 729-47 (2012))。Stx2Aには、それらのエピトープがマッピングされたマウスモノクローナル中和抗体である、11E10及びS2C4が結合する(Jiao Y et al., Progress in Biochem Biophys 36: 736-42 (2009); SmithM et al., Infect Immun 77: 2730-40 (2009); Guo X et al., J Med Mol Biol 5:382-7 (2010); Rocha L et al., Toxins 4: 729-47 (2012); Jaio Y et al., PLoS One9: e88191 (2014))。
3E9、HuMAb 2F10、HuMAb 1G3、HuMAb 4H9、HuMAb 5A4、Stx2−1、及びMAb S2C4など、複数の抗体が結合する(Stockbrine N et al., Infect Immun 50: 695-700 (1985); Downes F etal., Infect Imun 56:
1926-33 (1988); Perera L et al., J Clin Microbiol 26: 2127-31 (1988); Mukherjee
J et al., Infect Immun 70: 612-9 (2002); Mukherjee J et al., Infect Immun 70:5896-9 (2002); Sheoran A et al., Infect Immun 71: 3125-30 (2003);Krautz-Peterson
G et al., Infect Immun 76: 1931-9 (2008); Jiao Y et al., Prog Biochem Biophys36: 736-42 (2009); Smith M et al., Infect Immun 77: 2730-40 (2009); Guo X etal.,
J Med Mol Biol 5: 382-7 (2010); Rocha L et al., Toxins 4: 729-47 (2012); ChengL et al., Toxins 5: 1845-58 (2013); He X et al., J Immunol Methods 389: 18-28(2013))。これらの抗体の多くは、中和特徴及び/又は保護特徴を呈示する(Krautz-Peter
son G et al., Infect Immun 76: 1931-9 (2008); Jeong K et al., BMC Immunol 11:16
(2010))。例えば、インビトロにおけるStx2Aの酵素活性は、マウスモノクローナ
ル抗体である11E10により阻害される(Smith M et al., Infect Immun 77:2730-40
(2009); Rocha L et al., Toxins 4: 729-47 (2012))。Stx2Aには、それらのエピトープがマッピングされたマウスモノクローナル中和抗体である、11E10及びS2C4が結合する(Jiao Y et al., Progress in Biochem Biophys 36: 736-42 (2009); SmithM et al., Infect Immun 77: 2730-40 (2009); Guo X et al., J Med Mol Biol 5:382-7 (2010); Rocha L et al., Toxins 4: 729-47 (2012); Jaio Y et al., PLoS One9: e88191 (2014))。
アブリンのAサブユニットは、活性部位であるクレフト近傍のアミノ酸残基74〜123位において結合するマウスモノクローナル抗体である、mAb D6F10により中和される(Surendranath K, Karande A, Clin Vaccine Immunol 15: 737-43 (2008);Bagaria S et al., PLoS One 8: e70273 (2013))。低阻害濃度でも、この抗体はなお、内部化スクリーニングを可能とする(Surendranath K, Karande A, Clin Vaccine Immunol 15: 737-43 (2008);Bagaria S et al., PLoS One 8: e70273 (2013))。アブリン−aのAサブユニットには、アブリンのリボ毒性領域のリボ毒性に対する阻害活性を呈示しうるモノクローナル抗体である、mAb 4G1が結合する(Li X et al., J Agric Food Chem 59: 9796-9 (2011))。
シュードモナス属外毒素Aには、Ex−3C7、Ex−4F2、Ex−8H5、及びEx−2A10など、多くの抗体が結合する(Ohtsuka H et al., Infect Immun 60: 1061-8 (1992); Elzaim H et al.,Infect Immun 66: 2170-9 (1998))。例えば、Ex−2A
10は、酵素活性を阻害する(Ohtsuka H et al., Infect Immun 60: 1061-8(1992))。ウサギ中和抗体は、PE酵素626〜638(III)に結合し、PE酵素活性に干渉する
(Elzaim H et al., Infect Immun 66: 2170-9 (1998))。マウスモノクローナル抗体で
ある2A10は、PEに結合し、その酵素活性に干渉する(Elzaim H et al., InfectImmun 66: 2170-9 (1998))。
10は、酵素活性を阻害する(Ohtsuka H et al., Infect Immun 60: 1061-8(1992))。ウサギ中和抗体は、PE酵素626〜638(III)に結合し、PE酵素活性に干渉する
(Elzaim H et al., Infect Immun 66: 2170-9 (1998))。マウスモノクローナル抗体で
ある2A10は、PEに結合し、その酵素活性に干渉する(Elzaim H et al., InfectImmun 66: 2170-9 (1998))。
ジフテリア毒素のAサブユニットには、MAb−AC5、83B8、及びhMAb 3B2F3、512C5、3B4G1、54E2、57G3、513G3、56E6、及び513A1など、多くの抗体が結合する(Zucker D, Murhpy J, Mol Immunol 21: 785-93
(1984); Rolf J, Eidels, L, Infect Immun 61: 994-1003 (1993); Usuwanthim K etal., Asian Pac J Allergy Immunol 26: 47-55 (2008); Sevigny L et al., InfectImmun 81: 3992-4000 (2013))。例えば、mAb AC5であれば、DTの酵素活性を阻害しうるであろう(Usuwanthim K et al., Asian Pac J Allergy Immunol 26: 47-55 (2008))
。
(1984); Rolf J, Eidels, L, Infect Immun 61: 994-1003 (1993); Usuwanthim K etal., Asian Pac J Allergy Immunol 26: 47-55 (2008); Sevigny L et al., InfectImmun 81: 3992-4000 (2013))。例えば、mAb AC5であれば、DTの酵素活性を阻害しうるであろう(Usuwanthim K et al., Asian Pac J Allergy Immunol 26: 47-55 (2008))
。
さらなるリボ毒性領域の分子阻害剤を、創出することもでき、同定することもでき、得ることもできる。例えば、他の抗体、抗体の誘導体、及び免疫グロブリンドメイン構築物を、創出することもでき、同定することもでき、得ることもできる。例えば、アプタマー、ペプチド、及び低分子など、他の低分子阻害剤も作製することができる(Tang J et al., Biosens Bioelectron 22: 2456-63 (2007))。
当業者には、これらのディスプレイスクリーニング法で使用される阻害剤の量が公知であり、また、経験的に決定することもできる。例えば、4−APPは、約0.1ミリモル(mM)〜50mMの濃度で、細胞表面ディスプレイスクリーニングに有効なことが典型的である。阻害剤の濃度は、ディスプレイスクリーニングの種類、例えば、細胞表面ディスプレイスクリーニングと対比したインビトロディスプレイスクリーニング、真核生物ディスプレイスクリーニングと対比した原核生物ディスプレイスクリーニング、状態、持続時間、及び/又は阻害される特定のリボ毒性領域に応じて変化させうることが理解される。
細胞表面ディスプレイスクリーニングでは、適切なリボ毒性領域の阻害剤を産生する修飾宿主株を使用して、非リボ毒性のスクリーニング環境を創出することができる。酵母では、リボソームタンパク質L3の切断型の発現により、志賀毒素毒性の低減及び/又は消失をもたらしうる(米国特許出願公開第2010/0298238号明細書)。mak8−1遺伝子型を伴う酵母株は、RIP毒性に対する抵抗性が大きい(Mansouri S et al.,
RNA 12: 1683-92 (2006))。
RNA 12: 1683-92 (2006))。
IV.リボ毒性の一時的な減少に基づき、リボ毒性ポリペプチドをスクリーニングする方法の一般的な実行
本発明は、リボ毒性組換えタンパク質及びリボ毒性組換えポリペプチド、例えば、免疫毒素、リガンド−毒素融合体、イムノRNアーゼ、及び合成ペプチド、ターゲティングドメインを含む毒素バリアントの改善された分子ディスプレイスクリーニングのための多様な方法を提供する。本発明の方法は、細胞毒性ポリペプチド、並びに少なくとも2つの機能的な領域:細胞ターゲティング領域及びリボ毒性エフェクター領域を含む分子的枠組みについてのワンステップスクリーニングを可能とする。本発明のスクリーニング法は、毒素の機能的領域の単離を伴う、所望されない漸次法ではなく、複数の機能的領域の同時的な最適化を可能とする。
本発明は、リボ毒性組換えタンパク質及びリボ毒性組換えポリペプチド、例えば、免疫毒素、リガンド−毒素融合体、イムノRNアーゼ、及び合成ペプチド、ターゲティングドメインを含む毒素バリアントの改善された分子ディスプレイスクリーニングのための多様な方法を提供する。本発明の方法は、細胞毒性ポリペプチド、並びに少なくとも2つの機能的な領域:細胞ターゲティング領域及びリボ毒性エフェクター領域を含む分子的枠組みについてのワンステップスクリーニングを可能とする。本発明のスクリーニング法は、毒素の機能的領域の単離を伴う、所望されない漸次法ではなく、複数の機能的領域の同時的な最適化を可能とする。
本発明は、ライブラリーのリボ毒性構成要素の活性を、一時的に低減するか又は消失させた文脈及び/又は環境におけるスクリーニングにより、リボ毒性ポリペプチドの存在により引き起こされる問題を克服する。リボ毒性の低減又は消失は、少なくとも2つの方式で:1)1カ所若しくは2カ所以上の変異によりもたらされる、毒素領域の非リボ毒性形態を使用すること、並びに/又は2)阻害剤分子の存在下で、適切な毒素領域のスクリーニング及び/若しくは選択を実施することにより達成することができる。
A.スクリーニング時におけるリボ毒性ポリペプチドの存在は問題である
全てのタンパク質ディスプレイ技術は、リボソームに依存するため、発現ライブラリー内にリボ毒性分子が存在すると、任意のタンパク質ディスプレイ法を使用するディスプレイスクリーニングは攪乱される場合があろう。例えば、細胞表面ディスプレイ技術は、微生物(例えば、細菌、真菌)ディスプレイ及び哺乳動物細胞ディスプレイなど、生細胞を直接伴う。発現ライブラリー内にリボ毒性分子が存在すると、これらの系は劇的に攪乱される場合があろう。バクテリオファージディスプレイ及びウイルスディスプレイなど、細胞を要請しないディスプレイ技術でもなお、タンパク質ディスプレイライブラリーを発現させ、選択されるメンバーの遺伝子型を回収する媒介物として、生細胞を間接的に伴う。ここでもまた、発現ライブラリー内にリボ毒性分子が存在すると、例えば、ライブラリーのうちの最も毒性の大きなメンバーとは無関係な、望ましくないバイアスの招来などにより、これらの系は攪乱される場合があろう。
全てのタンパク質ディスプレイ技術は、リボソームに依存するため、発現ライブラリー内にリボ毒性分子が存在すると、任意のタンパク質ディスプレイ法を使用するディスプレイスクリーニングは攪乱される場合があろう。例えば、細胞表面ディスプレイ技術は、微生物(例えば、細菌、真菌)ディスプレイ及び哺乳動物細胞ディスプレイなど、生細胞を直接伴う。発現ライブラリー内にリボ毒性分子が存在すると、これらの系は劇的に攪乱される場合があろう。バクテリオファージディスプレイ及びウイルスディスプレイなど、細胞を要請しないディスプレイ技術でもなお、タンパク質ディスプレイライブラリーを発現させ、選択されるメンバーの遺伝子型を回収する媒介物として、生細胞を間接的に伴う。ここでもまた、発現ライブラリー内にリボ毒性分子が存在すると、例えば、ライブラリーのうちの最も毒性の大きなメンバーとは無関係な、望ましくないバイアスの招来などにより、これらの系は攪乱される場合があろう。
加えてまた、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びタンパク質−DNA連結ディスプレイなど、完全なインビトロディスプレイ法も、少なくとも、発現ステップのためにリボソームを活用するが、これも、発現ライブラリーのリボ毒性メンバーの存在により攪乱される場合があり、これにより、所望されない選択バイアスが結果としてもたらされる。リボソームを伴う、インビトロにおける翻訳ステップを要請する任意のタンパク質ディスプレイ法は、リボ毒性ポリペプチドの存在による攪乱を受ける。インビトロディスプレイ法の翻訳ステップは、原核生物供給源及び真核生物供給源の両方、例えば、大腸菌S30系、ウサギ網状赤血球溶解物、又はコムギ胚芽溶解物に由来する半精製リボソーム又は精製リボソームを活用することが多い(例えば、和光純薬工業株式会社(日本)製のPURE Express及びPURESYSTEM;Ueda T et al., Methods Mol Biol 607: 219-25 (201
0)を参照されたい)。
0)を参照されたい)。
こうして、全てではないにせよ、大半のタンパク質ディスプレイ技術は、機能的リボソームが適正に作動することを要請し、リボ毒性ライブラリーメンバーの存在により攪乱される場合があろう。ライブラリー内のリボ毒性の存在により攪乱が引き起こされると、スクリーニング全体が妨げられる場合もあり、デザインされた選択基準のうちのいずれよりも強力な新たな選択圧(例えば、未成熟の終止コドン、フレームシフト、及び/又は組換えイベントにより引き起こされる、点変異、欠失、挿入、逆位、切断などの自発的変異を介して、リボ毒性を失効化する圧力)をもたらす場合もあろう。リボ毒性の存在によりもたらされる所望されない選択圧が、ライブラリーのうちのリボ毒性の最も強いメンバーに対する、弱い選択圧に限られる場合でもなお、これにより、スクリーニングにおいて最も所望されるヒットの一部、すなわち、リボ毒性の最も強いメンバーに対して、望ましくない選択バイアスが加えられる。
さらに、大規模なタンパク質ライブラリーのハイスループットスクリーニングは、望ましくないバイアスの体系的導入を回避するように、ライブラリー内の遺伝子型間で比較的同等のリボソーム機能を要請する。スクリーニングの前にリボソーム機能を攪乱することにより、ライブラリーメンバーの表示にバイアスが招来される場合があるが、これは、例えば、一部の陽性ヒット遺伝子型の遮蔽(偽陰性)及び偽陽性の導入など、スクリーニングの結果に対するバイアスとなろう(後出の実施例を参照されたい)。リボ毒性が存在すると、例えば、バイアスのかかったライブラリー表示、バイアスのかかった選択、及びリボソームを伴う回収ステップにおける、バイアスのかかった効率など、リボ毒性の最も強いメンバーと無関係な、複数のバイアスがもたらされることが予測される。
B.リボ毒性の一時的な低減に基づく、細胞毒性組換えポリペプチドのライブラリーのスクリーニング、選択、及び濃縮
本発明は、リボ毒性の一時的な低減又は消失に基づき、特異的特徴を伴う細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法であり、例えば、標的生体分子への結合アフィニティー、標的細胞への結合アフィニティー、及び/又は標的細胞への内部化など、1又は2以上の選択可能な特徴に基づく方法を提供する。本発明の方法は、完全キメラ分子の文脈では、キメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドのワンステップ式選択を可能とする一方で、リボ毒性の存在により引き起こされる、望ましくない選択バイアスを最小化する。こうして、最終的なキメラタンパク質又はキメラポリペプチドの文脈で所望される発現、安定性、及び他の産生特徴を示すポリペプチドを、例えば、結合アフィニティーなど、他の所望される特徴について選択しながら、同時に、単一のスクリーニングステップで同定することができる。これらの方法は、例えば、RNAディスプレイ、ファージディスプレイ、及びリボソームディスプレイなど、比較的多様なポリペプチドライブラリーのスクリーニングを可能とするタンパク質ディスプレイ技術により、効率的で、有効で、強力なスクリーニングを提供する。
本発明は、リボ毒性の一時的な低減又は消失に基づき、特異的特徴を伴う細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法であり、例えば、標的生体分子への結合アフィニティー、標的細胞への結合アフィニティー、及び/又は標的細胞への内部化など、1又は2以上の選択可能な特徴に基づく方法を提供する。本発明の方法は、完全キメラ分子の文脈では、キメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドのワンステップ式選択を可能とする一方で、リボ毒性の存在により引き起こされる、望ましくない選択バイアスを最小化する。こうして、最終的なキメラタンパク質又はキメラポリペプチドの文脈で所望される発現、安定性、及び他の産生特徴を示すポリペプチドを、例えば、結合アフィニティーなど、他の所望される特徴について選択しながら、同時に、単一のスクリーニングステップで同定することができる。これらの方法は、例えば、RNAディスプレイ、ファージディスプレイ、及びリボソームディスプレイなど、比較的多様なポリペプチドライブラリーのスクリーニングを可能とするタンパク質ディスプレイ技術により、効率的で、有効で、強力なスクリーニングを提供する。
リボ毒性の低減又は消失は、少なくとも2つの方式で:1)1カ所若しくは2カ所以上の変異によりもたらされる、毒素領域の非リボ毒性形態を使用すること、並びに/又は2)阻害剤分子の存在下で、適切な毒素領域のスクリーニング及び/若しくは選択を実施することにより達成する。こうして、本発明の一方法は、修飾リボ毒性領域のリボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸置換、欠失、挿入、及び/又は付加により、リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域を伴う。スクリーニングで、ポリペプチドを同定したら、ポリペプチドのうちのリボ毒性のより強いバリアントを創出して、リボ毒性の低減又は消失を解除することができる。本発明の第2の方法は、適切なリボ毒性領域の阻害剤の存在下で、提示されたポリペプチドの産生、選択、及び/又は回収を実施するステップを伴う。
本発明のスクリーニング法を使用して、完全にリボ毒性であるリボ毒性領域と融合させた、細胞ターゲティング結合領域を含む、キメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドを同定することができる。これらのキメラ細胞毒性タンパク質及びキメラ細胞毒性ポリペプチドは、例えば、細胞殺滅のターゲティング、並びにがん、免疫障害、及び微生物感染を含む、様々な疾患、障害、及び状態の治療における治療剤として使用される。
スクリーニングを実施して、キメラ細胞毒性ポリペプチドの結合領域を発見又は改善することができる。細胞ターゲティング結合領域を、リボ毒性領域と連結することにより、強力な天然毒素の細胞毒性に対する細胞型特異的ターゲティングの操作が可能となる。キメラ細胞ターゲティング毒素が治療的に有用であるためには、細胞毒性組換えポリペプチドは、特定の細胞型に優先的に結合し、侵入しなければならない。細胞内に入ったら、内部化された細胞毒性ポリペプチドのうちの少なくとも一部は、リボ毒性領域の少なくとも一部を細胞質ゾルへと放出して、リボソームを不活性化することが可能でなければならない。特に、細胞毒性ポリペプチドを同定するか、又は枠組みをさらに最適化するために、2つの重要な特徴:1)標的の結合アフィニティー及び結合特異性、並びに2)標的細胞への侵入についてスクリーニングすることができる。これらの特徴についてスクリーニングすることにより、特異的細胞型を選択的に死滅させるポリペプチドのデザインが可能となる。スクリーニングの目標は、細胞外標的生体分子に特異的に結合することが可能なポリペプチド領域であって、例えば、がん細胞、腫瘍細胞、血漿細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を宿す宿主細胞など、所望の細胞型の表面へと物理的にカップリングするポリペプチド領域を含む結合領域を同定することであることが多い。
本発明は、リボ毒性の一時的な低減又は消失に基づき、特異的特徴を伴う細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法を提供する。本発明の方法は、各々が結合領域及び毒素領域を伴う、キメラタンパク質及びキメラポリペプチドを、所望される特徴について、領域間相互作用及びワンステップによる最適化の主因となる両方のポリペプチド領域の文脈においてスクリーニングし、選択することを可能とする。キメラ融合ポリペプチドの高度に多様なライブラリーは、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、RNAディスプレイ、DNA連結ディスプレイ、及び細菌ディスプレイなど、強力なディスプレイスクリーニング法を使用してスクリーニングすることができる(例えば、国際特許公開第1998/031700号パンフレット;国際特許公開第2000/047775号パンフレット;米国特許第6,207,446号明細書;米国特許第6,214,553号明細書;米国特許第6,258,558号明細書;米国特許第6,261,804号明細書;米国特許第6,281,344号明細書;米国特許出願公開第2003/0186374号明細書、米国特許出願公開第2004/0180422号明細書を参照されたい)。
本発明のキメラ細胞毒性ポリペプチドは、例えば、標的への結合アフィニティー、標的への結合選択性、細胞への結合アフィニティー、細胞への結合選択性、細胞への内部化、安定性の改善、可溶性の改善、薬物動態特性の改善、薬力学特性の改善、実験動物種若しくは細胞株における発現の改善、並びに/又は抗原性及び/若しくは免疫原性の低減など、多数の基準に基づき、スクリーニング又は選択することができる。例えば、融合ポリペプチドは、細胞型特異的発現を示す標的生体分子への結合領域、及び/又は特異的細胞型に照らした物理的局在化について選択することができる。例えば、本発明のある特定の細胞毒性ポリペプチドは、もっぱら1つの細胞型だけが細胞表面へと発現させる細胞表面標的に結合することが可能な結合性ドメインを含む。これにより、特異的細胞型に対する細胞殺滅のターゲティングであって、細胞外標的生体分子を発現させない「バイスタンダー」細胞型を上回る、高度な優先性を伴うターゲティングが可能となる。
代替的に、細胞外標的生体分子が、十分な低量で、ターゲティングされない細胞型へと発現し、及び/又は、低量で、ターゲティングされない細胞型と物理的にカップリングしている場合、結合領域の標的生体分子の発現は、もっぱら1つの細胞型に限定されるとは限らない場合もある。これによりまた、特異的細胞型に対する細胞殺滅のターゲティングであって、相当量の細胞外標的生体分子を発現させないか、又は著明量の細胞外標的生体分子へと物理的にカップリングしていない、「バイスタンダー」細胞型を上回る、高度な優先性を伴うターゲティングも可能となる。本発明の細胞毒性ポリペプチドの他の特徴は、異なる特化した環境であって、エクスビボにおける環境、インビトロにおける培養環境、又はインビボにおける環境(多細胞生物内のそれらの天然の場所におけるインサイチュでの細胞を含む)などの環境における使用のための細胞毒性ポリペプチドを最適化するために選択することができる。
B.非リボ毒性鋳型を使用する、スクリーニング、選択、及び濃縮
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法であって、細胞毒性タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数のタンパク質を用意するステップであり、各分子が、(1)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と、(2)リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域とを含むステップと;(b)複数のタンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴うタンパク質を選択するステップと;(c)前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた同定された結合領域に由来するか又はこれを含む1又は2以上のリボ毒性タンパク質を構築するために、選択されたタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法であって、細胞毒性タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数のタンパク質を用意するステップであり、各分子が、(1)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と、(2)リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域とを含むステップと;(b)複数のタンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴うタンパク質を選択するステップと;(c)前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた同定された結合領域に由来するか又はこれを含む1又は2以上のリボ毒性タンパク質を構築するために、選択されたタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
本発明の別の実施形態は、1又は2以上の細胞毒性融合ポリペプチドを同定するための方法であって、細胞毒性融合ポリペプチドが、(1)リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、(2)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドから構築された、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップであり、各融合ポリペプチドが、(1)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と、(2)リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域とを含むステップと;(b)複数の融合ポリペプチドが産生されるように、多様な核酸の発現ライブラリーを発現させるステップと、(c)産生された融合ポリペプチドの中から、発現させた融合ポリペプチドであり、特異的な特徴を伴う融合ポリペプチドを選択するステップと、(d)前記修飾リボ毒性領域のリボ毒性形態と融合させた前記結合領域を含む、1又は2以上の細胞毒性融合ポリペプチドを構築するために、選択された融合ポリペプチド配列を同定するステップとを含む方法である。
選択の後、コードされたポリペプチドは、宿主細胞を、発現ライブラリーの少なくとも1つのメンバー、又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作動可能に挿入した発現ベクターで形質転換し、コードされたポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより産生することができる。当技術分野では、この産生のための、多くの適切な代替的発現ベクター及び宿主細胞が公知である。例えば、細胞毒性ポリペプチドは、当業者に公知の産生系であって、毒性部分を宿主細胞から遮蔽するようにデザインされた産生系内で産生することができ、これにより、宿主細胞が、操作を伴わなければ殺菌性となるタンパク質を産生することを可能とする。
本発明の方法における、さらなる可能なステップは、選択された結合領域の、リボ毒性領域の非修飾形態への融合、及びこの誘導体である細胞毒性ポリペプチドの発現である。これは、本発明の方法の目標が一般に、がん細胞を死滅させる他、標的分子に選択的に結合する能力を有する細胞毒性ポリペプチドの産生であるためである。こうして、候補タンパク質結合剤を選択したら、リボ毒性領域を非毒性とするのに活用される遺伝子変化を元に戻してもよく、これにより、分子の毒性を復帰させ、特に選択された細胞毒性ポリペプチドの誘導体を産生する。本発明は、いかなる手段による毒性の復帰も想定するが、これらの特定のアミノ酸残基又はアミノ酸配列の、野生型形態(例えば、触媒作用に関与することが公知のアミノ酸をコードする配列)への復帰を、特に想定する。
ある特定のクラスの毒素に由来する毒素領域を伴う細胞毒性融合ポリペプチドの中では、特異的な復帰変異が想定される。細菌性リボ毒素に由来する細胞毒性融合ポリペプチドの中では、DTの148位、コリックス毒素の581位、及びPEの553位におけるグルタミン酸の復帰誘導体が、想定される誘導体である。真菌性リボ毒素及び/又はRNアーゼに由来する毒素領域を伴う細胞毒性融合ポリペプチドの中では、本明細書で記載される触媒作用に重要な、3つの、保存された、鍵となる、コアのアミノ酸残基のうちの1又は2以上、例えば、2つのヒスチジン残基及びグルタミン酸残基における変異の復帰誘導体が、想定される誘導体である。RIPファミリーの毒素に由来する毒素領域を伴う細胞毒性融合ポリペプチドの中では、本明細書で記載される触媒作用に重要な、5つの、保存された、鍵となる、コアのアミノ酸残基のうちの1又は2以上、例えば、触媒ドメインのアミノ末端近傍における2つのチロシン残基、触媒ドメインの中央部近傍におけるグルタミン酸及びアルギニン、及びトリプトファンにおける変異の復帰誘導体が、想定される誘導体である。具体的には、志賀毒素のAサブユニットの77位におけるトリプトファン残基及び/又は167位におけるグルタミン酸残基;リシンのA鎖の80位におけるチロシン残基、177位におけるグルタミン酸残基、180及び213位におけるアルギニン残基、並びに/又は203位におけるセリン残基;α−サルシンの137位におけるヒスチジン残基;サポリンのAサブユニットの176位におけるグルタミン酸残基、及び/又は179位におけるアルギニン残基;アブリンのAサブユニットの164位におけるグルタミン酸残基及び/又は167位におけるアルギニン;トリコサンチンの70位におけるチロシン残基、160位におけるグルタミン酸残基、163位におけるアルギニン残基、及び/又は192位におけるトリプトファン残基;ミトギリンの49及び136位におけるヒスチジン残基、95位におけるグルタミン酸残基、並びに/又は120位におけるアルギニン;レストリクトシンの47位におけるチロシン残基並びに/又は49及び136位におけるヒスチジン残基;ジフテリア毒素の50及び153位におけるトリプトファン残基、65位におけるチロシン残基、並びに/又は148位におけるアスパラギン酸残基の復帰誘導体が、想定される誘導体である。
野生型ポリペプチド配列の他の変化であって、リボ毒性領域の触媒機能にそれほど不可欠ではない変化は、産生される誘導体である細胞毒性ポリペプチド内で維持してもよく、このような分子の産生は、任意の方法ステップ内で想定される。
C.リボ毒性に対する分子阻害剤の存在下におけるスクリーニング、選択、及び濃縮
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法であって、細胞毒性タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数のタンパク質を用意するステップであり、各タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含むステップと;(b)リボ毒性領域の阻害剤
の存在下で、複数のタンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴う1又は2以上のタンパク質を選択するステップと;(d)選択されたタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
本発明の一実施形態は、1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法であって、細胞毒性タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数のタンパク質を用意するステップであり、各タンパク質が、(1)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、(2)ポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含むステップと;(b)リボ毒性領域の阻害剤
の存在下で、複数のタンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴う1又は2以上のタンパク質を選択するステップと;(d)選択されたタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップとを含む方法である。
本発明の別の実施形態は、1又は2以上の細胞毒性融合ポリペプチドを同定するための方法であって、細胞毒性融合ポリペプチドが、(1)リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、(2)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域とを含み、(a)複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドから構築された、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップであり、各融合ポリペプチドが、(1)少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と、(2)リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、(b)複数の融合ポリペプチドが産生されるように、多様な核酸の発現ライブラリーを発現させるステップとを含むステップと;(c)リボ毒性領域の阻害剤の存在下で、産生された融合ポリペプチドの中から、発現させた融合ポリペプチドであり、特異的な特徴を伴う融合ポリペプチドを選択するステップと、(d)選択された融合ポリペプチド配列であり、前記リボ毒性領域と融合させた前記結合領域を含む配列を同定するステップとを含む方法である。
本明細書で言及される、リボ毒性領域「阻害剤」とは、酵素活性アッセイ、例えば、インビトロにおけるリボソーム阻害により測定されるリボ毒性など、リボ毒性領域のリボ毒性を阻害する、任意の化学物質、組成物、又は化合物である。阻害剤は、RIPのN−グリコシダーゼ活性、コリックス毒素のADPリボシル化活性、及び/又は真菌性リボ毒素のRNアーゼ活性を低減することが典型的である。「リボ毒性領域阻害剤」という用語は、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ペプチド、核酸、ポリペプチド、免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリン、及び4−アミノピラゾロ[3,4−d]ピリミジン(4−APP)などの化学物質などの低分子を含む。スクリーニングステップにおけるある特定のリボ毒性活性の阻害は、ペプチド、ポリペプチド、又は免疫グロブリンドメインの付加又は発現を介して達成しうる他、スクリーニングステップにおいて存在するリボソームの少なくとも一部の不活性化を回避する系に寄与する、ある特定のヌクレオシド、ヌクレオチド、ペプチド、リボソームRNAなどの核酸、ポリペプチド、及び/又はリボソームタンパク質などのタンパク質のレベルに影響を及ぼす、ミュータント遺伝子型を伴う宿主細胞の使用を介しても達成することができる。
使用される阻害剤の量又は濃度は、阻害剤の存在下で、リボ毒性領域が、例えば、当業者に公知のアッセイなど、リボ毒性領域についての適切なアッセイを介して、リボ毒性活性の低減を呈示するように、リボ毒性領域のリボ毒性を阻害するのに十分でなければならない。リボ毒性領域活性は、アッセイにおいて、リボ毒性領域の酵素活性が、同じアッセイの阻害剤の非存在下におけるリボ毒性領域の活性と比較して、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%となるように阻害することができる。
D.タンパク質ディスプレイスクリーニング
一般に、タンパク質ディスプレイスクリーニングは、1)多様なメンバーから構成される分子ライブラリーを調製するステップと、2)ポリペプチドの分子ライブラリーを発現させるステップと、3)ポリペプチドを生物学的特徴についてスクリーニングするステップと、4)特徴が陽性と推定されるポリペプチドを同定するステップとを含む。
一般に、タンパク質ディスプレイスクリーニングは、1)多様なメンバーから構成される分子ライブラリーを調製するステップと、2)ポリペプチドの分子ライブラリーを発現させるステップと、3)ポリペプチドを生物学的特徴についてスクリーニングするステップと、4)特徴が陽性と推定されるポリペプチドを同定するステップとを含む。
第1のステップは、変化させたポリペプチド配列をコードすることが可能な、多様な核酸(遺伝子型)から構成される発現ライブラリーを創出又は獲得することを伴うことが典型的である。次いで、発現ライブラリーは、それをコードする核酸(すなわち、その遺伝
子型)への物理的接続を維持しながら、ライブラリーのポリペプチドを提示するように発現させる。提示することとは、ポリペプチドが、溶液中の分子、又は不動のプラットフォーム上、マイクロビーズ上、及び/若しくは細胞表面上に固定化された分子に結合するか、又は結合させるのに接触可能であることを意味する(例えば、Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013)を参照されたい)。これにより、多様なスクリーニングステップを、提示されたライブラリーポリペプチド上で実施して、所望される特徴、すなわち、表現型を選択することが可能となる。スクリーニングにおいて、提示されたポリペプチドであって、所望される表現型を伴うポリペプチドに「ヒット」したら、物理的にカップリングさせた遺伝子型を回収して、その表現型を付与するポリペプチド配列を同定することができる。加えて、遺伝子型(特定の核酸クローン)を使用して、1)個別化研究のためのポリペプチドを産生することもでき、及び/又は2)ライブラリーのメンバーとしてのクローンを、後続のライブラリースクリーニングのために繁殖させることもできる。
子型)への物理的接続を維持しながら、ライブラリーのポリペプチドを提示するように発現させる。提示することとは、ポリペプチドが、溶液中の分子、又は不動のプラットフォーム上、マイクロビーズ上、及び/若しくは細胞表面上に固定化された分子に結合するか、又は結合させるのに接触可能であることを意味する(例えば、Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013)を参照されたい)。これにより、多様なスクリーニングステップを、提示されたライブラリーポリペプチド上で実施して、所望される特徴、すなわち、表現型を選択することが可能となる。スクリーニングにおいて、提示されたポリペプチドであって、所望される表現型を伴うポリペプチドに「ヒット」したら、物理的にカップリングさせた遺伝子型を回収して、その表現型を付与するポリペプチド配列を同定することができる。加えて、遺伝子型(特定の核酸クローン)を使用して、1)個別化研究のためのポリペプチドを産生することもでき、及び/又は2)ライブラリーのメンバーとしてのクローンを、後続のライブラリースクリーニングのために繁殖させることもできる。
スクリーニングサイクルは、所望される特性を伴う、より好適なポリペプチドを同定するために、ライブラリー上で反復して実施することができる。例えば、当初極めて複雑なライブラリーも、スクリーニング、選択、濃縮、及び/又は「バイオパニング」の反復ラウンドにより、複雑性を低減することができる。同様に、多様な合成ポリペプチドのコレクションを、タンパク質ディスプレイスクリーニング及び変異誘発の反復サイクルにより、インビトロにおける進化にかけることもできる。スクリーニングの各ラウンドでは、適合性が最も大きなライブラリーのメンバーが優先的に濃縮される一方で、適合性がそれほど大きくない分子は、優先的に失われる結果として、反復による選択ステップを伴う時間と共に、それらの分子配列が変化し、それらの表示も変化するので、一層濃縮されたライブラリーがもたらされる。
加えて、複数の選択分取基準を同時又は逐次的に使用して、複数の特徴を同時に選択することもできる。例えば、元のライブラリーの、既に濃縮されたサブセットに対して、異なる選択基準を使用して、先行するスクリーニングステップで既に選択された特徴以外の特徴を選択するために、複数のスクリーニングラウンドを使用することもできる。
スクリーニングにより選択及び回収しうるのは、実在するメンバーだけであるため、ディスプレイスクリーニングでは、ライブラリーの量、複雑性、組成、及びサイズが、その有効性に肝要である。一般に、目標は、発現させたライブラリーのポリペプチドメンバーが、それらのポリペプチド配列において高度に異質であるように、可能な限り大規模で多様な発現ライブラリーを有することである。発現ライブラリーの複雑性は一般に、配列ランダム化合成核酸及び/又は核酸断片組換え/シャフリングを使用する、ライブラリーをコードする核酸の変異誘発及び/又はコンビナトリアルアセンブリーにより達成される。
本発明のタンパク質及びポリペプチドの結合領域は、例えば、リガンド、免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン、操作された抗体の誘導体、及び操作された抗体の代替物などに由来する多様なポリペプチド配列に由来しうる。免疫グロブリン型結合領域は、天然の免疫グロブリン、半合成の免疫グロブリン、合成の免疫グロブリン、又は操作された抗体の代替物に由来しうる(Tohidkia M et al., J Drug Target 20: 195-208 (2012); de Marco A,Crit Rev Biotechnol 33: 40-8 (2013))。こうして、スクリーニングのために使用されるポリペプチドをコードする、本発明の発現ライブラリーは、これらの同じ供給源に由来しうる。
免疫グロブリン及び/又は免疫グロブリンドメインをコードするポリヌクレオチドは、免疫化脊椎動物ドナー又は非免疫化脊椎動物ドナーの免疫グロブリンレパートリーから得ることができる(Bradbury A, Marks J, J Immunol Methods 290: 29-49 (2004); Harel
Inbar N, Benhar I, Arch Biochem Biophys 526: 87-98 (2012))。DNA又はRNAを
コードする免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物、ウサギ、齧歯動物、又はサメなど、免疫化脊椎動物ドナーから得ることができる(例えば、Lonberg N et al., Nat Biotechnol 23: 1117-25 (2005); Kim S et al., JImmunol Methods 329: 176-83 (2008); Muyldermans S et al., Vet ImmunolImmunopathol 128: 178-83 (2009); Bell A et al., Cancer Let 289: 81-90 (2010);Cheong C et al., Blood 116: 3828-38 (2010); Moon S et al., Mol Cells 31: 509-13(2011); Zhu C et al., J Immunol 187: 2492-501 (2011); Tarr A et al., Heptaology58: 932-9 (2013)を参照されたい)。DNA又はRNA
をコードする免疫グロブリンは、例えば、がん、腫瘍、又は微生物に由来する免疫原への曝露の後などにおけるヒト患者の免疫細胞から得ることができる(例えば、Larralde O et al., J Virol Methods 140: 49-58 (2007); Kalnina Z etal., J Immunol Methods 334: 37-50 (2008); Zhao A et al., J Immunol Methods 363:221-32 (2010); Xin L et al., Front Biosci (Landmark ed) 18: 765-72 (2013)を参照されたい)。脊椎動物は、例えば、所望される標的タンパク質に由来するタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、プロテオグリカン、脂質、糖脂質、炭水化物、腫瘍細胞、又は細胞内病原体などの抗原及び/又は免疫原で意図的に免疫化することができる。例えば、脊椎動物は、それらの細胞に特異的に結合する免疫グロブリンドメインを同定するために、特異的がん細胞で免疫化することができる(例えば、Baral T et al., J Immunol Methods 371: 70-80 (2011)を
参照されたい)。ヒト免疫グロブリン遺伝子配列で遺伝子改変された動物は、例えば、ヒト新生児Fc受容体を発現させるトランスジェニックウサギを使用することなどを介する、ヒト化免疫グロブリンの容易な創出を可能とする(Kacskovics I et al., MAbs 3: 431-9 (2011))。加えて、完全ヒト免疫グロブリンレパートリー及び完全ヒトモノクローナ
ル免疫グロブリンは、ヒト抗体遺伝子配列を発現させる免疫化トランスジェニックマウスからも作製することができる(LonbergN, Curr Opin Immunol 20: 450-9 (2008); Schultz L et al., Nat Rev Immunol 12:786-98 (2012))。
Inbar N, Benhar I, Arch Biochem Biophys 526: 87-98 (2012))。DNA又はRNAを
コードする免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物、ウサギ、齧歯動物、又はサメなど、免疫化脊椎動物ドナーから得ることができる(例えば、Lonberg N et al., Nat Biotechnol 23: 1117-25 (2005); Kim S et al., JImmunol Methods 329: 176-83 (2008); Muyldermans S et al., Vet ImmunolImmunopathol 128: 178-83 (2009); Bell A et al., Cancer Let 289: 81-90 (2010);Cheong C et al., Blood 116: 3828-38 (2010); Moon S et al., Mol Cells 31: 509-13(2011); Zhu C et al., J Immunol 187: 2492-501 (2011); Tarr A et al., Heptaology58: 932-9 (2013)を参照されたい)。DNA又はRNA
をコードする免疫グロブリンは、例えば、がん、腫瘍、又は微生物に由来する免疫原への曝露の後などにおけるヒト患者の免疫細胞から得ることができる(例えば、Larralde O et al., J Virol Methods 140: 49-58 (2007); Kalnina Z etal., J Immunol Methods 334: 37-50 (2008); Zhao A et al., J Immunol Methods 363:221-32 (2010); Xin L et al., Front Biosci (Landmark ed) 18: 765-72 (2013)を参照されたい)。脊椎動物は、例えば、所望される標的タンパク質に由来するタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、プロテオグリカン、脂質、糖脂質、炭水化物、腫瘍細胞、又は細胞内病原体などの抗原及び/又は免疫原で意図的に免疫化することができる。例えば、脊椎動物は、それらの細胞に特異的に結合する免疫グロブリンドメインを同定するために、特異的がん細胞で免疫化することができる(例えば、Baral T et al., J Immunol Methods 371: 70-80 (2011)を
参照されたい)。ヒト免疫グロブリン遺伝子配列で遺伝子改変された動物は、例えば、ヒト新生児Fc受容体を発現させるトランスジェニックウサギを使用することなどを介する、ヒト化免疫グロブリンの容易な創出を可能とする(Kacskovics I et al., MAbs 3: 431-9 (2011))。加えて、完全ヒト免疫グロブリンレパートリー及び完全ヒトモノクローナ
ル免疫グロブリンは、ヒト抗体遺伝子配列を発現させる免疫化トランスジェニックマウスからも作製することができる(LonbergN, Curr Opin Immunol 20: 450-9 (2008); Schultz L et al., Nat Rev Immunol 12:786-98 (2012))。
免疫グロブリンに由来する結合領域を伴う大規模ライブラリーは、免疫化供給源に由来する場合もあり、非免疫化供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もある。ライブラリー構築のコンビナトリアル法は、結合領域のより大規模なレパートリーを探索するための、より大規模でより多様な、合成ライブラリー又は半合成ライブラリーの作製を可能とする。コンビナトリアルポリヌクレオチドライブラリーは、免疫化ドナーに由来する免疫グロブリンをコードする核酸配列から構築することもでき、ナイーブ供給源又はバイアスのかからない供給源としてもまた公知の、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリンをコードする核酸配列から構築することもできる(Harel Inbar N, Benhar I, Arch Biochem Biophys 526: 87-98 (2012))。例えば、タンパク質ディスプレイスクリー
ニングは、所与の免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリン、又は免疫グロブリンレパートリーを取り巻く多様性を操作するように分子生物学法を使用して、免疫グロブリンに由来する配列を含む、大規模な合成ライブラリー又は半合成ライブラリーに対して実施することができる(Hoogenboom H, Winter G, J Mol Biol 227: 381-8 (1992); Barbas C etal., Proc Natl Acad Sci USA 89: 4457-61 (1992); Marks J et al., J Mol Biol 222:581-97 (1991); van Wyngaardt W et al., BMC Biotechnol 4: 6 (2004); Deschacht Net al., J Immunol 184: 5696-704 (2010))。加えて、免疫グロブリンの開発は、今や、
合成ライブラリーを使用することにより、脊椎動物免疫系を伴わずに達成することもできる(例えば、BradburyA et al., Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011)を参照されたい)
。
ニングは、所与の免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリン、又は免疫グロブリンレパートリーを取り巻く多様性を操作するように分子生物学法を使用して、免疫グロブリンに由来する配列を含む、大規模な合成ライブラリー又は半合成ライブラリーに対して実施することができる(Hoogenboom H, Winter G, J Mol Biol 227: 381-8 (1992); Barbas C etal., Proc Natl Acad Sci USA 89: 4457-61 (1992); Marks J et al., J Mol Biol 222:581-97 (1991); van Wyngaardt W et al., BMC Biotechnol 4: 6 (2004); Deschacht Net al., J Immunol 184: 5696-704 (2010))。加えて、免疫グロブリンの開発は、今や、
合成ライブラリーを使用することにより、脊椎動物免疫系を伴わずに達成することもできる(例えば、BradburyA et al., Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011)を参照されたい)
。
免疫グロブリン由来ポリペプチドに加えて、他のポリペプチドベースの結合性ドメインも操作されており、これらの一部は、抗体模倣体又は抗体足場と称されている(Worn A, Plueckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al.,Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62(2004); Binz H et al., N
at Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23:1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A,Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Zoller F et al., Molecules 16:2467-85 (2011))。これらの操作された免疫グロブリン型結合性ドメインは、サイズが比較的小型であり、抗体と類似する広範な標的分子に対する高アフィニティーを呈示し、これらに特異的に結合することが可能である。例えば、ヒトフィブロネクチンベースの足場を、RNAディスプレイ法で使用して、ヒト血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)に対する結合剤であって、メンバーを1013とするナイーブライブラリーに由来し、結合アフィニティーを解離定数で最大60ピコモルとする結合剤を同定し(Getmanova E et al., Chem Biol 13: 549-56 (2006));酵母ディスプレイでは、メンバーを108とするライブラリー
から、解離定数を最大51ピコモルとする、ヒトEGFRの結合剤を見出し(Hackel B, Wittrup K,Protein Eng Des Sel. 23: 211-9 (2010))、ファージディスプレイでは、最大の解離定数を7ナノモルとする、Abl SH2に対する結合剤を見出した(Wojcik J
et al., Nat Struct Mol Biol 17: 519-27 (2010))。
at Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23:1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A,Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Zoller F et al., Molecules 16:2467-85 (2011))。これらの操作された免疫グロブリン型結合性ドメインは、サイズが比較的小型であり、抗体と類似する広範な標的分子に対する高アフィニティーを呈示し、これらに特異的に結合することが可能である。例えば、ヒトフィブロネクチンベースの足場を、RNAディスプレイ法で使用して、ヒト血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)に対する結合剤であって、メンバーを1013とするナイーブライブラリーに由来し、結合アフィニティーを解離定数で最大60ピコモルとする結合剤を同定し(Getmanova E et al., Chem Biol 13: 549-56 (2006));酵母ディスプレイでは、メンバーを108とするライブラリー
から、解離定数を最大51ピコモルとする、ヒトEGFRの結合剤を見出し(Hackel B, Wittrup K,Protein Eng Des Sel. 23: 211-9 (2010))、ファージディスプレイでは、最大の解離定数を7ナノモルとする、Abl SH2に対する結合剤を見出した(Wojcik J
et al., Nat Struct Mol Biol 17: 519-27 (2010))。
コンビナトリアル構築、変異、及び遺伝子組換えなどにより、分子ライブラリーへと多様性を導入するための多様な方法が存在する(Miersch S, Sidhu S, Methods 57: 486-98
(2012)を参照されたい)。例えば、変異は、ミューテーター大腸菌株内の増殖、DNA
シャフリング、エラープローンPCR、部位指向変異誘発、カセット変異誘発、ポリヌクレオチドモジュールシャフリング、コスミックスプレクシング、及び/又はトリヌクレオチドバリアントなど、ポリヌクレオチド構成要素のランダム変化により達成することができる(例えば、Stemmer W, Nature 370: 389-91 (1994); Virnekas B et al., NucleicAcids Res 22: 5600-7 (1994); Kayushin A et al., Nucleic Acids Res 24: 3748-55(1996); Zhao H, Arnold F, Nucleic Acids Res 25:1307-8 (1997); Harayama S,Trends Biotechnol 16: 76-82 (1998); Zhao H et al., Nat Biotechnol 16: 258-261(1998); Horst J et al., Trends Microbiol 7: 29-36 (1999); Coia G et al., JImmunol Methods 251: 187-93 (2001); Collins J et al., J Biotechnol 74: 317-38(2001); Hayes R et
al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 15926-31 (2002); Wang L et al., Proc Natl AcadSci USA 101: 16745-9 (2004); Mena M, Daugherty P, Protein Eng Des Sel 18:559-61
(2005); Bratkovic T, Cell Mol Life Sci 67: 749-67 (2010); Labrou N et al., Curr
Protein Pept Sci 11: 91-100 (2010); Mandrup O et al., PLoS One 8: e76834 (2013)を参照されたい)。変異誘発とコンビナトリアルアセンブリーとは、例えば、特異的免疫グロブリンCDR領域など、選択された部分領域、カセット、及び/又はモジュールを使用して組み合わせることができる(例えば、Chen W et al., Mol Immunol 47: 912-21 (2010)を参照されたい)。変異誘発法及び/又は組換え法を使用して、哺乳動物の免疫応答時に天然で生じるV(D)J組換え過程を模倣することができる(King D et al., Curr Drug Discov Technol 11: 56-64 (2014))。多様性は、第1の選択ステップの前、並びにバイアス群の中から選択される特性を改善するためのライブラリー濃縮の後の両方において導入することができる。
(2012)を参照されたい)。例えば、変異は、ミューテーター大腸菌株内の増殖、DNA
シャフリング、エラープローンPCR、部位指向変異誘発、カセット変異誘発、ポリヌクレオチドモジュールシャフリング、コスミックスプレクシング、及び/又はトリヌクレオチドバリアントなど、ポリヌクレオチド構成要素のランダム変化により達成することができる(例えば、Stemmer W, Nature 370: 389-91 (1994); Virnekas B et al., NucleicAcids Res 22: 5600-7 (1994); Kayushin A et al., Nucleic Acids Res 24: 3748-55(1996); Zhao H, Arnold F, Nucleic Acids Res 25:1307-8 (1997); Harayama S,Trends Biotechnol 16: 76-82 (1998); Zhao H et al., Nat Biotechnol 16: 258-261(1998); Horst J et al., Trends Microbiol 7: 29-36 (1999); Coia G et al., JImmunol Methods 251: 187-93 (2001); Collins J et al., J Biotechnol 74: 317-38(2001); Hayes R et
al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 15926-31 (2002); Wang L et al., Proc Natl AcadSci USA 101: 16745-9 (2004); Mena M, Daugherty P, Protein Eng Des Sel 18:559-61
(2005); Bratkovic T, Cell Mol Life Sci 67: 749-67 (2010); Labrou N et al., Curr
Protein Pept Sci 11: 91-100 (2010); Mandrup O et al., PLoS One 8: e76834 (2013)を参照されたい)。変異誘発とコンビナトリアルアセンブリーとは、例えば、特異的免疫グロブリンCDR領域など、選択された部分領域、カセット、及び/又はモジュールを使用して組み合わせることができる(例えば、Chen W et al., Mol Immunol 47: 912-21 (2010)を参照されたい)。変異誘発法及び/又は組換え法を使用して、哺乳動物の免疫応答時に天然で生じるV(D)J組換え過程を模倣することができる(King D et al., Curr Drug Discov Technol 11: 56-64 (2014))。多様性は、第1の選択ステップの前、並びにバイアス群の中から選択される特性を改善するためのライブラリー濃縮の後の両方において導入することができる。
タンパク質ディスプレイスクリーニングは、多数の選択された特徴に基づく選択ステップ及び/又は濃縮ステップを伴いうる(Gloeckler J et al., Molecules 15: 2478-90 (2010); Boersma Y,Plueckthun A, Curr Opin Biotechnol 22: 849-57 (2011); Bradbury A et al., NatureBiotech 29: 245-54 (2011)を参照されたい)。一般に、分子間相互作用については、例えば、自己相互作用ナノ粒子分光法(SINS,self-interaction nanoparticle spectroscopy)、アフィニティークロマトグラフィー、表面結合による標的の固定化、酵素免疫測定アッセイ、表面プラズモン共鳴結合などの結合アッセイを使用することにより(例えば、BIAcore)、及びフローサイトメトリーによりスクリーニングする
(例えば、Leonard P et al., J Immunol Methods 323: 172-9(2007); Mazor Y et al.,
J Immunol Methods 321: 41-59 (2007); Jeong K et al., Proc Natl Acad Sci USA 104
: 8247-52 (2007); Bengali A, Tessier P et al., Biotechnol Bioeng 104: 240-50(2009); Turunen L et al., J Biomol Screen 14: 282-93 (2009); Yabe T et al., JBiol Chem 286: 12397-406 (2011); Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26:713-24 (2013); Habib I et al., Anal Biochem 438: 82-9 (2013); Salema V et al.,PLoS One 8: e75126 (2013); Wu Y et al., Int J Mol Med 32: 1451-7 (2013);Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014)を参照されたい)。選択は、精製された標的を
使用して実施することもでき、数百に及ぶ潜在的抗原を同時に提示する全細胞に対して実施することもできる。例えば、腫瘍関連抗原結合性タンパク質は、所望の抗原を発現させる全細胞に対するタンパク質ディスプレイライブラリースクリーニングを使用して選択することができる(例えば、Pavoni E et al., Mol Immunol 57: 317-22 (2014)を参照されたい)。
(例えば、Leonard P et al., J Immunol Methods 323: 172-9(2007); Mazor Y et al.,
J Immunol Methods 321: 41-59 (2007); Jeong K et al., Proc Natl Acad Sci USA 104
: 8247-52 (2007); Bengali A, Tessier P et al., Biotechnol Bioeng 104: 240-50(2009); Turunen L et al., J Biomol Screen 14: 282-93 (2009); Yabe T et al., JBiol Chem 286: 12397-406 (2011); Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26:713-24 (2013); Habib I et al., Anal Biochem 438: 82-9 (2013); Salema V et al.,PLoS One 8: e75126 (2013); Wu Y et al., Int J Mol Med 32: 1451-7 (2013);Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014)を参照されたい)。選択は、精製された標的を
使用して実施することもでき、数百に及ぶ潜在的抗原を同時に提示する全細胞に対して実施することもできる。例えば、腫瘍関連抗原結合性タンパク質は、所望の抗原を発現させる全細胞に対するタンパク質ディスプレイライブラリースクリーニングを使用して選択することができる(例えば、Pavoni E et al., Mol Immunol 57: 317-22 (2014)を参照されたい)。
多数ラウンドにわたり実施される選択は、スクリーニングされるライブラリーの多様性、任意の陽性ヒットのアフィニティー、選択の厳密性、及び任意の増幅バイアスの存在に依存することが多い。陰性選択ステップを使用して、多特異性試薬の使用を含む、非特異的結合剤又は非選択的結合剤を枯渇させることができる(Siva A et al., J Immunol Methods 330: 109-19 (2008); Xu Y et al.,Protein Eng Des Sel 26: 663-70 (2013)を参
照されたい)。核酸シークエンシングステップにより、例えば、リボソームディスプレイなどにより大規模ライブラリーをスクリーニングする効率を改善することができる(例えば、Larman H et al., Proc Natl Acad Sci USA 109: 18523-8 (2012); Hoen Pet al., Anal Biochem 421: 622-31 (2012); Larman H et al., Nat Protoc 9: 90-103(2014)を
参照されたい)。
照されたい)。核酸シークエンシングステップにより、例えば、リボソームディスプレイなどにより大規模ライブラリーをスクリーニングする効率を改善することができる(例えば、Larman H et al., Proc Natl Acad Sci USA 109: 18523-8 (2012); Hoen Pet al., Anal Biochem 421: 622-31 (2012); Larman H et al., Nat Protoc 9: 90-103(2014)を
参照されたい)。
大半の例は、免疫グロブリンに由来する結合性ドメインを伴うが、また、免疫グロブリンの代替物として考えられる他のポリペプチドベースの結合性ドメインも、同じ方法又は類似の方法を使用して、特異的な分子間相互作用についてスクリーニングすることに成功している(例えば、Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-1268 (2005); Binz H,Plueckthun A, Curr Opin Biotechnol 16: 459-69 (2005); Chao G et al., Nat Protoc1:
755-68 (2006); Paschke M, Appl Microbiol Biotechnol 70: 2-11 (2006); Zahnd C et
al., Nat Methods 4: 269-79 (2007); Skerra A, Curr Opin Biotechnol 18: 295-304(2007)を参照されたい)。導出される非免疫グロブリンである、免疫グロブリン型結合領
域のスクリーニング及び同定の例については、Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42(2002); Hackel B et al., J Mol Biol 381: 1238-52 (2008); Skerra A, FEBS J 275:2677-83 (2008); Saerens D et al., J Immunol Methods 329: 138-50 (2008); BloomL, Calabro V, Drug Discov Today 14: 949-55 (2009); Gebauer M, Skerra A, CurrOpin Chem Biol 13: 245-55 (2009); Liao H et al., J Biol Chem 284: 17512-20(2009); Lloyd C et al., Protein Eng Des Sel 22: 159-68 (2009); Hackle B,Wittrup K, Protein Eng Des Sel 23: 211-9 (2010); Hackel B et al., J Mol Biol401: 84-96 (2010); Lipovsek D, Protein Eng Des Sel 24 3-9 (2011); Tillib S etal., Acta Nature 2: 85-93 (2010); Wojcik J et al., Nat Struct Mol Biol 17:519-27 (2010); Zahnd C et al., Cancer Res 70: 1595-605 (2010); Boersma Y,Plueckthun A, Curr Opin Biotechnol 22: 849-57 (2011); Gebauer M, Skerra A,Methods Enzymol 503: 157-88 (2012); Jacobs S
et al., Protein Eng Des Sel 25: 107-17 (2012); Koide S et al., Methods Enzymol503: 135-56 (2012); Chen T et al., Methods Enzymol 523: 303-26 (2013))を参照さ
れたい。
755-68 (2006); Paschke M, Appl Microbiol Biotechnol 70: 2-11 (2006); Zahnd C et
al., Nat Methods 4: 269-79 (2007); Skerra A, Curr Opin Biotechnol 18: 295-304(2007)を参照されたい)。導出される非免疫グロブリンである、免疫グロブリン型結合領
域のスクリーニング及び同定の例については、Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42(2002); Hackel B et al., J Mol Biol 381: 1238-52 (2008); Skerra A, FEBS J 275:2677-83 (2008); Saerens D et al., J Immunol Methods 329: 138-50 (2008); BloomL, Calabro V, Drug Discov Today 14: 949-55 (2009); Gebauer M, Skerra A, CurrOpin Chem Biol 13: 245-55 (2009); Liao H et al., J Biol Chem 284: 17512-20(2009); Lloyd C et al., Protein Eng Des Sel 22: 159-68 (2009); Hackle B,Wittrup K, Protein Eng Des Sel 23: 211-9 (2010); Hackel B et al., J Mol Biol401: 84-96 (2010); Lipovsek D, Protein Eng Des Sel 24 3-9 (2011); Tillib S etal., Acta Nature 2: 85-93 (2010); Wojcik J et al., Nat Struct Mol Biol 17:519-27 (2010); Zahnd C et al., Cancer Res 70: 1595-605 (2010); Boersma Y,Plueckthun A, Curr Opin Biotechnol 22: 849-57 (2011); Gebauer M, Skerra A,Methods Enzymol 503: 157-88 (2012); Jacobs S
et al., Protein Eng Des Sel 25: 107-17 (2012); Koide S et al., Methods Enzymol503: 135-56 (2012); Chen T et al., Methods Enzymol 523: 303-26 (2013))を参照さ
れたい。
例えば、細胞への内部化など、結合アフィニティー以外の特徴も、選択することができる(例えば、BecerrilB et al., Biochem Biphys Res Commun 255: 386-93 (1999); Zhou Y et al., J MolBiol 404: 88-99 (2010); Zou Y, Marks J, Methods Enzymol 502: 43-66 (2012);国際特許公開第2006/072773号パンフレット;米国特許出願公
開第2007/0298430号明細書を参照されたい)。
開第2007/0298430号明細書を参照されたい)。
タンパク質ディスプレイライブラリー内で、結合領域を同定又は濃縮した後で、場合によって、「成熟」と称される工程における、さらなるディスプレイライブラリーの選択により、結合領域を、所望される特徴について改善することができる(例えば、Prabakaran
P et al., Front Microbiol 3: 277 (2012); Renaut L et al., Methods Mol Biol 907:
451-61 (2012)を参照されたい)。例えば、真核細胞ディスプレイは、アフィニティー成熟について、大きな成功を収めている(Boder E et al., Proc Natl Acad Sci USA 97: 10701-5 (2000); Pepper Let al., Comb Chem High Throughput Screen 11: 127-34 (2008))。他の例では、アフィニティー成熟は、大規模な免疫グロブリンライブラリーのランダム変異誘発を使用して、インビトロにおいて達成された(Hanes J et al., Nat Biotechnol 18: 1287-92 (2000); Kim H et al., JImmunol Methods 372: 146-61 (2011))。
アフィニティー成熟は、例えば、アンキリンリピートモチーフ含有ポリペプチドなど、免疫グロブリンの代替的足場上で実施されている(Zahnd C et al., J Mol Biol 369: 1015-28 (2007))。これらの方法では、結合アフィニティーが、自然発生の抗体について観察されるいかなる結合アフィニティーよりも高度な、免疫グロブリン結合領域が同定されている(Boder E et al., Proc Natl Acad Sci USA 97: 10701-5 (2000); Hanes Jet al.,
Nat Biotechnol 18: 1287-1292 (2000); Lee C et al., J Mol Biol 340: 1073-93(2004); Razai A et al., J Mol Biol 351: 158-69 (2005); Geyer C et al., MethodsMol Biol 901: 11-32 (2012))。しかし、合成のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ
ーについてのファージディスプレイを使用して、長時間を要するアフィニティー成熟ステップに対する必要なしに、高アフィニティーのヒト抗体が見出された(Hoet R et al., Nat Biotechnol 23: 344-8 (2005))。加えて、ディスプレイライブラリースクリーニングを使用して、高アフィニティー標的と無関係な結合領域の結合特異性及び既存の弱い結合の存在に基づく相同な標的に対する結合特異性を進化させることができる(Bostrom J et
al., Science 323: 1610-4 (2009))。
P et al., Front Microbiol 3: 277 (2012); Renaut L et al., Methods Mol Biol 907:
451-61 (2012)を参照されたい)。例えば、真核細胞ディスプレイは、アフィニティー成熟について、大きな成功を収めている(Boder E et al., Proc Natl Acad Sci USA 97: 10701-5 (2000); Pepper Let al., Comb Chem High Throughput Screen 11: 127-34 (2008))。他の例では、アフィニティー成熟は、大規模な免疫グロブリンライブラリーのランダム変異誘発を使用して、インビトロにおいて達成された(Hanes J et al., Nat Biotechnol 18: 1287-92 (2000); Kim H et al., JImmunol Methods 372: 146-61 (2011))。
アフィニティー成熟は、例えば、アンキリンリピートモチーフ含有ポリペプチドなど、免疫グロブリンの代替的足場上で実施されている(Zahnd C et al., J Mol Biol 369: 1015-28 (2007))。これらの方法では、結合アフィニティーが、自然発生の抗体について観察されるいかなる結合アフィニティーよりも高度な、免疫グロブリン結合領域が同定されている(Boder E et al., Proc Natl Acad Sci USA 97: 10701-5 (2000); Hanes Jet al.,
Nat Biotechnol 18: 1287-1292 (2000); Lee C et al., J Mol Biol 340: 1073-93(2004); Razai A et al., J Mol Biol 351: 158-69 (2005); Geyer C et al., MethodsMol Biol 901: 11-32 (2012))。しかし、合成のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ
ーについてのファージディスプレイを使用して、長時間を要するアフィニティー成熟ステップに対する必要なしに、高アフィニティーのヒト抗体が見出された(Hoet R et al., Nat Biotechnol 23: 344-8 (2005))。加えて、ディスプレイライブラリースクリーニングを使用して、高アフィニティー標的と無関係な結合領域の結合特異性及び既存の弱い結合の存在に基づく相同な標的に対する結合特異性を進化させることができる(Bostrom J et
al., Science 323: 1610-4 (2009))。
ヒト免疫グロブリンに由来するディスプレイスクリーニングライブラリーを作製するための特異的方法が存在する(CasaliP et al., Science 234: 476-9 (1986); Weitkamp J
et al., J Immunol Methods 275; 223-37 (2003); Tiller T et al., J. ImmunolMethods 329: 112-24 (2008); Scheid J et al., J Immunol Methods 343: 65-7(2009); Scheid J et al., Nature 458: 636-40 (2009); Di Niro R et al, J Immunol185: 5377-83 (2010); Di Niro R et al., Nature Med 18: 441-5 (2012))。例えば、免疫グロブリン
ディスプレイライブラリーは、ヒト骨髄、末梢血、及びヒト脾臓B細胞から作製することができる(Marasco W,Sui J, Nature Biotech 25: 1421-34 (2007))。ヒト免疫細胞は
、フローサイトメトリーを使用して、全末梢血単核細胞集団、メモリーB細胞、形質芽球、血漿細胞、活性化B細胞、及び/又はナイーブB細胞の中から選択するように分取された細胞でありうる。次いで、核酸を、スクリーニングのための免疫グロブリンライブラリーを構築するために、これらの試料からクローニングする。それらの表面上で免疫グロブリンを発現させるB細胞は、単一細胞発現のクローニングを使用することなどにより、スクリーニングのための免疫グロブリンライブラリーを構築する前に、標的への結合についてあらかじめ分取することができる(Lanzavecchia A et al., Curr Opin Biotechnol 18: 523-8 (2007))。一般に、重鎖領域及び軽鎖領域を、個別にクローニングし、スクリーニングのためのライブラリーを構築するときに組み換える。重鎖領域及び軽鎖領域のシャフリングにより、高アフィニティーの結合剤を探索及び同定するための免疫グロブリン結合空間の多様性の増大をもたらすことができる(Marks J et al., Biotechnology 10: 779-83 (1992))。
et al., J Immunol Methods 275; 223-37 (2003); Tiller T et al., J. ImmunolMethods 329: 112-24 (2008); Scheid J et al., J Immunol Methods 343: 65-7(2009); Scheid J et al., Nature 458: 636-40 (2009); Di Niro R et al, J Immunol185: 5377-83 (2010); Di Niro R et al., Nature Med 18: 441-5 (2012))。例えば、免疫グロブリン
ディスプレイライブラリーは、ヒト骨髄、末梢血、及びヒト脾臓B細胞から作製することができる(Marasco W,Sui J, Nature Biotech 25: 1421-34 (2007))。ヒト免疫細胞は
、フローサイトメトリーを使用して、全末梢血単核細胞集団、メモリーB細胞、形質芽球、血漿細胞、活性化B細胞、及び/又はナイーブB細胞の中から選択するように分取された細胞でありうる。次いで、核酸を、スクリーニングのための免疫グロブリンライブラリーを構築するために、これらの試料からクローニングする。それらの表面上で免疫グロブリンを発現させるB細胞は、単一細胞発現のクローニングを使用することなどにより、スクリーニングのための免疫グロブリンライブラリーを構築する前に、標的への結合についてあらかじめ分取することができる(Lanzavecchia A et al., Curr Opin Biotechnol 18: 523-8 (2007))。一般に、重鎖領域及び軽鎖領域を、個別にクローニングし、スクリーニングのためのライブラリーを構築するときに組み換える。重鎖領域及び軽鎖領域のシャフリングにより、高アフィニティーの結合剤を探索及び同定するための免疫グロブリン結合空間の多様性の増大をもたらすことができる(Marks J et al., Biotechnology 10: 779-83 (1992))。
選択ステップは、全身投与の後で組織特異的ターゲティングを同定する、インビボファージディスプレイを含む(BabickovaJ et al., Biotechnol Adv 31: 1247-59 (2013))
。ヒトモノクローナル抗体は、免疫化を、哺乳動物細胞ディスプレイ及びインビトロにおける体細胞超変異と組み合わせることにより同定することができる(McConnell A et al., PLoS ONE 7: e49458 (2012))。
。ヒトモノクローナル抗体は、免疫化を、哺乳動物細胞ディスプレイ及びインビトロにおける体細胞超変異と組み合わせることにより同定することができる(McConnell A et al., PLoS ONE 7: e49458 (2012))。
タンパク質ディスプレイ技術は、所望される特性を伴う生物学的配列の迅速な単離を可能とする。全てのタンパク質ディスプレイ技術では、ライブラリーメンバーを、提示されるタンパク質の表現型を、担体へと連結された遺伝子型へとカップリングさせる適切な担体上で提示する能力を活用する。タンパク質ディスプレイは、結合アフィニティー及び結合特異性を最適化するのに使用されることが典型的である(Levin A, Weiss G, Mol Biosyst 2: 49-57 (2006))。バクテリオファージディスプレイ(Sidhu S, Koide S, Curr Opin Struct Biol 17: 481-7 (2007))、細胞表面ディスプレイ(原核細胞又は真核細胞)
(Chao G et al., Nat Protoc 1: 755-68 (2006); Wu et al.,Trends Microbiol 16: 181-8 (2008); Loefblom J, Biotechnol J 6: 1115-29 (2011);Gera N et al., Methods 60: 15-26 (2013))、RNAディスプレイ、タンパク質−DNA連結ディスプレイ(Odegrip R et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-10 (2004);Reiersen H et al., Nucleic Acids Res 33: e10 (2005))、ビーズ表面ディスプレイ(Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013))、リボソームディスプレイ(Plueckthun A, Methods Mol Biol 805: 3-28 (2012))、及びウイルスディスプレイ(Jermutus L et al., Eur Biophys J 31: 179-84 (2002); Sepp A et al.,FEBS Lett 532, 455-9 (2002);米国特
許出願公開第2003/0186,374号明細書; Swers J et al., Nucleic AcidsRes 32: e36 (2004); Urban J et al., Nucleic Acids Res 33: e35 (2005); GranieriL et al., Chem Biol 17: 229-35 (2010))など、多様なタンパク質ディスプレイスクリーニング法が存在する。タンパク質ディスプレイの一部の非限定的な例については、下記でさらに開示する。
(Chao G et al., Nat Protoc 1: 755-68 (2006); Wu et al.,Trends Microbiol 16: 181-8 (2008); Loefblom J, Biotechnol J 6: 1115-29 (2011);Gera N et al., Methods 60: 15-26 (2013))、RNAディスプレイ、タンパク質−DNA連結ディスプレイ(Odegrip R et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-10 (2004);Reiersen H et al., Nucleic Acids Res 33: e10 (2005))、ビーズ表面ディスプレイ(Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013))、リボソームディスプレイ(Plueckthun A, Methods Mol Biol 805: 3-28 (2012))、及びウイルスディスプレイ(Jermutus L et al., Eur Biophys J 31: 179-84 (2002); Sepp A et al.,FEBS Lett 532, 455-9 (2002);米国特
許出願公開第2003/0186,374号明細書; Swers J et al., Nucleic AcidsRes 32: e36 (2004); Urban J et al., Nucleic Acids Res 33: e35 (2005); GranieriL et al., Chem Biol 17: 229-35 (2010))など、多様なタンパク質ディスプレイスクリーニング法が存在する。タンパク質ディスプレイの一部の非限定的な例については、下記でさらに開示する。
1.インビトロタンパク質ディスプレイプラットフォーム
インビトロタンパク質ディスプレイプラットフォームとは、スクリーニングステップ、選択ステップ、及び/又は濃縮ステップを、生体系を伴わずに実施しうるプラットフォームである。ファージディスプレイがおそらく最も成功し、日常的に使用される、インビトロタンパク質ディスプレイプラットフォームであるが、後年における、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びタンパク質−DNA連結系など、完全な無細胞インビトロタンパク質ディスプレイ系の開発により、なおより大規模な(例えば、固有のライブラリーメンバーを1×1015とする)ライブラリーの広範なスクリーニングが可能となっている。RNAディスプレイ及びリボソームディスプレイなど、完全なインビトロディスプレイ法の利点は、形質転換、トランスフェクションの最大効率などにより限定されることが典型的な、インビボにおけるクローニングステップの回避である。
インビトロタンパク質ディスプレイプラットフォームとは、スクリーニングステップ、選択ステップ、及び/又は濃縮ステップを、生体系を伴わずに実施しうるプラットフォームである。ファージディスプレイがおそらく最も成功し、日常的に使用される、インビトロタンパク質ディスプレイプラットフォームであるが、後年における、RNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びタンパク質−DNA連結系など、完全な無細胞インビトロタンパク質ディスプレイ系の開発により、なおより大規模な(例えば、固有のライブラリーメンバーを1×1015とする)ライブラリーの広範なスクリーニングが可能となっている。RNAディスプレイ及びリボソームディスプレイなど、完全なインビトロディスプレイ法の利点は、形質転換、トランスフェクションの最大効率などにより限定されることが典型的な、インビボにおけるクローニングステップの回避である。
a.ファージディスプレイスクリーニング
ファージディスプレイスクリーニングとは、広く使用されて大きな成功を収めたインビトロ法である(Geyer Cet al., Methods Mol Biol 901: 11-32 (2012); Zou Y, Marks J, Methods Enzymol502: 43-66 (2012))。一般的なファージディスプレイライブラリー
は、複雑性が1×106〜1×1010の範囲にあることが典型的であり、FDAで承認された多数の生物学的薬剤を開発するのに使用されている(Thie H et al., Curr Pharm Biotechnol 9: 439-46 (2008); Bratkovic T,Cell Mol Life Sci 67: 749-67 (2010))
。一般に、M13などの繊維状ファージ種は、pIII及びpVIIIなど、その大型のコート
タンパク質のうちの1つへとリンカーを介して融合させたポリペプチドを提示するのに使用される。ファージディスプレイスクリーニングは、免疫グロブリンに由来するポリペプチド、及び、例えば、がん抗原及び感染性疾患抗原への高アフィニティー結合など、所望される特徴を伴う非免疫グロブリンポリペプチドのスクリーニング及び同定に有効である(例えば、Vaughan T et al., Nat Biotechnol 14: 309-14 (1996); Silverman J etal.
, Nat Biotechnol 23: 1556-61 (2005); Steiner D et al., J Mol Biol 382: 1211-27(2008); Kim H et al., J Am Chem Soc 131: 3565-76 (2009); Huang Y et al., J BiolChem 285: 7880-91 (2010); Tillib S et al., Acta Nature 2: 85-93 (2010); Geyer Cet al., Methods Mol Biol 901: 11-32 (2012); Ohtani M et al., Fish ShellfishImmunol 34: 274-8 (2013); Zhang J et al., FASEB J 27: 581-9 (2013)を参照されたい)。
加えて、例えば、ジスルフィド安定化scFvなどの複雑な結合領域も、ファージディスプレイを使用してスクリーニング及び同定することができる(Chen I et al., Mol Biosyst 6: 1307-15 (2010))。ファージディスプレイを使用して、例えば、イントラボディーなど、還元条件下でもなお、細胞内標的の結合剤を同定することができる(Cardinale A,
Biocca S, Trends Mol Med 14: 373-80 (2008); Marschall A et al., MAbs 3: 3-16(2011); Ramgel R et al., Nat Protoc 8: 1916-39 (2013); Kaiser P et al., BiochimBiophys Acta 1844: 1933-42 (2014))。
ファージディスプレイスクリーニングとは、広く使用されて大きな成功を収めたインビトロ法である(Geyer Cet al., Methods Mol Biol 901: 11-32 (2012); Zou Y, Marks J, Methods Enzymol502: 43-66 (2012))。一般的なファージディスプレイライブラリー
は、複雑性が1×106〜1×1010の範囲にあることが典型的であり、FDAで承認された多数の生物学的薬剤を開発するのに使用されている(Thie H et al., Curr Pharm Biotechnol 9: 439-46 (2008); Bratkovic T,Cell Mol Life Sci 67: 749-67 (2010))
。一般に、M13などの繊維状ファージ種は、pIII及びpVIIIなど、その大型のコート
タンパク質のうちの1つへとリンカーを介して融合させたポリペプチドを提示するのに使用される。ファージディスプレイスクリーニングは、免疫グロブリンに由来するポリペプチド、及び、例えば、がん抗原及び感染性疾患抗原への高アフィニティー結合など、所望される特徴を伴う非免疫グロブリンポリペプチドのスクリーニング及び同定に有効である(例えば、Vaughan T et al., Nat Biotechnol 14: 309-14 (1996); Silverman J etal.
, Nat Biotechnol 23: 1556-61 (2005); Steiner D et al., J Mol Biol 382: 1211-27(2008); Kim H et al., J Am Chem Soc 131: 3565-76 (2009); Huang Y et al., J BiolChem 285: 7880-91 (2010); Tillib S et al., Acta Nature 2: 85-93 (2010); Geyer Cet al., Methods Mol Biol 901: 11-32 (2012); Ohtani M et al., Fish ShellfishImmunol 34: 274-8 (2013); Zhang J et al., FASEB J 27: 581-9 (2013)を参照されたい)。
加えて、例えば、ジスルフィド安定化scFvなどの複雑な結合領域も、ファージディスプレイを使用してスクリーニング及び同定することができる(Chen I et al., Mol Biosyst 6: 1307-15 (2010))。ファージディスプレイを使用して、例えば、イントラボディーなど、還元条件下でもなお、細胞内標的の結合剤を同定することができる(Cardinale A,
Biocca S, Trends Mol Med 14: 373-80 (2008); Marschall A et al., MAbs 3: 3-16(2011); Ramgel R et al., Nat Protoc 8: 1916-39 (2013); Kaiser P et al., BiochimBiophys Acta 1844: 1933-42 (2014))。
例えば、ファージミドディスプレイライブラリーは、VHドメインとVLドメインとのランダム融合体を使用して構築することもでき、結合してFabを形成する、VHポリペプチドとVLポリペプチドとの共発現を使用して構築することもできる。ファージミドディスプレイライブラリーでは、例えば、ELISAプレート上、細胞表面上、又はマイクロビーズ上に固定化された標的などの結合アフィニティーアッセイを使用する、バイオパニング及び/又は反復バイオパニングにより、高アフィニティーで標的に結合する免疫グロブリン型ポリペプチドを提示するファージについてスクリーニングすることができる。次いで、洗浄ステップ、単離ステップ、及び/又は結合させたファージの溶出ステップの後で、回収されたファージを、大腸菌宿主内で、クローン再増幅する。各ラウンドにおいて、非結合剤を洗い落とし、結合性ファージクローンを選択的に溶出させることにより、特異的結合剤を選択する。3又は4ラウンド後に、標的への特異的結合が高度なファージクローンを同定することができる。
b.リボソームディスプレイスクリーニング
高アフィニティーの結合領域についてのリボソームディスプレイスクリーニングは、免疫グロブリンに由来するポリペプチド上及び非免疫グロブリンポリペプチド上のいずれにおいても実施されている(例えば、Hanes J, Plueckthun A, Proc Natl Acad Sci USA 94: 4937-42 (1997);Hanes J et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 14130-5 (1998); Hanes J et al., FEBSLett 450: 105-10 (1999); Schaffitzel C et al., J Immunol Methods 231: 119-35(1999); Hanes J et al., Nat Biotechnol 18: 1287-92 (2000); Sun Y et al., PLoSOne 7: e33186 (2012); Liu J et al., Analyst 137: 2470-9 (2012); Seeger M etal., Protein Sci 22: 1239-57 (2013);米国特許第6,620,587号明細書;米国特許第7,074,557号明細書;米国特許出願公開第2006/0177862号明細書;国際特許公開第2001/075097号パンフレットを参照されたい)。例えば、ディープシークエンシングとカップリングさせたリボソームディスプレイを使用して、免疫グロブリンに由来する結合領域であって、細胞表面標的であるPVRL4に結合する結合領域を同定した(Larman H et al., Nat Protoc 9: 90-103 (2014))。他の例は、リボソームディスプレイが、免疫グロブリンの代替物であるポリペプチド足場ライブラリーからの分子の選択のために、広範に使用されていることを示す(例えば、Zahnd C et al., J Mol Biol 369: 1015-28 (2007); Ribosome Display andRelated Technologies - Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,vol. 805: pp. 261-334
(Eds. Douthwaite J, Jackson R. Humana Press 2012)を参照されたい)。
高アフィニティーの結合領域についてのリボソームディスプレイスクリーニングは、免疫グロブリンに由来するポリペプチド上及び非免疫グロブリンポリペプチド上のいずれにおいても実施されている(例えば、Hanes J, Plueckthun A, Proc Natl Acad Sci USA 94: 4937-42 (1997);Hanes J et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 14130-5 (1998); Hanes J et al., FEBSLett 450: 105-10 (1999); Schaffitzel C et al., J Immunol Methods 231: 119-35(1999); Hanes J et al., Nat Biotechnol 18: 1287-92 (2000); Sun Y et al., PLoSOne 7: e33186 (2012); Liu J et al., Analyst 137: 2470-9 (2012); Seeger M etal., Protein Sci 22: 1239-57 (2013);米国特許第6,620,587号明細書;米国特許第7,074,557号明細書;米国特許出願公開第2006/0177862号明細書;国際特許公開第2001/075097号パンフレットを参照されたい)。例えば、ディープシークエンシングとカップリングさせたリボソームディスプレイを使用して、免疫グロブリンに由来する結合領域であって、細胞表面標的であるPVRL4に結合する結合領域を同定した(Larman H et al., Nat Protoc 9: 90-103 (2014))。他の例は、リボソームディスプレイが、免疫グロブリンの代替物であるポリペプチド足場ライブラリーからの分子の選択のために、広範に使用されていることを示す(例えば、Zahnd C et al., J Mol Biol 369: 1015-28 (2007); Ribosome Display andRelated Technologies - Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,vol. 805: pp. 261-334
(Eds. Douthwaite J, Jackson R. Humana Press 2012)を参照されたい)。
例えば、リボソームディスプレイ法は、遺伝子型と表現型とをカップリングさせるのに、ポリペプチド−リボソーム−RNA間の非共有結合的三元複合体を要請することが多い。RNA内に終止コドンを欠くことにより、RNA(遺伝子型)及びポリペプチドの、リボソームからの放出が防止される。これらのリボソーム三元複合体は、インビトロでの翻
訳時に形成される。高濃度のマグネシウム及び低温を使用して、これらの三元複合体をさらに安定化させることができる。スクリーニング及び選択ステップを、これらの三元複合体に対して直接実施して、提示されるポリペプチドであって、細胞内環境における結合アフィニティーを含む、特異的特徴を伴うポリペプチドを同定することができる(米国特許出願公開第2011/0008774号明細書を参照されたい)。
訳時に形成される。高濃度のマグネシウム及び低温を使用して、これらの三元複合体をさらに安定化させることができる。スクリーニング及び選択ステップを、これらの三元複合体に対して直接実施して、提示されるポリペプチドであって、細胞内環境における結合アフィニティーを含む、特異的特徴を伴うポリペプチドを同定することができる(米国特許出願公開第2011/0008774号明細書を参照されたい)。
リボソームディスプレイは、標的濃度を減少させながら、厳密性を漸増させる選択ステップを使用することにより、標的への結合について既に濃縮されたファージディスプレイライブラリー内で、高アフィニティーの結合領域を選択するために使用することができる(Ribosome Display and Related Technologies - Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology, vol. 805: pp. 161-190 (Eds. Douthwaite J, JacksonR. Humana Press 2012))。加えて、リボソームディスプレイを使用して、ポリペプチドの安定性を弁別しうる選択ステップにおいて、ジチオトレイトール又は高温で安定性を試すことなどにより、ポリペプチドの安定性の改善について選択することもできる(Ribosome Display and Related Technologies - Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology, vol. 805: pp. 191-212 (Eds. Douthwaite J, JacksonR. Humana Press 2012))。
特化型のリボソームディスプレイは、例えば、scFvなど、ポリペプチドの、細菌による産生特徴の最適化を可能とする、細胞内リボソームディスプレイである(例えば、Contreras-Martinez L, DeLisa M, J Mol Biol 372: 513-24 (2007);Kaiser P et al., Biochim Biophys Acta 1844: 1933-42 (2014)を参照されたい)。
c.RNAディスプレイスクリーニング
高アフィニティーの結合領域についてのRNAディスプレイスクリーニングは、免疫グロブリンに由来するポリペプチド上及び非免疫グロブリンポリペプチド上のいずれにおいても実施されている(Roberts R, Szostak J, Proc Natl Acad Sci USA 94: 12297-302 (1997);Nemoto N et al., FEBS Lett 414: 405-8 (1997); Liu R et al., Methods Enzymol318: 268-293 (2000); Getmanova et al., Chem Biol 13: 549-56 (2006); Liao H et al., J Biol Chem 284: 17512-20 (2009); Emanuel S et al., MAbs 3: 38-48 (2011);Ribosome Display and Related Technologies - Methods and Protocols, Methods inMolecular Biology, vol. 805: pp. 87-100 (Eds. Douthwaite J, Jackson R. HumanaPress 2012);米国特許第6,214,553号明細書;米国特許第6,249,300号明細書;米国特許第6,258,558号明細書;米国特許第6,261,804号明細書;米国特許第6,281,344号明細書;米国特許第6,623,926号明細書;米国特許第6,518,018号明細書;米国特許第6,602,685号明細書;米国特許第7,270,950号明細書;米国特許第7,790,421号明細書;国際特許公開第2010/039850号パンフレット;国際特許公開第2011/049157号パンフレット;米国特許出願公開第2010/0105569号明細書;米国特許出願公開第2014/0128275号明細書)。例えば、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメインによるRNAディスプレイライブラリーを、TNFとの相互作用についてスクリーニングし、scFv RNAディスプレイライブラリーを、フルオレセインとの相互作用についてスクリーニングした(Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Fukuda I et al., NucleicAcids Res 34: e127 (2006))。
高アフィニティーの結合領域についてのRNAディスプレイスクリーニングは、免疫グロブリンに由来するポリペプチド上及び非免疫グロブリンポリペプチド上のいずれにおいても実施されている(Roberts R, Szostak J, Proc Natl Acad Sci USA 94: 12297-302 (1997);Nemoto N et al., FEBS Lett 414: 405-8 (1997); Liu R et al., Methods Enzymol318: 268-293 (2000); Getmanova et al., Chem Biol 13: 549-56 (2006); Liao H et al., J Biol Chem 284: 17512-20 (2009); Emanuel S et al., MAbs 3: 38-48 (2011);Ribosome Display and Related Technologies - Methods and Protocols, Methods inMolecular Biology, vol. 805: pp. 87-100 (Eds. Douthwaite J, Jackson R. HumanaPress 2012);米国特許第6,214,553号明細書;米国特許第6,249,300号明細書;米国特許第6,258,558号明細書;米国特許第6,261,804号明細書;米国特許第6,281,344号明細書;米国特許第6,623,926号明細書;米国特許第6,518,018号明細書;米国特許第6,602,685号明細書;米国特許第7,270,950号明細書;米国特許第7,790,421号明細書;国際特許公開第2010/039850号パンフレット;国際特許公開第2011/049157号パンフレット;米国特許出願公開第2010/0105569号明細書;米国特許出願公開第2014/0128275号明細書)。例えば、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメインによるRNAディスプレイライブラリーを、TNFとの相互作用についてスクリーニングし、scFv RNAディスプレイライブラリーを、フルオレセインとの相互作用についてスクリーニングした(Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Fukuda I et al., NucleicAcids Res 34: e127 (2006))。
d.DNAディスプレイ:タンパク質−DNA連結ディスプレイスクリーニング
DNA連結ディスプレイ(また、DNAディスプレイとも称される)では、ランダム化ポリペプチド配列をコードするDNA断片を、インビトロにおける転写及び翻訳の後で、共有結合的結合又は非共有結合を介して、それらがコードするポリペプチドへと複合体化させる(Odegrip R et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-10 (2004); Doi Net al., J Biotechnol 131: 231-9 (2007);米国特許第6,416,950号明細書)。特殊
な種類のDNA連結ディスプレイは、ディスプレイポリペプチドを、それをコードするDNA分子へと、マイクロビーズを介して連結する、マイクロビーズによるアフィニティー相互作用の使用を伴う(Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013))。
DNA連結ディスプレイ(また、DNAディスプレイとも称される)では、ランダム化ポリペプチド配列をコードするDNA断片を、インビトロにおける転写及び翻訳の後で、共有結合的結合又は非共有結合を介して、それらがコードするポリペプチドへと複合体化させる(Odegrip R et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-10 (2004); Doi Net al., J Biotechnol 131: 231-9 (2007);米国特許第6,416,950号明細書)。特殊
な種類のDNA連結ディスプレイは、ディスプレイポリペプチドを、それをコードするDNA分子へと、マイクロビーズを介して連結する、マイクロビーズによるアフィニティー相互作用の使用を伴う(Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013))。
2.細胞表面ディスプレイプラットフォーム
一部の系では、タンパク質又はポリペプチドの提示は、ライブラリーメンバーを、細胞の外部表面へとテザリングする膜貫通ドメインの使用に基づく。細胞ベースのタンパク質ディスプレイプラットフォームにより、スクリーニング時における、例えば、蛍光活性化、磁気、又は結合アフィニティーなどを介する、フローサイトメトリーによる細胞分取の使用が可能となる。原核生物及び真核生物のいずれも、細胞ベースのタンパク質ディスプレイスクリーニングのために使用することができる。細胞表面ディスプレイのために真核細胞を使用する利点は、例えば、酸化環境及びN連結グリコシル化など、真核生物タンパク質のフォールディング環境及び翻訳後修飾の存在である。
一部の系では、タンパク質又はポリペプチドの提示は、ライブラリーメンバーを、細胞の外部表面へとテザリングする膜貫通ドメインの使用に基づく。細胞ベースのタンパク質ディスプレイプラットフォームにより、スクリーニング時における、例えば、蛍光活性化、磁気、又は結合アフィニティーなどを介する、フローサイトメトリーによる細胞分取の使用が可能となる。原核生物及び真核生物のいずれも、細胞ベースのタンパク質ディスプレイスクリーニングのために使用することができる。細胞表面ディスプレイのために真核細胞を使用する利点は、例えば、酸化環境及びN連結グリコシル化など、真核生物タンパク質のフォールディング環境及び翻訳後修飾の存在である。
a.原核細胞表面ディスプレイスクリーニング
細菌ディスプレイスクリーニングは、標的タンパク質に特異的な免疫グロブリン型結合領域を同定するのに使用されている(Loefblom J, Biotechnol J 6: 1115-29 (2011))。例えば、エシェリキア(Escherichia)属などのグラム陰性菌、並びにバチルス(Bacillus)属及びブドウ球菌(Staphylococcus)属などのグラム陽性菌など、多様な細菌種を使
用することができる(Fleetwood F et al., Cell Mol Life Sci 70:1081 -93 (2013)を
参照されたい)。フローサイトメトリー法は、細菌ディスプレイライブラリーをスクリーニングする場合に実施することができる(例えば、Zhang S, Link A, Integr Biol (Camb) 3: 823-31 (2011)を参照されたい)。加えて、タンパク質は、細菌芽胞上に提示することもできる(例えば、Kim J, Schumann W, Cell Mol Life Sci 66: 3127-36 (2009)を参
照されたい)。細菌を使用して、例えば、イントラボディーなど、細胞内標的の結合剤についてスクリーニングすることができる(例えば、Fisher A, DeLisa M, J Mol Biol 385: 299-311 (2009); Kaiser P et al.,Biochim Biophys Acta 1844: 1933-42 (2014)を参照されたい)。
細菌ディスプレイスクリーニングは、標的タンパク質に特異的な免疫グロブリン型結合領域を同定するのに使用されている(Loefblom J, Biotechnol J 6: 1115-29 (2011))。例えば、エシェリキア(Escherichia)属などのグラム陰性菌、並びにバチルス(Bacillus)属及びブドウ球菌(Staphylococcus)属などのグラム陽性菌など、多様な細菌種を使
用することができる(Fleetwood F et al., Cell Mol Life Sci 70:1081 -93 (2013)を
参照されたい)。フローサイトメトリー法は、細菌ディスプレイライブラリーをスクリーニングする場合に実施することができる(例えば、Zhang S, Link A, Integr Biol (Camb) 3: 823-31 (2011)を参照されたい)。加えて、タンパク質は、細菌芽胞上に提示することもできる(例えば、Kim J, Schumann W, Cell Mol Life Sci 66: 3127-36 (2009)を参
照されたい)。細菌を使用して、例えば、イントラボディーなど、細胞内標的の結合剤についてスクリーニングすることができる(例えば、Fisher A, DeLisa M, J Mol Biol 385: 299-311 (2009); Kaiser P et al.,Biochim Biophys Acta 1844: 1933-42 (2014)を参照されたい)。
b.真核細胞表面ディスプレイスクリーニング
単細胞性真核細胞を、細胞表面ディスプレイのために使用することができる。例えば、酵母表面ディスプレイスクリーニングは、アフィニティー、特異性、発現、安定性、及び触媒活性に関する特徴を改善するのに使用されている(Gai S, Wittrup K, Curr Opin Struct Biol 17: 467-73 (2007))。
単細胞性真核細胞を、細胞表面ディスプレイのために使用することができる。例えば、酵母表面ディスプレイスクリーニングは、アフィニティー、特異性、発現、安定性、及び触媒活性に関する特徴を改善するのに使用されている(Gai S, Wittrup K, Curr Opin Struct Biol 17: 467-73 (2007))。
酵母表面ディスプレイでは、α−アグルチニン(Aga2p)、フロクリン、Cwp1p、Cwp2p、及びTip1pなど、グリコシル化ホスファチジルイノシトール(GPI,glycosylated phosphatidylinositol)でアンカリングされたタンパク質、並びにP
ir1〜4などのPirファミリータンパク質などの酵母表面タンパク質からデザインされた組換え融合タンパク質を活用する(Kondo A, Ueda M, Appl Microbiol Biotechnol 64: 28-40 (2004); Khasa Yet al., Yeast 28: 213-26 (2011))。出芽酵母(S. cerevisiae)、分裂酵母(S. pombe)、並びにピキア酵母(P. pastoris)及びハンセヌラ・ポリモルファ(H. polymorpha)などのメチロトローフ株を含む、多様な種の酵母を使用する
ことができる。酵母表面ディスプレイは、例えば、免疫グロブリンなど、ジスルフィド架橋を使用してアセンブルされた多重鎖タンパク質を含む、多量体タンパク質のディスプレイを可能とする(Lin Y et al., Appl Microbiol Biotechnol 62: 226-32 (2003); van denBeucken T et al., FEBS Lett 546: 288-94 (2003))。
ir1〜4などのPirファミリータンパク質などの酵母表面タンパク質からデザインされた組換え融合タンパク質を活用する(Kondo A, Ueda M, Appl Microbiol Biotechnol 64: 28-40 (2004); Khasa Yet al., Yeast 28: 213-26 (2011))。出芽酵母(S. cerevisiae)、分裂酵母(S. pombe)、並びにピキア酵母(P. pastoris)及びハンセヌラ・ポリモルファ(H. polymorpha)などのメチロトローフ株を含む、多様な種の酵母を使用する
ことができる。酵母表面ディスプレイは、例えば、免疫グロブリンなど、ジスルフィド架橋を使用してアセンブルされた多重鎖タンパク質を含む、多量体タンパク質のディスプレイを可能とする(Lin Y et al., Appl Microbiol Biotechnol 62: 226-32 (2003); van denBeucken T et al., FEBS Lett 546: 288-94 (2003))。
酵母表面ディスプレイスクリーニングは、高アフィニティーの免疫グロブリンに由来す
る結合領域を選択するのに使用されている(例えば、Feldhaus M et al., NatBiotechnol 21: 163-70 (2003); Walker L et al., J Mol Biol 389: 365-75 (2009);米国特許第
8,372,636号明細書を参照されたい)。酵母表面ディスプレイは、アフィニティー成熟で大きな成功を収めている(例えば、Wang Z et al., Bioconjug Chem 18: 947-55
(2007); Pepper L et al., Comb Chem High Throughput Screen 11: 127-34 (2008)を参照されたい)。酵母表面ディスプレイは、提示されるポリペプチド及びタンパク質が、真核細胞膜表面に沿ったコンフォメーションを取りうるため、細胞表面と関連するポリペプチド及びタンパク質を提示するのに有利である(Tillotson B et al., Methods 60: 27-37 (2013))。
る結合領域を選択するのに使用されている(例えば、Feldhaus M et al., NatBiotechnol 21: 163-70 (2003); Walker L et al., J Mol Biol 389: 365-75 (2009);米国特許第
8,372,636号明細書を参照されたい)。酵母表面ディスプレイは、アフィニティー成熟で大きな成功を収めている(例えば、Wang Z et al., Bioconjug Chem 18: 947-55
(2007); Pepper L et al., Comb Chem High Throughput Screen 11: 127-34 (2008)を参照されたい)。酵母表面ディスプレイは、提示されるポリペプチド及びタンパク質が、真核細胞膜表面に沿ったコンフォメーションを取りうるため、細胞表面と関連するポリペプチド及びタンパク質を提示するのに有利である(Tillotson B et al., Methods 60: 27-37 (2013))。
酵母ディスプレイをファージディスプレイと組み合わせて、免疫グロブリン型結合領域を同定するための強力な組合せスクリーニング法をもたらすことができる(Ferrara F et
al., PLoS One 7: e49535 (2012))。酵母ディスプレイを、RNAディスプレイと組み
合わせて、免疫グロブリン型結合領域を同定するための強力な組合せスクリーニング法をもたらすこともできる(例えば、国際特許公開第2012/158739号パンフレットを参照されたい)。
al., PLoS One 7: e49535 (2012))。酵母ディスプレイを、RNAディスプレイと組み
合わせて、免疫グロブリン型結合領域を同定するための強力な組合せスクリーニング法をもたらすこともできる(例えば、国際特許公開第2012/158739号パンフレットを参照されたい)。
多細胞生物に由来する真核細胞を、真核細胞表面ディスプレイスクリーニングのために使用することができる。特に、哺乳動物細胞表面ディスプレイスクリーニングは、広く適用されるようになっている(Bowers P et al., Methods 65: 44-56 (2014))。哺乳動物
表面細胞ディスプレイスクリーニングは、例えば、ヒト対象など、哺乳動物への投与のための薬物を開発するために適切なポリペプチドを選択するのにより最適なポリペプチドのフォールディング及び翻訳後修飾の利点をもたらす(Vendel M et al., Arch Biochem Biophys 526: 188-93 (2012)を参照されたい)。例えば、哺乳動物細胞ディスプレイは、所望される結合特異性を伴うヒト抗体を同定するのに使用されている(Bowers P et al., Proc Natl Acad Sci USA 108: 20455-60 (2011);McConnell A et al., PLoS One 7: e49458 (2012))。加えて、全長多重鎖免疫グロブリンは、例えば、Flpリコンビナーゼ、
非複製型プラスミド、エピソーム複製型プラスミド、シンドビスウイルスベクター、及びワクチンウイルスベクターなど、安定的発現系又は一過性発現系を使用して、哺乳動物細胞上に提示することができる(Akamatsu Y et al., J Immunol Methods 327: 40-52 (2007); Beerli R etal., Proc Natl Acad Sci USA 105: 14336-41 (2008); Ho M, Pastan I, Methods MolBiol 562: 99-113 (2009); Zhou C et al., mAbs 2: 508-18 (2010); Bowers P et al.,Proc Natl Acad Sci USA 108: 20455-60 (2011); Li C et al., Cell Mol
Immunol 9: 184-190 (2012))。例えば、哺乳動物細胞ディスプレイは、レトロウイルスベクターを使用して実施することができる(Breous-Nystrom E et al., Methods 65: 57-67 (2014))。分泌特徴を伴うヒト細胞ディスプレイ系は、ヒト免疫グロブリン結合領域
のスクリーニングのために使用されている(Horlick R et al., J Biol Chem 288:19861-9 (2013))。哺乳動物細胞表面ディスプレイは、結合領域のアフィニティー成熟のため
に使用されている(Bowers P et al., Methods 65: 44-56 (2014))。真核細胞を使用し
て、例えば、イントラボディーなど、細胞内標的の結合剤についてスクリーニングすることができる(例えば、GennariF et al., J Mol Biol 335: 193-207 (2004); Mazuc E et
al., PLoS One 9: e104998 (2014); Kaiser P et al., Biochim Biophys Acta 1844:1933-42 (2014)を参照されたい)。
表面細胞ディスプレイスクリーニングは、例えば、ヒト対象など、哺乳動物への投与のための薬物を開発するために適切なポリペプチドを選択するのにより最適なポリペプチドのフォールディング及び翻訳後修飾の利点をもたらす(Vendel M et al., Arch Biochem Biophys 526: 188-93 (2012)を参照されたい)。例えば、哺乳動物細胞ディスプレイは、所望される結合特異性を伴うヒト抗体を同定するのに使用されている(Bowers P et al., Proc Natl Acad Sci USA 108: 20455-60 (2011);McConnell A et al., PLoS One 7: e49458 (2012))。加えて、全長多重鎖免疫グロブリンは、例えば、Flpリコンビナーゼ、
非複製型プラスミド、エピソーム複製型プラスミド、シンドビスウイルスベクター、及びワクチンウイルスベクターなど、安定的発現系又は一過性発現系を使用して、哺乳動物細胞上に提示することができる(Akamatsu Y et al., J Immunol Methods 327: 40-52 (2007); Beerli R etal., Proc Natl Acad Sci USA 105: 14336-41 (2008); Ho M, Pastan I, Methods MolBiol 562: 99-113 (2009); Zhou C et al., mAbs 2: 508-18 (2010); Bowers P et al.,Proc Natl Acad Sci USA 108: 20455-60 (2011); Li C et al., Cell Mol
Immunol 9: 184-190 (2012))。例えば、哺乳動物細胞ディスプレイは、レトロウイルスベクターを使用して実施することができる(Breous-Nystrom E et al., Methods 65: 57-67 (2014))。分泌特徴を伴うヒト細胞ディスプレイ系は、ヒト免疫グロブリン結合領域
のスクリーニングのために使用されている(Horlick R et al., J Biol Chem 288:19861-9 (2013))。哺乳動物細胞表面ディスプレイは、結合領域のアフィニティー成熟のため
に使用されている(Bowers P et al., Methods 65: 44-56 (2014))。真核細胞を使用し
て、例えば、イントラボディーなど、細胞内標的の結合剤についてスクリーニングすることができる(例えば、GennariF et al., J Mol Biol 335: 193-207 (2004); Mazuc E et
al., PLoS One 9: e104998 (2014); Kaiser P et al., Biochim Biophys Acta 1844:1933-42 (2014)を参照されたい)。
V.本発明の方法を使用するディスプレイスクリーニングの結果として創出される、細胞毒性ポリペプチドのポリペプチド配列内の変化
当業者は、本明細書で提示される、リボ毒性領域ポリペプチドの、例示的な非リボ毒性鋳型及び/又はリボ毒性を低減した鋳型へと、変化を施しうることを認識するであろう。同様に、当業者は、本発明における使用のための、リボ毒性領域の、非リボ毒性鋳型及び/又はリボ毒性を低減した鋳型をデザインする場合に、多数の変化が可能であることも認
識するであろう。加えて、当業者は、前者のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドへと変化を施しうることも認識するであろう。例えば、一部の修飾は、発現、精製、及び/又は薬物動態特性、及び/又は免疫原性を容易としうる。このような修飾は、当業者に周知であり、例えば、開始部位をもたらすようにアミノ末端に付加されるメチオニン、好都合に配置された制限部位又は終結コドンを創出するように末端に置かれるさらなるアミノ酸、並びに好都合な検出及び/又は精製をもたらすように一方の末端へと融合させる生化学的アフィニティータグを含む。
当業者は、本明細書で提示される、リボ毒性領域ポリペプチドの、例示的な非リボ毒性鋳型及び/又はリボ毒性を低減した鋳型へと、変化を施しうることを認識するであろう。同様に、当業者は、本発明における使用のための、リボ毒性領域の、非リボ毒性鋳型及び/又はリボ毒性を低減した鋳型をデザインする場合に、多数の変化が可能であることも認
識するであろう。加えて、当業者は、前者のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドへと変化を施しうることも認識するであろう。例えば、一部の修飾は、発現、精製、及び/又は薬物動態特性、及び/又は免疫原性を容易としうる。このような修飾は、当業者に周知であり、例えば、開始部位をもたらすようにアミノ末端に付加されるメチオニン、好都合に配置された制限部位又は終結コドンを創出するように末端に置かれるさらなるアミノ酸、並びに好都合な検出及び/又は精製をもたらすように一方の末端へと融合させる生化学的アフィニティータグを含む。
当業者は、本発明の方法を使用して同定される、本発明の任意の細胞毒性ポリペプチドへと変化を施しうることを認識するであろう。加えて、当業者は、例えば、リボ毒性領域及び結合領域の全体的な構造及び機能を維持することにより、それらの生体活性を減少させずに、本発明の細胞毒性ポリペプチドへと変化を施しうることも認識するであろう。
本明細書ではまた、エピトープタグ又は他の部分の配列など、さらなるアミノ酸残基の、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端における包含も想定される。さらなるアミノ酸残基を、例えば、クローニングの容易化、発現の容易化、翻訳後修飾、合成の容易化、精製、検出の容易化、及び投与を含む多様な目的のために使用することができる。エピトープタグ及びエピトープ部分の非限定的な例は、キチン結合性タンパク質ドメイン、エンテロペプチダーゼによる切断部位、因子Xaによる切断部位、FIAsHタグ、FLAGタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP,green fluorescent protein)、グルタチオン−S−ト
ランスフェラーゼ部分、HAタグ、マルトース結合性タンパク質ドメイン、mycタグ、ポリヒスチジンタグ、ReAsHタグ、Strep-tag、Strep-tag II、TEVプロテアーゼ
部位、チオレドキシンドメイン、トロンビン切断部位、及びV5エピトープタグである。
ランスフェラーゼ部分、HAタグ、マルトース結合性タンパク質ドメイン、mycタグ、ポリヒスチジンタグ、ReAsHタグ、Strep-tag、Strep-tag II、TEVプロテアーゼ
部位、チオレドキシンドメイン、トロンビン切断部位、及びV5エピトープタグである。
上記の実施形態のうちのいくつかでは、本発明の細胞毒性ポリペプチドのポリペプチド配列を、ポリペプチド領域内に導入される1カ所又は2カ所以上の保存的アミノ酸置換により変化させる。本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、1又は2以上のアミノ酸を、別の、生物学的に類似のアミノ酸残基で置きかえることを表す。例は、類似の特徴を伴うアミノ酸残基、例えば、小型のアミノ酸、酸性のアミノ酸、極性のアミノ酸、塩基性のアミノ酸、疎水性のアミノ酸及び芳香族のアミノ酸による置換を含む(例えば、表Cを参照されたい)。内因性の哺乳動物ペプチド内及び哺乳動物タンパク質内では通常見出されない残基を伴う保存的置換の例は、アルギニン残基又はリシン残基の、例えば、オルニチン、カナバニン、アミノエチルシステイン、又は別の塩基性のアミノ酸による保存的置換である。ペプチド内及びタンパク質内で表現型上サイレントの置換に関するさらなる情報については、例えば、Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)を参照さ
れたい。
れたい。
表Cの保存的置換スキームでは、アミノ酸の例示的な保存的置換を、物理化学的特性:I:中性、親水性;II:酸及びアミド;III:塩基性;IV:疎水性;V:芳香族、バルク
アミノ酸、VI:親水性で非帯電、VII:脂肪族で非帯電、VIII:非極性で非帯電、IX:シ
クロアルケニル会合型、X:疎水性、XI:極性、XII:小型、XIII:ターン許容型、及びXIV:可撓性により群分けする。例えば、保存的アミノ酸置換は、以下の保存的アミノ酸置換であって、:1)Sは、Cで置換することができ;2)M又はLは、Fで置換することができ;3)Yは、Mで置換することができ;4)Q又はEは、Kで置換することができ;5)N又はQは、Hで置換することができ;6)Hは、Nで置換しうる保存的アミノ酸置換を含む。
アミノ酸、VI:親水性で非帯電、VII:脂肪族で非帯電、VIII:非極性で非帯電、IX:シ
クロアルケニル会合型、X:疎水性、XI:極性、XII:小型、XIII:ターン許容型、及びXIV:可撓性により群分けする。例えば、保存的アミノ酸置換は、以下の保存的アミノ酸置換であって、:1)Sは、Cで置換することができ;2)M又はLは、Fで置換することができ;3)Yは、Mで置換することができ;4)Q又はEは、Kで置換することができ;5)N又はQは、Hで置換することができ;6)Hは、Nで置換しうる保存的アミノ酸置換を含む。
さらなる保存的アミノ酸置換は、以下の保存的アミノ酸置換であって、:1)Sは、Cで置換することができ;2)M又はLは、Fで置換することができ;3)Yは、Mで置換することができ;4)Q又はEは、Kで置換することができ;5)N又はQは、Hで置換することができ;6)Hは、Nで置換しうる保存的アミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の細胞毒性ポリペプチドは、本発明のポリペプチド領域の機能的な断片又はバリアントであって、ポリペプチドが、その領域の機能性(例えば、結合領域では、結合機能であり、リボ毒性領域では、リボ毒性である)を保持する限りにおいて、本明細書で列挙されるポリペプチド配列と比較して、最大で、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1カ所のアミノ酸置換を有する断片又はバリアントを含みうる。本発明の細胞毒性ポリペプチドのバリアントは、細胞毒性の変化、細胞毒性作用の変化、免疫原性の変化、及び/又は血清中半減期の変化など、所望される特
性を達成するために、結合領域内又はリボ毒性領域内などで、1若しくは2以上のアミノ酸を変化させるか、又は1若しくは2以上のアミノ酸を欠失させるか若しくは挿入することにより、本発明のポリペプチドを変化させる結果として、本発明の範囲内にある。
性を達成するために、結合領域内又はリボ毒性領域内などで、1若しくは2以上のアミノ酸を変化させるか、又は1若しくは2以上のアミノ酸を欠失させるか若しくは挿入することにより、本発明のポリペプチドを変化させる結果として、本発明の範囲内にある。
したがって、ある特定の実施形態では、本発明の細胞毒性ポリペプチドのリボ毒性領域は、例えば、配列番号1〜14に列挙される任意の配列のうちの1つなど、自然発生の毒素に対して、少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%又は99.7%の全体的な配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる。
本発明の細胞ターゲティング分子のある特定の実施形態では、本発明の細胞毒性ポリペプチドのリボ毒性領域の酵素活性を増大させるために、1又は2以上のアミノ酸残基を、変異させるか、挿入するか、又は欠失させることができる。例えば、Stx1A内の残基位置であるアラニン231を、グルタミン酸へと変異させたところ、インビトロにおけるその酵素活性が増大し(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998))、PE内のアルギニン490を、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンへと変異させたところ、その酵素活性が増大した(国際特許公開第2005/052006号)。
VI.核酸、ライブラリー、及び同定されるリボ毒性タンパク質及びリボ毒性ポリペプチド 本発明のスクリーニング法の他に、本発明は、核酸、核酸ライブラリー、ライブラリーによりコードされるポリペプチド、及び本発明の任意の方法により創出されるディスプレイポリペプチドライブラリーも包摂する。加えて、本発明は、本発明の方法を使用して同定される任意のポリヌクレオチドも包摂する。
核酸の例について述べると、本発明の方法により創出される、リボ毒性を低減するか又は消失させた修飾リボ毒性領域を含む、1又は2以上のポリペプチドをコードする核酸及び核酸ライブラリーは、本発明の範囲内にある。これは、リボ毒性を低減するか又は消失させた修飾リボ毒性領域を含む融合ポリペプチドをコードする発現ライブラリーを含む。これはまた、核酸も含み、1又は2以上の修飾リボ毒性領域ポリペプチドをコードする核酸鋳型を含むライブラリーは、本発明の範囲内にある。本発明のスクリーニング法を使用して同定される任意の核酸であって、リボ毒性を低減するか又は消失させたリボ毒性領域を含む融合ポリペプチドをコードする任意の核酸は、本発明の範囲内にある。本発明のスクリーニング法を使用して同定される任意の核酸であって、リボ毒性を低減するか又は消失させたリボ毒性領域を含む融合ポリペプチドをコードする任意の核酸の他、核酸配列により明らかにされる、その任意のリボ毒性形態も、本発明の範囲内にある。
加えて、修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、非修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、本発明のスクリーニング法を使用して同定される任意の核酸も、本発明の範囲内にある。これは、本発明のスクリーニング法を使用する、1又は2以上の特徴についてのスクリーニング、陽性選択、陰性選択、及び/又は濃縮の結果としてもたらされる、任意の核酸ライブラリーを含む。
ポリペプチドの例について述べると、提示されるポリペプチドであって、リボ毒性を低減するか又は消失させた修飾リボ毒性領域を含むポリペプチドのライブラリーは、本発明の範囲内にある。修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、非修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、本発明のスクリーニング法を使用して同定される任意のポリペプチドは、本発明の範囲内にある。これは、本発明のスクリーニング法を使用する、1又は2以上の特徴についてのスクリーニング、陽性選択、陰性選択、及び/又は濃縮の結果としてもたらされる、任意のポリペプチドライブラリーを含む。
発現のための核酸ライブラリーを創出するには、任意の適切な発現ベクターを使用することができる。例えば、原核細胞用クローニングベクターは、例えば、colE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、pKSM、及びRP4など、大腸菌に由来するプラスミドを含む。原核細胞用
ベクターはまた、例えば、M13及び他の繊維状一本鎖DNAファージなど、ファージDNAの誘導体も含む。酵母内で有用なベクターの例は、2μプラスミドである、pYD1、pCTCON2、pDNL6、pPNL6、pNLS、pPIC、及びpGAPZである。哺乳動物細胞内の発現に適するベクターは、SV40、アデノウイルス、レトロウイルスの周知の派生物、他のウイルス由来のDNA配列、pDisplay(商標)、並びに上記で記載した哺乳動物用ベクターなど、機能的な哺乳動物用ベクターと、機能的なプラスミドと、ファージDNAとの組合せに由来するシャトルベクターを含む。
ベクターはまた、例えば、M13及び他の繊維状一本鎖DNAファージなど、ファージDNAの誘導体も含む。酵母内で有用なベクターの例は、2μプラスミドである、pYD1、pCTCON2、pDNL6、pPNL6、pNLS、pPIC、及びpGAPZである。哺乳動物細胞内の発現に適するベクターは、SV40、アデノウイルス、レトロウイルスの周知の派生物、他のウイルス由来のDNA配列、pDisplay(商標)、並びに上記で記載した哺乳動物用ベクターなど、機能的な哺乳動物用ベクターと、機能的なプラスミドと、ファージDNAとの組合せに由来するシャトルベクターを含む。
A.インビトロディスプレイ法のための多様なライブラリー
本発明のライブラリーのある特定の実施形態は、各々を、リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸変異を含む修飾リボ毒性領域へと融合させた、複数の結合領域をコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリーである。
本発明のライブラリーのある特定の実施形態は、各々を、リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸変異を含む修飾リボ毒性領域へと融合させた、複数の結合領域をコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリーである。
本発明のライブラリーのある特定の実施形態は、各々を、リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸変異を含む修飾リボ毒性領域へと融合させ、各々が、作動可能な組合せで、宿主細胞による発現又は無細胞系内の発現が可能である、複数の結合領域をコードすることが可能な複数のポリヌクレオチドを含む核酸発現ライブラリーである。
本発明の核酸のある特定の実施形態は、各々を、リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1カ所のアミノ酸変異を含む修飾リボ毒性領域へと融合させ、各々が、作動可能な組合せで、宿主細胞内の発現又は無細胞系内の発現が可能である、複数の結合領域をコードすることが可能な修飾リボ毒性領域内の1カ所又は2カ所以上の変異を元に戻すことにより創出される核酸である。
本発明の方法により創出される核酸、核酸ライブラリー、ポリペプチド、及び/又はディスプレイポリペプチドライブラリーのある特定の実施形態は、例えば、ファージディスプレイスクリーニング、リボソームディスプレイスクリーニング、RNAディスプレイスクリーニング、及びDNA連結ディスプレイスクリーニングなど、当業者に公知の多様な手法を介するインビトロディスプレイスクリーニングのために作動可能でありうる。
1.ファージディスプレイスクリーニングライブラリー
一般的なファージディスプレイライブラリーは、複雑性が1×106〜1×1010の範囲にあることが典型的である(Thie H et al., Curr Pharm Biotechnol 9: 439-46 (2008); Bratkovic T,Cell Mol Life Sci 67: 749-67 (2010))。ファージディスプレイラ
イブラリーは、例えば、米国特許第6,605,448号明細書;Clackson T, Lowman H,Phage Display: A Practical Approach (Oxford University Press 2004); Lindner Tet al., Molecules 16: 1625-41 (2011); Huan Qi et al., J Mol Biol 417: 129-143(2012); Huang R et al., Methods 58: 10-7 (2012)における方法など、当業者に公知の方
法により創出することができる。ファージディスプレイライブラリーの構築は、核酸によりコードされるポリペプチドを、ファージの表面上に、例えば、pIII、pVI、PVII、pVIII、pIX、遺伝子10カプシドタンパク質、gpSoc、gpHoc、及びgpDなどのカプシドタンパク質による融合を介してディスプレイするように、核酸を、例えば、繊維状ファージである、T4、T7、ラムダ(λ)などのファージ又はファージのファージミドゲノムへとライゲーションすることにより達成することができる(例えば、Krumpe L
et al., Proteomics 6: 4210-22 (2006); Dai M et al., Protein Eng Des Sel 21:413-424 (2008); Oslizlo A et al., BMC Biotechnol 11: 59 (2011)を参照されたい)。
一般的なファージディスプレイライブラリーは、複雑性が1×106〜1×1010の範囲にあることが典型的である(Thie H et al., Curr Pharm Biotechnol 9: 439-46 (2008); Bratkovic T,Cell Mol Life Sci 67: 749-67 (2010))。ファージディスプレイラ
イブラリーは、例えば、米国特許第6,605,448号明細書;Clackson T, Lowman H,Phage Display: A Practical Approach (Oxford University Press 2004); Lindner Tet al., Molecules 16: 1625-41 (2011); Huan Qi et al., J Mol Biol 417: 129-143(2012); Huang R et al., Methods 58: 10-7 (2012)における方法など、当業者に公知の方
法により創出することができる。ファージディスプレイライブラリーの構築は、核酸によりコードされるポリペプチドを、ファージの表面上に、例えば、pIII、pVI、PVII、pVIII、pIX、遺伝子10カプシドタンパク質、gpSoc、gpHoc、及びgpDなどのカプシドタンパク質による融合を介してディスプレイするように、核酸を、例えば、繊維状ファージである、T4、T7、ラムダ(λ)などのファージ又はファージのファージミドゲノムへとライゲーションすることにより達成することができる(例えば、Krumpe L
et al., Proteomics 6: 4210-22 (2006); Dai M et al., Protein Eng Des Sel 21:413-424 (2008); Oslizlo A et al., BMC Biotechnol 11: 59 (2011)を参照されたい)。
ファージにより提示されたポリペプチドの産生に加えて、各ファージディスプレイベクタークローンを使用して、さらなる操作を伴わず、大腸菌のある特定の株内で、カプシドタンパク質を伴わずに、ポリペプチドを産生することができる。
2.リボソームディスプレイスクリーニングライブラリー
リボソームディスプレイスクリーニングは、1×1013の大きさのライブラリー上で実施されている(He M, Taussig M, Nat Methods 4: 281-8 (2007); Zahnd C et al., NatMethods 4: 269-79 (2007))。リボソームディスプレイライブラリーは、例えば、RibosomeDisplay and Related Technologies - Methods and Protocols, Methods in MolecularBiology, vol. 805: pp. 349-366 (Eds. Douthwaite J, Jackson R. Humana Press2012); Passiora T, Suga H, Chemistry 19: 6530-6 (2013)における方法など、当業者に公知の方法により創出することができる。リボソームディスプレイライブラリーの複雑性に対する上限は、1×1015メンバーの大きさのライブラリーを作製するポテンシャルを備えるライブラリーを作製するのに妥当に使用されうるPCR容量に対する限界から得られる(Yang L et al., PLoS One 3: e2092 (2008))。
リボソームディスプレイスクリーニングは、1×1013の大きさのライブラリー上で実施されている(He M, Taussig M, Nat Methods 4: 281-8 (2007); Zahnd C et al., NatMethods 4: 269-79 (2007))。リボソームディスプレイライブラリーは、例えば、RibosomeDisplay and Related Technologies - Methods and Protocols, Methods in MolecularBiology, vol. 805: pp. 349-366 (Eds. Douthwaite J, Jackson R. Humana Press2012); Passiora T, Suga H, Chemistry 19: 6530-6 (2013)における方法など、当業者に公知の方法により創出することができる。リボソームディスプレイライブラリーの複雑性に対する上限は、1×1015メンバーの大きさのライブラリーを作製するポテンシャルを備えるライブラリーを作製するのに妥当に使用されうるPCR容量に対する限界から得られる(Yang L et al., PLoS One 3: e2092 (2008))。
3.RNAディスプレイスクリーニングライブラリー
RNAディスプレイスクリーニング法は、約1×1014という高度な多様性を伴うライブラリー上で実施されている(例えば、Valencia C et al., Biotechnol Prog 24: 561-9 (2008); Takahashi T,Roberts R, Meth Mol B 535: 293-314 (2009); DeKosky B et al., Nat Biotechnol 31:166-9 (2013)を参照されたい)。RNAディスプレイライブラリーは、例えば、Keefe A, CurrProtoc Mol Biol, Ch. 24: Unit 24.5 (2001); Cotton S et al., Nat Protoc 6:1163-82 (2011); Cotten S et al., Methods Mol Biol 805: 287-97 (2012); Wang etal., Methods Mol Biol 805: 87-100 (2012); Barendt P et al., ACS Comb Sci 15:77-81 (2013)における方法など、当業者に公知の方法により創出す
ることができる。
RNAディスプレイスクリーニング法は、約1×1014という高度な多様性を伴うライブラリー上で実施されている(例えば、Valencia C et al., Biotechnol Prog 24: 561-9 (2008); Takahashi T,Roberts R, Meth Mol B 535: 293-314 (2009); DeKosky B et al., Nat Biotechnol 31:166-9 (2013)を参照されたい)。RNAディスプレイライブラリーは、例えば、Keefe A, CurrProtoc Mol Biol, Ch. 24: Unit 24.5 (2001); Cotton S et al., Nat Protoc 6:1163-82 (2011); Cotten S et al., Methods Mol Biol 805: 287-97 (2012); Wang etal., Methods Mol Biol 805: 87-100 (2012); Barendt P et al., ACS Comb Sci 15:77-81 (2013)における方法など、当業者に公知の方法により創出す
ることができる。
4.DNA連結ディスプレイライブラリー
DNA連結ディスプレイ法は、1×1012メンバーを超えるライブラリー上で実施されている(Eldridge B et al., Protein Eng Des Sel 22: 691-8 (2009))。DNA連結
ディスプレイライブラリーは、当業者に公知の方法により創出することができる。
DNA連結ディスプレイ法は、1×1012メンバーを超えるライブラリー上で実施されている(Eldridge B et al., Protein Eng Des Sel 22: 691-8 (2009))。DNA連結
ディスプレイライブラリーは、当業者に公知の方法により創出することができる。
インビトロにおけるコンパートメント化を、リボソームディスプレイ法、RNAディスプレイ法、及びDNA連結ディスプレイ法のために使用することができる。インビトロコンパートメント化法は、物理的に隔離されたエマルジョンコンパートメントに基づき、インビトロにおける大規模なタンパク質ライブラリーの構築と、タンパク質の、その遺伝子型を表す分子への連結とを可能とする(Miller O et al., Nat Methods 3: 561-570 (2006); Lu W et al., Methods60: 75-80 (2013))。
B.細胞表面ディスプレイ法のための多様なライブラリー
本発明の方法により創出される核酸、核酸ライブラリー、ポリペプチド、及び/又はディスプレイポリペプチドライブラリーのある特定の実施形態は、例えば、細菌ディスプレイスクリーニング、酵母ディスプレイスクリーニング、昆虫細胞ディスプレイスクリーニング、及び哺乳動物細胞ディスプレイスクリーニングなど、当業者に公知の多様な手法を介する細胞表面ディスプレイスクリーニングのために作動可能でありうる。
本発明の方法により創出される核酸、核酸ライブラリー、ポリペプチド、及び/又はディスプレイポリペプチドライブラリーのある特定の実施形態は、例えば、細菌ディスプレイスクリーニング、酵母ディスプレイスクリーニング、昆虫細胞ディスプレイスクリーニング、及び哺乳動物細胞ディスプレイスクリーニングなど、当業者に公知の多様な手法を介する細胞表面ディスプレイスクリーニングのために作動可能でありうる。
1.原核細胞表面ディスプレイライブラリー
細菌ディスプレイスクリーニングは、1×1011という高度な多様性を伴うライブラリー上で実施されている(Daugherty P, Curr Opin Struct Biol 17: 474-80 (2007))。原核細胞ディスプレイライブラリーは、当業者に公知の方法により創出することができる(例えば、Jose J, Appl Microbiol Biotechnol 69: 607-14 (2006); Jose J, MeyerT, Microbiol Mol Biol Rev 71: 600-19 (2007)を参照されたい)。
細菌ディスプレイスクリーニングは、1×1011という高度な多様性を伴うライブラリー上で実施されている(Daugherty P, Curr Opin Struct Biol 17: 474-80 (2007))。原核細胞ディスプレイライブラリーは、当業者に公知の方法により創出することができる(例えば、Jose J, Appl Microbiol Biotechnol 69: 607-14 (2006); Jose J, MeyerT, Microbiol Mol Biol Rev 71: 600-19 (2007)を参照されたい)。
2.酵母細胞表面ディスプレイライブラリー
酵母表面ディスプレイスクリーニングは、1×109という高度な多様性を伴うライブラリー上で実施されている(Feldhaus M et al., Nat Biotechnol 21: 163-70 (2003))
。リボソームディスプレイライブラリーは、例えば、Chao G et al., Nat Protoc 1:755-68 (2006); Benatuil L et al., Protein Eng Des Sel 23: 155-9 (2010); VanDeventer J, Wittrup K, Methods Mol Biol 1131: 151-81 (2014)における方法など、当業者に公知の方法により創出することができる。
酵母表面ディスプレイスクリーニングは、1×109という高度な多様性を伴うライブラリー上で実施されている(Feldhaus M et al., Nat Biotechnol 21: 163-70 (2003))
。リボソームディスプレイライブラリーは、例えば、Chao G et al., Nat Protoc 1:755-68 (2006); Benatuil L et al., Protein Eng Des Sel 23: 155-9 (2010); VanDeventer J, Wittrup K, Methods Mol Biol 1131: 151-81 (2014)における方法など、当業者に公知の方法により創出することができる。
3.昆虫細胞表面ディスプレイ
昆虫細胞表面ディスプレイスクリーニングは、1×105メンバーを超えるライブラリー上で実施されている。昆虫細胞上の細胞表面ディスプレイのための、バキュロウイルスディスプレイライブラリーは、当業者に公知の方法により創出することができる(例えば、Ernst W et al., Nucleic Acids Res 26: 1718-23 (1998); Crawford F etal., PLoS Biol 2: 523-533 (2004); Wang Y et al., Proc Natl Acad Sci USA 102:2476-81; Meller H et al., BMC Biotechnology 8: 64-70 (2008)を参照されたい)。
昆虫細胞表面ディスプレイスクリーニングは、1×105メンバーを超えるライブラリー上で実施されている。昆虫細胞上の細胞表面ディスプレイのための、バキュロウイルスディスプレイライブラリーは、当業者に公知の方法により創出することができる(例えば、Ernst W et al., Nucleic Acids Res 26: 1718-23 (1998); Crawford F etal., PLoS Biol 2: 523-533 (2004); Wang Y et al., Proc Natl Acad Sci USA 102:2476-81; Meller H et al., BMC Biotechnology 8: 64-70 (2008)を参照されたい)。
4.哺乳動物細胞表面ディスプレイライブラリー
哺乳動物細胞表面ディスプレイスクリーニングは、異なる形態で広く適用されるようになっている(Bowers Pet al., Methods 65: 44-56 (2014); King D et al., Curr Drug Discov Technol 11:56-64 (2014))。哺乳動物細胞ディスプレイライブラリーは、例え
ば、Zhou C et al., MAbs 2: 508-518 (2010); Bowers P etal., Proc Natl Acad Sci USA 108: 20455-60 (2011)における方法など、当業者に公知の方法により創出することが
できる。
哺乳動物細胞表面ディスプレイスクリーニングは、異なる形態で広く適用されるようになっている(Bowers Pet al., Methods 65: 44-56 (2014); King D et al., Curr Drug Discov Technol 11:56-64 (2014))。哺乳動物細胞ディスプレイライブラリーは、例え
ば、Zhou C et al., MAbs 2: 508-518 (2010); Bowers P etal., Proc Natl Acad Sci USA 108: 20455-60 (2011)における方法など、当業者に公知の方法により創出することが
できる。
C.ディスプレイスクリーニングのための発現ライブラリーの構築
発現ライブラリーは、各々が融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、発現ベクターと接合させることにより構築することができる。
発現ライブラリーは、各々が融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、発現ベクターと接合させることにより構築することができる。
「作動可能な組合せ」という用語は、発現又はディスプレイなど、所望される機能を達成するように、コード配列を連結するか又は接合させる方式を指す。当技術分野では、作動可能な組合せを達成する方法が周知であり、有効な発現のために配列をインフレームに置くこと、又は配列を配列の機能(すなわち、発現時における、プロモーター又はエンハンサーの機能)を利用するのに有効な空間的距離内に置くことなど、周知の慣行を含む。
「多様な核酸の発現ライブラリー」という用語は、結合領域及び修飾リボ毒性領域を含む複数の融合ポリペプチドをコードすることが可能なポリヌクレオチドのコレクションを指す。このライブラリーを、作動可能な組合せで、有効な発現及び提示に必要とされる配列と接合させることにより、「多様なメンバーの発現ライブラリー」を構築及び活用して、複数の融合ポリペプチドを発現させることができ、ここで、各融合ポリペプチドは、前記結合領域及び前記リボ毒性領域を含む。
方法の可能な第1のステップは、融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドの核酸ライブラリーを構築するステップである。この構築の第1のステップは、異なる結合領域をコードする複数のポリヌクレオチドを用意するステップである(例えば、国際
特許公開第2005/012481号パンフレット;国際特許公開第2005/111081号パンフレット、国際特許公開第2008/067547号パンフレット;国際特許公開第2010/059981号パンフレット;米国特許第8,426,187号明細書;米国特許第8,722,586号明細書を参照されたい)。このステップは、非免疫化生物に由来するナイーブ結合領域の単離(例えば、Zhu Z, Dimitrov D, Methods Mol Biol 525:129-42 (2009)を参照されたい)、又は合成ライブラリー構築を介する方法(例え
ば、Griffiths et al., EMBO J 13: 3245-60 (1994); Mondon Pet al., Front Biosci 13: 1117-29 (2008); Prassler J et al., J Mol Biol 413:261-78 (2011)を参照された
い)など、当技術分野で周知の多くの方法を使用して達成することができる。
特許公開第2005/012481号パンフレット;国際特許公開第2005/111081号パンフレット、国際特許公開第2008/067547号パンフレット;国際特許公開第2010/059981号パンフレット;米国特許第8,426,187号明細書;米国特許第8,722,586号明細書を参照されたい)。このステップは、非免疫化生物に由来するナイーブ結合領域の単離(例えば、Zhu Z, Dimitrov D, Methods Mol Biol 525:129-42 (2009)を参照されたい)、又は合成ライブラリー構築を介する方法(例え
ば、Griffiths et al., EMBO J 13: 3245-60 (1994); Mondon Pet al., Front Biosci 13: 1117-29 (2008); Prassler J et al., J Mol Biol 413:261-78 (2011)を参照された
い)など、当技術分野で周知の多くの方法を使用して達成することができる。
例えば、免疫化材料を特異的にターゲティングする免疫グロブリンドメインについて濃縮された核酸の単離のために、生物において免疫細胞を発生させる目的で、標的分子若しくは標的分子をコードする核酸、腫瘍細胞、又は細胞内病原体で、生物を免疫化することができる(例えば、Popkov M, Berry J, Phage Display in Biotechnology and DrugDiscovery. Ch. 15: pp. 529-657 (CRC Press 2005)を参照されたい)。この方法では、適応免疫系を伴う任意の脊椎動物を使用しうるが、ヒトへの投与のための細胞毒性ポリペプチドを産生する場合の効率は、ヒト、ヒト細胞、又はトランスジェニックヒト免疫系を含む生物を活用することにより得ることができる。免疫化のために想定される一部の脊椎動物は、ヒト、マウス、ウサギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ヒツジ、ヤギ、及び鳥類を含む。ヒトベースの免疫系又は細胞を使用しない場合は、結果として得られる結合領域を、開発工程において、周知の手順であるヒト化を使用して、任意に最適化しうることが想定される(Almagro J, Fransson J, Frontiers in Biosci 1: 1619-33 (2008))。
分子の供給源、すなわち、死滅させるがん細胞型が既知である限りにおいて、求められる正確な標的分子についてあらかじめ知ることは必要でない(Shen et al., Cell Research 17: 650-60 (2007))。当技術分野で周知の通り、交差選択工程を使用することにより、死滅させようとする細胞型には特異的であるが、死滅させない細胞型上では比較的まれな分子をターゲティングする結合領域を単離することが可能である。この工程は、処置される対象における、非がん性細胞の意図されない死亡を引き起こす、望ましくない副作用を低減する一助となる(がん治療法の開発におけるディスプレイライブラリーの使用の包括的な総説については、Dantas-Barbosa C et al., Int J of Mol Sci 12: 5420-40 (2012)を参照されたい)。
タンパク質ディスプレイスクリーニングは、例えば、環状ペプチド、並びに、例えば、フレキシザイム、アミノアシル−tRNAの化学合成(例えば、Ribosome Display and Related Technologies - Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology, vol. 805: pp. 349-366 (Eds. Douthwaite J, JacksonR. Humana Press 2012); Albayrak C,
Swartz J, Nucleic Acids Res 41: 5949-63 (2013); Passiora T, Suga H, Chemistry19: 6530-6 (2013)を参照されたい)、又はある範囲の化学的戦略を介する翻訳後修飾(AngeliniA, Heinis C, Curr Opin Chem Biol 15: 355-61 (2011))など、多様な手法を使
用して組み込まれうる、β−シクロヘキシルアラニン(Cha,β-cyclohexylalanine)、β−(2−ナフチル)アラニン(Nap,β-(2-naphthyl)alanine)、シトルリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ホモシステイン(Hcy又はHey,homocysteine)、ヒドロキシプロリン(Hyp,hydroxyproline)、ヒドロキシプロリンヒプシン、N−ホルミルメチオニン、オルニチン(Orn,ornthinine)、ペニシラミン(Pen,penicillamine)、p−アセチルフェニルアラニン、p−アジドフェニルアラニン(pAzF,p-azidophenylalanine)、p−ベンゾフェニルアラニン、p−プロパルギルオキシフェニ
ルアラニン(pPaF,p-propargyloxyphenylalanine)、4−クロロフェニルアラニン
(PhCl,4-chlorophenylalanine)、ピログルタミン酸、ピロリシン(Pyl,pyrrolysine)、セレノシステイン(Scy又はSec,selenocysteine)、セレノメチオニン
、チロキシン、及びo−メチルチロシンなどの非天然アミノ酸など、さらなる特徴を含むポリペプチドのライブラリー上で実施することができる。
Swartz J, Nucleic Acids Res 41: 5949-63 (2013); Passiora T, Suga H, Chemistry19: 6530-6 (2013)を参照されたい)、又はある範囲の化学的戦略を介する翻訳後修飾(AngeliniA, Heinis C, Curr Opin Chem Biol 15: 355-61 (2011))など、多様な手法を使
用して組み込まれうる、β−シクロヘキシルアラニン(Cha,β-cyclohexylalanine)、β−(2−ナフチル)アラニン(Nap,β-(2-naphthyl)alanine)、シトルリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ホモシステイン(Hcy又はHey,homocysteine)、ヒドロキシプロリン(Hyp,hydroxyproline)、ヒドロキシプロリンヒプシン、N−ホルミルメチオニン、オルニチン(Orn,ornthinine)、ペニシラミン(Pen,penicillamine)、p−アセチルフェニルアラニン、p−アジドフェニルアラニン(pAzF,p-azidophenylalanine)、p−ベンゾフェニルアラニン、p−プロパルギルオキシフェニ
ルアラニン(pPaF,p-propargyloxyphenylalanine)、4−クロロフェニルアラニン
(PhCl,4-chlorophenylalanine)、ピログルタミン酸、ピロリシン(Pyl,pyrrolysine)、セレノシステイン(Scy又はSec,selenocysteine)、セレノメチオニン
、チロキシン、及びo−メチルチロシンなどの非天然アミノ酸など、さらなる特徴を含むポリペプチドのライブラリー上で実施することができる。
本発明のライブラリーの細胞毒性ポリペプチド、及び/又は本発明の方法を使用するスクリーニングにより同定される細胞毒性ポリペプチドは、例えば、毒素触媒ドメイン又はRNアーゼなど、他の酵素ドメインなど、自然発生のタンパク質又はポリペプチドと、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40又はこれを超えるアミノ酸残基(ただし、配列決定された領域内で、少なくとも85%、90%、95%、99%又はこれを超えるアミノ酸配列同一性を保持する配列において許容される差違以下)異なりうる。こうして、自然発生のタンパク質に由来するリボ毒性領域は、それが由来する親タンパク質の自然発生のポリペプチド領域に対して、少なくとも85%、90%、95%、99%又はこれを超えるアミノ酸配列同一性が維持される限りにおいて、元の配列に対する付加、欠失、切断、又は他の変化を含みうる。
特に、本発明は、本発明の細胞毒性融合ポリペプチドのバリアントであって、志賀毒素リボ毒性領域が、自然発生の志賀毒素Aサブユニットと、例えば、付加、欠失、切断、又は他の変化などにより、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40又はこれを超えるアミノ酸残基(ただし、少なくとも85%、90%、95%、99%又はこれを超えるアミノ酸配列同一性を保持する配列において許容される差違以下)異なるバリアントを提供する。したがって、ある特定の実施形態では、志賀毒素リボ毒性領域は、SLT−1A(配列番号1)、StxA(配列番号2)、SLT−2A(配列番号3)、及び/又は志賀毒素エフェクター領域ポリペプチド(配列番号4)など、自然発生の志賀毒素Aサブユニットに対して、少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%又は99.7%の全体的な配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれらから本質的になる。
ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、本発明の任意の方法を使用して創出又は同定された細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、本発明の任意の方法により産生された核酸である。ある特定のさらなる実施形態では、核酸は、配列番号40〜64のうちのいずれか1つによるポリヌクレオチド配列又はその誘導体を含む。ある特定の実施形態では、本発明の分子ライブラリーは、本発明の任意の方法により産生されたライブラリーである。ある特定のさらなる実施形態では、分子ライブラリーは、配列番号40〜64のうちのいずれか1つによるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
VII.本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドの産生
修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、非修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、本発明のスクリーニング法を使用して同定される任意のポリペプチドは、本発明の範囲内にある。これは、本発明のスクリーニング法を使用する、1又は2以上の特徴についてのスクリーニング、陽性選択、陰性選択、及び/又は濃縮の結果としてもたらされる、任意のポリペプチドライブラリーを含む。加えて、これは、例えば、本発明の任意の方法を使用して同定される配列情報を使用して創出される細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドなど、同定されるポリペプチド配列に由来する任意のポリペプチド又はタンパク質も含む。
修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、非修飾リボ毒性領域に基づくのであれ、本発明のスクリーニング法を使用して同定される任意のポリペプチドは、本発明の範囲内にある。これは、本発明のスクリーニング法を使用する、1又は2以上の特徴についてのスクリーニング、陽性選択、陰性選択、及び/又は濃縮の結果としてもたらされる、任意のポリペプチドライブラリーを含む。加えて、これは、例えば、本発明の任意の方法を使用して同定される配列情報を使用して創出される細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドなど、同定されるポリペプチド配列に由来する任意のポリペプチド又はタンパク質も含む。
本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドの他に、このような細胞毒性タンパク質又は細胞毒性融合ポリペプチド、又はこれらの機能的な部分をコードするポリヌクレオチドも、本発明の範囲内にある。「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と同義であり、これらのいずれも、デオキシリボ核酸(DNA,deoxyribonucle
ic acid)のポリマー、リボ核酸(RNA,ribonucleic acid)のポリマー、ヌクレオチ
ドアナログを使用して作製されるこれらのDNA又はRNAのアナログ、並びにこれらの誘導体、断片及びホモログを含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、三本鎖の場合もある。開示されるポリヌクレオチドは、例示的な細胞毒性融合ポリペプチドをコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドであって、例えば、RNAコドンの第3の位置において許容されることが公知のゆらぎを考慮しても、なお、異なるRNAコドンと同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むように具体的に開示される(Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)を参照されたい)。
ic acid)のポリマー、リボ核酸(RNA,ribonucleic acid)のポリマー、ヌクレオチ
ドアナログを使用して作製されるこれらのDNA又はRNAのアナログ、並びにこれらの誘導体、断片及びホモログを含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、三本鎖の場合もある。開示されるポリヌクレオチドは、例示的な細胞毒性融合ポリペプチドをコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドであって、例えば、RNAコドンの第3の位置において許容されることが公知のゆらぎを考慮しても、なお、異なるRNAコドンと同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むように具体的に開示される(Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)を参照されたい)。
一態様では、本発明は、本発明の細胞毒性融合ポリペプチド、又はその断片若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、細胞毒性融合ポリペプチドのアミノ酸配列のうちの1つを含むポリペプチドと、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%又はこれを超えて同一なポリペプチドをコードする核酸配列を含みうる。本発明はまた、本発明の細胞毒性融合ポリペプチド、又はその断片若しくは誘導体、又は任意のこのような配列のアンチセンス若しくは相補体をコードするポリヌクレオチドと、厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含む。
本発明のポリヌクレオチド(又は細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチド)の誘導体又はアナログは、とりわけ、例えば、同じサイズのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に対する、又は、配列決定された配列であって、当技術分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによりアライメントがなされた配列と比較した場合の、少なくとも約45%、50%、70%、80%、95%、98%、なお又は99%の同一性(80〜99%の同一性が好ましい)により、本発明のポリヌクレオチド又は細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドと実質的に相同な領域を有するポリヌクレオチド(又はポリペプチド)分子を含む。例示的なプログラムは、Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math. 2: 482-9 (1981)によるアルゴリズムを使用する、デフォルトの設定を使用した、GAP
プログラム(G Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison, WI, U.S.製のWisconsin Sequence AnalysisPackage, Version 8 for UNIX)である。また、本
発明のタンパク質をコードする配列の相補体と、厳密な条件(例えば、Ausubel F et al.,Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY,U.S.,
1993)を参照されたい)、及びこれを下回る条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドも含まれる。当業者には、厳密な条件が公知であり、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY,U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989))
において見出すことができる。
プログラム(G Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison, WI, U.S.製のWisconsin Sequence AnalysisPackage, Version 8 for UNIX)である。また、本
発明のタンパク質をコードする配列の相補体と、厳密な条件(例えば、Ausubel F et al.,Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY,U.S.,
1993)を参照されたい)、及びこれを下回る条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドも含まれる。当業者には、厳密な条件が公知であり、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY,U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989))
において見出すことができる。
本発明はさらに、本発明の範囲内のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドをコードすることが可能なポリヌクレオチドは、発現ベクターを産生するための、当技術分野で周知の材料及び方法を使用して、細菌プラスミド、ウイルスベクター及びファージベクターを含む公知のベクターへと挿入することができる。このような発現ベクターは、えり抜きの任意の宿主細胞又は無細胞発現系(例えば、pTxb1及びpIVEX2.3)における、想定される細胞毒性タンパク質及
び細胞毒性ポリペプチドの産生を支援するのに必要なポリヌクレオチドを含むであろう。当業者には、宿主細胞又は無細胞発現系の具体的な種類を伴う使用のための発現ベクターを構成する具体的なポリヌクレオチドが周知であり、日常的な実験を使用して決定することもでき、購入することもできる。
び細胞毒性ポリペプチドの産生を支援するのに必要なポリヌクレオチドを含むであろう。当業者には、宿主細胞又は無細胞発現系の具体的な種類を伴う使用のための発現ベクターを構成する具体的なポリヌクレオチドが周知であり、日常的な実験を使用して決定することもでき、購入することもできる。
本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、1又は2以上の発現単位を含む、直鎖状又は環状のポリヌクレオチドを指す。「発現単位」という用語は、所望のポリペプチドをコードし、宿主細胞内の核酸セグメントの発現をもたらすことが可能なポリヌク
レオチドセグメントを表す。発現単位は、全てが作動可能に構成される、転写プロモーター、所望のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写ターミネーターを含むことが典型的である。発現ベクターは、1又は2以上の発現単位を含有する。こうして、本発明の文脈では、単一のポリペプチド鎖(例えば、志賀毒素リボ毒性領域で遺伝子組換えされたscFv)を含む細胞毒性融合ポリペプチドをコードする発現ベクターが、単一のポリペプチド鎖のための少なくとも発現単位を含むのに対し、例えば、2つ又は3つ以上のポリペプチド鎖を含む(例えば、1つの鎖が、VLドメインを含み、第2のドメインがリボ毒性領域へと連結されたVHドメインを含む)細胞毒性融合タンパク質は、タンパク質の2つのポリペプチド鎖の各々に1つずつの、少なくとも2つの発現単位を含む。多重鎖細胞毒性タンパク質を発現させるために、各ポリペプチド鎖のための発現単位はまた、異なる発現ベクター上に、個別に含有される場合もある(例えば、発現は、各ポリペプチド鎖のための発現ベクターを導入した単一の宿主細胞により達成することができる)。
レオチドセグメントを表す。発現単位は、全てが作動可能に構成される、転写プロモーター、所望のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写ターミネーターを含むことが典型的である。発現ベクターは、1又は2以上の発現単位を含有する。こうして、本発明の文脈では、単一のポリペプチド鎖(例えば、志賀毒素リボ毒性領域で遺伝子組換えされたscFv)を含む細胞毒性融合ポリペプチドをコードする発現ベクターが、単一のポリペプチド鎖のための少なくとも発現単位を含むのに対し、例えば、2つ又は3つ以上のポリペプチド鎖を含む(例えば、1つの鎖が、VLドメインを含み、第2のドメインがリボ毒性領域へと連結されたVHドメインを含む)細胞毒性融合タンパク質は、タンパク質の2つのポリペプチド鎖の各々に1つずつの、少なくとも2つの発現単位を含む。多重鎖細胞毒性タンパク質を発現させるために、各ポリペプチド鎖のための発現単位はまた、異なる発現ベクター上に、個別に含有される場合もある(例えば、発現は、各ポリペプチド鎖のための発現ベクターを導入した単一の宿主細胞により達成することができる)。
当技術分野では、ポリペプチド及びタンパク質の一過性発現又は安定的発現を方向付けることが可能な発現ベクターが周知である。発現ベクターは一般に、以下:それらの各々が当技術分野で周知の、異種シグナル配列又は異種シグナルペプチド、複製起点、1又は2以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの1又は2以上を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、援用されうる、任意の調節制御配列、組込み配列、及び有用なマーカーが公知である。
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターの複製又は発現を支援しうる細胞を指す。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞又は真核細胞(例えば、酵母、昆虫、両生動物、鳥類、又は哺乳動物細胞)でありうる。本発明のポリヌクレオチドを含むか、又は本発明の細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドを産生することが可能な宿主細胞株の創出及び単離は、当業者に公知の標準的技法を使用して達成することができる。
「無細胞翻訳」という用語は、無傷細胞の非存在下における、ポリペプチドの、それをコードする核酸からの産生を指す。一般に、無細胞翻訳系は、原核生物種又は真核生物種に由来する機能的リボソームを伴う細胞抽出物を含む。半合成又は完全合成による産生のための化学的ポリペプチド合成法は、「無細胞翻訳」の範囲内にある。「ポリペプチド合成の化学的方法」という用語は、例えば、小型のポリペプチド及び/又はペプチドの、より大型のポリペプチドへのライゲーションなど、化学的方法を使用する合成ポリペプチドの創出を含む。化学的ライゲーション反応の非限定的な例は、インテインを使用する天然の化学的ライゲーション又はシュタウディンガー反応を含む。本発明の細胞毒性タンパク質又は細胞毒性ポリペプチドを産生するように、無細胞翻訳系を決定及び最適化することは、当業者に公知の標準的技法を使用して達成することができる。
[実施例]
[実施例]
以下の実施例では、本発明のある特定の実施形態が実証される。しかし、これらの実施例は、例示だけを目的とするものであり、本発明の条件及び範囲について、完全に限定的であることを意図するものではなく、そのようにみなすべきでもないことを理解されたい。以下の実施例における実験は、そうでないことが詳細に記載される場合を除き、当業者に周知であり日常的である、標準的な技法を使用して実行した。
リボ毒性ポリペプチドを伴うポリペプチド発現ライブラリーのタンパク質ディスプレイスクリーニングについての以下の実施例では、リボ毒性領域を含むポリペプチドをスクリーニングし、濃縮し、同定し、開発する場合に、リボ毒性を低減した文脈及び/又は非リボ毒性の文脈を使用する、有効性及び効率の改善が実証される。リボ毒素活性を低減するか又は消失させたタンパク質ディスプレイスクリーニングについてのこれらの実施例は、
ライブラリーサイズが比較的大規模であり、スクリーニングをワンステップで実施しうるため、細胞ターゲティング結合領域及びリボ毒性領域の両方を含む融合ポリペプチドの文脈では、細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定するための頑健で例示的な方法を示す。
ライブラリーサイズが比較的大規模であり、スクリーニングをワンステップで実施しうるため、細胞ターゲティング結合領域及びリボ毒性領域の両方を含む融合ポリペプチドの文脈では、細胞毒性タンパク質及び細胞毒性ポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定するための頑健で例示的な方法を示す。
本発明は、国際特許公開第2005/092917号パンフレット、国際特許公開第2007/033497号パンフレット、米国特許出願公開第2007/0298434号明細書、米国特許出願公開第2009/0156417号明細書、欧州特許第1727827号明細書、欧州特許第2228383号明細書、欧州特許第2402367号明細書、米国特許出願公開第2013/0196928号明細書、及び欧州特許第1945660号明細書において記載されている方法と関連するスクリーニングを実施するうちに発見された。提示されるポリペプチドのライブラリー内にリボ毒性が存在すると、インビトロ結合アッセイを使用するスクリーニング時において、結合シグナルが大幅に低減され、リボ毒性領域の触媒ドメイン内の、例外的にまれな自発的ミュータントに対する、強力で望ましくない選択バイアスが引き起こされることが発見されたのは予測外であった。
実施例5では、非修飾リボ毒性発現ライブラリー(すなわち、完全リボ毒性発現ライブラリー)についてのインビトロディスプレイスクリーニングにより、リボ毒性領域の触媒活性を不活性化する自発的変異を含む、単一の主要なポリペプチドであって、偽陽性を表すポリペプチドが得られた。触媒不活性化リボ毒性領域を含むポリペプチドを提示するファージクローンは、ファージELISAにおいて、同一な結合領域と、完全な触媒活性を伴う野生型毒素由来のリボ毒性領域とを含む陽性対照と比較して、1.7〜2.9倍の結合シグナルを示した。この望ましくない選択バイアス及び偽陽性問題は、発現ライブラリー内及びスクリーニング時において提示される融合ポリペプチド内のリボ毒性領域のリボ毒性を低減するか又は消失させることにより解決される。
結合アフィニティーに基づくインビトロ選択アッセイが、リボ毒性構成要素の存在により著明に損なわれることは、驚くべきことであった。理論に束縛されずに述べると、触媒不活性化毒素構成要素に対するこの強力な選択バイアスは、リボ毒性の低減又は消失により付与される繁殖有利性により引き起こされる偽陽性を表しうる(Vodnik M et al., Molecules 16: 790-817 (2011)を参照されたい)。増殖率がわずか数パーセント異なるだけ
で、ファージライブラリー内の多様性が損なわれ、ライブラリーが、選択される表現型から独立のクローンについて濃縮され、少数のクローンへの収束が結果としてもたらされることが多い(Derda R et al., Molecules 16: 1776-1803 (2011))。予測外の偽陽性率は、スクリーニングの前に、ライブラリーによりコードされるポリペプチドのリボ毒性を低減するか又は消失させることにより(おそらく、個々のファージライブラリークローン間でより最適な増殖動態及び/又はより均一な増殖動態を可能とすることにより)、著明に低下させることができる。
で、ファージライブラリー内の多様性が損なわれ、ライブラリーが、選択される表現型から独立のクローンについて濃縮され、少数のクローンへの収束が結果としてもたらされることが多い(Derda R et al., Molecules 16: 1776-1803 (2011))。予測外の偽陽性率は、スクリーニングの前に、ライブラリーによりコードされるポリペプチドのリボ毒性を低減するか又は消失させることにより(おそらく、個々のファージライブラリークローン間でより最適な増殖動態及び/又はより均一な増殖動態を可能とすることにより)、著明に低下させることができる。
リボ毒性を低減した文脈及び/又は非リボ毒性の文脈における、リボ毒素由来の領域を含む、組換え融合ポリペプチドのタンパク質ディスプレイスクリーニングについての以下の例により、単一ステップスクリーニングを、所望される選択可能な特徴を有するだけでなく、また、所望される発現及び安定性及び他の産生特徴も有するポリペプチドについて実施しうることが示される。これらの方法は、例えば、偽陽性など、リボ毒性領域によるリボソームの不活性化から生じる望ましくない選択バイアスを回避する、効率的で、有効で、強力なスクリーニングを提供する。
タンパク質ディスプレイスクリーニングのための、リボ毒性を低減したリボ毒性領域をコードする、細胞毒性ポリペプチド鋳型の創出
志賀様毒素1(SLT−1,Shiga-like toxin 1;配列番号1)のAサブユニットに由来するリボ毒性ポリペプチドを使用して、ファージディスプレイスクリーニングのための、細胞ターゲティング型細胞毒性融合ポリペプチド鋳型をデザインした。2カ所のアミノ酸置換を個別に導入すること及び組合せで導入することにより、リボ毒性領域であるSLT−1Aの3つの触媒不活性形態(Y77S、E167D、及びY77S/E167D)を創出した(Hovde, Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz,Biochemistry 31: 3272-80 (1992)を参照されたい)。pECHE9Aプラスミドへと挿入された、志
賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A,A subunit of Shiga-like toxin 1)に由
来するリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチドが得られた(Cheung, Mol Cancer 9: 28(2010))。QuikChange Lightning Site-Directed MutagenesisKit(Agilent Technologies, Inc.社、Santa Clara、CA、U.S.)を使用する、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部位指向変異誘発により、Y77S変異を、SLT−1Aリボ毒性領域ポリペプチドへと導入した。同様にして、E167D変異を、単独で導入し、Y77S変異と組み合わせて導入した。変異誘発反応は、変異させたプラスミドを、NEB 5-alpha Competent E. coli(High Efficiency)(New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.)へと形質転換する場合を除き、製造元のプロトコールに従い実施した。結合領域をインフレームで融合させて、推定キメラ細胞毒性ポリペプチドを同定するための鋳型を産生するように、3つの触媒不活性毒素エフェクター(Y77S、E167D、及びY77S/E167D)をコードするポリヌクレオチドを、ファージライブラリースクリーニングのためのベクターへと挿入した。結果として得られるポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列であって、3つの触媒不活性毒素エフェクター(Y77S、E167D、及びY77S/E167D)をコードするポリヌクレオチド配列は、サンガーシークエンシング(Functional
Biosciences社、Madison、WI、U.S.)により確認した。バリアントは、E167D変異
をSLT−1A−D;Y77S変異をSLT−1A−Y及び二重E167D/Y77S変異をSLT−1A−DYと表示する。結合領域とリボ毒性領域とを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(修飾されているのであれ、非修飾であれ)は、例えば、アミノ末端mycタグなどの末端生化学的タグであって、コードされるポリペプチドの検出を容易とする末端生化学的タグをコードする配列を含むことが多かった。
志賀様毒素1(SLT−1,Shiga-like toxin 1;配列番号1)のAサブユニットに由来するリボ毒性ポリペプチドを使用して、ファージディスプレイスクリーニングのための、細胞ターゲティング型細胞毒性融合ポリペプチド鋳型をデザインした。2カ所のアミノ酸置換を個別に導入すること及び組合せで導入することにより、リボ毒性領域であるSLT−1Aの3つの触媒不活性形態(Y77S、E167D、及びY77S/E167D)を創出した(Hovde, Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz,Biochemistry 31: 3272-80 (1992)を参照されたい)。pECHE9Aプラスミドへと挿入された、志
賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A,A subunit of Shiga-like toxin 1)に由
来するリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチドが得られた(Cheung, Mol Cancer 9: 28(2010))。QuikChange Lightning Site-Directed MutagenesisKit(Agilent Technologies, Inc.社、Santa Clara、CA、U.S.)を使用する、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部位指向変異誘発により、Y77S変異を、SLT−1Aリボ毒性領域ポリペプチドへと導入した。同様にして、E167D変異を、単独で導入し、Y77S変異と組み合わせて導入した。変異誘発反応は、変異させたプラスミドを、NEB 5-alpha Competent E. coli(High Efficiency)(New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.)へと形質転換する場合を除き、製造元のプロトコールに従い実施した。結合領域をインフレームで融合させて、推定キメラ細胞毒性ポリペプチドを同定するための鋳型を産生するように、3つの触媒不活性毒素エフェクター(Y77S、E167D、及びY77S/E167D)をコードするポリヌクレオチドを、ファージライブラリースクリーニングのためのベクターへと挿入した。結果として得られるポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列であって、3つの触媒不活性毒素エフェクター(Y77S、E167D、及びY77S/E167D)をコードするポリヌクレオチド配列は、サンガーシークエンシング(Functional
Biosciences社、Madison、WI、U.S.)により確認した。バリアントは、E167D変異
をSLT−1A−D;Y77S変異をSLT−1A−Y及び二重E167D/Y77S変異をSLT−1A−DYと表示する。結合領域とリボ毒性領域とを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(修飾されているのであれ、非修飾であれ)は、例えば、アミノ末端mycタグなどの末端生化学的タグであって、コードされるポリペプチドの検出を容易とする末端生化学的タグをコードする配列を含むことが多かった。
試験の目的で、結合領域とリボ毒性領域とを含む例示的な細胞毒性ポリペプチドの群(αHER2scFv::SLT−1A)を創出した。結合領域であるαHER2scFvは、免疫グロブリン4D5であるトラスツズマブに由来する免疫グロブリン型結合領域であった(Zhao et al., J Immunol 183: 5563-74 (2009);Genentech、Inc.社、South San Francisco、CA、U.S.製のHerceptin(登録商標)として市販されている)。結合領域であるαHER2scFvは、2つの免疫グロブリン可変領域(VL及びVH)をリンカーで隔てて創出した単鎖可変断片(scFv)を含んだ。αHER2scFvポリヌクレオチドを、マウス免疫グロブリンG(IgG,immunoglobulin-G)の「ヒンジ」領域をコードするポリヌクレオチド、及びSLT−1A又は触媒不活性SLT−1AなどのSLT−1Aリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチドと共に、インフレームでクローニングして、αHER2scFv::SLT−1A又はその触媒不活性化バリアント(αHER2scFv::SLT−1A−Y、αHER2scFv::SLT−1A−D、及びαHER2scFv::SLT−1A−DY)を産生した。
上記のHER2ターゲティングポリペプチド群の創出と同様に、ヒトSLAMF7に結合することが可能な免疫グロブリン型結合領域(αSLAMF7scFv)を含む、例示的な細胞毒性ポリペプチドの別のセットを創出した。αSLAMF7scFvをコードするポリヌクレオチドを、SLT−1A又は触媒不活性SLT−1AなどのSLT−1Aリボ毒性領域を含む毒素鋳型ポリヌクレオチドと、インフレームで融合させて、αSLAMF7scFv::SLT−1A又はその触媒不活性化バリアントを産生した。αSLAMF7scFvをコードするポリヌクレオチドを、触媒不活性SLT−1AY77Sを含む
ポリヌクレオチド鋳型と、インフレームで融合させて、触媒不活性αSLAMF7scFv::SLT−1A−Yバリアントを産生した。
ポリヌクレオチド鋳型と、インフレームで融合させて、触媒不活性αSLAMF7scFv::SLT−1A−Yバリアントを産生した。
SLT−1Aリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド鋳型と、CD20に結合することが可能なscFvをコードするポリヌクレオチド鋳型とを接合させることにより、ヒトCD20に結合することが可能な免疫グロブリン型結合領域(αCD20scFv)を、SLT−1Aリボ毒性領域へと融合させた、例示的な細胞毒性ポリペプチドの第3の群を創出した。触媒不活性ポリペプチドであるαCD20scFv::SLT−1A−Y77Sバリアントは、αCD20 scFvをコードするポリヌクレオチド鋳型と、リボ毒性領域であるSLT−1AY77Sをコードするポリヌクレオチド鋳型との融合体から創出した。
上記の鋳型及び例示的な細胞毒性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについての、大腸菌内の効率的発現のためコドン最適化は、DNA 2.0社(Melno Park、CA)が実施
した。一部の構築物は、修飾されているのであれ、非修飾であれ、SLT−1Aリボ毒性領域の242位における自然発生のシステインの変異を含んだが、これは、実施例で記載されるアッセイに対して、明らかな効果を及ぼさなかった。
した。一部の構築物は、修飾されているのであれ、非修飾であれ、SLT−1Aリボ毒性領域の242位における自然発生のシステインの変異を含んだが、これは、実施例で記載されるアッセイに対して、明らかな効果を及ぼさなかった。
リボ毒性ポリペプチドと対比した、非リボ毒性ポリペプチドについてのファージディスプレイ
実施例1で記載した、リボ毒性を低減したリボ毒性領域及び/又はリボ毒性を消失させたリボ毒性領域を含む多様な鋳型を、ファージディスプレイアッセイで使用して、完全リボ毒性バリアントと比較した。HER2をターゲティングするscFvと融合させたSLT−1Aを含む例示的な細胞毒性ポリペプチド、及びそれらの例示的な触媒不活性化誘導体の群をコードする多様なポリヌクレオチドを、T7ファージディスプレイ系へとロードした。特に、触媒不活性化リボ毒性ポリペプチドであるαSLAMF7scFv::SLT−1A−Y及びαCD20scFv::SLT−1A−Y77Sをコードするポリヌクレオチドを、T7ファージディスプレイ系へとロードした。
実施例1で記載した、リボ毒性を低減したリボ毒性領域及び/又はリボ毒性を消失させたリボ毒性領域を含む多様な鋳型を、ファージディスプレイアッセイで使用して、完全リボ毒性バリアントと比較した。HER2をターゲティングするscFvと融合させたSLT−1Aを含む例示的な細胞毒性ポリペプチド、及びそれらの例示的な触媒不活性化誘導体の群をコードする多様なポリヌクレオチドを、T7ファージディスプレイ系へとロードした。特に、触媒不活性化リボ毒性ポリペプチドであるαSLAMF7scFv::SLT−1A−Y及びαCD20scFv::SLT−1A−Y77Sをコードするポリヌクレオチドを、T7ファージディスプレイ系へとロードした。
ファージのクローニング、パッケージング、及び増幅は、本質的に、T7Select System Manual(Novagen社、Billerica、MA、U.S.)において記載されている通りに実施した。例示的な細胞毒性ポリペプチド鋳型をコードするポリヌクレオチドは、T7Select System(Novagen社、Billerica、MA、U.S.)を使用してファージ発現ライブラリーを作製するよう
に、T7Select 1-2c(低コピー型)ベクターへとクローニングした。細胞毒性ポリペプチ
ド鋳型は、修飾されている(触媒不活性化)か、又は非修飾の(野生型)SLT−1A由来のリボ毒性領域、及び例示的な結合領域である、αHER2、αSLAMF7、又はαCD20scFvを含んだ。パッケージング反応を実施し、個々のファージクローンを滴定及び単離するために、結果として得られるファージを大腸菌上に播種した。例示的な鋳型又は触媒不活性の推定細胞毒性ポリペプチドをコードする各ファージのファージクローン3つずつについて、サンガーシークエンシング(Functional Biosciences社、Madison
、WI、U.S.)により解析して、ファージゲノムへと挿入されたポリヌクレオチドを確認した。モノクローナルファージを、αHER2scFv::SLT−1A、αHER2scFv::SLT−1A−Y、αHER2scFv::SLT−1A−D、αHER2scFv::SLT−1A−DY、αSLAMF7scFv::SLT−1A−Y及びαCD20scFv::SLT−1A−Y77Sについて増幅した。低力価のモノクローナルファージの増幅は、宿主細胞が溶解するまでの、小スケール容量(1mL)の細菌宿主を伴うファージのインキュベーションを伴い、次いで、さらなる増幅のための、溶解物の、より大量の宿主培養物への付加を伴った。増幅されたファージ集団は、0.45ミクロンのフィルター(Millipore社、Billerica、MA、U.S.)を使用して精製及び滅菌濾過した。
に、T7Select 1-2c(低コピー型)ベクターへとクローニングした。細胞毒性ポリペプチ
ド鋳型は、修飾されている(触媒不活性化)か、又は非修飾の(野生型)SLT−1A由来のリボ毒性領域、及び例示的な結合領域である、αHER2、αSLAMF7、又はαCD20scFvを含んだ。パッケージング反応を実施し、個々のファージクローンを滴定及び単離するために、結果として得られるファージを大腸菌上に播種した。例示的な鋳型又は触媒不活性の推定細胞毒性ポリペプチドをコードする各ファージのファージクローン3つずつについて、サンガーシークエンシング(Functional Biosciences社、Madison
、WI、U.S.)により解析して、ファージゲノムへと挿入されたポリヌクレオチドを確認した。モノクローナルファージを、αHER2scFv::SLT−1A、αHER2scFv::SLT−1A−Y、αHER2scFv::SLT−1A−D、αHER2scFv::SLT−1A−DY、αSLAMF7scFv::SLT−1A−Y及びαCD20scFv::SLT−1A−Y77Sについて増幅した。低力価のモノクローナルファージの増幅は、宿主細胞が溶解するまでの、小スケール容量(1mL)の細菌宿主を伴うファージのインキュベーションを伴い、次いで、さらなる増幅のための、溶解物の、より大量の宿主培養物への付加を伴った。増幅されたファージ集団は、0.45ミクロンのフィルター(Millipore社、Billerica、MA、U.S.)を使用して精製及び滅菌濾過した。
以下の実施例におけるファージのスクリーニング、選択、及び濃縮は、本質的に、T7Select SystemManual(Novagen社、Billerica、MA、U.S.)において記載されている通りに実施した。
酵素免疫測定アッセイ(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)を使用し
て、本実施例で記載されるファージ発現クローンのファージディスプレイ結合シグナルについて調べた。ポリペプチドを提示する全ファージを使用するELISA(「ファージELISA」)を、ファージへと適用して、複数のファージにより提示されたポリペプチドの、細胞外標的生体分子への結合特徴を特徴づけた。本実施例の一部の実験のために、触媒不活性リボ毒性領域(SLT−1A Y77S)へと融合させたαCD20scFvを含む、例示的な非リボ毒性ポリペプチドであるαCD20scFv::SLT−1A−Yを、陰性対照として使用した。
て、本実施例で記載されるファージ発現クローンのファージディスプレイ結合シグナルについて調べた。ポリペプチドを提示する全ファージを使用するELISA(「ファージELISA」)を、ファージへと適用して、複数のファージにより提示されたポリペプチドの、細胞外標的生体分子への結合特徴を特徴づけた。本実施例の一部の実験のために、触媒不活性リボ毒性領域(SLT−1A Y77S)へと融合させたαCD20scFvを含む、例示的な非リボ毒性ポリペプチドであるαCD20scFv::SLT−1A−Yを、陰性対照として使用した。
ファージELISAは、例示的な細胞毒性ポリペプチドであるαHER2scFv::SLT−1A、又はHER2をターゲティングする同じscFv(αHER2scFv)へと融合させた、ミュータントのSLT−1A鋳型を使用して作製される触媒不活性化SLT−1Aリボ毒性領域を含むポリペプチド:αHER2scFv::SLT−1A−D、αHER2scFv::SLT−1A−Y及びαHER2scFv::SLT−1A−DYを提示するモノクローナルT7ファージ集団上で実施した。ファージELISAは、組換えヒトHER2の細胞外部分及び組換えヒトEGFRの細胞外部分、陰性対照としての近縁のタンパク質を使用して実施した。例示的な細胞毒性ポリペプチドであるαHER2scFv::SLT−1Aを提示するファージは、ファージディスプレイ系の外部で産生し、調べたところ、このポリペプチドはHER2に高アフィニティーで結合し、HER2発現細胞を死滅させるため、陽性対照として用いられた。
ファージELISAアッセイは、リン酸緩衝生理食塩液(PBS,phosphate buffered
saline)中に、ウェル1つ当たり100ナノグラム(ng,nanogram)のHER2−F
c又はEGFR−Fc(R and D Systems社、Minneapolis、MN、U.S.)により、摂氏4度(℃,degreeCelsius)で一晩にわたりコーティングされた96ウェルである、MaxiSorp(登録商標)ELISAプレート(Nunc社、Rochester、NY、U.S.)内で実施した。ウェ
ルを、PBS−T(0.1%のTween-20を伴うPBS)で洗浄し、次いで、ウェルを、室温(RT,room temperature)でPBS−T中に3パーセントのミルクと共にインキュベートすることにより、非特異的結合をブロッキングした。ウェルを、PBS−Tで洗浄し、次いで、3%のミルクPBS−T中に、各ファージ集団2×109プラーク形成単位(pfu,plaque forming unit)ずつを、ウェルへと添加した。ファージを、コーティン
グされたウェルと共に、RTでインキュベートした後で、ウェルを、PBS−Tで洗浄した。次いで、ウェルを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP,horseradish peroxidase)へとコンジュゲートさせたT7ファージカプシドタンパク質を認識する抗体(T7-Tag(登録商標)Antigody HRP Conjugate;Novagen社、Billerica、MA)と共に、RTでインキュベートした。ウェルを、PBS−Tで洗浄し、次いで、Pierce Ultra TMB(Thermo
Fisher Scientific社、Rockford、IL、U.S.)を、各ウェルへと添加して、RTで30分間にわたり、HRP反応を生じさせた。反応は、酸によりクエンチングした。プレート読取りデバイスを使用して、プレートを、450ナノメートルの波長へと設定された吸光度について読み取った。データは、Prism software(GraphPad Software社、San Diego、CA、U.S.)を使用して解析した。
saline)中に、ウェル1つ当たり100ナノグラム(ng,nanogram)のHER2−F
c又はEGFR−Fc(R and D Systems社、Minneapolis、MN、U.S.)により、摂氏4度(℃,degreeCelsius)で一晩にわたりコーティングされた96ウェルである、MaxiSorp(登録商標)ELISAプレート(Nunc社、Rochester、NY、U.S.)内で実施した。ウェ
ルを、PBS−T(0.1%のTween-20を伴うPBS)で洗浄し、次いで、ウェルを、室温(RT,room temperature)でPBS−T中に3パーセントのミルクと共にインキュベートすることにより、非特異的結合をブロッキングした。ウェルを、PBS−Tで洗浄し、次いで、3%のミルクPBS−T中に、各ファージ集団2×109プラーク形成単位(pfu,plaque forming unit)ずつを、ウェルへと添加した。ファージを、コーティン
グされたウェルと共に、RTでインキュベートした後で、ウェルを、PBS−Tで洗浄した。次いで、ウェルを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP,horseradish peroxidase)へとコンジュゲートさせたT7ファージカプシドタンパク質を認識する抗体(T7-Tag(登録商標)Antigody HRP Conjugate;Novagen社、Billerica、MA)と共に、RTでインキュベートした。ウェルを、PBS−Tで洗浄し、次いで、Pierce Ultra TMB(Thermo
Fisher Scientific社、Rockford、IL、U.S.)を、各ウェルへと添加して、RTで30分間にわたり、HRP反応を生じさせた。反応は、酸によりクエンチングした。プレート読取りデバイスを使用して、プレートを、450ナノメートルの波長へと設定された吸光度について読み取った。データは、Prism software(GraphPad Software社、San Diego、CA、U.S.)を使用して解析した。
ファージELISA実験の結果を、図2に示す。全ての被験ファージ集団は、HER2−Fcに、EGFR−Fcと比較して特異的に結合した。驚くべきことに、ミュータントリボ毒性領域を含む3つのポリペプチドを提示するファージは、アッセイにおいて、HE
R2−Fcに対して、完全に活性なリボ毒性領域を含む、例示的な細胞毒性ポリペプチドであるαHER2scFv::SLT−1Aよりはるかに高度な結合シグナルを提示した。提示された被験ポリペプチドの全てについて、EGFR−Fcへの結合は、バックグラウンドレベルと同等であるか、又はこれを下回った(図2における陰性対照である、αCD20scFv::SLT−1A−Yを参照されたい)。
R2−Fcに対して、完全に活性なリボ毒性領域を含む、例示的な細胞毒性ポリペプチドであるαHER2scFv::SLT−1Aよりはるかに高度な結合シグナルを提示した。提示された被験ポリペプチドの全てについて、EGFR−Fcへの結合は、バックグラウンドレベルと同等であるか、又はこれを下回った(図2における陰性対照である、αCD20scFv::SLT−1A−Yを参照されたい)。
免疫化マウスに由来する免疫グロブリン型結合領域を使用する、多様なファージ発現ライブラリーの創出
本実施例では、細胞ターゲティング型結合領域のための、バイアスのかかった哺乳動物免疫グロブリン配列、及び毒素由来の領域のための触媒不活性リボ毒性領域のセットを使用して、多様なファージディスプレイ発現ライブラリーを創出した。免疫グロブリンドメインをコードする核酸を、免疫化されたマウスのB細胞から単離して、免疫グロブリン型ドメイン及び触媒不活性リボ毒性領域を含む、多様な細胞毒性ポリペプチド発現ライブラリーを創出した。
本実施例では、細胞ターゲティング型結合領域のための、バイアスのかかった哺乳動物免疫グロブリン配列、及び毒素由来の領域のための触媒不活性リボ毒性領域のセットを使用して、多様なファージディスプレイ発現ライブラリーを創出した。免疫グロブリンドメインをコードする核酸を、免疫化されたマウスのB細胞から単離して、免疫グロブリン型ドメイン及び触媒不活性リボ毒性領域を含む、多様な細胞毒性ポリペプチド発現ライブラリーを創出した。
BALB/Cマウスを、標的抗原で免疫化した。陽性の免疫応答を確認した後で、B細胞を、脾臓細胞から単離した。全RNAを、B細胞から抽出し、相補性DNA(cDNA,complementary DNA)を合成するのに使用した。cDNA内の免疫グロブリン配列の重
鎖の可変部分(VH,variable portion of the heavychain)及び軽鎖の可変部分(V
L,variable portion of the light chain)を、公表された配列(Imai et al., Biol Pharm Bull 29: 1325-30 (2006))に由来するプライマーセットを使用するPCRにより増幅及び精製した。単鎖可変断片(scFv)は、オーバーラップPCR反応を使用して産生し、これにより、VH領域とVL領域との間にリンカー配列を付加した。これらのscFvをコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、実施例1で記載した鋳型を使用して、ファージベクターへと、リボ毒性領域であるSLT−1Aの触媒不活性形態とインフレームでクローニングした。scFvとSLT−1A−Y77Sの触媒不活性形態とを含むポリペプチドを提示するT7ファージの多様なライブラリーは、実施例1で記載した通りに、クローニング、パッケージング、及び増幅した。増幅されたライブラリーは、1ミリリットル当たり2.6×104pfu(pfu/mL:pfu per milliliter)の増幅倍数で、5.7×106の多様性を有すると計算された。
鎖の可変部分(VH,variable portion of the heavychain)及び軽鎖の可変部分(V
L,variable portion of the light chain)を、公表された配列(Imai et al., Biol Pharm Bull 29: 1325-30 (2006))に由来するプライマーセットを使用するPCRにより増幅及び精製した。単鎖可変断片(scFv)は、オーバーラップPCR反応を使用して産生し、これにより、VH領域とVL領域との間にリンカー配列を付加した。これらのscFvをコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、実施例1で記載した鋳型を使用して、ファージベクターへと、リボ毒性領域であるSLT−1Aの触媒不活性形態とインフレームでクローニングした。scFvとSLT−1A−Y77Sの触媒不活性形態とを含むポリペプチドを提示するT7ファージの多様なライブラリーは、実施例1で記載した通りに、クローニング、パッケージング、及び増幅した。増幅されたライブラリーは、1ミリリットル当たり2.6×104pfu(pfu/mL:pfu per milliliter)の増幅倍数で、5.7×106の多様性を有すると計算された。
特異的タンパク質相互作用についての選択によるバイオパニングは、このライブラリーに対して、本質的に、T7SelectSystem Manual(Novagen社、Billerica、MA、U.S.)において記載されている通りに実施した。略述すると、組換え標的タンパク質を、固体支持体へと固定化し、ミルクによりブロッキングした。ファージライブラリーを、標的タンパク質と共にインキュベートし、次いで、完全に洗浄した。これらの条件下で標的タンパク質へと結合させた任意のファージを、1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS,sodium dodecyl sulfate)により、又はBLT 5403細菌又はBLT 5615細菌を使用する、結合させたファージの増幅を介して溶出させた。3ラウンドにわたる増幅の後で、個々のファージクローンを単離し、それらのインサートDNAをシークエンシングした。モノクローナルファージ集団の結合は、適切な標的分子を使用して、実施例3で記載した結合アッセイにより確認した。
完全リボ毒性発現ライブラリーのファージディスプレイスクリーニング
ヒトHER2の細胞外部分をファージELISAベイトとして使用する、実施例3で記載したファージディスプレイバイオパニング法を使用して、細胞毒性ポリペプチドの多様な発現ライブラリーをスクリーニングした。ライブラリーは、完全に触媒活性のリボ毒性領域へと融合させたペプチド結合領域を伴うポリペプチドを含んだ。
ヒトHER2の細胞外部分をファージELISAベイトとして使用する、実施例3で記載したファージディスプレイバイオパニング法を使用して、細胞毒性ポリペプチドの多様な発現ライブラリーをスクリーニングした。ライブラリーは、完全に触媒活性のリボ毒性領域へと融合させたペプチド結合領域を伴うポリペプチドを含んだ。
スクリーニングにより濃縮されたファージに由来するPCR産物をシークエンシングして、選択される結合剤(陽性ヒット)のポリペプチド配列を同定した。1つの陽性ヒットでは、自発的変異が、SLT−1Aの自然発生のアミノ酸残基77位(Y77H)に配置されていることが観察された(図3)。
この自発的変異は、一層よく研究されている志賀毒素Aサブユニット変異であるY77S(Deresiewicz Ret al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al.,
Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993))と同様な触媒不活性化を結果としてもたらすと予
測された。Y77Hを含むSLT−1Aリボ毒性領域ポリペプチドは、野生型SLTA1〜251リボ毒性領域ポリペプチドであるSLT−1Aと比較してリボソーム阻害の大幅な緩和を示したため、この予測は正しかった(図4)。
Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993))と同様な触媒不活性化を結果としてもたらすと予
測された。Y77Hを含むSLT−1Aリボ毒性領域ポリペプチドは、野生型SLTA1〜251リボ毒性領域ポリペプチドであるSLT−1Aと比較してリボソーム阻害の大幅な緩和を示したため、この予測は正しかった(図4)。
SLT−1A−Y77Hの、野生型SLT−1Aと比較したリボソーム不活性化能は、TNT(登録商標)Quick Coupled Transcription/Translation Kit(Promega社型番L1170、Madison、WI、U.S.)を使用する、無細胞インビトロタンパク質翻訳アッセイにおいて決
定した。キットは、Luciferase T7 Control DNA及びTNT(登録商標)Quick Master Mixを含む。製造元の指示書に従い、リボソーム活性反応物を調製して、「TNT」反応混合物を
創出した。SLT−1Aと対比される、被験SLT−1A−Y77Hの10倍希釈系列を、適切な緩衝液中で調製し、各希釈液のための、同一なTNT反応混合物成分の系列を創出
した。各希釈系列内の各試料を、Luciferase T7 Control DNAと共に、TNT反応混合物の各々と組み合わせた。被験試料を、30℃で1.5時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後で、Luciferase Assay Reagent(Promega社型番E1483、Madison、WI
、U.S.)を、全ての被験試料へと添加し、製造元の指示書に従い、ルシフェラーゼタンパク質の翻訳量を、発光により測定した。翻訳阻害レベルは、全タンパク質の対数変換濃度についての、相対発光単位と対比した非線形回帰解析により決定した。統計学ソフトウェア(GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.)を使用することにより、各試料について、
50%阻害濃度(IC50,half maximal inhibitoryconcentration)値を計算した。
定した。キットは、Luciferase T7 Control DNA及びTNT(登録商標)Quick Master Mixを含む。製造元の指示書に従い、リボソーム活性反応物を調製して、「TNT」反応混合物を
創出した。SLT−1Aと対比される、被験SLT−1A−Y77Hの10倍希釈系列を、適切な緩衝液中で調製し、各希釈液のための、同一なTNT反応混合物成分の系列を創出
した。各希釈系列内の各試料を、Luciferase T7 Control DNAと共に、TNT反応混合物の各々と組み合わせた。被験試料を、30℃で1.5時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後で、Luciferase Assay Reagent(Promega社型番E1483、Madison、WI
、U.S.)を、全ての被験試料へと添加し、製造元の指示書に従い、ルシフェラーゼタンパク質の翻訳量を、発光により測定した。翻訳阻害レベルは、全タンパク質の対数変換濃度についての、相対発光単位と対比した非線形回帰解析により決定した。統計学ソフトウェア(GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.)を使用することにより、各試料について、
50%阻害濃度(IC50,half maximal inhibitoryconcentration)値を計算した。
ポリペプチドであるSLT−1A−Y77Hは、SLT−1Aと比較して、リボソーム阻害の大幅な緩和を示した(図5)。これらの結果は、リボ毒性ポリペプチドを完全活性環境においてスクリーニングする結果として、自発的なリボ毒性不活性化変異への選択バイアスであり、完全リボ毒性領域を伴う細胞毒性ポリペプチドを含む、所望されるライブラリーメンバーとは無関係な選択バイアスがもたらされうることを示した。インビトロにおけるファージディスプレイ系を使用して結合アフィニティーについて選択するときに、リボ毒性領域のリボ毒性が、おそらく、ファージクローン表示におけるバイアスを介して、リボ毒性領域の触媒活性を破壊する、まれな自発的変異から生じる偽陽性クローンが回収されるほどの著明な攪乱を引き起こしたことは予測外であった(図2及び3を参照されたい)。
非リボ毒性ライブラリーのファージディスプレイスクリーニングは、標的結合クローンについての濃縮を示した
実施例3で記載した通り、SLAMF7への高アフィニティー結合について選択するファージELISAを使用して、非リボ毒性ポリペプチドのファージ発現ライブラリーをスクリーニングした。ヒトSLAMF7の細胞外部分(組換えヒトSLAMF7のアミノ酸残基1〜226;Sino Biological社型番11691−H08H、Beijing、P.R.C.)を、ファージELISA「ベイト」として使用した。ライブラリー内で提示される全てのポリペプチドは、リボ毒性領域の触媒作用によるリボ毒性を消失させる、志賀毒素リボ毒性領域内のY77S変異を有した(SLT−1A−Y)。
実施例3で記載した通り、SLAMF7への高アフィニティー結合について選択するファージELISAを使用して、非リボ毒性ポリペプチドのファージ発現ライブラリーをスクリーニングした。ヒトSLAMF7の細胞外部分(組換えヒトSLAMF7のアミノ酸残基1〜226;Sino Biological社型番11691−H08H、Beijing、P.R.C.)を、ファージELISA「ベイト」として使用した。ライブラリー内で提示される全てのポリペプチドは、リボ毒性領域の触媒作用によるリボ毒性を消失させる、志賀毒素リボ毒性領域内のY77S変異を有した(SLT−1A−Y)。
このアッセイでは、SLT−1A−Yへと融合させた、SLAMF7をターゲティングする結合領域であるα−SLAMF7−V1及びα−SLAMF7−V2、並びにSLT−1A−Yへと融合させた、HER2をターゲティングする結合領域であるα−HER2scFvを使用した。ライブラリーを、ヒトSLAMF7の細胞外部分への結合アフィニティーについてスクリーニングする場合は、各々が、SLAMF7−V1及びSLAMF7−V2と名づけられる、異なるscFv構成要素を含む、2つのscFv−SLT−1A融合体を、陽性「ヒット」として使用した。ファージディスプレイ系から独立の単離ポリペプチドとして調べたところ、αSLAMF7−V1::SLT−1A及びαSLAMF7−V2::SLT−1Aのいずれも、組換えSLAMF7の細胞外部分に結合したが、アフィニティーは異なった。
全ファージ集団が、10%のαSLAMF7−V1::SLT−1A、10%のαSLAMF7−V2::SLT−1A、及び80%のαHER2::SLT−1A−Yを含むように意図するファージプールを創出した。これは、1×1010pfuのαSLAMF7−V1::SLT−1A−Y及び1×1010pfuのαSLAMF7−V2::SLT−1A−Yを、8×1010pfuのαHER2::SLT−1A−Yと混合することにより達成した。
このファージディスプレイライブラリーを、実施例3で記載した通りに、ヒトSLAMF7の細胞外部分をファージELISAベイトとして使用して、連続3ラウンドのバイオパニングにわたりスクリーニングした。第1ラウンドでは、陽性選択パニングステップ(SLAMF7標的)だけを使用し、第2ラウンド及び第3ラウンドは、陽性スクリーニングの前に、陰性選択枯渇ステップ(CEA)を含んだ。
バイオパニングの第1ラウンドでは、96ウェルMaxiSorp(登録商標)ELISAプレートを、PBS中に500ngの組換えヒトSLAMF7−HIS(Sino Biological社
、Beijing、P.R.C.)でコーティングし、4℃で一晩にわたり結合させた。ウェルを、P
BS−Tで洗浄し、次いで、ウェルを、室温(RT)でPBS−T中に3パーセントのミルクと共にインキュベートすることにより、非特異的結合をブロッキングした。ウェルを、PBS−Tで洗浄し、次いで、3%のミルクPBS−T中に懸濁させた1×109pfuのライブラリーを、ウェルへと添加した。ファージを、コーティングされたウェルと共に、RTで30分間にわたりインキュベートした後で、ウェルをPBS−Tで5回にわたり洗浄し、次いで、PBSで5回にわたり洗浄した。
、Beijing、P.R.C.)でコーティングし、4℃で一晩にわたり結合させた。ウェルを、P
BS−Tで洗浄し、次いで、ウェルを、室温(RT)でPBS−T中に3パーセントのミルクと共にインキュベートすることにより、非特異的結合をブロッキングした。ウェルを、PBS−Tで洗浄し、次いで、3%のミルクPBS−T中に懸濁させた1×109pfuのライブラリーを、ウェルへと添加した。ファージを、コーティングされたウェルと共に、RTで30分間にわたりインキュベートした後で、ウェルをPBS−Tで5回にわたり洗浄し、次いで、PBSで5回にわたり洗浄した。
結合させたファージを溶出させるため、IPTGで誘導された、200マイクロリットル(μL,microliter)の希釈BLT5615を、ウェルへと添加し、細菌の溶解が生じるまで、37℃で振とうしながら、プレートをインキュベートした。ウェル内の溶液の試料を、20μLの5モルの塩化ナトリウム(NaCl,sodium chloride)を含有するマ
イクロ遠心管へと移し、短時間にわたりボルテックスした。次いで、マイクロ遠心管を、重力の10,000倍で5分間にわたり遠心分離にかけて、細菌破砕物を除去した。上清を、未使用のマイクロ遠心管へと移し、ファージを沈殿させた。ファージは、300μLのPBS及び50%のポリエチレングリコール100μLを添加し、マイクロ遠心管を氷上で1時間にわたりインキュベートすることにより沈殿させた。沈殿させたファージは、4℃、重力の10,000倍で10分間にわたる遠心分離及び上清の除去により回収した。ファージは、250μLのPBS中に再懸濁させ、十分にボルテックスした。細菌破砕物は、重力の12,000倍で10分間にわたる遠心分離により除去した。精製されたファージは、標準法を使用して滴定し、次いで、次のラウンドのスクリーニングのために使用した。
イクロ遠心管へと移し、短時間にわたりボルテックスした。次いで、マイクロ遠心管を、重力の10,000倍で5分間にわたり遠心分離にかけて、細菌破砕物を除去した。上清を、未使用のマイクロ遠心管へと移し、ファージを沈殿させた。ファージは、300μLのPBS及び50%のポリエチレングリコール100μLを添加し、マイクロ遠心管を氷上で1時間にわたりインキュベートすることにより沈殿させた。沈殿させたファージは、4℃、重力の10,000倍で10分間にわたる遠心分離及び上清の除去により回収した。ファージは、250μLのPBS中に再懸濁させ、十分にボルテックスした。細菌破砕物は、重力の12,000倍で10分間にわたる遠心分離により除去した。精製されたファージは、標準法を使用して滴定し、次いで、次のラウンドのスクリーニングのために使用した。
バイオパニングの第2ラウンド及び第3ラウンドは、陽性選択される、ヒトSLAMF7に結合するファージへと添加する前に、ファージディスプレイライブラリーを、RTで30分間にわたり非関与性の標的(組換えヒト癌胎児性抗原(CEA)、Sino Biological社、Beijing、P.R.C.)に結合させる、陰性選択ステップを付加することを除き、同様の方式で実行した。
選択されるファージディスプレイライブラリー内の各ファージクローンのパーセント表示を決定するために、PCRベースの解析をデザインし、実行した。アッセイは、全ての構築物の、提示されるポリペプチドコード領域の上流に結合する一般的プライマーと、例えば、HER2及びSLAMF7など、特異的scFv内に結合する特異的PCRプライマーとを伴った。全プライマーと、単一の個々のファージとを含有するPCR反応は、予測されるサイズの単一のPCR産物を結果としてもたらす。アッセイは、混合されたプール内の特異的ファージの弁別が可能となるように、プール内の各個別のファージについて異なるバンド形成パターンをもたらすようデザインすることに成功した。
単離されたファージは、各ラウンドにわたるバイオパニングのために滴定プレートから採取し、PBS中、RTでインキュベートして、溶液への拡散を可能とした。上記で記載したPCR一式を使用して、ファージ単離物溶液のアリコートについて解析した。各ファージ単離物は、電気泳動ゲル上に、αHER2scFv、αSLAMF7−V1scFv、及びαSLAMF7−V2のコード配列を表すことが予測されるサイズのPCR産物バンドをもたらした。開始プール内及び第1〜3の各ラウンド内に占めるファージのパーセントを、図5に示す。各ラウンドにわたるバイオパニングの後では、αSLAMF7scFVを含有するファージの濃縮が観察された(図5)。SLAMF7、αSLAMF7−V1::SLTA−Y及びαSLAMF7−V2::SLTA−Yに結合することが可能なファージクローンのいずれもが濃縮されたが、非結合ファージであるαHER2::SLTA−Yのパーセントは、3ラウンドにわたり低減された(図5)。αSLAMF7−V1::SLTA−Yバリアントを提示するファージクローンであって、任意のファージディスプレイ系の外部でアッセイした場合にSLAMF7への最高の結合アフィニティーを示したファージクローンは、初期ラウンドにおける表示パーセントの増大及び各ラウンド内の全表示パーセントの増大により証拠立てられる通り、選択的バイオパニングのラウンドにより、優先的に濃縮された(図5)。
これらの結果により、発現ライブラリーを創出し、例えば、結合アフィニティーなどの特徴をスクリーニングするために、触媒不活性のミュータントのリボ毒素鋳型を使用する有効性が示された。加えて、これらの結果により、リボ毒性ポリペプチドのファージELISA結合アッセイによるスクリーニングは一般に、よりリボ毒性の強いリボ毒性領域と比較して、リボ毒性を低減するか又は消失させたリボ毒性領域を使用する場合に最適に実施されることも示唆された。理論に束縛されずに述べると、非リボ毒性ライブラリーを使用する結果の改善は、リボ毒性を低減するか又は消失させる場合に、発現ライブラリーを提示する全てのファージの生存率が、触媒活性のリボ毒性ポリペプチドを提示するファージと比較して大きく、及び/又は均一である結果でありうるだろう。ここでもまた理論に束縛されずに述べると、代替的であり、相互に排他的でない説明によれば、非リボ毒性ライブラリーを使用する結果の改善は、リボ毒性を低減したポリペプチド又は非リボ毒性ポリペプチドの、ファージ1つ当たりのコピー数を、完全リボ毒性ポリペプチドの、ファージ1つ当たりに提示されるコピー数と比較して、増大させる提示の結果でありうるだろう。
多様な非リボ毒性ライブラリーのファージディスプレイスクリーニング
非リボ毒性ポリペプチドの多様な発現ライブラリーを、実施例5で記載した、SLAM
F7への高アフィニティー結合についてのファージディスプレイによりスクリーニングして、バイオパニング時における、非リボ毒性SLAMF7結合性ポリペプチドの濃縮について調べた。αSLAMF7−V2::SLTA−Yの表示を、ライブラリー内のファージクローンを提示する単一のscFvと一致させる(0.00004%)ために、1mLの総容量中に、2.6×104pfuのモノクローナルαSLAMF7−V2::SLTA−Yを、実施例3による、6.5×101pfuの多様なライブラリーへと添加することにより、スクリーニングのための多様なファージ発現ライブラリーを創出した。
非リボ毒性ポリペプチドの多様な発現ライブラリーを、実施例5で記載した、SLAM
F7への高アフィニティー結合についてのファージディスプレイによりスクリーニングして、バイオパニング時における、非リボ毒性SLAMF7結合性ポリペプチドの濃縮について調べた。αSLAMF7−V2::SLTA−Yの表示を、ライブラリー内のファージクローンを提示する単一のscFvと一致させる(0.00004%)ために、1mLの総容量中に、2.6×104pfuのモノクローナルαSLAMF7−V2::SLTA−Yを、実施例3による、6.5×101pfuの多様なライブラリーへと添加することにより、スクリーニングのための多様なファージ発現ライブラリーを創出した。
3ラウンドにわたるバイオパニングは、組換えヒトSLAMF7に結合するファージを選択するように、実施例5で記載した通り、ファージELISAを使用して実施した。3ラウンドにわたるバイオパニングの後で、個々のファージ単離物を採取し、それらのリボ毒性領域についてのPCR解析にかけた。PCR産物をシークエンシングして、αSLAMF7−V2::SLTA−Yファージクローンは、110のうち2つのファージ単離物中で回収されることを明らかにした(図6)。この結果は、ファージELISAバイオパニングにより、リボ毒性を低減するか又は消失させるように、リボ毒性領域を変異させたキメラリボ毒性ポリペプチドを提示する、多様なファージディスプレイライブラリーから、標的に特異的に結合するファージ(SLAMF7結合性ファージ)を選択しうることを指し示した。こうして、これらの例は、ファージ発現ライブラリーの構築時において、提示されるポリペプチドのリボ毒性を意図的に低減すること及び/又は消失させることにより、リボ毒性ポリペプチドの存在により創出される、望ましくない選択バイアスが防止され、ファージディスプレイ系により、リボ毒性領域を不活性化する、まれな自発的ミュータント及び/又は標的への結合を欠く、まれな自発的ミュータントを提示するファージクローンを濃縮するのではなく、所望される標的結合性ファージを濃縮することが可能となることを実証される。
多様なリボ毒性ライブラリーと対比した、多様な非リボ毒性ライブラリーのファージディスプレイスクリーニング
SLAMF7とは、CS1、CD2様受容体活性化細胞毒性細胞(CRACC,CD2-like receptoractivating cytotoxic cell)、及びCD319としてもまた公知の細胞表
面タンパク質であって、ヒト骨髄腫細胞が過剰発現させる細胞表面タンパク質である(Xie Z et al.,Oncotarget 4: 1008-18 (2013))。ファージディスプレイスクリーニングは、実施例1で記載した、触媒不活性化リボ毒性領域と、実施例3で記載した、多様な免疫グロブリン由来領域とを伴って構築された発現ライブラリーを使用して実施する。バイオパニングによる選択ステップは、実施例6で記載した通り、悪性細胞マーカーであるSLAMF7をELISAベイトに使用して実施する。SLAMF7に高アフィニティーで結合し、不活性化リボ毒性領域を含む、キメラ融合ポリペプチドを同定する。
SLAMF7とは、CS1、CD2様受容体活性化細胞毒性細胞(CRACC,CD2-like receptoractivating cytotoxic cell)、及びCD319としてもまた公知の細胞表
面タンパク質であって、ヒト骨髄腫細胞が過剰発現させる細胞表面タンパク質である(Xie Z et al.,Oncotarget 4: 1008-18 (2013))。ファージディスプレイスクリーニングは、実施例1で記載した、触媒不活性化リボ毒性領域と、実施例3で記載した、多様な免疫グロブリン由来領域とを伴って構築された発現ライブラリーを使用して実施する。バイオパニングによる選択ステップは、実施例6で記載した通り、悪性細胞マーカーであるSLAMF7をELISAベイトに使用して実施する。SLAMF7に高アフィニティーで結合し、不活性化リボ毒性領域を含む、キメラ融合ポリペプチドを同定する。
同定されたキメラ融合ポリペプチドは、リボ毒性領域の触媒活性が回復されるように変異させる。結果として得られるポリペプチドを、リボソーム不活性化活性及び標的細胞への結合について、インビトロにおいて調べる。次いで、リボ毒性及び標的細胞への結合が確認される融合ポリペプチドを、細胞毒性について、インビボにおいて調べる。この方法を使用して同定される、ある特定のポリペプチドは、SLAMF7に高アフィニティーで結合することが可能な単鎖可変断片による結合領域であって、志賀毒素Aサブユニット由来のリボ毒性領域と組換えにより融合させた結合領域を含む細胞毒性融合ポリペプチドである。これらのαSLAMF7結合性細胞毒性ポリペプチドは、SLAMF7を細胞表面において発現させる細胞を、細胞への内部化の促進、細胞内の経路決定、及び志賀毒素由来のリボ毒性領域を介するリボソームの不活性化により、選択的に死滅させることが可能である。
リボ毒性ポリペプチドの発現ライブラリーで出発すると、リボ毒性ポリペプチドを提示するファージのファージELISAシグナルを、非リボ毒性ポリペプチドを提示するファージのファージELISAシグナルと比較してはるかに低下させるために、スクリーニング時において、リボ毒性領域が、例えば、ファージELISAによる選択ステップにおいて、強力な偽陽性シグナルとして現れる触媒不活性ミュータントなどの変異をもたらす、強い選択圧下に置かれる場合があろう。シグナルの低下は、繁殖率の低減により引き起こされる場合もあり、提示されるコピー数の低減により引き起こされる場合もあり、及び/又は出発配列の安定性の低減により引き起こされる場合もあろう。この仮説は、リボ毒性ライブラリーを、非リボ毒性ライブラリーと比較することにより検証する。
本実施例で同定される、等出発力価のSLAMF7結合性ファージクローンと、リボ毒性である同じ融合ポリペプチドを提示するファージクローンとを使用することにより、リボ毒性を低減したファージ又は非リボ毒性ファージをスクリーニングする頑健性及び効率を、完全リボ毒性ファージのスクリーニングと比較する。ファージのクローニング、パッケージング、及び増幅は、T7Select Systemを使用して実施する。2つのクローンは、実
施例6で記載した、多様な発現ライブラリーの一部として、同等の出発力価を伴うように調製する。多様なライブラリーの全体は、実施例6で記載した2つのクローンについての表示をモニタリングしながら濃縮する。
施例6で記載した、多様な発現ライブラリーの一部として、同等の出発力価を伴うように調製する。多様なライブラリーの全体は、実施例6で記載した2つのクローンについての表示をモニタリングしながら濃縮する。
触媒不活性リボ毒性領域(Y77/E167)を含む融合ポリペプチドを提示するファージクローンから生じるファージは、パッケージングステップ時、増幅ステップ時において、完全リボ毒性領域を伴うファージクローンと比較して、力価が高く、自発的変異が少なく、終止コドンをもたらす変異により引き起こされる切断が少ない。この結果は、触媒不活性バリアントにより、ファージディスプレイ、発現ライブラリーの構築、及びファージディスプレイライブラリーの発現が改善されるという考えを裏付ける。
2つの個別の多様なファージライブラリーを、SLT−1A構成要素のわずかな変化を除き、ファージディスプレイスクリーニングのための、実施例4で記載したのと同じscFv鋳型ライブラリーから創出する。1つのライブラリーでは、完全リボ毒性SLT−1Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、リボ毒性融合ポリペプチドのファージディスプレイライブラリーを創出し、他のライブラリーでは、触媒不活性SLTA−1Aポリペプチド(Y77/E167)をコードするポリヌクレオチドを使用して、非リボ毒性融合ポリペプチドのファージディスプレイライブラリーを創出する。
等出発力価を使用して、2つのライブラリーを、実施例6で記載した通り、並行的にスクリーニングする。2つのスクリーニングにおいて高アフィニティーのSLAMF7結合剤として同定されるファージクローンは、非毒性ライブラリーのスクリーニングでは、完全リボ毒性ライブラリーのスクリーニングと比較して、力価が高く、自発的変異が少なく、終止コドンをもたらす変異により引き起こされる切断が少ないであろう。本実施例の結果はリボ毒性を低減したバリアント及び非リボ毒性バリアントにより、ファージディスプレイスクリーニング工程の全体が改善され、これは、リボ毒性領域の触媒不活性化を結果としてもたらす、1カ所又は2カ所以上の特異的変異をデザインすることにより達成しうるという考えを裏付ける。
ジフテリア毒素に由来するリボ毒性ポリペプチドを含む、非リボ毒性ライブラリーのRNAディスプレイスクリーニング
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号17〜19を参照されたい)を介して触媒不活性化した、ジフテリア毒素(DT)由来のリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、DTリボ毒性領域(例
えば、配列番号5のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:W50A、Y65A、D148A、及び/又はW153Aのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うDTリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。これらのアミノ酸残基置換並びに/又は、例えば、ヒスチジン21、チロシン27、グリシン52、及び/若しくはチロシン54などの位置におけるその他の置換を選択して、DTリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、DTの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号17〜19を参照されたい)を介して触媒不活性化した、ジフテリア毒素(DT)由来のリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、DTリボ毒性領域(例
えば、配列番号5のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:W50A、Y65A、D148A、及び/又はW153Aのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うDTリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。これらのアミノ酸残基置換並びに/又は、例えば、ヒスチジン21、チロシン27、グリシン52、及び/若しくはチロシン54などの位置におけるその他の置換を選択して、DTリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、DTの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
ポリヌクレオチド構築物は、天然のジフテリア毒素に由来する任意の機能的な細胞結合領域を含むポリペプチドをコードしないようにデザインする。加えて、DT構築物は、例えば、米国特許出願公開第2009/0010966号明細書により記載されている、V7T、V7N、V7D、D8N、S9A、S9T、S9G、V28N、V28D、V28T、D29N、S30G、S30N、I290T、S292A、S292G及び/又はS292Tなど、天然で配置されたアミノ酸残基6〜8、28〜30、及び/又は289〜291への修飾を含んでもよい。
このリボ毒性を低減したDTポリヌクレオチド構築物及び/又は非リボ毒性DTポリヌクレオチド構築物を、修飾DTリボ毒性領域及び結合領域を含む融合ポリペプチドをコードする、本発明のタンパク質ディスプレイ発現ライブラリーを作製するための鋳型核酸として使用する。
本実施例では、多様なRNAディスプレイライブラリーを、非ヒト脊椎動物に由来する免疫グロブリン遺伝子に由来する結合領域をコードする核酸へと融合させた、修飾DT毒素エフェクター鋳型を使用して創出する。各メンバーが、以下の配列(5’〜3’):T7 RNAポリメラーゼプロモーター、TMV翻訳エンハンサー、修飾DTリボ毒性領域コード配列、結合領域コード配列、及びアミノ末端FLAGタグコード配列を有するようにデザインされた、多様な核酸ライブラリーを作製する。結合領域は、リボ毒性領域に対して特異的に配向されたカルボキシ末端である。
免疫細胞は、非ヒト脊椎動物から採取し、溶解させる。例えば、脊椎動物は、精製された標的生体分子、腫瘍細胞、又は細胞内病原体を伴う、複数回にわたる皮下注射の反復(例えば、6カ月間にわたり6回)により免疫化することができる。次いで、血漿を単離するために、50ミリリットル(mL)の抗凝固処理血液を回収することができ、末梢血リンパ球又は脾臓及びリンパ節組織を採取することができる。非ヒト脊椎動物ドナーは、ヒト化免疫グロブリン配列を含むトランスジェニック生物でありうる。
全RNAを、製造元(Qiagen社、Valencia、CA、U.S.)のプロトコールに従い、RNeasy
RNA単離キットを使用して、脊椎動物の免疫細胞溶解物から単離する。相補性DNA(cDNA)のライブラリーは、例えば、ランダム十量体、オリゴデオキシチミジン(oligo(dT),oligo-deoxythymidine)、及び/又はTTNNNNNNプライマーなど、縮重プライマーを使用して作製する。2マイクログラムの全RNAの逆転写は、製造元の指示書に従い、RETROscript(登録商標)Kit(Ambion社、Austin、TX、U.S.)を使用して実施する。mRNA鋳型は、RNアーゼHによる処置を使用して単離する。
RNA単離キットを使用して、脊椎動物の免疫細胞溶解物から単離する。相補性DNA(cDNA)のライブラリーは、例えば、ランダム十量体、オリゴデオキシチミジン(oligo(dT),oligo-deoxythymidine)、及び/又はTTNNNNNNプライマーなど、縮重プライマーを使用して作製する。2マイクログラムの全RNAの逆転写は、製造元の指示書に従い、RETROscript(登録商標)Kit(Ambion社、Austin、TX、U.S.)を使用して実施する。mRNA鋳型は、RNアーゼHによる処置を使用して単離する。
cDNAライブラリーの合成の後、PCRを使用して、CDRH3の多様性を、cDNAから増幅する。結果として得られるPCR産物をゲル精製し、ヒト重鎖生殖細胞株V領域及びヒト軽鎖生殖細胞株V領域(例えば、Kato M, Hanyu Y, J Immunol Methods 396:
15-22 (2013)を参照されたい)へと挿入する。免疫グロブリン由来領域の全体又は部分領域、例えば、VH領域及び/又はVL領域だけをコードする鋳型カセットのランダム変異誘発を使用して、多様な合成コンビナトリアルライブラリーを創出する。ライブラリーは、例えば、エラープローンPCR、DNAシャフリング、ランダム挿入及び欠失、並びにランダム挿入−欠失による鎖交換(例えば、Raipal A et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 8466-71 (2005); Nishi Met al., J Immunol Methods 2014: Jul 8 (2014)を参照
されたい)などのランダム変異誘発を使用して多様化することができる。ランダム変異誘発は、例えば、コドン構造及びオープンリーディングフレームを維持するために、停止シグナルコードしないことを除きランダムなトリヌクレオチドを使用することなどにより、完全にランダムな場合もあり、部分的にランダムな場合もある。ランダム化scFv集団を表すdsDNA分子のプールを回収し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化する。
15-22 (2013)を参照されたい)へと挿入する。免疫グロブリン由来領域の全体又は部分領域、例えば、VH領域及び/又はVL領域だけをコードする鋳型カセットのランダム変異誘発を使用して、多様な合成コンビナトリアルライブラリーを創出する。ライブラリーは、例えば、エラープローンPCR、DNAシャフリング、ランダム挿入及び欠失、並びにランダム挿入−欠失による鎖交換(例えば、Raipal A et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 8466-71 (2005); Nishi Met al., J Immunol Methods 2014: Jul 8 (2014)を参照
されたい)などのランダム変異誘発を使用して多様化することができる。ランダム変異誘発は、例えば、コドン構造及びオープンリーディングフレームを維持するために、停止シグナルコードしないことを除きランダムなトリヌクレオチドを使用することなどにより、完全にランダムな場合もあり、部分的にランダムな場合もある。ランダム化scFv集団を表すdsDNA分子のプールを回収し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化する。
脊椎動物scFvをコードする核酸ライブラリーは、修飾DTリボ毒性領域をコードする核酸へと連結する。多様な核酸ライブラリーを、scFv結合領域へと融合させた修飾DTリボ毒性領域をコードするようにデザインされた各メンバーにより作製する。次いで、リンカーを、dsDNAライブラリーメンバーへと指向的にライゲーションする。2つのカセットである、FLAGタグコード配列、及びピューロマイシン含有オリゴリンカーとハイブリダイズさせるためにデザインされた配列を、dsDNAライブラリーメンバー、T7プロモーター、5’側非翻訳領域(UTR,untranslated region)へとライゲー
ションして、真核無細胞発現系内のインビトロでの転写を改善する。様々なscFvへと融合させたキメラDTリボ毒性領域のこの多様なライブラリーは、1×1010又はこれを超える固有のメンバーを有しうる。
ションして、真核無細胞発現系内のインビトロでの転写を改善する。様々なscFvへと融合させたキメラDTリボ毒性領域のこの多様なライブラリーは、1×1010又はこれを超える固有のメンバーを有しうる。
RNAディスプレイは、各新生ポリペプチドの最後のアミノ酸残基と、それをコードするRNAとの間で、リボソーム内のペプチド結合を形成することにより達成する。以下:1)ライブラリーの、RNAへの、インビトロでの翻訳ステップ;2)鋳型を除去するDNA消化ステップ;3)オリゴリンカーをハイブリダイズさせ、UV架橋して、安定的な3’末端ヘアピン構造を形成すること(又は酵素スプリントライゲーション及びYライゲーションを代替的に使用すること)を介する、ピューロマイシン/ソラーレンを含むオリゴリンカーの、RNA分子の3’端へのコンジュゲーションステップ;4)ウサギ網状赤血球溶解物を使用することを介する、インビトロでの翻訳ステップ/融合体の形成ステップであって、ピューロマイシン連結RNAを翻訳し、Mg2+及びK+を付加した後におけるピューロマイシンの作用により、ライブラリー内の新生ポリペプチドを、それをコードするRNAへと共有結合的に連結するステップ;5)oligo(dT)及び/又は抗FLAG精製を使用することなどにより、RNA提示ライブラリーを単離する、RNA精製ステップ及び/又はタンパク質精製ステップ、6)未成熟の終止コドンを伴うライブラリーメンバーを消失させる、任意選択の予備選択ステップ;並びに7)DNA/RNAハイブリッド体を作製する逆転写ステップであって、RNA遺伝子型が、後続のステップを阻害しうる二次構造を形成することを防止するステップは、本実施例のRNAディスプレイライブラリーを創出するために実施しうるステップである。
選択ステップを、アフィニティータグにより精製し、組換えにより発現させたタンパク質標的であって、例えば、腫瘍細胞上及び/又はがん細胞上で過剰発現するヒト細胞表面タンパク質などのタンパク質標的への結合について実施する。精製された標的を得るか又は作製する。精製された標的は、Lightning-Link(登録商標)Biotinキット(Innova Bioscience社、Cambridge、U.K.)を使用してビオチニル化する。標的生体分子は、マイクロビーズ上に固定化し、ビーズは、カラムへと充填する。
上記で作製したRNA提示ライブラリーを、50mMのトリス−HCl、pH7.5、150mMのNaCl、0.05%のTween-20、1mg/mLのウシ血清アルブミン(B
SA,bovine serum albumin)、5mMの2−メルカプトエタノール、及び0.5mMのCaCl2中で希釈する。加えて、選択ステップを、tRNA及びBSAの存在下で実施して、非特異的ポリペプチド相互作用を低減する。RNA提示ライブラリーを、カラム上に流動させ、十分に洗浄する。結合したライブラリーメンバーを溶出させ、PCRを実施して、遺伝子型を増幅し、PCR産物をシークエンシングして、選択された融合ポリペプチドの遺伝子型を同定する。
SA,bovine serum albumin)、5mMの2−メルカプトエタノール、及び0.5mMのCaCl2中で希釈する。加えて、選択ステップを、tRNA及びBSAの存在下で実施して、非特異的ポリペプチド相互作用を低減する。RNA提示ライブラリーを、カラム上に流動させ、十分に洗浄する。結合したライブラリーメンバーを溶出させ、PCRを実施して、遺伝子型を増幅し、PCR産物をシークエンシングして、選択された融合ポリペプチドの遺伝子型を同定する。
サポリンリボ毒性領域を含む非リボ毒性ライブラリーのリボソームディスプレイスクリーニング
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号33〜35を参照されたい)を介して触媒不活性化した、サポリンリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、サポリンリボ毒性領域(例えば、配列番号10のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など;また、Flavell D et al., Br J Cancer 84: 571-8 (2001); Polito L et al.,Toxins 3: 697-720 (2011)により創出される組換えサ
ポリンも参照されたい)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:E176K及び/又はR179Qのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うサポリンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号33〜35を参照されたい)を介して触媒不活性化した、サポリンリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、サポリンリボ毒性領域(例えば、配列番号10のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など;また、Flavell D et al., Br J Cancer 84: 571-8 (2001); Polito L et al.,Toxins 3: 697-720 (2011)により創出される組換えサ
ポリンも参照されたい)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:E176K及び/又はR179Qのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うサポリンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。
ポリヌクレオチド構築物は、天然のサポリン毒素に由来する任意の機能的な細胞結合領域を含むポリペプチドをコードしないようにデザインする。このリボ毒性を低減したサポリンコードポリヌクレオチド構築物及び/又は非リボ毒性サポリンコードポリヌクレオチド構築物を、修飾サポリンリボ毒性領域及び結合領域を含む融合ポリペプチドをコードする、本発明のタンパク質ディスプレイ発現ライブラリーを作製するための鋳型核酸として使用する。
結合領域は、ナイーブ脊椎動物免疫細胞ライブラリーに由来する、1×1011を超えるメンバーによる大規模な抗体レパートリーに由来する。Ribomax Large Scale Production System(T7)(Promega社、Madison、WI、U.S.)を使用してmRNAを作製し、ProbeQuant(商標)G50 micro column(Amersham Biosciences社、Piscataway、NJ、U.S.)を使
用してmRNAを精製するように、ライブラリーを転写させる。精製の後、50mMのトリス−酢酸、pH7.5、200mMのグルタミン酸カリウム、7mMの酢酸マグネシウム、90μg/mLのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、0.35mMの各アミノ酸、2mMのATP、0.5mMのGTP、1.0mMのcAMP、30mMのアセチルリン酸、0.5mg/mLの大腸菌tRNA、20μg/mLのフォリン酸、及び1.5%の分子量8000ポリエチレングリコール(PEG,polyethylene glycol)を含有する
緩衝液中の大腸菌S30抽出物を使用して、mRNAをインビトロで翻訳させる。反応を0℃下に置くことにより、反応を停止させ、50mMのトリス−酢酸、pH7.5、150mMのNaCl、50mMの酢酸マグネシウム、0.1%のTween20、及び2.5μg
/mLのヘパリンの5倍希釈液(選択緩衝液)又は1L当たり5ミリモルのMgCl2及び5%のBSAを伴うPBSである緩衝液を添加することにより、三元リボソーム複合体を安定化させる。
用してmRNAを精製するように、ライブラリーを転写させる。精製の後、50mMのトリス−酢酸、pH7.5、200mMのグルタミン酸カリウム、7mMの酢酸マグネシウム、90μg/mLのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、0.35mMの各アミノ酸、2mMのATP、0.5mMのGTP、1.0mMのcAMP、30mMのアセチルリン酸、0.5mg/mLの大腸菌tRNA、20μg/mLのフォリン酸、及び1.5%の分子量8000ポリエチレングリコール(PEG,polyethylene glycol)を含有する
緩衝液中の大腸菌S30抽出物を使用して、mRNAをインビトロで翻訳させる。反応を0℃下に置くことにより、反応を停止させ、50mMのトリス−酢酸、pH7.5、150mMのNaCl、50mMの酢酸マグネシウム、0.1%のTween20、及び2.5μg
/mLのヘパリンの5倍希釈液(選択緩衝液)又は1L当たり5ミリモルのMgCl2及び5%のBSAを伴うPBSである緩衝液を添加することにより、三元リボソーム複合体を安定化させる。
ライブラリーは一般に、mRNA/リボソーム/ディスプレイポリペプチド三元複合体の集団を創出するように、翻訳時における新生ポリペプチドの放出に必要な終止コドンを欠く融合タンパク質により作製する。
ライブラリーの転写は、約500ngの鋳型DNAを使用して、mMessage mMachine(
登録商標)T7 Kit(Ambion社、Austin、TX、U.S.)により実施する。結果として得られる、キャッピングされたmRNAのライブラリーを、製造元の指示書に従い精製する。精製の後、mRNAを、ウサギ網状赤血球溶解物(ヌクレアーゼ処理された)を使用して、30℃で30分間にわたり、インビトロで翻訳させる。
登録商標)T7 Kit(Ambion社、Austin、TX、U.S.)により実施する。結果として得られる、キャッピングされたmRNAのライブラリーを、製造元の指示書に従い精製する。精製の後、mRNAを、ウサギ網状赤血球溶解物(ヌクレアーゼ処理された)を使用して、30℃で30分間にわたり、インビトロで翻訳させる。
精製されたmRNAを短時間にわたり加熱して、二次構造を溶解させ、70mMのKCl、0.8mMのMgOAc、20μMのアミノ酸ミックス、40unitのRNアーゼ阻害剤(Promega社、Madison、WI、U.S.)及び33μLのウサギ網状赤血球溶解物(Promega社、Madison、WI、U.S.)を含有する、インビトロ翻訳反応混合物へと添加する。翻訳反応は、0.1%(v/v)のTween 20(登録商標)(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、U.S.)、6.4mMのMgCl2、2.5mg/mLのヘパリンを伴う低温のPBSを添加して、最終的なMg濃度を5mMへと調整することにより停止させる。
ビオチニル化標的生体分子コーティング型カルボン酸磁気マイクロビーズを使用して、リボソーム複合体を、結合アフィニティーについて、提示されたポリペプチド融合体−リボソームライブラリーから一括で選択する。標的生体分子を、製造元の指示書(Dynabeads(登録商標)MyOne Carboxylic Acid;Life Technologies社、Grand Island、NY、U.S.
)に従い、アミンカップリングを使用して、ビーズへとカップリングさせる。コーティングされたビーズは、0.1%(v/v)のTween 20(登録商標)及び0.5%(w/v)のBSAを含有するPBSで洗浄する。複数ラウンドにわたるサブトラクティブバイオパニング及び選択は、低温のRNアーゼ非含有緩衝液中で、標的コーティングビーズを、リボソーム/RNA複合体へと融合させた、提示されるポリペプチドと組み合わせることにより実施する。各選択ラウンドでは、1時間にわたる緩徐な攪拌に続いて、結合しなかったライブラリー複合体を除去する洗浄ステップを使用する。洗浄は、DEPC H2O中に0.1%(v/v)のTween 20(登録商標)、5mMのMgCl2、2.5mg/mLのヘパリン、5%(w/v)のスキムミルクにより実施する。後続の選択ラウンドでは、同じ洗浄液によるより多くの洗浄ステップを付加することにより、厳密性を増大させる。
)に従い、アミンカップリングを使用して、ビーズへとカップリングさせる。コーティングされたビーズは、0.1%(v/v)のTween 20(登録商標)及び0.5%(w/v)のBSAを含有するPBSで洗浄する。複数ラウンドにわたるサブトラクティブバイオパニング及び選択は、低温のRNアーゼ非含有緩衝液中で、標的コーティングビーズを、リボソーム/RNA複合体へと融合させた、提示されるポリペプチドと組み合わせることにより実施する。各選択ラウンドでは、1時間にわたる緩徐な攪拌に続いて、結合しなかったライブラリー複合体を除去する洗浄ステップを使用する。洗浄は、DEPC H2O中に0.1%(v/v)のTween 20(登録商標)、5mMのMgCl2、2.5mg/mLのヘパリン、5%(w/v)のスキムミルクにより実施する。後続の選択ラウンドでは、同じ洗浄液によるより多くの洗浄ステップを付加することにより、厳密性を増大させる。
バイオパニングによる選択段階を終えるために、マイクロビーズを洗浄し、結合した融合ポリペプチド複合体の遺伝子型を、逆転写PCR(RT−PCR,reverse-transcription PCR)及びDNAシークエンシングにより同定する。マイクロビーズに結合したリボ
ソーム複合体のmRNAは、EDTA緩衝液(50mMのトリス−酢酸、pH7.5、150mMのNaCl、20mMのEDTA、10μg/mLの出芽酵母RNA)の使用により、三元複合体から放出させる。陽性ヒットの遺伝子型であるmRNAは、High Pure RNA Isolation Kit(RocheDiagnostics社、Mannheim、Germany)を使用して精製し、c
DNAへと逆転写させた後、PCR増幅及びDNAシークエンシングにかけた。
ソーム複合体のmRNAは、EDTA緩衝液(50mMのトリス−酢酸、pH7.5、150mMのNaCl、20mMのEDTA、10μg/mLの出芽酵母RNA)の使用により、三元複合体から放出させる。陽性ヒットの遺伝子型であるmRNAは、High Pure RNA Isolation Kit(RocheDiagnostics社、Mannheim、Germany)を使用して精製し、c
DNAへと逆転写させた後、PCR増幅及びDNAシークエンシングにかけた。
代替的に、scFvによる結合性ドメインを、プログラム型マイクロアレイ上で合成し、リボソームディスプレイ及びライブラリー濃縮にかける。マイクロアレイを創出した後で、ライブラリーのDNA分子を水中に放出させ、制限部位末端を含有するプライマーによるPCRにかける。次いで、PCR産物を、発現ベクターへとクローニングし、1×106の大腸菌形質転換体を作製する。ライブラリーに由来するプラスミドDNA(RiboMAX(商標)Large Scale RNA Production SystemT7;Promega社、Madison、WI、U.S.)を
、インビトロでの転写のための鋳型として使用して、RNAを産生し、次いで、これを、TRI試薬(Ambion社、Austin、TX、U.S.)により精製する。MagneGSTビーズ(Promega社、Madison、WI、U.S.)は、1倍濃度の、Tween 20を伴うトリス緩衝生理食塩液(TBS,Tris-buffered saline)(TBST,TBS with Tween 20)中で3回にわたり洗浄する。次いで、ビーズを、GSTタグを伴う標的生体分子でコーティングする。標的とビーズとの結合は、攪拌しながら4℃で一晩にわたり実施する。洗浄及び結合は、50mMの酢酸M
gを加えたRD Buffer及びRNasin(Promega社、Madison、WI、U.S.)を加えた0.5%のTween 20中で実施する。ビーズは、提示されたリボソームライブラリーと、数時間にわた
り混合する。ビーズ及びビーズに結合した材料は、4℃、14,000gの相対遠心力で5分間にわたる遠心分離により回収し、複数回にわたり洗浄する。最終回の洗浄の後、緩衝液中に20mMのEDTAと共に再懸濁させ、37℃で10分間にわたりインキュベートすることにより、リボソーム複合体を得る。次いで、RNAを、Qiagen RNeasyカラム
上で精製し、水で溶出させる。逆転写ステップ及びRNアーゼHステップを使用して、濃縮された結合剤遺伝子型についてのcDNAライブラリーを創出する。シークエンシングのために、PCR産物を、ベクターへとクローニングする。
、インビトロでの転写のための鋳型として使用して、RNAを産生し、次いで、これを、TRI試薬(Ambion社、Austin、TX、U.S.)により精製する。MagneGSTビーズ(Promega社、Madison、WI、U.S.)は、1倍濃度の、Tween 20を伴うトリス緩衝生理食塩液(TBS,Tris-buffered saline)(TBST,TBS with Tween 20)中で3回にわたり洗浄する。次いで、ビーズを、GSTタグを伴う標的生体分子でコーティングする。標的とビーズとの結合は、攪拌しながら4℃で一晩にわたり実施する。洗浄及び結合は、50mMの酢酸M
gを加えたRD Buffer及びRNasin(Promega社、Madison、WI、U.S.)を加えた0.5%のTween 20中で実施する。ビーズは、提示されたリボソームライブラリーと、数時間にわた
り混合する。ビーズ及びビーズに結合した材料は、4℃、14,000gの相対遠心力で5分間にわたる遠心分離により回収し、複数回にわたり洗浄する。最終回の洗浄の後、緩衝液中に20mMのEDTAと共に再懸濁させ、37℃で10分間にわたりインキュベートすることにより、リボソーム複合体を得る。次いで、RNAを、Qiagen RNeasyカラム
上で精製し、水で溶出させる。逆転写ステップ及びRNアーゼHステップを使用して、濃縮された結合剤遺伝子型についてのcDNAライブラリーを創出する。シークエンシングのために、PCR産物を、ベクターへとクローニングする。
サルシンリボ毒性領域を含む非リボ毒性ライブラリーのタンパク質−DNA連結ディスプレイスクリーニング
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号23〜24を参照されたい)を介して触媒不活性化した、サルシンリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、サルシンリボ毒性領域(例えば、配列番号7のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:H137Q又はH137A(例えば、Carreras-Sangra N et al., Protein Eng Des Sel 25: 425-35 (2012)を参
照されたい)のうちの1カ所又は2カ所以上を伴うサルシンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。これらのアミノ酸残基置換及び/又は、例えば、トリプトファン48、ヒスチジン49、ヒスチジン50、トリプトファン51、アスパラギン54、イソロイシン69、グルタミン酸95、グルタミン酸96、リシン11、リシン112、リシン114、アルギニン121、ヒスチジン136などの位置におけるその他の置換を選択して、サルシンリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、サルシンの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号23〜24を参照されたい)を介して触媒不活性化した、サルシンリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、サルシンリボ毒性領域(例えば、配列番号7のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:H137Q又はH137A(例えば、Carreras-Sangra N et al., Protein Eng Des Sel 25: 425-35 (2012)を参
照されたい)のうちの1カ所又は2カ所以上を伴うサルシンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。これらのアミノ酸残基置換及び/又は、例えば、トリプトファン48、ヒスチジン49、ヒスチジン50、トリプトファン51、アスパラギン54、イソロイシン69、グルタミン酸95、グルタミン酸96、リシン11、リシン112、リシン114、アルギニン121、ヒスチジン136などの位置におけるその他の置換を選択して、サルシンリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、サルシンの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
細菌により提示される表面足場をコードする核酸へと融合させるのにサルシンリボ毒性領域構築物を使用して、核酸ライブラリーを創出する。本実施例では、当業者に公知の方法を使用して、サルシンリボ毒性領域の、19〜25アミノ酸残基のランダム化ポリペプチドを含む、カルボキシ末端結合領域への、M.Hae IIによる融合体をコードする核酸ライブラリーを作製する。
50%(v/v)の鉱物油、45%(v/v)のSpan 80、及び5%(v/v)のTween-80(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、U.S.)を使用して、油エマルジョン溶液を調製
する。50μLの水を、950μLの油エマルジョンと、4℃で、強くかき混ぜながら、少なくとも5分間にわたり混合することにより、混合相溶液を作製する。油中水エマルジョンの水コンパートメントを、任意に、分散ツール、又は、例えば、ペルフルオロ界面活性剤(例えば、Matochko W et al., Methods 58: 18-27 (2012)を参照されたい)などの
界面活性剤を伴う、マルチウェルプラスチックプレート、シリカウェハ、又はバイオチップなどの支持層上で創出する。エマルジョンを使用して、コンパートメントは、マイクロ流体チャネル内の多分散エマルジョン又は単分散液滴として形成することができる(Kaminski T et al., Lab Chip 12: 3995-4002 (2012)を参照されたい)。単離コンパートメントを使用して、ライブラリーメンバーを作製することにより、増幅バイアスが最小化される。
する。50μLの水を、950μLの油エマルジョンと、4℃で、強くかき混ぜながら、少なくとも5分間にわたり混合することにより、混合相溶液を作製する。油中水エマルジョンの水コンパートメントを、任意に、分散ツール、又は、例えば、ペルフルオロ界面活性剤(例えば、Matochko W et al., Methods 58: 18-27 (2012)を参照されたい)などの
界面活性剤を伴う、マルチウェルプラスチックプレート、シリカウェハ、又はバイオチップなどの支持層上で創出する。エマルジョンを使用して、コンパートメントは、マイクロ流体チャネル内の多分散エマルジョン又は単分散液滴として形成することができる(Kaminski T et al., Lab Chip 12: 3995-4002 (2012)を参照されたい)。単離コンパートメントを使用して、ライブラリーメンバーを作製することにより、増幅バイアスが最小化される。
ライブラリーのインビトロにおける転写及び翻訳を実施して、提示されるポリペプチド
を、ライブラリーのDNA鋳型から創出する。各エマルジョン液滴に、50ngずつのライブラリー鋳型DNAを使用する。発現させたポリペプチドは、修飾メチル化標的配列である5’−GGFC−3’(F=5−フルオロ−2’−デオキシシチジン)を使用して、付加
物を形成することにより、それらをコードするDNA分子へと共有結合的に結合させる。
を、ライブラリーのDNA鋳型から創出する。各エマルジョン液滴に、50ngずつのライブラリー鋳型DNAを使用する。発現させたポリペプチドは、修飾メチル化標的配列である5’−GGFC−3’(F=5−フルオロ−2’−デオキシシチジン)を使用して、付加
物を形成することにより、それらをコードするDNA分子へと共有結合的に結合させる。
個々の液滴内の転写及び翻訳時に、発現させるライブラリーの融合ポリペプチド内に、組換えM.Hae IIIを存在させることにより、約2nMの濃度のDNA鋳型分子(遺伝子型
)を、発現させるライブラリーポリペプチド(表現型)へと共有結合的に架橋する。この工程を、30℃で、少なくとも3時間にわたり進行させる。その後、水性相を、エマルジョンから抽出し、製造元の指示書に従い、ビオチニル化DNA鋳型を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(Dynabeads(登録商標)M-280 Streptavidin;Life Technologies社、Grand Island、NY、U.S.)の表面上で捕捉する。水による複数回にわたる洗浄の後で、試料を、過剰量の、短いビオチニル化二本鎖DNA断片の存在下で、2分間にわたり、70℃まで加熱することにより、結合させたDNA分子を、ビーズから放出させる。
)を、発現させるライブラリーポリペプチド(表現型)へと共有結合的に架橋する。この工程を、30℃で、少なくとも3時間にわたり進行させる。その後、水性相を、エマルジョンから抽出し、製造元の指示書に従い、ビオチニル化DNA鋳型を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(Dynabeads(登録商標)M-280 Streptavidin;Life Technologies社、Grand Island、NY、U.S.)の表面上で捕捉する。水による複数回にわたる洗浄の後で、試料を、過剰量の、短いビオチニル化二本鎖DNA断片の存在下で、2分間にわたり、70℃まで加熱することにより、結合させたDNA分子を、ビーズから放出させる。
液滴内でDNA連結型提示ポリペプチドを形成した後で、遠心分離によりエマルジョンを分解し、単一の混合物分解緩衝液(1ミリモル(mM)のCaCl2、pH7.4を伴うPBS又はTBS)又はKrytox(登録商標)(Matochko W et al., Methods 58:18-27
(2012)を参照されたい)へと組み合わせる。混合物をエーテルで抽出して、DNA連結
型提示融合ポリペプチドを含む水性相を得る。
(2012)を参照されたい)へと組み合わせる。混合物をエーテルで抽出して、DNA連結
型提示融合ポリペプチドを含む水性相を得る。
次いで、PBS緩衝液、TBS緩衝液、トリスEDTA(TE,Tris EDTA)緩衝液、
又はこれらの誘導体などの緩衝液中の結合アフィニティー陽性選択及び結合アフィニティー陰性選択などの選択ステップを、ライブラリー上で実施する。非特異的結合のブロッキングは、室温で15分間にわたる、最終濃度を125μMとする短いビオチニル化二本鎖DNA分子:5’−ビオチン−GGA GCT TCT GCA TTC TGT GTG CTG−3’(配列番号88)(Qiagen社)を伴うインキュベーションを使用して達成する。結合についての陽性選択の後で、結合しなかった材料を洗い落とし、PCRにより、結合したDNA連結型提示ポリペプチドを同定する。
又はこれらの誘導体などの緩衝液中の結合アフィニティー陽性選択及び結合アフィニティー陰性選択などの選択ステップを、ライブラリー上で実施する。非特異的結合のブロッキングは、室温で15分間にわたる、最終濃度を125μMとする短いビオチニル化二本鎖DNA分子:5’−ビオチン−GGA GCT TCT GCA TTC TGT GTG CTG−3’(配列番号88)(Qiagen社)を伴うインキュベーションを使用して達成する。結合についての陽性選択の後で、結合しなかった材料を洗い落とし、PCRにより、結合したDNA連結型提示ポリペプチドを同定する。
選択ステップを、アフィニティータグにより精製し、組換えにより発現させたタンパク質標的であって、例えば、腫瘍細胞上及び/又はがん細胞上で過剰発現するヒト細胞表面タンパク質などのタンパク質標的への結合について実施する。精製された標的生体分子を得るか又は作製する。精製された標的は、Lightning-Link(登録商標)Biotinキット(Innova Bioscience社、Cambridge、U.K.)を使用してビオチニル化する。標的生体分子を、製造元の指示書に従い、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(Dynabeads(登録
商標)M-280 Streptavidin;LifeTechnologies社、Grand Island、NY、U.S.)へと連結
する。標的への結合についての選択は、自動式KingFisher(商標)磁気ビーズシステム(Thermo Lab Systems社、Thermo Scientific社グループ、Waltham、MA、U.S.)を使用して、溶液中で実施する。
商標)M-280 Streptavidin;LifeTechnologies社、Grand Island、NY、U.S.)へと連結
する。標的への結合についての選択は、自動式KingFisher(商標)磁気ビーズシステム(Thermo Lab Systems社、Thermo Scientific社グループ、Waltham、MA、U.S.)を使用して、溶液中で実施する。
陽性選択ステップは、標的生体分子コーティングマイクロビーズ上で実施する。DNA連結発現型融合ポリペプチドライブラリーと組み合わせた標的生体分子を、ロータリーシェーカー上、1分間当たり120回転(r.p.m.,revolutions per minute)で、60〜90分間にわたりインキュベートする。洗浄は、80μLのTE緩衝液(10mMのトリス、1mMのEDTA、pH=7.5)により実施する。磁気ビーズは、KingFisher(商標)Flex Magnetic ParticleSeparator(Thermo Scientific社グループ、Waltham、MA、U.S.)を使用して、100μLのカゼインB及びTween 20を伴うトリス緩衝生理食塩液(TBSCT,Tris-bufferedsaline with casein B and Tween 20)で6回にわたり
洗浄した後、100μLのカゼインBを伴うトリス緩衝生理食塩液(TBSC,Tris-buf
fered saline with casein B)で1回洗浄する。最後に、6mMのKOH溶液、pH11.7を使用して、PCRのために、捕捉された「ヒット」を調製するように、KOH溶出ステップを実施する。試料は、中和してから、DNA鋳型の配列を同定するために、一部をPCR混合物へと添加する。
洗浄した後、100μLのカゼインBを伴うトリス緩衝生理食塩液(TBSC,Tris-buf
fered saline with casein B)で1回洗浄する。最後に、6mMのKOH溶液、pH11.7を使用して、PCRのために、捕捉された「ヒット」を調製するように、KOH溶出ステップを実施する。試料は、中和してから、DNA鋳型の配列を同定するために、一部をPCR混合物へと添加する。
リシンリボ毒性領域を含む非リボ毒性ライブラリーの細胞表面ディスプレイスクリーニング
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号20〜22を参照されたい)を介して触媒不活性化した、リシン毒素(RT,ricin toxin)リボ毒性領域をコードするポリヌ
クレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、リシンリボ毒性領域(例えば、配列番号6のアミノ酸配列又はLui X et al., MAbs 4: 57-68 (2012)において記載されているアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:Y80S、E177Q、R180H、S203N、及び/又はR213Nのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うリシンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化であるが、これらは、Munishkin A, Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995)により記載されている1カ所又は2カ所以上の欠失を含んでもよい。これらのアミノ酸残基置換並びに/又は、例えば、アルギニン48、アスパラギン122、チロシン123、アスパラギン209、トリプトファン211、グリシン212、セリン215、及びイソロイシン252などの位置におけるその他の置換を選択して、DTリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、DTの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号20〜22を参照されたい)を介して触媒不活性化した、リシン毒素(RT,ricin toxin)リボ毒性領域をコードするポリヌ
クレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、リシンリボ毒性領域(例えば、配列番号6のアミノ酸配列又はLui X et al., MAbs 4: 57-68 (2012)において記載されているアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:Y80S、E177Q、R180H、S203N、及び/又はR213Nのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うリシンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化であるが、これらは、Munishkin A, Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995)により記載されている1カ所又は2カ所以上の欠失を含んでもよい。これらのアミノ酸残基置換並びに/又は、例えば、アルギニン48、アスパラギン122、チロシン123、アスパラギン209、トリプトファン211、グリシン212、セリン215、及びイソロイシン252などの位置におけるその他の置換を選択して、DTリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、DTの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
ポリヌクレオチド構築物は、天然のリシン毒素に由来する任意の機能的な細胞結合領域を含むポリペプチドをコードしないようにデザインする。加えて、リシン構築物は、例えば、置換N97A(Lui X et al., MAbs 4: 57-68 (2012)を参照されたい)など、天然で配置されたアミノ酸残基への修飾を含んでもよい。
抗体の代替的足場であるFn3のライブラリーであって、ループ長を変化させ、免疫グロブリンCDR−H3のアミノ酸残基レパートリー(Hackel B et al., J Mol Biol 40: 84-96 (2010))と類似するアミノ酸残基レパートリーを含むライブラリーを得るか又は作製する。
構築物は、結合領域へと融合させたリシンリボ毒性領域へと融合させたAga2pをコードする、pCT-CONベクター、pCT201ベクター、又はpCT302ベクターに基づき創出する。
Aga2pタンパク質は天然で、細胞壁タンパク質であるAga1pと、2つのジスルフィド結合を形成し、これにより、融合タンパク質の細胞表面ディスプレイをもたらす。結合領域は、最終構築物内のあらかじめの操作及び/又は3つのループ領域(BCループ、DEループ、FGループ)に焦点を絞るエラープローンPCR、フレームワーク変異を導入する、Fn3遺伝子の全体についてのエラープローンPCR、及びループに対するDNAシャフリングなどを介する変異誘発により多様化させる。
Aga2pタンパク質は天然で、細胞壁タンパク質であるAga1pと、2つのジスルフィド結合を形成し、これにより、融合タンパク質の細胞表面ディスプレイをもたらす。結合領域は、最終構築物内のあらかじめの操作及び/又は3つのループ領域(BCループ、DEループ、FGループ)に焦点を絞るエラープローンPCR、フレームワーク変異を導入する、Fn3遺伝子の全体についてのエラープローンPCR、及びループに対するDNAシャフリングなどを介する変異誘発により多様化させる。
アフィニティー結合選択アッセイは、標的生体分子でコーティングされた磁気マイクロビーズの調製を要請する。まず、標的生体分子をビオチニル化する。次いで、マイクロ遠心管内の100mLのPBSA(1倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液、0.1%のウシ血清アルブミン)中に10mLのDynabeads(登録商標)(1mL当たりのビーズ4×105
)当たり7〜35ピコモル(pmol,picomole)のビオチニル化標的を調製する。遠心
管を、4℃で攪拌しながら、少なくとも1時間にわたりインキュベートする。最後に、ビーズを、1mLのPBSAで洗浄し、提示される融合ポリペプチドの酵母ライブラリーを適用する直前に単離する。
)当たり7〜35ピコモル(pmol,picomole)のビオチニル化標的を調製する。遠心
管を、4℃で攪拌しながら、少なくとも1時間にわたりインキュベートする。最後に、ビーズを、1mLのPBSAで洗浄し、提示される融合ポリペプチドの酵母ライブラリーを適用する直前に単離する。
EBY100酵母株を使用し、トリプトファン欠損培地上で増殖させる。タンパク質ディスプレイは、形質転換した酵母を、グルコースリッチ培地から、ガラクトースリッチ培地への切替えを介して、構築物の発現を誘導することにより誘発する。選択は、本明細書で記載される通りに調製した標的生体分子コーティング磁気マイクロビーズ、及び/又は当業者に公知の方法を使用して調製した標的生体分子コーティング磁気マイクロビーズ(例えば、Ackerman M et al., Biotechnol Prog 25: 774-83 (2009)を参照されたい)を使用して実施する。
次いで、ライブラリースクリーニングを、Dynabeads(登録商標)Biotin Binder(Life
Technologies社、Grand Island、NY、U.S.)を使用して実施する。まず、ライブラリー
から、非特異的結合剤を枯渇させ、次いで、それらを、攪拌しながら、4℃で2時間にわたりインキュベートすることにより、所望のビオチニル化標的生体分子への結合剤を濃縮する。磁石を使用して、結合しなかった酵母細胞を、新たな遠心管へと分離し、PBSAで洗浄する。
Technologies社、Grand Island、NY、U.S.)を使用して実施する。まず、ライブラリー
から、非特異的結合剤を枯渇させ、次いで、それらを、攪拌しながら、4℃で2時間にわたりインキュベートすることにより、所望のビオチニル化標的生体分子への結合剤を濃縮する。磁石を使用して、結合しなかった酵母細胞を、新たな遠心管へと分離し、PBSAで洗浄する。
2ラウンドにわたる磁気ビーズ濃縮の後で、Fn3サブライブラリーを、変異誘発にかけて、多様性を集団へと導入した。この新たなライブラリーを、磁気ビーズを使用して再度スクリーニングする。Fn3結合剤の選択工程は、2ラウンドにわたる濃縮に続く変異誘発と同じままとする。複数ラウンドにわたる陰性選択及び陽性選択は、洗浄厳密性を増大させて実施する。選択厳密性の増大は、選択された表現型を欠く、所望されない拙速増幅クローンを最小化する一助となる。他の選択ステップは、酵母ディスプレイ免疫沈降法を含みうる(例えば、Cho Y et al., J Immunol Methods 341: 117-26 (2009)を参照されたい)。より複雑な選択を実施して、哺乳動物細胞への結合について選択することができる(例えば、Wang X, Shusta E, J Immunol Methods 304: 30-42 (2005); Wang X etal., Nat Methods 4: 143-5 (2007); Krishnaswamy S et al., Anal Biochem 395: 16-24(2009)を参照されたい)。
個々の酵母クローンを単離し、Zymoprep(商標)YeastPlasmid Miniprep II(Zymo Research Corp.社、Irvine、CA、U.S.)を使用して、それらのpCT-CONベクターを、シーク
エンシングのために精製する。pCT-CONの挿入領域をシークエンシングすることにより、
酵母表面提示融合ポリペプチドのスクリーニングヒットをコードするポリヌクレオチド配列の同定がなされる。
エンシングのために精製する。pCT-CONの挿入領域をシークエンシングすることにより、
酵母表面提示融合ポリペプチドのスクリーニングヒットをコードするポリヌクレオチド配列の同定がなされる。
RIP阻害剤である4−APPの存在下における、志賀毒素リボ毒性領域を含む、リボ毒性ライブラリーのファージディスプレイスクリーニング
当技術分野で公知の方法を使用して、VH領域とVL領域との間のリンカーをコードするコード領域内にlox部位を伴うベクターを使用する、ファージミドscFvディスプレイライブラリーを創出する。これは、数百万に及ぶ多様なクローンを創出する、Creリコンビナーゼベースの結合領域シャフリングを可能とする。全RNAを、免疫化された脊椎動物試料又はヒト試料から調製する。1又は2以上のcDNAライブラリーは、当業者に公知の標準的プロトコールに従い、ランダムヘキサマー及び全RNAの逆転写酵素を使用することにより創出する。例えば、IgM VH遺伝子及びIgM VL遺伝子のプライマーなど、異なるIgコード領域に対する異なるプライマーを選択することができる。次いで、scFvリンカー内の重複領域の他、制限クローニングステップを容易とする制限部位も付加するように、VHコード領域及びVLコード領域を再増幅する。次に、等
モル量のVHPCR産物とVLPCR産物との混合物をライゲーションすることにより、scFvをアセンブルする。scFvライブラリーは、一次ライブラリーへとクローニングすることができ、これは、より大規模でより多様な二次ライブラリーを創出するのに後で使用される。
当技術分野で公知の方法を使用して、VH領域とVL領域との間のリンカーをコードするコード領域内にlox部位を伴うベクターを使用する、ファージミドscFvディスプレイライブラリーを創出する。これは、数百万に及ぶ多様なクローンを創出する、Creリコンビナーゼベースの結合領域シャフリングを可能とする。全RNAを、免疫化された脊椎動物試料又はヒト試料から調製する。1又は2以上のcDNAライブラリーは、当業者に公知の標準的プロトコールに従い、ランダムヘキサマー及び全RNAの逆転写酵素を使用することにより創出する。例えば、IgM VH遺伝子及びIgM VL遺伝子のプライマーなど、異なるIgコード領域に対する異なるプライマーを選択することができる。次いで、scFvリンカー内の重複領域の他、制限クローニングステップを容易とする制限部位も付加するように、VHコード領域及びVLコード領域を再増幅する。次に、等
モル量のVHPCR産物とVLPCR産物との混合物をライゲーションすることにより、scFvをアセンブルする。scFvライブラリーは、一次ライブラリーへとクローニングすることができ、これは、より大規模でより多様な二次ライブラリーを創出するのに後で使用される。
ファージミドライブラリーを、Creリコンビナーゼを発現させるBS1365宿主細胞へと形質転換して、VHコード領域とVLコード領域との間の組換えを引き起こす。遺伝子型を表現型へと連結するには、個別の大腸菌感染のために、ファージミドを増幅し、次いで、単離しなければならない。
最適化されたヒトフレームワークと、重鎖相補性決定領域内の多様性の他、第3の軽鎖相補性決定領域内の多様性も創出するようにデザインされた変異誘発性オリゴヌクレオチドとを使用して、バクテリオファージの表面上でscFvを提示するライブラリーを創出する。変異誘発性オリゴヌクレオチドは、以下のモル比:25%のTyr、20%のSer、20%のGly、10%のAla及び5%ずつのPhe、Trp、His、Pro及びValの各々で、9アミノ酸のコドンを含有する、特注の三量体ホスホルアミダイトミックス(Glen Research社、Sterling VA、U.S.)を使用して合成する。ライブラリーは、野生型志賀毒素アミノ酸配列だけを含む志賀毒素リボ毒性領域と会合させた各scFvにより創出する。
ファージは、1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下で、大腸菌に、ファージタンパク質IIIのD2ドメインとD3ドメインとの間にトリプシン認識部
位を含有するKM13ヘルパーファージを重複感染させることにより産生する。ファージは、希釈系列からコロニー形成単位(CFU,colony forming unit)をカウントするこ
とにより滴定する。
位を含有するKM13ヘルパーファージを重複感染させることにより産生する。ファージは、希釈系列からコロニー形成単位(CFU,colony forming unit)をカウントするこ
とにより滴定する。
ファージの選択は、1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下、96ウェルMaxisorp(登録商標)Immunoplate(Nunc社、Rochester、NY、U.S.)内で、複数のラウンドにわたり実施する。次いで、個々のファージクローンは、1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下、96ウェルプレート内で繁殖させ、結合アフィニティーを特徴づけるように、ELISAで調べる。全てのELISAにより、結合剤は、提示されたポリペプチド配列を同定するようにシークエンシングされることが確認された。
生体分子標的は、ビオチンタグにより調製する。まず、生体分子標的の組換え形態を得るか又は作製し、精製する。次いで、製造元の指示書に従い、EZ-LinkH(商標)Sulfo-NHS-LC-LC-Biotinキット(Pierce社、Thermo Scientific社グループ、Waltham、MA、U.S.)を使用して、ビオチンタグを標的へと結合させる。
バイオパニングを、Kingfisher(商標)磁気ビーズシステム(Thermo Lab Systems社、Thermo Scientific社グループ、Waltham、MA、U.S.)を介する自動装置を使用して、1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下の溶液中で実施する。1×1014コロニー形成単位(cfu)のscFvファージライブラリーのプールを、125mLの最終容量内、2%のBSA、0.01%のTween-20を伴うPBS(PBS−LT)及び1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APP中、室温で1時間にわたりインキュベートして、非特異的結合を遮断した。第1の選択ラウンドでは、2.0mgのビオチニル化標的分子を、ブロッキングされたscFvライブラリーと共に、150mLの最終容量中、室温で1時間にわたりインキュベートする。インキュベーション後、scFvファージ−F1複合体を、室温で15分間にわたりインキュベートして、ファージの、1×108磁気ストレプトアビジンマイクロビーズ(Dynabeads(登録商標)M-280 Strep
tavidin;Life Technologies社、GrandIsland、NY、U.S.)への結合を可能とする。
tavidin;Life Technologies社、GrandIsland、NY、U.S.)への結合を可能とする。
ビーズ複合体は、PBS−LTで複数回にわたり洗浄し、次いで、0.1%のTween-20を伴うPBS(PBS−T:PBS with 0.1% Tween-20)で複数回にわたり洗浄する。最終的なscFv−毒素融合体提示ファージ結合集団は、室温で3分間にわたるインキュベーション及び0.1Mのグリシン、pH2.2を使用して30秒間にわたるインキュベーションを介して溶出させ、1Mのトリス−HCl(pH8.8)を添加することにより、pH7.5へと中和する。溶出させたscFvファージ集団は、DH5aF’大腸菌に感染させて、1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下、37℃で45分間にわたり、600nmの光学密度(OD600)で0.5まで増殖させることによりを回収する。ファージを感染させた細菌細胞は、100mg/mLのカルベニシリン、3%のグルコースを含有する2倍濃度のYT寒天培地(2×YT/Carb/Glu)、及び1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APP上に播種し、30℃で一晩にわたりインキュベートする。ファージを感染させた細菌細胞は、4−APPを含有する1.8mLの2×YT/Carb/Glu培養液中で回収し、10mLの細菌懸濁液を、4−APPを含有する10mLの2×YT/Carb/Glu培養液へと接種し、振とう(260rpm)しながら、37℃で、OD600が約0.5となるまでインキュベートする。増幅は、37℃で30分間にわたる静的インキュベーションを介して、感染させた細菌に、約1×1013cfuのM13K07ヘルパーファージ(Amersham Pharmacia Biotech Inc.社、PiscatawayNJ、U.S.)を共感染させることにより達成する。共感染の後、感染させた細菌を、3000rpmで30分間にわたる遠心分離により回収し、100mg/mLのカルベニシリン、25mg/mLのカナマイシン、及び1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPを含有する10mLの2×YT培養液中に再懸濁させ、振とう(260rpm)しながら、30℃で一晩にわたりインキュベートする。融合ポリペプチドを提示するファージは、3000rpmで30分間にわたる遠心分離により回収し、上清の単離、及びPEG/NaCl(20%w/vのポリエチレングリコール6000、2.5MのNaCl)を使用する沈降にかける。
選択ステップは、融合ポリペプチドのファージディスプレイ上で実施する。選択された標的生体分子は、それらを、ビオチニル化タグを伴う200μgの組換え標的生体分子で、一晩にわたりコーティングすることにより、MaxiSorp(登録商標)イムノチューブ(Thermo Lab Systems社、Thermo Scientific社グループ、Waltham、MA、U.S.)内で固定化し、次いで、PBSで3回にわたり洗浄し、2%のミルク/PBSにより、37℃で2時間にわたりブロッキングする。融合ポリペプチドを提示するファージを、標的を含有するイムノチューブ内、2%のミルク/PBS及び1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APP中で、少なくとも1時間にわたりあらかじめインキュベートし、次いで、遠心管を、4−APPを伴うPBS/0.1%のTween-20で洗浄する。各ラウンドにおいて、ビオチニル化標的分子の濃度を10分の1ずつ減少させ、洗浄時間を5分間ずつ延長することを介する、複数のラウンドにわたるバイオパニングにより、選択の厳密性状態を増大させる。各ラウンドでは、結合させたファージを、100mMのトリエチルアミン(pH10)1mlを使用して溶出させ、1Mのトリス−HCl(pH7.4)0.5mlを添加することにより、又はトリプシンを使用して中和する。溶出させたファージを、1mMの志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下、指数関数的に増殖する10mLのTG1細胞へと感染させ、4−APP及び/又は抗生剤を伴う適切な培地を使用することにより感染細胞を選択する。
陽性結合剤の同定は、溶出させたファージをクローニングすることにより達成する。細菌培養物に、溶出させたファージを、37℃で30分間にわたり感染させ、3300gの相対遠心力で、10分間にわたり遠心分離にかけ、再懸濁させ、4−APPを伴う抗生剤耐性2×YT寒天プレートへと展開する。結果として得られるプレート上の細菌コロニー
を、1%のグルコース/アンピシリン及び4−APPを伴う2×YT培地へとこすり落とし、OD 0.5まで増殖させてから、増幅のために、約1×109のM13K07ヘルパーファージを感染させる。培養物は、アンピシリン(100g/mL)、カナマイシン(25g/mL)、及び4−APPを伴うが、グルコースを伴わない2×YT培地中、37℃でインキュベートした。
を、1%のグルコース/アンピシリン及び4−APPを伴う2×YT培地へとこすり落とし、OD 0.5まで増殖させてから、増幅のために、約1×109のM13K07ヘルパーファージを感染させる。培養物は、アンピシリン(100g/mL)、カナマイシン(25g/mL)、及び4−APPを伴うが、グルコースを伴わない2×YT培地中、37℃でインキュベートした。
ELISAを使用して、各ファージクローンを、標的生体分子への結合について調べる。ポリペプチド配列は、DNA及び/又はインサートの全体をコードするターゲティング領域のPCR増幅、PCR産物の精製、並びにDNAシークエンシングにより同定する。選択された提示融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、それらをコードするDNA配列から推定する。
ヒト腫瘍細胞を使用して、ファージライブラリーを、標的細胞への結合及び細胞への内部化についてスクリーニングする。まず、陽性選択のために使用されるが、細胞表面標的を欠く細胞型と関連する対照細胞を使用して、所望されないファージのライブラリーを枯渇させるように、陰性選択ステップを使用する。志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下で、2〜6ラウンドにわたる、これらの対照細胞への前吸収を使用して、望ましくない表現型のライブラリーを枯渇させる。次に、志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下において、蛍光活性化細胞分取(FACS,fluorescence-activated cell sorting)により分取された細胞などの標的細胞型に対する陽性選択を実施し
て、所望される細胞表面標的の存在を確認する。
て、所望される細胞表面標的の存在を確認する。
標的ヒト腫瘍細胞は、T75フラスコ内、志賀毒素リボ毒性領域阻害剤である4−APPの存在下で、72時間にわたり、又は80〜90%のコンフルエンシーまで培養する。培養培地の大半は、細胞から除去する。例えば、3mLの培養培地中で希釈された、1×1013のファージ1mLなどのファージを、4℃で、細胞へと添加することにより、融合ポリペプチドを提示するファージを、細胞への結合について選択する。ファージは、時折揺動させながら、4℃で2時間にわたり、細胞と共にインキュベートする。次に、細胞を、5%の二酸化炭素ガスを施されたインキュベーター内、37℃で30分間にわたりインキュベートして、ファージの細胞への内部化を生じさせる。細胞は、4℃、4−APPを伴う10mLのPBSで3回にわたり洗浄して、結合しなかったファージを除去し、次いで、4mLのストリッピング緩衝液(50mMのグリシンpH2.8、0.5MのNaCl、2Mの尿素、2%のポリビニルピロリドン)で5分間ずつ3回にわたり洗浄して、内部化しなかったファージを除去する。ストリッピング緩衝液を中和し、細胞を、1mMの4−APPを伴う培養培地中に再懸濁させる。細胞を、37℃でトリプシン/EDTA(Gibco(登録商標)TE)により処理して、細胞をフラスコから解離させる。
細胞は、遠心分離により回収し、100mMのトリエチルアミン(TEA,triethylamine)溶液で溶解させる。溶解させた細胞混合物を中和し、37℃で、指数関数的に増殖
する大腸菌TG1(OD600nmを0.5とする)へと添加する。ファージの希釈液を、適切な選択用抗生剤及び4−APPを伴う好熱性細菌ビタミン鉱物培地(TYE/tet)プ
レート上に播種し、次いで、プレートを、30℃で一晩にわたりインキュベートして、腫瘍細胞への内部化について選択されたファージを繁殖させる。選択工程の全体を、同一な条件で、少なくともさらに1回反復する。
する大腸菌TG1(OD600nmを0.5とする)へと添加する。ファージの希釈液を、適切な選択用抗生剤及び4−APPを伴う好熱性細菌ビタミン鉱物培地(TYE/tet)プ
レート上に播種し、次いで、プレートを、30℃で一晩にわたりインキュベートして、腫瘍細胞への内部化について選択されたファージを繁殖させる。選択工程の全体を、同一な条件で、少なくともさらに1回反復する。
シークエンシングプラットフォーム、例えば、454社製のプラットフォーム(Illumina
社、Roche社、Solexa社製の、Illumina HiSeq 2000、Illumina GAllx、Solid 5500xl、Illumina HiSeq 2500 Rapid Run、Ion torrent、454 FLX titanium XL、PacBio RS II)、
又はPolonatorシステム(総説については、Sims Det al., Nat Rev Genet 15: 121-32 (2014)を参照されたい)を使用することなどにより、ライブラリーの多様性をモニタリン
グするように、選択ラウンドの前後における、ライブラリーのディープシークエンシングを使用することができる。
社、Roche社、Solexa社製の、Illumina HiSeq 2000、Illumina GAllx、Solid 5500xl、Illumina HiSeq 2500 Rapid Run、Ion torrent、454 FLX titanium XL、PacBio RS II)、
又はPolonatorシステム(総説については、Sims Det al., Nat Rev Genet 15: 121-32 (2014)を参照されたい)を使用することなどにより、ライブラリーの多様性をモニタリン
グするように、選択ラウンドの前後における、ライブラリーのディープシークエンシングを使用することができる。
コリックス毒素阻害剤であるPJ34の存在下における、PEリボ毒性領域を含む、リボ毒性ライブラリーのRNAディスプレイスクリーニング
シュードモナス属外毒素A(PE)由来のリボ毒性領域(例えば、配列番号8のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。コードされるPEリボ毒性領域は、小サイズの領域を産生するように切断された天然のPEに由来する、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方を有するが、天然のフリン切断部位は維持され、及び/又は外因性プロテアーゼ部位が付加される(例えば、395〜613以外の全てを切断したPE構築物(例えば、欧州特許第2570425A2号明細書を参照されたい)又はPE IIIドメインだけを含むPE構築物(例えば、国際出願公
開第2012154530号パンフレットを参照されたい)、及び他のバリアント(例えば、Hwang J etal., Cell 48: 129-36 (1987); Kondo T et al., J Biol Chem 263: 9470-5 (1988);Pai L et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 3358-62 (1991);米国特許第
4,892,827号明細書、及び同第5,602,095号明細書を参照されたい)を参照されたい)。
シュードモナス属外毒素A(PE)由来のリボ毒性領域(例えば、配列番号8のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。コードされるPEリボ毒性領域は、小サイズの領域を産生するように切断された天然のPEに由来する、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方を有するが、天然のフリン切断部位は維持され、及び/又は外因性プロテアーゼ部位が付加される(例えば、395〜613以外の全てを切断したPE構築物(例えば、欧州特許第2570425A2号明細書を参照されたい)又はPE IIIドメインだけを含むPE構築物(例えば、国際出願公
開第2012154530号パンフレットを参照されたい)、及び他のバリアント(例えば、Hwang J etal., Cell 48: 129-36 (1987); Kondo T et al., J Biol Chem 263: 9470-5 (1988);Pai L et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 3358-62 (1991);米国特許第
4,892,827号明細書、及び同第5,602,095号明細書を参照されたい)を参照されたい)。
任意に、PE構築物は、例えば、Iaドメインの欠失、Ibドメイン内、IIドメイン内及びIIIドメイン内の多様なアミノ酸残基の欠失;免疫原性を低減する、IIドメイン内の
多様な欠失(例えば、米国特許出願公開第2010/0215656A1号明細書を参照されたい)など、1又は2以上の内部欠失を伴うPEリボ毒性領域をコードする。任意に、PE構築物は、核局在化シグナルモチーフの付加(例えば、米国特許出願公開第2014/0005362A1号明細書を参照されたい);リソソームプロテアーゼに対して感受性の領域の多様な欠失(例えば、Weldon J et al., Blood 13: 3792-3800 (2009);国
際特許公開第2009/032954号パンフレットを参照されたい);及び/又はカルボキシ末端におけるアミノ酸であって、ER保留/回収シグナルモチーフを含むアミノ酸の付加(例えば、Siegall C et al., J Biol Chem 264: 14256-61 (1989)を参照されたい)など、天然のアミノ酸残基6〜8、28〜30又は289〜291位内に多様な修飾/置換(例えば、米国特許出願公開第2009/0010966A1号明細書を参照されたい)を伴うPEリボ毒性領域をコードする。任意に、PE構築物は、例えば、天然のアミノ酸残基位置であるD406、R432、R467、R490、R513、E548、K590、Q592、及び/又は当技術分野で公知の他の多くのアミノ酸残基位置の置換など、免疫原性を低減する、多様なアミノ酸置換を伴うPEリボ毒性領域をコードする(例えば、Chaudhary V et al., J Biol Chem 265: 16306-10 (1990); Brinkmann U etal., Proc Natl Acad Sci USA 89: 3065-9 (1992); Kasturi S et al., J Biol Chem267: 23427-33 (1992); Benhar I et al, J Biol Chem 269: 13398-404 (1994); Kuan Cet al., J Biol Chem 269: 7610-6 (1994); Onda M et al., Proc Natl Acad Sci USA105: 11311-6 (2008); Liu, W et al., Protein Eng Des Sel 25: 1-6 (2012);国際特許公開第2011032022号パンフレット;国際特許公開第2012170617号パンフレット;国際特許公開第2007016150A2号パンフレット;欧州特許第1910407B1号明細書;米国特許出願公開第2009/0142341A1号明細書;米国特許出願公開第2012/0263674A1号明細書;米国特許出願公開第2013/0121983A1号明細書;米国特許出願公開第2014/0094417A1号明細書;米国特許出願公開第2014/0213529A1号明細書を参照されたい)。
多様な欠失(例えば、米国特許出願公開第2010/0215656A1号明細書を参照されたい)など、1又は2以上の内部欠失を伴うPEリボ毒性領域をコードする。任意に、PE構築物は、核局在化シグナルモチーフの付加(例えば、米国特許出願公開第2014/0005362A1号明細書を参照されたい);リソソームプロテアーゼに対して感受性の領域の多様な欠失(例えば、Weldon J et al., Blood 13: 3792-3800 (2009);国
際特許公開第2009/032954号パンフレットを参照されたい);及び/又はカルボキシ末端におけるアミノ酸であって、ER保留/回収シグナルモチーフを含むアミノ酸の付加(例えば、Siegall C et al., J Biol Chem 264: 14256-61 (1989)を参照されたい)など、天然のアミノ酸残基6〜8、28〜30又は289〜291位内に多様な修飾/置換(例えば、米国特許出願公開第2009/0010966A1号明細書を参照されたい)を伴うPEリボ毒性領域をコードする。任意に、PE構築物は、例えば、天然のアミノ酸残基位置であるD406、R432、R467、R490、R513、E548、K590、Q592、及び/又は当技術分野で公知の他の多くのアミノ酸残基位置の置換など、免疫原性を低減する、多様なアミノ酸置換を伴うPEリボ毒性領域をコードする(例えば、Chaudhary V et al., J Biol Chem 265: 16306-10 (1990); Brinkmann U etal., Proc Natl Acad Sci USA 89: 3065-9 (1992); Kasturi S et al., J Biol Chem267: 23427-33 (1992); Benhar I et al, J Biol Chem 269: 13398-404 (1994); Kuan Cet al., J Biol Chem 269: 7610-6 (1994); Onda M et al., Proc Natl Acad Sci USA105: 11311-6 (2008); Liu, W et al., Protein Eng Des Sel 25: 1-6 (2012);国際特許公開第2011032022号パンフレット;国際特許公開第2012170617号パンフレット;国際特許公開第2007016150A2号パンフレット;欧州特許第1910407B1号明細書;米国特許出願公開第2009/0142341A1号明細書;米国特許出願公開第2012/0263674A1号明細書;米国特許出願公開第2013/0121983A1号明細書;米国特許出願公開第2014/0094417A1号明細書;米国特許出願公開第2014/0213529A1号明細書を参照されたい)。
ポリヌクレオチド構築物は、天然のPE毒素に由来する任意の機能的な細胞結合領域を含むポリペプチドをコードしないようにデザインする。例えば、PE Iaドメインの全体は、欠失させることもでき(例えば、米国特許第4,892,827号明細書を参照さ
れたい)、代替的に、非機能的となるように変異させることもできる(例えば、米国特許第5,512,658号明細書を参照されたい)。
れたい)、代替的に、非機能的となるように変異させることもできる(例えば、米国特許第5,512,658号明細書を参照されたい)。
本実施例では、結合領域は、脊椎動物免疫細胞のナイーブレパートリーに由来する、免疫グロブリン型ポリペプチドである。結合領域ライブラリーを構築するポリヌクレオチドは、合成により多様化されたIgNAR Vドメインライブラリーであって、魚類免疫細胞由来のライブラリーから単離された、単一の出発IgNAR Vドメインに由来するIgNAR Vドメインライブラリーに由来する。CDR3ループ配列は、配列及び長さがランダムに変化している。DNAカセットのライブラリーは、スプライス重複型ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により調製する。増幅されたカセット断片は、ゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼで消化し、同様に消化されたファージミドディスプレイベクターであるpHEN2へとライゲーションする。当業者に公知の標準的技法を使用して、結果として得
られるファージミドを、大腸菌へとクローニングする。
られるファージミドを、大腸菌へとクローニングする。
これらのIgNAR Vドメインをコードするポリヌクレオチドを、PEリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチドへと融合させて、各メンバーが、以下の配列(5’〜3’):T7 RNAポリメラーゼプロモーター、TMV翻訳エンハンサー、IgNAR Vドメイン、結合領域、コード配列、PEリボ毒性領域コード配列、アミノ末端FLAGタグコード配列、及びピューロマイシン含有オリゴリンカーとハイブリダイズさせるためにデザインされた配列を有するようにデザインされた、多様な核酸ライブラリーを創出する。結合領域は、リボ毒性領域に対して特異的に配向されたアミノ末端である。次いで、1×1010又はこれを超える固有のメンバーを伴うライブラリーを創出するように、リンカーを、発現ライブラリーメンバーの核酸へと指向的にライゲーションする。
RNAディスプレイは、各新生ポリペプチドの最後のアミノ酸残基と、それをコードするRNAとの間で、リボソーム内のペプチド結合を形成することにより達成する。以下:1)ライブラリーの、RNAへの、インビトロでの翻訳ステップ;2)鋳型を除去するDNA消化ステップ;3)オリゴリンカーをハイブリダイズさせ、UV架橋して、安定的な3’末端ヘアピン構造を形成すること(又は酵素スプリントライゲーション及びYライゲーションを代替的に使用すること)を介する、ピューロマイシン/ソラーレンを含むオリゴリンカーの、RNA分子の3’端へのコンジュゲーションステップ;4)ウサギ網状赤血球溶解物を使用することを介する、インビトロでの翻訳ステップ/融合体の形成ステップであって、ピューロマイシン連結RNAを翻訳し、Mg2+及びK+を付加した後におけるピューロマイシンの作用により、ライブラリー内の新生ポリペプチドを、それをコードするRNAへと共有結合的に連結するステップ;5)oligo-dT及び/又は抗FLAG精製を使用することなどにより、RNA提示ライブラリーを単離する、RNA精製ステップ及び/又はタンパク質精製ステップ、6)未成熟の終止コドンを伴うライブラリーメンバーを消失させる、任意選択の予備選択ステップ;並びに7)DNA/RNAハイブリッド体を作製する逆転写ステップであって、RNA遺伝子型が、後続のステップを阻害しうる二次構造を形成することを防止するステップは、本実施例のRNAディスプレイライブラリーを創出するために実施しうるステップである。
選択ステップを、アフィニティータグにより精製し、組換えにより発現させたタンパク質標的であって、例えば、腫瘍細胞上及び/又はがん細胞上で過剰発現するヒト細胞表面タンパク質などのタンパク質標的への結合について実施する。精製された標的を得るか又は作製する。精製された標的は、Lightning-Link(登録商標)Biotinキット(Innova Bioscience社、Cambridge、U.K.)を使用してビオチニル化する。標的生体分子は、マイクロビーズ上に固定化し、ビーズは、カラムへと充填する。
上記で作製したRNA提示ライブラリーを、50mMのトリス−HCl、pH7.5、
150mMのNaCl、0.05%のTween-20、1mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)、5mMの2−メルカプトエタノール、及び0.5mMのCaCl2中で希釈する。加えて、選択ステップを、tRNA及びBSAの存在下で実施して、非特異的ポリペプチド相互作用を低減する。RNA提示ライブラリーを、カラム上に流動させ、十分に洗浄する。結合したライブラリーメンバーを溶出させ、PCRを実施して、遺伝子型を増幅し、PCR産物をシークエンシングして、選択された融合ポリペプチドの遺伝子型を同定する。
150mMのNaCl、0.05%のTween-20、1mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)、5mMの2−メルカプトエタノール、及び0.5mMのCaCl2中で希釈する。加えて、選択ステップを、tRNA及びBSAの存在下で実施して、非特異的ポリペプチド相互作用を低減する。RNA提示ライブラリーを、カラム上に流動させ、十分に洗浄する。結合したライブラリーメンバーを溶出させ、PCRを実施して、遺伝子型を増幅し、PCR産物をシークエンシングして、選択された融合ポリペプチドの遺伝子型を同定する。
RNアーゼ阻害剤の存在下における、レストリクトシンリボ毒性領域を含む非リボ毒性ライブラリーの細胞表面ディスプレイスクリーニング
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号63を参照されたい)を介して触媒不活性化した、レストリクトシンリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、レストリクトシンリボ毒性領域(例えば、配列番号13のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域、又はGoyal A et al., Biochem J 345:
247-54 (2000)により記載されているリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:Y47A、H49A、E95A、及び/又はH156Aのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うレストリクトシンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。これらのアミノ酸残基置換並びに/又は、例えば、リシン110、リシン111、リシン113、及び/若しくはアルギニン120などの位置におけるその他の置換を選択して、レストリクトシンリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、レストリクトシンの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
1カ所又は2カ所以上の変異(例えば、配列番号63を参照されたい)を介して触媒不活性化した、レストリクトシンリボ毒性領域をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得る。代替的に、リボ毒性である、レストリクトシンリボ毒性領域(例えば、配列番号13のアミノ酸配列を含むリボ毒性領域、又はGoyal A et al., Biochem J 345:
247-54 (2000)により記載されているリボ毒性領域など)をコードするポリヌクレオチド構築物を創出するか又は得、次いで、1カ所又は2カ所以上の変化を、ポリヌクレオチドへと施して、リボ毒性を低減したバリアント及び/又は非リボ毒性バリアントを創出する。例えば、天然で配置されたアミノ酸残基における、以下のアミノ酸残基置換:Y47A、H49A、E95A、及び/又はH156Aのうちの1カ所又は2カ所以上を伴うレストリクトシンリボ毒性領域バリアントをコードするポリヌクレオチド構築物を結果としてもたらす変化である。これらのアミノ酸残基置換並びに/又は、例えば、リシン110、リシン111、リシン113、及び/若しくはアルギニン120などの位置におけるその他の置換を選択して、レストリクトシンリボ毒性領域ポリペプチドの全体的構造を著明に変化させずに、レストリクトシンの酵素活性を大幅に緩和するか又は消失させることができる。
ポリヌクレオチド構築物は、天然のレストリクトシン毒素に由来する任意の機能的な細胞結合領域を含むポリペプチドをコードしないようにデザインする。
このリボ毒性を低減したレストリクトシンポリヌクレオチド構築物及び/又は非リボ毒性レストリクトシンポリヌクレオチド構築物を、修飾レストリクトシンリボ毒性領域及び結合領域を含む融合ポリペプチドをコードする、本発明のタンパク質ディスプレイ発現ライブラリーを作製するための鋳型核酸として使用する。
本実施例では、結合領域は、脊椎動物免疫細胞のバイアスのかかったレパートリーに由来する、免疫グロブリン型ポリペプチドである。ラクダ科動物を、獣医科ワクチンアジュバント(例えば、GERBU Adjuvant(登録商標);GERBU Biotechnik GmbH社、Heidelberg
、Germanyなど)と混合して精製された標的生体分子(約1マイクログラム)で免疫化す
る。血液試料を、免疫化されたラクダ科動物から単離して、リンパ球を得る。リンパ球を使用して、全mRNAを単離する。VHH遺伝子は、標準法を使用する、mRNAに対するRT−PCRを使用して、単離された核酸から増幅する。増幅されたVHH断片を、大腸菌における細菌表面ディスプレイのためにデザインされたベクター、及び多様な核酸ライブラリーを創出するための、リボ毒性領域をコードする鋳型へとライゲーションする。多様性は、例えば、インビトロにおける進化法などの合成法を使用して、自然発生の多様性の範囲を超えて増大させることができる(例えば、Barthelemy P et al., J Biol Chem
283: 3639-54 (2008)を参照されたい)。核酸ライブラリーを、大腸菌へと形質転換する。25μMのCB5225540の存在下において、形質転換された大腸菌が、それらの表面上で融合ポリペプチドを提示するように、多様な融合ポリペプチドの発現を誘導する。誘導された大腸菌細胞(最終OD600を、5.0と同等とする)を、3分間にわたる
(相対遠心力4000gで)遠心分離により採取し、2mLのPBS(滅菌濾過及び脱気された)で3回にわたり洗浄し、最終容量1mLのPBS中に再懸濁させる。
、Germanyなど)と混合して精製された標的生体分子(約1マイクログラム)で免疫化す
る。血液試料を、免疫化されたラクダ科動物から単離して、リンパ球を得る。リンパ球を使用して、全mRNAを単離する。VHH遺伝子は、標準法を使用する、mRNAに対するRT−PCRを使用して、単離された核酸から増幅する。増幅されたVHH断片を、大腸菌における細菌表面ディスプレイのためにデザインされたベクター、及び多様な核酸ライブラリーを創出するための、リボ毒性領域をコードする鋳型へとライゲーションする。多様性は、例えば、インビトロにおける進化法などの合成法を使用して、自然発生の多様性の範囲を超えて増大させることができる(例えば、Barthelemy P et al., J Biol Chem
283: 3639-54 (2008)を参照されたい)。核酸ライブラリーを、大腸菌へと形質転換する。25μMのCB5225540の存在下において、形質転換された大腸菌が、それらの表面上で融合ポリペプチドを提示するように、多様な融合ポリペプチドの発現を誘導する。誘導された大腸菌細胞(最終OD600を、5.0と同等とする)を、3分間にわたる
(相対遠心力4000gで)遠心分離により採取し、2mLのPBS(滅菌濾過及び脱気された)で3回にわたり洗浄し、最終容量1mLのPBS中に再懸濁させる。
細菌提示ポリペプチドは、溶液中の、標的生体分子でコーティングされたマイクロビーズへのそれらの結合特徴に基づき選択する。約10nM〜250nMの濃度の、ビオチニル化された精製組換え標的生体分子を、25μMのCB5225540の存在下で、100μLの誘導された細菌へと添加し、最終容量を、「PBS−BSA」(0.5%w/vのBSAを補充され、滅菌濾過及び脱気され、また、25μMのCB5225540も含有するPBS)で、200μLへと調整した。標的生体分子を、細菌提示融合ポリペプチドライブラリーと共に、室温で1時間にわたりインキュベートする。インキュベーションの後で、細菌を、1mLのPBS−BSAで3回にわたり洗浄し、20μLの抗ビオチン常磁性ビーズ(Miltenyi Biotec社、Bergisch Gladbach、Germany)を含有する100μ
Lの同じ緩衝液中に再懸濁させ、4℃で20分間にわたりインキュベートする。次に、細菌を、1mLのPBS−BSAで3回にわたり洗浄し、500μLの同じ緩衝液中に再懸濁させ、500μLのPBS−BSAであらかじめ平衡化されたMACS(登録商標)MSカラム(MiltenyiBiotec社、Bergisch Gladbach、Germany)へと適用し、OctoMACS Separator(Miltenyi Biotec社、Bergisch Gladbach、Germany)上に配置する。結合しなかった細菌のフロースルーを回収し、カラムを、500μLのPBS−BSAで3回にわたり洗浄する。結合した細菌を、25μMのCB5225540を含有する2mLの細菌液体培養培地で溶出させる。必要な場合、選択ステップは、反復することができる。結合した細菌を希釈し、25μMのCB5225540を含有する培地上に播種して、個々のクローンを単離する。1回又は2回以上の結合選択の後で、個々のクローンに対するフローサイトメトリーを使用して、結合アフィニティーを検証する。陽性ヒットは、個々のクローンに由来するプラスミドDNAインサートのシークエンシング、又は結合した細菌のプールに対するディープシークエンシングにより同定する。同定されたVHHドメインのポリペプチド及びタンパク質は、例えば、米国特許第6,838,254号明細書及び米国特許第7,794,981号明細書により記載されている方法など、当業者に公知の多様な方法を使用して、個々の構成要素として産生することもでき、細胞毒性融合タンパク質として産生することもできる。
Lの同じ緩衝液中に再懸濁させ、4℃で20分間にわたりインキュベートする。次に、細菌を、1mLのPBS−BSAで3回にわたり洗浄し、500μLの同じ緩衝液中に再懸濁させ、500μLのPBS−BSAであらかじめ平衡化されたMACS(登録商標)MSカラム(MiltenyiBiotec社、Bergisch Gladbach、Germany)へと適用し、OctoMACS Separator(Miltenyi Biotec社、Bergisch Gladbach、Germany)上に配置する。結合しなかった細菌のフロースルーを回収し、カラムを、500μLのPBS−BSAで3回にわたり洗浄する。結合した細菌を、25μMのCB5225540を含有する2mLの細菌液体培養培地で溶出させる。必要な場合、選択ステップは、反復することができる。結合した細菌を希釈し、25μMのCB5225540を含有する培地上に播種して、個々のクローンを単離する。1回又は2回以上の結合選択の後で、個々のクローンに対するフローサイトメトリーを使用して、結合アフィニティーを検証する。陽性ヒットは、個々のクローンに由来するプラスミドDNAインサートのシークエンシング、又は結合した細菌のプールに対するディープシークエンシングにより同定する。同定されたVHHドメインのポリペプチド及びタンパク質は、例えば、米国特許第6,838,254号明細書及び米国特許第7,794,981号明細書により記載されている方法など、当業者に公知の多様な方法を使用して、個々の構成要素として産生することもでき、細胞毒性融合タンパク質として産生することもできる。
本発明のある特定の実施形態について、例示を目的として記載してきたが、本発明は、多くの改変、変化、及び適応により実施することが可能であり、本発明の精神から逸脱したり、特許請求の範囲を超えたりせずに、当業者の技術の範囲内にある、多数の同等な解決法又は代替的な解決法の使用により実施しうることが明らかであろう。
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許又は特許出願が、参照によりそれらの全体において組み込まれるように、具体的に、個別に指し示された場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。米国特許仮出願第61/777,130号明細書、同第61/932,000号明細書、同第61/936,255号明細書、同第61/951,110号明細書、同第61/951,121号明細書、同第62/010,918号明細書、同第62/049,325号明細書、及び同第62/107,644号明細書の各々の開示は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。米国特許出願公開第2007/0298434A1号明細書、米国特許出願公開第2009/0156417A1号明細書、及び米国特許出願公開第2013/0196928A1号明細書の各々の開示は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。国際特許公開第2014/164693号、同第WO2014/164680号、同第WO2015/113005号、及び同第WO2015/113007号の各々の開示は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。GenBank(National Center for BiotechnologyInformation、U.S.)から電子的に入手可能な、本明細書で引用されるアミノ酸配列及びヌクレオチド配列についての全ての生物学的配列情報の完全な開示も、参照により組み込まれる。
Claims (1)
- 1又は2以上の細胞毒性タンパク質を同定するための方法であって、
前記細胞毒性タンパク質が、
i)ポリペプチドを含み、リボソームを不活性化することが可能な、リボ毒性領域と、
ii)ペプチド又はポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と
を含み、
前記方法が、
a)複数のタンパク質を用意するステップであって、各タンパク質が、
i)ペプチド又はポリペプチドを含み、少なくとも1つの標的生体分子に結合することが可能な、結合領域と
ii)リボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域から修飾された、修飾リボ毒性領域と
を含む、ステップと;
b)前記タンパク質の中から、少なくとも1つのアッセイ選択可能な特徴を伴うタンパク質を選択するステップと;
c)前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた、同定された結合領域に由来するか又はこれを含む1又は2以上のリボ毒性タンパク質を構築するために、選択されたタンパク質のペプチド領域又はポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップと
を含む、前記方法。
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