CN114605556B - 一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用，属于植物修复技术领域。本发明提供的融合蛋白包括一个细菌脂多糖结合结构域和一个葡聚糖结合结构域。所述融合蛋白能与植物根系表面葡聚糖紧密结合，并吸附具有脂多糖的功能细菌，通过加强功能微生物与植物根的物理接触，在植物修复过程中增强植物根系对功能细菌的募集能力，提高对重金属、多环芳烃等污染物的植物修复能力，进一步促进植物生长。

Description

一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物修复技术领域，具体涉及一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
以重金属、多环芳烃、有机磷农药、微塑料、多溴联苯醚等为代表的环境污染问题，已经给全球生态环境和人类健康带来了巨大威胁。如何有效降低污染水体及土壤中上述污染物的含量，是全球面临的重大挑战。植物修复是一种广泛应用的环境污染生物治理策略，具有绿色环保、成本低廉、二次污染程度低等优势，目前已经成功应用于水体及土壤中重金属、多环芳烃、有机磷农药等污染物的生物治理过程。然而，植物修复通常存在污染物去除效率及植物抗逆性能低下的不足。因此，亟待开发出高效、经济、可行的技术，以提高植物的污染物治理及抗逆能力。
功能微生物是环境污染生物治理的主要参与者，尤其是在水体及土壤有机污染物(如持久性有机污染物、微塑料)的降解、重金属钝化与转移等过程中，功能微生物扮演着极为重要的角色。将功能微生物与修复植物进行合理组合，构建植物-功能微生物共生体系，有望极大提高植物修复的效率与抗逆能力。尽管目前有研究报道将植物与功能微生物进行联用，以提高植物修复效果，但提高效率仍然偏低，难以满足大规模环境污染治理的需要。究其原因，主要是由于植物对功能微生物的募集能力较差，使得两者难以形成紧密相互作用的共生体系，因而难以高效协同治理环境污染物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用，通过增强植物根系与功能微生物之间物理相互作用，从而提高修复植物根系募集功能微生物的能力，促进植物-功能微生物共生体系的形成及其对污染物的去除。
本发明提供了一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白，包括一个细菌脂多糖结合结构域和一个葡聚糖结合结构域。
优选的，在细菌脂多糖结合结构域和葡聚糖结合结构域之间还插入一个标记蛋白。
优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)按照酿酒酵母密码子优化融合蛋白的编码序列，将优化后的编码序列克隆至真菌表达载体中，得到重组真菌表达载体；
2)将所述重组真菌表达载体转化至酿酒酵母中，得到重组酿酒酵母；
3)将所述重组酿酒酵母进行培养，破碎菌体细胞，分离纯化蛋白，得到融合蛋白。
优选的，步骤1)中所述优化后的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
优选的，步骤1)中所述真菌表达载体为pESC-URA；优化后的编码序列在真菌表达载体的克隆的位置为BamHⅠ和XhoⅠ之间。
本发明提供了所述融合蛋白或所述制备方法制备得到的融合蛋白在募集植物根系功能微生物中的应用。
优选的，所述功能微生物包括以下一种或几种：中国台湾贪铜菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌。
本发明提供了所述融合蛋白或所述制备方法制备得到的融合蛋白在促进植物生长或提高植物修复重金属或多环芳烃污染中的应用。
优选的，所述重金属包括以下一种或几种：镉、铜、铅和铬；所述多环芳烃以下一种或几种：菲、蒽、萘和苯并芘；所述植物包括水生植物和陆生植物。
本发明提供的增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白，包括一个细菌脂多糖结合结构域和一个葡聚糖结合结构域。所述融合蛋白能与植物根系表面葡聚糖紧密结合，并吸附具有脂多糖的功能细菌(如中国台湾贪铜菌和恶臭假单胞菌)，作为媒介通过加强功能微生物与植物根的物理接触，在植物修复过程中增强植物根系对功能细菌的募集能力，有效提高重金属、多环芳烃等污染物处理能力，提高植物对重金属、多环芳烃的耐受能力，进一步促进植物生长。实验结果表明，所述融合蛋白能够显著提高如浮萍、龙葵、籽粒苋等修复植物根系对功能微生物，如中国台湾贪铜菌、恶臭假单胞菌的募集能力，从而形成修复植物-功能微生物共生体，极大提高修复植物对重金属、多环芳烃等污染物的治理能力，使植株的重金属去除率达到96％以上，多环芳烃去除率达到80％以上。
附图说明
图1为本发明实施例中提供的融合蛋白LcGC及对照蛋白GC的性能检测，其中图1a为融合蛋白LcGC及对照蛋白GC在酵母细胞中的表达情况；图1b为融合蛋白LcGC及对照蛋白GC对葡聚糖的结合情况；图1c为融合蛋白LcGC及对照蛋白GC对脂多糖的结合情况；图1d为融合蛋白LcGC 及对照蛋白GC对磷壁酸的结合作用；
图2为本发明实施例中提供的融合蛋白LcGC对浮萍根系微生物多样性及各微生物类群相对丰度的影响，其中(a)根系微生物组Simpson指数；(b) 根系微生物组Shannon指数；(c)根系微生物组中贪铜菌属相对丰度；(d) 根系微生物组非贪铜菌属微生物类群的相对丰度。
具体实施方式
本发明提供了一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白，包括一个细菌脂多糖结合结构域和一个葡聚糖结合结构域。
在本发明中，所述细菌脂多糖结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述葡聚糖结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。所述细菌脂多糖结合结构域的作用为结合细菌脂多糖。所述葡聚糖结合结构域的作用为结合植物根系表面葡聚糖，从而实现加强功能微生物与植物根的物理接触，使功能微生物发挥修复和促生作用。
在本发明中，在细菌脂多糖结合结构域和葡聚糖结合结构域之间优选还插入一个标记蛋白。所述标记蛋白包括荧光蛋白或藻红蛋白。所述荧光蛋白包括红色荧光蛋白mCherry或绿色荧光蛋白GFP。在本发明实施例中，以绿色荧光蛋白GFP作为标记蛋白结构域代表，说明融合蛋白的生物学功能。所述标记蛋白起蛋白标识作用，不影响结合葡聚糖性能。所述融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)按照酿酒酵母密码子优化融合蛋白的编码序列，将优化后的编码序列克隆至真菌表达载体中，得到重组真菌表达载体；
2)将所述重组真菌表达载体转化至酿酒酵母中，得到重组酿酒酵母；
3)将所述重组酿酒酵母进行培养，破碎菌体细胞，分离纯化蛋白，得到融合蛋白。
本发明按照酿酒酵母密码子优化融合蛋白的编码序列，将优化后的编码序列克隆至真菌表达载体中，得到重组真菌表达载体。
在本发明中，所述优化后的编码序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2 所示。所述真菌表达载体优选为pESC-URA。本发明对pESC-URA的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pESC-URA的来源即可。在本发明实施例中，所述pESC-URA购自南京金斯瑞生物科技有限公司。优化后的编码序列在真菌表达载体的克隆在pESC-URA载体的GAL1启动子下游，具体为 BamHⅠ和XhoⅠ之间。
得到重组真菌表达载体后，本发明将所述重组真菌表达载体转化至酿酒酵母中，得到重组酿酒酵母。
在本发明中，所述转化的方法优选为醋酸锂转化法。本发明对酿酒酵母的菌株种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的酿酒酵母的感受态即可。在本发明实施例中所述酿酒酵母为酿酒酵母底盘细胞InvSc1菌株。
得到重组酿酒酵母后，本发明将所述重组酿酒酵母进行培养，破碎菌体细胞，分离纯化蛋白，得到融合蛋白。
在本发明中，所述培养的条件优选为28～32℃，更优选为30℃。所述培养优选为振荡培养。所述振荡培养的转速优选为100～180rpm，更优选为140 rpm。摇床培养的时间优选为24～48h，更优选为36h。
在本发明中，所述破碎菌体细胞的方法优选为液氮研磨方法破碎。破碎后，优选离心法去除细胞残渣，收集上清液。所述离心的转速优选为 5000～15000rpm，更优选为12000rpm。所述上清液采用镍柱亲和层析分离纯化目的蛋白。所述镍柱亲和层析分离纯化的条件优选为镍柱用量10～50毫升/L蛋白提取液，洗脱液为100～300mM咪唑、150mM NaCl。
本发明提供了所述融合蛋白或所述制备方法制备得到的融合蛋白在募集植物根系功能微生物中的应用。
在本发明中，所述应用中，所述融合蛋白的添加量优选为0.01～0.5g/株植物，更优选为0.1g/株植物。所述功能微生物优选包括以下一种或几种：贪铜菌属、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌。所述融合蛋白对葡聚糖和脂多糖具有较强的结合能力，因此重组微生物能够利用融合蛋白与分泌葡聚糖的植物根系结合，同时，所述融合蛋白结合至根系中，并能够大量招募自然产葡聚糖的微生物，大大提高了植物根际微生物的丰度和数量，从而在植物根际形成新的微生物群落，提高功能细菌在植物根系的定植。
同时基于自然产葡聚糖的微生物具有广泛的促生长、抗逆作用以及去除重金属污染物的作用，从而提高植物的生长速度、抗逆性，发挥植物修复功效。因此，本发明提供了所述融合蛋白或所述制备方法制备得到的融合蛋白在促进植物生长或提高植物修复重金属或多环芳烃污染中的应用。
在本发明中，所述促进植物生长优选包括提高植物的相对生长速率、提高植株叶绿素a和叶绿素b的含量和降低MDA含量。本发明实施例结果表明，所述融合蛋白能够显著促进浮萍、凤眼莲及龙葵根系等植物对功能细菌 (中国台湾贪铜菌)的募集，提高功能细菌在植物根系的定植。
在本发明中，所述重金属优选包括以下一种或几种：镉、铜、铅和铬。所述多环芳烃优选包括以下一种或几种：菲、蒽、萘和苯并芘；所述植物包括水生植物和陆生植物。本发明实施例结果表明，所述融合蛋白和中国台湾贪铜菌联用能显著增强镉离子从污水向植株的转移，从而提高植株对重金属离子的去除能力。同时中国台湾贪铜菌、恶臭假单胞菌与所述融合蛋白联用显著增强重金属离子从土壤向龙葵的转移，从而提高龙葵对镉离子的去除能力，同时提高共生体系对多环芳烃的降解能力。
下面结合实施例对本发明提供的一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
融合蛋白LcGC对浮萍根系募集中国台湾贪铜菌及重金属修复的增强效应
1试验方法
(1)融合蛋白LcGC的制备：
首先设计一种高效结合葡聚糖与脂多糖的融合蛋白LcGC，该蛋白能够与植物根系及革兰氏阴性菌高效结合。LcGC由三个结构域组成：小鼠cochlin 的LCCL结构域、绿色荧光蛋白GFP结构域、黄瘤胃球菌CttA蛋白的葡聚糖结合结构域(CBMCttA)。同时设计对照蛋白GC，该蛋白仅由GFP和 CBMCttA两个结构域组成。采用从头合成方法，制备LcGC蛋白的编码基因 Lcgc，该基因的C端带有6×组氨酸标签。将该基因片段克隆到pESC-URA 的GAL1启动子下游，酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ，得到pESC-Lcgc质粒。采用醋酸锂转化法，将该质粒转化到酿酒酵母底盘细胞InvSc1菌株中，得到合成微生物ScLcGC。将ScLcGC细胞培养于SC-Gal培养基(无氨基酵母氮源0.67％，半乳糖2％，氨基酸粉末0.2％)，30度摇床培养48小时，离心收集菌体。采用液氮研磨方法破碎菌体细胞，离心去除细胞残渣。采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行分离纯化，镍柱用量50ml/L蛋白提取液，洗脱液为200mM咪唑，150mM NaCl，得到最终蛋白LcGC。采用同样方法构建GC表达菌株ScGC，提取最终对照蛋白GC。
(2)LcGC在酵母中的表达以及与底物的结合作用
为评价LcGC及GC的多糖结合能力，将两种蛋白分别通过戊二醛连接到巯基化介孔硅的表面，修饰度为10％。将FITC标记的葡聚糖、脂多糖、磷壁酸分别溶解在PBS缓冲液中，终浓度分别为100mg/L。混合物在孵化 37℃为30分钟，随后12000rpm离心2分钟。收集细胞上清，采用荧光酶标仪检测上清液FITC-葡聚糖的荧光强度，采用脂多糖及磷壁酸ELISA检测试剂盒检测上清脂多糖及磷壁酸浓度(上海酶联生物科技有限公司)。
(3)LcGC对浮萍根系募集功能微生物的增强作用
在模拟污水中培养浮萍，研究LcGC及功能微生物中国台湾贪铜菌对浮萍根际微生物群落的影响。污水由蛋白胨80mg/L、酵母膏30mg/L、(NH4)2SO428 mg/L、NH4Cl 25mg/L、KH2PO470 mg/L、CdCl21.6 mg/L、pH 6.0～6.5组成。污水COD为40mg/L，总氮TN为28mg/L，总钾TK为20mg/L，总磷TP 为16mg/L，Cd2+为1mg/L。设置三个实验组，分别为对照组(Control)、台湾贪铜菌与对照蛋白GC联用组(Ct+GC)、中国台湾贪铜菌与LcGC联用组 (Ct+LcGC)。在Ct+LcGC组中，将中国台湾贪铜菌细胞(1×108cells/L)及 LcGC蛋白(0.1g/L)加入到污水中，随后将污水加入到50mL容量的平皿，每个平皿添加20mL，然后加入20株浮萍。培养4天后，采集植物根系进行微生物多样性分析。
(4)LcGC对浮萍生长及污染物去除能力的影响：
在生长的第4和第7天，对各组的浮萍重量、根系长度、丙二醛(MDA) 含量、叶绿素含量、水体中镉离子浓度等指标测定。其中MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法(BioRad)，叶绿素含量测定采用分光光度法(BioRad)，镉离子浓度测定采用电感耦合等离子体光谱法(PerkinElmer Optima 8300)。
2试验结果
(1)融合蛋白LcGC及对照蛋白GC在酵母细胞中的表达及其对葡聚糖、脂多糖、磷壁酸的结合作用
共聚焦显微观察结果表明：GC和LcGC都在酵母底盘细胞中进行了高表达，并且大部分的蛋白位于细胞质(图1a)。葡聚糖结合实验显示，两种蛋白均表现出很强的葡聚糖结合能力，在葡聚糖浓度为10mg/L时，吸附量达到92％，在葡聚糖浓度为200mg/L时，吸附量仍维持在62～64％(图1b)。脂多糖(LPS)及磷壁酸(TA)结合实验表明，LcGC具有极强的LPS及TA 结合能力，在两种底物浓度高达200mg/L时，吸附量仍维持在55～68％(图 1c-1d)，而对照蛋白GC的LPS及TA结合能力都很低，均维持在12％以下 (图1c-图1d)。因此，LcGC具有高效结合葡聚糖、脂多糖及磷壁酸的能力。
(2)LcGC对浮萍根系募集功能微生物的增强作用
微生物多样性测定结果显示：与Control组和Ct+GC组相比，Ct+LcGC 组的根际微生物多样性显著偏低，表现为Shannon指数(5.03比5.27～5.83) 和Simpon指数(0.92比0.95～0.96)均有所下降。与前两组相比，Ct+LcGC 组根际微生物组中贪铜菌属的相对丰度显著偏高，而Brevundimonas、 Caulobacter、Delftia、Methylophilus、Burkholderiaceae等微生物类群的相对丰度显著偏低(图2)。由此表明：LcGC能够显著促进浮萍根系对功能细菌中国台湾贪铜菌的募集，提高功能细菌在植物根系的定植。
(4)LcGC对浮萍生长及污染物去除能力的增强作用
在模拟污水中培养7天后，Ct+LcGC组的浮萍植株的相对生长速率显著高于另外两组(0.6～0.7比0.2～0.4)，植株叶绿素a和叶绿素b的总含量均高于另外两组(132mg/g FW比95～108mg/g FW)，而MDA含量显著低于另外两组(6.8nmol/g FW比9.1～9.8nmol/g FW)。这表明LcGC与Ct联用能够显著提高浮萍在重金属胁迫下的生长能力，促进叶绿素的合成，同时使植物免受氧化损伤。
通过对各组处理的污水中重金属含量及植株中重金属含量进行检测，发现7天后Ct+LcGC组中污水中镉含量下降92％(0.08mg/L)，而另外两组中污水镉含量仅下降75～82％(0.18～0.25mg/L)。由此可见，LcGC与Ct联用显著增强镉离子从污水向植株的转移，从而提高植株对重金属离子的去除能力。
实施例2
LcGC对凤眼莲根系募集中国台湾贪铜菌及重金属修复的增强效应
1试验方法
(1)LcGC对凤眼莲根系募集功能微生物的增强作用
在模拟水体中培养凤眼莲，研究融合蛋白及功能微生物对凤眼莲根际微生物群落的影响。污水由蛋白胨80mg/L、酵母膏30mg/L、(NH4)2SO428 mg/L、NH4Cl 25mg/L、KH2PO470mg/L、CdCl21.6 mg/L、pH 6.0～6.5组成。污水COD为40mg/L，总氮TN为28mg/L，总钾TK为20mg/L，总磷TP 为16mg/L，Cd2+为1mg/L。设置三个实验组，分别为对照组(Control)、台湾贪铜菌与对照蛋白GC联用组(Ct+GC)、中国台湾贪铜菌与LcGC联用组 (Ct+LcGC)。在Ct+LcGC组中，将中国台湾贪铜菌细胞(1×108cells/L)及 LcGC蛋白(0.1g/L)加入到污水中，随后将污水加入到50mL容量的平皿，每个平皿添加20mL，然后加入20株凤眼莲。培养14天后，采集植物根系进行微生物多样性分析。
(3)LcGC对凤眼莲生长及污染物去除能力的影响：
在生长的第14天，对各组的凤眼莲重量、根系长度、丙二醛(MDA) 含量、叶绿素含量、水体中镉离子浓度、凤眼莲镉离子含量等指标测定。
2试验结果
(1)LcGC对凤眼莲根系募集功能微生物的增强作用
微生物多样性测定结果显示：与Control组和Ct+GC组相比，Ct+LcGC 组的根际微生物多样性显著偏低，表现为Shannon指数(5.35比5.76～5.99) 和Simpon指数(0.93比0.95～0.97)均有所下降。与前两组相比，Ct+LcGC 组根际微生物组中贪铜菌属的相对丰度显著偏高，而Caulobacter、Delftia、 Methylophilus、Acidobacter等微生物类群的相对丰度显著偏低。由此表明：LcGC能够显著促进凤眼莲根系对功能细菌中国台湾贪铜菌的募集，提高功能细菌在植物根系的定植。
(4)LcGC对凤眼莲生长及污染物去除能力的增强作用
在模拟污水中培养14天后，Ct+LcGC组的凤眼莲植株平均湿重显著高于另外两组(35～38g比27～30g)，植株叶绿素a和叶绿素b的总含量均高于另外两组(145mg/g FW比112～127mg/g FW)，而MDA含量显著低于另外两组(7.5nmol/g FW比9.7～10.5nmol/g FW)。这表明LcGC与Ct联用能够显著提高凤眼莲在重金属胁迫下的生长能力，促进叶绿素的合成，同时使凤眼莲免受镉造成的氧化损伤。
通过对各组处理的污水中重金属含量及植株中重金属含量进行检测，发现14天后Ct+LcGC组中污水重金属含量下降94％(0.06mg/L)，而另外两组中污水镉含量仅下降45～50％(0.50～0.55mg/L)。由此可见，LcGC与Ct 联用显著增强镉离子从污水向凤眼莲的转移，从而提高凤眼莲对镉离子的去除能力。
实施例3
LcGC对龙葵根系募集中国台湾贪铜菌与恶臭假单胞菌及重金属修复的增强效应
1试验方法
(1)LcGC对龙葵根系募集功能微生物的增强作用
在模拟土壤中培养龙葵，研究融合蛋白及功能微生物对龙葵根际微生物群落的影响。土壤中含有镉离子、铜离子、铅离子、铬离子分别为1mg/kg 湿重，菲5mg/kg湿重。设置三个实验组，分别为对照组(Control)，中国台湾贪铜菌、恶臭假单胞菌与对照蛋白GC联用组(Ct+Pp+GC)，中国台湾贪铜菌、恶臭假单胞菌与LcGC联用组(Ct+Pp+LcGC)。在Ct+Pp+LcGC组中，将台湾贪铜菌(1×108cells/kg湿重)、恶臭假单胞菌(1×108cells/kg湿重)及 LcGC蛋白(0.1g/kg湿重)加入到污染土壤中，随后将土壤加入到1L容量的花盆，每个花盆中栽种1棵龙葵，龙葵初始株高为10～12厘米。培养30 天后，采集植物根系进行微生物多样性分析。
(3)LcGC对龙葵生长及污染物去除能力的影响：
培养30天后，对各组的龙葵重量、根系长度、丙二醛(MDA)含量、叶绿素含量、水体中镉离子浓度、龙葵镉离子含量等指标测定。
2试验结果
(1)LcGC对龙葵根系募集功能微生物的增强作用
微生物多样性测定结果显示：与Control组和Ct+Pp+GC组相比， Ct+Pp+LcGC组的根际微生物多样性显著偏低，表现为Shannon指数(5.12比 5.38～5.74)和Simpon指数(0.91比0.93～0.94)均有所下降。与前两组相比， Ct+LcGC组根际微生物组中贪铜菌属和假单胞菌属的相对丰度显著偏高，而 Actinobacter、Chloroflexi、Acidobacter、Rhokubacter等微生物类群的相对丰度显著偏低。由此表明：LcGC能够显著促进龙葵根系对功能细菌中国台湾贪铜菌及恶臭假单胞菌的募集，提高功能细菌在龙葵根系的定植。
(4)LcGC对龙葵生长及污染物去除能力的增强作用
在污染土壤中培养30天后，Ct+Pp+LcGC组的龙葵植株平均湿重显著高于另外两组(45～50g比30～36g)，植株叶绿素a和叶绿素b的总含量均高于另外两组(125mg/g FW比98～110mg/g FW)，而MDA含量显著低于另外两组(5.9nmol/g FW比8.9～9.5nmol/g FW)。这表明LcGC与Ct联用能够显著提高龙葵在重金属胁迫下的生长能力，促进龙葵叶绿素的合成，同时使植株更好的耐受重金属及多环芳烃。
通过对各组处理土壤中重金属及多环芳烃含量进行检测，发现14天后 Ct+Pp+LcGC组中土壤中各种重金属含量均下降50％以上(土壤中残留镉0.49mg/kg，铜0.32mg/kg，铅0.45mg/kg，铬0.43mg/kg)，而另外两组中土壤各种重金属含量仅下降30％～45％(土壤中残留镉0.71～0.74mg/kg，铜 0.59～0.55mg/kg，铅0.62～0.69mg/kg，铬0.58～0.66mg/kg)。同样地， Ct+Pp+LcGC组土壤中多环芳烃降低率达到80％(土壤残留菲1mg/kg)，而另外两组土壤中多环芳烃降低率仅为40～46％(土壤残留菲2.2～3mg/kg)。由此可见，LcGC与Ct及Pp联用显著增强重金属离子从土壤向龙葵的转移，从而提高龙葵对镉离子的去除能力，同时提高共生体系对多环芳烃的降解能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
                         序列表
<110>  南开大学
<120>  一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用
<160>  4
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  730
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
Met Val Pro Ile Pro Val Thr Cys Phe Thr Arg Gly Leu Asp Ile Arg
1               5                   10                  15
Lys Glu Lys Ala Asp Val Leu Cys Pro Gly Gly Cys Ser Leu Glu Glu
            20                  25                  30
Phe Ser Val Phe Gly Asn Ile Val Tyr Ala Ser Val Ser Ser Ile Cys
        35                  40                  45
Gly Ala Ala Val His Arg Gly Val Ile Gly Thr Ser Gly Gly Pro Val
    50                  55                  60
Arg Val Tyr Ser Leu Pro Gly Arg Glu Asn Tyr Ser Ser Val Asp Ala
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ile Gln Ser Gln Met Leu Ser Arg Trp Ser Ala Ser Phe Gly
                85                  90                  95
Gly Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
            100                 105                 110
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser
        115                 120                 125
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe
    130                 135                 140
Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
145                 150                 155                 160
Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met
                165                 170                 175
Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
            180                 185                 190
Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala
        195                 200                 205
Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
    210                 215                 220
Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu
225                 230                 235                 240
Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys
                245                 250                 255
Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly
            260                 265                 270
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
        275                 280                 285
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala
    290                 295                 300
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu
305                 310                 315                 320
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
                325                 330                 335
Gly Gly Gly Val Ser Thr Asp Phe Val Lys Ala Pro Ala Gln Asn Val
            340                 345                 350
Gln Glu Gly Glu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Leu Leu Tyr Ile Pro Ala
        355                 360                 365
Glu Glu Thr Val Ser Thr Trp Asn Gln Thr Leu Ser Ala Ala Ile Ala
    370                 375                 380
Ser Ile Gly Ala Glu Asp Gly Glu Val Asp Val Ala Lys Phe Arg Asp
385                 390                 395                 400
Asp Ile Leu Ser Lys Ala Gly Ala Tyr Lys Glu Ala Ala Ala Tyr Ala
                405                 410                 415
Leu Asp Gln Cys Ile Ile Pro Asn Lys Val Asn Tyr Glu Ile Thr Gly
            420                 425                 430
Glu Asn Asp Val Val Ile Thr Gly Lys Ile Ser Glu Pro Asp Leu Asn
        435                 440                 445
Leu Lys Ile Ala Asn Thr Pro Ala Asp Ala Leu His Arg Ile Ala Asp
    450                 455                 460
Ser Tyr Asn Ala Pro Ala Leu Lys Asn Val Asp Tyr Ser Thr Val Lys
465                 470                 475                 480
Ile Gly Gly Asp Phe Lys Ile Thr Ile Gly Thr Ser Ala Leu Ala Ser
                485                 490                 495
Gly Lys Lys Val Ala Val Thr Phe Ala Tyr Thr Thr Ala Asp Gly Thr
            500                 505                 510
Tyr Gly Ile Gly Glu Leu Pro Ala Tyr Ala Ile Lys Lys Ile Glu Glu
        515                 520                 525
Ile Arg Lys Ile Asp Glu Ala Ala Ile Glu Lys Glu Val Ala Ala Asp
    530                 535                 540
Lys Val Asp Glu Ala Lys Ala Lys Tyr Asn Ala Lys Ile Asp Leu Ile
545                 550                 555                 560
Ile Asp Lys Leu Lys Lys Ala Glu Arg Ala Val Asp Lys Thr Leu Lys
                565                 570                 575
Ala Asp Lys Asn Ala Thr Tyr Ser Asp Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp
            580                 585                 590
Thr Asn Gly Trp Leu Lys Ala Asn Gly Ile Asn Arg Gln Leu Pro Gly
        595                 600                 605
Thr Ala Ser Glu Ile Ala Ala Lys Glu Phe Ile Val Lys Ala Tyr Asp
    610                 615                 620
Thr Ala Ile Lys Thr Ile Asp Ser Lys Gly Val Val Asp Ile Ser Ala
625                 630                 635                 640
Ala Asp Leu Gly Gly Phe Ala Asp Ser Ile Lys Asn Val Thr Phe Ser
                645                 650                 655
Leu Ala Asn Gly Lys Ala Glu Gly Ile Gly Thr Phe Asp Asp Ala Glu
            660                 665                 670
Gln Ala Glu Val Lys Ala Trp Val Glu Lys Asn Gly Tyr Ala Phe Val
        675                 680                 685
Asp Ser Tyr Lys Lys Ile Thr Ala Lys Val Asp Phe Ser Gly Ile Lys
    690                 695                 700
Ser Val Asp Ala Gly Ser Val Glu Val Glu Ile Glu Arg Ile Leu Val
705                 710                 715                 720
Thr Asp Thr Thr His His His His His His
                725                 730
<210>  2
<211>  2193
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
atggtcccaa ttccagtgac ttgtttcacc agaggtttgg acatcagaaa ggaaaaggct       60
gatgtcctct gtccaggtgg ttgttccttg gaagaatttt ctgttttcgg taacattgtc      120
tacgcttccg tttcctctat ctgtggtgcc gccgtccacc gtggtgttat tggtacttct      180
ggtggtccag tcagagttta ttctttgcca ggtagagaaa actattcttc cgttgatgct      240
aacggtatcc aatctcaaat gttgtccaga tggtctgcca gtttcggtgg tggcgtttct      300
aagggtgaag aattattcac cggtgtcgtc ccaattttgg tcgaactaga cggtgacgta      360
aatggtcaca agttttctgt ctccggcgaa ggtgaaggtg atgctaccta cggtaagttg      420
accttaaagt tcatctgcac cactggtaaa ttgccagttc catggccaac tttggttacc      480
actttaactt acggtgttca atgtttcagt agatacccag atcacatgaa gcaacacgat      540
ttcttcaaat cggctatgcc agaaggttac gttcaagaaa gaactatctt cttcaaggat      600
gacgggaact acaagactag agctgaagtc aagttcgaag gtgacacttt agtgaacaga      660
atcgaactga agggtattga cttcaaggaa gacggtaata tcttgggtca caagttggaa      720
tacaactaca actcccataa cgtttacatc atggctgaca agcaaaagaa cggtatcaag      780
gttaacttca agatcagaca caacatagaa gatggttccg tccaattggc tgaccactac      840
caacaaaaca ccccaatcgg tgatggtcca gtcttattac cagacaacca ttacttgagc      900
actcaatccg ccttgtccaa ggacccaaat gaaaagagag accacatggt tttgttggaa      960
tttgttaccg ccgctggtat cactttgggt atggacgaat tgtacaaggg tggtggcgtg      1020
agcacagatt tcgttaaggc accagctcaa aacgtacagg agggtgaatc attgaagcta      1080
gaaaacttgt tgtatattcc tgccgaagaa acagtcagta catggaacca aactttatcc      1140
gcggcaatcg cttccatcgg agcggaagac ggcgaggtag acgtagcgaa gtttcgtgat      1200
gatatcttat caaaagcagg tgcatataaa gaagcagccg cctatgcgct agatcagtgt      1260
attataccca ataaagtcaa ttacgagatt acaggagaaa atgatgtcgt aataaccggg      1320
aaaataagtg agccggacct caaccttaaa atagcaaata cgccagcgga cgcattacac      1380
agaatcgctg actcgtacaa tgccccagct ctcaaaaatg tagactactc taccgtcaag      1440
attggggggg atttcaaaat aacaataggc acatctgctc ttgcttctgg gaagaaggtc      1500
gcagtcacat ttgcttatac cacagctgat gggacctatg ggataggcga actaccagcc      1560
tacgcgatca agaaaataga ggaaatcagg aaaattgacg aagctgcgat cgagaaagag      1620
gtggcggcag acaaagtaga cgaagctaag gcaaagtata acgcgaagat tgatttaatt      1680
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gcgacatatt cagacgtgag cggtttgatt tcagatacca atggttggct gaaagccaac      1800
ggtattaacc gccagctccc cggcactgcc agtgaaatag cagccaagga gtttatagta      1860
aaagcgtacg atacagcgat taagacgatt gattcgaaag gggtcgtgga catttcagca      1920
gcagatttag gtggcttcgc cgattcaatc aaaaacgtta cgttttccct tgctaatggc      1980
aaagctgagg gaatagggac gttcgatgat gcggagcagg ccgaagtgaa agcctgggtt      2040
gagaaaaatg gatatgcctt cgttgattct tacaagaaaa tcacagctaa agttgatttt      2100
tcaggaatta agtccgttga cgccgggtcc gtagaagttg aaatagagag aatactagtg      2160
actgatacta cccaccatca ccaccatcat taa                             2193
<210>  3
<211>  95
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
Met Val Pro Ile Pro Val Thr Cys Phe Thr Arg Gly Leu Asp Ile Arg
1               5                   10                  15
Lys Glu Lys Ala Asp Val Leu Cys Pro Gly Gly Cys Ser Leu Glu Glu
            20                  25                  30
Phe Ser Val Phe Gly Asn Ile Val Tyr Ala Ser Val Ser Ser Ile Cys
        35                  40                  45
Gly Ala Ala Val His Arg Gly Val Ile Gly Thr Ser Gly Gly Pro Val
    50                  55                  60
Arg Val Tyr Ser Leu Pro Gly Arg Glu Asn Tyr Ser Ser Val Asp Ala
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ile Gln Ser Gln Met Leu Ser Arg Trp Ser Ala Ser Phe
                85                  90                  95
<210>  4
<211>  385
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
Val Ser Thr Asp Phe Val Lys Ala Pro Ala Gln Asn Val Gln Glu Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Leu Leu Tyr Ile Pro Ala Glu Glu Thr
            20                  25                  30
Val Ser Thr Trp Asn Gln Thr Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ser Ile Gly
        35                  40                  45
Ala Glu Asp Gly Glu Val Asp Val Ala Lys Phe Arg Asp Asp Ile Leu
    50                  55                  60
Ser Lys Ala Gly Ala Tyr Lys Glu Ala Ala Ala Tyr Ala Leu Asp Gln
65                  70                  75                  80
Cys Ile Ile Pro Asn Lys Val Asn Tyr Glu Ile Thr Gly Glu Asn Asp
                85                  90                  95
Val Val Ile Thr Gly Lys Ile Ser Glu Pro Asp Leu Asn Leu Lys Ile
            100                 105                 110
Ala Asn Thr Pro Ala Asp Ala Leu His Arg Ile Ala Asp Ser Tyr Asn
        115                 120                 125
Ala Pro Ala Leu Lys Asn Val Asp Tyr Ser Thr Val Lys Ile Gly Gly
    130                 135                 140
Asp Phe Lys Ile Thr Ile Gly Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Lys Lys
145                 150                 155                 160
Val Ala Val Thr Phe Ala Tyr Thr Thr Ala Asp Gly Thr Tyr Gly Ile
                165                 170                 175
Gly Glu Leu Pro Ala Tyr Ala Ile Lys Lys Ile Glu Glu Ile Arg Lys
            180                 185                 190
Ile Asp Glu Ala Ala Ile Glu Lys Glu Val Ala Ala Asp Lys Val Asp
        195                 200                 205
Glu Ala Lys Ala Lys Tyr Asn Ala Lys Ile Asp Leu Ile Ile Asp Lys
    210                 215                 220
Leu Lys Lys Ala Glu Arg Ala Val Asp Lys Thr Leu Lys Ala Asp Lys
225                 230                 235                 240
Asn Ala Thr Tyr Ser Asp Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Thr Asn Gly
                245                 250                 255
Trp Leu Lys Ala Asn Gly Ile Asn Arg Gln Leu Pro Gly Thr Ala Ser
            260                 265                 270
Glu Ile Ala Ala Lys Glu Phe Ile Val Lys Ala Tyr Asp Thr Ala Ile
        275                 280                 285
Lys Thr Ile Asp Ser Lys Gly Val Val Asp Ile Ser Ala Ala Asp Leu
    290                 295                 300
Gly Gly Phe Ala Asp Ser Ile Lys Asn Val Thr Phe Ser Leu Ala Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Ala Glu Gly Ile Gly Thr Phe Asp Asp Ala Glu Gln Ala Glu
                325                 330                 335
Val Lys Ala Trp Val Glu Lys Asn Gly Tyr Ala Phe Val Asp Ser Tyr
            340                 345                 350
Lys Lys Ile Thr Ala Lys Val Asp Phe Ser Gly Ile Lys Ser Val Asp
        355                 360                 365
Ala Gly Ser Val Glu Val Glu Ile Glu Arg Ile Leu Val Thr Asp Thr
    370                 375                 380
Thr
385

Claims (8)

1.一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白，其特征在于，包括一个细菌脂多糖结合结构域和一个葡聚糖结合结构域，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）按照酿酒酵母密码子优化融合蛋白的编码序列，将优化后的编码序列克隆至真菌表达载体中，得到重组真菌表达载体；
2）将所述重组真菌表达载体转化至酿酒酵母中，得到重组酿酒酵母；
3）将所述重组酿酒酵母进行培养，破碎菌体细胞，分离纯化蛋白，得到融合蛋白。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1）中所述优化后的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1）中所述真菌表达载体为pESC-URA；优化后的编码序列在真菌表达载体的克隆的位置为BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间。
5.权利要求1所述融合蛋白或权利要求2~4任意一项所述制备方法制备得到的融合蛋白在募集植物根系功能微生物中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述功能微生物包括以下一种或几种：台湾贪铜菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌。
7.权利要求1所述融合蛋白或权利要求2~4任意一项所述制备方法制备得到的融合蛋白在促进植物生长或提高植物修复重金属或多环芳烃污染中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述重金属包括以下一种或几种：镉、铜、铅和铬；所述多环芳烃包括以下一种或几种：菲、蒽、萘和苯并芘；所述植物包括水生植物和陆生植物。
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