JP6472784B2 - 細胞内在化を誘導するためのcd20結合免疫毒素及びそれを用いる方法 - Google Patents
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Description
志賀毒素サブユニットA由来エフェクター領域はCD20の細胞内在化を誘導するため、本発明は、機能のために細胞内在化を必要とするCD20を標的とする治療剤を操作するための課題を解決する。本発明は、細胞外CD20抗原に結合し、CD20を、細胞膜での位置から細胞の内部に迅速に内在化させるCD20結合タンパク質を提供する。ある特定の開示されるCD20結合タンパク質は、その表面上にCD20を発現する細胞を死滅させる。ある特定の開示されるCD20結合タンパク質は、分子カーゴの形態でさらなる外来物質を、その表面上にCD20を発現する細胞の内部に正確に送達することができる。本発明は、CD20を含み、CD20発現細胞の内部へのペイロードの正確な送達を可能にする多数の免疫毒素薬剤化可能な標的に拡張される。
本発明は、各CD20結合タンパク質が、1)細胞標的化のための免疫グロブリン型結合領域を含むCD20結合領域と、2)細胞死滅のための志賀毒素エフェクター領域とを含む、特定の細胞型の選択的死滅のための様々なCD20結合タンパク質を提供する。CD20標的化免疫グロブリン型結合領域と、志賀毒素サブユニットA由来領域との連結は、強力な志賀毒素細胞毒性の細胞型特異的標的化の操作を可能にする。このシステムは、様々な志賀毒素エフェクター領域と、さらなる外来物質とを同じCD20結合領域に連結して、CD20発現細胞を含む多様な適用を提供することができる点でモジュラー式である。本発明のCD20結合タンパク質は、真核細胞の外部細胞膜を貫通するCD20分子の少なくとも1つの細胞外部分に特異的に結合することができる免疫グロブリン型CD20結合領域に連結された志賀毒素ファミリーのメンバーのAサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域を含む。この一般構造は、様々なCD20結合領域を、様々な位置で、又はそれらの間を異なるリンカーを用いて志賀毒素サブユニットA由来エフェクター領域に連結して、同じ一般構造の変動をもたらすことができる点でモジュラー式である(例えば、図1を参照されたい)。
本発明の目的のために、用語「CD20結合領域」とは、CD20分子の細胞外部分に特異的に結合することができるポリペプチド領域を指す。CD20の名称は関連する構造を有する複数のタンパク質及び様々な種に由来するポリペプチド配列を指してもよいが、本発明の目的のために、用語「CD20」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに変化してもよい哺乳動物中に存在するBリンパ球抗原CD20タンパク質を指す。例えば、ヒトにおいては、CD20は主なポリペプチド配列UnitProt P11836及びNCBI受託番号NP690605.1により表されるタンパク質を指すが、異なるアイソフォーム及びバリアントが存在してもよい。様々なCD20タンパク質のポリペプチド配列が、コウモリ、ネコ、ウシ、イヌ、マウス、マーモセット、及びラットなどの様々な種において記載されており、遺伝子相同性に基づくいくつかの他の種におけるバイオインフォマティクスにより予測することができる(例えば、CD20は、ヒヒ、マカク、テナガザル、チンパンジー、及びゴリラなどの様々な霊長類において予測されている)(Zuccolo J et al., PLoS One 5: e9369 (2010)及びNCBIタンパク質データベース(National Center for Biotechnology Information、U.S.)を参照されたい)。当業者であれば、CD20タンパク質が参照配列とわずかに異なる場合であっても、哺乳動物においてそれを同定することができる。
本発明の目的のために、語句「志賀毒素エフェクター領域」とは、リボソームを不活化し、細胞毒性効果及び/又は細胞増殖抑制効果をもたらすことができる志賀毒素ファミリーのメンバーの志賀毒素Aサブユニットに由来するポリペプチド領域を指す。志賀毒素ファミリーのメンバーとは、構造的及び機能的に関連する、特に、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)及び大腸菌(E. coli)から単離される毒素(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))である天然タンパク質毒素のファミリーの任意のメンバーを指す。例えば、志賀毒素ファミリーは、志賀赤痢菌血清型1から単離される真の志賀毒素(Stx)、腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素1バリアント(SLT1又はStx1又はSLT−1又はSlt−I)、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素2バリアント(SLT2又はStx2又はSLT−2)を包含する。SLT1はStxとただ1個の残基で異なり、両方ともベロ細胞毒素又はベロ毒素(VT、Verotoxin)と呼ばれている(O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992))。SLT1及びSLT2バリアントはアミノ酸配列レベルでは互いに約53〜60%類似するに過ぎないが、それらは志賀毒素ファミリーのメンバーと共通の酵素活性及び細胞毒性の機構を共有する(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))。定義されたサブタイプStx1a、Stx1c、Stx1d、及びStx2a〜gなどの、39を超える異なる志賀毒素が記載されている(Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012))。志賀毒素をコードする遺伝子は水平遺伝子伝播により細菌種間で拡散し得るため、志賀毒素ファミリーのメンバーは任意の細菌種に自然に限定されない(Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol. 21: R242-6 (2011))。種間伝播の一例として、志賀毒素は患者から単離されたアシネトバクター・ヘモリティクス(A. haemolyticus)の株中で発見された(Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006))。志賀毒素をコードするポリヌクレオチドが新しい亜種又は種に進入すると、志賀毒素アミノ酸配列は、志賀毒素ファミリーのメンバーと共通の細胞毒性の機能を依然として維持しながら、遺伝子ドリフト及び/又は選択圧のためわずかな配列変化を生じることができると推定される(Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)を参照されたい)。
本発明のある特定の実施形態のうち、CD20結合タンパク質は、SLT−1A(配列番号1)、StxA(配列番号25)、又はSLT−2A(配列番号26)のアミノ酸75〜251を含むか、又はそれから本質的になる志賀毒素エフェクター領域を含む。さらなる実施形態は、志賀毒素エフェクター領域がSLT−1A(配列番号1)、StxA(配列番号25)、及び/又はSLT−2A(配列番号26)のアミノ酸1〜241を含むか、又はそれから本質的になるCD20結合タンパク質である。さらなる実施形態は、志賀毒素エフェクター領域がSLT−1A(配列番号1)、StxA(配列番号25)、及び/又はSLT−2A(配列番号26)のアミノ酸1〜251を含むか、又はそれから本質的になるCD20結合タンパク質である。さらなる実施形態は、志賀毒素エフェクター領域がSLT−1A(配列番号1)、StxA(配列番号25)、及び/又はSLT−2A(配列番号26)のアミノ酸1〜261を含むか、又はそれから本質的になるCD20結合タンパク質である。
本発明は、CD20タンパク質が、1)細胞標的化のための免疫グロブリン型CD20結合領域と、2)細胞内在化、場合により、同様に細胞死滅を誘導するための細胞毒性志賀毒素エフェクター領域を含む、特定の細胞型の選択的死滅のための様々なCD20結合タンパク質を提供する。CD20標的化免疫グロブリン型結合領域と、志賀毒素サブユニットA由来領域との連結により、CD20発現細胞に対する強力な志賀毒素細胞毒性の特異的標的化が可能になる。その好ましい実施形態において、本発明のCD20結合タンパク質は、細胞表面上に天然に存在するCD20に結合し、細胞に進入することができる。標的化された細胞型内に内在化されると、本発明のCD20結合タンパク質のある特定の実施形態は、細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド断片を標的細胞の細胞質ゾル中に送ることができる。標的化された細胞型の細胞質ゾル中に入ると、本発明のCD20結合タンパク質のある特定の実施形態は、リボソームを酵素的に不活化し、最終的に細胞を死滅させることができる。あるいは、非毒性バリアントを用いて、さらなる外来物質を送達する、及び/又は診断目的でCD20発現細胞の内部を標識することができる。
本発明の志賀毒素エフェクター領域は、CD20結合タンパク質を標的細胞の外部表面から標的細胞の細胞質ゾル中に移動させる、内在化機能を提供する。しかしながら、この内在化機能はまた、CD20の細胞内在化が促進又は誘導される点で加速機能でもある。本明細書及び特許請求の範囲で用いられる語句「迅速な内在化」とは、本発明のCD20結合タンパク質が、モノクローナル抗体リツキシマブなどの、先行技術の参照分子と比較して、結合時にCD20細胞内在化のための時間を減少させることを指す。
志賀毒素ファミリーのメンバーは真核細胞を死滅させるように適合化されるため、志賀毒素エフェクター領域を用いて設計されるCD20結合タンパク質は、強力な細胞死滅活性を示すことができる。志賀毒素ファミリーのメンバーのAサブユニットは、細胞の細胞質ゾル中に入ると、真核細胞を死滅させることができる酵素ドメインを含む。本発明のCD20結合タンパク質のある特定の実施形態は、この細胞毒性機構を利用する。
CD20発現細胞に対する高親和性免疫グロブリン型結合領域を用いて酵素的に活性な志賀毒素領域の送達を標的化することにより、この強力な細胞死滅活性を、CD20陽性細胞型を優先的に死滅させるように限定することができる。
CD20結合タンパク質はCD20の細胞外部分への結合後にCD20の細胞内在化を誘導することができるため、本発明のCD20結合タンパク質のある特定の実施形態を用いて、さらなる外来物質を、CD20発現細胞の内部に送達することができる。ある意味では、CD20結合タンパク質全体が、細胞に進入する外来物質である;かくして、「さらなる」外来物質は、CD20結合タンパク質コア自体以外に連結された物質である。
特定の上記実施形態において、本発明のCD20結合タンパク質は、ポリペプチド領域中に導入された1又は2以上のアミノ酸置換が存在するバリアントである。本明細書で用いられる用語「保存的置換」は、1又は2以上のアミノ酸が別の生物学的に類似するアミノ酸残基により置き換えられることを示す。例としては、類似する特性を有するアミノ酸残基、例えば、小さいアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸及び芳香族アミノ酸の置換を含む(例えば、以下の表Bを参照されたい)。通常は内因性の哺乳動物ペプチド及びタンパク質中には見出されない残基との保存的置換の例は、アルギニン又はリシン残基の、例えば、オルニチン、カナバリン、アミノエチルシステイン、又は別の塩基性アミノ酸との保存的置換である。ペプチド及びタンパク質における表現型的にサイレントな置換に関するさらなる情報については、例えば、Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)を参照されたい。以下の図表は、物理化学的特性により分類されたアミノ酸の保存的置換である。I:中性、親水性、II:酸性及びアミド、III:塩基性、IV:疎水性、V:芳香族、嵩高いアミノ酸。
本発明のCD20結合タンパク質を、当業者には周知の生化学的操作技術を用いて産生することができる。例えば、本発明のCD20結合タンパク質を、標準的な合成方法により、組換え発現系の使用により、又は任意の他の好適な方法により製造することができる。かくして、CD20結合タンパク質を、例えば、(1)標準的な固相若しくは液相方法を用いて、段階的に、若しくは断片集合によりCD20結合タンパク質のポリペプチド若しくはポリペプチド成分を合成し、最終ペプチド化合物産物を単離及び精製するステップ;(2)宿主細胞中でCD20結合タンパク質のポリペプチド若しくはポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを発現させ、宿主細胞若しくは宿主細胞培養物から発現産物を回収するステップ;又は(3)CD20結合タンパク質のポリペプチド若しくはポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを無細胞でインビトロで発現させ、発現産物を回収するステップ;又は(1)、(2)若しくは(3)の方法の任意の組合せによりペプチド成分の断片を取得した後、その断片を接続(例えば、ライゲート)して、ペプチド成分を取得し、ペプチド成分を回収するステップを含む方法などのいくつかの方法で合成することができる。
本発明は、以下にさらに詳細に説明される状態、疾患、障害、又は症状(例えば、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、及び免疫障害)の治療又は予防のための、医薬組成物における、単独での、又は1若しくは2以上のさらなる治療剤と組み合わせた使用のためのCD20結合タンパク質を提供する。本発明は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体と一緒に、本発明のCD20結合タンパク質、又は本発明によるその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、ホモ多量体及び/又はヘテロ多量体形態の本発明のCD20結合タンパク質を含んでもよい。医薬組成物は、以下にさらに詳細に説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療、改善、又は予防する方法において有用である。それぞれのそのような疾患、状態、障害、又は症状は、本発明による医薬組成物の使用に関して別々の実施形態であると想定される。本発明は、以下により詳細に説明されるような、本発明による治療の少なくとも1つの方法における使用のための医薬組成物をさらに提供する。
本発明のCD20結合タンパク質のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物は同様に本発明の範囲内にある。
本発明のCD20結合タンパク質を超えて、そのようなCD20結合タンパク質、又はその機能的部分をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内にある。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と等価であり、両方ともデオキシリボ核酸(DNA)のポリマー、リボ核酸(RNA)のポリマー、ヌクレオチドアナログを用いて生成されるこれらのDNA又はRNAのアナログ、並びにその誘導体、断片及びホモログを含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であってもよい。開示されるポリヌクレオチドは、例えば、RNAコドンの3番目の位置で許容されることが知られる揺れを考慮に入れて、例示的CD20結合タンパク質をコードすることができるが、依然として異なるRNAコドンと同じアミノ酸をコードする全てのポリヌクレオチドを含むように特に開示される(Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)を参照されたい)。
一般に、本発明の目的は、がん、腫瘍、免疫障害、又は本明細書に記載のさらなる病状などの、疾患、障害、及び状態の予防及び/又は治療において用いることができる、薬理活性剤、並びにそれを含む組成物を提供することである。従って、本発明は、CD20発現細胞を死滅させるため、さらなる外来物質をCD20発現細胞中に送達するため、CD20発現細胞の内部を標識するため、並びに本明細書に記載の疾患、障害、及び状態を治療するための本発明のCD20結合タンパク質及び医薬組成物の使用方法を提供する。
[実施例]
第1に、CD20結合領域と志賀毒素エフェクター領域とを設計又は選択した。以下の実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素1(SLT−1A)のAサブユニットに由来するものであった。pECHE9Aプラスミド中にクローニングされたSLT−1Aの断片を含有し、SLT−1Aのアミノ酸1〜251をコードするポリヌクレオチドを得た(Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010))。
αCD20scFv::SLT−1A CD20結合タンパク質のバージョン1と2の両方の細胞結合特性を、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定した。それぞれの試料は、0.5×106個のCD20発現細胞(Raji(CD20+))又は非発現細胞(BC1(CD20−))を含有し、以後、「1XPBS+1%BSA」と呼ばれる、リン酸緩衝生理食塩水Hyclone 1XPBS(Fisher Scientific社、Waltham、MA)+1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Calbiochem社、San Diego、CA、U.S.)中のCD20結合タンパク質の様々な希釈液100μLと共に摂氏4度(℃)で1hインキュベートした。反応の飽和を誘導するために、最も高い濃度のCD20結合タンパク質を選択した。細胞を1XPBS+1%BSAで2回洗浄した。細胞を、0.3μgの抗Strep tag(登録商標)mAb-FITC(#A01736-100、Genscript社、Piscataway、NJ、U.S.)を含有する100μlの1XPBS+1%BSAと共に4℃で1hインキュベートした。細胞を1XPBS+1%BSAで2回洗浄し、200μlの1XPBS中に懸濁し、フローサイトメトリーにかけた。全ての試料に関するベースライン補正された平均蛍光強度(MFI、mean fluorescence intensity)データを、それぞれの実験試料からFITCのみの試料(陰性試料)のMFIを差し引くことにより得た。Prismソフトウェア(GraphPad Software社、San Diego、CA、U.S.)を用いて、グラフをMFI対「タンパク質濃度」としてプロットした。見出し結合−飽和の下での1部位結合[Y=Bmax *X/(KD+X)]のPrismソフトウェア機能を用いてBmax及びKDをベースライン補正されたデータを用いて算出した。Bmaxは、MFIで報告される最大特異的結合である。KDは、ナノモル濃度(nM)で報告される平衡結合定数である。
αCD20scFv::SLT−1A CD20結合タンパク質のバージョン1と2の両方のリボソーム不活化能力を、TNT(登録商標)Quick Coupled Transcription/Translation kit(L1170 Promega社、Madison、WI、U.S.)を用いる無細胞インビトロタンパク質翻訳アッセイを用いて決定した。このキットは、Luciferase T7 Control DNA(L4821 Promega社、Madison、WI、U.S.)及びTNT(登録商標)Quick Master Mixを含む。リボソーム活性反応を、製造業者の説明書に従って調製した。
CD20−細胞株(BC−1、Jurkat(J45.01)、及びU266)と比較したCD20+陽性細胞株(Daudi、Raji、及びRamos)中でのαCD20scFv::SLT−1Aバージョン1の結合及び内在化プロファイルを分析するために、免疫蛍光試験を実行した。例えば、50nMのそれぞれのCD20タンパク質を、37℃で1時間、0.8×106個のRaji細胞と共にインキュベートして、CD20結合タンパク質の結合及び内在化を可能にした。次いで、細胞を1XPBSで洗浄し、BD cytofix/cytoperm(BD Biosciences社、San Jose、CA、U.S.)を用いて固定及び透過処理した後、1X BD Perm/Wash(商標)Buffer(BD Biosciences社、San Jose、CA、U.S.)で2回洗浄した。細胞を、室温で45分間、1X BD Perm/Wash(商標)Buffer中のAlexa Fluor(登録商標)-555標識されたマウス抗SLT−1A抗体(BEI Resources社、Manassas、VA、U.S.)と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、4℃で10分間、BD cytofix(BD Biosciences社、San Jose、CA、U.S.)で固定した。次いで、細胞を1XPBSで洗浄し、1XPBS中に再懸濁した後、細胞をポリ−L−リシン被覆スライドガラス(VWR社、Radnor、PA、U.S.)上に接着させた。スライドを、4’,6’−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)含有Vectashield(Fisher Scientific社、Waltham、MA、U.S.)でカバースリップし、Zeiss Fluorescence Microscope(Zeiss社、Thornwood、NY、U.S.)により観察した。
αCD20scFv::SLT−1Aの両バージョンの細胞毒性プロファイルを、CD20+細胞死滅アッセイにより決定した。このアッセイは、標的生体分子を発現しない細胞と比較して、細胞表面上にCD20を発現する細胞を死滅させるCD20結合タンパク質の能力を決定する。細胞を、384穴プレート中、20μLの培地中に播種した(2×103個/ウェル)。試験しようとするαCD20scFv::SLT−1Aタンパク質を、1XPBS中で5倍又は10倍に希釈し、5μLの希釈液又はバッファー対照を細胞に添加した。培地のみを含有する対照ウェルを、ベースライン補正のために用いた。細胞試料を、試験しようとするαCD20scFv::SLT−1A又はバッファーのみと共に37℃で3日間、5%二酸化炭素(CO2)の雰囲気中でインキュベートした。全細胞生存又は生存率を、製造業者の説明書に従ってCellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(G7573 Promega社、Madison、WI、U.S.)を用いる発光読出しを用いて決定した。実験ウェルの“生存率”を、以下の式:(試験RLU−平均培地RLU)/(平均細胞RLU−平均培地RLU)*100を用いて算出した。生存率に対するLogポリペプチド濃度を、Prismソフトウェア(GraphPad Prism社、San Diego、CA、U.S.)を使用してプロットし、対数(阻害剤)対正規化応答(可変勾配)分析を用いて、例示的CD20結合タンパク質に関する最大半量細胞毒性濃度(CD50)値を決定した。さらに、リンパ腫患者からの細胞試料をこの細胞死滅アッセイにおいて分析して、αCD20scFv::SLT−1Aバージョン1の細胞毒性プロファイルを決定した。
実施例5に記載のようなRaji細胞(CD20+)中でのCD20+細胞死滅アッセイを用いて、3つの潜在的に細胞毒性のCD20結合タンパク質を試験した。代表的な結果のセットを、表4に報告する。複数の実験にわたって、αCD20scFv::SLT−1Aバージョン1は、CD20結合タンパク質B9E9(配列番号12)と比較して50〜100倍大きい細胞死滅機能を示した(表4)。
免疫不全マウス株に基づく2つの異種移植片モデル系を用いて、経時的な、及び様々な用量に関する、インビボ及び腫瘍環境中でCD20+腫瘍細胞を死滅させる例示的CD20結合タンパク質の能力を試験した。これらの異種移植片モデル系は、移植片対宿主応答、を欠く、特に、免疫系不全であるよく特徴付けられたマウス株に依拠する。第1に、SCID(重症複合型免疫不全、severe combined immune deficiency)マウスを用いて静脈内腫瘍モデルを試験して、マウスを通じて播種された腫瘍を作製し、ヒト腫瘍細胞に対する例示的CD20結合タンパク質のインビボでの効果を試験した。第2に、BALBc/ヌードマウスを用いて皮下腫瘍モデルを試験して、マウス上で皮下腫瘍を作製し、再度、ヒト腫瘍細胞に対する例示的CD20結合タンパク質のインビボでの効果を試験した。
例示的CD20結合タンパク質αCD20scFv::SLT−1Aバージョン1を、非ヒト霊長類に投与して、インビボでの効果について試験した。カニクイザル霊長類における末梢血Bリンパ球のインビボでの枯渇を、様々な用量のαCD20scFv::SLT−1Aバージョン1の非経口投与後に観察した。
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する。免疫グロブリン型結合領域αCD20は、ヒトCD20に結合することができる免疫グロブリン型結合領域を含むモノクローナル抗体オファツムマブ(Gupta I, Jewell R, Ann N Y Acad Sci 1263: 43-56 (2012))に由来する。
免疫グロブリン型結合領域αCD20と、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、タンパク質を形成させる。例えば、CD20結合タンパク質SLT−1A::αCD20をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生する。SLT−1A::αCD20 CD20結合タンパク質の発現を、以前の実施例に記載のような、細菌及び/又は無細胞のタンパク質翻訳系を用いて達成する。
CD20+細胞及びCD20−細胞に関する本実施例のCD20結合タンパク質の結合特性を、以前の実施例に上記されたような蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。CD20+細胞に結合するSLT−1A::αCD20のBmaxは、約50,000〜200,000MFIであり、KDは0.01〜100nMの範囲内にあると測定されるが、このアッセイにおけるCD20−細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αCD20の細胞毒性特性を、CD20+細胞を用いて以前の実施例に上記されたような一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αCD20の選択的細胞毒性特性を、CD20+細胞との比較として、CD20−細胞を用いる同じ一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。本実施例のCD20結合タンパク質のCD50は、細胞株に応じてCD20+細胞について約0.01〜100nMである。CD20結合タンパク質のCD50は、細胞表面上にCD20を発現する細胞と比較して、細胞表面上にCD20を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対するCD20結合タンパク質SLT−1A::αCD20のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にCD20を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後のCD20結合タンパク質の効果を試験する。非ヒト霊長類を用いて、実施例8に記載のように末梢血B細胞に対するSLT−1A::αCD20の効果を試験することができる。
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)、志賀毒素(StxA)、及び/又は志賀様毒素2(SLT−2A)に由来する。免疫グロブリン型結合領域は、表7から選択される分子に由来する免疫グロブリンドメインに由来し、CD20の細胞外部分に結合する。本実施例の例示的細胞毒性タンパク質を作製し、CD20を細胞表面に発現するCD20+細胞を使用した以前の実施例に記載のように試験する。
Claims (52)
- a)
CD20分子の細胞外部分に特異的に結合することができる一本鎖可変断片を含むCD20結合領域と、
b)
(i)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸75〜251;
(ii)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜241;
(iii)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜251;及び/又
は
(iv)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜261;
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと
を含むCD20結合タンパク質であって、細胞表面上にCD20を発現する細胞にCD20結合タンパク質を投与すると、前記CD20結合タンパク質が細胞表面に発現したCD20に結合してから6時間未満で前記細胞内に内在化することができる、
前記CD20結合タンパク質。 - CD20結合タンパク質が細胞表面に発現したCD20に結合してから1〜5時間以内、又は1時間未満で細胞内に内在化できる、請求項1に記載のCD20結合タンパク質。
- 細胞にCD20結合タンパク質を投与すると、前記CD20結合タンパク質が、細胞表面上に天然に存在するCD20の細胞内在化を6時間未満で誘導することができる、請求項1又は2に記載のCD20結合タンパク質。
- 細胞にCD20結合タンパク質を投与すると、前記CD20結合タンパク質が、細胞表面上に天然に存在するCD20の細胞内在化を1時間未満で誘導することができる、請求項3に記載のCD20結合タンパク質。
- 細胞が、B細胞、B細胞の前駆細胞、及びB細胞に由来する新生物細胞からなる群から選択されるB細胞系列のメンバーである、請求項1〜4のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 細胞表面上にCD20を発現する細胞にCD20結合タンパク質を投与すると、前記CD20結合タンパク質が前記細胞の死を引き起こすことができる、請求項1〜5のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- メンバーがCD20を発現する第1の細胞集団に投与すると、メンバーがCD20を発現しない第2の細胞集団と比べて、少なくとも3倍高い細胞毒性効果を奏することができる、請求項6に記載のCD20結合タンパク質。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸75〜251のポリペプチド配列を含む、請求項1〜7のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜241のポリペプチド配列を含む、請求項1〜7のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜251のポリペプチド配列を含む、請求項1〜7のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜261のポリペプチド配列を含む、請求項1〜7のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- CD20結合領域が、
a)それぞれ、配列番号6、配列番号7、及び配列番号8に示されるHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変(VH)ドメインと、それぞれ、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11に示されるLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)ドメイン;
b)それぞれ、配列番号21、配列番号22、及び配列番号23に示されるHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変(VH)ドメインと、それぞれ、配列番号24、配列番号10、及び配列番号11に示されるLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)ドメイン;並びに
c)それぞれ、配列番号21、配列番号22、及び配列番号27に示されるHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変(VH)ドメインと、それぞれ、配列番号28、配列番号10、及び配列番号29に示されるLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)ドメイン
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項1〜11のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。 - CD20結合領域が、配列番号4のアミノ酸2〜245のポリペプチド配列を含むか、又はそれからなる、請求項12に記載のCD20結合タンパク質。
- CD20結合領域が、配列番号4のアミノ酸2〜245のポリペプチド配列を含むか、又はそれからなり、志賀毒素エフェクターポリペプチドが配列番号1のアミノ酸75〜251のポリペプチド配列を含むか、又はそれからなる、請求項13に記載のCD20結合タンパク質。
- 配列番号4、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16に示されるポリペプチドを含むか、又はそれからなる、請求項1〜12のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 配列番号4又は配列番号16に示されるポリペプチドを含むか、又はそれからなる、請求項15に記載のCD20結合タンパク質。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然のAサブユニットに対する変異であって、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失又は置換から選択される前記変異を含む、請求項1〜16のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 細胞表面上にCD20を発現する細胞中へのさらなる外来物質の送達のためのCD20結合タンパク質であって、前記CD20結合タンパク質が、
a)
CD20分子の細胞外部分に特異的に結合することができる一本鎖可変断片を含む、
CD20結合領域、
b)
(i)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸75〜251;
(ii)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜241;
(iii)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜251;及び/又は
(iv)配列番号1、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸1〜261;
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び
c)さらなる外来物質
を含み、細胞表面上にCD20を発現する細胞に前記CD20結合タンパク質を投与すると、前記CD20結合タンパク質が、前記CD20結合タンパク質が細胞表面に発現したCD20に結合してから6時間未満で前記細胞内に内在化することができ、前記さらなる外来物質を前記細胞の内部に送達することができる、
前記CD20結合タンパク質。 - CD20結合タンパク質が細胞表面に発現したCD20に結合してから1〜5時間以内、又は1時間未満で細胞内に内在化できる、請求項18に記載のCD20結合タンパク質。
- CD20結合領域が、
a)それぞれ、配列番号6、配列番号7、及び配列番号8に示されるHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変(VH)ドメインと、それぞれ、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11に示されるLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)ドメイン;
b)それぞれ、配列番号21、配列番号22、及び配列番号23に示されるHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変(VH)ドメインと、それぞれ、配列番号24、配列番号10、及び配列番号11に示されるLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)ドメイン;並びに
c)それぞれ、配列番号21、配列番号22、及び配列番号27に示されるHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変(VH)ドメインと、それぞれ、配列番号28、配列番号10、及び配列番号29に示されるLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)ドメイン
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項18又は19に記載のCD20結合タンパク質。 - 外来物質がペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び核酸からなる群から選択される、請求項18〜20のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 外来物質が、酵素を含むタンパク質又はポリペプチドである、請求項21に記載のCD20結合タンパク質。
- 外来物質が、リボ核酸である核酸である、請求項21に記載のCD20結合タンパク質。
- 外来物質が、抗原を含むペプチドである、請求項21に記載のCD20結合タンパク質。
- 抗原が細菌タンパク質に由来する、請求項24に記載のCD20結合タンパク質。
- 抗原が、がんにおいて変異したタンパク質に由来する、請求項24に記載のCD20結合タンパク質。
- 抗原が、がんにおいて異常に発現されるタンパク質に由来する、請求項24に記載のCD20結合タンパク質。
- 抗原がT細胞相補性決定領域である、請求項24に記載のCD20結合タンパク質。
- 抗原がCD20結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドとの間に位置し、前記CD20結合領域が、前記CD20結合タンパク質のアミノ末端にある、請求項24に記載のCD20結合タンパク質。
- 抗原がウイルスタンパク質に由来する、請求項24に記載のCD20結合タンパク質。
- 抗原が配列番号3に示されるポリペプチド配列を含む、請求項30に記載のCD20結合タンパク質。
- 配列番号16に示されるポリペプチドを含むか、又はそれからなる、請求項31に記載のCD20結合タンパク質。
- 細胞表面にCD20を発現する細胞が、B細胞、B細胞の前駆細胞、及びB細胞に由来する新生物細胞からなる群から選択されるB細胞系列のメンバーである、請求項18〜32のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- ホモ多量体又はヘテロ多量体の形態である、請求項1〜33のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 薬学的に許容される溶媒和物又は塩の形態である、請求項1〜34のいずれかに記載のCD20結合タンパク質。
- 請求項1〜35のいずれかに記載のCD20結合タンパク質と、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
- 少なくとも1つの薬学的に許容される担体が、生理学的に許容される溶媒、分散媒体、コーティング、抗微生物剤、等張剤、吸収遅延剤、滅菌水性溶液又は分散物及び滅菌粉末から選択される、請求項36に記載の医薬組成物。
- アジュバント;薬学的に許容される酸化防止剤;界面活性剤;バッファー;及び/又は安定剤をさらに含む、請求項36又は37に記載の医薬組成物。
- アジュバントが、保存剤、湿潤剤、乳化剤又は分散剤である請求項38に記載の医薬組成物。
- 経口、直腸、又は経鼻投与用;又は非経口投与用に製剤化されている、請求項36〜39のいずれかに記載の医薬組成物。
- 非経口投与が、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、又は経皮投与である請求項40に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜33のいずれかに記載のCD20結合タンパク質をコードすることができる核酸、又はその相補体。
- 請求項42に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項42に記載の核酸又は請求項43に記載の発現ベクターの一方を含む宿主細胞。
- CD20発現細胞を、請求項1〜35のいずれかに記載のCD20結合タンパク質又は請求項36〜41のいずれかに記載の医薬組成物とインビトロで接触させるステップを含む、前記CD20発現細胞中への前記CD20結合タンパク質の細胞内在化を6時間未満でインビトロで誘導する方法。
- CD20発現細胞を、請求項18〜35のいずれかに記載のCD20結合タンパク質又は請求項18〜35のいずれかに記載のCD20結合タンパク質及び少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤若しくは担体を含む医薬組成物とインビトロで接触させるステップを含む、前記CD20発現細胞中にさらなる外来物質をインビトロで送達する方法。
- CD20発現細胞を、請求項1〜17のいずれかに記載のCD20結合タンパク質とインビトロで接触させるステップを含み、前記CD20結合タンパク質が、その細胞表面上にCD20を発現する細胞の死を引き起こすことができる、前記CD20発現細胞をインビトロで死滅させる方法。
- CD20発現細胞を、請求項36〜41のいずれかに記載の医薬組成物とインビトロで接触させるステップを含み、前記医薬組成物が、その細胞表面上にCD20を発現する細胞の死を引き起こすことができるCD20結合タンパク質を含む、前記CD20発現細胞をインビトロで死滅させる方法。
- 請求項1〜35のいずれかに記載のCD20結合タンパク質又は請求項36〜41のいずれかに記載の医薬組成物を含む、がん、腫瘍、又は免疫障害の予防又は治療剤であって、前記がん、前記腫瘍、又は前記免疫障害が、細胞表面上にCD20を発現するがん細胞、腫瘍細胞、又は免疫細胞と関与する、前記予防又は治療剤。
- がん又は腫瘍が、骨のがん、白血病、リンパ腫、メラノーマ、及び骨髄腫からなる群から選択される疾患である、請求項49に記載の予防又は治療剤。
- 免疫障害が、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、HIV関連疾患、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される免疫障害である、請求項49に記載の予防又は治療剤。
- がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染症の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1〜35のいずれかに記載のCD20結合タンパク質の使用。
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