KR102398485B1 - 식물 세포 또는 식물 전체에서 결합제-독소 융합 단백질의 생산 방법 - Google Patents

식물 세포 또는 식물 전체에서 결합제-독소 융합 단백질의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도, 항체, 표적 결합 능력을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는 항체 모방물질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나의 단백질 결합제, 임의로, 펩티드 링커, 및 적어도 하나의 단백질 독소 또는 단백질 프로톡신을 포함하는 결합제-독소 융합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 방법은 식물 세포 또는 식물 전체를, 작동가능한 연결로 적어도 A) 단백질 결합제, 또는 이의 표적 결합 쇄 또는 도메인을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및 B1) 절단가능한 펩티드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및, 단백질 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 B2) 단백질 프로톡신(프로톡신은 이의 활성화를 위한 절단가능한 도메인을 포함한다)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 핵산 작제물과 접촉시키는 단계, 작제물을 식물 세포, 또는 식물 전체의 하나 이상의 세포의 핵내로 통합되도록 하는 단계, 및 핵산 작제물에 의해 암호화된 융합 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다(도 7).

Description

식물 세포 또는 식물 전체에서 결합제-독소 융합 단백질의 생산 방법
본원은 결합제-독소 융합 단백질의 분야에 관한 것이다.
표적 결합제와 독소를 겸비하는 접합체가 40년 전에 개발되었으며 현재는 암에 대항하는 큰 희망을 나타낸다. 상기 접합체는 주로, 링커(linker)를 통해 화학적 세포독성제에 화학적으로 접합된 단클론 항체로 이루어지는 항체-약물-접합체(Antibody Drug Conjugates; ADC)의 부류에 의해 대표된다. 상기 약물은 암세포를 표적화하는 단클론 항체의 특이성과, 건강한 조직에는 영향을 미치지 않으면서 표적화된 세포를 사멸하는 페이로드(payload)의 높은 독성 효능을 겸비한다.
그러나, 이 개념은 임상적 성공으로 번역(translating)하기에는 어려운 것으로 판명되었다. 종양 세포에 대한 이의 특이성에도 불구하고, 제품이 유효한 치료학적 용량에 도달하지 않은 상태에서 부작용이 빈번히 발생하여, 상대적으로 좁은 치료창(therapeutic window)을 생산시키고 이의 임상 반응을 제한할 수 있다. 용량-제한 독성은 전형적으로는 항체의 특이성 문제에 기인하기 보다는, 주로 사용된 링커의 상대적인 불안정성에 기인한 원치않는 독소 방출에 기인하여, 표적화되지 않은-발현 조직(표적-외 효과)에서 관찰되었다(Drake and Rabuka (2015)).
표적-외 독성 외에, 단지 매우 적은 백분율(1-2%)의 온전한 접합체만이 표적 종양에 도달하는 것으로 나타났다(Peters and Brown (2015)). 이러한 불량한 표적화 효율로 인해, 세포독성 페이로드는 낮은 용량에서도 여전히 표적화된 세포사(cell death)를 유발하기 위해 높은 효능을 가져야 한다.
그러나, 상술한 링커의 상대적인 불안정성으로 인해, 고 효능 독소의 사용은, 조기 독소 방출을 피하여 치료창을 확장시키기 위해서 혈류내에서 안정성이어야 하는 링커를 필요로 한다(Parslow et al. (2016)).
화학적으로 접합된 독성 페이로드는 화학적 링커로부터의 바람직하지 못한 해리(undesired dissociation) 위험을 가지며 이는 표적외 독성으로 이어진다(Alewine et al. (2014)). 이러한 불안정성은 그런 방식으로 제조된 면역접합체의 효능을 제한한다.
항체 약물 접합체의 치료창을 확장시키기 위한 한 가지 접근법은 주로 식물과 세균으로부터의, 고도로 세포독성인 단백질, 또는 펩티드에 융합된 항체의 개발이다. 상기 접근법은 1980년대 초에 처음으로 개발되었다. 상기와 같은 접합체의 제1 세대는 항체에 화학적으로 커플링(coupling)된 세포독성 펩티드로 이루어졌다.
그러나, 고유의 세포독성 단백질의 높은 면역원성과 함께, 이미 논의된 화학적 접합체의 상대적인 불안정성은 상기 접합체의 치료학적 유용성을 이기는 주요 장애물로 간주되었다.
그러나, 상기 접합체는 이론상, 치료법에 대한 이의 용도에 대해서 막대한 가능성을 갖는다. 대부분 단백질 독소의 작용 기전은 단백질 합성 억제에 기반하며, 이는 통상적으로 사용되는 유기 세포독소(주로 튜불린 억제제 또는 RNA 폴리머라제 억제제)와 상이하고, 이는 겹치지 않는 독성 프로파일, 및 표준 요법과의 용이한 조합물(combination)을 의미한다.
더욱이, 세포독성 단백질은 화학요법-불응성 환자에도 또한 효율적인 것으로 보이며, 이는 상기 단백질이 유기 세포독소에 대해 관찰되는 종양 내성 기전에 영향을 받지 않음을 암시한다.
더욱이, 대부분의 유기 세포독소와 달리, 세포독성 단백질은 휴지 세포, 즉 분열하지 않는 세포에 대해서도 또한 유효하다.
더욱이, 세포독성 단백질은 항체와, 즉 융합 단백질의 형태로 공발현될 수 있다. 융합 단백질의 상기와 같은 재조합적 생산은 화학적 링커 기술에 대해 관찰되는 바람직하지 못한 페이로드 해리(payload dissociation)를 감소시킨다.
펩티드 링커를 통한 세포독성 단백질에의 단백질 결합제, 예를 들어 항체의 유전학적 융합은 몇 가지 장점을 제공한다. 링커는 단지 연결하는 역할 외에, 융합 단백질의 폴딩(folding), 안정성, 약동학적 프로파일 및 생물학적 활성뿐만 아니라 숙주 세포에서 이의 생산 수율에 영향을 미칠 수 있다.
2개 범주의 링커, 즉 안정성 및 절단가능한 링커가 존재한다. 안정성 링커는, 연장된 혈장 반감기를 가지며 세포독성 단백질의 의도하지 않은 방출을 피할 수 있는 안정성 펩티드 서열로 이루어진다. 전체 접합체가 세포내로 내면화되고, 이어서 단백질 결합제의 세포내 분해에 의해 독소가 방출된다.
다수의 포유동물 프로테아제 민감성 서열이 절단가능한 생물-접합체의 설계에 링커로서 사용될 수 있다. 특히, 암세포에 의해 과발현된 효소에 민감한 서열을 사용하여 표적 세포내로 또는 종양 환경에서 세포독성 융합 단백질을 활성화시킬 수 있다. 그러나, 포유동물 효소 민감성 서열을 사용하는 상기 복합체 융합 단백질은 낮은 배경 발현에서조차 주로 특정 효소의 존재로 인해 표준 시스템(포유동물 세포(예를 들어 CHO 또는 HEK), 곤충 세포 및 효모)으로 생산하기 어렵다. 이 경우에, 활성 도메인의 방출에 의해 프로펩티드를 활성화시켜 숙주 세포 증식의 억제를 유도한다. 결과적으로, 포유동물 단백질분해 절단가능한 링커를 갖는 결합제-독소 융합 단백질은 세균 발현 시스템에서 생산되어야 한다. 그러나, 세균은 다수의 도메인을 갖는 복합체 단백질을 적합하게 폴딩할 수 없으며 디설파이드 결합을 형성하는 능력이 없다(Yin et al. (2007)). 이러한 한계는 세균 시스템을 단쇄 항체 단편(scFv) 및 아글리코실화된 세포독성 단백질 기반 결합제-독소 융합 단백질의 생산으로 제한한다. 그러나, 세균 scFv 기반 생물-접합체의 작은 크기는 빠른 신장 제거를 유도하여, 이들 분자의 치료창을 제한한다(Guo et al. (2016)).
WO2009064815는 조류 엽록체가 표준 시스템에서 관찰된 바와 같이 숙주세포 사멸을 피하는 복합체 결합제-독소 융합 단백질을 폴딩하는데 필수적인 기구를 함유함을 개시한다. 실제로, 조류 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)는, 원핵생물에서 발견되는 바와 같지만 복합체 단백질의 폴딩을 허용하는 단백질(단백질 디설파이드 이소머라제, 샤페론)을 함유하는 단일 엽록체를 갖는다. WO2009064815는 2개의 반복된 G4S 서열(4개의 글리신에 이어서 세린)로 이루어지는 절단가능하지 않은 링커에 의해 단백질 독소에 융합된 인간 IgG1의 힌지(hinge), CH2, CH3 도메인을 갖는 용해성이고 기능성인 단쇄 항체(CD22)를 생산시키기에 적합한 녹조류 엽록체의 적합성을 입증하였다. 그러나, 한 가지 주요한 우려는 미세-조류 엽록체의 번역-후 변형, 특히 생물약제에 중요한 속성인 N-글리코실화를 위한 효소 기구의 결여이다(Mathieu-Rivet et al. (2014)).
보호된 그랜자임(Granzyme) B에 G4S 안정성 링커를 통해 연결된 혈관 내피 성장 인자 121(VEG121)로 구성된 절단가능하지 않은 결합제-독소 융합 단백질을 사용하는 인간 배신장 세포(human embryonic kidney cell; HEK-293T)에 기반한 또 다른 접근법이 개발되었다(Mohamedali et al. (2013)). 프로테아제 그랜자임 B의 기능성 도메인이 아마도 숙주세포 사멸을 가장 잘 피할 것 같은 엔테로키나제 민감성 부위에 의해 연결된 여분의 히스티딘 태그에 의해 보호된다. 생산 후에, 상기 보호된 부위는 추가적인 엔테로키나제 처리 단계에 의해 제거되어야 한다. 항-종양 효능이 관찰되었다 하더라도, 상기 종류의 결합제-독소 융합 단백질의 생산은 복잡하다.
상기 한계는 펩티드 링커를 통해 펩티드 페이로드에 연결된 표적화 부분의 완전한 재조합 생물접합(recombinant bioconjugation)을 사용하여 극복될 수 있다. 상기와 같은 재조합 면역접합체는, 예를 들어 변형된 시가-형 독소에 접합되고 원핵생물 발현 시스템에서 발현된 CD20-특이성 단쇄 가변 단편(scFv)을 사용하여 설계되었다(WO2014164680A1). 생산되는 화합물은 NHL에서 I/Ib상의 유망한 결과를 나타내었으며, 이는 완전한 재조합 면역접합체가 펩티드 독소에 화학적으로 접합된 항체에 대해 관찰된 표적-외 독성을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
그러나, scFv 항체 기반 면역접합체는 이의 효능을 제한하는 신장 제거로 인해 매우 제한된 혈액 반감기를 가진 반면, scFv 기반 면역독소를 생산시키는데 종종 사용되는 세균 모델은 디설파이드 가교의 형성을 허용하지 못함으로 인해 완전길이 항체 또는 scFv-Fc 구조를 생산시키기에 적합하지 않은 것으로 나타났다. 더욱이, 상기와 같은 세균 시스템은 상기에 의해 생산된 항체 또는 항체 단편을 글리코실화하지 않으며, 이는 마찬가지로 감소된 반감기로 이어지거나 또는 상기 생산된 항체의 효과기 기능을 감소시킨다. 이러한 이유로 인해, 전형적으로 CHO(중국 햄스터 난소 세포)와 같은 포유동물 발현 시스템이 상기와 같은 복합체 항체 또는 항체 단편 또는 유도체의 생산에 사용될 것이다.
그러나, 활성 단백질 독소 페이로드, 또는 이를 포함하는 접합체의 생산은, 특히 포유동물 프로테아제에 의해 인식되는 절단 부위가 사용되는 경우, 독성을 이유로 포유동물 세포에서 거의 성취될 수 없다. 그러나, 면역접합체에서 포유동물 프로테아제에 의해 인식되는 상기와 같은 절단 부위를 갖는 것은 대단히 중요하다.
이는 결합제-독소 융합 단백질이 이의 표적에 결합된 후에, 예를 들어 상기 표적에 의해 특성화된 질병의 부위에서 상기 독소를 활성화되게 할 것이다. 상기 절단 부위는 포유동물 프로테아제에 대한 이의 감수성으로 인해 절단될 것이고 따라서 활성화된 독소가 방출될 것이다.
따라서 본 발명의 하나의 목적은 신규의 결합제-독소 융합 단백질의 치료학적 가능성을 활용하기에 효율적인 생산 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 추가의 목적은
a) 결합제 단백질 중 디설파이드 가교의 형성 및/또는 상기 결합제 단백질의 글리코실화를 허용하고
b) 포유동물 세포에 독성인 단백질 독소의 사용을 허용하고, 및/또는
c) 포유동물 프로테아제에 의해 인식되는 절단 부위의 통합을 허용하는
결합제-독소 융합 단백질의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 더욱 또 다른 목적은 링커 절단후 활성화되는 세포독성 단백질에 재조합적으로 융합된 표적화 부분과 연장된 혈청 반감기를 겸비하는 글리코실화된 결합제-독소 융합 단백질의 생산을 가능하게 하는 것이다.
실제 결합 단백질(a)이 글리코실화되지 않거나, (b) 포유동물 세포에 독성이 아닌 독소를 사용하거나, 또는 (c) 상기와 같은 절단 부위를 갖지 않는다 하더라도, 상기와 같은 방법이 상기 셋 중 어느 하나를 허용한다는 사실만으로도 높은 융통성을 제공하고 결합제-독소 융합 단백질의 큰 배열이 생산되기 때문에, 상기 목적 중 어느 하나라도 해결하는 것이 바람직할 것이다.
상기 및 추가의 목적은 본 발명의 독립항에 따른 방법 및 수단으로 충족된다. 종속항은 구체적인 구현예와 관련된다.
본 발명은 결합제-독소 융합 단백질을 생산시키는 방법을 제공한다. 본 발명 및 이의 특징의 일반적인 장점을 하기에서 상세히 논의할 것이다.
도 1. 아그로침투(agroinfiltration) 후 4 및 6일(4 또는 6 dpa) 후에 30 ㎍의 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎 추출물을 항 인간 IgG Fc 부분 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅(westernblotting)에 의해 분석하였다. p19 침묵 억제인자 유전자를 함유하거나(+) 또는 상기 유전자가 없는(-) 2원 형질전환 벡터가 사용되었다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(A. t.) LBA4404(레인(lane) 1 내지 4) 또는 GV3101(레인 5 내지 8)을 사용하여 융합 단백질을 발현시키고, 균주를 도면 상단에 나타낸다. 음성 대조군은 A. t. LBA4404(C-) 내로의 빈 pPZP-ATB 2원 플라스미드를 사용한다. 200 ng의 인간 혈청 IgG(Sigma, I5154)가 양성 대조군(C+)으로서 사용되었다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 비-환원 조건하에서 수행하였다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다.
도 2. 아그로침투 후 4일 후에 25 ㎍의 니코티아나 벤타미아나 잎 추출물을 항 인간 IgG Fc 부분 및 항-인간(좌측 패널) 그랜자임 B(우측 패널) 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅에 의해 분석하였다. p19 침묵 억제인자 유전자가 없는 아그로박테리움 투메파시엔스(A. t.) LBA4404를 사용하여 융합 단백질을 발현시켰다. 50 ng의 인간 혈청 IgG(Sigma, I5154)가 양성 대조군(C+)으로서 사용되었다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 환원(+DTT) 또는 비-환원(-DTT) 조건하에서 수행하였다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다. 단량체 적분 크기를 Δ로 나타낸다.
도 3은 아그로침투 후 4일 후에 40 ㎍의 니코티아나 벤타미아나 잎 추출물을 항 인간 IgG Fc 부분 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅에 의해 분석하였다. 50 ng의 인간 혈청 IgG(Sigma, I5154)가 양성 대조군(인간 혈청 IgG)으로서 사용되었다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 비-환원 조건하에서 수행하였다. 발현된 작제물(construct)을 상응하는 레인의 상단에 나타낸다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다.
도 4. 시험관내 세포독성 및 결합
A: WST-1 분석에 의한 시험관내 세포독성. 10 ㎕의 정제된 scFv-Fc-LINK1-TOX2(여기에서 LINK1은 서브틸리신-유사 전구단백질 전환효소 패밀리(family)에 의해 절단될 수 있고, TOX2는 단백질 합성을 억제하며, scFv-Fc는 B 세포상에서 발현된 세포 표면 단백질에 결합한다)를 Raji 세포상에 첨가하기 전에 40 ㎕의 생육 배지로 희석하였다. 생육력을 배양 후 72시간째에 광학 밀도 판독에 의해 관찰하였다. DMSO(5%) 또는 트리톤(2%)은 양성 대조군으로서 제공된다. 오직 완충제 대조군만을 사용하여(40 ㎕의 생육 배지에 10 ㎕) scFv-Fc-LINK1-TOX2 및 양성 대조군의 효과를 표준화하였다.
Figure 112021098159357-pct00001

B: ELISA에 의한 결합 능력 분석. 항원을 96 웰 미세플레이트상에 코팅하였다. 50 ㎕의 정제된 작제물을 1시간 동안 배양하였다. 염소 항-인간 Fc 항체 HRPO를 검출을 위해 첨가하였다. 50 ㎕의 특이적인 네이키드 mAb를 양성 대조군(적색 직선)으로서 사용하였다. 50 ㎕의 비특이적인 네이키드 mAb를 음성 대조군(회색 직선)으로서 사용하였다. FCS = 퓨린 절단 부위, GB = 그랜자임 B
Figure 112021098159357-pct00002

도 4. 공배양 후 3일 후에 25 ㎍의 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 식물 세포 추출물을 항 인간 IgG Fc 부분 및 항-인간(좌측 패널) 그랜자임 B(우측 패널) 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅에 의해 분석하였다. p19 침묵 억제인자 유전자를 갖는 2원 플라스미드를 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스(A. t.) LBA4404를 사용하여 융합 단백질을 발현시켰다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 비-환원 조건하에서 수행하였다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다.
도 5. 33 ㎕의 니코티아나 타바쿰 5일된 안정한 식물 세포 추출물을 항 인간 IgG Fc 부분 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅에 의해 분석하였다. scFv-Fc-FCS-그랜자임 B를 안정하게 발현하는 선택된 식물 세포주를 세포 추출물 분석에 사용하였다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 비-환원 조건하에서 수행하였다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다.
도 7. 인간 세포(좌측) 및 담배 식물 또는 세포(우측)에 의해 생산된 N-글리코실화 패턴.
도 8. (좌측 패널) 공배양 후 3일 후에 33 ㎕의 니코티아나 타바쿰 식물 세포 추출물을 항 인간 IgG Fc 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅에 의해 분석하였다. p19 침묵 억제인자 유전자를 갖는 2원 플라스미드를 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스(A. t.) LBA4404를 사용하여 융합 단백질을 발현시켰다. (우측 패널) 아그로침투 후 4일 후에 40 ㎍의 니코티아나 벤타미아나 잎 추출물을 항 인간 IgG Fc 부분 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅에 의해 분석하였다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 비-환원 조건하에서 수행하였다. 발현된 작제물을 상응하는 레인의 상단에 나타낸다. TOX2는 본원에 개시된 바와 같은 독소 부류 2로부터의 독소(단백질 합성 억제제)를 나타낸다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다.
도 9: 본 발명에 따른 결합제-독소 포맷의 구조.
9A-C: 독소가 항체 쇄의 C-말단에 융합된다. A: (scFv-FC)-(절단 부위)-독소/프로톡신(protoxin); B: HC + LC-(절단 부위)-독소/프로톡신, 및 C: LC + HC-(절단 부위)-독소/프로톡신.
9D-G 독소가 항체 쇄의 N-말단에 융합된다.
scFv-FC는 본원에 논의된 바와 같은 특이적인 항체 포맷이다. LC는 IgG 항체의 경쇄이다. HC는 IgG 항체의 중쇄이다. CS는 절단 부위를 의미하고, Tox는 독소/프로톡신을 의미한다. 상이한 쇄 사이의 막대는 디설파이드 결합을 상징한다.
도 10: 펩티드 당쇄(glycoform) 분석의 결과. 본원에 개시된 항체로부터 채취되고 N-글리코실화 부위를 포함하는 펩티드가 포유동물에서 생산된 단백질로부터 상기 펩티드를 분리하는 특징적인 당쇄를 가짐을 입증하기 위해서, 니코티아나 벤타미아나의 상이한 균주(이 중 일부는 RNA 간섭(RNAi) 기술(Material provided by NOMAD Bioscience GmbH, Munich)에 의해 당조작되었다)를 사용하여, 내인성 β-1,2-자일로실트랜스퍼라제(XylT) 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라제(FucT)의 표적화된 하향-조절을 획득하였고, 도 10은 상이한 균주에서 생산된 바와 같은 2개의 상기와 같은 펩티드의 MS 스펙트럼을 도시한다.
도 11: 절단 분석의 결과. scFv-Fc-FCS-GB(FCS = 퓨린 절단 부위, GB = 그랜자임 B)는 니코티아나 벤타미아나로부터 발현되었다. 단백질을 아그로침투 후 4일 후에 잎 추출물로부터 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 물질을 재조합 퓨린에 노출시켰다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 환원 조건하에서 수행하였다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 절단 후 생산되는 유리 GB 단백질을 별표로 나타낸다. 재조합 단백질 April을 절단 대조군으로서 사용하였다. April의 절단 관련 밴드를 Δ로 나타낸다.
도 12: SDS PAGE 쿠마씨 블루에 의한 정제된 단백질 분석. 다수의 작제물이 니코티아나 벤타미아나로부터 발현되었다. 단백질을 아그로침투 후 4일 후에 잎 추출물로부터 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 7 ㎕의 정제된 단백질을 7 ㎕의 로딩 완충제에 가하였다(2x). 이어서 12 ㎕를 각 웰에 로딩하였다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 비-환원 조건하에서 수행하였다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다.
도 13: SDS PAGE 쿠마씨 블루에 의한 정제된 단백질 분석. 다수의 작제물이 니코티아나 벤타미아나로부터 발현되었다. 단백질을 아그로침투 후 4일 후에 잎 추출물로부터 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 7 ㎕의 정제된 단백질을 7 ㎕의 로딩 완충제에 가하였다(2x). 이어서 12 ㎕를 각 웰에 로딩하였다. 4-20% 아크릴아미드 SDS-PAGE를 환원 조건하에서 수행하였다. L은 단백질 사다리(분자량 크기 마커)를 나타낸다. 포함된 단백질 크기를 별표로 나타낸다.
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명이, 기재된 장치의 특정한 구성요소 부분 또는 상기와 같은 장치로서 기재된 방법의 공정 단계로 제한되지 않으며 방법이 변화할 수 있음을 알아야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것은 아님을 알아야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 바와 같은 단수형 "하나" 및 "상기"는 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한 단수 및/또는 복수의 지시대상을 포함함에 유의해야 한다. 더욱이, 수치에 의해 구분되는 매개변수 범위가 제공되는 경우에, 그 범위는 이러한 제한 값을 포함하는 것으로 간주됨을 알아야 한다.
본원에 개시된 구현예들은 서로 관련되지 않는 개별적인 구현예로서 이해되도록 의도되지 않음을 또한 알아야 한다. 하나의 구현예에 의해 논의된 특징들은 또한 본원에 나타낸 다른 구현예들과 관련하여 개시되도록 의도된다. 하나의 경우에, 특정한 특징이 하나의 구현예에는 개시되지 않고 또 다른 구현예에 개시된다면, 당업자는 상기 특징이 반드시 상기 다른 구현예에 개시되지 않도록 의도됨을 의미하는 것은 아님을 이해할 것이다. 당업자는 다른 구현예에 대해서도 상기 특징을 개시하는 것이 본원의 요지이지만, 오직 명료성을 목적으로 하고 명세서를 관리가능한 분량으로 유지하기 위해 이를 수행하지 않았음을 이해할 것이다.
더욱 또한, 본원에서 지칭된 종래 기술 문서의 내용은 참고로 인용된다. 이는 특히 표준 또는 통상적인 방법을 개시하는 선행 기술 문서에 적용된다. 상기 경우에, 참고로 인용됨은 주로 충분한 허가 개시를 제공하고 긴 반복(lengthy repetition)을 피하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 첫 번째 태양에 따라,
a) ·항체
·표적 결합 능력(target binding capacity)을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
·항체 모방물질(antibody mimetic)
로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나의 단백질 결합제,
b) 임의로, 펩티드 링커, 및
c) 적어도 하나의 단백질 독소 또는 단백질 프로톡신
을 포함하는 결합제-독소 융합 단백질의 생산 방법을 제공하며,
상기 방법은
(i) 식물 세포 또는 식물 전체를, 작동가능한 연결(operational linkage)로 적어도 하기를 포함하는 핵산 작제물과 접촉시키는 단계,
A) 단백질 결합제, 또는 이의 표적 결합 쇄(target binding chain) 또는 도메인을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및
B1) 절단가능한 펩티드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및, 단백질 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는
B2) 단백질 프로톡신(여기서 프로톡신은 이의 활성화를 위한 절단가능한 도메인을 포함한다)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
중 어느 하나,
(ii) 핵산 작제물이 식물 세포, 또는 식물 전체의 하나 이상의 세포의 핵내로 통합되도록 하는 단계, 및
(iii) 핵산 작제물에 의해 암호화된 융합 단백질을 발현시키는
단계를 포함한다.
발명자는 놀랍게도 상기와 같은 방법에 의해, 재조합 결합제-독소 융합 단백질을 대규모로, 높은 생산성으로 생산시킬 수 있음을 발견하였다.
본원에 사용되는 바와 같이, "식물"(이로부터 유래된 세포 포함)이란 용어는 조류(녹조류(Chlorophyta) 및 윤조식물(Charophyta)/스트렙토식물(Streptophyta)뿐만 아니라, 메소스티그마강(Mesostigmatophyceae), 클로로키부스강(Chlorokybophyceae) 및 스피로타이니아(Spirotaenia) 속(genus)), 및 또한 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함한, 겉씨식물 및 속씨식물을 포함한, 육상 식물(유배식물(Embryophytes))에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 핵산 작제물과 접촉하는 식물 또는 식물 세포는 엽록체가 아니거나, 또는 조류의 엽록체, 특히 클라미도모나스 레인하르드티이의 엽록체가 아니다. 또 다른 구현예에서, 핵산 작제물과 접촉하는 식물 또는 식물 세포 중의 구조는 엽록체가 아니거나, 또는 조류의 엽록체, 특히 클라미도모나스 레인하르드티이의 엽록체가 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단백질 독소" 또는 "단백질 프로톡신"이란 용어는 세포독성 및/또는 세포정지성 단백질, 또는 이의 전구물질-변체를 포함하고자 한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "세포정지성 단백질"이란 용어는 반드시 세포를 사멸시키지는 않으면서 세포 증식 또는 세포 분열을 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 적합하게, 상기 세포정지제는 종양 세포의 증식을 억제한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포독성 단백질"이란 용어는 세포에 유해하고 최종적으로 세포사를 유발하는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포독성 단백질은 빠르게 분열하는 세포, 예를 들어 종양 세포에 유해하며 종양 세포사, 특히 비-종양 세포에는 손상을 유발하지 않거나 적게 유발하면서 종양 세포사를 유발한다.
"단백질 독소" 또는 "단백질 프로톡신"이란 용어는 비제한적으로 이의 화학적 성질에 의해, 단백질(즉 ≥50 아미노산 잔기의 길이를 갖는 펩티드) 또는 폴리펩티드(즉 ≥10 내지 ≤50 아미노산 잔기의 길이를 갖는 펩티드)인 독소를 지칭한다. 본 발명의 의미에서 프로톡신은, 예를 들어 억제성 아미노산 서열을 절단하거나 또는 입체형태 변화를 겪음으로써 활성화시킬 필요가 있는 독소의 전구체이며, 잠복성 독소라고도 칭한다. "프로톡신" 및 "단백질 프로톡신"이란 용어는 본원에서 호환가능하게 사용되며 동일한 해당 주제를 의미한다.
식물-기반 재조합 단백질 발현이 30년 동안 개발되었다. 오늘날, 식물 또는 식물 세포(예를 들어 담배 또는 담배 세포)에서 생산된 다수의 치료학적 단백질, 예를 들어 단클론 항체(mAb)가 임상 시험에서 시험되었으며 상업화되거나 이에 근접하고 있다(Yao et al. (2015)). 항체를 포함하여, 식물-기반 재조합 단백질의 발현을 또한 조류에서 수행할 수 있다(Hempel et al., 2011).
식물은 이의 저렴한 생산 비용, 본래적인 제품 안전성, 용이한 규모확대, 복합체 단백질을 폴딩하고 조립하며 복잡한 번역-후 변형을 수행하는 능력에 관하여 원핵생물 및 진핵생물 세포에 비해 몇 가지 장점을 갖는다.
게다가, 식물 현탁 세포 배양은 생산 중 증가된 재현성 및 안정성을 제공하며(알려진 미생물, 곤충 또는 포유동물 병원체가 없다), 현행의 양호한 제조 관행 생산 요건을 충족한다. 식물 현탁 세포 배양은 증식에 단지 단순한 한정된 영양소만을 요구하여, 포유동물이나 미생물 시스템보다 훨씬 저렴한 작동 비용을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "융합 단백질"이란 용어는 적어도 하나의 추가적인 성분에 작동가능하게 연결된 펩티드 성분을 갖고 이의 도메인의 조성 및/또는 구조가 천연 단백질과 상이한 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "작동적으로 연결된"이란 용어는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 언급할 때, 상이한 폴리뉴클레오티드가 서로 기능상 관련되게 놓이는 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 상기 프로모터가 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 마찬가지로, 신호 펩티드의 암호화 서열은 상기 신호 펩티드가 폴리펩티드의 세포외 분비에 영향을 미치는 경우 상기 폴리펩티드의 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 본 발명의 하나의 구현예에 따라, 각각의 폴리뉴클레오티드가 상이한 펩티드를 암호화하는 경우, "작동적으로 연결된"은 각각의 폴리뉴클레오티드가 인접하며, 2개의 단백질 암호화 영역을 결합시키는 것이 필요한 경우, 개방 판독 프레임을 정렬함을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "절단가능한 펩티드 링커"란 용어는 독소 단백질이 표적 세포 밖에서 이의 독성 효과를 발휘할 수 없게 하거나 또는 독소 단백질이 세포 성장을 억제하거나(세포정지) 또는 세포사를 유발하는(세포독성) 능력을 제한하기 위한, 결합제 부분과 독소 단백질을 연결하는 잔기를 함유하는 융합 단백질내의 내부 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 식으로, 상기 단백질 독소는 상기가 혈장 중에 있는 한, 표적 세포에 도달할 때까지(여기에서 세포독성 페이로드가 선택적으로 방출되고/되거나 활성화될 것이다) 불활성으로 유지된다(Grawunder & Stein, 2017). 상기 표적 세포내에서, 상기 절단가능한 링커 서열은 절단되고 독성 단백질은 활성으로 되거나 독성으로 된다. 본 발명의 융합 단백질은 특이성 프로테아제, 특히 비제한적으로 암 특이성 프로테아제에 대한 절단 인식 부위를 갖고/갖거나 특정한 조건, 예를 들어 비제한적으로 산 및/또는 환원 조건하에서 절단가능한 특정한 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열에 의해 연결되는 세포-특이성 결합제 부분 및, 단백질 독소 부분으로 구성된다. 특이성 프로테아제에 대한 절단 인식 부위를 암호화하는 서열을 공지된 편재하는 인간 프로테아제 중에서 및/또는 암 연관 프로테아제의 발현을 시험함으로써 식별할 수 있다. 또한 링커 서열은 세포 결합 및 리소솜내로의 내면화에서 결합제 부분의 역할을 방해하지 않아야 한다.
프로톡신의 "절단가능한 도메인"이란 용어는, 가수분해 또는 효소적 절단에 의해 일단 절단되면 상기 프로톡신의 독소 부분을 활성화하는 서열에 관한 것이다. 다수의 프로톡신은 효소에 의해 또는 pH 의존적인 가수분해(예를 들어 엔도솜에서 내포작용 후에)에 의해 특이적으로 절단되어 활성 독소 부분을 시토졸내로 방출하는 아미노산 도메인을 갖는다. 상기와 같은 절단가능한 도메인은, 독소가, 예를 들어 프로톡신로서 오지 않기 때문에, 활성화를 위한 절단가능한 도메인을 포함하지 않는 경우에 사용되어야 하는 절단가능한 펩티드 링커와 상반되게, "천연의" 절단가능한 펩티드 링커(또는 "본래의 절단 부위")로서 이중으로 작용한다.
"선택성 활성화/방출"이란 용어는 특정 조건하에서 세포 성장을 억제하거나(세포정지) 또는 세포사를 유발하는(세포독성) 프로톡신 또는 단백질 독소의 능력의 활성화를 지칭한다. 이러한 선택성 활성화는, 변형시 불활성 독소(단백질 프로톡신)를 활성 독소 또는 프로톡신의 고유의 절단가능한 링커로 전환시키는 단백질 독소의 비천연 또는 자연에서 발견되지 않는 변형성 활성화 부분을 지칭한다. 상기 선택적으로 변형성인 활성화 부분이 독소 융합 단백질의 성분인 경우, 상기 변형성 활성화 부분의 변형은 직접적으로 표적 세포에 독성으로 되는 독성전구물질을 생산시키거나, 또는 표적 세포에 독성으로 되는 자연적으로 활성화가능한 형태를 띠는 프로톡신을 생산시킬 수 있다. 자연적으로 활성화가능한 프로톡신은 예를 들어 상기 물질이 표적 세포의 내인성 성분, 또는 상기 표적 세포(예를 들어 표적 세포 특이성 프로테아제 또는 편재하는 프로테아제)를 둘러싸는 환경, 및/또는 특정한 조건, 예를 들어 비제한적으로 산 및/또는 환원 조건에 민감하게 하는 변형성 활성화 부분의 변형을 포함한다. 자연적으로 활성인 독소를, 상기 독소가 표적 세포의 내인성 성분 또는 상기 표적 세포를 둘러싸는 환경 및/또는 특정 조건, 예를 들어 비제한적으로 산 및/또는 환원 조건에 민감하게 하는 천연 또는 비천연의 자연에서 발견되지 않는 변형성 활성화 부분을 사용하여 독소 융합물로 불활성화(프로톡신)되도록 변형시킬 수 있다. 변형성 활성화 부분은 본 발명에서 절단가능한 링커로서 정의된다.
따라서, 절단가능한 링커는 활성 프로파일에 관하여 안정한 링커에 비해 분명한 장점을 제공하지만, 이의 사용은 상기 링커의 절단이 생산 시스템의 자기-중독으로 이어지기 때문에, 포유동물, 곤충 및 효모 세포에서 각각의 결합 단백질-독소 접합체의 생산을 복잡하게 한다. 그러나, 이는 하기로 인해 식물-기반 생산 시스템에는 적용되지 않는다.
(i) 링커를 절단하지 않는다(각각의 프로테아제 또는 환원/가수분해 조건의 결여로 인해), 및/또는
(ii) 포유동물 또는 포유동물 세포에 독성인 각각의 단백질 독소는 식물 또는 식물 세포에 독성이 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단클론 항체"란 용어는 동종 항체 집단, 즉 전체 면역글로불린, 또는 이의 항원 결합 단편 또는 유도체로 이루어지는 동종 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭할 것이다. 특히 바람직하게, 상기와 같은 항체는 IgG, IgD, IgE, IgA 및/또는 IgM, 또는 이들의 단편 또는 유도체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단편"이란 용어는 표적 결합 능력을 유지하는 상기와 같은 항체의 단편, 예를 들어
·CDR(상보성 결정 영역),
·고가변 영역,
·가변 도메인(Fv),
·IgG 중쇄(VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 이루어진다),
·IgG 경쇄(VL 및 CL 영역으로 이루어진다), 및/또는
·Fab 및/또는 F(ab)2를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "유도체"란 용어는 구조적으로 상이하지만, 통상적인 항체 개념에 대해 일부 구조적 관련성을 갖고(예를 들어 scFv, scFv-FC, Fab 및/또는 F(ab)2뿐만 아니라 이중-, 삼중- 또는 그 이상의 특이성의 항체 작제물 또는 1가 항체), 추가로 표적 결합 능력을 유지하는 단백질 작제물을 지칭할 것이다. 이들 항목은 모두 하기에서 설명된다.
당업자에게 공지된 다른 항체 유도체는 디아바디, 카멜리드 항체, 나노바디, 도메인 항체, scFv로 이루어지는 2개의 쇄를 갖는 2가 동종이량체, IgA(J 쇄 및 분비 성분에 의해 결합된 2개의 IgG 구조), 샤크 항체, 신세계 영장류 프레임워크 + 비-신세계 영장류 CDR로 이루어지는 항체, CH3+VL+VH를 포함하는 이량체화된 작제물, 및 항체 접합체(예를 들어 독소, 사이토카인, 방사성동위원소 또는 표지에 연결된 항체 또는 단편 또는 유도체)이다. 이들 유형은 문헌에 충분히 기재되어 있으며 본 개시내용에 기초하여, 추가의 독창적인 활성을 추가하여 당업자에 의해 사용될 수 있다.
하이브리도마 세포의 생산 방법은 앞서 기재되었다(본원에 참고로 인용된 문헌[Kohler and Milstein 1975]을 참조하시오). 필수적으로, 예를 들어 마우스를 인간 용해성 구아닐릴 사이클라제(sGC) 단백질로 면역화시킨 다음, 상기 마우스로부터 B-세포를 단리하고 상기 단리된 B-세포와 골수종 세포를 융합시킨다.
키메라 또는 인간화된 mAb의 생산 및/또는 선택 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 필수적으로, 예를 들어 표적 결합에 관련되지 않은 쥐 항 sGC 항체로부터의 단백질 서열을 상응하는 인간 서열에 의해 교체한다. 예를 들어 Genentech의 US6331415는 키메라 항체의 생산을 기재하는 반면 Medical Research Council의 US5859205는 인간화된 항체의 생산을 기재한다. 이들 개시내용은 모두 본원에 참고로 인용된다.
완전한 인간 mAb의 생산 및/또는 선택 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이는 인간 sGC로 면역화된 트랜스제닉 동물의 사용, 또는 효모 디스플레이, 파지 디스플레이, B-세포 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이와 같은 적합한 디스플레이 기법의 사용을 수반할 수 있으며, 여기에서 라이브러리로부터의 항체가 정지상에서 인간 sGC에 대해 선별된다.
시험관내 항체 라이브러리는 특히 MorphoSys의 US6300064 및 MRC/Scripps/Stratagene의 US6248516에 개시되어 있다. 파지 디스플레이 기법은 예를 들어 Dyax의 US5223409에 개시되어 있다. 트랜스제닉 포유동물 플랫폼은 예를 들어 TaconicArtemis의 EP1480515A2에 기재되어 있다. 이들 개시내용은 모두 본원에 참고로 인용된다.
IgG, scFv, scFv-FC, Fab 및/또는 F(ab)2는 당업자에게 주지된 항체 포맷이다. 관련된 허가 기술을 각각의 교과서로부터 입수할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "Fab"란 용어는 항원 결합 영역을 포함하는 IgG 단편에 관한 것이며, 상기 단편은 항체의 각 중쇄 및 경쇄로부터의 하나의 불변 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "F(ab)2"란 용어는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 Fab 단편으로 이루어지는 IgG 단편에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "scFv"란 용어는 짧은 링커, 대개는 세린(S) 또는 글리신(G)으로 함께 연결된, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합물인 단쇄 가변 단편에 관한 것이다. 상기 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩티드의 도입에도 불구하고, 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "scFv-FC"란 용어는 특이성 항체 포맷에 관한 것이다. 상기 포맷은 특히 안정하며 식물 세포 및 식물에서 고수율로 발현될 수 있다. scFv-Fc 작제물은 예를 들어 문헌[Bujak et al (2014)]에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 인용된다. scFv-Fc 작제물은 예를 들어 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 결합된 2개의 쇄를 포함하는 이량체성 작제물이며, 여기에서 상기 각각의 쇄는 하기와 같은 구조로 이루어진다(N -> C 방향으로):
Figure 112021098159357-pct00003
이때 VL은 항체의 경쇄의 가변 도메인이고, VH는 항체의 중쇄의 가변 도메인이며, FC는 항체의 불변 도메인이다.
완전길이 IgG-모양 항체 또는 scFv-Fc 결합 도메인의 사용은 접합체에 보다 긴 반감기를 부여한다. 더욱이, 항체의 Fc 부분은 CDC(보체 의존적인 세포독성) 또는 ADCC(항체 의존적인 세포 세포독성) 활성화가 요구될 때 최고로 중요한 것일 수 있다.
변형된 항체 포맷은 예를 들어 이중- 또는 삼중특이성 항체 작제물, 항체-기반 융합 단백질, 면역접합체 등이다. 이러한 유형은 문헌에 충분히 기재되어 있으며 본 개시내용에 기초하여 추가로 독창적인 활성을 가하여 당업자에 의해 사용될 수 있다. 더욱 또한, 1가 항체가 또한 앞서 US 2004/0033561 A1(상기 중에 모노바디로서 지칭됨) 또는 WO2007048037에 기재되었으며; 이들은 모두 본원에 참고로 인용된다.
항체 모방물질은 항체처럼 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 항체와 구조적으로 관련되지 않은 유기 화합물(대부분의 경우 재조합 단백질, 또는 펩티드)이다. 항체에 비해 통상적인 장점은 보다 양호한 용해도, 조직 침투성, 열 및 효소에 대한 안정성, 및 비교적 저렴한 생산 비용이다. 항체 모방물질은 치료 및 진단제로서 개발 중에 있으며, 그 중에서도 애피바디 분자, 애필린, 유비퀴틴, 애피머(Affimer), 애피틴, 알파바디, 안티칼린, 애비머(Avimer), DARPin, 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드, 모노바디 및 나노CLAMP를 포함한다. 항체 모방물질은 특히 문헌[Gebauer and Skerra (2009)](본원에 참고로 인용된다)에 보다 상세히 논의되어 있다.
일반적으로, 단백질 결합제는 단쇄로 이루어질 수 있다. 이는 예를 들어 상기 단백질 결합제가 scFv 항체 또는 scFv-FC인 경우이다. 이 경우에, 전체 단백질 결합제는 단일 폴리뉴클레오티드상에서 암호화될 수 있다.
또 다른 구현예에서 단백질 결합제는 예를 들어 완전 크기 IgG 또는 F(ab)2 단편에서와 같이 2개 이상의 쇄를 포함할 수 있다. 상기와 같은 경우에 핵산 작제물은 단백질 결합제에 대한 상이한 쇄 또는 도메인을 암호화하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
단백질 결합제가 2개 이상의 쇄를 포함하는 또 다른 구현예에서, 2개의 핵산 작제물이 제공되며, 첫 번째는 상기 단백질 결합제의 제1 쇄, 링커 및 독소를 암호화하는 3개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 반면, 두 번째는 상기 단백질 결합제의 제2 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 방법은 단계 (iii)에서 발현된 융합 단백질의 회수 및/또는 정제 단계 (iv)를 추가로 포함한다.
본 발명의 하나의 다른 구현예에 따라, 식물 또는 식물 세포는 니코티아나 속으로부터 유래한다.
하나의 구현예에서, 식물을 사용하는 경우 융합 단백질의 발현은 일시 발현이다. 또 다른 구현예에서, 식물 세포를 사용하는 경우 융합 단백질의 발현은 일시 또는 안정한 발현이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "일시 발현"이란 용어는 핵산, 가장 흔히는 발현 카세트(expression cassette)를 암호화하는 플라스미드 DNA를 숙주 세포 또는 식물에 도입시킨 후 단시간 동안 발현되는 유전자의 일시적인 발현에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "안정한 발현"이란 용어는 핵산, 가장 흔히는 발현 카세트를 암호화하는 플라스미드 DNA를 숙주 세포의 게놈에 도입시킨 후(핵 또는 플라스티드 통합) 시간이 지남에 따라 계속해서 발현되는 유전자의 발현에 관한 것이다. 안정하게 형질감염된 세포에서, 외부 유전자는 게놈의 일부로 되고 따라서 복제된다.
일시 및 안정한 발현은 모두 "유도성 프로모터"에 의해 유도될 수 있다. 상기 프로모터는 내인성 또는 외인성 자극의 존재에 따라 또는 화학물질, 환경, 호르몬 및/또는 발생 신호에 반응하여 작동적으로 연결된 DNA 서열을 선택적으로 발현한다. 이들 조절 요소는 비제한적으로, 문헌[Abdel-Ghany et al (2015)]에 리뷰되고 US 10344290 B2에 논의된 바와 같이(상기 참고문헌은 모두 본원에 참고로 인용된다) 에탄올, 열, 빛, 스트레스, 재스민, 살리실산, 식물호르몬, 염, 홍수 또는 가뭄에 민감하다. 비제한적으로 합성 성분을 포함하는 유도성 프로모터는 문헌[Ali et al (2019)]에 논의되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
니코티아나 속은 담배 식물을 포함한다. 담배 식물 또는 식물 세포는 이미 안정한 링커로 단백질 독소에 연결된 작은 sFv 단편으로 구성된 재조합 면역요법 결합제-독소 융합 단백질을 생산하는 것으로 시험되었다(Francisco et al. (1997), 및 US6140075A).
단백질 융합의 또 다른 예는 절단가능하지 않은 링커를 통해 scFv-Fc에 재조합적으로 융합된 인간 면역사이토카인 IL2의 니코티아나 벤타미아나에서의 일시적인 생산이다(Marusic et al. (2016)). 그러나, 절단가능한 링커를 통해 고도로 효능 있는 단백질 독소에 연결된 항체의 생산은 식물 시스템에서는 결코 개시된 적이 없다.
본 발명의 하나의 추가의 구현예에 따라, 식물 세포는 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나이다:
·니코티아나 타바쿰 cv. BY2,
·니코티아나 타바쿰 NT-1,
·아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana),
·다우쿠스 카로타(Daucus carota), 및/또는
·오리자 사티바(Oyrza sativa).
니코티아나 타바쿰 cv. BY2 aka 토바코 BY-2 세포 및 cv. 니코티아나 타바쿰 1(NT-1, BY-2의 동기)은 적합한 배양 배지 및 양호한 배양 조건에서 1주일내에 100배까지 그 수를 번식시킬 수 있는 녹색이 아닌, 빠르게 성장하는 식물 세포이다. 상기 담배 품종은 세포 배양물로서 및 보다 구체적으로 세포 현탁 배양물(액체 배지에서 성장하는 세포의 특수 집단으로, 식물 세포의 특정한 생물학적 성질을 연구하기 위해서 과학자에 의해 재배된다)로서 유지된다. 세포 현탁 배양물에서, 각각의 세포는 배양 배지에서 독립적으로 또는 기껏해야 짧은 쇄로 부유한다. 각각의 세포는 다른 것들과 유사한 성질을 갖는다.
모델 식물 시스템은 인간 연구에 대해서 HeLa 세포에 필적한다. 상기 유기체는 비교적 단순하고 예측가능하기 때문에 생물학적 과정의 연구를 보다 용이하게 하며 보다 복잡한 유기체의 이해를 향한 중간 단계일 수 있다. 상기는 식물 생리학자 및 분자 생물학자에 의해 모델 유기체로서 사용되며, 또한 여전히 식물 세포의 일반적인 양상을 특징으로 하면서 이의 비교적 높은 동종성 및 높은 생장률로 인해 고등 식물에 대한 모델 시스템으로서 사용된다. 자연적으로 생장한 식물의 임의의 부분내(생체내)의 세포 유형의 다양성은 살아있는 식물 세포의 일부 일반적인 생화학적 현상을 조사하고 이해하기 매우 어렵게 한다. 예를 들어, 세포 안팎으로의 용질의 수송은 다세포 유기체 중의 분화된 세포들이 상이하게 행동하기 때문에 연구하기 어렵다. 세포 현탁 배양물, 예를 들어 담배 BY-2는 서로 매우 유사하게 행동하기 때문에 단세포 수준 및 이의 구획에서 상기 연구에 양호한 모델 시스템을 제공한다. 이웃하는 세포 행동의 영향은 현탁액 중에서 온전한 식물만큼 중요하지는 않다. 그 결과 자극을 적용한 후에 관찰되는 임의의 변화들은 통계학적으로 상관될 수 있으며 이러한 변화가 자극에 대한 반응인지 또는 단지 우연인지를 결정할 수 있다. BY-2 및 NT-1 세포는 비교적 잘 이해되어 있으며 종종 이종 단백질, 특히 항체의 발현을 포함한 연구에 사용된다(Hellwig et al (2004)). 상기와 같은 방법은 문헌[H
Figure 112021098159357-pct00004
kkinen et al. (2018)]에 개시되어 있으며, 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
문헌[Torres (1989)]에서는 당근 세포 현탁 배양(Carrot Cell Suspension Culture)(다우쿠스 카로타(Daucus carota)을 확립시키는 방법을 논의한다. 문헌[Shaaltiel et al (2007)]에서는 당근 세포 기반 발현 시스템을 사용하는 효소의 생산을 논의한다. 이들 논문의 내용은 본원에 참고로 인용된다. 다우쿠스 카로타 및 오리자 사티바가 또한 문헌[Santos et al (2016)]에서 적합한 식물-세포 기반 발현 시스템으로서 논의되며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다. 니코티아나 타바쿰, 아라비도프시스 탈리아나, 오리자 사티바에서 재조합 단백질의 생산은 문헌[Plasson et al (2009)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
일반적으로, 본 발명은 식물의 세포가 외부 폴리펩티드의 발현에 적합한 DNA 작제물로 형질전환될 수 있고 표준 식물 세포 배양 조건하에서 배양될 수 있는 임의의 식물 품종으로 수행될 수 있다. 식물 세포 현탁 또는 식물 조직 배양이 바람직하지만, 캘러스 배양 또는 다른 통상적인 식물 세포 배양 방법을 사용할 수도 있다.
본 발명의 하나의 다른 구현예에 따라, 식물은 니코티아나 벤타미아나이다. 니코티아나 식물에서 항체의 생산은 예를 들어 문헌[Daniell et al. (2001)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 다른 식물 또는 식물 세포는 비제한적으로 상추(락투카 스페시즈(Lactuca spp.)), 시금치(스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea)), 및 아라비도프시스(아라비도프시스 스페시즈(Arabidopsis spp))를 포함한다.
본 발명의 하나의 추가의 구현예에 따라, 식물 세포 또는 식물 전체를 핵산 작제물과 접촉시키는 단계 (i)는 "발현 벡터"의 단독 사용을 수반하거나 또는 상기로부터 유래된 벡터인 아그로박테리움 투메파시엔스, 또는 입자 충격/유전자총법(biolistic)에 의해 매개된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "발현 벡터"란 용어는 핵산 작제물을 식물 또는 식물 세포내로 도입시킬 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 통합성 DNA 단편 및 기타의 비히클(vehicle)과 같은 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 유용한 발현 벡터는 당해 분야에 주지되어 있다. "벡터"란 용어는 조절 요소 및 핵산 작제물을 도입시키기 위한 부위를 포함하는 핵산 분자, 예를 들어 플라스미드를 의미한다.
일부 구현예에서, 벡터는 비제한적으로 전체 바이러스 시스템, 해체된 바이러스, 또는 비-바이러스 요소에 기반할 수 있다. 각각 Geneware(미국특허 제 7,939,318 호에 기재된 플랫폼) 및 MagnIcon이 가장 잘 알려진 전체 바이러스 시스템 및 해체된 바이러스 시스템이며, 이들은 문헌[Altman et al (2011)]에 기재되어 있고, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
대개는 상기 사용된 바이러스 벡터를 RNA 또는 DNA 기반 벡터로 분류할 수 있다. 예로서, RNA 벡터는 비제한적으로 토바모바이러스(예를 들어 담배 모자이크 바이러스(TMV)), 동백 모자이크 바이러스(CMV), 포텍스바이러스(예를 들어 감자 바이러스 X(PVX)) 또는 토브라바이러스(예를 들어 담배 딸랑이 바이러스(TRV))를 포함할 수 있다. DNA 벡터는 종종 마스트레바이러스, 쿠르토바이러스, 토포쿠바이러스 및 베고모바이러스를 포함하는 콜리모바이러스 및 제미니-바이러스와 연관되었다. 예로서 마스트레바이러스로부터의 콩황색왜성(BeYDV) 및 담배황색왜성 바이러스가 널리 사용되었다.
대안으로서, 벡터는 비-바이러스 요소에 기반할 수 있으며 예를 들어 합성적이거나(Peyret et al., 2019) 또는 다른 단백질로부터 유래하는(Diamos, et al., 2016) 5' 및 3' 번역되지 않은 영역을 포함한다. 이들 두 문서의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
본원에서 벡터는 복제성이거나 복제성이 아닐 수 있음에 유의하는 것이 중요하다. 또한, 벡터의 복제성은 문헌[Dugdale et al. (2013)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)에 기재된 식물내 활성화(충격) 시스템의 경우와 같이, 일단 조절 요소가 활성화되면 유도될 수 있다.
아그로박테리움 형질감염이 예를 들어 문헌[Mayo et al (2006)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다. TMF 형질감염은 예를 들어 문헌[Hussain Shah et al (2013)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다. 입자 충격/유전자총법은 예를 들어 문헌[Kikkert et al (2005)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
본 발명에 따른 방법의 장점은 담배 식물 또는 세포주를 사용하는 구현예로 제한되지 않음을 강조하는 것이 중요하다. 예를 들어, 절단가능한 링커 또는 절단가능한 도메인이 식물 또는 식물 세포에 의해 온전하게 남아있기 때문에 접합체가 식물에서 발현될 수 있다는 사실은 상기 식물 또는 식물 세포에 해를 입히지 않으면서 접합체의 발현을 허용하는 식물에 대한 보편적인 원리이다. 따라서, 본 발명의 개념을 적용할 수 있으며, 이는 재조합 발현에 사용될 수 있는 모든 식물 또는 식물 세포에서 가능하다.
핵산은 주어진 식물 또는 식물 세포에서 발현가능한 적합한 작동적으로 연결된 프로모터의 조절하에서 식물 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 임의의 통상적인 방법을, 비제한적으로 하기 실시예에 기재된 것들을 포함하여, 식물 세포 형질전환, 배양, 및 재생에 사용할 수 있다.
핵 게놈의 형질전환을 위해서, 통상적인 기법을 사용할 수 있다. 외부 DNA를 식물 세포에 일시적으로 또는 안정하게 도입시키는데 공지된 모든 수단, 예를 들어 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 일렉트로포레이션, 원형질체 융합, 입자 총 충격, 또는 DNA의 세포, 예를 들어 화분, 소포자, 종자 및 미성숙 배아내로의 침투를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터, 예를 들어 제미니 바이러스 또는 위성 바이러스를 또한 도입 수단으로서 사용할 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스 및 리조게네스가 발현 벡터 도입에 바람직한 수단을 구성한다. 이 경우에, 본 발명의 서열을 모든 필수적인 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 종결자 등뿐만 아니라, 안정한 식물 발생의 경우에 이종 서열이 통합된 형질전환체를 선택하는데 필요한 임의의 서열을 갖는 적합한 벡터내에 도입시킨다. 특정한 유도 발현의 경우에, 본 발명의 서열을 유도성 프로모터 또는 모든 필수적인 조절 서열을 함유하는 벡터내에 도입시킨다.
핵산 분자(들)를 식물 세포내에 도입시키는 것을 핵 게놈의 형질전환에 의해서, 또는 식물 세포의 엽록체 게놈의 형질전환에 의해서, 또는 미토콘드리아 게놈의 형질전환에 의해서 일시적인 또는 안정한 방식으로 수행할 수 있다.
식물 세포의 핵 게놈의 형질전환은 종종 상기에 언급되고 단백질의 발현 및/또는 축적이 발생하는 세포 구획을 결정하는 표적화 신호를 사용하여 수행된다.
표적화 서열은 펩티드 외에, KDEL, SEKDEL 또는 HEKDEL 펩티드로 이루어지는 내형질 체류 신호를 추가로 포함할 수 있다. 이들 신호는 통상적으로 단백질의 C-말단 단부에 존재하며 성숙한 단백질 상에서 남아있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 프로톡신 중의 펩티드 링커 또는 절단가능한 도메인은 포유동물 세포에 의해 발현된 효소, 또는 포유동물 숙주에 의해 생산되는 효소에 의해 특이적으로 또는 비-특이적으로 절단가능하다.
상기와 같은 효소의 예 및 이의 절단 부위를 하기 표에 나타낸다(또한 문헌[Choi et al (2012)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)을 참조하시오). 표에서, 각각의 효소에 관한 보다 많은 허가 정보에 대해서 "Merops" 데이터베이스를 참조한다. https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml.
Figure 112021098159357-pct00005
절단 부위는 절단 부위 지점(↓으로 나타낸다)으로부터 기재된다. 문자 x는 모든 아미노산을 지칭한다. 다수의 우선적인 아미노산이 존재하는 경우, 슬래시(/)에 의해 분리된다.
상기와 같은 효소는 바람직하게는 프로테아제이다. 하나의 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 식물 효소에 의해 절단가능하지 않다.
퓨린은 서브틸리신-유사 전구단백질 전환효소 패밀리에 속하고 표준 염기성 아미노산 서열 동기 Arg-X-Arg/Lys-Arg(RX(R/K)R)(여기에서 X는 임의의 천연 단백질생산 아미노산일 수 있다)의 C-말단에서 단백질을 절단하는 효소이다. 상기 동기를 본원에서 퓨린 절단 부위라 칭한다. 바람직하게, 이의 서열은 HRRRKRSLDTS이다.
카뎁신(Cathepsin)은 모든 동물뿐만 아니라 다른 유기체에서도 발견되는 프로테아제이다. 구성원의 대부분은 리소솜에서 발견되는 낮은 pH에서 활성화되게 된다. 카뎁신 B는 디펩티드 동기 Val-Ala(VA)를 포함하는 펩티드 서열을 절단할 수 있다. 상기 동기를 본원에서 카뎁신 B 절단 부위라 칭한다. 당업자는 문헌[Turk et al (2012)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)에서 카뎁신 및 이의 절단 부위에 대한 충분한 허가 정보를 발견한다.
그랜자임 B는 독특한 테트라펩티드 서열에서 절단하는 세린 프로테아제이다. 580개를 초과하는 상기와 같은 테트라펩티드 절단 부위가 존재한다(Wee et al. (2011)). 테트라펩티드 Ile-Glu-Pro-Asp(IEPD)가 시험관내에서 최적의 테트라펩티드 절단 서열로서 식별되었다. 그러나, 그랜자임 B 기질에 대한 새로운 데이터는 생체내 절단 특이성이 훨씬 더 다양하며, 이때 다수의 기질이 상기 테트라펩티드 서열을 넘어 확장되는 절단 특이성을 가짐을 제시한다(VanDamme et al. (2009)).
고유의 그랜자임 B 전구효소는 서열: DAGE'IIGG를 갖는 절단 부위에서 카뎁신(디펩티딜 펩티다제 I)에 의한 절단에 의해 활성화된다. 상기와 같은 방식으로, 활성화된 그랜자임 B 효소는 IIGGHE로 출발하는 N-말단을 가지며, 이를 본원에서 서열번호 1로서 나타낸다. 따라서 이는 본 발명의 하나의 구현예에 따라 사용되는 활성화된 효소의 N-절두된 서열이다.
카스파제(시스테인-아스파틱 프로테아제, 시스테인 아스파타제 또는 시스테인-의존성 아스파테이트-유도 프로테아제)는 예정세포사(programmed cell death)에서 필수적인 역할을 하는 프로테아제 효소의 한 패밀리이다. 1500개가 넘는 카스파제 기질이 인간 프로테옴에서 발견되었다. 일반적인 절단 동기는 DXXD-A/G/S/T(여기에서 X는 임의의 천연 단백질생산 아미노산일 수 있다)이다. 당업자는 문헌[Kumar et al (2014)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)에서 카스파제 및 이의 절단 부위에 대한 충분한 허가 정보를 발견한다.
기질 메탈로프로테이나제(MMP)(또한 매트릭신(matrixin)으로서 공지됨)는 칼슘-의존성 아연-함유 엔도펩티다제이며; 다른 패밀리 구성원은 아다말리신, 세랄리신, 및 아스타신이다. 종합적으로, 이들 효소는 모든 종류의 세포외 기질 단백질을 분해할 수 있지만, 또한 다수의 생물활성 분자를 처리할 수 있다. 당업자는 문헌[Eckard et al (2016)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)에서 기질 메탈로 프로테아제 및 이의 절단 부위에 대한 충분한 허가 정보를 발견한다.
일반적으로, 당업자는 통상적인 고려사항 및 문헌 참조에 의해 각각의 포유동물 효소와 합치하는 특정한 절단 부위를 선택하여, 단백질 독소 또는 프로톡신의 표적 특이적인 방출을 조절할 수 있다. 이러한 절단 부위를 찾기 위한 일반적인 지침은 예를 들어 문헌[Rawlings (2016)]에 개시되어 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 펩티드 링커 또는 프로톡신 중의 절단가능한 도메인은 식물 세포에 의해 발현된 효소, 또는 식물 숙주에 의해 생산되는 효소에 의해 절단가능하지 않다. 당업자는 상기 조건이 충족되는지의 여부를 확인하기 위해 여러가지 통상적인 방법을 알고 있다. 예를 들어 문헌[Wilbers et al (2016)]을 참조하시오.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 적어도 하나의 단백질 독소 또는 프로톡신은 효소이다. 단백질 독소는 가장 흔히 효소로서 작용하기 때문에, 하나의 독소 분자가 다수의 기질 분자상에서 작용할 수 있으며, 따라서 비효소 독소(대개는 단지 표적 구조에 관하여 화학량론적으로 작용한다)와 상반되게, 세포에 대해 다중 독성 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 단백질 독소는 하기 중에서 선택된 그룹 중 적어도 하나이다
(1) 세포사 유도 단백질("독소 부류 1")
(2) 단백질 합성 억제제("독소 부류 2")
(3) 막 동요 단백질(Membrane perturbating protein)("독소 부류 3")
(4) 세포분열 억제 단백질("독소 부류 4")
세포사 유도 단백질은 비제한적으로 세포사멸 경로상에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하고/하거나 핵산 성분에 영향을 미치는 단백질이다. 세포사 유도 단백질은 단백질 분해 및/또는 핵분해 활성에 따라 이의 모든 포맷으로, 세포사멸 매개된-단백질, RNA 및 DNA를 표적화한다.
단백질 합성 억제제의 부류는 리보솜의 적절한 작동을 방지하는 단백질을 포함한다. 이 부류는 주로, 비제한적으로 ADP-리보실화 단백질 그룹에 의해 대표된다. 이들 단백질은 포유동물 연장 인자 2의 ADP-리보실화를 촉매화하고, 이는 이의 불활성화 및 리보솜의 봉쇄로 이어진다.
막 동요 단백질은 비제한적으로 구멍-형성 단백질의 그룹을 포함한다. 이러한 그룹의 단백질은 원형질막내로 구멍을 삽입하여 전해질 및 다른 소분자의 자유로운 통과를 허용하여 막 완전성을 붕괴시켜 세포 용해에 이르게 한다.
세포분열 억제 단백질은 세포골격의 요소(미세소관, 튜불린, 액틴) 및/또는 세포주기 진행을 조절하는 단백질상에서 작용함으로써 세포주기를 중단시키는 단백질의 그룹이다. 미세소관 동역학의 억제 및 사이클린 의존성 단백질의 변경은 유사분열 정지를 유도하고 세포 제거를 유도한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 단백질 독소 또는 프로톡신은 고유 단백질 독소의 면역해제된 변체이다. 서열 변형에 의해 단백질 독소를 면역해제시키는 재조합 방법이 예를 들어 문헌[Schmohl et al. (2015)], 또는 문헌[Grinberg and Benhar (2017)]에 개시되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
하나의 구현예에 따라, 적어도 하나의 단백질 독소는 바람직하게는 그랜자임의 그룹 중에서 선택된 포유동물 독소, 보다 바람직하게는 그랜자임 B, 또는 상기 단백질 독소의 독성 활성을 유지하는 이의 단편이다.
그랜자임은 세포독성 T 세포 및 자연살해(NK) 세포내에서 세포질 과립에 의해 방출되는 세린 프로테아제이다. 상기는 표적 세포에서 예정세포사(세포사멸)를 유도하고, 따라서 암성으로 되었거나 바이러스 또는 세균으로 감염된 세포를 제거한다. 그랜자임은 또한 세균을 사멸시키고 바이러스 복제를 억제한다. NK 세포 및 T 세포에서, 그랜자임은 퍼포린과 함께 세포독성 과립 중에 패키징된다. 그랜자임은 또한 거친 소포체, 골지 복합체, 및 트랜스-골지망에서 검출될 수 있다. 세포독성 과립의 내용물은 그랜자임의 표적 세포 시토졸내로의 진입을 허용하는 기능을 한다. 과립은 표적 세포와 형성된 면역 시냅스내로 방출되고, 여기에서 퍼포린은 표적 세포 중의 엔도솜내로의, 및 최종적으로 표적 세포 시토졸내로의 그랜자임의 전달을 매개한다. 그랜자임은 세린 에스테라제 패밀리의 일부이다.
그랜자임 B는 세포사 유도 효과 및 또한 세포분열 억제를 모두 갖는다(Weidle et al (2014). 그랜자임 B 세포용해 단백질은 엔도솜으로부터 방출 후에 세포사멸을 유도한다. 또한, 그랜자임 B는 추가적인 사멸-기질, 예를 들어 폴리(ADP 리보스)폴리머라제, DNA-의존성 단백질 키나제, 세포골격의 성분 및 핵 유사분열 기구뿐만 아니라 스트레스 반응 및 세포 항상성에 관련된 단백질을 절단할 수 있다.
그랜자임 B는 세포사를 실행하는 카스파제-활성화된 DNase를 포함하여, 다수의 기질을 절단하는 카스파제(특히 카스파제-3)를 활성화함으로써 세포사멸을 활성화한다. 그랜자임 B는 또한 단백질 Bid를 절단하며, 상기 단백질은 단백질 Bax 및 Bak를 모집하여 미토콘드리아의 막 투과성을 변화시켜, 다른 단백질 중에서도 시토크롬 c(아폽토솜(apoptosome)을 통해 카스파제-9를 활성화하는데 필요한 부분 중 하나이다), Smac/Diablo 및 Omi/HtrA2(세포사멸 단백질의 억제제(IAP)를 억제한다)의 방출을 유발한다. 그랜자임 B는 또한 카스파제 활성의 부재하에서 세포사멸을 담당하는 단백질 중 다수를 절단한다. 다른 그랜자임은 카스파제-의존적인 및 카스파제-독립적인 기전에 의해 세포사를 활성화한다.
그랜자임은 이의 표적 세포를 사멸하는 것 외에, 세포내 병원체를 표적화하고 사멸할 수 있다. 그랜자임 B는 바이러스 단백질을 절단시켜 바이러스 활성화 및 복제를 억제한다. 그랜자임은 핵산 DNA 및 RNA에 직접 결합하며, 이는 이의 핵산 결합 단백질의 절단을 증대시킨다.
하나의 구현예에서, 상기 단백질 독소 또는 프로톡신은 식물 또는 식물 세포에 독성이 아니다. 당업자는 이 조건이 충족하는 지를 확인하는 다수의 통상적인 방법을 알고 있다. 예를 들어 개요에 대해서 문헌[Klain and Lewis (1995)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 기재에 따른 방법에 의해 생산된 결합제-독소 융합 단백질을 제공한다. 추가의 구현예에서, 상기와 같은 결합제-독소 융합 단백질은 상기 기재에 제시된 바와 같은 구조적 또는 기능적 한계를 모두 가질 수 있다. 상기는 특히 단백질 결합제, 링커 또는 절단 부위, 및 특정 독소의 포맷을 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 적어도
a) 선택된 하나의 단백질 결합제
b) 임의로, 펩티드 링커, 및
c) 적어도 하나의 단백질 독소 또는 단백질 프로톡신
을 포함하는 결합제-독소 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 상기 결합제-독소 융합 단백질은 작동가능한 연결로 적어도 하기를 포함하는 핵산 작제물에 의해 암호화된다
A) 단백질 결합제, 또는 이의 표적 결합 쇄 또는 도메인을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및
B1) 절단가능한 펩티드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및, 단백질 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는
B2) 단백질 프로톡신(여기서 프로톡신은 이의 활성화를 위한 절단가능한 도메인을 포함한다)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
다시, 추가의 구현예에서, 상기와 같은 결합제-독소 융합 단백질은 상기 기재에 제시된 바와 같은 구조적 또는 기능적 한계를 모두 가질 수 있다. 상기는 특히 단백질 결합제, 링커 또는 절단 부위, 및 특정 독소의 포맷을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 상기 단백질은 적어도 하나의 식물-특이성 N-글리칸을 포함한다. N-글리칸은 단백질 중의, 대개는 Asn-X-Thr 또는 Asn-X-Ser(NXT 또는 NXS)(여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다) 동기 중의 아스파라진(Asn) 잔기의 아미드 기에 연결되는 글리칸이다. 전형적인 식물-특이성 N-글리칸이 문헌[Gomord et al. (2010)]에 개시되어 있으며, 이는 포유동물 N-글리칸 패턴과 현저하게 상이하다. 또한 도 7을 참조하시오.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 단백질 결합제는 인간 CD20에 결합한다. 하나의 구현예에서, 단백질 결합제는 항체, 표적 결합 능력을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는 항체 모방물질이다.
하나의 구현예에서, 결합제는
a) 리툭시맙(C2B8) 중에 포함된 바와 같은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 세트
b) a)의 중쇄 CDR/경쇄 CDR 세트이나, 단 상기 CDR 중 적어도 하나는 인간 CD20에 결합하는 능력은 유지하면서 a)에서 명시한 바와 같은 각각의 CDR에 비해 3개 이하의 아미노산 치환을 갖는다,
c) a)의 중쇄 CDR/경쇄 CDR 조합이나, 단 상기 CDR 중 적어도 하나는 인간 CD20에 결합하는 능력은 유지하면서 a)에서 명시한 바와 같은 각각의 CDR에 비해 ≥66%의 서열 일치성을 갖는다
중 적어도 하나를 포함하며, 여기에서 CDR은 인간 CD20에 결합할 수 있도록 적합한 단백질 프레임워크 중에 삽입된다.
리툭시맙(또한 C2B8로 공지됨) 및 이의 서열을 개시하는 다양한 특허가 문헌[Storz U (2014)]에 포함되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
리툭시맙의 완전길이 서열을 본원에서 서열번호 4(중쇄) 및 5(경쇄)로서 나타낸다. 리툭시맙의 가변 도메인은 예를 들어 EP2000149B1의 청구항 1 및 도 4 및 5에 개시되어 있으며, 상기 특허의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
리툭시맙의 CDR에 상응하는 서열은 예를 들어 본원에서 하기에 나타낸 서열번호 9 내지 14에 개시된다.
일부 구현예에서, CDR 중 적어도 하나는 각각의 CDR에 대해 ≥67의 서열 일치성, 바람직하게는 ≥68, 보다 바람직하게는 ≥69, ≥70, ≥71, ≥72, ≥73, ≥74, ≥75, ≥76, ≥77, ≥78, ≥79, ≥80, ≥81, ≥82, ≥83, ≥84, ≥85, ≥86, ≥87, ≥88, ≥89, ≥90, ≥91, ≥92, ≥93, ≥94, ≥95, ≥96, ≥97, ≥98 중 어느 하나 또는 가장 바람직하게는 ≥99 %의 서열 일치성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, CDR 중 적어도 하나는 친화성 성숙화 또는 다른 변형에 의해 변형되어, 상기에 개시된 서열과 비교하여 서열 변형을 생산시켰다.
일부 구현예에서, CDR 중 적어도 하나는 a) 또는 b)에 명시된 바와 같은 각각의 CDR에 비해 2개 이하, 및 바람직하게는 1개의 아미노산 치환을 갖는다.
하나의 구현예에서, 결합제는 인간 CD20에 결합하는 능력을 유지하면서, 각각
a) 리툭시맙(C2B8)에 포함된 바와 같은 중쇄/경쇄 가변 도메인 쌍
b) a)의 중쇄/경쇄 가변 도메인 쌍이나, 단 상기 도메인 중 적어도 하나는 a)에 비해 ≥80%의 서열 일치성을 갖는다
c) a)의 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열이나, 단 상기 도메인 중 적어도 하나는 a)에 비해 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는다
중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 도메인 중 적어도 하나는 리툭시맙(C2B8)의 중쇄/경쇄 가변 도메인 쌍에 비해 ≥81, 바람직하게는 ≥82, 보다 바람직하게는 ≥83, ≥84, ≥85, ≥86, ≥87, ≥88, ≥89, ≥90, ≥91, ≥92, ≥93, ≥94, ≥95, ≥96, ≥97, ≥98 또는 가장 바람직하게는 ≥99 %의 서열 일치성을 갖는다.
일부 구현예에서, 도메인 중 적어도 하나는 리툭시맙(C2B8)의 중쇄/경쇄 가변 도메인 쌍에 비해 9개 이하, 바람직하게는 8개 이하, 보다 바람직하게는 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하 및 가장 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 단쇄 디아바디 중 적어도 하나의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
하나의 구현예에서, 단백질 결합제는
·상기 정의된 단백질 결합제 중 하나에 비해, 인간 CD20에 대해 ≥50%의 표적 결합 친화성을 갖고/갖거나,
·상기 정의된 단백질 결합제 중 하나와 인간 CD20에 대해서 결합을 경쟁한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "표적 결합 친화성"이란 용어는 이의 표적에 대한 본 발명에 따른 결합 분자의 친화성을 지칭하며, "KD" 값을 사용하여 숫자로 표현된다. 일반적으로, 보다 높은 KD 값은 보다 약한 결합에 상응한다. 일부 구현예에서, "KD"는 예를 들어 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000을 사용하여 방사성표지된 항원 결합 분석(MA) 또는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 측정된다. 몇몇 구현예에서, "결합속도" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합율" 또는 "kon" 및 "해리속도" 또는 "해리의 속도" 또는 "해리율" 또는 "koff"를 또한 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법으로 측정한다. 추가의 구현예에서, "KD", "kon", 및 "koff"를 Octet® 시스템을 사용하여 측정한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "결합에 대해서 경쟁하다"란 용어는 상기와 같은 서열에 의해 정의된 항체 중 하나와 관련하여 사용되며, 이는 실제 항체가 상기 서열이 정의한 항체와 동일한 표적 또는 표적 에피토프 또는 도메인 또는 서브도메인에 결합하는 활성을 의미하며, 상기 실제 항체는 후자의 변체이다. 결합 효율(예를 들어 동역학 또는 열역학)은 후자의 효율과 같거나 이보다 크거나 작을 수 있다. 예를 들어 기질에 대한 결합에 대한 평형 결합 상수는 상기 두 항체에 대해서 상이할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "주어진 표적에 결합하는 능력을 유지하는"이란 용어는, 예를 들어 각각의 변체가 변형되지 않은 펩티드의 경우에 비해 ≥50%의 표적 결합 친화성을 가짐을 의미한다.
이러한 상황에서, 본원에 사용되는 바와 같은 "보존적 아미노산 치환"은 비-보존적 치환보다 항체 기능에 대해 더 작은 효과를 갖는다. 아미노산을 분류하는데 다수의 방식이 존재하지만, 상기 아미노산은 종종 이의 구조 및 이의 R 기의 일반적인 화학적 특징에 기초하여 6개의 주요 그룹으로 분류된다.
일부 구현예에서, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 예를 들어, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에서 정의되었다. 이들 패밀리는
·염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘),
·산성 측쇄(예를 들어 아스파트산, 글루탐산),
·하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인),
·비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판),
·베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및
·방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)
를 갖는 아미노산을 포함한다.
다른 보존적 아미노산 치환은 또한 전체 아미노산 측쇄 패밀리에 걸쳐, 예를 들어 펩티드의 전하를 변형시키기 위해 아스파라진을 아스파트산 대신에 사용할 때 발생할 수 있다. 보존적 변화는 화학적으로 동종의 비-천연 아미노산의 치환을 추가로 포함할 수 있다(즉 류신 대신에 합성적인 비-천연 소수성 아미노산, 트립토판 대신에 합성적인 비-천연 방향족 아미노산).
"서열 일치성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교창에 대해 비교함으로써 측정되며, 여기에서 상기 비교창 중 폴리뉴클레오티드 서열 부분은, 상기 2개 서열의 최적의 정렬의 경우, 첨가 또는 결실을 포함하지 않는 참조 서열(예를 들어 폴리펩티드)에 비해 첨가 또는 결실(즉 끊김)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은, 2개 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하여 합치하는 위치의 수를 생산시키는 위치의 수를 결정하고, 상기 합치된 위치의 수를 비교창 중의 전체 위치의 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 백분율을 생산시킴으로써 계산된다.
추가의 구현예에서, 결합제-독소 융합 단백질은 하기의 구조 중 하나를 갖는다:
·(scFv-FC)-(절단 부위)-독소/프로톡신(이량체)
·2개의 HC 및 2개의 LC-(절단 부위)-독소/프로톡신의 사량체
·2개의 LC 및 2개의 HC-(절단 부위)-독소/프로톡신의 사량체
상기와 같은 구조를 예를 들어 도 9에 도시하며, 여기에서 CS는 절단 부위를 의미하고, Tox는 독소/프로톡신을 의미하며, HC는 IgG 항체의 중쇄를 나타내고, LC는 IgG 항체의 경쇄를 나타낸다. scFv-FC는 scFv-FC 작제물을 나타낸다.
추가의 구현예에서, 결합제-독소 융합 단백질은 하기의 구조 중 하나를 갖는다(N->C-배향):
·(scFv-FC)-CS-독소(이량체)(->FC 영역의 C-말단에 연결된 독소)(도 9a 참조)
·2개의 HC 및 2개의 LC-CS-독소(->LC의 C-말단에 연결된 독소)의 사량체(도 9b 참조)
·2개의 LC 및 2개의 HC-CS-독소(->HC의 C-말단에 연결된 독소)의 사량체(도 9c 참조)
·독소-CS-(scFv-FC)(이량체)(->scFv의 N-말단에 연결된 독소)(도 9d 참조)
·2개의 HC 및 2개의 독소-CS-LC(->LC의 N-말단에 연결된 독소)의 사량체(도 9e 참조)
·2개의 LC 및 2개의 독소-CS-HC(->HC의 N-말단에 연결된 독소)의 사량체(도 9f 참조)
·독소-CS-(-Fc-scFv)(이량체)(->FC의 N-말단에 연결된 독소)(도 9g 참조)
상기에서, CS는 "절단 부위"를 나타내고, 상기는 하나의 구현예에서 퓨린 절단 부위이다.
하나의 구현예에서, 독소는 그랜자임 B이다.
추가의 구현예에서, 결합제-독소 융합 단백질은 하기 중 적어도 하나를 포함한다
또 다른 구현예에 따라, 결합제-독소 융합 단백질은 하기 중 적어도 하나를 포함한다
·서열번호 2 또는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열
·서열번호 4(C2B8의 HC)에 제시된 바와 같은 2개의 아미노산 서열 및 서열번호 6(C2B8-FCS-그랜자임 B의 LC)에 제시된 바와 같은 2개의 아미노산 서열
·서열번호 7(C2B8-FCS-그랜자임 B의 HC)에 제시된 바와 같은 2개의 아미노산 서열 및 서열번호 5(C2B8의 LC)에 제시된 바와 같은 2개의 아미노산 서열
첫 번째 선택권에 관하여, 결합제-독소 융합 단백질은 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 서로 결합된, 상기 서열 중 2개를 포함할 수 있다.
두 번째 및 세 번째 선택권에 관하여, 결합제-독소 융합 단백질은 일련의 디설파이드 결합에 의해 하나에 접합된, 2개의 상기와 같은 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 적어도 상기 기재 중 어느 하나에 따른 융합 단백질, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (i) 상기 기재에 따른 융합 단백질, 또는 상기 기재에 따른 약학 조성물 및 (ii) 하나 이상의 치료학적으로 활성인 화합물을 포함하는 조합물을 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예에 따라, 상기 기재에 따른 결합제-독소 융합 단백질, 또는 상기 기재에 따른 조성물, 또는 상기 기재에 따른 조합물을
·신생물 질병(neoplastic disease)을 앓고 있고,
·신생물 질병의 발생 위험에 처해 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단되는
인간 또는 동물 대상체(subject)의 치료, 또는 상기와 같은 상태의 예방(이를 위한 약제의 제조)에 사용하기 위해 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라,
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병의 발생 위험에 처해 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단되는
인간 또는 동물 대상체의 치료, 또는 상기와 같은 상태의 예방을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 상기 기재에 따른 결합제-독소 융합 단백질, 또는 상기 기재에 따른 조성물, 또는 상기 기재에 따른 조합물의 투여를 포함한다.
이에 관하여, 식물에 의해 생산된 N-글리칸은 예를 들어 포유동물에서 생산된 것들과 현저하게 상이함을 강조하는 것이 중요하다. 특히, 담배에 의해 생산된 N-글리칸은
·α3 글리코사이드 링크(포유동물에서와 같은 α6 대신에)를 통해 근위 N-아세틸-글루코스아민 잔기에 접합된 푸코스 잔기
·β2 글리코사이드 링크를 통해 근위 만노스 잔기에 접합된 자일로스 잔기
·2개의 원위 N-아세틸-글루코스아민 잔기(이들은 각각 α3 글리코사이드 링크를 통해 푸코스 잔기, 및 β3 글리코사이드 링크(포유동물에서 뉴라민산 대신에)를 통해 갈락토스 잔기를 운반한다)
를 갖는다.
다른 한편으로, 예를 들어 조류에서 재조합적으로 발현된 단백질은 종종 어떠한 종류의 글리코실화도 없다. 조류는 그러나 IgG 모양 항체, 또는 하나 이상의 디설파이드 가교를 갖는 항체 단편을 발현할 수 있다.
따라서, 상기에 논의된 바와 같은 신규의 방법에 의해 생산된 결합제-독소 접합체는 또한 상이한 발현 시스템에서 생산된 결합제-독소 접합체에 비해 신규의 구조적 특징을 갖는다. 예를 들어 담배 식물에 의해 생산된 N-글리칸의 예시에 대해 도 7을 참조하시오.
실시예
본 발명을 도면 및 상기 설명에서 상세히 예시하고 기재하였지만, 상기와 같은 예시 및 기재는 제한이 아닌 예시 또는 본보기로 간주되어야 하며; 본 발명은 개시된 구현예들로 제한되지 않는다. 개시된 구현예에 대한 다른 변화는 도면, 개시내용 및 첨부된 청구항의 연구로부터, 청구된 발명을 실시함에 있어서 당업자에 의해 이해되고 수행될 수 있다. 청구항에서, "포함하는"이란 단어는 다른 요소나 단계를 제외하지 않으며, 부정관사 "하나의"는 복수를 제외하지 않는다. 단지 몇몇 척도가 서로 상이한 종속항에서 인용된다는 사실은 이들 척도의 조합물을 사용하는 것이 유리할 수 없음을 나타내는 것은 아니다. 청구항에서 임의의 참조 표시는 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서부터 C-말단으로 나타내며; 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'->3'으로 나타낸다.
물질 및 방법
유전학적 작제물
완전길이 리툭시맙 HC 및 LC 서열을 사용하여 mAb 기반 결합제-독소 융합 단백질을 개발하였다. 리툭시맙 서열의 중쇄 및 경쇄의 가변 부분 서열을 단쇄 scFv로 조립하고 인간 IgG1 Fc 부분 서열에 융합시켰다. 이어서 인간 퓨린 절단 서열을 사용하여 인간 그랜자임 B 서열을 완전길이 리툭시맙의 LC 또는 HC의 C-말단 부분에서 또는 scFv-Fc의 C-말단 부분에 융합시켜 HC+LC-FCS-그랜자임 B, HC-FCS-그랜자임 B+LC 및 scFv-c-FCS-그랜자임 B 융합 단백질 서열을 수득하였다. 또 다른 결합제-독소 융합 단백질은 절단 부위 없이 그랜자임 B에 연결된 scFv-Fc 부분으로 실현되어 scFv-Fc-그랜자임 B를 수득하였다. 이들 서열은 XbaI 및 IsceI와 측면인접한 유전자 합성에 의해 생산되었다.
pPZP200 2원 플라스미드의 주쇄를 사용하여 연속적으로 nptII 카나마이신 내성 카세트, 하나(scFv-Fc 포맷) 또는 2개(mAb 포맷)의 관심 유전자 발현 카세트(들) 및 GFP 발현 카세트를 함유하는 새로운 2원 플라스미드 pPZP-ATB를 구성하였다. 리툭시맙 HC 및 LC, LC-FCS-GB, HC-FCS-GB, scFv-Fc-FCS-GB, scFv-Fc-GB를 암호화하는 ORF를 XbaI 및 IsceI를 사용하여 콜리플라워 모자이크 바이러스 p35S 프로모터(p35S)와 아그로박테리움 노팔린 신타제 종결자(tNOS) 사이에서 적합한 2원 플라스미드내에 도입시켰다. 관심 유전자와 GFP 카세트 사이에 토마토 덤불 위축 바이러스 p19 유전자 발현 카세트를 포함하는 pPZP-ATB 2원 플라스미드의 한 버전을 또한 생산시켰다.
니코티아나 벤타미아나 식물 잎에서 일시적인 발현
16h 명/8h 암 광주기, 22 +/- 3℃, 7-8주된 식물 잎에서 증식된 니코티아나 벤타미아나를 주사기 침투에 의해 일시적으로 형질전환시켰다. 대략 0.8 내지 1.0의 600 ㎚ 광학 밀도(OD600)에 달하는 pPZP-ATB-scFv-Fc-F-GB 또는 pPZP-ATB-scFv-Fc-F-GB-p19 2원 플라스미드를 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(pBBR1MCS-5.virGN54D) 또는 GV3101(pMP90RK)를 3500 g에서 10분간 원심분리에 의해 수집하였다. 최종적으로, 세균을 침투 완충제(10 mM MgCl2, 10 mM MES, 100 μM 아세토시린곤, pH 5.6) 중에서 0.5의 OD600으로 조절하고, 혼합물을 무바늘 주사기로 침투시켰다. 침투된 영역을 아그로침투 후 4 및 6일째에 수확하였다. 아그로침투 후 4일째에 수확된 전체 잎을 단백질 A 정제에 사용하였다.
엔 타바쿰 세포에서의 발현
니코티아나 타바쿰 식물 현탁 세포를 문헌[Nagata et al. (1992)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이 식물 배양 배지에서 130 rpm, 25℃에서 5일간 증식시켰다. 대략 0.8 내지 1.0의 600 ㎚ 광학 밀도(OD600)에 달하는 pPZP-ATB 2원 플라스미드를 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(pBBR1MCS-5.virGN54D)를 2000 g에서 5분간 원심분리에 의해 수집하였다. 이어서 식물 세포 및 세균 세포를 30분간 공배양 배지에서 공배양한 후에 200 g에서 5분 원심분리시켰다. 상등액 제거 후에, 세포를 2일간 고체 공배양 배지상에 도말하였다. 이어서, 세포를 일시적인 형질전환의 경우에, 추가 분석을 위해 수확 전에 수집하고 3회 세척하고 세포탁심 및 칼베니클린을 함유하는 식물 배양 배지에서 배양한 후에 추가 분석을 위해 수확하였다. 안정한 형질전환의 경우에, 2일의 고체 공배양 후에, 세포를 세척하고 선택적인 카나마이신 및 세포탁심 및 칼베니클린 항생제를 함유하는 식물 배지상에 도말하였다. 후속 분석을 위해 4주 후에 캘러스를 선택하고 고체 배지 또는 액체 현탁 배양물에서 계대배양하였다.
단백질 분석: ELISA, SDS-PAGE 및 웨스턴블럿
수집된 잎 조직(120 ㎎)을 400 ㎕ 추출 완충제(2 ㎍/㎖의 각각의 프로테아제 억제제: 류펩틴, 아프로티닌, 안티페인, 펩스타틴 A, 키모스타틴이 보충된, 250 mM 솔비톨, 60 mM 트리스, Na2EDTA, 0.6% Polyclar AT, 1 mM PMSF, pH 8.0)에서 분쇄하였다. 균질화된 조직을 4℃에서 40분간 18200g에서 원심분리시켰다. 이어서 상등액을 회수하고, 액체 질소에서 동결시키고 -20℃에서 보관하였다.
추출된 조직을 웨스턴블럿팅에 의해 분석하였다. 단백질을 환원 또는 비-환원 SDS 로딩 완충제(1 mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일: 2 ㎍/㎖의 각각의 류펩틴, 아프로티닌, 안티페인, 키모스타틴 및 펩스타틴이 보충된, 80 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루)에서 5분간 비등시키고, 13000 rpm에서 5분간 원심분리시키고 SDS-PAGE(4-20% 폴리아크릴아미드)에 의해 분리시켰다. 웨스턴 블럿팅을 위해서, 단백질을 반-건조 전기영동 장치(Biorad Trans-Blot Turbo)를 사용하여 PVDF 멤브레인(Biorad)상에 전기전달하고; 이어서 상기 멤브레인을 TBST 완충제(50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% 트윈 20, pH 7.5) 중의 3%(w/v) 무지방 분유로 실온에서 1h 동안 차단하고 이어서 1:10.000의 희석비로 항-인간 IgG Fc 특이성 영역(A0170; Sigma-Aldrich), 또는 1:10.000의 희석비로 인간 그랜자임 B 1차 항체(EPR20129-217; Abcam)에 대한 HRP-접합된 항체와 실온에서 1h 동안 배양하였다(TBS-트윈 0.1% + 0.5% 무지방 분유). 이어서 상기 항-그랜자임 B 항체를 1:10 000의 희석비로 HRP-접합된 항-토끼 항체(0545; Sigma)와 배양하였다. 단백질을 증대된 화학발광(Amersham Imager 600/GE; GE Healthcare)에 의해 검출하였다.
항 CD20 ELISA
항-CD20 접합체 특이성 분석을 위해서, 식물 추출물을, 100 ㎕의 5 ㎍/㎖ CD20(AcroBiosystems)으로 37℃에서 2h 동안 코팅되고 이어서 세척 완충제(TBS 트윈 0,1%)로 5회 세척된 96 웰 미세플레이트(Greiner)에 의해 분석하였다. 이어서 TBS pH 8.0 중의 1% BSA 200 ㎕로 RT에서 30분간 차단을 수행하고, 이어서 5회 세척하였다. 100 ㎕의 항-CD20 대조용 항체를 로딩하여 5 내지 0 ㎍/㎖의 교정 곡선을 실현시키고 100 ㎕ 샘플을 비교를 위해 RT에서 2h 동안 동일한 96 웰 플레이트상에 로딩하고 이어서 5회 세척하였다. 100 ㎕의 1/150.000 희석된 검출 항체(염소 항-인간 HRPO, Bethyl)를 로딩하고 RT에서 1h 배양하였다. 이어서 100 ㎕ TMB 반응 완충제(Zentech)로 30분간 발현(revelation)을 수행하고 최종적으로 1M H3PO4로 정지시켰다. 이어서 효소 활성을 450 ㎚에서 분광분석에 의해 분석하였다.
추가적인 ELISA
개시되지 않은 항원(인간 세포의 표면상에서 발현되고, 일부 암에서 과발현된 구조, 본원에서 항원 X라 칭한다)에 특이적인 접합체의 특이성 분석을 위해서, X에 대한 결합제를 포함하는 정제된 결합제-독소 융합 단백질을 96 웰 미세플레이트(Greiner)에 의해 분석하였다. 웰을 50 ㎕의 항원 X(2,5 ㎍/㎖)로 37℃에서 1h 동안 코팅하고 이어서 250 ㎕의 세척 완충제(PBS 트윈 0.1%)로 5회 세척하였다. 이어서 RT에서 30분간 PBST 중의 하이드로카제인(3.6%) 150 ㎕로 차단을 수행하고 이어서 5회 세척하였다. 50 ㎕의 항 항원 대조용 항체를 로딩하여 5 내지 0 ㎍/㎖의 교정 곡선을 실현시키고 50 ㎕의 샘플을 비교를 위해 동일한 96 웰 플레이트상에 RT에서 1h 동안 로딩하고 이어서 5회 세척하였다. 50 ㎕의 1/200.000 희석된 검출 항체(염소 항-인간 HRPO, Bethyl)를 로딩하고 RT에서 1h 동안 배양하였다. 이어서 50 ㎕ TMB 반응 완충제(Zentech)로 15분간 발현을 수행하고 최종적으로 1M H3PO4로 정지시켰다. 이어서 효소 활성을 450 ㎚에서 분광분석에 의해 분석하였다. 결과를 도 4b에 나타낸다.
단백질 A 정제
아그로침투 후 4일째에, 잎을 수집하고, 칭량하고, 신선한 아그로침투된 잎 그램당 2 ㎖의 추출 완충제(2 ㎍/㎖의 각각의 프로테아제 억제제: 류펩틴, 아프로티닌, 안티페인, 펩스타틴 A, 키모스타틴이 보충된, 250 mM 솔비톨, 60 mM 트리스, Na2EDTA, 0.6% Polyclar AT, 1 mM PMSF, pH 8.0)를 사용하여 블렌더에서 분쇄하였다. 이어서 혼합물을 이중 Miracloth(Millipore) 층을 통해 여과하였다. 이어서 여액을 4℃에서 30분간 20.000 g에서 원심분리하였다. 이어서 상등액을 추출 완충제로 예비평형화시킨 단백질 A 수지상에 로딩하였다. 이어서 수지를 10 컬럼 부피의 60 mM 트리스 pH 8.0으로 세척하고 10% 트리스 1M pH 8.0으로 직접 완충된 100 mM 글리신 pH 3.0을 사용하여 용출을 수행하였다. 이어서 농축된 단백질 분획을 수집하고 액체 질소에서 동결시켰다.
시험관내 세포독성 분석
표적 세포 Raji(CD20+) 및 비-표적 세포 Loucy(CD20)에 대한 항-CD20 항체 리툭시맙 및 리툭시맙 기반 접합체 효과를 시험관내 세포독성 분석(MTT)에 의해 평가한다. 간단히, Raji 및 Loucy 세포주를 배양하고 무 FBS 배양 배지에 1.105 세포/50 ㎕의 밀도로 재현탁시키고 50 ㎕의 상기 세포 현탁액을 96-웰 편평바닥 플레이트로 보냈다. 이어서, 리툭시맙 및 상기를 포함하는 접합체를 37℃, 5% CO2에서 6, 24 및 48h 동안 다양한 농도로 상기 세포와 배양한다. 각각의 시점에 대해서, 세포독성을 MTT 키트 분석(Roche)을 사용하여 평가한다. 세포 생육력을 550 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 계산한다. 3회 중복 분석에 대해 생육력 평균을 계산하였다.
추가적인 시험관내 세포독성 분석
개시되지 않은 항원 X에 대한 결합제를 포함하는 정제된 결합제-독소 융합 단백질의 효과를 세포주의 생육력에 대해 분석하고 세포 증식 시약 WST-1(Merck, 5015944001)을 사용하여 평가하였다. WST-1(4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설포네이트)은 미토콘드리아 데하이드로게나제에 대한 기질이며 포르마잔(formazan)으로 절단된다. 형성된 포르마잔 염료의 양은 배양물 중 대사적으로 활성인 세포의 수에 직접적으로 상관된다.
세포를 96 웰 미세적정 플레이트에 50 ㎖의 생육 배지 중의 30.000 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 결합제-독소 융합 단백질, 또는 완충제의 희석물을, 40 ㎖의 생육 배지에 10 ㎖의 결합제-독소 융합 단백질, 또는 완충제를 가하여 제조하고, 상기 혼합물을 상기 세포로 배양하였다. 결합제-독소 융합 단백질을 중복 시험하였다. 완충제 및 양성 대조군(2% 트리톤 및 5% DMSO)을 3회 중복 시험하였다.
37℃에서 5% CO2와 함께 72h 배양 후에, 10 ㎖의 세포 증식 시약 WST-1(Merck, 5015944001)을 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 추가로 4시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 상기 플레이트의 OD를 배경 공제를 위해 450 ㎚ 및 690 ㎚에서 판독하여 포르마잔 염료를 정량분석하였다.
처리되지 않은 세포 및 결합제-독소 융합 단백질 및 양성 대조군으로 처리된 세포의 생육력%를 측정하기 위해서, 완충제로 처리된 웰의 평균 OD 값을 계산하고(OD450㎚ - OD690㎚) 100% 생육력으로 설정하였다. 결과를 도 4a에 나타낸다.
펩티드 당쇄 분석
본 발명에 따른 방법으로 제조된 결합제-독소 융합 단백질이 예를 들어 포유동물과 같은 다른 발현 시스템에서 제조된 결합제-독소 융합 단백질과 구조적으로 상이한 것을 입증하기 위해서, 상이한 니코티아나 벤타미아나 균주로 제조된 펩티드 EEQY NST YR 및 NFS NDIMLLQLER(둘 다 본원에서 서열번호 15 및 16으로서 개시된 굵게-표시된 N-글리코실화 부위를 포함하고 본원에 개시된 결합제-독소 융합 단백질 중 일부에 포함된다)의 당쇄를 분석하였다. ATB_3 및 ATB_4는 야생형이고, ATB_22 및 ATB_24는 내인성 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(XylT 또는 T) 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라제(FucT 또는 FT) 유전자에 대해 RNAi에 의해 녹-다운되었다(방법에 대해서 문헌[Strasser et al (2008)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)을 참조하시오).
Figure 112021098159357-pct00006
간단히, 샘플을 용액 중에서 절단하였다. 단백질을 요오도아세트아미드로 S-알킬화하고 트립신(Promega)으로 절단하였다.
절단된 샘플을 수성 용매로서 80 mM 암모늄 포르미에이트 완충제를 사용하여 BioBasic C18 컬럼(BioBasic-18, 150 x 0.32 ㎜, 5 ㎛, Thermo Scientific)상에 로딩하였다. 6 ㎕/분의 유량으로, 45분간 5% B(B: 80% ACCN)에서 40% B로의 구배를 적용한 다음, 40% B에서 90% B로의 15분 구배를 적용하여 큰 펩티드의 용출을 촉진하였다. 검출을 양이온, DDA 모드(= 용출 피크에 대해 MSMS 모드로 스위칭)의 표준 ESI 소스가 장착된 QTOF MS(Bruker maXis 4G)로 수행하였다. MS-스캔을 기록하고(범위: 150-2200 Da) 3개의 최고 피크를 단편화를 위해 선택하였다. ESI 교정 혼합물(Agilent)을 사용하여 장비 교정을 수행하였다. 3개의 가능한 당펩티드가 펩티드 부분, 및 HexNAc 단위, 헥소스, 데옥시헥소스 및 펜토스 잔기의 수가 변하는 부착된 N-글리칸으로 이루어지는 피크 세트로서 식별되었다. 이들 당펩티드의 이론적인 질량을 아미노산 및 모노사카라이드에 대한 단일동위원소 질량을 사용하여 스프레드 시트로 측정하였다.
DataAnalysis 4.0(Bruker)을 사용하여 수동 당펩티드 연구를 수행하였다. 상이한 당쇄의 정량분석을 위한 처음 4개의 동위원소 피크의 EIC(추출된 이온 크로마토그램)의 피크 면적
절단 분석
독소의 방출을 허용하는 절단가능한 특성은 정제된 scFv-Fc-FCS-GB(결합제-독소 융합 단백질)상에 재조합 퓨린의 첨가 후 시험관내에서 입증되었다. 25 단위/㎖ 퓨린(NEB P8077S) 내지 6 마이크로그램의 결합제-독소 융합 단백질을 35 ㎕의 절단 완충제(20 mM Hepes, 트리톤 X-100 0,1%, 1 mM CaCl2, pH 7.5)에 첨가한 다음 25도에서 밤새 반응을 수행하였다. 절단을 SDS Page 쿠마씨 블루 젤(4-20% 폴리아크릴아미드)에 의해 시각화하였다. 마우스로부터의 증식-유도 리간드(APRIL)를 퓨린 절단의 대조군으로서 사용하였다. APRIL(SRP3189 - Sigma-Aldrich, 20 ㎍ 동결건조 단백질)을 0.1% BSA를 함유하는 20 ㎕의 수에 재현탁하였다.
결과
본 연구에서, 우리는 절단가능한 링커에 의해 독소에 융합된 결합 부분으로 구성된 다수의 재조합 결합제-독소 융합 단백질을 설계하였고 이를 식물 세포 또는 전체 식물에서 성공적으로 발현시켰다. 리툭시맙(C2B8) 기반 완전길이 mAb, scFv-Fc 포맷 및 scFv 포맷을 결합 부분으로서 사용하였다. 리툭시맙 및 이의 서열은 문헌[Storz (2014)]에 기재되어 있다. 아미노산 서열 HRRRKRSLDTS를 갖는 퓨린 절단 서열(FCS)을 절단가능한 링커로서 사용하였다. 절단 서열 없이 고유의 그랜자임 B에 재조합적으로 연결된 scFv-Fc로 구성된 또 다른 결합제-독소 융합 단백질을 또한 재조합 절단가능하지 않은 링커의 예로서 사용하였다. 인간 그랜자임 B를 페이로드 예로서 사용하였다. 페이로드 위치는 결합 부분에 따라 변할 수 있으며, 본 연구에서 우리는 완전길이 mAb 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 그랜자임 B의 융합을 예시하였다.
scFv-Fc 포맷에 기반한 다수의 재조합 결합제-독소 융합 단백질을 구성하였고: scFv-Fc-FCS-그랜자임 B, scFv-Fc-그랜자임 B, scFv-Fc 단독을 또한 대조군으로서 구성하였다. 완전길이 mAb에 기반한 2개의 결합제-독소 융합 단백질을 구성하였다: HC+LC-FCS-그랜자임 B, HC-FCS-그랜자임 B+LC. 접합되지 않은 mAb를 단독으로 대조군으로서 또한 구성하였다.
하기의 표는 본원에서 생산된 접합체들을 요약한다:
Figure 112021098159357-pct00007
각각의 DNA 작제물의 DNA 서열을 식물 코돈 최적화하고 콜리플라워 모자이크 바이러스 p35S 프로모터(p35S)와 아그로박테리움 노팔린 신타제 종결자(tNOS) 사이에서 pPZP-ATB 아그로박테리움 2원 형질전환 벡터에 도입시켰다. 담배 식물에서 코돈 최적화를 위한 접근법은 문헌[Rouwendal et al. (1997)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
동일 작제물을 또한 침묵 억제인자 유전자 p19에 대한 보충 발현 카세트를 운반하는 pPZP-ATP-p19에 도입시켰다. 본 실시예에서, 추가적인 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 카나마이신 내성 카세트를 안정한 클론 선택을 위해 삽입하였다. 모든 작제물을 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 또는 GV3101내로 일렉트로포레이션하였다.
전체 식물 발현 시스템
아그로박테리움 균주를 사용하여 먼저, scFv-Fc-F-그랜자임 B 접합체를 암호화하는 작제물로 주사기 아그로침투에 의해 니코티아나 벤타미아나를 일시적으로 형질전환시켰다. 이어서 아그로침투된 식물 조직 추출물을 아그로침투 후 4 및 6일(dpa) 후에 항-인간 IgG Fc 부분 항체(도 1)를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. 융합 단백질 발현에 대한 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 또는 아그로박테리움 GV3101 균주의 사용뿐만 아니라, 수확일 및 p19 공-발현의 영향을 평가하였다. 융합 단백질이 발현되며 이는 주로 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 사용하여 발현시 아그로침투 후 4일 후에 온전하게 보인다(도 1, 레인 1&2). 보다 많은 분해 산물이 아그로침투 후 6일 후에 또는 GV3101 균주 사용시 나타나는 것으로 보인다. 유전자 침묵의 p19 억제인자의 첨가는, 오직 p19의 존재하에서만 발현을 보이는 GV3101 균주에 비해(도 1, 레인 6&8) LBA4404(도 1, 레인 2&4)에 의해 수행시 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 수확 시간에 관하여, 아그로침투 후 6일 후에 보다 많은 분해 단편이 보인다(도 1, 레인 3,4&8).
scFv-Fc-FCS-그랜자임 B 융합 단백질은 80 kDa의 2개의 단량체 형태로 구성되어 대략 160 kDa의 완전한 이량체 형태를 생산시킨다. 각각의 단량체 성분은 도 1에서 사용된 바와 같이(좌측 패널), 환원(+DTT) 및 비-환원(-DTT) 조건하에서 인간 IgG Fc 부분(도 2, 좌측) 또는 인간 그랜자임 B(도 2, 우측)에 대한 특정한 검출 mAb를 사용하여, 아그로박테테리움 투메파시엔스 LBA4404 감염 후에 단백질 추출물상에서 웨스턴 블럿팅에 의해 식별되었다. 완전 크기 scFv-Fc-FCS-그랜자임 B(도 2)의 검출은 항 IgG Fc 부분(좌측 패널, -DTT)을 사용하는 약 250 kDa 신호의 검출에 의해서 및 항-그랜자임 B 항체(우측 패널, -DTT)를 사용하는 동일한 크기의 신호의 검출에 의해서 확인된다. 대략 150 kDa의 인간 혈청 IgG는 또한 대략 250 kDa의 신호를 생산시킴에 주목한다. 환원 조건하에서, 단량체 형태가 또한 80 kDa의 단량체 예상 크기에 가까운 70 내지 100 kDa의 신호(좌측 및 우측 패널에서 Δ에 의해 표시됨)를 갖는 항 IgG Fc 항체 및 항-그랜자임 B 항체 모두에 의해 검출된다.
결합제-독소 융합 단백질의 다른 포맷은 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404를 사용하여 니코티아나 벤타미아나에서 일시적으로 발현되었으며, 식물 잎 추출물을 도 3에 나타낸다. scFv-Fc-FCS-그랜자임 B, scFv-Fc-그랜자임 B가 예상된 크기로 검출된다. 더욱이, 전체 mAb 기반 결합제-독소 융합 단백질 HC-FCS-그랜자임 B + LC가 또한 예상된 크기로 검출된다.
식물 세포 발현 시스템
아그로박테리움 균주를 또한 사용하여 니코티아나 타바쿰 cv. 브라이트 옐로우 2 세포(BY-2 세포)를 일시적으로 형질전환시켰다. 상이한 결합제-독소 융합 단백질이 니코티아나 타바쿰 cv. BY-2에서 일시적으로 발현되었다. 이어서 세포내 추출물을 항 Fc-인간 IgG를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다.
scFv-Fc-FCS-그자임 B 정체의 발현은 도 5에서 확인되었으며, 이량체성 완전 크기 융합 단백질이 항-인간 IgG Fc 부분 및 항-그랜자임 B 항체에 의해 대략 250 kDa의 크기로 검출된다.
이들 결합제-독소 융합 단백질을 또한 식물 현탁 세포에서 안정하게 발현시킬 수 있다. 일례로서, 우리는 아그로박테리움 균주와의 공배양에 의해 니코티아나 타바쿰 cv. BY-2 식물 세포 안정성 형질전환을 수행하였다. 이 경우에, 카나마이신 내성 카세트를 사용하여 안정한 식물 세포 클론을 선택하였다. 도 6은 안정한 식물 현탁 세포에서 scFv-FCS-그랜자임 B 결합제-독소 융합 단백질의 존재를 통합 예상 크기로 도시하며, 이는 이러한 종류의 분자가 식물 세포 시스템에서 안정하게 발현될 수 있음을 가리킨다.
scFv-Fc, 퓨린 절단 부위 및 독소 패밀리 2 중의 독소로 구성된 신규의 결합제-독소 융합 단백질(scFv-Fc-FCS-TOX2)이 또한 식물 세포(도 8, 좌측 패널) 및 전체 식물(도 8, 우측 패널)에서 성공적으로 발현되었다. TOX2는 본원에 개시된 바와 같은 부류 2로부터의 독소(단백질 합성 억제)이다. 완전 크기 결합제-독소 융합 단백질이 이미 상기에 나타낸 scFv-Fc-FCS-그랜자임 B와 유사한 예상 크기로 검출된다.
종합하면, 이들 데이터는 인간 절단가능한 서열을 통해 세포독성 단백질 페이로드에 연결된 단백질 결합제로 구성된 결합제-독소 융합 단백질이 전체 식물 또는 식물세포 시스템에서 생산가능함을 입증한다.
식물 세포에서 생산된 scFv-Fc-GB 접합체의 결합 기능을, 리툭시맙의 친화성에 필적하는 친화성을 갖는 항 CD20 Elisa에 의해 평가하였다(데이터 도시 안 됨). 시험관내 세포독성 분석을 또한 CD20+ 세포(Raji 세포)상에서 수행하였다. 리툭시맙과 비교하여 유사하거나 개선된 세포독성이 기다려진다. 이러한 결과는 scFv-Fc-GB의 Fc 부분이 기능성이며 표적세포에 대해 생물학적 세포독성을 나타냄을 제시한다.
펩티드 당쇄 분석
도 10에서, 당부위(EEQY NST YR 및 NFS NDIMLLQLER)의 MS 스펙트럼을 도시한다(본원에 개시된 결합제 독소 융합 펩티드 중 일부에 포함된, 서열번호 15 및 16).
식별된 주요 당쇄는 복잡한 유형의 글리칸(GnGn/GnGnXF)이었다. 다른 당쇄(Man5-Man9, GnGnF, GnGnX, MMXF, Man5Gn 및 GnM(X)(F))가 또한 검출되었다. 표 1은 구조 및 이의 상대적인 비율을 나열한다. 모든 샘플은 글리코실화되지 않은 펩티드를 함유하였다.
MS 스펙트럼에서 피크 높이는 당쇄의 몰비를 대략적으로 반영한다(당쇄당 하나 초과의 하전 상태를 나타냄에 유의한다). 오류! 참조 소스를 찾을 수 없음 및 표 2에서, 상이한 당쇄의 정량분석을 나타낸다(처음 4개의 동위원소 피크의 EIC의 적분에 의해 정량분석됨). 상이한 당쇄의 약어에 대한 설명에 대해서 문헌[Strasser et al (2008)](상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
Figure 112021098159357-pct00008
EEQY NST YR에 대한 당쇄의 비율%
Figure 112021098159357-pct00009
NFS NDIMLLQLER에 대한 당쇄의 비율%
하나의 가능한 이성질체를 제공하며 사용된 방법은 단지 글리칸의 조성만을 제공함에 유의하시오. 글리칸 명칭에 대해서, 프로글리칸 명명법이 사용되었다(http://www.proglycan.com/protein-glycosylation-analysis/nomenclature). 또한 문헌["What's your name, sugar ? - A imple abbreviation system for complex N-glycan structures"]을 참조하시오.
상기 명명법에 따라, MGnX는 예를 들어 하기를 의미한다
Figure 112021098159357-pct00010
참고문헌
Figure 112021098159357-pct00011
Figure 112021098159357-pct00012
Figure 112021098159357-pct00013
Figure 112021098159357-pct00014
Figure 112021098159357-pct00015
본원에 사용된 바와 같은 약어
HC = 항체 중쇄
LC = 항체 경쇄
TOX = 독소
CS = 절단 부위
FCS = 퓨린 절단 부위
LINK = 링커/절단 부위
LINK2: 부류 2의 링커(=시토졸 절단 부위)
LINK3: 부류 3의 링커(=세포 표면 절단 부위)
GB = 그랜자임 B
TOX2: 부류 2의 독소(=단백질 합성 억제)
TOX3: 부류 3의 독소(=막 동요 단백질)
scFv: 단쇄 포맷
scFv-FC: scFv-FC-포맷
서열
하기의 서열은 본원의 개시내용의 일부를 형성한다. WIPO ST 25 호환성 전자 서열 목록도 또한 본원과 함께 제공된다. 의심을 피하기 위해서, 하기 표와 전자 서열 목록의 서열들간에 불일치가 존재하는 경우, 이 표의 서열이 정확한 것으로 생각될 것이다.
Figure 112021098159357-pct00016
Figure 112021098159357-pct00017
SEQUENCE LISTING <110> ATB Therapeutics <120> Method of producing a binder-toxin fusion protein in a plant cell or a whole plant <130> AD41XX <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 474 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 1 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln 145 150 155 160 Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn 165 170 175 Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 180 185 190 Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr 195 200 205 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly 210 215 220 Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 370 375 380 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 2 <211> 716 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 2 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln 145 150 155 160 Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn 165 170 175 Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 180 185 190 Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr 195 200 205 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly 210 215 220 Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 370 375 380 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg His Arg Arg His Arg 465 470 475 480 Arg Arg Lys Arg Ser Leu Asp Thr Ser Ile Ile Gly Gly His Glu Ala 485 490 495 Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln 500 505 510 Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val 515 520 525 Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly 530 535 540 Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val 545 550 555 560 Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn 565 570 575 Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala 580 585 590 Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly 595 600 605 Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys 610 615 620 His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg 625 630 635 640 Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu 645 650 655 Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser 660 665 670 Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr 675 680 685 Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser 690 695 700 Phe Val His Trp Ile 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Gly Gln Thr Ala Pro 595 600 605 Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln 610 615 620 Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr 625 630 635 640 Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys 645 650 655 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile 660 665 670 Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys 675 680 685 Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met Lys Arg Tyr 690 695 700 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 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Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 6 <211> 455 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 6 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Leu Asp Thr Ser 210 215 220 Arg His Arg Arg Ile Ile 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Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile 435 440 445 Lys Lys Thr Met Lys Arg Tyr 450 455 <210> 7 <211> 693 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Leu Asp Thr Ser Arg His 450 455 460 Arg Arg Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr 465 470 475 480 Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly 485 490 495 Gly Phe Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp 500 505 510 Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln 515 520 525 Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro 530 535 540 Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu 545 550 555 560 Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro 565 570 575 Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly 580 585 590 Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu 595 600 605 Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg 610 615 620 His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile 625 630 635 640 Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn 645 650 655 Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro 660 665 670 Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys 675 680 685 Thr Met Lys Arg Tyr 690 <210> 8 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe 20 25 30 Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser 35 40 45 Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro 50 55 60 Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg 85 90 95 Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly 115 120 125 Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys 130 135 140 Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr 145 150 155 160 Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys 165 170 175 Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val 180 185 190 Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg 195 200 205 Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met 210 215 220 Lys Arg Tyr 225 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 9 Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 10 Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 11 Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 12 Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 13 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 14 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 15 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 16 Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 710 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 17 Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe 20 25 30 Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser 35 40 45 Ser Ile Asn Val Ala Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro 50 55 60 Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Lys Asn Phe Ala Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg 85 90 95 Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly 115 120 125 Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys 130 135 140 Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr 145 150 155 160 Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys 165 170 175 Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val 180 185 190 Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg 195 200 205 Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met 210 215 220 Lys Arg Tyr His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Leu Asp Thr Ser Asp Lys 225 230 235 240 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 465 470 475 480 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 485 490 495 Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 500 505 510 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 515 520 525 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 530 535 540 Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser 545 550 555 560 Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly 565 570 575 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln 580 585 590 Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 595 600 605 Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 610 615 620 Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile 625 630 635 640 Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys 645 650 655 Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu 660 665 670 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 675 680 685 Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr 690 695 700 Thr Val Thr Val Ser Ala 705 710 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 18 His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Leu Asp Thr Ser 1 5 10

Claims (19)

  1. 적어도
    a) ·항체
    ·표적 결합 능력(target binding capacity)을 유지하는 항체 단편, 또는
    ·항체 모방물질(antibody mimetic)
    로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나의 단백질 결합제,
    b1) 절단가능한 펩티드 링커(linker) 및 단백질 독소, 또는
    b2) 절단가능한 도메인을 포함하는 단백질 프로톡신(protoxin)
    을 포함하는 결합제-독소 융합 단백질의 생산 방법으로서,
    상기 방법이:
    (i) 식물 세포 또는 식물 숙주 전체를, 작동가능한 연결(operational linkage)로 적어도
    A) 단백질 결합제, 또는 이의 표적 결합 쇄(target binding chain) 또는 도메인을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및
    B1) 절단가능한 펩티드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및, 단백질 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는
    B2) 활성화를 위한 절단가능한 도메인을 포함하는 단백질 프로톡신을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나
    를 포함하는 핵산 작제물(construct)과 접촉시키는 단계,
    (ii) 핵산 작제물이 식물 세포, 또는 식물 전체의 하나 이상의 세포의 핵 내로 통합되도록 하는 단계, 및
    (iii) 핵산 작제물에 의해 암호화된 융합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하고,
    여기서 펩티드 링커 또는 프로톡신 내의 절단가능한 도메인이 식물 세포에 의해 발현된 효소, 또는 식물 숙주에 의해 생산된 효소에 의해 절단가능하지 않는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, (iv) 단계 (iii)에서 발현된 융합 단백질을 회수 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 식물 또는 식물 세포가 니코티아나(Nicotiana) 속(genus)에 속하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 펩티드 링커 또는 프로톡신 내의 절단가능한 도메인이 포유동물 세포에 의해 발현된 효소, 또는 포유동물 숙주에 의해 생산되는 효소에 의해 특이적으로 또는 비-특이적으로 절단가능한 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 절단가능한 링커 또는 프로톡신 내의 절단가능한 도메인이
    a) 엔도솜 및/또는 리소솜 프로테아제 절단 부위,
    b) 시토졸 프로테아제(cytosolic protease) 절단 부위, 및/또는
    c) 세포 표면 프로테아제 절단 부위
    로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 단백질 독소 또는 프로톡신이 효소인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단백질 독소가
    (1) 세포사(cell death) 유도 단백질,
    (2) 단백질 합성 억제제,
    (3) 막 동요 단백질(Membrane perturbating protein), 및
    (4) 세포분열 억제 단백질
    중에서 선택된 그룹 중 적어도 하나인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 단백질 독소가 포유동물 독소이거나, 또는 그랜자임(Granzyme)의 그룹으로부터 선택되거나, 또는 그랜자임 B, 또는 상기 단백질 독소의 독성 활성을 유지하는 이의 단편인, 방법.
  9. 삭제
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