JP2022524221A - 標的指向活性遺伝子編集剤及び使用方法 - Google Patents

標的指向活性遺伝子編集剤及び使用方法 Download PDF

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Abstract

遺伝子編集タンパク質の細胞内送達に関する方法及び組成物を提供する。本発明は、遺伝子編集ポリペプチド、例えばＣａｓ９またはＣａｓ１２を、生体外または生体内で細胞内に輸送するための組成物及び方法に関する。本発明は、細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを含む標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤、及び核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチドを含む。抗原結合性ポリペプチドと部位特異的改変性ポリペプチドは、細胞外細胞膜結合分子を提示している細胞の中に部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行できるように安定して結び付いている。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０１９年３月２２日に出願された米国仮出願第６２／８２２，５２９号に基づく優先権を主張するものである。参照により優先権出願の内容を本明細書に援用する。
分野
本発明は、概して、抗原結合性ポリペプチドに結合体化された部位特異的改変性ポリペプチドを使用して細胞内の核酸を編集するための方法及び組成物に関する。
発明の背景
ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９は、様々な細胞種及び生物におけるゲノム操作のための多目的ツールとなった（例えばＵＳ８，６９７，３５９（特許文献１）を参照されたい）。ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）は、二本鎖ＲＮＡ複合体またはキメラ一本鎖ガイドＲＮＡなどのガイドＲＮＡに誘導されて標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡ）中に部位特異的な二本鎖切断部（ＤＳＢ）または一本鎖切断部（ＳＳＢ）を作り出すことができる。標的核酸の切断が細胞（例えば真核細胞）内で起こると、標的核酸中の切断部は、非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修飾（ＨＤＲ）によって修復され得る。加えて、触媒的に不活性なＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）を単独で、または転写活性化因子またはリプレッサードメインと融合した状態で使用して、切断を伴わずに、標的部位との結合によって標的核酸中の部位での転写レベルを変化させることができる。
しかしながら、ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼを特定の細胞または組織に送達及び標的指向させる能力は難題であり続けている。ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼの送達のための様々な方法またはビヒクル、例えば、電気穿孔、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス及び脂質ナノ粒子が利用されてきた（例えば、Ｌｉｎｏ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２５（１），ｐｐ．１２３４－１２５７（非特許文献１）を参照されたい）。Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌに記載されているように、特定の方法、例えばマイクロインジェクションまたは電気穿孔は、主として試験管内での用途に限られる。他の送達様式、例えば、ＡＡＶまたは脂質ナノ粒子は、生体内でのＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼの送達のために利用されてきたが、これらの送達方法は、生体内環境での難題に直面している。例えば、ＡＡＶに基づく送達ビヒクルは、免疫学的障壁、パッケージングサイズ限界、及び遺伝毒性ゲノム組込み事象のリスクを呈する（例えば、Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、及びＷａｎｇ，Ｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１８（５），ｐｐ．３５８－３７８（非特許文献２）を参照されたい）。さらに、脂質ナノ粒子によるＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼの送達には、積荷のエンドソーム分解、特異的細胞向性、及び肝臓における生物蓄積を含めたいくつか欠点がある（例えば、Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、及びＦｉｎｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ，２２（９），ｐｐ．２２２７－２２３５（非特許文献３）を参照されたい）。
受容体でＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ自体を改変することによってＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼの標的送達を改善する代替方法が試みられたことがある。しかしながら、そのような受容体媒介ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼは、試験管内で限られた編集を示し、生体内での編集を成し遂げなかった（例えば、Ｒｏｕｅｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ－ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ，１４０（２１），ｐｐ．６５９６－６６０３（非特許文献４）を参照されたい）。
ＵＳ８，６９７，３５９
Ｌｉｎｏ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２５（１），ｐｐ．１２３４－１２５７ Ｗａｎｇ，Ｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１８（５），ｐｐ．３５８－３７８ Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ，２２（９），ｐｐ．２２２７－２２３５ Ｒｏｕｅｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ－ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ，１４０（２１），ｐｐ．６５９６－６６０３
所望の細胞または組織を標的とする能力を有する、特に生体内編集のための、ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼの必要性が未だ満たされずに存在する。所望の細胞または組織を標的とするＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼを利用する遺伝子編集療法の効果的な送達が当技術分野で必要とされている。さらには、生体内での標的指向遺伝子編集を提供する組成物及び方法の必要性が未だ満たされずに存在する。
本明細書では、特定細胞種を生体内でも生体外でも編集することができる抗原結合性ポリペプチドを含む標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤を提供する。ＴＡＧＥ剤のモジュール方式のプログラム可能な設計は、様々な細胞種の柔軟な標的指向を可能にする迅速な指向先変更及び多機能性を可能にする。さらに、標的細胞において特定の核酸配列（例えば遺伝子及び調節エレメント）を編集することによって、ＴＡＧＥ剤は二重特異性を有し、ＤＮＡに基づく送達手法（Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ．１４．６（２０１７）：６００、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２４．６（２０１４）：１０１２－１０１９）と比較してより少ないオフターゲット作用を有する。ＴＡＧＥ剤は、標的細胞におけるＴＡＧＥ剤の細胞結合及び／または細胞内部移行を促進する１つ以上の抗原結合性ポリペプチドを含む。さらに、ある場合には、抗原結合性ポリペプチドは、ＴＡＧＥ剤の受容体媒介進入を可能にするだけでなく、場合によっては抗原結合性ポリペプチドは、（例えば細胞内シグナル伝達経路を変化させることによって）細胞の生態を媒介することも行う。
かくして、細胞外細胞膜結合分子（例えば細胞表面分子）に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチドを含み、細胞外細胞膜結合分子（例えば細胞表面分子）を提示している細胞の中に部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行できるように抗原結合性ポリペプチドと部位特異的改変性ポリペプチドとが安定して結び付いている、遺伝子編集用細胞内部移行剤（ＴＡＧＥ剤）に関する方法及び組成物が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体である。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９またはＣａｓ１２である。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、ガイドＲＮＡと部位特異的改変性ポリペプチドとがリボ核タンパク質を形成している。
別の態様において、本発明は、標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤であって、細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及びＣＲＩＳＰＲ配列を認識するＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む部位特異的改変性ポリペプチドを含み、細胞外細胞膜結合分子を提示している細胞の中に部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行できるように抗原結合性ポリペプチドと部位特異的改変性ポリペプチドとが安定して結び付いており、抗原結合性ポリペプチドが、抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体である、当該ＴＡＧＥ剤を提供する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡと部位特異的改変性ポリペプチドとがリボ核タンパク質を形成している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、配列番号１１９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１１９との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはアミノ酸置換Ｃ８０Ａを含む（例えば、配列番号１）。別の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９以外のヌクレアーゼ（例えば第ＩＩＩ節に記載のもの）である。ある実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ Ｖ型ヌクレアーゼである。具体的な実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ（例えば、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｃａｓ１２ａ、配列番号１２０）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、配列番号１２０との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書においてＴＡＧＥ剤に有用なＣａｓ１２ａ変異体の例としては、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｕｌｔｒａ（例えば、ＩＤＴカタログ番号１０００１２７２）、またはこれをもって参照により援用されるＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７．３（２０１９）：２７６－２８２の中で記載されるＣａｓ１２ａが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドに結合する結合体化部分をさらに含む。ある実施形態では、結合体化部分はタンパク質である。ある実施形態では、タンパク質は、プロテインＡ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＨａｌｏ－Ｔａｇである。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとがリンカーを介して結合体化している。ある実施形態では、リンカーは切断可能である。
いくつかの実施形態では、抗体模倣体は、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合性分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ｎａｎｏＣＬＡＭＰ、ユニボディ、バーサボディ、アプタマー、またはペプチド性分子である。
いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合性部分は、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）２、またはイントラボディである。
いくつかの実施形態では、抗体は、完全抗体、または二重特異性抗体である。
いくつかの態様において、本発明は、標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤であって、細胞外細胞膜結合タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、及びＣａｓ９ヌクレアーゼを含む部位特異的改変性ポリペプチドを含み、細胞外細胞膜結合タンパク質が発現している細胞の中に部位特異的改変性ポリペプチドが抗体またはその抗原結合性部分を介して内部移行できるように抗体またはその抗原結合性部分と部位特異的改変性ポリペプチドとが結合体化部分を介して安定して結び付いている、当該ＴＡＧＥ剤を提供する。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳを含む。ある実施形態では、ＳＶ４０ ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＮＬＳは部位特異的改変性ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、または両方にある。ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、少なくとも２つのＮＬＳを含む。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、細胞外細胞膜結合タンパク質が発現している細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、ガイドＲＮＡと部位特異的改変性ポリペプチドとが核タンパク質を形成している。
ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性部分に結合できる結合体化部分をさらに含む。ある実施形態では、結合体化部分はタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、プロテインＡ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＨａｌｏ－Ｔａｇである。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、配列番号１１９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１１９との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはアミノ酸置換Ｃ８０Ａを含む（例えば、配列番号１）。ある実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施形態では、抗体の抗原結合性部分は、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）２、またはイントラボディである。
ある実施形態では、抗体は、完全抗体、または二重特異性抗体である。
ある実施形態では、細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質（例えば細胞表面分子またはタンパク質）は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＡｃｈＲ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐＣａｍ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＩＣＯＳまたはＲＳＶである。
いくつかの実施形態では、細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質はＣＤ１１ａである。いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体はエファリズマブである。
いくつかの実施形態では、細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質はＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、抗ＣＤ２５抗体はダクリズマブである。
別の態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ配列を認識するＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、及び細胞外細胞膜結合分子（例えば細胞表面分子）に特異的に結合する抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体に結合する結合体化部分を含む、部位特異的改変性ポリペプチドを提供する。
ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含む。ある実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、配列番号１１９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１１９との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはアミノ酸置換Ｃ８０Ａを含む（例えば配列番号１）。別の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ Ｖ型ヌクレアーゼである。具体的な実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ（例えば、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃａｓ１２ａ、配列番号１２０）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、配列番号１２０との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書においてＴＡＧＥ剤に有用なＣａｓ１２ａ変異体の例としては、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｕｌｔｒａ（例えば、ＩＤＴカタログ番号１０００１２７２）、またはこれをもって参照により援用されるＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７．３（２０１９）：２７６－２８２の中で記載されるＣａｓ１２ａが挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳを含む。ある実施形態では、ＳＶ４０ ＮＬＳはＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む。ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、少なくとも２つのＮＬＳを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＮＬＳは部位特異的改変性ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、または両方にある。
ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、抗体、その抗原結合性部分、または抗体模倣体に結合できる、結合体化部分をさらに含む。ある実施形態では、結合体化部分はタンパク質である。ある実施形態では、タンパク質は、プロテインＡ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＨａｌｏ－Ｔａｇである。
ある実施形態では、細胞外細胞膜結合分子は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＡｃｈＲ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＥｐＣａｍ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、またはＲＳＶからなる群から選択されるタンパク質である。
いくつかの実施形態では、細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質はＣＤ１１ａである。いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体はエファリズマブである。
いくつかの実施形態では、細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質はＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、抗ＣＤ２５抗体はダクリズマブである。
別の態様において、本発明は、核タンパク質であって、部位特異的改変性ポリペプチド、及びガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡが、細胞外細胞膜結合タンパク質を提示している細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするものである、当該核タンパク質を提供する。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示される部位特異的改変性ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。一実施形態では、ベクターは核酸を含む。別の実施形態では、細胞は部位特異的改変性ポリペプチドを含む。
別の態様において、本発明は、標的細胞のゲノムを改変する方法であって、標的細胞を、本明細書に記載の標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤と接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態では、標的細胞は真核細胞である。ある実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞またはヒト細胞である。ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはゲノムの標的領域に切断部位を生成し、それによってゲノムを改変する。ある実施形態では、ゲノムの標的領域は標的遺伝子である。
ある実施形態では、本明細書に記載のＴＡＧＥ剤の使用を含む方法は、標的遺伝子の発現を改変するのに有効である。ある実施形態では、方法は、基準レベルと比較して標的遺伝子の発現を増強するのに有効である。ある実施形態では、方法は、基準レベルと比較して標的遺伝子の発現を減少させるのに有効である。
別の態様では、哺乳動物対象において標的細胞内で核酸配列を改変する方法であって、対象において標的細胞を、細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び標的細胞の核酸配列が改変されるような標的細胞内で核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチドを含む、標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤と接触させることを含む、当該方法が本明細書に提供される。
別の態様では、哺乳動物対象において標的細胞内で核酸配列を改変する方法であって、細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び標的細胞の核酸配列が改変されるような標的細胞内で核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチドを含む、標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤を対象に局所投与することを含む、当該方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、ＴＡＧＥ剤を対象に筋肉内注射、骨内注射、眼内注射、腫瘍内注射または皮内注射によって局所投与することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、対象において遺伝子改変された標的細胞のレベルを、抗原結合性ポリペプチドがない部位特異的改変性ポリペプチドによる治療によって達成されるレベルに比べて上昇させるのに有効である。
いくつかの実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。
いくつかの実施形態では、対象は、眼疾患、幹細胞障害及びがんから選択される疾患を有し、方法は、疾患を治療するのに有効である。
別の態様では、標的哺乳動物細胞内で核酸配列を改変する方法であって、核酸配列が改変されるような、ＴＡＧＥ剤が標的細胞内に内部移行する条件の下で標的哺乳動物細胞と標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤とを接触させることを含み、ＴＡＧＥ剤が、細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び標的細胞内で核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチドを含むものであり、ＴＡＧＥ剤の内部移行が電気穿孔に依存しない、当該方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、造血細胞（ＨＳＣ）、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたは線維芽細胞である。ある実施形態では、標的哺乳動物細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ある実施形態では、標的哺乳動物細胞は、造血幹細胞でない骨髄中の細胞（例えば、線維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、破骨細胞（ｏｓｔｃｌａｓｔ）または内皮細胞）である。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドはヒトＨＳＣ上の細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する。ある実施形態では、ＨＳＣ上の細胞外細胞膜結合分子は、ＣＤ３４、ＥＭＣＮ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ｃｋｉｔ、ＣＤ４５またはＣＤ４９Ｆである。
いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞とＴＡＧＥ剤とが、生体外での共インキュベーションによって接触する。
いくつかの実施形態では、方法は、それを必要としている対象に投与される遺伝子改変された標的細胞をもたらす。
いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞とＴＡＧＥ剤とが、対象の組織への注射によってインサイチュで接触する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は対象に筋肉内注射、骨内注射、眼内注射、腫瘍内注射、または皮内注射によって投与される。
いくつかの実施形態では、核酸は標的細胞のゲノム内の遺伝子であり、上記遺伝子の発現は上記改変の後に変化する。
いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体である。
ある実施形態では、抗体模倣体は、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合性分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アプタマー．アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ｎａｎｏＣＬＡＭＰ、ユニボディ、バーサボディ、アプタマー、またはペプチド性分子である。
いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合性部分は、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ（ｍｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）２、またはイントラボディである。
いくつかの実施形態では、抗体は、完全抗体、または二重特異性抗体である。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドに結合される細胞外細胞膜結合分子は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＡｃｈＲ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐＣａｍ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＩＣＯＳまたはＲＳＶである。
ある実施形態では、細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質はＣＤ１１ａである。いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体はエファリズマブまたはその抗原結合性断片である。
いくつかの実施形態では、細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質はＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、抗ＣＤ２５抗体はダクリズマブである。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は４つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は６つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は７つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は８つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳを含む。ある実施形態では、ＳＶ４０ ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む。
いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、標的哺乳動物細胞の集団である。いくつかの実施形態では、方法は、集団中の遺伝子改変された標的哺乳動物細胞のレベル（数）を増大させるのに有効である。ある実施形態では、増大は、哺乳動物細胞における応答（例えば表現型）によって立証される。ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤によって改変された哺乳動物細胞の数の増大は、哺乳動物細胞の集団におけるレベルを、抗原結合性ポリペプチドがない部位特異的改変性ポリペプチドによる治療によって達成されるレベルと比較することによって判定され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤の部位特異的改変性ポリペプチドは、標的哺乳動物細胞において増強された細胞内部移行を有する。ある実施形態では、内部移行の増大は、哺乳動物細胞における応答、例えば表現型によって立証される。ある実施形態では、哺乳動物内へのＴＡＧＥ剤の内部移行の増大は、哺乳動物細胞の集団におけるＴＡＧＥ剤の内部移行を、抗原結合性ポリペプチドがない部位特異的改変性ポリペプチドによって達成される細胞内部移行と比較することによって判定され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤の部位特異的改変性ポリペプチドは、標的哺乳動物細胞において、抗原結合性ポリペプチドがない部位特異的改変性ポリペプチドによって達成される核内部移行に比べて増強された核内部移行を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは核酸依存性ヌクレアーゼであり、ＴＡＧＥ剤は、標的哺乳動物細胞の核酸配列の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイド核酸をさらに含み、ガイド核酸と核酸依存性ヌクレアーゼとが核タンパク質を形成している。
ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはＲＮＡ依存性ヌクレアーゼであり、ＴＡＧＥ剤は、標的哺乳動物細胞の核酸配列の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、ガイドＲＮＡとＲＮＡ依存性ヌクレアーゼとがリボ核タンパク質を形成している。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、またはｃｒ：ｔｒＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼはクラス２Ｃａｓポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、クラス２ＣａｓポリペプチドはＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣａｓポリペプチドはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、配列番号１１９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１１９との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはアミノ酸置換Ｃ８０Ａを含む（例えば配列番号１）。別の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、クラス２ＣａｓポリペプチドはＶ型Ｃａｓポリペプチドである。ある実施形態では、Ｖ型ＣａｓポリペプチドはＣａｓ１２である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ（例えば、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃａｓ１２ａ、配列番号１２０）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、配列番号１２０との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書においてＴＡＧＥ剤に有用なＣａｓ１２ａ変異体の例としては、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｕｌｔｒａ（例えば、ＩＤＴカタログ番号１０００１２７２）、またはこれをもって参照により援用されるＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７．３（２０１９）：２７６－２８２の中で記載されるＣａｓ１２ａが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドまたはそれに結合した相補的結合性部分に結合する結合体化部分をさらに含む。ある実施形態では、結合体化部分はタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＨａｌｏ－Ｔａｇである。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとがリンカーを介して結合体化している。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能リンカーである。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、エンドソーム脱出剤をさらに含む。ある実施形態では、エンドソーム脱出剤はＴＤＰまたはＴＤＰ－ＫＤＥＬである。
抗体、抗原結合剤または抗体様分子と複合体化して標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤を形成した本明細書に記載のヌクレアーゼ抗体結合剤の模式図である。図１中の「ヌクレアーゼ抗体結合剤」という用語は、ヌクレアーゼを含む部位特異的改変性ポリペプチドを指す。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）を単独で、または抗ＣＤ３抗体と複合体化したＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ：α－ＣＤ３」）を、またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）を評価した、試験管内ＤＮＡ切断アッセイの結果を、Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳの活性に対する相対的な活性のプロットによってグラフに表したものである。 刺激ヒトＴ細胞内へのヌクレオフェクションの後でのＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）の編集活性を評価した生体外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質をＴ細胞にヌクレオフェクションして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。編集活性をＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳの活性に対して相対的にプロットする。 抗ＣＤ３抗体に対するＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）の結合性を評価した試験管内結合アッセイの結果をグラフに表したものである。Ｃａｓ９－ｐＡ単独及び抗ＣＤ３抗体単独での結果も示す。 ＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ１９ Ｂ細胞（Ｂ）における抗ＣＤ３（１８ｎＭ）または抗ＣＤ２２（１００ｎＭ）抗体のＰＢＭＣ内部移行の速度を測定したＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）と複合体化してＴＡＧＥ剤を形成した抗体（ｈｕＩｇＧ１，ＣＤ２２）の、結合及び内部移行試験からの結果を示す。各１０ｎＭの示されたタンパク質をＰＢＭＣに加え、３０分間染色した、ＦＡＣＳベース細胞結合アッセイの結果をグラフに表したものである。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）と複合体化してＴＡＧＥ剤を形成した抗体（ｈｕＩｇＧ１，ＣＤ２２）の、結合及び内部移行試験からの結果を示す。各１０ｎＭの示されたタンパク質をＰＢＭＣに加え、示された温度及び時間で染色した、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。抗Ａ４８８抗体による失活あり及びなしでの各条件からの試料をＦＡＣＳ分析によって評価した。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）と複合体化してＴＡＧＥ剤を形成した抗体（ｈｕＩｇＧ１，ＣＤ２２）の、結合及び内部移行試験からの結果を示す。ＰＢＭＣのプールにおけるＴ細胞による内部移行をＢ細胞と対比してさらに示す。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）、抗ＣＤ３抗体、または抗ＣＤ３抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡ（「Ｃａｓ９ｐＡ：ＣＤ３」）を含むＴＡＧＥ剤の内部移行をＴ細胞（Ａ及びＢ）または骨髄細胞（Ｃ）において評価した、様々な失活方法（ヘパリン洗浄、酸洗浄、抗Ａ４８８抗体、失活なし）を利用したＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。図７Ａは、Ａ４８８で標識付けされた抗ＣＤ３抗体による、またはＡ４８８で標識付けされたガイドＲＮＡを有するＣａｓ９－ｐＡ：抗ＣＤ３ ＲＮＰによる内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）、抗ＣＤ３抗体、または抗ＣＤ３抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡ（「Ｃａｓ９ｐＡ：ＣＤ３」）を含むＴＡＧＥ剤の内部移行をＴ細胞（Ａ及びＢ）または骨髄細胞（Ｃ）において評価した、様々な失活方法（ヘパリン洗浄、酸洗浄、抗Ａ４８８抗体、失活なし）を利用したＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。図７Ｂは、ＡＴＴＯ５５０で標識付けされたガイドＲＮＡを有するＣａｓ９－ｐＡ：抗ＣＤ３ ＲＮＰまたはＣａｓ９－ｐＡを使用した、Ｔ細胞における内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）、抗ＣＤ３抗体、または抗ＣＤ３抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡ（「Ｃａｓ９ｐＡ：ＣＤ３」）を含むＴＡＧＥ剤の内部移行をＴ細胞（Ａ及びＢ）または骨髄細胞（Ｃ）において評価した、様々な失活方法（ヘパリン洗浄、酸洗浄、抗Ａ４８８抗体、失活なし）を利用したＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。図７Ｃは、ＡＴＴＯ５５０で標識付けされたガイドＲＮＡを有するＣａｓ９－ｐＡ：抗ＣＤ３ ＲＮＰまたはＣａｓ９－ｐＡを使用した、骨髄細胞における内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）、抗ＣＤ３抗体、または抗ＣＤ３抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡ（「Ｃａｓ９ｐＡ：ＣＤ３」）を含むＴＡＧＥ剤の内部移行をＴ細胞（Ａ及びＢ）または骨髄細胞（Ｃ）において評価した、様々な失活方法（ヘパリン洗浄、酸洗浄、抗Ａ４８８抗体、失活なし）を利用したＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。図７Ｄは、各失活方法の毒性作用を評価した生死判定ＦＡＣＳベースアッセイの結果をグラフに表したものである。 ＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（Ｅｃ１）（「Ｃａｓ９－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）」）（Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）とも称される）またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）によるＤＮＡ切断を評価した試験管内ＤＮＡ切断アッセイの結果を、Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ活性に対する相対的な活性のプロットによってグラフに表したものである。 刺激ヒトＴ細胞内へのヌクレオフェクションの後でのＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（Ｃａｓ９－ｐＡ）またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）の編集を評価した生体外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質をＴ細胞にヌクレオフェクションして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。編集活性をＣ８０Ａ活性に対して相対的にプロットする。 上皮細胞株ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３の細胞表面に対するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）（「Ｄａｒｐｉｎ」）またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）の結合性を評価したＦＡＣＳベース結合アッセイの結果をグラフに表したものである。ＢＴ４７４細胞に対する１０、２５、５０、１００または３００ｎＭのＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳまたはＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）のＦＡＣＳベース結合アッセイの結果をグラフに表したものである。 上皮細胞株ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３の細胞表面に対するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）（「Ｄａｒｐｉｎ」）またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）の結合性を評価したＦＡＣＳベース結合アッセイの結果をグラフに表したものである。ＳＫＢＲ３細胞に対する１０、２５、５０、１００または３００ｎＭのＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳまたはＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）のＦＡＣＳベース結合アッセイの結果をグラフに表したものである。 上皮細胞株ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３の細胞表面に対するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）（「Ｄａｒｐｉｎ」）またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）の結合性を評価したＦＡＣＳベース結合アッセイの結果をグラフに表したものである。ＳＫＢＲ３細胞またはＢＴ４７４細胞に対するＥｐＣＡＭ抗体による結合の結果をグラフに表したものであり、両細胞株にＥｐＣＡＭが発現することを実証している。 上皮細胞株ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３の細胞表面に対するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）（「Ｄａｒｐｉｎ」）またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）の結合性を評価したＦＡＣＳベース結合アッセイの結果をグラフに表したものである。ＢＴ４７４細胞またはＳＫＢＲ３細胞に対する２５、１００または３００ｎＭのＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳまたはＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）のＦＡＣＳベース結合アッセイの結果をグラフに表したものである。 図１０Ｄ－１の説明を参照。 図１０Ｄ－１の説明を参照。 ３７℃または４℃で、示された時間（６０分間または３０分間）にわたって１００ｎＭまたは３００ｎＭのＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）をＢＴ４７４細胞またはＳＫＢＲ３細胞と共にインキュベートした後、事前の失活を伴ってまたは伴わずにＦＡＣＳで検査した、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。 図１１－１の説明を参照。 ＢＴ４７４細胞またはＳＫＢＲ３細胞におけるｈｕＣＤ４７ガイドＲＮＡを有するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）ＲＮＰとの共インキュベーションによって、示された時間（４日間または７日間）の後に成し遂げられた編集を評価した、生体外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。ＲＮＰに曝露されていない対照細胞から得られた結果も示す。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。フローサイトメトリーによって決定された編集された細胞のパーセントを各グラフに示す。 図１２－１の説明を参照。 ｈｕＣＤ４７ガイドＲＮＡを有するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）ＲＮＰのヒトＴ細胞におけるヌクレオフェクションに続いて示された時間（４日間または７日間）の後にフローサイトメトリーによって評価したときの生体外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２ ＴＡＧＥ剤（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ＝ｍＣＤ２２」）の分析をグラフに表したものである。Ａは、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２抗体ＴＡＧＥ剤のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ２００ １０／３００Ｉｎｃｒｅａｓｅサイズ分離カラム）からのクロマトグラムをグラフに表したものであり、８．５～１１ｍＬにあるピークは抗体－Ｃａｓ９結合体化材料を表す。Ｂは、Ｃａｓ９－抗体結合体化の比率を同定するために使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像である。サイズ排除分析のピーク１からピーク３までの材料が入っているレーンに表記する。「Ａｂ－２ｘＣａｓ９」は、抗体１つあたり２つのＣａｓ９分子を含んだ結合体を指す。 Ａ４８８ガイドＲＮＡを有する２０ｎＭの示されたＴＡＧＥ剤ＲＮＰ（Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２抗体（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：ｍＣＤ２２」）、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ：ＩｇＧ１（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ－ＩｇＧ１」）、またはＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」））を３７℃または４℃で示された時間（１５分間または６０分間）にわたって全脾細胞と共にインキュベートした、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。失活を伴う及び伴わない各条件からの試料を、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に基づいて選別されるＦＡＣＳ分析によって評価した。 Ａ４８８ガイドＲＮＡを有する２０ｎＭの示されたＴＡＧＥ剤ＲＮＰ（Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２抗体（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：ｍＣＤ２２」）、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ：ＩｇＧ１（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ－ＩｇＧ１」）、またはＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」））を３７℃または４℃で示された時間（１５分間または６０分間）にわたって腫瘍浸潤リンパ球と共にインキュベートした、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイの結果をグラフに表したものである。失活を伴う及び伴わない各条件からの試料を、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に基づいて選別されるＦＡＣＳ分析によって評価した。 Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）単独によるＤＮＡ切断、または抗ＣＤ２２抗体（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：ｍＣＤ２２」）、抗ＣＴＬＡ４抗体（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：ｍＣＴＬＡ４」）、ＩｇＧ１（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：ＩｇＧ１」）と複合体化したＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏを含むＴＡＧＥ剤によるＤＮＡ切断を評価する試験管内ＤＮＡ切断アッセイ（Ａ）及びヒトＴ細胞における生体外ヌクレオフェクション編集アッセイ（Ｂ）の結果を、Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ活性に対して相対的な活性のプロットによってグラフに表したものである。生体外編集を評価するために、ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質をＴ細胞にヌクレオフェクションして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。加えて、Ｂは、Ｈａｌｏ－３０ａ．ａ．－Ｃａｓ９、Ｈａｌｏ－３ａ．ａ．－Ｃａｓ９、及びｈＩｇＧ１：Ｈａｌｏ－３ａ．ａ．－Ｃａｓ９による編集を示し、３０ａ．ａ．及び３ａ．ａ．は構築物中のペプチドリンカーのアミノ酸（「ａ．ａ．」）の長さを指す。 示されたＴＡＧＥ剤ＲＮＰ（Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ単独（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）、または抗ＣＤ２２抗体（「Ｈａｌｏ－ｍＣＤ２２」）、抗ＣＴＬＡ４抗体（「Ｈａｌｏ－ｍＣＴＬＡ４」）、ＭＨＣＩＩ－Ｎｂ（「ＭＨＣＩＩ－Ｎｂ」）もしくはＩｇＧ１（「Ｈａｌｏ－ＩｇＧ１」）と複合体化したＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏを、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍から単離された混合細胞集団の中への内部移行について評価した、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイからの結果をグラフに表したものである。選別されたＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、非Ｔ／Ｂ細胞、及びＣＤ４５－ ＰＤＰＮ＋細胞についての結果を示す。 抗ＣＤ２２抗体（図１８Ａ；マウス脾細胞との結合）、抗ＦＡＰ抗体（図１８Ｂ；ヒト線維芽細胞との結合）または抗ＣＴＬＡ－４抗体（図１８Ｃ；Ｔ細胞との結合）に結合体化されたＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）を含むＴＡＧＥ剤を使用した試験管内結合アッセイからの結果をグラフに表したものである。２０ｎＭの、Ａ４８８標識ガイドを有するＲＮＰ、あるいはＡ４８８標識抗体を、全マウス脾細胞と３０分間氷上でインキュベートした。 抗ＣＤ２２抗体（図１８Ａ；マウス脾細胞との結合）、抗ＦＡＰ抗体（図１８Ｂ；ヒト線維芽細胞との結合）または抗ＣＴＬＡ－４抗体（図１８Ｃ；Ｔ細胞との結合）に結合体化されたＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）を含むＴＡＧＥ剤を使用した試験管内結合アッセイからの結果をグラフに表したものである。ヒト線維芽細胞を２０ｎＭのタンパク質と３０分間氷上でインキュベートした。抗体はＡ４８８で標識付けされ（１：１の色素：抗体）、各ＲＮＰはＡ４８８標識ガイドを含有する。 抗ＣＤ２２抗体（図１８Ａ；マウス脾細胞との結合）、抗ＦＡＰ抗体（図１８Ｂ；ヒト線維芽細胞との結合）または抗ＣＴＬＡ－４抗体（図１８Ｃ；Ｔ細胞との結合）に結合体化されたＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）を含むＴＡＧＥ剤を使用した試験管内結合アッセイからの結果をグラフに表したものである。刺激マウスＴ細胞を２０または１００ｎＭのタンパク質と１５分間、３７℃でインキュベートした。抗体はＡ４８８で標識付けされ（１：１の色素：抗体）、各ＲＮＰはＡ４８８標識ガイドを含有する。 ヒト皮膚線維芽細胞と共インキュベートされた、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏに結合体化されたヒト抗ＦＡＰ抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した、細胞外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。ヒト皮膚線維芽細胞を一晩播種した。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。３７．５ｕＭのＲＮＰを２．５％のＦＢＳの中で細胞と共に１時間インキュベートした。その後、完全培地を添加し、ＲＮＰを３００ｎＭに希釈した。インキュベート後６日目に試料をＣＤ４７発現について分析した。 制御性Ｔ細胞（図１８Ｅ）または全刺激Ｔ細胞（図１８Ｆ）と共インキュベートされた、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ－２ｘＮＬＳに結合体化されたマウス抗ＣＴＬＡ－４抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した、生体外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。遺伝子編集は、ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光レポーターシステムを使用して測定された。誘導Ｔｒｅｇまたは全脾細胞を３日間刺激した。２５０，０００個の細胞を７５ピコモルのＲＮＰ（３．７５ｕＭ）と共に、血清２．５％で１時間インキュベートした。１時間後、完全培地を添加してＲＮＰを３００ｎＭに希釈した。インキュベート後６日目に細胞をＦＡＣＳによって分析してｔｄＴｏｍａｔｏ信号を測定した。 制御性Ｔ細胞（図１８Ｅ）または全刺激Ｔ細胞（図１８Ｆ）と共インキュベートされた、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ－２ｘＮＬＳに結合体化されたマウス抗ＣＴＬＡ－４抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した、生体外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。遺伝子編集は、ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光レポーターシステムを使用して測定された。誘導Ｔｒｅｇまたは全脾細胞を３日間刺激した。２５０，０００個の細胞を７５ピコモルのＲＮＰ（３．７５ｕＭ）と共に、血清２．５％で１時間インキュベートした。１時間後、完全培地を添加してＲＮＰを３００ｎＭに希釈した。インキュベート後６日目に細胞をＦＡＣＳによって分析してｔｄＴｏｍａｔｏ信号を測定した。 Ｃａｓ９に結合体化されたヒト抗ＦＡＰ抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した生体外での編集及び結合アッセイの結果をグラフに表したものである。抗体を、ｓｐｙｔａｇ（ＳＴ）部分を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ（「ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９」）に結合体化させた。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。図１９Ａは、ヒト皮膚線維芽細胞におけるＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９編集アッセイの結果をグラフに表したものである（「Ｃ８０Ａ」はＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳを指し、「ＦＡＰ－ＬＬ」はＦＡＰ－ＳＴ－長鎖リンカーを指し、「ＦＡＰ－ＳＬ」はＦＡＰ－ＳＴ－短鎖リンカーを指す）。 Ｃａｓ９に結合体化されたヒト抗ＦＡＰ抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した生体外での編集及び結合アッセイの結果をグラフに表したものである。抗体を、ｓｐｙｔａｇ（ＳＴ）部分を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ（「ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９」）に結合体化させた。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。図１９Ｂ及び図１９Ｃは、ヒト皮膚線維芽細胞における３７５０ｎＭ（図１９Ｂ）または５８５０ｎｍ（図１９Ｃ）でのＦＡＰ＝（４ｘ－ＳＣ－２ｘ）２編集アッセイの結果をグラフに表したものである（「Ｃ８００Ａ＋ＦＡＰ」は、非結合体化抗体の影響を除外すべく編集中にトランスで添加されたＦＡＰ－ＳＴ抗体を指し、「２ｘ」は２ｘＮＬＳを指し、「４ｘ」は４ｘＮＬＳを指す）。 Ｃａｓ９に結合体化されたヒト抗ＦＡＰ抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した生体外での編集及び結合アッセイの結果をグラフに表したものである。抗体を、ｓｐｙｔａｇ（ＳＴ）部分を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ（「ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９」）に結合体化させた。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。図１９Ｂ及び図１９Ｃは、ヒト皮膚線維芽細胞における３７５０ｎＭ（図１９Ｂ）または５８５０ｎｍ（図１９Ｃ）でのＦＡＰ＝（４ｘ－ＳＣ－２ｘ）２編集アッセイの結果をグラフに表したものである（「Ｃ８００Ａ＋ＦＡＰ」は、非結合体化抗体の影響を除外すべく編集中にトランスで添加されたＦＡＰ－ＳＴ抗体を指し、「２ｘ」は２ｘＮＬＳを指し、「４ｘ」は４ｘＮＬＳを指す）。 Ｃａｓ９に結合体化されたヒト抗ＦＡＰ抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した生体外での編集及び結合アッセイの結果をグラフに表したものである。抗体を、ｓｐｙｔａｇ（ＳＴ）部分を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ（「ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９」）に結合体化させた。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。図１９Ｄは、ヒト皮膚線維芽細胞における編集をｈＣＴＬＡ４＝Ｃａｓ９（「Ｉｐｉ」）とＦＡＰ＝Ｃａｓ９とで比較した結果をグラフに表したものである（「ＲＮＰなし」は、Ｃａｓ９を添加しなかった条件を意味し、「Ｃ８０Ａ：ＢＦＰ」は、Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳを非標的指向性ガイドと共に添加したことを意味し、他の全ての条件はｓｇＣＤ４７を標的指向性ｇＲＮＡとして使用し、ＦＡＰ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２は、Ｃａｓ９をＦＡＰ＋線維芽細胞に指向するための陽性対照を指し、Ｉｐｉ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２は、Ａｂ－Ｃａｓ９のための陰性対照を指し、線維芽細胞には結合しないはずである）。 Ｃａｓ９に結合体化されたヒト抗ＦＡＰ抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した生体外での編集及び結合アッセイの結果をグラフに表したものである。抗体を、ｓｐｙｔａｇ（ＳＴ）部分を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ（「ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９」）に結合体化させた。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。図１９Ｅは、示された分子を使用した線維芽細胞結合アッセイの結果を示す。 Ｃａｓ９に結合体化されたヒト抗ＦＡＰ抗体を含むＴＡＧＥ剤を使用した生体外での編集及び結合アッセイの結果をグラフに表したものである。抗体を、ｓｐｙｔａｇ（ＳＴ）部分を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ（「ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９」）に結合体化させた。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付けて、リボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。図１９Ｆは、ヒト皮膚線維芽細胞に対して過剰なＦｃ＝ＳＣ－Ｃａｓ９及び示された分子を使用した競合アッセイの結果を示す。「Ｐａｌｉ」は、陰性対照として使用された、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗体であるパリビズマブを指し、「Ｉｐｉ」は、陰性対照である、ＣＴＬＡ－４に対する抗体であるイピリムマブを指し、「Ｆｃ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２」は、抗体のＦｃ部分と２つのＣａｓ９とを繋ぎ合わせたものについての陰性対照を指し、「ＦＡＰ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２」は、陽性対照である完全長抗体を指し、「ＦＡＰ－Ｆ（ａｂ’）２＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２」は、陽性対照である、ＦｃドメインがないＦ（ａｂ’）２のみを指し、「ＦＡＰ－Ｆａｂ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２」は、陽性対照である、Ｆｃドメインがなく単一の結合性ドメインであるＦａｂのみを指し、「ＦＡＰ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２＋過剰ＦＡＰ」は、ＦＡＰ＝Ｃａｓ９結合体の結合を遮断するために過剰なＦＡＰ抗体が加えられたさらなる対照を指す（ＦＡＰ媒介特異性を実証する）。 Ｔ細胞に結合する抗体－Ｃａｓ９結合体（「Ａｂ＝Ｃａｓ９」）を含むＴＡＧＥ剤に対する試験管内スクリーニングの結果をグラフに表したものである。各抗体を、ＳｐｙＴａｇ（「ＳＴ）を介してＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）に結合体化させた。図２０Ａは、示されたＲＮＰによるＣＤ４＋Ｔ細胞結合のレベルをグラフに表したものである。全ＰＢＭＣを２日間活性化させ、その後、７または７０ｎＭのＡｂ＝Ｃａｓ９結合体で染色した。Ａ５５０信号はＡ５５０標識ガイドからのものである。Ｐａｌｉ＝パリビズマブ、陰性対照。多重比較によるＡＮＯＶＡを行って各抗体をパリビズマブ（「Ｐａｌｉ」）と比較し、抗体を、Ｐａｌｉよりも有意に大きい染色を有していた場合に次の段階に移した。 Ｔ細胞に結合する抗体－Ｃａｓ９結合体（「Ａｂ＝Ｃａｓ９」）を含むＴＡＧＥ剤に対する試験管内スクリーニングの結果をグラフに表したものである。各抗体を、ＳｐｙＴａｇ（「ＳＴ）を介してＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）に結合体化させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞において、示された抗体＝Ｃａｓ９ ＴＡＧＥ剤によるＴ細胞結合が非結合体化（「冷たい」）抗体によって遮断されるか否かを評価した、遮断アッセイの結果をグラフに表したものである。ＴＡＧＥ剤はＡ５５０標識ガイドと複合体化し、これがＹ軸上に表記されるＡ５５０信号を生成した。 Ｔ細胞に結合する抗体－Ｃａｓ９結合体（「Ａｂ＝Ｃａｓ９」）を含むＴＡＧＥ剤に対する試験管内スクリーニングの結果をグラフに表したものである。各抗体を、ＳｐｙＴａｇ（「ＳＴ）を介してＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）に結合体化させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞において、示された抗体＝Ｃａｓ９ ＴＡＧＥ剤によるＴ細胞結合が非結合体化（「冷たい」）抗体によって遮断されるか否かを評価した、遮断アッセイの結果をグラフに表したものである。ＴＡＧＥ剤はＡ５５０標識ガイドと複合体化し、これがＹ軸上に表記されるＡ５５０信号を生成した。 Ｔ細胞に結合する抗体－Ｃａｓ９結合体（「Ａｂ＝Ｃａｓ９」）を含むＴＡＧＥ剤に対する試験管内スクリーニングの結果をグラフに表したものである。各抗体を、ＳｐｙＴａｇ（「ＳＴ）を介してＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）に結合体化させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞において非結合体化抗体によって遮断されるＡｂ＝Ｃａｓ９結合のパーセントをグラフに表したものである。 Ｔ細胞に結合する抗体－Ｃａｓ９結合体（「Ａｂ＝Ｃａｓ９」）を含むＴＡＧＥ剤に対する試験管内スクリーニングの結果をグラフに表したものである。各抗体を、ＳｐｙＴａｇ（「ＳＴ）を介してＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）に結合体化させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞において非結合体化抗体によって遮断されるＡｂ＝Ｃａｓ９結合のパーセントをグラフに表したものである。 実施例１９で同定された、Ｃａｓ９に結合体化された抗体（Ａｂ＝Ｃａｓ９）を含むＴＡＧＥ剤を使用した、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）における生体外編集アッセイの結果をグラフに表したものである。抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ２５ａ抗体（実施例２１に記載のＴ細胞スクリーニングで同定されたもの）をＣａｓ９に結合体化させた（ＣＤ１１ａ＝Ｃａｓ９、及びＣＤ２５ａ＝Ｃａｓ９）。各抗体を、ＳｐｙＴａｇ（「ＳＴ）を介してＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）またはＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－４ｘＮＬＳ（「ＡＣ２６」）に結合体化させて抗体ベースＴＡＧＥ剤を形成した。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡと、各ＴＡＧＥ剤とを結び付け、ＴＡＧＥ剤をＴ細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。「２段階」は、３７５０ｎＭのＲＮＰを１時間にわたって添加し、その後３００ｎＭになるまで希釈し、読み取り時までインキュベートしたことを表す。抗体＝ＡＣ２６（またはＡＣ２８）は、完全長抗体を含む試験品を指し、Ｐａｌｉ＝ＡＣ２６またはＰａｌｉ＝ＡＣ２８を陰性対照として使用した、というのも、それはＴ細胞に結合しないからである。Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆｃドメインがない抗体断片を指す。 図２１Ａの説明を参照。 Ｔ細胞または線維芽細胞の生体外編集を検出するための２つの異なる方法を比較したアッセイの結果をグラフに表したものである：（１）フローサイトメトリー（例えば、表現型読み取り情報、すなわちＣＤ４７またはＣＤ４４の細胞表面発現の消失を検出すること）によって得られた編集測定結果、または（２）Ｃ４７もしくはＣＤ４４をコードする遺伝子の編集を検出する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって得られた編集測定結果。各手法で同じ試料を分析し、測定結果を比較した。０～５０％の編集の試料について、フローサイトメトリー（ｙ軸）による編集測定結果のＮＧＳ（ｘ軸）に対する比較をグラフに表したものである。 Ｔ細胞または線維芽細胞の生体外編集を検出するための２つの異なる方法を比較したアッセイの結果をグラフに表したものである：（１）フローサイトメトリー（例えば、表現型読み取り情報、すなわちＣＤ４７またはＣＤ４４の細胞表面発現の消失を検出すること）によって得られた編集測定結果、または（２）Ｃ４７もしくはＣＤ４４をコードする遺伝子の編集を検出する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって得られた編集測定結果。各手法で同じ試料を分析し、測定結果を比較した。０～２％の編集の試料について、フローサイトメトリー（ｙ軸）による編集測定結果のＮＧＳ（ｘ軸）に対する比較をグラフに表したものである（図２２Ａと同じ試料であるがｘ軸の目盛りが異なる）。
発明の詳細な説明
本明細書では、特定の細胞種の中で核酸を生体内及び生体外で編集することができる標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤に関する組成物及び方法を提供する。さらには、生体内及び生体外での部位特異的改変性ポリペプチドの細胞内での細胞内部移行を促進するための組成物及び方法を本明細書に提供する。ＴＡＧＥ剤のモジュール方式のプログラム可能な設計は、様々な所望の細胞種の柔軟な標的指向を可能にする迅速な指向先変更及び多機能性を可能にする。さらに、特定の標的細胞において特定の核酸を編集することによって、ＴＡＧＥ剤は二重特異性を有し、ＤＮＡに基づく送達手法と比較してより少ないオフターゲット作用を有する。これを実現するために、ＴＡＧＥ剤は、細胞結合及び／または細胞内部移行を促進する１つ以上の抗原結合性ポリペプチドを含む。これによって、本発明の組成物及び方法のＴＡＧＥ剤は、標的細胞種の中への部位特異的改変性ポリペプチド（例えば遺伝子編集ポリペプチド）、例えばＣａｓ９の送達及び内部移行を促進する。さらに、抗原結合性ポリペプチドは、ＴＡＧＥ剤の受容体媒介進入を可能にするだけでなく、場合によっては抗原結合性ポリペプチドは、（例えば細胞内シグナル伝達経路を変化させることによって）細胞の生態を媒介することも行う。本明細書に記載のＴＡＧＥ剤は全身送達に特に適している。
かくして、抗原結合性ポリペプチド、及び核酸配列を細胞内で認識する部位特異的改変性ポリペプチドを含み、細胞内に部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行できるように抗原結合性ポリペプチドと部位特異的改変性ポリペプチドとが安定して結び付いている、ＴＡＧＥ剤に関する方法及び組成物が本明細書に提供される。
一態様において、本明細書では、細胞外細胞膜結合分子（例えば細胞表面分子）に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び標的細胞内で核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチドを含む標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤を提供する。抗原結合性ポリペプチドと部位特異的改変性ポリペプチドは、細胞外細胞膜結合分子を提示している標的細胞の中に部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行できるように安定して結び付いている。
さらには、生体外または生体内で細胞のゲノムを改変する方法、及びＴＡＧＥ剤によって部位特異的改変性ポリペプチドを対象に送達する方法を本明細書に提供する。ＴＡＧＥ剤による標的指向生体外編集は、様々な細胞療法に利用するための細胞（例えば造血幹細胞）の遺伝子改変を可能にする。さらに、対象へのＴＡＧＥ剤の投与は、生体内での所望の細胞種の標的指向編集を可能にする。
Ｉ．定義
「標的指向活性遺伝子編集」または「ＴＡＧＥ」剤という用語は、細胞膜上に提示された細胞外標的分子（例えば細胞外タンパク質またはグリカン、例えば細胞表面上の細胞外タンパク質）に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド（例えば抗体またはその抗原結合性部分）、及び核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチド（例えば、限定されないが、エンドヌクレアーゼ）を含む、分子の複合体を指す。ＴＡＧＥ剤の抗原結合性ポリペプチドは、標的細胞、すなわち抗原結合性ポリペプチドに結合される細胞外分子が発現している細胞によって少なくとも部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行するように部位特異的改変性ポリペプチドと結び付いている。ＴＡＧＥ剤の例は、部位特異的改変性ポリペプチドが核酸依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えばＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ）である活性ＣＲＩＳＰＲ指向（ＴＡＧＥ）剤、例えばＣａｓ９またはＣａｓ１２である。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、少なくとも１つのＮＬＳを含む。注目すべきことに、ＴＡＧＥ剤は、遺伝子を含むがこれに限定されない細胞内の任意の核酸を標的とすることができる。
本明細書中で使用される「抗原結合性ポリペプチド」という用語は、特定の標的抗原、例えば細胞外細胞膜結合タンパク質（例えば細胞表面タンパク質）に結合するタンパク質を指す。抗原結合性ポリペプチドの例としては、抗体、抗体の抗原結合性断片、及び抗体模倣体が挙げられる。ある実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは抗原結合性ペプチドである。
本明細書中で使用する場合、「部位特異的改変性ポリペプチド」は、改変性ポリペプチド自体または関連分子（例えばＲＮＡ）による特定の配列（複数可）の認識によってポリヌクレオチド鎖の特定の核酸配列または類似する配列の組に指向され、ポリペプチドがポリヌクレオチド鎖を改変できる、タンパク質を指す。
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、本明細書中で交換可能に使用されるが、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。「ポリペプチド」という用語は、天然または人工タンパク質、タンパク質断片、及びタンパク質配列のポリペプチド類縁体を包含する。
本明細書中で使用される「結合体化部分」という用語は、もう２つまたはそれよりも多い分子、例えば、抗原結合性タンパク質と部位特異的改変性ポリペプチドとを結合体化させることができる部分を指す。「結合体化」という用語は、本明細書中で使用する場合、分子（例えば抗体）と第２分子（例えば部位特異的改変性ポリペプチド、治療剤、薬物または標的指向性分子）との間で形成される物理的または化学的な複合体化を指す。化学的複合体化は、具体的には、第１分子（例えば抗体）の官能基と第２分子（例えば部位特異的改変性ポリペプチド、治療剤または薬物）の官能基との間で形成された結合または化学部分を構成する。そのような結合としては、限定はしないが共有結合性リンケージ及び非共有結合が挙げられる一方、そのような化学部分としては、限定はしないがエステル、カーボネート、イミンホスフェートエステル、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチドリンケージ及びオリゴヌクレオチドリンケージが挙げられる。一実施形態では、結合体化は、物理的な結び付き、または非共有結合的な複合体化によって成し遂げられる。
本明細書中で使用する場合、「標的細胞」という用語は、（遺伝子改変細胞を生体内または生体外でもたらすために）核酸の部位特異的改変が望まれる核酸配列を含む細胞または細胞の集団、例えば哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）を指す。ある場合には、標的細胞は、その細胞膜上に、ＴＡＧＥ剤の抗原結合性ポリペプチドによって特異的に結合される細胞外分子（例えば細胞外タンパク質、例えば、受容体もしくはリガンドまたはグリカン）を提示する。
本明細書中で使用する場合、「遺伝子改変細胞」という用語は、部位特異的改変性ポリペプチドによってＤＮＡ配列が意図的に改変された細胞またはその祖先を指す。
本明細書中で使用する場合、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは他のＤＮＡもしくはＲＮＡを含めたヌクレオチドを含む分子を指す。一実施形態では、核酸は、細胞内に存在し、細胞分裂によって細胞の子孫へ移される。場合によっては、核酸は、その染色体の中の、細胞のゲノムの中に見つかる遺伝子（例えば内在性遺伝子）である。他の例では、核酸は、細胞内にトランスフェクトされた哺乳動物発現ベクターである。細胞のゲノムの中に例えばトランスフェクション法を用いて組み込まれたＤＮＡはまた、たとえ組み込まれたＤＮＡが子孫細胞へ移されることを意図していなくとも、本明細書中で使用される「核酸」の範疇に同じく入るとみなされる。
本明細書中で使用する場合、「エンドソーム脱出剤」または「エンドソーム遊離剤」という用語は、分子（例えばポリペプチド、例えば部位特異的改変性ポリペプチド）に結合体化されたとき細胞内のエンドソームからの分子の遊離を促進することができる薬剤（例えばペプチド）を指す。エンドソーム内にとどまるポリペプチドは、最終的には、細胞質中に放出されるか細胞内の所望の目的地へ輸送されるのではなく、分解または再利用の標的となり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はエンドソーム脱出剤を含む。
本明細書中で使用する場合、「安定して結び付いている」という用語は、ＴＡＧＥ剤の文脈で使用される場合、細胞内で核酸編集が起こり得るような、標的細胞内に複合体が内部移行できるような方法で複合体化する、抗原結合性ポリペプチド及び部位特異的改変性ポリペプチドの能力を意味する。ＴＡＧＥ剤が安定して結び付いているか否かを判定する方法の例としては、例えば標準的な遺伝子編集システムを用いて遺伝子編集が起こったか否かを判定することによって、ＴＡＧＥ剤に細胞を曝露した後に複合体の結び付きを判定する、試験管内アッセイが挙げられる。そのようなアッセイの例は当技術分野で既知であり、例えば、タンパク質複合体及びＰＣＲ増幅を判定するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、サイズ排除クロマトグラフィー及び電気泳動移動度シフトアッセイ、直接配列決定（例えば次世代シーケンシングまたはサンガーシーケンシング）、編集を確認するためのヌクレアーゼ（例えば）による遺伝子座の酵素的切断；ならびに特定遺伝子を編集することの下流での影響、例えば、ウェスタンブロットもしくはフローサイトメトリーによって測定されるタンパク質の消失、または機能アッセイによって測定される機能性タンパク質の生成を測定する間接的な表現型アッセイがある。
本明細書中で使用する場合、「核酸を改変する」という用語は、部位特異的改変性ポリペプチドの標的となる核酸に対する任意の改変を意味する。そのような改変の例としては、アミノ酸配列に対する任意の変更が挙げられ、これには、基準配列（例えば野生型または天然配列）と比較したときの核酸配列におけるアミノ酸残基の任意の挿入、欠失または置換が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアミノ酸変更は、例えば、遺伝子の発現の変化（例えば発現の増強または減少）、または核酸配列の置換えをもたらすことがある。核酸の改変には、さらには、二本鎖切断、一本鎖切断、または標的部位に対する本明細書に開示される任意のＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼの結合が含まれ得る。ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼの結合は、核酸の発現を阻害することがあり、または標的部位を含む核酸に機能可能に連結された任意の核酸の発現を増強することがある。
「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）という用語は、結合体化分子、詳しくは１つ以上の部位特異的改変性ポリペプチドの細胞取込みを容易にすることができる概して長さ約５～６０アミノ酸残基（例えば、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、または５５～６０アミノ酸残基）のペプチドを指す。ＣＰＰはまた、ある実施形態では、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜（例えば核膜）、小胞膜または細胞壁の１つ以上を横切って／通って分子状結合体が移動または横断するのを容易にすることができることを特徴とし得る。本明細書においてＣＰＰは、ある実施形態ではカチオン性、両親媒性または疎水性であり得る。本明細書において有用なＣＰＰの例、及びＣＰＰについてのさらなる説明は、Ｂｏｒｒｅｌｌｉ，Ａｎｔｏｎｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３．２（２０１８）：２９５、Ｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｆｒａｎｃｅｓｃａ．Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏｄａｙ １７．１５－１６（２０１２）：８５０－８６０に開示されており、参照によりそれらを本明細書に援用する。さらに、実験的に立証されたＣＰＰのデータベース（ＣＰＰｓｉｔｅ、Ｇａｕｔａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）が存在する。ＴＡＧＥ剤のＣＰＰは任意の既知のＣＰＰ、例えば、ＣＰＰｓｉｔｅデータベースに示されているＣＰＰであり得る。
本明細書中で使用する場合、「核局在化シグナル」または「ＮＬＳ」という用語は、分子（例えばポリペプチド、例えば部位特異的改変性ポリペプチド）に結合体化された場合に核輸送による細胞核内への分子の移入を促進することができるペプチドを指す。ＮＬＳは、例えば、それと結び付いているタンパク質を細胞の細胞質から核膜バリアを横切って輸送するのを促すことができる。ＮＬＳは、特定ペプチドの核局在化配列だけでなく、核膜バリアを横切る細胞質ポリペプチドの移行を促すことができるその誘導体も包含することを意図している。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、２～６、３～７、４～８、５～９、６～１０、７～１０、８～１０個のＮＬＳ）を本明細書のＴＡＧＥ剤のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端との両方に結合させてもよい。
本明細書中で使用される「ＴＡＴ関連ペプチド」という用語は、ヒト免疫不全ウイルスの転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）に由来するＣＰＰを指す。ＴＡＴのアミノ酸配列は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９）を含む。したがって、ＴＡＴ関連ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９）のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有しペプチドがなおも細胞内に内部移行することができるアミノ酸配列を含む任意のペプチドを含む。ある実施形態では、ＴＡＴ関連ペプチドは、１、２または３個のアミノ酸置換を含み、ＴＡＴ関連ペプチドが標的細胞内に内部移行することができる。
本明細書中で使用する場合、「特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する抗原を認識してそれに結合する抗原結合性ポリペプチドであって、試料中の他の分子の認識またはそれとの結合を実質的にしない、当該抗原結合性ポリペプチドを意味する。一実施形態では、抗原に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴、または本明細書中でさらに記載されているものを含めた当技術分野で知られている他の手法（例えば、フィルター結合アッセイ、蛍光偏光、等温滴定熱測定）によって決定したとき、少なくとも約１×１０－４、１×１０－５、１×１０－６Ｍ、１×１０－７Ｍ、１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１２Ｍの、またはそれを上回るＫｄで抗原に結合する。一実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴によって決定したとき抗原結合性ポリペプチドが非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で抗原に結合する場合、抗原に特異的に結合する。リガンドの文脈で使用する場合、「特異的に結合する」という用語は、リガンドの各受容体（複数可）を認識してそれに結合するリガンドの能力を意味する。ＣＰＰの文脈で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、細胞の膜を転位置するＣＰＰの能力を意味する。ある場合には、ＣＰＰ（複数可）と抗体かリガンドかのどちらかとがＴＡＧＥ剤として結び付けられている場合、ＴＡＧＥ剤は抗体またはリガンドとＣＰＰ（複数可）との両方の特異的結合特性を呈し得る。例えば、そのような例では、ＴＡＧＥ剤の抗体またはリガンドが細胞外細胞表面分子、例えば細胞表面タンパク質に対する特異的な結合性を付与し得る一方、ＣＰＰ（複数可）は、細胞膜を横切って移行するＴＡＧＥ剤の強化された能力を付与する。
「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ナノボディ、モノボディ及び抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖との４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、及びその多量体（例えばＩｇＭ）を含む。各重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）、及び重鎖定常領域（またはドメイン）を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で並んだ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、１－Ｒ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。したがって、ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼称されるより保存された領域を間に挟んだ、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で並んだ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
本明細書中で使用する場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域の中に見つかる不連続な抗原結合性部位を指す。これらの特定領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６（１９７７）、及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）によって記載がなされており、定義は、互いとの比較をしたとき、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含んでいる。上に引用される各参考文献によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は比較のために提示される。好ましくは、「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づいてＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲである。
「Ｆｃドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用されるが、これは、完全抗体のパパイン消化によって生成し得る。Ｆｃドメインは、天然配列Ｆｃドメインまたは変異型Ｆｃドメインであり得る。免疫グロブリンのＦｃドメインは、一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの２つの定常ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。抗体エフェクター機能を変化させるためのＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置換えは、当技術分野で知られている（Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６４８，２６０号、第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃドメインは、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ならびに抗体及び抗原－抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。ある実施形態では、結合性タンパク質のエフェクター機能が変化するようにＦｃドメイン含有結合性タンパク質のＦｃドメインの中の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する（例えば、欠失させる、挿入する、または置き換える）。
本明細書中で使用される「完全」または「完全長」抗体は、２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖との４本のポリペプチド鎖を含む抗体を指す。一実施形態では、完全抗体は完全ＩｇＧ抗体である。
本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、つまり、集団を構成する個々の抗体は、あり得る変異型抗体、例えば、天然に存在する突然変異を含有するもの、またはモノクローナル抗体作製物の製造中に現れるものが大抵少ない量で存在するのでこれらを別とするならば、同一であり、及び／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含むのが典型的であるポリクローナル抗体作製物とは対照的に、モノクローナル抗体作製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特質を表しており、何らかの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含んだ遺伝子導入動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作ることができ、モノクローナル抗体を作るためのそのような方法及び他の例示的方法は本明細書に記載されている。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、フレームワーク及びＣＤＲ領域が両方ともヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基（例えば、試験管内でのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、または生体内での体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでいてもよい。しかしながら、本明細書中で使用する場合、「ヒト抗体」という用語が、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に継ぎ足された抗体を含むことは意図していない。
「ヒト化抗体」という用語は、ある哺乳動物種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に継ぎ足された抗体を指すことを意図している。ヒトフレームワーク配列内でさらなるフレームワーク領域改変がなされてもよい。抗体の「ヒト化形態」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がある種に由来しており定常領域配列が別の種に由来している抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来しており定常領域配列がヒト抗体に由来している抗体を指すことを意図している。
抗体の「抗体断片」、「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」は、完全抗体の一部を含んでおり完全抗体が結合する抗原に結合する、完全抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「多重特異性抗原結合性ポリペプチド」または「多重特異性抗体」は、１つよりも多い抗原またはエピトープを標的としてそれに結合する抗原結合性ポリペプチドである。「二重特異性」、「デュアル特異性」または「二機能性」の抗原結合性ポリペプチドまたは抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合性部位を有する混成型の抗原結合性ポリペプチドまたは抗体である。二重特異性抗原結合性ポリペプチド及び抗体は、多重特異性抗原結合性ポリペプチドまたは多重特異性抗体の例であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含むがこれらに限定されない様々な方法によって製造され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ．２０１７．ＭＡＢＳ．９（２）：１８２－２１２を参照されたい。二重特異性抗原結合性ポリペプチドまたは抗体の２つの結合性部位は、例えば、同じまたは異なるタンパク質標的の上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合するものである。
「抗体模倣体」または「抗体模倣物」という用語は、抗体とは構造的に関係がないが抗原に特異的に結合することができる分子を指す。抗体模倣体の例としては、限定はしないがアドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合性分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ｎａｎｏＣＬＡＭＰ、ナノボディ、ユニボディ、バーサボディ、アプタマー及びペプチド性分子が挙げられ、これらは全て、従来の抗体結合を模倣しながらも別個の機序によって生成及び機能する結合性構造を採用している。
本明細書に記載のアミノ酸配列は、変更する、コード配列に単一のアミノ酸または少数のアミノ酸を付加するまたは欠失させる核酸の置換、欠失または付加を含めた、核酸変化の結果として化学的に類似するアミノ酸が置換される「保存的突然変異」を含んでいてもよい。保存的アミノ酸置換は、化学的及び／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）が第１アミノ酸と類似している第２アミノ酸による、第１アミノ酸の置換えを指す。保存的置換としては、以下の群の中でのあるアミノ酸の別のアミノ酸による置換えが挙げられる：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；Ｎ、Ｑ、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）；Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ及びＥ；Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＱ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｈ、Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴ；Ｃ及びＡ；Ｓ及びＴ；Ｃ及びＳ；Ｓ、Ｔ及びＹ；Ｖ、Ｉ及びＬ；Ｖ、Ｉ及びＴ。他の保存的アミノ酸置換も、問題となっているアミノ酸の文脈によっては有効であると認識される。例えば、ある場合には、メチオニン（Ｍ）でリジン（Ｋ）を置き換えることができる。加えて、保存的変異が異なっている配列は大抵において相同である。
「単離された」という用語は、他の細胞性物質を実質的に含まない、例えば抗体または抗体断片であり得る化合物を意味する。したがって、いくつかの態様において、提供される抗体は、異なる特異性を有する抗体から分離された単離された抗体である。
さらなる定義は以下の節の中で記載されている。
本発明の様々な態様について、以下の小節にさらに詳しく記載する。
ＩＩ．標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤
本発明は、遺伝子編集ポリペプチド（すなわち部位特異的改変性ポリペプチド）を標的細胞に送達するのに有用な標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は生物製剤であり得る。特定の実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、細胞膜の細胞外領域と結び付いた抗原に結合する抗原結合性タンパク質にタンパク質が結合体化されることを可能にする結合体化部分を含有する。この標的特異性は、抗原を提示している細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば活性化Ｔ細胞）、線維芽細胞または他の細胞）のみへの部位特異的改変性ポリペプチドの送達を可能にする。そのような細胞は、疾患に関連する特定の組織または細胞種に関連したものであり得る。ＴＡＧＥ剤は、このように、標的細胞のゲノムが改変され得る手段を提供する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、ＣＲＩＳＰＲ配列を認識するＣａｓ９などの核酸依存性エンドヌクレアーゼ（例えばＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ）、及び標的細胞膜上に局在化した細胞外分子（例えば、タンパク質、グリカン、脂質）に特異的に結合する抗原結合性タンパク質を含む。本発明のＴＡＧＥ剤に使用され得る抗原結合性タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物及び方法において使用され得る抗原結合性タンパク質の種類についいては第ＩＶ節でより詳しく記載する。
ＴＡＧＥ剤中のタンパク質（すなわち、少なくとも部位特異的ポリペプチドと抗原結合性ポリペプチド）は、抗原結合性タンパク質が部位特異的改変性ポリペプチドを細胞表面に指向して部位特異的改変性ポリペプチドが標的細胞内に内部移行するように安定して結び付いている。ある実施形態では、抗原結合性タンパク質と細胞表面上の抗原との結合は、標的細胞によって部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行するが抗原結合性タンパク質が内部移行しないように行われる。いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチド及び抗原結合性タンパク質は両方とも標的細胞内に内部移行する。
第ＩＩＩ節でより詳しく記載するが、ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドが核酸依存性エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９である場合、核酸依存性エンドヌクレアーゼはガイド核酸と結び付いて核タンパク質を形成している。例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）がＲＮＡ依存性ヌクレアーゼに結合してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成しているか、またはガイドＤＮＡがＤＮＡ依存性ヌクレアーゼに結合してデオキシリボ核タンパク質（ＤＮＰ）を形成している。他の実施形態では、核酸依存性エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡ：ＲＮＡ混成鎖を含むガイド核酸と結び付いている。そのような例では、ＤＮＡ：ＲＮＡ混成ガイドに結合した、リボ核タンパク質（すなわちＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ）、デオキシリボ核タンパク質（すなわちＤＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ及びガイドＤＮＡ）または核酸依存性エンドヌクレアーゼが標的細胞内に内部移行する。別個の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＲＮＡ混成鎖）は標的細胞へと、同じ細胞に入る核酸依存性エンドヌクレアーゼとは別個に送達される。ガイド核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＲＮＡ混成鎖）は、核酸依存性エンドヌクレアーゼがＴＡＧＥ剤との接触の時点で内部移行した時、標的細胞内に既に存在していてもよい。
ＴＡＧＥ剤は、標的細胞膜上に局在化した細胞外分子（例えば、タンパク質、グリカン、脂質）に特異的に結合する。標的分子は、例えば、細胞外膜結合タンパク質であり得るが、非タンパク質分子、例えばグリカンまたは脂質であってもよい。一実施形態では、細胞外分子は、標的細胞によって発現する細胞外タンパク質、例えばリガンドまたは受容体である。細胞外標的分子は、特定の疾患状態または生物中の特定の組織に関連したものであり得る。細胞膜と結び付いた細胞外分子標的の例は以下の節に記載される。
部位特異的改変性ポリペプチドは、抗原結合性タンパク質が部位特異的改変性ポリペプチドと安定して結び付くこと（したがって、ＴＡＧＥ剤を形成すること）ができるような、結合体化部分を含む。結合体化部分は、抗原結合性タンパク質と部位特異的改変性ポリペプチドとの間に共有結合性または非共有結合性リンケージのどちらかを形成する。
ある実施形態では、本発明のＴＡＧＥ剤に有用な結合体化部分は、細胞外で安定しており、ＴＡＧＥ剤の凝集を防止し、及び／またはＴＡＧＥ剤を水性媒体中で自由に溶解できる状態に及び単量体状態に保つ。細胞内への輸送または送達の前のＴＡＧＥ剤は、安定しており完全なままであり、例えば、抗体またはその抗原結合性タンパク質が核酸依存性エンドヌクレアーゼに連結されたままである。
一実施形態では、結合体化部分はプロテインＡであり、部位特異的改変性ポリペプチドがプロテインＡを含んでおり、抗原結合性タンパク質は、プロテインＡに結合され得るＦｃ領域、例えば、Ｆｃドメインを含む抗体を含んでいる。一実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは配列番号２またはそのＦｃ結合性部分を含む（配列番号２はプロテインＡのアミノ酸配列に相当する）。
別の実施形態では、結合体化部分は、Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇペプチドシステムである。例えば、ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含み、抗原結合性ポリペプチドはＳｐｙＴａｇを含む。例えば、部位特異的改変性ポリペプチドがＣａｓ９を含む場合、Ｃａｓ９は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに結合体化されてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（配列番号６）またはＣａｓ９－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号７）を形成していてもよい。一実施形態では、ＳｐｙＴａｇペプチド配列はＶＰＴＩＶＭＶＤＡＹＫＲＹＫ（配列番号１１６）である。
本明細書に提供されるＴＡＧＥ剤に有用な他の結合体化部分としては、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタグ、Ｓｎｏｏｐタグ、ハロアルカンデハロゲナーゼ（Ｈａｌｏタグ）、Ｓｏｒｔａｓｅ、モノアビジン、ＡＣＰタグ、ＳＮＡＰタグ、または当技術分野で知られている他の任意の結合体化部分が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、抗体結合性部分は、プロテインＡ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ＧＳＴ、ポリ（Ｈｉｓ）、ビオチン／ストレプトアビジン、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＮＥタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｓｎａｐタグ、Ｆｃタグ、Ｎｕｓタグ、ＢＣＣＰ、チオレドキシン、ＳｎｏｏｐｒＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳＢＰタグ、Ｓタグ、ＡｖｉＴａｇ及びカルモジュリンから選択される。
いくつかの実施形態では、抗体結合性部分は化学タグである。例えば、化学タグは、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＨａｌｏＴａｇ、またはＴＭＰタグであり得る。一例において、化学タグはＳＮＡＰタグまたはＣＬＩＰタグである。ＳＮＡＰ及びＣＬＩＰ融合タンパク質は、事実上いかなる分子も関心対象のタンパク質に特異的に共有結合で結合させることを可能にする。別の例では、化学タグはＨａｌｏＴａｇである。ＨａｌｏＴａｇは、溶液か生細胞か化学的に固定された細胞かのいずれかにおいて異なる分子を単一の遺伝子融合体に連結することを可能にするモジュール方式のタンパク質タグ付けシステムを含む。別の例では、化学タグはＴＭＰタグである。
いくつかの実施形態では、抗体結合性部分はエピトープタグである。例えば、エピトープタグは、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２５）もしくはドデカヒスチジン（配列番号１２６）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグまたはＶ５タグであり得る。
結合体化手法によっては、抗体結合剤と、対応する抗体、その抗原結合性断片または抗体模倣体とが接触時に安定して結び付くのを可能にする相補的結合対を含むように、部位特異的改変性ポリペプチド及び抗原結合性タンパク質を各々操作してもよい。結合性部分の例示的な組合せ対としては、（ｉ）ストレプトアビジンに結合するペプチド（ストレプトアビジン結合性ペプチド、ＳＢＰ）とストレプトアビジン（ＳＴＶ）、（ｉｉ）ビオチンとＥＭＡ（強化単量体型アビジン）、（ｉｉｉ）ＳｐｙＴａｇ（ＳＴ）とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳＣ）、（ｉｖ）ＨａｌｏタグとＨａｌｏタグリガンド、（ｖ）とＳＮＡＰタグ、（ｖｉ）Ｍｙｃタグと抗Ｍｙｃ免疫グロブリン（ｖｉｉ）ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ免疫グロブリン、及び（ｉｘ）ｙｂｂＲタグと補酵素Ａ群が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体結合性単位は、ＳＢＰ、ビオチン、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグから選択される。
ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、代わりに、リンカーを結合体化部分とする本明細書に記載の１つ以上のリンカーを介して抗原結合性タンパク質と結び付いていてもよい。
本明細書中で使用される「リンカー」という用語は、抗原結合性タンパク質を部位特異的改変性ポリペプチドに共有結合で結合させてＴＡＧＥ剤を形成させる、共有結合または原子の鎖を含む二価化学部分を意味する。ペプチドまたは巨大分子の結合体化の任意の既知の方法を本開示の文脈で使用することができる。通常、抗原結合性タンパク質と部位特異的改変性ポリペプチドとを共有結合で結合させるには、リンカーが２つの反応性官能基を有していること、つまり反応性の意味で二価であることが必要である。２つ以上の機能性または生物活性部分、例えば、ペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテン及びレポーター基を結合させるのに有用な二価リンカー試薬は既知であり、そのような結合体化のための方法は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ２３４－２４２に記載されており、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するその開示内容を本明細書に援用する。さらなるリンカーは、例えば、Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ，Ｋ．及びＺｈｉｑｉａｎｇ，Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌ，９（１），ｐ．３３－４６，（２０１８）に開示されており、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するその開示内容を本明細書に援用する。
全般的に、開示される組成物及び方法に使用するのに適したリンカーは、循環中は安定しているが、標的細胞あるいは標的細胞の近傍においては抗原結合性タンパク質及び／または部位特異的改変性ポリペプチドの遊離を可能にする。本開示に適するリンカーは、非切断可能または切断可能、及び細胞内または細胞外に大別され得、その各々について以下の本明細書にさらに記載する。
非切断可能リンカー
いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質と部位特異的改変性ポリペプチドとを結合体化させるリンカーは非切断可能である。非切断可能リンカーは、分解（例えばタンパク質分解）に耐える安定した化学結合を含む。全般的に、非切断可能リンカーは、標的細胞の内部でのタンパク質分解を必要とし、高い細胞外安定性を呈する。さらには、本明細書における使用に適する非切断可能リンカーは、結合、－（Ｃ＝Ｏ）－、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｃ２－Ｃ６アルケニレン、Ｃ２－Ｃ６ヘテロアルケニレン、Ｃ２－Ｃ６アルキニレン、Ｃ２－Ｃ６ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン及びそれらの組合せから選択される１つ以上の基を含み得、その各々は、任意選択的に置換されていてもよく、及び／または１つ以上の炭素原子の代わりに１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｓ、ＮまたはＯ）を含んでいてもよい。そのような基の非限定的な例としては、アルキレン（ＣＨ２）ｐ、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｐ、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ）、単位が挙げられ、式中のｐは、その時々で独立して選択される１～６の整数である。抗体－薬物結合体化に利用される非切断可能リンカーの非限定的な例としては、マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレート、カプロイルマレイミド、及びアセチルフェニルブタン酸に基づくものが挙げられる。
切断可能リンカー
いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質と部位特異的改変性ポリペプチドとを結合体化させるリンカーは、細胞内環境または細胞外環境（例えば細胞表面への分子の結合時）においてリンカーの（例えば、メタロプロテアーゼなどのプロテアーゼによる）切断がＴＡＧＥ剤からＣＲＩＳＰＲ指向性エレメント、または抗体もしくはその抗原結合性タンパク質、または両方を遊離させるような、切断可能なものである。切断可能リンカーは、局所環境、例えば細胞外及び細胞内環境、例えば、ｐＨ、還元電位または酵素濃度の違いを利用して標的細胞におけるＴＡＧＥ剤構成要素（すなわち、抗原結合性タンパク質、部位特異的改変性ポリペプチド、または両方）の遊離を誘発するように設計される。全般的に、切断可能リンカーは、生体内での循環中は比較的安定しているが、細胞内環境では１つ以上の（例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ及びグルクロニダーゼの活性を含むがこれらに限定されない）機序によって切断を特に受けやすい。本明細書において使用される切断可能リンカーは、標的細胞の外部では安定しており、標的細胞の内部または標的細胞の細胞外膜の近傍では幾分効果的な速度で切断され得る。有効なリンカーは：（ｉ）抗原結合性タンパク質、例えば抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）ＴＡＧＥ剤またはその構成要素（すなわち、部位特異的改変性ポリペプチド）の細胞内または細胞外送達を可能にし、（ｉｉｉ）ＴＡＧＥ剤がその標的部位に送達または輸送されてしまうまでは安定したまま及び完全なまま、つまり切断されないままであり、そして（ｉｖ）部位特異的改変性ポリペプチドの遺伝子指向作用（例えばＣＲＩＳＰＲ）を維持するものであろう。ＴＡＧＥ剤の安定性は、標準的な分析技術、例えば、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィーによるサイズ決定、または動的光散乱による拡散定数測定、ＨＰＬＣ、及び分離／分析技術ＬＣ／ＭＳによって測定され得る。
好適な切断可能リンカーとしては、例えば、酵素的加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、塩基性条件下での加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核的切断または有機金属的切断によって切断され得るものが挙げられる（例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０：５７１－５８２，２０１２を参照されたく、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するその開示内容を本明細書に援用する）。好適な切断可能リンカーには、例えば、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテルまたはペプチドなどの化学部分が含まれ得る。
酸性条件下で加水分解可能であるリンカーとしては、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなどが挙げられる（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号、第５，８２４，８０５号、第５，６２２，９２９号、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７－１２３、Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３－１４６６１を参照されたく、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するそれらの各々の開示内容の全体を本明細書に援用する。そのようなリンカーは中性ｐＨ条件、例えば血中条件の下で比較的安定しているが、ｐＨが５．５、またはリソソームのおおよそのｐＨである５．０よりも低いと不安定である。全般的に、そのような酸不安定官能性を含むリンカーは細胞外での安定性が比較的より低い傾向にある。このより低い安定性は、細胞外での切断が望まれる場合に有益となり得る。
還元性条件下で切断可能であるリンカーとしては、例えばジスルフィドが挙げられる。例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢ及びＳＭＰＴを使用して形成され得るものを含めて、様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で知られている（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４－５９３１、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７を参照されたい。また、米国特許第４，８８０，９３５も参照されたく、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するそれらの各々の開示内容の全体を本明細書に援用する。ジスルフィド系リンカーは、血漿における循環中は比較的不安定となる傾向にあるが、このより低い安定性は、細胞外での切断が望まれる場合に有益となり得る。また、切断の受けやすさは、例えばジスルフィド部分の近くに立体的な嵩高さを導入して還元的切断を妨げることによって調整され得る。
酵素的加水分解を受けやすいリンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内のペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチド含有リンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、長さが少なくとも２アミノ酸、または長さが少なくとも３アミノ酸である。例示的なアミノ酸リンカーとしては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが挙げられる。好適なペプチドの例としては、バリン、アラニン、シトルリン（Ｃｉｔ）、フェニルアラニン、リジン、ロイシン及びグリシンなどのアミノ酸を含有するものが挙げられる。アミノ酸リンカー構成要素を構成するアミノ酸残基としては、天然に存在するもの、ならびに微量アミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸類縁体、例えばシトルリンが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン－シトルリン（ｖｃ、またはｖａｌ－ｃｉｔ）、及びアラニン－フェニルアラニン（ａｆ、またはａｌａ－ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）、及びグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジペプチド、例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、またはＰｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、またはＴｒｐ－Ｃｉｔを含む。Ｖａｌ－ＣｉｔまたはＰｈｅ－Ｌｙｓなどのジペプチドを含有するリンカーは、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号に開示されており、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するその開示内容の全体を本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｖａｌ－Ａｌａ及びＶａｌ－Ｃｉｔから選択されるジペプチドを含む。ある実施形態では、ペプチド部分を含むリンカーは、細胞内及び細胞外の両方において様々な度合いの切断を受けやすくなり得る。いくつかの実施形態では、それゆえに、リンカーがジペプチドを含み、ＴＡＧＥ剤が細胞外で切断される。いくつかの実施形態では、それゆえに、リンカーがジペプチドを含み、ＴＡＧＥ剤が細胞外で安定しており細胞内で切断される。
本明細書に開示される抗原結合性タンパク質を、本明細書に開示される部位特異的改変性ポリペプチドに結合体化させるのに適するリンカーには、抗原結合性タンパク質または部位特異的改変性ポリペプチドを１，６－脱離プロセスによって遊離させることができるものが含まれる。この脱離プロセスを可能とする化学部分としては、ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）基、６－マレイミドヘキサン酸、ｐＨ感受性カーボネート、及びＪａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３２：３５２６－３５４０，２０１５に記載されている他の試薬が挙げられ、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するその開示内容を本明細書に援用する。
いくつかの実施形態では、リンカーは「自己崩壊性」基、例えば上記のＰＡＢまたはＰＡＢＣ（パラ－アミノベンジルオキシカルボニル）を含むが、これらは例えば、Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）２４：４７９－４８０、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６：６３８－６４４、ＵＳ６２１４３４５、ＵＳ２００３０１３０１８９、ＵＳ２００３００９６７４３、ＵＳ６７５９５０９、ＵＳ２００４００５２７９３、ＵＳ６２１８５１９、ＵＳ６８３５８０７、ＵＳ６２６８４８８、ＵＳ２００４００１８１９４、Ｗ０９８／１３０５９、ＵＳ２００４００５２７９３、ＵＳ６６７７４３５、ＵＳ５６２１００２、ＵＳ２００４０１２１９４０、Ｗ０２００４／０３２８２８に開示されている）。このプロセスを可能とする他のそのような化学部分（「自己崩壊性リンカー」）としては、メチレンカルバメート、及びヘテロアリール基、例えば、アミノチアゾール、アミノイミダゾール、アミノピリミジンなどが挙げられる。そのような複素環式自己崩壊性基を含有するリンカーは、例えば、米国特許公開第２０１６０３０３２５４号及び第２０１５００７９１１４号、ならびに米国特許第７，７５４，６８１号、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７、ＵＳ２００５／０２５６０３０、ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８８１５－８８３０、及びＵＳ７２２３８３７に開示されている。いくつかの実施形態では、ジペプチドを自己崩壊性リンカーと組み合わせて使用する。
本明細書における使用に適するリンカーは、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｃ２－Ｃ６アルケニレン、Ｃ２－Ｃ６ヘテロアルケニレン、Ｃ２－Ｃ６アルキニレン、Ｃ２－Ｃ６ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、及びそれらの組合せから選択される１つ以上の基を含み得、これらの各々は任意選択的に置換されていてもよい。そのような基の非限定的な例としては、（ＣＨ２）ｐ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ、及び－（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｐ－単位が挙げられ、式中のｐは、その時々で独立して選択される１～６の整数である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテル、ジペプチド、ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）基、複素環式自己崩壊性基、任意選択的に置換されたＣ１－Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１－Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたＣ２－Ｃ６アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２－Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたＣ２－Ｃ６アルキニル、任意選択的に置換されたＣ２－Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたＣ３－Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール、溶解性向上基、アシル、－（Ｃ＝Ｏ）－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ－基の１つ以上を含み得、式中のｐは１～６の整数である。当業者であれば、列挙された基のうちの１つ以上が二価（ジラジカル）種、例えばＣ１－Ｃ６アルキレンなどの形態で存在していてもよいことを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、リンカーはｐ－アミノベンジル基（ＰＡＢ）を含む。一実施形態では、ｐ－アミノベンジル基は、細胞毒性薬とリンカー中のプロテアーゼ切断部位との間に配置される。一実施形態では、ｐ－アミノベンジル基は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル単位の一部である。一実施形態では、ｐ－アミノベンジル基はｐ－アミノベンジルアミド単位の一部である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ａｃ）－ＰＡＢ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｃ）－ＰＡＢ、Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ＰＡＢ、またはＡｌａ－ＰＡＢを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチド、オリゴ糖、－（ＣＨ２）ｐ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ－、ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ａｃ）－ＰＡＢ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｃ）－ＰＡＢ、Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ＰＡＢ、またはＡｌａ－ＰＡＢの１つ以上の組合せを含む。
好適なリンカーは、溶解性または反応性を調整する基で置換されていてもよい。好適なリンカーは、溶解性向上特性を有する基を含有していてもよい。（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ単位（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）を含むリンカーは、例えば、アミノ、スルホン酸、ホスホン酸またはリン酸残基で置換されたアルキル鎖と同様に溶解性を向上させることができる。そのような部分を含むリンカーは、例えば、米国特許第８，２３６，３１９号及び第９，５０４，７５６号に開示されており、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するそれらの各々の開示内容の全体を本明細書に援用する。そのような基を含有するリンカーは、例えば、米国特許第９，６３６，４２１号及び米国特許出願公開第２０１７／０２９８１４５号に記載されており、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するそれらの開示内容を本明細書に援用する。
本明細書に開示される抗原結合性タンパク質と部位特異的改変性ポリペプチドとを共有結合で結合体化させるのに適するリンカーは、２つの反応性官能基（すなわち２つの反応性末端）を有し得、片方は抗原結合性タンパク質に結合体化させるためのものであり、もう片方は部位特異的改変性ポリペプチドに結合体化させるためのものである。抗原結合性タンパク質上の結合体化に適する部位は、ある実施形態では求核性であり、例えば、チオール、アミノ基またはヒドロキシル基である。本明細書に開示される抗原結合性タンパク質の中に存在し得る反応性（例えば求核性）部位としては、アミノ酸残基上の求核性置換基、例えば、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、（ｉｖ）側鎖ヒドロキシル基、例えばセリン、または（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合の糖のヒドロキシルもしくはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合性タンパク質上の結合体化に適する部位としては、セリン、スレオニン及びチロシン残基のヒドロキシル部分；リジン残基のアミノ部分；アスパラギン酸及びグルタミン酸残基のカルボキシル部分；ならびにシステイン残基のチオール部分、ならびに天然に存在しないアミノ酸のプロパルギル、アジド、ハロアリール（例えばフルオロアリール）、ハロヘテロアリール（例えばフルオロヘテロアリール）、ハロアルキル及びハロヘテロアルキル部分が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、リンカー上の抗体結合体化反応性末端は、ある実施形態では、チオール反応性基、例えば（マレイミド中にあるような）二重結合、脱離基、例えば、クロロ、ブロモ、ヨードもしくはＲ－スルファニル基、またはカルボキシル基である。
部位特異的改変性ポリペプチド上の結合体化に適する部位も、ある実施形態では求核性であり得る。本明細書に開示される部位特異的改変性ポリペプチドの中に存在し得る反応性（例えば求核性）部位としては、アミノ酸残基上の求核性置換基、例えば、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、（ｉｖ）側鎖ヒドロキシル基、例えばセリン、または（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合の糖のヒドロキシルもしくはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。部位特異的改変性ポリペプチド上の結合体化に適する部位としては、セリン、スレオニン及びチロシン残基のヒドロキシル部分；リジン残基のアミノ部分；アスパラギン酸及びグルタミン酸残基のカルボキシル部分；ならびにシステイン残基のチオール部分、ならびに天然に存在しないアミノ酸のプロパルギル、アジド、ハロアリール（例えばフルオロアリール）、ハロヘテロアリール（例えばフルオロヘテロアリール）、ハロアルキル及びハロヘテロアルキル部分が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、リンカー上の部位特異的改変性ポリペプチド結合体化反応性末端は、ある実施形態では、チオール反応性基、例えば（マレイミド中にあるような）二重結合、脱離基、例えば、クロロ、ブロモ、ヨードもしくはＲ－スルファニル基、またはカルボキシル基である。
いくつかの実施形態では、リンカーに結合している反応性官能基は、抗原結合性タンパク質上、部位特異的改変性ポリペプチド上または両方に存在する求電子基との反応性を有する求核基である。抗原結合性タンパク質上または部位特異的改変性ポリペプチド上の有用な求電子基としては、アルデヒド及びケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。求核基のヘテロ原子は抗原結合性タンパク質上または部位特異的改変性ポリペプチド上の求電子基と反応して抗原結合性タンパク質または部位特異的改変性ポリペプチドとの共有結合を形成することができる。有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴＡＧＥ剤はヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。そのようなヌクレオシドまたはヌクレオチドの上の結合体化に適する部位は、それぞれ－ＯＨまたはリン酸基を含む。そのような実施形態に用いるのに適するリンカー及び結合体化方法は、例えば、Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２１（９），１６４２－５５，２０１０、及び２０１７年８月１６日にオンラインで公開されたＢｅｒｎａｒｄｉｎｅｌｌｉ，Ｇ．ａｎｄ Ｈｏｇｂｅｒｇ，Ｂ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（１８），ｐ．ｅ１６０に開示されており、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するそれらの各々の開示内容を本明細書に援用する。
結合体化した状態のリンカーについて記載する際に「リンカー」という用語を使用する場合、反応性末端の片方または両方ともが、リンカーと抗原結合性タンパク質との間及び／またはリンカーと部位特異的改変性ポリペプチドとの間での結合の形成ゆえに存在しない（化学部分に変換されている）かまたは不完全になっている（例えば、カルボン酸のカルボニルのみになっている）ことになる。それゆえ、本明細書において有用なリンカーは、限定はされないが、リンカー上の反応性官能基と抗原結合性タンパク質上の求核基あるいは反応性置換基との間でのカップリング反応によって形成された化学部分、及びリンカー上の反応性官能基と部位特異的改変性ポリペプチド上の求核基との間でのカップリング反応によって形成された化学部分を含有するリンカーを含む。
これらのカップリング反応によって形成される化学部分の例は、求核剤／求電子剤対（例えば、チオール／ハロアルキル対、アミン／カルボニル対、またはチオール／α，β－不飽和カルボニル対など）、ジエン／求ジエン体対（例えば、数ある中でも、アジド／アルキン対、またはジエン／α，β不飽和カルボニル対）などを含めた化学反応性官能基間での反応の結果として得られる。化学部分を形成する反応性官能基間でのカップリング反応としては、チオールアルキル化、ヒドロキシルアルキル化、アミンアルキル化、アミンまたはヒドロキシルアミン縮合、ヒドラジン形成、アミド化、エステル化、ジスルフィド形成、環化付加（例えば、数ある中でも、［４＋２］ディールズ－アルダー環化付加、［３＋２］ヒュスゲン環化付加）、芳香族求核置換、芳香族求電子置換、及び当技術分野で知られているまたは本明細書に記載される他の反応様式が挙げられるが、これらに限定されない。好適なリンカーは、抗原結合性タンパク質上、部位特異的改変性ポリペプチド上または両方の上の求核性官能基との反応のための求電子性官能基を含有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合性タンパク質、部位特異的改変性ポリペプチドまたは両方の中に存在する反応性官能基は、アミンまたはチオール部分である。特定の抗原結合性タンパク質は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗原結合性タンパク質は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）などの還元剤による処理によって、リンカー試薬との結合体化に関して反応性にされ得る。したがって、各システイン架橋は理論的には２つの反応性チオール求核剤を形成することになる。リジンと２－イミノチオラン（トラウト試薬）とを反応させてアミンからチオールへの変換をもたらすことによって、抗原結合性タンパク質中にさらなる求核基を導入することができる。反応性チオール基は、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのシステイン残基を導入すること（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含む突然変異抗体を作製すること）によって抗原結合性タンパク質中に導入され得る。米国特許第７，５２１，５４１号は、反応性システインアミノ酸の導入によって抗体を操作することを教示している。
本明細書に開示される共有結合での結合体の合成に適するリンカーは、限定はされないが、反応性官能基、例えばマレイミドまたはハロアルキル基を含む。これらの基は、リンカーまたは架橋試薬の中、例えば、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－Ｌ－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、スルホ－ＳＭＣＣ、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＭＢＳ）、スルホ－ＭＢＳ、及びスクシンイミジルヨードアセテートの中に存在し得、これらは例えばＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，１８：６９０－６９７，１９７９に他のものも含めて記載されており、参照により、化学的結合体化のためのリンカーに関するその開示内容を本明細書に援用する。
いくつかの実施形態では、リンカーに結合している反応性官能基のうちの片方または両方は、マレイミド、アジドまたはアルキンである。マレイミド含有リンカーの一例は、非切断可能なマレイミドカプロイル系リンカーである。そのようなリンカーについては、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７：１４－２４，２００６によって記載がなされており、参照により、化学的結合体化のためのリンカーに関するその開示内容を本明細書に援用する。
いくつかの実施形態では、反応性官能基は、－（Ｃ＝Ｏ）－または－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－基と、抗原結合性タンパク質または部位特異的改変性ポリペプチドまたは両方のアミノ基との反応によってそれぞれ生成するアミドまたは尿素部分によってリンカーが抗原結合性タンパク質または部位特異的改変性ポリペプチドに連結され得るような、－（Ｃ＝Ｏ）－、または－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、反応性官能基は、Ｎ－マレイミジル基、ハロゲン化Ｎ－アルキルアミド基、スルホニルオキシＮ－アルキルアミド基、カーボネート基、スルホニルハライド基、チオール基またはその誘導体、内部炭素－炭素三重結合を含むアルキニル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基、ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル基、内部炭素－炭素二重結合を含むアルケニル基、シクロアルケニル基、テトラジニル基、アジド基、ホスフィン基、ニトリルオキシド基、ニトロン基、ニトリルイミン基、ジアゾ基、ケトン基、（Ｏ－アルキル）ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、ハロゲン化Ｎ－マレイミジル基、１，１－ビス（スルホニルメチル）メチルカルボニル基またはその脱離誘導体、カルボニルハライド基、またはアレンアミド基であり、これらの各々は任意選択的に置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、反応性官能基はシクロアルケン基、シクロアルキン基、または任意選択的に置換された（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む。
本明細書に記載の結合体を調製するのに適する二価リンカー試薬の例としては、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖型」類縁体（ＬＣ－ＳＭＣＣ）であるＮ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、及びＮ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。ハロアセチル系部分を含む架橋試薬としては、Ｎ－スクシンイミジル－４－（ヨードアセチル）－アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ－スクシンイミジルボロアセテート（ＳＢＡ）、及びＮ－スクシンイミジル３－（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。
本明細書に開示される化学基、部分及び特徴の１つ以上のうちのいずれか１つを様々な方法で組み合わせて本明細書に開示される部位特異的改変性ポリペプチドとの本明細書に開示される抗原結合性タンパク質の結合体化に有用なリンカーを形成してもよいことは、当業者によって認識されよう。本明細書に記載の組成物及び方法に関連して有用となるさらなるリンカーは、例えば米国特許出願公開第２０１５／０２１８２２０号に記載されており、参照により、共有結合での結合体化に適するリンカーに関するその開示内容を本明細書に援用する。
ＩＩＩ．ＴＡＧＥ剤の部位特異的改変性ポリペプチド
ＴＡＧＥ剤は、部位特異的改変性ポリペプチド、例えば、標的細胞内の核酸配列を認識する核酸依存性エンドヌクレアーゼ（例えばＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）またはＤＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ）を含む。
本開示の組成物及び方法に使用される部位特異的改変性ポリペプチドは、ポリペプチド自体または結び付いている分子が特定の核酸配列または一組の類似する配列（すなわち標的配列（複数可））を認識及び指向する、という点で部位特異的である。いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチド（またはそれに結び付いた分子）は、１つ以上の位置で縮重していてもよい保存された塩基またはモチーフを含んだ、類似する配列を認識する。
特定の実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはポリヌクレオチドをその標的配列の外側の特定の場所（複数可）（すなわち改変部位（複数可））で改変する。特定の部位特異的改変性ポリペプチドによって改変される改変部位（複数可）はまた、大抵は特定の配列、または類似配列の組に特有のものでもある。これらの実施形態のいくつかでは、部位特異的改変性ポリペプチドは、１つ以上の位置で縮重していてもよい保存された塩基またはモチーフを含んだ、類似する配列を改変する。他の実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、標的配列（複数可）に対して相対的に特定の場所の中にある配列を改変する。例えば、部位特異的改変性ポリペプチドは、標的配列（複数可）の上流側または下流側の特定の数の核酸の中にある配列を改変し得る。
部位特異的改変性ポリペプチドに関して本明細書中で使用する場合、「改変」という用語は、改変部位における少なくとも１つのヌクレオチドの任意の挿入、欠失、置換または化学修飾、あるいは標的部位に隣接する遺伝子の発現の変化を意味する。改変部位における少なくとも１つのヌクレオチドの置換は、シチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼドメインなどの塩基編集ドメインの動員の結果であり得る（例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４７５（１１）：１９５５－１９６４を参照されたく、この全体を本明細書に援用する）。
標的部位に隣接する遺伝子の発現の変化は、遺伝子のプロモーター領域への転写活性化ドメインもしくは転写抑制ドメインの動員、またはＤＮＡもしくはヒストンタンパク質を共有結合的に改変してＤＮＡ配列の変化を伴わずにヒストン構造及び／または染色体構造を変化させて結果として隣接遺伝子の遺伝子発現に変化をもたらすエピゲノム修飾ドメインの動員の結果として生じ得る。「改変」という用語はまた、特定の核酸配列（例えば疾患関連配列）の検出を可能にする、部位特異的改変性ポリペプチドまたは結び付いている分子（例えばｇＲＮＡ）に結合体化され得る検出可能標識を、標的部位に動員することも包含する。
いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはヌクレアーゼまたはその変異体であり、それゆえ、ヌクレアーゼまたはその変異体を含む薬剤のことを本明細書では遺伝子編集細胞指向（ＴＡＧＥ）剤と呼称する。本明細書中で使用する場合、「ヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖の主鎖中のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。本開示の組成物及び方法に適するヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ及び／またはエキソヌクレアーゼ活性を有し得る。エキソヌクレアーゼは、ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖の末端から１つずつ切断する。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の両末端にあるものを除くポリヌクレオチド鎖中のホスホジエステル結合を切断することによってポリヌクレオチド鎖を切断する。ヌクレアーゼは、ＲＮＡポリヌクレオチド鎖（つまり、リボヌクレアーゼ）及び／またはＤＮＡポリヌクレオチド鎖（つまり、デオキシリボヌクレアーゼ）を切断することができる。
ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖を切断し、その結果として切断部位をもたらす。本明細書中で使用する場合、「切断する」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の主鎖中のホスホジエステル結合の加水分解を意味する。本開示のＴＡＧＥ剤のヌクレアーゼによる切断は、一本鎖または二本鎖の切断であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの二本鎖切断は、２つのヌクレアーゼによる切断によって成し遂げられるものであり、各ヌクレアーゼがＤＮＡの一本鎖を切断する。ヌクレアーゼによる切断は、平滑末端またはずれ末端をもたらし得る。
本開示の組成物及び方法に適するヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ、例えばＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋ１）；亜鉛フィンガーヌクレアーゼ；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び核酸依存性ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ）が挙げられる。
本明細書中で使用する場合、「メガヌクレアーゼ」は、１２塩基対よりも長い標的配列においてＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡに異種二量体として結合する。本開示の組成物及び方法に適するメガヌクレアーゼとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１２７）ファミリーのものであってこのアミノ酸モチーフまたはその変異型を含むものが挙げられる。
本明細書中で使用する場合、「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」は、制限エンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインと融合した亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインを含むキメラタンパク質を指す。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインは、独特の構造を安定化させる役割を果たす亜鉛イオンによって結合される。
本明細書に使用する場合、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」は、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインと融合した複数のＴＡＬドメイン反復を含むＤＮＡ結合性ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ＴＡＬドメイン反復は、プロテオバクテリアのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からのタンパク質のＴＡＬＥファミリーに由来するものであり得る。ＴＡＬドメイン反復は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼称される１２番目及び１３番目の超可変性アミノ酸を有する、３３～３４アミノ酸配列である。ＲＶＤは、標的配列結合の特異性を付与する。ＴＡＬドメイン反復を合理的または実験的手段によって操作して特有の標的配列特異性を有する変異型ＴＡＬＥＮを生成することができる（例えば、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９－１５１２、及びＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１を参照されたく、参照によりそれらの各々の全体を援用する）。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断は、非特異的スペーサー領域の両脇に位置する２つのＤＮＡ標的配列を必要とし、各ＤＮＡ標的配列にＴＡＬＥＮ単量体が結合する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮはコンパクトＴＡＬＥＮを含むが、これは、ホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＴｅｖＩ、ＭｍｅＩ、ＥｎｄＡ、Ｅｎｄ１、Ｉ－ＢａｓＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＴｗｏＩ、ＭｓｐＩ、ＭｖａＩ、ＮｕｃＡ及びＮｕｃＭ）の任意の部分に任意の配向で融合した１つ以上のＴＡＬドメイン反復を有するＤＮＡ結合性ドメインを含んだエンドヌクレアーゼを指す。コンパクトＴＡＬＥＮは、ＤＮＡプロセシング活性のための二量体化を必要とせず、それゆえ単一の標的部位しか必要としない、という点で有益である。
本明細書中で使用する場合、「核酸依存性ヌクレアーゼ」は、ヌクレアーゼに結び付けられているガイド核酸（すなわち、ガイドＲＮＡもしくはｇＲＮＡ、ガイドＤＮＡもしくはｇＤＮＡ、またはガイドＤＮＡ／ＲＮＡ混成鎖）と、標的配列との間の（完全または部分的な）相補性に基づいて特定の標的配列を指向するヌクレアーゼを指す。ガイドＲＮＡと標的配列との結合は、ヌクレアーゼを標的配列の近傍に動員するのに役立つ。本開示の組成物及び方法に適する核酸依存性ヌクレアーゼの非限定的な例としては、原核生物（例えば、細菌、古細菌）由来の天然に存在する規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、またはその変異体が挙げられる。原核生物にみられるＣＲＩＳＰＲ配列は、侵入ウイルスからのポリヌクレオチドの断片に由来する配列であり、次の感染の間に類似ウイルスを認識すること、及びＲＮＡ依存性ヌクレアーゼとして機能してウイルスポリヌクレオチドを切断するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを介してウイルスポリヌクレオチドを切断することのために使用される。本明細書中で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド」または「Ｃａｓポリペプチド」は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムの中でＣＲＩＳＰＲ配列の近傍にみられる天然に存在するポリペプチドを指す。特定のＣａｓポリペプチドはＲＮＡ依存性ヌクレアーゼとして機能する。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも２つのグラス、クラス１及びクラス２が存在する。総じて本開示の組成物及び方法の核酸依存性ヌクレアーゼは、核酸依存性ヌクレアーゼ活性を有する単一のポリペプチドをクラス２ＣＲＩＳＰＲシステムが含んでいるという前提で、クラス２Ｃａｓポリペプチドまたはその変異体であり、他方、クラス１ＣＲＩＳＰＲシステムはヌクレアーゼ活性のためにタンパク質の複合体を必要とする。クラス２ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも３つの既知の型、ＩＩ型、Ｖ型及びＶＩ型が存在し、これらの中には、複数の亜型（未確定または推定上の亜型もある中でとりわけ亜型ＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、ＩＩ－Ｃ、Ｖ－Ａ、Ｖ－Ｂ、Ｖ－Ｃ、ＶＩ－Ａ、ＶＩ－Ｂ、及びＶＩ－Ｃ）が存在する。一般に、ＩＩ型及びＶ－Ｂ型システムは、ｃｒＲＮＡに加えてｔｒａｃｒＲＮＡを活性のために必要とする。対照的に、Ｖ－Ａ型及びＶＩ型は活性のためにｃｒＲＮＡしか必要としない。全ての既知のＩＩ型及びＶ型ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを標的とするが、他方、全ての既知のＶＩ型ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼは一本鎖ＲＮＡを標的とする。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ依存性ヌクレアーゼは本明細書及び文献においてＣａｓ９と呼称される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法の核酸依存性ヌクレアーゼはＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体である。ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼとして機能するＶ型Ｃａｓポリペプチドは、標的配列を指向及び切断するのにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。本明細書及び文献において、ＶＡ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ依存性ヌクレアーゼはＣｐｆ１と呼称され、ＶＢ型ＣＲＩＳＰＲシステムのものはＣ２Ｃ１と呼称され、ＶＣ型ＣＲＩＳＰＲシステムのものはＣａｓ１２ＣまたはＣ２Ｃ３と呼称され、ＶＩＡ型ＣＲＩＳＰＲシステムのものはＣ２Ｃ２またはＣａｓ１３Ａ１と呼称され、ＶＩＢ型ＣＲＩＳＰＲシステムのものはＣａｓ１３Ｂと呼称され、ＶＩＣ型ＣＲＩＳＰＲシステムのものはＣａｓ１３Ａ２と呼称される。ある実施形態では、本開示の組成物及び方法の核酸依存性ヌクレアーゼはＶＡ型Ｃｐｆ１タンパク質またはその変異体である。核酸依存性ヌクレアーゼとして機能する天然に存在するＣａｓポリペプチド及びその変異体は当技術分野で知られており、限定はされないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１、またはＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５（３）：１６９－１８２、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３（１１）：７２２－７３６、及び米国特許第９７９０４９０号に記載されているものを含み、これらの各々の全体を本明細書に援用する。クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ１２及びＣａｓ１２の任意の亜型、例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ及びＣａｓ１２ｉが挙げられる。ＲＮＡ標的配列を切断するために、Ｃａｓ１３を含めたクラス２ ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをＴＡＧＥ剤に含ませてもよい。
本開示の組成物及び方法の核酸依存性ヌクレアーゼは、天然に存在する核酸依存性ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９）またはその変異体であり得る。変異型核酸依存性ヌクレアーゼは、例えば、ヌクレアーゼドメインの１つ以上における活性を変化させるもの、改変特性を付与する異種ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、エピゲノム修飾ドメイン、検出可能ラベル）に核酸依存性ヌクレアーゼを融合させるもの、ヌクレアーゼの安定性を改変するもの、またはヌクレアーゼの特異性を改変するものであるアミノ酸の置換、欠失または付加を含有する、操作されたかまたは天然に存在している変異体であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸依存性ヌクレアーゼは、標的部位に対する特異性及び／または細胞内微小環境における安定性を改善する１つ以上の突然変異を含む。例えば、タンパク質がＣａｓ９（例えばＳｐＣａｓ９）または改変型Ｃａｓ９である場合、それは、Ｒｅｃ２ドメインのＮ１７５からＲ３０７まで（端点を含む）の任意または全ての残基を欠失させることが好都合であり得る。ヌクレアーゼのより小さい、またはより低い分子量の形態がより効果的であることが見出される場合がある。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、天然に存在する形態のヌクレアーゼに対して相対的に少なくとも１つの置換を含む。例えば、タンパク質がＣａｓ９または改変型Ｃａｓ９である場合、Ｃ８０またはＣ５７４（または、インデルを有する改変型タンパク質においてはその相同体）を突然変異させることが好都合であり得る。Ｃａｓ９において望ましい置換は、Ｃ８０Ａ、Ｃ８０Ｌ、Ｃ８０Ｉ、Ｃ８０Ｖ、Ｃ８０Ｋ、Ｃ５７４Ｅ、Ｃ５７４Ｄ、Ｃ５７４Ｎ、Ｃ５７４Ｑのいずれかを（任意の組合せで）、特にＣ８０Ａを含み得る。置換は、ヌクレアーゼの細胞内タンパク質結合性を低減するため及び／または標的部位特異性を向上させるために含められ得る。さらに、またはあるいは、置換は、組成物のオフターゲット毒性を軽減するために含められ得る。
核酸依存性ヌクレアーゼは、それがガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ））と結び付いていることによって、特定の標的配列へと差し向けられる。核酸依存性ヌクレアーゼは、非共有結合性の相互作用を介してガイド核酸に結合し、かくして複合体を形成する。ポリヌクレオチド指向性核酸は、標的配列の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことによって標的特異性を複合体に提供する。複合体の核酸依存性ヌクレアーゼまたはそれに融合あるいは結合体化されたドメインまたは標識は、部位特異的な活性をもたらす。換言すれば、核酸依存性ヌクレアーゼは、それがポリヌクレオチド指向性ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントと結び付いているおかげで、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、染色体核酸中の標的配列；染色体外核酸中、例えば、エピソーム核酸中、ミニサークル中の標的配列；ミトコンドリア核酸中の標的配列；葉緑体中の標的配列；プラスミド中の標的配列）へと導かれる。
このように、ガイド核酸は、「ポリヌクレオチド指向性セグメント」と「ポリペプチド結合性セグメント」との２つのセグメントを含む。「セグメント」とは、分子のセグメント／区域／領域（例えば、ＲＮＡ中の連続する一続きのヌクレオチド）を意味する。セグメントは、セグメントが１つよりも多くの分子の領域を含み得るといった具合に、複合体の領域／区域を指すこともある。例えば、場合によっては、ポリヌクレオチド指向性核酸の（以下に記載される）ポリペプチド結合性セグメントはたった１つの核酸分子を含み、したがって、ポリペプチド結合性セグメントはその核酸分子の領域を含む。他の例では、ＤＮＡ指向性核酸の（以下に記載される）ポリペプチド結合性セグメントは、相補性の領域に沿ってハイブリダイズしている２つの別個の分子を含む。
ポリヌクレオチド指向性セグメント（または「ポリヌクレオチド指向性配列」もしくは「ガイド配列」）は、標的配列中の特定の配列（例えば、標的ＤＮＡ配列の相補鎖）に対して（完全または部分的に）相補的なヌクレオチド配列を含む。ポリペプチド結合性セグメント（または「ポリペプチド結合性配列」）は、核酸依存性ヌクレアーゼと相互作用する。一般に、核酸依存性ヌクレアーゼによる標的ＤＮＡの部位特異的な切断または改変は、（ｉ）核酸のポリヌクレオチド指向性配列と標的ＤＮＡとの塩基対合相補性、及び（ｉｉ）標的配列中の短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼称される）の両方によって決まる場所で起こる。
プロトスペーサー隣接モチーフは、長さが様々であり得、標的配列からの距離が様々であり得るが、一般的にはＰＡＭは、標的配列から約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０ヌクレオチドの所を含めて約標的配列から約１～約１０ヌクレオチド以内の所にある。ＰＡＭは、標的配列の５’側または３’側にあり得る。一般的にはＰＡＭは約３～４ヌクレオチドのコンセンサス配列であるが、特定の実施形態では長さが２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る、またはそれを上回り得る。所与のＲＮＡガイドヌクレアーゼのための好ましいＰＡＭ配列またはコンセンサス配列を同定する方法は当技術分野で知られており、限定されないが、Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １６：２５３によって記載されたＰＡＭ除去アッセイ、またはＰａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１（９）：８３９－４３に開示されているアッセイを含み、参照によりこれらの各々の全体を援用する。
ポリヌクレオチド指向性配列（すなわちガイド配列）は、関心対象の標的配列と直接にハイブリダイズするヌクレオチド配列である。ガイド配列は、関心対象の標的配列と完全または部分的に相補的となるように操作される。様々な実施形態において、ガイド配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドまたはそれよりも多くを含み得る。例えば、ガイド配列は、長さが約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０ヌクレオチドであり得る、またはそれを上回り得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列は長さが約１０～約２６ヌクレオチド、または長さが約１２～約３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイド配列は長さが約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との相補性の度合いは、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントした場合、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％である、またはそれを上回る。特定の実施形態では、ガイド配列は二次構造がなく、ｍＦｏｌｄ（例えば、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：１３３－１４８を参照されたい）、及びＲＮＡｆｏｌｄ（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４を参照されたい）を含むがこれらに限定されない当技術分野で知られている任意の好適なポリヌクレオチド折りたたみアルゴリズムを用いて予測することができる。
いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、２つの別個の核酸分子（「活性化剤核酸」及び「指向剤核酸」、以下参照）を含み、本明細書において「二重分子ガイド核酸」または「二分子ガイド核酸」と呼称される。他の実施形態では、主題となるガイド核酸は、単一の核酸分子（単一のポリヌクレオチド）であり、本明細書において「単分子ガイド核酸」、「一本鎖ガイド核酸」または「ｓｇＮＡ」と呼称される。「ガイド核酸」または「ｇＮＡ」という用語は包括的であり、二重分子ガイド核酸及び単分子ガイド核酸（すなわちｓｇＮＡ）を両方とも指す。ガイド核酸がＲＮＡである実施形態では、ｇＲＮＡは二重分子ガイドＲＮＡまたは一本鎖ガイドＲＮＡであり得る。同様に、ガイド核酸がＤＮＡである実施形態では、ｇＤＮＡは二重分子ガイドＤＮＡまたは一本鎖ガイドＤＮＡであり得る。
例示的な二分子ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「指向剤ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ反復」）分子、及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化剤ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（指向剤ＲＮＡ）は、ガイドＲＮＡのポリヌクレオチド指向性セグメント（一本鎖）と、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合性セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の半分を形成し本明細書中でＣＲＩＳＰＲ反復配列と呼称される一続きのヌクレオチド（「二本鎖形成セグメント」）との両方を含む。
「活性化剤核酸」または「活性化剤ＮＡ」という用語は、二重分子ガイド核酸のｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を意味して本明細書中で使用される。「指向剤核酸」または「指向剤ＮＡ」という用語は、二重分子ガイド核酸のｃｒＲＮＡ様分子を意味して本明細書中で使用される。「二本鎖形成セグメント」という用語は、対応する活性化剤ＮＡまたは指向剤ＮＡ分子の一続きのヌクレオチドとハイブリダイズすることによってｄｓＲＮＡ二本鎖の形成に寄与する活性化剤ＮＡまたは指向剤ＮＡの一続きのヌクレオチドを意味して本明細書中で使用される。換言すれば、活性化剤ＮＡは、対応する指向剤ＮＡの二本鎖形成セグメントに対して相補的な二本鎖形成セグメントを含む。このように、活性化剤ＮＡが二本鎖形成セグメントを含む一方、指向剤ＮＡは二本鎖形成セグメントとガイド核酸のＤＮＡ指向性セグメントとの両方を含む。したがって、主題となる二重分子ガイド核酸は、任意の対応する活性化剤ＮＡと指向剤ＮＡとの対を含み得る。
活性化剤ＮＡは、活性化剤ＮＡ（ガイド核酸のポリペプチド結合性セグメントの他方の部分）にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する領域を含むヌクレオチド配列を含むＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドまたはそれよりも多くを含み得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、長さが約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０ヌクレオチドであり得る、またはそれを上回り得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒ配列の逆反復領域との相補性の度合いは、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントした場合、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％である、またはそれを上回る。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（すなわち活性化剤ＮＡ）は、ガイド核酸のポリペプチド結合性セグメントの二本鎖化した二本鎖の他方の部分を形成する一続きのヌクレオチド（二本鎖形成セグメント）を含む。換言すれば、ｃｒＲＮＡ様分子（すなわちＣＲＩＳＰＲ反復配列）の一続きのヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（すなわち逆反復配列）の一続きのヌクレオチドに対して相補的であり、ハイブリダイズして、ガイド核酸のポリペプチド結合性ドメインの二本鎖化した二本鎖を形成する。ｃｒＲＮＡ様分子はさらに、一本鎖ＤＮＡ指向性セグメントを提供する。かくして、ｃｒＲＮＡ様及びｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は（対応する対として）ハイブリダイズしてガイド核酸を形成する。所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の厳密な配列は、ＣＲＩＳＰＲシステム、及びＲＮＡ分子が見つかる種に特徴的である。主題となる二重分子ガイドＲＮＡは、任意の対応するｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの対を含み得る。
トランス活性化様ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（本明細書中では「活性化剤ＮＡ」とも呼称される）は、本明細書中で逆反復領域と呼称されるｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する領域を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は、二次構造（例えばステムループ）を有する、またはその対応するｃｒＲＮＡとハイブリダイズした時に二次構造を形成する領域をさらに含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して完全または部分的に相補的なｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の領域は分子の５’末端にあり、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の３’末端は二次構造を含む。この二次構造領域は一般に、逆反復配列の隣に見つかるものである連結ヘアピンを含めたいくつかのヘアピン構造を含む。連結ヘアピンは、ヘアピンステムの基部に保存されたヌクレオチド配列を有することが多く、ｔｒａｃｒＲＮＡの連結ヘアピンの多くにおいてモチーフＵＮＡＮＮＣが見つかっている。ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端には末端ヘアピンが存在することが多く、これは構造が様々であり得るが、ＧＣに富むＲｈｏ独立転写終結因子ヘアピンとそれに続く３’末端にある一連のＵとを含んでいることが多い。例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３－３３９、Ｂｒｉｎｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ（２０１６）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９０９０２、及び米国公開第２０１７／０２７５６４８号を参照されたく、参照によりそれらの各々の全体を本明細書に援用する。
様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して完全または部分的に相補的なｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の逆反復領域は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、またはそれよりも多くを含む。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ様逆反復配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列との塩基対合の領域は長さが約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０ヌクレオチドであり得る、またはそれを上回り得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様逆反復配列との相補性の度合いは、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントした場合、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％である、またはそれを上回る。
様々な実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子全体は、約６０ヌクレオチド～約１４０ヌクレオチド超を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は長さが約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０ヌクレオチドであり得る、またはそれを上回り得る。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９及び約１００ヌクレオチドの長さを含めた約８０～約１００ヌクレオチドの長さである。
主題となる単分子ガイド核酸（すなわちｓｇＮＡ）は２本のヌクレオチドの連なり（指向剤ＮＡと活性化剤ＮＡ）を含み、これらは、互いに相補的であり、介在ヌクレオチド（「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合で繋げられており、ハイブリダイズしてタンパク質結合性セグメントの二本鎖化した核酸二本鎖を形成し、かくしてステムループ構造がもたらされる。指向剤ＮＡと活性化剤ＮＡとを、指向剤ＮＡの３’末端及び活性化剤ＮＡの５’末端を介して共有結合で繋げることができる。あるいは、指向剤ＮＡと活性化剤ＮＡとを、指向剤ＮＡの５’末端及び活性化剤ＮＡの３’末端を介して共有結合で繋げることができる。
単分子ＤＮＡ指向性核酸のリンカーは、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、リンカーは、限定はされないが約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０またはそれより多くのヌクレオチドを含めた約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、または約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、単分子ＤＮＡ指向性核酸のリンカーは４ｎｔである。
例示的な単分子ＤＮＡ指向性核酸は、ハイブリダイズして二本鎖化した二本鎖を形成する相補的な２本のヌクレオチドの連なりを含み、さらには、特定の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。
ｃｒＲＮＡ（及びいくつかの実施形態ではｔｒａｃｒＲＮＡ）の適切な天然に存在する同属対は、発見された核酸依存性ヌクレアーゼとして機能するほとんどのＣａｓタンパク質のためのものについては既知であり、または核酸依存性ヌクレアーゼ活性を有する特定の天然に存在するＣａｓタンパク質のためのものについては、Ｃａｓ核酸依存性ヌクレアーゼタンパク質の隣接配列を配列決定及び解析してｔｒａｃｒＲＮＡコード配列を、よってｔｒａｃｒＲＮＡ配列を既知の逆反復コード配列もしくはその変異体の探索によって同定することで突き止めることができる。ｔｒａｃｒＲＮＡの逆反復領域は、ｄｓタンパク質結合性二本鎖の半分を含む。ｄｓタンパク質結合性二本鎖の半分を含む相補性反復配列をＣＲＩＳＰＲ反復と呼ぶ。既知のＣＲＩＳＰＲ核酸依存性ヌクレアーゼによって利用されるＣＲＩＳＰＲ反復及び逆反復配列は当技術分野で知られており、例えば、ｃｒｉｓｐｒ．ｉ２ｂｃ．ｐａｒｉｓ－ｓａｃｌａｙ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒ／にてワールドワイドウェブ上のＣＲＩＳＰＲデータベースで見つけることができる。
一本鎖ガイド核酸または二本鎖ガイド核酸は、化学的に、または試験管内での転写によって合成され得る。核酸依存性ヌクレアーゼとガイド核酸との配列特異的な結合を判定するためのアッセイは当技術分野で知られており、限定はしないが、発現させた核酸依存性ヌクレアーゼとガイド核酸との試験管内結合アッセイを含み、これは、検出可能標識（例えばビオチン）でタグ付けすること、及び核タンパク質複合体を検出可能標識（例えばストレプトアビジンビーズ）によって捕捉するプルダウン検出アッセイに用いることができるものである。ガイド核酸とは無関係な配列または構造を有する対照ガイド核酸が、核酸との核酸依存性ヌクレアーゼの非特異的結合の陰性対照として使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ、ｇＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ、またはＤＮＡ指向性ＲＮＡ、ｇＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の改変を含む。場合によっては、ｓｇＲＮＡ（例えば、切断型ｓｇＲＮＡ）は、標的核酸に対して相補的な第１ヌクレオチド配列、及びＣａｓポリペプチドと相互作用する第２ヌクレオチド配列を含む。他の例では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上の改変型ヌクレオチドを含む。場合によっては、第１ヌクレオチド配列中及び／または第２ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの１つ以上は、改変型ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、改変型ヌクレオチドは、リボース基、リン酸基、核酸塩基またはそれらの組合せにおける改変を含む。場合によっては、リボース基における改変は、リボース基の２’位における改変を含む。場合によっては、リボース基の２’位における改変は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）及びそれらの組合せからなる群から選択される。他の例では、リン酸基における改変は、ホスホロチオエート改変を含む。他の実施形態では、改変型ヌクレオチドは、２’－リボ３’－ホスホロチオエート（Ｓ）、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、本開示の組成物及び方法の部位特異的改変性ポリペプチドは、ニッカーゼとして機能するヌクレアーゼ変異体を含み、野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼが、二本鎖核酸分子の一本鎖を切断することしかできないかまたはヌクレアーゼ活性を完全に欠く（すなわちヌクレアーゼ消滅型）ヌクレアーゼになる突然変異を含んでいる。
ニッカーゼとしてしか機能しないヌクレアーゼ、例えば核酸依存性ヌクレアーゼは、単一の機能性ヌクレアーゼドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、さらなるヌクレアーゼドメインは、その特定のドメインのヌクレアーゼ活性が低減または除去されるように突然変異している。
他の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えばＲＮＡ依存性ヌクレアーゼ）は、ヌクレアーゼ活性を完全に欠き、本明細書中でヌクレアーゼ消滅型と呼称される。これらの実施形態のいくつかでは、ヌクレアーゼ中の全てのヌクレアーゼドメインは、ポリペプチドの全てのヌクレアーゼ活性が除去されるように突然変異している。部位特異的ヌクレアーゼの１つ以上のヌクレアーゼドメインの中に突然変異を導入するために、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、米国公開第２０１４／００６８７９７号及び米国特許第９，７９０，４９０号に示されているものを用いることができ、参照によりこれらの各々の全体を援用する。
ヌクレアーゼ活性を低減または除去するヌクレアーゼドメイン内での任意の突然変異を用いて、ニッカーゼ活性を有する核酸依存性ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼ消滅型核酸依存性ヌクレアーゼを生成することができる。そのような突然変異は当技術分野で知られており、限定はされないが、ＲｕｖＣドメイン内でのＤ１０Ａ突然変異、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＨＮＨドメイン内での、もしくは別の核酸依存性ヌクレアーゼの中でＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９との相同性が最大となるようにアラインメントしたときに類似する位置（複数可）でのＨ８４０Ａ突然変異を含む。ニッカーゼまたはヌクレアーゼ消滅型タンパク質を生成するために突然変異させてもよいＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の位置としては、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３及びＤ９８６が挙げられる。ニッカーゼまたはヌクレアーゼ消滅型タンパク質をもたらし得る核酸依存性ヌクレアーゼのヌクレアーゼドメイン内の他の突然変異としては、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１タンパク質の、またはＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１タンパク質との相同性が最大となるようにアラインメントした場合の別の核酸依存性ヌクレアーゼの中で類似する位置（複数可）での、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ及びＮ１２５７Ａが挙げられる（米国特許第９，７９０，４９０号、参照によりその全体を援用する）。
ヌクレアーゼ消滅型ドメインを含む部位特異的改変性ポリペプチドは、ポリヌクレオチドを改変することができるドメインをさらに含み得る。ヌクレアーゼ消滅型ドメインに融合され得る改変性ドメインの非限定的な例としては、転写活性化または抑制ドメイン、塩基編集ドメイン、及びエピゲノム改変ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、ヌクレアーゼ消滅型ドメインを含む部位特異的改変性ポリペプチドは、標的配列の存在を検出するのに役立ち得る検出可能標識をさらに含む。
ヌクレアーゼ消滅型ドメインに融合され得るエピゲノム改変ドメインは、ＤＮＡまたはヒストンタンパク質を共有結合的に改変して、ＤＮＡ配列自体を変化させることなくヒストン構造及び／または染色体構造を変化させるのに役立ち、結果として遺伝子発現が変化する（上方制御または下方制御）。部位特異的改変性ポリペプチドによって誘発され得るエピゲノム改変の非限定的な例としては、ヒストン残基における以下の変更及びその逆反応：アルギニンまたはリジン残基のスモイル化、メチル化、リジン残基のアセチル化またはユビキチン化、セリン及び／またはスレオニン残基のリン酸化、ならびにＤＮＡの以下の変更及びその逆反応：シトシン残基のメチル化またはヒドロキシメチル化が挙げられる。したがって、エピゲノム改変ドメインの非限定的な例としては、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱アセチル化ドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、及びＤＮＡ脱メチル化酵素ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、転写制御エレメント及び／または転写調節タンパク質、例えば転写因子またはＲＮＡポリメラーゼとの相互作用によって少なくとも１つの隣接遺伝子の転写を活性化させる転写活性化ドメインを含む。好適な転写活性化ドメインは当技術分野で知られており、限定はされないが、ＶＰ１６活性化ドメインを含む。
他の実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、同じく転写制御エレメント及び／または転写調節タンパク質、例えば転写因子またはＲＮＡポリメラーゼと相互作用して少なくとも１つの隣接遺伝子の転写を軽減し得るまたは終結させ得るものである転写抑制因子ドメインを含む。好適な転写抑制ドメインは当技術分野で知られており、限定されないが、ＩκＢ及びＫＲＡＢドメインを含む。
さらに他の実施形態では、ヌクレアーゼ消滅型ドメインを含む部位特異的改変性ポリペプチドは、標的配列の存在を検出するのに役立ち得る検出可能ラベルをさらに含み、これは疾患関連配列であり得る。検出可能標識は、可視化あるいは観察され得る分子である。検出可能標識は、融合タンパク質（例えば蛍光タンパク質）として核酸依存性ヌクレアーゼに融合され得るか、または視覚的にもしくは他の手段で検出され得るヌクレアーゼポリペプチドに結合体化された低分子であり得る。融合タンパク質として本開示の核酸依存性ヌクレアーゼに融合され得る検出可能標識は、特定の抗体による検出が可能であり得る蛍光タンパク質またはタンパク質ドメインを含むがこれらに限定されない任意の検出可能タンパク質ドメインを含む。蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）及び黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）が挙げられる。低分子検出可能標識の非限定的な例としては、放射性標識、例えば３Ｈ及び３５Ｓが挙げられる。
核酸依存性ヌクレアーゼは、ＴＡＧＥ剤の一部として細胞内へと、そのガイド核酸に結合した核酸依存性ヌクレアーゼを含む核タンパク質複合体として送達され得る。あるいは、核酸依存性ヌクレアーゼがＴＡＧＥ剤として送達され、ガイド核酸が別個に提供される。ある実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として標的細胞内に導入され得る。ガイドＲＮＡは、試験管内で転写され得るかまたは化学合成され得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を細胞内に導入する。これらの実施形態のいくつかでは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はプロモーター（例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）に機能可能に連結されており、これは天然のプロモーターであってもよいしまたはガイドＲＮＡコードヌクレオチド配列に対して異種であってもよい。
ある実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、追加のアミノ酸配列、例えば、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は、細胞の核の中への部位特異的ポリペプチドの輸送を増進する。核内に輸送されるタンパク質は、核膜孔複合体中のタンパク質の１つ以上、例えば、一般的にはリジン及びアルギニン残基に最も良く結合するものであるインポーチン／カリオフェリン（ｋａｒｙｐｈｅｒｉｎ）タンパク質に結合する。最も良好に特性評価されている核局在化の経路には、インポーチン－αタンパク質に結合する短いペプチド配列が関与する。これらの核局在化配列は塩基性アミノ酸の連なりを含むことが多く、２つのそのような結合部位がインポーチン－α上に存在していることを考慮すると、少なくとも１０アミノ酸によって隔てられた２つの塩基性配列は、２部分からなるＮＬＳを構成し得る。２番目に最も良好に特性評価されている核輸送の経路には、インポーチン－β１タンパク質に結合するタンパク質、例えば、ＨＩＶ－ＴＡＴ、及びＨＩＶ－ＲＥＶタンパク質が関与しており、これらはそれぞれ配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９）及びＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲ（配列番号１３）を使用してインポーチン－β１に結合する。他の核局在化配列は当技術分野で知られている（例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：５１０１－５１０５を参照されたい）。ＮＬＳは、部位特異的ポリペプチドの天然に存在するＮＬＳであってもよいし、または異種ＮＬＳであってもよい。本明細書中で使用する場合、配列に関して「異種」は、外来の種に由来する配列のことであるか、または同じ種からのものである場合にはその天然形態から組成及び／またはゲノム座位が人間の意図的な介入によって実質的に改変された配列のことである。部位特異的ポリペプチドの核局在化を増進するために使用され得るＮＬＳ配列の非限定的な例としては、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びｃ－ＭｙｃのＮＬＳが挙げられる。ある実施形態では、ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む。
部位特異的ポリペプチドは、１つよりも多くのＮＬＳ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多くのＮＬＳ配列を含み得る。複数のＮＬＳの各々の配列が独特であってもよいし、または同じＮＬＳ配列が１つよりも多く使用されていてもよい。ＮＬＳは、部位特異的ポリペプチドのアミノ末端上（Ｎ末端上）、カルボキシ末端（Ｃ末端）、またはポリペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方ともに存在し得る。ある実施形態では、部位特異的ポリペプチドはそのＮ末端上に４つのＮＬＳ配列を含む。他の実施形態では、部位特異的ポリペプチドは部位特異的ポリペプチドのＣ末端上に２つのＮＬＳ配列を含む。さらに他の実施形態では、部位特異的ポリペプチドはそのＮ末端上に４つのＮＬＳ配列を含みかつ２つのＮＬＳ配列をそのＣ末端上に含む。
ある実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、繋げられているタンパク質またはペプチドの細胞の原形質膜からの吸収を誘発するものである細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含む。一般に、ＣＰＰは、その全体形状のため、及び膜貫通孔に自己組織化する傾向か、負に帯電したリン脂質外膜と相互作用して膜の湾曲を誘発してこれが今度は内部移行を活性化させるものであるいくつかの正に帯電した残基を有する傾向かのどちらかのために、細胞内への進入を誘発する。例示的な透過性ペプチドは、限定されないが、トランスポータン、ＰＥＰ１、ＭＰＧ、ｐ－ＶＥＣ、ＭＡＰ、ＣＡＤＹ、ポリＲ（例えば配列番号１２８）、ＨＩＶ－ＴＡＴ（配列番号９）、ＨＩＶ－ＲＥＶ（配列番号１３）、ペネトラチン、Ｒ６Ｗ３、Ｐ２２Ｎ、ＤＰＶ３、ＤＰＶ６、Ｋ－ＦＧＦ、及びＣ１０５Ｙを含み、また、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ（２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：８８８－８９３、及びＦａｒｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ５７：７８－９４の中で総説されており、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。
部位特異的ポリペプチドは、ＮＬＳに加えて、またはそれに代えてさらなる異種アミノ酸配列、例えば、本明細書中のどこかに記載されている検出可能標識（例えば蛍光タンパク質）、または精製タグを含んで、融合タンパク質を形成していてもよい。精製タグは、混合物（例えば、生体試料、培養培地）からタンパク質または融合タンパク質を単離するために利用され得る任意の分子である。精製タグの非限定的な例としては、ビオチン、ｍｙｃ、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）及びグルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）が挙げられる。
本開示の組成物及び方法を用いて、（例えば、エラーの起こりやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）または代替的末端結合（ａｌｔ－ＥＪ）経路によって）修復されて特定ゲノム位置に突然変異を導入するものである配列特異的な二本鎖切断部の導入によってゲノムを編集することができる。修復プロセスのエラーの起こりやすい性質のために、二本鎖切断部の修復は、標的配列に対する改変をもたらし得る。あるいは、導入された二本鎖切断部の修復の過程でドナー鋳型ポリヌクレオチドを標的配列に組み込むかまたはそれと交換して、外来ドナー配列の導入をもたらしてもよい。したがって、組成物及び方法は、隣接する相同末端を含み得るドナー鋳型ポリヌクレオチドをさらに含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、本明細書中のどこかに記載されているリンカーを介してドナー鋳型ポリヌクレオチドをＴＡＧＥ剤に繋ぎ止める（例えば、切断可能リンカーを介してドナー鋳型ポリヌクレオチドを部位特異的ポリペプチドに結合させる）。
いくつかの実施形態では、ドナー配列は、新たに組み込まれたドナー配列が核酸依存性ヌクレアーゼによって認識及び切断されることがないように元の標的配列を変化させる。ドナー配列は、相同性に依存する修復によってドナー配列の組込みを増進するための、標的配列に隣接する配列との実質的な配列同一性を有する隣接配列を含み得る。核酸依存性ヌクレアーゼが二本鎖ずれ切断部を生成する特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの両脇には適合するオーバーハングが位置し得、その結果、二本鎖切断部を修復する間の非相同修復プロセスによるドナー配列の組込みが可能となり得る。
ＩＶ．ＴＡＧＥ剤の抗原結合性ポリペプチド
抗原結合性ポリペプチドは、細胞膜に結び付いている細胞外抗原を標的とし、部位特異的改変性ポリペプチドの送達に用いられる特異性を提供する。本明細書に記載のＴＡＧＥ剤の中に含ませてもよい抗原結合性ポリペプチドの例としては、抗体、抗体の抗原結合性断片または抗体模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体及び抗原結合性断片
ある実施形態では、本明細書に提供されるＴＡＧＥ剤は、標的細胞膜上に局在化したまたは特定の組織に結び付いた細胞外分子（例えば、タンパク質、グリカン、脂質）に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。抗体またはその抗原結合性断片に特異的に結合される細胞外分子は、抗原、例えば、限定はされないが、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５４、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＡｃｈＲ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣａｍ、ＰＤ－１またはＦＡＰ１であり得る。ある実施形態では、抗原はＣＤ２２である。実施形態において、抗体またはその抗原結合性部分はＣＤ３に特異的に結合する。本発明のＴＡＧＥ剤中の抗体、その抗原結合性断片の、他の例示的な標的としては、（ｉ）腫瘍関連抗原；（ｉｉ）細胞表面受容体；（ｉｉｉ）ＣＤタンパク質及びそのリガンド、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５４、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９ａ）及びＣＤ７９Ｐ（ＣＤ７９ｂ）；（ｉｖ）ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；（ｖ）細胞接着分子、例えば、アルファあるいはベータサブユニットを含めたＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、及びαｖ／β３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ならびに（ｖｉ）ＶＥＧＦなどの成長因子、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ４、プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７などが挙げられる。抗体またはその抗原結合性断片の標的となり得る他の抗原の例としては、細胞表面受容体、例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１３．４（２０１３）：２２７に記載されているものが挙げられ、参照によりそれを本明細書に援用する。
本明細書に記載のＴＡＧＥ剤に使用される抗原結合性ポリペプチドはまた、特定の細胞種に対して特異的であってもよい。例えば、抗原結合性ポリペプチド、例えば抗体またはその抗原結合性部分は、造血細胞（ＨＳＣ）の細胞表面に存在する抗原に結合し得る。ＨＳＣ上にみられる抗原の例としては、ＣＤ３４、ＥＭＣＮ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ｃ－ＫＩＴ、ＣＤ４５またはＣＤ４９Ｆが挙げられるが、これらに限定されない。細胞の細胞外表面上に発現するまたは提示される抗原を介して抗原結合性ポリペプチドに結合され得る、したがってＴＡＧＥ剤によって遺伝子編集され得る他の細胞種としては、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ及び線維芽細胞が挙げられる。
例示的な抗体（またはその抗原結合性断片）としては、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗ＡｃｈＲ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥｐＣａｍ抗体、抗ＰＤ－１抗体、または抗ＦＡＰ１抗体から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの様々な標的に対する例示的な抗体は以下の配列表に配列番号１４～１１５として記載されている。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合性断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ある実施形態では、抗ＣＤ２２抗体は、エプラツズマブ（ｈＬ２２としても知られ、例えば、米国特許第５７８９５５４号、米国出願第２０１２０３０２７３９号を参照されたい；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓによってカタログ番号ＮＢＰ２－７５１８９で販売されている（２０１９年３月３日現在）、ベクツモマブ（例えば、米国特許第ＵＳ８４２００８６号を参照されたい）、ＲＦＢ４（例えば、ＵＳ特許第ＵＳ７３５５０１２号を参照されたい）、ＳＭ０３（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｒｕｇ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ（２０１６）３６：８８９－９０２を参照されたい）、ＮＣＩ ｍ９７２（例えば、ＵＳ８５９１８８９、ＵＳ９２７９０１９、ＵＳ９５９８４９２を参照されたい）またはＮＣＩ ｍ９７１（例えば、ＵＳ７４５６２６０、ＵＳ８５９１８８９、ＵＳ９２７９０１９、ＵＳ９５９８４９２を参照されたい）から選択される。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１０８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号１０９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１０９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ＣＤ１１ａ（インテグリンとしても知られる、アルファＬ、リンパ球機能関連抗原１、アルファポリペプチドまたはＩＴＧＡＬ；Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０７０１）は、細胞接着及びリンパ球共刺激シグナル伝達に関与するインテグリンである。ＣＤ１１ａは、ＣＤ１８と合わせた２つの成分のうちの一方であるが、これらは、白血球上に発現するものであるリンパ球機能関連抗原１を形成する。ある実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体はエファリズマブ（例えばＷＯ１９９８０２３７６１または米国特許第６，６５２，８５５号に記載されており、これをもって参照によりそれらの各々を援用する）。
一実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体は、抗ＣＤ１１ａ抗体エファリズマブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに抗ＣＤ１１ａ抗体エファリズマブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体は、抗ＣＤ１１ａ抗体エファリズマブの重鎖可変領域、及び抗ＣＤ１１ａ抗体エファリズマブの軽鎖可変領域を含む。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ＣＤ２５（インターロイキン２受容体アルファ鎖としても知られる、ＩＬ２ＲＡ；Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１５８９）は、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、いくつかの胸腺細胞、骨髄前駆体及びオリゴデンドロサイトの上に存在するＩ型膜貫通タンパク質である。インターロイキン２（ＩＬ２）受容体アルファ（ＩＬ２ＲＡ）及びベータ（ＩＬ２ＲＢ）鎖は共通のガンマ鎖（ＩＬ２ＲＧ）と一緒になって高親和性ＩＬ２受容体を形成する。ある実施形態では、抗ＣＤ２５抗体はダクリズマブ（例えば米国特許第７，３６１，７４０号に記載されており、これをもって参照により援用する）である。
一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、抗ＣＤ２５抗体ダクリズマブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに抗ＣＤ２５抗体ダクリズマブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、抗ＣＤ２５抗体ダクリズマブの重鎖可変領域、及び抗ＣＤ１１ａ抗体ダクリズマブの軽鎖可変領域を含む。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＦＡＰ抗体またはその断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）は、セプラーゼとしても知られるが、ポストプロリルエンドペプチダーゼ活性を有するプロリルオリゴペプチダーゼファミリーの膜結合型セリンプロテアーゼである。腫瘍微小環境（例えば腫瘍間質）へのＦＡＰの制限された発現は、それを、様々な腫瘍の治療で標的とするための魅力的な治療的候補にしている。ある実施形態では、抗ＦＡＰ抗体は、シブロツズマブ／ＢＩＢＨ１（ＷＯ９９／５７１５１、Ｍｅｒｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９２，２４０－２４８（２００１）、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６８，１７３０－１７３８（２００１）、ＷＯ０１／６８７０８、ＷＯ２００７／０７７１７３に記載されている）、Ｆ１９（ＷＯ９３／０５８０４に記載されており、ＡＴＣＣ番号はＨＢ８２６９であり、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓによってカタログ番号ＭＡＢ３７１５で販売されている）、ＯＳ４（Ｗｕｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ ９２，１５９－１６８（２００１）に記載されている）から選択される。他の抗ＦＡＰ抗体は、例えば、米国特許第８５６８７２７号、米国特許第８９９９３４２号、米国出願第２０１６００６０３５６号、米国出願第２０１６００６０３５７号及び米国特許第ＵＳ９０１１８４７号に記載されており、参照によりそれらの各々を本明細書に援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＦＡＰ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１００に示されるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＦＡＰ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１００に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１０１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、ＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）としても知られるが、タンパク質受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、免疫応答を下方制御する免疫チェックポイントとして機能する。ＣＴＬＡ４はＴリンパ球の表面上に発現し、早期活性化ＣＤ８Ｔ細胞の表面上には一過的に発現し、制御性Ｔ細胞上には恒常的に発現する。ある実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブ（商標名：ヤーボイ（登録商標）；米国特許第６９８４７２０号、米国特許第６０５２３８号、米国特許第８０１７１１４号、米国特許第８３１８９１６号及び米国特許第８７８４８１５号に記載される）から選択される。他の抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば、米国特許第９７１４２９０号、米国特許第１０２０２４５３号及び米国公開第２０１７０２１６４３３号に記載されており、参照によりそれらの各々を本明細書に援用する。
一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１０２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号１０３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１０３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。上記配列は、抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブに相当する。
一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１０４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号１０５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１０５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。上記配列は、抗ＣＴＬＡ４抗体トレメリムマブに相当する。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ４４抗体またはその断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ＣＤ４４は、多くのがんにおいて高度に発現し、細胞表面へのＣＤ４４の動員によって転移を調節する、遍在性の細胞表面糖タンパク質である。ある実施形態では、抗ＣＤ４４抗体は、ＲＧ７３５６（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３０６３４９８Ａ１号に記載されている）から選択される。他の抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば、米国公開第２０１７０２１６４３３号、米国公開第２００７０２３７７６１Ａ１号及び米国公開第ＵＳ２０１０００９２４８４号に記載されており、参照によりそれらの各々を本明細書に援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ４４抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号３１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ４４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号３１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ５４抗体またはその断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ＣＤ５４は、白血球機能関連抗原１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８［ＬＦＡ－１］）に結合する細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ５４は、内皮細胞への白血球のＬＦＡ－１依存性接着と、細胞間接触を伴う免疫機能との両方を調節する。抗ＣＤ５４抗体は、例えば、米国特許第７９４３７４４号、米国特許第５７７３２９３号、米国特許第８６２３３６９号、ＰＣＴ公開第Ｗ０９１／１６９２８号及び米国公開第ＵＳ２０１０００９２４８４号に記載されており、参照によりそれらの各々を本明細書に援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ５４抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ５４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号８７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ５４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
特定の実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ３３抗体またはその断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ＣＤ３３またはＳｉｇｌｅｃ－３（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３、ＳＩＧＬＥＣ３、ＳＩＧＬＥＣ－３、ｇｐ６７、ｐ６７）は、シアル酸結合性受容体ファミリーの骨髄特有のメンバーであり、骨髄前駆細胞上には高度に発現するが、分化細胞にはよりはるかに低いレベルで発現する。ある実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、リンツズマブ（クローンＨｕＭ１９５としても知られ、米国特許第９０７９９５８号に記載されている）、２Ｈ１２（米国特許第９５８７０１９号に記載されている）から選択される。他のＣＤ３３抗体は、例えば、米国特許第７，３４２，１１０号、米国特許第７，５５７，１８９号、米国特許第８，１１９，７８７号、米国特許第８，３３７，８５５号、米国特許第８，１２４，０６９号、米国特許第５，７３０，９８２号、米国特許第７，６９５，７１号、ＷＯ２０１２０７４０９７、ＷＯ２００４０４３３４４、ＷＯ１９９３０２０８４８、ＷＯ２０１２０４５７５２、ＷＯ２００７０１４７４３、ＷＯ２００３０９３２９８、ＷＯ２０１１０３６１８３、ＷＯ１９９１００９０５８、ＷＯ２００８０５８０２１、ＷＯ２０１１０３８３０１、Ｈｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２９，３１６－３２３，Ｒｏｌｌｉｎｓ－Ｒａｖａｌ ａｎｄ Ｒｏｔｈ，（２０１２）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６０，９３３－９４２）、Ｐｅｒｅｚ－Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．２１，７５７－７７０）、Ｆｅｒｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：８２７－８３３，Ｖｉｔａｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：５７６４－５７６９，Ｊａｎｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８２，３２３－３３２、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３０，２４０－２４８，Ｊｕｒｃｉｃ，（２０１２）Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ ７，６５－７３、及びＲｉｃａｒｔ，（２０１１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７，６４１７－６４２７に記載されており、参照によりそれらの各々を本明細書に援用する。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ２２抗体またはその断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。ある実施形態では、抗ＣＤ２２抗体は、抗ＣＤ２２抗体エプラツズマブ（ｈＬ２２としても知られ、例えば、米国特許第５７８９５５４号、米国出願第２０１２０３０２７３９号を参照されたい；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓによってカタログ番号ＮＢＰ２－７５１８９で販売されている（２０１９年３月３日現在）、またはエプラツズマブ抗体に相当する抗原結合性領域を含む抗ＣＤ２２抗体である。エプラツズマブ抗体は、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞に対して作らせたマウス抗ＣＤ２２ ＩｇＧ２ａである抗体ＬＬ２（ＥＰＢ－２）に由来するヒト化抗体である。
一実施形態では、抗ＣＤ２２抗体は、抗ＣＤ２２抗体エプラツズマブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖、ならびに抗ＣＤ２２抗体エプラツズマブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片である抗原結合性ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ムロモナブ（ＯＫＴ３としても知られる；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄによってカタログ番号３１７３０１または３１７３０２で販売されている（２０１９年３月３日現在））、ビジリズマブ（例えば、米国特許第５８３４５９７号、米国特許第７３８１８０３号、米国出願第２００８００２５９７５号を参照されたい）、オテリキシズマブ（例えばＷＯ２００７１４５９４１を参照されたい）、またはＤｏｗ２（例えばＷＯ２０１４１２９２７０を参照されたい）である。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ３抗体を含み、抗ＣＤ３抗体が、抗ＣＤ３抗体ムロモナブ（ＯＫＴ３としても知られる；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄによってカタログ番号３１７３０１または３１７３０２で販売されている（２０１９年３月３日現在））、またはムロモナブに相当する抗原結合性領域を含む抗ＣＤ３抗体である。
一実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３抗体ムロモナブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖、ならびに抗ＣＤ３抗体ムロモナブのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号７７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号７７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ４５抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４５抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号１５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ４５抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ４８抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４８抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号１７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ４８抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号１９３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号２０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号２１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号２２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号２３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号２４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号２５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号２６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号２７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＣＲ２抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ２抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号２８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号２９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＣＲ２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＣＲ５抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号３３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＣＲ５抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号３３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号３５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号３５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＳＬＡＭＦ７抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号３７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号３７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号３９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号３９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号４０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号４１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号４１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号４２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号４３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号４３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号４４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号４５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号４５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号４６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号４７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号４７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＩＦＮＡＲ１抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＦＮＡＲ１抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号４８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号４９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＩＦＮＡＲ１抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号４９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗トランスフェリン抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号５０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号５１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗トランスフェリン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号５２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号５３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＩＬ６－Ｒ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ６－Ｒ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号５４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号５５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＩＬ６－Ｒ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＴＣＲｂ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＣＲｂ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号５６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号５７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＴＣＲｂ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ５９抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ５９抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号５８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号５９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ５９抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ４抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号６０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号６１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号６０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号６２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号６３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号６２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号６４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号６５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号６４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号６６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号６７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号６６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号６８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号６９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号６８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号７１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号７１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ｎｋｇ２ａ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ｎｋｇ２ａ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号７３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ｎｋｇ２ａ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号７３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号７５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号７５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＴＬＲ２抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＬＲ２抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号７９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＴＬＲ２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号７９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号８１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ２抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号８３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号８５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号８９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号９０に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号９１に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号９１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号９２に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号９３に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号９３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号９４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号９５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号９５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ３４抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３４抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号９６に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号９７に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ３４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号９７に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ５９抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ５９抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号９８に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号９９に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ５９抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号９９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合性部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１１４に示されるアミノ酸残基を含む可変重鎖領域、及び配列番号１１５に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１４に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１１５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って決定され得る。
いくつかの実施形態では、抗体、その抗原結合性断片は、引用される参考文献の中の配列を含めた本明細書に開示される抗体と少なくとも９５％、９６％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変領域を含む。あるいは、抗体、その抗原結合性断片は、引用される参考文献の中の配列を含めた本明細書に開示される抗体と少なくとも９５％、９６％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する本明細書に記載の可変領域のフレームワーク領域を有する本明細書に開示される抗体のＣＤＲを含む。配列及び本明細書中に具体的に列挙される開示内容を参照により明示的に援用する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば活性化Ｔ細胞）、線維芽細胞または他の細胞から選択される細胞の表面に発現したタンパク質に結合する抗原結合性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞である。ある実施形態では、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）またはエフェクターＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は腫瘍浸潤Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞（ＨＳＣｓＯまたは造血前駆細胞（ＨＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、マクロファージはＭ１またはＭ２マクロファージである。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤の抗原結合性タンパク質は、抗原結合性断片である。そのような断片の例としては、ドメイン抗体、ナノボディ、ユニボディ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＢｉＴｅ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）２またはイントラボディが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤の抗原結合性ポリペプチドはナノボディである。
一実施形態では、ナノボディは抗ＭＨＣＩＩナノボディである。一実施形態では、抗ＭＨＣＩＩナノボディは配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ナノボディは抗ＥＧＦＲナノボディである。一実施形態では、抗ＥＧＦＲナノボディは配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ナノボディは抗ＨＥＲ２ナノボディである。一実施形態では、抗ＨＥＲ２ナノボディは配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、ドメイン抗体及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）か軽鎖（ＶＬ）かのどちらかの可変領域に相当する抗体の小さな機能性結合性ユニットである。ドメイン抗体は、およそ１３ｋＤａの分子量を有する。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全ヒトＶＨ及びＶＬ ｄＡｂの一連の大きな高機能ライブラリー（各ライブラリーは１００億種を超える異なる配列を含む）を開発しており、これらのライブラリーを使用して、治療標的に特異的なｄＡｂを選択する。多くの従来の抗体とは対照的に、ドメイン抗体は、細菌、酵母及び哺乳動物細胞システムにおいて良好に発現する。ドメイン抗体及びその生産方法のさらなる詳細は、米国特許第６，２９１，１５８号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、第６，１７２，１９７号、第６，６９６，２４５号、米国シリアル番号２００４／０１１０９４１、欧州特許出願第１４３３８４６号、ならびに欧州特許第０３６８６８４及び第０６１６６４０号、ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９及びＷＯ０３／００２６０９号を参照することによって得られ得るが、参照によりそれらの各々の全体を本明細書に援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、ナノボディ及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。ナノボディは、天然に存在する重鎖抗体の独特の構造的及び機能的特性を含む抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含有する。重要なことに、クローニングされ単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能力を内包して完璧なまでに安定しているポリペプチドである。ナノボディはヒト抗体のＶＨドメインとの高い相同性を有しており、活性を何ら失うことなくさらにヒト化されることができる。重要なことに、ナノボディは、免疫原となる可能性が低く、このことは、ナノボディ先導化合物を使った霊長類試験において確認済みである。
ナノボディは、従来の抗体の利点と低分子薬の重要な特徴とを組み合わせたものである。従来の抗体と同様に、ナノボディは、高い標的特異性、その標的に対する高い親和性、及び低い固有毒性を示す。しかしながら、それは低分子薬と同様に、酵素を阻害することができ、受容体の割れ目に容易に到達することができる。しかも、ナノボディは極めて安定しており、注射以外の手段で投与されることができ（例えば、ＷＯ０４／０４１８６７を参照されたく、参照によりその全体を本明細書に援用する）、製造が簡単である。ナノボディの他の利点には、その大きさが小さい結果として珍しいまたは隠れたエピトープを認識すること、その独特の三次元的な薬物形式柔軟性ゆえにタンパク質標的の空孔内または活性部位に高い親和性及び選択性で結合すること、半減期が適宜変更されること、ならびに創薬が簡単で速いことが含まれる。
ナノボディは、単一の遺伝子にコードされ、原核生物または真核生物宿主、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照されたく、参照によりその全体を本明細書に援用する）、カビ（例えば、アスペルギルス属またはトリコデルマ属）及び酵母（例えば、サッカロマイセス属、クリベロマイセス属、ハンセヌラ属またはピキア属）（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照されたく、参照によりその全体を本明細書に援用する）において産生され得る。生産プロセスは規模変更可能であり、数キログラム量のナノボディが生産されたことがある。ナノボディが従来の抗体に比べて優れた安定性を発揮するので、それを長い貯蔵寿命の即使用可能な液剤として製剤化することができる。
ナノクローン法（例えばＷＯ０６／０７９３７２を参照されたく、参照によりその全体を本明細書に援用する）は、Ｂ細胞の自動化高処理量選択に基づいて所望の標的に対するナノボディを生成するための独占所有されている方法であり、本発明の文脈で使用されることもあり得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、ユニボディ及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。ユニボディは、別の抗体断片技術であるが、この技術はＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づいている。ヒンジ領域の欠失は、本質的に従来のＩｇＧ４抗体の半分の大きさでありＩｇＧ４抗体の二価結合性領域ではなく一価結合性領域を有する分子をもたらす。ＩｇＧ４抗体が不活性であり、それゆえ免疫系と相互作用しないことも、よく知られており、このことは、免疫応答が望まれない疾患の治療において有益であり得、この利点はユニボディに受け継がれている。例えば、ユニボディは、それに結合している細胞を阻害またはサイレンシングするが殺滅しないように機能し得る。加えて、がん細胞に結合しているユニボディはその増殖を刺激しない。しかも、ユニボディは従来のＩｇＧ４抗体のおよそ半分の大きさであるため、それは、潜在的に利点となる有効性を伴ってより大きな固形腫瘍の全てにわたってより良好な分布を示し得る。ユニボディは、完全ＩｇＧ４抗体と同程度の速度で体内から排出され、その抗原に完全抗体と同程度の親和性で結合することができる。ユニボディのさらなる詳細は、特許出願ＷＯ２００７／０５９７８２を参照することによって得られ得るが、参照によりその全体を本明細書に援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、アフィボディ及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。アフィボディ分子は、ブドウ球菌のプロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインの１つに由来する５８アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の類を表す。この３つのヘリックスバンドルドメインは、ファージディスプレイ技術を用いて所望の分子を標的とするアフィボディ変異体の選出がなされ得るコンビナトリアルファージミドライブラリー構築のための足場として使用されてきた（Ｎｏｒｄ Ｋ，Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ，Ｒｉｎｇｄａｈｌ Ｊ，Ｓｔａｈｌ Ｓ，Ｕｈｌｅｎ Ｍ，Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ Ａ，Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ａｎ α－ｈｅｌｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７；１５：７７２－７。Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ，Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ，Ｕｈｌｅｎ Ｍ，Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ Ａ，Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ（ＩｇＡ）－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２；２６９：２６４７－５５）。アフィボディ分子の単純で堅牢な構造は、その低い分子量（６ｋＤａ）と組み合わさってそれを多様な用途に、例えば、検出試薬として（Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ，Ｈａｒｍｏｎ Ｍ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｂｏｄｙ－Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２；２６１：１９９－２１１）、及び受容体相互作用を阻害するために（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ Ｋ，Ｘｕ Ｚ，Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｇ，Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ Ａ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２８－ＣＤ８０ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｂｙ ａ ＣＤ２８－ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００３；１６：６９１－７）適したものにする。アフィボディのさらなる詳細及びその生産方法は、米国特許第５，８３１，０１２号を参照することによって得られ得るが、参照によりその全体を本明細書に援用する。
いくつかの実施形態では、抗体、その抗原結合性断片または抗体模倣体は、標的細胞膜上に局在化したもしくは特定の組織に結び付いた細胞外分子（例えば、タンパク質、グリカン、脂質）に少なくとも約１×１０－４、１×１０－５、１×１０－６Ｍ、１×１０－７Ｍ、１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１２Ｍの、もしくはそれより高いＫｄで特異的に結合し得、及び／または非特異抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で抗原に結合し得る。そのような結合によって抗原媒介表面相互作用が生じ得る。しかしながら、結合性タンパク質が配列に関連性がある２つ以上の抗原に特異的に結合できる場合があることは、理解されるべきである。例えば、本発明の結合性ポリペプチドは、抗原のヒト及び非ヒト（例えばマウスまたは非ヒト霊長類）オーソログの両方に特異的に結合し得る。
いくつかの実施形態では、抗体、その抗原結合性断片または抗体模倣体は、ハプテンに結合し、それが今度は細胞外細胞表面タンパク質に特異的に結合する（例えば、細胞受容体を標的とするＣａｓ９－抗体－ハプテン）。
抗原と抗体との結合性または親和性、当技術分野で知られている様々な技術、例えば、限定されないが、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ＫｉｎＥｘＡ、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８；または放射免疫測定法（ＲＩＡ））を用いて、または表面プラズモン共鳴アッセイ、もしくは他の速度論に基づくアッセイの機序（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ．ＲＴＭ．分析、またはＯｃｔｅｔ．ＲＴＭ．分析（ｆｏｒｔｅＢＩＯ））、ならびに他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合的結合アッセイ 蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動及びクロマトグラフィー（例えばゲル濾過）によって決定され得る。これら及び他の方法は、検査しようとする成分の１つ以上に付けた標識を利用するもの、及び／または発色性、蛍光、発光もしくは同位体標識を含むがこれらに限定されない様々な検出方法を採用するものであってもよい。結合親和性及び速度論についての詳細な説明は、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）の中に見つかり得、これらは抗体－免疫原相互作用に着目している。競合的結合アッセイの一例は、漸増量の非標識抗原の存在下での標識抗原と関心対象の抗体とのインキュベーション、及び標識抗原に結合した抗体の検出を含む、放射免疫測定法である。特定の抗原に対する関心対象の抗体の親和性、及び結合解離速度は、ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット解析によるデータから決定され得る。二次抗体との競合も、放射免疫測定法を用いて決定され得る。この場合、抗原を、標識付けされた化合物に結合体化された関心対象の抗体と共に漸増量の非標識二次抗体の存在下でインキュベートする。
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、完全長抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン抗体、多重鎖もしくは一本鎖抗体、及び／または細胞外分子に特異的に結合する結合性断片、例えば、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ）、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、（代替軽鎖構築物を含む）サロボディ、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体などの形態であり得る。それらはまた、例えば、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）もしくはＩｇＭを含めた任意のアイソタイプ、またはそれに由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）である。
一実施形態では、抗体は、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ；ＣＤ４１）、アレムツズマブ（Ｌｅｍｔｒａｄａ、Ｃａｍｐａｔｈ；ＣＤ５２）、アブリルマブ（インテグリンα４β７）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、アレムツズマブ（Ｌｅｍｔｒａｄａ、Ｃａｍｐａｔｈ；ＣＤ５２）、アニフロルマブ（インターフェロンα／β受容体）、アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲ）、アプルツマブ（ＦＧＦＲ２）、アセリズマブ（Ｌ－セレクチンまたはＣＤ６２Ｌ）、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ；ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ；ＰＤ－Ｌ１）、アジンツキシズマブ（ＣＤ３１９）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ；ＣＤ２５）、ＢＣＤ－１００（ＰＤ－１）、ベクツモマブ（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ；ＣＤ２２）、ベランタマブ（ＢＣＭＡ）、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ；ＢＡＦＦ）、ベマリツズマブ（ＦＧＦＲ２）、ベンラリズマブ（Ｆａｓｅｎｒａ；ＣＤ１２５）、ベルサンリマブ（ＩＣＡＭ－１）、ビマグルマブ（ＡＣＶＲ２Ｂ）、ビバツズマブ（ＣＤ４４ ｖ６）、ブレセルマブ（ＣＤ４０）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ；ＣＤ１９）、ブロソズマブ（ＳＯＳＴ）、ブレンツキシマブ（Ａｄｃｅｎｔｒｉｓ；ＣＤ３０）、ブロンチクツズマブ（Ｎｏｔｃｈ１）、カビラリズマブ（ＣＳＦ１Ｒ）、カミダンルマブ（ＣＤ２５）、カムレリズマブ（ＰＤ－１）、カロツキシマブ（エンドグリン）、カツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ；ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セデリズマブ（ＣＤ４）、セミピリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ；ＰＣＤＣ１）、セトレリマブ（ＰＤ－１）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ；ＥＧＦＲ）、シビサタマブ（ＣＥＡＣＡＭ５）、シルムツズマブ（ＲＯＲ１）、シクスツムマブ（ＩＧＦ－１受容体、ＣＤ２２１）、クレノリキシマブ（ＣＤ４）、コルツキシマブ（ＣＤ１９）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ；ＣＤ２５）、ダロツズマブ（ＩＧＦ－１受容体、ＣＤ２２１）、ダピロリズマブペゴル（ＣＤ１５４、ＣＤ４０Ｌ）、ダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ；ＣＤ３８）、デムシズマブ（ＤＬＬ４）、デニンツズマブ（ＣＤ１９）、デパツキシズマブ（ＥＧＦＲ）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、ＤＳ－８２０１（ＨＥＲ２）、デリゴツズマブ（ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ３）、デュピルマブ（ＩＬ－４Ｒα）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ；ＰＤ－Ｌ１）、ドゥボルツキシズマブ（ＣＤ１９、ＣＤ３Ｅ）、エファリズマブ（ＣＤ１１ａ）、エルゲムツマブ（ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ３）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エマクツズマブ（ＣＳＦ１Ｒ）、エナポタマブ（ＡＸＬ）、エナバツズマブ（ＴＷＥＡＫ受容体）、エンリモノマブペゴル（ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５４）、エノブリツズマブ（ＣＤ２７６）、エノチクマブ（ＤＬＬ４）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルリズマブ（ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８）、エルツマキソマブ（Ｒｅｘｏｍｕｎ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（Ａｂｅｒｇｉｎ；インテグリンαｖβ３）、エチギリマブ（ＴＩＧＩＴ）、エトロリズマブ（インテグリンβ７）、エクスビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、ファノレソマブ（ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ；ＣＤ１５）、ファラリモマブ（インターフェロン受容体）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ、ＣＤ２０）、フィバツズマブ（エフリン受容体Ａ３）、フィジツムマブ（ＩＧＦ－１受容体、ＣＤ２２１）、フロテツズマブ（ＩＬ３受容体）、フォラルマブ（ＣＤ３イプシロン）、フツキシマブ（ＥＧＦＲ）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガンコタマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ガニツマブ（ＩＧＦ－１受容体、ＣＤ２２１）、ガビリモマブ（ＣＤ１４７、バイシジン）、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ；ＣＤ３３）、ゴミリキシマブ（ＣＤ２３、ＩｇＥ受容体）、イアナルマブ（ＢＡＦＦ－Ｒ）、イバリズマブ（Ｔｒｏｇａｒｚｏ；ＣＤ４）、ＩＢＩ３０８（ＰＤ－１）、イビリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ－１）、イファボツズマブ（ＥＰＨＡ３）、イラダツズマブ（ＣＤ９７Ｂ）、イムガツズマブ（ＥＧＦＲ）、インデュサツマブ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、イネビリズマブ（ＣＤ１９）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノリモマブ（ＣＤ２５）、イノツズマブ（Ｂｅｓｐｏｎｓａ；ＣＤ２２）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ；ＣＤ１５２）、イオマブ－Ｂ（ＣＤ４５）、イラツムマブｂ（ＣＤ３０）、イサツキシマブ（ＣＤ３８）、イスカリマブ（ＣＤ４０）、イスチラツマブ（ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ２２１）、イトリズマブ（Ａｌｚｕｍａｂ、ＣＤ６）、ケリキシマブ（ＣＤ４）、ラプリツキシマブ（ＥＧＦＲ）、レマレソマブ（ＮＣＡ－９０、顆粒球抗原）、レンベルビマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、レロンリマブ（ＣＣＲ５）、レキサツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、ロサツキシズマブ（ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ１、ＨＥＲ１）、リロトマブ（ＣＤ３７）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、リリルマブ（ＫＩＲ２Ｄ）、ロルボツズマブ（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルリズマブペゴル（ＣＤ２８）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３、ＩｇＥ受容体）、ルムレツズマブ（ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ３）、ルパルツマブ（ＬＹＰＤ３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、マルゲツキシマブ（ＨＥＲ２）、マスリモマブ（Ｔ細胞受容体）、マブリリムマブ（ＧＭＣＳＦ受容体α鎖）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、ミルベツキシマブ（葉酸受容体アルファ）、モドツキシマブ（ＥＧＦＲ受容体ドメインＩＩＩ）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モナリズマブ（ＮＫＧ２Ａ）、モスネツズマブ（ＣＤ３Ｅ、ＭＳ４Ａ１、ＣＤ２０）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ムロモナブ－ＣＤ３（ＣＤ３）、ナコロマブ（Ｃ２４２抗原）、ナラツキシマブ（ＣＤ３７）、ナルナツマブ（ＭＳＴ１Ｒ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ、インテグリンα４）、ナキシタマブ（ｃ－Ｍｅｔ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ネモリズマブ（ＩＬ３１ＲＡ）、ニモツズマブ（Ｔｈｅｒａｃｉｍ、Ｔｈｅｒａｌｏｃ；ＥＧＦＲ）、ニルセビマブ（ＲＳＶＦＲ）、ニボルマブ（ＰＤ－１）、オビヌツズマブ（ＣＤ２０）、オカラツズマブ（ＣＤ２０）、オクレリズマブ（ＣＤ２０）、オデュリモマブ（ＬＦＡ－１、ＣＤ１１ａ）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ－Ｒα）、オンブルタマブ（ＣＤ２７６）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オンツキシズマブ（ＴＥＭ１）、オンバチリマブ（ＶＳＩＲ）、オピシヌマブ（ＬＩＮＧＯ－１）、オテリキシズマブ（ＣＤ３）、オトレルツズマブ（ＣＤ３７）、オキセルマブ（ＯＸ－４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パチツマブ（ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ３）、ＰＤＲ００１（ＰＤ－１）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＰＤ－１）、ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピジリズマブ（ＰＤ－１）、ピナツズマブ（ＣＤ２２）、プロザリズマブ（ＣＣＲ２）、ポガリズマブ（ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー４）、ポラツズマブ（ＣＤ７９Ｂ）、プリリジマブ（ｐｒｉｌｉｚｉｍａｂ）（ＣＤ４）、ＰＲＯ１４０（ＣＣＲ５）、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ；ＶＥＧＦＲ２）、ラバガリマブ（ＣＤ４０）、レラトリマブ（ＬＡＧ３）、リヌクマブ（血小板由来成長因子受容体ベータ）、リツジマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ、Ｒｉｔｕｚａｎ；ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ－１受容体、ＣＤ２２１）、ロレデュマブ（ＲＨＤ）、ロベリズマブ（ＬｅｕｋＡｒｒｅｓｔ；ＣＤ１１、ＣＤ１８）、ロザノリキシズマブ（ＦＣＧＲＴ）、ルプリズマブ（Ａｎｔｏｖａ；ＣＤ１５４、ＣＤ４０Ｌ）、ＳＡ２３７（ＩＬ－６Ｒ）、サシツズマブ（ＴＲＯＰ－２）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、サムロタマブ（ＬＲＲＣ１５）、サトラリズマブ（ＩＬ６受容体）、セリバンツマブ（ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ３）、セトルスマブ（ＳＯＳＴ）、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ（ＣＤ１９）、ＳＨＰ６４７（粘膜アドレシン細胞接着分子）、シプリズマブ（ＣＤ２）、シルトラツマブ（ＳＬＩＴＲＫ６）、スパルタリズマブ（ＰＤＣＤ１、ＣＤ２７９）、スレソマブ（ＮＣＡ－９０、顆粒球抗原）、スプタブマブ（ＲＳＶＦＲ）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タドシズマブ（インテグリンαＩＩｂβ３） タラコツズマブ（ＣＤ１２３）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、タレキシツマブ（Ｎｏｔｃｈ受容体）、タボリマブ（ＣＤ１３４）、テリソツズマブ（ＨＧＦＲ）、テネリキシマブ（ＣＤ４０）、テポジタマブ（樹状細胞関連レクチン２）、テプロツモマブ（ＩＧＦ－１受容体、ＣＤ２２１）、テツロマブ（ＣＤ３７）、ＴＧＮ１４１２（ＣＤ２８）、チブリズマブ（ＢＡＦＦ）、チガツズマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、チミグツズマブ（ＨＥＲ２）、チラゴツマブ（ＴＩＧＩＴ）、チスレリズマブ（ＰＣＤＣ１、ＣＤ２７９）、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ、ＲｏＡｃｔｅｍｒａ；ＩＬ－６受容体）、トムゾツキシマブ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１）、トラリズマブ（ＣＤ１５４、ＣＤ４０Ｌ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ；ＣＤ２０）、トベツマブ（ＰＤＧＦＲＡ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、トラスツズマブ（Ｋａｄｃｙｌａ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、トレガリズマブ（ＣＤ４）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ４）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウロクプルマブ（ＣＸＣＲ４、ＣＤ１８４）、ウレルマブ（４－１ＢＢ、ＣＤ１３７）、ウトミルマブ（４－１ＢＢ、ＣＤ１３７）、バダスツキシマブタリリン（ＣＤ３３）、バナリマブ（ＣＤ４０）、バンチクツマブ（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体）、バルリルマブ（ＣＤ２７）、バテリズマブ（ＩＴＧＡ２、ＣＤ４９ｂ）、ベドリズマブ（Ｅｎｔｙｖｉｏ；インテグリンα４β７）、ベルツズマブ（ＣＤ２０）、ベセンクマブ（ＮＲＰ１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ；ＣＤ３）、ボバリリズマブ（ＩＬ６Ｒ）、ボロシキシマブ（インテグリンα５β１）、ボンレロリズマブ（ＣＤ１３４）、ボプラテリマブ（ＣＤ２７８、ＩＣＯＳ）、ＸＭＡＢ－５５７４（ＣＤ１９）、ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ－ＥＧＦｒ；ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（ＨｕＭａｘ－ＣＤ４；ＣＤ４）、ザツキシマブ（ＨＥＲ１）、ゼノクツズマブ（ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ３）、ジラリムマブ（ＣＤ１４７、ベイシジン）、ゾルベツキシマブ（クローディン１８アイソフォーム２）、ゾリモマブ（ＣＤ５）、３Ｆ８（ＧＤ２ガングリオシド）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アルツモマブ（Ｈｙｂｒｉ－ｃｅａｋｅｒ；ＣＥＡ）、アマツキシマブ（メソテリン）、アナツモマブマフェナトクス（ＴＡＧ－７２）、アネツマブ（ＭＳＬＮ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アトロリムマブ（Ｒｈｅｓｕｓ因子）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベシレソマブ（Ｓｃｉｎｔｉｍｕｎ；ＣＥＡ関連抗原）、カンツズマブ（ＭＵＣ１）、カプラシズマブ（Ｃａｂｌｉｖｉ；ＶＷＦ）、クリバツズマブテトラキセタン（ｈＰＡＭ４－Ｃｉｄｅ；ＭＵＣ１）、コドリツズマブ（グリピカン３）、クリザンリズマブ（セレクチンＰ）、クロテデュマブ（ＧＣＧＲ）、ジヌツキシマブ（Ｕｎｉｔｕｘｉｎ；ＧＤ２ガングリオシド）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エレザヌマブ（ＲＧＭＡ）、ｆガチポツズマブ（ｆｇａｔｉｐｏｔｕｚｕｍａｂ）（ＭＵＣ１）、グレムバツムマブ（ＧＰＮＭＢ）、イゴボマブ（Ｉｎｄｉｍａｃｉｓ－１２５；ＣＡ－１２５）、ＩＭＡＢ３６２（ＣＬＤＮ１８．２）、イマプレリマブ（ＭＣＡＭ）、インクラクマブ（セレクチンＰ）、インダツキシマブ（ＳＤＣ１）、ラベツズマブ（ＣＥＡ－Ｃｉｄｅ、ＣＥＡ）、リファスツズマブ（リン酸－ナトリウム共輸送体）、ミンレツモマブ（ＴＡＧ－７２）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モロリムマブ（Ｒｈｅｓｕｓ因子）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ－１２５）、パンコマ
ブ（ＭＵＣ１の腫瘍特異的グリコシル化）、ペムツモマブ（Ｔｈｅｒａｇｙｎ、ＭＵＣ１）、ラコツモマブ（Ｖａｘｉｒａ、ＮＧＮＡガングリオシド）、ラドレツマブ（フィブロネクチン細胞外ドメインＢ）、レファネズマブ（ミエリン関連糖タンパク質）、ソンツズマブ（エピシアリン）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２ガングリオシド）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ロンカスツキシマブ（ＣＤ１９）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、サツモマブペンデチド（ＴＡＧ－７２）、ソフィツズマブ（ＣＡ－１２５）、ソリトマブ（ＥｐＣＡＭ）、アビツズマブ（ＣＤ５１）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ；ＴＮＦ－α）、ブロダルマブ（Ｓｉｌｉｑ；ＩＬ－１７受容体）、セルグツズマブアムナロイキン（ＣＥＡ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ；ＴＮＦ－α）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ；ＴＮＦ－α）、バリサクマブ（ＶＥＧＦＲ２）、サリルマブ（Ｋｅｖｚａｒａ、ＩＬ－６Ｒ）、シルツキシマブ（Ｓｙｌｖａｎｔ；可溶性ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ）、またはアビシキシズマブ（ＤＬＬ４、ＶＥＧＦＡ）である。特異的抗体に関して上記文中に開示される細胞表面標的に対する抗体または抗原結合性タンパク質も、細胞表面上の標的、例えばＨＥＲ２として企図される。
他の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に使用され得る抗体は、内部移行すること及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）として有効であることが知られている抗体である。本明細書に記載のＴＡＧＥ剤に使用され得るそのような抗体の例としては、アネツマブ（メソテリン）、アオルツマブ（ＦＧＦＲ２）、アジンツキシズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、ベランタマブ（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ビバツズマブ（ＣＤ４４ｖ６）、ブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、カミダンルマブ（ＣＤ２５）、カンツズマブ（ＣａｎＡｇ）、カンツズマブ（ＣａｎＡｇ）、クリバツズマブ（ＭＵＣ１）、コフェツズマブ（ＰＴＫ７）、コルツキシマブ（ＣＤ１９）、デニンツズマブ（ＣＤ１９）、デパツキシズマブ（ＥＧＦＲ）、エナポタマブ（ＡＸＬ）、エンフォルツマブ（ネクチン－４）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、ゲムツズマブ（ＣＤ３３）、グレムバツムマブ（ＧＰＮＭＢ）、ヘルツズマブ（ＨＥＲ２）、イラダツズマブ（ＣＤ７９Ｂ）、インダツキシマブ（ＣＤ１３８）、インデュスツズマブ（ＧＣＣ）、イノツズマブ（ＣＤ２２）、ラベツズマブ（ＣＥＡ－ＣＡＭ４）、ラジラツズマブ（ＬＩＶ－１）、ラプリツキシマブ（ＥＧＦＲ）、リファスツズマブ（ＳＬＣ３４Ａ２）、ロンカスツキシマブ（ＣＤ１９）、ロルボツズマブ（ＣＤ５６）、ロサツキシマブ（ＥＧＦＲ）、ルパルツマブ（ＬＹＰＤ３）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミルベツキシマブ（ＰＳＭＡ）、ナラツキシマブ（ＣＤ３７）、ピナツズマブ（ＣＤ２２）、ポラツズマブ（ＣＤ７９Ｂ）、ロバルピツズマブ（ＤＬＬ３）、サシツズマブ（ＴＡＣＳＴＤ２）、サムロタマブ（ＬＲＲＣ１５）、シルトラツマブ（ＳＬＴＲＫ６）、ソフィツズマブ（ムチン１６）、テリソツズマブｂ（ｃ－Ｍｅｔ）、チソツマブ（ＴＦ）、トラスツズマブ（ＥＲＢＢ２）、バダスツキシマブ（ＣＤ３３）、バンドルツズマブ（ＳＴＥＡＰ１）、またはボルセツズマブ（ＣＤ７０）が挙げられるが、これらに限定されない。上記文中に言及される標的を指向する抗体も本明細書において企図される。有効なＡＤＣ標的であることが示されているさらなる細胞表面標的としては、ＫＡＡＧ－１、ＰＲＬＲ、ＤＬＫ１、ＥＮＰＰ３、ＦＬＴ３、ＡＤＡＭ－９、ＣＤ２４８、エンドセリン受容体ＥＴＢ、ＨＥＲ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＳＬＣ４４Ａ４、５Ｔ４、ＡＸＬ、Ｒｏｒ２、ＣＡ９、ＣＦＣ１Ｂ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＨＧＦＲ、ＣＸＣＲ４、ＴＩＭ－１、ＣＤ１６６、ＣＤ１６３、ＧＰＣ２、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ、葉酸受容体、ＦＸＹＤ５、ＣＤ２０、ＣＡ１２５、ＡＭＨＲＩＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤＨ－６、ＣＤ９８、ＳＡＩＬ、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、アルファ－Ｖインテグリン、ＣＤ１２３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１１７、ＦＧＦＲ、ＥｐｈＡ、ＣＤ２０５、ＣＤ２７６、ＣＤ９９、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＭＴＸ３、ＭＴＸ５、Ｐ－カドヘリン、ＳＳＴＲ２、ＥＦＮＡ４、Ｎｏｔｃｈ３、ＴＲＯＰ２、ガングリオシドＧＤ３、ＦＯＬＨ１、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＡ－ＣＡＭ５、ＬＡＭＰ１、Ｌｅ（ｙ）、ＣＤ３５２、ＥＲ－アルファ３６、ＳＴｎ、葉酸受容体アルファ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、ＣＤ３８、Ｈ－フェリチン、ＳＬｅＡ、ＮＫＡ、ＣＤ１４７、ＯＦＰ、ＳＬＩＴＲＫ５、エフリンＡ４、ＶＥＧＦＲ２、ＧＣＬ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、またはＮａＰｉ２ｂが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、完全長抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン抗体、多重鎖もしくは一本鎖抗体、及び／または細胞外分子に特異的に結合する結合性断片、例えば、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ）、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、（代替軽鎖構築物を含む）サロボディ、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体などの形態であり得る。それらはまた、例えば、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）もしくはＩｇＭを含めた任意のアイソタイプ、またはそれに由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）である。ある実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは多重特異性タンパク質、例えば多重特異性（例えば二重特異性）抗体である。
一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、細胞の細胞外細胞膜上の標的に結合する第１抗体からの第１抗原結合性部位、及び異なる結合特異性、例えば細胞の細胞外細胞膜上の第２標的に対する結合特異性を有する第２抗原結合性部位を含む、二重特異性分子、すなわち、第１及び第２抗原結合性部位が第１または第２抗原のどちらかとの結合に関して互いに交差遮断しない二重特異性抗体である。標的抗原の例は上に示されている。このように、ＴＡＧＥ剤が、２つの抗原、例えば本明細書に記載のもの、例えばＣＴＬＡ４とＣＤ４４とに結合する二重特異性分子を含むことが企図される。
例示的な二重特異性抗体分子には、（ｉ）片方が第１抗原に対する特異性を有しもう片方が第２標的に対する特異性を有する、結合体化し合った２つの抗体、（ｉｉ）第１抗原に対して特異的な１本の鎖またはアーム、及び第２抗原に対して特異的な第２の鎖またはアームを有する、単一の抗体、（ｉｉｉ）例えば追加のペプチドリンカーによって縦並びに繋げられた２つのｓｃＦｖを介して、第１抗原及び第２抗原に対する特異性を有する、一本鎖抗体、（ｉｖ）２つの可変ドメインが短いペプチドリンケージによって縦並びになったものを軽鎖及び重鎖が各々含有する、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－ＩｇＴＭ）Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））、（ｖ）化学的に繋げられた二重特異性（Ｆａｂ’）２断片、（ｖｉ）２本の一本鎖ダイアボディを融合させて得られた、標的抗原の各々に対する２つの結合性部位を有する四価二重特異性抗体である、Ｔａｎｄａｂ、（ｖｉｉ）ｓｃＦｖとダイアボディとを組み合わせて得られた多価分子であるフレキシボディ、（ｖｉｉｉ）Ｆａｂに対して適用した場合に２つの同一Ｆａｂ断片が異なるＦａｂ断片に連結されたものからなる三価二重特異性結合性タンパク質を生成することができるものであるプロテインキナーゼＡ中の「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドック・アンド・ロック」分子、（ｉｘ）例えばヒトＦｃ領域の両末端に融合された２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるサソリ型分子、ならびに（ｘ）ダイアボディが含まれる。
二重特異性抗体を調製するのに有用な基幹の例としては、ＢＩＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｆｃａｂ及びＭａｂ．ｓｕｐ．２（Ｆ－ｓｔａｒ）、Ｆｃ操作型ＩｇＧ１（Ｘｅｎｃｏｒ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
異なる部類の二重特異性抗体の例としては、分子の片側が少なくとも１つの抗体のＦａｂ領域またはＦａｂ領域の一部を含有し、分子のもう片側が少なくとも１つの他の抗体のＦａｂ領域またはＦａｂ領域の一部を含有する、非対称ＩｇＧ様分子が挙げられ、この部類においては、Ｆｃ領域にも非対称性が存在して分子の２つの部分の特異的なリンケージのために使用されることがあり得；また、分子が両側に各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂ領域またはＦａｂ領域の一部を含有する、対称ＩｇＧ様分子；完全長ＩｇＧ抗体が追加のＦａｂ領域またはＦａｂ領域の一部と融合した、ＩｇＧ融合分子；一本鎖Ｆｖ分子または安定化ダイアボディがＦｃガンマ領域またはその一部と融合した、Ｆｃ融合分子；異なるＦａｂ断片が融合し合った、Ｆａｂ融合分子；異なる一本鎖Ｆｖ分子または異なるダイアボディが互いに融合した、または別のタンパク質もしくは担体分子と融合した、ＳｃＦｖ及びダイアボディに基づく分子が挙げられるが、これらに限定されない。
非対称ＩｇＧ様分子の例としては、トリオマブ／クアドローマ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ノブ・イントゥ・ホール（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、及び静電整合体（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、鎖交換操作型ドメイン体（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）及びＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
対称ＩｇＧ様分子の例としては、二重指向性（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、ツーインワン抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸボディ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＩｇＧ融合分子の例としては、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ならびにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｆｃ融合分子の例としては、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合体（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、二重親和性指向先変更技術（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及び二重（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－中国）が挙げられるが、これらに限定されない。
クラスＶ二重特異性抗体の例としては、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ａｍｇｅｎ）、Ｄｕａｌ－ＡｃｔｉｏｎまたはＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、二価二重特異体（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ及びダイアボディに基づく分子の例としては、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性指向先変更技術（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭ ＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得る抗体、抗原結合性断片または抗体模倣体には、上記抗体及びその抗原結合性断片、ならびに上記の非ヒト抗体及びその抗原結合性断片のヒト化変異体、ならびに例えば競合的抗原結合アッセイによって評価したとき上記と同じエピトープに結合する抗体または抗原結合性断片が含まれる。
本明細書に記載の抗体または結合性断片はまた、抗体及び／または断片の特性を変化させる改変及び／または突然変異を含んでいてもよい。抗体を操作する方法は、当技術分野でよく知られている任意の改変を含む。これらの方法としては、抗体または抗体の少なくとも定常領域をコードする調製されたＤＮＡ分子の、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発及びカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。部位特異的変異誘発は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４４３１－４４４３（１９８５）、及びＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８（１９８７）を参照されたい）。ＰＣＲ変異誘発は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作るのにも適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７－１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）、及びＶａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７２３－７３３（１９８９）を参照されたい。配列変異体を調製するための別の方法であるカセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５－３２３（１９８５）によって記載される技術に基づいている。
抗体またはその断片は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組換え方法及び組成物を用いて生産され得る。一実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのそのような実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクター、を含む（例えばそれで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は真核性、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＣＬＬ－１抗体を作る方法であって、上に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に適した条件の下で培養すること、及び任意選択的に抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、当該方法が提供される。
抗体（または抗体断片）を組換えによって生産するには、例えば上記のような抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／または発現のために１つ以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離及び配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適する宿主細胞としては、本明細書に記載の原核または真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、とりわけグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照されたい（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について記載したＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）。発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離され得、さらに精製され得る。
脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で成長するように適合させた哺乳動物細胞株が有用となり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓細胞株（２９３または２９３細胞、例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載のもの）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４細胞、例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるもの）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載のもの；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体生産に適する特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
抗体模倣体
ＴＡＧＥ剤は、関心対象の抗原に結合することができる抗体模倣体を含み得る。以下に詳述されるように、多様な抗体断片及び抗体模倣体技術が開発されており、当技術分野で公知である。総じて本明細書に記載の抗体模倣体は、構造的に抗体との関係がなく、アドネクチン、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、バーサボディ、アプタマー及びＳＭＩＰＳを含む。抗体模倣体は、従来の抗体結合を模倣しながらも別個の機序によって生成及び機能する結合性構造を用いる。これらの代替構造のいくつかは、Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｄａｍｌｅ（２００６）１７：６５３－６５８の中で総説されている。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、アドネクチン分子及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。アドネクチン分子は、フィブロネクチンタンパク質の１つ以上のドメインに由来する操作された結合性タンパク質である。フィブロネクチンは人体に天然に存在する。それは、細胞外マトリックス中に不溶性糖タンパク質二量体として存在し、リンカータンパク質としての役割も果たす。それは血漿中にジスルフィドで繋げられた二量体として可溶性形態でも存在する。血漿形態のフィブロネクチンは、肝臓細胞（肝細胞）によって合成され、ＥＣＭ形態は、軟骨細胞、マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞、及び上皮のいくつかの細胞によって作られる。先に述べたとおり、フィブロネクチンは、天然では細胞接着分子として機能し得、またはそれは細胞外マトリックス中で接点を作ることによって細胞の相互作用を媒介し得る。典型的には、フィブロネクチンは、３つの異なるタンパク質モジュール、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型モジュールで作られている。フィブロネクチンの機能の構造の総説については、Ｐａｎｋｏｖ ａｎｄ Ｙａｍａｄａ（２００２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．；１１５（Ｐｔ ２０）：３８６１－３、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ（２００２）２１：１１５－１２８、及びＬｕｃｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ Ｃｌｉｎ．４８：２４９－２６２を参照されたい。
一実施形態では、アドネクチン分子は、２つのベータシートの間に分布する複数のベータストランドからなる天然タンパク質を変化させることによってフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインから得られる。フィブロネクチンは、それを得る元となった組織に応じて、例えば１Ｆｎ３、２Ｆｎ３、３Ｆｎ３などと表され得る複数のＩＩＩ型ドメインを含有し得る。１０Ｆｎ３ドメインは、インテグリン結合性モチーフを含有し、さらに、ベータストランド同士を連結している３つのループを含有する。これらのループは、ＩｇＧ重鎖の抗原結合性ループに相当するものと考えることができ、以下に述べる方法によってそれらを関心対象の標的に特異的に結合するように変化させてもよい。好ましくは、本発明の目的のために有用となるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ、ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）から受託コード１ｔｔｇで入手され得るフィブロネクチンＩＩＩ型分子の構造をコードする配列との少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を呈する配列である。また、アドネクチン分子を、単純な単量体型１０Ｆｎ３構造ではなく１０Ｆｎ３関連分子のポリマーから得てもよい。
天然１０Ｆｎ３ドメインはインテグリンに結合するのが典型的であるが、アドネクチン分子となるのに適合した１０Ｆｎ３タンパク質は、関心対象の抗原に結合するような変更がなされている。一実施形態では、１０Ｆｎ３分子に対する変更は、ベータストランドに対する少なくとも１つの突然変異を含む。好ましい実施形態では、１０Ｆｎ３分子のベータストランド同士を連結しているループ領域を、関心対象の抗原に結合するように変化させる。
１０Ｆｎ３における変更は、エラープローンＰＣＲ、部位特異的変異誘発、ＤＮＡシャフリングまたは本明細書中で言及される他の種類の組換え変異誘発を含むがこれらに限定されない当技術分野で知られている任意の方法によってなされ得る。一例を挙げると、１０Ｆｎ３配列をコードするＤＮＡの変異体を試験管内で直接合成し、後に試験管内または生体内で転写及び翻訳してもよい。あるいは、標準的な（例えば米国特許出願第２００７００８２３６５号の中で実施されているような）方法を用いて天然１０Ｆｎ３配列をゲノムから単離またはクローニングし、その後、当技術分野で知られている変異誘発法を用いて突然変異させてもよい。
一実施形態では、標的抗原を固体担体、例えば、カラム樹脂、またはマイクロタイタープレート内のウェルの上に固定化してもよい。その後、標的を潜在的結合性タンパク質のライブラリーと接触させる。ライブラリーは、１０Ｆｎ３配列の変異誘発／ランダム化によってまたは（ベータストランドではなく）１０Ｆｎ３ループ領域の変異誘発／ランダム化によって野生型１０Ｆｎ３から得られた１０Ｆｎ３クローンまたはアドネクチン分子を含み得る。好ましい実施形態では、ライブラリーは、Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，２５８，５５８号及び第６，２６１，８０４号、Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ．のＷＯ９８９／３１７００、ならびにＲｏｂｅｒｔｓ ＆Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）９４：１２２９７－１２３０２に記載される技術によって生成されたＲＮＡ－タンパク質融合体ライブラリーであり得る。ライブラリーはまた、ＤＮＡ－タンパク質ライブラリー（例えば、Ｌｏｈｓｅの米国特許第６，４１６，９５０号及びＷＯ００／３２８２３に記載されているもの）であってもよい。次いで、融合ライブラリーを固定化標的抗原と共にインキュベートし、固体担体を洗浄して非特異的結合性部分を除去する。その後、ストリンジェントな条件の下で強固な結合剤を溶離させ、ＰＣＲを用いて遺伝情報を増幅するか、または結合性分子の新たなライブラリーを作り出して（さらなる変異誘発を伴うまたは伴わない）プロセスを繰り返す。選択／変異誘発プロセスは、標的に対する十分な親和性を有する結合剤が得られるまで繰り返され得る。本発明に使用するためのアドネクチン分子は、Ａｄｎｅｘｕｓ，ａ Ｂｒｉｓｔｏｎ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ ｃｏｍｐａｎｙによって採用されているＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）技術を用いて操作され得る。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ技術は、上に言及される技法（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＆Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）９４：１２２９７－１２３０２）に基づいて生み出された。変化させた１０Ｆｎ３ドメインのライブラリーを生成し、本発明と共に使用され得る適切な結合剤を選択する方法は、以下の米国特許及び特許出願文書に十分な記載がなされており、参照によりそれらを本明細書に援用する：米国特許第７，１１５，３９６号、第６，８１８，４１８号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３号、第７，１９５，８８０号、第６，４１６，９５０号、第６，２１４，５５３号、第６６２３９２６号、第６，３１２，９２７号、第６，６０２，６８５号、第６，５１８，０１８号、第６，２０７，４４６号、第６，２５８，５５８号、第６，４３６，６６５号、第６，２８１，３４４号、第７，２７０，９５０号、第６，９５１，７２５号、第６，８４６，６５５号、第７，０７８，１９７号、第６，４２９，３００号、第７，１２５，６６９号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３号、ならびに米国特許出願第２００７００８２３６５号、第２００５０２５５５４８号、第２００５００３８２２９号、第２００３０１４３６１６号、第２００２０１８２５９７号、第２００２０１７７１５８号、第２００４００８６９８０号、第２００４０２５３６１２号、第２００３００２２２３６号、第２００３００１３１６０号、第２００３００２７１９４号、第２００３００１３１１０号、第２００４０２５９１５５号、第２００２０１８２６８７号、第２００６０２７０６０４号、第２００６０２４６０５９号、第２００３０１００００４号、第２００３０１４３６１６号及び第２００２０１８２５９７号。１０Ｆｎ３などのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインにおける多様性の生成とその後の選択工程は、当技術分野で知られている他の方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または酵母表面ディスプレイ、例えば、Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６８：１０２４－１０４１、Ｓｅｒｇｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．５８：１６２２－１６５４、Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：７－１５、Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．６：１７７－１８７、及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５－１１１６を用いて成し遂げられてもよい。
上に引用される方法の参考文献が、好ましい１０Ｆｎ３ドメイン以外のタンパク質から抗体模倣体を得るために使用されてもよいことは、当業者に理解されるべきである。上に言及される方法によって抗体模倣体を生成するために使用され得るさらなる分子としては、ヒトフィブロネクチンモジュール１Ｆｎ３～９Ｆｎ３、及び１１Ｆｎ３～１７Ｆｎ３、ならびに非ヒト動物及び原核生物からの関連するＦｎ３モジュールが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、１０Ｆｎ３との配列相同性を有する、他のタンパク質、例えばテネイシン及びウンデュリンからのＦｎ３モジュールを使用してもよい。免疫グロブリン様フォールドを有する（しかし、ＶＨドメインとの関係がない配列を有する）他の例示的なタンパク質としては、Ｎ－カドヘリン、ＩＣＡＭ－２、ティティン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、Ｅ－カドヘリン、及び抗生色素タンパク質が挙げられる。関係する構造を有するさらなるドメインは、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、Ｉ型ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、ＶＣＡＭ－１のＣ２及びＩセットドメイン、ミオシン結合性プロテインＣのＩセット免疫グロブリンフォールド、ミオシン結合性プロテインＨのＩセット免疫グロブリンフォールド、テロキンのＩセット免疫グロブリンフォールド、テリキン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、ＧＣ－ＳＦ受容体、インターフェロンガンマ受容体、ベータ－ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、及びトランスグルタミナーゼから得られ得る。あるいは、１つ以上の免疫グロブリン様フォールドを含む他の任意のタンパク質を利用してアドネクチン様結合性部分を作り出してもよい。そのようなタンパク質は、例えば、プログラムＳＣＯＰ（Ｍｕｒｚｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：５３６（１９９５）、Ｌｏ Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５７（２０００）を用いて同定され得る。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、アプタマー及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。本明細書に開示される組成物及び方法に使用される「アプタマー」は、ペプチドかヌクレオチドかのどちらかから作られたアプタマー分子を含む。ペプチドアプタマーは、多くの特性がヌクレオチドアプタマーと共通しており（例えば、大きさが小さいこと、及び標的分子に高い親和性で結合する能力）、それらは、ヌクレオチドアプタマーを生成するために用いられるものと原理が類似している選択方法、例えば、参照により本明細書に援用されるＢａｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃｏｌａｓ．２００６．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．１１（７－８）：３３４－４１、及びＢｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１（３）：１０６６－９１によって生成され得る。
ある実施形態では、アプタマーは、特定の分子標的に結合する小さなヌクレオチドポリマーである。アプタマーは一本鎖または二本鎖核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得るが、但し、ＤＮＡ系アプタマーは最も一般的には二本鎖である。アプタマー核酸に決まった長さはないが、最も一般的にはアプタマー分子の長さは１５～４０ヌクレオチドである。
アプタマーは、標的分子に対するその親和性を決定付ける複雑な三次元構造を形成することが多い。アプタマーは、主にそれが試験管内で全体的に操作及び増幅され得るものであるがために、単純な抗体に勝る多くの利点を提供し得る。しかも、アプタマーは免疫応答をほとんどまたは全く引き起こさないことが多い。
アプタマーは、様々な技術を用いて生成され得るが、当初は試験管内での選択（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ．３４６（６２８７）：８１８－２２）及びＳＥＬＥＸ法（指数的濃縮によるリガンドの体系的進化）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２８（３）：８６２－９）を用いて開発され、参照によりそれらの内容を本明細書に援用する。アプタマーを作り使用するための他の方法は、Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ．Ｔｈｅ Ａｐｔａｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＩＳＢＮ：９７８－３－５２７－３１０５９－３、Ｕｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ ９（８）：６１９－３２、Ｃｅｒｃｈｉａ ａｎｄ ｄｅ Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｓ．２００７．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３６１：１８７－２００、Ｉｒｅｓｏｎ ａｎｄ Ｋｅｌｌａｎｄ．２００６．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００６ ５（１２）：２９５７－６２、米国特許第５，５８２，９８１号、第５，８４０，８６７号、第５，７５６，２９１号、第６，２６１，７８３号、第６，４５８，５５９号、第５，７９２，６１３号、第６，１１１，０９５号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２００７０００９４７６Ａ１号、米国出願第ＵＳ２００５０２６０１６４Ａ１号、米国特許第７，９６０，１０２号及び米国公開第ＵＳ２００４０１１０２３５Ａ１号を含めて公開されており、参照によりそれらを全て本明細書に援用する。
ＳＥＬＥＸ法は、明らかに最もよく知られており、３つの基礎工程で行われる。第１に、特定の分子標的に対する結合性のための、候補核酸分子のライブラリーの選択を行う。第２に、標的に対する十分な親和性を有する核酸を非結合剤から分離する。第３に、結合した核酸を増幅し、第２ライブラリーを形成し、プロセスを繰り返す。繰返しの度に標的分子に対するますます高い親和性を有するアプタマーが選択される。ＳＥＬＥＸ法は、以下の刊行物においてより十分な記載がなされており、参照によりそれらを本明細書に援用する：Ｂｕｇａｕｔ ｅｔ ａｌ．２００６．４（２２）：４０８２－８、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ．２００７ ２４（４）：３８１－４０３、及びＧｏｐｉｎａｔｈ．２００７．Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２００７．３８７（１）：１７１－８２。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、ＤＡＲＰｉｎ及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能力を活用するために開発された抗体模倣ＤＲＰ（設計された反復タンパク質）技術の一例である。反復タンパク質、例えばアンキリンまたはロイシンリッチ反復タンパク質は、遍在する結合性分子であり、抗体とは違って細胞内及び細胞外に出現する。それらの独特なモジュール式の構成様式は、繰り返す構造単位（反復）を特徴としており、これらが重なり合って、可変なモジュール式の標的結合性表面を現出する細長い反復ドメインを形成している。このモジュール性に基づいて、高度に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーが生成され得る。この方策は、可変な表面残基を現出する自己適合性反復の共通な設計、及びそれらの反復ドメインへのランダムな組立てを含む。
ＤＡＲＰｉｎは細胞発現システムにおいて非常に高い収量で生産され得、それは、知られている最も安定したタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルス及び膜タンパク質を含めた広範な標的タンパク質に対する高度に特異的な高親和性ＤＡＲＰｉｎが選抜された。一桁のナノモルからピコモルまでの範囲の親和性を有するＤＡＲＰｉｎを得ることができる。
ＤＡＲＰｉｎは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップ用途、親和性精製またはウェスタンブロッティングを含めた多様な用途に使用されている。ＤＡＲＰｉｎはまた、細胞内区画において、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合した細胞内マーカータンパク質として、高活性であることも証明された。さらに、ＤＡＲＰｉｎは、ｐＭ範囲のＩＣ５０でウイルス侵入を阻害するために使用された。ＤＡＲＰｉｎは、タンパク質－タンパク質相互作用を遮断するのに理想的であるだけでなく、酵素も阻害する。プロテアーゼ、キナーゼ及び輸送体は、ほとんどの場合アロステリック阻害様式で、成功裏に阻害された。腫瘍上での非常に速く特異的な濃縮、及び非常に好都合な腫瘍対血液比がＤＡＲＰｉｎを生体内診断または治療手法によく適したものにしている。
ＤＡＲＰｉｎ及び他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号及び国際特許出願公開第ＷＯ０２／２０５６５号の中に見出すことができ、これをもって参照によりそれらの両方の全体を援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、アンチカリン及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。アンチカリンは別の抗体模倣体技術であるが、この場合の結合特異性は、ヒト組織及び体液において天然に豊富に発現する低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、化学的に感受性または不溶性である化合物の生理学的輸送及び貯蔵に関連した生体内での様々な機能を行うように進化した。リポカリンは、タンパク質の片方の末端において４つのループを支持する高度に保存されたβバレルを含む堅牢な固有の構造を有する。これらのループは、結合ポケットへの入口を形成し、分子のこの部分における立体配座の違いが別個のリポカリンの結合特異性の変動をもたらしている。
保存されたβシートフレームワークによって支持された超可変ループの全体構造は免疫グロブリンを連想させるが、リポカリンは、大きさの点で抗体とはかなり異なっており、単一の免疫グロブリンドメインよりもやや大きい１６０～１８０アミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなる。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、リポカリン及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。アンチカリンを作り出すためには、リポカリンをクローニングし、それらのループを操作に供する。構造的に多様なアンチカリンのライブラリーが生成されたことがあり、アンチカリンディスプレイは、結合機能の選抜及びスクリーニング、ならびにその後の原核生物または真核生物システムにおけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現及び生産を可能にする。試験は、事実上いかなるヒト標的タンパク質に対しても特異的なアンチカリンを開発でき単離できること、及びナノモルまたはそれより高い範囲の結合親和性を得ることができることを成功裏に実証した。
アンチカリンを二重指向性タンパク質、いわゆるデュオカリンとして構成することもできる。デュオカリンは、その２つの結合性ドメインの構造的配向に関係なく標的特異性及び親和性を保持しながら標準的な製造プロセスを用いて簡単に生産される単量体タンパク質１つで、２つの別個の治療標的と結合する。
単一の分子による複数の標的の調節は、１つよりも多くの原因因子が関与することが知られている疾患において特に有益である。さらに、デュオカリンのような二価または多価結合形式は、細胞表面受容体の結合及び密集によってシグナル伝達経路に対するアゴニスト作用を媒介するかまたは増強された内部移行作用を誘導するので、疾患において細胞表面分子を指向する顕著な潜在能力を有している。さらに、デュオカリンの固有の高い安定性は単量体アンチカリンに匹敵し、柔軟な製剤化及び送達の可能性をデュオカリンにもたらしている。
アンチカリンに関するさらなる情報は、米国特許第７，２５０，２９７号及び国際特許出願公開第ＷＯ９９／１６８７３号の中に見出すことができ、これをもって参照によりそれらの両方の全体を援用する。
本発明の文脈で有用となる別の抗体模倣体技術は、アビマーである。アビマーは、結合及び阻害特性を有する多重ドメインタンパク質を生成する試験管内でのエクソンシャフリング及びファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーから進化したものである。複数の独立した結合性ドメインを繋ぐことは、結合力を生み出し、従来の単一エピトープ結合性タンパク質に比べて改善された親和性及び特異性をもたらすことが示された。他の潜在的利点としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける多重標的特異性分子の単純かつ効率的な産生、改善された熱安定性及びプロテアーゼに対する耐性が挙げられる。様々な標的に対してナノモル未満の親和性を有するアビマーが得られている。
アビマーに関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００６／０２８６６０３号、第２００６／０２３４２９９号、第２００６／０２２３１１４号、第２００６／０１７７８３１号、第２００６／０００８８４４号、第２００５／０２２１３８４号、第２００５／０１６４３０１号、第２００５／００８９９３２号、第２００５／００５３９７３号、第２００５／００４８５１２号、第２００４／０１７５７５６号の中に見出すことができ、これをもって参照によりそれら全ての全体を援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、バーサボディ及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。バーサボディは、本発明の文脈で使用されることもあり得る別の抗体模倣体技術である。バーサボディは、システインが１５％を上回ってこれが高いジスルフィド密度の足場を形成して典型的なタンパク質が有する疎水性コアを置き換えている３～５ｋＤａの小さなタンパク質である。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸を少数のジスルフィドで置き換えることで、より小さく、親水性がより高く（凝集及び非特異的結合がより少なく）、プロテアーゼ及び熱に対する耐性がより高く、Ｔ細胞エピトープの密度がより低くなる、というのも、ＭＨＣ提示に最も大きく寄与する残基は疎水性であるからである。これら４つの特性は全て、免疫原性に影響することがよく知られており、それらは一緒になって免疫原性の大幅な低下をもたらすと期待される。
バーサボディに対するひらめきは、予想外に低い免疫原性を呈することが知られているヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ及びアネモネによって産生される天然の注射可能なバイオ医薬品から来ている。設計及びスクリーニングによって選択された天然のタンパク質ファミリーから出発して、大きさ、疎水性、タンパク質分解的抗原プロセシング及びエピトープ密度は、天然の注射可能タンパク質の平均をはるかに下回るレベルにまで最小化される。
バーサボディの構造を前提として、これらの抗体模倣体は、多価、多重特異性、半減期機序の多様性、組織指向モジュール、及び抗体Ｆｃ領域の非存在を含めた多目的形式を提供する。さらに、バーサボディはＥ．ｃｏｌｉにおいて高収量で製造され、その親水性、及び大きさが小さいことゆえに、バーサボディは溶解性が高く、高濃度に製剤化されることができる。バーサボディは、並外れて耐熱性であり（煮沸されることができ）、延長された貯蔵寿命を提供する。
バーサボディに関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２号の中に見出すことができ、これをもって参照によりその全体を援用する。
一実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、ＳＭＩＰ及び部位特異的改変性ポリペプチドを含む。ＳＭＩＰ（商標）（小モジュール免疫薬－Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、標的との結合性、エフェクター機能、生体内での半減期及び発現レベルを維持及び最適化するように操作されている。ＳＭＩＰは、３つの別個なモジュールドメインからなる。第１に、それは、特異性を付与する任意のタンパク質（例えば、細胞表面受容体、一本鎖抗体、可溶性タンパク質など）からなり得る結合性ドメインを含有する。第２に、それは、結合性ドメインとエフェクタードメインとの間の柔軟なリンカーとしての役割を果たすとともにＳＭＩＰ薬の多量体化を制御するのに役立つヒンジドメインを含有する。最後に、ＳＭＩＰは、Ｆｃドメインまたは他の特別に設計されたタンパク質を含めた様々な分子に由来し得るエフェクタードメインを含有する。デザインのモジュール性は、多様な結合性、ヒンジ及びエフェクタードメインを有するＳＭＩＰの単純な構築を可能にし、高速かつカスタマイズ可能な薬物デザインをもたらす。
ＳＭＩＰに関するさらなる情報は、その設計の仕方の例を含めて、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ １１０：２５６９－７７、ならびに以下の米国特許出願第２００５０２３８６４６号、第２００５０２０２５３４号、第２００５０２０２０２８号、第２００５０２０２０２３号、第２００５０２０２０１２号、第２００５０１８６２１６号、第２００５０１８０９７０号及び第２００５０１７５６１４号の中に見出され得る。
上に提供される抗体断片及び抗体模倣体技術の詳細な説明は、本明細書の文脈で用いられることがあり得る全ての技術の包括的な掲載を意図したものではない。例えば、また限定はしないが、代替となるポリペプチドベースの技術、例えば、これをもって参照により全体が援用されるＱｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（８）９２１－９２９（２００７）の中で概説されているような相補性決定領域の融合体、及び核酸ベースの技術、例えば、これをもって参照により全てが援用される米国特許第５，７８９，１５７号、第５，８６４，０２６号、第５，７１２，３７５号、第５，７６３，５６６号、第６，０１３，４４３号、第６，３７６，４７４号、第６，６１３，５２６号、第６，１１４，１２０号、第６，２６１，７７４号及び第６，３８７，６２０号に記載されるＲＮＡアプタマー技術を含めた様々な付加的技術を、本発明の文脈で用いることがあり得る。
ＴＡＧＥ剤構築物
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、Ｎ末端からＣ末端に向かう順に、抗原結合性ポリペプチド及び部位特異的改変性ポリペプチド（例えばＣａｓ９）を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、Ｎ末端からＣ末端に向かう順に、部位特異的改変性ポリペプチド（例えばＣａｓ９）及び抗原結合性ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、Ｎ末端からＣ末端に向かう順に、部位特異的改変性ポリペプチド（例えばＣａｓ９）、２つの核局在化シグナル（例えば、２ｘ ＳＶ４０ ＮＬＳ）、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む。例えば、ＴＡＧＥ剤は、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ構築物を含み得、これが今度は、ＳｐｙＴａｇに連結された抗原結合性ポリペプチドに結合体化され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、Ｎ末端からＣ末端に向かう順に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、部位特異的改変性ポリペプチド（例えばＣａｓ９）、及び２つの核局在化シグナル（例えば、２ｘ ＳＶ４０ ＮＬＳ）を含む。例えば、ＴＡＧＥ剤は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ構築物を含み得、これが今度は、ＳｐｙＴａｇに連結された抗原結合性ポリペプチドに結合体化され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、Ｎ末端からＣ末端に向かう順に、表１から選択されるペプチドリンカー（例えば遺伝子融合体）または化学リンカーによって繋がり合った一連のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、表１に示される構築物は、示されたポリペプチドの間の１つ以上のペプチドリンカーをさらに含む。ある実施形態では、表１に示される構築物は、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ切断部位に相当するペプチド配列をさらに含む。
（表１）ＴＡＧＥ剤またはその断片の例
Figure 2022524221000002
Figure 2022524221000003
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、第１の一連のポリペプチド（例えば、第１の遺伝子融合体、例えば、表１から選択される融合体）及び第２の一連のポリペプチド（例えば、第２の遺伝子融合体、例えば、表１から選択される融合体）を含み、第１及び第２の遺伝子融合体が、非共有結合様式または共有結合様式で、例えば相補的結合体化部分、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／Ｓｐｙｔａｇ、またはＨａｌｏ／Ｈａｌｏ－Ｔａｇ、またはリガンドを介して、安定して結び付いている）。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥは、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳに結合体化された、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）抗体－ＳｐｙＴａｇ融合体を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥは、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ）２に結合体化された、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）抗体－ＳｐｙＴａｇ融合体を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥは、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－４ｘＮＬＳに結合体化された、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）抗体－ＳｐｙＴａｇ融合体を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥは、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮに結合体化された、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）抗体－ＳｐｙＴａｇ融合体を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥは、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）４ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳに結合体化された、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）抗体－ＳｐｙＴａｇ融合体を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥは、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）ＨＴＮ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳに結合体化された、（Ｎ末端からＣ末端に向かう順に）抗体－ＳｐｙＴａｇ融合体を含む。
ＩＩＩ．使用方法
本明細書に記載のＴＡＧＥ剤を使用して標的細胞のゲノムを改変することができる。方法は、少なくとも部位特異的改変性ポリペプチドが細胞内に内部移行してその後に標的細胞のゲノム（または標的核酸）を改変するように、標的細胞を本明細書に開示されるＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。そのような方法は、ゲノムの改変をそれを必要とする対象において行うことが疾患または障害の治療をもたらす治療的用途の場合を含めて試験管内環境、生体外または生体内で用いられ得る。
本明細書に記載のＴＡＧＥ剤は、関心対象の抗原を現出している任意の細胞に部位特異的改変性ポリペプチドを指向するために使用され得る。細胞は、哺乳動物細胞を含むがこれに限定されない真核細胞であり得る。本発明のＴＡＧＥ剤によって標的とされ得る（そしてゲノムの改変を受け得る）哺乳動物細胞の例としては、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞またはヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
ＴＡＧＥ剤は、ある場合には、特定の細胞種、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば活性化Ｔ細胞）、線維芽細胞または他の細胞を生体外または生体内で編集するために使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞である。ある実施形態では、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）またはエフェクターＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は腫瘍浸潤Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、マクロファージは、Ｍ０、Ｍ１またはＭ２マクロファージである。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、造血幹細胞、造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば活性化Ｔ細胞）及び線維芽細胞から選択される複数（例えば２つ以上）の細胞種を編集するために使用される。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＣＰＰをさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＣＰＰをさらに含み、方法は、マクロファージ（例えばヒトマクロファージ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＣＰＰをさらに含み、方法は、ＨＳＣ（例えばヒトＨＳＣ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＣＰＰを含み、方法は、対象の骨髄の中の細胞をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞（例えば、線維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、破骨細胞または内皮細胞）ではない。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は少なくとも４つのＮＬＳをさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は少なくとも４つのＮＬＳをさらに含み、方法は、マクロファージ（例えばヒトマクロファージ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＣＰＰをさらに含み、方法は、ＨＳＣ（例えばヒトＨＳＣ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は少なくとも６つのＮＬＳをさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は少なくとも４つのＮＬＳをさらに含み、方法は、マクロファージ（例えばヒトマクロファージ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は少なくとも６つのＮＬＳをさらに含み、方法は、ＨＳＣ（例えばヒトＨＳＣ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は少なくとも６つのＮＬＳを含み、方法は、線維芽細胞（例えばヒト線維芽細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＮＬＳ（ＨＴＮ）ペプチドをさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＨＴＮペプチドをさらに含み、方法は、マクロファージ（例えばヒトマクロファージ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＨＴＮペプチドをさらに含み、方法は、ＨＳＣ（例えばヒトＨＳＣ）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＨＴＮペプチドを含み、方法は、対象の骨髄の中の細胞をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞（例えば、線維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、破骨細胞または内皮細胞）ではない。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤はＨＴＮペプチドをさらに含み、方法は、線維芽細胞（例えばヒト線維芽細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗体をさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗体を含み、方法は、マクロファージ（例えばヒトマクロファージ）をＴＡＧＥ剤と接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗体を含み、方法は、ＨＳＣ（例えばヒトＨＳＣ）をＴＡＧＥ剤と接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗体をさらに含み、方法は、線維芽細胞（例えばヒト線維芽細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＦＡＰ抗体をさらに含み、方法は、線維芽細胞（例えばヒト線維芽細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＴＬＡ－４抗体をさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ２５抗体をさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は抗ＣＤ１１ａ抗体をさらに含み、方法は、Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞）をＴＡＧＥ剤と接触させることを含む。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤の部位特異的改変性ポリペプチドは、標的細胞のゲノムの標的領域に切断部位を作り出し、続いて細胞のゲノムを改変してゲノム発現に影響を与える。このように、一実施形態では、ゲノムの標的領域は標的遺伝子である。標的細胞のゲノムを改変する部位特異的改変性ポリペプチドの能力は、ある実施形態では、標的遺伝子の発現を改変する道を提供する。標的核酸、例えば遺伝子の発現レベルは標準的な方法によって決定することができるが、ある状況では、本明細書に開示される方法は、標的遺伝子の発現を基準レベルよりも高くするのに有効である。あるいは、他の状況では、本明細書に開示される方法は、標的遺伝子の発現を基準レベルよりも低くすることができる。基準レベルは、非特異的ガイドＲＮＡ／部位特異的改変性ポリペプチドを使用する標準的なアッセイにおいて決定され得るが、この場合、標的核酸、例えば遺伝子の増加または減少は対照に対して相対的に測定され得る。
部位特異的改変性ポリペプチドの内部移行は、標準的な内部移行アッセイ及び以下の実施例に記載のものによって決定することができる。一実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％または少なくとも１５％は、ＴＡＧＥ剤と細胞外細胞結合抗原との接触の所与の時間（例えば、１時間、２時間、３時間または３時間超）以内に細胞によって内部移行する。例えば、ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、対照薬剤、例えば非結合体化（つまり、抗原結合性ポリペプチドを有さない）部位特異的改変性ポリペプチドに比べてより高い効率で、ＴＡＧＥ剤と細胞外細胞結合抗原との接触の１時間以内に標的細胞によって内部移行する。
ＴＡＧＥ剤またはその構成要素の内部移行は、当技術分野で知られている任意の内部移行アッセイを用いて評価することができる。例えば、ＴＡＧＥ剤またはその構成要素の内部移行は、検出可能標識（例えば蛍光色素）をペプチド（及び／またはトランスフェクトされる積荷）に結合させるかまたはペプチドをレポーター分子と融合させてこれによって細胞内取込みが起こった時点での例えばＦＡＣＳ分析または特異的な抗体による検出を可能にすることによって、評価され得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤の１つ以上の構成要素を、失活可能信号を有するレポーター分子に結合体化させる。例えば、実施例５に記載されるように、標識付けされた構成要素と細胞とを所与の期間にわたってインキュベートした後、Ａｌｅｘａ－４８８標識ＴＡＧＥ構成要素（例えば、タンパク質構成要素または核酸ガイド）を検出し、その後、抗Ａ４８８抗体による失活の有無によって得られた結果を比較することに基づいて、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイを利用することができる。標的細胞によって内部移行する標識付けされた分子は抗Ａ４８８抗体による失活から保護され、それゆえ、失活後に対照に比べてより強いＡｌｅｘａ４８８信号を保持する。それにひきかえ、内部移行しておらずそれゆえ細胞表面上にとどまっている標識付けされた分子は抗Ａ４８８抗体による失活を受けやすく、それゆえ、失活されない対照に比べて弱められたＡｌｅｘａ４８８信号を呈する。
本明細書に記載のＴＡＧＥ剤を使用して部位特異的改変性ポリペプチドを、所与の細胞外細胞膜結合性タンパク質（例えば、抗原結合性タンパク質、リガンドまたはＣＰＰ）が標的となり得る任意の細胞に指向させることができる。細胞は、哺乳動物細胞を含むがこれに限定されない真核細胞であり得る。本発明のＴＡＧＥ剤によって標的とされ得る（そしてゲノムの改変を受け得る）哺乳動物細胞の例としては、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞またはヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞は、（ｉ）生体内の生物／組織に、（ｉｉ）生体外の組織もしくは細胞群に、または（ｉｉｉ）試験管内にある状態で存在するものであり得る。ある場合には、本明細書において真核細胞は、単離された状態で（例えば、試験管内の細胞、培養細胞に）、または単離されていない状態で（例えば、対象、例えば哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類またはマウスに）存在するものであり得る。ある実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。
標的細胞において標的核酸、例えば遺伝子を編集するＴＡＧＥ剤の能力は、例えば表現型アッセイまたは配列決定アッセイを含めた当技術分野で知られている方法に従って決定され得る。そのようなアッセイは、ＴＡＧＥ剤によって編集されている標的細胞の遺伝子または核酸と結び付けられたマーカーの存否を判定し得る。例えば、以下の実施例に記載されるように、ＣＤ４７フローサイトメトリーアッセイを用いて、遺伝子編集に対するＴＡＧＥ剤の有効性を判定することができる。ＣＤ４７フローサイトメトリーアッセイでは、標的細胞内の内在性ＣＤ４７遺伝子配列がＴＡＧＥ剤の標的となり、標的細胞の細胞表面上でのＣＤ４７発現の欠如によって編集が証明される。細胞の集団においてＣＤ４７のレベルが測定され得、同じ種類の標的細胞において非標的指向性ガイドＲＮＡを陰性対照として使用した対照ＴＡＧＥ剤と比較され得る。例えば、対照と比較したときのＣＤ４７のレベルの低下は、ＴＡＧＥ剤の遺伝子編集を示唆している。ある場合には、検査のためのアッセイにおいて対照と比較したときの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％などの低下は、ＴＡＧＥ剤による核酸、例えば遺伝子の編集を示唆している。上記百分率の範囲も本明細書において企図される。ＴＡＧＥ剤の核酸編集、例えば遺伝子編集の活性を見極めることができる他の方法としては、当技術分野で知られている配列ベースのアッセイ、例えば、アンプリコン配列決定が挙げられる。
代替実施形態では、標的細胞内の内在性配列がＴＡＧＥ剤の標的となり、編集は、マーカーの発現が標的細胞の細胞表面上でまたは細胞内で（例えば細胞内ｔＤｔｏｍａｔｏまたは蛍光（例えばＧＦＰ）レポーターなどに対応して）増加することによって証明される。そのような実施形態では、対照と比較したときの例えばフローサイトメトリーによって検出されるマーカーのレベルの上昇は、ＴＡＧＥ剤の遺伝子編集を示唆している。ある場合には、検査のためのアッセイにおいて対照と比較したときの細胞表面マーカーの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％などの増加は、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を示唆している。ある場合には、検査のためのアッセイにおいて対照と比較したときの細胞表面マーカーの発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれを上回るなどの増加は、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を示唆している。例えば、蛍光マーカー（例えば、ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光システム）の発現の増加を用いてＴＡＧＥ剤による編集の増加を測定することができる。上記百分率の範囲も本明細書において企図される。ＴＡＧＥ剤の核酸編集、例えば遺伝子編集の活性を見極めることができる他の方法としては、当技術分野で知られている配列ベースのアッセイ、例えば、アンプリコン配列決定が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、標的細胞内の細胞表面タンパク質をコードする内在性遺伝子配列（例えばＣＤ４７）を標的とし、編集は、標的細胞の細胞表面上での細胞表面タンパク質の発現を欠く標的細胞の百分率によって証明される。いくつかの実施形態では、対照と比較したときの例えばフローサイトメトリーによって検出される細胞表面タンパク質の発現を欠く標的細胞の百分率は、ＴＡＧＥ剤の遺伝子編集を示唆している。ある場合には、検査のためのアッセイにおいて検出したとき標的細胞の集団において標的細胞の少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％などにおける細胞表面タンパク質（例えばＣＤ４７）の非存在は、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を示唆している。上記百分率の範囲も本明細書において企図される。ある場合には、細胞表面タンパク質（例えばＣＤ４７）が存在しない標的細胞の百分率が、検査のためのアッセイにおいて対照と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれを上回って増加することは、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を示唆している。ＴＡＧＥ剤の核酸編集、例えば遺伝子編集の活性を見極めることができる他の方法としては、当技術分野で知られている配列ベースのアッセイ、例えば、アンプリコン配列決定が挙げられる。
代替実施形態では、標的細胞内の内在性配列がＴＡＧＥ剤の標的となり、この場合、編集は、対照（例えば非編集標的細胞）と比較したときの遺伝子編集のレベルの倍率の変化によって証明される。一実施形態では、フローサイトメトリーによって決定される細胞表面マーカーの倍率の特定の上昇または低下は、対照、例えば非標的指向性ガイドＲＮＡを有するＴＡＧＥ剤、または陰性対照としての抗原結合性ポリペプチドを欠くＴＡＧＥ剤に対して相対的な核酸編集、例えば遺伝子編集を指し示すものである。ある場合には、細胞表面マーカーの倍率上昇は、対照と比較してレベルが少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１～５倍、少なくとも１～４倍、少なくとも２～５倍高いなどである。ある場合には、検査のためのアッセイにおいて対照と比較したときの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれを上回るなどの細胞表面マーカーの発現の増加は、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を示唆している。ある場合には、検査のためのアッセイにおいて対照と比較したときの多くとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１またはそれを下回るなどの細胞表面マーカーの発現の減少は、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を示唆している。そのような（ＴＡＧＥ剤によって促される核酸編集の結果に応じた）倍率上昇または低下は、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を指し示すものである。ある場合には、検査のためのアッセイにおいて対照と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれを上回るなどの細胞表面マーカーの発現の増加は、ＴＡＧＥ剤による核酸編集、例えば遺伝子編集を示唆している。上記倍率変化の範囲も本明細書において企図される。ＴＡＧＥ剤の核酸編集、例えば遺伝子編集の活性を見極めることができる他の方法としては、当技術分野で知られている配列ベースのアッセイ、例えば、アンプリコン配列決定が挙げられる。
タンパク質（例えば抗体結合性ポリペプチド）を細胞に送達する方法に関して、タンパク質は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて、例えば、共有結合性もしくは非共有結合性リンケージによって、または変異型タンパク質をコードする核酸からの好適な宿主細胞における発現によって、生産され得る。タンパク質を生産するための複数の方法が当技術分野で知られている。例えば、タンパク質を、酵母、細菌、昆虫細胞株、植物、遺伝子導入動物、または培養された哺乳動物細胞から生産及び精製することができ、例えば、Ｐａｌｏｍａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４；２６７：１５－５２を参照されたい。さらには、タンパク質が細胞内に入った時点で切断されるリンカーを任意選択的に使用して、抗原結合性ポリペプチドを、細胞内への移入を促進する部分、例えば脂質ナノ粒子に連結してもよい。
いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは部位特異的改変性ポリペプチドを細胞内プロセスによって細胞内に送達し得る。そのようなプロセスの例には、マクロ飲作用、クラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオラ／脂質ラフト媒介エンドサイトーシス、及び／または受容体媒介エンドサイトーシス機序（例えば、スカベンジャー受容体媒介取込み、プロテオグリカン媒介取込み）が含まれ得る。
部位特異的改変性ポリペプチドが一旦細胞の内部に入ると、それは例えば核膜またはミトコンドリア膜などの細胞小器官膜を横切り得る。ある実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドは、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多く）の核指向性配列（例えばＮＬＳ）を含む。他の実施形態では、核膜またはミトコンドリア膜などの細胞小器官膜を横切る能力は、核指向性配列の存在に依存しない。したがって、いくつかの実施形態では、部位特異的改変性ポリペプチドはＮＬＳを含まない。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、生体外で細胞、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆幹細胞（ＨＳＰＣ）に投与される。例えば、本明細書に提供されるＴＡＧＥ剤（例えば、抗ＣＤ３４ＴＡＧＥ剤、またはＴＡＧＥ－ＣＰＰ剤）を生体外でＨＳＣに投与してすぐにＴＡＧＥ編集ＨＳＣを、その後に造血幹細胞移植を必要とする対象に移植してもよい。
ある実施形態では、本明細書に記載のＴＡＧＥ剤は、対象に例えば局所投与によって投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は対象に経皮、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、骨内または腫瘍内投与され得る。
ＴＡＧＥ剤は、対象に治療的有効量で（例えば、対象における疾患を治療または予防するゲノム編集のレベルをもたらす量で）投与され得る。例えば、治療的有効量のＴＡＧＥ剤は、がん（例えば結腸癌腫またはメラノーマ）、眼疾患または幹細胞障害を有する対象に投与され得る。治療的有効量は、送達の様式、例えば、ＴＡＧＥ剤が局所（例えば、皮内（例えばマウスの場合に腹測または耳を介して）、腫瘍内、骨内、眼内または筋肉内注射によって）投与されるのかそれとも全身投与されるのかによって決まり得る。
本明細書に記載のＴＡＧＥ剤は、皮内、腫瘍内、骨内、眼内または筋肉内注射によるなどの意図した投与経路に適合するように製剤化され得る。液剤、懸濁剤、分散剤または乳剤は、そのような投与のために使用され得、無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重硫酸ナトリウム；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、及び張度の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムを使用して調整され得る。調合薬は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルに封入され得る。ある実施形態では、医薬組成物はＴＡＧＥ剤及び薬学的に許容される担体を含む。
ＴＡＧＥ剤は、組成物を対象に例えば皮内、腫瘍内、骨内、眼内または筋肉内注射によって送達するのに適した医療装置と一緒にキット、容器、包みまたは分注器の中に含まれ得る。キットの中に含まれる組成物は、異なる構成要素の寿命が維持され得るような、及び容器の材料による吸収または変化を受けることがないような、任意の種類の容器の中に入った状態で供給され得る。例えば、密封されたガラス製アンプルまたはバイアルの中に、窒素などの中性の非反応性ガスの下で充填された本明細書に記載の組成物が収容されていてもよい。アンプルは、任意の好適な材料、例えば、ガラス、有機ポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレンなど、セラミックス、金属、または試薬を保持するために典型的に採用される他の任意の材料からなり得る。好適な容器の他の例としては、アンプルと類似する物質から作製されたボトル、及びアルミニウムまたは合金などの箔で裏打ちされた内部からなる包みが挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどが挙げられる。いくつかの容器は、皮下注射針によって繰り返し貫通され得る栓を有するボトルのように、解除可能な無菌出入口を有し得る。
ＴＡＧＥ剤は、治療目標に則った経路によって対象に投与され得る。所望の細胞または組織にＴＡＧＥ剤を送達するために、全身または局所送達を含めた様々な経路が用いられ得る。
ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、がん、例えば結腸癌腫またはメラノーマを有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、がんは、例えば、メラノーマ、泌尿生殖器癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、白血病、肝臓癌腫、網膜芽細胞腫、星細胞腫、神経膠芽腫、歯肉癌、舌癌、神経芽腫、頭部癌、頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、消化器癌、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、結腸癌、肉腫または膀胱癌である。がんは、原発がんまたは転移がんであり得る。ある実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、患者において例えば腫瘍内の１つ以上の細胞種（例えば、マクロファージ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞または線維芽細胞）を編集するのに有効な量で腫瘍内に（腫瘍内注射によって）直接注射され得る。例えば、ＴＡＧＥ剤を腫瘍内に投与することによって対象（例えばヒト）における固形腫瘍を治療するために本開示のＴＡＧＥ剤を使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、針、例えばＴｕｒｎｅｒ生検針またはチバ生検針を使用して固形腫瘍内に直接注射され得る。例えば、肺内の固形腫瘍を治療する場合、ＴＡＧＥ剤は、気管支鏡、または気管支にカニューレを挿入することができる装置を使用して胸郭内に投与され得る。気管支樹を介した到達が可能な塊には、広く利用されている経気管支吸引針を使用することによって直接注射がなされ得る。ＴＡＧＥ剤はまた、当業者に知られている腫瘍組織を貫通する任意の好適な方法を用いて固形腫瘍内に埋植されてもよい。そのような技術は、腫瘍内に開口部を作り出すこと及び腫瘍内にＴＡＧＥ剤を配置することを含み得る。
他の実施形態では、ＴＡＧＥ剤は、対象の骨髄の中に注射され得る（つまり、骨内注射）。骨内送達は、対象において骨髄細胞（例えば造血幹細胞（ＨＳＣ））を編集するために使用され得る。本開示のＴＡＧＥ剤は、骨内に送達される場合、対象（例えばヒト）における幹細胞障害を治療するために使用され得るが、この場合、骨髄細胞、例えばＨＳＣＳは、幹細胞障害の治療をもたらすような方法で改変される。
さらなる実施形態において、ＴＡＧＥ剤は、対象、例えばヒトの眼窩区画内に網膜下細胞（例えば網膜色素上皮（ＲＰＥ）または光受容器）を編集するのに有効な量で直接注射され得る。例えば、本開示のＴＡＧＥ剤は、ＴＡＧＥ剤を眼内に（例えば網膜下注射によって）投与することによって対象（例えばヒト）における眼疾患を治療するために使用され得る。
一実施形態では、抗原結合性ポリペプチド（例えば抗体）を含むＴＡＧＥ剤は、局所送達によってヒト対象に投与され得る。局所送達は、ＴＡＧＥ剤が全身ではなくその送達がなされた領域の中で作用することになる身体の特定の場所への送達を意味する。抗原結合性ポリペプチドを含むＴＡＧＥ剤のための局所送達の例としては、局所投与、眼内送達、関節内送達、心臓内送達、皮内、皮膚内送達、骨内送達、クモ膜下腔内送達または吸入が挙げられる。
一実施形態では、抗原結合性ポリペプチド（例えば抗体またはその抗原結合性断片）を含むＴＡＧＥ剤は、全身投与によってヒト対象に投与される。抗原結合性ポリペプチド（例えば抗体またはその抗原結合性断片）を含有するＴＡＧＥ剤のための全身送達の例としては、静脈内注射または腹腔内注射が挙げられる。
本発明は、以下の実施例を参照することによってより詳しく理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定しているとみなされるべきでない。全ての文献及び特許引用文献を参照により本明細書に援用する。
実施例の全体を通して使用されている、構築物の名称（例えば、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ）の中の記号「－」は、別段の指示がない限り遺伝子融合体を意味する。構築物の名称（例えば、Ｃａｓ９－プロテインＡ：抗体、抗体－ＳｐｙＴａｇ＝ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９）の中の「＝」または「：」という記号は、２つの結合体化部分（例えば、プロテインＡと抗体のＦｃ領域、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇ、またはＨａｌｏとＨａｌｏタグ）の間の相互作用によって媒介される結合体化を意味する。
実施例１．Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡの設計及び生産
２ｘ核局在化シグナル及びプロテインＡを含むＣａｓ９融合体（Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ、別段の指示がない限りこれ以降は「Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ」または「Ｃａｓ９－ｐＡ」とも呼称する；配列番号３；図２Ａ）をＥ．ｃｏｌｉから以下の工程に従って構築及び精製した。
Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡを発現させるベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉを選択ＴＢ培地中で３７℃で２００ｒｐｍ超で振盪しながら培養した。ＯＤ６００が０．６～０．８となった時にＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡの発現を１ｍＭのＩＰＴＧによって１６℃で一晩、または３７℃で３時間誘導した。その後、培養物を４℃で４０００ｘｇで２０分間の遠心分離によって採取した。各１リットルの細胞を２０ｍｌの低温の溶解用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１Ｘのプロテアーゼ阻害剤、０．０２５％のＴＸ－１００）で再懸濁させ、細胞を超音波処理によって溶解させた。残屑を４℃で１５０００ｘｇで４０分間にわたってペレット化した。
溶解物を５ｍｌのＮｉＮＴＡ Ｆａｓｔｆｌｏｗ予備充填カラムに適用した。カラムを少なくとも５体積のＮｉＮＴＡ洗浄用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。その後、カラムを少なくとも５体積のＴＸ－１００緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、０．０２５％のＴＸ－１００）で洗浄した。続いてカラムをＮｉＮＴＡ洗浄用緩衝液で最後まで洗浄した。洗浄をＢｒａｄｆｏｒｄ試薬によって監視した。試料をＮｉＮＴＡ溶離用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール）で溶離させ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬によって監視した。典型的には、全てのタンパク質を４カラム体積のＮｉＮＴＡ溶離用緩衝液で溶離させた。
溶離液中のタンパク質濃度を測定し、ＨＰＶ３Ｃプロテアーゼを１：９０ｗ／ｗのプロテアーゼ：溶離液で添加した。溶離液を透析カセットに移し、１Ｌの透析用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、３００ｍＭのＮａＣｌ）で一晩４℃で透析した。透析液を、オーバーナイト透析用緩衝液で平衡化された５ｍｌのＮｉＮＴＡカラムに適用し、流出液を回収した。この工程を２回繰り返した。全ての流出タンパク質が回収されることを確保するために、カラムを約５ｍｌのオーバーナイト透析用緩衝液で洗浄した。その後、試料を無塩緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１０％のグリセロール）で１：１ｖ／ｖに希釈して塩濃度を約１５０ｍＭに下げ、１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離して何らかの沈降したタンパク質をペレット化した。
可溶性タンパク質を、イオン交換（ＩＥＸ）緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣＬ、１０％のグリセロール）で平衡化されたＨｉＴｒａｐ ＳＰカラムに適用し、ＩＥＸ緩衝液ＡからＢ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１．５ＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール）まで２０ＣＶの線形勾配で５ｍｌ／分の速度で溶離させた（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ）。他の精製からの内毒素持ち越しがないことを確保するためにＳＰカラムを０．５ＭのＮａＯＨで洗浄した。
Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡはＳＰカラムから約３３ｍＳ／ｃｍまたは約２２％ＩＥＸ緩衝液Ｂをピークとして溶離された。画分をプールし、３０ｋＤａスピン濃縮器で約０．５ｍｌに濃縮した。
タンパク質を、サイズ排除用緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、２００ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール）で平衡化されたＳ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラムで分離した。他の精製からの内毒素持ち越しがないことを確保するためにＳ２００カラムを０．５ＭのＮａＯＨで洗浄した。Ｃａｓ９－プロテインＡは約１２ｍｌをピークとして溶離された。タンパク質を濃縮し、－８０℃で保存した。
精製後、試料を内毒素レベルがおおよその低値（例えば一般的には０．１ＥＵ／用量）になるまで選択的内毒素除去用樹脂と共にインキュベートした。
Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ融合体はおよそ１ｍｇ／Ｌの終濃度で精製された。
実施例２．Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡの試験管内でのＤＮＡ切断
Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ単独（Ｃａｓ９－ｐＡ）、または抗ＣＤ３抗体に結合したＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ－α－ＣＤ３」）によるＤＮＡ切断を、試験管内ＤＮＡ切断アッセイによって評価した。
５００ｎＭのＣａｓ９－ｐＡ：α－ＣＤ３を、１ｕｌの５×緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ＭのＫＣｌ、２５％のグリセロール、２５ｍＭのＭｇＣｌ２）、２．５ｕｌの１ｕＭのＣａｓ９、０．６ｕｌの５ｕＭの再折りたたみガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ；終濃度０．６ｎＭ）及び０．９ｕｌの水と合わせることによって再構成した。再構成されたＣａｓ９ ＲＮＰを１０分間３７℃でインキュベートしてＣａｓ９ ｇＲＮＡが結合できるようにした。ＤＮＡ切断を評価するために、１００ｎＭの各Ｃａｓ９ ＲＮＰを１００ｎＭのｄｓＤＮＡ標的と共に３０分間３７℃でインキュベートした。Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）を対照として評価した。
１ｕｌの２０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫを反応物に添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。失活反応物を４℃に保った後にＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒキャピラリー電気泳動（ＣＥ）機器で分離した。２ｕｌの反応物を２２ｕｌのＴＥ緩衝液で希釈し、キャピラリー電気泳動によって製造業者の推奨に従って分析した。切断反応を３反復で行い、バックグラウンドをバンド強度から差し引いた。切断パーセントを以下の等式に従って定量した：切断％＝（切断生成物総モル数）／（基質の総モル数）。結果はＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）内部対照に対して相対的な切断％として表される。
図２に示すように、Ｃａｓ９－ｐＡ：α－ＣＤ３は、Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳと同程度のレベルのＤＮＡ切断を成し遂げた。
実施例３．ヌクレオフェクション後のＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡによる生体外でのＤＮＡ編集
生体外でＤＮＡを編集するＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）の能力を評価するために、２５ｐＭのＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡまたはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（「Ｃ８０Ａ」）を、刺激されたヒトＴ細胞の中にヌクレオフェクションによって導入した。
刺激されたヒトＴ細胞を単離するために、まずバッフィーコートからＰＢＭＣを単離した（ＳｔｅｍＣｅｌｌによるＳｅｐＭａｔｅ単離プロトコール）。その後、ＰＢＭＣからＴ細胞をＴ細胞培地（Ｘ－Ｖｉｖｏ－１５培地、５％のＦＢＳ、５０ｕＭの２－メルカプトエタノール、１０ｕＭのＮ－アセチルＬ－システイン、及び１％のＰｅｎｎ－Ｓｔｒｅｐｐ）中に単離した（ＳｔｅｍＣｅｌｌによるＥａｓｙＳｅｐ単離プロトコール）。Ｔ細胞を刺激するために、Ｔ細胞をＴ細胞培地中１×１０６細胞／ｍＬの濃度でフラスコに移し、刺激用試薬（２００Ｕ ｍｌ－１のＩＬ－２、５ｎｇ ｍｌ－１のＩＬ－７、５ｎｇ ｍｌ－１のＩＬ－１５、及び１ｍｌあたり２５ｕｌのｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ可溶性ＣＤ３／ＣＤ２８）をＴ細胞に添加した。７２時間刺激した後にＴ細胞はヌクレオフェクションのための準備が整った。
次に、５０ｕＭのＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡと、ＣＤ４７遺伝子を標的とする２５ｕＭの再折りたたみ一本鎖ガイドＲＮＡ（ＣＤ４７ＳＧ２）とをＣａｓ９緩衝液中で１０分間３７℃でインキュベートすることによってＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡをガイドＲＮＡと複合体化させてＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ：ｇＲＮＡ ＲＮＰを調製した。
ＤＮＡを生体外で編集するＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（Ｃａｓ９－ｐＡ）ＲＮＰの能力を評価するために、２５ｐＭのＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ ＲＮＰまたはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）ＲＮＰを、刺激されたヒトＴ細胞の中にヌクレオフェクションによって導入した。ヌクレオフェクション後、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いてＣＤ４７の下方制御を評価した。最後に、ＤＮＡを細胞から単離し、アンプリコン配列決定によって解析した。図３に示すように、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ ＲＮＰは、刺激されたヒトＴ細胞において生体外での編集を発揮した。
実施例４．Ｃａｓ９－ｐＡ：抗体薬剤の形成を評価する試験管内結合アッセイ
抗体と複合体化するＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（Ｃａｓ９－ｐＡ）の能力を評価するために、Ｃａｓ９－プロテインＡ（ｐＡ）を抗ＣＤ３抗体と２：１の抗体：Ｃａｓ９比で混合した。Ｃａｓ９ｐＡ単独、抗ＣＤ３抗体単独、またはＣａｓ９－ｐＡと抗ＣＤ３抗体との混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーによってＳ２００サイズ排除用カラムで分析した。
図４に示すように、Ｃａｓ９－ｐＡは抗ＣＤ３抗体に結合することができ、それによってＣａｓ９ｐＡ：抗体薬剤を形成することができる。
実施例５．抗体及びＣａｓ９－ｐＡ：抗体の内部移行アッセイ
抗体及びＴＡＧＥ剤の内部移行をＦＡＣＳベース内部移行アッセイによって評価した。
ＦＡＣＳベース内部移行アッセイ
ＦＡＣＳベース内部移行アッセイは、標識付けされた分子と細胞とを所与の期間にわたってインキュベートした後のＡｌｅｘａ－４８８標識分子（例えば、タンパク質またはＲＮＡガイド）の検出、及び抗Ａ４８８抗体による失活の有無によって得られた結果を比較することに基づく。細胞によって内部移行する標識付けされた分子は抗Ａ４８８抗体による失活から保護され、それゆえ、失活後の対照に比べてより強いＡｌｅｘａ４８８信号を保持する。それにひきかえ、内部移行しておらずそれゆえ細胞表面上にとどまっている標識付けされた分子は抗Ａ４８８抗体による失活を受けやすく、それゆえ、失活されない対照に比べて弱められたＡｌｅｘａ４８８信号を呈する。
本明細書に記載のＡｌｅｘａ－４８８標識タンパク質（例えばＣａｓ９または抗体）は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから販売されているＮＨＳｅｓｔｅｒ－Ａｌｅｘａ４８８（品目番号Ａ３７５６３）を使用してタンパク質上の到達可能なリジンと結合体化させることで調製された。Ａｌｅｘａ－４８８標識タンパク質を調製するために、１０％の重炭酸ナトリウム ｐＨ８．５が補充されたサイズ排除用緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、２００ｍＭのＫＣｌ、及び１０％のグリセロール）の中で１６０００ｐｍｏｌのＮＨＳエステル－Ａｌｅｘａ－４８８を１０００ｐｍｏｌのタンパク質と共に室温で１時間インキュベートした。余分な非結合体化ＮＨＳエステルを１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８で失活させ、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムを使用して余分な色素を除去した。
Ａｌｅｘａ－４８８標識ガイドＲＮＡは、５’にＡｌｅｘａ４８８が標識付けされた注文製のｔｒａｃｒＲＮＡをＩＤＴから購入することによって調製された。ｔｒａｃｒＲＮＡをｃｒｉｓｐｒＲＮＡと複合体化させる。まず、１×再折りたたみ用緩衝液、２５ｕＭのｃｒｉｓｐｒＲＮＡ、及び２５ｕＭのＡｌｅｘａ－４８８－ｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせることによって再折りたたみガイドＲＮＡを調製する。再折りたたみ反応物を５分間７０℃に加熱し、その後、室温に平衡化させる。続いて、２０ｍＭのＭｇＣＬ２を反応物に添加し、５０℃で５分間加熱し、その後、室温に平衡化させる。その後、標識付けされたガイドＲＮＡをＣａｓ９と複合体化させる（１．３：１のｃｒ／ｔｒＲＮＡ：Ｃａｓ９比）。
標識付けされた分子が調製された時点で関心対象の分子を使用した力価曲線作製を実施して、無関係な細胞におけるバックグラウンドを伴わずに良好な染色を成し遂げるのに最適な量を見つけた。その後、細胞を以下の方法に従って調製した。細胞を回収し、それが５００，０００～１００万細胞／１００ｕＬ（５百万～１千万個／ｍＬ）となるように再懸濁させた。Ｆｃ遮断薬を細胞に添加し（マウスのためには１：１００、ヒトのためには試料１つあたり５ｕＬ）、氷上で１５分間インキュベートした。１００ｕＬの細胞を各ウェルに添加し、３００ｘｇで３分間遠心沈殿させ、細胞を８０ｕＬの１０％のＲＰＭＩの中に再懸濁させた。必要に応じて細胞を刺激して表面マーカーの上方制御をもたらした。その後、以下の洗い流し法、または次の節に示す連続標識付け法に従って、標識付けされた分子に細胞を曝露した。
「洗い流し」法は、まず全ての試料を、４８８で標識付けされた分子と共に４℃でインキュベートして表面結合ができるようにすることを含んでいた。その後、分子を洗浄した後、細胞を３７℃に移した。こうすることで、最初に表面に結合していた分子のみが内部移行した。洗い流し法では、２０ｕＬのＡ４８８－分子を８０ｕＬのＲＰＭＩ／ＦＢＳの中の細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、１００ｕＬのＰＢＳをウェルの上から加え、細胞を３００ｘｇで３分間回転させた。細胞を１００ｕＬのＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳの中に再懸濁させた。４℃試料及び対照は氷上に保たれた一方、３７℃試料は別個のプレート（複数可）に移されて一組の時間量（例えば、１５分、６０分またはより長い時間（例えば３時間））にわたってインキュベートされた。第１の時間点（すなわち１５分）が終了した後、プレートまたは細胞を取り出して氷上に保った。
対照的に、連続法は、細胞を３７℃に移すこと（またはそれを４℃に保つこと）、及び４８８で標識付けされた分子を最初から添加することを含んでいた。これは、３７℃でのインキュベーション期間全体にわたる分子の連続的な取込みを可能にした。４℃試料は氷上に保たれた一方、３７℃試料は３７℃でインキュベートされた。その後、時間点が最も長い試料から始めて適切な時間にＡ４８８標識分子を試料に添加した（つまり、４８８標識分子をまず３時間の試料に添加し、（１時間残っている）２時間後に４８８分子を６０分の試料に添加し、次に、（０．２５時間残っている）２．７５時間後に４８８分子を１５分の試料に添加した。最終の時間点の後、全ての試料を氷上に戻した。連続法は以下の実験で利用した。
最後に、試料を抗Ａ４８８抗体で失活させ、ＦＡＣＳ分析のために染色した。遠心沈殿させる前に、各試料を２分割して各時間点のための２つの５０ｕＬの試料とした。プレートに３００ｘｇで３分間、遠心沈殿を掛けた。その後、失活させない全てのウェルに、５０ｕＬのＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた。次に、失活させる全てのウェルに、５０ｕＬの抗Ａ４８８失活マスターミックスを加えた。最後に、５０ｕＬのＦＡＣＳミックスを全試料に添加した。その後、試料を氷上で３０分間インキュベートした。次いで１００ｕＬのＭＡＣＳ緩衝液を各ウェルに添加し、その後、細胞を３００ｘｇで３分間４℃で遠心沈殿させた。細胞を１７０ｕＬのＭＡＣＳ緩衝液及び１０ｕＬの７ＡＡＤの中に再懸濁させた。５分間インキュベートした後、試料をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＦフローサイトメータに流した。あるいは、細胞を１００ｕＬのＰＢＳ中４％のＰＦＡの中に再懸濁させ、１０分間室温でインキュベートし、１００ｕＬのＰＢＳを上から添加し、遠心沈殿させ、細胞を１８０ｕＬのＰＢＳに再懸濁させることによって、細胞を分析前に固定することができる。細胞はこの後、翌日に分析され得る。
抗体内部移行
Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）：抗体薬剤において機能し得る候補抗体を同定するために、抗体をまず、Ｃａｓ９－ｐＡなしでのその内部移行能力について評価した。異なる標的（すなわち、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ２５、ＣＤ５４、ＣＤ４４及びＥＧＦＲ）を有する様々な抗体の内部移行をマウス及びヒト細胞集団（例えば、Ｂ細胞、骨髄細胞、Ｔ細胞、活性化Ｔ細胞、上皮細胞）において評価した。表２に示すように、広範なヒトマウス免疫細胞によって内部移行する抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３、抗ＣＸＣＲ４、抗ＣＤ５４及び抗ＣＤ４４抗体が同定された。
（表２）抗体内部移行
Figure 2022524221000004
詳しくは、抗ＣＤ３（８ｎＭ）または抗ＣＤ２２（１００ｎＭ）抗体の内部移行の速度は、各抗体をＰＢＭＣに添加することによって評価された。示された温度での示された時間の後、外部Ａ４８８信号を抗Ａ４８８抗体によって失活させた。特定の細胞集団がＦＡＣＳによって同定された。図５のＡ及びＢに示すように、ＣＤ３及びＣＤ２２を認識する抗体は異なる速度で内部移行する。
ＴＡＧＥ剤内部移行
次に、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（Ｃａｓ９－ｐＡ）と複合体化した候補抗体の内部移行をＦＡＣＳベース内部移行アッセイにおいて評価した。ヒトＩｇＧ１または抗ＣＤ２２抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡを、Ｃａｓ９－ｐＡか抗体かのどちらかにＡ４８８標識が付いた状態で評価した。抗ＣＤ２２抗体単独を対照として評価した。
まず、１０ｎＭの各タンパク質をＰＢＭＣに添加すること及び氷上で３０分間染色することによって細胞結合性を評価した。図６Ａに示すように、Ｃａｓ９－ｐＡと抗ＣＤ２２との複合体化はＴ細胞ではなくＢ細胞に対する結合性を増大させる。
次に、１０ｎＭの各タンパク質をＰＢＭＣに添加して失活させた後、細胞をＣＤ４５、ＣＤ３及びＣＤ１９について染色した。図６Ｂに示すように、Ｃａｓ９－ｐＡは抗ＣＤ２２と複合体化した場合に内部移行することができる一方、Ｃａｓ９－ｐＡは内部移行しない。図６Ｃに示すように、同じ細胞プールにおいてＣａｓ９－ｐＡ：抗ＣＤ２２はＴ細胞ではなくＢ細胞にのみ結合及び内部移行する。したがって、Ｃａｓ９－ｐＡ：抗体薬剤は、バルクＰＢＭＣに送達された場合にＢ細胞による効果的な内部移行を呈する。
実施例６．抗体及びＣａｓ９－ｐＡ：抗体の内部移行アッセイ
実施例５に記載のＦＡＣＳベース内部移行アッセイにおける異なる失活方法の有効性を評価するために、抗体（抗ＣＤ３抗体）、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）ＲＮＰ、またはＴＡＧＥ剤（Ｃａｓ９－ｐＡ：抗ＣＤ３抗体ＲＮＰ（「Ｃａｓ９ｐＡ：ＣＤ３」）の内部移行を、レポーター信号（Ａ４８８またはＡＴＴＯ５５０）をヘパリン洗浄（２０００Ｕ／ｍＬ）、酸洗浄（ｐＨ３．５）または抗Ａ４８８抗体によって失活させるＦＡＣＳベース内部移行アッセイによって評価した。各ＲＮＰのためにレポーター信号（Ａ４８８またはＡＴＴＯ５５０）をガイドＲＮＡに結合体化させた。さらには、ＣＤ４５＋細胞に対する各失活方法の毒性を、ＦＶＤｅ５０６＋細胞（死細胞）のレベルをＦＡＣＳによって決定するＦＡＣＳベース生死判定アッセイによって評価した（図７Ｄ）。図７Ｄに示されるように、酸失活及びヘパリン失活は通常の失活よりも毒性が高かった。
Ｃａｓ９－ｐＡ、抗ＣＤ３抗体、または抗ＣＤ３抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡの内部移行をＴ細胞（図７Ａ及び図７Ｂ）または骨髄細胞（図７Ｃ）において評価した。図７Ａ及び図７Ｂに示すように、酸洗浄は抗Ａ４８８抗体と同様に内部移行アッセイにおける失活に有効であった。骨髄集団では、Ｃａｓ９－ｐＡ染色に関して酸洗浄は抗Ａ４８８抗体よりも失活に有効であった（図７Ｃ）。
実施例７．Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡによる試験管内でのＤＮＡ切断
ＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）によるＤＮＡ切断を、実施例２に記載されるような試験管内ＤＮＡ切断アッセイによって評価した。図８に示すように、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）はＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳと類似するレベルのＤＮＡ切断を成し遂げた。
実施例８．ヌクレオフェクション後のＣａｓ９－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）による生体外でのＤＮＡ編集
生体外でＤＮＡを編集するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）（「Ｃａｓ９－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）」）の能力を評価するために、刺激されたヒトＴ細胞（実施例３参照）に２５ｐＭのＣａｓ９－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）ＲＮＰまたはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）ＲＮＰをヌクレオフェクションした。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡを各々のＴＡＧＥ剤に結び付けてリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質をＴ細胞にヌクレオフェクションして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。ヌクレオフェクション後、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いてＣＤ４７の下方制御を評価した。最後に、ＤＮＡを細胞から単離し、アンプリコン配列決定によって解析した。図９に示すように、Ｃａｓ９－Ｄａｒｐｉｎ（ＥＣ１）ＲＮＰは、刺激されたヒトＴ細胞において生体外での編集を発揮した。
実施例９．ＥｐＣＡＭ＋細胞に対するＣａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）の結合性
ＥｐＣＡＭ＋細胞に結合するＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）（「Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）」）の能力を評価するために、ＰＢＳ中１０、２５、５０、１００または３００ｎＭのＣａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）ＲＮＰ、またはＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）２ｘＮＬＳ対照を２つの異なるヒト上皮乳癌細胞株ＳＫＢＲ－３及びＢＴ４７４と共にインキュベートした。図１０Ｃに示すように、ＳＫＢＲ－３及びＢＴ４７４細胞は、ＥｐＣＡＭ抗体染色によって検出されるＥｐＣＡＭを発現させた。示されたＲＮＰを、Ａ４８８で標識付けされたＨＢＢ ｃｒ／ｔｒガイドと複合体化させ、ＳＫＢＲ－３及びＢＴ４７４細胞株と共に氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。
図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、ＥｐＣＡＭ指向性Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎはＥｐＣＡＭ＋細胞に結合する。図１０Ｄに示すように、結合は、細胞を高濃度のＣａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）と共にインキュベートした場合に特に検出される。
実施例１０．Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）の内部移行
ＥｐＣＡＭ＋ ＢＴ－４７４細胞またはＳＫＢＲ３細胞におけるＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）（「Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）」）の内部移行を、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイを用いて評価したが、このためのプロトコールは実施例５にさらに記載されている。１００ｎＭまたは３００ｎＭのＣａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）をＢＴ４７４細胞またはＳＫＢＲ３細胞と共に、示された時間（６０分または３０分）にわたって３７℃または４℃でインキュベートし、その後に失活させた。
図１１に示すように、Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）はＢＴ４７４細胞に内部移行する。
実施例１１．共インキュベーションまたはヌクレオフェクション後のＣａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）の生体外での編集
ＴＡＧＥ剤Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）（「Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）」）を、ＢＴ４７４細胞における共インキュベーションによって成し遂げられる編集のレベルとＳＫＢＲ３細胞で成し遂げられるそれとを比較する生体外編集アッセイによって評価した。
共インキュベーションによる付着細胞の生体外での編集－細胞が懸濁している間の編集
Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）と、ＣＤ４７を標的とするｈｕＣＤ４７ｇ２ガイドＲＮＡとを組み合わせることによって、ＲＮＰ複合体を調製した。組織培養プレート上で成長させた細胞を短時間のトリプシン化によって浮かせた。少なくとも５倍過剰の完全細胞培養培地を添加することによってトリプシン化を停止させた。その後、細胞を計数し、細胞培養培地で洗浄した。細胞培養培地は、所望の編集条件に適した０～１０％のウシ胎仔血清を含有していた。その後、細胞を遠心分離によってペレット化し、細胞培養培地中に高密度で再懸濁させた。濃縮細胞（約５００，０００個の細胞）をエッペンドルフチューブ内で３．７５ｕＭのＲＮＰと混合した。その後、細胞を３７℃のインキュベータの中に１時間置いた。１時間後、ＲＮＰを有する細胞を、完全細胞培養培地が予め充填された組織培養プレートに移した。
翌日、細胞を、それらが８０～１００％コンフルエンス（最適な細胞密度は、使用される細胞種によって決まる）に達した時に分割した。共インキュベート後４日目及び７日目に細胞を採集して遺伝子編集の度合いをフローサイトメトリーを用いて測定した。
結果
図１２に示すように、Ｃａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）は、ＢＴ４７４細胞における共インキュベート後におよそ１．３４％の編集、及びＳＫＢＲ３細胞における共インキュベート後に０．７％の編集を発揮した。ＲＮＰを含まない条件で得られた結果を比較のために示す。対照として、ヌクレオフェクションによって導入されたＣａｓ９－ＤＡＲＰｉｎ（ＥｐＣＡＭ）による編集がヒトＴ細胞において確認された（図１３）。
実施例１２．Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗体結合体の生産
実施例１に概要が述べられている、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡを生産するために用いた同様のプロトコールに従って、Ｈａｌｏタグに連結されたＣａｓ９を含むＴＡＧＥ剤（Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ）（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）をＥ．ｃｏｌｉから構築及び精製した。Ｃａｓ９－Ｈａｌｏは、Ｈａｌｏリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐ６７５１）に連結されたスクシンイミジルエステルを使用して任意のアイソタイプの抗体（または他の任意のタンパク質）に結合体化され得る。この実施例では、抗ＣＤ２２抗体をＣａｓ９－Ｈａｌｏと複合体化させた。
まず、以下のとおりに抗ＣＤ２２抗体をＨａｌｏ－スクシンイミジルエステルに、抗体上のリジンに対するアミン反応性基を介して連結した。重炭酸ナトリウム ｐＨ８．５を１００ｍＭで抗体に添加した。その後、８モル過剰のＮＨＳｅｓｔｅｒ－Ｈａｌｏリガンドを抗体に添加した。結合体化を１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５で停止させた。抗体に対するｈａｌｏリガンドのモル過剰量を増加または減少させることを用いてＣａｓ９：抗体結合体化比を変化させることができる。次に、脱塩カラム上で抗体結合体化反応を行い、抗体を５０ｕＭ超に濃縮した。
Ｈａｌｏリガンドに連結された抗ＣＤ２２抗体をＣａｓ９－Ｈａｌｏと結合体化させるために、抗体及びＣａｓ９－Ｈａｌｏと１：１．５のモル比で組み合わせ、室温で１時間インキュベートした。ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＫＣＬ、及び１０％のグリセロール）で満たされたＳ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ選別カラムを使用して抗体－ｃａｓ９結合体を非結合体化物質から分離した（図１４Ａ）。８．５～１１ｍＬのピークは結合体化物質を含有していた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用してＣａｓ９－抗体結合体化の比率を同定した（図１４Ｂ）。
実施例１３．Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２抗体の内部移行
健常脾臓由来マウスＢ細胞またはＢ１６腫瘍におけるＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）：抗ＣＤ２２抗体を含むＴＡＧＥ剤の内部移行を、実施例５にプロトコールがさらに記載されているＦＡＣＳベース内部移行アッセイを用いて（洗い流し法を用いて）評価した。Ａ４８８ガイドＲＮＡを有する２０ｎＭの示されたＲＮＰ（Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２抗体、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：ＩｇＧ１、またはＣａｓ９－Ｈａｌｏ）を全脾細胞または腫瘍浸潤リンパ球と共に３７℃または４℃で示された時間（１５分または６０分）にわたってインキュベートした。失活を伴う及び伴わない各条件からの試料を、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に基づいて選別されるＦＡＣＳ分析によって評価した。
図１５Ａ及び図１５Ｂに示すように、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２は健常脾臓由来マウスＢ細胞及びＢ１６腫瘍の中に内部移行した。
実施例１４．Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２抗体による試験管内でのＤＮＡ切断及び生体外での編集
Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）を含むＴＡＧＥ剤を試験管内でのＤＮＡ切断において評価し、生体外でのヌクレオフェクション編集活性を、それぞれ実施例２及び実施例３に概要が述べられているように評価した。詳しくは、Ｃａｓ９－ｈａｌｏ（２０１８１２０９）、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗ｍＣＴＬＡ４、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：ＩｇＧ１、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗ＣＤ２２、Ｈａｌｏ－３０ａａ－Ｃａｓ９、Ｈａｌｏ－３ａａ－Ｃａｓ９を、ｄｓＤＮＡと共にインキュベートすることによって試験管内での活性について評価した。各構築物は試験管内でのＤＮＡ切断活性を発揮した（図１６のＡ）。
次に、２５ｐＭの各ＲＮＰをヌクレオフェクションによって、刺激されたヒトＴ細胞に導入した。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡを各々のＴＡＧＥ剤に結び付けてリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質をＴ細胞にヌクレオフェクションして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。図１６のＢは、Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳと比較したときのＨａｌｏ複合体化抗体による編集の相対効率を示す。
実施例１５．混合細胞集団におけるＣａｓ９－Ｈａｌｏ：抗体ＲＮＰの差次的内部移行
抗体と複合体化したＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－Ｈａｌｏ（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ」）を含むＴＡＧＥ剤（「Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗体」）の内部移行、ＴＡＧＥ剤ＲＮＰ内部移行を混合細胞集団において評価した。プールされたＢ１６Ｆ１０腫瘍から単離された生細胞を、異なる抗体（抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＩｇＧ１、ＭＨＣＩＩ－Ｎｂ）と複合体化したＣａｓ９－Ｈａｌｏ ＴＡＧＥ剤ＲＮＰと混合した。対照として、単独でのＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）ＲＮＰ及びＣａｓ９－Ｈａｌｏ ＲＮＰも評価した。Ａ４８８標識ガイドＲＮＡを有する各ＲＮＰを腫瘍細胞と共に４℃及び３７℃で１時間インキュベートし、その後、失活を伴ってまたは伴わずにＦＡＣＳ分析によって試料を評価した。各ＲＮＰの内部移行を、選別されたＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、非Ｔ／Ｂ細胞、及びＣＤ４５－ ＰＤＰＮ＋細胞において評価した。
図１７に示すように、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗体ＲＮＰは、ＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、非Ｔ／Ｂ細胞、及びＣＤ４５－ ＰＤＰＮ＋細胞において差次的な内部移行パターンを呈した。
実施例１６．プロテインＡと結合体化した抗体ＴＡＧＥ剤－内部移行及び編集アッセイ
５つの異なる抗体（抗ＣＤ３３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＦＡＰ抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体）のうちの１つに連結されたＣａｓ９－２ｘＮＬＳ－プロテインＡ（「Ｃａｓ９－ｐＡ」）を含有するＴＡＧＥ剤を、異なる細胞種において内部移行と編集の両方について試験した。
まず、ＦＡＣＳベース内部移行アッセイを実施して、抗ＣＤ３３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＦＡＰ抗体を含むＣａｓ９－ｐＡ：抗体複合体の細胞内部移行を評価した（データ示さず；実施例４も参照されたい）。抗ＣＤ３３抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡを含有するＴＡＧＥ剤は、Ｃａｓ９ｐＡ：ｈｕＩｇＧ１と比較してＵＳ９３７細胞におけるＣａｓ９－ｐＡの内部移行を増進したが、抗体単独の内部移行のレベルには至らなかった。抗ＥＧＦＲ抗体と複合体化したＣａｓ９－ｐＡは、ｐＡ：ｈｕＩｇＧ１と比較してＡ４３１上皮細胞における結合及び内部移行を媒介した。同様に、ヒト線維芽細胞においてＣａｓ９－ｐＡ：ＦＡＰはｐＡ：ｈｕＩｇＧ１（アイソタイプ対照）よりも強く結合し、ヒト線維芽細胞に対するＣａｓ９－ｐＡ内部移行を促すことができる。
Ｃａｓ９－ｐＡ編集（抗体なし）は、一貫してＣａｓ９単独（Ｃ８０Ａ）よりも少ない編集を示した（データ示さず）。さらに、Ｃａｓ９－ｐＡを抗体に結合体化した場合には、試験された５つの異なる細胞種及び抗体にわたって、検出可能な編集は認められなかった（表３）。表３からの結果は、Ｃａｓ９－ｐＡ構築物は、結合して細胞内に内部移行する能力を有するにもかかわらず、ＴＡＧＥ剤の標的となる抗原とは無関係に編集を対照よりも減少させたことを示唆している。それゆえ、実施例１７～２１に記載するようにプロテインＡ以外の代替の結合体化部分を評価した。
（表３）
Figure 2022524221000005
実施例１７．Ｈａｌｏ結合体化を有する抗体ＴＡＧＥ剤－結合及び生体外編集アッセイ
以下の実施例に示すように、Ｈａｌｏ／Ｈａｌｏタグを介したＣａｓ９に対する抗体の結合体化は、いくつかの抗体／細胞種対ではＣａｓ９ ＴＡＧＥ剤の文脈において抗体結合に影響を及ぼすようであった。
本実施例に記載される抗体を、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏに対する結合体化のためにＨａｌｏタグ（ＨＴ）に連結してＣａｓ９－Ｈａｌｏ：ＨＴ－抗体結合体（別名Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗体結合体）を形成した。
マウス抗ＣＤ２２抗体による最初の試験は、抗ＣＤ２２抗体に結合体化されたＣａｓ９－Ｈａｌｏを含むＴＡＧＥ剤と、それと比較される抗ＣＤ２２抗体単独とで、同等のＢ細胞結合性を実証した（図１８Ａ）。その後のＣａｓ９－Ｈａｌｏに結合体化された抗ＦＡＰ抗体を使用する線維芽細胞結合アッセイ、またはＣａｓ９－Ｈａｌｏに結合体化された抗マウスＣＴＬＡ－４抗体を使用するＴ細胞結合アッセイ（３つの異なるクローンを試験した）は、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏ：抗体結合体が抗体単独に比べて細胞結合性が低いが陰性対照よりは結合性が高かったことを明らかにした（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。さらなる試験によって、Ｃａｓ９のＮ末端からＣ末端に向かってのＨａｌｏタグの位置もＨａｌｏタグの数も結合性に影響を及ぼさなかったことが示された。
Ｃａｓ９－Ｈａｌｏを含むＴＡＧＥ剤はまた、Ｃａｓ９－Ｈａｌｏが内部移行する細胞種に応じて可変な編集も示した。細胞外編集アッセイは、抗ＦＡＰ抗体に結合体化されたＣａｓ９－Ｈａｌｏ（ＣＤ４７ガイドＲＮＡ；フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いることによって編集を評価した）が共インキュベートによってヒト線維芽細胞をＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳ（陽性対照として使用されるＣＰＰ系ＴＡＧＥ剤）と同程度のレベルで編集することができたことを実証した（図１８Ｄ）。しかしながら、抗ＣＴＬＡ－４抗体に結合体化されたＨａｌｏ－Ｃａｓ９を含んでおりマウスＴ細胞と共インキュベートされたＴＡＧＥ剤は、（ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光受容体システムによって測定した場合）Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳと比較してより低い編集レベルを呈した（Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳで認められた編集の約２０％；図１８Ｅ及び図１８Ｆ）。
上記実施例からの結果は、線維芽細胞を標的とするＴＡＧＥ剤（すなわち抗ＦＡＰ ＴＡＧＥ剤）を使用したこれらの細胞の結合及び編集を実証しており、Ｔ細胞におけるそのような編集結果が標的または抗体に依存し得ることを示唆している。
実施例１８．抗ＦＡＰ抗体ＴＡＧＥ剤の内部移行及び生体外編集アッセイ
本実施例では、Ｃａｓ９に結合体化されたヒト抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）抗体を含むＴＡＧＥ剤の内部移行及び生体外編集を評価した。
ＳｐｙＴａｇ（ＳＴ）に連結された抗ＦＡＰ抗体、及びｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ（ＳＣ）部分に連結されたＣａｓ９を、哺乳動物細胞における抗体の発現のための標準的な方法を用いて発現させた（Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ． ａｌ．，（２０１８）．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１３（１），９９参照）。ＳｐｙＴａｇは抗体の軽鎖のＣ末端に遺伝子融合していた一方、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒはＣａｓ９－２ｘＮＬＳのＮ末端に遺伝子融合してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳを形成していた。抗ＦＡＰ－ＳｐｙＴａｇをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９に結合体化して抗ＦＡＰ抗体／Ｃａｓ９結合体（「ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９」）を形成した。複合体の一部が抗体１つあたり１つのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９を含んでいた（ＦＡＰ－ＳｐｙＴａｇ＝ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９）一方、結合体の別の部分は、抗体１つあたり２つのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９部分を含んでいた（ＦＡＰ－ＳｐｙＴａｇ＝（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｃａｓ９）２）。抗体１つあたり２本の軽鎖及び２つのＳｐｙＴａｇが存在するために、単一の抗体の上に２つのＣａｓ９分子を有する複合体が形成された。
結合体の結合性を評価するために、付着性ヒト皮膚線維芽細胞を２７０ｎＭのタンパク質と共に４℃または３７℃で１時間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳによって分析した。Ａ４８８信号は、標識付けされた抗体またはＡ４８８標識ガイド（Ｃａｓ９が存在する場合）に由来する。ＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９は抗ＦＡＰ抗体単独と同程度に結合した。さらに、様々な細胞種においてＦＡＰ＝ＳＣ－Ｃａｓ９結合体の内部移行を、本明細書に記載のＦＡＣＳベース内部移行アッセイを用いて評価した。ＦＡＰ抗体及びＳＣ－Ｃａｓ９結合体はヒト線維芽細胞内に速やかに内部移行した。
続いて、抗ＦＡＰ抗体による線維芽細胞の生体外での編集を評価した。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡを各々のＴＡＧＥ剤に結び付けてリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質を線維芽細胞と共に共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。編集をｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ（ＳＣ）ありまたはなしでＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳと比較した。さらに、長いリンカー（ＬＬ）または短いリンカー（ＳＬ）によってｓｐｙタグ（ＳＴ）に連結された抗ＦＡＰ抗体を評価した。ヒト皮膚線維芽細胞を３７５０ｎＭの示された分子と共に１時間インキュベートし、その後、３７５ｎＭのＲＮＰの中でさらに５日間保った。編集された細胞をＣＤ４７表面タンパク質の消失によって検出した。編集値を各群についての技術的３反復の平均として決定した。
図１９Ａに示すように、ＳＣ－Ｃａｓ９に対するＦＡＰ－ＳＴ抗体の結合体化は、ＳＣ－Ｃａｓ９（裸対照）よりも高いレベルの編集を示した。非結合体化抗体の影響を除外するために、Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳの編集中に抗ＦＡＰ－ＳＴ抗体をトランスで添加した（Ｃ８０Ａ＋ＦＡＰ）。抗体１つあたり単一のＣａｓ９部分を有する結合体と同様に結合及び内部移行したにもかかわらず、２：１のＣａｓ９：Ａｂ結合体（Ａｂ１つあたり２つのＣａｓ９）は対照よりも良好に編集した。特に、高濃度においてＦＡＰ＝（４ｘＮＬＳ－ＳＣ－Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ）２は４ｘＮＬＳ－ＳＣ－Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ単独よりも増強された編集を示した（図１９Ｂ及び図１９Ｃ）。さらに、２：１のＣａｓ９：Ａｂ結合体は、非結合体化Ｃａｓ９とトランスで抗ＦＡＰ抗体が送達された条件よりも良好に編集した。
線維芽細胞にはＣＴＬＡ－４が発現しないので、ＦＡＰ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２のための陰性（アイソタイプ）対照として、抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ、Ｉｐｉ＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２）による線維芽細胞の編集を評価した。さらに、様々な抗体＝ＳＣ－Ｃａｓ９結合体が線維芽細胞に同程度に結合した（図１９Ｅ）。全ての構築物をヒト皮膚線維芽細胞（ドナー８１９４）に対して５０ｎＭの濃度で試験した。抗ＣＴＬＡ４対照構築物はＦＡＰ＝Ｃａｓ９結合体と同程度に編集し、線維芽細胞に結合し、このことは、線維芽細胞における取込み及び編集を可能にするさらなる機序が存在することを示唆していた。例えば、ＳＣ－Ｃａｓ９及びＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）は細胞結合性をあまり示さなかったのに対し、（線維芽細胞に対して）非特異的な様々な抗体を含むＣａｓ９結合体（例えば、繋ぎ合わされた２つのＣａｓ９を有するイピリムマブ、パリビズマブまたは抗体のＦｃ部分）は線維芽細胞に対する結合性を呈した（図１９Ｅ）。過剰なＦＡＰは線維芽細胞に対する抗ＦＡＰ抗体＝ＳＣ－Ｃａｓ９結合体の結合を遮断し、このことから、線維芽細胞の細胞表面上に発現したＦＡＰに対して抗ＦＡＰ抗体＝ＳＣ－Ｃａｓ９ ＴＡＧＥ剤の特異性が存在することが示唆された（図１９Ｅ）。
次に、過剰なＦｃ＝ＳＣ－Ｃａｓ９（ＳＣ－Ｃａｓ９に結合体化された抗体Ｆｃドメイン）との競合アッセイを実施して、抗ＦＡＰ抗体及びＳＣ－Ｃａｓ９を含むＴＡＧＥ剤による結合が抗ＦＡＰ抗体のＦｃ領域によって媒介されるか否かを判定した。Ｆｃの添加は、イピリムマブ及びパリビズマブに加えて抗ＦＡＰ抗体＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２ＴＡＧＥ剤の線維芽細胞に対する結合を遮断した。これは、線維芽細胞に対する抗ＦＡＰ抗体＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２結合体の結合が抗ＦＡＰ抗体のＦｃドメインによって、またはＣａｓ９自体によって媒介され得ることを示唆している。しかいながら、図１９Ｆに示すように、Ｆｃ＝ＳＣ－Ｃａｓ９によって遮断され得なかった残存する抗ＦＡＰ抗体＝（ＳＣ－Ｃａｓ９）２結合があり、これは、ＦＡＰによって媒介される結合と整合している（図１９Ｆ中の四角を参照されたい）。
実施例１９．ヒトＴ細胞における抗体ＴＡＧＥ剤スクリーニング
この試験の目的は、Ｔ細胞指向性ＴＡＧＥ剤を操作するための抗体を同定することであった。このスクリーニングでは、臨床的に立証されているヒトＴ細胞上の標的に対する抗体を収集した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳＣ）－Ｃａｓ９に結合体化するように、ヒトＩｇＧ１主鎖上にＳｐｙＴａｇを有する抗体を生成し、結合及び編集を検証した。
抗体スクリーニング
このスクリーニングアッセイのために、ｓｐｙｔａｇでタグ付けされたヒトＴ細胞結合性抗体をＥｘｐｉ２９３細胞においてクローニングし発現させた。Ｅｘｐｉ２９３細胞を２４ウェルプレート形式で４ｍＬの培地の中で成長させた。０日目に、生存能が少なくとも９５％である３×１０６／ｍＬの細胞に、細胞１ｍＬあたり０．５ｕｇの、抗体の重鎖を発現するベクター、及び細胞１ｍＬあたり０．５ｕｇの、抗体の軽鎖を発現するベクターをトランスフェクトした。４日目か、生存能が８５％未満に落ち込んだ時かのどちらか早い方において細胞を採集した。細胞を３０００ｘｇで１０分間ペレット化し、上清をＰＢＳで１：１の体積：体積に希釈し、０．４４ｕＭのフィルターで濾過した。当日使用しない場合は上清を４℃で一晩維持した。
抗体を精製するために各抗体を、上に記したように調製された２５ｍＬのＥｘｐｉ２９３細胞において発現させた。その後、抗体発現細胞からの細胞溶解物を５ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ５ｍＬ ＨｉＴｒａｐカラムに適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体を５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液で溶離させ、ピーク画分をプールした。プールされた溶離液のｐＨを１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８でｐＨ７．５に調整した。最終抗体溶液を、３０ｋＤ濃縮器を使用して濃縮した。
Ｆ（ａｂ’）２断片を生産するために、Ｇｅｎｏｖｉｓ ＦｒａｇＩＴ Ｍｉｄｉ－Ｓｐｉｎ樹脂を消化用緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．５）で平衡化した。抗体を、損失がいくらかあることを考慮して最終Ｆ（ａｂ’）２の望まれる量の２倍添加し、室温で２時間振盪することで消化した。消化はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。
ｓｐｙｔａｇでタグ付けされた精製抗体（Ａｂ－ＳＴ）をＥｘｐｉ２９３培地中で、別名「ＳＣ－Ｃａｓ９」とも呼称されるＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）と混合して、Ａｂ－ＳＴ＝ＳＣ－Ｃａｓ９結合体を形成した。結合体化していない余分なＣａｓ９をｓｐｙｔａｇ（室温で１～２時間、５×ＳｐｙＴａｇ溶液）で「失活させ」て、余分なＣａｓ９によって作り出されるノイズがない状態での遮断を可能にした。ＰＢＭＣを１０％のＥｘｐｉ２９３培地で処理することによってＰＢＭＣによる実験を実施した。Ａｂ－ＳＴ＝ＳＣ－Ｃａｓ９がＥｘｐｉ２９３培地中で結合体化され、それによって完全な結合体の精製の必要性がなくなった。
このアッセイのために、ヒトＴ細胞上の受容体に結合した４５種の抗体が同定され、クローニングのために選択された。ｓｐｙｔａｇでタグ付けされた３１種の抗体をさらなる試験のために発現させた。
抗体のＴ細胞結合性
ｓｐｙｔａｇでタグ付けされた３１種のＴ細胞結合性抗体をヒトＴ細胞に対する結合性について試験した。パリビズマブ（「Ｐａｌｉ」）、及び染色されていない細胞を使用するＲＮＰなしの条件を陰性対照として評価した。０、２または７日間活性化させた全ＰＢＭＣを、示された標的に対する抗体で７０ｎＭで１時間、４℃で染色した。Ａ４８８標識抗ヒト二次抗体を使用して結合を検出した。多重比較を伴うＡＮＯＶＡを行って各抗体をＰａｌｉと比較し、それらの染色がＰａｌｉよりも有意に強い場合に抗体を次の工程に移した。
試験された３１種の抗体のうち１４種がヒトＴ細胞にバックグラウンドよりも有意に強く結合した。同定された抗体は以下の抗原を標的とするものであった：ＣＤ１１ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ５９、ＧＩＴＲ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合体化システムを使用して抗ＣＴＬＡ－４マウス及びヒト抗体（イピリムマブ及びトレメリムマブを含む）を含有するＴＡＧＥ剤を、前もって脾細胞及び刺激されたＰＢＭＣに対して試験した。これらのＴＡＧＥ剤は、内部移行することはできたものの、編集が認められなかった。イピリムマブ及びトレメリムマブのさらなる研究を、Ｔ細胞抗体スクリーニングで同定された新たな抗原に加えて以下に記載する。
Ａｂ＝Ｃａｓ９結合体のＴ細胞結合性
次に、イピリムマブ（「Ｉｐｉ」）及びトレメリムマブ（「Ｔｒｅｍ」）に加えて、先の工程で同定された１４種の抗体（合計１６種の抗体）に対して、Ｃａｓ９との結合体化についての選択を行った。全ＰＢＭＣを２日間活性化させ、その後、７または７０ｎＭのＡｂ＝Ｃａｓ９結合体で染色した。結合は、Ａ５５０標識ｇＲＮＡの存在を基準として検出された。パリビズマブ（Ｐａｌｉ）を陰性対照として使用した。多重比較を伴うＡＮＯＶＡを行って各抗体をＰａｌｉと比較し、それらの染色がＰａｌｉよりも有意に強い場合に抗体を次の工程に移した。
図２０Ａに示すように、試験されたＡｂ＝Ｃａｓ９結合体（抗体＝Ｃａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」））のうちの１４種がＴ細胞に陰性対照（Ｐａｌｉ）よりも有意に強く結合した。
ヒトＴ細胞に対するＡｂ＝Ｃａｓ９結合体の結合性を、過剰な非結合体化抗体がＡｂ＝Ｃａｓ９結合体の結合を遮断するか否かを評価する５Ｘの「冷たい」抗体による７０ｎＭ遮断アッセイにおいてさらに評価した。全ＰＢＭＣを２日間活性化させ、まず、結合体化しておらずＳｐｙＴａｇでタグ付けされた３５０ｎＭの抗体で３０分間遮断した。その後、細胞を７０ｎＭのＡｂ＝Ｃａｓ９結合体で染色した。Ａ５５０信号は、Ａ５５０標識ガイドから来る。Ａ５５０信号に基づいて、遮断あり及びなしでの抗体結合体の結合の量を比較することによって遮断パーセントを決定した。
図２０Ｂ～２０Ｅに示すように、試験された１５種のＴＡＧＥ剤（Ａｂ＝Ｃａｓ９）のうち１４種はヒトＴ細胞に結合し、遮断アッセイにおいて非結合体化抗体によって遮断された。これらの結果は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＧＩＴＲ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を標的とする抗体を含むＴＡＧＥ剤（Ａｂ＝Ｃａｓ９）がヒトＴ細胞に特異的に結合できることを示している。
実施例２０．抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ２５抗体ＴＡＧＥ剤の生体外でのヒトＴ細胞の編集
（実施例１９に記載のＴ細胞スクリーニングで同定された）抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ２５ａ抗体、またはその抗原結合性断片をＣａｓ９に結合体化して抗体ベースのＴＡＧＥ剤（ＣＤ１１ａ＝Ｃａｓ９、及びＣＤ２５ａ＝Ｃａｓ９）を形成した。詳しくは、抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ２５ａ抗体をＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－４ｘＮＬＳ（「ＡＣ２６」）またはＣａｓ９（ＷＴ）－２ｘＮＬＳ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＨＴＮ（「ＡＣ２８」）に結合体化した。結合体を精製し、共インキュベートによるヒトＴ細胞の編集を試験した。ＣＤ４７を標的とするガイドＲＮＡを各々のＴＡＧＥ剤に結び付け、ＴＡＧＥ剤をＴ細胞と共インキュベートして編集を試験した。編集は、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７の消失を測定する表現型読み取りを用いて測定された。２名の異なるドナーからのヒトＴ細胞の編集を評価した。より小さい分子の方がより高度に編集できるのか否かを見極めるために完全長抗体及びＦｃドメインがない抗体断片を試験した。パリビズマブを陰性対照として使用した。
図２１のＡ及びＢに示すように、抗ＣＤ１１ａ抗体か抗ＣＤ２５抗体かのどちらかまたはその抗原結合性断片に結合体化されたＣａｓ９（例えばＡＣ２６またはＡＣ２８）は、アイソタイプ対照抗体と比較してヒトＴ細胞の増加した編集を呈した。第２のドナーから得られたヒトＴ細胞において同程度の編集が成し遂げられた。
実施例２１．アンプリコン配列決定に対するフローサイトメトリーによる生体外編集測定結果の比較
先の実施例において、生体外での編集は、いくつかの例では、フローサイトメトリーを用いる表現型読み取りによって評価された（例えば、実施例３、８、１４、１７、１８、２０、２３、２７、２８、３９、４５または４７を参照されたい）。フローサイトメトリーは、標準的なアンプリコン配列決定手法と比較して編集を高速で検出する方法を提供する。フローサイトメトリーによって得られた編集測定結果が配列決定によって得られた編集測定結果と相関する程度を明らかにするために、ＴＡＧＥ剤によって（共インキュベートまたはヌクレオフェクションによって）編集されたＴ細胞または線維芽細胞をフローサイトメトリーと次世代シーケンシング（ＮＧＳ）との両方によって評価した。
Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳまたは４ｘＮＬＳ－Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）－２ｘＮＬＳを含むＴＡＧＥ剤を、ＣＤ４７またはＣＤ４４を標的とするｓｇＲＮＡと複合体化させてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。非標的指向性ｓｇＲＮＡを陰性対照として使用した（ｓｇＢＦＰ；ＢＦＰは、ヒトゲノム中に存在していない遺伝子である）。
ＴＡＧＥ剤による線維芽細胞の編集を各ＴＡＧＥ剤による共インキュベートまたはヌクレオフェクションによって評価した。
共インキュベートによる線維芽細胞の編集を評価するために、ヒト皮膚線維芽細胞を組織培養プレート上で成長させた。ＲＮＰを９６ウェル丸底超低付着性組織培養プレートのウェルに加えた。３０ｕＬの適切なＲＮＰを添加して５ｕＭのＲＮＰ濃度に達した。ヒト皮膚線維芽細胞を組織培養プレートから採集し、線維芽細胞成長培地中に２０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。１０ｕＬの線維芽細胞を、ＲＮＰが入ったウェルに加えた。各ウェルの最終条件は、体積４０ｕＬ、３．７５ｕＭのＲＮＰ、５×１０６細胞／ｍＬで２００，０００細胞／ウェルであった。プレートを摂氏３７度で１時間インキュベートした。インキュベート後、ウェル１つあたり１ｍＬの終体積とするために各試料を９６０ｕＬの線維芽細胞成長培地が入った１２ウェル組織培養プレートの１つのウェルに移した。３日後に細胞をプレートから浮かせ、６ウェル組織培養プレートに移した。さらに３日後（共インキュベートから６日後）に細胞を採集し、２分割した。以下に概要を述べるように、細胞の半分をゲノムＤＮＡ単離のために使用して次世代配列決定（ＮＧＳ）のために処理し、半分の細胞をフローサイトメトリーのために処理した。
ヌクレオフェクションによる線維芽細胞の編集を評価するために、ヒト皮膚線維芽細胞を組織培養プレート上で成長させた。ＲＮＰを９６ウェル丸底超低付着性組織培養プレートのウェルに加えた。５ｕＬの適切なＲＮＰを各ウェルに加えて５ｕＭのＲＮＰ濃度に達した。ヒト皮膚線維芽細胞を組織培養プレートから採集し、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション用緩衝液Ｐ４中に１０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。２０ｕＬの線維芽細胞を、ＲＮＰが入ったウェルに加えた。各ウェルの最終条件は、体積２５ｕＬ、１ｕＭのＲＮＰ、８×１０６細胞／ｍＬで２００，０００細胞／ウェルであった。ＲＮＰと混合した細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ用のヌクレオフェクションカセットのウェルに移した。機器コードＤＳ－１３７を用いてＬｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して細胞をヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション後、ウェル１つあたり１ｍＬの終体積とするために各試料を９７５ｕＬの線維芽細胞成長培地が入った１２ウェル組織培養プレートの１つのウェルに移した。３日後に細胞をプレートから浮かせ、６ウェル組織培養プレートに移した。さらに３日後（共インキュベートから６日後）に細胞を採集し、２分割した。以下に記載するように、細胞の半分をゲノムＤＮＡ単離のために使用して次世代配列決定（ＮＧＳ）のために処理し、半分の細胞をフローサイトメトリーのために処理した。
ＴＡＧＥ剤によるＴ細胞の編集を各ＴＡＧＥ剤との共インキュベートによって評価した。ヒトＴ細胞を、Ｔ細胞刺激のためのＣＤ３及びＣＤ２８架橋抗体が入ったＴ細胞培養培地中で４日間培養した。４日間刺激した後、細胞を採集し、Ｔ細胞成長培地中に２０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。ＲＮＰを９６ウェル丸底超低付着性組織培養プレートのウェルに加えた。３０ｕＬの適切なＲＮＰを各ウェルに加えて５ｕＭのＲＮＰ濃度に達した。１０ｕＬのＴ細胞を、ＲＮＰが入ったウェルに加えた。各ウェルの最終条件は、体積４０ｕＬ、３．７５ｕＭのＲＮＰ、５×１０６細胞／ｍＬで２００，０００細胞／ウェルであった。プレートを摂氏３７度で１時間インキュベートした。インキュベート後、各試料を１６０ｕＬのＴ細胞成長培地で希釈した。次の６日間にわたって細胞に新鮮な培地を供給し、標準的なＴ細部成長条件のために適切と認められる場合にはより大きなウェル体積に増殖させた。共インキュベート後からさらに６日後に細胞を採集し、２分割した。細胞の半分をゲノムＤＮＡ単離のために使用して次世代配列決定（ＮＧＳ）のために処理し、半分の細胞をフローサイトメトリーのために処理した。
まず、フローサイトメトリーを用いて表面ＣＤ４７またはＣＤ４４の消失を測定する表現型読み取りを用いて編集を測定した。細胞を標準的なフローサイトメトリー法によって処理し、ヒトＣＤ４４及びＣＤ４７タンパク質に対する抗体で染色した。試料をフローサイトメータで分析した。遺伝子編集は、ＣＤ４４またはＣＤ４７染色が減少した細胞の頻度を解析することによって測定された。ＣＤ４４指向性ＲＮＰで編集された細胞を、非標的指向性（ｓｇＢＦＰ）ＲＮＰで処理した細胞と比較してＣＤ４４染色について分析した。ＣＤ４７指向性ＲＮＰで編集された細胞を、非標的指向性（ｓｇＢＦＰ）ＲＮＰで処理した細胞と比較してＣＤ４７染色について分析した。
次に、次世代配列決定を用いて編集を測定した。少なくとも１０，０００細胞／試料から単離されたゲノムＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲプライマーは、遺伝子特異的領域、及びＩｌｌｕｍｉｎａ系シーケンシングを可能にするアダプターを含有する領域を含有していた。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング機器を使用して各試料の配列決定を行った。各試料の読み取られた配列決定情報をヒトゲノムの標的領域のゲノムＤＮＡ配列とアラインメントした。各試料について、改変されていない配列、ならびに挿入及び欠失突然変異（インデル）を含有する配列を計数した。遺伝子編集は、各試料の対応するＲＮＰ標的部位におけるインデル突然変異の頻度として測定された。
各試料について、フローサイトメトリーによって測定された遺伝子編集を、ＮＧＳによって測定された遺伝子編集と比較した。
図２２Ａに示すように、フローサイトメトリーによって測定された編集の百分率は、遺伝子及び細胞種にわたってアンプリコン配列決定と相関していた。フローサイトメトリー及び配列決定によって得られた編集測定結果は、編集の度合いが小さい細胞においても相関していた（図２２Ｂ）。
これらの結果は、フローサイトメトリーによる表現型読み取りがアンプリコン配列決定アッセイの代わりになり、どちらを用いてもＴＡＧＥ剤の遺伝子編集の有効性を決定できることを示している。図２２Ａ及び図２２Ｂに示される結果はまた、異なる細胞種、ｓｇＲＮＡ及び編集効率にわたってフローサイトメトリーアッセイが遺伝子編集のレベルを、配列決定によって得られる編集測定結果に比べて２～４分の１に低く見積もる可能性があることも示唆している。
（表４）配列表
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Claims (130)

  1. 標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤であって、
    細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び
    核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチド
    を含み、
    前記細胞外細胞膜結合分子を提示している細胞の中に前記部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行できるように、前記抗原結合性ポリペプチドと前記部位特異的改変性ポリペプチドとが安定して結び付いている、
    前記ＴＡＧＥ剤。
  2. 前記抗原結合性ポリペプチドが、抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体である、請求項１に記載のＴＡＧＥ剤。
  3. 前記部位特異的改変性ポリペプチドがヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む、請求項１または請求項２に記載のＴＡＧＥ剤。
  4. 前記ヌクレアーゼがＤＮＡエンドヌクレアーゼである、請求項３に記載のＴＡＧＥ剤。
  5. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項４に記載のＴＡＧＥ剤。
  6. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ１２である、請求項４に記載のＴＡＧＥ剤。
  7. 前記細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、前記ガイドＲＮＡと前記部位特異的改変性ポリペプチドとがリボ核タンパク質を形成している、請求項１～６のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  8. 標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤であって、
    細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び
    ＣＲＩＳＰＲ配列を認識するＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む部位特異的改変性ポリペプチド
    を含み、
    前記細胞外細胞膜結合分子を提示している細胞の中に前記部位特異的改変性ポリペプチドが内部移行できるように、前記抗原結合性ポリペプチドと前記部位特異的改変性ポリペプチドとが安定して結び付いており、
    前記抗原結合性ポリペプチドが、抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体である、
    前記ＴＡＧＥ剤。
  9. 前記細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、前記ガイドＲＮＡと前記部位特異的改変性ポリペプチドとがリボ核タンパク質を形成している、請求項８に記載のＴＡＧＥ剤。
  10. 前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項８または請求項９に記載のＴＡＧＥ剤。
  11. 前記部位特異的改変性ポリペプチドが、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  12. 前記部位特異的改変性ポリペプチドが、
    前記抗原結合性ポリペプチドに結合する結合体化部分
    をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  13. 前記結合体化部分がタンパク質である、請求項１２に記載のＴＡＧＥ剤。
  14. 前記タンパク質が、プロテインＡ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＨａｌｏ－Ｔａｇである、請求項１３に記載のＴＡＧＥ剤。
  15. 前記部位特異的改変性ポリペプチドと前記抗原結合性ポリペプチドとがリンカーを介して結合体化している、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  16. 前記リンカーが切断可能である、請求項１５に記載のＴＡＧＥ剤。
  17. 前記抗体模倣体が、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合性分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ｎａｎｏＣＬＡＭＰ、ユニボディ、バーサボディ、アプタマー、またはペプチド性分子である、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  18. 前記抗体の前記抗原結合性部分が、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ（ｍｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）２、またはイントラボディである、請求項２～１６のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  19. 前記抗体が完全抗体または二重特異性抗体である、請求項２～１６のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  20. 標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤であって、
    細胞外細胞膜結合タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を含む抗原結合性ポリペプチド、及び
    Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む部位特異的改変性ポリペプチド
    を含み、
    前記細胞外細胞膜結合タンパク質が発現している細胞の中に前記部位特異的改変性ポリペプチドが前記抗体またはその抗原結合性部分を介して内部移行できるように、前記抗体またはその抗原結合性部分と前記部位特異的改変性ポリペプチドとが結合体化部分を介して安定して結び付いている、
    前記ＴＡＧＥ剤。
  21. 前記部位特異的改変性ポリペプチドが、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項２０に記載のＴＡＧＥ剤。
  22. 前記少なくとも１つのＮＬＳがＳＶ４０ ＮＬＳを含む、請求項２１に記載のＴＡＧＥ剤。
  23. 前記ＳＶ４０ ＮＬＳがアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む、請求項２２に記載のＴＡＧＥ剤。
  24. 前記少なくとも１つのＮＬＳが、前記部位特異的改変性ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、または両方にある、請求項２０～２３のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  25. 少なくとも２つのＮＬＳを含む、請求項２０～２４のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  26. 前記細胞外細胞膜結合タンパク質が発現している細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、前記ガイドＲＮＡと前記部位特異的改変性ポリペプチドとが核タンパク質を形成している、請求項２０～２５のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  27. 前記部位特異的改変性ポリペプチドが、
    前記抗体またはその抗原結合性部分に結合できる結合体化部分
    をさらに含む、請求項２０～２６のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  28. 前記結合体化部分がタンパク質である、請求項２７に記載のＴＡＧＥ剤。
  29. 前記タンパク質が、プロテインＡ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＨａｌｏ－Ｔａｇである、請求項２８に記載のＴＡＧＥ剤。
  30. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがアミノ酸置換Ｃ８０Ａを含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  31. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、配列表に記載されるＣａｓ９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２０～２９のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  32. 前記抗体の前記抗原結合性部分が、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）２、またはイントラボディである、請求項２０～２９のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  33. 前記抗体が完全抗体または二重特異性抗体である、請求項２０～２９のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  34. 前記細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質が、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＡｃｈＲ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐＣａｍ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、またはＲＳＶである、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  35. 前記細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質がＣＤ１１ａである、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  36. 前記抗原結合性ポリペプチドが抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３５に記載のＴＡＧＥ剤。
  37. 前記抗ＣＤ１１ａ抗体がエファリズマブである、請求項３６に記載のＴＡＧＥ剤。
  38. 前記細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質がＣＤ２５である、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＴＡＧＥ剤。
  39. 前記抗原結合性ポリペプチドが抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３８に記載のＴＡＧＥ剤。
  40. 前記抗ＣＤ２５抗体がダクリズマブである、請求項３９に記載のＴＡＧＥ剤。
  41. ＣＲＩＳＰＲ配列を認識するＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、及び
    細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体に結合する、結合体化部分
    を含む、部位特異的改変性ポリペプチド。
  42. 細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含む、請求項４１に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  43. 前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項４１または請求項４２に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  44. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがアミノ酸置換Ｃ８０Ａを含む、請求項４３に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  45. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、配列表に記載されるＣａｓ９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  46. 前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ１２ヌクレアーゼである、請求項４１または請求項４２に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  47. 少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項４１～４６のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  48. 前記少なくとも１つのＮＬＳがＳＶ４０ ＮＬＳを含む、請求項４６に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  49. 前記ＳＶ４０ ＮＬＳがＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む、請求項４７に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  50. 少なくとも２つのＮＬＳを含む、請求項４１～４９のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  51. 前記少なくとも１つのＮＬＳが、前記部位特異的改変性ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、または両方にある、請求項４１～５０のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  52. 前記抗体、その抗原結合性部分、または抗体模倣体に結合できる結合体化部分
    をさらに含む、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  53. 前記結合体化部分がタンパク質である、請求項５２に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  54. 前記タンパク質が、プロテインＡ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＨａｌｏ－Ｔａｇである、請求項５３に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  55. 前記細胞外細胞膜結合分子が、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＡｃｈＲ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐＣａｍ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、またはＲＳＶからなる群から選択されるタンパク質である、請求項４１～５４のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  56. 前記細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質がＣＤ１１ａである、請求項４１～５５のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  57. 前記抗原結合性ポリペプチドが抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片である、請求項５６に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  58. 前記抗ＣＤ１１ａ抗体がエファリズマブである、請求項５７に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  59. 前記細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質がＣＤ２５である、請求項４１～５５のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  60. 前記抗原結合性ポリペプチドが抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片である、請求項５９に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  61. 前記抗ＣＤ２５抗体がダクリズマブである、請求項６０に記載の部位特異的改変性ポリペプチド。
  62. 請求項４１～６１のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチド及びガイドＲＮＡを含む核タンパク質であって、前記ガイドＲＮＡが、前記細胞外細胞膜結合タンパク質を提示している細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするものである、前記核タンパク質。
  63. 請求項４１～６１のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  64. 請求項６３に記載の核酸を含む、ベクター。
  65. 請求項４１～６１のいずれか１項に記載の部位特異的改変性ポリペプチドを含む、細胞。
  66. 標的細胞のゲノムを改変する方法であって、
    前記標的細胞を、請求項１～４０のいずれか１項に記載の標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤と接触させること
    を含む、前記方法。
  67. 前記標的細胞が真核細胞である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記哺乳動物細胞が、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記部位特異的改変性ポリペプチドが前記ゲノムの標的領域に切断部位を生成し、それによって前記ゲノムを改変する、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記ゲノムの前記標的領域が標的遺伝子である、請求項６６～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記標的遺伝子の発現を改変するのに有効である、請求項７１に記載の方法。
  73. 基準レベルと比較して前記標的遺伝子の発現を増強するのに有効である、請求項７２に記載の方法。
  74. 基準レベルと比較して前記標的遺伝子の発現を減少させるのに有効である、請求項６０に記載の方法。
  75. 哺乳動物対象において標的細胞内で核酸配列を改変する方法であって、
    前記対象において前記標的細胞を、
    以下：
    細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び
    前記標的細胞の前記核酸配列が改変されるような、前記標的細胞内で前記核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチド
    を含む標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤と接触させること
    を含む、前記方法。
  76. 哺乳動物対象において標的細胞内で核酸配列を改変する方法であって、
    以下：
    細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び
    前記標的細胞の前記核酸配列が改変されるような、前記標的細胞内で前記核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチド
    を含む標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤
    を前記対象に局所投与することを含む、前記方法。
  77. 筋肉内注射、骨内注射、眼内注射、腫瘍内注射、または皮内注射によって前記ＴＡＧＥ剤を前記対象に局所投与すること
    を含む、請求項７５または請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ＴＡＧＥ剤の投与の後に、前記対象において遺伝子改変された標的細胞の数を増大させるのに有効である、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記哺乳動物対象がヒト対象である、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記対象が、眼疾患、幹細胞障害、及びがんから選択される疾患を有し、前記方法が、前記疾患を治療するのに有効である、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 標的哺乳動物細胞内で核酸配列を改変する方法であって、
    前記核酸配列が改変されるように、標的指向活性遺伝子編集（ＴＡＧＥ）剤が前記標的細胞内に内部移行する条件の下で、前記標的哺乳動物細胞と前記ＴＡＧＥ剤とを接触させること
    を含み、
    前記ＴＡＧＥ剤が、
    細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、及び
    前記標的細胞内で前記核酸配列を認識する部位特異的改変性ポリペプチド
    を含むものであり、
    前記ＴＡＧＥ剤の前記内部移行が電気穿孔に依存しない、
    前記方法。
  82. 前記標的哺乳動物細胞が、造血細胞（ＨＳＣ）、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または線維芽細胞である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記標的哺乳動物細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、またはＨＳＣでない骨髄細胞である、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記抗原結合性ポリペプチドが、ヒトＨＳＣ上の細胞外細胞膜結合分子に特異的に結合する、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記ＨＳＣ上の前記細胞外細胞膜結合分子が、ＣＤ３４、ＥＭＣＮ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ｃｋｉｔ、ＣＤ４５、またはＣＤ４９Ｆである、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記標的哺乳動物細胞と前記ＴＡＧＥ剤とが、生体外での共インキュベーションによって接触する、請求項８１～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. それを必要としている対象に投与される遺伝子改変された標的細胞をもたらす、請求項８１～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記標的哺乳動物細胞と前記ＴＡＧＥ剤とが、対象の組織への注射によってインサイチュで接触する、請求項８１～８５のいずれか１項に記載の方法。
  89. 筋肉内注射、骨内注射、眼内注射、腫瘍内注射、または皮内注射によって前記ＴＡＧＥ剤が前記対象に投与される、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記核酸が前記標的細胞のゲノム内の遺伝子であり、前記遺伝子の発現が前記改変の後に変化する、請求項７５～８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 前記標的哺乳動物細胞が、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項７５～９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記抗原結合性ポリペプチドが、抗体、抗体の抗原結合性部分、または抗体模倣体である、請求項７５～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記抗体模倣体が、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合性分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アプタマー．アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ｎａｎｏＣＬＡＭＰ、ユニボディ、バーサボディ、アプタマー、またはペプチド性分子である、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記抗体の前記抗原結合性部分が、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ（ｍｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）２、またはイントラボディである、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記抗体が完全抗体または二重特異性抗体である、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記抗原結合性ポリペプチドに結合される前記細胞外細胞膜結合分子が、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＡｃｈＲ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐＣａｍ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、またはＲＳＶである、請求項７５～９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質がＣＤ１１ａである、請求項７５～９５のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記抗原結合性ポリペプチドが抗ＣＤ１１ａ抗体またはその抗原結合性断片である、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記抗ＣＤ１１ａ抗体がエファリズマブである、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記細胞外細胞膜結合分子またはタンパク質がＣＤ２５である、請求項７５～９５のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記抗原結合性ポリペプチドが抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記抗ＣＤ２５抗体がダクリズマブである、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記ＴＡＧＥ剤が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項７５～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記ＴＡＧＥ剤が、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項７５～１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記ＴＡＧＥ剤が４つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記ＴＡＧＥ剤が６つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１０４に記載の方法。
  107. 前記ＴＡＧＥ剤が７つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１０４に記載の方法。
  108. 前記ＴＡＧＥ剤が８つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１０４に記載の方法。
  109. 前記ＮＬＳがＳＶ４０ ＮＬＳを含む、請求項１０３～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記ＳＶ４０ ＮＬＳがアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記標的哺乳動物細胞が、標的哺乳動物細胞の集団である、請求項７５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 遺伝子改変された標的哺乳動物細胞の数を増大させるのに有効である、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記ＴＡＧＥ剤の前記部位特異的改変性ポリペプチドが、前記標的哺乳動物細胞において増強された細胞内部移行を有する、請求項７５～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  114. 前記ＴＡＧＥ剤の前記部位特異的改変性ポリペプチドが、前記標的哺乳動物細胞において増強された核内部移行を有する、請求項７５～１１３のいずれか１項に記載の方法。
  115. 前記部位特異的改変性ポリペプチドがヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む、請求項７５～１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記部位特異的改変性ポリペプチドが核酸依存性ヌクレアーゼであり、前記ＴＡＧＥ剤が、前記標的哺乳動物細胞の前記核酸配列の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイド核酸をさらに含み、前記ガイド核酸と前記核酸依存性ヌクレアーゼとが核タンパク質を形成している、請求項７５～１１５のいずれか１項に記載の方法。
  117. 前記部位特異的改変性ポリペプチドがＲＮＡ依存性ヌクレアーゼであり、前記ＴＡＧＥ剤が、前記標的哺乳動物細胞の前記核酸配列の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、前記ガイドＲＮＡと前記ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼとがリボ核タンパク質を形成している、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記ガイドＲＮＡが、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｃｒ：ｔｒＲＮＡである、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼがクラス２Ｃａｓポリペプチドである、請求項１１７に記載の方法。
  120. 前記クラス２ＣａｓポリペプチドがＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記ＩＩ型ＣａｓポリペプチドがＣａｓ９である、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記クラス２ＣａｓポリペプチドがＶ型Ｃａｓポリペプチドである、請求項１１９に記載の方法。
  123. 前記Ｖ型ＣａｓポリペプチドがＣａｓ１２である、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記部位特異的改変性ポリペプチドが、
    前記抗原結合性ポリペプチドまたはそれに結合した相補的結合性部分に結合する、結合体化部分
    をさらに含む、請求項７５～１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 前記結合体化部分がタンパク質である、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記タンパク質が、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＨａｌｏ－Ｔａｇである、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記部位特異的改変性ポリペプチドと前記抗原結合性ポリペプチドとがリンカーを介して結合体化している、請求項７５～１２６のいずれか１項に記載の方法。
  128. 前記リンカーが切断可能リンカーである、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記ＴＡＧＥ剤が、エンドソーム脱出剤をさらに含む、請求項７５～１２８のいずれか１項に記載の方法。
  130. 前記エンドソーム脱出剤がＴＤＰまたはＴＤＰ－ＫＤＥＬ（配列番号１２３）である、請求項１２９に記載の方法。
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